zellatmung - Ruhr-Universität Bochum

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ZELLATMUNG
Die Aktivität der mitochondrialen ATP-Synthase ist von der Arbeit der mitochondrialen
Atmungskette abhängig und damit auch vom Sauerstoffverbrauch der Atmungskette.
Gegenstand der Experimente zur Zellatmung ist die Abhängigkeit des mitochondrialen
Sauerstoffverbrauchs von der Oxidation verschiedener Stoffwechselprodukte.
A.
BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
ATP ist in allen Organismen der wichtigste Energieträger. Zur Freisetzung der Energie wird
das ATP im Stoffwechsel in der Regel zu ADP abgebaut, mitunter auch zu AMP. Das ATP
kann dann auf verschiedenen Wegen regeneriert werden, das meiste ATP wird ausgehend
von ADP und freien Phosphat-Ionen durch oxidative Phosphorylierung im Rahmen der
Zellatmung in den Mitochondrien gebildet: Phosphoryliert wird dabei ADP zu ATP, die
Diphosphatgruppe des ADP wird zu einer Triphosphatgruppe verlängert. Ein Bezug zu
Oxidationen ist dabei nur indirekt gegeben:

Die Bildung des ATP wird – ausgehend von ADP und Phosphat-Ionen - von der
mitochondrialen ATP-Synthase katalysiert. Diese ist in der mitochondrialen
Innenmembran verankert, die drei katalytischen Zentren befinden sich im F1-Teil des
Enzyms, der in die mitochondriale Matrix ragt.

Die ATP-Synthase wird (vergleichbar einer Wassermühle) durch einen Einstrom von
Protonen (H+-Ionen) in die mitochondriale Matrix in Gang gesetzt. Die Protonen
fließen an einer bestimmten Stelle durch den membranständigen FO-Teil des Enzyms
hindurch. Der FO-Teil enthält einen Rotor, der dabei in Drehungen versetzt wird.

Die Protonen fließen nur in die Matrix, wenn ihre Konzentration im Intermembranraum
höher ist als in der Matrix, erforderlich ist also ein Protonengradient. Dieser wird von
einer Reihe an Proteinen der Innenmembran aufgebaut, die gemeinsam als
Atmungskette bezeichnet werden (Abb.
Abb. 1
8

Die Atmungskette ist eine Protonenpumpe. Für ihre Aktivität benötigt sie Energie. Die
Energie bezieht sie aus elektrischem Strom, also aus einem Fluss von Elektronen.
Die Elektronen werden in der Atmungskette letztlich auf molekularen Sauerstoff (O 2)
übertragen, dabei entsteht in der Atmungskette letztlich (durch Reaktionen mit
zusätzlichen Protonen) Wasser:
O2 + 4 Elektronen + 4 Protonen → 2 H2O
Im Lauf eines Tages wird in den Mitochondrien eines Menschen auf diese Weise etwa ein
halber Liter Wasser synthetisiert. Das dazu verwendete O 2 stammt aus der Atemluft.
 Der Verbrauch an Sauerstoff (O2) in der Atmungskette wird im Praktikum mit Hilfe
einer Sauerstoffelektrode gemessen.
Anmerkung: Im biochemischen Sinne ist das Entscheidende an der Zellatmung allerdings nicht
der Sauerstoffverbrauch, sondern die Arbeit der Elektronentransportkette in einer Membran,
die einen Protonengradienten aufrechterhält, der an eine Energiegewinnung durch eine ATPSynthase gekoppelt ist. In vielen Bakterien wird ähnlich wie in den Mitochondrien ein
Protonengradient aufgebaut, der für eine ATP-Synthese genutzt wird. In einigen Bakterien
werden die Elektronen aber nicht auf O 2, sondern z.B. auf Schwefel (S) übertragen. In
derartigen Fällen wird nicht H2O sondern (unangenehm riechendes) H2S gebildet, etwa in
sauerstoffarmen Gewässern, und es liegt nicht Sauerstoff-Atmung vor, sondern SchwefelAtmung.
