Das menschliche Chromatin-assoziierte DEK

Das menschliche Chromatin-assoziierte
DEK-Protein:
Funktionelle Domänen und
Phosphorylierung
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der
Naturwissenschaften (Dr. rer. nat) des Fachbereiches Biologie
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion
Universität Konstanz
Vorgelegt von
Ferdinand Kappes
Konstanz, im August 2004
Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2004
Referentin: Priv-Doz. Dr. Claudia Gruss
Referent:
Prof. Dr. Rolf Knippers
Inhaltsverzeichnis
II
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht:
Kappes, F., C. Damoc, R. Knippers, M. Przybylski, L. A. Pinna, and C. Gruss. 2004.
Phosphorylation by Protein Kinase CK2 Changes the DNA Binding Properties of the Human
Chromatin Protein DEK. Mol Cell Biol 24:6011-20.
Kappes, F.*, I. Scholten*, N. Richter, C. Gruss, and T. Waldmann. 2004. Functional Domains
of the Ubiquitous Chromatin Protein DEK. Mol Cell Biol 24:6000-10.
* geteilte Erstautorenschaft
Waldmann, T., I. Scholten, F. Kappes, H.G. Hu, and R. Knippers. 2004. The DEK protein –
an abundant and ubiquitous constituent of mammalian chromatin, in press
Weitere Veröffentlichungen:
Kappes, F., K. Burger, M. Baack, F. O. Fackelmayer, and C. Gruss. 2001. Subcellular
localization of the human proto-oncogene protein DEK. J Biol Chem 276:26317-23.
Kulartz, M., E. Hiller, F. Kappes, L. A. Pinna, and R. Knippers. 2004. Protein kinase CK2
phosphorylates the cell cycle regulatory protein Geminin. Biochem Biophys Res Commun
315:1011-7.
Präsentation auf Kongressen:
9/2000
Weimar Conference of Genetics, Weimar
Poster-Präsentation
10/2001
Annual Meeting of the German Genetics Society, Halle,
Short Talk
10/2003
„1st Symposium of Transregio 5“, München,
Poster-Präsentation
Inhaltsverzeichnis
III
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Januar 2001 bis August 2004 am Lehrstuhl für
Molekulare Genetik (Prof. Dr. R. Knippers) der Universität Konstanz angefertigt.
Bei meiner Betreuerin Priv. Doz. Dr. Claudia Gruss möchte ich mich für die Bereitstellung des
Themas, für das stete Interesse am Fortgang der Arbeit, für die Diskussionsbereitschaft und für
den vierwöchigen Forschungsaufenthalt in Oslo bedanken. Sie schied im Januar diesen Jahres
durch eine Stellung in der Industrie aus. Ich wünsche Ihr von ganzem Herzen weiterhin viel
Erfolg.
Herrn Prof. Dr. R. Knippers möchte ich für die Aufnahme in die Arbeitsgruppe danken, für das
Interesse an der Arbeit und für die viele Unterstützung, die mir gerade nach dem Ausscheiden
von Claudia Gruss entgegengebracht wurde.
Einen besonderen Dank möchte ich dem „DEK-Labor“ aussprechen, denn Tanja Waldmann,
Nicole Richter, Friederike Knoche, Ingo Scholten und Hong Gang Hu, waren nicht nur
Mitstreiter und oft genug Leidensgenossen im wissenschaftlichen Sinne, sondern schafften
auch eine einzigartig freundschaftliche Atmosphäre. Dies wird mir sehr fehlen. Nicole und Tanja
sei ganz besonders für die wunderbare Zusammenarbeit im „Mutanten“-Projekt und bei den
unzähligen Reinigungen gedankt. Bei Tanja möchte ich mich noch ganz herzlich für die
unermüdliche Hilfe, die Durchsicht dieses Manuskripts und für die vielen aufmunternden Worte,
gerade am Schluss dieser Arbeit, bedanken.
Martina Baack, die immer ein offenes Ohr für mich hatte, möchte ich für die vielen
methodischen Tipps und für die vielen fruchtbaren Diskussionen danken, ohne die einiges nicht
so gut geklappt hätte.
Catalina Damoc gebührt ein großer Dank für die Durchführung der Massenspektrometrie.
Ein weiterer Dank geht an Monika Kulartz und Daniel Schaarschidt, die beide immer sehr
hilfsbereit waren und gerade am Schluss viel Geduld bei der Durchsicht des Manuskriptes
aufgebracht haben.
Allen anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe, die namentlich nicht erwähnt wurden, möchte ich
an dieser Stelle für die große Hilfsbereitschaft und das Miteinander danken. So trug jeder
einzelne ein Stück zu dieser Arbeit bei.
Bei Anita Krebs, die ein Jahr in unserer Gruppe verbrachte, möchte ich mich für den großen
Enthusiasmus für die Problembewältigung des Baculovirus-Systems bedanken.
Bei Sonja von Aulock möchte ich mich für die Einführung in die FACS-Messung bedanken.
Ein Dankeschön geht hier auch an New England Biolabs, ohne deren „λ-Phosphatase“ die
meisten hier gezeigten Daten nicht zustande gekommen wären.
Meinen „Mädels“ möchte ich ebenfalls einen Dank aussprechen für die vielen unschlagbaren
„Konstanzer“-Nächte, den unzähligen Erörterungen über das Leben und die Welt und für das
„ichsein-dürfen“. Karina möchte ich hier einen besonderen Dank aussprechen, denn „du bist
nicht alles, aber ohne dich ist alles nichts“.
Danke auch an Alex und Nino, die die Zeit in Konstanz mit so manch unvergesslichen Stunden
gefüllt haben.
Meiner WG und der Nachbarin möchte ich für die schöne Zeit danken und für die vielen kleinen
wundervollen Gesten, die mir entgegengebracht wurden.
Auch wenn ich im Laufe dieser Arbeit neben Höhen auch so manche Tiefen durchschritten
habe, so entschädigte doch jedes Ergebnis vielfach und ließ die Freude an dieser
faszinierenden Wissenschaft nie untergehen.
Sehr schmerzlich war der Verlust meiner Oma, die die Fertigstellung dieser Arbeit leider nicht
mehr miterleben durfte.
Der letzte Dank an dieser Stelle gebührt meinen Eltern, die, obwohl nicht immer glücklich mit
meinem eingeschlagenen Lebensweg, doch immer kompromisslos hinter mir standen und sich
meist mehr gefreut und meist mehr gelitten haben als ich selber. Ich bin unendlich froh, euch zu
haben. Diese Arbeit widme ich euch. Danke, euer Nondi.
Inhaltsverzeichnis
IV
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis:
1
Einleitung
1.1
Der Zellkern
IV
VIII
10
10
1.2
Chromatin
1.2.1
Hierarchische Organisation des Chromatins
1.2.2
Histone
12
13
15
1.3
Modifikation der Chromatinstruktur
1.3.1
Posttranslationale Modifikation der Histone
1.3.2
Nicht-Histon-Proteine: HMG Proteine
1.3.2.1
HMGB (HMG-1/-2)
1.3.2.2
HMGA (HMGY/I)
1.3.2.3
HMGN (HMG14 / -17)
1.3.3
Chromatinremodeling
16
17
19
20
21
22
23
1.4
Das DEK-Protein
1.4.1
Entdeckung
1.4.2
Eigenschaften
1.4.3
Subzelluläre Lokalisation und Zellzyklusverhalten
1.4.4
Topologieveränderung und DNA-Bindung
1.4.5
Interaktion mit anderen Proteinen
1.4.5.1
Interaktion AP-2α, einem Transkriptionsaktivator
1.4.5.2
Interaktion mit Daxx, einem Transkriptionsrepressor
1.4.5.3
Interaktion mit LANA
24
24
25
26
27
28
28
28
29
2
Zielsetzung
30
3
Material und Methoden
31
3.1
Material
31
3.2
Allgemeine Lösungen
33
3.3
Allgemeine Methoden
35
3.3.1
SDS-Polyacryalmid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
35
3.3.2
Coomassie Färbung und Silber Färbung von Polyacrylamid Gelen
35
3.3.3
Western-Blot und Immunfärbung (Immunblot)
35
3.3.4
Proteinfällung nach Wessel und Flügge (1984)
36
3.3.5
Agarosegelelektrophorese
36
Inhaltsverzeichnis
3.3.6
3.3.7
V
DNA Fällung
Plasmid-Präparation und Cäsiumchlorid Reinigung
36
37
3.4
Baculovirus-System und Proteinreiniung
3.4.1
Klonierung von His-DEK
Ko-Transfektion und Plaque-Assay
3.4.2
Infektion, Reinigung und Dephosphorylierung von His-DEK und
His-DEK Deletionsmutanten
37
37
38
3.5
Antikörperproduktion und Reinigung
42
3.6
SV40
3.6.1
Präparation von SV40-DNA
3.6.2
Präparation von SV40-Minichromosomen
44
44
44
3.7
Topologieassay (DEK Assay)
45
3.8
DNA-Bandshiftassay (EMSA)
45
41
3.9
Zellkultur, Synchronisation, Radioaktive Markierung mit [32P]Orthophosphat und [35S]-Methionin (Pulse- und Pulse Chase
Experimente), S-20 Extrakte, Hancock-Chromatin und
Immunpräzipitation
3.9.1
HeLa und CV1 Zellen
3.9.2
Insektenzellen
3.9.3
Synchronisation und in vivo Pulse-Markierung mit [32P]Orthophosphat und [35S]-Methionin
3.9.4
FACS Analyse
3.9.5
Herstellung von Hanckock Chromatin
3.9.6
Immunpräzipitation
3.9.7
Herstellung von S-20 Extrakten
46
47
47
48
49
3.10
In Vitro Phosphorylierung
49
3.11
In-Gel-Kinaseassay
50
3.12
Filter-Bindungs-Assay
50
3.13
South-Western-Analysen
51
3.14
Zellfraktionierung
51
3.15
Mikrokokken Nuklease Verdau
52
3.16
Sucrose-Dichtengradientenzentrifugation
53
3.17
RNA-Präparation, Reverse Transkription und Real Time PCR
53
3.18 Massenspektrometrie
3.18.1 In-Gel-Verdau
3.18.2 Triple-Quadrupole-Ion-Trap-Massenspektrometrie
3.18.3 Datenbank-Suche und Kennzeichnung der Phosphopeptide
45
45
46
54
54
54
55
Inhaltsverzeichnis
4
Ergebnisse
4.1
Biochechemische Charakterisierung von DEK in vivo
4.1.1
DEK mRNA während des Zellzyklus
4.1.2
Neusynthese des DEK-Proteins während des Zellzyklus
4.1.3
Halbwertszeit des DEK-Proteins in vivo
4.1.4
DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert
VI
56
56
56
57
59
60
4.2
Expression, Reinigung und Charakterisierung von
rekombinantem His-DEK mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystem
62
4.2.1
His-DEK aus dem Baculovirus-System ist hoch phosphoryliert 63
4.3
Charakterisierung der DEK-Phosphorylierung
4.3.1
Phosphorylierung von DEK in vitro mit Zellextrakten
4.3.2
Potenzielle DEK-phosphorylierende Kinasen und deren
Phosphorylierungsstellen
4.3.3
DEK wird durch die Protein-Kinase CK2 in vitro und in vivo
phosphoryliert
4.3.3.1
Filter-Bindungsassays mit gereinigten Kinasen
4.3.3.2
„In-Gel-Kinaseassay“
4.3.3.3
Inhibition der DEK-Phosphorylierung mit TBB, einem hoch
spezifischen CK2-Inhibitor
4.3.3.4
Kartierung der CK2-Phosphorylierungsstellen in der DEKAminosäuresequenz
65
65
67
68
68
69
71
74
4.4
Funktionelle Domänen des DEK-Proteins
77
4.4.1
Nur dephosporyliertes His-DEK führt, wie GST-DEK, zur Bildung
80
einer Topoisomerleiter und bindet an DNA
4.4.2
Dephosporyliertes His-DEK bindet wie GST-DEK an SV40
Minichromosomen
81
4.4.3
DNA-Bindung und Toplologierveänderung von DEK und DEK83
Deletionsmutanten
4.4.4
Das SAF-Box enthaltende Fragment 87-187 bindet DNA
83
4.4.5
Das SAF-Box-Fragment (87-187) ist für die Topologieveränderung
verantwortlich
85
4.4.6
Identifizierung einer zweiten DNA-Bindedomäne (270-350) des
DEK-Proteins
86
4.5
Biochemische Aspekte der DEK-Phosphorylierung
4.5.1
DEK-Multimerisierung und Phosphorylierung
4.5.2
Effekte der CK2-Phosphorylierung auf die DEK-DNA-Bindung.
4.5.3
Einfluss der CK2-Phosphorylierung auf die Aktivität der beiden
DEK-DNA-Bindedomänen?
4.5.4
Effekte der CK2-Phosphorylierung auf die DEK-ChromatinInteraktion
88
88
91
94
96
Abbildungsverzeichnis:
4.5.4.1
Eine stärkere Phosphorylierung in der G1-Phase des
Zellzyklus führt zu keiner Lokalisationsänderung von DEK
4.5.5
Wie wird phosporyliertes DEK an Chromatin gebunden?
4.6
5
VII
101
103
DEK ist nur phosphoryliert auf Hancock-Chromatin zu finden 107
Diskussion
109
5.1
DEK-mRNA, DEK-Neusynthese und Halbwertszeit von DEK in
110
HeLa Zellen
5.2
DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert
112
5.2.1
Kann eine erhöhte Phosphorylierung von DEK alleine durch die
115
CK2 hervorgerufen werden?
5.3
DEK – ein Protein mit mehreren Modulen
117
5.3.1
Das SAF-Box enthaltende Fragment (87-187) des DEK-Proteins
ist für die DNA-Bindung und für die Topologieveränderung verantwortlich.
117
5.3.2
Der Bereich 270-350 stellt eine zweite DNA-Bindedomäne von
DEK dar
122
5.4
Phosphorylierung durch die Protein Kinase CK2 – Regulation der
DEK-Funktion ?
123
5.4.1
Einfluss der CK2-Phopshorylierung auf die DEK-Chromatin125
Bindung
5.4.2
DEK bleibt in vivo auch im phosphorylierten Zustand mit
Chromatin assoziiert.
127
5.4.3
Regulation der DNA-Bindung und Multimerisierung von DEK
127
durch die CK2- ein Modell
6
Zusammenfassung
130
7
Literatur
131
8
Abkürzungen
139
Abbildungsverzeichnis:
VIII
Abbildungsverzeichnis:
Abbildung 1-1 Subkompartimentierung des Nukleus
11
Abbildung 1-2 Modellvorstellung der Genomorganisation
12
Abbildung 1-3 Das Nukleosom
14
Abbildung 1-4 Hierarchische Organisation von Chromatin
15
Abbildung 1-5 Die „Core“-Histone
16
Abbildung 1-6 Modifikationen von Histon H3 und H4
18
Abbildung 1-7 Die „histone-code“-Hypothese
19
Abbildung 1-8 Die HMG-Proteine
20
Abbildung 1-9 Domänen des humanen DEK-Proteins
25
Abbildung 3-1 pBlueBacHis2
38
Abbildung 3-2 Prinzip der homologen Rekombination zur Gewinnung von
rekombinanten Viren
40
Abbildung 3-3 „Plaque“-Assay
41
Abbildung 3-4 Reinigung über Ni-NTA-Agarose
42
Abbildung 4-1 DEK m-RNA während des Zellzyklus
57
Abbildung 4-2 Neusynthese von DEK während des Zellzyklus
58
Abbildung 4-3 Halbwertszeit von zellulärem DEK
60
Abbildung 4-4 Phosphorylierung von DEK in vivo
62
Abbildung 4-5 Reinigung von wtHis-DEK aus dem Baculovirus-System
63
Abbildung 4-6 His-DEK wird phosphoryliert exprimiert
64
Abbildung 4-7 In vitro Phosphorylierung von DEK
66
Abbildung 4-8 Potenzielle Phosphorylierungsstellen von DEK
67
Abbildung 4-9 Filterbindungs-Assay mit gereinigten Kinasen
68
Abbildung 4-10 „In-Gel-Kinaseassay“
69
Abbildung 4-11 Filterbindungs-Assay und Inhibition der CK2 durch TBB
72
Abbildung 4-12 Inhibition der DEK-Phosphorylierung durch Einstz von TBB in
vitro und in vivo
73
Abbildung 4-13 Kartierung von CK2-Phosphorylierungsstellen durch ESI-MS 75
Abbildung 4-14 Identifizierte Peptide und Gesamtabdeckung
76
Abbildung 4-15 Schematische Darstellung aller klonierten und überexprimierten
78
DEK-Deletionsmutanten
Abbildung 4-16 Darstellung einer Auswahl an gereinigten Deletionsmutanten
aus dem Baculovirus-System
79
Abbildung 4-17 EMSA, South-Western und Topologieassay mit wtHis-DEK 81
Abbildung 4-18 Bindung von unbehandeltem und dephosphoryliertem His-DEK
an salzgewaschene SV40 Minichromosomen
82
Abbildung 4-19 EMSAs mit wt-His-DEK und verschiedenen DEK
Deletionsmutanten
84
Abbildung 4-20 Topologieassay mit verschiedenen DEK-Deletionsmutanten 86
Abbildungsverzeichnis:
IX
Abbildung 4-21 EMSA mit C-terminalen DEK Fragmenten
87
Abbildung 4-22 Sedimentationsanalyse und native Gelelektrophorese von
phosphoryliertem und dephosphoryliertem His-DEK
90
Abbildung 4-23 Sedimentationsverhalten von DEK in einer CK291
Phosphorylierungszeitreihe
Abbildung 4-24 Phosphorylierung durch die Protein Kinase CK2 inhibiert die
93
DEK-DNA Bindung
Abbildung 4-25
93
Abbildung 4-26 EMSAs mit CK2-phosphorylierten DEK-Fragmenten
95
Abbildung 4-27 Mikrokokken-Nuklease Verdau von SV40-Minichromosomen 97
Abbildung 4-28 Interaktion von dephosphoryliertem und phosphoryliertem His99
DEK mit salzgewaschenen SV40-Minichromosomen
Abbildung 4-29 Gereinigte CK2 phosphoryliert endogenes, nukleosomal
100
gebundenes DEK
Abbildung 4-30 Zellfraktionierung von G1-Phase-Zellen
102
Abbildung 4-31 Assoziation von dephosphoryliertem und phosphoryliertem HisDEK mit nativen Oligonukleosomen
105
Abbildung 4-32 Hancock-Chromatin-Präparation
108
Abbildung 5-1 Funktionelle Domänen des DEK-Proteins
123
Abbildung 5-2 Modell einer möglichen Regulation der DEK-Funktion durch CK2128
Phosphorylierung
1
Einleitung
1.1
Der Zellkern
Der Zellkern setzt das Prinzip der Kompartimentierung der eukaryotischen Zelle
durch die Existenz einer Kernhülle um. Dies ist einer der fundamentalsten
Unterschiede zur prokaryotischen Zelle. Die Kernhülle besteht aus zwei LipidDoppelschichten, von denen die äußere kontinuierlich in das Membransystem
des Endoplasmatischen Retikulums übergeht, während die andere sich zum
Kerninneren hin orientiert. Die Kernmembran ist durch Kernporenkomplexe
durchspannt, die den Transport von Makromolekülen von und in den Kern
regulieren (z.B. (Adam, 2001) und damit den Informationsaustausch zwischen
Kern und Cytoplasma ermöglichen. Der Kern wird durch ein Geflecht von
Intermediärfilamenten beweglich in der Zelle verankert. Die innere Stabilität wird
durch die Kernlamina, die auch den Ab- und Wiederaufbau während der
Kernteilung reguliert, vermittelt (Vlcek et al., 2001; Gruenbaum et al., 2003). Die
Kernlamina ist auch an vielen anderen Prozessen regulierend beteiligt.
Trotz der hohen Dichte an Proteinen, DNA und RNA im Zellkern, muss ein
geordneter und regulierter Ablauf aller genetischen Prozesse ermöglicht
werden. Dies wird, nach Meinung vieler Autoren, durch eine weitere
Subkompartimentierung des Nukleus erreicht. Das am längsten bekannte
Subkompartiment des Nukleus ist der Nukleolus, der den Ort der rRNASynthese und des Ribosomenzusammenbaus darstellt (Scheer and
Weisenberger, 1994). Eine weitere funktionelle Kompartimentierung erfolgt
durch die Chromosomen Territorien. Jedes Chromosom nimmt, seinem DNAGehalt folgend, ein bestimmtes, nicht überlappendes Territorium im Zellkern ein
(Lichter et al., 1988), welches wiederum in sogenannte subchromosomale Foci
untergliedert ist. Aktive Gene oder aktive Transkriptionseinheiten sind hierbei
auf der Oberfläche, inaktive Gene eher im inneren Bereich zu finden (Croft et
al., 1999). In diesen Territorien lassen sich weitere Strukturen, die sogenannten
PcG-Körper finden, die Polycomb Proteine enthalten und dadurch
heterochromatische Bereiche darstellen (Saurin et al., 1998). Diese Bereiche
können mit der Kernlamina assoziiert sein. Die Bereiche zwischen den
Chromosomenterritorien werden durch das Inter-Chromatin-DomänenKompartiment (ICD) ausgefüllt (Bridger et al., 1998). Dieses „Kanalsystem“
umgibt die Territorien, durchspannt sie teilweise und dient als Transportweg für
Makromoleküle (z.B RNA) aus dem Kern. Pre-mRNA Spleißproteine kommen
gehäuft in den sogenannten „nuclear-speckles“ vor, wovon es pro Zelle etwa
25-50 gibt (Spector, 1993). Weitere verschiedene örtlich eingegrenzte
Einleitung
11
Strukturen wurden kollektiv als „nuclear-bodies“ bezeichnet (Grande et al.,
1997) (Gall, 2000), (Schul et al., 1996).
Die räumliche Trennung dieser Subkompartimente wird vermutlich über die
Assoziation oder Anheftung an die sogenannte Kernmatrix vermittelt. Die
Kernmatrix ist eine operational definierte Struktur, deren genaue
Zusammensetzung noch nicht erschöpfend bekannt ist. Sie kann durch
enzymatische Extraktion des Chromatins gewonnen werden und beinhaltet
Teile der Kernporenkomplexe, Überreste der Nukleoli und ein
dreidimensionales Netzwerk, das hauptsächlich aus heterogener RNA und
verschiedenen Proteinen besteht. Die RNA übt bei der Aufrechterhaltung der
faserigen Struktur eine wichtige Rolle aus (Xing and Lawrence, 1991),(He et al.,
1990). Behandelt man Zellen mit Transkriptionshemmstoffen führt dies zum
Zusammenbruch der Kernmatrix, was eine direkte Korrelation zwischen
Transkription und der Existenz der Kernmatrix vermuten lässt (Fey et al., 1986);
(Nickerson et al., 1989).
Abbildung 1-1 Subkompartimentierung des Nukleus
Der Nukleus ist eine mosaikartig zusammengesetzte Organelle, die durch die Kernhülle vom Cytoplasma
getrennt ist. Die größten Strukturen sind die Chromosomenterritorien, die durch die ICD-Domänen
voneinander getrennt werden. Weitere „Kompartimente“ sind schematisch dargestellt (entnommen aus
Architektur des Zellkerns (Fackelmayer, 2000).
Die Kernmatrix scheint daher im Interphase-Kern eine wichtige Rolle bei der
Organisation des Genoms und der subnuklearen Kompartimente zu haben
(Gasser et al., 1989).
Man geht davon aus, dass die Chromatinfasern in Schleifen von ca. 2000080000 bp organisiert sind. Es wird vermutet, dass jede Schleife, in vivo einen
funktionellen Abschnitt darstellt (Gasser et al., 1989). Die Chromatinschleifen
sind über SAR/MAR-Bereiche an die Kernmatrix gebunden. Die 200-3000 bp
Einleitung
12
langen SAR/MAR-Elemente zeichnen sich durch AT-Reichtum aus und
befinden sich meist außerhalb von kodierenden Regionen. Den SAR/MARBereichen wird eine Funktion bei der Aufrecherhaltung der Domänenorganistion
eukaryotischer Gene, bei der Transkriptionsaktivierung und bei der DNAReplikation zugesprochen. Häufig werden SAR/MAR-Elemente stromaufwärts
und -abwärts von transkribierten Genen oder Gengruppen gefunden oder liegen
in unmittelbarer Nähe von regulatorischen Sequenzen, wie Promotoren und
Enhancern (Blasquez et al., 1989; Bonifer et al., 1991). Als Beispiele für
SAR/MAR-bindende Proteine sind SAF-A (Romig et al., 1992a), Topoisomerase
II (Udvardy et al., 1985; Adachi et al., 1989), Histon H1 (Izaurralde et al., 1989),
Lamin B1, A und C (Luderus et al., 1994) bekannt.
