Forschungsbericht - Medizinische Hochschule Hannover

LABORATORIUMSMEDIZIN
Institut für Molekularbiologie
Direktor: Prof. Dr. Achim Gossler
Tel.: 0511 / 532-4322 • E-Mail: [email protected] • www: mh-hannover.de/218.html
Forschungsprofil
Der Arbeitsschwerpunkt der Abteilung liegt auf der Analyse molekularer Mechanismen, die der Ausbildung des Körperplans sowie der Differenzierung und Organogenese zugrunde liegen. Innerhalb
dieser Thematik werden grundlegende musterbildende Prozesse einerseits, die Entwicklung einzelner
Organe und ihrer differenzierten Zelltypen andererseits mit molekularbiologisch-molekulargenetischen
Techniken untersucht. Darüber hinaus sind grundsätzliche Fragen und Mechanismen der Zellzykluskontrolle, auch im Hinblick auf ihre Bedeutung für die Tumorentstehung, zentrale Themen einer
Arbeitsgruppe, die in Kooperation mit der Abteilung Gastroenterologie und Hepatologie besteht.
Als Modellorganismus dient die Maus. Transgene Mäuse sowie durch homologe Rekombination
hergestellte Mutanten sind wesentlicher Bestandteil aller bearbeiteten Fragenkomplexe und werden
in der Abteilung hergestellt.
Ausgewähltes Forschungsprojekt
Inhibition proteolytischer Mechanismen des Abbaus von Zellzyklusinhibitoren (p27)
zur Hemmung von Tumorwachstum und -progression
Die erheblichen Fortschritte im Bereich der Molekular- und Zellbiologie haben in den letzten Jahren zu
einem Paradigmenwechsel in der Medizin geführt. Die klassischen, auf empirischen Untersuchungen
beruhenden Behandlungskonzepte beginnen neuen Therapieansätzen zu weichen, die mit hoher Spezifität molekulare Mechanismen der Krankheitsentstehung beeinflussen und bereits zu grundlegenden
Verbesserungen der Therapie einiger menschlicher Erkrankungen, wie zum Beispiel von Leukämien
(Glivec ), geführt haben.
Die Herstellung von neuen molekularen Pharmazeutika, welche Phase I/II Studien der klinischen
Erprobung erreichen, erscheint vor diesem Hintergrund von besonderem Interesse.
Ein für translationale Arbeiten besonders wichtiger Bereich medizinischer Grundlagenforschung
umfasst die Kontrolle zellulärer Wachstums- und Teilungsprozesse. Cycline und ihre Bindungspartner
die Cyclin-abhängigen Kinasen (cyclin dependent kinase, cdk) sind grundlegende Regulatoren der
Zellproliferation. Nach Aktivierung dieser Kinasen beginnt die Zelle mit der Replikation der zellulären
DNA und initiiert die Zellteilung. Alle menschlichen Tumoren weisen Veränderungen in der Expression
und Aktivität dieser Proteinkomplexe auf. Aufgrund der erheblichen Bedeutung der Expression von
Cyclin/Kinase-Komplexen für die Kontrolle der Zellteilung steht die Aktivität dieser Enzyme unter der
direkten Kontrolle einer Gruppe von Proteinen, die als Cyclin/Kinase-Inhibitoren (CKI) bezeichnet
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wird. Diese Proteine können durch direkte Bindung an CDKs die katalytische Aktivität der Kinase
inhibieren und hierdurch die Teilung der Zelle verhindern. Aufgrund dieser Funktion wirken einige
CKI Proteine (p19 und p27) als außerordentlich potente Tumorsuppressorproteine, deren Expression
in vielen Tumoren deutlich vermindert ist.
Ein besonders stark als Tumorsuppressorprotein wirkendes CKI stellt das p27kip1 Protein dar. Die
Expression von p27 ist in praktisch allen bislang untersuchten Tumoren deutlich vermindert (Darm,
Magen, Leber, Brust, Pankreas, Prostata, Lymphome, verschiedene Leukämien) und korreliert direkt
mit der Prognose der Patienten. Gleichzeitig weisen Mäuse, in denen das p27 Protein deletiert wurde
(p27-/-), eine erhöhte Tumoranfälligkeit nach Behandlung mit chemischen Karzinogenen in praktisch
allen Organen auf. Bedeutend ist hierbei, dass der Verlust von p27 mit der Aktivierung anderer, wichtiger an der Tumorentstehung beteiligter Onkogene kooperiert. Hierzu zählen das Pten (Prostata),
Retinoblastoma (Hypophyse), Inhibin (Gonaden), APCmin (Kolon) und Eµ-myc (Lymphom) Gen. Es gilt
daher als gesichert, dass der Verlust von p27 eines der zentralen Ereignisse in der Entstehung einer
Vielzahl menschlicher Tumoren darstellt.
