ZÜRICH

Research Collection
Doctoral Thesis
Sequenzanalyse des arc-Operons von Pseudomonas aeruginosa
und Charakterisierung von genetisch veränderten OrnithinCarbamoyl-Transferasen
Author(s):
Baur, Heinz
Publication Date:
1989
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-000568881
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ETH Library
Diss. ETH Nr. 9036
SEQUENZANALYSE DES AflC-OPERONS VON
PSEUDOMONAS AERUGINOSA UND
CHARAKTERISERUNG VON GENETISCH VERÄNDERTEN
ORNITHIN-CARBAMOYL-TRANSFERASEN
ABHANDLUNG
zur
Erlangung des Titels
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt
von
HEINZ BAUR
dipl. Natw. ETH
geboren
von
am
23. Juli 1949
Gaiserwald SG
Angenommen auf Antrag
von
PD Dr. D. Haas. Referent
Prof. Dr. N. Amrhein, Korreferent
Zürich 1989
ZUSAMMENFASSUNG
1.
Die
Argin1n-Deim1nase-Weges,
des
Gene
Pseudomonas aeruginosa PAO,
eines
Arginln-Abbauwegen
4
von
in
1m chromosomalen arc-Operon lokalisiert.
sind
Hegt auf einem 5 kb-Fragment.
Das Operon
In dieser Arbeit wurde die Nucleotidsequenz der beiden DNA-Stränge dieses
Fragmentes bestimmt. Die Sequenzanalyse ergab 4 offene Leseraster: 3 davon
Strukturgene
die
für
kodieren
arcB
(Arglnin-Deiminase),
arcA
(katabole
(cOTC)) und arcC (Carbamat-Klnase). Die
Orn1th1n-Carbamoyltransferase
aus
der Nucleotidsequenz abgeleiteteten molekularen Massen stimmten mit denje¬
nigen der gereinigten Proteine überein. Der vierte Leseraster,
diert
fUr
sehr
ein
protein, das
am
arcD.
ko¬
hydrophobes Protein, wahrscheinlich ein Transmembran¬
anaeroben
Transport
Arginen beteiligt ist. Die 4 Gene
von
sind als arcDABC-Operon organisiert.
GC-Gehalt
Der
im
Genom
arc-Operon
im
Auf Grund
P.aeruginosa beträgt 67*.
von
arcDABC-Transkript
das
dass
postuliert,
der durchschnittliche GC-Gehalt
beträgt 64%,
Hegt zwischen arcB und arcC.
IR3
und
arcB.
nen
Rho-unabhängigen Terminator des Operons dar.
IR2
arcB hat
Homologien:
signifikante
57%
86%
zueinander
55%.
eine
Identität
stärkere Verwandtschaft
Teil
zweiten
regulierten
starke
vivo
dieser
cOTC
von
Arbeit
Kooperativität
in
nur
CitrulUn
CitrulUn)
in
von
für
E.coli
argF und argl. die
von
arcB
und
argl
be¬
(arcB)
von
mit
cOTC
abgeleitet, dass
Daraus wurde
Untersuchungen
Enzym
(CP)
(phosphorolytische
Richtung
CP)
wirken.
durch
das
argF-Enzym (aOTC)
Die
anabole
allosterisch
der
an
Das
CarbamoylPhosphat
und
In vivo ebenfalls unidirektionell.
für
nur
von
von
(argF)
durchgeführt.
katabolen
wird
argF
P.aeruginosa mit dem argF-Enzym
Ornithin
der
mit
P.aeruginosa besteht.
von
wurden
positive
aOTC
35%.
von
P.aeruginosa
Identität
Identität
Die
von
der cOTC
E.coli als mit dem argF-Enzym
von
Im
Aminosäurevergleich
ergab eine
P.aeruginosa
aufweisen.
Identität
Der
IR1
stellt wahrscheinlich ei¬
die Produkte
K12. Dieser Stamm hat 2 OTC-Isoenzyme,
trägt
"Inverted
von
liegt zwischen arcA
arc-Gene mit Sequenzen der EMBL-Genbank brachte
Der Vergleich der
arcB
Stellen
(IR) stabile Haarnadel strukturen enthält:
Repeats"
Sequenzanalyse wird
der
3
an
und
das
eine
kann
Spaltung
Reaktion
katalysiert;
zeigt
(Bildung
in
von
von
Enzym wirkt
Stammes PAO
Mutanten des
siert.
