Immunhistochemische Differentialdiagnose von kleinzelligen

Ruhr-Universität Bochum
PD Dr. med. Michael Krismann
Dienstort: Augusta-Krankenanstalt
Abteilung: Institut für Pathologie
Immunhistochemische Differentialdiagnose von kleinzelligen
Lungenkarzinomen und epitheloiden Mesotheliomen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Zahnmedizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität-Bochum
vorgelegt von
Janine Pohlmann
aus Hattingen
2007
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
PD Dr. med. M. Krismann
Koreferent: Prof. Dr. med. A. Tannapfel
Tag der mündlichen Prüfung: 29. Mai 2008
meinen Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
3
1
Einleitung
6
1.1
Geschichtlicher Überblick
6
1.2
Entwicklungsgeschichte und Anatomie der Pleura und der angrenzenden
Strukturen
8
1.2.1 Histogense
10
1.2.2 Gefäßversorgung, Lymphbahnen und Nerven
11
1.2.3 Funktionen der Pleura
12
1.3
Epidemiologie und Inzidenz
13
1.4
Maligne Mesotheliome
15
1.4.1 Klinische und radiologische Befunde, Therapie und Prognose
15
1.4.2 Makroskopische Befunde
23
1.5
25
Asbest
1.5.1 Historischer Überblick
25
1.5.2 Fasertypen
27
1.5.3 Charakteristische Eigenschaften der Fasern und Pathogenese
28
1.5.4 Vorkommen und Verbrauch von Asbest
31
1.6
Andere ätiologische Aspekte
33
1.7
Berufskrankheit Mesotheliom
35
1.8
Primäre pulmonale kleinzellige Karzinome
36
1.9
Sekundäre Pleuratumoren
40
1.10
Metastasierungsverhalten der sekundären Tumoren der Pleura
42
1.11
Immunhistochemie zur Sicherung der Diagnose maligner Pleuratumoren 43
2
Fragestellung
45
3
Materialien und Methoden
46
3.1
Materialien
46
3.1.1 Mesotheliome
47
3.1.2 Kleinzellige Tumore
49
3.2
50
Methoden
3.2.1 TMA-Technik
50
3.2.2 Färbevorgang
55
Inhaltsverzeichnis
3.3
Verwendete Antikörper
4
58
3.3.1 CD 56
59
3.3.2 Thyreoidaler Transkriptionsfaktor (TTF1)
60
3.3.3 CK 5/6, CK MNF 116
61
3.3.4 Calretinin
62
3.3.5 Ki-67
63
3.4
64
Beurteilung der Reaktionsmuster
3.4.1 Sensitivität
68
3.4.2 Spezifität
68
3.4.3 positiver-/negativer prädiktiver Wert
68
3.4.4 Statistische Aussagen
69
4
Ergebnisse
71
4.1
Alters- und Geschlechtsverteilung
71
4.1.1 Gesamtkollektiv
71
4.1.2 Teilkollektiv der männlichen Patienten
72
4.1.3 Teilkollektiv der weiblichen Patienten
73
4.2
4.3
Ergebnisse hinsichtlich der Vergleichbarkeit von TMA-Schnitten
versus Originalschnitten
74
Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen
76
4.3.1 TTF1
77
4.3.2 Zytokeratine (MNF 116 und CK 5/6)
80
4.3.3 CD 56
85
4.3.4 Calretinin
89
4.3.5 Ki-67
92
4.4
96
Einsatz von Markerkombinationen
4.4.1 TTF1 und CD 56
97
4.4.2 CK MNF 116 und CK 5/6
98
4.4.3 Calretinin und CK MNF 116
99
4.4.4 TTF1, CD 56 und Ki-67
100
4.4.5 TTF1 und CK MNF 116
102
Inhaltsverzeichnis
5
4.4.6 CD 56 und TTF1
103
4.4.7 TTF1 und Calretinin
104
4.4.8 Calretinin und CD 56
105
4.5
108
Kasuistische Beispiele
4.5.1 Pseudomesotheliomatös wachsendes kleinzelliges Karzinom
108
(Fall 105)
4.5.2 Fraglicher Fall eines Pleuramesothelioms (Fall 6 F)
110
5
Diskussion
113
5.1
Allgemeine Betrachtungen zum methodischen Vorgehen
113
5.1.1 Qualitätskontrolle
115
5.1.2 TMA-Technik
116
5.1.3 Heterogenität epitheloider Mesotheliome und kleinzelliger Karzinome
117
5.2
119
Immunhistochemische Untersuchungen
5.2.1 Thyreoidaler Transkriptionsfaktor (TTF1)
120
5.2.2 Zytokeratine
124
5.2.3 CD 56
133
5.2.4 Calretinin
136
5.2.5 Ki-67
139
5.3
Anwendung von Markerkombinationen zur differentialdiagnostischen
Abgrenzung epitheloider Mesotheliome und kleinzelliger Karzinome
142
6
Zusammenfassung
146
6.1
Einleitung
146
6.2
Material und Methoden
146
6.3
Ergebnisse
146
6.4
Diskussion
148
7
Literaturverzeichnis
149
1 Einleitung
1
Einleitung
1.1
Geschichtlicher Überblick
6
Erstmals beschrieben wird die Existenz eines bösartigen Tumors der serösen
Häute im Jahre 1767 von Joseph Liteutaud (Brockmann und Müller, 1991).
Dennoch wird meist erst die Arbeit von Wagner aus dem Jahre 1870 als Ausgangspunkt der wissenschaftlichen Beschäftigung mit dieser Tumorentität angesehen.
Schon 1906 berichtete Auribault über den Tod von Arbeitern, die in den Jahren
1890-1895 in einer Asbestspinnerei und Weberei gearbeitet hatten.
1908 wurde über 30 Arbeiter berichtet, die ebenfalls in der asbestverarbeitenden
Industrie beschäftigt waren und zwischen 1894 und 1906 wegen progredienter
Schwindsucht behandelt worden waren (Neumeister et al., 2001).
Zu diesem Zeitpunkt wurde noch kein Zusammenhang zwischen Asbest und den
Erkrankungen der Arbeiter hergestellt, obwohl Asbest 1902 in die Liste gesundheitsgefährdender Stäube aufgenommen worden war. Vielmehr war man der Ansicht, die rasch zum Tode führende Erkrankung sei auf Kalkstaub und die damit
einhergehende Anfälligkeit für Tuberkulose zurückzuführen.
In den folgenden Jahren wurden in verschiedenen Ländern der Welt Untersuchungen bezüglich bösartiger Pleuratumoren durchgeführt und versucht, erste
ätiologische und pathogenetische Erkenntnisse zu gewinnen.
Eine einheitliche Terminologie wurde erst 1931 von Klemperer und Rabin mit der
Abgrenzung eines benignen lokalisierten und eines malignen diffusen Mesothelioms eingeführt.
Schon zu diesem Zeitpunkt war eine große histologische Vielfalt des Pleuramesothelioms bekannt und von Klemperer und Rabin auf die Pluripotenz der Mesothelzellen zurückgeführt worden.
Heute wird die Gruppe der malignen Mesotheliome in lokalisierte maligne und diffuse maligne Formen aufgeteilt, wobei letztere in epitheloide, biphasische und sarkomatoide Typen eingeteilt werden (Brockmann und Müller, 1991).
1 Einleitung
7
Trotz zahlreicher weiterer Veröffentlichungen über maligne Pleuratumoren und die
Assoziation mit dem universellen Werkstoff Asbest, die erstmals von Gloyne und
Weiss 1935 in Großbritannien in Bezug zur Ätiologie dieses Tumors gesehen wurde (McDonald und McDonald,1996), wenig später auch von Nordmann u.a., erlangte die Existenz eines Mesothelioms als eigene Tumorentität erst mit der Arbeit
von Wagner et al. (1960) breite Anerkennung.
Auch eine epidemiologische Bestätigung der Vermutung von Gloyne und Weiss im
Hinblick auf die induzierende Wirkung von Asbest konnte von Wagner et al. erfolgen.
Eine auffällige Verbindung zwischen Asbestexposition und dem Auftreten von
Pleuramesotheliomen wurde bei Minenarbeitern in der nordwestlichen Kapprovinz
von Südafrika festgestellt. Wagner bezeichnete die pathologische Veränderung als
„tuberkelähnliches Lymphom“ der Pleura (Wagner et al., 1960).
Seitdem wurde vor allem in den Industrienationen bis heute durch den weit verbreiteten Einsatz von Asbest besonders nach dem zweiten Weltkrieg eine Zunahme der Mesotheliominzidenz beobachtet.
Dennoch erfolgte die Anerkennung des Pleuramesothelioms als Berufskrankheit
erst 1977 mit der Folge, dass immer mehr Verdachtsfälle schon zu Lebzeiten gemeldet und auch anerkannt wurden.
1 Einleitung
1.2
8
Entwicklungsgeschichte und Anatomie der Pleura und der
angrenzenden Strukturen
Im 1. Embryonalmonat entwickelt sich, ausgehend vom Ektoderm, das extraembryonale Mesoderm. Es ist vorwiegend aus kubischen Zellen aufgebaut, aus denen das spätere Mesothel (Deckepithel) hervorgeht, und kleidet als parietales Mesoderm die Außenwand und als viszerales Mesoderm die Innenwand der Zölomhöhle, der Vorläuferin der Körperhöhlen, aus.
Mit fortschreitender Differenzierung des Bronchialsystems entwickelt sich dann
aus dem viszeralen Blatt des Mesoderms die Pleura viszeralis, welche die spätere
Lunge, ausgenommen den Hilus und die Stelle von der das Lig. pulmonale abgeht, vollständig bedeckt (Langmann, 1985).
Sie setzt sich auch in den Fissurae interlobares der Lunge fort.
Mit zunehmender Vergrößerung der Lungenanlagen und der Pleurahöhlen bekommen diese schließlich Kontakt mit dem Herzen und der Thoraxwand.
Diese wird von der Pleura parietalis ausgekleidet, die aus dem parietalen Blatt des
Mesoderms entstanden ist (Moore und Persaud, 1996).
Die beiden Pleurablätter gehen am Lungenstiel ineinander über (Rauber und
Kopsch, 1987).
Sowohl die Lungenoberfläche als auch die seitliche Thoraxwand sind also in gleicher Weise von einer serösen Haut bedeckt. Zwischen den Pleurablättern befindet
sich ein weniger als 20 µm breiter Spaltraum, der mit 3-5 ml einer hyaluronsäurereichen Flüssigkeit gefüllt ist.
Viszerale und parietale Pleura bestehen mikroskopisch aus 5 verschiedenen
Schichten:
•
Mesothelschicht mit Basalmembran
•
sehr dünne Schicht submesothelialen Bindegewebes
•
äußere elastische Grenzlamelle
•
Pleurahauptschicht
•
innere elastische Grenzlamelle
1 Einleitung
9
Die Pleuradeckschicht, das Mesothel, besteht aus einer einschichtigen Lage flacher bis kubischer Zellen, die im apikalen Bereich einen dichten Mikrovillibesatz
aufweisen.
Diese sind von einer sog. Glykokalix, einer Gleitschicht, umgeben, die eine hohe
Affinität zu Hyaluronsäure besitzt und das Gleiten der beiden Pleurablätter während der Atemexkursion erleichtert (Herbert, 1986).
Die Zellen der Mesothelschicht verformen sich während der Atembewegung und
sind durch Desmosomen miteinander verbunden (Müller, 1994).
Das Mesothel ist von der darunterliegenden Pleurahauptschicht durch eine Basalmembran separiert.
Die Pleurahauptschicht ist aus kollagenem Bindegewebe mit einzelnen mesenchymalen Zellen aufgebaut, sie wird zum Mesothel durch eine äußere elastische
Grenzlamelle, zur Lunge durch die innere, straffer entwickelte elastische Grenzlamelle abgegrenzt (Müller, 1983).
Sowohl Blut- und Lymphgefäße als auch Nerven verlaufen in der Pleurahauptschicht.
Die Struktur der Pleura parietalis ist der der Pleura viszeralis sehr ähnlich, dennoch gibt es einige funktionelle und strukturelle Unterschiede.
Während die Pleura visceralis der Lungenoberfläche fest anliegt, ist die Pleura
parietalis mit der Brustwand durch eine Bindegewebsschicht (Fascia endothoracica) verschieblich verbunden (Waldeyer und Mayet, 1979).
Mikroskopisch lassen sich in der Pleurahauptschicht der Pleura parietalis keinerlei
elastische Schichten belegen, und nur in einigen Abschnitten befinden sich ausgeweitete Lymphgefäße, die direkt mit der Pleurahöhle in Verbindung stehen und
in der Lage sind, Partikel bis Erythrocytengröße (8,4 µm) aufzunehmen.
Sowohl die Pleura parietalis als auch die Pleura viszeralis besitzen transsudative
und resorptive Fähigkeiten, allerdings ist die resorptive Leistung der Pleura parietalis deutlich größer.
1 Einleitung
1.2.1
10
Histogenese
Wie aus der Embryonalentwicklung deutlich wird, entstammen sowohl die hochdifferenzierten Zellen des Mesoderms als auch die mesenchymalen Zellen des submesothelialen Bindegewebes demselben Ursprungsgewebe.
Aus diesem Grunde liegt die Vermutung nahe, dass epitheloide Pleuratumoren,
die mikroskopisch die Zellen des Mesothels imitieren und sarkomatoide Tumoren,
deren Erscheinungsbild dem der spindelförmigen Zellen des submesothelialen
Bindegewebes weitgehend entspricht, ebenfalls aus einer gemeinsamen Stammzelle entstehen.
Eine Vielzahl von wissenschaftlichen Untersuchungen hat sich mit der Klärung
dieser Frage befasst.
Der obigen Argumentation folgend sind viele Autoren der Meinung, dass beide
Tumorentitäten sich aus einer Stammzelle des Mesothels entwickeln (Stosiek und
Goertchen, 1986).
Demgegenüber steht eine Reihe von Forschern, die der Ansicht sind, sowohl epitheloide als auch sarkomatoide Mesotheliome entstünden aus Subserosazellen.
(Brockmann et al., 1991).
Die abschließende Klärung der Frage nach ihrer Histogenese ist bis dato weiterhin
unklar.
1 Einleitung
1.2.2
11
Gefäßversorgung, Lymphbahnen und Nerven
Die Blutversorgung der Pleura parietalis erfolgt hauptsächlich über Intercostal- und
Zwerchfellarterien, im Pericardbereich über die Aorta, wohingegen die Pleura viszeralis von Pulmonal- und Bronchialarterien mitversorgt wird.
Die Gefäße verlaufen in der bindegewebigen Pleurahauptschicht.
Über Sammelvenen gelangt das Blut in die interlobulären Venen, um dem Körperkreislauf wieder zugeführt zu werden.
Zusätzlich führt die Pleurahauptschicht ein dichtes System von Lymphgefäßen.
Sie befinden sich vorwiegend entlang der peripheren Grenze zum umgebenden
Lungengewebe und münden schließlich in die interlobulären Lymphbahnen der
Lunge.
Die Pleura parietalis besitzt Stomata, über die sie direkt mit der Pleurahöhle in
Verbindung steht und somit den Abtransport auch größerer Partikel aus dem Pleuraspalt in die Brustwand gewährleistet.
Im kaudalen Bereich sowie im Bereich des Zwerchfells ist die resorptive Leistung
aufgrund der Häufung der Stomata am höchsten. Ihr Durchmesser beträgt im
Durchschnitt 1,2 µm, kann sich aber durch eine Dehnung im Zuge der Einatmung
bis um das Zehnfache erweitern.
Es wird verständlich, weshalb sich Partikel, darunter auch Asbestkörper, bevorzugt in diesen Bereichen der Pleurablätter ansammeln.
Die Phagozytoseaktivität der Pleuradeckzellen ist gering.
Die Pleura viszeralis besitzt im Gegensatz zur Pleura parietalis keine sensiblen
Fasern, letztere wird sensibel von Ästen des Nervus phrenicus und von Intercostalnerven innerviert.
Die Pleura viszeralis wird durch Äste des N. vagus und der sympathischen Nerven
innerviert, die auch die Bronchien versorgen (Müller, 1983).
1 Einleitung
1.2.3
12
Funktionen der Pleura
Es existieren drei wesentliche Funktionen der Pleura:
Durch ihre große Oberfläche und den interpleuralen Flüssigkeitsfilm wird eine
leichtere Beweglichkeit der Lungen gewährleistet. Zusätzlich wird durch den Flüssigkeitsfilm eine verschiebliche Haftung zwischen Pleura viszeralis und Pleura parietalis erreicht.
Zudem besitzt die Pleura, besonders die Pleura viszeralis, eine Art Stützfunktion
gegenüber dem leichten elastischen Lungengewebe, das gewissermaßen zwischen den Blättern der Pleura viszeralis „aufgespannt“ ist.
Durch den dichten Abschluss zum Lungengewebe, den die Pleura gewährleistet,
herrscht in der Pleurahöhle ein stetiger negativer Druck von 0,4-0,8 kPa. Hierdurch wird ein Kollaps der Lungen in der Expirationsphase vermieden (Lee und
Olak, 1994).
1 Einleitung
1.3
13
Epidemiologie und Inzidenz
Das maligne Pleuramesotheliom als hochmaligner Tumor der serösen Häute ist
eine in der Normalbevölkerung selten zu diagnostizierende Neoplasie.
Die Inzidenz variiert zwischen einem und 15 Fällen pro einer Million Einwohner
(Neumann et al., 2001, Müller et al., 2003).
Bei stattgehabter Asbestexposition dagegen nimmt die Häufigkeit der diagnostizierten Fälle erheblich zu. Studien gehen von sechs bis elf Erkrankten pro 100
Exponierten aus, sodass man von einem „Signaltumor“ bei Asbestexposition
spricht (Müller et al., 2003, Konietzko et al., 2000).
Tatsächlich kann bei 70-90% der Erkrankten von einer meist beruflich bedingten
Asbestexposition ausgegangen werden (Krismann und Müller, 2000).
Andere Studien nehmen sogar an, dass nahezu 100% aller Mesotheliome durch
Asbest und andere biobeständige Fasern kritischer Länge hervorgerufen werden,
wenn die Gefährdung in der Umwelt und im privaten Bereich mitberücksichtigt wird
(Konietzko et al., 2000).
Allerdings ist es mitunter schwierig, eine eindeutige Asbestexposition zu eruieren,
da zwischen Exposition und Manifestation der ersten Symptome eine durchschnittliche Latenzzeit von 35 Jahren liegt, wobei hier Abweichungen zwischen 10 und
60 Jahren vorkommen können.
Der jüngste Mesotheliompatient verstarb mit 36 Jahren (Drechsel-Schlund et al.,
2003). Dies ist wahrscheinlich auf eine Exposition im Kindesalter zurückzuführen.
Der Altersmedian der Patienten liegt im Allgemeinen zwischen dem 55. und 60.
Lebensjahr, wobei Männer weitaus häufiger betroffen sind als Frauen, die 13-22%
der Fälle ausmachen (Neumeister et al., 2001, Bittmann und Wöckel, 2003).
Dies ist anhand der Tatsache zu erklären, dass in den sog. Staubberufen zum
überwiegenden Teil Männer tätig gewesen sind.
Das Risiko einer Asbeststaubexposition war in handwerklichen Berufen, etwa im
Isolier- Bau-, Metall- und Elektrohandwerk oder den Asbestzementprodukte herstellenden Industriezweigen, besonders hoch (Woitowitz et al., 1989).
Im Gegensatz zum asbestassoziierten Lungenkrebs gibt es bei der Entstehung
asbestassoziierter Mesotheliome keine Schwellendosis. Vielmehr können auch
1 Einleitung
14
kurze Expositionzeiten nach entsprechender Latenzzeit Mesotheliome verursachen.
Die gewerblichen Berufsgenossenschaften berichteten 2003 über eine Textilarbeiterin, die nach einer Exposition von drei Wochen an einem Mesotheliom erkrankte
und daran verstorben war. Hain et al. verwiesen 1984 auf einen Patienten, der
nach einer entsprechenden Latenzzeit nach nur zweiwöchiger Exposition im beruflichen Bereich an einem Mesotheliom erkrankt war.
Im Allgemeinen liegt aber eine über mindestens zwei Jahre sich erstreckende Exposition im beruflichen oder urbanen Bereich vor (Hain et al., 1984).
Im Jahre 2004 wurden im Deutschen Mesotheliomregister 780 neue Patienten mit
einer Mesotheliomerkrankung erfasst, im selben Jahr wurden 808 Berufskrankheiten nach Ziffer 4105 anerkannt (Butz, 2004).
Im Vergleich dazu waren es 1988 nur 168 Fälle (Neumann et al., 2001), was einerseits daran liegt, dass diese vergleichsweise seltene Erkrankung auch außerhalb spezialisierter Zentren immer häufiger diagnostiziert wird, andererseits aber
auch an einer Zunahme der Erkrankungshäufigkeit.
Da in Deutschland der maximale Asbestverbrauch zwischen 1965 und 1980 stattfand (Krismann und Müller, 2000), ist das Maximum der Inzidenz nach entsprechender Latenzzeit zwischen 2010 und 2015 (Coenen und Schenk, 1990) zu erwarten.
Seit den 80er Jahren nimmt der Asbestverbrauch stetig ab. Obwohl schon 1979
die gesundheitsschädigende Wirkung bekannt war, konnte erst nach einem langwierigen Prozess über viele Jahre, und nachdem geeignete Ersatzstoffe zur Verfügung standen, in einigen Industrieländern ein Herstellungs- und Verwendungsverbot durchgesetzt werden.
In Deutschland erfolgte das Verbot 1993.
Seitdem ist eine Verarbeitung nur noch mit Sondergenehmigungen weiterhin zulässig, oder wenn der Umgang im Rahmen von Abbruch- Sanierungs- und Instandhaltungsarbeiten nicht zu vermeiden ist (Merget, 2005).
Dennoch werden v.a. in den sog. Schwellenländern (z.B. China) noch immer jährlich etwa 2.5 Mio. Tonnen Asbest gewonnen und verwendet.
1 Einleitung
1.4
Maligne Mesotheliome
1.4.1
Klinische und radiologische Befunde, Therapie und Prognose
15
Die klinische Symptomatik ist in frühen Erkrankungsstadien meist uncharakteristisch.
Eines der ersten, und führendes Symptom ist ein schlecht zu lokalisierender thorakaler, einseitiger, meist dumpfer Schmerz, oft atemabhängig mit gleichzeitiger
Manifestation eines einseitigen Pleuraergusses und Dyspnoe. Des Weiteren klagen etwa ein Drittel der Patienten über einen begleitenden Reizhusten.
Mit Fortschreiten der Erkrankung kommen typische Symptome wie Abgeschlagenheit, Fieber, Gewichtsverlust und Nachtschweiß hinzu.
In Spätstadien ist häufig eine zur Seite gebeugte, schmerzbedingte Schonhaltung
der Patienten zu beobachten (Neumeister et al., 2001).
Die zum Teil sehr starken Schmerzen sind Folge des infiltrativen Wachstums des
Tumors in Brustwand und Muskulatur und die dadurch eingeschränkte Beweglichkeit der Lungen während der Atemexkursion.
Greift der Tumor auf das Mediastinum über und infiltriert das Perikard, kommt es
dort zur Ergussbildung mit typischer klinischer Symptomatik.
Bei bereits weit fortgeschrittenem Wachstum findet man zwar einen Befall der mediastinalen Lymphknoten, eine hämatogene Metastasierung findet sich dagegen
erst spät.
Zur Sicherung der Diagnose kommen invasive und nicht invasive Maßnahmen zur
Anwendung:
Radiologisch und computertomographisch zeigt ein Mesotheliom neben einem
einseitigen Pleuraerguss, der bei vielen Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose
vorliegt, oftmals ein ungleichmäßiges arkadenförmiges Wachstum, welches sich in
Form eines Begleitschattens an den vom Erguss nicht überdeckten Anteilen der
Thoraxwand darstellt.
In späten Stadien sind besonders im basalen Bereich zum Teil massive knollenartige Verschattungen und Verschwartungen der betroffenen Seite zu diagnostizieren.
Eine Ausbreitung zur Gegenseite erfolgt meist erst in späten Stadien (Calavrezos
und Hain, 1982).
1 Einleitung
16
Da es mittels hochauflösender Computertomographie (HRCT) möglich ist, Strukturen bis zu 3 mm darzustellen, ist es denkbar, auch Mesotheliome in sehr frühen
Stadien zu diagnostizieren, was bei den sog. Hochrisikogruppen im Rahmen von
Vorsorgeuntersuchungen von Bedeutung sein kann (Hering et al., 1993). Um ein
Frühmesotheliom handelt es sich nach Müller, „ wenn sicher eine noch frühe Infiltration auf beurteilbare Areale der Pleurahauptschicht beschränkt bleibt “, es sich
also um ein pT1(a) Stadium handelt.
Nach Bauer (1993) sind nachsorgende Untersuchungen dann durchzuführen,
wenn die Auslöseschwelle am Arbeitsplatz überschritten wurde, und eine Asbeststaubexposition länger als drei Monate vorlag. Ab einem Wert von 15000 F/m³
besteht die Pflicht zur Durchführung arbeitsmedizinischer Vorsorgeuntersuchungen.
Laut Hauptverband der gewerblichen Berufsgenossenschaften (HVGB) erwiesen
sich die Mortalitätsraten für die Diagnose Mesotheliom speziell bei den Beschäftigten der Asbesttextil- sowie der Asbestzementprodukte herstellenden Industrie und
der verarbeitenden Handwerksberufe als sehr hoch (Woitowitz et al., 1989).
Im Rahmen der Hochrisikogruppen- Identifikation sollten die relevanten Zeitdaten
der Asbesteinwirkung (Beginn der Exposition und Dauer), ebenso wie das Lebensalter der Patienten berücksichtigt werden, da das Risiko sich mit zunehmender Dauer der zurückliegenden Einwirkzeit erhöht.
Die Auswertung von Studienergebnissen führt zu der Annahme, dass das Lebensalter zwischen 60 und 65 Jahren ein für diese Erkrankung prädestinierter Lebensabschnitt zu sein scheint, auch wenn die Einwirk- und Latenzzeiten eine viel
breitere Streuung vermuten lassen (Drechsel-Schlund et al., 2003).
1 Einleitung
17
Eine neuere Methode zur Diagnosesicherung ist die Positronenemissionstomographie (FDG-PET).
Mit einer Genauigkeit von bis zu 92% gelingt die Unterscheidung zwischen gutund bösartigen Prozessen. Zudem bestehen auch in der Darstellung mediastinaler
Lymphknotenmetastasen, deren frühzeitige Diagnose im Rahmen eines multimodalen Therapieschemas große prognostische Bedeutung erlangt, einige Vorteile
gegenüber dem CT oder dem MRT (Neumeister et al., 2001).
Die beschriebenen Befunde sind nicht spezifisch für das maligne Pleuramesotheliom, besonders im Hinblick auf die häufige Metastasierung anderer Tumorentitäten in die Pleura.
Aufgrund mehrerer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass trotz vielfältiger
bildgebender Untersuchungsmethoden zur Diagnosesicherung zu Lebzeiten in
den allermeisten Fällen eine videogestützte Thorakoskopie nötig ist, die die Beurteilung sämtlicher Pleuraflächen unter direkter Sicht erlaubt und den Patienten
kaum belastet (Dienemann, 2005).
Allerdings sollten wegen der noch an anderer Stelle zu erwähnenden großen Heterogenität mehrere Proben von verschiedenen Abschnitten entnommen werden.
Eine „blinde“ Pleurabiopsie hat dagegen nur eine Sensitivität von unter 50%, da
Mesotheliome der Pleura oft in den distalen Bereichen der parietalen/ diaphragmalen Pleura auftreten, die für eine Biopsie schwer zugänglich sind (Konietzko et al.,
2000).
Als weitere diagnostische Maßnahme kommt schließlich die Pleurapuktion in Betracht, wobei jedoch auch hier nur in 35-50% der Fälle der definitive Nachweis maligner Zellen im Exsudat gelingt. Eine negative Zytologie kann also keinesfalls ein
Mesotheliom ausschließen (Müller et al., 2003).
Eine Bronchoskopie mit anschließender histologischer oder zytologischer Untersuchung kommt beim erforderlichen differentialdiagnostischen Ausschluss eines
peripheren Bronchialkarzinoms in Betracht (Calavrezos und Hain, 1982).
Aufgrund der oben geschilderten Symptome, die lange Zeit unspezifisch bleiben,
werden die meisten Pleuramesotheliome in bereits weit fortgeschrittenen Stadien
diagnostiziert, weshalb besonders pallativen Therapiemaßnahmen große Bedeutung zukommt.
1 Einleitung
18
Die Pleurektomie oder die Entfernung größerer Tumormassen zur Schmerzlinderung kann indiziert sein. Auch die Pleurodese mit Tetracyclinen oder Talkum ist
bei rezidivierenden Pleuraergüssen sehr wirkungsvoll. Beide Substanzen sind in
ihrer Wirkung einander gleichwertig (Müller et al., 2003).
Angaben zur kurativen Radiotherapie sind selten. Sie wird von den meisten Autoren kritisch beurteilt, da die großen Strahlenfelder und die notwendigerweise hohen Dosen zu erheblichen Nebenwirkungen führen können, sie ist jedoch als
Schmerztherapie sehr wirkungsvoll (Mezger, 2000, von Bültzingslöwen, 1996).
Erhebliche Bedeutung hat sie in der Bestrahlung von Punktionsstellen bei vorangegangener Biopsie, Punktion oder Drainage erlangt, da der Tumor in diesen Bereichen oftmals nach außen wächst.
Eine chirurgische Intervention wird im Allgemeinen nur bei Patienten mit einem
Stadium I oder frühem Stadium II und gleichzeitig gutem Allgemeinzustand zu vertreten sein, was zum Zeitpunkt der Diagnose nur bei weniger als 30% der Patienten zutrifft.
Die potentiell kurative, erweiterte Pleuropneumonektomie im Sinne einer radikalen
Resektion des gesamten Tumors mit angrenzenden Strukturen wie Diaphragma
und Perikard (sog. P3D) ist möglich, jedoch mit einer hohen Morbidität belastet.
25% der Patienten erleiden ernsthafte Komplikationen (Müller et al., 2003).
Mit limitierten Eingriffen wie Dekortikation und Pleurektomie, liegt die postoperative Mortalität zwar nur bei 2%, allerdings werden sie letztlich nur in pallativer Absicht durchgeführt, da ein vollständiges Entfernen aller malignen Zellen unmöglich
ist. Letztlich ist immer ein Abwägen zwischen den Nachteilen fehlender Radikalität
und den Nebenwirkungen chirurgischer Maßnahmen nötig, v. a. da in neueren
Studien nachgewiesen wurde, dass die Überlebenszeit entscheidend vom Tumorstadium und weniger von der Art des Eingriffs bestimmt wird.
Das Pleuramesotheliom konnte bis dato durch eine Chemotherapie kaum beeinflusst werden, der Einsatz schien nur bei raschem Fortschreiten mit klinischen
Symptomen gerechtfertigt zu sein (Michael et al., 2001).
In einigen neueren Studien sind jedoch gewisse Erfolge mit Pemetrexed vor allem
in Kombination mit Cisplatin dokumentiert worden (Müller et al., 2003, Eberhardt,
2004).
1 Einleitung
19
Als Konsequenz dieser Entwicklung wurde kürzlich die Kombinationstherapie mit
Pemetrexed und Cisplatin als erster chemotherapeutischer Behandlungsstandard
für das Pleuramesotheliom von der FDA für die USA zugelassen (Tomek und Manegold, 2005).
Die Prognose der malignen Pleuramesotheliome ist trotz einiger Fortschritte bezüglich Diagnose und Therapie in den letzten Jahren außerordentlich schlecht.