Bemerkenswerterweise und im Gegensatz zu vielen anderen Tumorsuppressorproteinen sind
bislang praktisch keine Mutationen des genomischen p27 Lokus identifiziert worden. Der zentrale
Mechanismus, der zur verminderten Expression des p27 Proteins in menschlichen Tumoren führt,
ist der erhöhte, proteolytische Abbau des Proteins durch Multiubiquitinylierung und nachfolgende
Degradation durch das Proteasom. Kontrolliert wird der Abbau von p27 durch Phosphorylierung des
Proteins an einem konservierten Threonin (T187 in Maus und Mensch), welches nach Phosphorylierung
die Bindung von p27 an das F-Box Protein skp2 ermöglicht. Skp2 ist Bestandteil eines sog. E3 Ligase
Komplexes, welcher die Polyubiquitinylierung und damit den Abbau des Proteins induziert. Dieser
enge Zusammenhang zwischen gesteigertem Abbau, verminderter Expression und schlechter Prognose
des Patienten führte zu der Hypothese, dass durch Verhinderung des p27 Abbaus die Teilung von
Tumorzellen verhindert werden könnte. Im Gegensatz zur somatischen Gentherapie ist hierfür jedoch
nicht die Einschleusung eines „gesunden“ Gens in die Tumorzelle notwendig. Vielmehr sollte durch
die Blockade der enzymatischen Prozesse, die zum Abbau des Proteins führen, eine Stabilisierung
der Expression erreicht werden. Das p27 Protein und die Prozesse, die zu seinem Abbau führen, sind
somit geeignete Angriffspunkte für eine „pharmakologische Gentherapie“.
Voraussetzung für die Untersuchung dieser Hypothese ist die Erzeugung geeigneter Tiermodelle,
in denen die Auswirkung eines verzögerten oder blockierten Abbaus des p27 Proteins auf die Tumorentstehung untersucht werden kann. Derartige Tiermodelle sind in unserer Arbeitsgruppe etabliert
worden. In einem dieser Modellsysteme ist der Abbau des p27 Proteins durch Phosphorylierung an
T187 durch Mutation in T187A blockiert. Darüber hinaus haben unsere Arbeiten belegt, dass der skp2
vermittelte Abbau von p27 in Leber, Lungen und Nierenepithelien einen zentralen Mechanismus zur
Kontrolle von Zellteilung und Zellwachstum darstellt. Des Weiteren gelang die biochemische Beschreibung eines weiteren Abbaumechanismus des p27 Proteins, der die Stabilität des Proteins insbesondere
in ruhenden Zellen kontrolliert. In aktuellen Arbeiten zeigt die Arbeitsgruppe, dass der Abbau von p27
die Adenom-Karzinom-Sequenz von intestinalen Tumoren kennzeichnet und dass die Stabilisierung
von p27 (durch Verhinderung des Phosphorylierungs-induzierten Abbaus) die Tumorprogression an
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diesem kritischen Übergang hemmt. Diese Arbeiten belegen den „proof of principle“ für einen neuen
Therapieansatz, in dem die Verhinderung des proteolytischen Abbaus von p27 zu einer Blockade der
Tumorprogression führt.
Basierend auf diesen Ergebnissen hat unsere Arbeitsgruppe zelluläre Assaysysteme etabliert,
mit deren Hilfe Substanzen identifiziert werden können, die den Abbau des p27 Proteins blockieren.
Eines dieser Assaysysteme beruht auf der stabilen Expression eines p27-GFP Fusionsproteins in
menschlichen Tumorzelllinien. Nach Behandlung der p27-GFP positiven Zellen mit Substanzen, die
den Abbau von p27 hemmen, kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenz, was mit Hilfe eines automatisierten Systems detektiert werden kann. Dieses Assaysystem ist bereits zur Analyse von mehr
als 8000 Wirkstoffkandidaten sowie einer Sammlung von Naturstoffen am Helmholtz-Zentrum für
Infektionsforschung (HZI) eingesetzt worden.