Abbildung 1-2 Modellvorstellung der Genomorganisation
Die einzelnen Chromatinschleifen sind an ihrer Basis mit architektonischen Elementen, den SAR/MARBereichen, und über SAR/MAR-bindende Proteine an die Kernmatrix geheftet (entnommen aus: Die
Archtitektur des Zellkerns (Fackelmayer, 2000)
1.2
Chromatin
Die DNA, der Träger der genetischen Information aller Organismen, würde in
einer eukaryotischen Zelle im ausgestreckten Zustand eine Länge von etwa
zwei Meter in Anspruch nehmen. Diese langen Moleküle müssen nicht nur in
einem Zellkern von 10-5 m Durchmesser Platz finden, sondern auch in einer
hoch organisierten Art und Weise gelagert werden, die verschiedenste
Prozesse, wie Transkription, DNA-Replikation, DNA-Reparatur und DNARekombination ermöglichen. Dies wird durch eine Kompaktierung der DNA in
verschieden stark kondensierten Schleifen erreicht. Diesen lichtmikroskopisch
deutlich anfärbbaren Nukleoproteinkomplex nennt man Chromatin. Neben den
Einleitung
13
Histonen, den am häufigsten vorkommenden Proteinen im Chromatin, sind
noch
eine
Vielzahl
anderer
Proteine,
wie
Nicht-Histon-Proteine,
Transkriptionsfaktoren und Topoisomerasen mit diesem assoziiert. Chromatin
ist eine hochdynamische Struktur, die verschiedensten Veränderungen,
abhängig von dem funktionellen Status der Zelle, unterliegt.
1.2.1
Hierarchische Organisation des Chromatins
Chromatin ist in drei verschiedene Ebenen organisiert, wobei Histon H1
entscheidend
an
der
Entstehung
und
Aufrecherhaltung
höherer
Chromatinstrukturen beteiligt ist. Das Nukleosom stellt den kleinsten
strukturellen Baustein des Chromatins und gleichzeitig die erste
Kompaktierungsstufe dar. Ein Nukleosom besteht aus einem Histonoktamer,
um das 146 bp DNA in 1,75 linksgängigen Windungen gewunden sind. Histone
sind kleine basische Proteine auf die in Kapitel 1.2.2 eingegangen wird. Durch
die Bindung eines Histons H1-Moleküles an die Ein- und Austrittsstelle des
Nukleosoms wird dieses zum Chromatosom vervollständigt. Hier sind nun 168
bp DNA in zwei vollen Windungen zu finden (Thoma et al., 1979; Thoma, 1988).
Das Histonoktamer besteht aus je zwei H2A/H2B Dimeren und einem H3/H4
Tetramer, die zusammen die „Core“-Histone bilden. Im Nukleosem wird je ein
H3/H4-Tetramer beidseitig von einem H2A/H2B-Dimer flankiert. Verbunden
werden die einzelnen Nukleosomen durch die „Linker“-DNA, einem kurzen
Stück DNA, die je nach Organismus und Zelltyp zwischen 0 und 120 bp
variieren kann (Richmond, 1984; Luger et al., 1997).
Einleitung
14
Abbildung 1-3 Das Nukleosom
A. Modell des Chromatosoms, bestehend aus dem „Histonoktamer-Kern“ und zwei vollen Windungen der
DNA (168 bp), die von einem Molekül H1 an der Ein- und Austrittstelle stabilisiert werden (aus Knippers, 6
Auflage, Thieme Verlag).
B. Darstellung der 4 „core“-Histone, Struktur, Faltung und Interaktionen sind vereinfacht dargestellt. DNA
wird durch einen weißen Schlauch symbolisiert. (a) “Core“-Histon Oktamer; (b) Nukleosomen–„Core“
Partikel in der Seitenansicht, mit 1.75 DNA-Windungen um das Oktamer; (c) Nukleosomen–„Core“
Partikel, Ansicht um 90° gedreht; (d) Lage der flexiblen N-terminalen Domönen der „Core“-Histone,
Ansicht wie in (b); (e) Aufsicht auf die Struktur (aus (Smith, 1991).
Die nukleosomale Verpackung der DNA wird als „10 nm“-Faser oder auch als
Perlenkettenstruktur („beads on a string“) bezeichnet und führt zu einer
Kompaktierung um den Faktor 6-7, im Vergleich zu proteinfreier DNA. Mit
Bindung von Histon H1 an die Ein- und Austrittstelle des Nukleosoms, bildet
sich die sogenannte „30 nm“-Faser aus, bei der sich 6-8 Nukleosomen
aufspiralisieren. Histon H1 befindet sich bei diesem sogenannten
Solenoidmodell im Inneren der Helix. Diese zweite Kondensationsstufe führt zu
einer Kompaktierung um den Faktor 40. Eine weitere Kompaktierung um den
Faktor 600-800 wird durch die Anheftung der 30 nm-Faser über SAR/MAR-
Einleitung
15
Bereiche an die Kernmatrix vermittelt (Wolffe, 1998). Dabei entstehen die in
Abbildung 1-2 beschriebenen Schleifen.
Abbildung 1-4 Hierarchische Organisation von Chromatin
Organisation von Nukleosomen in Chromatin. Die „core“-Histone bilden zusammen mit 146 bp DNA das
Nukleosom. Es ensteht eine Perlenkettenstruktur („10 nm“-Faser), die durch die Bindung von H1 und unter
bestimmten Salzbedingungen zu der „30 nm“-Faser kondensiert (Solenoid-Struktur), wobei H1 immer zur
zentralen Helix hin gerichtet ist. Die 30nm Faser spiralisiert sich weiter auf, bildet Schleifen die über die
Kernmatrix angeheftet werden können. Rechts, Metaphase-Chromosom. (aus Schiessel, www.mpipmainz.mpg.de/~heli ).
1.2.2
Histone
Die Histone, kleine basische Proteine, bilden den Proteinbestandteil des
Nukleosoms. Sie liegen im Massenverhältnis 1:1 zur DNA vor und sind die
evolutionär am höchsten konservierten Proteine. Histone bestehen aus zwei
Proteindomänen, einer globulären und ein- bis zwei flexiblen N- oder Cterminalen Armen (Abbildung 1-5).
Die Histone H3 (135 aa, 15 kDa) und H4 (102 aa, 11,2 kDa) sind am höchsten
konserviert. Sie unterscheiden sich an nur vier bzw. zwei Stellen zwischen Tierund Pflanzenzellen. Beide weisen einen hohen Anteil an Arginin auf (13 bzw. 14
%).
H2A (129 aa, 13.9 kDa) und H2B (125 aa, 13.7 kDa) sind weniger stark
konserviert und haben einen höheren Anteil an Lysin (11 bzw. 16 %).
H1, das „Linker" Histon, ist das größte (210-230 aa, 22.5 kDa) und zugleich am
wenigsten konservierte Histon. Es hat einen sehr hohen Anteil an Lysin (29%).
Einleitung
16
Im C-terminalen Bereich der „Core“-Histone liegt die „Histone-fold“-Domäne, die
maßgeblich an den Wechselwirkungen der Histone untereinander, sowie an der
DNA-Bindung beteiligt ist. Diese Domäne besteht aus einer zentral gelegenen
großen α-Helix, an die beidseitig jeweils eine kleinere α-Helix angeschlossen
ist. Hierbei dient die große α-Helix als Dimerisierungsdomäne, mit deren Hilfe
H3 mit H4 sowie H2A mit H2B Heterodimere ausbilden können. Die Kontakte
der Histone mit der DNA erfolgt über Argininreste, die eine elektrostatische
Wechselwirkung mit dem Phosphatrückgrat der DNA-Doppelhelix eingehen
(Pruss et al., 1995; Luger et al., 1997)
Die N- und C-terminalen flexiblen Arme der Histone sind an der Ausbildung von
höheren Chromatinstrukturen durch Wechselwirkungen mit benachbarten
Nukleosomen beteiligt (Luger et al., 1997). Darüber hinaus sind sie
Angriffspunkte für posttranslationale Modifikationen, die eine wichtige Rolle bei
der Genregulation spielen.
Abbildung 1-5 Die „Core“-Histone
Schematische Darstellung der „Core“-Histone und des „Linker“-Histons H1. Alle Histone bestehen aus
einer zentralen, globulären Domäne und flexiblen Armen mit einem hohen Anteil der basischen
Aminosäuren Arginin (R) und Lysin (K). N, aminoterminales Ende. (aus Knippers 2001).
1.3
Modifikation der Chromatinstruktur
Chromatin ist eine hochdynamische Struktur, die durch mannigfaltige
Modifikationen auf veränderte Anforderungen in der Zelle reagieren muss. Die
Chromatinstruktur spielt bei allen DNA-abhängigen Prozessen wie Replikation,
Einleitung
17
Transkription, Rekombination und Reparatur eine Rolle und greift regulierend in
diese Prozesse ein. Neben den regulatorischen DNA-Sequenzen spielt die
Veränderung der Chromatinstruktur eine immer bedeutendere Rolle.
Mechanismen wie posttranslationale Modifikation der Histone oder Austausch
der „Core“-Histone durch spezialisierte, funktionsspezifische Varianten,
Chromatinremodeling, und Chromatinsilencing ermöglichen durch strukturelle
und funktionelle Veränderungen eine gerichtete Antwort auf veränderte
Situationen in der Zelle.
1.3.1
Posttranslationale Modifikation der Histone
Zu
posttranslationalen
Veränderungen
der
Histonarme
gehören
Phosphorylierung (Serin/Threonin), Acetylierung (Lysine), Ubiquitinierung
(Lysin), Sumoilierung (Lysin), ADP-Ribosylierung (Glutaminsäure) und die
Methylierung (Lysine, Arginin).
Die bisher am besten untersuchte Modifikation ist die reversible
Acetylierung/Deacetylierung von bis zu 4 ε-Aminogruppen an Lysinresten der
N-terminalen Domänen von H3 und H4 (Grunstein, 1997). Jede eingeführte
Acetylgruppe neutralisiert eine positive Ladung und schwächt somit die Bindung
des Histons an das negativ geladene DNA-Rückgrat ab. Dies führt zu partiellen
Auflockerungen im Nukleosom, die eine erleichterte Zugänglichkeit für
Transkriptionsfaktoren an diesen Bereich ermöglichen. Tatsächlich sind die
Histone
in
transkriptionsaktiven
Chromatinbereichen
hyperacetyliert,
wohingegen die Histone in inaktiven Bereichen hypoacetyliert sind (Grunstein,
1997). Die reversible Acetylierung/Deacetylierung wird durch die EnzymFamilien der Histon-Acetyltransferesen (HATs) und durch die HistonDeacetylasen (HDACs) vermittelt (Marmorstein, 2001; Marmorstein and Roth,
2001). Die Acetylierung der „Core“-Histone beeinflusst auch die
Wechselwirkung des Histons H1 mit dem Chromatin. In hyperacetylierten
Bereichen des Genoms ist die H1 Menge deutlich erniedrigt (Ridsdale et al.,
1990).
Neben der Acetylierung werden die Histone auch an Serinen und Threoninen
phosphoryliert (Abbildung 1-6), was funktionelle Konsequenzen in der Mitose, in
der Chromosomenkondensation und auf die transkriptionelle Aktivität hat.
Beispielsweise wird Histon H1 zellzyklusabhängig phosphoryliert, wobei das
Maximum in der Mitose erreicht wird (Roth and Allis, 1992);(Bradbury et al.,
1974). Die Phosphorylierung scheint auch eine Rolle bei der Regulation anderer
Histon-Modifikationen zu haben. So ist z.B. die Phosphorylierung von S10 des
Histons H3 eine Voraussetzung für die Acetylierung von K14.
Die Methylierung von Histonen wird von Histon-Methyl-Transferasen
(HMTasen) durchgeführt. Histon H3 kann an fünf Lysinen (K4, K9, K27, K36,
K79) methyliert werden, wobei bisher nur eine Stelle bei H4 (K20) bekannt ist.
Einleitung
18
Methylierte Histone werden sowohl in aktiv transkribierten Genen, wie auch in
stillen Regionen gefunden. Zum einen wurde die H3-K4-Methylierung in aktiven
Genen, die H3-K9-Methylierung hingegen in inaktiven Genen beobachtet
(Übersicht in (Kouzarides, 2002), wobei der Methylierungsstatus eine weitere
wichtige Rolle spielt. So konnte gezeigt werden, dass trimethyliertes K4 in H3,
in aktiven Genen und dimethyliertes K4 in aktiven und inaktiven Genen zu
finden ist (Santos-Rosa et al., 2002). Die Methylierung von Argininen in H3 und
H4 ist mit transkriptionsaktiven Bereichen assoziiert und erleichtert die weitere
Acetylierung (Zhang and Reinberg, 2001).
Ubiquitinierung von Histonen hat einen positiven Effekt auf die Transkription,
wohingegen Sumoilierung von H4 eine Rolle bei der transkriptionellen
Repression spielt (Shiio and Eisenman, 2003; Zhang, 2003).
Abbildung 1-6 Modifikationen von Histon H3 und H4
Darstellung der posttranslationalen Modifikation von H3 und H4. Dargestellt ist die Aminosäuresequenz
der N-terminalen Arme. Acetylierung ist als grünes, Phosphorylierung als weißes und Methylierung als
gelbes Symbol dargestellt. (Aus (Strahl and Allis, 2000)
Die Histon-Modifikationen verändern also die Wechselwirkung von Histonen
und DNA auf elektrostatischer Ebene, wie beispielsweise für die Acetylierung
und Phosphorylierung gezeigt werden konnte. Andererseits ist dies nicht zu
verallgemeinern, da dieselbe Modifikation (z.B. Methylierung) zum einen mit
aktiven und zum anderen mit inaktiven Genen in Zusammenhang gebracht
werden konnte. Dies führte zur sogenannten „Histon-Code-Hypothese“, die
besagt, dass sich die Histonmodifikationen nicht ausschließlich auf die
Chromatinstruktur auswirken. Vielmehr werden durch die Modifikationen
Regulatoren rekrutiert, die ihrerseits die Chromatinstruktur weiter verändern.
(Strahl and Allis, 2000; Jenuwein and Allis, 2001). In Abbildung 1.7 sind die
bisher bekannten kombinatorischen Modifikation dargestellt und, wenn bekannt,
die Proteine/Proteinkomplexe die diese Modifikation spezifisch erkennen, und
die dadurch implizierte Funktion (Abbildung 1.7, weitere Übersicht in
(Khorasanizadeh, 2004).
Einleitung
19
Abbildung 1-7 Die „histone-code“-Hypothese
Dargestellt sind verschiedene gefundene posttranslationale Modifikationen, ihre Funktion und die
Rekrutierung von Protein-Komplexen. CENP-A ist eine Zentromer-spezifische H3 Form.(Wolffe, 1995)
(aus (Strahl and Allis, 2000)
Gesamtheitlich werden alle kombinatorischen Modifikationen der Histone und
die dadurch implizierte Funktion als Epigenetik bezeichnet. Hier fließt auch die
DNA-Methylierung an CpG-Inseln ein. Methylierung an Histonen und DNA führt
auch zu dem sogenannten „genomic-imprinting“, Modifikationsarten, die von
Generation zu Generation weitervererbt werden (Bird et al., 1998) (Lachner and
Jenuwein, 2002); (Lachner et al., 2003).
1.3.2
Nicht-Histon-Proteine: HMG Proteine
Einen weiteren Einfluß auf die Chromatinstruktur stellt die Einlagerung von
Nicht-Histon-Proteinen dar.
Zur Gruppe der Nicht-Histon-Proteine zählen alle Proteine, die an Chromatin
binden, aber nicht zur Klasse der Histone gehören, wie z.B
Transkriptionsfaktoren, Polymerasen und Topoisomerasen, deren Mengen vom
Zelltyp abhängig sind.
Eine Gruppe der Nicht-Histon-Proteine, die in verschiedenen Zelltypen ubiquitär
und in konstanten Menge zu finden sind, sind die klassischen High-MobilityGroup-(HMG)-Proteine. Sie erhielten ihren Namen durch ihre hohe
gelelektrophoretische Mobilität (10-30 kDa). Die Einteilung erfolgt aufgrund ihrer
DNA-Bindemotive (Bustin, 2001).
Einleitung
20
Die Gruppe der klassischen HMG-Proteine setzen sich aus den HMGBs (alter
Name:HMG-1/-2), den HMGAs (alter Name: HMG-I/-Y) und HMGNs (alter
Name: HMG-14/-17) zusammen (siehe Abbildung 1-8).
Abbildung 1-8 Die HMG-Proteine
Die Familie der klassischen HMG-Proteine und die HMG-Motiv-Proteine mit neuer und alter Nomenklatur.
Das funktionelle Motiv, das die Klassenzugehörigkeit bestimmt, ist angegeben.
1.3.2.1 HMGB (HMG-1/-2)
Die HMG-1-Domäne (HMG-Box) ist das funktionelle Motiv der größten
Unterfamilie der HMG-Proteine. HMGB-Proteine weisen zwei unabhängige
HMG-1-Domänen (HMG1 A und B Box) auf, die für die sequenzunspezifische
DNA-Bindung verantwortlich sind. Eine saure Domäne im C-terminalen Bereich
vermittelt Proteininteraktionen und modelliert die DNA-Bindung. Die HMG-1Domäne besteht aus etwa 80 Aminosäuren, die eine gedrehte L-förmige,
homolog gefaltete Domäne aus drei α-Helices bildet. Die Konservierung der
HMG-1-Domänen beruht eher auf dieser Struktur als auf der
Aminosäuresequenz. Die DNA-Bindung erfolgt ausschließlich an der kleinen
Rinne der DNA durch interkalierende, hydrophobe Aminosäuren. Dies führt zu
einer teilweisen Entwindung der DNA und dadurch zu einer Erweiterung der
kleinen Rinne. Die HMGB-Proteine binden mit einer geringen Spezifität an B-
Einleitung
21
Form DNA, haben allerdings eine hohe Affinität für ungewöhnliche DNAFormen, wie kreuzförmige, gebogene und supergecoilte DNA. Die Bindung an
relaxierte Plasmid-DNA führt in vitro zu einer Einführung von Supercoils.
HMGB-Proteine können durch Transkriptionsfaktoren rekrutiert werden, führen
in
diesen
Bereichen
zu
DNA-Strukturveränderungen,
die
eine
Transkriptionserleichterung darstellen, und verlassen dann diese Stelle wieder.
Deshalb werden die HMGB-Proteine als „Architektur-Transkriptionsfaktoren“
oder „Chromatin-Chaperone“ bezeichnet. Durch ihre hohe Mobilität im Zellkern
werden sie auch „an architekt for hire“ bezeichnet. Interaktionen, sowohl mit
Proteinen als auch mit DNA, sind immer transient und von sehr kurzer Dauer.
HMGB spielen so wie die HMGAs eine Rolle in der „Enhancosome“ Ausbildung,
jedoch sind bis jetzt nur einige „B-Enhancosomen“ bekannt, was durch die
transiente Bindung erklärt werden könnte. (entnommen aus (Agresti and
Bianchi, 2003).
Für die V(D)J-Rekombination konnte in vivo gezeigt werden, dass die HMGvermittelte DNA-Biegung eine Erleichterung darstellt (Aidinis et al., 1999). In
vitro konnte für HMGB1 nachgewiesen werden, dass durch die DNA-biegende
Eigenschaft das „Nukleosomen-Sliding“ durch ACF/CHRAC erleichtert wird
(Bonaldi et al., 2002).
1.3.2.2 HMGA (HMGY/I)
Die humanen HMGA-Proteine bestehen aus vier Mitgliedern, HMGA1a,
HMGA1b HMGA1c und HMGA2, und zeichnen sich durch die Anwesenheit von
drei identischen, jedoch unabhängigen DNA-bindenden AT-Hooks und einem
sauren C-terminalen Bereich aus. Das positiv geladene AT-Hook-Motiv besteht
aus neun Aminosäuren, wobei die Aminosäuren Prolin-Arginin-Glycin-ArgininProlin die Kernsequenz bilden, die von einer bestimmten Anzahl an Lysinen und
Argininen umringt wird, was wiederum einen Einfluss auf die Bindung ausübt
(Reeves and Nissen, 1990; Aravind and Landsman, 1998). Die Kernsequenz ist
in allen AT-Hook-Proteinen evolutionär hoch konserviert. Eine Bindung mit dem
AT-Hook erfolgt an der kleinen Rinne der DNA und führt zu
Strukturveränderungen des gebundenen Bereiches. Die bevorzugte Bindung
erfolgt an AT-reiche DNA-Sequenzen (AA(T/A)T). Wie die HMGBs auch, binden
die HMGAs bevorzugt an ungewöhnliche DNA-Formen, wie kruziform,
supergecoilte, gebogene und nukleosomale DNA-Formen. Durch eine Bindung
von HMGA-Proteinen werden die DNA-Bereiche je nach Ausgangssituation
gebogen, begradigt, aufgewunden oder Schleifen ausgebildet. In vitro können
HMGAs, wie die HMGBs, auch Supercoils in relaxierte Plasmid-DNA einführen.
Strukturveränderungen durch HMGAs sind ATP-unabhängig und erfolgen im
Gegensatz zu den HMGBs nicht durch Interkalation. Es wird vermutet, dass die
Veränderung durch das gleichzeitige Binden der drei AT-Hooks hervorgerufen
wird. HMGA-Proteine sind an der Formierung von sogenannten
Einleitung
22
„Enhancosomen“ beteiligt und spielen damit eine wichtige Rolle bei der
Expression von Genen. Sie können verschiedene Funktionen in diesen
Enhancosomen ausüben, die teilweise durch Protein-Protein-Interaktion, aber
hauptsächlich durch HMGA-DNA Interaktion, die zu einer DNA-Biegung führt,
vermittelt werden. Das am besten untersuchte Beispiel ist der IFN(Interferon)β-Promotor, wobei viele weitere Enhancosomen bekannt sind
(Übersicht in (Reeves and Beckerbauer, 2001).
Durch die Beteiligung der HMGA-Proteine an der Transkriptionskontrolle, der
Chromatinarchitektur, der DNA-Strukturveränderung und vielen anderen
Prozessen, sind die HMGA-Proteine hoch-multifunktionelle Proteine in der
Zelle.
1.3.2.3 HMGN (HMG14 / -17)
Die dritte HMG-Familie sind die HMGNs. Sie binden über die „NukleosomenBindungsdomäne“ (NBD) an Chromatin. Die NBD erstreckt sich über etwa 30
Aminosäuren und ist zweigeteilt. Der N-terminale Bereich ist hoch konserviert
und an Argininen angereichert, wobei der C-terminale Teil reich an Prolinen und
Lysinen ist. Mit dieser Domäne erkennen die HMGN-Proteine die Struktur des
Nukleosomenkerns (146 bp). Die HMGN-Familie besteht aus HMGN1 und
HMGN2. Beide stimulieren die Transkription und die Replikation von Chromatin,
doch nicht von proteinfreier DNA. Dies wird durch eine Dekompaktierung der
Chromatinstruktur erreicht, wobei der Mechanismus noch nicht genau
verstanden ist. Es konnte gezeigt werden, dass der C-terminale, saure Bereich
von HMGN mit den N-terminalen Armen von H3 interagieren kann und dass
diese Interaktion essenziell ist, da an trypsiniertes H3 die Bindung von HMGN
sehr schwach ist. Interessant ist auch, dass die HMGN-Proteine offensichtlich
wie H1 an die Ein- und Austrittstelle der DNA im Nukleosom binden und
dadurch mit H1 um die Bindestelle konkurrieren. Eine Stimulation von
Transkription und Rekombination könnte dann damit erklärt werden, dass
HMGN H1, das inhibitorisch wirkt, vom Nukleosom verdrängt und die
Wechselwirkung zwischen Histonoktamer und DNA auflockert. Tatsächlich
konnte gezeigt werden, dass HMGN-Proteine in aktiv proliferierenden Zellen
durch den ganzen Zellkern in vielen Foci lokalisiert sind, sich aber in
transkriptionsinaktiven Zellen in dem interchromosomalen Bereich befinden
(Bustin, 1999).
Neben den klassischen HMGs gibt es die sogenannten HMG-Motiv-Proteine die
eine strukturelle Eigenschaft, wie HMG-Box, Nukleosomen-Bindemotiv oder ATHook aufweisen (siehe Abbildung 1-8). Bei den HMG-Motiv Proteinen handelt
es sich um verschiedenste Proteine, die neben einem oder mehreren HMGMotiven auch andere Motive besitzen. Diese Proteine kommen teilweise
Zelltyp-spezifisch vor und sind nicht so verbreitet wie die klasischen HMG-
Einleitung
23
Proteine. Meist binden sie sequenzspezifisch an DNA oder dienen der
Expression einer definierten Subklasse von Genen.
1.3.3
Chromatinremodeling
Der Mechanismus des Chromatinremodelings stellt eine dritte Möglichkeit dar,
die Chromatinstruktur zu verändern. Bei diesem Mechanismus wird die
Chromatinstruktur
ATP-abhängig
von
sogenannten
Chromatinremodelingkomplexen verändert. Dabei handelt es sich um
Multiproteinkomplexe (0,5 – 2 MDa), deren gemeinsames Merkmal eine
ATPase-Untereinheit
ist.
Nach
diesen
ATPasen
werden
die
Chromatinremodelingkomplexe in vier Familien unterteilt: Swi2, ISWI, MI-2
(CHD) und INO80 Familie (Shen et al., 2000; Varga-Weisz, 2001). Die
ATPasen besitzen neben der ATP-Domäne noch weitere funktionelle Domänen.