Obwohl Mesotheliome im Vergleich zu den Lungenkarzinomen langsam wachsen,
liegt die mittlere Überlebenszeit nach Diagnosestellung zwischen 12 und 15 Monaten (Neumann et al., 2001), wobei Frauen durchschnittlich länger leben als Männer (Hartmann und Schütze, 1992).
In seltenen Fällen konnte aber über ungewöhnlich lange Überlebenszeiten berichtet werden (Wong et al., 2002). Die längste Überlebenszeit, die im Deutschen Mesotheliomregister bekannt ist, beträgt 19 Jahre. (Neumann et al., 2001)
Law et al. konnten 1983 in einer Studie eine kürzere Überlebenszeit von Patienten
mit nachgewiesener Abestexposition im Vergleich zu Patienten ohne Exposition
feststellen.
Insgesamt scheint die Tumorhistologie neben dem Tumorstadium bei Diagnosestellung ein signifikanter Prognosefaktor zu sein, wobei der epitheloide Subtyp mit
einer Überlebenszeit von 14,2 Monaten die beste Prognose hatte, gefolgt vom
biphasischen (8,3 Monate) und dem sarkomatoiden Typ (6,1 Monate) (Hartmann
und Schütze, 1992, Schirren et al., 1998).
Auch das Alter der Patienten hat einen Einfluss auf die mittlere Überlebenszeit.
Hartmann und Schütze sind sogar der Ansicht, es beeinflusse die Prognose weit
stärker als der histologische Subtyp. Demnach lebten unter 60-jährige Patienten
mit einer Überlebenszeit von durchschnittlich 16 Monaten signifikant länger als
Patienten, die älter als 60 Jahre waren (6,7 Monate).
In derselben Untersuchung konnte gleichzeitig eine längere Überlebenszeit von
Frauen bei gleicher Altersverteilung festgestellt werden.
Das wichtigste die Prognose beeinflussende Kriterium bleibt jedoch das Tumorstadium zum Zeitpunkt der Diagnose. Aus diesem Grunde sollte vor jeder Therapie das Stadium mittels TNM-Klassifikation so exakt wie möglich ermittelt werden.
1 Einleitung
Tabelle 1: TNM-Klassifikation maligner Pleuramesotheliome (6. Auflage 2004)
pT1
Ipsilaterale parietale Pleura
pT1a
Nur Pleura parietalis
pT1b
Pleura parietalis und fokale Beteiligung der Pleura viszeralis
pT2
Ipsilaterale Pleura mit mindestens einem der folgenden Merkmale:
Konfluierender Tumor der viszeralen Pleura, Zwerchfellinfiltration,
Lungenparenchyminfiltration
pT3
Ipsilaterale Pleura mit mindestens einem der folgenden Merkmale:
Infiltration der fascia endothoracica, des mediastinalen Fettgewebes.
Einzelner Tumorherd mit Thoraxwandinfiltration. Nicht transmurale Pericardinfiltration. Potentiell resektabler Tumor
pT4
Ipsilaterale Pleura mit mindestens einem der folgenden Merkmale:
Diffuse oder multifokale Infiltration des Thoraxwandweichteilgewebes, Rippeninfiltration, transdiaphragmale Zwechfellinfiltration, Infiltration anderer
Mediastinalorgane, direkte Ausbreitung auf kontralaterale Pleura,Infiltration
der Wirbelsäule, transmurale Pericardinfiltration, maligner Pericarderguß,
Myokardinfiltration, Infiltration des Plexus brachialis
PN0
Keine regionalen Lymphknotenmetastasen
PN1
Metastase(n) in ipsilateralen bronchopulmonalen und/oder ipsilateralen Hiluslymphknoten
PN2
Metastase(n) in subcarinalen und/oder ipsilateralen Lymphknoten entlang der
A. mammaria interna oder in mediastinalen Lymphknoten
PN3
Metastase(n) in kontralateralen mediastinalen Lymphknoten, solchen entlang
der kontralateralen A. mammaria interna, kontralateralen Hilus- und/oder ipsioder kontralateralen Skalenus- oder supraklavikulären Lymphknoten
PMx
Das Vorhandensein von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden
PM0
Keine Fernmetastasen
PM1
Fernmetastasen vorhanden
20
1 Einleitung
21
Charakteristisch für die Histologie der malignen Mesotheliome ist die große Heterogenität ihrer Wachstumsmuster untereinander und sogar innerhalb eines Tumors.
Nach der WHO-Klassifikation von 2004 werden drei verschiedene Wachstumstypen des malignen Pleuramesothelioms unterschieden:
•
Vorwiegend epitheloide Mesotheliome
•
Vorwiegend sarkomatoide Mesotheliome
•
Biphasische (gemischte) Mesotheliome
Ein vorwiegender Subtyp wird immer dann angegeben, wenn die zweite Tumorkomponente weniger als 10% der gesamten Tumorzellen ausmacht (Müller und
Krismann, 2004).
Diese Einteilung geht noch auf Klemperer und Rabin zurück (Brockmann und Müller, 1991).
Der epitheloide Subtyp tritt am häufigsten auf.
Bei den Tumorzellen handelt es sich um polygonale bis flach zylindrische, epithelähnliche Mesothelzellen. Sie können sehr verschiedene Wachstumsmuster aufweisen: azinär, papillär, tubulär, solide oder zystisch.
Sarkomatoide Mesotheliome bestehen aus spindeligen Zellformen, und ähneln
den mesenchymalen Zellen der Pleurahauptschicht.
Sie sind überwiegend parallel angeordnet, aber auch wirbelartige Anordnungen
von Fasern und Tumorzellen kommen vor.
In die Gruppe der sarkomatoiden Mesotheliome ist auch das desmoplastische
Mesotheliom einzuordnen, das sich durch eine ausgeprägte Kollagenfaserproduktion und Zellarmut auszeichnet.
Beim biphasischen Subtyp kommen in unterschiedlichen Anteilen sarkomatoide
und epitheloide Tumorzellen nebeneinander vor.
1 Einleitung
22
Die definitive Zuordnung eines Mesothelioms zu einem der beiden erstgenannten
Subtypen ist kritisch zu sehen, wenn nur kleinere Biopsieproben eines ausgedehnten Tumors der Klassifikation zu Grunde liegen.
Sehr häufig kommen in verschiedenen Bereichen eines Pleuramesothelioms beide
Subtypen in unterschiedlichen Anteilen vor.
1 Einleitung
1.4.2
23
Makroskopische Befunde
Beim malignen Pleuramesotheliom werden lokalisierte und diffuse Formen unterschieden, wobei erstere ausgesprochen selten sind, breitbasig von der Pleura
ausgehen und durch infiltrierendes, destruierendes Wachstum mit nur unvollständiger Kapsel charakterisiert sind (Brockmann und Müller, 1991).
Einige Autoren sind der Ansicht, dass die diffusen Formen ihren Ausgang von der
parietalen Pleura nehmen und sich dann charakteristischerweise in den anatomisch gegebenen Räumen entlang der parietalen und viszeralen Pleura sowie den
interlobulären Septen ausbreiten (Boutin, 1989).
Prädilektionsstellen scheinen die basalen, zwerchfellnahen Bereiche zu sein, von
wo aus der Tumor in caudocranialer Richtung wächst (Vogt-Moykopf et al., 1987).
In Frühstadien bilden sich multiple weiße, kleine Knötchen zunächst oft in der
Pleura parietalis, die mit Fortschreiten der Erkrankung zu millimeter- bis zentimeterdicken Tumormassen konfluieren und die Lunge schließlich zirkulär umschließen und komprimieren.
Häufig finden sich aufgrund einer unvollständigen Obliteration der Pleurahöhle und
infolge rezidivierender Ergüsse abgeschlossene, unterschiedlich große, zystische
Hohlräume.
Die Grenze zum Lungengewebe wird meist lange scharf toleriert (innere elastische
Grenzlamelle). Erst in späten Stadien kommt es bei Mesotheliomen vom epitheloiden Subtyp zu einer Infiltration des Lungenparenchyms, sarkomatoide Mesotheliome dagegen neigen schon früh zu einer Infiltration in das Lungengewebe (Krismann und Müller, 2000).
Demgegenüber kommt es häufig entlang von Stichkanälen nach bioptischen Eingriffen zu einer Ausbreitung durch die Brustwand.
Die Konsistenz des Tumors ist fest bis sehr fest, seine Schnittfläche grau- weiß
bei sarkomatoiden Formen, bei epitheloider Differenzierung ist die Konsistenz infolge Hyaluronidaseexpression fadenziehend.
1 Einleitung
24
Durch lokal infiltratives Wachstum kann es zum Befall der Mediastinalorgane und
der Thoraxwand kommen, ein Befall der kontralateralen Pleura ist nicht selten,
aber meist nur in Endstadien zu beobachten.
Über das Zwerchfell und die serösen Häute des Abdomens wächst der Tumor in
seltenen Fällen per continuitatem direkt ins Peritoneum vor.
In weit fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung kann es darüber hinaus zu Rippenarrosionen infolge eines massiven Befalls der Intercostalmuskulatur kommen.
Es besteht eine Koinzidenz zwischen dem Auftreten hyaliner Pleuraplaques und
Mesotheliomen. Erstere sind bei über 50% der Patienten zu diagnostizieren, dabei
handelt es sich um weiße, flach erhabene, faserreiche Fibrosen in rippenparalleler
Anordnung v.a. der Pleura parietalis.
Bevorzugt treten sie im Zentrum tendineum des Zwerchfells und in den
posterio- lateralen Abschnitten in Höhe der 7. bis 10. Rippen auf. Sie entwickeln
sich in 70% der asbestassoziierten Fälle (Krismann und Müller, 2000) infolge jahrelanger Enzündungsreaktionen als Reaktion auf intrapleural liegende Asbestfasern, sind aber nicht als Präneoplasien maligner Mesotheliome zu werten (Brockmann und Stolpe, 1991), sondern können vielmehr als Brückenbefunde einer
meist jahrelangen Asbestexposition betrachtet werden (Hain et al., 1984).
Maligne Pleuramesotheliome bleiben nur in 18% der Fälle lokal begrenzt, eine
Metastasierung in die mediastinalen und pulmonalen Lymphknoten ist sehr häufig.
Der Obduktionsbefund zeigt in 50-75% der Fälle ein Übergreifen des Tumors auf
die kontralaterale Pleura (Brockmann, 1992, Law et al., 1982).
Eine hämatogene Metastasierung findet sich zwar in 50% der Fälle, die Metastasen sind jedoch bis auf einzelne Ausnahmen klein, häufig ohne klinische Relevanz
und werden deshalb erst bei der Obduktion erkannt.
Mit abnehmender Häufigkeit sind bei der Fernmetastasierung epitheloider Pleuramesotheliome folgende Organe bzw. Organsysteme betroffen:
kontralaterale Pleura (50%), ipsilaterale/kontralaterale Lunge (jeweils 40%), Leber
(20%), Myokard (20%), Peritoneum, Milz, Haut (jeweils 10%) (Scharmach et al.,
2005).
Epitheloide Mesotheliome metastasieren bevorzugt in die hilären und mediastinalen Lymphknoten, während sich die Mesotheliome vom sarkomatoiden Subtyp
relativ früh auf hämatogenem Weg ausbreiten und sich klinisch ähnlich wie Sarkome verhalten (England et al., 1989).
1 Einleitung
1.5
Asbest
1.5.1
Historischer Überblick
25
Der Werkstoff Asbest ist schon seit der Steinzeit bekannt, dies belegen asbestfaserhaltige Keramik- und Töpferwaren, die im Sudan und in der Nähe heutiger Asbestminen in Finnland gefunden wurden und die auf die Jahre 2500 v. Chr. datiert
werden.
Auch im alten Griechenland, und im Ägypten der Pharaonenzeit wurde es aufgrund seiner vielfältigen Materialeigenschaften verwendet und geschätzt.
Plutarch (120-46 v. Chr.) erwähnt ein Material namens Asbest, welches zu Garn
gesponnen und im Feuer gereinigt werden könne (Neumeister et al., 2001).
Im Altertum baute man Asbest bevorzugt im Mittelmeerraum ab, später auch in
Russland und nach Entdeckung großer Vorkommen im 19 Jh. auch in Südafrika
und Kanada.
Eine kommerzielle Nutzung ist erstmals aus dem Jahre 1720 belegt, wonach Peter
der Große asbestverarbeitende Fabriken im Ural bauen ließ.
Im Zuge der Industrialisierung und der großen Nachfrage wurde ab Ende des
19.Jh. Asbest in großen Mengen aus Kanada und Südafrika importiert, das Importmaximum wurde in den 70er Jahren des 20. Jh. mit 200 000 Tonnen erreicht.
In den folgenden Jahren nahm der Rohasbestimport zwar ab, dennoch wurden
1988 noch über 55000 Tonnen verarbeitet (Raithel et al., 1996).
Die größten asbestverarbeitenden Fabriken in Deutschland befanden sich in
Hamburg, Hannover, Dortmund und Frankfurt (Böhme, 1951).
In den neuen Bundesländern gehörte Dresden neben Magdeburg und Halle- Bitterfeld zu den Städten mit der höchsten Asbestbelastung (Katschinski und Müller,
1994).
Eine gesundheitsschädigende Wirkung ist seit Anfang des vorigen Jahrhunderts
bekannt, es wurden Fälle von Asbestose beschrieben.
Es folgten weitere Untersuchungen und auch tierexperimentelle Studien um einen
ätiologischen Zusammenhang zwischen pathologischen Veränderungen und Asbestexposition zu sichern.
Dennoch traten erste Unfallverhütungsvorschriften, die zulässige Höchstgrenzen
der Staubkonzentration angaben, erst im Jahre 1973 in Kraft.
1 Einleitung
26
Seit 1993 herrscht ein allgemeines Herstellungs- und Verarbeitungsverbot in
Deutschland und neuerdings in der ganzen EU.
Abbruch-, Sanierungs- und Instandhaltungsarbeiten werden zukünftig die wesentlichen asbeststaubgefährdenden Tätigkeiten darstellen, für deren Ausführung umfassende Schutzvorschriften gelten.
Dennoch ist die Gefährdung durch Asbest noch nicht gebannt, da global Produktion und Verwendung sogar wieder zunehmen (Baader und Schittly, 2004).
Somit besteht aufgrund der weltweiten Handelsbeziehungen weiterhin ein gewisses Gefährdungspotential, und nur ein weltweites Verbot kann verhindern, das es
auch in der Zukunft zu weiteren Todesfällen kommt, obwohl die Gefahren heute
sehr gut bekannt sind.
1 Einleitung
1.5.2
27
Fasertypen
Asbest ist ein Oberbegriff für zwei Gruppen von natürlich vorkommenden, silikatischen Mineralien mit charakteristischer feinfaseriger Struktur: die Serpentinasbeste und die Amphibolasbeste, wobei sich letztere in mehrere Untergruppen gliedern lassen.
•
Serpentinasbest:
Chrysotil (Weißasbest)
•
Amphibolasbest:
Krokydolith (Blauasbest)
Amosit (Braunasbest)
Tremolit
Aktinolith
Antophyllit
Die wirtschaftlich bedeutendsten Asbestarten waren Chrysotil mit einem Anteil von
90-95% und Krokydolith mit einem Anteil von 5-10% am Gesamtverbrauch (BGFE,
2001).
1 Einleitung
1.5.3
28
Charakteristische Eigenschaften der Fasern und Pathogenese
Die chemische Zusammensetzung der einzelnen Gruppen unterscheidet sich in
einigen Punkten, was ihre verschiedenen Eigenschaften bedingt.
Die Amphibolasbeste zum Beispiel gehören zu den Kettensilikaten, ihre Fasern
sind gerade, starr und stäbchenförmig, in Bezug auf die Säurebeständigkeit sind
sie dem Serpentinasbest weit überlegen.
Dieser ist aufgrund seines schichtgitterartigen Aufbaus weicher, besser spinnbar
und sehr hitzebeständig (Böhme, 1951).
Seine Fasern sind gekrümmt, feiner und, bedingt durch den komplexen chemischen Aufbau, hohlfaserig.
Je nach geforderten Materialeigenschaften wurde entweder die eine oder andere
Gruppe von Asbest verwendet.
Das unterschiedliche gesundheitliche Gefährdungspotential ist auf diese chemisch- physikalischen Eigenschaften zurückzuführen.
Zwar können alle kommerziell verfügbaren Faserarten im Tierexperiment Lungenkrebserkrankungen hervorrufen, jedoch gilt Chrysotil als wesentlich weniger gefährlich als Krykodolit und Amosit (McDonald und McDonald, 1996).
Dies ist auf die bessere Löslichkeit und Biegsamkeit seiner Fasern zurückzuführen, eine Elimination im Gewebe ist leichter möglich.
Amphibolfasern sind starrer und zu lang, um von Alveolarmakrophagen phagozytiert zu werden.
Die Abhängigkeit der Pathogenität der Fasern von ihren geometrischen Abmessungen gilt als bewiesen, demnach steigt deren kanzerogene Potenz mit zunehmender Länge und Abnahme des Durchmessers (Bauer, 1993).
Kanzerogen sind demnach Fasern mit einem Durchmesser von höchstens 1 µm
und einer Länge von mindestens 3 µm. Es soll eine besonders hohe kanzerogene
Potenz gegeben sein, wenn ihr Durchmesser weniger als 0,2 µm und ihre Faserlänge mehr als 10 µm beträgt.
Im Wesentlichen erreichen die Asbestfasern den Pleuraspalt auf lymphatischem
Wege, wo es zu einer Aktivierung von Lymphocyten und Gewebsmakrophagen
kommt, die ihrerseits aufgrund der Faserlänge nicht in der Lage sind, die Fasern
vollständig zu umschließen und zu phagozytieren. Durch die Ausschüttung von
Zytokinen werden Fibroblasten und andere Zielzellen stimuliert und es kommt un-
1 Einleitung
29
ter Umständen zur Auslösung chronisch entzündlicher, fibrotischer und tumoröser
Prozesse. Eine genaue Übersicht zu den immunologischen Vorgängen findet man
bei Kagan und Brody (1996).
Die Fasern verbleiben im Gewebe und es kommt durch Anlagerung einer eisenhaltigen Proteinhülle zur Bildung von Asbestkörpern. Es handelt sich hierbei um
eine Art Schutzvorrichtung des Organismus gegenüber der mechanischen Reizung der Asbestfasern (Böhme, 1951).
Pseudoasbestkörper sind im Gegensatz dazu morphologisch ähnliche Gebilde, die
nicht auf die Inhalation von Asbest, sondern anderer faserförmiger Mineralien (z.B.
Glaswolle) zurückzuführen sind (Woitowitz et al., 1986). Eine Abgrenzung kann
schwierig sein, da beide Gebilde eine eisenhaltige Proteinhülle aufweisen.
Die Klärung ihrer Herkunft ist nur durch eine Lungenstaubfaseranalyse mittels
lichtmikroskopischer und elektronenmikroskopischer Untersuchung möglich.
Abbildung 1: Asbestkörperchen zentral im Lungenparenchym, eisenhaltige Makrophagen in der Nachbarschaft (Berlinerblau-Färbung).
1 Einleitung
30
Das griechische Wort asbestos (= unauslöschlich, unvergänglich) bezeichnet bereits die wichtigsten Materialeigenschaften.
Asbest ist chemisch sehr beständig, unterliegt nicht dem natürlichen Vorgang der
Korrosion, ist nicht brennbar, säureresistent und eignet sich hervorragend als Isoliermaterial.
Charakteristisch für Asbest ist die leichte Spaltbarkeit in einzelne Fasern, die eingeatmet werden und auf diesem Wege Lunge und Pleura erreichen.
Dieses „Verstaubungsverhalten“ ist weit stärker ausgeprägt als bei allen künstlichen mineralischen Fasern.
Allerdings erlaubt die unter Mineralien selten anzutreffende feinfaserige Struktur,
Asbestfasern zu verspinnen, zu weben und in die Länge zu ziehen, was wiederum
die Materialeigenschaften von Produkten mit Asbestzusatz für die Bereiche Brandfestigkeit, Wärme-/Hitzebeständigkeit, Zugfestigkeit/Elastizität, Chemikalienbeständigkeit und Isolation (Wärme und Elektrizität) erheblich verbesserte.
1 Einleitung
1.5.4
31
Vorkommen und Verbrauch von Asbest
In der Natur sind Asbestvorkommen weltweit verbreitet.
Chrysotilvorkommen befinden sich vor allem in Kanada, Russland und Südafrika.
Krokydolith und Amosit werden in Südafrika und Italien abgebaut, Anthophyllit in
Finnland und Tremolit wird vorwiegend in China und Italien gefunden.
In Deutschland befinden sich geringe Vorkommen als Nebenbestandteile in anderen Gesteinen (Sauerland, Harz).
Vielfach wird Asbest im Tagebau gewonnen, aber auch ein Abbau im Stollenbetrieb ist möglich.
Es gilt als belegt, dass es in der Vergangenheit kaum einen industriellen und
handwerklichen Bereich gab, in dem nicht wenigstens zeitweilig mit Asbest und
asbesthaltigen Materialien umgegangen wurde. Entsprechend vielfältig sind die
Berufsgruppen, die im Laufe ihres Berufslebens asbestexponiert gewesen sein
können:
Sie umfassen Dachdecker, Kfz- Mechaniker, Isolierer, Elektriker ebenso wie Arbeiter in Kraftwerken, der chemischen und metallverarbeitenden Industrie sowie der
Textilindustrie und des Schiffbaus.
Die mit Abstand stärkste Gefährdung ist im Umgang mit Asbestzement und
schwach gebundenen Asbestfasern, wie sie zur Isolierung von Lüftungsrohren und
Stahlkonstruktionen bis Mitte der 70er Jahre obligat verwendet wurden, zu sehen
(Schrab et al., 2000).
Unter den beruflich asbestexponierten Personengruppen stehen Isolierer zusammen mit Werftarbeitern an erster Stelle.
Auch in der Textilindustrie bei der Herstellung asbesthaltiger Schutzkleidung und
im Baugewerbe bei der Herstellung und Verarbeitung von Asbestzement wurden
sehr hohe Staubbelastungen erreicht.
Durch die breite Verwendung von Asbest kann von einer allgemeinen Umweltbelastung ausgegangen werden, so dass sich nahezu bei jedem Menschen Asbestfasen in der Lunge nachweisen lassen, auch wenn er keinen direkten Umgang mit
diesem Material hatte.
1 Einleitung
32
Neumann et al. gehen ab einem Wert von > 22 Asbestkörpern pro cm³ Lungengewebe von einer erhöhten Asbestbelastung aus (Neumann et al., 2001). Eine über
diesen Wert hinausgehende Belastung ist auch bei Personen, die in der Nähe asbestverarbeitender Fabriken oder Asbestminen lebten, festzustellen.
Senyigit et al. berichteten 2000 über ein vermehrtes Auftreten von Mesotheliomen
in einigen Bereichen der südlichen Türkei als Folge der Umgebungsbelastung.
Auch wurden hier asbesthaltige Produkte als Reinigungsprodukte im Haushalt
verwendet.
Auch im Trinkwasser lassen sich aufgrund asbesthaltiger Leitungssysteme in
Deutschland Belastungen von einer bis elf Mio. Fasern pro Liter feststellen.
Bisher konnte jedoch diesbezüglich keine erhöhte Inzidenz von Krebserkrankungen des Verdauungstraktes nachgewiesen werden.
(Müller und Krismann, 1996).
1 Einleitung
1.6
33
Andere ätiologische Aspekte
Künstliche Mineralfasern werden zum Teil als Asbestersatzmaterialien verwendet,
es handelt sich dabei um amorphe Silicate mit andersartiger Faserstruktur.
In Tierversuchen konnten Malignome lediglich nach intraperitonealer Instillation,
nicht aber nach inhalativer Exposition hervorgerufen werden.
Respondek et al. berichteten 1993 über tierexperimentelle Ergebnisse bezüglich
der fibrogenen und neoplastischen Potenzen von sogenannten Rockwool- Fasern.
Es handelt sich dabei um künstlich aus Basaltgestein hergestellte Mineralfasern.
Im Vergleich zu Asbest waren die fibrogenen Auswirkungen gering, und es konnten keinerlei neoplastische Zellen nachgewiesen werden, was in Anbetracht der
nur 10 monatigen Versuchsdauer und der Latenzzeiten, die bei Pleuramesotheliomen üblicherweise vorkommen, nicht verwunderlich ist.
Bis dato ist eine abschließende Aussage bezüglich des Gefährdungspotentials,
das von künstlichen Mineralfasern ausgeht, nicht möglich.
Neben Asbest kommt in der Gruppe der Mineralien natürlichen Ursprungs nur
noch dem Erionit, einem faserförmigen Zeolith, eine kanzerogene Wirkung zu
(Müller, 2005).
In einigen Gegenden der Türkei besteht eine Erionitexposition aus der natürlichen
Umgebung. Sehr hohe Erkrankungsraten wurden in den sogenannten „ZeolithDörfern“ von Kappadokien festgestellt, deren Bewohner in Häusern aus diesem
faserförmigen Vulkangestein lebten.
Im Mesotheliomregister Bochum sind Fälle von ehemaligen türkischen Gastarbeitern bekannt, die an einem Mesotheliom erkrankten und bei denen eine berufliche
Exposition nicht nachgewiesen werden konnte.
Für die Kombination von Rauchen und Asbest konnte bezüglich der Entwicklung
von Mesotheliomen kein Kausalzusammenhang festgestellt werden.
Allerdings wiesen Selikoff und Hammond schon in den 70er Jahren epidemiologisch ein um das Hundertfache erhöhte Lungenkrebsrisiko für Raucher nach, die
gleichzeitig asbestexponiert waren (Selikoff und Hammond, 1975).
1 Einleitung
34
Rauchen allein erhöhte das Risiko an einem Lungentumor zu erkranken um das
bis zu 25- fache. Ein synkanzerogener Effekt tritt auch bei der Kombination von
Asbest und Strahlung auf (Kotschy-Lang, 2001).
Neben Mineralien natürlichen und künstlichen Ursprungs wird auch der Einfluss
radioaktiver Strahlung und Thorotrastapplikation (ein früher gebräuchliches Kontrastmittel) als Ursache für eine Mesotheliomentstehung diskutiert.
Auch konnten in verschiedenen Studien DNA Sequenzen des SV40 in bis zu 60%
der Mesotheliome festgestellt werden.
Müller berichtete 2005, dass in 57% der Mesotheliome, die alle vom epithelialen
Subtyp waren, DNA Sequenzen des SV 40 gefunden werden.
Erstmals gelang der Nachweis 1994. Die Tatsache, dass zwischen 1955 und 1961
mit dem SV 40 Virus verseuchte Poliomyelitis- Impfstoffe im Umlauf waren, ließen
den Verdacht eines erhöhten Risikos für bestimmte Tumoren (u.a. auch für Mesotheliome) in den betroffenen Jahrgänge aufkommen.
Allerdings sind diese Zusammenhänge noch nicht vollständig verstanden und Gegenstand aktueller Forschungsprojekte.
1 Einleitung
1.7
35
Berufskrankheit Mesotheliom
Die Inhalation von Asbeststaub kann zu einer Lungenfibrose, der sog. Asbestose,
zu einem Lungenkarziom, zu einem Mesotheliom der Pleura, des Peritoneums
und des Pericards, oder zu einem Larynxkarzinom führen.
Mit einem Anteil von 70% an der Gesamtzahl der zu entschädigenden berufsbedingten Krebserkrankungen nimmt Asbest unter den kanzerogenen Arbeitsstoffen
mit weitem Abstand die Spitzenposition ein (Rösler et al., 1994).
Woitowitz bezeichnet es als die „bedeutendste, krebserzeugende Arbeitsnoxe“
(Woitowitz et al., 1986).
Theoretisch kann jede Asbestfaser kritischer Abmessung Auslöser eines Mesothelioms sein. Es existiert keine Schwellendosis. Die Erkrankung an einem malignen
Pleuramesotheliom wird von den Berufsgenossenschaften auch nach nur einmaliger beruflicher Exposition anerkannt, da es als gesichert gilt, dass es infolge einer
kurzfristigen bis zu 30 Jahre zurückliegenden Einatmung hoher Faserkonzentrationen (z. B. kommt es bei der mechanischen Bearbeitung von Asbestplatten zu
Faserkonzentrationen von bis zu 50 Mio. Fasern/m³ im Staub) zur Inkorporation in
Lunge und Pleura kommen kann (Muhle et al., 1998).
Die Aufnahme in die Liste der Berufskrankheiten erfolgte in der ehemaligen DDR
1972, in der Bundesrepublik sogar erst 1977.
Weit früher wurde 1936 die Asbestose, und 1943 bösartige Lungentumoren bei
gleichzeitiger Asbestose in Deutschland als Berufskrankheit anerkannt. Seit 1992
ist der Nachweis sogenannter medizinischer Brückenbefunde (asbestassoziierte
Lungen- oder Pleuraveränderungen) zur Anerkennung eines asbestassoziierten
Lungenkarzinoms nicht mehr zwingend erforderlich.
Vielmehr wird eine Kausalität auch bejaht, wenn der Betroffene mehr als 25 sogenannte Faserjahre einer beruflichen Exposition ausgesetzt war.
Ein Faserjahr entspricht einer achtstündigen täglichen Einwirkung über ein Jahr
von 10 6F/m³ der kritischen Abmessungen (Länge > 5µm, Durchmesser <3 µm,
Länge zu Durchmesserverhältnis mindestens 3:1) über einen Zeitraum von mindestens 240 Arbeitstagen (Bauer et al., 1997).
Seit 1993 können auch die Mesotheliome des Perikards unter der Listennummer
4105 der Berufskrankheitenverordnung entschädigt werden.
1 Einleitung
36
Wegen der bereits erwähnten differentialdiagnostischen Schwierigkeiten kommt
dem Pathologen auch im Hinblick auf versicherungstechnische Fragestellungen
eine besondere Verantwortung zu.
1.8
Primäre pulmonale kleinzellige Karzinome
Primäre maligne Lungentumoren stellen unter den bösartigen Neoplasien die
weltweit häufigste Todesursache dar (Müller et al. 1998).
Kleinzellige Lungentumoren nehmen dabei einen Anteil von 20-25% ein.
Sie sollen sich bevorzugt in den zentralen und intermediären Segment- und Subsegmentbronchien entwickeln (Müller et al., 1998).
Der Ausgangspunkt kann am Operations- oder Obduktionspräparat jedoch häufig
nicht mehr eindeutig bestimmt werden.
Zum Diagnosezeitpunkt sind sie meist schon weit fortgeschritten.
Diese sehr aggressiven Tumore sind durch hohe Proliferationsraten (die durchschnittliche Tumorverdoppelungszeit beträgt nur 30 Tage) und eine frühzeitige
lymphogene und hämatogene Metastasierung gekennzeichnet. Dementsprechend
ist ihre Prognose mit einer Überlebenszeit von 4-12 Monaten außerordentlich
schlecht.
In 70% der Fälle liegen zum Diagnosezeitpunkt bereits Metastasen entsprechend
eines M1 Stadiums in anderen Organen und/oder Organsystemen im Sinne von
Fernmetastasen vor.
Nach Junker und Müller weisen 47% der kleinzelligen Karzinome Lebermetastasen, 38,5% Knochenmetastasen, 29,9% Metastasen in der Nebenniere und 18,4%
Hirnmetastasen auf (Junker und Müller, 1989).
Einige der Tumoren machen sich u.a. durch paraneoplastische Syndrome bemerkbar, da sie Hormone ins Blut sezernieren und dadurch den natürlichen Hormonhaushalt beeinflussen.
In Biopsien von oftmals nur 1-2 mm Größe erfolgt die Diagnose zunächst nach
dem histomorphologischen Erscheinungsbild.
Die Tumorzellen sind im Vergleich zu denen anderer Subtypen auffallend klein.
