Dissertation Samaya Burk

Optimierung des Buffy Coat-Volumens bei
Leukozytapheresen
Transfusionsmedizinische und Hämostaseologische Abteilung
der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik
Der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Samaya Marei Burk
aus
Vollersode
Als Dissertation genehmigt von der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
Prof. Dr. E. Strasser
Gutachter:
Prof. Dr. R. Eckstein
Tag der mündlichen Prüfung:
19. Dezember 2014
Inhaltsverzeichnis
Seite
1.
Zusammenfassung
1
1.1
Zusammenfassung
1
1.1.1
Hintergrund und Ziele
1
1.1.2
Methoden
1
1.1.3
Beobachtungen und Ergebnisse
1
1.1.4
Praktische Schlussfolgerungen
2
1.2
Summary
3
1.2.1
Background
3
1.2.2
Methods
3
1.2.3
Results
3
1.2.4
Conclusions
4
2.
Einleitung
5
2.1
Zusammensetzung des Blutes
5
2.2
Apherese
6
2.2.1
Arten der präparativen Hämapherese
7
2.2.1.1
Stammzellapherese
7
2.2.1.2
Plasmapherese
8
2.2.1.3
Erythrozytapherese
8
2.2.1.4
Thrombozytapherese
8
2.2.1.5
Granulozytapherese
9
2.2.1.6
Lymphozytapherese
9
2.2.1.7
Monozytapherese
10
2.2.2
Therapeutische Apherese
10
2.2.3
Beschreibung des Buffy Coats bei Leukozytapheresen
11
2.3
Mononukleäre Zellen
13
2.3.1
Monozyten
13
2.3.1.1
Beschreibung der Phagozytose
14
2.3.1.2
Antigenpräsentation der Monozyten
14
2.3.1.3
Zytokinproduktion der Monozyten
16
2.3.2
Lymphozyten
16
2.3.2.1
T-Lymphozyten
16
2.3.2.2
B-Lymphozyten
17
2.4
Dendritische Zellen
18
2.5
Fragestellungen der Studie
21
3.
Material und Methoden
22
3.1
Spendeverfahren
22
3.1.1
Einschlusskriterien
22
3.1.2
Ausschlusskriterien
22
3.1.3
Leukapherese
23
3.2
Der COM.TEC Zellseparator
24
3.2.1
Aufbau
24
3.2.2
Programme des COM.TEC Zellseparators
28
3.2.2.1
Leukozytenseparation
28
3.2.2.2
Das Standard MNC Programm
29
3.2.2.3
Das autoMNC Programm
31
3.3
Der ElutraTM Zellseparator
33
3.4
Durchflusszytometrie
35
3.5
Studiendesign und Spenderkollektiv
37
3.6
Statistische Auswertung
37
3.7
Untergruppen der Datenanalyse
39
3.8
Berechnungen und Formeln
40
4.
Ergebnisse
44
4.1
Spendedaten
44
4.1.1
Blutwerte der Spender
45
4.1.2
Zellgehalt und Sammeleffizienz
47
4.2
Vergleich verschiedener Buffy Coat-Volumina
49
4.2.1
Buffy Coat-Volumenänderung
49
4.2.2
Ergebnisse bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens
53
4.2.2.1
Leukozyten
54
4.2.2.2
CD14+ Monozyten
57
4.2.2.3
Thrombozyten
60
4.2.2.4
Erythrozyten
64
4.2.2.5
Konzentratvolumen
68
4.3
Sammelzyklen
69
4.3.1
Leukozyten
69
4.3.2
CD14+ Monozyten
72
4.3.3
Thrombozyten
74
4.3.4
Erythrozyten
75
4.3.5
Konzentratvolumen
77
4.4
Separationszeit
78
4.5
Mehrfache Monozytenspende
83
4.6
Korrelationen der Ziel- und Restzellen
85
5.
Diskussion
88
5.1
Der COM.TEC Zellseparator
88
5.2
Diskussion der Studienergebnisse
92
5.2.1
Reduktion des Buffy Coat-Volumens
92
5.2.2
Änderung der Sammelzyklen
96
5.2.3
Änderung der Separationszeit
98
5.2.4
Mehrfache Monozytenspende
99
5.2.5
Schlussfolgerung
100
6.
Literaturverzeichnis
102
7.
Abkürzungsverzeichnis
109
8.
Publikationen
111
9.
Danksagung
112
10.
Lebenslauf
113
1
1. Zusammenfassung
1.1 Zusammenfassung
1.1.1 Hintergrund und Ziele
Die Kultivierung dendritischer Zellen aus durch Apherese gewonnenen
Monozyten verlangt eine optimale Produktqualität, weil die Funktion der
dendritischen Zellen durch die Anwesenheit von Restzellen negativ beeinflusst werden kann. Das Standard MNC Programm des COM.TEC Zellseparators der Firma Fresenius Kabi erreicht die höchsten Sammeleffizienzen für die CD14+ Monozyten. Die gewonnenen Konzentrate wiesen
allerdings eine hohe Konzentration an Restzellen auf. Durch die Entwicklung des autoMNC Programmes konnte die Erythrozytenkonzentration
im Apheresat bereits signifikant gesenkt werden. Diese Arbeit soll zeigen,
ob es durch eine gezielte Reduktion des Buffy Coat-Volumens möglich ist,
die Konzentration der Restzellen weiter zu senken und damit die Produktqualität zu optimieren.
1.1.2 Methoden
Bei den 253 mit dem autoMNC Programm des COM.TEC Zellseparators
durchgeführten Separationen wurde das Buffy Coat-Volumen gezielt reduziert. Die Konzentration der Leukozyten, Lymphozyten, Erythrozyten,
Thrombozyten und der Hämatokrit wurden durch Partikelzählung mit dem
Sysmex K1000 Blutbild-Automaten bestimmt. Die Konzentration der
CD14+ Monozyten wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS CaliburTM)
bestimmt. Die statistische Auswertung erfolgte durch das Tabellenkalkulationsprogramm PASW Statistics 18 (SPSS® für Microsoft Windows, SPSS
Inc.).
1.1.3 Beobachtungen und Ergebnisse
Bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens nahm die Konzentration der
CD14+ Monozyten im Apheresat signifikant zu, die Sammeleffizienz und
der Zellgehalt der CD14+ Monozyten nahmen signifikant ab. Die Thrombo-
2
zytenkonzentration stieg bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens signifikant an. Der Zellgehalt und die Sammeleffizienz der Erythrozyten nahmen
mit der Reduktion des Buffy Coat-Volumens signifikant ab. Das Konzentratvolumen korrelierte hochsignifikant mit dem Buffy Coat-Volumen. Der
Zellgehalt und die Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten waren bei längeren Separationszeiten signifikant höher, für die Thrombozyten- und Erythrozytenkonzentrationen ergab sich kein signifikanter Unterschied.
1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen
Durch die Reduktion des Buffy Coat-Volumens konnte eine Anreicherung
der CD14+ Monozyten im Konzentrat erreicht werden. Der Zellgehalt und
die Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten nahmen signifikant ab, die zur
in vitro Herstellung der dendritischen Zellen notwendige Monozytenzahl
wurde aber erreicht. Die Erythrozytenkonzentration, der Zellgehalt und die
Sammeleffizienz der Erythrozyten konnten durch die Reduktion des Buffy
Coat-Volumens signifikant gesenkt werden, während die Konzentration
der Thrombozyten signifikant zunahm. Der Zellgehalt und die Sammeleffizienz der Thrombozyten konnten erst durch ein sehr niedriges Buffy
Coat-Volumen von unter 6 ml signifikant reduziert werden.
Eine längere Separationszeit führte zu einer hohen Mobilisierung und
einer verbesserten Ausbeute an CD14+ Zellen. Durch mehrfache Monozytenspenden konnte die Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten signifikant erhöht werden.
3
1.2 Summary
1.2.1 Background
The cultivation of dendritic cells from monocytes won by apheresis,
requires an optimum product quality because the presence of residual
cells during the cultivation process can influence the function of the
dendritic cells negatively. The Standard MNC Program of the COM.TEC
cell separator of the company Fresenius Kabi achieves the highest
collection efficiencies for the CD14 positive monocytes. However, these
products showed a high concentration of platelets and erythrocytes. The
development of the autoMNC Program already facilitated a significant
reduction of erythrocytes in the apheresis product. This work illustrates
whether it is possible to lower the concentration of residual cells even
more and optimize the product quality by a specific reduction of the Buffy
Coat-Volume.
1.2.2 Methods
The 253 leukapheresis procedures, including the specific reduction of the
Buffy Coat-Volume, were performed with the autoMNC Program of the
COM.TEC cell separator. The concentration of leucocytes, lymphocytes,
erythrocytes, platelets and the haematocrit were determined by an
automated blood cell counter (Sysmex K1000). The concentration of the
CD14 positive monocytes was determined by flow cytometry (FACS
CaliburTM). The statistical evaluation occurred through the table calculation
program PASW Statistics 18 (SPSS® for Microsoft Windows, SPSS Inc.).
1.2.3 Results
The reduction of the Buffy Coat-Volume induced a significantly higher
concentration of CD14 positive monocytes in the product but a significantly lower collection efficiency and yield. The platelet concentration in
the product increased significantly by reducing the Buffy Coat-Volume,
whereas the erythrocyte yield and collection efficiency obtained significantly lower results. The concentrate volume correlated highly significant
4
with the reduction of the Buffy Coat-Volume. The cell yield and the
collection efficiency of the CD14 positive monocytes were significantly
higher with longer separation times, whereas the platelet and erythrocyte
concentration did not show a significant difference.
1.2.4 Conclusions
An enrichment of CD14 monocytes in the product could be achieved by
reducing the Buffy Coat-Volume. The yield and collection efficiency of the
CD14 positive monocytes decreased significantly, however, the necessary
concentration of CD14 monocytes for cultivating dendritic cells could be
achieved. The erythrocyte concentration, yield and collection efficiency
could be lowered significantly by the reduction of the Buffy Coat-Volume,
while the platelet concentration increased significantly. The platelet yield
and the collection efficiency could be reduced significantly only by a Buffy
Coat-Volume less than 6 ml.
A high mobilization and an improved yield of CD14 positive monocytes
could be achieved by longer separation times. The collection efficiency of
CD14 positive monocytes could be raised significantly by multiple
monocyte donations.
5
2. Einleitung
2.1 Zusammensetzung des Blutes
Das Blut wird in zwei Hauptbestandteile aufgeteilt: das Plasma, das ca.
56% des Blutvolumens ausmacht und die Blutzellen, als fester Bestandteil
mit ca. 44%, der auch als Hämatokrit bezeichnet wird. Das Plasma besteht
zum Großteil aus Wasser, enthält aber u.a. auch Proteine, Elektrolyte,
Enzyme, Glukose und Gerinnungsfaktoren. Die Blutzellen werden in Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten unterteilt.
Die Leukozyten können in Zellen der angeborenen und erworbenen
Immunabwehr aufgeteilt werden. Granulozyten und Monozyten gehören
der angeborenen, auch unspezifischen, Immunabwehr an und agieren als
Fresszellen, Phagozyten, die körperfremde Strukturen durch Endozytose
aufnehmen und zerstören. Lymphozyten sind Teil des erworbenen oder
spezifischen Immunsystems und können wiederum in B- und T-Lymphozyten unterteilt werden. Ihre Funktion ist nicht angeboren, sie müssen im
Laufe ihrer Entwicklung geprägt werden. B-Lymphozyten haben ihre
Hauptfunktion in der Bildung von Antikörpern. T-Lymphozyten werden in
CD8+-zytotoxische Zellen und CD4+-Helferzellen eingeteilt. Erstere eliminieren direkt als fremd oder entartet präsentierte Zellen, während letztere
primär über die Aktivierung von antikörperproduzierenden B-Zellen und
zytotoxischen T-Zellen wirken. Tabelle 2.1 gibt einen Überblick der im peripheren Blut vorkommenden Leukozyten und deren Normwerte.
Die Leukozyten werden anhand funktioneller und biochemischer Marker durch die CD-Klassifikation (Cluster of differentiation) eingeteilt. Es
handelt sich um immunphänotypische Oberflächenmerkmale, die als
membrangebundene Glykoproteine Informationen über den Reifegrad, die
Art und den Aktivitätszustand der Zellen geben [37]. Die Zelltypen und
deren Entwicklungsstufen können durch die Anwendung monoklonaler
Antikörper gezielt nachgewiesen werden.
6
Tabelle 2.1: Leukozyten im peripheren Blut
Leukozyten
Absolut x10³/µl
Relativ in %
Gesamt
4,0-11,0
Neutrophile Granulozyten
2,5-7,5
50-70
Eosinophile Granulozyten
0,04-0,4
2-4
Basophile Granulozyten
0,01-0,1
0-1
Monozyten
0,2-0,8
2-6
Lymphozyten
1,5-3,5
20-40
Modifiziert nach [37]
2.2 Apherese
Der Begriff Apherese stammt von dem griechischen „aph-heiréo“ und
bedeutet „wegnehmen“, „entziehen“ [29]. Es handelt sich um ein Separationsverfahren zur Sammlung von Blutbestandteilen. Die Apherese bietet
durch einen extrakorporalen Kreislauf die Möglichkeit das Blut aufzutrennen und anschließend die nicht benötigten Bestandteile dem Spender
direkt zurückzugeben. Dieser Vorgang dauert bis zu zwei Stunden, in denen im Mittel 15 Zyklen durchlaufen werden. Die Auftrennung der Blutbestandteile erfolgt durch Filtration oder Zentrifugation. Durch Filtration
werden die Blutzellen anhand ihrer Größe aufgetrennt. Dieses Verfahren
kann zur Trennung von Blutzellen und Plasma verwendet werden, aber
auch zur Separation der Blutzellen untereinander. Die bei dieser Studie
eingesetzte Zentrifugation nutzt die unterschiedlichen Dichten der Zellen
und trennt sie durch Zentrifugalkraft. Erythrozyten besitzen die größte
Dichte aller Blutzellen und lagern sich am Zentrifugenrand ab. Das
Blutplasma verbleibt innen. Zwischen diesen beiden Schichten bildet sich
eine weitere: die Buffy Coat-Schicht. Sie enthält Leukozyten und Thrombozyten. Die drei Schichten werden in Abbildung 2.1 schematisch dargestellt.
7
Abbildung 2.1: Trennung der Blutbestandteile durch Apherese
Modifiziert nach [32]
Die Apherese kann zur Herstellung von Blutprodukten und als therapeutisches Verfahren eingesetzt werden. Sowohl die therapeutische als
auch die Spendeapherese läuft in der Regel über ein Zwei-Arm-Verfahren.
Das Blut wird aus der einen Vene entnommen, dem Apherese-Set zugeführt und dem Patienten oder Spender über eine Vene des anderen
Armes wieder zurückgegeben. Um die Blutgerinnung zu verhindern, wird
dem extrakorporalen Kreislauf Zitrat zugefügt.
2.2.1 Arten der präparativen Hämapherese
Die Sammlung von Blutzellen und Plasma zur Herstelllung von Blutprodukten im Rahmen des Arzneimittelgesetztes wird als präparative Hämapherese bezeichnet. Durch Zellseparatoren wird die selektive Sammlung
von Blutstammzellen, Blutplasma, Erythrozyten, Thrombozyten, Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten ermöglicht.
2.2.1.1 Stammzellapherese
Periphere Stammzellen werden meist im Rahmen einer autologen oder
allogenen Stammzelltransplantation gesammelt. Bei der autologen Transplantation spendet der Patient seine eigenen Zellen, die ihm nach einer
8
Hochdosis-Chemotherapie
wieder zurückgegeben
werden.
Allogene
Transplantate werden von gesunden Spendern gewonnen. Sowohl der
Patient als auch der Spender müssen zur Produktion und Ausschwemmung der Stammzellen in das periphere Blut mit G-CSF (GranulozytenKolonie-stimulierender Faktor) stimuliert werden. Die Konzentrate werden
unter Zusatz von Gefrierschutzmitteln kryokonserviert und sind bis zu 10
Jahre haltbar [11].
2.2.1.2 Plasmapherese
Das durch Zentrifugation und Filtration gewonnene zellfreie Plasma wird
schockgefroren. Es enthält aktive Gerinnungsfaktoren und kann bei einem
entsprechenden Mangel als gefrorenes Frischplasma (GFP) substituiert
werden. Die Menge des entnommenen Plasmas orientiert sich an dem
Körpergewicht des Spenders. Die Blutzellen werden dem Spender zurückgegeben und der entstandene Flüssigkeitsmangel durch den Einstrom von
Gewebsflüssigkeit ausgeglichen. Unter regelmäßiger Blutwertkontrolle
können pro Jahr bis zu 45 Plasmapheresen durchgeführt werden [9].
2.2.1.3 Erythrozytapherese
Erythrozytenkozentrate können durch Apherese und aus Vollblutkonserven hergestellt werden. Durch ihre hohe Dichte lagern sich die Erythrozyten während der Apherese am Zentrifugenrand ab. Die restlichen Blutbestandteile werden dem Spender zurückgegeben. Das entnommene Erythrozytenvolumen darf bei Frauen 1000 ml und bei Männern 1500 ml innerhalb eines Jahres nicht überschreiten [9].
2.2.1.4 Thromobozytapherese
Thrombozytenkonzentrate können aus Vollblutkonserven oder mittels
Apherese hergestellt werden. Die durch Apherese hergestellten Konzentrate haben einen deutlich höheren Thrombozytengehalt und werden
daher bevorzugt [11]. Der Spender darf eine Woche vor der Sammlung
keine Medikamente einnehmen, die die Funktion der Thrombozyten beein-
9
flussen [11]. Hierzu gehört vor allem die Acetylsalicylsäure (ASS). Als
Spendevoraussetzung gilt eine Thrombozytenzahl von mehr als 150.000
pro µl, die während der Spende auf maximal 100.000 pro µl absinken darf.
Innerhalb von 12 Monaten sind 25 Thrombozytapheresen möglich [9].
2.2.1.5 Granulozytapherese
Granulozytenkonzentrate können bei Patienten eingesetzt werden, die
sich aufgrund einer zytostatischen Therapie in einer Neutropenie (Granulozyten unter 500 pro µl) befinden und somit stark infektanfällig sind.
Die Granulozytenkonzentrate sollten HLA-kompatibel sein und müssen vor
Anwendung gekreuzt (hoher Erythrozytenanteil) und bestrahlt (hoher Lymphozytenanteil) werden, damit Nebenwirkungen beim Patienten möglichst
minimiert werden [11]. Zur Sammlung von Granulozyten mittels Zellseparatoren muss der Spender mit G-CSF oder Kortikoiden vorbehandelt werden, die zu einer vermehrten Bildung und Ausschwemmung der Granulozyten in das periphere Blut führen. Um die Trennung der Granulozyten
von den restlichen Blutzellen zu optimieren werden Sedimentationsbeschleuniger eingesetzt [35]. Durch diese Zusätze kann es zu allergischen
Reaktionen kommen, worüber der Spender aufgeklärt werden muss. Aufgrund der Sedimentationsbeschleuniger ist die Zahl der Granulozytapheresen auf maximal 4 pro Jahr begrenzt.
2.2.1.6 Lymphozytapherese
Die Bedeutung der Lymphozytapherese nimmt im Rahmen der Immuntherapie von Tumoren immer mehr zu. Die nach der Leukozytensammlung
angereicherte Lymphozytenpopulation des Stammzellspenders kann im
Rahmen einer Lymphozyteninfusion (sog. „DLI“) dem Patienten nach
Stammzelltransplantation in der Phase der Immundefizienz für die Regeneration des Immunsystems und zur Vermeidung von Infektionen verabreicht werden. Aus isolierten T-Zellen können hierbei virusspezifische TZellvakzinen hergestellt werden (z.B. CMV-spezifische T-Zelltherapie). Die
Spender werden nicht vorbehandelt und um die eigene Immunabwehr
10
nicht zu schwächen, sollten maximal 6 Lymphozytapheresen pro Jahr
durchgeführt werden [9].
2.2.1.7 Monozytapherese
Die durch Apherese gewonnenen Monozyten dienen zur in vitro Herstellung von dendritischen Zellen, die als Tumorvakzinen in der Immuntherapie verwendet werden. Die Monozyten reichern sich während der Separation in der Buffy-Coat Schicht an. Aufgrund der ähnlichen Dichte und
Größe der Leukozyten und zur Eliminierung von Erythrozyten und Thrombozyten wird das gewonnene Monozytenkonzentrat durch ein weiteres
Trennverfahren mit dem ElutraTM Zellseparator gereinigt. Diese zusätzliche Reinigung ist notwendig, weil die in vitro Herstellung der dendritischen Zellen von der Anwesenheit anderer Blutzellen negativ beeinflusst
werden kann [19, 30]. Die Monozytenspende mittels Apherese dauert bis
zu zwei Stunden, in denen bei dem COM.TEC Zellseparator in der Regel
15 Sammelzyklen durchlaufen werden. Die Apherese läuft wie üblich über
ein Zwei-Arm-Verfahren. Eine medikamentöse Stimulation der Spender ist
nicht notwendig. Wenn die Ergebnisse der regelmäßigen Kontrolluntersuchungen es zulassen und bei den Spendern nicht vermehrt Infekte auftreten, sind pro Jahr 6 Monozytapheresen möglich.
2.2.2 Therapeutische Apherese
Die Apherese kann als Blutreinigungsverfahren therapeutisch eingesetzt
werden und bietet die Möglichkeit, pathogene Stoffe oder Antikörper aus
dem Blut zu entfernen. Dies kann durch den Plasmaaustausch oder zelluläre Verfahren wie die Immunadsorption geschehen [58]. Bei beiden Verfahren werden Blutzellen und Plasma in der Regel zuerst voneinander getrennt. Die zu entfernenden Substanzen befinden sich im Plasma. Bei dem
Plasmaaustausch wird das gewonnene Plasma verworfen und durch
Humanalbumin ersetzt, das mit den Blutzellen vermischt und dem Patienten zurückgegeben wird. Die Immunadsorption hingegen ermöglicht eine
Reinigung des Plasmas, indem es über mit Liganden beladene Adsorp-
11
tionssäulen geleitet wird, die die im Plasma befindlichen Antikörper binden
[24]. Die Immunadsorption ist in der Therapie von Autoimmunerkrankungen von entscheidender Bedeutung. Sie wird bei vielen Krankheitsbildern, wie der Multiplen Sklerose, dem systemischen Lupus erythematodes, dem Guillian-Barré-Syndrom oder der HLA-Hyperimmunisierung im
Rahmen einer Transplantation erfolgreich eingesetzt [23]. Eine weitere
wichtige Indikation der therapeutischen Apherese ist die Lipidapherese.