So besitzt die Swi2-ATPase eine zusätzliche Bromodomäne, die acetylierte
Histone erkennt. Die Mi-2-ATPasen dagegen haben eine Chromodomäne, die
an methylierte Histone bindet (Berger, 2002);(Varga-Weisz, 2001).
Neben der ATPase-Untereinheit, setzen sich die verschiedenen
Remodelingkomplexe aus unterschiedlichen akzessorischen Untereinheiten
zusammen. ACF, der kleinste Komplex, besitzt neben der ATPase ISWI nur
noch eine Untereinheit, Acf1. SWI/SNF hat mehrere zusätzliche Untereinheiten.
Es wird vermutet, dass die unterschiedliche Zusammensetzung der
Remodelingkomplexe deren Funktion und deren Aktionsort beeinflusst.
Die Mechanismen der Remodelingkomplexe sind in vitro gut charaktersiert. So
sind sie in der Lage, Histon-Oktamere auf kurzen DNA-Fragmenten zu
verschieben. So könnten Regulatorelemente auf der DNA nukleosomenfrei
gemacht werden. Von den ISWI-Komplexen ist bekannt, dass sie für eine
regelmäßige Anordnung von Nukleosomen auf längeren DNA-Fragmenten
verantwortlich sind („Nukloesomen-Spacing“). Dies kommt wahrscheinlich auch
durch die oben beschriebene „Sliding“-Aktivität zustande (Vignali et al., 2000).
Im Gegensatz zu den in vitro Daten ist über die in vivo Funktion nur wenig
bekannt. Für ACF konnte eine Beteiligung bei der Replikation in
heterochromatischen Bereichen in der späten S-Phase gezeigt werden (Collins
et al., 2002).
Chromatinremodelingkomlexe sind aber nicht nur in die Genaktivierung,
sondern auch in dem Verschließen oder „Silencen“ von Chromatin beteiligt. Hier
wäre z.B der NURD-Komplex zu nennen. Neben der MI-2 ATPAse und anderen
Untereinheiten, hat dieser Komplex eine HDAC-Untereinheit, die Histone
deacetylieren kann und dadurch zu einer unzugänglicheren Chromatinstruktur
führt (Xue et al., 1998). In Microarray-Studien wurde gezeigt, dass etwa 5 % der
Gene in Hefe durch die ATPase-Aktivität des SWI/SNF-Komplexes stimuliert,
aber auch reprimiert werden können (Sudarsanam and Winston, 2000).
Einleitung
24
Aus diesen wenigen genannten Beispielen wird deutlich, dass die Regulation
der Genexpression auf epigenetischer Ebene weit komplexer ist als bisher
vermutet wurde.
1.4
Das DEK-Protein
1.4.1
Entdeckung
Das DEK-CAN Onkogen wurde 1992 bei Patienten mit einer Subform der
akuten myeloiden Leukämie entdeckt (AML). Dieses Fusionsprodukt entsteht
durch eine Chromosomentranslokation des 3`-Bereiches des CAN-Gens auf
Chromosom 9, auf den 5`-Bereich des DEK-Gens auf Chromosom 6, die sich
im Leseraster befindet. Durch diese Translokation t(6;9)(p23;q34) entsteht ein
Fusionsprotein aus 350 Aminosäuren (1-350) von DEK und 1278 Aminosäuren
des C-Terminus von CAN, das ein Molekulargewicht von 165 kDa hat (von
Lindern et al., 1990), (von Lindern et al., 1992). Bei CAN (Nup214) handelt es
sich um eine Komponente des Kernporenkomplexes, daher ist es strikt in der
Kernmembran lokalisiert, wohingegen das Fusionprotein DEK-CAN im Zellkern
zu finden ist (Fornerod et al., 1995), (Hamaguchi et al., 1998) (Boer et al.,
1998). Bei den AML-Patienten mit der DEK-CAN-Fusion bleibt je ein Allel
unbeeinflusst und es werden höhere Mengen an DEK-Transkript im Vergleich
zu dem DEK-CAN-Transkript beobachtet. Die Präsenz des Fusionsproteins
DEK-CAN ist oft die einzige karyotypische Abnormalität bei diesen Patienten,
deshalb wurde hier die transformierende Aktivität vermutet und DEK selbst als
Protoonkogen eingestuft. Weitere Studien zeigten jedoch, dass die
Translokation t(6;9) in AML sehr selten vorkommt. Thiede et al. konnten unter
979 AML-Patienten nur zehn mit dieser Translokation finden. Jedoch wiesen
90% der DEK-CAN-Patienten eine Mutation in der FLT3-Kinase (FMS-TyrosinKinase) auf, wohingegen dies in nur 20 % der anderen untersuchten AMLPatienten zu finden war (Thiede et al., 2002). Die Mutation führt zu einer
konstitutiv erhöhten Kinaseaktivität. Die FLT3-Kinase ist in der
cytoplasmatischen Membran lokalisiert und dient als Rezeptor für verschiedene
Wachstumssignale. Sie ist daher in verschiedene Signaltransduktionswege
involviert und scheint bei der Aufrechterhaltung der Proliferation und bei der
Entgegenwirkung der Differenzierung in diesen leukämischen Zellen eine
wichtige Rolle zu spielen (Libura et al., 2003). Eine Überexpresion von DEKCAN in U937 myeloiden Vorläuferzellen konnte die Ausdifferenzierung dieser
Zellen nicht verhindern (Boer et al., 1998). Die Expression von DEK-CAN in
transgenen Mäusen führte nicht zur Ausbildung einer Leukämie (Grosveld,
2002). Daher scheint eher die Mutation in der FLT3-Kinase und nicht die
Präsenz von DEK-CAN zu einer Transformation zu führen, wobei man nicht
ausschließen kann, dass DEK-CAN in bestimmten Transformationsstadien eine
Rolle spielt. Es bleibt daher fraglich, ob DEK wirklich ein Protoonkogen ist.
Einleitung
1.4.2
25
Eigenschaften
DEK ist ein sehr häufiges Kernprotein (2-4 106 Kopien/Zelle), das in allen
höheren Eukaryoten gefunden wird (Pflanzen, Pilze, Tiere), aber nicht in Hefe
vorkommt. Die DEK-Proteine unterschiedlicher Spezies weisen homologe
Bereiche auf, die in den unterschiedlichen Spezies in der Länge variieren
(Abbildung 1-9). Humanes DEK hat ein Molekulargewicht von 43 kDa und
enthält 375 Aminosäuren. Dahingegen ist DEK aus D. melanogaster 612
Aminosäuren lang, aus X.laevis nur 300 Aminosäuren lang. DEK-Proteine der
verschiedenen Organismen weisen alle eine SAF- oder SAP-Box auf (Aravind
and Koonin, 2000; Kipp et al., 2000). Diese konservierte, 35 Aminosäuren lange
DNA-Bindedomäne erstreckt sich bei menschlichem DEK von Aminosäure 149
bis
187
(Abbildung
1-9).
Des
Weiteren
findet
man
eine
Kernlokalisationssequenz (205-221) und vier saure Bereiche, die sich jeweils
von Aminosäure 30-49, 228-236, 241-254 und 300-310 erstrecken.
Durch Yeast-Two-Hybrid-Analysen und Far-Western-Studien konnte eine
Multimerisierungsdomäne, die sich von Aminosäure 270-350 erstreckt,
identifiziert werden (Kappes et al., 2004; Scholten, 2004).
Abbildung 1-9 Domänen des humanen DEK-Proteins
Das menschliche DEK-Gen ist auf Chromosom 6 (6;p23) lokalisiert und enthält
11 Exons. Der DEK-Promotor weist die Eigenschaften eines Haushaltsgens auf
(CCAATT-Box, unmethylierte CpG-Inseln, keine TATA-Box) und wird potenziell
über die Faktoren NF-Y und YY1 reguliert (Sitwala et al., 2002). Die DEKExpression ist in allen untersuchten Geweben sehr stark und in vielen
Krebsarten wird DEK überexprimiert, wohingegen die DEK-Expression in
ausdifferenzierten Zellen eher schwach ist (Boer et al., 1998; Kondoh et al.,
1999; Kroes et al., 2000; Makita et al., 2002; Savli et al., 2002; SanchezCarbayo et al., 2003; Daibata et al., 2004; Evans et al., 2004). Bisher sind keine
Einleitung
26
Spleissvarianten und regulatorische Elemente, die die Stabilität oder die
Translationseffizienz der DEK-mRNA beeinflussen könnten, bekannt.
DEK wurde in vielen humanen Autoimmunkrankheiten als Antigen gefunden. In
einer Untersuchung von Dong et al. (2000) wurden DEK-Antikörper in juveniler
rheumatoider Arthritis (JRA, 40 % der Patienten), im systemischen Lupus
erythematodes (SLE, 25% der Patienten), in der Sytemsklerose und in weiteren
Autoimmunkrankeiten gefunden. Die Produktion von DEK-Antikörpern scheint
auf eine erhöhte Anwesenheit von IFNγ (Interferon) zurückzuführen zu sein
(Dong et al., 2000).
1.4.3
Subzelluläre Lokalisation und Zellzyklusverhalten
DEK ist ausschließlich im Nukleus lokalisiert. Durch Zellfraktionierungsstudien
konnte gezeigt werden, dass sich die Hauptfraktion von DEK mit 250 mM NaCl
aus isolierten Kernen extrahieren lässt. DEK weist damit ein Verhalten auf, wie
es für andere Chromatinproteine beschrieben ist (z.B (Ritzi et al., 1998).
Sedimentationsanalysen von freigesetzten Chromatinfragmenten zeigten
tatsächlich, dass DEK in vivo Zellzyklus-unabhängig mit Chromatin assoziiert ist
(Kappes et al., 2001). DEK ist sowohl mit Metaphase-Chromosomen und mit
mitotischem Chromatin assoziiert (Fornerod et al., 1995; Kappes et al., 2001;
Krithivas et al., 2002; Scholten, 2004). Die DEK-Protein-Menge ändert sich im
Zellzyklus nicht. Eine Assoziation mit hetero- und euchromatischen Bereichen
konnte gezeigt werden, jedoch wurde eine fünffache Anreicherung in
Euchromatin gefunden (Kappes et al., 2001). Mit zwei verschiedenen Methoden
der Kernmatrix-Präparation konnte eine Assoziation von DEK mit dieser
Struktur nachgewiesen werden (Kappes, 2000).
DEK ist, wie viele andere Chromatin-assozierte Kernproteine, hoch mobil,
unterliegt folglich einer schnellen Dissoziation und Wiederbindung an
Chromatin. Dies wurde durch FRAP-(flueorescence recovery after
photobleaching) Analysen von transient exprimierten GFP-(green fluorescent
protein) DEK gezeigt (Scholten, 2004). Es wurden aber auch DEK-Populationen
gefunden, die über Minuten hinweg einen stabilen Komplex ausbilden.
Eine kleinere Population von DEK ist in vivo mit RNA assoziiert (Kappes et al.,
2001).
Einige Gruppen konnten eine Interaktion von DEK mit dem EJC-(exon-exonjunction) Komplex nachweisen (Le Hir et al., 2000; Le Hir et al., 2001)
(McGarvey et al., 2000). Es stellte sich allerdings heraus, dass die gefundene
Interaktion auf einer Kreuzreaktion des verwendeten Antikörpers beruhte
(Reichert et al., 2002). Weitere Studien in unserem Labor bestätigten die
Kreuzreaktion (Scholten, 2004).
Einleitung
1.4.4
27
Topologieveränderung und DNA-Bindung
Alexiadis et al. (2000) zeigten, dass natives, über konventionelle
Säulenchromatographie gereinigtes DEK in Anwesenheit von Topoisomerase I
die superhelikale Dichte von SV40-Minichromosomen verändert. Diese
Topologieveränderung wurde zuerst nur an Chromatin-Substraten beobachtet
(Alexiadis et al., 2000). In weiteren Arbeiten von Waldmann et al. konnte diese
Topologieveränderung auch an proteinfreier DNA beobachtet werden
(Waldmann et al., 2002; Waldmann et al., 2003). Es konnte gezeigt werden,
dass DEK fixierte, positive Supercoils in proteinfreie DNA einführt und zu einer
Reduktion von negativen Supercoils in SV40 Minichromosomen führt. Der
Mechanismus der Topologieveränderung ist bisher noch nicht genau
verstanden, ein Nukleosomenverlust konnte jedoch ausgeschlossen werden
(Alexiadis et al., 2000). In elektronenmikroskopischen Studien konnte auch ein
„Wrapping-Machanismus“ ausgeschlossen werden, wie für die Histone gezeigt.
Jedoch wurde eine leichte Längenzunahme beobachtet. Durch die Präsenz von
interkalierenden Aminosäuren (Phenylalanine) inmitten der potenziellen DNABindedomäne SAF-Box, kann die Interkalation von DEK nicht ausgeschossen
werden.
Alle
bisher
beschriebenen
Arbeiten
identifizierten
DEK
als
sequenzunspezifisches DNA-Bindeprotein. Die Gruppe von Markovitz allerdings
beschrieben eine Sequenzspezifität von DEK für eine Sequenz aus dem HIV-2
Promotor (pets-site) und für eine Sequenz aus MHC-II Genen (Fu et al., 1997;
Faulkner et al., 2001; Adams et al., 2003). In identischen Experimenten von
Waldmann et al. konnte diese sequenzspezifische Bindung von DEK an die
pets-site nicht gezeigt werden (Waldmann et al., 2003). Vielmehr wurde
gefunden, dass DEK strukturspezifisch an supergecoilte und kruziforme DNA
bindet (Waldmann et al., 2003). Diese Eigenschaft verbindet DEK mit
Architekturproteinen.
Die Bindung von DEK an Chromatinsubstrate in vitro führt zu einer drastischen
Kompaktierung und dadurch zu einer verminderten Zugänglichkeit für
Restriktionsenzyme, Mikrokokken-Nuklease und Replikationsproteine (Alexiadis
et al., 2000), (Waldmann et al., 2003). Alexiadis et al. wiesen eine Assoziation
von DEK mit SV40 Chromatin in vitro nach und konnten in Far-Western-Studien
zeigen, dass DEK mit den Histonen H2A und H2B in vitro interagiert (Alexiadis
et al., 2000). Allerdings konnte in weiteren Experimenten keine Interaktion von
DEK mit rekombinanten Histonen gezeigt werden (Scholten, 2004).
Wird DEK zusammen mit proteinfreier DNA inkubiert und im
Elektronenmikroskop analysiert, findet man zum einen intermolekulare
Wechselwirkungen zwischen DEK und DNA, die zu Schleifenbildungen führen
und zum anderen kann man erkennen, dass DEK in einer geordneten Art und
Einleitung
28
Weise an DNA-Substrate bindet (Waldmann et al., 2002; Waldmann et al.,
2003).
1.4.5
Interaktion mit anderen Proteinen
In den letzten Jahren wurden drei Interaktionspartner von DEK identifiziert. Zwei
davon, hDaxx und AP-2α sind Komponenten der Transkriptionskontrolle. Der
dritte Partner ist LANA, ein virales Protein, das die Bindung des KaposiSarkoma assoziierten Herpesvirus an zelluläres Chromatin vermittelt.
1.4.5.1 Interaktion AP-2α, einem Transkriptionsaktivator
Campillos et al. (2003) identifizierten DEK in Affinitätsreinigungen als
Interaktionspartner von AP-2α. AP-2α ist ein Mitglied der AP-2
Transkritionsfaktoren-Familie, die eine Funktion bei der Embryogenese,
Apoptose und Differenzierung haben. In EMSAs wurde DEK als stimulierender
Faktor für die AP-2α-Bindung gefunden. Jedoch wurde hier GST-DEK
eingesetzt, dem N-terminal 80 Aminosäuren fehlen, und GST alleine konnte
schon die AP-2α-Bindung deutlich stimulieren. In Ko-Transfektionsassys in
Leberzellen konnten die Transkription eines AP-2α-abhängigen Promotors
(APOE) durch die Überexpression von DEK stimuliert werden. Die Autoren
folgern daraus, dass DEK über eine transiente Komplexbildung mit Cterminalen Bereichen des AP-2α-Proteins dessen Affinität für DNA steigert. Der
C-terminale Bereich ist in der AP-2-Familie konserviert, deshalb wird auf eine
generelle Interaktion von DEK mit allen Mitgliedern dieser Familie spekuliert.
Auffälligerweise konnte DEK alleine nicht an die verwendete DNA, die
Sequenzähnlichkeiten zum pets-Fragment hat, binden (Campillos et al., 2003).
Diese Interaktion von DEK mit AP-2α könnte in der DEK-CAN Fusion gestört
sein und dadurch zu einer Transformation führen (Campillos et al., 2003).
1.4.5.2 Interaktion mit Daxx, einem Transkriptionsrepressor
Im Gegensatz zu Campillos et al., die für DEK eine Rolle in der
Transkriptionsaktivierung postulieren, finden Hollenbach et al. eine potenzielle
transkriptionsreprimierende Funktion für DEK (Hollenbach et al., 2002). Daxx ist
ein ubiquitär exprimiertes Protein, das die Transkription in verschiedenen
Zelltypen reprimiert (Hollenbach et al., 1999). Durch konventionelle
säulenchromatographische Auftrennung von Flag-DEK überexprimierenden
Zellen konnte in einigen Fraktionen gemeinsam hDaxx, HDAC II, acetyliertes
H4, die „Core“ Histone und Flag-DEK gefunden werden. Die Autoren leiteten
daraus ein Modell ab, bei dem DEK eine Rolle in der Rekrutierung von hDaxx
an das Chromatin hat. In diesem Modell wird phosphoryliertes hDaxx über die
Transkriptionsfaktoren Pax3 und ETS-1 an aktiv transkribiertes Chromatin
rekrutiert. Die Assoziation von Daxx an Chromatin wird dann über die „Core“Histone und chromatingebundenes DEK vermittelt, woraufhin die HDAC II
Einleitung
29
rekrutiert werden kann und die Deacetylierung von Histonen vermittelt. Es
kommt dadurch zu einer Kompaktierung dieser Chromatinbereiche, die in einer
Transkriptionsrepression endet. DEK ist hier eine Komponente eines
Multiproteinkomplexes und vermittelt als chromatingebundenes Protein weitere
Proteininteraktionen (Hollenbach et al., 2002).
1.4.5.3 Interaktion mit LANA
LANA (latency associated nuclear antigen) ist ein konstitutiv exprimiertes
Protein in Kaposis Sorkoma-assozierten Herpesinfektionen (KSHV) und ist für
die Verteilung der episomalen viralen DNA auf die Tochterzellen notwendig.
LANA bindet dabei an terminale Repeats (TR) des KSHV-Genoms und
assoziiert die viralen Episomen mit zellulärem Chromatin und Chromosomen.
Krithivas at al. konnten zeigen das LANA über MeCP2 (methyl CpG binding
protein 2) und DEK an das zelluläre Chromatin gebunden wird. LANA assoziiert
hierbei über eine N-terminale Interaktion mit MeCP2, das an methylierte
„Linker“ DNA bindet, und über eine C-terminale Interaktion mit DEK an das
Chromatin. DEK dient hier als Plattform für weitere Proteininteraktionen
(Krithivas et al., 2002). Interessanterweise gab es Studien, in denen H1 als
potenzielle Plattform für die LANA Bindung dienen sollte.
2
Zielsetzung
DEK ist ein sehr häufiges und ubiquitär vorkommendes Chromatin-assoziiertes
Protein (Kappes et al., 2001) und wird unter anderem in Zusammenhang mit
Transkriptionskontrolle gebracht (Hollenbach et al., 2002; Campillos et al.,
2003).
Durch die Entdeckung von DEK als Fusionsprotein mit dem Nukleoporin CAN in
einer Subform der akuten myeloiden Leukämie (von Lindern et al., 1990; von
Lindern et al., 1992) und durch die Überexpression von DEK in verschiedenen
Krebsarten wird es als Protoonkogen bezeichnet. Bis heute wurde kein
eindeutiger Zusammenhang zwischen DEK-Expression und Onkogenese
festgestellt, jedoch scheint die DEK-Expression im Zusammenhang mit dem
Proliferations– und Differenzierungsstatus einer Zelle zu stehen.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Biochemie des DEK-Proteins besser zu
verstehen. Dazu wurden drei verschiedene Untersuchungsstrategien gewählt.
Aufbauend auf Kappes et al. (2001) sollten weitere Zellzykluseigenschaften von
DEK in vivo untersucht werden, die einen Beitrag zum Verständnis der
Expressionskontrolle von DEK liefern sollten.
Eine weitere beschriebene Eigenschaft von DEK ist die Einführung von
Supercoils in DNA- und Chromatinsubstrate in vitro und die
sequenzunspezifische Bindung an DNA (Alexiadis et al., 2000; Waldmann et
al., 2002). Hier sollten durch die Herstellung von DEK-Deletionsmutanten die
verantwortlichen Bereiche für diese Aktivitäten identifiziert werden.
Im dritten Teil dieser Arbeit sollte die Phosphorylierung, die einzige bisher
bekannte posttranslationale Modifikation von DEK (Fornerod et al., 1995), die
bisher jedoch noch nicht näher charakterisiert wurde, untersucht werden. Hierzu
sollte die Phosphorylierung von DEK in vivo und die dafür verantwortliche(n)
Kinase(n) identifiziert werden. Des Weiteren sollten die Auswirkungen der
Phosphorylierung auf die DEK-Funktion untersucht werden.
3
Material und Methoden
3.1
Material
•Aldrich:
Phosphat-freies DMEM
Methioninfreies DMEM
Plasmid-Präparations-Kit
•Amersham Pharmacia Biotech:
Molekulargewichtsmarker für die SDS-PAGE (LMW-Marker)
ECL Western-Blot-Detektions-System
ATP
•Beckmann:
Zentrifugenröhrchen aus Polyallomer für die Ultrazentrifugation (SW-40
Rotor)
Rotoren: SW-40, SS-34, GS-3, HB-4.
•Biolabs (NEB)
100x BSA
λ-Phosphatase
•Gibco:
Nährmedium für die Zellkultur (DMEM, Grace`s Insect Medium)
Fötales Kälberserum (FCS)
HeLa S3 Zellen
•Greiner:
62-95-145 mm Plastikpetrischalen in Zellkultur-(TC)-Qualität
Zellkulturflaschen für die Kultur von SF-9 und High-5 Zellen
•Invitrogen:
Bac-N-Blue-DNA
•Sarstedt:
13 ml Polypropylenröhrchen („Weisskappenröhrchen“)
Material und Methoden
Plastikküvetten (1ml)
•Schleicher & Schuell:
Nitrocellulose Membran (Protran®) und Blotfilter für Western Blot
Nitrocellulose Filter für die Filterbindung
Sterilfilter
Dialyse Schwimmfilter
•MBI Fermantas :
Mikrokokken Nuklease (MNase)
•Promega:
PKC
Topoisomerase I (wheat germ)
•Roche:
DNase I (RNase frei)
RNase A
Complete (Proteasen Inhibitor Mix)
•Fluka:
Nonidet-P40 Lösung (10%)
•Roth:
Roti®-Block (Blocking Reagenz für den Western Blot)
Polyacrylamid (Gel 30)
•TPP:
50 ml Polypropylenröhrchen („Gelbkappenrörchen“)
•Pierce:
SulfoLink Coupling Gel
BCA-Proteinbestimmungs Kit
•Millipore:
Dialysefilter
•ICN:
[γ-32P] ATP
[α-32P] ATP
•Fuji Film:
32
Material und Methoden
33
Medizinische Röntgenfilme (Super RX) für den Western Blot
•Mitsubishi:
Thermopapier (K 65HM)HD Type) für die Fotographie von DNA Gelen
•Eppendorf:
Reaktionsgefäße
Tischzentrifuge
Alle übrigen Chemikalien wurden von den Firmen Fluka, Riedel-deHäen, Serva,
Sigma, Roth und Calbiochem bezogen. Sofern nicht ausdrücklich angegeben,
hatten alle Chemikalien den Reinheitsgrad „pro analysi“ (pa).
3.2
Allgemeine Lösungen
Im Folgenden sind alle verwendeten Lösungen und Puffer aufgelistet, auf die
nicht näher eingegangen wird. Spezielle Lösungen und Puffer werden bei den
entsprechenden Methoden aufgeführt.
PBS:
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
2 mM KH2PO4
5 x TBE :
450 mM Tris-Base
445 mM Borsäure
10 mM EDTA, pH 8
4 x Probenpuffer für SDS-PAGE:
200 mM Tris-HCl, pH 6,8
8 % SDS
40 % Glycerin
0,4 % Bromphenolblau (oder Orange G für Agarosegele)
10 % β-Mercaptoethanol
Material und Methoden
34
5 x Laufpuffer für SDS-PAGE:
247 mM Tris-Base
1,9 M Glycin
0,5 % SDS (pH nicht einstellen)
2 x Sammelgelpuffer für SDS-PAGE:
0,25 M Tris-HCl, pH 6,8
0,2 % SDS
1 Spatelspitze Bromphenolblau
50 x TAE:
242 g Tris-Base
57,1 ml Essigsäure conc.
