Molekulargenetischer Nachweis und Genotypisierung

Molekulargenetischer Nachweis
und Genotypisierung von HPV
Dr. Sabine Sussitz-Rack
Institut für Labordiagnostik und
Mikrobiologie
Vorstand: Prim. Prof. DDr. Pranav Sinha
Humanes Papillomavirus HPV
HPV ist ein kleines ds-DNA-Virus
mit lediglich 8 Genen.
Die genetische Information
ist in nicht umhüllten
Capsiden verpackt.
Humanes Papillomavirus HPV
6 dieser Gene codieren für Proteine, die für
die Virusvermehrung gebraucht werden
(frühe Proteine E1-E5).
Die beiden anderen Gene
sind für den Zusammenbau
des Capsids notwendig
(L1 und L2) – enthält
Epitope, die für die
Immunneutralisation
notwendig sind.
Virusgenom
Für die kanzerogene
Wirkung verantwortlich
sind die Onkogene E6
und E7
E6 Protein bindet an p53
und führt auch zur
Telomeraseaktivierung
E7 Protein interagiert mit
p21 und dem Rb Protein
und aktiviert Gene für die
Zellproliferation
Humanes Papillomavirus HPV
HPV ist extrem heikel in der Auswahl
seiner Zielzellen. Infiziert werden
ausschließlich die basalen Zellen von
Haut oder Schleimhautepithel.
Diese Zellen liegen der Basalmembran
an und sind als „basale Stammzellen“
in der Lage, Epithelzellen zu ersetzen.
Sie proliferieren
Infektionsverlauf
Die meisten HPV-Infektionen verlaufen
transient über circa 4-20 Monate, wobei
Hochrisiko-Viren länger zu persistieren
scheinen als Niedrigrisiko-Viren
Trottier H., Franco E. L. The epidemiology of genital
human papillomavirus infection Vaccine. 2006 Mar
30; 24 Suppl 1: S1-15
Abstrichproben
Für den Nachweis des humanen Papilloma
Virus aus Urogenitalproben kommt der
sorgfältigen Probengewinnung eine
wesentliche Bedeutung zu,
da die Erreger intrazellulär in
Zylinderepithelzellen liegen und Zellmaterial
im Abstrich enthalten sein muss.
Abstrichproben
Kein anderes als das von
uns empfohlene und
validierte Entnahmebesteck
verwenden, da nur damit
eine optimale Durchführung
des Tests möglich ist.
Bürste bis auf den Boden
des Transportröhrchens
einführen. Schaft an der
Bruchlinie abbrechen und
Röhrchen fest verschließen.
Abstrichproben
Ein negativer HPV-Befund schließt das
Vorhandensein viraler DNA aber nicht
vollständig aus:
a. zu wenig Epithelzellen im Abstrich (Ort und
Qualität des Abstrichs)
b. geringe Virusproduktion – die
Virusproduktion unterliegt zum Teil starken
Schwankungen
Bei zytologischem Verdacht empfiehlt sich
eine Kontrolluntersuchung der PCR in einigen
Wochen.
Wahl der Teste
1.
2.
3.
1.
Obsolet, da zu wenig empfindlich
Southern Blot
In-situ-Hybridisierung
Immunhisto- oder Zytochemie
Empfohlen durch Fachgesellschaften
PCR
Vorteil: empfindlich, spezifisch, HPV Typen werden erfasst
Nachteil: störanfällig, kein Grenzwert definiert, ab dem klinische
Relevanz
2.
Hybrid Capture Assay
Vorteil: schnell, spezifisch, 18 HPV Typen werden erfasst
Nachteil: Diskriminierung nur zwischen low risk und high risk Typen
möglich, keine Genotypisierung
PCR
Detektion und
Typisierung des PCR
Produktes mittels
RFLP und Gel
Dot Blot Assay
EIA oder
Reversen Line Blot
Assay möglich
PCR – reverser Line Blot Assay
PCR
Patientenprobe
Typ
16
18
31
Sichbarmachung
der Infektion
HPV Type Express – Bio Products
MY09/11 single step
PCR mit allel
spezifischer reverser
Hybridisierung
(Reverse Line Blot
Assay – LBA)
HPV Type Express
HPV Type Express
Low risk Typen:
6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81
High risk Typen:
16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,
73,82
und 26,53,66
Somit 11 low risk Typen und 18 high risk
Typen
Hybrid Capture Assay (HC2)
Beim Hybrid Capture® II
HPV-Test (Digene, USA)
handelt es sich um ein
Signal-verstärkendes
Hybridisierungsverfahren,
das im Unterschied zur
PCR ohne Amplifikation
des nachzuweisenden
Erreger-Genoms
auskommt
Aussage des Hybrid
Capture HPV-Tests
Die Hybridiserung der Patientenproben erfolgt mit 2
verschiedenen 'Sonden-Cocktails'.
Sonde A erkennt die HPV-Typen 6, 11, 42, 43, 44, die mit
einem geringen Krebsrisiko assoziert sind ('Low
oncogenic risk').
Sonde B reagiert mit den HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, bei denen das Krebsrisiko
als intermediär bis hoch eingestuft wird ('High oncogenic
risk').
Aussage des Hybrid
Capture HPV-Tests
Der Test erlaubt damit nicht nur die
Aussage, ob eine HPV-Infektion
vorliegt, sondern - im positiven Fall auch, ob die Infektion durch Viren der
'Low Risk' und/oder der 'High Risk'Gruppe verursacht ist.
PCR versus HC2-Assay
HPV Typisierung von hoher Relevanz, da die Persistenz
eines Hochrisiko-HPV-Typs ein deutlich erhöhtes
kanzerogenes Risiko darstellt.
10 Jahresinzidenz einer schweren Dysplasie beim
Nachweis von HPV 16 oder 18 beträgt 17% bzw. 13%,
hingegen bei einem HC2-High-Risk-positivem Ergebnis
nur 3% (Khan et al., J Natl Cancer Inst 2005; 97: 1072-1079)
Genotypisierung von HPV-Typen ist nur mit der PCR
möglich und nicht mit dem HC2-Assay
PCR versus HC2-Assay
Der Direkthybridisierungstest (HC2Assay) erfasst einige HPV-Typen nicht,
die eine schwere Dysplasie und
Zervixkarzinome verursachen z.B. HPV
53, HPV 66, HPV 73, HPV 82.
HPV Typisierung mittels PCR
Differenzierung zwischen Reaktivierung
bei persistierender HPV-Infektion und
Neuinfektion/Reinfektion mit einem
anderen Genotyp
Nachweis einer Infektion mit mehreren
HPV-Typen
HPV-Genotypisierung
Risikoabschätzung durch Differenzierung
kanzerogener HPV Typen
Überwachung der Persistenz einer HR-Infektion
als wichtigem Progressionsmarker (S. Venturoli et al.
Journal of Medical Virology 2008; 80: 1434 – 1440)
Prognoseabschätzung – Behandlungs-Outcome –
HPV 16 und 18 erhöhtes Rezidivrisiko (A. R. Kreimer
et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006; 15/5: 908-914)
zuverlässige Detektion HPV-negativer Proben mit sehr
hohem negativen prädiktiven Aussagewert