Im Rahmen dieser Untersuchungen sind mehrere Wirkstoffkandidaten identifiziert worden, die zu
einer Stabilisierung des p27 Proteins in Tumorzellen führen. Diese Substanzen befinden sich derzeit in
verschiedenen Phasen der präklinischen Entwicklung.
HZI150006 reveals a critical role for the tumor suppressor protein p27kip1 in mediating anti-tumor
activities in response to proteasome inhibition. Irina Nickeleit, Steffen Zender, Florenz Sasse, Robert
Geffers, Gudrun Brandes, Inga Sörensen, Heinrich Steinmetz, Stefan Kubicka, Teresa Carlomagno,
Dirk Menche, Jan Buer, Achim Gossler, Michael P. Manns, Markus Kalesse, Ronald Frank and Nisar
P. Malek (in revision).
Projektleiter: Nisar P. Malek; beteiligte Wissenschaftler: Irina Nickeleit; Steffen Zender; Förderung:
Deutsche Krebshilfe
Weitere Forschungsprojekte
Identifizierung des molekularen Mechanismus durch den p27kip1 die Differenzierung
von Kolonkarzinom beeinflusst
Projektleiter: Nisar P. Malek; Förderung: DFG (Einzelantrag)
Hepatozelluläres Karzinom: Kontrolle proteolytischer Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase in Leberepithelien
Projektleiter: Nisar P. Malek; Förderung: DFG (KFG)
Gentherapeutische Strategien zur Verbesserung der Hepatozyten-Transplantation
Projektleiter: Nisar P. Malek; Förderung: DFG (SFB 738)
Das F-Box Protein skp2 als potentielles Target innovativer Tumortherapien
Projektleiter: Nisar P. Malek; Förderung: Deutsche Krebshilfe im Rahmen des Max-Eder-Programmes
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Exzellenzinitiative an der MHH (REBIRTH)
Leiter der AG Zellproliferationskontrolle: Nisar P. Malek; Förderung: DFG
Mechanismen der Cyclin E induzierten genetischen Instabilität in der Entstehung
maligner Tumoren
Projektleiter: Nisar P. Malek; Förderung: Sander-Stiftung
Identifizierung, funktionelle Analyse und Entwicklung von medizinischen Wirkstoffkandidaten
Projektleiter: Nisar P. Malek; Förderung: BioRegio Förderung des BMBF
Molekulargenetische Analyse des Homeoboxtranskriptionsfaktors Noto: Regulation
und Zielgene
Projektleiter: Achim Gossler; Förderung: DFG
Analyse der biochemischen Äquivalenz der Notchliganden Dll1 und Dll3
Projektleiter: Achim Gossler; Förderung: DFG
Struktur-Funktionsanalysen des Notchliganden Dll1
Projektleiter: Achim Gossler; Förderung: DFG
Analyse der Rolle von Notch Signalen im paraxialen Mesoderm mittels konditioneller
Notchaktivierung
Projektleiter: Achim Gossler; Förderung: Grundausstattung
Untersuchungen zur Funktion des Notchliganden Dll1 im vaskulären Endothel
Projektleiter: Achim Gossler; Förderung: DFG (KFG)
Exzellenzinitiative an der MHH (REBIRTH)
Untersuchungen zur Funktion der Notchsignalübertragung im Lungenepithel
Projektleiter: Achim Gossler; Förderung: DFG
Funktionelle Charakterisierung spezifisch im Darmepithel exprimierter Gene
Projektleiter: Achim Gossler; Förderung: DFG (GK705), Grundausstattung
Die Funktion von Uncx4.1 in der anterior-posterioren Polarisierung der Somiten der
Maus
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: DFG
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Funktionelle Analyse des Tbx18 Gens in der Somitogenese der Maus
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: DFG
Analyse der funktionellen Redundanz der T-Box-Transkriptionsfaktoren Tbx15 und
Tbx18 in der Entwicklung der Gliedmaßen in der Maus
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: DFG
Funktionelle Analyse des Tbx20 Gens in der Herzentwicklung der Maus
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: EU
Funktionelle Analyse von T-Box Genen in der Entwicklung des Innenohrs der Maus
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: DFG, Grundausstattung
Funktionelle Analyse von Tbx18 in der Entwicklung des Ureters der Maus
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: DFG
Funktionelle Analyse des Tbx18 Gens in der Entwicklung des Herzens der Maus
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: EU
Funktionelle Charakterisierung des Tbx8 Gens der Maus
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: DFG
Biochemische Charakterisierung von Tbx18
Projektleiter: Andreas. Kispert; Förderung: DFG, Grundausstattung
Exzellenzinitiative an der MHH (REBIRTH):
Funktionelle Analyse von T-Box Genen in der Leberentwicklung
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: DFG
Exzellenzinitiative an der MHH (REBIRTH):
Genetische Analyse der Epikardentwicklung in der Maus
Projektleiter: Andreas Kispert; Förderung: DFG
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Forschungsbericht 2007
LABORATORIUMSMEDIZIN
Originalpublikationen
Airik R, Kispert A. Down the tube of obstructive nephropathies: the importance of tissue
interactions in ureter development. Kidney Int
2007; 72:1459-67.