100 ml EDTA (0,5 M, pH 8)
ad 1l mit bidest H2O
TBST:
150 mM NaCl
50 mM Tris-HCl, pH 7,8
0,05 % Tween 20
TE:
10 mM Tris-HCl, pH 8
1 mM EDTA
Coomassie –Färbung:
0,1 % Coomassie Brilliant Blue
40 % Methanol
10 % Essigsäure
Semi-Dry-Puffer für den Western-Transfer:
20 % Methanol
50 mM Tris
40 mM Glycin
1,5 mM SDS
Material und Methoden
35
6 x Probenpuffer für Agarosegele:
15 % Ficoll Type 400
60 mM EDTA
0,6 % SDS
0,25 % Orange G
LB-Medium:
10 g Trypton
5g Hefeextrakt
10 g NaCl
ad 1l mit H2O
3.3
Allgemeine Methoden
3.3.1
SDS-Polyacryalmid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Auftrennung der Proteine erfolgte aufgrund ihres Molekulargewichtes
mittels Polyacrylamid-SDS-Gelelektrophorese nach Lämmli (Laemmli, 1970),
modifiziert nach ((Thoma et al., 1979). Wenn nicht anders angegeben, wurden
Gele mit 10 % Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8) und einer Dicke von 0,7 mm
verwendet. Die Trennung wurde bei 20 mA gestartet und bei 40 mA
durchgeführt. Die Gesamtlaufzeit betrug 80 min.
3.3.2
Coomassie Färbung und Silber Färbung von Polyacrylamid Gelen
Der Nachweis der Proteinbanden in Polyacrylamidgelen erfolgte durch
Anfärbung mit Coomassie Brilliantblau nach Sambrook et al. (Sambrook et al.,
1989b).
Die Silberfärbung von Proteingelen wurde nach Wray et al. (Wray et al., 1981)
durchgeführt.
3.3.3
Western-Blot und Immunfärbung (Immunblot)
Für den immunologischen Proteinnachweis wurden zunächst die Proteinbanden
aus dem Polyacrylamidgel auf eine Nitrocellulose Membran transferiert. Der
Transfer wurde in einer Semi-Dry-Blot Apparatur der Firma Hoefer durchgeführt
und erfolgte mit 0,8 mA/cm2 für eine Stunde bei einer Geldicke von 0,7 mm. Im
Anschluss an den Transfer wurde die Membran kurz in Wasser gewaschen und
mit Poinceau-S Lösung (0,2 % Poinceau-Red, 5 % Essigsäure) angefärbt, um
die Position der Markerproteine und die Qualität das Transfers festzuhalten.
Nach dem Entfärben der Membran in TBST wurde sie für 1 h in 1 x Rotiblock
Material und Methoden
36
Lösung inkubiert, um Proteinbindestellen abzusättigen. Danach wurde die
Membran mit TBST gewaschen und für 1 h mit dem primären Antikörper
(verdünnt in TBST) inkubiert. Nach weiteren Waschschritten mit TBST (3 x 5
min) folgte eine einstündige Inkubation mit dem sekundären Antikörper
(verdünnt in TBST, 0,5 % Magermilchpulver). Die Nachweisreaktion erfolgte
nach erneutem Waschen in TBST (2x5 min; 1x 15 min) durch eine
Chemolumineszenzreaktion nach Angaben des Herstellers (ECL, Amersham).
3.3.4
Proteinfällung nach Wessel und Flügge (1984)
Für die quantitative Fällung von Proteinen aus verdünnten, wässrigen Lösungen
wurde die Methode nach Wessel und Flügge (Wessel and Flügge, 1984)
verwendet. Zu einem Volumen Probe wurde ein Volumen 100 % Methanol und
¼ Volumen 100 % Chloroform gegeben und kräftig gemischt. Nach einer
Zentrifugation (Eppifuge, 14.000 rpm, 5 min, RT) und erfolgter Phasentrennung
(obere wässrige Phase: DNA, Interphase: Proteine) wurde die obere Phase
abgenommen, zu dem Rest wurden ¾ Volumen 100 % Metanol gegeben,
kräftig gemischt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen,
das proteinhaltige Pellet wurde im Exsikator oder bei 55 °C getrocknet (30 min).
Bei Proben, die mehr als 10 % Sucrose (siehe Gradienten) oder Glycerin
enthielten, musste die Chloroformmenge auf 1/3 oder ½ des
Ausgangsvolumens erhöht werden. Das Pellet wurde in 1x Lämmliprobenpuffer
aufgenommen und erhitzt. Bei Immunfällungen wurde das Proteinpellet zuerst
in 2 % SDS gelöst (30 min, 55°C), dann wurde die Probe auf 200 mM DTT
eingestellt, für 10 min bei RT inkubiert mit 10 x Lämmliergänzungspuffer
versetzt und für 5 min bei 95°C erhitzt.
3.3.5
Agarosegelelektrophorese
Gereinigte oder deproteinisierte DNA wurde auf einem 0,8 % oder 1 %
Agarosegel aufgetrennt. Als Laufpuffer wurde entweder 1 x TAE
(Chromatinfragmente) 0,5 x TBE (Topolgie Assay) oder 0,5 x TBE-spezial
(EMSA) verwendet. Die Gelelektrophorese wurde im Allgemeinen bei einer
Spannung von 100 V und einer Laufzeit von 90 min durchgeführt. Für
topologische Untersuchungen wurden 0,8 % Gele verwendet, die mit 2 V/cm für
16 h liefen. Die Gele wurden für 30 min in Ethidiumbromid (0,05 µg/ml in
Wasser) eingelegt, dann für 15 min in reichlich Wasser entfärbt und fotografiert.
3.3.6
DNA Fällung
Zu einer Probe wurde 1/10 Volumen 3M Natriumacetat und das 2,5-fache
Volumen 100 % Ethanol (-20°C) gegeben, gemischt und für 1 h bei –20°C
gefällt. Die Probe wurde dann für 15 min zentrifugiert (Eppifuge, 14.000 rpm,
4°C), der Überstand verworfen und das Pellet mit 0,5 ml 70 % Ethanol
Material und Methoden
37
gewaschen und erneut zentrifugiert. Für Oligonukleosomen wurde 80 %
Ethanol verwendet. Die Pellets wurden im Exsikator oder bei 55°C getrocknet
und im entsprechenden Probenpuffer aufgenommen.
3.3.7
Plasmid-Präparation und Cäsiumchlorid Reinigung
Plasmidpräparationen wurden zu Kontrollzwecken aus einer 5 ml
Übernachtkultur mittels einem Plasmid-Mini-Präp-Kit durchgeführt. Für einen
Cäsiumchloridgradienten wurden die Plasmide aus einer 500 ml
Übernachtkultur nach Birnboim aufgereinigt (Birnboim, 1983). Der
Cäsiumchloridgradient zur Reinigung der Plasmide wurde nach Sambrook et al
(Sambrook et al., 1989a) durchgeführt.
3.4
Baculovirus-System und Proteinreiniung
3.4.1
Klonierung von His-DEK
Die DEK cDNA (open reading frame) wurde aus dem pRSET–A Vektor (Ingo
Scholten, Universität Konstanz) durch EcoRI und BamHI-Verdau gewonnen
(Fragment von 1,2 kb). Dieses Fragment wurde in einen durch EcoRI und
BamHI linearisierten pBacBlueHis2 A subkloniert und amplifiziert. Der Vektor
wurde in den E.coli Stamm XL-1 Blue mittels Hitzeschock transformiert. Klone
wurden gepickt, der Vektor durch Plasmidpräparation aufgereingt und durch
erneuten Restriktionsverdau und Sequenzierung auf die Richtigkeit überprüft.
Um genügend Material zu bekommen, wurden Maxipräparationen mit
anschließender Cäsiumchlorigradienten Reinigung durchgeführt.
Material und Methoden
38
Abbildung 3-1 pBlueBacHis2
A. Multiple Clonig Site von pBlueBacHis2. Es wurden die BamHI und EcoRI Schnittstellen zum
Subklonieren der DEK cDNA verwendet. B. Nukleotidsequenz der Multiple Clonig Site.
Ko-Transfektion und Plaque-Assay
Um einen rekombinanten Virus im Baculovirus-System herzustellen, wurde
linearisierte BAC-N-Blue DNA (AcMNPV DNA) zusammen mit dem
pBacBlueHis2A–DEK Vektor in SF-9 Zellen kotransfiziert.
Für eine Transfektion wurde folgender Ansatz gewählt:
0,25µg BAC-N-Blue-DNA
5µl
4µg pBlueBacHis2 A-DNA
Max. 10µl
20µl Cellfectin
15 min RT (ab und zu schnippen)
+ 1 ml Hämolymphe -und Serum-freies Medium
-Infektion der Zellen für 1 h
SF-9 Zellen wurden 4 h vor der Transfektion auf kleine Zellkulturflaschen (5 ml)
umgesetzt, damit sie ca. 50 % konfluent waren. Das Medium wurde abgesaugt,
der DNA-haltige Ko-Transfektionsansatz wurde dazugegeben und für 1 h bei
27°C inkubiert. Während der Inkubation wurde alle 15 min die Flasche
geschwenkt. Das Medium wurde dann abgesaugt und mit 5 ml Serum - und
hämolymphehaltigem Medium aufgefüllt. Die so behandelten Zellen wurden nun
für 6-8 Tage bei 27°C inkubiert. Es erfolgte eine tägliche Kontrolle der Zellen.
Bei sichtbaren „Höfen“ und beginnendem Schwimmen der Zellen wurden diese
geerntet. Nach einer Zentrifugation (500 g, 5 min) stellt der Überstand den
virushaltigen „P0“ Stock dar. Da die Möglichkeit nicht auszuschließen ist, dass
Wildtyp-Viren vorhanden sind, wurde mit dem P0 Stock ein „Plaque Assay“
durchgeführt. Die Kontamination durch Wt-Viren würde den Virusstock
unbrauchbar machen, da der Wt-Virus in den nächsten Amplifikationsrunden
überhand nehmen würde.
Zur Durchführung des „Plaque Assays“ wurden 5x106 SF-9 Zellen auf eine 94
mm Zellkulturschale ausgesät und sich mindestens 4 h absetzen lassen. Es
wurden Verdünnungen des P0 Stocks hergestellt (10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7),
und die SF-9 Zellen wurden damit für 1 h unter regelmäßigem Schwenken
infiziert. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen mit einer Mischung aus
low-melting-Agar (50°C), Serum mit X-Gal (RT) und Serum bei 50°C (je 3 ml)
überschichtet. Nach dem Aushärten unter der Sterilbank (Kontrolle im
Material und Methoden
39
Lichtmikroskop) wurden die Platten in 145 mm Petrischalen überführt, die mit
einem in 5 mM EDTA getränkten Glasfaserfilter ausgelegt waren, um
Kontaminationen zu vermeiden. Nach 4-8 Tagen konnte man blaue Plaques
erkennen, die mittels einer Pasteurpipette gepickt wurden und in 1 ml Medium
aufgenommen wurden. Es wurde versucht, nur Plaques zu picken, die räumlich
nicht in der Nähe von Wt-Virus-Plaques (weissliche, stark lichtbrechende
Struktur) lagen. Die so erhaltenen Plaque-gereinigten rekombinanten Viren sind
bei 4°C und Dunkelheit über Jahre hinweg haltbar. Um nun „High-Titer“
Virusstöcke anzulegen, wurden SF-9 Zellen mit den gepickten Plaques infiziert.
Es folgten drei Runden der Virusamplifikation (P1 (5 ml), P2 (15ml), „high-titer“P3 Virusstock (30 ml)), die je 4-8 Tage dauerten (27°C, normale
Luftzusammensetzung und Feuchtigkeit). Geerntet wurden die Überstände
immer dann, wenn sich die Zelllyse andeutete (500 g, 5 min). Falls schon Zellen
lysiert waren, wurde mehrmals zentrifugiert. Die P1-P3 Stöcke wurden bei 4°C
und Dunkelheit aufbewahrt.
Material und Methoden
40
Abbildung 3-2 Prinzip der homologen Rekombination zur Gewinnung von rekombinanten Viren
A. Prinzip der homologen Rekombination zur Herstellung von rekombinanten Viren. B. verwendete Bac-NBlue-DNA.
Material und Methoden
41
Abbildung 3-3 „Plaque“-Assay
Prinzip des „Plaque Assays“.
3.4.2
Infektion, Reinigung und Dephosphorylierung von His-DEK und
His-DEK Deletionsmutanten
High-5 Zellen wurden 4 h vor der Infektion ausgesät (50 % Konfluenz) und mit
150 µl eines P3 Stockes infiziert. Nach 3 Tagen Infektion wurden die Zellen von
der Platte abgeschabt und in 50 ml Röhrchen überführt. Nach dreimaligem
Waschen mit PBS (Jouan, 500g, 5 min, 4°C) wurden die Zellpellets bei –70°C
gelagert. Die Lyse erfolgte mit 2 ml Lysepuffer (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM
NaCl, 0,5 mM MgCL2, 5 mM KCl, 5 mM Imidazol, 1 % NP-40, 1x Complete) für
das Pellet einer großen Zellkulturflasche. Nach einer Inkubation von 30 min auf
Eis wurde das Lysat auf 1,3 M NaCl eingestellt und für 20 min bei RT gerollt.
Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation (100.000 g, SW-40, 10min,
4°C) entfernt. Der Überstand wurde mit Lysepuffer auf 750 mM NaCl verdünnt
danach die äquilibrierte Ni-NTA Agarose dazugegeben (20µl, 50 % Lösung für
4 ml Lysat). Nach der Bindung (1h, 4°C, rollen) wurden die Beads
abzentrifugiert (Jouan, 3500 rpm, 50 sec, 4°C) und zweimal mit je 20 ml WP150 (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM Imidazol) gewaschen. Die
Beads wurden dann in eine Minisäule überführt und je zweimal mit WP-300 (50
mM Tris, pH7,5, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol) und je zweimal mit WP-150
gewaschen. Die Elution erfolgte im Elutionspuffer (100 mM Tris, pH 7,5, 150
mM NaCl, 500 mM Imidazol) mit doppeltem Säulenvolumen in zehn Schritten.
Die verschiedene Elutionen wurden auf einem SDS-PAGE mit folgender
Comassie Färbung auf ihren Proteingehalt untersucht. Die Fraktionen mit dem
meisten Proteingehalt (Fraktion 2-5) wurden vereinigt, RNAse verdaut und in
Material und Methoden
Aliquoten bei –70°C gelagert. Der Proteingehalt
Deletionsmutanten wurde an wt-His-DEK abgeglichen.
42
der
verschiedenen
Zur Entfernung der Phosphatreste von gereinigtem His-DEK wurde die Protein
Phosphatase λ verwendet. 10 pmol rekombinantes Protein wurde mit 400 units
λ-Phosphatase in Dephosphorylierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM
MnCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,01 Brij 35) für mindestens 90 min bei 30°C
inkubiert.
Abbildung 3-4 Reinigung über Ni-NTA-Agarose
A. Prinzip der Reinigung von überexprimierten His-getaggten Proteine über Ni-NTA Agarose. B. Bindung
des His-Tags an die Ni-NTA Matrix . C. Struktur von Imidazol und Histidin.
3.5
Antikörperproduktion und Reinigung
Um DEK spezifische Antikörper herzustellen, wurden Kaninchen (Chinchilla
Bastard) mit rekombinantem His-DEK gepspritzt. Als Adjuvans wurde RAS-2
verwendet.
Die Kaninchen wurden folgendermaßen immunisiert:
-testen des allgemeinen Antikörpertiters der Tiere auf HeLa Ganzzellextrakt;
das Tier durfte keinen zu starken Antikörpertiter haben.
-Grundimmunisierung mit 200 µg His-DEK (in max. 500µl Volumen)
Material und Methoden
43
-nach 10 Tagen Blutentnahme und Serumgewinnung, Test des Titers im
Immunblot.
-nach 6 Wochen: 1 Boost mit 200 µg His-DEK
-nach 10 weiteren Tagen Blutentnahme und Serumgewinnung, Test des Titers
im Immunblot.
-ab jetzt: alle 4 Wochen mit 200 µg His-DEK geboostet, Titerbestimmung
erfolgte nach 10 Tagen im Immunblot.
Im Allgemeinen konnte ein sehr guter Titer nach 4-5 Boosts festgestellt werden.
Das Tier wurde dann ausgeblutet und das Serum gewonnen (ca. 50 ml).
Das Serum konnte im Western-Blot in Verdünnungen bis 1:20.000 verwendet
werden. Für Immunfällungen wurde das Serum monospezifisch aufgereinigt.
Dafür wurde rekombinantes His-DEK an Sulfo-Link Gel gekoppelt. 500 µl
gepackte Beads wurden mit 6 Säulenvolumen Puffer A (50 mM Tris, pH 8,5, 5
mM EDTA) in einer Säule gewaschen. Die Säule wurde verschlossen und 100
µg His-DEK wurden in 500 µl Puffer A dazugegeben, für 20 min bei RT gerollt
und für weitere 40 min ab und zu gevortext. Der Durchfluss wurde gesammelt,
um die Kopplungseffizienz zu bestimmen. Die Säule wurde nun mit 3 Volumen
Puffer A gewaschen, danach mit 50 mM Cystein (60 mg in Puffer A) geblockt
(15 min rollen, 30 min stehen lassen, RT). Das Säulenmaterial wurde nun mit
16 Volumen 1M NaCl und 16 Volumen bidest H2O gewaschen und konnte so
für Wochen bei 4°C aufbewahrt werden. Vor der ersten Verwendung wurde sie
mit 100 mM Citrat, pH 2,5 und 10 Volumen TBST gewaschen. Das Serum
wurde aufgetaut und auf 10 mM Tris, pH 8 eingestellt und abzentrifugiert und
anschließend auf die Säule gebracht (mit Ausschluss des Todvolumens) und
über Nacht bei RT gerollt. Nach der Bindung ließ man das Serum durchtropfen
und die Säule wurde mit 20 Volumen TBST + 1 M NaCl, 20 Volumen TBST und
2 Volumen Wasser gewaschen. Die Elution der Antikörper erfolgte mit 100 mM
Citratpuffer, pH 3 (1 M Citronensäure (pH2) + 1M Na-Citrat mischen bis pH 3
erreicht, dann mit bidest H2O auf 100 mM verdünnen) in 10 Schritten mit halben
Säulenvolumen. Um eine Umpufferung der Antikörper zu erreichen, wurde 1M
Tris, pH 8 dazugegeben, bis pH 7 erreicht war. Die Antikörpermenge wurde nun
bei OD280 bestimmt (OD280 1,4 ≅ 1 mg/ml Protein). Der Antikörper befand sich in
Fraktion 2-5. Die Eluate wurden vereinigt und im Immunblot auf ihre Spezifität
hin getestet. Die monospezifischen Antikörper konnten bis zu 6 Monate bei 4°C
aufbewahrt werden.
Material und Methoden
3.6
SV40
3.6.1
Präparation von SV40-DNA
44
Für eine Präparation wurden 10-20 konfluente CV1 Zellen (145 mm
Zellkulturplatten) mit Wiltyp SV40 Virus infiziert. Nach 60 h wurde das Medium
entfernt und die Zellen 4 x mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann für 20
min mit Hirt-Lösung (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,6 % SDS) bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von ¼ Volumen 5 M NaCl wurden die
Hirtüberstände über Nacht bei 4°C gefällt. Danach erfolgte eine Zentrifugation
bei 20.000 rpm, SS34, 1h. Zu den Überständen wurden 0,6 Volumen 100 %
Isopropanol gegeben. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (9000 rpm,
GS3, 15 min) befand sich die SV40 DNA im Pellet. Das Pellet wurde daraufhin
in
11
ml
MOPS-Acetat
gelöst
und
anschließend
auf
einen
Cäsiumchloridgradienten (CsCl 1g/ml) überführt. Nach der Zentrifugation
(37.000 rpm, 50Ti, 60h, 18°C) wurde die Form I Bande mittels einer Kanüle
abgesaugt. Mit NaCl gesättigtem Isopropanol wurde das CsCl ausgetauscht.
Die DNA wurde 1:2 verdünnt und nochmals gefällt. Die DNA Konzentration
wurde anhand eines Standards auf einem Agarosegel abgeschätzt oder
photometrisch bestimmt (Gruss, 1995).
3.6.2
Präparation von SV40-Minichromosomen
Für die Reinigung von SV40 Minichromosomen wurden 30 konfluente CV1
Zellen (145 mm Zellkulturplatten) mit Wildtyp SV40-Virus infiziert. Nach 38 h
wurden die Zellen 2x mit TSS (20 mM Tris, pH 7,8, 137 mM NaCl, 5 mM KCl,
1mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 250 mM Sucrose) und dann 2 x mit LS (20 mM
Hepes-KOH, pH 7,8, 5 mM Kalium-Acetat, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT)
gewaschen. Die Zellen wurden abgeschabt und in einem 5 ml Douncer
überführt. Nach 6-maligem Douncen wurden die Kerne abzentrifugiert (2638 g,
5 min) anschließend in 200 µl HS-Puffer (20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 500 mM
Kalium Acetat, 0,5 mM MgCl2) pro Platte aufgenommen und für 2 h bei 4°C
eluiert. Danach wurden die Kerne erneut abzentrifugiert (HB-4, 4000 rpm, 5
min) und der Überstand nochmals zentrifugiert (SS34, 13.000 rpm, 5 min).
Dieser zweite Überstand wurde einem RNase A (100µg/ml) Verdau unterzogen.
Je 1 ml dieses RNase-behandelten Überstandes wurde über 5 %-30 %
Sucrosegradienten (10 mM Tris , pH 7,5, 1 mM EDTA) gereinigt. Für
salzgewaschene Minichromosomen wurden 500 mM NaCl, für native
Minichromosomen 150 mM NaCl dem Sucrosegradienten Puffer hinzugefügt.
Nach einer Zentrifugation (3h, SW40, 39.000 rpm, 4°C) wurden die Gradienten
fraktioniert. Fraktionen, die Minichromosomen enthielten (Agarosegel), wurden
vereinigt und über Nacht pelletiert (SW55, 55.000 rpm, 4°C, 16 h). Die
Material und Methoden
45
Konzentration der Minichromosomen (nach Deproteinisierung)wurde mittels
einem Standard auf einem Agarosegel bestimmt (Gruss, 1995).
3.7
Topologieassay (DEK Assay)
Zuerst wurde die benötigte Menge an rekombinantem His-DEK
(dephosphoryliert) gegen nE 300 mit 1/10 100 x BSA (10mg/ml) für 90 min auf
Schwimmfiltern bei 4°C dialysiert. 175 ng (0,05 pmol) SV40 Minichromosomen
oder SV40 DNA wurden mit unterschiedlichen Mengen an His-DEK in nE 100
(20 mM Hepes, KOH, pH 7,6, 100 mM NaCl, 10 mM Natriumbisulfit, 1 mM
EDTA) mit Topoisomerase I in einem Gesamtvolumen von 90 µl 1h bei 37°C
inkubiert. Die Proben wurden auf 1% SDS eingestellt und mit 10-20 µg
Proteinase K versetzt und für 30 min bei 55°C inkubiert. Die DNA wurde durch
Ethanolpräzipitation gefällt. Die Produkte wurden auf einem 0,8 % Agarosegel
(0,5 x TBE) aufgetrennt und durch Ethidiumbromid (EtBr)-Färbung analysiert.
3.8
DNA-Bandshiftassay (EMSA)
Um DNA-Protein Komplexe zu untersuchen, wurden 175 ng linerisierte SV40
DNA (Form III, EcoRI verdaut) mit steigenden Mengen rekombinantem His-DEK
oder Deletionsmutanten in nE 100 inkubiert. Das Reaktionsvolumen war 45 µl.
Nach einer Stunde bei 37°C wurden die Proben mit 6µl 6 x Probenpuffer
versetzt und direkt auf einem 0,6 % Agarosegel (0,5 x TBE-Spezial; 50 mM
Tris-Borat, 1 mM EDTA, auf pH 7,8 mit Borsäure eingestellt) aufgetrennt (16h, 2
V/cm), dann mittels EtBr-Färbung sichtbar gemacht.
3.9
Zellkultur, Synchronisation, Radioaktive Markierung mit
[32P]-Orthophosphat und [35S]-Methionin (Pulse- und
Pulse Chase Experimente), S-20 Extrakte, HancockChromatin und Immunpräzipitation
3.9.1
HeLa und CV1 Zellen
HeLa S3 Zellen (menschliche Zervixkarzinomzellen) und CV1- Zellen (Zellen
der afrikanischen grünen Meerkatze) wurden auf 145 mm Petrischalen als
Monolayerkultur in DMEM mit 5 % FCS (3,75 g/L NaHCO3, 4,5 g/L Glucose) bei
37°C, 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 kultiviert. Dem Kulturmedium waren
40 µg/ml Penicillin-G und 80 µg/ml Streptomycin-Sulfat zugesetzt. Die Zellen
wurden alle 2-3 Tage mit Trypsin (5 mg/ml in PBS) von der Platte gelöst und in
einem Verhältnis 1:5 umgesetzt. Zellen, die für Experimente zur Verwendung
kamen, wurden am Vortag im Verhältnis 1:2 umgesetzt, damit sie am Folgetag
subkonfluent waren.