Die Aufgabe der mitochondrialen Atmungskette besteht darin, Protonen aus der Matrix in den
mitochondrialen Intermembranraum zu pumpen. Dabei werden, gleichsam nebenbei, zudem
Protonen zur Synthese von Wasser verbraucht. Die Atmungskette transportiert also
Protonen, und sie verbraucht Protonen (Abb. 2).
Abb. 2
9

Woher kommt der elektrische Strom, der von der Atmungskette benötigt wird? Woher
stammen also die Elektronen, die letztlich auf den Sauerstoff übertragen werden?
Im Stoffwechsel werden verschiedene chemische Verbindungen (= „Metabolite“) oxidiert, d.h.
ihnen werden Elektronen entnommen:
 So wird etwa im Citratzyklus Succinat zu Fumarat oxidiert, dabei werden dem Succinat
2 Elektronen entnommen. Diese werden direkt auf den Komplex II der Atmungskette
übertragen.
 Nach längerem Fasten entsteht im Stoffwechsel der Leber durch Abbau von Fettsäuren
sehr viel -Hydroxybutyrat. Dieses zählt zu den sogen. „Ketonkörpern“, die beim
längeren Hungern oder Fasten an das Blut abgegeben werden. -Hydroxybutyrat wird
von verschiedenen Geweben aufgenommen und dann in den Mitochondrien oxidiert.
Es trägt dazu bei, dass der Organismus auch bei Nahrungsmangel längere Zeit
überleben kann. Bei der Oxidation des -Hydroxybutyrats wird NAD+ zu NADH
reduziert, welches 2 Elektronen zum Komplex I der Atmungskette transportieren kann.
Aus dem -Hydroxybutyrat entsteht dabei Acetoacetat.
Die Aktivität der Atmungskette ist somit davon abhängig, dass Metabolite im
Stoffwechsel oxidiert werden und die dabei anfallenden Elektronen der Atmungskette zur
Verfügung gestellt werden. Die Atmungskette baut dann den Protonengradienten auf, der
von der ATP-Synthase zur Phosphorylierung von ADP zu ATP genutzt wird. In diesem
Sinne kann dann von einer oxidativen Phosphorylierung gesprochen werden.
Die Abhängigkeit des Sauerstoffverbrauchs der mitochondrialen Atmungskette von der
Verfügbarkeit von Stoffen wie Succinat oder -Hydroxybutyrat soll im Praktikum
demonstriert werden.
Dazu werden isolierte Mitochondrien der Leber einer Ratte in einer wässrigen Lösung bei
neutralem pH-Wert suspendiert, und in einem Probengefäß wird dann mit Hilfe einer
Sauerstoffelektrode der Verbrauch an O 2 in der Suspension nachgewiesen. Es wird dann
jeweils eine kleine Menge der jeweiligen Metabolite zugegeben und über den Verbrauch an
O2 die Aktivität der Atmungskette gemessen.

Die Metabolite werden in der Matrix der Mitochondrien oxidiert. Wie aber gelangen die
Metabolite in die Mitochondrien hinein?
Die mitochondriale Außenmembran enthält kleine Poren, die hinreichend groß sind um eine
freie Diffusion der Metabolite zu ermöglichen. Die mitochondriale Innenmembran enthält
hingegen keine porenbildenden Proteine. Ein Transport von Metaboliten ist nur durch
10
bestimmte integrale Membranproteine möglich, die jeweils für bestimmte Metabolite spezifisch
sind:
 Succinat ist eine Dicarbonsäure, sie enthält also zwei Carboxylgruppen:
Succinat:
-
OOC-CH2-CH2-COO-
Succinat kann mit Hilfe des mitochondrialen Dicarboxylat-Translokators (Dicarboxylate carrier)
im Austausch gegen anorganische Anionen wie z.B. Phosphat in die Matrix transportiert
werden. Der Dicarboxylat-Translokator gehört zu einer großen Familie von 53 ähnlich
aufgebauten mitochondrialen Proteinen, die – jeweils spezifisch für bestimmte Metabolite –
deren Transport über die Innenmembran vermitteln.