Bei Patienten mit einer familiären Hypercholesterinämie ist es oft nicht
möglich, den LDL-Cholesterinspiegel durch Ernährung und Medikamente
ausreichend zu senken, die Patienten leiden bereits früh unter kardiovaskulären Erkrankungen [31, 25]. Durch die Lipidapherese kann der LDLSpiegel im Blut um bis zu 60% gesenkt werden [31]. Zusätzlich zu der
oben beschriebenen Methode gibt es die Möglichkeit, das Cholesterin aus
dem Vollblut zu entfernen [25].
2.2.3 Beschreibung des Buffy Coats bei Leukozytapheresen
Die drei Schichten, die sich bei Zentrifugation des Blutes bilden, sind in
Abbildung 2.1 dargestellt. Das zellarme Plasma verbleibt im Inneren der
Zentrifuge, während sich die Erythrozyten aufgrund ihrer hohen Dichte
gegenüber den anderen Blutzellen am Zentrifugenrand ablagern. Die mittlere Schicht besteht vor allem aus Leukozyten und durch ihre ähnliche
Dichte auch aus Thrombozyten und wird als Buffy Coat bezeichnet. Buffy
Coat bedeutet „lederfarbene Schicht“ und beschreibt die Farbe der Zwischenschicht.
Zur Sammlung des leukozytenreichen Buffy Coats wird das gewünschte Buffy Coat-Volumen an dem Zellseparator manuell eingestellt. Es wird
in Milliliter angegeben und bezeichnet das Volumen, das von der Zellpumpe in den Konzentratbeutel gefördert wird. Hierzu muss zuerst das
zellarme Plasma aus der Zentrifuge abgesammelt werden. Dann folgt der
Buffy Coat, unter dem sich die Erythrozytenschicht gebildet hat. In Abbildung 2.2 ist dieser Vorgang schematisch dargestellt: das in gelb dargestellte Plasma wurde bereits über die Plasmapumpe abgesammelt. Der
12
Buffy Coat ist in blau abgebildet und wird durch die Zellpumpe in den Konzentratbeutel gefördert. Weil die Grenzen der drei Schichten ineinander
übergehen, kann das Konzentrat mit nicht gewünschten Restzellen verunreinigt sein. Die Menge der im Buffy Coat enthaltenen Erythrozyten und
Thrombozyten beeinflusst die weiteren Trennverfahren zur Reinigung der
Leukozyten und somit die Möglichkeit zur Herstellung von dendritischen
Zellen aus Monozyten [7, 19, 52].
Abbildung 2.2: Absammlung des Buffy Coats
Modifiziert nach: Copyright Fresenius Kabi. Verwendet mit Genehmigung.
13
2.3 Mononukleäre Zellen
2.3.1 Monozyten
Monozyten gehören wie Lymphozyten zu den mononukleären Zellen und
sind mit einem Durchmesser von bis zu 20 µm die größten der weißen
Blutkörperchen. Sie besitzen einen charakteristischen bohnenförmigen
Kern und wenig Zytoplasma. Sie entwickeln sich aus einer pluripotenten
CD34 positiven Stammzelle. Aus ihr entsteht durch mehrere Zwischenschritte der Myelomonoblast, die gemeinsame Vorläuferzelle der Granulozyten- und Makrophagenreihe. Durch Stimulationsfaktoren wie GM-CSF
(Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) und M-CSF
(Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) wird die Ausreifung zum Monozyten angeregt. Dieser Vorgang ist in Abbildung 2.3 schematisch dargestellt.
Abbildung 2.3: Schematische Darstellung der Hämatopoese
Modifiziert nach [33].
14
2.3.1.1 Beschreibung der Phagozytose
Monozyten sind die Vorläufer der im Gewebe lokalisierten Makrophagen
und dendritischen Zellen und somit ein wichtiger Teil des Immunsystems.
Solange sie im Blut zirkulieren, beträgt ihre Lebensdauer 1 bis 3 Tage
[64]. Nachdem sie ausdifferenziert ins Gewebe gewandert sind, können
sie dort mehrere Wochen und Monate ihre Funktion ausüben. Hierzu gehört als Teil der unspezifischen Immunabwehr die Phagozytose körperfremder Strukturen. Durch den Kontakt zu speziellen Oberflächenmolekülen wie Peptidoglykanen oder Lipopolysacchariden, die auf Bakterien zu
finden sind, werden Toll-like-Rezeptoren (TLR) aktiviert, die den Vorgang
einleiten. Diese Rezeptoren gehören zu der Gruppe der „Pattern Recognition Receptors (PRR)“ und werden von antigenpräsentierenden Zellen
exprimiert [62]. Sie erkennen körperfremde Strukturen, sogenannte
„Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMP)“, und führen durch die
Aktivierung einer intrazellulären Signalkaskade zu deren Zerstörung [62].
Die TLRs sind ein Teil des angeborenen Immunsystems und können in
Oberflächenrezeptoren und endosomale Rezeptoren unterteilt werden
[62]. Dadurch ist es ihnen möglich sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre Strukturen, wie zum Beispiel virale RNA-Fragmente, zu erkennen
[62]. Spezielle Gewebsmakrophagen sind Alveolarmakrophagen in der
Lunge, Mesangiumzellen in der Niere und Langerhans-Sternzellen in der
Haut.
2.3.1.2 Antigenpräsentation der Monozyten
Eine weitere Funktion der Monozyten ist die Antigenpräsentation. Sie
basiert auf dem Prinzip der Histokompatibilitäts-Antigene, auch HLA(Human-Leukozyte-Antigene) Moleküle genannt, durch die jeder Mensch
ein individuelles Genmuster besitzt. Die entsprechenden Merkmale befinden sich beim Menschen auf dem MHC-Komplex (Major-Histocompatibility-Complex) auf dem Chromosom 6 und werden auch als MHC-Moleküle
bezeichnet [37].
15
Abbildung 2.4: Schematische Darstellung der Antigenpräsentation
Die MHC-Moleküle können in mehrere Klassen unterteilt werden. MHCKlasse-I-Moleküle werden auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert. Sie
sind für die Präsentation zerlegter Proteine intrazellulärer Erreger zuständig und werden von CD8+-zytotoxischen-T-Zellen erkannt, indem der
MHC-Komplex durch ihren T-Zell-Rezeptor abgetastet wird. Erkennt der
Rezeptor die Zelle als körperfremd, krank oder entartet, kann sie direkt
eliminiert werden. Entsprechend der HLA-Nomenklatur sind die wichtigsten Vertreter dieser Gruppe die HLA-Moleküle A, B und C, die in weitere
Subgruppen unterteilt werden können [59]. Das Merkmal HLA-A2 zählt zu
den dominantesten HLA-Antigenen [63] und eignet sich entsprechend
besonders gut zur Antigenpräsentation. Deshalb werden für Apheresen
bevorzugt Spender ausgewählt, die dieses HLA-Merkmal besitzen.
MHC-Klasse-2-Moleküle werden dagegen nur auf den antigenpräsentierenden Zellen, Monozyten, Makrophagen, B-Lymphozyten und dendritischen Zellen exprimiert. Sie nehmen extrazelluläre Proteine durch Phagozytose oder Endozytose auf und zerlegen sie intrazellulär zu Peptiden,
die dann auf den MHC-Komplex geladen und an der Zelloberfläche präsentiert werden. Hier können sie durch CD4+-T-Helferzellen erkannt werden, die dann durch Zytokinausschüttung die antikörperproduzierenden B-
16
Zellen aktivieren und zu einer Verstärkung der CD8+-T-Zellfunktion führen. Zugehörige HLA-Moleküle sind als wichtigste Vertreter HLA-DP, -DQ,
-DR [60].
2.3.1.3 Zytokinproduktion der Monozyten
Monozyten können außerdem Zytokine sezernieren, auch Monokine genannt. Hierzu gehören zum Beispiel die Interleukine-1,-6 und -8 und der
Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α). Es handelt sich um Peptide, die ihre
Steuer- und Wachstumsfunktion ausüben, indem sie Entzündungszellen
und Phagozyten aktivieren und die Kommunikation mit dem spezifischen
Abwehrsystem ermöglichen [37].
2.3.2 Lymphozyten
Lymphozyten haben einen Durchmesser von 7-8 µm und einen großen
dichten Kern mit wenig Zytoplasma. Sie werden in B- und T-Lymphozyten
unterteilt, die jeweils ca. 50% ausmachen, und entstammen der lymphatischen Blutzellreihe (siehe Abbildung 2.3). B- und T-Lymphozyten können
nur anhand ihrer immunphänotypischen Oberflächenmarker unterschieden
werden, morphologisch ist das nicht möglich.
2.3.2.1 T-Lymphozyten
T-Lymphozyten sind u.a. CD3 positiv und reifen im Thymus aus, nachdem
sie das Knochenmark früh verlassen haben. Hier findet auch die positive
und negative Selektion statt, bei der alle Zellen durch Apoptose eliminiert
werden, die körpereigene Rezeptoren, Antigen-Komplexe oder Peptide als
fremd erkennen. Dieser Vorgang wird als Toleranzentwicklung des Immunsystems bezeichnet und verhindert eine Immunreaktion gegen den
eigenen Körper [37]. Anhand ihrer Funktion und Oberflächenmoleküle
können T-Lymphozyten als Teil der spezifischen zellulären Abwehr in zwei
Gruppen eingeteilt werden.
Die CD8+-zytotoxischen-T-Zellen machen etwa ein Drittel der T-Zellen
aus. Sie interagieren mit den MHC-Klasse-I-Komplexen kernhaltiger Zellen
17
und führen direkt durch Einleitung der Apoptose zur Eliminierung einer als
fremd oder krank erkannten Zelle. Die anderen zwei Drittel der T-Zellen
bilden die CD4+-T-Helferzellen. Sie führen indirekt über MHC-Klasse-IIKomplexe antigenpräsentierender Zellen zu einer Aktivierung des Immunsystems, in dem sie B-Lymphozyten zur Antikörperproduktion aktivieren
und die Funktion der CD8+-T-Zellen verstärken. Anhand ihrer Zytokinproduktion können die CD4+-T-Helferzellen in weitere Untergruppen unterteilt
werden. Die Th1-Helferzellen interagieren primär mit intrazellulären Erregern und produzieren die Interleukine-1 und -3, Interferon-γ und den
Tumornekrosefaktor-beta (TNF-β) [14]. Sie unterstützen damit die zelluläre Immunabwehr. Die Th2-Helferzellen sind in ihrer Funktion gegen extrazelluläre Erreger von Bedeutung. Sie produzieren die Interleukine -4, -5,
-6, -10, -13, und -25 und unterstützen die humorale Immunabwehr [14].
2.3.2.2 B-Lymphozyten
B-Lymphozyten reifen im Knochenmark aus und tragen die Oberflächenmerkmale CD19, CD20 und CD21. Ihre Aufgabe ist die Antikörperproduktion. Sie sind Teil der spezifischen humoralen Abwehr. B-Zellen zirkulieren
im Blut und werden durch Kontakt mit einem Antigen aktiviert. Diese Aktivierung kann im Rahmen der T-Zell-unabhängigen Stimulation direkt über
den B-Zell-Rezeptor erfolgen [37]. Auch B-Zellen besitzen die Fähigkeit
der Antigenpräsentation und binden die aufgenommenen und intrazellulär
zerlegten Proteine an MHC-Klasse-II-Komplexe, die wiederum von CD4+T-Zellen erkannt werden. Dieser Weg ist T-Zell-abhängig und Voraussetzung für die Bildung von Gedächtniszellen und den Klassenwechsel in der
Antikörperproduktion [37]. Die aktivierte B-Zelle wandert in sekundär lymphatische Organe ein und produziert als Plasmazelle Antikörper. Plasmazellen sind nicht mehr teilungsfähig und sind CD19, CD38 und CD138
positiv [37]. Eine Plasmazelle produziert immer nur eine Art von Antikörpern, sogenannte monoklonale Antikörper. B- und T-Zellen sind in der
Lage Gedächtniszellen zu bilden, die bei erneutem Antigenkontakt eine
18
schnellere und effizientere Immunantwort und Antikörperproduktion gewährleisten.
2.4 Dendritische Zellen
Die Bezeichnung dendritische Zelle kommt aus dem Griechischen:
dendros, auf Deutsch Baum [44]. Sie beschreibt die astförmigen Ausläufer
der Zellen in aktiviertem Zustand (Abbildung 2.5).
Abbildung 2.5: Aktivierte dendritische Zellen
Copyright Fraunhofer IGB. Verwendet mit Genehmigung.
Dendritische Zellen sind die stärksten antigenpräsentierenden Zellen
des Immunsystems [30]. Als Vorläuferzellen sind sie in nahezu allen Geweben des Körpers zu finden, wo sie extrazelluläre Strukturen über Endozytose und Phagozytose aufnehmen. Diese Proteine werden intrazellulär
zerlegt und an MHC-Moleküle gebunden an der Zelloberfläche präsentiert.
Nach der Antigenaufnahme verlieren die dendritischen Zellen ihre Fähigkeit zur Phagozytose und exprimieren vermehrt MHC-Moleküle. Durch die
Veränderung des Zytokinskeletts und der Chemokin-Rezeptoren gelangen
die aktivierten dendritischen Zellen in den drainierenden Lymphknoten
19
[44]. Hierdurch und auch durch die Freisetzung von Zytokinen, v.a. Interleukin-12, kommt es zur Interaktion mit T-Zellen. Interleukin-12 gehört zu
den wichtigsten proinflammatorischen Zytokinen als Bindeglied zwischen
angeborenem und erworbenem Immunsystem und wird primär von dendritischen Zellen produziert [30]. Durch aktivierte T-Zellen werden weitere
dendritische Zellen stimuliert. Nicht aktivierte dendritische Zellen wandern
im Rahmen der physiologischen Zellteilung in lymphatisches Gewebe ein.
Durch die Interaktion von T-Zellen mit diesen nicht aktivierten Zellen tragen die dendritischen Zellen zur Immuntoleranz bei. Aufgrund ihrer starken immunmodulatorischen Eigenschaften werden antigenbeladene dendritische Zellen im Rahmen der aktiven Immuntherapie als Tumorvakzine
eingesetzt. Tumorzellen werden zwar durch T-Zellen erkannt, eine effektive Immunantwort bleibt jedoch meist aus. Gründe hierfür sind das Vorkommen tumorassoziierter Antigene in gesunden Geweben [44], die Sekretion immunsuppressiver Substanzen und die verminderte Expression
von MHC-Molekülen [15] durch den Tumor selbst. Durch spezifisch beladene dendritische Zellen kann eine stärkere Immunantwort hervorgerufen
werden, die es erlaubt, Tumoren effektiv zu bekämpfen [40, 45].
Dendritische Zellen können in vitro aus Monozyten oder CD34 positiven hämatopoetischen Stammzellen hergestellt werden. Als Goldstandard gilt die Herstellung aus durch Leukapherese gewonnenen Monozyten
[52]. Zur Aufreinigung der Monozyten aus dem Apheresekonzentrat bietet
der ElutraTM Zellseparator eine standardisierte Methode. Aufgrund der
ähnlichen Dichte aller Zellen der Buffy Coat-Schicht nutzt der ElutraTM Zellseparator zusätzlich die Zellgröße zur Auftrennung der Zellen anhand ihrer
durch Dichte und Größe bedingten Sedimentationsgeschwindigkeit [7].
Um gute Ergebnisse zu erzielen, sollte das Apheresekonzentrat mindestens 4-5 x109 kernhaltige Zellen enthalten [7]. Der ElutraTM Zellseparator
arbeitet mit einem geschlossenen System und erlaubt mit einer Dauer von
ca. 60 Minuten eine schnelle und effiziente Anreicherung von Monozyten.
Thrombozyten können hierbei als kleinste zelluläre Anteile fast komplett
ausgewaschen werden [7], was für die Herstellung der dendritischen Zel-
20
len essentiell ist, weil deren Funktion durch Thrombozyten beeinflusst
werden kann. Dendritische Zellen, die zusammen mit Thrombozyten angezüchtet wurden, blieben phänotypisch unreif und wiesen eine sehr viel
geringere Interleukinproduktion auf [19]. Dies zeigt, wie wichtig die Aufreinigung der Monozytenpräparate ist, um eine effektive Immunantwort
durch die dendritischen Zellen zu gewährleisten. Die angereicherten
Monozyten werden für 5 Tage in sterilen Teflon-Beuteln unter Zugabe von
Interleukin-4 und GM-CSF kultiviert [7, 27]. Um die so entstandenen unreifen dendritischen Zellen in reife umzuwandeln, werden IL-1β (Interleukin-1beta), Interleukin-6, TNF-α und PGE2 (Prostaglandin E2) hinzugefügt [7, 27]. Die reifen dendritischen Zellen werden mit Antigenen beladen und dem Patienten zugeführt. Die Applikation kann sub- oder intrakutan, intranodal oder intravenös [44] erfolgen.
21
2.5 Fragestellungen der Studie
Die Fragestellung dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss einer
Reduktion des Buffy Coat-Volumens auf den Anteil an Ziel- und Restzellen
im Apheresat des COM.TEC Zellseparators. Die Zielzellen des Sammelprozesses sind die Leukozyten mit den CD14+ Monozyten und als Restzellen gelten die Erythrozyten und Thrombozyten im Apheresat.
Folgende Fragen werden in der vorliegenden Arbeit untersucht:
1. Wie wirkt sich ein unterschiedliches Buffy Coat-Volumen auf die
Konzentration der Ziel- und Restzellen aus?
2. Welche Auswirkung hat die gezielte Reduktion des Buffy Coat-Volumens auf die Sammelergebnisse der Ziel- und Restzellen?
3. Welchen Einfluss haben die Zyklenanzahl und die Separationszeit
auf die Produktqualität?
4. Gibt es eine Korrelation zwischen der Leukozytenkonzentration vor
der Spende und den CD14+ Monozyten im Konzentrat?
5. Wie korreliert die Monozytenkonzentration im Produkt mit dem
Anteil an Restzellen?
22
3. Material und Methoden
3.1. Spendeverfahren
3.1.1. Einschlusskriterien
Der Ablauf einer Spendeentnahme ist in den Richtlinien der Bundesärztekammer genau festgelegt. Wichtig ist die korrekte und ausführliche Aufklärung des Spenders, die schriftlich festgehalten werden muss. Die Spendetauglichkeit wird anhand einer Anamnese, einer körperlichen Untersuchung und Laborparametern durch einen Arzt bestimmt, um eine
Selbstgefährdung oder Übertragung von Krankheiten durch eine Spende
auszuschließen. Weitere Voraussetzungen sind das Alter zwischen 18
und 68 Jahren und ein Mindestkörpergewicht von 50 kg.
Vor Freigabe des Präparates müssen an jedem Blutprodukt mehrere
Untersuchungen durchgeführt werden. Hierzu gehören die Blutgruppenbestimmung (ABO-System, Rhesus-Merkmale, Kell-Antikörper und Serumeigenschaften), die Infektionsdiagnostik (HIV, Hepatitis B und C, Lues) und
der Antikörper Suchtest zum Ausschluss klinisch relevanter Antikörper.
Sollten die Tests nicht, wie verlangt, negativ sein, muss das Präparat verworfen werden, es sei denn es wird zu wissenschaftlichen Zwecken oder
für Qualitätskontrollen verwendet. Im Rahmen des Rückverfolgungsverfahrens müssen von jedem Spender Plasma- und Serumproben für die
Dauer eines Jahres nach Ablauf der Haltbarkeit eines Präparates aufbewahrt werden. Hiermit wird gewährleistet, dass die Proben wenn nötig in
einer Nachuntersuchung erneut auf Infektiosität getestet werden können.
3.1.2 Ausschlusskriterien
Zu den dauerhaften Ausschlusskriterien von einer Blutspende gehören
alle chronischen Erkrankungen und Risikosituationen, die zu einer Gefährdung des Spenders oder Empfängers führen können [9]. Hierzu gehören
zum Beispiel bösartige Neoplasien, Infektionen und Personen mit Drogenoder Medikamentenmissbrauch oder ein Hochrisikosexualverhalten. Ein
vorübergehender Ausschluss kann durch einen Aufenthalt in Risikoge-
23
bieten, bestimmte Erkrankungen (z. B. Malaria) oder Kontakt zu Erkrankten, durch Stichverletzungen oder Lebendimpfstoffe bedingt sein.
3.1.3 Leukapherese
Die selektive Spende mononukleärer Zellen wird durch Zellseparatoren
wie den COM.TEC Zellseparator der Firma Fresenius Kabi ermöglicht.
Aus denen im Rahmen der Studie gewonnenen Apheresaten werden
Monozyten- und Lymphozytenkonzentrate hergestellt. Aus den Monozyten
können in vitro dendritische Zellen kultiviert werden, die als Tumorvakzinen im Rahmen der Immuntherapie maligner Tumoren von zunehmender Bedeutung sind. Bei den Lymphozyten sind die T-Zellen entscheidend,
die als tumorantigenspezifische T-Zellen ebenfalls in der Immuntherapie
verwendet werden.