Laut WHO-Klassifikation von 2004 darf ihr Durchmesser maximal dem Durchmesser von drei kleinen, ruhenden Lymphozyten entsprechen (Travis et al., 2004).
1 Einleitung
37
Ebenfalls nach obiger Klassifikation sind kleinzellige Karzinome definiert als maligne epitheliale Tumoren bestehend aus kleinen Zellen mit wenig Zytoplasma,
schlecht definierten Zellgrenzen, fein- granulärem Kernchromatin und fehlenden
oder unauffälligen Nukleolen. Die Zellen sind rund, oval oder spindelförmig, ihre
Zellkerne prominent. Nekrosen sind typischerweise ausgedehnt, die Mitoseraten
hoch.
Die chromatinreichen Kerne stehen gegenüber dem nur wenig oder nicht deutlich
erkennbaren Zellplasma im Vordergrund.
Durch den Zellreichtum und die weiche Konsistenz des Tumors sind Quetschartefakte ebenso ein typisches Merkmal in bioptisch gewonnenem Gewebe wie oftmals ausgedehnte Nekrosen.
Es können vielfältige Wachstumsmuster vorkommen, die Anordnung der Zellen
reicht von solide über bandförmige bis zu rosettenartigen Formationen (Hermanek
und Gall, 1979).
Seit 1999 werden die kleinzelligen Tumoren einer Gruppe neuroendokriner Tumoren zugeordnet.
Die Weltgesundheitsorganisation unterteilt diese nach der Klassifikation von 2004
in:
•
Kleinzellige Karzinome
•
Kombinierte kleinzellige Karzinome
•
Karzinoidtumoren (typisch und atypisch)
•
Großzellige neuroendokrine Karzinome
Das Vorkommen eines kleinzelligen Karzinoms mit einer anderen Tumorentität im
Sinne eines zusammengesetzten Tumors ist oftmals beobachtet worden (kombiniert kleinzellige Karzinome).
Die Kombination eines kleinzelligen Lungenkarzinoms und eines malignen Mesothelioms in der Pleura schilderten 2004 Lee und Soomro.
Der Patient war beruflich asbestexponiert und Raucher.
1 Einleitung
38
Die epitheloiden Zellen zeigten ein papilläres Wachstumsmuster und wurden von
charakteristischen kleinzelligen Komponenten eingeschlossen.
Typischerweise exprimierten die epitheloiden Zellen des Mesothelioms Calretinin
und Cytokeratin 5/6. CD 56 und TTF1 dagegen waren erwartungsgemäß ausschließlich in kleinzelligen Tumorzellen positiv.
Nach Müller sind die häufigsten Primärtumoren mit sekundärer Pleurabeteiligung
Lungentumoren und hier vor allem Adenokarzinome und kleinzellige Karzinome
(Müller, 2005).
Es existieren zahlreiche Studien, die sich mit pseudomesotheliomatös wachsenden Lungenkarzinomen beschäftigen, wobei hier vor allem die Adenokarzinome
besonders gut erforscht sind (Harwood et al., 1976, Ordonez, 2000, Ordonez,
2003, Leers et al., 1998).
Bis zum heutigen Zeitpunkt liegen jedoch kaum Ergebnisse bezüglich pseudomesotheliomatös wachsender kleinzelliger Karzinome vor.
Falkonieri et al. untersuchten 1995 vier pseudomesotheliomatös wachsende kleinzellige Karzinome mit dem Ergebnis, dass eine Unterscheidung nach klinischen
und radiologischen Kriterien nicht möglich war, wohl aber nach histochemischen
und immunhistochemischen Zusatzuntersuchungen.
Die Tumoren waren vom „oat cell“ Typ und wiesen keinerlei kombinierte Bereiche
glandulärer oder squamöser Komponenten auf.
Es existieren demgegenüber Fälle von kombinierten kleinzelligen Karzinomen, die
allein auf histomorphologischer Ebene eine Abgrenzung zu epitheloiden Mesotheliomen nicht erlauben.
Ein ebensolcher Fall machte 2004 im Institut für Pathologie der Ruhr-Universität
Bochum an den Kliniken Bergmannsheil zahlreiche Zusatzuntersuchungen notwendig, mit dem Resultat, dass eine Einordnung dennoch nicht eindeutig erfolgen
konnte. Zwar konnte für CD 56 und TTF1 eine Positivität nachgewiesen werden,
gleichzeitig jedoch auch eine fokale, kräftig positive Reaktion für Calretinin und
Cytokeratin 5/6, die in epitheloiden Mesotheliomen charakteristischerweise positiv
ausfällt.
1 Einleitung
39
Aufgrund der sehr hohen Proliferationsfraktion erfolgte schließlich die Zuordnung
zu einem kleinzelligen Karzinom mit dem Hinweis auf das Vorliegen einer nicht
kleinzelligen Komponente („nach Art eines basalzelligen Plattenepithelkarzinoms“)
im Sinne eines kombinierten kleinzelligen Karzinoms.
Abbildung 2: Lungenschnittfläche eines pseudomesotheliomatös wachsenden kleinzelligen Lungenkarzinoms, hämorrhagischer Lungeninfarkt im Bereich des basalen Unterlappens.
1 Einleitung
1.9
40
Sekundäre Pleuratumoren
Bei dem größten Teil maligner Tumoren der Pleura handelt es sich nicht um primär aus Ursprungszellen der Pleura sich entwickelnde Tumoren.
Nur 1-3% aller Pleuratumoren sind Mesotheliome (Krismann und Müller, 2000).
Sehr viel häufiger haben sich Metastasen anderer Primärtumoren per continuitatem, auf lymphogenem oder hämatogenem Wege in der Pleura ausgebreitet.
Die häufigste in die Pleura metastasierende Tumorentität stellen dabei die Lungenkarzinome dar (Hartmann, 1989).
Einen besonderen Stellenwert nehmen die peripheren Lungenkarzinome ein, die
frühzeitig die Pleura involvieren und sich hier extensiv ausbreiten.
Ihr Wachstumsverhalten imitiert das der Pleuramesotheliome, was zum Begriff des
pseudomesotheliomatösen Wachstums geführt hat (Brockmann, 1992).
Eine klinische, radiologische und makroskopische Unterscheidung ist oftmals nicht
möglich, allerdings ist anamnestisch meist keine Asbestexposition nachzuweisen
(Dessy und Pietra, 1991).
Eine zuverlässige Diagnostik bei der Abgrenzung von sekundären Tumoren der
Pleura ist erst seit den 80er Jahren mit Hilfe der Immunhistochemie möglich
(Krismann und Müller, 2000), und auch mit modernen immunhistologischen Untersuchungsmethoden gelingt eine definitive Diagnose in einigen Fällen nicht.
Pleurametastasen sind ebenfalls bei malignen Tumoren der Oberbauchorgane
(Magen, Pankreas, Leber), des Dickdarms und der endokrinen Organe zu diagnostizieren (Brockmann und Müller, 1991).
Klinisch werden nicht selten diese Primärtumoren erst nach typischer thorakaler
Symptomatik der Pleurametastasen entdeckt, wenn diesbezüglich weitere Staginguntersuchungen durchgeführt wurden (Sommer et al., 1981).
In seltenen Fällen konnte über das synchrone Auftreten von Mesotheliomen und
einer zweiten Tumorentität berichtet werden. In diesen Fällen handelte es sich zu
67% bei dem Zweittumor um ein Lungenkarzinom (Attanoos et al., 2003).
Kann die pleurale Neoplasie aufgrund histologisch und immunhistochemisch überlappender Merkmale mit dem Zweittumor nicht eindeutig als Mesotheliom diagnos-
1 Einleitung
41
tiziert werden, stellt sich die Frage, ob es sich nicht um eine pseudomesotheliomatös wachsende Metastase desselben handelt.
Tumormetastasen sind oft niedriger differenziert als der Primärtumor und eine zuverlässige Einordnung auf Grund spezifisch exprimierter Produkte nicht mehr
möglich (Fisseler-Eckhoff et al., 2000).
Die Klärung dieser Frage ist nicht nur aus versicherungsmedizinischen Gründen
relevant, sondern auch Voraussetzung für das weitere Therpiekonzept.
Im Hinblick auf die zum Teil schwierige Diagnosesicherung wurde 1993 vom europäischen Mesotheliompanel ein 5-stufiges Schema erstellt, welches die diagnostische Wahrscheinlichkeit eines Mesothelioms angibt:
Mesotheliom A: sicheres Mesotheliom, kein Zweifel an der histologischen Diagnose.
Mesotheliom B: wahrscheinliches Mesotheliom, die Zurückhaltung kann ihre Begründung in der mangelnden Gewebegröße, der schlechten Qualität oder der
mangelnden Differenzierung finden, oder das Fehlen gewisser histologischer Details kann zu leichten Zweifeln Anlass geben.
Mesotheliom C: mögliches Mesotheliom, die Diagnose kann nicht abgelehnt werden, aber es fehlen Hinweise für eine positive Diagnose.
Mesotheliom D: wahrscheinlich kein Mesotheliom, die Diagnose ist zwar unwahrscheinlich, kann aber nicht absolut von der Hand gewiesen werden.
Mesotheliom E: sicher kein Meotheliom, die konkrete Diagnose eines anderen
Tumors sollte angegeben werden (Brockmann und Müller, 1991).
1 Einleitung
1.10
42
Metastasierungsverhalten der sekundären Tumoren der
Pleura
Die prädisponierte Lage von Lunge und Pleura innerhalb des Organsystems sowie
der spezielle anatomische Aufbau der Pleurahöhle sind die wichtigsten Gründe für
die häufige Metastasierung sekundärer Tumoren in die Pleura.
Eine Metastasierung erfolgt per continuitatem durch das Einwachsen des Tumors
in die umliegenden Gewebe oder es findet eine Verschleppung der Tumorzellen
über Lymphbahnen und Blutgefäße statt.
Allgemein wird davon ausgegangen, dass sich die Tumoren epithelialen Ursprungs bevorzugt lokal und auf lymphatischem Wege, sarkomatöse Tumoren
dagegen vermehrt hämatogen ausbreiten (Law et al., 1982).
Die Mehrzahl der sekundären Pleuratumoren manifestiert sich vermutlich über die
Pleura viszeralis.
Hier befinden sich dichtgelagert kleinere Blutgefäße und direkt subpleural ein
engmaschiges Netz von Lymphgefäßen.
Die Pleura parietalis kommuniziert einerseits mit dem subpleuralen Lymphgefäßsystem, und steht andererseits ebenfalls mit der Pleurahöhle in direkter Verbindung.
Tumoren aus dem Bauchraum gelangen über die paraaortalen und die begleitenden Lymphbahnen sowie direkt durch lokales Vorwachsen in die Pleurahöhle.
Findet eine lymphogene Ausbreitung statt, kommt es zu dem typischen Erscheinungsbild einer Lymphangiosis carcinomatosa mit ausgeweiteten Lymphgefäßen
und kleinknotiger, vernetzt erscheinender, grauer Verbreiterung der Pleura.
Histologisch finden sich untereinander vernetzte Tumorzellstränge mit begleitender Fibrose in den pulmonalen und pleuralen Lymphgefäßen. Diese kommunizieren über zahlreiche Ausläufer mit Tumorknötchen, die sich intra- und subpleural
oder aber auch im Lungenparenchym gebildet haben (Dail, 1994).
1 Einleitung
1.11
43
Immunhistochemie zur Sicherung der Diagnose maligner
Pleuratumoren
Wie alle Gewebe exprimieren auch Tumorzellen gemäß ihres Ursprungs mehr
oder weniger spezifische zytoplasmatische, nukleäre und Oberflächenantigene,
die mittels immunhistochemischer Färbemethoden nachgewiesen werden und
Hinweise auf ihre Histogenese geben können.
Bei der pathologisch-anatomischen Untersuchung erlaubt der Nachweis bestimmter Antigene bei Neoplasien unklaren Ursprungs gelegentlich eine sichere histogenetische Zuordnung, da auch entdifferenzierte Tumore meist die Filamentstruktur ihrer Muttergewebe beibehalten. Da jedoch die meisten aller bisher bekannten
Antigene nicht tumor- oder organspezifisch sind, werden je nach Fragestellung
spezielle Antigenkombinationen eingesetzt.
Erstmals nachgewiesen wurden gewebespezifische Antigene bereits 1941 von
Coon und Mitarbeitern.
Erst in den 70er Jahren fanden diese Erkenntnisse jedoch breitere Anwendung
auch in der Tumordiagnostik. Besonders die Entwicklung monoklonaler Antikörper
von Köhler et al. 1975 beeinflusste die immunhistochemischen Nachweismethoden entscheidend.
Seit den 80er Jahren sind auch die diagnostischen Möglichkeiten der primären
und sekundären Pleuratumoren durch den Fortschritt und die Erweiterung immunhistochemischer Methoden erheblich bereichert worden.
Trotzdem kann, insbesondere bei kleinen Gewebeproben und/oder fehlenden klinischen Angaben, die Unterscheidung zwischen primären und sekundären malignen Prozessen in vielen Fällen erhebliche Probleme bereiten.
Bis zum heutigen Zeitpunkt existiert kein spezifischer Mesotheliommarker, vielmehr wird ein immunhistochemisches Markerpanel, welches je nach Fragestellung
variiert, zur Diagnosesicherung eingesetzt.
Die spezifischen wiederkehrenden Profile helfen in vielen Fällen, eine abschließende Diagnose zu stellen.
1 Einleitung
44
Es existieren drei typische Problemfälle, die in der Diagnose maligner Tumoren
der Pleura auftreten können:
die Unterscheidung sarkomatoider Mesotheliome und sekundärer Pleuratumoren
primärer Weichteilsarkome kann unter Umständen schwierig sein, besonders
wenn einzelne Parameter vom typischen Bild abweichen.
Auch die Abgrenzung reaktiver Läsionen von sog. Frühmesotheliomen ist zum Teil
nicht unproblematisch. Die Konzentration auf Kernatypien, invasives Wachstum
und andere typische Tumormerkmale ist zwingend zu einer sicheren Diagnose
erforderlich.
Allerdings gelingt in Frühstadien in einigen Fällen der Nachweis infiltrativen
Wachstums noch nicht. Andererseits können reaktive Serosaläsionen geringgradige Kernatypien zeigen.
Auch eine Reihe von Pleurametastasen primärer Lungenkarzinome können sehr
leicht mit vorwiegend epitheloiden Mesotheliomen verwechselt werden.
Besonders hervorzuheben sind hier die Adenokarzinome der Lunge. Zahlreiche
Autoren haben sich bereits mit diesem differentialdiagnostischen Problem befasst
und schlagen aufgrund der Auswertung ihrer Untersuchungsergebnisse in den
allermeisten Fällen ein Markerpanel bestehend aus Markern (Calretinin und CK
MNF 116), die nach aktuellen Erkenntnissen in einem hohen Prozentsatz der Mesotheliomzellen nachzuweisen sind, und gegen HEA (human epithelial antigen)
gerichteten Antikörpern vor, die in der Regel in Mesotheliomen nicht nachgewiesen werden.
Mit diesem Vorgehen ist in der Regel eine Abgrenzung möglich, wenngleich es
aber Grenzfälle gibt, bei denen diese Marker allein eine sichere Diagnose nicht
erlauben.
Außerdem können Faktoren, die mit dem Material (Biopsiegröße, Bedingungen
der Fixierung) oder mit den Methoden/Verfahren (z.B. Einsatz proteolytischer Enzyme) zusammenhängen, die Ergebnisse zum Teil erheblich beeinflussen.
In seltenen Fällen ist eine abschließende Beurteilung unmöglich, und versicherungsmedizinisch relevante Fragen machen ein fachübergreifendes kritisches Abwägen der in Betracht kommenden Differentialdiagnosen erforderlich.
2 Fragestellung
2
45
Fragestellung
Ziel der durchgeführten Untersuchungen war es, die Validität verschiedener Marker im Hinblick auf die Differentialdiagnose zwischen epitheloiden Mesotheliomen
und kleinzelligen Karzinomen zu ermitteln und die Wertigkeit verschiedener Markerkombinationen im Hinblick auf eine möglichst hohe Sensitivität und/oder Spezifität anzugeben.
Die durchgeführten Untersuchungen sollen die folgenden Fragen klären:
1. Dass sich in epitheloiden Mesotheliomen konstant Zytokeratine und Calretinin nachweisen lassen, ist bekannt. Es soll geprüft werden, zu welchem
Prozentsatz dies auch für kleinzellige Karzinome zutrifft.
2. Wie zuverlässig ist die TMA-Technik (Tissue-Micro-Array-Technik) bezüglich der Diagnose von epitheloiden Mesotheliomen in kleinen Gewebeproben im Vergleich zu den an Originalschnitten durchgeführten Immunfärbungen?
3. Können Mesotheliome neuroendokrine Differenzierungen aufweisen, und
wenn ja, in welcher Häufigkeit?
4. Welche Rolle spielt die Proliferationsfraktion des jeweiligen Tumorgewebes
im Hinblick auf die differentialdiagnostische Unterscheidung zwischen epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen Karzinomen?
5. Wie hoch ist die Sensitivität und Spezifität der angewendeten immunhistochemischen Färbungen, wenn es um die Unterscheidung zwischen kleinzelligen Lungenkarzinomen und epitheloiden Mesotheliomen geht?
6. Lassen sich durch Markerkombinationen Sensitivität und Spezifität steigern?
3 Materialien und Methoden
3
Materialien und Methoden
3.1
Materialien
46
Insgesamt lagen der Untersuchung 112 Mesotheliome aus den Jahren 2000-2004
zugrunde.
Von jedem Tumor wurden drei Stanzen von unterschiedlichen Bereichen entnommen, in Tissue-Micro-Array-Blöcke (TMA-Blöcke) eingebracht (vgl. S. 51ff.) und
nach immunhistochemischer Färbung ausgewertet (vgl. S. 60ff.).
Von den Mesotheliomen wurden insgesamt 18 TMA-Blöcke hergestellt, 15 davon
mit je 20 Gewebestanzen, drei enthalten 12 Stanzen.
Bei den kleinzelligen Karzinomen kamen 100 Tumore pulmonalen Ursprungs zur
Auswertung, wobei hier keine TMA-Blöcke hergestellt wurden, da die zu untersuchenden Tumore in Form von Biopsieproben vorlagen und somit nicht genug Gewebe für diese Form der Untersuchung boten.
Alle untersuchten Gewebeproben stammen aus dem Archiv des Instituts für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken
Bergmannsheil.
Sowohl kleinzellige Karzinome als auch Mesotheliome wurden nach histologischen Kriterien der WHO-Klassifikation in Kombination mit immunhistochemischen
Zusatzuntersuchungen diagnostiziert.
Bei allen untersuchten Geweben handelte es sich um formalinfixiertes Gewebe,
das standardisiert aufgearbeitet und in Paraffin eingebettet worden war.
3 Materialien und Methoden
3.1.1
47
Mesotheliome
Insgesamt lagen den Untersuchungen 112 Mesotheliome aus den Jahren 20002004 zugrunde. Bei 60 Fällen handelte es sich um auswärtige Gewebeproben, die
dem Institut für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil zur konsiliarischen Begutachtung vorgelegt
worden waren.
Es wurden jeweils nur Fälle ausgewertet, von denen mindestens zwei repräsentative Tumorstanzen vorlagen. Für keine Färbung waren alle ursprünglich eingebrachten Stanzen auswertbar, so dass unterschiedliche Fallzahlen resultieren.
Die Zahl der ausgewerteten Mesotheliome schwankt je nach Färbung zwischen
103 (CD 56) und 95 (Calretinin), je nachdem, wie viele Stanzen während des Aufziehens auf Objektträger verloren gegangen waren oder aus anderen Gründen (zu
wenige Tumorzellen in tieferen Schnittebenen der Stanze, unspezifische Hintergrundfärbung, Stanzzylinder übereinander geklappt und deshalb nicht auswertbar)
nicht repräsentativ waren und deshalb nicht zur Auswertung gelangen konnten.
Alle untersuchten Mesotheliome waren vom vorwiegend epitheloiden Subtyp und
zum ganz überwiegenden Teil pleuralen Ursprungs (n=105). 7 Mesotheliome
stammten aus dem Peritoneum.
Zur Verfügung standen Operationspräparate in Form von Resektaten, Exstirpaten,
Dekortikaten und P3D-Präparaten (hierbei handelt es sich um ein Pleuropneumoniepräparat, welches zusammen mit dem angrenzenden Perikard und dem Diaphragma im Sinne eines en block- Resektates entfernt wird) sowie Biopsieproben.
Bei den auswärtigen Präparaten wurde vermerkt, ob das Gewebe als Nassmaterial oder in Form von Paraffinblöcken bei der Zusendung vorgelegen hat.
Es wurden nur Mesotheliome für die Untersuchung ausgewählt, die ausreichend
Gewebe für mehrere immunhistologische Schnitte lieferten und von denen entweder ausreichend große Areale von Tumorgewebe in einem Block vorlagen die einen Abstand von mindestens 0,5 cm zwischen den Stanzen erlaubten, oder aber
mehrere Gewebeblöcke mit repräsentativen Tumorzellen, um der Heterogenität
dieser Tumorentität Rechnung zu tragen.
3 Materialien und Methoden
48
Das Durchschnittsalter der an einem Mesotheliom erkrankten Patienten lag zum
Diagnosezeitpunkt bei 65,2 Jahren, wobei der jüngste Patient 41, der älteste 83
Jahre alt war.
Alters- und Geschlechtsverteilung sind Abbildung 3 zu entnehmen.
Verteilung der Mesotheliome auf Altersgruppen
und Geschlecht
n
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
41
33
18
7
0 0
30-39
3
1
40-49
3
2
50-59
60-69
70-79
4
0
45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
total m
total w
%
80-89
Altersgruppe
Abbildung 3: Alters- und Geschlechtsverteilung in der Gruppe der Mesotheliome.
3 Materialien und Methoden
3.1.2
49
Kleinzellige Tumore
Zur Auswertung kamen 100 kleinzellige Karzinome aus den Jahren 2002 bis 2004.
Dabei handelte es sich fast ausschließlich um kleinzellige Tumoren pulmonalen
Ursprungs, in zwei Fällen lag eine Pleurakarzinose eines kleinzelligen Karzinoms
vor.
Da den Untersuchungen zum überwiegenden Teil kleinere Biopsieproben der Tumore zugrunde lagen, konnten keine Tissue-Micro-Array (TMA) Blöcke der kleinzelligen Tumoren hergestellt werden.
Das durchschnittliche Alter der Patienten zum Diagnosezeitpunkt lag bei 68 Jahren, der älteste Patient war 86, der jüngste 34 Jahre alt (Abb.4).
Verteilung der kleinzelligen Karzinome
auf Altersgruppen und Geschlecht
n
40
35
30
25
20
15
10
5
0
31
25
11
2
5
0
30-39
1
40-49
8
4
50-59
60-69
6
70-79
4 3
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
total m
total w
%
80-89
Altersgruppe
Abbildung 4: Alters- und Geschlechtsverteilung in der Gruppe der kleinzelligen Karzinome.
3 Materialien und Methoden
3.2
50
Methoden
3.2.1 TMA-Technik
Erstmals im Jahre 1986 wurden verschiedene Gewebeproben simultan im Rahmen der sog. Sausage-Technik von Battifora et al. untersucht.
Bei dieser Methode wurden sogenannte Multi-Tissue Tumor Blöcke (MTTB) hergestellt, indem bis zu 100 verschiedene Gewebe wenig standardisiert mittels eines
Biopsieinstrumentes von Hand in einen Empfängerparaffinblock eingebracht wurden (Fedor und De Marzo, 2005).
Aufgrund der fehlenden Standardisierung war die Auswertung der jeweiligen Untersuchungsergebnisse erheblich erschwert.
Eine technische und gedankliche Weiterentwicklung dieser Untersuchungsmethode stellt der Tissue-Micro-Arrayer dar, der 1998 von Kononen et al. entwickelt
wurde, um eine große Anzahl von Geweben unter standardisierten Bedingungen
gleichzeitig histochemisch und immunhistochemisch zu untersuchen (Kononen et
al., 1998)
Durch die genaue Positionierungsmöglichkeit jeden Gewebes in X- und YRichtung ist die Reproduzierbarkeit gewährleistet und die Bewertung der Färbeergebnisse sehr erleichtert.
Vor dem eigentlichen Stanzvorgang wurden die zu untersuchenden morphologisch
repräsentativen Bereiche der Tumoren auf den HE-Schnitten mit einem Faserstift
markiert.
3 Materialien und Methoden
51
Stanzvorgang:
Das hierzu gebräuchliche Gerät, der Tissue-Micro-Arrayer, ist kommerziell bei
Beecher Instruments, Silver Springs, Maryland/USA zu beziehen. Es besteht aus
einer Basisplatte mit eingelassener Haltevorrichtung in der sich das Empfängerparaffinblöckchen einspannen lässt. Über diesen in seiner Position fixierten Block
wird ein Tischchen geschoben, auf dessen Oberfläche der Block mit dem zu entnehmenden Gewebe frei beweglich ist.
In definiertem Abstand dazu befindet sich oberhalb ein manuell in rechts- und
links- Richtung schwenkbarer und in der Senkrechten beweglicher Arm, an dessen
Enden sich in ihrem Durchmesser unterschiedliche Stanzzylinder anbringen lassen. Die Position der Zylinder lässt sich durch digitale Präzisionsführer in X- und
Y-Richtung manuell steuern.
Schwenkvorrichtung
mit rechtem und linkem Stanzzylinder
Präzisionsführer Y-Achse
Präzisionsführer X-Achse
Basisplatte
Tisch mit Entnahmeblock
Haltevorrichtung mit
Empfängerblock
Abbildung 5: Tissue-Micro-Arrayer mit Entnahme- und Empfängerblock.
3 Materialien und Methoden
52
Der Entnahmeblock wird nun so positioniert, dass sich der zuvor auf dem HESchnitt markierte Bereich des Tumors direkt unter der linken Stanznadel befindet.
Die linke Nadel besitzt einen etwas größeren Durchmesser als die rechte,
das bedeutet einen leicht vergrößerten Durchmesser des Stanzzylinders des entnommenen Gewebes gegenüber dem zuvor mit der rechten Nadel im Empfängerblock ausgestanzten Zylinder. Auf diesem Wege wird eine Klemmpassung des
Gewebes im Empfängerblock gewährleistet.
Nachdem ein Zylinder aus dem Entnahmeblock ausgestanzt wurde, wird das
Tischchen mit diesem entfernt und der Arm mit den Stanznadeln umgeschwenkt,
so dass sich nun durch Herabdrücken der rechten Nadel in festgelegter Position
ein zylindrischer Hohlraum für den einzubringenden Tumorzylinder im Empfängerblöckchen schaffen lässt.
Nachfolgend kann die Gewebeprobe der linken Nadel vorsichtig in diesen Hohlraum eingebracht werden.
Anschließend werden die Nadeln mit Hilfe der Präzisionsführer um 1,5 mm in Xund/oder Y-Richtung verschoben und ein neuer Stanzzyklus begonnnen.
Abb.: 6 a
Abb.: 6 b
Abb.: 6 c
Abbildung 6 a - c: Stanzvorgang mit Ausstanzen eines Zylinders im Empfängerblock, Ausstanzen
des entsprechenden Areals im Entnahmeblock und Einbringen in den Empfängerblock.
Für jeden Block wurde mittels Tabelle die Position der untersuchten Tumoren dokumentiert.
Da sich durch das Ausstanzen des Zylinders im Empfängerblock im Randbereich
sehr leicht das Paraffin aufwirft, hat sich ein leichtes Erwärmen der Blöckchen vor
dem Stanzvorgang bewährt.
Da die Empfängerblöcke eine Höhe von 4 mm aufweisen, die Entnahmeblöcke
durch vormalig angefertigte Schnitte aber meist dünner sind, ist ein stufenloser
3 Materialien und Methoden
53
Abschluss des Gewebes mit dem umgebenden Paraffin nicht gegeben. Aus diesem Grunde ist es notwendig, die Höhe durch Unterlegen von Paraffin auf 4 mm
anzupassen.
So befinden sich nach Einbringen aller Stanzzylinder alle auf annähernd gleichem
Höhenniveau, so dass ein Gewebeverlust beim Schneiden der ohnehin zum Teil
reduzierten Gewebe vermieden wird.
Am Rand jeden Blöckchens wurde ein gewebefreier Rand von 3 mm eingehalten,
um einem Gewebeverlust durch Abschwimmen während des Aufziehens der
Schnitte vorzubeugen.
Es wurden insgesamt 18 TMA-Blöcke hergestellt, 15 davon enthalten je 20 Mesotheliomstanzen von 2 mm Durchmesser und 2 mitgeführte Positivkontrollen (originäres Lungengewebe/Lungengewebe mit angeschnittener Bronchiole).
Drei Blöcke enthalten nur 12 Stanzen mit je zwei Positivkontrollen, da diese nachträglich hergestellt worden sind, nachdem sich herausgestellt hatte, dass durch
Faktoren während des Färbens und die vorbereitenden Arbeitsschritte so viele
Stanzzylinder verloren gegangen waren, dass die geforderte Kollektivgröße von
100 Mesotheliomfällen nicht erreicht wurde.
Die Positivkontrollen dienen einerseits bei den Färbungen TTF1 und CD 56 zur
Kontrolle, ob die entsprechenden immunhistochemischen Reaktionen korrekt abgelaufen sind, oder negative Ergebnisse eventuell auf einen fehlerhaften Ablauf
der immunhistochemischen Arbeitsschritte zurückzuführen sind.
Andererseits werden unspezifische Färbeergebnisse auf diese Weise ausgeschlossen.
Gleichzeitig wird die Auswertung der jeweils angefertigten Schnitte erheblich erleichtert, da sich durch die spezifische Position der Positivkontrollen am rechten
oberen Rand eine falsche Zuordnung der Gewebezylinder durch unbewußt spiegelbildliches Betrachten der Schnitte ausschließen lässt.
3 Materialien und Methoden
54
Abbildung 7: TMA-Blöckchen mit 20 Stanzzylindern epitheloider Mesotheliome sowie zwei
Stanzen originären Lungengewebes am rechten oberen Rand.
Pro Tumor sind drei Stanzen aus jeweils repräsentativen Bereichen entweder aus
einem Blöckchen oder, wann immer vorhanden, aus zwei oder drei verschiedenen
entnommen worden und in drei unterschiedliche Empfängerblöcke immer an gleicher „Schachbrettposition“ eingebracht worden (Tabelle 6).
Einerseits wurde so der bekannten Heterogenität dieser Tumorentität, andererseits einem möglichen schwankenden Ausfall der Färbequalität, hervorgerufen
durch Faktoren während der immunhistochemischen Arbeitsschritte, Rechnung
getragen.
Nach Subtrahieren der Anzahl an Stanzen, die nach dem Schneiden und Aufziehen auf die Objektträger verloren gegangen waren oder die nach mikroskopischer
Kontrolle nicht mehr ausreichend viele Tumorzellen enthielten, verblieben je nach
Färbung unterschiedlich viele repräsentative Mesotheliomstanzen aus 95 (Calretinin) bis 103 (CD 56) Mesotheliomen.
Alle angefertigten Blöcke wurden für eine Stunde bei 40°C im Brutschrank erwärmt, um eine bessere Adhäsion zu erreichen und möglicherweise vorhandene
Spalträume zwischen Stanzzylinder und umgebenem Paraffin zu eliminieren.
3 Materialien und Methoden
55
3.2.2 Färbevorgang
Vorbehandlung:
Von allen untersuchten Gewebeproben wurden nach Formalinfixierung (phosphatgepuffertes, 4%iges Formalin, pH 7,4) und Paraffineinbettung 1-2 µm dicke
Schnittpräparate angefertigt, die auf gelatinebeschichtete Objektträger aufgezogen
wurden.