Material und Methoden
3.9.2
46
Insektenzellen
High-5 Zellen (Eizellen aus Trichoplusia ni) und SF-9 Zellen (Ovarienzellen aus
Spodoptera frugiperda) wurden in Zellkulturflaschen als Monolayerkulturen in
Grace`s Insect Medium (Gibco BRL) mit 10 % FCS bei 28°C kultiviert. Die
Zellen wurden zum Umsetzten vom Flaschenboden geklopft und im Verhältnis
1:3 oder 1:5 umgesetzt. Floater (bei SF-9) wurden regelmäßig abgesaugt.
3.9.3
Synchronisation und in vivo Pulse-Markierung
Orthophosphat und [35S]-Methionin
mit
[32P]-
Für die Arretierung von HeLa S3 Zellen im Übergang G1/S-Phase wurde die
Methode des doppelten Thymidin-Blocks gewählt. Es wurden je 2 x 106 HeLa
Zellen in 10 ml Medium auf 94 mm Zellkulturschalen (für FACS Analysen: 8 x
105 in 2,5 ml Medium auf 64 mm Zellkulturschalen) ausgesät. Nach 4 h wurden
2 ml (0,5 ml) einer 13,2 mM Thymidin-Stammlösung (in Medium, sterilfiltriert,
äquilibriert) den Zellen gegeben (Endkonzentration 2,2 mM). Nach einer
Inkubation für 14-16 h (1.Block) wurden die Platten 2 x mit Medium gewaschen
und erneut mit der entsprechenden Menge Medium aufgefüllt und für 9 h
inkubiert (Release). Im Anschluss daran wurde wieder Thymidin zugegeben
und für weitere 12-14 h inkubiert (2. Block). Ein weiterer Release folgte. Die
Zellen befanden sich nun im G1/S Phase Übergang und laufen synchron durch
den Zellzyklus. Die Zellen wurden zu bestimmten Zeiten nach dem Release
geerntet.
Tabelle 3-1 Synchronisierung
I
II
Tag 1
6:00
Aussaat
10:00 Thymidin (1.Block)
18:00
Aussaat
22:00
Thymidin (1.Block)
24:00 Release
Tag 2
9:00
Thymidin (2.Block)
12:00
Release
21:00 Release
Thymidin (2.Block)
9:00
Release (G1/S Phase)
Tag 3
Frühe G1
Material und Methoden
47
Für die Untersuchung der Phosphorylierung von DEK wurden die Zellen mit
[32P]-Orthophosphat markiert. Die synchronisierten Zellen wurden dafür zweimal
mit 1x SSC (150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat) und einmal mit
phosphatfreiem Medium gewaschen. Es folgte eine Inkubation in 5 ml
phosphatfreiem Medium mit 200 µCi [32P]-Orthophosphat.
Für die Untersuchung der Neusynthese und Halbwertszeit von DEK wurden die
Zellen gleich behandelt und in methioninfreiem Medium mit 200 µCi [35S]Methionin markiert. Für die Ermittlung der Halbwertszeit wurden die Zellen nach
der Markierung in Medium mit einem zehnfachen Überschuss an Methionin
entlassen (Pulse-Chase).
3.9.4
FACS Analyse
Zur genauen Bestimmung der Zellzyklusphase von Zellen wurde die FACS
(fluorescence activated cell sorting)-Analyse verwendet. Mit dieser Methode
lässt sich der DNA-Gehalt einer Zelle bestimmen und damit das Stadium der
Zelle im Zellzyklus ermitteln. Die Zellen wurden dreimal mit eiskaltem PBS/5
mM EDTA gewaschen und mit 5 ml PBS/5 mM EDTA über Nacht bei 4°C auf
der Platte inkubiert. Die Zellen lösen sich durch das EDTA (Chelierung
divalenter Kationen, Zerstörung der Zell-Zell Kontakte) von der Platte ab und
wurden in Zentrifugenröhrchen gesammelt. Die Zellzahl wurde durch
Zellzählung mit dem Coulter-Counter (Beckmann) bestimmt. Für eine Messung
wurden 4x105 Zellen abzentrifugiert und in 50 µl PBS/5 mM EDTA
aufgenommen. Nun wurde die Propidiumiodid (PI) Färbelösung hergestellt. Für
4 x 105 Zellen benötigt man 18 µg PI. Es wurde eine PI Stocklösung hergestellt
(1,4 mg/ml bidest H2O). Für einen Ansatz wurden 12,8 µl PI (= 18 µg) und 0,5 %
Triton X-100 verwendet. Der Ansatz wurde auf 250 µl mit PBS/5 mM EDTA
aufgefüllt und der Zellsuspension beigefügt (Endvolumen 300µl). Die Proben
wurden für 30 min auf Eis und im Dunkeln inkubiert und anschließend in einem
FACS Gerät (FACS-Calibur, BD Bioscience) vermessen. Die Auswertung
erfolgte mit dem Programm CellQuest (BD Bioscience).
3.9.5
Herstellung von Hanckock Chromatin
Die Präparation von Chromatin nach Hancock (Hancock, 1974) beruht auf der
salzfreien Extraktion von Kernen. Deshalb mussten alle verwendeten
Glaswaren ausgiebig mit bidest H2O gespült werden, da schon geringste
Salzspuren zum Platzen der Kerne führen würden. Alle Arbeiten wurden im
Kühlraum und auf Eis durchgeführt. Eine HeLa S-3 Platte (145 mm, 2-4 107
Zellen) wurde dreimal mit je 50 ml EDTA-Puffer (0,25 mM EDTA, pH 8, 0,2 mM
Tris) gewaschen und beim letzten Schritt für 2 min inkubiert. Jetzt wurde die
Platte mit 40 ml EDTA-Puffer für 30 min auf Eis inkubiert (Zellen lösen sich von
der Platte). Der Überstand wurde abgezogen und die Zellen sehr vorsichtig von
Material und Methoden
48
der Platte geklopft. Beides wurde in einem Zentrifugenröhrchen gesammelt und
pelletiert (600 g, 10 min, 4°C, Jouan). Der Überstand wurde abgezogen und
stellt den EDTA-Überstand dar (S1). Das Pellet wurde durch sanftes Schütteln
resuspendiert, mit 10 ml EDTA-Puffer versetzt, mittels einer Pateurpipette in ein
13 ml Zentrifugenröhrchen überführt und erneut pelletiert. Der Überstand wurde
mit S1 vereinigt. Das Pellet wurde resuspendiert, in 2 ml EDTA-Puffer
aufgenommen und unter leichtem Schwenken wurden 2 ml einer 1 % NP-40
Lösung (in EDTA-Puffer) dazupippetiert und für 5 min auf Eis inkubiert. Die
Chromatinkörperchen durften nicht klumpen oder kleben, denn dies wäre ein
Zeichen für gescherte genomische DNA, die die Präparation unbrauchbar
machen würde. Die Chromatin-Lösung wurde nun auf 12 ml einer Sucrose
Lösung (100 mM Sucrose, 0,5 mM Tris, pH 8) aufgeschichtet (Corex-RG
Glasröhrchen) und für 15 min bei 4000 rpm (HB-4) zentrifugiert. Der Überstand
wurde abgenommen (NP-40 Überstand, S2), das Pellet erneut in 2 ml EDTAPuffer aufgenommen und über ein zweites Sucrose-Kissen zentrifugiert. Die
beiden Überstände wurden vereinigt. Das gallertartige, durchsichtige Pellet
enthielt nun die Chromatinkörperchen (chromatin bodies). Diese wurden in 500
µl EDTA-Puffer resuspendiert und der DNA-Gehalt wurde bei OD260 nm
vermessen. Die Proteine aus den entsprechende Überständen wurden gefällt
und die Proben mittels Immunblot analysiert.
3.9.6
Immunpräzipitation
Für die Immunfällung von DEK wurde HeLa S-3 Zellen fraktioniert (siehe 3.14).
Die Kernfraktion wurde in einem Schritt mit 450 mM NaCl extrahiert. Extrakte
wurden entweder frisch oder eingefroren verwendet. Nach dem Auftauen
wurden die Extrakte bei 4°C, 10 min abzentrifugiert (14.000 rpm, Eppifuge) um
Proteinpräzipitate zu entfernen. Im Falle von Synchronisierungsreihen wurde
der Proteingehalt der Extrakte mittels einem Proteinbestimmungskit (Pierce,
BCA) ermittelt. Die Extrakte wurden auf den gleichen Proteingehalt und auf 0,5
% NP-40 eingestellt. Für ca. 2-3 x 106 Zellen wurden 3 µg monospezifischer,
polyklonaler α-DEK Antikörper (rabbit) verwendet. Der Antikörper wurde
zusammen mit den einzelnen Extrakten für 1 h und unter ständigem Rollen bei
4°C inkubiert. Nach Zugabe von 30 µl einer 50 % Protein A Sepharose Lösung
zu den einzelnen Proben wurde eine weitere Stunde bei 4°C gerollt. Die
Immunkomplexe wurden nun dreimal mit Extraktionspuffer (20 mM Hepes, pH
7,4, 0,5 mM MgCl2, 450 mM NaCl) gewaschen (5min, 4°C, 14.000 rpm,
Eppifuge) und anschließend von der Protein A Sepharose mit 2 % SDS, 5 % βMercaptoethanol eluiert. Die Elution wurde bei 37°C für 1 h durchgeführt. Die
Beads wurden dann je dreimal nacheluiert, die Eluate vereinigt und die Proteine
mittels der Wessel und Flügge Fällung präzipitiert. Die Proteinpellets wurden
bei 55°C für mindestens 30 min getrocknet. Für die Analyse in der SDS-PAGE
wurden sie zuerst mit 2 % SDS versetzt und für 30 min bei 55°C inkubiert. Es
Material und Methoden
49
erfolgte dann die Zugabe von 200 mM DTT (Endkonzentration) und Inkubation
für 10 min bei RT. Zuletzt wurde den Proben ein 10 x Lämmli-Ergänzungspuffer
(10x, 50 % Glycerin, 40 % β-Mercaptoethanol, 10 % 1M Tris, pH 7,6)
beigemischt und für 10 min bei 95°C gekocht. Diese Prozedur verhindert große
Antikörperkomplexe im Gel, die zu Fehlinterpretationen in der nachfolgenden
Analyse führen würden. Die Proben wurden nun durch SDS-PAGE aufgetrennt,
auf eine Membran transferiert und mittels Autoradiographie und Immunblot
analysiert.
3.9.7
Herstellung von S-20 Extrakten
Für die Herstellung von S-20 (S-100) Extrakten wurden 10-20 HeLa S-3 Platten
(145 mm Ø) verwendet. Alle Arbeiten wurden im Kühlraum und auf Eis
durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, mit
einem Gummischaber von der Platte entfernt und in 13 ml Zentrifugenröhrchen
gesammelt. Nun wurden sie pelletiert (164 g, 10 min, 4°C, Jouan) und in 5 ml
hypotonem Puffer plus Sucrose aufgenommen (20 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 5
mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 250 mM Sucrose, 0,1 mM DTT (kurz vor Gebrauch
zugeben) ) und erneut pelletiert. Das Zellpellet wurden nun in 10 ml hypotonem
Puffer ohne Sucrose aufgenommen und erneut pelletiert. Das Volumen des
Pellets verdoppelt sich bei diesem Schritt. Falls bei der Pelletierung keine
eindeutige Grenze zwischen Pellet und Überstand zu sehen war, wurde erneut
zentrifugiert. Das Pellet wurde nun in einen Douncer überführt (5 ml, S- Fit) und
für 10 min auf Eis inkubiert (weitere Schwellung der Kerne). Anschließend
wurde 12 mal gedounct (Brechen der Zellmembran) und die Zellsuspension
wurde für weitere 30 min auf Eis inkubiert (Elution der Kernproteine). Die
Suspension wurde dann in Ultrazentrifugenröhrchen überführt und für eine
Stunde zentrifugiert (z.B TLA-45, 20.000 g (20.000 rpm), 100.000 g (45.000
rpm), 4°C), der Überstand abgenommen, vereinigt und in vorgekühlte
Reaktionsgefäße aliquotiert und bei – 70°C gelagert. Die Pelletfraktion wurde
bei Bedarf mit steigenden NaCl Mengen, oder SDS nacheluiert und wie oben
beschriebenen behandelt. Es folgte eine Proteinbestimmung mit BSA als
Standard (Biorad- Assay). Die gelagerten Extrakte wurden maximal 3 Monate
verwendet.
3.10
In Vitro Phosphorylierung
Rekombinantes, dephosphoryliertes His-DEK wurde mit S-20 Extrakt (150 µg
Gesamtprotein), in der Anwesenheit von 1 mM Na-Vanadat, 20 mM NaF, 1 x
Complete und 30 µCi [γ-32P] ATP (spezifische Radioaktivität > 4000 Ci/mmol)
bei 30°C für verschiedene Zeitpunkte inkubiert. Bei Verwendung von Inhibitoren
(z.B TBB) wurden diese 10 min vor Reaktionsbeginn (= Zugabe von His-DEK
und [γ-32P] ATP) zu dem Ansatz gegeben und auf Eis vorinkubiert. Die
Material und Methoden
50
Phosphorylierungsreaktion wurde durch Zugabe von 500 mM NaCl, 0,5 % NP40 und 40 µM ATP (im Premix) auf Eis abgestoppt. His-DEK wurde nun über
Ni-NTA Agarose aus dem Ansatz gereinigt. Elution der Beads erfolgte mittels
dreimaliger Elution mit 2 % SDS bei 55°C. Die Eluate wurden vereinigt und
Wessel-Flügge-gefällt. Die Proben wurden mittels Immunblot und
Autoradiographie untersucht. Rekombinantes Geminin, das als Kontrolle diente,
wurde über Immunfällung aus den Ansätzen gereinigt und gleich behandelt
(Kulartz et al., 2003).
3.11
In-Gel-Kinaseassay
Vor dem Gießen des SDS-Polyacrylamid-Geles wurde der Gelmixtur 40 µg/ml
dephosphoryliertes His-DEK beigefügt. Das Gel wurde gegossen, und während
der Auspolymerisierung erfolgte eine kovalente Kopplung von DEK an die
Polyacrylamid Struktur. Nun trennte man über dieses Gel steigende Mengen an
S-20 HeLa Zellextrakt und gereinigte Kinasen (SDS-PAGE unter
Standardbedingung). Das Gel wurde nach der Elektrophorese zweimal mit
Puffer A (50 mM Tris, pH 8, 20 % Isopropanol, je 30 min mit 100 ml), zweimal
mit Puffer B (50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM β-Mercaptoethanol, je 30 min mit 100
ml) und einmal für 1 h in Puffer C (Puffer B + 6 M Guanidinium-HCl, 200 ml)
inkubiert. Dies diente der Entfernung von SDS und der erneuten Denaturierung
der Proteine. Um nun die Proteine zu renaturieren, wurde das Gel über Nacht
bei 4°C in Puffer B + 0,05 % Tween geschwenkt (je 200 ml mit 5
Pufferwechseln). Dann wurde es kurz in Kinase Puffer (25 mM Hepes, pH 7,8,
10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 25 µM ATP) geschwenkt und in 10 ml Kinase
Puffer mit 10 µCi [γ-32P] ATP /ml für eine Stunde bei 25°C inkubiert. Es
erfolgten Waschschritte: 5 x mit je 200 ml Puffer D (5 % TCA, 1 % NaPyrophosphat) über einen Zeitraum von 2-3 h. Eine Commassie Färbung wurde
durchgeführt, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Nach erfolgter
Trocknung wurde das Gel in der Autoradiographie analysiert (Geahlen et al.,
1986), (Lacks and Springhorn, 1980; Kameshita and Fujisawa, 1989).
3.12
Filter-Bindungs-Assay
Rekombinantes, dephosphoryliertes His-DEK wurde mit verschiedenen
gereinigten Kinasen inkubiert (je 10 units). Die Kinasen und His-DEK wurden in
dem entsprechenden Puffer in Anwesenheit von 1 µCi [γ-32P] ATP für
verschiedene Zeiten bei 30°C inkubiert. Zum Stoppen der Reaktion wurden
Aliquote abgenommen, in 5 ml 5% Na-Pyrophosphat verdünnt und auf
Nitrocellulose-Filter gebracht (Filtrationsapparatur). Die Filter wurden dann
dreimal mit definierten Volumina 5% Na-Pyrophosphat gewaschen, getrocknet
und in einem Liquid Scintillation Counter vermessen.
Material und Methoden
51
Folgende Puffer wurden zur Messung der Phosphorylierungsaktivität der
Proteinkinasen verwendet:
-CK2:
20 mM Hepes, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2
-PKC:
20 mM Hepes, pH 7,4, 2 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 1mM DTT
-GSK-3:
20 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT
Gereinigte Protein Kinase CK2 (Holoenzym, bis zur Homogenität aus
Rattenleber aufgereinigt) war ein Geschenk von L.A Pinna (Universität Padua,
Italien). Protein Kinase C (PKC, Mischung aus α, β, γ Isoformen aus Rattenhirn
aufgereinigt) und Glykogen Synthase Kinase 3 (GSK-3, β-Isoform, rekombinat
aus E.coli) wurden käuflich erworben.
Für Filterbindungen mit radioaktiv markierter DNA wurden 10 ng SV40 DNA
(Markierung siehe 3.13) mit steigenden Mengen an dephosphoryliertem,
rekombinantem oder CK2-phosphoryliertem His-DEK in einem Gesamtvolumen
von 30µl, entweder in nE50 oder nE100 angesetzt. Nach einer Inkubation für 1
h bei 37°C wurden die Proben auf Nitrocellulose-Filter gebracht und dreimal mit
je einem ml nE50 oder nE 100 gewaschen. Die Auswertung erfolgte wie oben
beschrieben.
3.13
South-Western-Analysen
Um Protein-DNA Wechselwirkungen zu untersuchen, wurde die Methode des
South-Western Assays verwendet. SV40-DNA wurde zuerst mit der
Restriktionsendonuklease Hinf I verdaut, um Fragmente verschiedener Länge
zu bekommen und 5`-Überhänge zu generieren. 5-10 pmol dieser DNA wurden
nun mit je 7 mM dGTP, dTTP, dCTP und 20-50 µCi [α-32P] ATP, und KlenowPolymerase für 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz über
eine Sephadex G25-Spin-Säule gereinigt. Der erhaltene Einbau wurde im
Szintillationszähler nach Cherenkow ermittelt. Identische Mengen an
dephosphoryliertem und phosphoryliertem His-DEK wurden über SDS-PAGE
aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Diese Membran
wurde nun mit 50 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA und 5
% Magermilchpulver für eine h bei RT geblockt. Als Sonde wurden 1x106
cpm/ml Hinf I und endmarkierte SV40-DNA verwendet. Nach einer Inkubation
für 1 h bei RT, wurde die Membran 5x mit 10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1
mM DTT und 1 mM EDTA gewaschen, getrocknet und eine Autoradiographie
und ein Immunblot durchgeführt.
3.14
Zellfraktionierung
Eine nicht subkonfluente HeLa S3 Zellplatte (145 mm Ø, am Vortag 1:2
umgesetzt) wurde dreimal mit eiskaltem hypotonem Puffer gewaschen (20 mM
Material und Methoden
52
Hepes, pH 7,4, 20 mM NaCl, 5 mM MgCl2), um Mediumproteine zu entfernen.
Die Zellen wurden vorsichtig von der Platte geschabt, in einem 13 ml Röhrchen
gesammelt und auf ein Endvolumen von 5 ml eingestellt. Die verwendete
Puffermenge wurde immer der Plattengröße angepasst. Die Zellen wurden nun
für 15 min auf Eis inkubiert, dann durch fünfmaliges douncen aufgebrochen.
Durch das Magnesium im Puffer bleiben die Kernporenkomplexe geschlossen
und die Kerne intakt. Nun wurde die Zellsuspension für 5 min bei 2000 rpm
abzentrifugiert (HB-4, 4°C), um im Überstand das Cytosol zu erhalten (alle
löslichen cytosolischen Proteine). Das Pellet wurde gevortext, mit 1 ml
hypotonem Puffer versetzt, erneut gevortext und auf 5 ml mit hypotonem Puffer
aufgefüllt. Unter Schwenken wurden tropfenweise 250 µl einer 10 % NP-40
Lösung dazupipettiert (Endkonzentration 0,5 %) und für 15 min auf Eis
inkubiert. NP-40 ist ein nicht-ionisches Detergenz, das die Kernmembran sanft
zerstört. Dadurch werden lösliche nukleosolische und nicht NP-40 resistente
Proteine freigesetzt. Eine erneute Zentrifugation (2500 rpm, HB-4, 5 min, 4°C)
ergibt das Nukleosol. Des resultierende Pellet enthält nun alle
chromatingebundenen Proteine, die Kernmatrix und genomische DNA. Diese
Struktur lässt sich nun mit steigenden NaCl Mengen extrahieren (20 mM Hepes,
pH 7.4, 0.5 mM MgCl2, 0-500 mM NaCl, +- 300 mM Sucrose). Das Pellet wurde
hierfür in dem entsprechenden Puffer aufgenommen, für 15 min auf Eis
inkubiert und wie oben zentrifugiert.
3.15
Mikrokokken Nuklease Verdau
Mikrokokken Nuklease (MNase) ist ein häufig verwendetes Werkzeug in der
Chromatin-Forschung. MNase schneidet im „linker“-Bereich zwischen zwei
Nukleosomen und hat die Eigenschaft RNA zu degradieren. Je nach MNase
Menge und Dauer des Verdaus kann man verschieden lange
Chromatinfragmente, bis hin zum Mononukleosom aus dem Zellkern freisetzen
und diese analysieren. Die Zellkerne von HeLa S3 Zellen wurden analog zu
Punkt 3.14 extrahiert. Cytosol und Nukleosol wurden verworfen, die Kerne dann
zweimal mit 50 mM oder 100 mM NaCl Kernextraktionspuffer gewaschen. Nach
dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in 0.5 ml Extraktionspuffer
aufgenommen und die OD260nm bestimmt. Die Kernlösung wurde auf 500 µg
DNA/ml und 2 mM CaCl2 eingestellt, dann für 10 min bei 14°C äquilibriert. Mit
der Zugabe der MNase wurde die Reaktion gestartet. Abgestoppt wurde zu der
gewünschten Zeit auf Eis und durch Zugabe von 8 mM EDTA
(Endkonzentration).
Freigesetzte
Chromatinfragmente
wurden
durch
Zentrifugation (10 min, 14.000 rpm, Eppifuge, 4°C) von unlöslichen
Bestandteilen getrennt. Der Überstand enthält nun die gewünschten Mono- bis
Oligonukleosomen mit den daran gebundenen Proteinen.
Material und Methoden
3.16
53
Sucrose-Dichtengradientenzentrifugation
Dephosphoryliertes, rekombinantes His-DEK wurde mit salzgewaschenen
SV40-Minichromosomen in Anwesenheit von 10 units Topoisomerase I für 1 h
in nE 50 (20 mM Hepes, pH 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM Na-Bisulfit, 1 mM EDTA)
und 37°C inkubiert (molares Verhältnis DEK/DNA : 60). Danach wurden 2 mM
Na-Vanadat, 30 mM NaF, 50 µM ATP und 60 µCi [γ-32P] ATP zu dem Ansatz
gegeben. Um die in situ Phosphorylierung zu starten, wurde zu den DEKhaltigen Minichromosomem 300 units CK2 gegeben und für eine weitere h bei
37°C inkubiert. Die Proben wurden nun auf 5 -30 % Sucrose Gradienten (nE 70,
2 mM Vanadat, 30 mM NaF) aufgeschichtet und für 3 h bei 36.000 rpm in einem
SW40 Rotor zentrifugiert. Die Gradienten wurden in 600 µl Fraktionen eingeteilt.
Die einzelnen Fraktionen wurden halbiert, aus einer Hälfte wurde die DNA, aus
der anderen Hälfte die Proteine aufgereingt.
Für die Auftrennung von nativen Oligonukleosomen wurden 5-40 % Sucrose
Gradienten verwendet (in 20 mM Hepes, pH 7,5, 0,5 mM MgCl2, 100 mM NaCl,
1 mM Na-Vanadat, 30 mM NaF). Nach der Zugabe von dephosporyliertem und
CK2 phosphoryliertem His-DEK wurden die nativen Oligonukleosomen für 1 h
bei 37°C, in der Anwesenheit von Protease –und Phosphatase Inhibitoren
inkubiert. Die Zentrifugation erfolgte für 14 h bei 36.000 rpm bei 4°C. Die
Aufreinigung der Proteine und der DNA vollzog sich wie oben beschrieben.