Neben den allgemeinen Richtlinien zu dem Ablauf einer Blutspende
gibt es bei der Spende durch Apheresegeräte einige Besonderheiten. Die
Spende von mononukleären Zellen durch den COM.TEC Zellseparator
dauert je nach Zyklenanzahl bis zu zwei Stunden. Die Spende läuft in der
Regel über ein Zwei-Arm-Verfahren. Das Blut wird aus der Vene des
einen Armes entnommen und über ein steriles Einmalsystem in das Apheresegerät geleitet, wo es durch Zentrifugation aufgetrennt wird. Nach Absammlung aller gewünschten Zellen werden die nicht benötigten Blutbestandteile wieder gemischt und dem Spender über die Vene des anderen Armes zurückgegeben. Um die Blutgerinnung innerhalb dieses extrakorporalen Kreislaufes zu verhindern wird als gerinnungshemmende Substanz Zitrat zugefügt. Hierbei ist zu beachten, dass es neben den Nebenwirkungen einer einfachen Blutspende, wie Übelkeit, Erbrechen und Kreislaufschwäche, auch zu zitratabhängigen Reaktionen kommen kann. Hierzu gehören neurologische Erscheinungen wie Ameisenlaufen in Fingerund Zehenspitzen oder der Zunge und Muskelverkrampfungen. Auch
Pulsunregelmäßigkeiten und Müdigkeit können auftreten. Auch wenn alle
Geräte über ausgeprägte Sicherheitssensoren verfügen, müssen die
Spender über mögliche Luftembolien und Blutgerinnsel aufgeklärt werden.
24
Durch Scherkräfte innerhalb des Trennsystems kann es zur Hämolyse
kommen. Die Spender werden gebeten, jegliche Art von Missempfindungen unverzüglich mitzuteilen und nach jedem Spendevorgang wird
dokumentiert, ob und welche Nebenwirkungen aufgetreten sind. Die Spender dürfen bis sieben Tage vor Beginn der Apherese keine Medikamente
einnehmen [9].
Alle Spender werden halbjährlich körperlich und laborchemisch untersucht. Zur Feststellung der aktuellen Spendetauglichkeit und zur Einhaltung der vorgegebenen Zellwerte wird vor und nach jeder Spende das Blutbild kontrolliert. Bei der Spende von mononukleären Zellen werden zusätzlich zu den Leukozyten im Differentialblutbild die Lymphozyten bestimmt.
Sollten diese auf weniger als 1000 pro µl abfallen oder Infekte vermehrt
auftreten, müssen zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden [12].
Gesunde Spender dürfen bis zu sechs Mal pro Jahr mononukleäre Zellen
spenden.
3.2 Der COM.TEC Zellseparator
Der COM.TEC Zellseparator ermöglicht eine selektive Spende von Blutzellen. Das Gerät bietet neben unterschiedlichen Stammzell-Programmen
auch die Möglichkeit zur Sammlung von Thrombozyten und zur Durchführung von Therapieverfahren. Zu letzteren gehört der therapeutische
Austausch von Plasma, Erythrozyten oder Thrombozyten. Auch eine Depletion (die Entfernung von Substanzen aus dem Organismus) von Erythrozyten, Thrombozyten oder Lymphozyten sowie eine therapeutische
Plasmaseparation sind möglich. Der COM.TEC Zellseparator arbeitet mit
einem kontinuierlichen Verfahren, wobei das Blut über zwei Gefäßzugänge gleichzeitig entnommen und zurückgegeben werden kann.
3.2.1 Aufbau
Abbildung 3.1 zeigt den COM.TEC Zellseparator schematisch von der Vorderseite. Auf der Frontplatte befinden sich mehrere Klemmen und Detektoren, die für die Sicherheit und den regelrechten Ablauf des Separations-
25
Abbildung 3.1: COM.TEC Frontseite [22]
Beutelaufhängung
Frontplatte
Schlauchpumpen
Zentrifugentür
Serviceblende
Feststellbremse
Lenkrollen vorne
prozesses zuständig sind. Im Alarmfall kann so der Spenderkreislauf von
dem Maschinenkreislauf getrennt werden. Durch den Spillover Detektor
kann beispielsweise der Gehalt an Erythrozyten und Thrombozyten gemessen werden und der Luftdetektor schlägt Alarm, sobald er Luftblasen
im System erkennt, die den Spender gefährden könnten. Der COM.TEC
Zellseparator ist mit vier peristaltischen Schlauchpumpen (Zellen-, Plasma-, Vollblut,- Rezirkulationspumpe) und einer ACD-Pumpe (Acid-Citrate-
26
Dextrose) ausgestattet. Die Zellpumpe fördert die gesammelten Zellen aus
der Separationskammer in den Sammelbeutel. Die Plasmapumpe sorgt für
den Abtransport des Plasmas. Die Vollblutpumpe fördert das Blut des
Spenders in die Separationskammer. Registriert sie Veränderungen, zum
Beispiel des Blutflusses, werden alle anderen Pumpen und die Zentrifugendrehzahl entsprechend angepasst. Durch die Vollblutpumpe wird der
Spender durch den Druck im System geschützt. Sollte dieser trotzdem zu
Abbildung 3.2: COM.TEC Zentrifuge [22]
Copyright Fresenius Kabi.
Verwendet mit Genehmigung.
Legende:
1 Zentrifugeninnenraum
2 Zentrifugenrotor
6 Stroboskoplampe unten
3 Kammerverriegelung
7 Trenngrenzenfenster
4 Kammeraufnahme
8 Stroboskoplampe oben
5 Antrieb
9 Trenngrenzenfenster
27
groß werden, wird der Ablauf durch eine Klemme gestoppt. Die Rezirkulationspumpe fördert das Plasma erneut durch die Kammer, wo es mit dem
Vollblut des Spenders vermischt wird. Die ACD-Pumpe fördert das Antikoagulanz und wird über einen Tropfenzähler zur Überwachung des
Flusses kontrolliert.
Das Herzstück des Zellseparators ist die Zentrifuge (Abbildung 3.2). Es
handelt sich hierbei um eine rotierende Separationskammer, in der Blutzellen und Plasma durch Zentrifugalkraft voneinander getrennt werden.
Die Zentrifuge muss gleitdichtungsfrei sein. Dafür wird der Zentrifugenschlauch durch den Zentrifugenrotor um die Separationskammer herumgeleitet. Um zu verhindern, dass sich der Zentrifugenschlauch verdrillt,
dreht er sich nur halb so schnell wie die Separationskammer, die bis zu
2200 Umdrehungen pro Minute erreichen kann.
Der COM.TEC Zellseparator kann die Trenngrenzeneinstellung automatisch regeln. Die Trenngrenze ist die Grenze zwischen dem im Inneren
der Zentrifuge verbleibenden Plasma und den sich außen ablagernden
Blutzellen. Die Trenngrenze entsteht in der Einlaufphase des Separationsprozesses durch den hohen Plasmafluss und kann an der Lochreihe
(insgesamt 8) auf der Separationskammer abgelesen werden. Eine LichtAbbildung 3.3: Trenngrenzenerkennung (EK = Erythrozyten)
Copyright Fresenius Kabi. Verwendet mit Genehmigung.
28
schranke erfasst die Lage der Trenngrenze bei jeder Umdrehung anhand
des lichtdurchlässigen Plasmas und der lichtundurchlässigen Blutzellen.
Ist die Differenz zwischen Ist- und Sollwert zu groß wird sie automatisch
angeglichen.
3.2.2 Programme des COM.TEC Zellseparators
3.2.2.1 Leukozytenseparation
Zur Gewinnung peripherer Stammzellen stehen mehrere Verfahren zur
Verfügung. Ob mit einer ein- oder zweistufigen Separationskammer gearbeitet wird, entscheidet sich anhand der Leukozytenwerte des Spenders
vor der Apherese. Bei niedrigen Leukozyten- und Thrombozytenwerten
wird die Separation mit einer zweistufigen Kammer empfohlen, bei hohen
Leukozytenwerten mit einer einstufigen Kammer. In der zweiten Stufe der
Kammer werden die gewünschten Zellen aus dem zellreichen Plasma
gesammelt [53]. Die zweistufige Kammer wird vor allem für die Thrombozytenapherese genutzt. Im Rahmen dieser Studie wurde eine einstufige
Separationskammer verwendet. Für jedes Separationsprogramm wird ein
spezielles Apherese-Set benötigt. Jede Separation besteht aus 5 Schritten:
1. Einlegen des Apherese-Sets
2. Füllen
3. Separation
4. Reinfusion
5. Entnahme des Apherese-Sets
Um die Luft aus dem System zu verdrängen, werden beim Füllen des
Apherese-Sets Natriumchlorid und ACD-A (Acid-Citrate-Dextrose Formula
A, A steht für das Konzentrationsverhältnis) zugefügt.
In der Regel laufen alle Separationsprozesse über ein Dual NeedleVerfahren bzw. Zwei-Arm-Verfahren. Sollte es während des Ablaufes zu
Venenproblemen kommen, muss das Verfahren abgebrochen werden.
29
Eine Leukozytapherese kann, wie oben beschrieben, nicht mit einem sog.
„Ein-Arm-Verfahren“ durchgeführt werden. Zur Sammlung mononukleärer
Zellen bietet der COM.TEC Zellseparator das PBSC-Lym Programm, das
Standard MNC Programm und das autoMNC Programm. Die für diese
Arbeit verwendeten Apheresate wurden mit dem autoMNC Programm gesammelt, weshalb an dieser Stelle nicht näher auf das PBSC-Lym Programm eingegangen wird.
3.2.2.2 Das Standard MNC Programm
Vor Separationsbeginn müssen folgende Daten des Spenders eingegeben
werden: das Geschlecht, die Größe, das Gewicht, der Hämatokrit und die
Leukozytenwerte vor der Spende. Außerdem kann der Vollblutfluss
(Normwert 50 ml/min), die Option einer zusätzlichen Plasmaentnahme, die
Zentrifugendrehzahl und die Trenngrenzenregelung eingestellt werden.
Das ACD:Blut-Verhältnis ist bei dem Standard MNC Programm auf 1:10
eingestellt. Dies erfordert eine gute Überwachung des Spenders aufgrund
möglicher Zitrat-Reaktionen.
Im Spillover-Menü werden das Zyklus-Volumen, das Spillover-Volumen, das Buffy Coat-Volumen und die Zyklenanzahl manuell eingestellt.
Das Zyklus-Volumen ist das prozessierte Vollblutvolumen pro Sammelzyklus. Je höher der Leukozytenwert des Spenders vor der Separation ist,
desto geringer wird das Zyklus-Volumen gewählt, weil sich der Buffy Coat
schnell anreichert. Bei niedrigen Werten sollte es hingegen größer sein,
weil eine Anreicherung entsprechend länger dauert.
Für die Absammlung des Buffy Coats, der sich während der Sammelphase anreichert, wird in der sog. „Spillover-Phase“ bei reduziertem Blutfluss die Sammelkammer durch die Plasmapumpe entleert und der Buffy
Coat in Richtung Sammelbeutel transportiert. Das Volumen ist abhängig
von der Menge des Buffy Coats und der Tiefe in der gesammelt wird. Der
Buffy Coat wird auf diese Art bis zum Y-Stück des Apherese-Sets gefördert. Das Y-Stück verbindet die Plasma- und die Zellenpumpe. Das
Spillover kann unterbrochen werden, wenn sich Zellen über das Y-Stück
30
hinausbewegen. Das bisher geförderte Volumen wird als aktueller Wert in
das Menü übernommen und durch einen Ausdruck dokumentiert.
Das Buffy Coat-Volumen ist das Volumen, das durch die Zellenpumpe
in den Konzentratbeutel gefördert wird. Es muss umso größer sein, je
tiefer in die Buffy Coat-Schicht hinein gesammelt werden soll. Sollten zu
viele Erythrozyten in den Konzentratbeutel gelangen, kann die Buffy CoatPhase unterbrochen werden. Das bis zu diesem Zeitpunkt geförderte Volumen wird automatisch als neuer Wert in das Menü übernommen und
durch einen Ausdruck dokumentiert.
Das Standard MNC Programm ist ein zyklisches Verfahren. Für den
Separationsvorgang wird das P1Y Leukozyten-Set und eine einstufige
Kammer, die PL1 Kammer, verwendet. Jeder Zyklus besteht aus 4 Phasen:
1. Sammelphase
2. Verdichten
3. Spilloverphase
4. Buffy Coat-Phase
In Phase 1 und 2 ist die automatische Trenngrenzenregelung aktiviert, in
Phase 3 und 4 ist sie ausgeschaltet. Die Software des Zellseparators kontrolliert die Plasmapumpe, die die Trenngrenze in Position 7:1 (Zellen:
Plasma) hält. Während das separierte Plasma in der Tropfkammer wieder
mit den Erythrozyten vermischt und dem Spender zurückgegeben wird,
baut sich in der Kammermitte der Buffy Coat auf (Abbildung 3.4). Der gesammelte Buffy Coat wird in der Kammer verdichtet (Abbildung 3.4), von
der Plasmapumpe zum Y-Stück transportiert (Abbildung 3.5) und über die
Zellenpumpe in den Konzentratbeutel gefördert (Abbildung 3.6). Anschließend beginnt der nächste Zyklus. Nach Beendigung der eingegebenen
Zyklen wird das im Apheresesystem enthaltene Blut durch die Spülung mit
Natriumchlorid und ACD-A an den Spender zurückgegeben.
31
Das Standard MNC Programm des COM.TEC Zellseparators ist bei der
Sammlung von CD14+ Zellen anderen Programmen und Zellseparatoren
überlegen [8, 52, 53], weist jedoch einen hohen Gehalt an Restzellen auf,
die die Herstellung dendritischer Zellen beeinflussen können [19, 30, 55].
Abbildung 3.4: Sammel- und Verdichtungsphase
Modifiziert nach: Copyright Fresenius Kabi. Verwendet mit Genehmigung.
3.2.2.3 Das autoMNC Programm
Das autoMNC Programm ist eine Weiterentwicklung des Standard MNC
Programmes, bei dem das Spillover-Volumen nicht manuell eingestellt
werden muss, sondern automatisch geregelt wird. Das autoMNC Programm verfügt über einen optischen Sensor, der bereits geringe Trübungen oder Turbulenzen im System erkennt und die Spillover-Klemme kontrolliert [55]. Die Turbulenzen werden durch thrombozytenreiches Plasma
32
Abbildung 3.5: Spilloverphase
Modifiziert nach: Copyright Fresenius Kabi. Verwendet mit Genehmigung.
verursacht [55]. Das Spillover-Volumen wird durch die Software automatisch angeglichen. Das Buffy Coat-Volumen muss jedoch manuell reguliert
werden. Während bei dem Standard MNC Programm die Buffy Coat-Phase direkt auf die Spillover-Phase folgt, wird bei dem autoMNC Programm
eine Wartephase dazwischen geschaltet, in der sich die Erythrozytenschicht abtrennt [55]. Dies führt zwar zu einer Reduktion des Buffy CoatVolumens, senkt aber auch die Anzahl der Erythrozyten im Konzentrat
[55]. Durch den zusätzlichen Einzug von thrombozytenreichem Plasma
über den Spillover-Sensor ist die Konzentration an Thrombozyten in durch
das autoMNC Programm gesammelten Konzentraten höher als bei dem
Standard MNC Programm [55]. Das autoMNC Programm benötigt das
P1YA-Apherese-Set und sammelt mit der einstufigen PL1 Kammer.
33
Abbildung 3.6: Buffy Coat-Phase
Modifiziert nach: Copyright Fresenius Kabi. Verwendet mit Genehmigung.
3.3 Der ElutraTM Zellseparator
Der Elutra
TM
Zellseparator bietet eine schnelle und effektive Möglichkeit,
gesammelte Monozytenkonzentrate in einem funktionell geschlossenen
System aufzureinigen [7]. Durch die im Konzentrat vorhandenen Restzellen wird die Herstellung der dendritischen Zellen beeinflusst [19, 30,
55], weshalb eine Aufreinigung notwendig ist. Der ElutraTM Zellseparator
trennt die Zellen anhand ihrer Sedimentationsgeschwindigkeiten, die
durch die Zellgröße und Dichte bestimmt werden, wobei die Zellgröße in
diesem Verfahren die entscheidende Bedeutung hat [7]. Das Separationsprinzip der Gegenstromelutriation ist in Abbildung 3.7 schematisch
dargestellt.
34
Abbildung 3.7: Separationsprinzip des ElutraTM Zellseparators
Gemäß dem gewünschten Wortlaut der Firma:
“Copyright, CaridianBCT, Inc. 2011. Used with Permission.”
Um ein gutes Ergebnis zu erzielen muss das Konzentrat mindestens 45x109 kernhaltige Zellen enthalten, damit innerhalb der Separationskammer ein Gradient aufgebaut werden kann [7]. Dem Zellkonzentrat wird in
der 40 ml großen Separationskammer ein Phosphatpuffer und Humanalbumin zugefügt [7]. Der Separationsprozess dauert ca. 60 Minuten und
kann in fünf Zellfraktionen (1 bis 5, von der Zellgröße her zunehmend) eingeteilt werden, die in unterschiedliche Beutel gesammelt werden [7, 13].
• Fraktion 1: Thrombozyten, teilweise Erythrozyten
• Fraktion 2: Erythrozyten, wenige Lymphozyten
• Fraktion 3: Lymphozyten
• Fraktion 4: Granulozyten, wenige Monozyten
• Fraktion 5: Monozyten
Der ElutraTM Zellseparator ermöglicht eine Monozytenausbeute von ca.
60% mit einem durchschnittlichen Reinheitsgrad von 80% [7]. Bis zu 95%
der Thrombozyten können durch dieses Verfahren ausgewaschen werden
[7]. Der Erythrozytenanteil des Leukozytenkonzentrates darf nicht zu hoch
sein, weil sonst ein höherer Anteil an Leukozyten inklusive Subpopulationen (Monozyten oder Lymphozyten) zusammen mit den Erythrozyten
35
verloren geht und damit den Anteil der gewonnenen Leukozytenpopulation
nach Aufreinigung durch Elutriation erheblich vermindert [13]. Als Grenzwerte gelten ein Erythrozytenvolumen von 7,5 ml [13] oder ein Hämatokrit
unter 2% [7]. Sollte die Konzentration höher sein, können die Erythrozyten
verdichtet werden (Abbildung 3.8), was jedoch mit einem hohen Verlust
von Monozyten einhergeht und deshalb vermieden werden sollte [13].
Abbildung 3.8: ElutraTM Separationskammer
Gemäß dem gewünschten Wortlaut der Firma:
“Copyright, CaridianBCT, Inc. 2011. Used with Permission.”
Links: Anfangskonzentrat
Mitte: Verdichtung von Erythrozyten
Rechts: Monozytenanreicherung in Fraktion 5
3.4 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie bietet die Möglichkeit, die physikalischen und
molekularen Eigenschaften einzelner Zellen mit einer hohen Messgeschwindigkeit zu erfassen. Die Zellen werden an einem Lichtstrahl (Laser)
vorbeigeführt, der je nach Zellaufbau gebrochen und von Detektoren gemessen wird. Die zu analysierende Probe wird in eine Messküvette gegeben. Der Querschnitt der Messküvette wird verringert und so eine beschleunigte laminare Strömung erzeugt. Dieser Vorgang wird durch die die
Küvette umhüllende Trägerflüssigkeit unterstützt. Durch die Verringerung
des Querschnitts wird der Abstand zwischen den Zellen vergrößert und sie
passieren nacheinander den Lichtstrahl. Auf diese Weise kann jede Zelle
einzeln gemessen werden. Hierbei entstehen ein Vorwärts- und ein Seit-
36
wärtsstreulicht. Das Vorwärtsstreulicht entsteht durch Lichtbeugung und
ist proportional zur Zelloberfläche, misst also die Zellgröße [3], das Seitwärtsstreulicht entsteht durch Lichtbrechung und Reflexion und ist proportional zur Zellgranularität bzw. Zellkomplexität [3]. Dieser Vorgang ist in
Abbildung 3.9 schematisch dargestellt.
Abbildung 3.9: Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht
Modifiziert nach [3]
Die Daten werden in ein Diagramm (Dot Plot) mit x-Achse (Vorwärtsstreulicht) und y-Achse (Seitwärtsstreulicht) aufgetragen. Durch Floureszenzmarker können die molekularen Eigenschaften der Zellen bestimmt
werden. Das einfallende Licht trifft auf die mit einem Floureszenzmarker
beladene Zelle, wo es in einem 90 Grad Winkel mit einer geringeren
Energie absorbiert und von den Detektoren gemessen wird [3]. Diese
Messung ist notwendig, um die Zellen anhand der CD-Klassifikation einzuteilen. Die gemessenen Daten können in einem Histogramm oder einem
Punktewolken-Diagramm (Dot Plot) dargestellt werden. Das für die Daten
37
dieser Arbeit verwendete Durchflusszytometer FACS CaliburTM erreicht
eine Messgeschwindigkeit von bis zu 4000 Zellen pro Sekunde [3] und
bietet somit eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit der Zellanalyse.
3.5 Studiendesign und Spenderkollektiv
An der Studie nahmen 102 Personen teil. Darunter waren 24 weibliche
und 78 männliche Spender. Ihr Alter betrug 18 bis 58 Jahre. Bei den
Spendern handelt es sich um gesunde, nicht durch Zytokine stimulierte
Probanden. Insgesamt wurden in der Zeit von Januar 2008 bis Dezember
2009 253 Apheresate gespendet. Alle wurden mit dem autoMNC Programm des COM.TEC Zellseparators der Firma Fresenius Kabi gesammelt. Die Zentrifugendrehzahl betrug 1500 Umdrehungen pro Minute, der
Vollblutfluss lag bei 50 ml pro Minute. Es wurde eine einstufige Zentrifugenkammer verwendet. Die Anzahl der Zellzyklen lag zwischen 11 und
17, die Spendezeit zwischen 89 und 130 Minuten. Das prozessierte Blutvolumen betrug 3634 bis 5629 ml.
Vor und nach jedem Spendevorgang wurden jedem Spender 2 ml
EDTA-Blut entnommen und die Leukozyten, Lymphozyten, Erythrozyten,
Thrombozyten und der Hämatokrit durch Partikelzählung mit dem Sysmex
K1000 Blutbild-Automaten bestimmt. Aus dem Konzentrat wurden hierfür
0,5 ml entnommen. Die Klassifizierung der Monozyten erfolgte durch
direkte Immunfloureszenz anhand der Durchflusszytometrie (FACS
CaliburTM).
3.6 Statistische Auswertung
Alle Daten wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm PASW Statistics 18 (SPSS® für Microsoft Windows, SPSS Inc.) statistisch analysiert.