Die Präparate wurden über Nacht bei einer Temperatur von 37°C im Brutschrank
getrocknet. Da Paraffinreste eine verstärkte Hintergrundfärbung immunhistochemischer Färbungen bedingen, erfolgte die sorgfältige Entparaffinierung mittels absteigender Alkoholreihe.
Für die Antikörper CD 56, CK 5/6, Mib1, Calretinin und TTF 1 wurde eine hitzeinduzierte Antigendemaskierung in der Mikrowelle vorgenommen.
Dazu wurden die entparaffinierten Schnitte in eine mit EDTA-Puffer (pH 8, außer
Calretinin: hier pH 9,5) gefüllte Küvette gestellt und 20 min. in der Mikrowelle bei
ca. 100°C (800 W) erwärmt.
Bei CK MNF 116 erfolgte eine enzymatische Demaskierung mit Protease für 15
min. bei 37°C.
Bei der Antigendemaskierung wurden die Bindungsstellen der Antigene, die durch
die Formalinfixierung vernetzt sind, für die nachfolgende Bindung mit den jeweiligen Antikörpern freigelegt.
Für das weitere Vorgehen wurden die verschiedenen Primärantikörper gemäß den
Herstelleranweisungen mit Hilfe eines Diluents der Firma Zymed verdünnt, was
einerseits ihre Haltbarkeit steigert und andererseits die Einwirkung in der jeweils
geeigneten Konzentration gewährleistet.
Konzentrationen der Primärantikörper:
CD 56 (Zymed):
1:400
TTF 1(Neo Markers):
1:100
CK MNF 116 (DAKO):
1:1600
CK 5/6 (DAKO):
1:200
Mib1 (DAKO):
1:800
Calretinin (DAKO):
1:2000
3 Materialien und Methoden
56
Da alle hier durchgeführten immunhistochemischen Färbungen nach der Labelled
StreptAvidin-Biotin-Methode (LSAB-Methode) erfolgten, soll diese im Folgenden
kurz erläutert und ihre Vorteile gegenüber anderen Methoden aufgezeigt werden.
LSAB-Methode:
Bei dieser Methode bindet der spezifische Primärantikörper an das Antigen im
Gewebe und wird mit einem biotinylierten Sekundärantikörper markiert, der eine
Brücke zwischen dem Primärantikörper und dem LSAB-Komplex bildet.
Bei Biotin handelt es sich um ein wasserlösliches Vitamin, das sich gut an den
Brückenantikörper koppeln lässt und aufgrund der hohen Affinität zu Avidin eine
Verbindung zum Streptavidin-Enzymkonjugat herstellen kann.
Die Schnitte wurden für 25 min. bei Raumtemperatur mit den Primärantikörpern
inkubiert, danach für jeweils 15 min. mit den biotinylierten Brückenantikörpern und
dem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat.
Nach jedem Vorgang wurde mit Pufferlösung gespült, um im Gewebe verbliebene
Überschüsse zu entfernen.
Abbildung 8: Die drei Schritte der LSAB-Methode bestehen aus Primärantikörper (Schritt 1), biotinyliertem Brückenantikörper (Schritt 2) und enzymmarkiertem Streptavidin (Schritt 3)
(Boenisch, 2003).
3 Materialien und Methoden
57
In einem letzten Schritt wurde der Komplex durch die Zugabe des Chromogens
Neu-Fuchsin (rot) sichtbar gemacht.
Dieses bindet an die alkalische Phosphatase des Streptavidin-Enzymkomplexes
und bildet somit einen Enzym-Substratkomplex.
Die Einwirkzeit betrug 10 min.
Die beschriebenen Schritte erfolgten im Autostainer Tech-Mate 500 der Firma
DAKO.
Anschließend wurden die Schnitte von Hand mit Hämatoxylin (Mayer) für zwei Minuten gegengefärbt und dann ebenfalls für zwei Minuten in Wasser gebläut und
danach wiederum für zwei Minuten in Tris-Puffer gespült.
Daraufhin wurden die Präparate durch die aufsteigende Alkoholreihe geführt und
somit dehydriert bevor sie über Xylol mit Eukitt, einem Klebstoff auf Xylolbasis,
und Deckgläsern eingedeckt wurden.
Abbildung 9: TMA-Schnitt mit 20 Tumorstanzen epitheloider Mesotheliome sowie zwei Positivkontrollen am Beispiel der Calretinin- Färbung.
Die Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Präparate wurde mit einem
Lichtmikroskop der Firma Leica vorgenommen.
3 Materialien und Methoden
3.3
58
Verwendete Antikörper
Für die vorliegende Untersuchung wurden monoklonale Antikörper gegen Ki-67
(Klon Mib 1, Dako, Hamburg), Calretinin (Klon DAK Calret 1, Dako, Hamburg),
TTF1 (Klon 8G7G3/1, Neomarkers, Fremont, CA, USA), CD 56 (Klon 123C3, Zymed, South San Francisco, CA, USA), sowie Antikörper gegen Zytokeratin 5 und 6
(Klon D5/16 B4, Dako, Hamburg) und Zytokeratin 5, 6, 8, 17 und 19 (Klon MNF
116, Dako, Hamburg) verwendet.
Da monoklonale Antikörper nur ein Epitop eines Antigens erkennen, sind sie sehr
spezifisch, Kreuzreaktionen sind selten.
Weitere Vorteile sind die saubere positive Darstellung ohne Beeinträchtigung
durch eine Hintergrundfärbung und die garantierte Reproduzierbarkeit des Färbeergebnisses. Andererseits reagieren monoklonale Antikörper aufgrund der hohen
Spezifität wesentlich empfindlicher auf mögliche Veränderungen des Epitops, und
es kann z.B. bei Überfixierungen zu falsch negativen Ergebnissen kommen.
Tabelle 2: Charakteristika der verwendeten Antikörper.
Antigen
Antikörper-Klon
Hersteller
Spezies
Isotyp
Ki-67
Mib1
Dako
Maus
IgG1, Kappa
Calretinin
Dak Calret 1
Dako
Maus
IgG1, Kappa
TTF1
8G7G3/1
Neomarkers Maus
IgG1, Kappa
CD 56
123C3
Zymed
Maus
IgG1
CK 5/6
D5/16B4
Dako
Maus
IgG1, Kappa
CK 5/6/8/17/19 MNF 116
Dako
Maus
IgG1, kappa
Tabelle 3: Verdünnung der verwendeten Primärantikörper und Vorbehandlung der Schnittpräparate.
Antigen
Antikörper-Klon
Verdünnung
Vorbehandlung
Ki-67
Mib1
1:800
hitzeinduzierte Antigendemaskierung
Calretinin
Dak Calret 1
1:2000
hitzeinduzierte Antigendemaskierung
TTF1
8G7G3/1
1:100
hitzeinduzierte Antigendemaskierung
CD 56
123C3
1:400
hitzeinduzierte Antigendemaskierung
CK 5/6
D5/16B4
1:200
hitzeinduzierte Antigendemaskierung
1:1600
enzymatische Antigendemaskierung
CK 5/6/8/17/19 MNF 116
3 Materialien und Methoden
3.3.1
59
CD 56
Bei CD 56 handelt es sich um ein Protein, welches in Form dreier verschiedener
Isoformen molekularer Massen, 180 kD, 140 kD und 120 kD, in menschlichem und
tierischem Gewebe vorkommt.
Das neural cell adhesion molecule (NCAM) gehört zur Familie der Immunglobuline.
Es sind Oberflächenproteine, die durch charakteristische Bindungen in Zell zu
Zell- Interaktionen während der Embryonalentwicklung eine Rolle spielen.
Sie werden exprimiert in neuralem, neuroektodermalem und neuroendokrinem
Gewebe und in Neoplasien, die aus diesen Ursprungsgeweben hervorgehen.
Es findet eine zytoplasmatische Reaktion in den jeweiligen Geweben statt.
In Normalgewebe (originärem Gewebe) bedingt CD 56 (Klon 123C3) eine Anfärbung peripherer Nervenzellen, Zellen der Schilddrüse, des Gehirns und der Plazenta.
In neoplastischen Geweben wird es verwendet zur Detektion kleinzelliger Lungenkarzinome und kann ebenso bei der Diagnose von T-Zell-Lymphomen hilfreich
sein.
Schon in den 80er Jahren konnte an Gefrierschnitten gezeigt werden, dass nahezu 100% aller kleinzelligen Karzinome diffus CD 56 exprimieren, nicht kleinzellige
Karzinome jedoch nur selten positiv für CD 56 sind.
Kaufmann konnte 2000 zeigen, dass auch Untersuchungen an Paraffinmaterial
sehr gut geeignet sind, kleinzellige und nicht kleinzellige Karzinome immunhistochemisch zu unterscheiden (Kaufmann, 2000).
3 Materialien und Methoden
3.3.2
60
Thyreoidaler Transkriptionsfaktor (TTF1)
Der thyreoidale Transkriptionsfaktor TTF1 ist ein 38 kD schwerer nukleärer
Transkriptionsfaktor der NKx2 Familie (Abutaily et al., 2002). In dieser
Untersuchung kam der kommerziell verfügbare Antikörper gegen TTF1 (Klon
8G7G3/1) zur Anwendung.
Eine nukleäre Färbung zeigen in originärem Lungengewebe die Typ IIPneumozyten und die nicht kinozilientragenden Bronchialepithelien ebenso wie
die Zellen der Schilddrüse und des Dienzephalons (Kaufmann, 2000, Lau et al.
2002).
In neoplastischem Gewebe reagieren außer den Karzinomen der Schilddrüse Adenokarzinome und kleinzellige Karzinome der Lunge zu einem überwiegenden
Teil positiv auf TTF1.
Law et al. wiesen allerdings 2002 darauf hin, dass in undifferenzierten und anaplastischen Schilddrüsentumoren in den allermeisten Fällen keine Färbereaktion
nachzuweisen ist. Dies trifft auch auf undifferenzierte Lungenkarzinome zu (Krismann, 2005, persönliche Mitteilung).
Tamiolakis et al. (2002) konnten in ihrer Studie über eine TTF1- Positivität bei
66,7% der von ihnen untersuchten kleinzelligen Lungenkarzinome berichten, in
einer weiteren Untersuchung waren es nur 53% (Chang et al., 2004).
Die Mehrzahl aller Studien berichten jedoch von einer TTF1- Expression in mehr
als 80% der kleinzelligen Lungenkarzinome (Chhieng et al., 2001, Myong, 2003,
Wu et al., 2003, Chang et al., 2004, Johansson, 2004, Lau et al., 2002), allerdings
sei es nicht spezifisch für diese, eine Expression könne auch in kleinzelligen Karzinomen anderer Primärlokalisationen gefunden werden (Lau et al. 2002).
Die TTF1- Immunreaktion wird außerdem verwendet zur Unterscheidung zwischen
primären Lungentumoren (insbesondere Adenokarzinomen) und extrapulmonalen
nicht kleinzelligen Tumoren (außer Schilddrüsentumoren) und Mesotheliomen, die
ebenfalls in der Regel negativ reagieren.
Der Wert von TTF1 als prognostischer Marker in Neoplasien der Lunge ist bereits
in vielen Studien untersucht worden, allerdings zum Teil mit sehr widersprüchlichen Ergebnissen (Myong, 2003, Syed et al., 2000, Puglisi et al., 1999), so dass
der diesbezügliche Nutzen von TTF1 weiterhin Gegenstand aktueller Forschungen
bleibt.
3 Materialien und Methoden
3.3.3
61
CK 5/6, CK MNF 116
Die Zytokeratine sind Polypeptide des Alpha Typs mit einem Molekulargewicht
zwischen 40 und 68 kD und gehören zur Familie der Intermediärfilamente, die als
Komponente des Zellskeletts in fast allen epithelialen Zellen und auch einigen
nicht epithelialen Zellen gefunden werden. Die Intermediärfilamente lassen sich in
7 Subtypen unterteilen. Die Zytokeratine bilden eine dieser Untergruppen.
Zytokeratine sind die meistverbreiteten Marker der Epitheldifferenzierung, es lassen sich je nach Molekulargewicht und isometrischem Punkt 20 verschiedene Typen unterscheiden (Moll et al., 1982).
Bei dem genutzten Antikörper (Monoclonal Mouse Anti- Human Cytokeratin 5/6,
Klon D5/16B4) handelt es sich um einen Antikörper gegen Zytokeratin 5 und 6. CK
5 besitzt ein Molekulargewicht von 58 kD, es gehört, ebenso wie Zytokeratin 6 (56
kD) zu den hochmolekularen Zytokeratinen des Grundtyps.
CK 5/6 wird in allen Zellschichten des mehrschichtigen Epithels, des Übergangsepithels und komplexen Epithels sowie in Mesothelzellen und in epitheloiden Mesotheliomzellen exprimiert. Darüber hinaus auch in Basalzellen des Plattenepithels
(Boenisch, 2003).
In der Regel wird es nicht in einfachen Epithelien und nicht epithelialem Gewebe
nachgewiesen.
Es gilt als ein positiver Marker für den Nachweis von epitheloiden Mesotheliomen
(Clover et al., 1997) und als hilfreich bei deren Abgrenzung gegenüber primären
Lungenkarzinomen, insbesondere Adenokarzinomen, wenn er in Kombination mit
anderen der Fragestellung entsprechenden Markern eingesetzt wird.
Der zweite verwendete Antikörper aus der Gruppe der Zytokeratine (Monoclonal
Mouse Anti- Human Cytokeratin, Klon MNF 116) markiert ebenfalls Epithelgewebe
und Tumoren epithelialen Ursprungs, allerdings reagiert er zusätzlich mit Zytokeratinen niedrigeren Molekulargewichts, sein Reaktionsspektrum umfasst Zytokeratine mit einem Molekulargewicht zwischen 40 und 58 kD (Boenisch, 2003). Er reagiert mit den hochmolekularen Zytokeratinen 5, 6 und 17 sowie den niedermolekularen Zytokeratinen 8 und 19.
3 Materialien und Methoden
3.3.4
62
Calretinin
Calretinin wird von originären und neoplastischen Mesothelzellen exprimiert und
ist ein hoch spezifischer und sensitiver Marker zur Identifizierung von Mesotheliomen vom epitheloiden Subtyp besonders im Hinblick auf die Abgrenzung derselben gegenüber pulmonalen Karzinomen adenoider (=Adenokarzinome) aber auch
kleinzelliger Differenzierung. Auch hier sollte die Diagnose je nach Fragestellung
immer durch ein Panel von Antikörpern, beispielsweise zwei positive „Mesotheliommarker“ (Calretinin, CK 5/6) und zwei negative (TTF1, CEA) gestützt werden
(Abutaily et al., 2002, Attanoos et al., 2003).
Bei Calretinin handelt es sich um ein Calcium bindendes Protein einer Molekülmasse von 29 kD (Die Tos und Doglioni, 1998), welches in zentralem und peripherem Nervengewebe sowie normalen Mesothelzellen, Mastzellen und Muskelzellen
exprimiert wird.
Auch in Makrophagen ist gelegentlich eine positive Reaktion nachweisbar (Abutaily et al. 2002).
Seine Funktion ist noch nicht eindeutig geklärt, einige Autoren postulieren eine
Calciumpufferfunktion an Nervenzellen bei Störungen des Calciumhaushaltes (Dei
Tos und Doglioni, 1998).
Der in dieser Untersuchung verwendete Antikörper (Klon DAK Calret 1) weist das
entsprechende Antigen im Zellkern und im Zytoplasma nach.
Bei Mesotheliomen fällt die Reaktion charakteristischerweise sowohl nukleär als
auch zytoplasmatisch positiv aus.
3 Materialien und Methoden
3.3.5
63
Ki-67
Das Ki-67 Antigen wurde erstmals 1983 von Gerdes et al. in basaloiden Tumoren
nachgewiesen, die komplette molekularbiologische Struktur aber erst 1993 von
Schlüter und Mitarbeitern publiziert (Schlüter et al., 1993, Gerdes et al., 1984).
Demnach handelt es sich um ein nukleäres Protein, welches in zwei Isoformen mit
345 und 395 kD vorkommt. Ein Nachweis mit dem Antikörper Mib1 gelingt jeweils
nur in den aktiven Phasen eines Zellzyklus (späte G1-, S-, G2-, M-Phase) ausschließlich im Zellkern. In den Ruhephasen wird das Protein sehr schnell abgebaut.
Der Ki-67 Proliferationsindex ist der prozentuale Anteil der Zellen mit nukleärer
Mib1- Reaktion und dient zum Nachweis der Wachstumsfraktion verschiedener
normaler und neoplastischer Gewebe.
In Normalgewebe finden sich positive Reaktionen in Geweben mit hohen Zellteilungsraten, wie Dünn- und Dickdarmschleimhaut, Zellen der Magenschleimhaut
und in lymphatischen Keimzentren.
Die Proliferationsfraktion ist in neoplastischen Geweben gemäß ihrer Definition
zumeist größer als in Normalgewebe, kann je nach Tumorentität und Malignitätsgrad jedoch erheblich schwanken, und ist hier teilweise auch von differentialdiagnostischer Bedeutung.
Die Funktion des Ki-67 Antigens ist noch nicht abschließend geklärt. Einige Autoren schreiben ihm eine Bedeutung in der Aufrechterhaltung der DNA-Struktur während der Teilungsphase zu (Sawhney und Hall 1992, zit. bei Junker, 2001)
In zahlreichen Studien wurde eine Korrelation zwischen der Malignität verschiedener Tumorentitäten und ihrer Wachstumsfraktion festgestellt (Gerdes et al., 1984,
Schönherr et al., 2004).
3 Materialien und Methoden
3.4
64
Beurteilung der Reaktionsmuster
Die Auswertung sowohl der kleinzelligen Tumore, als auch der Mesotheliome erfolgte für alle verwendeten Immunfärbungen mit Ausnahme von Mib1 semiquantitativ nach dem modifizierten immunreaktiven Score nach den Richtlinien von
Remmele und Stegner.
Bei dieser Methode wird das Ergebnis durch die Färbeintensität und den Prozentsatz der angefärbten Tumorzellen bestimmt.
Dazu wird das Produkt der Werte für Färbeintensität und des Anteils positiver Tumorzellen gebildet. Es resultiert ein Score von 0-12. Werte von 0-1 entsprechen in
dieser Auswertung einem negativen Ergebnis.
Tabelle 4: Wertung von Färbeintensität und Prozentsatz der angefärbten Tumorzellen bei den
Markierungen Calretinin, CK 5/6, CK MNF 116, TTF1 und CD 56.
Punkte
Färbeintensität
Anteil positiver Tumorzellen
keine Anfär0
bung
0%
1
schwach
<10%
2
mäßig
10-50%
3
stark
51-80%
4
-
>80%
3 Materialien und Methoden
65
Tabelle 5: Bewertung des immunreaktiven Scores.
Bewertung des immunreaktiven Scores
Score
0
negativ
1
schwach
positiv
mäßig
positiv
2
3
4
6
8
stark
positiv
9
12
Bei der zellulären Lokalisation der Immunreaktion wurde unterschieden zwischen
zytoplasmatischer und nukleärer Reaktion, bei den kleinzelligen Karzinomen wurde bei der CK MNF 116- Immunfärbung zusätzlich vermerkt, ob innerhalb der Zellen das Färbesignal homogen/diffus oder heterogen/punktförmig war.
Die Auswertung des Proliferationsmarkers Mib1 erfolgte ausschließlich nach dem
Prozentsatz der sich in der Teilungsphase befindlichen Tumorzellen, die Einteilung
erfolgte in vier Gruppen mit unterschiedlicher Anzahl sich teilender Tumorzellen:
Gruppe I:
1-20% der Tumorzellen angefärbt
Gruppe II: 21-40% der Tumorzellen angefärbt
Gruppe III: 41-60% der Tumorzellen angefärbt
Gruppe IV:
>60% der Tumorzellen angefärbt
Die Auswertung erfolgte für die Mesotheliome mit Hilfe einer schachbrettartigen
Tabelle, die die Vergleichbarkeit der drei Proben eines Tumors erleichterte.
3 Materialien und Methoden
66
Tabelle 6: Auswertungstabelle der Mesotheliome für Calretinin am Beispiel der Blöcke 2a- 2c.
2a A
Ergebnis
B
Ergebnis C
Ergebnis D
Ergebnis
E
Ergebnis
1
M21a
+++
M25a
f
M29a
++
M33a
+++
M37a
+++
2
M22a
M26a
+
M30a
++
M34a
+++
M38a
+++
3
M23a
+++
M27a
+++
M31a
+++
M35a
++
M39a
+++
4
M24a
++
M28a
+++
M32a
+++
M36a
+++
M40a
+++
2b A
Ergebnis
B
Ergebnis C
Ergebnis D
Ergebnis
E
Ergebnis
1
M21b
+++
M25b
+++
M29b
++
M33b
+++
M37b
++
2
M22b
+++
M26b
+
M30b
++
M34b
M38b
++
3
M23b
+++
M27b
+++
M31b
+++
M35b
++
M39b f
4
M24b
+++
M28b
+++
M32b
+++
M36b
+++
M40b
+++
2c A
Ergebnis
B
Ergebnis C
Ergebnis D
Ergebnis
E
Ergebnis
1
M21c
+++
M25c
+++
M29c
++
M33c
M37c
+++
2
M22c
+++
M26c
+++
M30c
++
M34c
+++
M38c
+++
3
M23c
+++
M27c
M31c
+++
M35c
++
M39c
+++
4
M24c
+++
M28c
M32c
+++
M36c
+++
M40c
+++
f
+++
f
Legende:
+++:
stark positives Färbeergebnis
++ :
mäßig positives Färbeergebnis
+
:
schwach positives Färbeergebnis
-
:
negatives Färbeergebnis
leeres Ergebnisfeld : bei den jeweiligen Mesotheliomen war die Entnahme einer
dritten Tumorstanze aufgrund der limitierten Gewebegröße
nicht möglich, so dass diese Fälle nur in die Gesamtbewertung einflossen, sofern die verbliebenen zwei Teilergebnisse identisch waren.
f:
die entsprechende Tumorstanze ist während der immunhistochemischen Arbeitsschritte durch Abschwimmen oder
während des Schneidvorgangs verloren gegangen.
3 Materialien und Methoden
67
Die bei den Mesotheliomen entnommenen Tumorstanzen wurden jeweils als Einheit betrachtet, es wurden nur Tumore ausgewertet, von denen mindestens zwei
übereinstimmende Ergebnisse vorlagen.
Lag beispielsweise bei drei Proben eine Abweichung in nur einer Gewebeprobe
von nicht mehr als einem Punkt (+) gegenüber den beiden anderen vor, so wurde
jeweils zugunsten des übereinstimmenden Ergebnisses der beiden anderen entschieden (M 37 wurde beispielsweise stark positiv bewertet).
Bei Abweichungen in mehr als einem Punkt in einer oder bei unterschiedlichen
Ergebnissen in allen drei Proben wurde nach wiederholter Prüfung je nach Grund
der Abweichung entweder zugunsten der beiden übereinstimmenden Ergebnisse
entschieden, eventuell das Ergebnis korrigiert, oder der jeweilige Tumor aufgrund
der offensichtlich sehr großen Heterogenität nicht in die Untersuchung aufgenommen.
Alle hinsichtlich des Ergebnisses nicht eindeutigen Gewebestanzen sind von zwei
Personen unabhängig voneinander bewertet worden.
Ein Ziel dieser Untersuchungen ist die Errechnung des diagnostischen Wertes
jedes einzelnen der verwendeten Marker bezüglich der Differentialdiagnose zwischen epitheloidem Mesotheliom und kleinzelligem Lungenkarzinom, sowie der
Frage, ob sich durch verschiedene Markerkombinationen Sensitivität und Spezifität steigern lassen.
Dem jeweiligen Reaktionsergebnis entsprechend lassen sich richtig positive, richtig negative, falsch positive und falsch negative Resultate unterscheiden.
3 Materialien und Methoden
3.4.1
68
Sensitivität
Allgemeine Definition:
Sensitivität= richtig positive/(richtig positive + falsch negative)
Die Sensitivität der immunhistochemischen Marker CK 5/6, CK MNF 116 und Calretinin ist definiert als die Anzahl der richtig positiven Fälle in Bezug auf die Gesamtheit der Mesotheliome, bei den Markern für eine neuroendokrine Differenzierung (CD 56 und TTF1) ist sie entsprechend definiert als die Anzahl der richtig
positiven kleinzelligen Karzinome an der Gesamtheit der kleinzelligen Karzinome.
3.4.2
Spezifität
Allgemeine Definition:
Spezifität= richtig negative/(richtig negative + falsch positive)
In dieser Studie ist die Spezifität der Anteil der richtig negativen kleinzelligen Karziome an allen kleinzelligen Karzinomen bei den Reaktionen für CK 5/6, CK MNF
116 und Calretinin, sowie die Anzahl der richtig negativen Mesotheliome in Bezug
auf alle Mesotheliome bei den Immunreaktionen für CD 56 und TTF1.
Die Bezeichnungen „richtig“ und „falsch“ bezogen sich dabei auf die erwartete Reaktion mit den jeweiligen Markern in Abhängigkeit von der nach Auswertung des
verwendeten Markerpanels gestellten Diagnose.
3.4.3
positiver-/negativer prädiktiver Wert
Wie hoch die Wahrscheinlichkeit ist, dass bei einem positiven Reaktionsergebnis
ein epitheloides Mesotheliom (CK 5/6, CK MNF 116, Calretinin) bzw. ein kleinzelliges Karzinom (TTF1, CD 56) vorliegt, wird mit Hilfe des positiven prädiktiven Wertes (ppW) ausgedrückt.
ppW= richtig positive/(richtig positive + falsch positive)
Der negative prädiktive Wert (npW) hingegen gibt Aufschluss über die Höhe der
Wahrscheinlichkeit, dass bei einem negativen Testergebnis kein epitheloides Mesotheliom bzw. bei den Markern TTF1 und CD 56 kein kleinzelliges Karzinom vorliegt.
3 Materialien und Methoden
69
npW= richtig negative/(richtig negative + falsch negative)
3.4.4
Statistische Aussagen
Da in unserer Untersuchung zwei Karzinomtypen verglichen wurden, sind für alle
immunhistochemischen Markierungen Chi²-Tests mit dem Statistikprogramm SAS
gerechnet worden.
Der Chi²-Test geht der Fragestellung nach, ob die beobachteten Größen einer bestimmten Verteilung unterliegen, in unserer Untersuchung also, ob der jeweilige
immunhistochemische Marker Mesotheliome und kleinzellige Lungenkarzinome in
gleicher Weise identifiziert.
Die Nullhypothese des Chi²-Tests unterstellt also eine Gleichverteilung der Ausprägungen positives und negatives Färbeergebnis für Mesotheliome und kleinzellige Lungenkarzinome.
Der p-Wert gibt nun die Wahrscheinlichkeit an, mit der die Nullhypothese Gültigkeit behält.
Wünschenswert ist in unserer Untersuchung also ein möglichst niedriger p-Wert,
da Mesotheliome und kleinzellige Lungenkarzinome anhand einer möglichst unterschiedlichen Verteilung der positiven und negativen Markierungen der einzelnen immunhistochemischen Marker voneinander abgegrenzt werden sollen.
Somit gibt der p-Wert Aufschluss über die Validität der hier untersuchten Immunmarkierungen.
Die statistischen Untersuchungen sind im Institut für medizinische Informatik und
Biomathematik des Universitätsklinikums Münster von Frau Sauerland durchgeführt worden.
Die relevanten Faktoren wurden in Form von modifizierten Wertetabellen zusammengeführt und ausgewertet.
Solch eine Wertetabelle ist in Tabelle 7 beispielhaft abgebildet.
3 Materialien und Methoden
70
Tabelle 7 : Wertetabelle.
Färbeintensität
Mesotheliome
kleinzellige Karzinome
stark positiv
richtig positiv (A)
falsch positiv (E)
mäßig positiv
richtig positiv (B)
falsch positiv (F)
schwach positiv
richtig positiv (C)
falsch positiv (G)
negativ
falsch negativ (D)
richtig negativ (H)
gesamt
Sensitivität:
Spezifität:
(A+B+C)/(A+B+C+D)
H/(E+F+G+H)
Chi²-Test:
4 Ergebnisse
71
4
Ergebnisse
4.1
Alters- und Geschlechtsverteilung
4.1.1
Gesamtkollektiv
Das Maximum der Erkrankungshäufigkeit liegt bei den an einem Mesotheliom erkrankten Patienten mit 42,3% in der Altersgruppe zwischen 60 und 69 Jahren, das
mittlere Alter bei Diagnosestellung beträgt 65,2 Jahre.
Bei den an einem Mesotheliom erkrankten Patienten variiert das Alter bei Diagnosestellung zwischen 41 und 83 Jahren.
Bei den an einem kleinzelligen Karzinom leidenden Patienten beträgt das Durchschnittsalter 68 Jahre. Das Maximum der Erkrankungshäufigkeit liegt zehn Jahre
später, also in der Altersklasse zwischen 70 und 79 Jahren.
Der jüngste Patient in diesem Kollektiv ist 34, der älteste 86 Jahre alt. Bei letzterem handelt es sich um einen der zwei Patienten mit einer Pleurakarzinose.
Gesamtkollektiv m und w
48
50
45
40
37 36
33
35
Anzahl der Fälle
30
kleinzellige Karzinome
25
Mesotheliome
20
20
15
15
10
7
6
4
5
4
2
0 0
0 0
0 0
0 bis 9
10 bis 19
20 bis 29
0
0
30 bis 39
40 bis 49
50 bis 59
60 bis 69
70 bis 79
80 bis 89
Altersgruppen
Abbildung 10: Altersverteilung der untersuchten kleinzelligen Lungenkarzinome und Mesotheliome im
Gesamtkollektiv.
4 Ergebnisse
4.1.2
72
Teilkollektiv der männlichen Patienten
Das Kollektiv der männlichen Patienten beider Gruppen setzt sich aus n= 177
(82,6%) Personen zusammen, und liegt somit weit über dem Anteil der weiblichen
Patienten beider Kollektive.
Das Kollektiv der männlichen, an einem Mesotheliom erkrankten Patienten umfasst dabei n=99, dies entspricht einem prozentualen Anteil von 88,3% am Gesamtkollektiv dieser Gruppe. Zum Zeitpunkt der Diagnose ist der jüngste Patient
41, der älteste 83 Jahre alt.
Die mit Abstand höchste Erkrankungsrate liegt mit 36 % (n= 40) in der Altersgruppe der zwischen 60- und 69-Jährigen. Das mittlere Alter bei Diagnosestellung beträgt in diesem Kollektiv 65,4 Jahre. Die an einem kleinzelligen Karzinom erkrankten männlichen Patienten nehmen mit n= 78 einen prozentualen Anteil von 76,5%
ein. Das Maximum in den unterschiedenen Altersklassen liegt hier mit 39,7% am
Gesamtkollektiv der männlichen Patienten zwischen dem 70. und 79. Lebensjahr.
Das durchschnittliche Alter zum Zeitpunkt der Diagnose liegt bei 66,8 Jahren und
unterscheidet sich nur geringfügig von dem der Mesotheliompatienten.
Teilkollektiv m
45
41
40
35
33
31
Anzahl der Fälle
30
25
25
20
Kleinzellige Karzinome
Mesotheliome
18
15
11
10
5
5
0
0
0
0
0
0
4
3
2
4
0
0
0 bis 9
10 bis 19
20 bis 29
30 bis 39
40 bis 49
50 bis 59
60 bis 69
70 bis 79
80 bis 89
Altersgruppen
Abbildung 11: Altersverteilung der untersuchten kleinzelligen Lungenkarzinome und Pleuramesotheliome im Teilkollektiv der männlichen Patienten.
4 Ergebnisse
4.1.3
73
Teilkollektiv der weiblichen Patienten
Das Kollektiv umfasst, beide Gruppen betreffend, nur n= 35 Patientinnen (17,4%).