3.17
RNA-Präparation, Reverse Transkription und Real Time
PCR
Gesamt RNA wurde aus HeLa S3 Zellen mittels eines RNAeasy Kit (Qiagen)
gereinigt und DNAse I verdaut. Die Konzentration der RNA wurde
photometrisch und die Qualität wurde auf einem Agarosegel bestimmt (als
Indikator wurde die 18 S und 28 S rRNA verwendet, welche klare, scharfe
Banden liefern mussten). Die Reverse Transkription wurde folgendermaßen
durchgeführt:
-1 µg Gesamt-RNA + 0,5 µg (25 pmol) OligodT –Primer
-auf 11 µl mit RNAse-freiem Wasser auffüllen
-5 min bei 70°C inkubieren
-+ 5 µl 5 x Reaktionspuffer
-+ 2µl 10 mM dNTP Mix
- +0,5 µl RNAse Inhibitor (20 units)
- +0,5 µl RNAse-freies Wasser
-5 min bei 37°C inkubieren
Material und Methoden
54
-
+ 1 µl Reverse Transkriptase (200 units, RevertAid M-MuLV Reverse
Transcriptase, MBI Fermentas)
-
60 min bei 42°C inkubieren, 10 min bei 70°C
-
cDNA mittels Ethanol Präzipitation fällen
-
PCR mit spezifischen Primern
Für die PCR Reaktion wurden DEK-spezifische und als interne Kontrolle β-Aktin
spezifische Primer verwendet (je 5 pmol).
DEK–89-for:
5`-CGA AAT GCC CGG TCC CAG AGA-3`
DEK–634-rev:
5`-TCG CTT AGC CTT CCT TGC CAT TCC-3`
β-Aktin-583-for:
5`-CTA GAA GCA TTT GCG GTGGAC CAT-3`
β-Aktin-1169-rev:
5`-CTG GCC GGG ACC TGA CTG AC-3
Für die spezifische c-DNA Amplifikation wurde das LightCycler System (Roche)
mit dem LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I Kit nach den
Empfehlungen des Herstellers verwendet. Als Standard wurde eine
Verdünnungsreihe von 5-5000 pg cDNA von asynchronen HeLa S3 Zellen
verwendet.
3.18
Massenspektrometrie
3.18.1 In-Gel-Verdau
His-DEK wurde dephosphoryliert und durch CK2 in vitro rephoshoryliert.
Auftrennung erfolgte durch SDS-PAGE (10 %) und das Gel wurde durch
Coomassie gefärbt. Die Banden wurden ausgeschnitten und in einer 60 %
Acetonitril/H2O Mischung für 20 min bei 25°C entfärbt. Nach der Lyophilisierung
der Gelstücke wurden diese mit 50 mM NH4HCO3 für 20 min bei 25°C wieder
rehydriert. Dies wurde zweimal wiederholt und die letzte Rehydration erfolgte
mit 12.5 ng Trypsin (modified Trypsin, Promega)/ µl in 50 mM NH4HCO3 für 45
min bei 4°C. Die Gelstückchen wurden dann für 12 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die Elution der Peptidfragmente erfolgte mit einer 60% Acetonitril/H2O
Mischung für 3-4 Stunden. Die Eluate wurden bis zur Trockenheit lyophilisiert.
Vor der Analyse wurden die Proben durch Behandlung mit ZipTipC18, nach den
Empfehlungen des Herstellers, entsalzt und mit einem GELoader tip
(Eppendorf) in einem Volumen von 5 µl einer 50 % Methanol/0,1 % CH3COOH
Lösung in die Nanospray Nadel überführt.
3.18.2 Triple-Quadrupole-Ion-Trap-Massenspektrometrie
Zur Identifizierung der Phopshoakzeptor Stellen in dem DEK Protein wurde das
Q TRAP Massenspektrometer (Applied Biosystems MDS SCIEX Q TRAP
Material und Methoden
55
LC/MS/MS System) verwendet. Phosphopeptide tendieren durch Kollision in
einem Energiefeld ihre Phosphatgruppen zu verlieren. Der Verlust einer
Phosphatgruppe, PO3, hat ein Charakteristikum von m/z von entweder 79 Da im
negativen Ionen-Modus oder von 98 Da im positiven Ionen-Modus. Dies
entspricht dem Verlust von entweder H3PO4oder HPO32-und H2O (b Elimination,
neutral loss). Diese Eigenschaft wurde auf der Suche nach
Phosphorylierungsstellen ausgenutzt. Die Methode der Quadrupole Ion Trap
Massenspektrometrie wurde also dazu verwendet, zuerst Phosphopeptide zu
isolieren, diese durch MS/MS zu charakterisieren um dann durch den Verlust
der Phosphatgruppe auf die Phosphoryrielungsstelle zu schließen.
3.18.3 Datenbank-Suche und Kennzeichnung der Phosphopeptide
Die gesamten MS/MS Daten wurden direkt mit dem Analyst Programm (Applied
Bioscience) in Kombination mit der MASCOT MS/MS Ion Search Engine
(www.matrixscience.com) ausgewertet. In die Auswertung flossen ein: Trypsin
(modified), Phosphorylierung und Oxidation von Methionin. Für alle gefundenen
Peptide wurden die Spektren noch manuell ausgewertet. Es standen genügend
Information zur Verfügung, um die Peptidsequenz samt der phosphorylierten
Aminosäuren anzugeben.
4
Ergebnisse
4.1
Biochechemische Charakterisierung von DEK in vivo
DEK wurde in früheren Studien als chromatingebundenes Protein identifiziert,
dessen
Lokalisierung,
Menge
und
Chromatinbindung
keiner
zellzyklusspezifischen Schwankung unterliegt (Kappes et al., 2001). Hier sollten
im Anschluss an die biochemischen Charakterisierungen die DEK mRNAMenge, die Neusyntheserate, die Halbwertszeit und die Phosphorylierung von
DEK während des Zellzyklus studiert werden.
4.1.1
DEK mRNA während des Zellzyklus
Verschiedene Studien zeigten, dass DEK in stark proliferierenden Zellen und in
Krebszellen eine erhöhte Expression aufweist, jedoch war nicht bekannt, ob die
Expression innerhalb eines Zellzyklus einer Regulation unterliegt. Diese
Fragestellung wurde im Folgenden behandelt.
Zur Ermittlung der DEK-mRNA-Menge während des Zellzyklus wurden HeLa
S3-Zellen mittels eines doppelten Thymidinblocks synchronisiert und die
Gesamt-mRNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Release gewonnen
und mittels reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Um Histon-mRNAs
und rRNAs, die den Hauptbestandteil der Gesamt-RNA bilden, zu eliminieren,
wurden zum Umschreiben in cDNA oligo-dT Primer verwendet. Dadurch
erfolgte die ausschließliche Amplifikation von proteinkodierenden mRNAs mit
einem polyA-Ende. Eine Analyse der so gewonnenen c-DNAs durch RealTimePCR mit DEK-spezifischen Primern erfolgte im Anschluss. Als interne Kontrolle
diente β-Aktin, dessen mRNA-Menge zu allen Zeitpunkten im Zellzyklus
konstant vorliegt. Die Spezifität der RealTime-PCR für DEK und β-Aktin wurde
durch Schmelzpunktanalysen und Agarosegelelektrophorese überprüft (Daten
nicht gezeigt).
Ergebnisse
57
Abbildung 4-1 DEK m-RNA während des Zellzyklus
HeLa S3 Zellen wurden mittels eines doppelten Thymidinblocks synchronisiert. Zu den angegebenen
Zeiten nach dem Release (0h: G1/S-Phase-Übergang, 3h: frühe S-Phase, 6h: max. S-Phase, 9h:
G2/Mitose, 12h: frühe G1-Phase, 15, 18h : Mitte- und späte G1-Phase, 21h: G1/S-Phase-Übergang)
wurde Gesamt-RNA extrahiert und durch reverse Transkiptase in cDNA umgeschrieben. Die cDNA wurde
mittels RealTime-PCR quantifiziert (Daten wurden gegen β-Aktin normiert). Gezeigt sind gemittelte Werte
aus 2 unabhängigen Experimenten. Die Zellzyklusstadien wurden parallel durch FACS analysiert.
In Abbildung 4-1 ist zu erkennen, dass die DEK-mRNA-Menge zu allen
gemessenen Zeitpunkten im Zellzyklus konstant ist. In der G1-Phase ist ein
leichter, jedoch nicht signifikanter Anstieg der mRNA-Menge zu beobachten (15
h release).
4.1.2
Neusynthese des DEK-Proteins während des Zellzyklus
Da die mRNA-Menge von DEK keiner oder nur einer geringen
zellzyklusabhängigen
Schwankung
unterliegt,
war
es
in
diesem
Zusammenhang interessant, die Neusynthese von DEK zu untersuchen. Dafür
wurden HeLa S3 Zellen, wie in 4.1.1 beschrieben, synchronisiert und mit [35S]Methionin für je drei Stunden vor der Ernte markiert (Abbildung 4-2, Zeitpunkt
der Ernte = 3h Markierung). So erreicht man eine Markierung der
neusynthetisierten Proteine in diesem Zeitfenster. Die Zellen wurden zu den
angegebenen Zeitpunkten geerntet und DEK mittels Immunfällung aus den 450
mM NaCl-Extrakten präzipitiert, wobei die Fällung von DEK aus den einzelnen
Proben immer quantitativ war (Daten nicht gezeigt). Die Analyse der
gewonnenen Immunkomplexe erfolgte über SDS-PAGE, Autoradiographie und
Immunblot (Abbildung 4-2).
Ergebnisse
58
Abbildung 4-2 Neusynthese von DEK während des Zellzyklus
HeLa S3 Zellen wurden durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und vor den angegebenen
35
Zeitpunkten für 3 Stunden mit je 200 µCi [ S]-Methionin markiert. Nach einer Zellfraktionierung wurde
DEK mittels monospezifischen, polyklonalen Antikörpern aus dem 450 mM-NaCl-Extrakt gefällt. Die
Extrakte der einzelnen Zeitpunkte wurden in ihrem Gesamtproteingehalt angeglichen. Die Immunkomplexe
35
wurden durch Immunblot (DEK) und Autoradiographie ( S) analysiert. Oben sind die Zellzyklus-Phasen
angegeben (durch FACS analysiert, Daten nicht gezeigt). IgGHc kennzeichnet die Position der schweren
Immunglobulin-Kette. Die erhaltenen Banden wurden mittels eines Densitometrie-Programmes (NIHImager) ausgewertet und in einem Balkendiagramm dargestellt (unten), wobei das Verhältnis von
Immunblot/Autoradiographie gezeigt ist.
Die Neusynthese von DEK erfolgt während des ganzen Zellzyklus und ist keiner
signifikanten Schwankung unterworfen, was mit der mRNA-Menge korreliert
(Abbildung 4-1). In den Proben 15, 18 und 21 wurde weniger DEK gefällt, was
Ergebnisse
59
auf den Proteinabgleich zurückzuführen ist, denn die Gesamt-DEK-Menge
ändert sich innerhalb des Zellzyklus nicht (Kappes et al., 2001).
Diese beiden Beobachtungen (Abbildung 4-1, Abbildung 4-2) zeigen, dass DEK
während des ganzen Zellzyklus neu synthetisiert wird. Da es jedoch zu keiner
Zunahme oder Akkumulation kommt (Kappes et al., 2001), stellt sich die Frage,
wie stabil ein neu synthetisiertes DEK-Molekül in der Zelle ist. Um diesen Punkt
näher zu untersuchen, wurden „Pulse-Chase“-Experimente durchgeführt.
4.1.3
Halbwertszeit des DEK-Proteins in vivo
Zur Untersuchung der Halbwertszeit von DEK wurden asynchron wachsende
HeLa S3-Zellen für drei Stunden mit radioaktivem [35S]-Methionin markiert
(„pulse“), dann in Medium mit zehnfachem Überschuss an Methionin entlassen
und bis zu 72 Stunden weiter kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden
die Zellen geerntet, eine Zellfraktionierung durchgeführt und DEK quantitativ
über Immunfällungen aus den 450 mM-NaCl-Extrakten gewonnen. Nach der
Analyse der Immunkomplexe durch Autoradiographie und Immunblot wurden
die Signale densitometrisch verglichen und als Funktion der Zeit aufgetragen
(Abbildung 4-3, unten). Der 0-Wert (nach 3h Markierung) wurde als 100%
gesetzt. Nach 24 h waren noch 47% der anfänglich markierten DEK-Population
detektierbar. Daraus lässt sich eine relative Halbwertszeit von 20 h errechnen.
Es scheinen verschiedene DEK-Populationen vorzukommen, da bei 60 h nur
noch 12,5 % der DEK Population markiert sein sollten, eine Halbwertszeit von
20 Stunden vorausgesetzt. Tatsächlich sind noch 21 % der DEK Population
markiert. Dies könnte ein Hinweis auf die Existenz von verschiedenen DEKPopulationen sein, die vielleicht abhängig von ihrer posttranslationalen
Modifikation oder ihren Bindungspartnern verschieden schnell abgebaut
werden.
Ergebnisse
60
Abbildung 4-3 Halbwertszeit von zellulärem DEK
A.
B.
4.1.4
Asynchron wachsende HeLa S3 Zellen wurden für drei Stunden mit 200 µCi [35S]-Methionin
markiert („pulse“). Die Zellen wurden anschließend in Medium mit einem 10-fachen Überschuss
an Methionin kultiviert („chase“) und zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Nach einer
Zellfraktionierung und Abgleich der Proteinmengen wurde DEK mittels monospezifischen,
polyklonalen Antikörpern aus dem 450 mM-NaCl-Extrakt gefällt. Die Immunkomplexe wurden
durch Immunblot und Autoradiographie analysiert. IgGHc kennzeichnet die Position der schweren
Immunglobulin-Kette. Als Kontrolle wurde HeLa S3-Extrakt aufgetragen.
Die erhaltenen Banden wurden densitometrisch (NIH-Image) ausgewertet und in einem
Diagramm als Zeitfunktion aufgetragen Dargestellt ist das Verhältnis von Immunoblot zu
Autoradiographie. Die Position eines Proteinstandards ist in kDa angegeben.
DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert
Da weder die Lokalisierung noch die Neusynthese von DEK zellzyklusabhängig
sind, sollten im Folgenden posttranslationale Modifikationen von DEK
untersucht werden. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass transient
exprimiertes DEK in vivo phosphoryliert werden kann (Fornerod et al., 1995),
allerdings wurde die DEK-Phosphorylierung bisher nicht näher charakterisiert.
So sollte hier die Phosphorylierung von endogenem DEK während des
Zellzyklus untersucht werden. Dafür wurden HeLa S3-Zellen synchronisiert und
nach dem Entlassen aus dem Thymidinblock für je zwei Stunden mit [32P]Orthophosphat markiert. Nach einer Zellfraktionierung der einzelnen Ansätze
erfolgte die quantitative Fällung von DEK aus den 450 mM-NaCl-Extrakten
Ergebnisse
61
mittels DEK-spezifischen Antikörpern. Die Immunkomplexe wurden
anschließend durch SDS-PAGE, Autoradiographie und Immunblot analysiert.
Um die Zellzyklusphasen zu kontrollieren, wurden parallel zu der Markierung
HeLa S3-Zellen, die gleich behandelt wurden, für die FACS-Analyse präpariert
(Abbildung 4-4, oben). In Abbildung 4-4, A ist zu erkennen, dass im ganzen
Zellzyklus radioaktives [32P]-Orthophosphat in DEK inkorporiert wurde (32P). Ein
Vergleich von Immunblot (α-DEK) und Autoradiographie (32P) zeigt, dass die
Phosphorylierung von DEK in der G1-Phase ihr Maximum erreicht (unteres
Balkendiagramm). Eine Behandlung der gefällten Immunkomplexe mit λPhosphatase (eine Serin/Threonin spezifische Protein-Phosphatase) führte zu
einem Verlust der radioaktiven Markierung (Abbildung 4-4, B). Infolgedessen
muss es sich bei den in vivo Phosphoakzeptorstellen von DEK um Serine oder
Threonine handeln (siehe dazu Kapitel 4.3.3).
Ergebnisse
62
Abbildung 4-4 Phosphorylierung von DEK in vivo
A.
B.
HeLa S3-Zellen wurden durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und für zwei h mit
32
200 µCi [ P]-Orthophosphat markiert. Angegeben ist der Zeitpunkt der Ernte. Die Zellen wurden
fraktioniert und die Kerne mit 450 mM NaCl extrahiert. Aus den verschiedenen Extrakten wurde
DEK mittels monospezifischer Antikörper präzipitiert. Die Immunkomplexe wurden durch SDS32
PAGE, Immunblot (α-DEK) und Autoradiographie ( P) analysiert. IgGHc kennzeichnet die
schwere Kette des Antikörpers. Die Intensitäten der Autoradiographiesignale und des Immunblots
wurden densitometrisch vermessen (NIH-Image) und als relative Phosphorylierung in einem
Diagramm dargestellt (A, unten).
Die Immunkomplexe des 14 h-Wertes (A) wurden für 30 min bei 37°C mit λ-Phosphatase
behandelt. Der Immunblot wurde mit monoklonalen DEK Antikörpern (unten) durchgeführt. Die
Autoradiographie ist oben dargestellt.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit sollte die DEK-Phosphorylierung näher
charakterisiert werden. Für dieses Vorhaben wurde rekombinantes Wildtyp
(wt)DEK benötigt.
4.2
Expression, Reinigung und Charakterisierung von
rekombinantem His-DEK mit Hilfe des BaculovirusExpressionssystem
Zu Beginn dieser Arbeit standen zwei DEK Quellen zur Verfügung: zum einen
rekombinantes DEK als Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsprotein aus E.
coli (Alexiadis et al., 2000), (Waldmann et al., 2002) und zum anderen
rekombinantes DEK als Hexa-Histidin-(His) Fusionsprotein, exprimiert in COS
Zellen. Für den Erfolg dieser Arbeit war es zunächst wichtig, polyklonale DEKAntikörper in ausreichenden Mengen herzustellen. Das bisher verwendete
GST-DEK eignete sich für diesen Zweck nicht, da GST selbst sehr immunogen
ist. Die Ausbeuten an His-DEK, das in COS-Zellen exprimiert wurde, war
dagegen zu gering, um eine erfolgreiche Immunisierung durchzuführen. Da eine
Expression von His-DEK in E. coli nicht möglich war, sollte die Expression im
Baculovirus-System durchgeführt werden. Ein weiterer Vorteil von HistidinFusionsproteinen ist, dass der His-„Tag“ kleiner ist als der GST-„Tag“ (26 kDa)
und daher keinen oder nur einen geringen Einfluss auf die biochemischen
Eigenschaften des zu untersuchenden Proteins hat. Vom GST-„Tag“ dagegen
ist bekannt, dass es zu einer Dimer-Ausbildung neigt (Awasthi et al., 1994), was
in Studien zu Protein-Multimerisierungen hinderlich sein könnte.
Der Vorteil eines eukaryotischen Expressionsytems liegt in der korrekten
posttranslationalen Modifikation und Faltung der überexprimierten Proteine.
Die DEK-c-DNA wurde in den pBacBlueHis2 A-Vektor kloniert (F. Kappes),
durch homologe Rekombination wurden rekombinante Viren gewonnen, und
nach „Plaque“-Reinigung wurde ein „High-Titer“-Virusstock hergestellt. Es folgte
die Infektion von High5-Zellen. Die Reinigung von His-DEK wurde auf Reinheit
und Expressionsmenge hin optimiert. Es stellte sich nach verschiedensten
Optimierungsschritten heraus (Daten nicht gezeigt), dass das meiste Protein bei
Ergebnisse
63
1,3 M NaCl löslich war. Daraus kann auch geschlossen werden, dass das
überexprimierte Protein nicht in „occlusion bodies“ vorliegt. Wie in Abbildung
4-5 gezeigt, erfolgte die Lyse der infizierten Zellen mit 150 mM NaCl (rechts)
und mit 1,3 M NaCl (links). Zu sehen ist, dass bei einer Lyse mit 1,3 M NaCl
wesentlich mehr lösliches Protein vorhanden ist (Spur Load versus Pellet) und
dadurch die Sauberkeit des rekombinanten Proteins erheblich gesteigert wurde
(vergleiche Fraktionen 1-4). Kontaminationen durch DNasen, Topoisomerasen
und RNA, die in nachfolgenden Assays störend sein könnten, wurden so
komplett vermieden (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 4-5 Reinigung von wtHis-DEK aus dem Baculovirus-System
Drei Tage nach Infektion mit einem „High-Titer“-Virus Stock wurden die infizierten Zellen geerntet und mit
150 mM oder 1,3 M NaCl lysiert. Unlösliche Bestandteile wurden abzentrifugiert und in 2% SDS
resuspendiert (Pellet). Der Überstand wurde auf 0,7 M NaCl mit Lysepuffer verdünnt (Load) und mit NiNTA-Agarose inkubiert. Das Material wurde in eine Säule überführt und der Durchfluss gesammelt (Flow).
Die Ni-NTA-Agarose wurde gewaschen und mit einem halben Säulenvolumen zehnmal eluiert. Alle
Proben wurden auf einem 10 % SDS-Polyacrylamid Gel aufgetrennt und mittels Coomassie wurden die
Proteine sichtbar gemacht. Die Position eines Proteinstandards ist in kDa angegeben.
4.2.1
His-DEK aus dem Baculovirus-System ist hoch phosphoryliert
Da bekannt ist, dass in Insektenzellen Proteine hyperphosphoryliert exprimiert
werden können, wurde His-DEK zunächst auf den Phosphorylierungsstatus hin
untersucht. Dazu erfolgte eine Inkubation von gereinigtem His-DEK mit λPhosphatase.
Diese
Behandlung
resultierte
in
einer
erhöhten
gelelektrophoretischen Mobilität (Abbildung 4-6, A), was darauf hinweist, dass
Phosphatreste entfernt wurden. Da in den nachfolgenden Experimenten
(Kapitel 4.3) His-DEK in in vitro-Phosphorylierungsexperimente eingesetzt
werden sollte, wurde getestet, wie sich die Phosphorylierung von His-DEK
durch das Baculovirus-System auswirkt. Dazu wurde rekombinantes His-DEK
unbehandelt oder dephosphoryliert in die in vitro Phosphorylierung mit
Zellextrakt und radioaktivem [32P]γ-ATP eingesetzt (siehe dazu Kapitel 4.3.1).
Eine Dephosphorylierung von His-DEK vor Einsatz in den Assay resultierte in
Ergebnisse
64
einer gesteigerten Effizienz der Phosphorylierung (Abbildung 4-6, B, +PPase, +
in vitro Phosph., 32P) im Vergleich zum Ansatz ohne vorherige
Dephosphorylierung (B, -PPase, + in vitro Phosph., 32P). Dies ist ein weiterer
Hinweis darauf, dass His-DEK phosphoryliert aus dem Baculovirus-System
gereinigt wird. Wie in Abbildung 4-4, B gezeigt, konnten die Phosphatreste von
in vivo phosphoryliertem DEK durch λ-Phosphatase entfernt werden. Wurde
durch Zellextrakt phosphoryliertes His-DEK mit λ-Phosphatase behandelt, so
erfolgte auch hier die Entfernung von Phosphatresten (Abbildung 4-6, C). Dies
deutet darauf hin, dass die Phosphorylierung von His-DEK durch Zellextrakt
ähnlicher Natur ist wie die Phosphorylierung von DEK in vivo. Die
weitergehende Charakterisierung der DEK-Phosphorylierung erfolgt in Kapitel
4.3.
Abbildung 4-6 His-DEK wird phosphoryliert exprimiert
Gereinigtes His-DEK wurde ohne und mit λ-Phosphatase inkubiert. Die Proben wurden durch
SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunblot mit DEK-spezifischen Antikörpern analysiert.
B. In vitro-Phosphorylierung mit HeLa S3-Zellextrakt. Rekombinantes His-DEK wurde entweder
unbehandelt oder dephosphoryliert in die in vitro Phosphorylierung eingesetzt. Die Reaktion
wurde nach 10 min gestoppt, His-DEK über Ni-NTA-Agarose aus den Ansätzen gereinigt und
32
durch SDS-PAGE, Autoradiographie ( P) und Immunblot (α-DEK) analysiert.
C. His-DEK wurde wie in B behandelt. Nach der in vitro Phosphorylierung erfolgte eine erneute
Dephosphorylierung mit λ-Phosphatase.
A.
Ergebnisse
65
Diese Experimente zeigten, dass His-DEK als phosphoryliertes Protein aus
dem Baculovirus-Sytem gereinigt wird. Um ein definiertes Substrat für alle
weiteren Experimente zu haben, wurde His-DEK vor Gebrauch
dephosphoryliert.
Das gereinigte His-DEK wurde auch zur Gewinnung von polyklonalen DEKAntikörpern aus Kaninchen verwendet. Nach 4-5 Immunisierungen konnte man
im Allgemeinen ein hoch spezifisches Serum gewinnen, das im Immunblot bei
einer Verdünnung von 1:20.000 eine spezifische Bande lieferte. Nach einer
Aufreinigung des Serums über Säulenchromatographie konnte ein
monospezifischer DEK Antikörper hergestellt werden. Dieser Antikörper konnte
für Immunfluoreszenzen (siehe dazu (Scholten, 2004), Immunfällungen und
Immunblot verwendet werden. Da zur Immunisierung von Kaninchen
nichtbehandeltes His-DEK verwendet wurde, stellte sich die Frage, ob der
hergestellte Antikörper spezifisch phosphoryliertes DEK erkennt. Dies konnte
ausgeschlossen werden, denn in Abbildung 4-6 wurden gleiche Mengen an
rekombinantem His-DEK aufgetragen, was der Immunblot widerspiegelt. Auch
konnte im weiteren Verlauf dieser Arbeit keine selektive oder spezifische
Erkennung von phosphorylierten DEK-Molekülen durch den Antikörper
gefunden werden.