Die eingegebenen und berechneten Daten wurden anhand des ShapiroWilk-Tests auf Normalverteilung geprüft. War der p-Wert größer als 0,05,
sind die Daten normalverteilt und wurden mit dem T-Test für ungepaarte
Stichproben analysiert. War der p-Wert kleiner als 0,05, liegt keine
Normalverteilung vor und die Daten wurden anhand des U-Tests (Mann-
38
Whitney-Wilcoxon) statistisch analysiert. P steht für „probability“, auf
Deutsch „Wahrscheinlichkeit“. Bei dem p-Wert handelt es sich um einen
Wert zwischen Null und Eins, der im Rahmen statistischer Tests verwendet wird um zu entscheiden, ob die formulierte Nullhypothese angenommen oder verworfen wird. Die Nullhypothese (Beispiel: es gibt keinen
Unterschied zwischen den Therapien) steht der Alternativhypothese (Beispiel: es gibt einen Unterschied zwischen den Therapien) gegenüber. Ist
der p-Wert kleiner als 0,05 bzw. 0,01, gelten die Ergebnisse als signifikant
bzw. hochsignifikant und die Nullhypothese wird verworfen. Ist er größer
als 0,05, ist der Unterschied nicht signifikant und die Nullhypothese wird
angenommen. Die Irrtumswahrscheinlichkeit liegt bei unter 5%.
Zur graphischen Darstellung wurden der Boxplot und der Scatterplot
verwendet. Der Boxplot (Box-and-Whiskers-Plot) ermöglicht die Darstellung von Minimum, Maximum, Median, 25. und 75. Perzentile eines
stetigen Merkmals, das eine quantitative Messgröße darstellt. Mit dem
Scatterplot (Punktewolke-Diagramm) ist eine Darstellung des Zusammenhangs zweier stetiger Merkmale möglich. Je größer der Zusammenhang
der angegebenen Werte, desto mehr lagern sich die Punkte zu einer Geraden zusammen. Um den Zusammenhang numerisch auszudrücken,
kann der Korrelationskoeffizient (r) berechnet werden. Liegt ein linearer
Zusammenhang vor und sind die Daten normalverteilt, wird der Koeffizient
nach Pearson berechnet. Besteht keine symmetrische Verteilung, wird der
Koeffizient nach Spearman berechnet. Die Werte können zwischen -1 und
+1 liegen. Ist der Koeffizient größer als Null, besteht ein positiver, ist er
kleiner als Null, ein negativer Zusammenhang. Je mehr sich der Koeffizient dem Wert +1 annähert, desto größer ist der positive lineare Zusammenhang der Merkmale und umgekehrt. Ist der Koeffizient gleich Null,
liegt kein linearer Zusammenhang vor.
39
3.7 Untergruppen der Datenanalyse
Zur Beschreibung und statistischen Analyse der Daten wurden Variablen
gebildet und in verschiedene Subgruppen unterteilt.
1) Blutvolumen
Das Verhältnis des während der Sammelzyklen prozessierten Blutvolumens (PBV) zu dem von Geschlecht und Körpergewicht abhängigen totalen Blutvolumen (TBV) des Spenders wurde berechnet und mit < 1 (n =
140) und ≥ 1 (n = 113) definiert.
2) Buffy Coat-Volumen
Zur näheren Beschreibung der Buffy Coat-Volumina (BCV) und den Einfluss der Volumenvariation und Volumenreduktion wurden die folgenden
sechs Untergruppen gebildet:
Tabelle 3.1: Einteilung des Buffy Coat-Volumens
Gruppe
1
2
3
4
5
6
BCV in ml
≥ 10
9-9,9
8-8,9
7-7,9
6-6,9
<6
Anzahl (n)
48
19
84
34
33
35
3) Änderung des Buffy Coat-Volumens
Bei 87 Spendern wurde das Buffy Coat-Volumen während der Sammelzyklen variiert, bei 166 blieb es über den gesamten Separationsablauf
gleich.
4) Mehrfache Monozytenspende
48 Apheresate wurden durch Spender gespendet, die im Beobachtungszeitraum einmalig zur Monozytenapherese kamen und 205 Apheresate
durch Spender, die mehrfach Apheresate gespendet haben.
40
5) Konzentratvolumen
Das Konzentratvolumen (KV) der Apheresate wurde in vier Gruppen
eingeteilt.
Tabelle 3.2: Einteilung des Konzentratvolumens
Gruppe
1
2
3
4
Konzentratvolumen in ml
≤ 99
100-124
125-149
≥ 150
Anzahl (n)
34
79
92
48
6) Sammelzyklen
Bei den meisten Separationen wurden 15 Zyklen durchlaufen. Um zu
prüfen, ob durch eine höhere oder niedrigere Zyklenanzahl die Produktqualität verbessert werden kann, wurden anhand der Sammelzyklen Gruppen von 11 bis 17 gebildet und untereinander verglichen.
7) Separationszeit
Zur Beurteilung der Separationszeit (SZ) und ihres Einflusses auf die
Qualität des Apheresats wurden zwei Gruppen definiert, deren Werte sich
von der üblichen Zeitangabe von 120 Minuten am stärksten unterschieden. Bei 8 Spenden betrug die Separationszeit weniger als 106 Minuten (Gruppe A), bei 12 Zyklen mehr als 126 Minuten (Gruppe B).
3.8 Berechnungen und Formeln
Die Konzentration der CD14+ Monozyten vor und nach der Spende wurde
folgendermaßen berechnet:
• Zellkonzentration (Zellen/µl) =
CD14+ (%) x (Leukozyten x103/µl) x 10
41
Die Konzentration der CD14+ Monozyten im Konzentrat wurde wie folgt
berechnet:
• Zellkonzentration (Zellen/µl) = CD14+ (%) x (Leukozyten/µl) / 100
Der Zellverlust (ZV) wurde folgendermaßen berechnet:
• ZV CD14+ in % = {1- [(Zellkonzentration CD14+/µl nach Spende) /
(Zellkonzentration CD14+/µl vor Spende)]} x (-100)
• ZV Leukozyten in % = {1- [(Leukozyten x103/µl nach Spende) /
(Leukozyten x103/µl vor Spende)]} x (-100)
• ZV Lymphozyten in % = {1- [(Lymphozyten x103/µl nach Spende /
Lymphozyten x103/µl vor Spende)]} x (-100)
• ZV Thrombozyten in % = {1- [(Thrombozyten x103/µl nach Spende)
/ (Thrombozyten x103/µl vor Spende)]} x (-100)
• ZV Erythrozyten in % = {1- [(Erythrozyten x106/µl nach Spende) /
(Erythrozyten x106/µl vor Spende)]} x (-100)
• ZV Hämatokrit in % = {1- [(Hämatokrit in % nach Spende /
Hämatokrit in % vor Spende)]} x (-100)
Der Zellgehalt (ZG) wurde wie folgt berechnet:
• ZG CD14+ x109 = [(Leukozyten/µl im Konzentrat) x KV (ml) /
1000000] x CD14+ Zellen (%) im Konzentrat / 100
• ZG Leukozyten x109 = (Leukozyten/µl im Konzentrat) x KV (ml) /
1000000
42
• ZG Thrombozyten x1011 = (Thrombozyten x103/µl im Konzentrat) x
KV (ml) / 100000
• ZG Erythrozyten x1011 = (Erythrozyten x106/µl im Konzentrat) x KV
(ml) / 100
Der Zellgehalt pro Minute wurde folgendermaßen berechnet:
• ZG pro Minute Leukozyten x107 = [(Leukozyten/µl im Konzentrat) x
KV x 1000000] x 100 / SZ (min)
• ZG pro Minute CD14+ Monozyten x107 = {[(Leukozyten/µl im
Konzentrat) x KV (ml) / 1000000] x CD14+ Zellen im Konzentrat (%)
/ 100} x 100 / SZ (min)
• ZG pro Minute Thrombozyten x109 = [(Thrombozyten x103/µl im
Konzentrat) x KV (ml) / 100000] x 100 / SZ (min)
• ZG pro Minute Erythrozyten x108 = [(Erythrozyten x106/µl im
Konzentrat) x KV (ml) / 100] x 1000 / SZ (min)
Die Sammeleffizienz (SE) wurde wie folgt berechnet:
• SE CD14+ in % = {(ZG CD14+ x109/µl) / [PBV (ml) / 1000000 x 0,5
x ((CD14+/µl vor Spende) + (CD14+/µl nach Spende))]} x 100
• SE Leukozyten in % = {(ZG Leukozyten x109/µl) / [PBV (ml) / 1000
x 0,5 x ((Leukozyten x103/µl vor Spende) + (Leukozyten x103/µl
nach Spende))]} x 100
43
• SE Thrombozyten in % = {(ZG Thrombozyten x1011/µl) / [PBV (ml) /
100000
x
0,5
x
((Thrombozyten
x103/µl
vor
Spende)
+
(Thrombozyten x103/µl nach Spende))]} x 100
• SE Erythrozyten in % = {(ZG Erythrozyten x1011/µl) / [PBV (ml) /
100 x 0,5 x ((Erythrozyten x106/µl vor Spende) + (Erythrozyten
x106/µl nach Spende))]} x 100
Das Verhältnis zwischen prozessiertem Blutvolumen (PBV) und totalem
Blutvolumen (TBV) des Spenders wurde folgendermaßen berechnet:
• Ratio = PBV (ml) / TBV(ml)
44
4. Ergebnisse
4.1 Spendedaten
Insgesamt wurden 24 weibliche und 78 männliche gesunde Spender in die
Studie eingeschlossen. Das Alter der Spender lag zwischen 18 und 58
Jahren. Es wurde eine retrospektive statistische Auswertung von 253
Apheresaten durchgeführt, die zwischen Januar 2008 und Dezember 2009
gespendet wurden. Alle Konzentrate wurden mit dem autoMNC Programm
des COM.TEC Zellseparators gesammelt. Die Zentrifugendrehzahl lag bei
1500 Umdrehungen pro Minute, der Vollblutfluss bei 50 ml pro Minute. Die
Separationszeit ist von der Anzahl der Sammelzyklen (MW = 15) abhängig
und betrug im Mittel 120 Minuten. Das Verhältnis von zugefügtem Antikoagulans und prozessiertem Blutvolumen betrug 1:10. Das totale Blutvolumen wird durch das Geschlecht und Körpergewicht der Spender beeinflusst. Die Tabelle 4.1 gibt einen Überblick über die Spendedaten.
Tabelle 4.1: Übersicht der Spendedaten
Minimum
Maximum
Median
MW ± SA
Alter der Spender
18
58
29
33,32 ± 10,31
Körpergewicht (kg)
54
125
77
78,94 ± 13,03
3480
7784
5207
5190 ± 828
3634
5629
5275
5093 ± 309
364
569
527
511 ± 31,46
11
17
15
15,01 ± 0,94
89
130
122
120 ± 6,39
63
206
129
128 ± 28
Totales Blutvolumen
(ml)
Prozessiertes
Blutvolumen (ml)
Antikoagulation (ml)
Anzahl
Separationszyklen
Separationszeit
(min)
Konzentratvolumen
(ml)
45
4.1.1 Blutwerte der Spender
Um eine gesundheitliche Gefährdung der Spender durch einen zu hohen
Zellverlust erkennen zu können, wurde vor und nach jedem Sammelprozess ein Blutbild mit Differentialblutbild bestimmt. Es zeigte sich eine Abnahme der CD14+ Monozyten und Lymphozyten um bis zu 23% und eine
Tabelle 4.2: Blutwerte der Spender vor und nach der Apherese
VOR
MW ± SA
NACH
MW ± SA
Zellverlust
in %
MW ± SA
Leukozyten x103/µl
5,30 ± 1,15
4,77 ± 1,04
9,30 ± 11,75
CD14+ Monozyten/µl
345 ± 146
267 ± 114
19,63 ± 24,47
1,61 ± 0,46
1,20 ± 0,33
23,39 ± 16,04
234 ± 48
162 ± 33
30,26 ± 8,50
Erythrozyten x10 /µl
4,74 ± 0,36
4,58 ± 0,39
3,40 ± 4,01
Hämatokrit in %
41,59 ± 2,70
40,37 ± 3,04
2,92 ± 4,23
3
Lymphozyten x10 /µl
3
Thrombozyten x10 /µl
6
Abbildung 4.1: Lymphozytenkonzentration der Spender
46
Abnahme der Thrombozyten um 30%. Die Lymphozyten- und die Thrombozytenkonzentrationen der Spender vor und nach der Apherese sind in
den Abbildungen 4.1 und 4.2 dargestellt.
Abbildung 4.2: Thrombozytenkonzentration der Spender
Neben den Blutwerten der Spender wurden auch die Zellwerte der gewonnenen Konzentrate bestimmt (Tabelle 4.3).
Tabelle 4.3: Zellkonzentrationen im Apheresat
Minimum Maximum Median
MW ± SA
Leukozyten/µl
13700
82300
48200
49002 ± 12222
CD14+ Monozyten/µl
2459
23970
10450
10853 ± 3348
Lymphozyten x103/µl
11,00
74,40
38,50
38,88 ± 10,93
1614
7232
4083
4064 ± 1102
Erythrozyten x10 /µl
0,24
4,13
0,77
0,86 ± 0,41
Hämatokrit in %
1,10
35,30
6,90
7,89 ± 3,90
3
Thrombozyten x10 /µl
6
47
Die Konzentration der CD14+ Monozyten im Apheresat betrug im Mittel
10853 Zellen pro µl. Die Thrombozyten und Erythrozyten sollten als Restzellen möglichst geringe Werte erreichen. Die Thrombozytenkonzentration
lag im Mittel bei 4046 x103/µl und die Erythrozytenkonzentration bei 0,86
x106/µl. Als extremer Ausreißer ist die maximale Erythrozytenkonzentration von 4,13 x106/µl zu bewerten, die einen maximalen Hämatokrit von
35,3% im Konzentrat bedingt. Im Mittel lag der Hämatokrit bei 7,89%.
4.1.2 Zellgehalt und Sammeleffizienz
Der Zellgehalt, der Zellgehalt pro Minute und die Sammeleffizienz sind im
Gegensatz zu den maschinell gemessenen Zellzahlen pro Mikroliter
statistisch berechnete Werte, die zusätzliche Parameter berücksichtigen.
Der Zellgehalt beschreibt die Konzentration der Zellen im Apheresat und
wird anhand der Zellkonzentration im Apheresat und des Konzentratvolumens berechnet. Tabelle 4.4 gibt einen Überblick der Werte der Zielund Restzellen im Konzentrat. Für die CD14+ Monozyten ergab sich ein
Zellgehalt von 1,36 x109. Der Zellgehalt der Thrombozyten lag bei 5,04
x1011 und die Erythrozyten erreichten einen Mittelwert von 1,15 x1011.
Tabelle 4.4: Zellgehalt im Konzentrat
Zellgehalt
Minimum
Maximum
Median
MW ± SA
Leukozyten x109
1,73
11,41
6,08
6,13 ± 1,63
CD14+ Monozyten x109
0,31
2,55
1,30
1,36 ± 0,44
Thrombozyten x1011
1,61
11,15
4,93
5,04 ± 1,35
Erythrozyten x1011
0,25
6,28
0,89
1,15 ± 0,71
Der Zellgehalt pro Minute berücksichtigt den Einfluss der Separationszeit und ermöglicht eine zeitkorrigierte Aussage über die Zellkonzentrationen. Der Zellgehalt pro Minute der CD14+ Monozyten lag bei 1,13 x107.
Der Zellgehalt pro Minute der Thrombozyten erreichte einen Mittelwert von
48
4,14 x109. Der Zellgehalt pro Minute der Erythrozyten zeigte eine starke
Differenz zwischen Minimum und Maximum und erreichte einen Mittelwert
von 9,61 x108.
Tabelle 4.5: Zellgehalt pro Minute im Konzentrat
Zellgehalt pro Minute
Minimum Maximum
Median
MW ± SA
Leukozyten x107
1,43
9,38
5,02
5,10 ± 1,34
CD14+ Monozyten x107
0,26
2,12
1,08
1,13 ± 0,36
Thrombozyten x109
1,31
8,92
4,14
4,19 ± 1,09
Erythrozyten x108
2,25
57,07
7,38
9,61 ± 6,20
Die Sammeleffizienz wird durch das prozessierte Blutvolumen, die Zellwerte der Spender vor und nach dem Separationsprozess und der entsprechenden Zellkonzentration im Apheresat berechnet und gibt Aufschluss über die Effektivität des Sammelprozesses. Die Sammeleffizienz
der CD14+ Monozyten durch den COM.TEC Zellseparator lag im Mittel bei
99%. Die Sammeleffizienz der Thrombozyten erreichte mit 51% ebenfalls
einen hohen Wert.
Tabelle 4.6: Sammeleffizienz der Ziel- und Restzellen
Sammeleffizienz in %
Minimum
Maximum
Median
MW ± SA
Leukozyten
7,17
44,63
24,38
24,31 ± 6,06
CD14+ Monozyten
18,36
367,80
86,63
99,10 ± 50,17
Thrombozyten
16,66
84,80
50,32
50,52 ± 10,80
Erythrozyten
0,11
2,72
0,38
0,49 ± 0,33
49
4.2 Vergleich verschiedener Buffy Coat-Volumina
Das bei dem COM.TEC Zellseparator automatisch eingestellte Buffy CoatVolumen lag bei 10 ml. Im Rahmen dieser Studie wurde das Buffy CoatVolumen manuell zwischen 4 ml und 15 ml variiert. Während der Sammelprozesse wurden von allen Spendern mindestens 11 Zyklen durchlaufen,
maximal waren es 17 Sammelzyklen. Das Buffy Coat-Volumen lag im Mittel bei 8 ml. Die Mittelwerte der Buffy Coat-Volumina während der unterschiedlichen Sammelzyklen sind in Tabelle 4.7 dargestellt.
Tabelle 4.7: Buffy Coat-Volumen und Sammelzyklen
Sammelzyklus
N
1 bis 11
Buffy Coat-Volumen (ml)
Minimum
Maximum
MW ± SA
253
4,0
15,0
8,23 ± 1,85
12
251
4,0
15,0
8,10 ± 1,90
13
248
4,0
15,0
8,08 ± 1,91
14
243
4,0
12,0
8,03 ± 1,85
15
211
4,0
12,0
8,16 ± 1,85
16
37
4,0
12,0
8,70 ± 2,79
17
24
4,0
12,0
7,39 ± 2,36
4.2.1 Buffy Coat-Volumenänderung
Das Buffy Coat-Volumen (BCV) konnte während der Sammlung verändert
werden. Von insgesamt 253 Apheresen wurde bei 87 das Volumen geändert, bei 166 blieb es die gesamte Separationszeit über gleich. Die Sammelergebnisse der Zielzellen sind in Tabelle 4.8 dargestellt.
Das Konzentratvolumen der Apheresate, bei denen das Buffy Coat-Volumen über den gesamten Zyklus gleich blieb, war mit einem p-Wert
kleiner 0,01 hochsignifikant größer als dasjenige, bei dem im Verlauf eine
Änderung erfolgte. Bei den absoluten Leukozyten- und Monozytenwerten
zeigte sich kein signifikanter Unterschied. Der Zellgehalt und die Sammeleffizienz für die Leukozyten und CD14+ Monozyten hingegen waren bei
den gleich bleibenden Buffy Coat-Werten hochsignifikant größer (p-Werte
50
Abbildung 4.3: Sammeleffizienz der Leukozyten
Abbildung 4.4: Zellgehalt der CD14+ Monozyten
51
< 0,01). Die Sammeleffizienz der Leukozyten bei geändertem Buffy CoatVolumen ist in Abbildung 4.3 dargestellt. Der Zellgehalt pro Minute lieferte
als zeitkorrigierter Wert für die Leukozyten und CD14+ Monozyten im
Konzentrat ebenfalls hochsignifikant höhere Ergebnisse für die Gruppe,
bei der das Buffy Coat-Volumen nicht variiert wurde (p-Werte < 0,01).
Der Zellgehalt der CD14+ Monozyten bei variiertem und nicht variiertem Buffy Coat-Volumen ist in Abbildung 4.4 dargestellt.
Tabelle 4.8: Sammelergebnisse der Zielzellen
Buffy Coat-Volumen
Variiert
MW ± SA
Nicht variiert
MW ± SA
p–Wert
Konzentratvolumen in ml
110,64 ± 22,46
136,53 ± 26,41
< 0,01A
Leukozyten/µl
49253 ± 12773
48702 ± 12009
0,735B
Zellgehalt
Leukozyten x109
5,36 ± 1,44
6,53 ± 1,59
< 0,01B
Zellgehalt pro Minute
Leukozyten x107
4,48 ± 1,21
5,43 ± 1,30
< 0,01A
Sammeleffizienz
Leukozyten in %
21,14 ± 5,85
25,97 ± 5,49
< 0,01A
CD14+ Monozyten/µl
11111 ± 3615
10683 ± 3179
0,633A
Zellgehalt CD14+
Monozyten x109
1,22 ± 0,44
1,43 ± 0,43
< 0,01A
Zellgehalt pro Minute
CD14+ Monozyten x107
1,02 ± 0,36
1,19 ± 0,35
< 0,01A
Sammeleffizienz CD14+
Monozyten in %
85,37 ± 38,72
106,29 ± 53,96
< 0,01A
A = U-Test, B = T-Test
Die Sammelergebnisse der Thrombozyten und Erythrozyten im Konzentrat bezogen auf eine Änderung des Buffy Coat-Volumens sind in
Tabelle 4.9 dargestellt. Die absolute Thrombozytenkonzentration war bei
den nicht veränderten Buffy Coat-Werten hochsignifikant niedriger (p-Wert
< 0,01). Dieser Verlauf ist in Abbildung 4.5 graphisch dargestellt. Für den
Zellgehalt und den Zellgehalt pro Minute der Thrombozyten zeigten sich
52
Tabelle 4.9: Sammelergebnisse der Restzellen
Buffy Coat-Volumen
Variiert
(MW ± SA)
Nicht variiert
(MW ± SA)
p–Wert
Thrombozyten x103/µl
4475 ± 1022
3849 ± 1084
< 0,01B
Zellgehalt
Thrombozyten x1011
4,94 ± 1,61
5,09 ± 1,20
0,132A
Zellgehalt pro Minute
Thrombozyten x109
4,13 ± 1,29
4,23 ± 0,97
0,162A
Sammeleffizienz
Thrombozyten in %
48,33 ± 11,95
51,67 ± 9,99
0,019B
Erythrozyten x106/µl
0,69 ± 0,31
0,95 ± 0,43
< 0,01A
Zellgehalt
Erythrozyten x1011
0,78 ± 0,46
1,34 ± 0,74
< 0,01A
Zellgehalt pro Minute
Erythrozyten x108
6,55 ± 4,06
11,22 ± 6,52
< 0,01A
Sammeleffizienz
Erythrozyten in %
0,33 ± 0,22
0,58 ± 0,34
< 0,01A
A = U-Test, B = T-Test
Abbildung 4.5: Thrombozytenkonzentration
53
keine signifikanten Unterschiede. Die Sammeleffizienz der Thrombozyten
war bei einer Buffy Coat-Volumenänderung signifikant geringer (p-Wert
0,019).