 -Hydroxybutyrat ist eine Monocarbonsäure:

-Hydroxybutyrat:
H3C-CH2-CHOH-COO-
Auch dieser Metabolit wird vermutlich ähnlich wie die Dicarboxylate in die Mitochondrien
importiert, das Transportprotein ist aber bis heute nicht identifiziert worden.
Das berühmteste Mitglied der Familie der mitochondrialen Metabolit-Translokatoren ist der
ADP/ATP-Translokator (AAC). Dieser vermittelt den Transport von ADP in die Mitochondrien,
welches von der ATP-Synthese als Substrat benötigt wird. Gleichzeitig vermittelt der gleiche
Translokator aber auch den Export des neu synthetisierten ATP aus den Mitochondrien in das
Zytosol. Der Import der ebenfalls zur ATP-Synthese benötigten Phosphat-Ionen wird von
einem Phosphat-Translokator vermittelt.
Der P/O-Quotient

Wieviel ADP kann zu ATP phosphoryliert werden, wenn bei intakter Atmungskette und
intakter ATP-Synthase ausgehend von molekularem Sauerstoff ein H 2O synthetisiert
wird?
Das Verhältnis von Phosphorylierung zu O2-Verbrauch wird traditionell als P/O-Quotient
bezeichnet. Unter optimalen experimentellen Bedingungen lässt sich ein P/O-Quotient von ca.
2.5 nachweisen.
→ Im Rahmen des Praktikums soll der P/O-Quotient experimentell bestimmt werden.
Der Wert des P/O-Quotienten ist grundsätzlich davon abhängig, (1.) wie viele Protonen von
der Atmungskette in den Intermembranraum gepumpt werden und (2.) wie viele Protonen
erforderlich sind, damit von der ATP-Synthase 1 ATP synthetisiert werden kann. Aus
umfangreichen Forschungsarbeiten sind die folgenden Daten verfügbar:
11
-
Wenn 1 NADH seine beiden Elektronen an den Komplex I der Atmungskette abgibt,
kann vom Komplex IV der Atmungskette ein Sauerstoffatom eines O 2 zu 1 H2O
umgesetzt werden. Dabei werden 10 Protonen in den Intermembranraum gepumpt. →
Die Atmungskette pumpt 10 H+ wenn sie 1 H2O synthetisiert
-
8 Protonen sind erforderlich, damit sich der Rotor der ATP-Synthase einmal um 360°
drehen kann, dabei werden in den drei katalytischen Zentren des Enzyms 3 ATP
synthetisiert. → Die ATP-Synthase benötigt 8 H+ für 3 ATP, also 2.67 H+ für 1 ATP
-
Wenn – vermittelt von ADP/ATP-Translokator - 1 ATP im Austausch gegen ADP von
den Mitochondrien an das Cytosol abgegeben wird, geht dem mitochondrialen
Membranpotential eine weitere Ladung verloren, denn die Triphosphatgruppe des ATP
trägt 4 negative Ladungen, die Diphosphatgruppe des ADP trägt hingegen nur drei
Ladungen: → Jeder ATP-Export benötigt ein weiteres Proton zum Ladungsausgleich
10
Mit diesen Zahlen ergibt sich ein P/O-Quotient von (2,67+1) = 2,725
Tatsächlich können dem mitochondrialen Protonengradienten allerdings auch durch andere
Transportprozesse Protonen verloren gehen, weshalb die experimentell bestimmten Werte in
der Regel niedriger liegen.
Sofern Succinat oxidiert wird, kann die Atmungskette pro 1 O nur 6 H+ translozieren und der
maximale P/O-Quotient liegt bei 1.6.
Bei Experimenten zur oxidativen Phosphorylierung kann in die Effizienz der oxidativen
Phosphorylierung durch Zusatz verschiedener Reagenzien eingegriffen werden:
Adenosindiphosphat (ADP)
Die ATP-Synthase benötigt als Ausgangsstoffe der ATP-Synthese ADP und Phosphat-Ionen.