4.3
Charakterisierung der DEK-Phosphorylierung
4.3.1
Phosphorylierung von DEK in vitro mit Zellextrakten
In Abbildung 4-4 konnte gezeigt werden, dass die DEK-Phosphorylierung ihr
Maximum in der G1-Phase hat. Dieser Befund sollte mit einer anderen Methode
verifiziert werden. Dazu diente die in vitro Phosphorylierung mit
cytosolischen/nukleosolischen S-20 Extrakten. Als Substrat für die
phosphorylierenden Aktivitäten in den Extrakten wurde das rekombinante
wtHis-DEK verwendet, das vor Einsatz in den Assay mittels λ-Phosphatase
dephosphoryliert werden. Als Kontrolle für die Spezifität der Extrakte diente
rekombinantes His-Geminin. Zur Verwendung kamen S-20 Extrakte aus der SPhase (6 h nach dem Entlassen aus dem Thymidinblock) und der G1-Phase
(15.5 h nach dem Entlassen aus dem Thymidinblock). Gleiche Mengen an
Gesamtprotein (150 µg) wurden mit His-DEK und His-Geminin in Anwesenheit
von Phosphataseinhibitoren und [32P]-γ-ATP bei 30°C inkubiert. Die Reaktion
wurde gestoppt und His-DEK über Ni-NTA-Agarose, Geminin (Kulartz et al.,
2003) über eine Immunfällung, aus dem Ansatz gereinigt. Die gereinigten
Proteine wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie und
Immunblot analysiert. DEK wird in G1-Phase-Extrakt in etwa doppelt so stark
phosphoryliert wie in S-Phase-Extrakt (Abbildung 4-7,vergleiche G1 versus S).
Eine unspezifische Adhäsion von [32P]γ-ATP an die rekombinanten Proteine
Ergebnisse
66
konnte durch einen Ansatz ohne Extrakt ausgeschlossen werden (Abbildung
4-7, Spur: control). Die Phosphorylierungsreaktion läuft sehr schnell ab, da
keine Steigerung zwischen 5 und 10 Minuten Reaktionszeit zu sehen ist,
obwohl [32P]γ-ATP und ATP in einem Überschuss in der Reaktion vorhanden
waren. Als Kontrolle für die Spezifität der Extrakte wurde parallel Geminin in die
Phosphorylierungsreaktion eingesetzt. Kulartz et al. (Kulartz et al., 2003)
konnten zeigen, dass Geminin in der S-Phase phosphoryliert wird, allerdings
kaum in der G1-Phase. Dieser Befund spiegelt sich auch hier wider (Abbildung
4-7, rechte Seite).
Abbildung 4-7 In vitro Phosphorylierung von DEK
Rekombinantes, dephosphoryliertes His-DEK (600 ng) wurde mit G1- und S-Phase HeLa S-20 Extrakt
(150 µg Gesamtprotein) in der Anwesenheit von [32P]γ-ATP für die angegebenen Zeitpunkte inkubiert. Die
Reaktionen wurden abgestoppt und His-DEK wurde durch Ni-NTA Agarose aus den Ansätzen gereinigt.
32
Die Eluate wurden gefällt und durch SDS-PAGE, Immunblotting (α-DEK) und Autoradiographie ( P)
analysiert. Rekombinantes Geminin wurde durch Immunfällung mit monospezifischen, polyklonalen
Antikörpern aus den Ansätzen gereinigt und wie oben beschrieben analysiert. Das Zellzyklusstadium der
verwendeten Extrakte wurde durch FACS Analyse untersucht (oben). Spur „control“ ist ohne Extrakt.
Mit zwei unterschiedlichen Methoden konnte gezeigt werden, dass DEK zum
einen während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert wird, und dass zum
anderen ein Maximum der Phosphorylierung in der G1-Phase zu finden ist
(Abbildung 4-4; Abbildung 4-7). Handelt es sich hier nun um eine
Phosphorylierung durch eine Kinase, deren Aktivität im Zellzyklus oszilliert, um
eine Phosphorylierung durch mehrere Kinasen oder um eine Mischung von
beiden Möglichkeiten? Dies sollte in nachfolgenden Experimenten untersucht
werden. Dazu wurden zuerst potenzielle Kinasen, die für die DEKPhosphorylierung verantwortlich sein könnten, identifiziert.
Ergebnisse
4.3.2
Potenzielle
DEK-phosphorylierende
Phosphorylierungsstellen
67
Kinasen
und
deren
Um einen Hinweis auf potenzielle DEK-phosphorylierende Kinasen zu erhalten,
wurde die DEK-Proteinsequenz (accession number: SwissProt, P35659) auf
Das
Kinase-Konsensussequenzen
durchsucht
(http://scansite.mit.edu).
Programm berücksichtigt 62 verschiedene Protein-Kinasemotive und die
Oberflächenwahrscheinlichkeit des Moleküls. Die gewählte Einstellung war
„high-stringency“. In Abbildung 4-8 sind die möglichen Kinasen und deren
Phosphorylierungsstellen schematisch dargestellt (CK2 (Casein Kinase 2), PKC
(Protein Kinase C) und GSK-3 (Glykogen Kinase Synthase-3)). Wurde die
Einstellung „low-stringency“ gewählt, so konnten weitere potenzielle Kinasen
gefunden werden, wie die ATM-Kinase, DNA-PK, PKA, Erk-1 Kinase, und die
Calmodulin abhängige Kinase 2 (nicht dargestellt). Interessanterweise weist die
DEK-Sequenz kein S(T)/P Motiv für CDKs (cyclin dependent kinases) auf.
Abbildung 4-8 Potenzielle Phosphorylierungsstellen von DEK
Schematische Darstellung der DEK-Proteinsequenz. Die SAF-Box ist grün, die sauren Boxen sind rot
unterlegt. Die potenziellen Kinasen und deren mögliche Phosphorylierungsstellen sind durch Symbole
gekennzeichnet.
Ergebnisse
4.3.3
68
DEK wird durch die Protein-Kinase CK2 in vitro und in vivo
phosphoryliert
Im folgenden Kapitel werden die potenziellen DEK-Kinasen in vitro auf ihre
DEK-phosphorylierende Aktivität hin getestet.
4.3.3.1 Filter-Bindungsassays mit gereinigten Kinasen
Die drei möglichen Proteinkinasen wurden in Standard-Filterbindungsassays
untersucht. Zu diesem Zweck wurde rekombinantes His-DEK dephosphoryliert
und mit gleichen Mengen an CK2, PKC und GSK-3 (jeweils gleiche units) in der
Anwesenheit von [32P]γ-ATP inkubiert. Nach verschiedenen Zeitpunkten
wurden die Reaktionen gestoppt und die Ansätze auf Nitrocellulosefilter
überführt und ausgewertet. In Abbildung 4-9, A ist zu sehen, dass CK2 die
stärkste DEK-phosphorylierende Aktivität aufweist (A, CK2). PKC kann DEK
auch phosphorylieren, allerdings mit einer wesentlich geringeren Effizienz (A,
PKC). GSK-3 dagegen, zeigt keine DEK-phosphorylierende Aktivität (A, GSK3). Um eine unspezifische Adhäsion von [32P]γ-ATP an die Membran
auszuschließen, wurden die Ansätze parallel über SDS-PAGE aufgetrennt. In
Abbildung 4-9, B ist zu sehen, dass es sich tatsächlich um eine spezifische
DEK-Phosphorylierung handelt (vergleiche Autoradiographie (32P) mit
Immunoblot (α-DEK)), denn es wurden keine weiteren Signale in der
Autoradiographie detektiert. Dies schließt auch eine Autophosphorylierung der
Kinasen selbst aus.
Abbildung 4-9 Filterbindungs-Assay mit gereinigten Kinasen
A.
Dephosphoryliertes, rekombinantes His-DEK (5 pmol) wurde mit den gereinigten Kinasen (CK2,
PKC, GSK-3, je 10 units) in der Anwesenheit von [32P]γ-ATP für 0, 10 oder 30 min bei 30°C
inkubiert. Für die jeweiligen Kinasen wurde der geeignete Puffer (siehe Material und Methoden
3.12) verwendet. Einzelne Aliquote wurden nach den angegebenen Zeitpunkten entnommen und
in Na-Pyrophosphat Puffer (5 ml) überführt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden
durch Nitrocellulose-Filter filtriert, mit definierten Mengen an Na-Pyrophosphat Puffer gewaschen,
getrocknet und in einem Szintilationszähler vermessen. Dargestellt sind die cpm (counts per
minutes x 10 4).
Ergebnisse
B.
69
Aliquote aus dem Ansatz in A (10 min Wert) wurden parallel auf einem SDS-Polyacrylamidgel (10
%) aufgetrennt und durch Immunblotting und Autoradiographie analysiert.
Mit den Filterbindungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich
gereinigte CK2 und in geringem Maße auch gereinigte PKC an der DEKPhosphorylierung in vitro beteiligt sind.
4.3.3.2 „In-Gel-Kinaseassay“
Im Folgenden sollte festgestellt werden, ob diese beiden Kinasen für die
beobachtete DEK-Phosphorylierung mit Zellextrakt (Abbildung 4-7)
verantwortlich sind. Hierfür wurde ein „In-Gel-Kinaseassay“ durchgeführt. Der
Vorteil dieser Methode ist, dass man das zu phosphorylierende Protein kovalent
an eine Gelmatrix koppelt und anhand der Proteingrößen und der Signale in der
Autoradiographie die phosphorylierende(n) Kinase(n) ermitteln kann (z. B (Liu
et al., 1997), (Hibi et al., 1993). Das mit rekombinantem, dephosphorylierten
His-DEK kovalent gekoppelte Gel wurde mit steigenden Mengen S-20-Extrakt
von asynchronen HeLa S3 Zellen und mit je 10 units der gereinigten CK2, PKC
und GSK-3 beladen. Nach einer Standard-Gelelektrophorese wurde das Gel,
wie in Kapitel 3.11 beschrieben, weiter behandelt. Die Analyse erfolgte durch
Comassie-Färbung (Abbildung 4-10, links) und durch Autoradiographie
(Abbildung 4-10, rechts).
<
Abbildung 4-10 „In-Gel-Kinaseassay“
Rekombinantes, dephosphoryliertes His-DEK wurde vor dem Gießen des Gels der Gelmatrix beigemischt
(40µg/ml Gelmatrix). Nach dem Auspolymerisieren wurden 5, 10 und 20 µg Gesamtprotein (S-20 Extrakt
aus asynchronen HeLa S3 Zellen) und je 10 units von gereinigter CK2, PKC und GSK-3 auf diesem Gel
unter Standardbedingungen aufgetrennt. Nach dem Lauf wurde das SDS entfernt, die Proteine erneut
denaturiert (6 M Guanidinium-HCl) und über Nacht renaturiert. Dieser erneute Denaturierungsschritt ist
zwingend notwendig um die Aktivität der Kinasen wieder herzustellen (Geahlen et al., 1986), (Lacks and
Springhorn, 1980), (Kameshita and Fujisawa, 1989). Nach erfolgter Inkubation in Kinasepuffer in der
32
Anwesenheit von [ P]γ-ATP wurde das Gel gewaschen, Comassie gefärbt (linke Seite) und getrocknet.
Ergebnisse
70
Die Analyse erfolgte durch Autoradiographie (rechte Seite). Die Positionen der gereinigten Kinasen sind
mit Punkten gekennzeichnet (links). Die Untereinheiten der CK2 sind durch Sternchen gekennzeichnet (*,
α-Untereinheit, ** α`-Untereinheit). Die Position eines Proteinstandards ist in kDa angegeben.
In den S-20 Extrakten (Abbildung 4-10, extract, rechte Seite) tritt deutlich eine
Kinase-Aktivität hervor, die der CK2 zuzuordnen ist. Die geringere Mobilität der
CK2 in den Extrakten im Vergleich zu gereinigter CK2, lässt sich auf eine
limitierte Proteolyse der α-Untereinheit vom C-Terminus zurückführen (α-UE
oben*, α`-UE unten**). Das Laufverhalten dieser deletierten α-UE ist ähnlich
dem der α`-UE und wurde für die hier verwendete gereinigte CK2 beschrieben
(Sarno et al., 2002). Die Proteolyse hat keinen Einfluss auf die Aktivität (Sarno
et al., 2002). Darüber hinaus konnte noch eine zweite, schwächere
Kinaseaktivität bei 94 kDa detektiert werden, die wahrscheinlich auf die PKC
zurückzuführen ist (Abbildung 4-10, <). Es gibt verschiedene Isoformen der
PKC, die sich durch Ca2+-Abhängigkeit, strukturelle Eigenschaften und
Molekulargewicht (80-97 kDa) unterscheiden (PKC Isoformen: α, β1, β1, γ , δ, ε,
η, θ, µ, ξ, λ, ι). Hier scheinen mehrere PKC-Isoformen DEK zu phosphorylieren,
wovon eine PKCε sein könnte, da sie bei 97 kDa läuft. Die Kontrolle mit
gereinigter PKC weist allerdings keine Aktivität auf. Eine mögliche Erklärung
könnte sein, dass sie, wie schon gezeigt, DEK nur schwach phosphoryliert
(Abbildung 4-9, PKC) oder dass die DEK-phosphorylierenden PKC-Isoformen
hier nicht vorhanden sind. Denn die gereinigte PKC besteht aus einer Mischung
von α, β, und γ Isoformen.
Die verwendeten S-20-Extrakte bestehen aus cytosolischen und
nukleosolischen
Proteinen.
Um
auszuschließen,
dass
weitere,
chromatingebundene Kinasen für die DEK-Phosphorylierung verantwortlich
sind, wurden die Pellets der S-20 Präparationen mit 500 mM NaCl
nachextrahiert. Mit diesen Extrakten wurde das Experiment wiederholt (Daten
nicht gezeigt). Es konnten keine weiteren Signale wie die in Abbildung 4-10
detektiert werden. In einer weiteren Kontrolle, die dazu diente, Artefakte durch
Autophosphorylierungen der Kinasen auszuschließen, wurde das Experiment
wiederholt, diesmal ohne kovalent gekoppeltes DEK in der Matrix. Selbst nach
längerer Exposition waren keine signifikanten Signale in der Autoradiographie
zu erkennen (Daten nicht gezeigt).
Aus diesem Experiment lässt sich schließen, dass die im S-20-Extrakt
enthaltene Protein-Kinase CK2 DEK phosphoryliert. Des Weiteren könnten
noch verschiedene Isoformen der PKC an der DEK-Phosphorylierung beteiligt
sein. Die CK2 allerdings weist eine weitaus höhere Aktivität auf.
Ergebnisse
71
4.3.3.3 Inhibition der DEK-Phosphorylierung mit TBB, einem hoch spezifischen
CK2-Inhibitor
In allen bisherigen Experimenten zeigte die CK2 starke DEK-phosphorylierende
Aktivität. Um weitere Hinweise über die CK2-abhängige DEK-Phosphorylierung
zu bekommen, wurde ein hoch spezifischer CK2-Inhibitor, 4,5,6,7 tetra-bromobenzotriazol (TBB), eingesetzt. TBB wurde in der Arbeitsgruppe von Lorenzo A.
Pinna
(Universität
Padua,
Italien)
entwickelt
und
charakterisiert.
Selektivitätsstudien zu TBB zeigten, dass es bei quantitativer Hemmung der
CK2 nur bei drei weiteren Kinasen zu einer leichten Inhibierung führt. TBB ist
der zur Zeit selektivste CK2-Inhibitor (Sarno et al., 2001). Darüberhinaus ist
TBB membrangängig und kann daher auch für in vivo Experimente verwendet
werden (Sarno et al., 2001), (Ruzzene et al., 2002). Ein weiterer Vorteil ist, dass
TBB bei kurzfristiger Inkubation (bis 5h) in der Zellkultur keine Auswirkung auf
die Zellviabilität hat (Ruzzene et al., 2002).
Zuerst wurde die TBB-Menge, die zur quantitativen Hemmung der CK2 Aktivität
nötig ist, ermittelt. Dazu wurden in Vorversuchen Filterbindungen mit gereinigter
CK2, dephosphoryliertem His-DEK und steigenden Mengen TBB durchgeführt
(Daten nicht gezeigt).
Zur quantitativen Hemmung der DEK Phosphorylierung in vitro waren 10 µM
TBB nötig (Abbildung 4-11, A: DEK-CK2; DEK-CK2-TBB). Die
Autophosphorylierung der CK2 war in diesen Ansätzen vernachlässigbar
(Abbildung 4-11, A: CK2-CK2). Als Kontrolle für die Spezifität wurden die
Phosphorylierungsansätze parallel über SDS-PAGE aufgetrennt und durch
Autoradiographie und Immunblot analysiert (Abbildung 4-11, B). Es waren keine
anderen markierten Produkte außer DEK zu sehen, was gegen eine
unspezifische Adhäsion von [32P]γ-ATP an die Membran spricht.
Ergebnisse
72
Abbildung 4-11 Filterbindungs-Assay und Inhibition der CK2 durch TBB
A.
B.
Dephosphoryliertes rekombinantes His-DEK wurde mit gereinigter CK2 in der Anwesenheit von
32
[ P] γ-ATP inkubiert. Ein Ansatz wurde mit 10 µM TBB vorinkubiert. Als Kontrolle diente ein
Ansatz mit CK2 alleine. Aliquote wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen, in NaPyrophosphat abgestoppt und auf Nitrocellulosefilter transferiert. Nach dem Waschen und
Trocknen der Filter wurden diese in Szintillationszähler vermessen. Dargestellt sind die cpm
(counts per minute).
Die Ansätze von A wurden parallel über SDS-PAGE, Autoradiographie (32P) Imunblot (α-DEK)
analysiert
Da TBB zur Hemmung der CK2 und damit auch zur Hemmung der DEKPhosphorylierung geeignet ist, sollte nun TBB in vitro und in vivo getestet
werden. Dazu wurde wie in Kapitel 4.3.1 eine in vitro Phosphorylierung mit
Zellextrakten aus S- und G1-Phase HeLa S3-Zellen verwendet (Abbildung 4-12,
A). Vor der Phosphorylierungsreaktion wurden steigende Mengen an TBB zum
Extrakt gegeben und für 10 min auf Eis vorinkubiert. Die Reaktion wurde nach
10 min gestoppt und das rekombinante His-DEK über Ni-NTA-Agarose
Ergebnisse
73
aufgereinigt. Die Analyse erfolgte über SDS-PAGE, Immunblot und
Autoradiographie. Es zeigte sich, dass in S-Phase-Extrakt 5 µM TBB für eine
vollständige Hemmung ausreichen (Abbildung 4-12, A, S), wohingegen 20 µM
TBB in G1-Phase-Extrakt benötigt wurde (Abbildung 4-12, A, G1).
Die Beteiligung der CK2 an der DEK-Phosphorylierung in vivo sollte im
nächsten Schritt durch den Einsatz von TBB in der Zellkultur untersucht
werden. Asynchron wachsende HeLa S3-Zellen wurden für drei Stunden mit
steigenden Mengen TBB in der Anwesenheit von [32P]-Orthophosphat inkubiert.
Die Zellen wurden geerntet und aus der Chromatinfraktion eine Immunfällung
mit DEK-spezifischen Antikörpern durchgeführt. Die Analyse der
Immunkomplexe erfolgte durch Immunblot und Autoradiographie (Abbildung
4-12, B). Es ist deutlich zu sehen, dass mit steigenden Mengen TBB die DEKPhosphorylierung in vivo signifikant abnimmt. Bei der höchsten TBB-Menge
(Abbildung 4-12, B, Spur 75) liegt die Restphosphorylierung von DEK bei etwa
20 % im Vergleich zur Kontrolle. Die verbleibende Phosphorylierung kann
möglicherweise durch andere Kinasen, wie z. B PKC, verursacht werden.
Dieses Experiment zeigt eindeutig, dass die CK2 in vivo die dominierende
Kinase für die DEK-Phosphorylierung ist.
Abbildung 4-12 Inhibition der DEK-Phosphorylierung durch Einstz von TBB in vitro und in vivo
A.
B.
In vitro Phosphorylierung. Rekombinantes, dephosphoryliertes His-DEK (600 ng, 12.7 pmol)
wurde in S-20 HeLa S3 Extrakt (150 µg Gesamtprotein je aus G- und S-Phase Zellen, siehe
32
Abbildung 4-7) in der Anwesenheit von [ P] γ-ATP, Protease und Phosphataseinhibitoren und
steigenden Mengen an TBB (0,5 –20 µM, gelöst in DMSO) für 10 min bei 30°C inkubiert. Die
32
Extrakte wurden 10 min vor Reaktionsstart (= Zugabe von DEK und [ P] γ-ATP) mit TBB auf Eis
vorinkubiert. Als Kontrolle wurde DMSO (Spur DMSO) verwendet. Spur „control“ ist ohne Extrakt.
Die Reaktionen wurden gestoppt, und DEK wurde über Ni-NTA-Agarose aus den einzelnen
Reaktionen gereinigt. Die Analyse erfolgte über SDS-PAGE, Immunblot (α-DEK) und
Autoradiographie (32P). Die Größe eines Proteinstandards ist in kDa angegeben.
In vivo Phosphorylierung. Asynchron proliferierende HeLa S3 Zellen wurden mit den
angegebenen TBB Mengen für eine Stunde in phosphatfreiem Medium vorinkubiert. Die Zellen
wurden gewaschen und mit TBB und 200 µCi[32P]-Orthophosphat für weitere zwei Stunden
inkubiert. DEK wurde aus dem 450 mM-NaCl-Extrakt mittels monospezifischen, polyklonalen
Antikörpern gefällt. Die Immunkomplexe wurden durch SDS-PAGE, Immunblot (α-DEK) und
Autoradiographie (32P) analysiert.
Ergebnisse
74
Alle bisherigen Experimente erbrachten eindeutige Evidenz dafür, dass die CK2
die Hauptkinase für die DEK-Phosphorylierung in vitro und in vivo ist. Hier soll
festgehalten werden, dass dieser Befund eine Phosphorylierung durch andere
Kinasen, wie z.B die PKC, nicht ausschließt.
4.3.3.4 Kartierung
der
CK2-Phosphorylierungsstellen
Aminosäuresequenz
in
der
DEK-
Im nächsten Schritt sollten die CK2-Phosphoakzeptorstellen im DEK-Molekül
identifiziert werden. Dafür wurde rekombinantes His-DEK verwendet. Zuerst
wurde gereinigtes His-DEK, das wie in Kapitel 4.2.1 beschrieben,
hyperphosphoryliert ist, mittels λ-Phosphatase dephosphoryliert, dann mit
gereinigter CK2 in vitro wieder aufphosphoryliert. Beide DEK-Präparationen
wurden durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) in einem
Quadrupol-Massenspektrometer auf phosphorylierte Aminosäuren hin
untersucht. Die Arbeiten wurden von Catalina Damoc in Kooperation mit der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Przybylski, Universität Konstanz, durchgeführt. Die
verwendete Methode erlaubt eine sofortige Sequenzierung der identifizierten
phosphorylierten Peptide, ermöglicht also eine genaue Aussage über die
phosphorylierte Aminosäure in einer Peptidkette.
Durch CK2-phosphoryliertes DEK wies folgende phosphorylierte Aminosäuren
auf: S-32, S-243, S-244, S-251, S-301, S-303, S-306 und S-307. S-230, S-231
und S-232 wurden nur teilweise phosphoryliert vorgefunden und konnten
deshalb
nicht
eindeutig
identifiziert
werden
(Abbildung
4-13).
Interessanterweise
liegen,
außer
S-32,
alle
ermittelten
CK2Phosphorylierungsstellen im C-terminalen Bereich von DEK. Es wurden auch
einige
Phosphorylierungsstellen
gefunden,
die
gegenüber
einer
Dephosphorylierung resistent sind und dem Baculovirus-System entstammen.
Diese Phosphatreste üben allerdings keinen erkennbaren Effekt auf DNABindung und Topologieveränderung aus (siehe dazu: 4.4.1 und 4.4.2). In
weiteren Experimenten sollte nun der Phosphorylierungsstatus von endogenem
DEK untersucht werden. Hierzu erfolgte ein tryptischer Verdau von
immungefälltem DEK aus asynchron proliferierenden HeLa S3-Zellen.
Phosphopeptide wurden über IMAC (ion metal affinity chromatography)
angereichert
und
massenspektrometrisch
bestimmt.
In
vorläufigen
Experimenten, die durch Martina Baack und Catalina Damoc durchgeführt
wurden, zeigte sich eindeutig, dass Phosphopeptide identifiziert wurden, die mit
den in vitro kartierten CK2-Stellen überlappen. Es wurden weiterhin noch
andere Phosphopeptide gefunden (Abbildung 4-13).