Die absolute Erythrozytenzahl zeigte bei verändertem Buffy Coat-Volumen eine hochsignifikante Abnahme (p-Wert < 0,01). Der Zellgehalt pro
Minute der Erythrozyten im Konzentrat ist in Abbildung 4.6 dargestellt. Es
ergaben sich hochsignifikant geringere Werte bei variiertem Buffy CoatVolumen (p-Wert < 0,01). Der Zellgehalt und die Sammeleffizienz der Erythrozyten waren bei einer Volumenänderung ebenfalls hochsignifikant
geringer (p-Werte < 0,01).
Abbildung 4.6: Zellgehalt pro Minute der Erythrozyten
4.2.2 Ergebnisse bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens
Im Rahmen dieser Studie wurde das Buffy Coat-Volumen mit dem Ziel, die
Qualität der Monozytenkonzentrate zu verbessern und die Konzentration
der Thrombozyten und Erythrozyten zu reduzieren, auf bis zu 4 ml gesenkt. Das Buffy Coat-Volumen wurde für die Analyse in sechs Gruppen
eingeteilt (Tabelle 3.1).
54
4.2.2.1 Leukozyten
Bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens zeigte sich eine Zunahme der absoluten Leukozytenzahl im Konzentrat. Als Ausgangsgruppe für die statistische Auswertung wurde die Gruppe 1 gewählt und mit den anderen fünf
Gruppen durch den T-Test für unabhängige Stichproben verglichen.
Im Vergleich der Ausgangsgruppe mit der Gruppe 2 zeigte sich bei
einem p-Wert von 0,011 eine signifikante Zunahme der Leukozyten im
Konzentrat und ab einem Buffy Coat-Volumen von unter 9 ml eine hochsiTabelle 4.10: Sammelergebnisse der Leukozyten
Gruppe BCV
in ml
Leukozyten
x103/µl
MW ± SA
SammelZellgehalt
effizienz in
x109
%
MW ± SA
MW ± SA
Zellgehalt
pro Minute
x107
MW ± SA
1
≥ 10
40,72 ± 9,65
28,61 ± 5,73
6,87 ± 1,69
5,88 ± 1,41
2
9 bis 9,9
47,62 ± 9,72
26,91 ± 4,70
6,75 ± 1,36
5,51 ± 1,07
3
8 bis 8,9
49,98 ± 11,85
24,94 ± 5,66
6,41 ± 1,56
5,30 ± 1,28
4
7 bis 7,9
52,20 ± 10,82
23,37 ± 4,88
6,06 ± 1,30
5,00 ± 1,04
5
6 bis 6,9
51,25 ± 11,44
20,91 ± 4,43
5,33 ± 1,38
4,44 ± 1,08
6
<6
52,72 ± 15,00
19,62 ± 5,44
4,89 ± 1,44
4,08 ± 1,16
BCV = Buffy Coat-Volumen
Tabelle 4.11: P-Werte der Leukozyten
Vergleich
der Gruppen
p-Wert
Leukozyten/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x109
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x107
1 und 2
0,011B
0,256B
0,778B
0,312B
1 und 3
< 0,01B
0,001B
0,119B
0,016B
1 und 4
< 0,01B
< 0,01B
0,022B
0,003B
1 und 5
< 0,01B
< 0,01B
< 0,01B
< 0,01B
1 und 6
< 0,01B
< 0,01B
< 0,01B
< 0,01B
A = U-Test, B = T-Test
55
gnifikante Zunahme (p-Wert < 0,01). Dieser Verlauf ist in Abbildung 4.7
graphisch dargestellt. Im Vergleich der Gruppen 2 bis 6 untereinander
(Tabelle 4.12) ergab sich kein signifikanter Unterschied.
Abbildung 4.7: Leukozytenkonzentration
Die Sammeleffizienz der Leukozyten zeigte bei Reduktion des Buffy
Coat-Volumens abnehmende Werte (Abbildung 4.8). Diese Abnahme war
ab einem Buffy Coat-Volumen von weniger als 9 ml hochsignifikant (pWert < 0,01). Der Leukozytengehalt nahm bei Reduktion des Buffy CoatVolumens ab. Die Abnahme des Zellgehaltes war bei einem Vergleich der
Gruppen 1 und 4 signifikant (p-Wert 0,022) und ab einem Buffy CoatVolumen von unter 7 ml hochsignifikant (p-Wert < 0,01). Der Zellgehalt pro
Minute der Leukozyten zeigte mit der Volumenreduktion ebenfalls abnehmende Werte. Bei dem Vergleich der Gruppen 1 und 3 ergab sich mit
einem p-Wert von 0,016 eine signifikante und bei einem Buffy Coat-
56
Volumen von unter 8 ml eine hochsignifikante (p-Wert < 0,01) Abnahme
des Zellgehaltes pro Minute. Bei dem Vergleich der Gruppen 2 bis 6
untereinander (Tabelle 4.12) war der Abfall der Sammeleffizienz, des ZellTabelle 4.12: P-Werte beim Vergleich der Gruppen untereinander
Vergleich
der Gruppen
p-Wert
Leukozyten/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x109
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x107
2 und 3
0,420B
0,161B
0,391B
0,492B
3 und 4
0,348B
0,160B
0,243B
0,114A
4 und 5
0,728B
0,035B
0,030B
0,021A
5 und 6
0,652B
0,286B
0,197B
0,196B
A = U-Test, B = T-Test
Abbildung 4.8: Sammeleffizienz der Leukozyten
57
gehaltes und des Zellgehaltes pro Minute der Leukozyten, außer bei dem
Vergleich der Gruppen 4 und 5, nicht signifikant.
4.2.2.2 CD14+ Monozyten
Die CD14+ Monozyten waren die Zielzellen des Sammelprozesses. Sie
werden zur in vitro Herstellung von dendritischen Zellen verwendet, wofür
eine optimale Produktqualität Voraussetzung ist. Um den Einfluss der
gezielten Buffy Coat-Volumenreduktion auf die Sammelwerte der CD14+
Monozyten zu analysieren, wurde wie bei den Leukozytenwerten die
Gruppe 1 als Ausgangsgruppe gewählt und mit den anderen fünf Gruppen
verglichen (Tabelle 4.14).
Tabelle 4.13: Sammelergebnisse der CD14+ Monozyten
Gruppe BCV
in ml
CD14+/µl
MW ± SA
Sammeleffizienz in %
MW ± SA
Zellgehalt
x109
MW ± SA
Zellgehalt
pro Minute
x107
MW ± SA
1
≥ 10
9351 ± 2366
113,18 ± 49,99
1,58 ± 0,41
1,34 ± 0,33
2
9 bis 9,9
10374 ± 3757 113,60 ± 68,50
1,47 ± 0,53
1,20 ± 0,42
3
8 bis 8,9
11055 ± 3362 104,59 ± 53,97
1,42 ± 0,43
1,17 ± 0,35
4
7 bis 7,9
11188 ± 3001 88,16 ± 35,85
1,29 ± 0,32
1,07 ± 0,26
5
6 bis 6,9
11725 ± 4014 85,11 ± 38,19
1,22 ± 0,42
1,01 ± 0,34
6
<6
11375 ± 3338 82,54 ± 43,88
1,07 ± 0,40
0,89 ± 0,32
BCV = Buffy Coat-Volumen
Die Monozytenkonzentration im Apheresat nahm bei Reduktion des
Buffy Coat-Volumens zu (Abbildung 4.9). Die Zunahme war ab einem
Buffy Coat-Volumen von unter 9 ml hochsignifikant (p-Wert < 0,01). Der
Vergleich der Gruppen 2 bis 6 untereinander (Tabelle 4.15) zeigte keinen
signifikanten Unterschied der Zellzunahme.
Die Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten erreichte bei einem Vergleich der Gruppen 1 und 3 (p-Wert 0,014) signifikant und bei einem Buffy
Coat-Volumen von unter 8 ml hochsignifikant (p-Wert < 0,01) geringere
58
Werte. Im Vergleich der Gruppen 3 und 4 zeigte sich ebenfalls eine signifikante Abnahme der Sammeleffizienz, für die anderen Gruppen ergab sich
kein signifikanter Unterschied (Tabelle 4.15).
Abbildung 4.9: Konzentration der CD14+ Monozyten
Der Zellgehalt der CD14+ Monozyten im Konzentrat nahm bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens auf weniger als 9 ml signifikant ab (p-Wert
0,039). Wurde das Buffy Coat-Volumen auf unter 8 ml reduziert, war die
Abnahme bei einem p-Wert kleiner 0,01 hochsignifikant. Der Zellgehalt pro
Minute der CD14+ Monozyten lieferte als zeitkorrigierter Wert ebenfalls
eine Abnahme der Werte bei einer Reduktion des Buffy Coat-Volumens.
Im Vergleich der Gruppen 1 und 2 ergab sich kein signifikanter Unterschied. Bei einer Reduktion des Buffy Coat-Volumens auf unter 9 ml war
die Abnahme des Zellgehaltes pro Minute bei p-Werten kleiner 0,01 hochsignifikant. Der graphische Verlauf ist in Abbildung 4.10 dargestellt.
59
Tabelle 4.14: P-Werte der CD14+ Monozyten
Vergleich der
Gruppen
p-Wert
CD14+/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x109
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x107
1 und 2
0,185B
0,278A
0,385B
0,128B
1 und 3
0,002B
0,014A
0,039B
0,005B
1 und 4
0,003B
< 0,01A
0,001B
< 0,01B
1 und 5
0,001B
< 0,01A
< 0,01B
< 0,01A
1 und 6
0,002B
< 0,01A
< 0,01B
< 0,01A
A = U-Test, B = T-Test
Abbildung 4.10: Zellgehalt pro Minute der CD14+ Monozyten
60
Bei dem Vergleich der Gruppen 2 bis 6 untereinander zeigten sich, wie
in Tabelle 4.15 dargestellt, für den Zellgehalt und den Zellgehalt pro Minute der CD14+ Monozyten keine signifikanten Unterschiede.
Tabelle 4.15: P-Werte bei dem Vergleich der Gruppen untereinander
Vergleich der
Gruppen
p-Wert
CD14+/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x109
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x107
2 und 3
0,438B
0,683A
0,641B
0,769B
3 und 4
0,841B
0,039A
0,132B
0,121B
4 und 5
0,851A
0,590A
0,397B
0,387A
5 und 6
0,917A
0,593A
0,160A
0,160A
A = U-Test, B = T-Test
4.2.2.3 Thrombozyten
Zur Analyse der Thrombozytenwerte im Konzentrat wurde die Gruppe 1
mit den anderen fünf Gruppen verglichen (Tabelle 4.17). Bei Reduktion
des Buffy Coat-Volumens zeigte sich bei p-Werten kleiner 0,01 in allen
Gruppen eine hochsignifikante Zunahme der Thrombozytenkonzentration
Tabelle 4.16: Sammelergebnisse der Thrombozyten
Gruppe BCV
in ml
Thrombozyt
en x103/µl
MW ± SA
Sammeleffizienz in %
MW ± SA
Zellgehalt
x1011
MW ± SA
Zellgehalt
pro Minute
x109
MW ± SA
1
≥ 10
2983 ± 954
49,76 ± 9,24
5,01 ± 1,59
4,28 ± 1,30
2
9-9,9
4129 ± 762
56,08 ± 9,25
5,84 ± 0,99
4,77 ± 0,75
3
8-8,9
4088 ± 1078
53,35 ± 11,18
5,22 ± 1,35
4,32 ± 1,12
4
7-7,9
4558 ± 655
51,15 ± 9,51
5,30 ± 0,85
4,37 ± 0,64
5
6-6,9
4434 ± 733
47,09 ± 8,76
4,60 ± 0,96
3,84 ± 0,77
6
<6
4627 ± 1153
44,41 ± 12,16
4,35 ± 1,54
3,63 ± 1,21
BCV = Buffy Coat-Volumen
61
im Apheresat, die in Abbildung 4.8 graphisch dargestellt ist. Der Vergleich
der Gruppen 2 bis 6 untereinander ist in Tabelle 4.19 dargestellt. Für den
Tabelle 4.17: P-Werte der Thrombozyten
Vergleich der
Gruppen
p-Wert
p-Wert
Thrombozyten Sammelx103/µl
effizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x1011
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x109
1 und 2
< 0,01A
0,014B
0,004A
0,017A
1 und 3
< 0,01A
0,062B
0,181A
0,499A
1 und 4
< 0,01A
0,510B
0,036A
0,150A
1 und 5
< 0,01A
0,196B
0,322A
0,136A
1 und 6
< 0,01A
0,025B
0,042A
0,011A
A = U-Test, B = T-Test
Abbildung 4.11: Thrombozytenkonzentration
62
Vergleich der Gruppen 3 und 4 ergab sich ein signifikanter Anstieg der
Thrombozytenkonzentration (p-Wert 0,019), bei den anderen Gruppen
zeigte sich kein signifikanter Unterschied.
Die Sammeleffizienz der Thrombozyten stieg im Vergleich der Gruppen
1 und 2 signifikant an (p-Wert 0,014), sank aber bei einer weiteren Reduktion des Buffy Coat-Volumens auf unter 9 ml wieder ab. Aufgrund dieser
Abnahme der Sammeleffizienz wurde die Gruppe 2 als Vergleichsgruppe
für die weitere Analyse gewählt (Tabelle 4.18). Bei dem Vergleich der
Gruppe 2 mit den Gruppen 3 bis 6 zeigte sich ab einem Buffy Coat-Volumen von 6,9 ml bei p-Werten kleiner 0,01 eine hochsignifikante Reduktion
der Sammeleffizienz. Die p-Werte für den Vergleich der anderen Gruppen
untereinander sind in der rechten Hälfte der Tabelle 4.18 dargestellt. Es
zeigte sich kein signifikanter Unterschied.
Tabelle 4.18: P-Werte der Sammeleffizienz der Thrombozyten
Vergleich der
Gruppen
p-Wert
Sammeleffizienz
in %
Vergleich der
Gruppen
p-Wert
Sammeleffizienz
in %
2 und 3
0,324B
3 und 4
0,303B
2 und 4
0,073B
4 und 5
0,199A
2 und 5
0,001B
5 und 6
0,117A
2 und 6
0,001B
A = U-Test, B = T-Test
Der Thrombozytengehalt im Apheresat ist in Abbildung 4.12 dargestellt.
Es lässt sich keine kontinuierliche Zu- oder Abnahme des Zellgehaltes bei
Reduktion des Buffy Coat-Volumens erkennen. Der statistische Vergleich
wurde mit der Ausgangsgruppe 1 (Tabelle 4.17) und den Gruppen untereinander durchgeführt (Tabelle 4.19). Die höchsten Zellwerte wurden in
der Gruppe 2 erreicht. Im Vergleich mit der Gruppe 1 ist dieser Anstieg
hochsignifikant (p-Wert 0,004). Bei dem Vergleich der Gruppen 2 und 3
fiel der Zellgehalt bei einem p-Wert von 0,024 signifikant ab. Im Vergleich
63
der Gruppe 1 und 3 zeigte sich kein signifikanter Unterschied. Bei einer
weiteren Reduktion des Buffy Coat-Volumens (Gruppe 4) stieg der Thrombozytengehalt wieder leicht an. Dieser Anstieg war bei dem Vergleich der
Gruppen 3 und 4 nicht signifikant (p-Wert 0,480), im Vergleich der Gruppen 1 und 4 aber signifikant (p-Wert 0,036). Wurde das Buffy Coat-Volumen auf unter 7 ml gesenkt, kam es zu einem erneuten Abfall des Zellgehaltes der Thrombozyten im Konzentrat. Die Abnahme war bei einem
Vergleich der Gruppen 4 und 5 und einem p-Wert von 0,003 hochsignifikant, im Vergleich der Gruppen 1 und 5 aber nicht signifikant. Bei einer
Reduktion des Buffy Coat-Volumens auf unter 6 ml zeigte sich ein weiterer, im Vergleich zu dem Vorwert (Gruppe 5) nicht signifikanter Abfall (pWert 0,246) des Zellgehaltes. Bei dem Vergleich der Gruppe 1 mit einem
Buffy Coat-Volumen von unter 6 ml ergab sich eine signifikante Abnahme
(p-Wert 0,042) des Zellgehaltes der Thrombozyten im Konzentrat.
Abbildung 4.12: Thrombozytengehalt
64
Tabelle 4.19: P-Werte bei dem Vergleich der Gruppen untereinander
Vergleich der
Gruppen
p-Wert
Zellgehalt
x1011
p-Wert
Zellgehalt pro
Minute x109
p-Wert
Thrombozyten
x103/µl
1 und 2
0,004A
0,017A
< 0,01B
2 und 3
0,024A
0,042A
0,877B
3 und 4
0,480A
0,440A
0,019B
4 und 5
0,003A
0,002A
0,466B
5 und 6
0,246A
0,232A
0,417B
A = U-Test, B = T-Test
Der Zellgehalt pro Minute der Thrombozyten stieg bei einem Vergleich
der Gruppen 1 und 2 mit einem p-Wert von 0,017 signifikant an und fiel bei
erneuter Reduktion des Buffy Coat-Volumens (Gruppe 3) wieder ab.
Dieser Abfall war im Vergleich zur Gruppe 1 nicht signifikant (p-Wert
0,499), im Vergleich mit der Gruppe 2 aber signifikant (p-Wert 0,042). Bei
einer weiteren Reduktion (Gruppe 4) stieg der Zellgehalt pro Minute
wieder leicht an. Dieser Anstieg war aber weder im Vergleich zur Gruppe 1
(p-Wert 0,150) noch zur Gruppe 3 (p-Wert 0,440) signifikant. Im Vergleich
der Gruppe 5 mit der Gruppe 4 zeigte sich ein hochsignifikanter (p-Wert <
0,01) Abfall des Zellgehaltes pro Minute, der Vergleich der Gruppe 5 mit
der Gruppe 1 ergab keinen signifikanten Unterschied (p-Wert 0,136). In
der Gruppe mit dem kleinsten Buffy Coat-Volumen von unter 6 ml kam es
zu einer weiteren Abnahme des Zellgehaltes pro Minute, die im Vergleich
zur Gruppe 5 nicht signifikant (p-Wert 0,232) war. Im Vergleich der
Gruppen 1 und 6 zeigte sich ein signifikanter (p-Wert 0,011) Abfall des
Thrombozytengehaltes pro Minute.
4.2.2.4 Erythrozyten
Bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens nahm die Erythrozytenkonzentration im Apheresat ab. Tabelle 4.20 zeigt den Abfall der Erythrozytenkonzentration bei einem Buffy Coat-Volumen von bis zu 6 ml. Bei einer wei-
65
teren Reduktion auf weniger als 6 ml stieg die Konzentration der Erythrozyten wieder leicht an. Dieser Verlauf ist in Abbildung 4.13 graphisch
dargestellt. In der Auswertung wurde erneut die Gruppe 1 als Referenzwert mit den anderen fünf Gruppen verglichen (Tabelle 4.21). Die Erythrozytenkonzentration im Apheresat war im Vergleich der Gruppe 1 mit den
anderen Gruppen ab einem Buffy Coat-Volumen von weniger als 9 ml
hochsignifikant (p-Wert < 0,01) geringer. Bei dem Vergleich der Gruppen 2
bis 6 untereinander (Tabelle 4.22) zeigte sich bei einer Reduktion des VoTabelle 4.20: Sammelergebnisse der Erythrozyten
Gruppe BCV
in ml
SammelErythrozyten
Zellgehalt
effizienz in
x106/µl
x1011
%
MW ± SA
MW ± SA
MW ± SA
Zellgehalt
pro Minute
x108
MW ± SA
1
≥ 10
1,15 ± 0,58
0,88 ± 0,42
1,94± 0,93
16,70 ± 8,38
2
9 bis 9,9
0,95 ± 0,35
0,58 ± 0,25
1,36 ± 0,57
11,21 ± 4,43
3
8 bis 8,9
0,89 ± 0,38
0,48 ± 0,23
1,15 ± 0,53
9,49 ± 4,36
4
7 bis 7,9
0,68 ± 0,24
0,33 ± 0,11
0,79 ± 0,27
6,53 ± 2,19
5
6 bis 6,9
0,67 ± 0,20
0,30 ± 0,10
0,70 ± 0,24
5,86 ± 1,97
6
<6
0,72 ± 0,31
0,30 ± 0,19
0,70 ± 0,43
5,84 ± 3,50
BCV = Buffy Coat-Volumen
Tabelle 4.21: P-Werte der Erythrozyten
Vergleich der
Gruppen
p-Wert
Erythrozyten
x106/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x1011
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x108
1 und 2
0,205A
0,002A
0,003A
0,002A
1 und 3
0,004A
< 0,01A
< 0,01A
< 0,01A
1 und 4
< 0,01A
< 0,01A
< 0,01A
< 0,01A
1 und 5
< 0,01A
< 0,01A
< 0,01A
< 0,01A
1 und 6
< 0,01A
< 0,01A
< 0,01A
< 0,01A
A = U-Test, B = T-Test
66
Abbildung 4.13: Erythrozytenkonzentration
lumens von der Gruppe 3 auf die Gruppe 4 mit einem p-Wert von 0,007
eine hochsignifikante Abnahme der Erythrozytenkonzentration. Für die
anderen Gruppen ergaben sich keine signifikanten Unterschiede.