Im Praktikum wird gezeigt werden, wie sich ein Mangel an ADP auf den Sauerstoffverbrauch
der Mitochondrien auswirkt: Sobald den Mitochondrien kein ADP zur Verfügung steht, wird die
ATP-Synthase inaktiv und auch die Atmungskette reduziert ihre Aktivität. Entsprechend
reduziert sich auch der Sauerstoffverbrauch: ADP reguliert die Zellatmung.
Entkoppler
Als Entkoppler bezeichnet man Stoffe, die sich in die mitochondriale Innenmembran einlagern
und dann einen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials verursachen. Berühmte
Entkoppler sind das CCCP (Carbonylcyanide-3-chlorophenylhydrazone) und das 2,4Dinitrophenol. Beide Verbindungen können Protonen transportieren und verursachen so den
Verlust des Membranpotentials, das von der Atmungskette aufgebaut wurde. Dabei bleibt
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die Aktivität der Atmungskette und somit auch der Sauerstoffverbrauch der
Atmungskette in vollem Umfang erhalten! Von der Aktivität der Atmungskette ist die
Aktivität der ATP-Synthase unter diesen Bedingungen jedoch abgekoppelt: Die ATPSynthase ist gänzlich inaktiv, denn ein Membranpotential ist nicht mehr vorhanden.
Rotenon, ein Inhibitor des Komplex I
Rotenon ist eine giftige organische Verbindung, die von bestimmten Pflanzen gebildet wird.
Rotenon lagert sich in den Komplex I der Atmungskette ein und blockiert dort den Transport
der Elektronen. Diese können dann nicht mehr zum O2 der Atmungskette gelangen.
Malonat, ein Inhibitor des Komplex II
Malonat ist ein Hemmstoff des Komplex II der Atmungskette. Ähnlich dem Succinat ist auch
Malonat eine Dicarbonsäure:
Succinat:
Malonat:
-
OOC-CH2-CH2-COO-
OOC-CH2-COO-
Aufgrund der Ähnlichkeit seiner Struktur kann sich Malonat in die Succinat-Bindestelle des
Komplexes II einlagern, dort kann es dann aber nicht oxidiert werden. Es agiert somit als
kompetitiver Inhibitor. Succinat kann dann keine Elektronen an die Atmungskette abgeben.
Die Atmungskette kann gleichwohl aktiv sein, sofern Elektronen von NADH auf den Komplex
I der Atmungskette übertragen werden.
Antimycin A, ein Inhibitor des Komplex III
Das Antimycin A ist eine giftige organische Verbindung, die von bestimmten Bakterien gebildet
wird. Es lagert sich spezifisch in den Komplex III der Atmungskette ein und blockiert dort die
Weiterleitung der Elektronen. In Gegenwart von Antimycin A können Elektronen weder von Hydroxybutyrat, noch von Succinat zum O 2 gelangen, die Aktivität der Atmungskette ist damit
vollständig blockiert.
Cyanid-Ionen: Blockade der Sauerstoff-Bindestelle im Komplex IV
Cyanidionen, CN-, lagern sich mit hoher Affinität in die O 2-Bindestelle des Komplex IV ein, sie
sind deshalb außerordentlich giftig.
Oligomycin: Blockade des FO-Teils der ATP-Synthase
Auch Oligomycin ist eine organische Verbindung, die von bestimmten Bakterien synthetisiert
wird. Es blockiert jedoch nicht die Atmungskette, vielmehr lagert es sich in den FO-Teil der
ATP-Synthase ein und blockiert damit die Aktivität des Enzyms. In der traditionellen
13
Bezeichnung „FO-Teil“ bezieht sich der tiefgestellte Buchstabe O auf das Oligomycin, dessen
Bindestelle sich in diesen Teil des Enzyms befindet.
B.
ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE
Mitochondrien, die auf schonende Weise aus frischer Rattenleber isoliert wurden, besitzen die
Fähigkeit zur ATP-Synthese. Diese läuft unter Verbrauch von Sauerstoff ab und ist abhängig
vom Vorhandensein von ADP und Phosphat. In den folgenden Versuchen sollen
-
das ADP/O-Verhältnis und der Atmungskontrollkoeffizient unter Verwendung der
beiden Substrate 3-Hydroxybutyrat und Succinat ermittelt werden;
-
der Einfluss von Oligomycin (des Inhibitors der ATP-Synthase) und des Entkopplers
2,4-Dinitrophenol auf die oxidative Phosphorylierung untersucht werden;
-
der Elektronenfluss der Atmungskette durch selektive Inhibitoren der Komplexe I bis IV
gehemmt werden.
C.
VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL
Mitbringliste: Kittel, Lineal, Taschenrechner
Für den Versuch werden folgende Lösungen benötigt:
Mitochondriensuspension (20 mg Protein/ml) in isotonischer Pufferlösung
-
Testpuffer "H" (10 mM K-Phosphat pH = 7.4; 5 mM MgCl2; 20 mM KCl; 0,25 M
Mannit) mit 20 mM 3-Hydroxybutyrat
-
Testpuffer "S" (10 mM K-Phosphat pH = 7.4; 5 mM MgCl2; 20 mM KCl; 0,25 M
Mannit) mit 20 mM Succinat
-
0,25 M ADP ( auf pH = 7.4)
-
0,1 M Succinat
-
0,5 M 3-Hydroxybutyrat
-
10 mM 2,4-Dinitrophenol (auf pH = 7.4)
-
0,5 mM CCCP*) in Ethanol
-
Oligomycin*) (1 mg/ml in Ethanol)
-
Rotenon*) (1 mg/ml in Ethanol)
-
1,0 M Malonat
-
Antimycin A*) (2 mg/ml in Ethanol) Formel s. Anlage
14
Versuchsanordnung:
Als Messzelle für alle Versuche dient ein thermostatisierbares Glasgefäß, das eine
Sauerstoffelektrode enthält (Abb. 3). Diese besteht aus einem Silber/Platin-Elektrodenpaar,
das sich in einer Elektrolytlösung befindet und durch eine gasdurchlässige Teflonmembran
umschlossen wird. Ein Verstärker versorgt die Elektroden mit einer Polarisationspannung,
wobei Sauerstoff, der sich zwischen den Elektrodenflächen befindet vollständig reduziert wird.
Dadurch fließt zwischen den Elektroden ein Strom, der in einem direkten stöchiometrischen
Verhältnis zum verbrauchten Sauerstoff steht. Bei ausreichender Durchmischung des
Probevolumens (Magnetrührer!) erfolgt über die gasdurchlässige Teflonmembran ein rascher
Sauerstoffaustausch zwischen der Probe in der Messzelle und der Elektrolytlösung der
Elektrode, so dass der zwischen den Elektroden fließende Strom der jeweiligen
Sauerstoffkonzentration in der Probe proportional ist. Dieser Strom wird vom Verstärker in eine
Spannung umgewandelt und so verstärkt, dass sich eine Messgröße im Voltbereich ergibt, die
mit Hilfe eines A/D-Wandlers und eines PCs in ihrem zeitlichen Verlauf dargestellt werden
kann. Auf diese Weise können zeitliche Änderungen der Sauerstoffkonzentration registriert
werden; die Steigung einer aufgezeichneten Linie entspricht der Geschwindigkeit des
Sauerstoffverbrauchs.
Abb. 3:
Versuchsanordnung zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von
Mitochondrien
15
1.
Messung der Atmungskontrolle und des ADP/O-Verhältnisses mit den
Substraten 3-Hydroxybutyrat und Succinat
1.1.
