Geno- und Pathotypisierung von Pseudomonas aeruginosa
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Geno- und Pathotypisierung von Pseudomonas aeruginosa Die zunehmende Verfügbarkeit umfangreicher Sequenzinformationen für verschiedenste Organismen bildet eine wesentliche Grundlage zum Einsatz von DNA-Array Technologien. Mit Hilfe von Oligonukleotidsonden-Arrays ist es möglich, neue medizinische Diagnostikfelder zu erschließen. Hauptziele in diesem Zusammenhang stellen die Gewinnung eines hohen diagnostischen Informationsgehaltes in kurzer Zeitdauer sowie eine kostengünstige, leicht zu handhabende, aber dennoch robuste Experimenttechnik dar. Der hier vorgestellte DNA-Test zur Genound Pathotypisierung von Pseudomonas aeruginosa mit dem ArrayTube System ist ein Beispiel für die gute Erreichbarkeit der skizzierten Ziele. gung an nosokomialen (im Krankenhaus erworbenen) Infektionen. Zusätzlich hat P. aeruginosa bei Mukoviszidose-Patienten durch die chronische Besiedelung der Atemwege einen entscheidenden Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung. Aufgrund der großen Anpassungsfähigkeit des Bakteriums ist die effiziente Behandlung von P. aeruginosa-Infektionen vor allem auf Intensivstationen häufig problematisch. Es ist daher entscheidend, die Ausbreitung des Erregers von Patient zu Patient möglichst zu unterbinden bzw. im Fall einer Verschleppung den Verbreitungsweg rasch aufzuklären. Um dies zu erreichen und entsprechende Maßnahmen ergreifen zu können, muss eine schnelle und sichere Typisierung des jeweiligen P. aeruginosa-Stammes gewährleistet sein. Medizinisch-biologischer Hintergrund Pseudomonas aeruginosa ist ein gramnegatives Bakterium mit ubiquitärer Verbreitung. Als opportunistisches Pathogen kann P. aeruginosa eine hohe Morbidität bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem verursachen, beispielsweise durch seine häufige Beteili- Diagnostik Die Typisierung von P. aeruginosa Isolaten erfolgte bisher meistens durch Untersuchungen des Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP). Derartige Untersuchungen erfordern einen so hohen Aufwand an Zeit und tech- nischen Vorkenntnissen, dass sie für Routinelabors ungeeignet sind. Es war daher das Ziel, basierend auf der ArrayTube (AT) Technologie von CLONDIAG einen schnellen und einfachen Test zu entwickeln, mit dem auch ein nicht spezialisiertes mikrobiologisches Routinelabor innerhalb eines Arbeitstages eine Typisierung von P. aeruginosa durchführen kann. Die ArrayTube (AT)Plattform wurde aufgrund ihrer einfachen Handhabung, Flexibilität und der erfolgreichen Anwendung in anderen diagnostischen Assays gewählt [1, 2]. Für das Array zur Typisierung der P. aeruginosa-Isolate wurden geeignete Oligonukleotid-Sonden auf Basis der Sequenzbereiche von 14 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) aus konservierten P. aeruginosa Genen ausgewählt. Weitere Sonden des Arrays enthalten spezifische DNA-Sequenzen aus Geninseln und Pathogenitätsfaktoren wie exoS, exoU oder Flagellin. Diese zusätzlichen Sequenzen ermöglichen eine noch differenziertere Typisierung, die in der Gesamtheit aller verwendeten Faktoren eine Genauigkeit von >99,99 % erreicht. Abb.1: Experimenteller Ablauf des P. aeruginosa-DNA Patho- und Genotypisierungstests auf Basis der ArrayTube-Plattform BIOforum 06/2004, S.48–49, GIT VERLAG GmbH & Co. KG, Darmstadt, www.bioforum.de Abb.2: Detektionsmuster (nach Hybridisierung im ArrayTube) dreier P. aeruginosa-Stämme. In der unteren Chiphälfte (gelb) befinden sich die SNP-Sonden, in der oberen Hälfte (blau) die Sonden mit spezifischen DNA-Sequenzen aus verschiedenen Pathogenitätsfaktoren und Geninseln. A und B stammen von klonalen Varianten, C von einem anderen P. aeruginosa Klon. Ergebnisse Zur Etablierung eines zuverlässigen Tests mit dem AT-System wurde parallel zu den Array-spezifischen Parametern (Sondenauswahl, -optimierung und Detektionsverfahren) auch die Methoden zur Probengewinnung der P. aeruginosa Stämme optimiert. Ausgehend von einer Agarplatte mit P. aeruginosa ist es möglich, einen Stamm innerhalb von 6 Stunden zu typisieren. Die Amplifikation aller zu untersuchenden 50 DNA-Sequenzen kann dabei in einer einzigen Multiplex-PCR direkt aus den gewaschenen Bakterien erfolgen. Die Detektion erfolgt durch eine kalorimetrische Farbreaktion im AT-Lesegerät (Abb. 1). Die komplette Arbeitstation mit PC und Software ermöglicht neben automatischer Detektion und Analyse auch die Verwaltung und den Austausch der erhaltenen Daten. Zur Durchführung des Tests sind außer dem AT-Lesegarät und der Software nur Standard-Laborgeräte erforderlich, so dass eine P. aeruginosa-Typisierung in jedem Routinelabor möglich ist. Auf die nosokomiale Ausbreitung eines Stammes kann so rasch und effizient reagiert werden. Für die schnelle und automatische Analyse von ArrayTubes im Routinebetrieb steht außerdem eine Auslesestation ATS zur Verfügung, die den aktuellen EURichtlinien zur in-vitro Diagnostik entspricht. Drei Typisierungsbeispiele von P. aeruginosa-Stämmen sind in Abbildung 2 dargestellt. Neben der Einfachheit und Schnelligkeit des ArrayTube-Assays liegt ein weiterer Vorteil in der Flexibilität dieses Systems. In nachfolgenden AT-Chip-Generationen können zusätzliche P. aeruginosa-Sequenzen, z. B. für den Nachweis bisher unbekannter Pathogenitätsfaktoren, sofort aufgenommen werden. Das Ergebnis der Typisierung wird automatisch in einem universellen, austauschbaren Format abgelegt. Durch eine breite Nutzung des Tests von vielen Anwendern wird es zusätzlich möglich, anhand des SNP-Genotyps das pathogene Potential verwandter Stämme zu vergleichen und so neben einer Hygienekontrolle auch einem behandelnden Arzt Entscheidungshilfen zur Therapie zu geben. Referenzen [1] DNA-based detection of Staphylococcus aureus resistance genes, Genome Letters 2, 116–128 (2003) [2] DNA-Array-Technologie für die Diagnostik, BIOforum 25, 636–637 (2002) Dr. rer.nat. Lutz Wiehlmann Wissenschaftlicher Mitarbeiter Benny Siebert Technischer Angestellter Prof. Dr. Dr. Burkhard Tümmler Leiter der Klinischen Forschergruppe Medizinische Hochschule Hannover Klinische Forschergruppe OE6711 30623 Hannover [email protected] Dr. rer.nat. Gerd Wagner Dipl. biol. Peter Slickers Elke Müller CLONDIAG chip technologies Löbstedter Str.103-105 07749 Jena