Andreou AM, Pauws E, Jones MC, Singh MK,
Bussen M, Doudney K, Moore GE, Kispert
A, Brosens JJ, Stanier S. TBX22 missense mutations found in X-linked cleft palate (CPX) patients affect DNA binding, sumoylation and
transcriptional repression. Am J Hum Genet.
2007; 81:700-12.
Beckers A, Alten L, Viebahn C, Andre P,
Gossler A. The mouse homeobox gene Noto
regulates node morphogenesis, notochordal
ciliogenesis, and left-right patterning. Proc Natl
Acad Sci U S A 2007; 104:15765-70.
Cheng H-T, Kim M, Valerius MT, Surendran K,
Schuster-Gossler K, Gossler A, McMahon
AP, Kopan R. Notch2, but not Notch1, is required
for proximal fate acquisition in the mammalian
nephron. Development 2007; 134:801-11.
Estrach S, Cordes R, Hozumi K, Gossler A,
Watt FM. Role of the Notch ligand Delta1 in
embryonic and adult mouse epidermis. J Invest
Dermatol 2007; 1523-1747 (electronic).
Farin HF, Bussen M, Schmidt MK, Singh
MK, Schuster-Gossler K, Kispert A. Transcriptional repression by the T-box proteins Tbx18
and Tbx15 depends on Groucho corepressors. J
Biol Chem 2007; 282:25748-59.
Geffers I, Serth K, Chapman G, Jaekel R,
Schuster-Gossler K, Cordes R, Sparrow DB,
Kremmer E, Dunwoodie SL, Klein T, Gossler A.
Divergent functions and distinct localization of
the Notch ligands DLL1 and DLL3 in vivo. J Cell
Biol 2007; 178:465-76.
Forschungsbericht 2007
Kaelin RE, Kretz MP, Meyer AM, Kispert A,
Heppner FL, Brändli AW. Paracrine and autocrine
mechanisms of apelin signaling govern embryonic and tumor angiogenesis. Dev Biol 2007;
305:599-614.
Kirchhoff TD, Bleck JS, Dettmer A, Chavan A,
Rosenthal H, Merkesdal S, Frericks B, Zender L,
Malek NP, Greten TF, Kubicka S, Manns MP,
Galanski M. Transarterial chemoembolization
using degradable starch microspheres and iodized oil in the treatment of advanced hepatocellular carcinoma: evaluation of tumor response,
toxicity, and survival. Hepatobiliary Pancreat Dis
Int 2007; 6(3):259-66.
Limbourg A, Ploom M, Elligsen D, Sörensen
I, Ziegelhoeffer T, Gossler A, Drexler H, Limbourg FP. The Notch ligand Delta-like 1 (Dll1) is
essential for postnatal arteriogenesis. Circ Res
2007; 100:363-71.
McEvoy JD, Kossatz U, Malek N, Singer,
JD. Constitutive turnover of cyclin E by Cul3
maintains quiescence. Mol Cell Biol 2007;
27(10):3651-66.
Reggiani L, Raciti D, Airik R, Kispert A,
Brändli AW. The prepattern transcription factor
Irx3 directs nephron segment identity. Genes Dev
2007; 21:2358-70.