Eichung der Sauerstoffelektrode
Das Reaktionsgefäß wird mit Wasser gefüllt, das bei Raumtemperatur mit Luft gesättigt ist und
daher etwa 250 nmol O2 /ml enthält. Das Gefäß wird sofort mit einem Glasstopfen
verschlossen und der Magnetrührer wird eingeschaltet. Durch Betätigen des Start-Buttons im
Programm wird der Messvorgang gestartet. Sobald die auf dem Monitor dargestellte
Spannungslinie einen waagerechten oder nur geringfügig abfallenden, linearen Verlauf
anzeigt wird dem Wasser etwas Natrium-Dithionit (Reduktionsmittel) zugesetzt: dadurch wird
der im Wasser gelöste Sauerstoff verbraucht, und die registrierte Spannung fällt rasch ab, um
sich nach kurzer Zeit bei einem niedrigen Wert zu stabilisieren. Die Messung wird durch
Anklicken des Stopp-Buttons beendet. Die graphische Darstellung der Messwerte wird dann
ausgedruckt. Die Differenz der Spannung vor und nach Zugabe von Dithionit entspricht einer
Sauerstoffkonzentration von 250 nmol/ml.
1.2.
Bestimmung des Atmungskontrollkoeffizienten und des ADP/O-Quotienten
Vor Versuchsbeginn wird die Zelle mit Hilfe einer Vakuumvorrichtung (Pipettenspitze) entleert
und dreimal mit Wasser nachgespült. Dabei ist drauf zu achten, dass das Wasser der letzten
Spülung möglichst vollständig entfernt wird. Entsprechend dem folgenden Versuchsplan
werden dann die Suspension von Rattenlebermitochondrien sowie der jeweils erforderliche
Testpuffer in die Messzelle pipettiert. Diese wird sofort mit einem Glasstopfen verschlossen,
der mit einer kapillaren Öffnung versehen ist, und der Magnetrührer wird eingeschaltet. Durch
Betätigen der Start-Taste im Programm wird der Messvorgang gestartet, und die
Sauerstoffkonzentration in der Messzelle kann am Monitor unmittelbar verfolgt werden. Nach
Erreichen einer konstanten Geschwindigkeit der Sauerstoffabnahme wird mit Hilfe einer
Mikroliterspritze durch die Kapillare des Glasstopfens ADP-Lösung, entsprechend dem
Versuchsplan, zugegeben. Nun wird der aktive Zustand der Mitochondrien erreicht und eine
erhöhte Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs beobachtet, die so lange anhält, bis das
zugegebene ADP nahezu vollständig in ATP umgewandelt ist. Der Sauerstoffverbrauch nimmt
wieder ab, die Mitochondrien befinden sich im Ruhezustand. Die erneute Zugabe einer
größeren Menge von ADP ergibt das gleiche Bild. Lediglich die Dauer des aktiven Zustandes
und damit die Höhe des Sauerstoffverbrauches verändern sich entsprechend der größeren
Menge an zugegebenem ADP. Nach Erreichen des Ruhezustandes wird die Messung durch
Drücken des Stop-Buttons beendet.
Der Quotient aus den Geschwindigkeiten im aktiven und im Ruhezustand wird als
Atmungskontrollkoeffizient bezeichnet. Aus der zugegebenen ADP-Menge und der im
aktiven Zustand verbrauchten Sauerstoffmenge lässt sich der ADP/O-Quotient errechnen
(siehe Rechenbeispiel).
16
Versuchsplan
Versuchsnummer
1.2.1
1.2.2
Benutztes Substrat
3-Hydroxybutyrat
Succinat
Testpuffer "H"
1,7 ml
-
Testpuffer "S"
-
1,75 ml
100 µl
50 µl
Mitochondriensuspension
Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist!
ADP 0,25 M
1 µl
0.5 µl
Warten bis der Sauerstoffverbrauch wieder abnimmt und der Ruhezustand erreicht ist!
ADP 0,25 M
2 µl
1 µl
17
Hemmung der ATP-Bildung durch Inhibitoren und Entkoppler
2.1
Hemmung der ATP-Synthese und des ADP/ATP-Austausches / Entkopplung
durch 2,4-Dinitrophenol
Wie in den vorherigen Versuchen (1.2.1 und 1.2.2) wird einer Suspension von
Rattenlebermitochondrien in Testpuffer, der 20 mmol/l 3-Hydroxybutyrat enthält, zunächst
ADP-Lösung zugesetzt. Nach Erreichen der Ruhephase wird der Inhibitor Oligomycin und
etwa 1 min später weiteres ADP zugegeben, das nun keinen Effekt mehr zeigt. Erst die Zugabe
des Entkopplers 2,4-Dinitrophenol stimuliert den Sauerstoffverbrauch.