Der prozentuale Anteil der weiblichen, an einem kleinzelligen Karzinom erkrankten
Patienten liegt mit 22% (n= 22) deutlich über dem der Mesotheliompatientinnen
mit 11,7% (n= 13) am Gesamtkollektiv ihrer Gruppe. Das Alter der weiblichen Patientinnen bewegt sich in der Gruppe der kleinzelligen Karzinome zwischen dem
46 und dem 82. Lebensjahr. Allerdings liegt der größte Anteil in der Altersgruppe
der zwischen 60 und 69 Jährigen, und somit zehn Jahre früher als im Kollektiv der
männlichen Patienten und im GesamtkolIektiv. Das mittlere Alter bei Diagnosestellung weicht mit 63,7 Jahren nur geringfügig von dem der Mesotheliompatientinnen
ab. Die weiblichen Patienten erkranken im Durchschnitt drei Jahre früher an einem
kleinzelligen Karzinom als die männlichen Patienten. Im Kollektiv der weiblichen
Mesotheliompatienten ist die jüngste Patientin 47, die älteste 75 Jahre alt, der Altersmittelwert liegt bei 63,3 Jahren. Die Erkrankungshäufigkeit liegt hier in Übereinstimmung mit dem Gesamtkollektiv und dem der männlichen Patienten in der
Altersgruppe der 60- bis 69-Jährigen. Vergleicht man die Altersverteilung bei Diagnosestellung, so fällt das etwas breitere Spektrum bei den an einem kleinzelligen Karzinom leidenden Patientinnen auf.
Teilkollektiv w
40
35
Anzahl der Fälle
30
25
Kleinzellige Karzinome
20
Mesotheliome
15
10
8
7
4
5
0
0
0
0
0
0
0
0
1
3
2
1
6
3
0
0
0 bis 9
10 bis 19
20 bis 29
30 bis 39
40 bis 49
50 bis 59
60 bis 69
70 bis 79
80 bis 89
Altersgruppen
Abbildung 12: Altersverteilung der untersuchten kleinzelligen Lungenkarzinome und Mesotheliome im
Teilkollektiv der weiblichen Patienten.
4 Ergebnisse
4.2
74
Ergebnisse hinsichtlich der Vergleichbarkeit von TMASchnitten versus Originalschnitten
Da die für die Mesotheliome angewandte TMA-Technik im Hinblick auf die bekannte Heterogenität dieser Tumorentität problematisch sein kann, wurde vor dem
Einsatz dieser Methode geprüft, in wieweit die Ergebnisse der Stanzen, die aus
jeweils drei unterschiedlichen Bereichen des Tumors entnommen wurden, repräsentativ für das gesamte in Form von Originalschnitten zur Verfügung stehende
Gewebe waren.
Um diese Frage zu klären, wurden 33 Mesotheliome, also annähernd ein Drittel
des Untersuchungsgutes, nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und die Ergebnisse
der immunhistochemischen Färbungen mit den zur Verfügung stehenden Immunfärbungen der Originalschnitte verglichen.
Pro Tumorgewebe wurden, je nach Vorhandensein von korrespondierenden Originalschnitten, ein bis fünf Immunfärbungen (Calretinin, CK MNF 116, CK 5/6, TTF
1, Mib1) der TMA-Schnitte mit den entsprechenden Originalschnitten verglichen.
Bei der Bewertung wurde unterschieden zwischen völliger und teilweiser Übereinstimmung sowie keiner Übereinstimmung.
Eine völlige Übereinstimmung ist bei einem gleichen Ergebnis des Originalschnitts
und des TMA-Schnitts gegeben, unabhängig davon, ob das jeweilige Ergebnis
innerhalb des Variationsspektrums der definierten Ergebnisbereiche in einem
Punkt die Intensität oder den Prozentsatz der angefärbten Zellen betreffend, variierte.
Somit lag eine völlige Übereinstimmung auch dann vor, wenn das Ergebnis für
eine Immunfärbung im Originalschnitt und TMA-Schnitt im Endergebnis jeweils
zwar stark positiv ausfiel, diesem Endergebnis aber jeweils ein anderer Score
zugrunde lag. ( Beispiel: War die Färbeintensität nur mäßig (2), die Anzahl der
angefärbten Tumorzellen lag aber über 80% (4) im Originalschnitt, so resultierte
ein Score von 8.
4 Ergebnisse
75
Im TMA-Schnitt resultierte das Endergebnis jedoch aus einer starken Färbeintensität (3) bei einem Anteil zwischen 51 und 80% der angefärbten Tumorzellen (3),
wobei hier ein Score von 9 erreicht wird.)
Ein nicht übereinstimmendes Ergebnis ist bei der Mib1 Färbung als eine Abweichung des Ergebnisses zwischen TMA-Schnitt und Originalschnitt von mindestens
5% definiert.
Eine völlige Übereinstimung lag in 99 der miteinander verglichenen Immunfärbungen aus insgesamt 33 Tumoren vor. Dies entspricht einer Übereinstimmung von
90 %.
Bei 24 der verglichenen Gewebe entstammten die Stanzen des Untersuchungsgutes demselben Block wie das Gewebe des Originalschnitts, bei vier Mesotheliomen lag dem Originalschnitt ein anderer Gewebeblock zugrunde.
Stimmte das Ergebnis des Originalschnitts zwar mit einer der untersuchten Tumorstanzen überein, nicht aber mit dem gewerteten Gesamtergebnis für diesen
Tumor, welches sich aus den drei Stanzen zusammensetzte, so war die Übereinstimmung lediglich teilweise und wurde als solche vermerkt. (Beispiel: Ergebnis
des Originalschnittes Ö stark positiv; Endergebnis der TMA-Schnitte: Ömäßig positiv bei zwei mäßig positiven Stanzen und einer stark positiven Stanze.)
Dies war bei vier der verglichenen Immunfärbungen (3,6%) aus vier unterschiedlichen Tumoren der Fall. In der Hälfte dieser Fälle lag derselbe Block den zu vergleichenden Schnitten zugrunde.
Bei sieben (6,4%) Markierungen lag keine Übereinstimmung zwischen Originalund TMA-Schnitt vor. Die Ergebnisse wichen bis zu zwei Punkte bei den Markierungen für Calretinin, CK 5/6, MNF 116 und TTF1 voneinander ab. Diese Immunreaktionen stammten aus sechs verschiedenen Tumorgeweben.
In drei Fällen handelte es sich um die CK MNF 116- Reaktion, in zwei Fällen um
die Immunreaktion mit dem Proliferationsmarker Mib1. Jeweils einmal waren die
Calretinin- und die CK 5/6- Reaktionen betroffen.
In vier Fällen stammte das untersuchte Gewebe aus demselben Paraffinblock.
4 Ergebnisse
4.3
76
Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen
Für die Beurteilung der Schnittpräparate wurden nur gut erhaltene Zellen berücksichtigt, extrazelluläre Anfärbungen und Anfärbungen nekrotischer Areale wurden
als unspezifisch betrachtet.
Da sowohl die Intensität als auch die Anzahl der angefärbten Zellen in der Gruppe
der Mesotheliome gelegentlich in den einzelnen Bereichen der Stanzen nicht einheitlich war, wurde bei der Bewertung dieser Fälle semiquantitativ ein repräsentativer Durchschnittswert gebildet.
Da bei der Bewertung der kleinzelligen Karzinome in einigen Fällen bei den Färbungen Calretinin, CK 5/6 und CK MNF 116 positiv reagierende Zellen nicht eindeutig als Tumorzellen identifiziert werden konnten und somit die Möglichkeit einer
Verwechselung mit in den Tumor eingedrückten originären Epithelzellen oder auch
tumorassoziierten Entzündungszellen gegeben war, wurden in allen nicht eindeutigen Fällen die CD 56-, die Mib1- oder auch die korrespondierenden HE-Schnitte
vergleichsweise zur Begutachtung herangezogen und auf diese Weise versucht,
den Ursprung der entsprechenden Zellen zu eruieren.
Gelang dies aufgrund sehr variierender Schnittebenen der zu vergleichenden
Schnitte nicht zweifelsfrei, so wurde die überprüfte Immunreaktion des entsprechenden kleinzelligen Tumors als negativ gewertet.
In der Auswertung der immunhistochemischen Färbungen wurden die Ergebnisse
der kleinzelligen Tumoren und der Mesotheliome in Form der bereits vorgestellten
Wertetabellen zusammengeführt, und die Validität der einzelnen Marker bzw. Markerkombinationen anhand von erreichter Sensitivität und Spezifität angegeben.
4 Ergebnisse
4.3.1
77
TTF1
Eine positive nukleäre Reaktion mit dem Antikörper gegen TTF1 zeigen in originärem Lungengewebe die nicht kinozilientragenden Bronchialepithelien sowie die
Typ II-Pneumozyten.
Es kamen insgesamt 98 Mesotheliome in Form von Gewebestanzen zur Auswertung, in keinem Fall konnte eine Positivität nach den Wertungskriterien nach
Remmele und Stegner nachgewiesen werden.
In zwei Fällen fiel die Auswertung zunächst schwer, da hier bei bestehender Infiltration in benachbartes Lungengewebe die Unterscheidung zwischen Tumorzellen, originären Zellen und tumorassoziierten Alveolarmakrophagen nicht eindeutig
gelang.
Nach kritischer Beurteilung durch einen zweiten Gutachter und zusätzlich angefertigter CD 68- Immunfärbung konnten die auf TTF1 stark positiv reagierenden Typ
II-Pneumozyten als solche identifiziert, und das jeweilige Tumorgewebe als TTF1negativ gewertet werden (Abbildung 13, 14, 15).
Abbildung 13: Fallstrickpräparat: Mesotheliom mit TTF1 positiven Typ II-Pneumozyten (Fall 3D2).
4 Ergebnisse
78
Abbildung 14: Mesotheliom mit TTF1 positiven
Typ II-Pneumozyten (Fall 3D2).
Abbildung 15: TTF1 positive Typ II-Pneumozyten
(Fall 3C3).
In der Gruppe der kleinzelligen Karzinome war die immunhistochemische Reaktion
in nicht artifiziell gequetschten Bereichen des Tumors nukleär nachweisbar.
Demnach exprimierten 41% (n=41) der kleinzelligen Karzinome stark (Abbildung
16), 13% (n=13) mäßig (Abbildung 17) und 6% (n=6) schwach TTF1.
40% (n=40) der kleinzelligen Karzinome waren TTF1- negativ.
Abbildung 16: SCLC, TTF1 stark positiv (Fall 66).
Abbildung 17: SCLC, mäßig positiv für TTF1
(Fall 6).
Bei der Abgrenzung von kleinzelligen Lungenkarzinomen und epitheloiden Pleuramesotheliomen betrug die Sensitivität 60% (npW= 71%), die Spezifität 100%
(ppW= 100%) für die Erkennung eines kleinzelligen Karzinoms durch eine positive
TTF1- Immunreaktion (Tabelle 8).
4 Ergebnisse
79
Tabelle 8: Kleinzellige Karzinome und epitheloide Mesotheliome, Gegenüberstellung der Ergebnisse
der TTF1- Immunreaktion.
TTF 1
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
negativ
98
40
schwach positiv
0
6
mäßig positiv
0
13
stark positiv
0
41
gesamt
98
100
Sensitivität=(41+13+6)/100=0,6Ö60%
Spezifität=98/(98+0+0)=1Ö100%
ppW=(41+13+6)/(60+0)=1Ö100%
npW=98/(98+40)=0,71Ö71%
Chi²-Test: p< 0,0001
100%
80%
negativ
60%
schwach po sitiv
mäßig po sitiv
stark po sitiv
40%
20%
0%
M eso thelio me
Kleinzellige Karzino me
Abbildung 18: Kleinzellige Karzinome und epitheloide Mesotheliome, Gegenüberstellung der Ergebnisse der TTF1- Immunreaktion.
4 Ergebnisse
4.3.2
80
Zytokeratine (MNF 116 und CK 5/6)
Sowohl für die CK 5/6-, als auch für die CK MNF116- Immunreaktion war die Reaktion bei den Mesotheliomen stets fein-granulär (homogen), zytoplasmatisch lokalisiert.
Es wurden in der Auswertung der CK 5/6- Färbung 101 Mesotheliome berücksichtigt, 100 kamen in der CK MNF116- Immunreaktion zur Auswertung.
Bei den Mesotheliomen reagierten 9,9% (n= 10) negativ für CK 5/6, ebenfalls
9,9% wurden als schwach positiv eingestuft. 15,8% (n=16) exprimierten mäßig
und der überwiegende Teil von 64,4% (n=65) stark CK 5/6.
Demgegenüber wurde bei der CK MNF116- Immunreaktion keines der Mesotheliome negativ gewertet. Bei 3% (n=3) konnte eine schwach positive Immunreaktion,
bei 10% (n=10) eine mäßig starke (Abbildung 19), und bei 87% (n=87) eine stark
positive Immunreaktion dokumentiert werden (Abbildung 20).
Abbildung 19: Mesotheliom, mäßig positiv in der
CK MNF116- Reaktion (Fall 3B1).
Abbildung 20: Mesotheliom, stark positiv in der CK
MNF 116- Reaktion (Fall 3D1).
4 Ergebnisse
81
Abbildung 21: SCLC, CK 5/6 mäßig positiv (Fall 7).
Abbildung 22: Mesotheliom, CK 5/6 mäßig positiv
(Fall 2A1).
Abbildung 23: Mesotheliom, CK 5/6 mäßig positiv
(Fall 2E3).
Im Gegensatz dazu waren 80% (n=80) der kleinzelligen Karzinome CK 5/6 negativ, 53% (n=53) von insgesamt 100 der kleinzelligen Karzinome waren auch negativ auf die Gruppe der Zytokeratine des Markers CK MNF 116. CK MNF 116 dient
in dieser Untersuchung als Marker, welcher sicherstellt, dass es sich in der Gruppe der Mesotheliome auch mit 100 %iger Wahrscheinlichkeit um einen Tumor dieser Entität handelt. 100% aller epitheloiden Mesotheliome reagierten CK MNF
116- positiv.
Insgesamt reagierten 20% (n=20) aller untersuchten kleinzelligen Karzinome positiv für Zytokeratin 5/6, 18% (n=18) davon lediglich schwach positiv, 2% (n=2) mäßig positiv (Abbildung 21).
4 Ergebnisse
82
Um sicher zu gehen, dass es sich bei diesen positiv reagierenden Zellen um Tumorzellen handelte, wurden die korrespondierenden CD 56- und/oder TTF1- Immunreaktionen zur Überprüfung herangezogen.
In 80% der CK 5/6 positiven kleinzelligen Karzinome war das Ergebnis der CD 56Immunreaktion gleichzeitig stark positiv, lediglich einmal negativ, hier aber die
TTF1- Reaktion dafür mäßig positiv.
Die Immunreaktion der kleinzelligen Karzinome für CK 5/6 war stets homogen perinukleär zytoplasmatisch nachweisbar.
Für das Zytokeratinspektrum des Markers CK MNF 116 reagierten 16% (n=16) der
kleinzelligen Karzinome schwach, ebenfalls 16% mäßig und 15% (n=15) stark positiv. Bei 27,7% (n=13) der insgesamt 47 CK MNF 116 positiven kleinzelligen Karzinome war die Reaktion lediglich eine zytoplasmatische, fokal punktförmige. Die
übrigen Karzinome dieser Gruppe wiesen eine homogene zytoplasmatische Immunreaktion in den betreffenden Tumorzellen auf. Die Sensitivität und Spezifität
bei der Abgrenzung von epiteloiden Mesotheliomen und kleinzelligen Karzinomen
betrug 100% (Sensitivität) und 53% (Spezifität) für die Erkennung eines epitheloiden Mesothelioms durch eine positive CK MNF 116- Immunreaktion (Tabelle 9).
4 Ergebnisse
83
Tabelle 9: Epitheloide Mesotheliome und kleinzellige Karzinome, Gegenüberstellung der Ergebnisse
der CK MNF 116- Immunreaktion.
CK MNF 116
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
negativ
0
53
schwach positiv
3
16
mäßig positiv
10
16
stark positiv
87
15
gesamt
100
100
Sensitivität= (87+10+3)/100=1Ö100%
Spezifität= 53/(53+15+16+16)=0,53Ö53%
ppW=100/(100+15+16+16)=0,68Ö68%
npW=53/(53+0)=1Ö100%
Chi²-Test: p < 0,0001
100%
80%
negativ
60%
schwach positiv
mäßig positiv
stark positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 24: Epitheloide Mesotheliome und kleinzellige Karzinome, Gegenüberstellung der Ergebnisse der CK MNF 116- Immunreaktion.
4 Ergebnisse
84
Tabelle10: Epitheloide Mesotheliome und kleinzellige Karzinome, Gegenüberstellung der Ergebnisse
der CK 5/6- Immunreaktion.
CK 5/6
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
negativ
10
80
schwach positiv
10
18
mäßig positiv
16
2
stark positiv
65
0
gesamt
101
100
Sensitivität=(65+16+10)/101=0,9Ö90%
Spezifität= 80/(80+18+2+0)=0,8Ö80%
ppW=91/(91+0+2+18)=0,82Ö82%
npW=80/(80+10)=0,89%Ö89%
Chi²-Test: p < 0,0001
100%
80%
negativ
60%
schwach positiv
mäßig positiv
stark positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 25: Epitheloide Mesotheliome und kleinzellige Karzinome, Gegenüberstellung der Ergebnisse der CK 5/6- Immunreaktion.
Die Spezifität der CK 5/6- Immunreaktion bei der Abgrenzung von kleinzelligen
Lungenkarzinomen und epitheloiden Pleuramesotheliomen betrug 80%, die Sensitivität dagegen 90% (ppW= 82%, npW= 89%) für die Erkennung eines epitheloiden Mesothelioms durch eine positive CK 5/6- Immunreaktion (Tabelle 10).
4 Ergebnisse
4.3.3
85
CD 56
Ein überwiegender Anteil von 75% (n=75) aller kleinzelligen Karzinome dieser
Studie reagierte stark positiv mit dem Antikörper gegen CD 56 (Abbildung 27). Bei
13% (n=13) war die Reaktion mäßig stark (Abbildung 26), und in 8% (n=8) konnte
eine schwache CD 56 Positivität nachgewiesen werden. Lediglich 4% (n= 4) der
Fälle reagierten negativ, d.h. es konnte in drei Fällen keinerlei und in einem Fall in
weniger als 10% der Zellen nur eine schwache Immunreaktion festgestellt werden.
Die Fälle der kleinzelligen Karzinome mit negativem oder schwachem CD 56- Ausfall waren, genau wie die mit einer auffällig geringen Proliferationsfraktion von unter 20% sehr oft stark nekrotisch zerfallen oder wiesen starke Quetschartefakte
auf.
Abbildung 26: SCLC, CD 56 mäßig positiv (Fall 6).
Abbildung 27: SCLC, CD 56 stark positiv, zytoplasmatische Färbelokalisation (Fall 4).
4 Ergebnisse
86
Die Lokalisation der Färbereaktion war in fast allen Fällen fein-granulär, homogen
und intrazytoplasmatisch. In drei der als stark CD 56- positiv gewerteten kleinzelligen Karzinome wurde eine fokale punktförmige zytoplasmatische Positivität festgestellt.
In der Gruppe der Mesotheliome kamen insgesamt 103 Fälle zur Auswertung:
Mit 99% reagierten fast alle dieser Fälle (n=102) negativ für den Antikörper gegen
CD 56. Allerdings konnte in einem der Mesotheliomfälle (1%) eine positive Immunreaktion für den Antikörper gegen CD 56 festgestellt werden. Das Gesamtergebnis
der drei Stanzen war mäßig positiv.
Die Immunreaktion war innerhalb der Stanze sehr inhomogen, inselartig nachweisbar, dabei teils paranukleär zytoplasmatisch, teils homogen zytoplasmatisch
in bis zu 50% der Tumorzellen (Abbildung 28).
Abbildung 28: Mesotheliom, CD 56 mäßig positiv (Fall 3B3).
4 Ergebnisse
87
Es zeigte sich, dass Muskelzellen sowie Entzündungszellen, und hier vor allem
Plasmazellen und Alveolarmakrophagen stark positiv mit dem Antikörper gegen
CD 56 reagieren (Abbildung 29, 30, 31).
Fallstrickpräparate:
Abbildung 29: Mesotheliom, CD 56 positive Alveo-
Abbildung 30: Mesotheliom, CD 56 positive Alveo-
larmakrophagen (Fall 6D4).
larmakrophagen (Fall 6E3).
Abbildung 31: Mesotheliom, CD 56 positive Plasmazellen (Fall 6E4).
Bei der Abgrenzung von kleinzelligen Lungenkarzinomen und epitheloiden Mesotheliomen betrug die Spezifität 99%, die Sensitivität 96% für die Erkennung eines kleinzelligen Karzinoms durch eine positive CD 56- Immunreaktion (Tabelle
11).
4 Ergebnisse
88
Tabelle 11: Kleinzellige Karzinome und epitheloide Mesotheliome, Gegenüberstellung der Ergebnisse
der CD 56- Immunreaktion.
CD 56
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
negativ
102
4
schwach positiv
0
8
mäßig positiv
1
13
stark positiv
0
75
gesamt
103
100
Sensitivität= (75+13+8)/100=0,96Ö96%
Spezifität= 102/(0+1+102)=0,99Ö99%
ppW=96/(96+0+1+0)=0,99Ö99%
npW=102/(102+4)=0,96Ö96%
Chi²-Test: p < 0,0001
100%
80%
negativ
60%
schwach po sitiv
mäßig po sitiv
stark po sitiv
40%
20%
0%
M eso thelio me
Kleinzellige Karzino me
Abbildung 32: Kleinzellige Karzinome und epitheloide Mesotheliome, Gegenüberstellung der Ergebnisse der CD 56- Immunreaktion.
4 Ergebnisse
4.3.4
89
Calretinin
Die positive Reaktion wurde bei den kleinzelligen Karzinomen sowie den Mesotheliomen zytoplasmatisch und oftmals zugleich nukleär nachgewiesen.
88% (n=88) der kleinzelligen Karzinome waren für Calretinin negativ, 4% (n=4)
reagierten schwach, 7% (n=7) mäßig und lediglich 1% (n=1) stark positiv mit dem
Antikörper gegen Calretinin (Abbildung 36).
Insgesamt liegen der Auswertung 95 Mesotheliome zu Grunde.
5,6% (n=5) der Mesotheliome zeigten eine negative Calretinin- Reaktion.
Es fiel auf, dass diese Calretinin- negativen Fälle gleichzeitig auch in der CK 5/6
Immunfärbung entweder negativ (n=3) oder allenfalls schwach positiv (n= 2) reagierten (Abbildung 33 und 34).
Abbildung 33: Mesotheliom, Calretinin negativ
Abbildung 34: Mesotheliom, CK 5/6 schwach
(Fall 5D3).
positiv (Fall 5D3).
90 der Mesotheliome (94,7%) wurden als positiv gewertet, die mit Abstand
größte Fraktion mit 73,7% (n=70) reagierte stark positiv mit dem Antikörper
gegen Calretinin, 17,9% (n=17) zeigten ein mäßig (Abbildung 35), und lediglich 3,2% (n=3) ein schwach positives Ergebnis.
4 Ergebnisse
90
Abbildung 35: Mesotheliom, Calretinin mäßig posi- Abbildung 36: SCLC, Calretinin stark positiv
tiv (Fall 2C2).
(Fall 39).
Für die Sensitivität und Spezifität von Calretinin für primäre pulmonale kleinzellige Karzinome versus epitheloide Mesotheliome ergab sich damit eine
95%ige Sensitivität und eine 88%ige Spezifität für die Erkennung eines epitheloiden Mesothelioms durch eine positive Calretinin- Immunreaktion (Tabelle 12).
4 Ergebnisse
91
Tabelle 12: Epitheloide Mesotheliome und kleinzellige Karzinome, Gegenüberstellung der Ergebnisse der Calretinin- Immunreaktion.
Calretinin
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
negativ
5
88
schwach positiv
3
4
mäßig positiv
17
7
stark positiv
70
1
gesamt
95
100
Sensitivität=(70+17+3)/95= 0,95Ö95%
Spezifität=88/(88+4+7+1)=0,88Ö88%
ppW=90/(90+1+7+4)=0,88Ö88%
npW=88/(88+5)=0,95Ö95%
Chi²-Test: p < 0,0001
100%
80%
negativ
60%
schwach positiv
mäßig positiv
stark positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 37: Epitheloide Mesotheliome und kleinzellige Karzinome, Gegenüberstellung der
Ergebnisse der Calretinin- Immunreaktion.
4 Ergebnisse
4.3.5
92
Ki-67
Der größte Teil der kleinzelligen Lungenkarzinome konnte mit 42% (n=42)
der Gruppe IV der am stärksten proliferationsaktiven Tumoren zugeordnet
werden (Abbildung 44). 26% fielen in die Gruppe III mit einem Anteil zwischen 41 und 60% proliferationsaktiven Tumorzellen.
Die Tumoren dieser beiden Gruppen wiesen, wenn überhaupt, lediglich leichtere Quetschartefakte auf.
19% (n=19) der kleinzelligen Karzinome wurden Gruppe II zugeordnet, 13%
(n=13) der Gruppe I mit einer vergleichsweise geringen Proliferationsfraktion
zwischen 1 und 20% der Tumorzellen.
Dabei wiesen 42,1% (n=8) der der Gruppe II zugeteilten Tumoren starke
Quetschartefakte auf, bei den der Gruppe I zugeordneten Tumoren waren es
sogar 46,2% (n=6) (Abbildung 38).
Abbildung 38: SCLC, Mib1: ca. 10%, starke Quetschartefakte
(Fall 56).
4 Ergebnisse
93
Die Lokalisation der Immunreaktion war stets nukleär.
Ausgewertet wurden 96 Mesotheliome, deren Gesamtergebnis sich in der Mehrzahl der Fälle als arithmetischer Mittelwert aus drei, mindestens aber aus zwei
repräsentativen Tumorstanzen errechnete.
Bei einem Vergleich der Einzelergebnisse der drei Stanzen untereinander, waren
diese nur in 55,2% (n=53) der Fällen übereinstimmend, bei 44,8% (n=43) der Mesotheliome wichen sie um mindestens 5% voneinander ab.
Auch bei der Mib1- Reaktion wird die besondere Heterogenität dieser Tumorentität
also deutlich repräsentiert (Beispiel: Fall 5B1, Abbildung 39-41).
Abbildung 39: Mesotheliom,1. Stanze mit Mib1:
< 40% (Fall 5B1).
Abbildung 40: Mesotheliom, 2. Stanze mit Mib1:
ca. 50%.
Abbildung 41: Mesotheliom, 3. Stanze mit Mib1: ca. 20%.
4 Ergebnisse
94
Bei allen weiblichen an einem Mesotheliom erkrankten Patienten lag die Fraktion
der sich in der Teilungsphase befindlichen Tumorzellen unter 25%.
Auch in der Gruppe der Peritonealmesotheliome betrug die Proliferationsfraktion
nicht mehr als 22% der Tumorzellen.
Der größte Anteil der Mesotheliome mit 68,8 % (n=66) war Gruppe I zuzuordnen.
Die Zahl der Mesotheliome, die den Gruppen II-IV zugehörig waren, waren mit
insgesamt 31,2% entsprechend geringer, dabei entfiel mit 27,1% (n=26) der ganz
überwiegende Teil mit einer Prozentzahl proliferationsaktiver Tumorzellen zwischen 21% und 40% auf Gruppe II.
Nur 3,1% (n=3) der Mesotheliome wiesen im Durchschnitt je 50% proliferationsaktive Tumorzellen auf, und lediglich ein Mesotheliom (1%) mehr als 60%.
Bei diesem waren in zwei der entnommenen Stanzen ca. 90% Mib1 positive Zellen (Abbildung 42) und in einer ca. 40% sich in der Teilungsphase befindliche Zellen nachzuweisen.
Abbildung 42: Mesotheliom, Mib1: ca. 90%
(Fall 5B3).
Abbildung 43: zum Vergleich: SCLC, Mib1: > 90%
(Fall 34).
4 Ergebnisse
95
Tabelle 13: Epitheloide Mesotheliome und kleinzellige Karzinome, Gegenüberstellung der Ergebnisse
der Immunreaktion mit dem Mib1- Antikörper.
Mib1
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
1-20%
66
13
21-40%
26
19
41-60%
3
26
> 60%
1
42
gesamt
96
100
100%
80%
1-20%
60%
21-40%
41-60%
>60%
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 44: Epitheloide Mesotheliome und kleinzellige Karzinome, Gegenüberstellung der Ergebnisse der Immunreaktion mit dem Mib1- Antikörper.
4 Ergebnisse
4.4
96
Einsatz von Markerkombinationen
In diesem Teil der Auswertung werden verschiedene Kombinationen von Markern
untersucht und die Frage erörtert, ob sich durch bestimmte Kombinationen von
Markern Sensitivität und Spezifität auf 100% steigern lassen. Die Markerkombinationen wurden nach folgenden Kriterien zusammengestellt:
•
Anwendbarkeit in der klinischen Routinesituation.
•
möglichst hohe Sensitivität und Spezifität die Fragestellung betreffend.
Folgende Kombinationen wurden untersucht:
•
TTF1 und CD 56, mit der Bedingung, dass beide Marker positiv sind.
•
CK MNF 116 und CK 5/6, mit der Bedingung, dass beide Immunreaktionen
positiv ausfallen.
•
Calretinin und CK MNF 116, mit der Bedingung, dass beide Marker positiv reagiert haben.
•
TTF1, CD 56 und Ki-67 (Mib1), mit der Bedingung, dass mindestens einer der
beiden Ersteren positiv ist, und der Prozentsatz der proliferationsaktiven Tumorzellen über 50% liegt.
•
TTF1 und CK MNF 116, mit der Bedingung, dass TTF1 negativ und CK MNF
116 positiv ist.
•
CD 56 positiv und/oder TTF1 positiv.
•
TTF1 negativ und Calretinin positiv.
•
Calretinin positiv und CD 56 negativ.
4 Ergebnisse
4.4.1
97
TTF1 und CD 56
56 von 100 kleinzelligen Karzinomen reagierten sowohl in der TTF1-, als auch in
der CD 56- Immunfärbung positiv.
Alle bewertbaren Mesotheliome (n=103) reagierten für beide Antikörper negativ.
Daraus ergibt sich eine Sensitivität von 56% sowie eine Spezifität von 100%
(ppW=100%, npW=70%) für die Erkennung eines kleinzelligen Karzinoms durch
eine positive Immunreaktion für TTF1 und CD 56.
Tabelle 14: Gegenüberstellung der Ergebnissse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker TTF1 und CD 56.
TTF1 +/CD 56 +
Mesotheliome
kleinzellige Karzinome
negativ
103
44
positiv
0
56
gesamt
103
100
Spezifität:103/(0+103)=1Ö100%
Sensitivität:56/(56+44)=0,56Ö56%
npW=103/(103+44)=0,70Ö70%
ppW=56/(56+0)=1Ö100%
100%
80%
60%
negativ
positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 45: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker TTF1 und CD 56.
4 Ergebnisse
4.4.2
98
CK MNF 116 und CK 5/6
15 von 100 kleinzelligen Karzinomen waren gleichzeitig positiv für beide Marker.
88 von 98 (89,8%) für diese Kombination bewertbare Mesotheliome waren gleichzeitig positiv für beide Antikörper. Daraus ergibt sich eine Sensitivität von 90% und
eine Spezifität von 85% (ppW= 85%, npW=89%) für die Erkennung eines epitheloiden Mesothelioms durch eine positive Reaktion für CK MNF 116 und CK 5/6.
Tabelle 15: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker CK MNF 116 und CK 5/6.