In
untersuchten Mutanten
5
pression
der
einer
zu
arcB(Su)-Gene
der
Punktmutation
Gly
oder
ist
eine
führte
Um
höhere
Einfluss
die
ergab
Austausch
cOTC
konnte,
von
CP;
einzige
Glu-106 durch
Gegensatz
1m
Der
katalysleren.
für
eine
jeweils
zum
Reaktion
Affinität
Glu-106
von
entsprechenden
ersetzt.
Die
Mutation
Met-102
Grund
zum
dafür
Aminosäure-Austausch
der
in den
nahe verwandten argF-Genen von P.ae¬
durch gezielte Mutagenese die Aminosäuren
Met-102
Positionen,
Mutationen
bewirkten
argF
in
Glu
+
arcB auf die Kooperativität für CP noch
von
wurden
bzw.
eine
Reduktion
P.aeruginosa
von
durch
Gln-105,
der
den Glu-
an
Glu
oder
Gly
OTC-Akt1vität;
die
führte
zur
Inaktivlerung
Keine der Mutationen führte zu einer slgmolden Sättigungskurve
des Enzyms.
die
CP;
die
fast vollständigen Verlust der Kooperativität.
ruginosa und E.coli
für
anabole
arg£-Mutat1on;
führenden
Mutanten
5
modifizierte
Die
weiter zu untersuchen,
106
dieser
auch die
wesentlich
zum
den
führte.
vivo
eine Mutation in arcB die Sup¬
Arginln-Prototrophie. Die Sequenz¬
zur
selben Adenosinrest,
am
Ala
in
Wildtyp,
bewirkte
Arginln-Auxotrophie
arcB führte
in
Suppressor-Mutation
analyse
P.aeruginosa wurden isoliert und charakteri¬
von
Enzyme
die
wie
zeigten,
eine
argF-Wi ldtyp-Enzyme.
Michaelis-Menten-Kinetik für CP.
Genfusionen
E.coli
dieselbe
wiesen,
bride
aktiven
zu
argF-MutatIonen
von
zeigten
P.aeruginosa
von
OTC-Hybriden.
P.aeruginosa
(ein
Quartärstruktur
war
(cOTC)
arcB
zwischen
führten
zu
3
Fusionsplasmide
Trimer) wie das Wildtypenzym
vorhanden,
1m
anderen
protein wurde eine Quartärstruktur gefunden,
spricht
(Nona-
oder
Dodecamer).
Das
In
einem der
nicht.
Im
(aOTC)
waren
von
die
argF auf¬
beiden
dritten
von
imstande,
OTC-Hybride,
2
komplementleren.
keine Kooperativität für CP.
Glu-106
argF
und
OTC-Hy¬
OTC-Hybrid-
die derjenigen der cOTC ent¬
Fusionsprotein
wies
einen
Austausch
der 9 C-terminalen Aminosäuren der cOTC durch die 8 C-term1nalen Aminosäu¬
ren
typ
des argF-Enzyms auf.
(arcB)
reduzierte
Das OTC-Hybrid zeigte eine im Vergleich
Kooperativität
für
CP
und
eine
zum
Wild¬
partielle anabole
Funktion.
Diese Ergebnisse
P.aeruginosa
wichtig sind.
zeigten,
mindestens
dass
2
für die Kooperativität für CP der cOTC von
Faktoren
-
Glu-106
und
der
C-Term1nus
-
2. SUMMARY
The arglnine delminase pathway 1s
of four different arginine catabolic
one
pathways 1n Pseudomonas aeruginosa.
The genes of this pathway
chromo¬
are
somal ly located and orgaMzed into an Operon known as the arc-operon.
The nucleotide
sis
arcA
genes:
of the arc-operon
sequence
revealed four open
delminase),
(arglnine
determined.
was
Sequence analy¬
three of which code for structural
reading frames,
arcB
carbamoyl-
Ornithine
(catabolic
transferase, cOTC) and arcC (carbamate kinase). The subunlt sizes of these
purlfied
based
encodes
which
nucleotide
fourth
A
of
transport
reading frame (arcD)
transmembrane
a
sizes
predicted
the
open
posslbly
protein,
the
in
participates
with
agreement
sequences.
hydrophoblc
very
a
1n
were
enzymes
their
on
The
arginine.
four
protein,
are
genes
organized 1nto the arcDABC-operon.