Schuster-Gossler K, Cordes R, Gossler
A. Premature myogenic differentiation and depletion of progenitor cells cause severe muscle
hypotrophy in Delta1 mutants. Proc Natl Acad
Sci U S A 2007; 104:537-42.
Teppner I, Becker S, Hrabe de Angelis M, Gossler A, Beckers J. Compartmentalised expression
of Delta-like 1 in epithelial somites is required for
655
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the formation of intervertebral joints. BMC Dev
Biol 2007; 7:68.
Wittler L, Shin E-H, Grote P, Kispert A, Beckers A, Gossler A, Werber M, Herrmann BG.
Expression of Msgn1 in the presomitic mesoderm
is controlled by synergism of WNT signaling and
Tbx6. EMBO Rep 2007; 8:784-9.
Yamanaka Y, Tamplin OJ, Beckers A, Gossler
A, Rossant J. A changing genetic hierarchy
regulates morphogenesis in three regions of the
mouse notochord. Dev Cell 2007; 13:884-96.
Übersichtsarbeiten
Kossatz U, Malek NP. p27: tumor suppressor
and oncogene ...? Cell Res 2007; 17:832-3.
Malek NP, Greten T, Kubicka S. [Systemic
treatment of liver and biliary tumors]. Internist
(Berl) 2007; 48:46-9.
Nickeleit I, Zender S, Kossatz U, Malek
NP. p27kip1: a target for tumor therapies? Cell
Div 2007; 2:13.
Abstracts
2007 wurden insgesamt 17 Abstracts veröffentlicht.
Habilitationen
Nisar Peter Malek (PD Dr. med.) (Venia Legendi
für das Fach Innere Medizin): Regulation und
Funktion des Tumorsuppressorproteins p27kip1
in der Organregeneration und der Entstehung
maligner Tumoren.
Promotionen
Anja Beckers (Dr rer. nat.): Funktionelle Analyse
des murinen Homeobox Transkriptionsfaktors
Noto.
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Uta Kossatz-Böhlert (Dr. rer. nat.): Die Funktion
von Cyclin E und Skp2 in der Regulation der
Proliferation und genetischen Instabilität in Hepatozyten der Maus.
Aravind Sekhar (PhD): Functional analysis of
genes specifically expressed in the intestinal
epithelium.
Diplom- und Bachelorarbeiten
Anna Trincone (Dipl.-Biol.): Expressionsanalyse
potentieller Zielgene des Homöobox-Transkriptionsfaktors Noto.
Simon Danisch (B.Sc. Biologie): Expressionsanalyse der Komponenten des Wnt-Signalwegs in der
Innenohrentwicklung der Maus.
Wissenschaftspreise
Juliane Feller (Dipl.-Biol.): Posterpreis bei der 17.
Jahrestagung der Gesellschaft für Entwicklungsbiologie (GfE) in Marburg zum Thema “Is Notch1
the generator of the segmentation clock? ”.
Mark-Oliver Trowe (Dipl.-Biol.): Posterpreis bei
der 17. Jahrestagung der Gesellschaft für Entwicklungsbiologie (GfE) in Marburg zum Thema
“Deafness caused by Tbx18 deficiency”.
Reena Singh (M.Sc.): Posterpreis beim Retreat
des MD/PhD-Programms “Molecular Medicine”
der MHH zum Thema “Functional and biochemical analysis of Tbx20 in cardiac development”.
Weitere Tätigkeiten in der Forschung
Achim Gossler (Prof. Dr. rer. nat.): Fachgutachter
für das Fach “Entwicklungsbiologie” im Fachkollegium “Grundlagen der Biologie und Medizin”
der DFG; Reviewertätigkeit für die Zeitschriften
Development, Genes and Development, Nature,
Science.
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Andreas Kispert (Prof. Dr. rer. nat.): Gutachter
der DFG; Gutachtertätigkeit für die Zeitschriften
Proceedings of the National Academy of Science
U S A, Journal of Clinical Investigation, Development, European Journal of Human Genetics,
Gene Expression Patterns.
Nisar P. Malek (PD Dr. med): Gutachter der DFG
und der Robert Bosch Stiftung; Reviewer für die
Zeitschriften: EMBO Journal, Molecular Biology
of the Cell, Oncogene, EMBO Reports, Glia, Cell
Cycle.
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