Tabelle 4.22: P-Werte bei dem Vergleich der Gruppen untereinander
Vergleich der
Gruppen
p-Wert
Erythrozyten
x106/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x1011
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x108
2 und 3
0,370A
0,091A
0,094A
0,122A
3 und 4
0,007A
0,001A
< 0,01A
< 0,01A
4 und 5
0,950A
0,210A
0,164A
0,214A
5 und 6
0,632A
0,401A
0,401A
0,380A
A = U-Test, B = T-Test
67
Die Sammeleffizienz der Erythrozyten nahm im Vergleich der Gruppe 1
mit den anderen Gruppen bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens hochsignifikant ab (p-Werte < 0,01). Der graphische Verlauf ist in Abbildung 4.14
dargestellt. Der Vergleich der Gruppen 2 bis 6 untereinander (Tabelle
4.22) zeigte für die Volumenreduktion der Gruppe 3 auf die Gruppe 4 mit
einem p-Wert von 0,001 eine hochsignifikante Abnahme der Sammeleffizienz. Für die anderen Gruppen ergab sich kein signifikanter Unterschied.
Abbildung 4.14: Sammeleffizienz der Erythrozyten
Der Zellgehalt und der Zellgehalt pro Minute der Erythrozyten nahmen
mit Reduktion des Buffy Coat-Volumens kontinuierlich ab. Die Abnahme
war bereits bei Buffy Coat-Werten unter 10 ml hochsignifikant (p-Werte <
0,01). Im Vergleich der Gruppen 2 bis 6 untereinander (Tabelle 4.22)
zeigte sich bei einer Reduktion des Buffy Coat-Volumens von der Gruppe
3 auf die Gruppe 4 für den Zellgehalt und den Zellgehalt pro Minute der
68
Erythrozyten bei p-Werten < 0,01 eine hochsignifikante Abnahme der Erythrozytenwerte. Für die anderen Gruppen ergab sich kein signifikanter
Unterschied.
4.2.2.5 Konzentratvolumen
Das Konzentratvolumen nahm bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens
kontinuierlich ab. Diese Abnahme war im Vergleich der Gruppe 1 mit den
anderen fünf Gruppen und den Gruppen 2 bis 6 untereinander hochsignifikant (p-Werte < 0,01). Der graphische Verlauf ist in Abbildung 4.15 dargestellt. Das Buffy Coat-Volumen korrelierte hochsignifikant mit dem Konzentratvolumen (r = 0,980, Koeffizient nach Spearman).
Tabelle 4.23: Ergebnisse des Konzentratvolumens
Gruppe
Buffy Coat-Volumen
in ml
Konzentratvolumen in ml
MW ± SA
1
≥ 10
169,29 ± 20,77
2
9-9,9
141,84 ± 4,11
3
8-8,9
128,43 ± 8,84
4
7-7,9
116,29 ± 9,55
5
6-6,9
103,85 ± 11,72
6
<6
94,29 ± 19,59
Tabelle 4.24: P-Werte des Konzentratvolumens
Vergleich der
Gruppen
p-Wert
Vergleich
Konzentratvolumen der BCV in
in ml
ml
p-Werte
Konzentratvolumen
in ml
1 und 2
< 0,01A
2 und 3
< 0,01A
1 und 3
< 0,01A
3 und 4
< 0,01A
1 und 4
< 0,01A
4 und 5
< 0,01B
1 und 5
< 0,01A
5 und 6
< 0,01A
1 und 6
< 0,01A
A = U-Test, B = T-Test
69
Abbildung 4.15: Konzentratvolumen
4.3 Sammelzyklen
4.3.1 Leukozyten
Die Anzahl der Sammelzyklen lag zwischen 11 und 17. Bei 173 von 253
Apheresen wurden 15 Sammelzyklen durchlaufen. Im Rahmen der weiteren statistischen Auswertung wurde diese Gruppe als Standard festgelegt und geprüft, ob durch eine höhere oder niedrigere Anzahl an Sammelzyklen eine signifikante Verbesserung der Sammelergebnisse erreicht
werden konnte.
Die Leukozytenkonzentration im Apheresat betrug bei 15 Sammelzyklen im Mittel 49.000 Zellen pro µl. Im Vergleich mit einer anderen Anzahl an Sammelzyklen zeigte sich keine signifikante Erhöhung der Zellkonzentration (Tabelle 4.26). Bei der Durchführung von 16 Sammelzyklen
70
ergab sich im Vergleich zu 15 Zyklen ein signifikanter Abfall der Leukozytenkonzentration (p-Wert 0,012).
Die Sammeleffizienz betrug bei 15 Sammelzyklen 24,5%. Bei 14 Zyklen zeigte sich im Vergleich dazu eine hochsignifikante Abnahme der
Sammeleffizienz (p-Wert 0,008). Der Vergleich mit einer anderen Anzahl
an Sammelzyklen ergab keinen signifikanten Unterschied (Tabelle 4.26).
Die Sammeleffizienz der Leukozyten bezogen auf die Zyklenanzahl ist in
Abbildung 4.16 graphisch dargestellt.
Abbildung 4.16: Sammeleffizienz der Leukozyten
Der Zellgehalt der Leukozyten im Konzentrat lag in der Standardgruppe mit 15 Sammelzyklen bei 6,19 x109 Zellen im Konzentrat. Im Vergleich
mit den anderen Gruppen ergab sich bei 14 Zyklen ein mit einem p-Wert
von 0,008 hochsignifikanter Abfall des Zellgehaltes. Wurden nur 11 statt
15 Zyklen durchgeführt, kam es zu einer signifikanten Abnahme des
71
Zellgehaltes (p-Wert 0,014). Bei einer anderen Anzahl an Sammelzyklen
konnte kein signifikanter Unterschied gezeigt werden.
Tabelle 4.25: Sammelergebnisse der Leukozyten
Zyklen N
Leukozyten
x103/µl
MW ± SA
Sammeleffizienz in %
MW ± SA
Zellgehalt
x109
MW ± SA
Zellgehalt
pro Minute
x107
MW ± SA
17
24
51,07 ± 12,69
25,27 ± 5,21
6,59 ± 1,92
5,33 ± 1,51
16
14
40,79 ± 7,90
26,25 ± 7,56
7,00 ± 1,53
5,86 ± 1,32
15
173
49,05 ± 12,01
24,50 ± 6,00
6,19 ± 1,56
5,09 ± 1,30
14
32
51,32 ± 13,91
21,31 ± 5,14
5,39 ± 1,45
4,67 ± 1,25
13
5
43,32 ± 14,08
24,87 ± 8,50
5,09 ± 1,61
4,90 ± 1,44
12
3
48,40 ± 9,04
27,81 ± 4,80
5,79 ± 1,78
6,08 ± 2,36
11
2
41,40 ± 7,49
24,15 ± 11,57
3,43 ± 0,56
3,81 ± 0,62
Tabelle 4.26: P-Werte der Leukozyten
p-Wert
Zellgehalt
x109
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x107
Vergleich
der Zyklen
p-Wert
Leukozyten/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
15 und 17
0,440B
0,553B
0,256B
0,420B
15 und 16
0,012B
0,307B
0,063B
0,035B
15 und 14
0,340B
0,005B
0,008B
0,086B
15 und 13
0,296B
0,894B
0,123B
0,746B
15 und 12
0,926B
0,344B
0,659B
0,201B
15 und 11
0,371B
0,935B
0,014B
0,165B
A = U-Test, B = T-Test
Der Zellgehalt pro Minute der Leukozyten nahm als zeitkorrigierter Wert
bei 16 statt 15 Sammelzyklen signifikant zu (p-Wert 0,035). Bei einer
anderen Anzahl an Sammelzyklen zeigte sich keine signifikante Ab- oder
Zunahme der Zellwerte.
72
4.3.2 CD14+ Monozyten
Die Sammelergebnisse der CD14+ Monozyten in Abhängigkeit der Anzahl
der Sammelzyklen sind in den Tabellen 4.27 und 4.28 dargestellt. Für die
Konzentration der CD14+ Monozyten im Apheresat zeigten sich im Vergleich mit der Standardgruppe von 15 Sammelzyklen bei der Durchführung von 14 Zyklen signifikant höhere Zellwerte (p-Wert 0,042). Dieser
Verlauf ist in Abbildung 4.17 graphisch dargestellt.
Abbildung 4.17: Konzentration der CD14+ Monozyten
Bezüglich der Sammeleffizienz der CD 14+ Monozyten kam es bei 14
statt 15 Sammelzyklen zu einer hochsignifikanten Abnahme der Werte (pWert 0,005).
Der Zellgehalt der CD14+ Monozyten zeigte im Vergleich zur Standardgruppe bei 16 Sammelzyklen eine signifikante Zunahme (p-Wert 0,033)
und bei 11 Zyklen eine hochsignifikante Abnahme (p-Wert 0,003) der Zell-
73
werte. Der Zellgehalt pro Minute der CD14+ Monozyten nahm bei 16 statt
15 Sammelzyklen hochsignifikant zu (p-Wert 0,009). Bei einer anderen
Anzahl an Zyklen ergab sich im Vergleich mit der Standardgruppe von 15
Zyklen bezüglich der Zellkonzentration, der Sammeleffizienz, des Zellgehaltes und des Zellgehaltes pro Minute der CD14+ Monozyten kein signifikanter Unterschied.
Tabelle 4.27: Sammelergebnisse der CD14+ Monozyten
Sammeleffizienz in %
MW ± SA
Zellgehalt
x109
MW ± SA
Zellgehalt
pro Minute
x107
MW ± SA
Zyklen
N
CD14+/µl
MW ± SA
17
24
10629 ± 2729
113,86 ± 55,93
1,36 ± 0,34
1,10 ± 0,27
16
14
9607 ± 2667
94,75 ± 29,47
1,66 ± 0,51
1,39 ± 0,43
15
173
10829 ± 3333
101,15 ± 52,68
1,37 ± 0,44
1,13 ± 0,35
14
32
12174 ± 3618
85,45 ± 41,98
1,29 ± 0,43
1,12 ± 0,37
13
5
8327 ± 4259
79,00 ± 15,82
0,97 ± 0,46
0,93 ± 0,41
12
3
10439 ± 1911
81,93 ± 22,02
1,23 ± 0,27
1,29 ± 0,38
11
2
7235 ± 1920
68,80 ± 15,77
0,59 ± 0,05
0,66 ± 0,05
Tabelle 4.28: P-Werte der CD14+ Monozyten
Vergleich
der Zyklen
p-Wert
CD14+/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x109
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x107
15 und 17
0,714A
0,598A
0,954A
0,684B
15 und 16
0,143A
0,420A
0,033A
0,009B
15 und 14
0,042A
0,005A
0,324A
0,898B
15 und 13
0,066A
0,885A
0,057A
0,229B
15 und 12
0,959A
0,340A
0,627A
0,442B
15 und 11
0,099A
0,922A
0,003A
0,062B
A = U-Test, B = T-Test
74
4.3.3 Thrombozyten
Im Vergleich mit der Standardgruppe von 15 Sammelzyklen ergab sich für
die Thrombozytenkonzentration im Apheresat (Abbildung 4.18) bei der
Durchführung von 17 Sammelzyklen eine signifikante (p-Wert 0,013) und
bei 16 Zyklen eine hochsignifikante (p-Wert 0,009) Abnahme der Zellwerte. Bei 14 Sammelzyklen zeigte sich eine signifikante Zunahme (pWert 0,037) der Zellkonzentration. Die Sammeleffizienz der Thrombozyten
erreichte bei 17 statt 15 Sammelzyklen mit einem p-Wert von 0,002 einen
hochsignifikant niedrigeren Wert. Der Zellgehalt war bei 13 statt 15 Zyklen
signifikant niedriger (p-Wert 0,022). Bei dem Zellgehalt pro Minute zeigte
sich im Vergleich zur Standardgruppe bei 17 Zyklen eine signifikante Zellabnahme (p- Wert 0,046) und bei 12 Zyklen eine signifikante Zellzunahme
(p-Wert 0,014).
Abbildung 4.18: Thrombozytenkonzentration
75
Tabelle 4.29: Sammelergebnisse der Thrombozyten
Zyklen N
Thrombozyten Sammelx103/µl
effizienz in %
MW ± SA
MW ± SA
Zellgehalt
x1011
MW ± SA
Zellgehalt
pro Minute
x109
MW ± SA
17
24
3527 ± 919
44,88 ± 12,41
4,54 ± 1,30
3,67 ± 1,03
16
14
3215 ± 1329
51,28 ± 9,96
5,32 ± 1,70
4,45 ± 1,44
15
173
4120 ± 1099
51,70 ± 9,88
5,16 ± 1,36
4,23 ± 1,07
14
32
4543 ± 716
48,76 ± 13,17
4,83 ± 1,12
4,18 ± 0,95
13
5
3221 ± 818
44,03 ± 14,78
3,77 ± 0,93
3,66 ± 0,91
12
3
4930 ± 1652
54,44 ± 8,04
5,59 ± 1,03
5,71 ± 0,66
11
2
4809 ± 297
49,75 ± 2,59
4,07 ± 1,14
4,53 ± 1,27
Tabelle 4.30: P-Werte der Thrombozyten
Vergleich
der Zyklen
p-Wert
Thrombozyten
x103/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x1011
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x109
15 und 17
0,013B
0,002B
0,092A
0,046A
15 und 16
0,009A
0,879B
0,890A
0,685A
15 und 14
0,037B
0,146B
0,139A
0,736A
15 und 13
0,072B
0,093B
0,022A
0,293A
15 und 12
0,211B
0,634B
0,382A
0,014A
15 und 11
0,378B
0,782B
0,206A
0,633A
A = U-Test, B = T-Test
4.3.4 Erythrozyten
Für die Analyse der Erythrozytenwerte wurden erneut 15 Sammelzyklen
als Standardwert für den statistischen Vergleich festgelegt. Wurden 14
Sammelzyklen durchlaufen, nahm die Erythrozytenkonzentration im Produkt im Vergleich hochsignifikant ab (p-Wert < 0,01). Bei 16 statt 15 Zyklen zeigte sich eine signifikante Zunahme (p-Wert 0,036) und bei 12 statt
15 Zyklen eine signifikante Abnahme (p-Wert 0,014) der Zellkonzentration.
76
Tabelle 4.31: Sammelergebnisse der Erythrozyten
Zyklen N
Erythrozyten
x106/µl
MW ± SA
Sammeleffizienz in %
MW ± SA
Zellgehalt
x1011
MW ± SA
Zellgehalt
pro Minute
x108
MW ± SA
17
24
0,87 ± 0,32
0,51 ± 0,28
1,20 ± 0,68
9,67 ± 5,40
16
14
1,09 ± 0,35
0,85 ± 0,37
1,94 ± 0,78
16,29 ± 6,68
15
173
0,90 ± 0,45
0,50 ± 0,33
1,18 ± 0,71
9,82 ± 6,30
14
32
0,63 ± 0,19
0,29 ± 0,12
0,68 ± 0,27
5,84 ± 2,35
13
5
0,84 ± 0,32
0,59 ± 0,43
1,17 ± 0,82
11,26 ± 7,91
12
3
0,43 ± 0,02
0,29 ± 0,09
0,51 ± 0,09
5,30 ± 1,38
11
2
0,72 ± 0,13
0,37 ± 0,21
0,63 ± 0,32
7,00 ± 3,58
Tabelle 4.32: P-Werte der Erythrozyten
Vergleich
der Zyklen
p-Wert
Erythrozyten
x106/µl
p-Wert
Sammeleffizienz in %
p-Wert
Zellgehalt
x1011
p-Wert
Zellgehalt
pro Minute
x108
15 und 17
0,970A
0,909A
0,897A
0,991A
15 und 16
0,036A
0,001A
0,001A
0,001A
15 und 14
< 0,01A
< 0,01A
< 0,01A
< 0,01A
15 und 13
0,878A
0,625A
0,885A
0,638A
15 und 12
0,014A
0,179A
0,019A
0,101A
15 und 11
0,634A
0,616A
0,210A
0,564A
A = U-Test, B = T-Test
Die Sammeleffizienz der Erythrozyten war bei der Durchführung von 16
statt 15 Sammelzyklen hochsignifikant höher (p-Wert 0,001). Bei 14 Zyklen zeigte sich im Vergleich zur Standardgruppe eine hochsignifikante
Abnahme der Sammeleffizienz (p-Wert < 0,01).
Der Zellgehalt und der Zellgehalt pro Minute der Erythrozyten erreichten bei der Durchführung von 16 statt 15 Sammelzyklen eine hochsignifikante Zunahme der Zellzahl (p-Werte 0,001). Bei 14 Zyklen zeigte sich im
77
Vergleich zu 15 Zyklen eine hochsignifikante Abnahme des Zellgehaltes
und des Zellgehaltes pro Minute (p-Wert < 0,01). Wurden 12 statt 15 Zyklen durchgeführt, kam es zu einer signifikanten Abnahme des Zellgehaltes (p-Wert 0,019). Der Zellgehalt der Erythrozyten in Abhängigkeit der
Sammelzyklen ist in Abbildung 4.19 dargestellt.
Abbildung 4.19: Zellgehalt der Erythrozyten im Konzentrat
4.3.5 Konzentratvolumen
Das Konzentratvolumen war im Vergleich mit der Standardgruppe von 15
Sammelzyklen bei 16 Zyklen mit einem p-Wert kleiner 0,01 hochsignifikant
größer. Bei 14 Zyklen zeigte sich eine hochsignifikante (p-Wert < 0,01)
und bei 11 Sammelzyklen eine signifikante (p-Wert 0,036) Abnahme des
Konzentratvolumens.
78
Tabelle 4.33: Ergebnisse des Konzentratvolumens
Zyklen N
Konzentratvolumen
in ml
MW ± SA
Vergleich der
Zyklen
p-Wert
Konzentratvolumen in ml
17
24
132,29 ± 38,16
15 und 17
0,612A
16
14
173,93 ± 33,86
15 und 16
< 0,01A
15
173
127,73 ± 20,70
15 und 14
< 0,01A
14
32
107,09 ± 21,26
15 und 13
0,771A
13
5
125,60 ± 51,81
15 und 12
0,496A
12
3
118,67 ± 23,69
15 und 11
0,036A
11
2
85,50 ± 28,99
A = U-Test, B = T-Test
4.4 Separationszeit
Die Separationszeit betrug im Mittel 120 Minuten. Für die statistische Analyse wurden zwei Gruppen gebildet, deren Zeiten am stärksten von der
üblichen Zeit abwichen: bei 8 Apheresen war die Separationszeit kürzer
als 106 Minuten (Gruppe A) und bei 12 Separationen länger als 126 Minuten (Gruppe B). Die Zellparameter dieser beiden Gruppen wurden miteinander verglichen, um zu prüfen, ob durch die Abweichung von der
regulären Separationszeit signifikante Unterschiede der Sammelergebnisse erreicht wurden. Tabelle 4.34 gibt einen Überblick der Sammelergebnisse der Zielzellen und des Konzentratvolumens.
Das Konzentratvolumen zeigte im Vergleich der beiden Gruppen bei
längeren Separationszeiten eine mit einem p-Wert von 0,057 nicht signifikante Zunahme von 30 ml.
Die absolute Leukozytenkonzentration im Apheresat nahm bei einer
längeren Separationszeit zu. Dieser Unterscheid war bei einem p-Wert
von 0,360 nicht signifikant. Der Zellgehalt der Leukozyten erreichte bei
Separationszeiten von mehr als 126 Minuten eine signifikante Zellzunahme (p-Wert 0,017; Abbildung 4.20). Der Zellgehalt pro Minute der
Leukozyten erreichte als zeitkorrigierter Wert eine nicht signifikante Zu-
79
nahme (p-Wert 0,820) der Werte. Die Sammeleffizienz der Leukozyten
zeigte bei einer längeren Separationszeit eine geringe, nicht signifikante
Abnahme (p-Wert 0,777).
Tabelle 4.34: Sammelergebnisse der Zielzellen
Gruppe
A
B
Separationszeit
< 106 Minuten
MW ± SA
> 126 Minuten
MW ± SA
p-Wert
Konzentratvolumen (ml)
111,25 ± 43,12
141,25 ± 33,43
0,057A
Leukozyten/µl
43363 ± 8064
46308 ± 6002
0,360B
Zellgehalt
Leukozyten x109
4,70 ± 1,65
6,47 ± 1,35
0,017B
Zellgehalt pro Minute
Leukozyten x107
4,93 ± 1,84
5,08 ± 1,06
0,820B
Sammeleffizienz
Leukozyten in %
25,61 ± 8,37
24,85 ± 3,17
0,777B
CD14+ Monozyten/µl
8281 ± 2348
10543 ± 2163
0,040B
Zellgehalt CD14+
Monozyten x109
0,90 ± 0,36
1,46 ± 0,32
0,002B
Zellgehalt pro Minute
CD14+ Monozyten x107
0,94 ± 0,40
1,15 ± 0,25
0,163B
Sammeleffizienz CD14+
Monozyten in %
77,46 ± 16,46
104,48 ± 24,39
0,014B
A = U-Test, B = T-Test
Die Konzentration der CD14+ Monozyten nahm bei einer Separationszeit von mehr als 126 Minuten im Vergleich zu einer Separationszeit von
weniger als 106 Minuten hochsignifikant zu (p-Wert 0,040). Der Zellgehalt
der CD14+ Monozyten war bei einer längeren Separationszeit hochsignifikant größer (p-Wert 0,002). Der Anstieg des Zellgehaltes pro Minute der
CD14+ Monozyten war bei einem p-Wert von 0,163 nicht signifikant. Die
Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten in Abhängigkeit der Separationszeit ist in Abbildung 4.21 dargestellt. Es zeigte sich bei einem p-Wert von
80
Abbildung 4.20: Zellgehalt der Leukozyten im Konzentrat
Abbildung 4.21: Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten
81
0,014 ein signifikanter Anstieg der Sammeleffizienz bei einer Separationszeit von mehr als 126 Minuten.
Die Sammelergebnisse der Restzellen sind in Tabelle 4.35 dargestellt.
Die Thrombozytenkonzentration im Apheresat erreichte im Vergleich der
Separationszeit von weniger als 106 Minuten mit der von mehr als 126 Minuten eine nicht signifikante Abnahme (p-Wert 0,310) der Zellzahl. Der
Zellgehalt der Thrombozyten war bei einer Zunahme der Separationszeit
nicht signifikant geringer (p-Wert 0,304). Der Zellgehalt pro Minute der
Thrombozyten nahm bei einem p-Wert von 0,209 nicht signifikant ab
(Abbildung 4.22). Die Sammeleffizienz der Thrombozyten war bei einer
längeren Separationszeit nicht signifikant höher (p-Wert 0,651).