Versuchsplan
Versuchsnummer: 2.1
Testpuffer "H"
1,7 ml
Mitochondriensuspension
100 µl
Warten, bis eine konstante Abnahme des O 2-Verbrauchs erreicht ist!
ADP 0,25 M
1 µl
Warten, bis der O2-Verbrauch wieder abnimmt und der Ruhezustand erreicht ist.
Oligomycin (1 mg/ml)
1 µl
ca. 1 min warten
ADP 0,25 M
1 µl
ca. 1 min warten
2,4-Dinitrophenol (10 mM)
2 µl
18
2.2
Hemmung des Elektronentransports
Rattenlebermitochondrien werden in den jeweils angegebenen Substrat-Pufferlösungen
suspendiert. Sobald ein konstanter Sauerstoffverbrauch zu beobachten ist, wird die Atmung
durch Anwendung des Entkopplers CCCP aktiviert. Die Zugabe von Inhibitoren und weiteren
Substraten erfolgt entsprechend dem Versuchsplan.
Versuchsplan
Versuchsnummer:
2.2
Benutztes Substrat: 3-Hydroxybutyrat
Testpuffer "H"
1,7 ml
Mitochondriensuspension
100 µl
Warten bis eine konstante Abnahme des Sauerstoffverbrauchs erreicht ist!
CCCP 0,5 mM
1 µl
ca. 40 sec warten
Rotenon (1 mg/ml)
1 µl
ca. 2 min warten
Succinat 0,1 M
10 µl
ca. 40 sec warten
Antimycin A (2mg/ml)
1 µl
19
Versuchsplan
Versuchsnummer
2.3
benutzte Substrate
Succinat
benutzte Inhibitoren
Malonat
Testpuffer “S”
1,75 ml
Mitochondriensuspension+
50 µl
Warten bis eine konstante Abnahme des
Sauerstoffverbrauchs erreicht ist
CCCP 0,5 mM
1 µl
Ca. 40 sec warten
Malonat 1,0 M
10 µl
20
D.
AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION
1.
Berechnung des ADP/O-Verhältnisses und des Atmungskontrollkoeffizienten
Die Auswertung der Versuche erfolgt entsprechend den Abbildungen 4a und 4b. Entnehmen
Sie die Resultate dem bei der Versuchsdurchführung ausgedruckten Diagramm und
übertragen Sie diese in die entsprechenden leeren Kästchen der Abb. 4 (Messdaten).
1)
Berechnen Sie aus den Ergebnissen der Versuche 1.2.1 und 1.2.2 folgende Größen:
a)
die ADP/O-Quotienten für die Substrate 3-Hydroxybutyrat und Succinat
b)
die Reaktionsgeschwindigkeiten (nmol O/(min  mg Protein)) für den aktiven Zustand
und den Ruhezustand mit beiden Substraten
c)
2)
die Atmungskontrollkoeffizienten für beide Substrate.
Vergleichen Sie die Geschwindigkeiten des Sauerstoffverbrauchs im aktiven Zustand,
die Atmungskontrollkoeffizienten und die ADP/O-Quotienten für die Substrate
3-Hydroxybutyrat und Succinat. Warum verwenden wir bei Mitochondrienversuchen
3-Hydroxybutyrat statt NADH?
2.
Einfluss von Inhibitoren und Entkoppler auf den Sauerstoffverbrauch von
Rattenlebermitochondrien
1)
zu Versuch 2.1:
a)
Welches ist Angriffspunkt für den Inhibitor Oligomycin?
b)
Warum lässt sich in Anwesenheit des Oligomycins die Aktivität der Atmung zwar durch
Entkoppler, nicht aber durch ADP steigern?