CKMNF116+/CK 5/6 +
Mesotheliome
kleinzellige Karzinome
negativ
10
85
positiv
88
15
gesamt
98
100
Sensitivität:88/(88+10)=0,898Ö90%
Spezifität:85/(15+85)=0,85Ö85%
ppW=88/(88+15)=0,85Ö85%
npW=85/(85+10)=0,89Ö89%
100%
80%
60%
negativ
positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 46: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker CK MNF 116 und
CK 5/6.
4 Ergebnisse
4.4.3
99
Calretinin und CK MNF 116
Nur 5 von 100 kleinzelligen Karzinomen waren gleichzeitig positiv für Calretinin
und CK MNF 116. Die Spezifität dieser Kombination für die Erkennung eines epitheloiden Mesothelioms ist dementsprechend hoch, sie beträgt 95% (npW=97%).
Bei den Mesotheliomen waren 94 von 97 für beide Marker positiv, daraus ergibt
sich eine Sensitivität von 97% (ppW=95%) für die Erkennung eines epitheloiden
Mesothelioms durch eine positive Reaktion für Calretinin und CK MNF 116.
Tabelle 16: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker Calretinin und CK MNF 116.
Calretinin +/
CK MNF116 +
Mesotheliome
kleinzellige Karzinome
negativ
3
95
positiv
94
5
gesamt
97
100
Sensitivität:94/(94+3)=0,97Ö97%
Spezifität:95/(5+95)=0,95Ö95%
ppW=94/(94+5)=0,95Ö95%
npW=95/(95+3)=0,97Ö97%
100%
80%
60%
negativ
positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 47: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der Marker Calretinin und CK MNF 116.
4 Ergebnisse
4.4.4
100
TTF1, CD 56 und Ki-67
56 von 100 kleinzelligen Karzinomen waren für TTF1 und/oder für CD 56 positiv
und zeigten zusätzlich einen Prozentsatz der proliferationsaktiven Tumorzellen
von über 50%.
Daraus ergibt sich eine Sensitivität für die Erkennung eines kleinzelligen Karzinoms durch die Kombination von TTF1, CD 56 und Ki-67 (Mib1) von 56%
(ppW=100%). Keines der 90 in dieser Markerzusammenstellung auswertbaren
Mesotheliome war dagegen positiv. Dies entspricht einer 100%igen Spezifität für
die Kombination dieser drei immunhistochemischen Marker (npW=67%).
4 Ergebnisse
101
Tabelle 17: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker TTF1, CD 56 und Mib1.
TTF1+ und/oder
CD56+;Mib1>50%
Mesotheliome
kleinzellige Karzinome
negativ
90
44
positiv
0
56
gesamt
90
100
Spezifität:90/(0+90)=1Ö100%
Sensitivität:56/(56+44)=0,56Ö56%
npW=90/(90+44)=0,67Ö67%
ppW=56/(56+0)=1Ö100%
100%
80%
60%
negativ
positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 48: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker TTF1, CD 56 und
Mib1.
4 Ergebnisse
4.4.5
102
TTF1 und CK MNF 116
18 von 100 kleinzelligen Karzinomen waren negativ für TTF1, gleichzeitig aber CK
MNF 116 positiv. Bei den Mesotheliomen traf dies in 100% der Fälle zu (n=100).
Für die Erkennung eines epitheloiden Mesothelioms durch diese Markerkombination resultierte eine 82%ige Spezifität (npW=100%), die Sensitivität betrug entsprechend 100% (ppW=85%).
Tabelle 18: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker TTF1 und CK MNF 116.
TTF1 -/CK MNF116 +
Mesotheliome
kleinzellige Karzinome
negativ
0
82
positiv
100
18
gesamt
100
100
Sensitivität:100/(100+0)=1Ö100%
Spezifität:82/(18+82)=0,82Ö82%
ppW=100/(100+18)=0,85Ö85%
npW=82/(82+0)=1Ö100%
100%
80%
60%
negativ
positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 49: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker TTF1 und CK MNF
116.
4 Ergebnisse
4.4.6
103
CD 56 + und/oder TTF1 +
Alle kleinzelligen Karzinome reagierten für beide, zumindest aber für einen dieser
Marker positiv. Dagegen reagierten 102 von 103 Mesotheliomen negativ für diese
Antikörperkombination. Daraus ergibt sich für die Erkennung eines kleinzelligen
Karzinoms durch diese Kombination eine Sensitivität von 100% (ppW=99%) sowie
eine Spezifität von 99% (npW=100%).
Tabelle 19: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Kazinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker CD 56 und TTF1.
CD56 + und/ oder TTF1 +
Mesotheliome
kleinzellige Karzinome
negativ
102
0
positiv
1
100
gesamt
103
100
Spezifität:102/(1+102)=0,99Ö99%
Sensitivität:100/(100+0)=1Ö100%
npW=102/(102+0)=1Ö100%
ppW=100/(100+1)=0,99Ö99%
100%
80%
60%
negativ
positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 50: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker CD 56 und TTF1.
4 Ergebnisse
4.4.7
104
TTF1 und Calretinin
95 von 100 für diese Antikörperkombination auswertbaren Mesotheliome, aber
lediglich zwei von 100 kleinzelligen Karzinomen reagierten positiv für Calretinin
und gleichzeitig negativ für TTF1. Daraus ergibt sich für die Erkennung eines epitheloiden Mesothelioms durch diese Kombination eine Sensitivität von 95%
(ppW=98%) und eine Spezifität von 98% (npW=95%).
Tabelle 20: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker TTF1 und Calretinin.
TTF1 -/Calretinin +
Mesotheliome
kleinzellige Karzinome
negativ
5
98
positiv
95
2
gesamt
100
100
Sensitivität:95/(95+5)=0,95Ö95%
Spezifität:98/(2+98)=0,98Ö98%
ppW=95/(95+2)=0,98Ö98%
npW=98/(98+5)=0,95Ö95%
100%
80%
60%
negativ
positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 51: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker TTF1 und Calretinin.
4 Ergebnisse
4.4.8
105
Calretinin und CD 56
Keines der kleinzelligen Karzinome, jedoch 94% der Mesotheliome reagierten für
Calretinin positiv und gleichzeitig negativ für CD 56.
Daraus ergibt sich für die Erkennung eines epitheloiden Mesothelioms durch diese
Kombination eine Sensitivität von 93% sowie eine Spezifität von 100%
(ppW=100%; npW=93%).
Tabelle 21: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker Calretinin und CD 56.
Calretinin+/CD 56-
Mesotheliome
kleinzellige Karzinome
negativ
7
100
positiv
94
0
gesamt
101
100
Sensitivität:94/(94+7)=0,93Ö93%
Spezifität:100/(100+0)=1Ö100%
ppW= 94/(94+0)=1Ö100%
npW=100/(100+7)=0,93Ö93%
100%
80%
60%
negativ
positiv
40%
20%
0%
Mesotheliome
Kleinzellige Karzinome
Abbildung 52: Gegenüberstellung der Ergebnisse von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen bei der Kombination der immunhistochemischen Marker Calretinin und CD
56.
4 Ergebnisse
106
Die Markerkombinationen mit den höchsten Werten für Sensitivität und Spezifität
sind in absteigender Reihenfolge:
•
CD 56 und TTF1, mit der Bedingung für die Diagnose eines kleinzelligen Karzinoms, dass CD 56 positiv ist, und/oder TTF1 positiv ist.
•
TTF1 und Calretinin, mit der Bedingung für die Diagnose eines Mesothelioms,
dass die immunhistochemische Reaktion für TTF1 negativ war, aber gleichzeitig positiv für den Antikörper gegen Calretinin ausfiel. Gleichwertig war die
Kombination von Calretinin und CD 56 mit der Bedingung für die Diagnose eines Mesothelioms, dass die Reaktion auf Calretinin positiv und gleichzeitig negativ für den Antikörper gegen CD 56 war.
•
Calretinin und CK MNF 116, mit der Bedingung für die Diagnose eines Mesothelioms, dass sowohl die Calretinin- Reaktion als auch die CK MNF 116Reaktion positiv ausgefallen war.
•
TTF1 und CK MNF 116, mit der Bedingung für die Diagnose eines Mesothelioms, dass TTF1 negativ, die Reaktion auf den Antikörper gegen CK MNF 116
aber gleichzeitig positiv ausgefallen war.
•
CK MNF 116 und CK 5/6, mit der Bedingung für die Diagnose eines Mesothelioms, dass sowohl die CK MNF 116- Reaktion als auch die CK 5/6- Reaktion
positiv war.
•
CD 56 und TTF1 für die Diagnose eines kleinzelligen Karzinoms, wenn beide
Reaktionen positiv waren.
•
CD 56, TTF1 und Mib1, wenn die immunhistochemische Reaktion gegen mindestens einen der beiden Ersteren positiv war und gleichzeitig der Prozentsatz
der proliferationsaktiven Tumorzellen über 50% lag.
4 Ergebnisse
107
Tabelle 22: Auflistung aller getesteten Markerkombinationen im Hinblick auf Sensitivität, ppW, Spezifität und npW.
Sensitivität ppW
CD 56+ und/oder TTF1+ (SCLC)
Spezifität
npW
100%
99%
99%
100%
TTF1- und Calretinin+ (Mesotheliom)
95%
98%
98%
95%
Calretinin+ und CD 56- (Mesotheliom)
93%
100%
100%
93%
Calretinin+ und CK MNF 116+ (Mesotheliom)
97%
95%
95%
97%
100%
85%
82%
100%
CK MNF 116+ und CK 5/6+ (Mesotheliom)
90%
85%
85%
89%
CD 56+ und TTF1+ (SCLC)
56%
100%
100%
70%
TTF1+ und/oder CD 56+; Mib1 >50% (SCLC)
56%
100%
100%
67%
TTF1- und CK MNF 116+ (Mesotheliom)
4 Ergebnisse
4.5
Kasuistische Beispiele:
4.5.1
Pseudomesotheliomatös wachsendes kleinzelliges Karzinom
108
(Fall 105):
Bei einem zum Diagnosezeitpunkt 68-jährigen männlichen Patienten wurde ein
kleinzelliges Tumorgewebe der Pleura parietalis nachgewiesen, wobei hier zunächst die differentialdiagnostische Einordnung bei einem basalzelligen Plattenepithelkarzinom, einem kleinzelligen Karzinom oder einem epitheloiden Pleuramesotheliom in Betracht gezogen worden war.
Letzteres war bei diesem Patienten anhand einer früheren Gewebeprobe der
Pleura parietalis unter Vorbehalt diagnostiziert worden. Gleichzeitig war die Verdachtsdiagnose eines kombinierten kleinzelligen Karzinoms angegeben worden.
Somit stellte sich die Frage, ob es sich um metastatische, pseudomesotheliomatös
wachsende Absiedelungen eines kleinzelligen Karzinoms handelte, oder ob doch
ein Mesotheliom vorlag.
Zur Klärung dieser Frage wurden im Rahmen eines fachpathologischen Zusatzgutachtens immunhistochemische Untersuchungen mit folgendem Ergebnis
durchgeführt:
Für CD 56 und TTF1 wurde jeweils eine kräftig positive Reaktion in den Tumorzellen nachgewiesen.
Der Reaktionsausfall der Zytokeratine MNF 116 zeigte eine punktförmige Anfärbung.
Die immunhistochemischen Untersuchungen für Zytokeratin 5/6 und Calretinin
zeigten ebenfalls eine fokal positive Reaktion.
In der Mib1- Reaktion konnte mit über 90% ein hoher Anteil proliferationsaktiver
Tumorzellen nachgewiesen werden (Abbildung 53-56).
4 Ergebnisse
109
Abbildung 53: mäßig positive CK MNF 116- Reakti- Abbildung 54: Proliferationsfraktion von über 90%
on (Fall 105).
Abbildung 55: mäßig positive Calretinin- Reaktion
(Fall 105).
(Fall 105).
Abbildung 56: stark positive CD 56- Reaktion
(Fall 105).
Aufgrund der vorliegenden Untersuchungsergebnisse erfolgte schließlich auch in
Anbetracht der sehr hohen Proliferationsfraktion in Verbindung mit der positiven
TTF1- und CD 56- Reaktion die Zuordnung zu einem kleinzelligen Karzinom im
Sinne eines pseudomesotheliomatös wachsenden primären Lungentumors.
Die Verdachtsdiagnose eines primären Pleuratumors konnte nicht verifiziert werden. Eine Asbestexposition konnte nicht gesichert werden. Der für die Anerkennung einer Berufskrankheit nach Ziffer 4104 der BKV notwendige Nachweis asbestassoziierter Brückenbefunde konnte nicht erbracht werden.
Eine Berufskrankheit nach der Ziffer 4104 bzw. 4105 der BerufskrankheitenVerordnung wurde bei diesem Patienten daher nicht anerkannt.
4 Ergebnisse
4.5.2
110
Fraglicher Fall eines Pleuramesothelioms (Fall 6F):
Bei diesem, zum Zeitpunkt der Diagnose 65-jährigen männlichen Patienten wurde
zur Klärung der Frage einer Berufskrankheit nach Ziffer 4105 der BKV ein wissenschaftlich begründetes fachpathologisches Zusatzgutachten von der zuständigen
Berufsgenossenschaft in Auftrag gegeben.
Den Untersuchungsergebnissen lagen mehrere paraffineingebettete Proben der
Pleura parietalis zugrunde.
Klinischerseits war die Diagnose eines Pleuramesothelioms bereits angegeben
worden.
Aufgrund des histomorphologisch kleinzelligen Erscheinungsbildes des Fremdgewebes mit hyperchromatischen Zellkernen stand jedoch ebenfalls die Einordnung
bei einem kleinzelligen neuroendokrinen Karzinom zur Diskussion.
Zur Klärung der histologischen Typisierung des Tumorgewebes wurden ergänzende immunhistochemische Zusatzuntersuchungen mit folgendem Ergebnis
durchgeführt:
Die Ergebnisse fielen im überwiegenden Anteil der Fremdgewebszellen für die Antikörper CK MNF 116 und CK 5/6 jeweils zytoplasmatisch deutlich positiv aus (Abbildung 57, 58, 59).
Abbildung 57: Positive CK MNF 116- Reaktion,
(Fall 6F).
Abbildung 58: Epitheloide Zellverbände positiv in
der CK MNF 116- Reaktion (Fall 6F).
4 Ergebnisse
111
Abbildung 59: Epitheloide Zellverbände positiv in
der CK 5/6- Reaktion (Fall 6F).
Abbildung 60: Epitheloide Zellverbände in der Calretinin- Reaktion positiv (Fall 6F).
Eine positive Reaktion konnte zwar auch in der Calretinin- Reaktion nachgewiesen
werden (Abbildung 60), allerdings fiel diese im Vergleich mit den beiden zuvor beschriebenen immunhistochemischen Reaktionen deutlich schwächer aus.
In der TTF1- Reaktion konnte keine positive Reaktion nachgewiesen werden. Für
den neuroendokrinen Marker CD 56 allerdings zeigte sich eine positive, zytoplasmatische Reaktion (Abbildung 61).
Abbildung 61: Positive CD 56- Reaktion (Fall 6F).
4 Ergebnisse
112
Die Reaktion auf den Proliferationsmarker Mib1 zeigte fokal eine erhöhte Proliferationsaktivität.
Obwohl die immunhistochemischen Färbeergebnisse nicht durchgehend die Diagnose eines malignen Pleuramesothelioms stützten, erfolgte die Zuordnung letztendlich auch aufgrund der passenden klinischen Befunde bei einem primären
Pleuratumor im Sinne eines malignen Mesothelioms mit fokaler neuroendokriner
Differenzierung.
Allerdings wurde dieser Tumor wegen des zum Teil ungewöhnlichen Reaktionsausfalls der immunhistochemischen Untersuchungen als Mesotheliom B nach der
Klassifikation des Europäischen Mesotheliom Panels eingestuft.
5 Diskussion
113
5
Diskussion
5.1
Allgemeine Betrachtungen zum methodischen Vorgehen
Immunhistochemische Zusatzuntersuchungen gelten seit Mitte der 1980er Jahre
als Routineverfahren bei differentialdiagnostischen Fragestellungen in der histopathologischen Diagnostik.
Sensitivität und Spezifität beschreiben hierbei die diagnostische Zuverlässigkeit
der immunhistochemischen Marker und hängen bei der Diagnostik an Paraffinmaterial vom Erhaltungszustand des Gewebes, der Vorbehandlung (u.a. der Fixierung), dem verwendeten Antikörper, dem Detektionssystem und den Auswertungskriterien ab.
Da diese Faktoren nicht standardisiert sind, kann es in unterschiedlichen Studien,
ein und denselben immunhistochemischen Marker für eine Tumorentität betreffend, zu differenten, nur eingeschränkt vergleichbaren Ergebnissen kommen.
Neben diesen methodischen Unterschieden können unterschiedliche Ergebnisse
in den einzelnen Studien auch in den früher üblicherweise verwendeten polyklonalen Antikörpern begründet sein, die oftmals falsch positive Ergebnisse aufgrund
von unerwünschten Kreuzreaktionen mit anderen, den gesuchten sehr ähnlichen
Antigenstrukturen hervorgerufen haben (King und Hasleton, 2001).
Generell gilt die Empfehlung für die Auswertung immunhistochemischer Färbungen, dass zum Erhalt einer hohen Spezifität ein Färbeergebnis erst dann als positiv gewertet werden sollte, wenn mindestens ein bestimmter Anteil der Tumorzellen (vorzugsweise 10%) ein mindestens mittelstarkes Färbesignal zeigt.
Zur Vermeidung eines falsch positiven Ergebnisses durch eingeschlossene und
dann oftmals schwierig zu identifizierende originäre Epithelien (z.B. aktivierte Alveolarepithelien), gilt dies in besonderem Maße für Zytokeratinmarkierungen
(Kaufmann, 2000).
Ein nicht unerhebliches Problem stellt die Überprüfung der Zuverlässigkeit immunhistochemischer Markierungen dar, besonders im Hinblick auf unerwartet negative Reaktionsausfälle.
5 Diskussion
114
In solchen Fällen muss entschieden werden, ob das entsprechende Antigen wirklich nicht in dem gefärbten Gewebe vorhanden ist oder ob andere Gründe für die
ausbleibende Reaktion verantwortlich sein können.
Beispielsweise beeinflusst die Zeit zwischen Gewebeentnahme und Fixierung das
morphologische Erscheinungsbild ebenso wie die Dauer der Fixierung. Eine sofortige Fixierung ist eine unabdingbare Voraussetzung für aussagekräftige immunhistochemische Färbungen.
Die Fixierungsdauer sollte 24 Stunden nicht überschreiten (Noll und SchaubKuhnen, 2000), denn eine zu starke und/oder zu lange Fixierung in Formaldehyd
bedingt überschüssige Aldehyd-Bindungen, die die Bindungsstellen für die Primärantikörper blockieren. Die Antigene können dann auch durch die angewendeten Demaskierungsverfahren nicht mehr freigelegt werden.
Darüber hinaus kann das Fixierungsmittel das Antigen denaturieren oder zerstören, so dass dessen Bindungsstellen für die spezifischen Antikörper nicht mehr
erkennbar bzw. vorhanden sind, und eine ursprünglich vorhandene Antigenität
folglich nicht mehr nachzuweisen ist.
Auch in dieser Untersuchung existieren in der Gruppe der Mesotheliome drei Fälle, bei denen das negative Ausfallen einiger immunhistochemisch typischerweise
stark positiv ausfallender Marker (Calretinin und CK 5/6) den Verdacht nahe legt,
dass hier die Dauer der Fixierung in kausalem Zusammenhang mit der fehlenden
immunhistochemischen Reaktion steht, vor allem, da es sich bei diesen Mesotheliomen um zwei Konsiliarfälle in Form von Feuchtmaterial, welches einer nicht genau zu eruierenden, mindestens aber einwöchigen Formalinfixierung unterzogen
worden war, handelt.
Natürlich kann retrospektiv nicht mit absoluter Sicherheit festgestellt werden, ob
das ungewöhnliche Färbeergebnis nicht doch ursächlich in anderen Faktoren begründet liegt oder tatsächlich bei den jeweiligen Präparaten keinerlei entsprechende Antigene vorgelegen haben. Gelingt es nicht, andere Faktoren, die für die fehlende Positivität ursächlich sind, zu eruieren, ist bis auf weiteres von einer fehlenden Antigenität auszugehen.
5 Diskussion
115
Auch Wu et al. (2003) berichten in ihrer Studie bezüglich der p53- und TTF1- Immunreaktivität in einem kleinzelligen Lungenkarzinom von einer fehlenden Antigenität des in Formalin fixierten Biopsiematerials bei gleichzeitig nachgewiesener
Positivität im Blockmaterial desselben Tumorgewebes (das Blockmaterial war in
Alkohol fixiert worden).
5.1.1
Qualitätskontrolle
Als ein wichtiger Faktor der Qualitätskontrolle haben sich Positivkontrollen bewährt, die zusammen mit den zu prüfenden Gewebeproben auf denselben Schnitten mitgeführt werden und dazu dienen, zu überprüfen, ob die immunhistochemischen Reaktionen regulär abgelaufen sind. Vor der Auswertung der immunhistochemischen Färbungen sind deshalb zunächst jeweils die obligat positiven Gewebeproben (Positivkontrollen) überprüft worden.
In der Gruppe der kleinzelligen Karzinome sind Fehler während der immunhistochemischen Arbeitsschritte, die negative Ergebnisse in den Färbungen CD 56 und
Mib1 bedingen können, anhand einer Wiederholung der entsprechenden immunhistochemischen Reaktion ausgeschlossen worden.
Es stellte sich außerdem heraus, dass die Gewebe mit ungewöhnlichen Reaktionsausfällen oftmals nekrotisch waren oder in sehr wenigen Fällen bereits in geringem Maße autolytisch verändert.
Diese Angaben konnten den jeweiligen Befundberichten entnommen werden.
Nekrotische und/oder autolytisch bereits veränderte Präparate sollten deshalb nur
immunhistochemisch untersucht werden, wenn dies aufgrund des Fehlens zusätzlicher Gewebeproben zwingend notwendig erscheint.
Als Ursache für falsch negative Reaktionen kommt theoretisch auch der sog. „Bigbee-Effekt“ bei zu wenig verdünnten Lösungen in Frage. Der Brückenantikörper
bindet dabei mit seinen Fab-Stücken an das Fc-Stück des Primärantikörpers und
hat deshalb keine Bindungsstellen mehr für andere Komplexe frei (Noll und
Schaub-Kuhnen, 2000).
Dies kann jedoch in dieser Untersuchungsreihe mit einiger Sicherheit ausgeschlossen werden. Bei der Verdünnung wurde jeweils nach Herstellerangaben
verfahren, die stets einen Kompromiss zwischen stark positiver Zellanfärbung und
dem Vermeiden unerwünschter Hintergrundfärbung darstellen.
5 Diskussion
5.1.2
116
TMA-Technik
Die relevante Frage, die TMA-Technik betreffend, ist sicherlich die, inwieweit die
sehr kleinen Ausschnitte der Tumoren repräsentativ für den gesamten Tumor sein
können, und ob die Wertigkeit der Ergebnisse dadurch beeinflusst wird.
Camp et al. (2000) konnten nachweisen, dass bereits zwei Gewebeproben ausreichend waren, um übereinstimmende Ergebnisse zwischen vollständigen Originalschnitten und den Stanzen in über 95% der Fälle zu erreichen. Allerdings lag dieser Studie eine andere Tumorentität zugrunde. Es handelte sich hier um Mammakarzinome, die eine geringere Tumorheterogenität als Mesotheliome aufweisen.
Aus diesem Grunde wurden für die Mesotheliome, in Übereinstimmung mit den
Angaben bei Bubendorf et al. (2001) drei Gewebeproben aus jeweils repräsentativen Bereichen entnommen.
Die Übereinstimmung zwischen Originalschnitt und TMA-Stanzen betrug in dieser
Untersuchung 90%, und stimmt mit anderen in der Literatur bekannten Zahlen
(Camp et al., 2000; Hoos et al., 2001) überein. Die TMA-Technik ist somit auch für
heterogen geltende Tumorentitäten wie Mesotheliome ein geeignetes Untersuchungsverfahren.
5 Diskussion
5.1.3
117
Heterogenität epitheloider Mesotheliome und kleinzelliger Karzinome
Sind die positiv reagierenden Tumorzellen in kleinen Biopsieproben sehr heterogen verteilt, kann es zu falsch negativen Ergebnissen kommen. Aus diesem Grunde sind in der vorliegenden Untersuchung, die Mesotheliome betreffend, zwecks
maximaler Erweiterung des Ausschnittsbereiches die Stanzzylinder mit dem größten Durchmesser (2mm) ausgewählt worden. Diese Entscheidung wurde auch von
der Überlegung einer einfacheren Handhabung der größeren Zylinder und der
Verringerung des Risikos, Nicht-Tumorareale zu treffen, beeinflusst.
Das Problem der Heterogenität bzw. der heterogenen Expressionsmuster wird
besonders deutlich im Falle des CD 56 positiven epitheloiden Mesothelioms. In
diesem Gewebe sind die positiven Tumorzellen sehr heterogen- inselartig zwischen nicht markiertenTumorzellen verteilt.
Ebenfalls bei der Mib1- Färbung sind unterschiedliche Expressionsmuster nicht
selten, besonders vor dem Hintergrund, dass einige Tumoren mehr als andere
dazu neigen, so genannte Proliferationsfronten mit einer erhöhten Zellteilungsaktivität zu bilden.
Unterschiedliche Expressionsmuster innerhalb eines Tumors sind bis dato nicht
ursächlich geklärt.
Sie können darin begründet sein, dass nicht alle Tumorzellen gleiche Mengen eines Antigens enthalten, oder aber durch unterschiedliche Differenzierungen innerhalb eines Tumorgewebes erklärt werden (Müller, 1986).
Müller und Menne (in Seeber, 1985) konnten feststellen, dass jeder zweite maligne Lungentumor eine heterogene Differenzierung aufweist.
Anhand dieser Tatsache ließe sich auch das heterogene Expressionsmuster einiger Mesotheliome (CD 56) und die punktförmige Expression der kleinzelligen Karzinome nur in einigen Teilbereichen der Biopsieprobe in der CK MNF 116- Immunreaktion erklären.
Auch in der Gruppe der kleinzelligen Karzinome sind differierende morphologische
Zusammensetzungen, wie etwa das Vorkommen adenoider und plattenepithelialer
Strukturen in einer Vielzahl von Studien beschrieben worden. Obwohl diese Tumorentität lichtmikroskopisch als relativ uniform eingestuft wird (Ehmke-Meißner,
5 Diskussion
118
1995), sollte ihre histomorphologische Homogenität in tumorbiologischer Hinsicht
(also immunhistologisch, ultrastrukturell) nicht überbewertet werden.
Brereton et al. (1978) fanden in 23,8% der Fälle neben dem kleinzelligen Tumoranteil auch plattenepitheliale Wachstumsmuster, die in immunhistochemischer
Hinsicht entsprechend divergent reagieren.
Auch Heymer (1989) konnte in 15% der von ihm untersuchten Fälle von kleinzelligen Karzinomen das Vorliegen eines Kombinationstumors im Sinne eines kombinierten kleinzelligen Karzinoms bestätigen.
Diese Angaben decken sich ebenfalls mit den Studienergebnissen von Abeloff et
al., die 1979 bei bioptisch gesicherten kleinzelligen Karzinomen bei anschließender Obduktion zeigen konnten, dass nicht selten Karzinome anderer Differenzierung und/oder unterschiedlich differenzierte Bereiche nebeneinander vorkommen.
Demnach ist eine Heterogenität der morphologischen Charakteristika innerhalb
eines Tumors möglich, wenn nicht gar wahrscheinlich, wenn das gesamte Gewebe der Untersuchung zugrunde liegt.
5 Diskussion
5.2
119
Immunhistochemische Untersuchungen
Dass in dieser Studie nahezu ausschließlich primäre kleinzellige Lungenkarzinome zur Auswertung kamen und nicht pseudomesotheliomatös wachsende, sich
entweder per continuitatem oder aber auch auf lymphogenem oder hämatogenem
Weg ausbreitende Metastasen von kleinzelligen Karzinomen, ist in der Tatsache
begründet, dass Metastasen und deren Ursprungstumoren sich immunhistochemisch nahezu identisch verhalten.
Diese zunächst nur nahe liegende Vermutung ist in verschiedenen Untersuchungen wissenschaftlich überprüft und übereinstimmend für zutreffend befunden worden, so dass Pleurametastasen mit den Primärtumoren gleichgesetzt werden können (Kaufmann, 2000, Osborn und Weber, 1983).
Ein weiterer Grund ist, dass in die Pleura verschleppte Tumorzellen und sich hier
extensiv im Sinne eines pseudomesotheliomatösen Wachstums ausbreitende Metastasen kleinzelliger primärer Lungenkarzinome relativ selten sind, so dass, um
repräsentative Kollektivzahlen zu erreichen, auf Gewebeproben kleinzelliger primärer Lungenkarzinome zurückgegriffen werden musste.
5 Diskussion
5.2.1
120
Thyreoidaler Transkriptionsfaktor (TTF1)
Lau et al., (2002) postulierten einen großen Nutzen von TTF1 zur Unterscheidung
einerseits von Mesotheliomen und pulmonalen Adenokarzinomen, andererseits
von kleinzelligen Lungenkarzinomen und Merkelzell-Karzinomen.
Antikörper gegen TTF1 schienen aufgrund dieser Grundannahmen ebenso hilfreich bei der Differentialdiagnose von kleinzelligen Lungenkarzinomen und Mesotheliomen zu sein.
Die vorliegenden Untersuchungsergebnisse bezüglich einer fehlenden Antigenität
epitheloider Mesotheliome für TTF1 decken sich mit nahezu allen in der Literatur
bekannten Daten, die übereinstimmend von einer fehlenden Antigenität von Mesotheliomen gegenüber diesem immunhistochemischen Marker berichten (Khoor
et al.,1999, Di Loreto et al., 1998, Ordonez, 2000, Ordonez, 2003, Abutaily et al.,
2002).
In Übereinstimmung mit diesen Untersuchungen kann aufgrund der hier vorliegenden Ergebnisse somit gesagt werden, dass TTF1 der immunhistochemische
Marker mit der höchsten Spezifität zum Ausschluss eines Mesothelioms ist, gleichzeitig aber auch als hilfreich bei der Diagnose von kleinzelligen Karzinomen eingestuft wird (Attanoos et al., 2003).
In dieser Studie untersuchten die Autoren den immunhistochemischen Reaktionsausfall ausgewählter Marker im Hinblick auf die Differentialdiagnose von Mesotheliomen, primären Lungenkarzinomen (hier zu 70% Adenokarzinome, lediglich zwei
kleinzellige Karzinome) und Metastasen anderer Organe. Auch hier sind Calretinin, CK 5/6, TTF1 u.a. als immunhistochemische Marker verwendet worden.
Die Mehrzahl der in der Literatur bekannten Studienergebnisse zeugen von einer
exzellenten Sensitivität von TTF1 für eine Vielzahl von pulmonalen Tumoren im
Allgemeinen, und kleinzellige Lungenkarzinome im Besonderen (Myong, 2003, Wu
et al., 2003, Johansson, 2004)
Die Zahlen bewegen sich in der überwiegenden Mehrzahl zwischen 80 und 100%
positiven Fällen bei den kleinzelligen Karzinomen/Lungenkarzinomen und decken
sich daher nicht mit den Ergebnissen in dieser Untersuchung.
5 Diskussion
121
Die Sensitivität lag in der vorliegenden Untersuchung nur bei 60%, die Spezifität
allerdings betrug 100% für primäre kleinzellige Lungenkarzinome versus epitheloide Mesotheliome.