Die Erythrozytenkonzentration im Apheresat erreichte bei einer Separationszeit von mehr als 126 Minuten im Vergleich zu weniger als 106
Tabelle 4.35: Sammelergebnisse der Restzellen
Gruppe
A
B
Separationszeit
< 106 Minuten
MW ± SA
> 126 Minuten
MW ± SA
p-Wert
Thrombozyten x103/µl
4313 ± 1304
3750 ± 1096
0,310B
Zellgehalt
Thrombozyten x1011
4,51 ± 1,34
5,13 ± 1,24
0,304B
Zellgehalt pro Minute
Thrombozyten x109
4,69 ± 1,28
4,03 ± 0,98
0,209B
Sammeleffizienz
Thrombozyten in %
48,83 ± 12,37
51,45 ± 12,56
0,651B
Erythrozyten x106/µl
0,62 ± 0,25
0,91 ± 0,35
0,058B
Zellgehalt
Erythrozyten x1011
0,74 ± 0,60
1,32 ± 0,67
0,025A
Zellgehalt pro Minute
Erythrozyten x108
7,73 ± 6,07
10,36 ± 5,22
0,165A
Sammeleffizienz
Erythrozyten in %
0,41 ± 0,33
0,53 ± 0,27
0,280A
A = U-Test, B = T-Test
82
Abbildung 4.22: Zellgehalt pro Minute der Thrombozyten
Abbildung 4.23: Sammeleffizienz der Erythrozyten
83
Minuten keinen signifikanten Unterschied (p-Wert von 0,058). Der Zellgehalt der Erythrozyten nahm bei längeren Separationszeiten signifikant zu
(p-Wert 0,025). Der Zellgehalt pro Minute erreichte als zeitkorrigierter Wert
ebenfalls einen Anstieg bei längeren Separationszeiten, der bei einem pWert von 0,165 aber nicht signifikant war. Die Sammeleffizienz bezogen
auf die Separationszeit ist in Abbildung 4.23 dargestellt. Sie stieg bei Zunahme der Separationszeit nicht signifikant an (p-Wert 0,280).
4.5 Mehrfache Monozytenspende
Von den insgesamt 253 Monozytenkonzentraten wurden 48 von Spendern
gespendet, die im Beobachtungszeitraum nur ein Monozytenkonzentrat
spendeten und 205 Konzentrate von Spendern, die mehrmals zur Monozytenapherese kamen. Der Vergleich dieser beiden Gruppen soll zeigen,
ob bei mehrfacher Monozytenspende signifikante Unterschiede der Sammelergebnisse erreicht werden konnten. Die Sammeldaten der Zielzellen
und sind in Tabelle 4.36 dargestellt, die der Restzellen in Tabelle 4.37.
Abbildung 4.24: Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten
84
Tabelle 4.36: Sammelergebnisse der Zielzellen
Einfache
Spende
MW ± SA
Mehrfache
Spende
MW ± SA
p–Wert
Konzentratvolumen (ml)
122,22 ± 28,81
128,94 ± 27,82
0,128A
Leukozyten/µl
50500 ± 12588
48671 ± 12145
0,332B
Zellgehalt
Leukozyten x109
6,02 ± 1,57
6,17 ± 1,65
0,639B
Zellgehalt pro Minute
Leukozyten x107
5,05 ± 1,26
5,13 ± 1,37
0,778B
Sammeleffizienz
Leukozyten in %
25,86 ± 6,19
24,49 ± 6,06
0,583B
CD14+ Monozyten/µl
10721 ± 3311
10882 ± 3363
0,909A
Zellgehalt CD14+
Monozyten x109
1,28 ± 0,41
1,38 ± 0,45
0,139A
Zellgehalt pro Minute
CD14+ Monozyten x107
1,07 ± 0,33
1,15 ± 0,37
0,217A
Sammeleffizienz CD14+
Monozyten in %
81,51 ± 27,16
103,67 ± 53,33
0,006A
A = U-Test, B = T-Test
Für das Konzentratvolumen, die Leukozyten- und Thrombozytenwerte
zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Sammelergebnissen. Die Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten nahm bei mehrfacher Monozytenspende hochsignifikant zu (p-Wert 0,006, Abbildung
4.24). Die Erythrozytenkonzentration im Apheresat war bei mehrfacher
Spende signifikant höher (p-Wert 0,021) und der Zellgehalt der Erythrozyten nahm bei einem p-Wert von 0,015 signifikant zu. Der Zellgehalt pro
Minute der Erythrozyten erreichte bei mehrfacher Monozytenspende ebenfalls signifikant höhere Werte (p- Wert 0,018). Die Sammeleffizienz der
Erythrozyten stieg bei mehrfacher Spende signifikant an (p-Wert 0,022).
Bei den übrigen Sammelergebnissen zeigte sich keine signifikante Zuoder Abnahme bezüglich der Häufigkeit einer Monozytenspende.
85
Tabelle 4.37: Sammelergebnisse der Restzellen
Einfache
Spende
MW ± SA
Mehrfache
Spende
MW ± SA
p–Wert
Thrombozyten x103/µl
4354 ± 1288
3991 ± 1048
0,052B
Zellgehalt
Thrombozyten x1011
5,19 ± 1,61
4,99 ± 1,29
0,512A
Zellgehalt pro Minute
Thrombozyten x109
4,36 ± 1,31
4,15 ± 1,03
0,362A
Sammeleffizienz
Thrombozyten in %
49,95 ± 12,01
50,60 ± 10,59
0,693B
Erythrozyten x106/µl
0,74 ± 0,33
0,89 ± 0,43
0,021A
Zellgehalt
Erythrozyten x1011
0,95 ± 0,59
1,19 ± 0,73
0,015A
Zellgehalt pro Minute
Erythrozyten x108
8,02 ± 5,32
9,97 ± 6,34
0,018A
Sammeleffizienz
Erythrozyten in %
0,41 ± 0,29
0,51 ± 0,33
0,022A
A = U-Test, B = T-Test
4.6 Korrelationen der Ziel- und Restzellen
Aufgrund der fehlenden Normalverteilung der zu vergleichenden Werte
wurde der Korrelationskoeffizient nach Spearman berechnet.
Die Leukozytenkonzentration der Spender vor der Separation korrelierte bei einem Korrelationskoeffizienten von 0,437 und einem p-Wert
kleiner 0,01 schwach, aber hochsignifikant mit der Konzentration der
CD14+ Monozyten im Konzentrat. Der Zellgehalt der CD14+ Monozyten
zeigte bezüglich der Leukozytenkonzentration vor der Spende ebenfalls
eine schwache, aber hochsignifikante Korrelation (r = 0,442, p-Wert <
0,01). Die Konzentration der Leukozyten und Lymphozyten im Konzentrat
korrelierte bei einem Korrelationskoeffizienten von 0,356 ebenfalls
schwach, aber mit hoher Signifikanz (p-Wert < 0,01).
86
Tabelle 4.38: Korrelation der Ziel- und Restzellen
Vergleichsparameter
Korrelationskoeffizient (r)
nach Spearman
p-Wert
Leukozyten vor der CD14+ Monozyten
Spende x10³/µl
im Konzentrat/µl
0,437
< 0,01
Zellgehalt CD14+
Monozyten im
Konzentrat x109
0,442
< 0,01
Lymphozyten im
Konzentrat x10³/µl
0,356
< 0,01
Thrombozyten im
Konzentrat x10³/µl
0,149
0,018
Erythrozyten im
Konzentrat x106/µl
-0,117
0,063
0,121
0,055
0,282
< 0,01
CD14+ Monozyten
im Konzentrat/µl
Zellgehalt CD14+
Monozyten im
Konzentrat x109
Zellgehalt Thrombozyten im Konzentrat
x1011
Zellgehalt Erythrozyten im Konzentrat
x1011
A = U-Test, B = T-Test
Die CD14+ Monozyten und Thrombozyten im Konzentrat zeigten mit
einem Korrelationskoeffizienten von 0,149 und einem p-Wert von 0,018
eine sehr schwache, aber signifikante Korrelation. Für den Zellgehalt der
CD14+ Monozyten und Thrombozyten im Apheresat ergab sich bei einem
Koeffizienten von 0,121 und einem p-Wert von 0,055 keine signifikante
Datenkorrelation. Die CD14+ Monozyten im Konzentrat korrelierten bei
einem Korrelationskoeffizienten von -0,117 und einem p-Wert von 0,063
nicht signifikant mit den Erythrozyten im Konzentrat. Der Zellgehalt der
Erythrozyten und CD14+ Monozyten im Apheresat zeigte eine sehr
schwache, aber signifikante Korrelation (r = 0,282, p-Wert < 0,01).
87
Abbildung 4.25: Korrelation der Leukozyten vor der Spende
88
5. Diskussion
5.1 Der COM.TEC Zellseparator
Dendritische Zellen gewinnen im Rahmen der aktiven Immuntherapie maligner Tumoren immer mehr an Bedeutung. Sie sind die stärksten antigenpräsentierenden Zellen des Immunsystems [30] und führen als antigenbeladene Tumorvakzinen zu einer starken Immunmodulation. Bei der Therapie des Malignen Melanoms konnten auf diese Weise bereits gute Erfolge
erzielt werden [40, 45]. Die dendritischen Zellen werden in vitro aus durch
Zellseparatoren gewonnenen Monozytenkonzentraten kultiviert. Die Kultivierung dendritischer Zellen aus CD14+ Monozyten setzt ein Konzentrat
mit möglichst wenig Restzellen wie Thrombozyten und Erythrozyten voraus, weil die Anwesenheit dieser Zellen den Kultivierungsprozess und die
Funktion der dendritischen Zellen negativ beeinflussen können. Es konnte
gezeigt werden, dass dendritische Zellen, die zusammen mit Thrombozyten angezüchtet wurden, phänotypisch unreif blieben und eine sehr viel
geringere Interleukinproduktion aufwiesen [19]. Die CD14+ Monozyten
werden durch Zellseparatoren mittels Zentrifugation von den anderen Blutzellen getrennt und abgesammelt. Zur Herstellung dendritischer Zellen ist
ein Zellgehalt von mindestens 1 x 109 CD14+ Monozyten notwendig [52].
Aktuell werden für die Separation vor allem der Zellseparator COBE
Spectra der Firma CaridianBCT und der COM.TEC Zellseparator der
Firma Fresenius Kabi verwendet. Beide Zellseparatoren trennen das Vollblut mittels einer Zentrifuge. Die Erythrozyten besitzen die höchste Dichte
der Blutzellen und lagern sich am Zentrifugenrand ab. Das zellarme
Plasma verbleibt im Inneren der Zentrifuge. Zwischen diesen beiden
Schichten bildet sich der Buffy Coat, der vor allem Leukozyten und aufgrund ihrer ähnlichen Dichte auch Thrombozyten enthält. Die CD14+
Monozyten als Zielzellen des Sammelprozesses reichern sich in dem
Buffy Coat an. Durch ein Pumpensystem wird der Buffy Coat in den Konzentratbeutel gefördert. Das Produkt der Zellseparation ist der komplette
Buffy Coat mit den angereicherten CD14+ Monozyten, sie werden nicht
89
aus dem Buffy Coat heraus gesammelt. Die Monozytenkonzentrate dieser
Studie wurden mit dem COM.TEC Zellseparator gesammelt, der hierfür
unterschiedliche Programme bietet.
Das Standard MNC Programm des COM.TEC Zellseparators ist bezüglich der Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten anderen Programmen
und Zellseparatoren deutlich überlegen [8, 52, 53]. Allerdings weisen die
durch das Standard MNC Programm gewonnenen Konzentrate eine hohe
Konzentration an Restzellen auf [55]. Das autoMNC Programm des
COM.TEC Zellseparators ist eine Weiterentwicklung des Standard MNC
Programmes, bei dem das Spillover-Volumen nicht mehr manuell eingestellt werden muss. Das Spillover-Volumen ist notwendig, um das Buffy
Coat-Volumen durch die Plasmapumpe aus der Separationskammer zu
fördern. Desweiteren verfügt das autoMNC Programm über einen optischen Sensor, der bereits geringe Trübungen erkennt und das SpilloverVolumen automatisch anpasst. Das autoMNC Programm erreichte, verglichen mit dem Standard MNC Programm, laut Strasser und Mitarbeiter
eine nahezu identische Sammeleffizienz für die CD14+ Monozyten [55].
Der Zellgehalt der CD14+ Monozyten war bei dem Standard MNC Programm aber signifikant höher [55]. Das autoMNC Programm lieferte im
Vergleich zu dem Standard MNC Programm ein geringeres Konzentratvolumen und signifikant geringere Erythrozytenwerte [55]. Ursache hierfür
war laut Strasser und Mitarbeiter die Wartephase zwischen der Spilloverund der Buffy Coat-Phase, in der sich die Erythrozyten von dem Buffy
Coat abtrennen [55]. Bei dem Standard MNC Programm gehen die beiden
Phasen ohne Pause direkt ineinander über. Die Thrombozytenkonzentration war bei dem autoMNC Programm allerdings deutlich höher als bei
dem Standard MNC Programm [55]. Ursache hierfür könnte der optische
Sensor gewesen sein, der bereits geringe Trübungen durch thrombozytenreiches Plasma erkennt und mit der Sammlung des Buffy Coats beginnt.
Die Thrombozyten können durch die Weiterverarbeitung des Konzentrates
mit dem ElutraTM Zellseparator um bis zu 95% entfernt werden, der mittels
Gegenstromelutriation die Zellen anhand ihrer Sedimentationsgeschwin-
90
digkeiten auftrennt [7]. Der entscheidende Parameter bei diesem Verfahren ist die Zellgröße, die Dichte der Zellen ist aber ebenfalls von Bedeutung. Der ElutraTM Zellseparator bietet in einem funktionell geschlossenen System eine effektive und mit einer Dauer von ca. 60 Minuten schnelle Möglichkeit, die gewonnenen Konzentrate aufzureinigen [7].
Voraussetzung für eine Weiterverarbeitung des Konzentrates mit dem
ElutraTM Zellseparator ist eine niedrige Erythrozytenkonzentration. Der
Grenzwert liegt bei 7,5 ml [13]. Liegt die Erythrozytenkonzentration oberhalb des Grenzwertes, kann keine effiziente Elutriation durchgeführt werden, was zu einem Verlust von bis zu 40% der CD14+ Monozyten führen
kann [13].
Das Ziel der Monozytenapherese ist der Gewinn eines Konzentrates
mit einem hohen Anteil an CD14+ Monozyten und möglichst wenig Erythrozyten und Thrombozyten, die die Weiterverarbeitung der Konzentrate
negativ beeinflussen können. In der Fachliteratur gibt es zahlreiche Vergleiche von Zellseparatoren und deren Programmen hinsichtlich dieser
Gesichtspunkte [1, 8, 16, 46, 50, 53, 55, 56]. Glaser und Mitarbeiter
führten 2001 eine Untersuchung der Aphereseprodukte von Melanompatienten mit dem AS.TEC 204 Zellseparator von Fresenius, dem
Vorläufermodell des COM.TEC Zellseparators, und dem COBE Spectra
Zellseparator von CaridianBCT durch [16]. Die Standardprogramme wurden mit einem modifizierten Programm verglichen, bei dem die Zentrifugengeschwindigkeit reduziert wurde, was zu einer ausreichenden
Sammlung an Zielzellen und einer Reduktion der Thrombozyten im Konzentrat führte. Eine hohe Thrombozytenkonzentration im Apheresat verminderte die Ausbeute der angezüchteten dendritischen Zellen. Dies
konnte durch Strasser und Mitarbeiter bestätigt werden [50]. Sie verglichen ebenfalls die Sammelergebnisse der modifizierten Programme des
AS.TEC 204 und des COBE Spectra Zellseparators. Der AS.TEC Zellseparator erreichte bei einer 5-Liter Apherese eine höhere Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten, bei der 10-Liter Apherese zeigte sich allerdings kein signifikanter Unterschied der beiden Geräte. Die Erythro-
91
zytenkonzentration war bei dem AS.TEC Zellseparator höher. Der seit
2001 auf dem Markt befindliche COM.TEC Zellseparator bietet drei
Programme zur Sammlung mononukleärer Zellen: das PBSC-Lym
Programm, das Standard MNC Programm und das autoMNC Programm.
Die Unterschiede des Standard MNC und des autoMNC Programmes und
deren Einfluss auf die Sammelergebnisse wurden bereits dargestellt.
Sowohl Schwella und Mitarbeiter [46] als auch Strasser und Mitarbeiter
[53] führten einen Vergleich des PBSC-Lym und des Standard MNC
Programmes durch. Das MNC Programm arbeitet mit einer einstufigen
Separationskammer, das PBSC-Lym Programm mit einer zweistufigen.
Schwella und Kollegen prüften die Sammeleffizienz der beiden Programme hinsichtlich der CD34+ Stammzellen und konnten zeigen, dass
das MNC Programm gegenüber dem PBSC-Lym Programm eine signifikant höhere Sammeleffizienz (77,5% vs. 58,3%) erreichte. Die prozentuale Anzahl der mononukleären Zellen und der CD34+ Stammzellen
war bei dem MNC Programm allerdings geringer und es kam zu einem
signifikant höheren Thrombozytenverlust der Spender. Strasser und
Mitarbeiter untersuchten gezielt das Sammelverhalten der beiden Programme bei einer 5-Liter Apherese hinsichtlich der Ausbeute an CD14+
Monozyten. Das MNC Programm lieferte neben einem signifikant höheren
Gehalt an CD14+ Monozyten und einer signifikant höheren Sammeleffizienz (84,3% vs. 37,8%) auch eine signifikant höhere Konzentration an
Restzellen. Das PBSC-Lym Programm konnte durch die Verwendung der
zweistufigen Kammer die Thrombozytenkonzentration signifikant senken,
erreichte aber nicht den zur Herstellung von dendritischen Zellen notwendigen Gehalt von 1 x 109 CD14+ Monozyten.
Eine Übersichtsarbeit von Strasser und Eckstein aus dem Jahr 2010
vergleicht die Zellseparatoren und deren Programme bezüglich der Monozytenisolation zur Herstellung von dendritischen Zellen von dem Beginn
ihrer Entwicklung bis zu dem aktuellen Stand [52]. Die besten Sammelergebnisse der Zielzellen werden durch das Standard MNC Programm des
COM.TEC Zellseparators erreicht. Das autoMNC Programm führt zu einer
92
signifikanten Reduktion der Erythrozyten im Konzentrat. Der COBE
Spectra Zellseparator erreicht im Vergleich trotz der signifikant längeren
Separationsdauer eine geringere Sammeleffizienz der Zielzellen, aber
auch eine geringere Konzentration an Restzellen. Das Standard MNC Programm kann anhand der Konzentration der CD34+ Stammzellen des
Spenders vor der Separation und dem prozessierten Blutvolumen die zu
erwartende Ausbeute an CD34+ Zellen effektiv berechnen [38]. Für die
CD14+ Monozyten gibt es diese Möglichkeit bisher nicht.
Im Zentrum dieser Arbeit steht das Buffy Coat-Volumen: es ist ein
manuell einzustellender und damit beeinflussbarer Parameter und wurde
in dieser Studie mit der Zielsetzung einer weiteren Optimierung der Sammelergebnisse gezielt reduziert. Die im Rahmen dieser Studie gesammelten 253 Monozytenkonzentrate wurden mit dem autoMNC Programm des
COM.TEC Zellseparators von gesunden, nicht stimulierten Spendern gesammelt. Die Zentrifugendrehzahl betrug 1500 Umdrehungen pro Minute,
der Vollblutfluss 50 ml pro Minute. Es wurde die einstufige Separationskammer verwendet. Die Anzahl der Zellzyklen lag zwischen 11 und 17, die
Spendezeit zwischen 89 und 130 Minuten. Das prozessierte Blutvolumen
betrug 3634 bis 5629 ml.
5.2 Diskussion der Studienergebnisse
5.2.1 Reduktion des Buffy Coat-Volumens
Bei 87 Monozytenspenden wurde das Buffy Coat-Volumen während der
Separation geändert, bei 166 blieb es über den gesamten Separationsablauf gleich. Im Vergleich ergab sich ein hochsignifikant niedrigeres Konzentratvolumen für die Gruppe mit dem variierten Buffy Coat-Volumen.
Der Zellgehalt, der Zellgehalt pro Minute und die Sammeleffizienz der
Leukozyten und CD14+ Monozyten erreichten bei variiertem Buffy CoatVolumen ebenfalls hochsignifikant geringere Werte. Für die Thrombozytenkonzentration ergab sich eine hochsignifikante Abnahme bei geändertem Buffy Coat-Volumen, die Sammeleffizienz war signifikant höher.
93
Die Sammelergebnisse der Erythrozyten waren bei variiertem Volumen
hochsignifikant niedriger.
Die gezielte Reduktion des Buffy Coat-Volumens bewirkte eine Zunahme der Leukozyten- und Monozytenkonzentration im Aphereseprodukt. Die Zellzunahme der Leukozyten war bei der Reduktion des Buffy
Coat-Volumens von Gruppe 1 auf Gruppe 2 signifikant (40,72 x103/µl vs.
47,62 x103/µl). Durch die weitere Reduktion des Buffy Coat-Volumens
konnte im Vergleich zu dem jeweiligen Vorwert keine signifikante Erhöhung der Leukozytenkonzentration erreicht werden. Vergleicht man aber
die Zunahme der Leukozytenkonzentration mit der Gruppe 1, wurde ab
einem Volumen von unter 9 ml eine hochsignifikante Zellzunahme erreicht.
Die Konzentration der CD14+ Monozyten nahm bei Reduktion des
Buffy Coat-Volumens bis zu einem Volumen der Gruppe 5 kontinuierlich
zu und bei einem Buffy Coat-Volumen unter 6 ml wieder leicht ab. Die Zunahme der Monozytenkonzentration war im Vergleich mit dem Ausgangswert der Gruppe 1 ab einem Volumen von weniger als 9 ml hochsignifikant, der Vergleich der Gruppen untereinander ergab keinen signifikanten
Unterschied.