2)
a)
zu Versuch 2.2:
Worin unterscheidet sich die Wirkung der in dieser Versuchsgruppe benutzen
Inhibitoren von der Wirkung des Oligomycins des vorherigen Experiments?
b)
Ordnen
Sie
die
einzelnen
Inhibitoren
den
entsprechenden
Enzymen
zu!
Inwieweit lässt sich diese Zuordnung durch das Versuchsergebnis bestätigen?
3)
zu Versuch 2.3:
Malonat ist ein kompetitiver Inhibitor. Welche Eigenschaften sind für kompetitive
Inhibitoren charakteristisch?
21
Rechenbeispiel
zu Aufgabe 1.1a)
Der ADP/O-Quotient gibt das Verhältnis von ADP-Einsatz und Sauerstoffverbrauch, bezogen
auf atomaren Sauerstoff, an.
ADP/O 
nmol ADP
2  nmol O
2
Der Sauerstoffverbrauch wird aus dem ausgedruckten Diagramm ermittelt, wie in
Abb. 3.dargesellt.
Dazu
werden
im Bereich des 2.
und 3.
Ruhezustandes der
Sauerstoffverbrauchskurve (Abb. 4b) Tangenten angelegt. Die Strecke x entspricht dem
Sauerstoffverbrauch für die vorgegebene Menge an ADP. Die Strecke y in Abb. 3a gibt die
Differenz der Sauerstoffkonzentration von Wasser, welches bei Raumtemperatur mit Luft
gesättigt wurde, und von praktisch sauerstofffreiem Wasser an und entspricht somit einer O 2Konzentration von 250 nmol/ml.
Abb. 4a:
Eichung der Sauerstoffelektrode
Abb. 4b:
Berechnung des Sauerstoffverbrauchs
22
Für den Sauerstoffverbrauch gilt dann:
Sauerstoff verbrauch 
250 nmol
y  ml
 VT  x
Im folgenden Beispiel beträgt das Volumen des Testansatzes (V T) 1,8 ml; y entspricht 7,2 cm
und x = 2,6 cm.
Sauerstoff verbrauch 
250 nmol
7,2 cm  ml
 1,8 ml  2,6 cm
= 162 nmol O2
Die Aktivierung der mitochondrialen ATP-Synthese erfolgte durch Zugabe von 2 µl 0,25 M
ADP-Lösung, das entspricht 500 nmol ADP. Daraus ergibt sich:
ADP/O 
500 nmol
2  162 nmol
 1,54
zu Aufgabe 1b)
Reaktionsgeschwindig keit =
Sauerstoff verbrauch/ min
mg Protein im Ansatz
Der Sauerstoffverbrauch pro Minute wird entsprechend dem Sauerstoffverbrauch in Beispiel
1a) berechnet. Dabei wird jedoch der Ausdruck x (= Sauerstoffverbrauch) durch x/min (=
Sauerstoffverbrauch pro Minute) ersetzt. (Beachten Sie bitte, dass die eingesetzten
Proteinmengen bei den einzelnen Versuchsansätzen differieren können!)
zu Aufgabe 1c)
Atmungskoe ffizient 
Reak tionsgeschwindig k eit im ak tiven Zustand
Reak tionsgeschwindig k eit im Ruhezustan d
23
Ergebnisse
zu Versuch 1.2.1 und 1.2.2
Substrat
Sauerstoffverbrauch
in der aktiven Phase
(nmol O2):
Eingesetzte Menge an
ADP (nmol):
ADP/O-Quotient:
Sauerstoffverbrauch/min
in der Ruhephase
(nmol O2/min):
Sauerstoffverbrauch/min
in der aktiven Phase
(nmol O2/min):
Eingesetzte Menge an
Protein (mg):
Reaktionsgeschwindigkeit
in der Ruhephase
(nmol O/(min · mg Protein)):
Reaktionsgeschwindigkeit
in der aktiven Phase
(nmol O/(min · mg Protein)):
Atmungskontrollkoeffizient:
3-Hydroxybutyrat
Succinat
24
zu Versuch 2.1
zu Versuch 2.2
zu Versuch 2.3
25
E.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
26
F.
ANHANG