Chhieng et al. (2001) gehen von einer TTF1- Expression in mehr als 90% der
kleinzelligen Lungenkarzinome aus. Nach Wu et al., (2003) reagierten 87% der 23
in dieser Studie untersuchten kleinzelligen Lungenkarzinome positiv mit Antikörpern gegen TTF1, Myong (2003) kam zu einem fast identischen Ergebnis, hier
exprimierten 88% der untersuchten kleinzelligen Lungenkarzinome TTF1.
Ähnlich sind auch die Ergebnisse von Kaufmann (2000), der denselben auch in
unserer Untersuchung verwendeten Klon 8G7G3/1 gegen TTF 1 einsetzte. In der
Arbeit von Kaufmann sind erstmals kleinzellige Karzinome extrapulmonalen Ursprungs und kleinzellige Karzinome pumonalen Ursprungs bezüglich ihrer TTF1Antigenität miteinander verglichen worden, in 81% der pulmonalen und in 80% der
extrapulmonalen kleinzelligen Karzinome konnte eine Positivität für TTF1 nachgewiesen werden.
Nach Kaufmann wird TTF1 in 80-100% der kleinzelligen Karzinome pulmonalen
und extrapulmonalen Ursprungs in nahezu gleichem Maße exprimiert, so dass
metastatische Infiltrate eines kleinzelligen Karzinoms mit dieser Untersuchung
nicht von einem Primärherd der Lunge unterschieden werden können.
TTF1 ist nicht in extrapulmonalen, nicht kleinzelligen Karzinomen (außer Schilddrüsenkarzinomen) und auch nicht in Plattenepithelkarzinomen der Lunge nachzuweisen.
Lau et al. (2002) bestätigen die Angaben von Kaufmann. Sie gehen von einer
TTF1- Positivität in mehr als 90% der Karzinome aus. Auch hier wird von einer
fehlenden Spezifität von TTF1 für kleinzellige Lungenkarzinome berichtet, da es in
der Untersuchung von Lau et al. auch in extrapulmonalen kleinzelligen Tumoren
anderer Primärlokalisationen wie Gastrointestinaltrakt, Prostata, weiblicher Genitaltrakt, Schilddrüse und Blase vielfach gefunden wurde.
Johansson konnte in einer Untersuchung, der ein kleineres Patientenkollektiv
zugrunde lag (n=13), eine Positivität in 100% der Fälle nachweisen (Johannsson,
2004).
5 Diskussion
122
Im Gegensatz zu diesen Angaben existieren auch einige Studien mit abweichenden Ergebnissen:
Chang et al. (2004) beispielsweise konnten nur in 53% der von ihnen untersuchten
kleinzelligen Lungenkarzinomen eine positive Immunreaktion für TTF1 nachweisen.
Auch Tamiolakis et al. (2002) kamen zu einem Ergebnis, wonach der Anteil TTF1positiver kleinzelliger Lungenkarzinome mit 66,66% deutlich unter dem Wert von
über 80% lag. Untersucht wurden Tumorzellen in der Pleuraflüssigkeit. Allerdings
liegen diesem Kollektiv nur neun Fälle kleinzelliger Lungenkarzinome zugrunde,
was die Wertigkeit dieses Ergebnisses mindert.
Dennoch entsprechen diese Untersuchungsergebnisse am ehesten den eigenen.
Auch hier reagierten nur 60% der kleinzelligen Karzinome positiv auf Antikörper
gegen TTF1.
Eine fehlende Antigenität der 40% negativen Fälle kann nicht in der Art und Dauer
der Fixierung begründet liegen, denn es handelt sich bis auf zwei Fälle, die aber
TTF1- positiv sind, ausschließlich um Fälle, bei denen von einem regelrechten
Ablauf der einzelnen vorbereitenden Arbeitsschritte zweifelsfrei auszugehen ist.
Die Sensitivität einer positiven TTF1- Reaktion von 60% für kleinzellige Karzinome
ist different von den in der Literatur angegebenen Durchschnittswerten von über
80%.
Die Spezifität der positiven TTF1- Reaktion allerdings deckt sich mit den übrigen
Literaturangaben. Neben der 100%igen Spezifität in unserer Untersuchung von
TTF1 für die Diagnose eines kleinzelligen Karzinoms ist außerdem das homogene
Expressionsmuster in allen Tumorzellen von Bedeutung, da somit die Gefahr
falsch negativer Ergebnisse auch bei kleinen Biopsieproben nahezu ausgeschlossen wird.
Da darüberhinaus nur ein nukleäres Färbesignal als positiv zu bewerten ist, kann
es nicht zum Vortäuschen falsch positiver Ergebnisse bei unspezifischen zytoplasmatischen Hintergrundfärbungen kommen, wie sie von Kaufmann häufiger
in Plattenepithelkarzinomen beobachtet worden sind (Kaufmann, 2000).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das mit dem Antikörper nachgewiesene Antigen TTF1 ein mäßig sensitiver, aber hochspezifischer immunhistochemischer Marker für kleinzellige Karzinome versus epitheloide Mesotheliome ist, der
5 Diskussion
123
in seiner Spezifität allen übrigen Markern und auch Markerkombinationen überlegen ist.
Die Wertigkeit von TTF1 als prognostischem Marker ist in dieser Studie nicht überprüft worden.
Myong konnte einen Unterschied bezüglich der TTF1- Positivität von kleinzelligen
Karzinomen im Stadium limited disease (100% der kleinzelligen Karzinome reagierten TTF1- positiv) und extensive disease (75% der kleinzelligen Karzinome
reagierten TTF1- positiv) feststellen. Die TTF1- positiven Fälle wiesen tendentiell
längere Überlebenszeiten auf (Myong, 2003).
Allerdings sind auch gegenteilige Ergebnisse in der Literatur bekannt.
Puglisi et al., (1999) stellten eine positive Korrelation zwischen starker TTF1- Positivität (< 50%) bei NSCLC und einer ungünstigeren Prognose, unabhängig vom
Tumorstadium fest. Die prognostische Bedeutung einer TTF1- Expression in kleinzelligen Karzinomen kann bis dato nicht abschließend geklärt werden und bleibt
weiterhin Gegenstand wissenschaftlicher Studien.
5 Diskussion
5.2.2
124
Zytokeratine
Die Zytokeratine (CK) lassen sich in zwei Gruppen einteilen:
die plattenepitheltypischen, höhermolekularen Zytokeratine (CK 1-6 und 9-17) sowie die zylinderepitheltypischen, niedermolekularen Zytokeratine (CK 7+8 und 1820).
Bei dem von uns eingesetzten Zytokeratinmarker MNF 116 handelt es sich um
einen immunhistochemischen Marker, der ein breites Zytokeratin-Spektrum erfasst. Er reagiert mit den hochmolekularen Zytokeratinen 5, 6 und 17 sowie den
niedermolekularen Zytokeratinen 8 und 19.
Breitspektrum-Zytokeratinantikörper sind sinnvoll in der Diagnose vergleichsweise
schlecht bis undifferenzierter Karzinome, zu denen auch die kleinzelligen Lungenkarzinome gezählt werden müssen, oder wenn nur kleinere Proben eines neoplastischen Gewebes zur Verfügung stehen (Moll, 1993).
Das CK 8 gehört, zusammen mit CK 18 zum Basispaar der zylinderepitheltypischen Zytokeratine, und wird in allen Zylinderepithelien exprimiert. CK 19 als
kleinstes Zytokeratin ist weit verbreitet, es wird in duktalen, gastrointestinalen,
mehrreihigen und in Basalzellen unverhornter Plattenepithelien u.a. exprimiert. CK
17 kommt als Basiszytokeratin der plattenepitheltypischen Zytokeratine in den Basalzellen mehrreihiger Epithelien vor.
Der immunhistochemische Marker CK 5/6 besitzt ausschließlich Determinanten
gegen hochmolekulare Zytokeratine.
Das CK 5 gehört zur Gruppe der Basiszytokeratine und wird in der undifferenzierten Basalzellschicht der mehrschichtigen Plattenepithelien exprimiert.
CK 6 gehört zu den sog. Reifungszytokeratinen und steht mit einem höheren Proliferationsgrad des Plattenepithels in Zusammenhang (Moll, 1993).
Der Fragestellung entsprechend sollten kleinzellige Karzinome und epitheloide
Mesotheliome primär anhand der Qualität und Quantität der positiven Reaktionsausfälle in den Zytokeratinfärbungen 5/6 und MNF 116 und dem Vergleich ihrer
Überschneidungen voneinander abgegrenzt werden.
5 Diskussion
125
Darüber hinaus wurden in unserer Untersuchung Zytokeratine von hohem, sowie
ein Zytokeratinmarker, der gleichzeitig Zytokeratine von niedrigem und hohem Molekulargewicht markiert, eingesetzt, um möglicherweise aufgrund der unterschiedlichen Zytokeratinprofile der Tumorzellen von epitheloiden Mesotheliomen und
kleinzelligen Karzinomen diese voneinander abzugrenzen.
Dass maligne Mesotheliome sowohl nieder- als auch hochmolekulare Zytokeratine
exprimieren, ist bekannt. Nun stellte sich die Frage, ob eine zuverlässige Diagnose in unklaren Fällen eventuell anhand des spezifischen Expressionsmusters für
Zytokeratine unterschiedlichen molekularen Gewichts bei den kleinzelligen Karzinomen möglich ist.
Leider hat sich dies nicht bestätigt. An den Untersuchungsergebnissen für diese
beiden immunhistochemischen Marker lässt sich ablesen, dass kleinzellige Karzinome offenbar sowohl niedermolekulare Zytokeratine als auch die hochmolekularen Zytokeratine 5/6 in ihrem Zytoplasma besitzen.
Moll konnte in seiner Studie feststellen, dass kleinzellige Karzinome der Lunge
vorwiegend CK 8, 18 und zum Teil CK 19 exprimieren, letzteres war durchgehend
in den kleinzelligen Karzinomen vom sog. Intermediärzelltyp feststellbar.
Die Untergruppe der oat-cell Karzinome zeigte weit weniger Filamentstrukturen
und demnach weniger Zytokeratin- Polypeptide.
Bei einigen Fällen war die Mehrzahl der Tumorzellen völlig frei von Zytokeratinen.
Diese Einteilung der kleinzelligen Karzinome in oat-cell- und Intermediärzelltyp ist
heute wegen fehlender klinischer Bedeutung weitgehend verlassen worden, sodass nicht gesagt werden kann, ob die in unserer Untersuchung positiv auf CK
MNF 116 reagierenden kleinzelligen Karzinome vorwiegend diesem Typ angehören.
In jedem Falle werden Zytokeratine niedrigeren Molekulargewichtes unseren Untersuchungsergebnissen zufolge lediglich in 47% der kleinzelligen Karzinome
nachgewiesen.
Auch andere Autoren konnten feststellen, dass kleinzellige Lungenkarzinome die
zylinderepitheltypischen Zytokeratine (in unserer Untersuchung durch CK MNF
116 repräsentiert) als Nachweis der Intermediärfilamentproteine im Zytoplasma
exprimieren (Broers et al., 1985, Moss et al., 1986).
5 Diskussion
126
Bemerkenswerterweise exprimiert aber ein nicht unerheblicher Teil von 20% der
kleinzelligen Karzinome unserer Studie auch CK 5/6, wenngleich in 18 von 20 positiven Fällen, lediglich schwach.
Es könnte sich hier um basaloide plattenepitheliale Tumoranteile handeln.
4 von diesen kleinzelligen Karzinomfällen waren ausschließlich positiv für CK 5/6.
16 dieser Fälle waren gleichzeitig auch positiv für CK MNF 116. Die Positivität war
dann oftmals für letztere Gruppe der Zytokeratine stark und für CK 5/6 schwach.
Bei einem Vergleich der Ergebnisse der CK MNF 116- und der CK 5/6 Reaktion
lassen sich folgende Überlegungen ableiten:
Bei den oben genannten Fällen scheinen die niedermolekularen Zytokeratine zu
überwiegen.
Es kann davon ausgegangen werden, dass nur ein geringer Teil aller auswertbaren kleinzelligen Lungenkarzinome unserer Untersuchung eine alleinige Positivität
für die Zytokeratine 5 und 6 besitzt.
Der überwiegende Teil von 61,5% (n=32) an allen Zytokeratin- positiven kleinzelligen Karzinomen (52%) exprimiert die Zytokeratine 8, 17 und 19 (Zytokeratine
niedrigeren Molekulargewichtes) schwach bis stark, denn CK 5/6 ist in diesen Fällen negativ.
12 Fälle exprimieren sowohl Zytokeratine niedrigeren (Zytokeratin 8 und 19) als
auch Zytokeratine höheren Molekulargewichtes (Zytokeratin 5, 6 und 17), wenngleich die Expression der niedermolekularen Zytokeratine zu überwiegen scheint.
Ein vergleichsweise geringer Anteil der kleinzelligen Karzinome exprimiert ausschließlich Zytokeratine höheren Molekulargewichtes.
Es handelt sich hier sowohl um die 4 ausschließlich für CK 5/6 positiven kleinzelligen Karzinome als auch um diejenigen Fälle, die zwar für CK 5/6 und CK MNF
116 positiv sind, das Ergebnis der Stärke der Anfärbung in quantitativer Hinsicht
aber identisch ist.
Moll konnte im Gegensatz zu unseren Ergebnissen über keinerlei Positivität kleinzelliger Karzinome gegen diese höhermolekularen, plattenepitheltypischen Zytokeratine berichten. Das seiner Untersuchung zugrunde liegende Kollektiv umfasst
allerdings lediglich 13 Fälle kleinzelliger Karzinome.
Weitere vergleichbare Daten sind in der Literatur diesbezüglich nicht vorhanden.
5 Diskussion
127
Bei Betrachtung der Gruppe der Mesotheliome stufen einige Autoren Zytokeratine
als hilfreiche Marker bei den Mesotheliomen vom vorwiegend epitheloiden Subtyp
ein:
100% (n=60) der in einer Studie von Ordonez (2003) untersuchten epitheloiden
Mesotheliome waren positiv für CK 5/6.
In der Untersuchung von Abutaily et al. (2002) reagierten zwar nur 63% der Mesotheliome positiv, diese Gruppe setzte sich jedoch aus allen drei Subtypen zusammen. Bei ausschließlicher Betrachtung der epitheloiden Mesotheliome zeigten
92% eine positive Reaktion mit dem Antikörper gegen Zytokeratin 5/6 (Abutaily et
al., 2002).
Moll bestätigt eine ausgeprägte Positivität für CK 5 in den meisten Fällen, darüberhinaus eine stetige, starke, homogene Expression von CK 8, 18 und 19 für epitheloide Mesotheliome (Moll, 1993).
In unserer Untersuchung exprimierten 100% der Mesotheliome CK MNF 116, bei
90,1% war darüberhinaus auch eine Positivität für Zytokeratine höheren Molekulargewichtes vorhanden.
Die intensivsten und häufigsten positiven Reaktionen wurden aber gegen Zytokeratine eines Molekulargewichtes zwischen 40 und 58 kD mit dem entsprechenden
monoklonalen Antikörper MNF 116 erzielt, und zwar sowohl in der Gruppe der
Mesotheliome als auch in der der kleinzelligen Karzinome.
Aufgrund dieser Parallelität ist der diagnostische Nutzen der Zytokeratin MNF 116Immunfärbung dem der Zytokeratin 5/6- Markierung die Spezifität betreffend unterlegen.
Wenngleich in Übereinstimmung mit obigen Studien festgestellt werden muss,
dass zwar die meisten Mesotheliome eine Antigenität für Zytokeratine höheren
Molekulargewichtes (zwischen 52 und 58 kD) besitzen, sind diese hochmolekularen Zytokeratine nicht absolut spezifisch für Mesotheliome, da gleichzeitig auch
Fälle von Mesotheliomen existieren, die bei einer Positivität für Anti-Zytokeratin
MNF 116 gleichzeitig aber negativ für Anti-Zytokeratin 5/6 sind (es existieren 8
solche Fälle in unserer Untersuchung), woraus zu schließen ist, dass diese,
wenngleich seltenen Fälle, ausschließlich Zytokeratine niedrigeren Molekulargewichtes exprimieren.
5 Diskussion
128
Bezüglich der Antigenität konnte eine positive Korrelation zwischen Calretinin und
den Zytokeratinen 5/6 festgestellt werden. Demnach exprimieren epitheloide Mesotheliome bei fehlender Positivität für Anti-Calretinin gleichzeitig in allen Fällen
auch Zytokeratine des Spektrums 5/6 entweder nicht, oder wenn, dann nur
schwach.
Bei 60% dieser Fälle handelte es sich um Konsiliarfälle, deren Gewebe als in
Form schon länger fixierten Nassmaterials übersandt wurde. Die diesbezügliche
Problematik wurde bereits an anderer Stelle erörtert (vgl. S. 114).
Bezüglich dieser Beobachtung sind bisher keine vergleichenden Angaben in der
Literatur verfügbar.
Wenngleich CK 5/6 und CK MNF 116 von der Mehrzahl der Autoren als hilfreich
bei differentialdiagnostischen Fragestellungen, epitheloide Mesotheliome und metastatische Absiedelungen betreffend, eingestuft werden (Clover et al., 1997), wird
die Interpretation von Attanoos et al. (2003) als problematisch angesehen, da Plattenepithelkarzinome ebenfalls eine starke fokale Positivität für CK 5/6 aufwiesen,
und demnach pleurale Tumoren mit plattenepitelialer Differenzierung aufgrund
ihres positiven Reaktionsausfalles ein Mesotheliom vortäuschen können.
Auch Moll bezeichnet die Zytokeratine 5/6 als generelle Plattenepithelkarzinommarker, die auch in schlecht differenzierten Fällen und in Metastasen zuverlässig
exprimiert werden.
Diese Tatsache ist ebenfalls im Hinblick auf die hier zur Diskussion stehende Differentialdiagnose von Relevanz, da auch kleinzellige Karzinome mit plattenepithelialen Komponenten (kombinierte kleinzellige Karzinome, ICD-0 code: 045/3) bekannt sind, welche aufgrund des Vorhandenseins letzterer und bei entsprechendem CK 5/6- Reaktionsausfall in fraglichen Fällen ein epitheloides Mesotheliom
vortäuschen können. Deshalb ist vor allem bei kleinen Biopsieproben und insbesondere bei untypisch heterogenem Verteilungsmuster der markierten Tumorzellen äußerste Vorsicht bei der Interpretation geboten.
Pleurale Tumoren können, sofern sie die sie umgebende Lunge tangieren und
somit in die Nähe von Alveolarzellen gelangen, eine Infiltration vortäuschen, da
Alveolarepithelien ebenfalls positiv für Zytokeratine sind (King und Hasleton,
2001).
5 Diskussion
129
Generell ist es deshalb nach Kaufmann für Zytokeratinmarkierungen empfehlenswert, zum Erhalt einer hohen Spezifität ein Färbeergebnis erst dann als positiv zu
werten, wenn mindestens ein bestimmter Anteil von Tumorzellen (vorzugsweise
10%) ein mindestens mäßig starkes Färbesignal zeigt (Kaufmann, 2000).
Damit wird neben der erwähnten, vorgetäuschten Infiltration auch vermieden, dass
eventuell im Tumor eingeschlossene und gelegentlich schwierig als solche zu identifizierende originäre Epithelien (z.B. aktivierte Alveolarepithelien) als positiv
gewertet werden.
Dieses Phänomen sollte nicht unterschätzt werden, da es in primären Lungentumoren und auch metastatischen Absiedelungen recht häufig beobachtet wird und
diese eingeschlossenen Alveolarepithelien unter Umständen in eine so enge
räumliche Beziehung zu den Tumorzellen treten, dass sie nur sehr schwer von
diesen zu unterscheiden sind.
Das Vorkommen von solchen eingequetschten Epithelien kann besonders bei
Geweben aus Probebiopsien, wie sie bei der Diagnosesicherung von kleinzelligen
Karzinomen in der Regel vorgenommen werden, recht häufig beobachtet werden.
In das Tumorgewebe eingedrückte Epithelgewebe wiederum gehen in der Regel
mit den für diese Tumorentität typischen Quetschartefakten einher, die zusammen
mit der Kleinheit und damit eingeschränkter Repräsentativität endoskopischbioptisch gewonnenen Gewebes, die Abgrenzung gegenüber undifferenzierten
Tumoren, Lymphomen, lymphozytären Infiltrationen und eben auch epitheloiden
Mesotheliomen zusätzlich erschweren können.
Versuch der Bewertung variierender Expressionsmuster:
Nach Osborn und Weber (1983) variiert die Expression unterschiedlicher KeratinPolypeptide epithelialer Zellen mit ihrem Differenzierungsgrad, folglich werden in
Zellen wenig differenzierter Tumoren Keratine in geringerem Maße exprimiert.
Auch Moll bestätigt, dass eine Expression der Zytokeratin- Polypeptide mit dem
Grad der Differenzierung eng korreliert (Moll, 1993).
Dies könnte auch ein Grund, sowohl bei den Mesotheliomen als auch den kleinzelligen Karzinomen, für die unterschiedlichen Expressionsmuster innerhalb der bei-
5 Diskussion
130
den Tumorgruppen sein, und erklären, weshalb einige Mesotheliome Zytokeratine
sehr stark exprimieren, andere dagegen mäßig oder schwach.
Moll (1993) konnte nachweisen, dass innerhalb eines Karzinoms mit Entdifferenzierung, die mit zunehmender Malignität korreliert, eine Reduktion, aber auch ein
Zugewinn von Intermediärfilament-Proteinen erfolgen kann.
Nachgewiesen wurde eine Reduktion bis zum Verlust beispielsweise für CK 13 in
Urothelkarzinomen, aber auch bei manchen kleinzelligen Lungenkarzinomen, die
Zytokeratine 8 und 19 betreffend, die in originärem Bronchialepithel stets stark
homogen nachgewiesen werden können, in Tumorzellen kleinzelliger Karzinome
nicht mehr in allen Fällen und wenn, dann meist nur heterogen (Moll, 1993).
Andere Epitheltypen zeigen hingegen ein umgekehrtes Verhalten, es kommt zu
einem quantitativen und/oder qualitativen Zugewinn von Zytokeratinen beim Vergleich von originärem Gewebe (Ursprungsgewebe) und neoplastischem Gewebe
auf der einen Seite, und auch innerhalb bestimmter Karzinomarten im Zuge der
Entdifferenzierung.
Ein Beispiel hierfür sind die Mesotheliome, die CK 5 konstant stark exprimieren,
wohingegen Mesothelzellen eine sehr schwache Expressionstendenz, nur fokal,
zeigen.
Der ausschließlich zytoplasmatische Nachweis jeglicher Zytokeratine ist in der
elektronenmikroskopisch nachgewiesenen Lokalisation der Zytokeratine perinukleär bzw. peripher begründet. Diese Intermediärfilamente greifen an den Desmosomen an oder sind diffus, netzartig im Zytoplasma verteilt (Corson und Pinkus
1982).
In Kombination mit CD 56 können Zytokeratine nach Kaufmann zum Ausschluss
eines kleinzelligen Karzinoms in der Differentialdiagnose gegen ein epitheloides
Mesotheliom eingesetzt werden, da letztere meistens oben beschriebene Zytokeratine exprimieren, kleinzellige Karzinome jedoch nicht.
Aufgrund unserer Untersuchungsergebnisse kann dieser Aussage nur im ersten
Teil zugestimmt werden, da keines der epitheloiden Mesotheliome negativ für die
Zytokeratine des Spektrums MNF 116 ist, und in 90,1% der Fälle zugleich CK 5/6
exprimieren.
5 Diskussion
131
Demgegenüber steht allerdings bei den Zytokeratinen 5/6 ein Prozentsatz von
20% positiven kleinzelligen Karzinomen, wenngleich 18% lediglich schwach Zytokeratine dieses hohen Molekulargewichts exprimieren.
Bei der CK MNF 116- Immunreaktion sind es jedoch 47% positive kleinzellige Karzinome, auch die Intensität des Reaktionsausfalls ist bei 31% vergleichsweise
stark bis mäßig.
Somit resultiert bei 100%iger Sensitivität von CK MNF 116 für epitheloide Mesotheliome gleichzeitig eine geringe Spezifität (53%).
Die sich für CK MNF 116 und CK 5/6 ergebenden Sensitivitäten und Spezifitäten
zeigen, dass diese Antikörper bei der Differentialdiagnose von kleinzelligen Karzinomen und epitheloiden Mesotheliomen nur eingeschränkt aussagekräftig sind,
wobei CK MNF 116 aufgrund der 100%igen Sensitivität für epitheloide Mesotheliome CK 5/6 vorzuziehen ist.
Dennoch sollte auch bei Verwendung ersteren Markers die zusätzliche Anwendung von TTF1 wegen der deutlich gesteigerten Spezifität in Erwägung gezogen
werden.
Bewertung der fokal punktförmigen Anfärbung im Zytoplasma einiger kleinzelliger
Karzinome in der CK MNF 116- Immunreaktion:
27,7% der für CK MNF 116 positiven kleinzelligen Karzinome wiesen eine fokal
punktförmige Färbelokalisation im Zytoplasma der entsprechenden Tumorzellen
auf. Dabei war dieses Phänomen in einigen der Tumoren stärker ausgeprägt als in
anderen.
Immer aber war die Ausprägung in allen markierten Tumorzellen eines kleinzelligen Karzinoms einheitlich.
Elektronenmikroskopisch wiesen einige Untersuchungen (Hattori et al., 1972,
Gould und Chejfec, 1978) bei kleinzelligen Karzinomen des oat-cell-Typs neurosekretorische Granula im Zytoplasma nach, dies könnte eine Erklärung für die
punktförmige Färbelokalisation bei einigen kleinzelligen Karzinomen sein.
Einen anderen Erklärungsansatz bieten Popper et al. (1987):
Die Autoren vermuteten, dass der Grund für die fokale Anfärbung nur auf einer
Seite der Tumorzellen im Zytoplasma in den von ihnen untersuchten kleinzelligen
5 Diskussion
132
Tumoren, in der ultrastrukturell sichtbaren perinukleären Konzentration der Filamente im Zytoplasma liegen könnte.
Moll bestätigt diese Aussage insofern, als er einräumt, dass die zwar in aller Regel
an Desmosomen verankerten Intermediärfilamente in gebündelter Form homogen
ins Zytoplasma einstrahlen, „diese Filamente aber auch locker irregulär vorliegen
können.“
Eine Erklärung hierfür bieten Franke et al. (1982), die anhand der tief greifenden
reversiblen Umorganisation der Filamentstrukturen während der Mitose zu kleineren globulären Partikeln zeigen konnten, dass das Zytokeratinskelett trotz seiner
mechanischen Stützfunktion sehr dynamisch ist.
5 Diskussion
5.2.3
133
CD 56
Bereits in den 1980er Jahren konnte an Gefrierschnitten gezeigt werden, dass fast
alle kleinzelligen Karzinome diffus CD 56 exprimieren, dass aber die nichtkleinzelligen Karzinome sehr selten positiv für CD 56 sind.
Kaufmann und Mitarbeiter konnten zeigen, dass auch an Paraffinmaterial der
Nachweis von CD 56 und somit die Abgrenzung von kleinzelligen versus nicht
kleinzellligen Karzinomen sehr gut gelingt (Kaufmann et al., 1997).
Kaufmann schlägt eine Kombination von CD 56 mit einem Antikörper gegen Zytokeratine mit hohem Molekulargewicht (vorzugsweise Klon D5/16B4 gegen CK 5/6)
vor, um andere „relativ kleinzellige“ (Zitat Kaufmann) Karzinome auszuschließen,
da die Expression von CD 56 in kleinzelligen Karzinomen nicht absolut spezifisch
ist, und “kleinzellige Karzinome diese Zytokeratine nicht exprimieren“ (Moll, 1993,
Kaufmann, 2000).
Dieser Aussage muss aufgrund der vorliegenden Untersuchungsergebnisse widersprochen werden, denn einerseits reagierten 18% der kleinzelligen Karzinome
in unserer Untersuchung schwach und 2% mäßig positiv mit dem Antikörper gegen CK 5/6, wobei der von Kaufmann vorgeschlagene Klon D5/16B4 verwendet
wurde.
Darüber hinaus zeigte sich, dass eine negative CD 56- Reaktion nicht absolut spezifisch für Mesotheliome des epitheloiden Subtyps ist (Spezifität = 98%).
Insgesamt sind aus den eigenen Untersuchungen zwei Mesotheliome des epitheloiden Subtyps bekannt, die eine positive CD 56- Reaktion zeigen.
Einer dieser Fälle ist im Rahmen der immunhistochemischen Untersuchungen erst
entdeckt worden, der zweite Fall war im Rahmen einer gutachterlichen, fachpathologischen Zusatzuntersuchung bei differentialdiagnostisch fraglichem Pleuramesotheliom versus neuroendokrin-kleinzelligem, pseudomesotheliomatös wachsendem Lungenkarzinom entdeckt worden.
Bei der Abgrenzung von kleinzelligen Lungenkarzinomen gegenüber epitheloiden
Mesotheliomen kann CD 56 mit einer Sensitivität von 96% und einer Spezifität von
99% als zuverlässiger Marker bezeichnet werden.
Die Angaben bei Kaufmann bestätigen dies. Es zeigte sich, dass kleinzellige Karzinome mit sehr guter Sensitivität und Spezifität von nicht kleinzelligen Karzino-
5 Diskussion
134
men abgegrenzt werden können. Die Spezifität lag hier bei 94% für kleinzellige
Karzinome versus nicht kleinzellige Karzinome.
Die zwei jeweils für CD 56 mäßig positiven Fälle epitheloider Mesotheliome der
eigenen Untersuchungsserie zeigten, genau wie die Karzinome des kleinzelligen
Subtyps, eine zytoplasmatische Lokalisation der Markierung.
Bei einer geringen Zahl der im Rahmen dieser Studie ausgewerteten Mesotheliome, den so genannten „Fallstrickpräparaten“, konnte eine deutliche positive Reaktion von Entzündungszellen (Alveolarmakrophagen) in der CD 56- Immunfärbung
festgestellt werden.
Da entzündliche Reaktionen in malignen Tumoren im allgemeinen als Reaktion
des Gewebes auf den invasiven infiltrierenden Prozess in vielen Studien belegt
sind, und maligne Mesotheliome im besonderen sich im Gefolge chronischentzündlicher asbestassoziierter Pleuritiden entwickeln und deshalb hier in der
überwiegenden Anzahl der Fälle eine entzündliche Stromareaktion beobachtet
wird (Brockmann, 1992) kann eine positive CD 56- Reaktion in Entzündungszellen
leicht eine falsch positive Reaktion der Tumorzellen vortäuschen.
Nach Brockmann sollen sich im Gegensatz zu den sarkomatoiden und den biphasischen Mesotheliomen in denen vom vorwiegend epitheloiden Subtyp am häufigsten Entzündungszellen in der Tumorrandzone belegen lassen (in 65% der Fälle).
Aus diesem Grunde ist bei einer positiven CD 56- Reaktion in stark entzündlich
infiltrierten Tumorbereichen größte Vorsicht bei der Interpretation der Immunreaktion geboten.
Kaufmann (2000) konnte in seiner Studie nachweisen, dass nach hitzeinduzierter
Epitopdemaskierung 69 von 70 kleinzelligen, in Paraffin eingebetteten Karzinomen
eine positive Immunfärbung mit dem 123 C3 Antikörper (Sensitivität 0,99) zeigten.
Die in unserer Untersuchung erreichte Sensitivität von 96% ist bei gleichen Bedingungen geringfügig niedriger. Die Immunmarkierung war ebenfalls membranös
lokalisiert, verringerte sich aber in Biopsien mit Quetschartefakten.