Durch die Reduktion des Buffy Coat-Volumens konnte eine Anreicherung der Zielzellen im Konzentrat erreicht werden. Das Konzentratvolumen korrelierte hochsignifikant mit dem Buffy Coat-Volumen und nahm mit
dessen Reduktion kontinuierlich ab. Das Zellprodukt wurde konzentriert.
Die Sammeleffizienz, der Zellgehalt und der Zellgehalt pro Minute der
Leukozyten nahmen mit Reduktion des Buffy Coat-Volumens kontinuierlich ab. Im Vergleich mit dem Ausgangswert der Gruppe 1 war die Abnahme der Sammeleffizienz ab einem Buffy Coat-Volumen unter 9 ml
hochsignifikant. Der Zellgehalt war ab einem Buffy Coat-Volumen von
unter 8 ml signifikant und unter 7 ml hochsignifikant geringer. Der Zellgehalt pro Minute war ab einem Buffy Coat-Volumen von weniger als 9 ml
signifikant und bei unter 8 ml hochsignifikant. Bei dem Vergleich der Gruppen untereinander zeigte sich ein erneuter signifikanter Abfall der Zell-
94
werte der Sammeleffizienz, des Zellgehaltes und des Zellgehaltes pro
Minute der Leukozyten bei einer Reduktion des Buffy Coat-Volumens von
Gruppe 4 auf Gruppe 5.
Die Sammeleffizienz, der Zellgehalt und der Zellgehalt pro Minute der
CD14+ Monozyten nahmen bei Reduktion des Buffy Coat-Volumens ebenfalls kontinuierlich und signifikant ab. Im Vergleich der Gruppen untereinander ergab sich für den Zellgehalt und den Zellgehalt pro Minute kein
signifikanter Unterschied.
Die Reduktion des Buffy Coat-Volumens führte folglich zu einem Verlust der Sammeleffizienz, des Zellgehaltes und des Zellgehaltes pro Minute der Leukozyten und CD14+ Monozyten. Durch die Reduktion des Buffy
Coat-Volumens wurde bei der Separation die Buffy Coat-Schicht weniger
tief abgesammelt. Die Buffy Coat-Schicht bildet sich während der Separation zwischen der zellarmen Plasmaschicht und der Erythrozytenschicht,
die sich am Außenrand der Zentrifuge befindet. Nach der Absammlung
des Plasmas wird die Buffy Coat-Schicht entsprechend dem angegebenen
Volumen in den Konzentratbeutel gefördert. Je geringer das Buffy CoatVolumen eingestellt ist, desto größer ist der Abstand zu der äußeren Erythrozytenschicht. Das führte zwar zu einer niedrigeren Erythrozytenkonzentration, aber auch zu einem Verlust an Zielzellen. Bei einem höheren
Buffy Coat-Volumen wurde eine höhere Konzentration an Zielzellen, aber
auch an Erythrozyten, erreicht. Trotz des Verlustes an CD14+ Monozyten
durch die Reduktion des Buffy Coat-Volumens wurde der zur Herstellung
von dendritischen Zellen notwendige Zellgehalt von 1 x 109 CD14+ Monozyten erreicht.
Die Thrombozytenkonzentration stieg bei der Reduktion des Buffy
Coat-Volumens kontinuierlich und im Vergleich mit der Gruppe 1 hochsignifikant an. Die Zunahme der Thrombozytenkonzentration kann durch
den Konzentrierungseffekt erklärt werden. Die Sammeleffizienz, der Zellgehalt und der Zellgehalt pro Minute stiegen bei der Reduktion des Buffy
Coat-Volumens auf Werte der Gruppe 2 signifikant an, nahmen aber bei
einer weiteren Volumenreduktion wieder ab. Aufgrund des hohen Anstiegs
95
fielen die Werte allerdings erst bei einem Buffy Coat-Volumen von weniger
als 7 ml wieder unter die Ausgangskonzentration. Erst bei einer Reduktion
des Buffy Coat-Volumens unter 6 ml konnte im Vergleich mit der Gruppe 1
eine signifikante Reduktion der Sammeleffizienz (44,41% vs. 49,76%), des
Zellgehaltes (4,35 x1011 vs. 5,01 x1011) und des Zellgehaltes pro Minute
(3,63 x 109 vs. 4,28 x 109) der Thrombozyten erreicht werden. Die hohen
Thrombozytenkonzentrationen im Apheresat können zu einem Verlust
bzw. einer schlechteren Funktion der kultivierten dendritischen Zellen
führen [16, 19, 27].
Die Thrombozyten sind innerhalb des Organismus nicht nur für die
Hämostase von entscheidender Bedeutung. Sie sind auch an der Steuerung des Immunsystems und Entzündungsprozessen beteiligt. Es gibt
Studien, die belegen, dass sich gezielt eingesetzte Thrombozyten auch
positiv auf die kultivierten dendritischen Zellen auswirken können. Kissel
und Mitarbeiter konnten zeigen, dass dendritische Zellen, die bei der Kultivierung Kontakt zu aktivierten Thrombozyten hatten, zwar weniger proinflammatorische Zytokine wie IL-12 produzierten, dafür aber eine vermehrte Produktion des immunmodulatorischen Interleukins-10 aufwiesen
[30]. Martinson und Mitarbeiter konnten nachweisen, dass aktivierte
Thrombozyten effektiv die Reifung von immunpotenten dendritischen
Zellen induzieren können [34]. Nguyen und Mitarbeiter konnten ebenfalls
keinen negativen Einfluss auf die Reifung der dendritischen Zellen feststellen [39]. Es kam sogar zu einer Anreicherung kostimulatorischer Moleküle, die mit der Ausschüttung von Interleukin-12 zu einer starken TZellantwort der Th1- und Th2-Zellen führten [39].
Der Thrombozytenverlust der Spender während der Apherese lag bei
bis zu 30%. Auch wenn Thrombozyten schnell mobilisiert werden können,
weil sie nur teilweise im Blut zirkulieren und zum Beispiel in der Milz gespeichert werden, darf dieser Aspekt nicht vernachlässigt werden.
Die Erythrozytenkonzentration, die Sammeleffizienz, der Zellgehalt und
der Zellgehalt pro Minute der Erythrozyten konnten durch die Reduktion
des Buffy Coat-Volumens gesenkt werden. Der Vergleich mit dem Aus-
96
gangswert der Gruppe 1 war für die Erythrozytenkonzentration erst ab
einem Buffy Coat-Volumen unter 9 ml hochsignifikant, für alle anderen
Werte zeigt sich eine kontinuierliche hochsignifikante Abnahme bereits bei
einer Reduktion des Volumens auf unter 10 ml. Die Sammelergebnisse
der Gruppe 5 und 6 sind nahezu identisch. Eine Reduktion des Buffy
Coat-Volumens unter 6 ml scheint die Erythrozytenwerte nicht weiter
senken zu können. Die Abnahme der Zellwerte der Erythrozyten ist dadurch zu erklären, dass durch ein geringeres Buffy Coat-Volumen weniger
in die Erythrozytenschicht hinein gesammelt wird. Der Buffy Coat befindet
sich in der Zentrifugenkammer zwischen dem Plasma und den Erythrozyten, die sich als Zellen mit der größten Dichte am Zentrifugenrand abgelagert haben. Nachdem das Plasma abgesammelt wurde, folgt die Buffy
Coat-Schicht. Je kleiner das Buffy Coat-Volumen eingestellt ist, desto
weiter weg bleibt man von der Erythrozytenschicht. Mit zunehmendem Abstand von der Erythrozytenschicht steigt aber auch der Verlust an Zielzellen.
5.2.2 Änderung der Sammelzyklen
In der Regel werden während eines Separationsprozesses 15 Zyklen
durchlaufen. Um den Einfluss einer abweichenden Anzahl an Sammelzyklen auf die Zellkonzentrationen im Apheresat zu analysieren, wurden die
Gruppen miteinander verglichen. Hierbei ergaben sich drei Gruppen mit
einer sehr niedrigen Fallzahl: 13 Zyklen wurden insgesamt nur bei fünf, 12
Zyklen bei drei und 11 Zyklen sogar nur bei zwei Separationen durchgeführt. Diese drei Gruppen wurden aufgrund der niedrigen statistischen
Aussagekraft bei der Beurteilung der Ergebnisse vernachlässigt.
Für die Leukozytenwerte im Konzentrat konnte durch eine Änderung
der Zyklenanzahl außer für den Zellgehalt pro Minute (5,86 x107 vs. 5,09
x107 bei 14 statt 15 Zyklen) keine Verbesserung der Sammelergebnisse
erreicht werden. Auch die Zellwerte der CD14+ Monozyten konnten nur in
Einzelfällen verbessert werden (Tabellen 4.27 und 4.28). Der Zellgehalt
und der Zellgehalt pro Minute der CD14+ Monozyten konnten zwar bei der
97
Durchführung von 16 statt 15 Sammelzyklen signifikant und hochsignifikant gesteigert werden, die Sammeleffizienz und die absolute Monozytenkonzentration zeigten aber abnehmende Werte. Eine Änderung der Zyklenanzahl erbrachte für die Sammelergebnisse der Zielzellen keinen signifikanten Vorteil.
Für die Zellwerte der Thrombozyten wurde bei 16 und 17 statt 15
Zyklen eine hochsignifikant und signifikant niedrigere Thrombozytenkonzentration erreicht. Auch die Sammeleffizienz und der Zellgehalt pro
Minute waren bei 17 statt 15 Zyklen hochsignifikant und signifikant geringer. Wurden 14 statt 15 Zyklen durchgeführt, war die Thrombozytenkonzentration signifikant höher (4543 x103/µl vs. 4120 x103/µl). Für die
Sammeleffizienz, den Zellgehalt und den Zellgehalt pro Minute zeigten
sich in diesem Vergleich keine signifikanten Unterschiede. Durch eine erhöhte Anzahl an Sammelzyklen ist es folglich möglich, die Thrombozytenkonzentration zu senken.
Die Erythrozytenkonzentration, die Sammeleffizienz, der Zellgehalt und
der Zellgehalt pro Minute der Erythrozyten erreichten bei der Durchführung von 14 statt 15 Sammelzyklen hochsignifikant geringere und bei 16
statt 15 Zyklen signifikant bzw. hochsignifikant höhere Werte. Die Sammelergebnisse bei 17 Zyklen zeigten keinen signifikanten Unterschied zu
denen der Ausgangsgruppe. Die Erythrozytenkonzentration kann dementsprechend durch die Durchführung einer geringeren Anzahl an Sammelzyklen reduziert werden. Zur genaueren Untersuchung müsste allerdings
ein Vergleich mit 14 und weniger Sammelzyklen mit statistisch verwertbaren Gruppenzahlen erfolgen.
Der Vergleich der unterschiedlichen Sammelzyklen spiegelt die Wichtigkeit der genauen Planung und Durchführung der Separationen. Bereits
ein Zyklus mehr oder weniger kann die Sammelergebnisse beeinflussen.
Das zeigt sich nicht erst bei den einzelnen Zellwerten, sondern z. B. bereits bei dem Konzentratvolumen. Bei der Durchführung von 14 statt 15
Zyklen ist das Konzentratvolumen hochsignifikant geringer (107 ml vs. 128
ml) und bei 16 statt 15 Zyklen hochsignifikant größer (174 ml vs. 128 ml).
98
Ein geringeres Konzentratvolumen vereinfacht die Weiterverarbeitung und
Lagerung der Apheresate, vorausgesetzt die nötige Anzahl an Zielzellen
ist vorhanden.
5.2.3 Änderung der Separationszeit
Die Separationszeit betrug im Mittel 120 Minuten. Für den statistischen
Vergleich wurden zwei Gruppen gebildet, deren Zeitwerte hiervon stark
abwichen und entweder weniger als 106 Minuten (Gruppe A; n = 8) oder
mehr als 126 Minuten (Gruppe B; n = 12) betrugen.
Bezüglich der Leukozyten ergab sich nur für den Zellgehalt ein signifikanter Unterschied der beiden Gruppen (4,70 x109 Gruppe A vs. 6,47
x109 Gruppe B). Die Sammelergebnisse der CD14+ Monozyten hingegen
erreichten außer bei dem Zellgehalt pro Minute, als bereits zeitkorrigierten
Wert, signifikante bis hochsignifikante Unterschiede. Die Monozytenkonzentration war bei mehr als 126 Minuten signifikant höher als bei einer
Separationszeit unter 106 Minuten (10543/µl vs. 8281/µl). Entsprechend
verhielten sich auch die Ergebnisse der Sammeleffizienz mit 104,48% bei
einer Zeit über 126 Minuten und 77,46% bei weniger als 106 Minuten. Der
Zellgehalt der CD14+ Monozyten war bei einer verlängerten Separationszeit sogar hochsignifikant höher (1,46 x109 Gruppe B vs. 0,90 x109 Gruppe A). Die Sammelergebnisse der CD14+ Monozyten zeigen einen deutlichen Zusammenhang mit der Separationszeit. Durch die längere Separationsdauer nahm das prozessierte Blutvolumen und somit die Ausbeute an
Zielzellen zu. Strasser und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die CD14+
Monozyten während der Apherese eine gute Zellrekrutierung erreichten,
während die Thrombozyten und Erythrozyten eher träge mobilisiert wurden [56].
Die Zellwerte der Thrombozyten erreichten im Vergleich der Gruppen A
und B keinen signifikanten Unterschied. Für die Sammelergebnisse der
Erythrozyten zeigte sich außer bei dem Zellgehalt (1,32 x1011 Gruppe B
vs. 0,74 x1011 Gruppe A) ebenfalls kein signifikanter Unterschied. Das
Konzentratvolumen war zwar bei einer Separationszeit von mehr als 126
99
Minuten mit 141 ml größer als das bei einer Separation von weniger als
106 Minuten (111 ml), der Unterschied war aber nicht signifikant.
5.2.4 Mehrfache Monozytenspende
Von den insgesamt 253 Monozytenkonzentraten wurden 205 von Spendern gespendet, die zwischen Januar 2008 und Dezember 2009 mehrfach
zu einer Monozytenspende kamen. Die anderen 48 Konzentrate stammen
von Spendern, die in dieser Zeit nur einmal gespendet haben. Der Vergleich der Sammelergebnisse dieser beiden Gruppen zeigte für die Zellwerte der Leukozyten keine signifikanten Unterschiede. Dies gilt auch für
die Konzentration, den Zellgehalt und den Zellgehalt pro Minute der
CD14+ Monozyten. Die Sammeleffizienz der CD14+ Monozyten war aber
bei den Konzentraten, die von Mehrfachspendern stammen, hochsignifikant höher als bei denen, die nur einmal spendeten (103,67% vs.
81,51%). Das zeigt, dass durch die Spende von Monozytenkonzentraten
eine starke Mobilisierung und damit höhere Sammeleffizienz der CD14+
Monozyten erreicht werden kann. Die hohe Rekrutierung von CD34+
Stammzellen während der Durchführung einer Apherese ist in der Literatur
mehrfach beschrieben [10, 26, 48]. Strasser und Mitarbeiter konnten
außerdem bereits zeigen, dass es zu einer Mobilisierung der CD14+
Monozyten kommt, diese aber individuellen Einflüssen des Spenders
selbst oder der Monozytensubpopulationen unterliegt [8]. Es wurde
ebenfalls gezeigt, dass Programmeinstellungen des Zellseparators, die
auf einen hohen Zellgewinn zielen, zu einer höheren Zellrekrutierung
führten [8].
Für die Zellwerte der Thrombozyten ergaben sich in dem Vergleich der
beiden Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Die Erythrozytenkonzentration, der Zellgehalt, der Zellgehalt pro Minute und die Sammeleffizienz der Erythrozyten hingegen zeigten signifikant höhere Werte in den
Konzentraten der Spender, die innerhalb der zwei Jahre mehrfach zu
einer Monozytenspende kamen. Es scheint also nicht nur zu einer Mobilisierung der Stammzellen und Monozyten, sondern auch der Erythrozyten
100
zu kommen. Durch jede Art der Blutspende wird in den Regelkreislauf des
Körpers eingegriffen und es kommt zu einem Zellverlust des Spenders.
Diese Zellen müssen von dem Körper mobilisiert oder neu gebildet werden, was bei einer wiederholten Spende zu höheren Zellwerten führen
kann.
5.3 Schlussfolgerung
Durch die Reduktion des Buffy Coat-Volumens konnte die Konzentration,
die Sammeleffizienz und der Zellgehalt der Erythrozyten im Konzentrat
signifikant reduziert werden. Eine Reduktion der Sammeleffizienz und des
Zellgehaltes der Thrombozyten waren erst ab einem Buffy Coat-Volumen
von weniger als 6 ml möglich. Bei der Reduktion des Buffy Coat-Volumens
wurde zwar eine Anreicherung der Leukozyten und CD14+ Monozyten im
Konzentrat erreicht, die Sammeleffizienz und der Zellgehalt nahmen aber
signifikant ab. Weil trotz dieser Abnahme der zur Herstellung von dendritischen Zellen notwendige Gehalt an CD14+ Monozyten erreicht wurde
und die Erythrozytenkonzentration signifikant gesenkt werden konnte, ist
ein geringeres Buffy Coat-Volumen bei der Durchführung einer Monozytenapherese zu empfehlen. Aufgrund der hohen Thrombozytenwerte ist
eine anschließende Aufreinigung der Konzentrate mit dem ElutraTM Zellseparator notwendig.
Durch die Änderung der Separationszyklen konnten die Sammelwerte
der Leukozyten und CD14+ Monozyten nicht wesentlich und die Ergebnisse der Restzellen nicht einheitlich verbessert werden. Eine Änderung
der Zyklenanzahl bringt dementsprechend keinen Vorteil für die Qualität
der Monozytenkonzentrate.
Eine längere Separationszeit erhöhte das prozessierte Blutvolumen
und führte zu einer hohen Mobilisierung und somit zu einer verbesserten
Ausbeute an CD14+ Monozyten. Bei Spendern, die mehrfach zu Monozytenspende kamen, konnte eine signifikant höhere Sammeleffizienz der
CD14+ Monozyten erreicht werden.
101
Die Leukozytenkonzentration der Spender vor der Separation korrelierte schwach, aber hochsignifikant mit der Konzentration der CD14+
Monozyten im Konzentrat. Die Konzentration und der Zellgehalt CD14+
Monozyten korrelierten nur teilweise und sehr schwach mit den Zellwerten
der Erythrozyten und Thrombozyten im Konzentrat.
102
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7. Abkürzungsverzeichnis
AB0
Blutgruppen A, B, 0
ACD-A
Acid-Citrate-Dextrose Formula A
ASS
Acetylsalicylsäure
BCV
Buffy Coat-Volumen
CD
Cluster of differentiation
CD4+
CD4-positive T-Zellen
CD8+
CD8-positive T-Zellen
CD14+
CD14-positive Monozyten
CD34+
CD34-positive Stammzelle
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
G-CSF
Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor
GFP
Gefrorenes Frischplasma
HIV
Humanes Immundefizienz-Virus
HLA
Human Leukocyte Antigen
IL-1β
Interleukin-1beta
kg
Kilogramm
KV
Konzentratvolumen
LDL
Low-Density-Lipoprotein
M-CSF
Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor
MHC
Major-Histocompatibility-Complex
min
Minute
ml
Milliliter
MW
Mittelwert
n
Anzahl
PAMP
Pathogen Associated Molecular Pattern
PBV
Prozessiertes Blutvolumen
PGE2
Prostaglandin E2
PRR
Pattern Recognition Receptor
r
Korrelationskoeffizient
RNA
Ribonukleinsäure
110
SA
Standardabweichung
SE
Sammeleffizienz
SZ
Separationszeit
TBV
Totales Blutvolumen
Th
T-Helferzelle
TLR
Toll-like Rezeptor
TNF-α
Tumornekrosefaktor-alpha
TNF-β
Tumornekrosefaktor-beta
ZG
Zellgehalt
ZV
Zellverlust
µl
Mikroliter
µm
Mikrometer
111
8. Publikationen
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psychiatric concepts at the beginning of the clinical phase of medical
education: a mind-map study, GMS, Vol.27(1).
112
9. Danksagung
Vielen Dank an Herrn Prof. Dr. med. Reinhold Eckstein, den Leiter der
Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung des
Universitätsklinikums Erlangen.
Ganz besonders herzlich danke ich Herrn Prof. Dr. med. Erwin Strasser
für die tatkräftige Unterstützung und hervorragende Betreuung. Herzlichen
Dank, dass Sie immer erreichbar waren und mir mit vielen Anregungen
und Engagement zur Seite standen.
Vielen Dank an das Team der Abteilung für die stetige Hilfsbereitschaft.
Lieber Peter, bei dir möchte ich mich ganz besonders herzlich für deine
Unterstützung während meines gesamten Studiums und meiner Doktorarbeit bedanken. Danke, dass du immer für mich da bist.
Ganz besonders herzlichen Dank an meine Familie, meine Eltern, Geschwister und Großeltern, die mir dieses Studium ermöglicht und mich in
allem unterstützt haben.
113
9. Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Samaya Marei Burk
Geburtsdatum:
04. Juli 1984
Geburtsort:
Vollersode
Familienstand:
ledig
Schulausbildung:
1991-1995
Freie Waldorfschule Wangen im Allgäu
1996-2004
Zinzendorf-Gymnasium Königsfeld
06/2004
Allgemeine Hochschulreife
Studium:
10/2005 bis 03/2006
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Russland-Studien und Französisch
04/2006 bis 06/2012
Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg
Humanmedizin
03-04/2008
Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung
02/2011 bis 01/2012
Praktisches Jahr Universitätsklinikum Erlangen
Wahlfach: Gynäkologie
04-05/2012
Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Berufstätigkeit:
01.10.2012 – 30.11.2012 Katholisches Klinikum Koblenz – Abteilung für
Allgemeine Orthopädie, Kinderorthopädie und
Endoprothetik
01.12.2012 – 13.12.2013 Katholisches Klinikum Koblenz – Abteilung für
Gynäkologie und Geburtshilfe
01.01.2014 – 31.03.2014 Universitätsklinikum Heidelberg – Klinik für
Allgemein-, Viszeral- und
Transplantationschirurgie
Seit 01.04.2014
Klinikum Darmstadt - Frauenklinik