The G+C content of the DNA of the arc-operon is 64%, while the G+C content
of the genome of P.aeruginosa
arc-operon
arcA
The
and
revealed
arcB.
inverted
these
from
T-rich
IR2
(IRs).
arcB and arcC and
of
structures
repeats
which
sequence
67%. Analysis of the DNA sequence of the
inverted repeats
three
between
stem-loop
predicted
is
typical
is
of
suggest that the mRNAs
is
IR3
stable.
are
located between
downstream of arcC.
1s
IR3
mRNAs
the
1s
IR1
rho-independent
followed
by
a
in
terminators
Escherichia coli.
A
of
comparison
the
arc-gene
sequences
W1th
the
EMBL
gene
bank
revealed
significant homologies between other amino acid metabolism genes and ttrcB.
arcB and the argF-OTC of E.coli K12 display 57% Identity at the amino acid
level.
K12
two 0TC-1soenzymes,
has
which share 86% amino add
nes,
at the amino add
OTC
level.
from P.aeruginosa
organism showed 35%
tabolic OTCs
are
The wild-type
vivo.
(argF) and the catabolic enzyme
aOTC
ge¬
These
results
(arcB)
of
the
same
indicate that anabolic and
ca¬
evolutionarlly closely releated.
cOTC of P.aeruginosa displays
reaction
The
products of the argF and argl
comparison of the amino acids of the anabollc
idently.
for carbamoylphosphate
bolic
A
the
homology. arcB and argl have 55% homology
(CP) and for this
reason
(carbamoylation of Ornithine,
displays
unidirectlonally in vivo.
sigmoidal Saturation kineties
Michaelian-Menten
does
not catalyze the ana¬
giving citrulUne and
kineties
and
also
Pi)
in
functions
Mutants of the arcB gene in P.aeruginosa
the
arcB
anabollc
mutation
that
This
in
cooperativlty
carbamoylphosphate
resembles that of the aOTC.
curve
Glutamate-106
case
of
blnding.
The
loss
of
either
most
resulting
argF
an
arcB(Su)
5
replaced
was
the
P.aeruginosa.
although
analysis
caused
with
variants
in
phenotype
Sequence
replacement
cOTC
in
argF mutation
Arg+
P.aeruginosa.
each
in
alanine.
or
result
an
the
displayed
in
Point mutations in
isolated.
were
could
mutants
suppression of
mutations
present
was
revealed
genes
glycine
these
I.e.
activity.
arcB(Su)
Such
of
genes
of
by
the
Saturation
Thus, Glutamate-106 1s essentlal for the
homotropic cooperativlty of the wild-type enzyme.
By
site-directed
E.coli
from
te
while
and Meth1onine-102,
glycine.
or
the
These
mutations
of
replacement
P.aeruginosa
acids
amino
respectively,
caused
enzyme.
the
encoded
of
of
the
the
OTCs
of the cOTC,
OTC-activ1ty,
the
1n
glutamate
by
None
argF
replaced by glutama¬
were
reduction
a
Meth1onine-102
the
inaetivated
of
to Glutamate-106
P.aeruginosa corresponding
and
Glutamlne-105
the
mutagenesis,
aOTC
mutatlonally
from
altered
argF-enzymes displayed sigmoldal Saturation kineties for CP.
Comblning
from
In
E.coli
contrast
were
able
enzymes
no
the
the N-terminal
to
half of
by in vivo recombinatlon produced
the
to
arcB
wild-type
3
gene,
same
cooperativity
for
Glutamate-106
hybrid enzyme had
trimeric
CP
from
a
structure
binding.
the
One
native
as
of
arcB.
the argF(E)
these
the
hybrid
other
In
this hybrid the 9 C-term1nal
(arcB) had been replaced with the 8 C-terminal
lost part of the sigmoidal
hybrid
genes
Two OTC hybrid
enzyme
enzymes
did
argF(E)
hybrid enzymes.
arcB-argF(E)
nonameric (or dodecamerlc) structure,
arcB wild-type enzyme.
This hybrid had
active OTC
in P.aeruginosa.
complement argF(P) mutations
had the
half of
arcB and the C-terminal
not.
and
showed
contalned
The
third
like that of the
amino acids of cOTC
resldues of aOTC (argF(E)).
CP Saturation curve.
that the C-term1nus of wild-type cOTC has a role
in CP binding.
indicating