Nach Kaufmann beeinflussen Quetschartefakte und Nekrosen nicht den Ausfall
der immunhistochemischen Färbung bei CD 56. Im Gegensatz dazu stehen die
Untersuchungsergebnisse dieser Studie: Demnach existiert sowohl eine positive
Korrelation zwischen dem oftmals untypischerweise negativen oder nur schwach
5 Diskussion
135
positiven Reaktionsausfall in der CD 56- Markierung als auch zwischen einer auffallend geringen Proliferationsfraktion und ausgedehnten Quetschartefakten oder
einer schon fortgeschrittenen Nekrose in der Biopsieprobe.
In dieser Untersuchung exprimierten zwar mit einem Anteil von 74% und 14% die
überwiegende Zahl der kleinzelligen Karzinome stark bzw. mäßig CD 56. Demgegenüber stehen aber einige negative Fälle sowie Fälle von kleinzelligen Lungenkarzinomen mit geringer positiver Reaktion gegenüber CD 56, wo dies nicht durch
das Vorhandensein starker Quetschartefakte oder einer ausgeprägten Nekroseneigung zu begründen ist.
Bei einem dieser kleinzelligen Karzinome handelte es sich um einen Wi- Fall, hier
könnte die Dauer der Fixierung ursächlich für die fehlende Reaktion gewesen sein.
Einen anderen Erklärungsansatz bieten Aletsee-Ufrecht et al., die nachweisen
konnten, dass die Expression von CD 56 in kleinzelligen Lungenkarziomen im Verlauf der Krankheit variiert (Aletsee-Ufrecht et al., 1990), was erklären würde, weshalb manche immunhistochemischen Marker, die als typisch für eine neuroendokrine Differenzierung gelten, nur schwach oder gar nicht von einigen dieser Tumoren exprimiert werden, je nachdem, in welchem Tumorstadium sich diese befinden.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass CD 56 als positiver Marker für Tumoren
neuroendokriner Differenzierung mit einer sehr hohen Spezifität von 99% und einer ebenfalls sehr hohen Sensitivität von 96% ausgezeichnet geeignet ist, die zur
Diskussion stehenden Tumorentitäten voneinander abzugrenzen.
Da die CD 56- positiven Fälle epitheloider Mesotheliome jeweils eine besonders
markante inselartige Verteilung der angefärbten Zellen zeigten, die Verteilung bei
den kleinzelligen Tumoren aber bis auf stark gequetschte Bereiche sehr homogen
war, ist dieses Phänomen hinsichtlich dieser Differentialdiagnose fraglicher Fälle
in die Entscheidungsfindung einzubeziehen.
5 Diskussion
5.2.4
136
Calretinin
Dieses Protein gehört zur EF-hand Familie der Calcium-bindenden Proteine.
Die EF-hand Proteine sind charakteristischerweise durch helix-loop-helix-Schleifen
aufgebaut, welche als Bindungsstelle für Calcium dienen.
Es handelt sich bei den für Calretinin positiv reagierenden kleinzelligen Karzinomen zweifelsfrei um positiv reagierende Tumorzellen, eine Kontamination, beispielsweise mit eingedrückten originären Mesothelzellen, ist ausgeschlossen.
Darüber hinaus wurden diese Zellen durch eine CD 56- Gegenprobe zweifelsfrei
als Tumorzellen eines kleinzelligen Karzinoms identifiziert.
Insgesamt exprimierten 12% der untersuchten kleinzelligen Karzinome Calretinin.
Dieses Ergebnis deckt sich nicht mit den Angaben bei Lugli et al. (2003), wonach
17,6% der untersuchten kleinzelligen Lungenkarzinome (n=17) schwach, 23,5%
stark positiv für Calretinin waren.
Die differenten Ergebnisse sind höchstwahrscheinlich auf unterschiedliche Untersuchungsbedingungen zurückzuführen:
Im Gegensatz zu unserer Studie wurden hier Gewebeproben kleinzelliger Karzinome in TMA-Blöcke eingebracht, die Vorbehandlung und Detektionsverfahren
waren unterschiedlich, und es wurden ausschließlich polyklonale Antikörper (Kaninchen) verwendet, die bekanntermaßen zu unerwünschten Kreuzreaktionen mit
anderen, dem gesuchten Antigen ähnlichen Strukturen, führen können, und auf
diese Weise ein positives Ergebnis vortäuschen.
Alle für Calretinin positiv reagierenden kleinzelligen Karzinome (n=12) unserer Untersuchung waren in allen Fällen stark positiv für CD 56, und gleichzeitig in 83,3%
der Fälle auch für TTF1 stark positiv.
Der für diese differentialdiagnostisch schwierig einzuordnenden Fälle charakteristische immunhistochemische Phänotyp (CD 56 und TTF1 stark positiv) erleichtert
die Diagnose, da keines der epitheloiden Mesotheliome TTF1- positiv reagierte
und die Spezifität einer positiven CD 56- Reaktion für die Diagnose eines kleinzelligen Karzinoms versus epitheloides Mesotheliom in dieser Studie ebenfalls bei
98% lag (nur ein für CD 56 positiv reagierendes epitheloides Mesotheliom).
5 Diskussion
137
Abutaily et al. (2002) konnten von einer 100%igen Anti-Calretinin Positivität der
epitheloiden Mesotheliome (n=11) berichten, ebenso Dei Tos und Doglioni (1998).
In derselben Studie wurde über eine Calretininexpression in Neuronen des peripheren und zentralen Nervensystems berichtet, ebenso in Steroid-produzierenden
Zellen.
Auch Ordonez (2000) fand in seiner Untersuchung eine 100%ige Calretinin- Positivität für das Kollektiv der epitheloiden Pleuramesotheliome (n=60).
Miettinen und Sarlomo-Rikala (2003) wiesen eine Expression von Calretinin (polyklonal) in 92% der von ihnen untersuchten epitheloiden Mesotheliome, und in
37% der kleinzelligen Karzinome in mehr als 10% der Tumorzellen nach. Die Autoren weisen ebenfalls darauf hin, dass die Lokalisation der Färbereaktion bei den
Karzinomen pulmonalen Ursprungs ebenso wie bei den epitheloiden Mesotheliomen sowohl nukleär als auch zytoplasmatisch lokalisiert ist, was die Differentialdiagnose zusätzlich erschwert.
Dasselbe Phänomen ist auch in unserer Untersuchung bei den kleinzelligen Karzinomen zu beobachten gewesen.
95% der Mesotheliome reagierten positiv mit Antikörpern gegen Calretinin, der
überwiegende Teil davon stark.
Bei den wenigen Fällen, die keine Positivität für Calretinin zeigten, handelte es
sich bei 60% (n=3) um Konsiliarfälle, deren Gewebe zum Teil als in Form von bereits länger in Formalin fixiertem Nassmaterial übersandt wurde. Die diesbezügliche Problematik wurde an anderer Stelle bereits erläutert (vgl. S. 114).
Es ist sehr wahrscheinlich, dass bei zwei dieser Fälle die ungewöhnliche Calretinin- Negativität auf diese Weise zu erklären ist, da der Reaktionsausfall in der CK
MNF 116- Immunfärbung bei Vergleich der drei Stanzen sehr different ausfiel:
In einem Fall war eine Stanze stark positiv, eine schwach, und die dritte Stanze
dieses Tumors negativ. Im zweiten Fall war die Konstellation ähnlich, und aus diesem Grunde gelangten diese zwei Fälle in der CK MNF 116- Markierung nicht zur
Auswertung.
Eine Erklärung für diesen Reaktionsausfall, der in der längeren Fixierung begründet liegt, ist recht wahrscheinlich.
In den zwei übrigen Fällen mit negativer Calretinin- Reaktion ist der Reaktionsausfall in der CK MNF 116- Markierung stark positiv, aus diesem Grunde ist davon
5 Diskussion
138
auszugehen, dass Calretinin nicht in diesem Gewebe nachzuweisen ist, und es
sich infolgedessen um eine richtig negative Reaktion handelt.
Insgesamt kann der immunhistochemische Marker Calretinin aufgrund unserer
Untersuchungsergebnisse und der in der Literatur bekannten Angaben als hochsensitiv für epitheloide Mesotheliome bezeichnet werden. Seine herabgesetzte
Spezifität gegenüber pulmonalen Karzinomen im Allgemeinen (Miettinen und Sarlomo-Rikala, 2003) und kleinzelligen Lungenkarzinomen im Besonderen schränkt
seinen diagnostischen Nutzen entsprechend ein, so dass es ratsam erscheint, ihn
bei entsprechenden Fragestellungen nur in Kombination mit einem hochspezifischen Zweitmarker, wie z.B. TTF1, zum Ausschluss eines epitheloiden Mesothelioms einzusetzen.
5 Diskussion
5.2.5
139
Ki-67
Bei den weiblichen Mesotheliompatienten dieser Studie liegt der Anteil der proliferationsaktiven Tumorzellen in allen Fällen unter 25%.
Geht man davon aus, dass ein geringer Anteil proliferationsaktiver Tumorzellen
positiv mit einer besseren Prognose, bzw. einer längeren Überlebenszeit, korreliert, so decken sich diese Daten mit den Angaben einiger Autoren, demnach
Frauen eine verlängerte Überlebenszeit aufweisen (Hartmann und Schütze, 1992).
Ebenso konnte bei den Peritonealmesotheliomen eine vergleichsweise geringe
Proliferationsaktivität festgestellt werden. Diese lag nur in einem der Fälle über
20% (21,66%).
In Übereinstimmung mit anderen in der Literatur bekannten Daten scheinen Peritonealmesotheliome vergleichsweise langsam zu wachsen, was aber dennoch in
keinem Verhältnis zum Verlauf der Erkrankung zu stehen scheint, da die Möglichkeiten der Therapie in jedem Stadium sehr eingeschränkt sind.
Trupiano et al. (2004) konnten eine deutlich längere Überlebenszeit bei Patienten
mit Peritonealmesotheliomen (9-18 Monate) gegenüber solchen mit pleuralen Mesotheliomen feststellen (4-12 Monate).
Geht man davon aus, dass eine positive Korrelation zwischen Mib1 Fraktion und
Überlebenszeit besteht, wie sie von einigen Autoren (Müller, 2005, Schönherr et
al., 2004, Kayser et al., 2001) postuliert wird, so stehen diese Ergebnisse im Einklang mit den Ergebnissen unserer Untersuchung.
Demnach lag der Prozentsatz der proliferationsaktiven Tumorzellen in Peritonealmesotheliomen unter 22%, 30,2% der Mesotheliome pleuralen Ursprungs hingegen wiesen einen Prozentsatz proliferationsaktiver Tumorzellen über 20% auf.
Schönherr et al. (2004) geben Prozentzahlen proliferationaktiver Tumorzellen bei
epitheloiden Mesotheliomen zwischen 3,5 und 70% an (Durchschnittswert:
22,4%).
Kayser et al. (2001) fanden eine Proliferationsfraktion bei kleinzelligen Karzinomen
von durchschnittlich 68%. In derselben Studie konnte ein Zusammenhang zwischen mittlerer Überlebenszeit und dem Prozentanteil der proliferationsaktiven
Zellen nachgewiesen werden. Lag demnach die Proliferationsrate über 70% der
5 Diskussion
140
Tumorzellen, verringerte sich die mediane Überlebenszeit um 4,2 Monate auf 10,9
Monate.
Das gute Ansprechen dieser Tumoren auf eine Chemotherapie wird auf ihre hohe
Proliferationsfraktion zurückgeführt, so reagieren sie einerseits sehr empfindlich
auf zytotoxische Schädigung, bilden andererseits aber rasch Resistenzen, wodurch die hohen Ansprechraten und die kurzen Überlebenszeiten erklärt werden
können.
Bei den als relativ homogen erscheinenden kleinzelligen Tumoren konnten Proliferationsfronten, sog Cluster, im Hinblick auf das Proliferationsverhalten festgestellt
werden. Diese bestehen innerhalb eines Tumors aus Bereichen mit erhöhter Proliferationstendenz. Diese Bezirke umfassen durchschnittlich 25 Tumorzellen innerhalb eines Radius von 100 µm (Kayser et al., 2001).
Solche stark inhomogenen Bereiche im Sinne oben definierter Proliferationsfronten sind in der vorliegender Untersuchung auch in der Gruppe der Mesotheliome
nachgewiesen worden, was im Hinblick auf die ohnehin bekannte starke Heterogenität dieser Tumorentität weniger überraschend ist als in der Gruppe der als
relativ homogen geltenden kleinzelligen Karzinome. Diese Tatsache erschwert
natürlich die Abgrenzung zwischen den zur Diskussion stehenden Tumorentitäten
zusätzlich, sofern der Prozentsatz proliferationsaktiver Tumorzellen sich auf ähnlichem Niveau befindet.
Bei Betrachtung der vier verschiedenen Gruppen der Mib1- Färbung zeigte sich,
dass 95,8% der Mesotheliome den Gruppen I und II zugehörig sind (Gruppe I: 120% der Tumorzellen positiv, Gruppe II: 21-40% der Tumorzellen positiv, Gruppe
III: 41-60% der Tumorzellen positiv, Gruppe IV: > 60% der Tumorzellen positiv).
In den zwei Gruppen mit höherer Proliferationsfraktion gibt es demnach fast keine
Überschneidungen zwischen kleinzelligen Karzinomen und Mesotheliomen.
Anders sieht es in den Gruppen I und II der kleinzelligen Karzinome aus, da mit
einem Anteil von 32% ein vergleichsweise hoher Anteil hier einzuordnen war, und
es dementsprechend zu einer großen Schnittmenge mit den Mesotheliomen
kommt.
Die kleinzelligen Karzinome weisen eine breite Variabilität, die Anzahl proliferationsaktiver Tumorzellen betreffend, auf.
5 Diskussion
141
Diese starke Variabilität resultiert zu einem großen Teil aus dem Vorhandensein
mittlerer bis starker Quetschartefakte in den Fällen, die den Gruppen I und II mit
niedrigerem Anteil proliferationsaktiver Zellen zugeordnet wurden.
Das Variationsspektrum bei den Mesotheliomen ist sehr breit, es liegt erfahrungsgemäß zwischen < 5-80% (Krismann, 2005; persönliche Mitteilung), wenngleich
der prozentual höchste Anteil den Gruppen I und II zuzuordnen ist.
In dieser Untersuchung konnten 95,8% (n= 92) den Gruppen I und II zugeordnet
werden.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass sich der „Proliferationsmarker“
Mib1 als hilfreich in der Differentialdiagnose von kleinzelligen Karzinomen und epitheloiden Mesotheliomen erwiesen hat, sofern es sich um Biopsieproben kleinzelliger Karzinome ohne ausgedehntere Quetschartefakte handelt, die das Ergebnis
nachweislich erheblich beeinflussen können.
5 Diskussion
5.3
142
Anwendung von Markerkombinationen zur differentialdiagnostischen Abgrenzung epitheloider Mesotheliome und
kleinzelliger Karzinome
Bei Betrachtung von Sensitivität und Spezifität werden bei der Kombination von
CD 56 und TTF1 die höchsten Werte erreicht.
Die Vorbedingung lautete hierbei, dass CD 56 und/oder TTF1 positiv ist.
Die Sensitivität für die Erkennung eines kleinzelligen Karzinoms lag bei 100%, die
Spezifität war mit 99% ebenfalls sehr hoch. Lediglich ein Mesotheliom war in dieser Konstellation positiv.
Allerdings handelte es sich hierbei um einen der differentialdiagnostisch schwer
einzuordnenden Fälle (hier sind die zwei Mesotheliome gemeint, die CD 56 positiv
waren, wobei einer davon lediglich als kasuistisches Beispiel im Ergebnisteil erwähnt wird, da letztendlich die Zuordnung zu einem Mesotheliom B erfolgte, und
der Fall darum nicht als zweifelsfreies Mesotheliom in die eigenen Untersuchungen aufgenommen werden konnte), bei denen allein bei Betrachtung dieser zwei
Parameter eine Unterscheidung nicht zweifelsfrei möglich war.
Jedoch fällt in beiden Fällen die ungewöhnliche Lokalisation der Färbereaktion
auf:
In einem Fall ließ sich eine Positivität für CD 56 lediglich fokal nachweisen, im
zweiten Fall reagierten umschriebene inselartige Areale positiv.
Bei allen für CD 56 positiven kleinzelligen Karzinomen allerdings war die Färbereaktion homogen zytoplasmatisch verteilt.
Somit können Ausprägung und Lokalisation eine wertvolle Entscheidungshilfe bei
fraglichen Fällen darstellen.
Bei einer Kombination von TTF1, als Marker mit der höchsten Spezifität für die
Erkennung kleinzelliger Karzinome, mit Calretinin ließ sich die Sensitivität von
60% (TTF1 allein) auf 95% steigern, die Spezifität dagegen fiel um 2%, da zwei
der kleinzelligen Karzinome sowohl negativ für TTF1, als auch positiv für Calretinin
waren.
Diese kleinzelligen Karzinome reagierten jedoch typischerweise stark positiv mit
Anti-CD 56 und sind somit nicht als differentialdiagnostisch fragliche Fälle einzustufen.
5 Diskussion
143
Bei einem Vergleich verschiedener Konstellationen von typischen positiven Mesotheliommarkern, ist die Kombination von CK MNF 116, als immunhistochemischer Marker mit der höchsten Sensitivität (100%), und Calretinin der von CK MNF
116 und CK 5/6 deutlich überlegen. Bei ersterer wird eine Sensitivität für die Erkennung eines epitheloiden Peuramesothelioms von 97% und eine Spezifität von
95% erreicht, bei letzterer nur 90% bzw. 85%.
Eine Kombination von drei immunhistochemischen Markern ist unabhängig von
einem höheren Verbrauch an Reagenzien und somit höheren Kosten auch insofern nicht sinnvoll, als dass bei einer 100%igen Spezifität eine deutlich verringerte
Sensitivität (56%) gegenüber der alleinigen Anwendung von CD 56 und TTF1 resultiert. Das gleiche gilt auch für die Kombination von TTF1 und CD 56 unter der
Bedingung, dass beide Reaktionen positiv ausfallen, wobei hier die Spezifität der
Kombination vergleichsweise stark gegenüber der von beiden Markern allein absinkt.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass bei der Unterscheidung zwischen kleinzelligen Lungenkarzinomen und epitheloiden Mesotheliomen TTF1,
wenn es als Marker allein eingesetzt wird, eine 100%ige Spezifität erreicht. Bei
einer positiven Reaktion kann also ein epitheloides Mesotheliom mit 100%iger
Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen und auf den Einsatz einer Kombination verzichtet werden.
Gleichzeitig kann aber das Vorliegen eines kleinzelligen Karzinoms bei einer negativen TTF1- Reaktion natürlich noch nicht ausgeschlossen werden, da die
Wahrscheinlichkeit, dass bei einer negativen TTF1- Reaktion kein kleinzelliges
Karzinom vorliegt, nur bei 71% liegt.
Bei einer negativen TTF 1- Reaktion ist also ist der Einsatz weiterer Marker gerechtfertigt.
Aufgrund der hier vorliegenden Ergebnisse sollte in diesem Fall einer zusätzlichen
Calretinin- Reaktion der Vorzug gegeben werden. Lässt sich in dieser keinerlei
Positivität feststellen, so ist bezüglich der hier analysierten Differentialdiagnose mit
einer Wahrscheinlichkeit von 95% (npW) davon auszugehen, dass kein Mesotheliom vorliegt.
5 Diskussion
144
Die Kombination der Marker Calretinin und CD 56, wobei ersterer für die Diagnose
eines epitheloiden Mesothelioms positiv und letzterer negativ ausfallen muss, ist
der Kombination von TTF1 und Calretinin gleichwertig, der Kombination Calretinin/CK MNF 116 geringfügig und der Kombination CK MNF 116/CK 5/6 deutlich
überlegen.
Fazit:
Obwohl die WHO-Klassifikation für maligne Neoplasien der Lungen noch immer
auf der lichtmikroskopischen Untersuchung konventionell gefärbter Schnittpräparate basiert, sind immunhistochemische Zusatzuntersuchungen in der modernen
histopathologischen Diagnostik zu einem unerlässlichen additiven Faktor geworden.
Die immunhistochemischen Untersuchungen erlangen vor allem vor dem Hintergrund der differenzierten Therapiemöglichkeiten, der steigenden Inzidenz primärer
Pleuratumoren und der versicherungsmedizinischen Relevanz möglicherweise
berufsbedingter Erkrankungen große Bedeutung.
Trotz Fortschritten in der Diagnostik durch immunhistochemische Untersuchungen
existieren Grenzfälle, die bis dato weder durch morphologische Analysen, noch
durch aufwändige immunhistochemische Zusatzuntersuchungen zu lösen sind.
Da es bekanntermaßen keinen spezifischen positiven Mesotheliommarker gibt,
können Überschneidungen der Expressionsmuster mit einigen primären Lungentumoren (z.B. kleinzelligen Lungenkarzinomen) die eindeutige Zuordnung gelegentlich außerordentlich erschweren.
Dies wird ebenfalls deutlich bei Betrachtung der immunhistochemischen Profile
der kasuistischen Beispiele, da diese sowohl die für die kleinzelligen Lungentumoren typischen immunhistochemischen Marker exprimieren als auch diejenigen, die
bei epitheloiden Mesotheliomen in den meisten Fällen positiv sind.
Hinzu kommt, dass die Diagnose kleinzelliger Karzinome auch in Anbetracht der
Kleinheit, und der damit eingeschränkten Repräsentativität endoskopisch-bioptisch
gewonnenen Gewebes sowie durch die typischen Quetschartefakte, in der Abgrenzung gegenüber lymphozytären Infiltrationen, undifferenzierten Tumoren und
eben auch epitheloiden Mesotheliomen schwierig sein kann.
5 Diskussion
145
Aufgrund der vorliegenden Untersuchungsergebnisse lässt sich sagen, dass die
verwendeten Marker die Fragestellung betreffend alle als hilfreich eingestuft werden können, da die Sensitivität aller „Mesotheliommarker“ immer zwischen 90 und
100% lag und die Spezifität von TTF1 und CD 56 für die Diagnose eines kleinzelligen Karzinoms mit 100 und 96% ebenfalls sehr hoch war.
In Anlehnung an die Ergebnisse dieser Studie gelten bei der differentialdiagnostischen Abgrenzung von epitheloiden Mesotheliomen gegenüber kleinzelligen Lungenkarzinomen folgende Empfehlungen:
Für die hier zur Diskussion stehende Differentialdiagnose zwischen pseudomesotheliomatös wachsendem kleinzelligen Karzinom und epitheloidem Pleuramesotheliom hat die Markerkombination von CD 56 und TTF1 für den Fall, dass mit
einem dieser Marker eine positive Reaktion nachgewiesen werden kann, die
höchsten Werte für Spezifität und Sensitivität für die Diagnose eines kleinzelligen
Karzinoms (Sensitivität=100%, Spezifität=99%) ergeben.
Für das praktische Vorgehen sollte daher auch unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten mit einer immunhistochemischen Analyse dieser Antigene begonnen
werden. Im Fall einer positiven Reaktion kann mit einer sehr großen Wahrscheinlichkeit (ppW=99%) von der Diagnose eines kleinzelligen Karzinoms ausgegangen
werden. Für den Fall einer mit beiden Antigenen negativen Reaktion sind weitere
immunhistochemische Untersuchungen (Calretinin) zur Sicherung der Diagnose
eines epitheloiden Pleuramesothelioms erforderlich.
Bei einer positiven Calretinin- Reaktion liegt die Wahrscheinlichkeit, dass es sich
um ein epitheloides Mesotheliom handelt bei 98%, vorausgesetzt, es soll abgegrenzt werden zwischen kleinzelligem Lungenkarzinom und epitheloidem Mesotheliom.
Um die Verdachtsdiagnose zu bestätigen, kann bei positiver Calretinin- Markierung und sollte bei einer fehlenden Calretinin- Markierung eine zusätzliche MNF
116- Immunreaktion durchgeführt werden.
Ist diese negativ, schwach oder mäßig stark ausgeprägt, oder weist sie eine
punktförmige Markierung auf, so handelt es sich im Hinblick auf die hier zur Diskussion stehende Differentialdiagnose nicht um ein Mesotheliom.
6 Zusammenfassung
6
Zusammenfassung
6.1
Einleitung
146
Bei den kleinzelligen Lungenkarzinomen handelt es sich, neben den
Adenokarzinomen der Lunge, um die häufigsten Primärtumoren mit sekundärer
Pleurabeteiligung und somit um eine Tumorentität, die die Differentialdiagnose
gegenüber einem Mesotheliom in einigen Fällen sehr erschweren kann.
Dennoch liegen bis zum heutigen Zeitpunkt kaum Erkenntnisse bezüglich
pseudomesotheliomatös wachsender kleinzelliger Karzinome vor.
In der klinischen Pathologie werden zur differentialdiagnostischen Abgrenzung
verschiedener Tumorentitäten immunhistochemische Marker verwendet. Ziel
dieser Untersuchung war es, den Nutzen einzelner Marker und
Markerkombinationen bezüglich der Abgrenzung kleinzelliger Lungenkarzinome
versus epitheloider Mesotheliome zu ermitteln.
6.2
Material und Methoden
Es wurden 100 kleinzellige Karzinome und 112 epitheloide Mesotheliome
untersucht. Dabei wurden die Mesotheliome mit Hilfe der TMA-Technik
immunhistochemisch analysiert. Es wurden jeweils drei Tumorstanzen aus
unterschiedlichen Bereichen des Tumors entnommen, auf diese Weise entstanden
18 TMA-Blöcke mit insgesamt 336 Stanzen epitheloider Mesotheliome.
In der immunhistochemischen Untersuchung wurden Antikörper gegen TTF1, CD
56, CK 5/6, CK MNF 116, Calretinin und Ki-67 eingesetzt.
6.3
Ergebnisse
In Anlehnung an die Fragestellung konnten folgende Erkenntnisse gewonnen
werden:
47% der untersuchten kleinzelligen Karzinome reagierten positiv auf die
Zytokeratine des Markers CK MNF 116, und 20% positiv auf die Zytokeratine 5/6.
Die festgestellten Spezifitäten für CK MNF 116 und CK 5/6 zeigten, dass diese
allein nur eingeschränkt aussagekräftig sind, wobei CK MNF 116 wegen der
6 Zusammenfassung
147
höheren Sensitivität (100%) für epitheloide Mesotheliome CK 5/6 (Sensitivität=
90%) überlegen ist.
Bei der Untersuchung mit dem immunhistochemischen Marker Calretinin lag der
Anteil der positiv reagierenden kleinzelligen Karzinome bei 12%.
Calretinin erwies sich somit als hochsensitiv (95%) bei einer Spezifität von 88% für
die Diagnose eines epitheloiden Mesothelioms
Bezüglich der Validität der TMA-Technik konnte eine Übereinstimmung zwischen
Originalschnitten und den Tumorstanzen in 90% der Fälle nachgewiesen werden.
Die TMA-Technik erwies sich somit als geeignetes Untersuchungsverfahren auch
für heterogen geltende Tumorentitäten.
Es konnte festgestellt werden, dass Mesotheliome in seltenen Fällen
neuroendokrine Differenzierungen aufweisen (siehe Kapitel 4.5.2 und 4.3.3). Im
Rahmen dieser Untersuchung konnten zwei Fälle fokaler neuroendokriner
Differenzierung nachgewiesen werden (Fall 6F, Fall 3B3)
Der Proliferationsmarker Mib1 erwies sich lediglich als hilfreich bezüglich der zur
Diskussion stehenden Differentialdiagnose, sofern die Biopsieproben keine
Quetschartefakte beinhalteten, die das Ergebnis nachweislich beeinflussten. Das
Variationsspektrum in der Gruppe der epitheloiden Mesotheliome war sehr breit,
es lag zwischen 5< und 90%, wenngleich der prozentual höchste Anteil von 95,8%
(n=92) eine Proliferationsfraktion von 40%< der Tumorzellen aufwies. Da bei 32%
der kleinzelligen Karzinome ebenfalls eine Proliferationsfraktion von unter 40%
nachgewiesen wurde, kommt es zu einer großen Schnittmenge mit den
Mesotheliomen. Mib1 kann daher nicht als alleiniger Marker zur Anwendung
kommen.
Mit einem Wert von 100% ist TTF1 der Marker mit der höchsten Spezifität für die
Diagnose eines kleinzelligen Karzinoms, wobei die Sensitivität lediglich 60%
betrug. CD 56 erreichte eine Spezifität von 99% und eine 96%ige Sensitivität für
die Erkennung eines kleinzelligen Karzinoms.
Bei der Abgrenzung von epitheloiden Mesotheliomen und kleinzelligen
Karzinomen betrug die Sensitivität 100% und die Spezifität 53% für die Erkennung
eines epitheloiden Mesothelioms durch eine positive CK MNF 116Immunreaktion. Für CK 5/6 konnte eine Sensitivität von 90% sowie eine Spezifität
von 80% festgestellt werden. Für Calretinin ergab sich eine 95%ige Sensitivität
6 Zusammenfassung
148
und eine 88%ige Spezifität für die Diagnose eines epitheloiden Mesothelioms im
Falle einer positiven Immunreaktion.
Durch Markerkombinationen können Sensitivität und Spezifität gesteigert werden.
Hier erwies sich die Kombination von CD 56 und TTF1 als hilfreich für die
Erkennung eines kleinzelligen Karzinoms (Sensitivität= 100%, Spezifität= 99%).
Für die Erkennung eines epitheloiden Mesothelioms ergaben die Kombinationen
von TTF1 und Calretinin (Sensitivität= 95%, Spezifität= 98%) sowie CD 56 und
Calretinin die höchsten Werte (Sensitivität= 93%, Spezifität= 100%).
6.4
Diskussion
Alle in dieser Untersuchung verwendeten Marker können als hilfreich eingestuft
werden, da die für epitheloide Mesotheliome typischerweise positiv reagierenden
Marker CK 5/6, CK MNF 116 und Calretinin eine Sensitivität für diese Diagnose
zwischen 90 und 100% erreichen und die Spezifität von TTF1 und CD 56 mit 100
bzw. 98% für die Diagnose eines kleinzelligen Karzinoms ebenfalls sehr hoch war.
Individuelle Gewebemerkmale wie Größe, Dauer der Fixierung, Quetschartefakte,
von der Norm abweichende Färbemuster etc. müssen im Einzelfall kritisch
betrachtet werden, da diese die Ergebnisse nachweislich beeinflussen können.
Durch Markerkombinationen können Sensitivität und Spezifität gesteigert werden
wobei natürlich die Kosten-Nutzenrelation kritisch abgewogen werden sollte.
7 Literaturverzeichnis
7
149
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Danksagung
Für die Überlassung des Themas, die wertvollen Anregungen und die
Unterstützung während der Bearbeitung möchte ich mich bei meinem
Doktorvater Herrn PD Dr. M. Krismann bedanken.
Ebenso bin ich Frau Sauerland und Herrn Seidl bezüglich statistischer
Fragestellungen und den Mitarbeiterinnen des Immunhistochemischen Labors
des pathologischen Institutes Bergmannsheil für Ihre Hilfsbereitschaft zu Dank
verpflichtet.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern für deren Geduld und Unterstützung in
vielerlei Hinsicht.
Lebenslauf
Name:
Pohlmann
Vorname:
Janine
Adresse:
Felderbachstr. 91a, 45529 Hattingen
Telefon:
0163/2559403
Geburtsdaten:
03.06.1978 in Hattingen
Familienstand:
ledig
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Schulausbildung:
1985-1989: Grundschule Herzkamp in Sprockhövel
1989-1998: Städtisches Gymnasium
Velbert-Langenberg
Mai 1998:
Studium : Zahnmedizin
Allgemeine Hochschulreife
1998-2003: Universität Witten-Herdecke:
Fakultät für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde
16.12.2003: Staatsexamen
Ab 2004:
Assistenzzahnärztin in freier Praxis
Promotion im Institut für Pathologie an der AugustaKrankenanstalt in Bochum