Ergebnisse
75
Abbildung 4-13 Kartierung von CK2-Phosphorylierungsstellen durch ESI-MS
Identifizierte Phosphorylierungstellen des DEK-Proteins. Rekombinantes His-DEK wurde mittels λPhosphatase dephosphoryliert und mit gereinigter CK2 in vitro aufphosphoryliert. Phosphorylierungsstellen
wurden durch nano-ESI-Q-Trap Messungen identifiziert. Gezeigt ist die Aminosäuresequenz des DEKProteins. Die potenzielle DNA-Bindedomäne SAF-Box ist grün, die sauren Boxen sind rot umrandet. Die
potenziellen Phosphorylierungsstellen sind angegeben. Die Phosphatase-resistenten Stellen sind in grau,
die kartierten CK2 Phosphorylierungsstellen sind in rot eingezeichnet. Phosphopetide, die in
immungefälltem DEK in vivo gefunden wurden, sind schwarz unterstrichen.
Abbildung 4-14 zeigt die identifizierten Peptide und die Gesamtabdeckung zum
Versuch in Abbildung 4-13. Aufgeführt sind die identifizierten Peptide und die
kartierten Stellen des in vitro Versuches mit CK2-phosphoryliertem DEK.
Ergebnisse
76
A.
B.
C.
Phosphorylated peptides identified with nano-ESI-Q-Trap
30
phosphorylated sites identified after
phosphatese
fragmentation of the peptides
treatment
EESEEEEDEDDEEEEEEEKEK51
32
159
SICEVLDLER168
199
TCSKGSKKER208
199
241
EESSDDEDKESEEEPPKKTAKR262
243
279
SANVKKADSSTTK291
293
NQNSSKK299
299
KESESEDSSDDEPLIKK315
S
159
287
S
resistant
T, 201S, 204S
resistant
S, 244S, 251S
dephosphorylation
S, 288S, 289T, 290T
resistant
296
301
dephosphorylation
S
resistant
S, 303S, 306S, 307S
dephosphorylation
Abbildung 4-14 Identifizierte Peptide und Gesamtabdeckung
A.
Sequenzabdeckung des DEK Proteins nach in vitro Phosphorylierung mit gereinigter CK2 und
Messung durch nano-ESI-Q-TRAP Massenspektroskopie. Phosphoryliert vorgefundene Peptide
sind mit schwarzen Boxen gekennzeichnet. Unphosphoryliert vorgefundene Peptide sind in rot
gekennzeichnet. Die Sequenzabdeckung dieser Peptide liegt bei 33 % des Gesamtproteins.
Wurden phosphorylierte und an Methioninen oxidierte Peptide in die Abdeckung eingerechnet, so
lag diese bei 99 % des Gesamtproteins.
Ergebnisse
77
Sequenzabdeckung des DEK Proteins nach Dephosphorylierung mit λ-Phosphatase und
Messung durch nano-ESI-Q-TRAP Massenspektroskopie. Die dephosphorylierten Peptide, die
vorher phosphoryliert vergefunden wurden, sind in gestrichelten Boxen dargestellt. Mit
Berücksichtigung der neu identifizierten dephosphorylierten Peptide, stieg die Gesamtabdeckung
auf 45 %. Die vorgefundenen phosphorylierten Peptide, die resistent gegenüber der
Dephosphorylierung waren, sind in roten Boxen dargestellt. Die Gesamtabdeckung stieg auf 70
%, wenn phosporylierte und an Methioninen oxidierte Peptide miteingerechnet wurden.
C. Darstellung der gefundenen phosphorylierten Peptide mit den vergefundenen phosphorylierten
Aminosäuren.
B.
4.4
Funktionelle Domänen des DEK-Proteins
Durch die Herstellung einer Serie von DEK-Deletionsmutanten sollten die
Domänen, die für die DNA-bindenden und Topologie-verändernden
Eigenschaften des DEK-Proteins verantwortlich sind, untersucht werden. Wie
schon in Kapitel 4.2 beschrieben, wurde wtDEK im Baculovirus-System
exprimiert. Dieses System wurde auch für die Expression der DEKDeletionsmutanten gewählt. In Abbildung 4-15 sind alle klonierten und
überexprimierten DEK-Deletionsmutanten gezeigt.
Ergebnisse
78
Abbildung 4-15 Schematische Darstellung aller klonierten und überexprimierten DEKDeletionsmutanten
Rote Boxen stellen die sauren Bereiche, die grüne Box stellt die potenzielle DNA-Bindedomäne SAF-Box
(oder SAP-Box) dar. In der rechten Spalte ist die Expression dargestellt, wobei die Menge an
überexprimiertem Protein durch + dargestellt ist. Mutanten die mit +/? gekennzeichnet sind, wurden
entweder nicht exprimiert, oder waren bis zur Beendigung dieser Arbeit nicht charakterisiert.
Bei der Herstellung
berücksichtigt:
der
Deletionsmutanten
wurde
folgende
Kriterien
-Bereich, der bei der DEK-CAN Fusion fehlt (aa 350-375)
-homologe Bereiche zu DEK-Proteinen aus anderen Spezies (aa 87-187
und 310-375)
-potenzielle DNA-bindende Bereiche (SAF-Box, 149-187)
Ergebnisse
79
-Saure Domänen
-Bereiche für potenzielle Protein-Protein-Interaktionen
-Ergebnisse aus „Yeast-Two-Hybrid“-Analysen (Scholten, 2004) (Kappes
et al., 2004)
-Bereich der den Phänotyp von ATM aufheben kann (310-375)
(Meyn et al., 1993)
Nach diesen Kriterien wurden N- und C-terminale Bereiche des Proteins
deletiert. Die potenzielle DNA-Bindedomäne, SAF-Box, wurde ebenfalls vom Nund C-terminalen Bereich her eingegrenzt (Klonierung der Mutanten durch Ingo
Scholten).
Die Reinigung der verschiedenen Deletionsmutanten wurde auf Reinheit und
Expressionsmenge hin optimiert. Die Vorgehensweise bei der Reinigung war
analog zu der von wtDEK (Kapitel 4.2). Beispielhaft sind in Abbildung 4-16
repräsentative Reinigungen gezeigt. Der Reinheitsgrad der verschiedenen
Mutanten war bei ca. 90-95%. Die Deletionsmutante 87-187 stellte mit 70 %
Reinheitsgrad die schlechteste Präparation dar.
Abbildung 4-16 Darstellung einer Auswahl an gereinigten Deletionsmutanten aus dem
Baculovirus-System
Die verschiedenen Mutanten und wtDEK wurden auf einem 10-18 % SDS-PAGE aufgetrennt und durch
eine Comassie Färbung sichtbar gemacht. Die Position eines Proteinstandards ist in kDa angegeben.
Bevor mit den biochemischen Studien der DEK-Deletionsmutanten begonnen
werden konnte, wurde wtHis-DEK auf seine Eigenschaften bezüglich der DNABindung und im Topologieassay untersucht. Im folgenden Kapitel erfolgt ein
Vergleich von His-DEK mit den beschriebenen Eigenschaften des gut
Ergebnisse
80
charakterisierten GST-DEKs. Da His-DEK phosphoryliert aus dem BaculovirusSystem gereinigt wird, wurde diese Tatsache besonders berücksichtigt.
4.4.1
Nur dephosporyliertes His-DEK führt, wie GST-DEK, zur Bildung
einer Topoisomerleiter und bindet an DNA
In den folgenden Experimenten sollte untersucht wurden, ob His-DEK alle
bisher von GST-DEK bekannten Eigenschaften wie Supercoiling-Aktivität und
DNA/Chromatin-Bindung (Alexiadis et al., 2000; Waldmann et al., 2002;
Waldmann et al., 2003) aufweist.
GST-DEK bindet an DNA und führt zu großen DNA-Protein-Komplexen, die in
den Geltaschen liegen bleiben (Waldmann et al., 2002; Waldmann et al., 2003).
Diese Eigenschaft wurde durch EMSAs für His-DEK untersucht (Abbildung
4-17, A). His-DEK wurde sowohl unbehandelt (DEKphos.), als auch
dephosphoryliert (DEKdephos.) in den Assay eingesetzt. Zu erkennen ist nun,
dass die beiden Populationen unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, wobei
die
dephosphorylierte
His-DEK-Form
wie
GST-DEK
zu
großen
Nukleoproteinkomplexen
führt.
Eine
veränderte
DNA-Bindung
für
unbehandeltes His-DEK wurde auch in South-Western-Untersuchungen
gefunden (Abbildung 4-17, B). Hier weist die unbehandelte His-DEK-Form eine
wesentlich geringere DNA-Bindung als dephosphoryliertes His-DEK auf. Es
scheint sich hier, abhängig von der Untersuchungsmethode, einmal um eine
andere Art der DNA-Bindung (Abbildung 4-17, A) und einmal um eine inhibierte
DNA-Bindung zu handeln (Abbildung 4-17, B).
Die Inkubation von zirkulär geschlossener, proteinfreier DNA-Substrate mit
GST-DEK führt zu einer Topologieveränderung durch die Einführung von
positiven Supercoils (Waldmann et al., 2002). Wurden nun unbehandeltes
(DEKphos.) und dephosphoryliertes His-DEK (DEKdephos.) in einem
Topologieassay (DEK-Assay) getestet, so wies nur die dephosphorylierte Form
topologieverändernde Eigenschaften auf (Abbildung 4-17, C).
In allen untersuchten Punkten erfüllte die dephosphorylierte His-DEK-Form die
Eigenschaften von GST-DEK und wurde folglich für alle weiteren
Untersuchungen verwendet.
Als Kontrolle wurden die Untersuchungen ebenfalls mit Reinigungen aus mocktransfizierten Zellen durchgeführt. Hier zeigte sich weder eine Aktivität in der
DNA-Bindung noch in der Topologieveränderung, und es wurden weder
DNasen noch Topoisomerasen mitgereinigt (Daten nicht gezeigt).
Ergebnisse
81
A.
EMSA.
Steigende
Mengen
unbehandeltes
(DEKphos.)
und
dephosphoryliertes His-DEK (DEKdephos.)
wurden mit Form III SV40 DNA (linear)
inkubiert. Die Produkte wurden auf einem
0.6 % Agarosegel aufgetrennt und durch
Ethidiumbromid-(EtBr) Färbung sichtbar
gemacht. (–) kennzeichnet die Probe
ohne Protein.
B. South-Western Assay. Gleiche
Mengen
an
unbehandeltem
und
dephosphoryliertem His-DEK wurden
über SDS-PAGE aufgetrennt und auf
eine Nitrocellulose Membran transferiert.
Nach Blocken der Membran erfolgte eine
Inkubation mit radioaktiv markierter, HinfI
verdauter SV40-DNA. Die Membran
wurde
gewaschen
und
durch
Autoradiographie
(32P-DNA)
und
Immunblot (α-DEK) analysiert.
C. DEK-Assay. Steigende Mengen an
unbehandeltem und dephosphoryliertem
His-DEK wurden mit 175 ng Form I SV40
DNA (supergecoilt) in der Anwesenheit
von Topoisomerase I inkubiert. Die
Ansätze wurden deproteinisiert, die DNA
gefällt und auf einem 0.8 % Agarosegel
und EtBr. Färbung analysiert. (–)
kennzeichnet die Probe ohne DEK.
Abbildung 4-17 EMSA, South-Western und Topologieassay mit wtHis-DEK
4.4.2
Dephosporyliertes His-DEK bindet wie GST-DEK an SV40
Minichromosomen
Eine weitere beschriebene Eigenschaft von GST-DEK ist die Bindung an SV40Minichromosomen, die zum einem zu einer Topologieveränderung und zum
anderen zu einem veränderten Sedimentationsverhalten führt (Waldmann et al.,
2002). Dieser Aspekt wurde hier durch Sedimentationsanalysen mit
unbehandeltem (Abbildung 4-18, -λ PPase) und dephosphoryliertem His-DEK
Ergebnisse
82
(+ λ PPase) in der Gegenwart von salzgewaschenen SV40-Minichromosomen
untersucht.
Abbildung
4-18 Bindung von unbehandeltem und
salzgewaschene SV40 Minichromosomen
dephosphoryliertem
His-DEK
an
Unbehandeltes (-λ PPase) und dephosphoryliertes (+λ PPase) wurde mit SV40-Minichromosomen in der
Anwesenheit von Topoisomerase I inkubiert. Die molaren Verhältnisse sind angegeben. Die Ansätze
wurden auf 5-30 % Sucrose Gradienten aufgeschichtet, für 3 h bei 36.000 rpm sedimentiert und
fraktioniert. Die DNA der einzelnen Fraktionen wurde nach Deproteinisierung gefällt und auf 0.8 %
Agarosegelen aufgetrennt und durch EtBr-Färbung sichtbar gemacht (jeweils obere Abbildung). Die
Proteine der einzelnen Fraktionen wurden präzipitiert und durch Immunblot mit DEK-spezifischen
Antikörpern analysiert (jeweils untere Abbildung). Als Kontrollen wurden Gradienten nur mit SV40Minichromosomen allein (MC without DEK) und nur DEK allein (-, + λ PPase, free DEK) durchgeführt.
Wie schon für proteinfreie DNA gezeigt, kann nur dephosphoryliertes His-DEK
an die Minichromosomen binden und somit auch die Topologie verändern.
Phosphoryliertes His-DEK dagegen bindet nicht an die Minichromosomen
(DEK/MC 15). Bei höheren DEK-Mengen allerdings (DEK/MC 30, -λ PPase)
findet sich eine Subpopulation an DEK, die mit den Minichromosomen ko-
Ergebnisse
83
lokalisiert. Dies könnte auf eine inhomogene DEK-Population, bei der nicht alle
Moleküle gleich stark phosphoryliert vorkommen, zurückzuführen sein. Im Falle
von dephosphoryliertem His-DEK ist eine Bindung an die Minichromosomen
und eine damit verbundene Topologieveränderung deutlich erkennbar.
Freies unbehandeltes und dephosphoryliertes His-DEK befinden sich nach 3
Stunden Zentrifugation in den gleichen Fraktionen (Abbildung 4-18, free DEK)
des Gradienten. Nach einer Zentrifugation von 14 Stunden fällt das
phosphorylierte DEK jedoch komplett aus (Daten nicht gezeigt).
Unbehandeltes
His-DEK
scheint
nicht
immer
den
gleichen
Phosphorylierungsstatus aufzuweisen, denn sowohl in den EMSAExperimenten (Abbildung 4-17, A) als auch in den Sedimentationsanalysen
zeigten sich Subpopulationen, die an DNA binden können. Es handelt sich in
Folge dessen immer um eine Mischpopulation von vollständig phosphorylierten
und unter- oder dephosphorylierten DEK-Molekülen. Selbst nach einer
Dephosphorylierung mit λ Phosphatase blieben einige Phosphatgruppen
erhalten (siehe Abbildung 4-13). Diese resistenten Phospatgruppen
beeinflussen die DEK Aktivität in den hier untersuchten Assays jedoch nicht.
Aus diesem Kapitel lässt sich schließen, dass sich dephosphoryliertes His-DEK
in Bezug auf Topologieveränderung und DNA/Chromatin-Bindung wie das gut
charakterisierte GST-DEK verhält. Deshalb konnte für alle weiteren DNABindungs- und Topologiestudien das rekombinante, dephosphorylierte His-DEK
verwendet werden. Alle DEK-Deletionsmutanten wurden ebenfalls vor
Gebrauch, analog zu wtDEK, dephosphoryliert.
4.4.3
DNA-Bindung und Toplologierveänderung von DEK und DEKDeletionsmutanten
Die DEK-Aminosäuresequenz weist eine Homologie zu dem DNA-Bindemotiv
SAF-Box (oder SAP-Box) auf. Da DEK als sequenzunspezifisches DNABindeprotein identifiziert wurde (Alexiadis et al., 2000; Waldmann et al., 2003),
könnte dieser Bereich für die Vermittlung der DNA-Bindung verantwortlich sein.
4.4.4
Das SAF-Box enthaltende Fragment 87-187 bindet DNA
Diese Vermutung sollte durch EMSA-Studien untersucht werden. WtHis-DEK
bindet, wie GST-DEK auch, an DNA und führt zu großen DNA-Protein
Komplexen, die in den Geltaschen liegen bleiben (Abbildung 4-19; A, wt, Spur 3
und 4) (Waldmann et al., 2002), (Waldmann et al., 2003). Diese Eigenschaft
wurde auch für die Fragmente 1-250 und 1-187 beobachtet (Spur 6,7 und 9,10).
Der Bereich um die SAF-Box wurde weiter eingegrenzt und das kleinste zur
Verfügung stehende Fragment 87-187 zeigt eine vergleichbare DNABindeaktivität wie wtDEK. Das SAF-Box enthaltende Fragment ist folglich für
die DNA-Bindung verantwortlich.
Ergebnisse
84
Wie schon in der Einleitung erwähnt (Kapitel 1.4.2) konnte eine
Multimerisierungsdömäne in dem Protein identifiziert werden (Kappes et al.,
2004), die sich von Aminosäure 270-350 erstreckt (Abbildung 4-19, B).
Durch das Fehlen dieser Domäne (270-350) in allen hier untersuchten
Fragmenten kann eine Beteiligung der Multimerisierungsdomäne bei der
Generierung der großen Nukleoproteinkomplexe ausgeschlossen werden.
Abbildung 4-19 EMSAs mit wt-His-DEK und verschiedenen DEK Deletionsmutanten
A.
B.
0,5 pmol linearisierte SV40-DNA wurde mit je 9, 28, und 46 pmol der dephosphorylierten DEKFragmente (Spuren 2-4; 5-7; 8-10; 11-13) oder ohne (Spur 1) für 1 h bei 37°C inkubiert. Die
Nukleoprotein-Komplexe wurden auf 0.6 % Agarosegele 175 ng in 0.5 x TBE aufgetrennt und
durch EtBr-Färbung sichtbar gemacht. Das jeweilige Fragment ist angegeben.
Schematische Darstellung des DEK Proteins. Das DNA-bindende Fragment (87-187) und die
Multimerisierungsdomäne sind dargestellt (270-350).
Ergebnisse
4.4.5
85
Das SAF-Box-Fragment (87-187) ist für die Topologieveränderung
verantwortlich
Bisher wurde gezeigt, dass 87-187 das SAF-Box beinhaltende Fragment die
DNA Bindung vermittelt. Nun stellt sich die Frage, welcher Bereich des DEKProteins für die Topologieveränderung notwendig ist. Dazu wurden die
verschiedenen Deletionsmutanten in einen Topologieassay (DEK-Assay)
eingesetzt. Das wtDEK-Protein zeigt die bekannte Topologieveränderung
(Abbildung 4-20, wt, Spur 2-4). Durch Teilung des wt-Proteins in den Bereich
von 1-187 und 187-375 ist zu erkennen, dass die topologieverändernde Aktivität
auf dem Fragment 1-187 lokalisiert ist (1-187, Spur 6-8). Testet man nun das
Fragment 87-187, so ist dieses ebenfalls zur Topologieveränderung fähig (87187, Spur 14-16). Wird dieser Bereich aus dem Gesamtprotein deletiert (∆87187, Spur 18-20), so geht die topologieverändernde Aktivität verloren. Das
DNA-bindende Fragment 87-187 ist folglich auch für die Generierung von
Supercoils verantwortlich. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass dieses
Fragment auch die intermolekulare Wechselwirkung zwischen verschiedenen
DNA-Molekülen stimuliert (Kappes et al., 2004). Das Fragment 87-178 ist
deshalb für drei funktionelle Aspekte verantwortlich. Erstens für die Vermittlung
der DNA-Bindung, zweitens für die Generierung von Supercoils und drittens für
die Stimulierung von intermolekularen Wechselwirkungen („end-to-end“-joining
von DNA-Molekülen), wobei dieses Fragment keine DNA-Biegung verursacht
(Waldmann et al., 2003; Kappes et al., 2004).
Ergebnisse
86
Abbildung 4-20 Topologieassay mit verschiedenen DEK-Deletionsmutanten
A.
B.
4.4.6
Form I SV40 DNA (10 ng, 0.003 pmol) wurde ohne (-, Spuren 1, 5, 9, 13, 17) oder mit steigenden
Mengen der angegebenen DEK Fragmente (Spuren 2-4, 6-8, 10-12, 14-16, 18-20; je 1,8, 2,4 und
3 pmol Protein) in der Anwesenheit von 1unit Topoisomerase I inkubiert. Die einzelnen Proben
wurden nach 1 h mittles Proteinase K deproteinisiert, die DNA wurde gefällt und auf einem 0.8 %
Agarosegel aufgetrennt. Der Nachweis erfolgte durch Sybr-Gold Färbung.
Schematische Darstellung des DEK Proteins mit den bisher identifizierten funktionellen
Bereichen.
Identifizierung einer zweiten DNA-Bindedomäne (270-350) des
DEK-Proteins
In weiteren Experimenten sollten alle hergestellten DEK-Deletionsmutanten auf
deren DNA-Bindung getestet werden. Interessanterweise stellte sich heraus,
dass das Fragment 187-375 (Abbildung 4-21, A, Spur 3-4) ebenfalls eine DNAbindende Aktivität aufweist. Allerdings ist die Art der Bindung anderer Natur als
die des 1-187 Fragmentes, denn hier entstehen keine hochmolekularen
Komplexe. Bei Deletion der SAF-Box (∆ 87-187, Spur 6-7) zeigte sich das
gleiche Bild. Wurde das Fragment 310-375 eingesetzt, sieht man selbst bei der
höchsten Menge an Protein keine DNA-Bindung. Im Gegensatz dazu ist das
Fragment 270-350 zu einer Bindung fähig. Folglich konnte eine neue, zweite
DNA-Bindungsdomäne des DEK-Proteins zwischen den Aminosäuren 270-350
lokalisiert werden. Diese Domäne scheint eine duale Funktion auszuüben, denn
dieser Bereich konnte auch als Multimerisierungsdomäne identifiziert werden.
Ergebnisse
87
Weiterhin befinden sich in diesem Bereich die meisten kartierten CK2Phosphorylierungsstellen (4.3.3.4). Um die Multimerisierungsdomäne zu
charakterisieren, wurden Far-Western-Studien durchgeführt (Kappes et al.,
2004). Diese Experimente wurden mit unbehandeltem wtDEK und
Deletionsmutanten durchgeführt. Wie schon in Kapitel 4.2.1 dargestellt, wurden
diese Proteine phosphoryliert eingesetzt. Auch die Sonde, das PKA-DEK,
stammt aus dem Baculovirus-System und ist deshalb ebenfalls phoshoryliert.
Auf diesen Aspekt der Multimerisierung in Zusammenhang mit der
Phosphorylierung wird in Abschnitt 4.5.1 eingegangen.
Abbildung 4-21 EMSA mit C-terminalen DEK Fragmenten
A.
B.
175 ng (0.05 pmol) linearisierte SV40-DNA wurde mit 9, 28 und 46 pmol der angegebenen,
dephosphorylierten DEK-Fragmente (Spuren 2-4; 5-7; 8-10; 11-136) oder ohne Protein (Spur 1,
input) für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Auftrennung und der Nachweis der DNA-ProteinKomplexe erfolgte auf einem 0.6 % Agarosegel in 0.5 x TBE mit EtBr- Färbung.
Schematische Darstellung des DEK-Proteins mit der neu identifizierten zweiten DNABindedomäne.
Ergebnisse
4.5
88
Biochemische Aspekte der DEK-Phosphorylierung
In dem folgenden Abschnitt sollte nun der Einfluss der Phosphorylierung auf die
biochemischen Eigenschaften des DEK-Proteins untersucht werden. Es wurde
der Einfluss auf die DEK-DEK-Interaktion (Multimerisierung), die DEK-DNA und
DEK-Chromatin-Interaktion untersucht.
4.5.1
DEK-Multimerisierung und Phosphorylierung
Bisher gibt es mehrere Hinweise darauf, dass DEK di- oder multimerisieren
kann. Waldmann et al. (Waldmann et al., 2003), (Waldmann et al., 2002),
konnten anhand von elektronenmikroskopischen Bildern zeigen, dass DEK auf
DNA multimerisiert. Ausgehend von einem Punkt kommt es bei steigenden
DEK-Mengen zur Ausbildung von Proteinketten, die das DNA-Molekül
bedecken. Auch beobachtete man intermolekulare Interaktionen zwischen
verschiedenen DNA-Molekülen, die durch DEK hervorgerufen wurden. Im Falle
von SV40-Minichromosomen kann man eine drastische Kompaktierung
beobachten. In beiden Fällen spricht dies für eine Multimerisierung oder auch
für eine kooperative Bindung von DEK an DNA. Von „Vernetzungs“Experimenten war bekannt, dass DEK zu einer Ausbildung von großen
Proteinkomplexen neigt (Tanja Waldmann, persönliche Kommunikation).
Die Vermutung, dass DEK multimerisiert, wurde durch das „Yeast-Two-Hybrid“System (Scholten, 2004),(Kappes et al., 2004) und durch Far-Western-Studien
bestätigt. Das Far-Western-Experiment wurde mit unbehandeltem wtDEK und
Deletionsmutanten durchgeführt. Wie schon in Kapitel 4.2.1 dargestellt, wurden
diese Proteine phosphoryliert eingesetzt. Auch die Sonde, das PKA-DEK,
stammt aus dem Baculovirus-System und ist deshalb ebenfalls phoshoryliert.
Auf dem Bereich 270-350 befinden sich auch die meisten kartierten CK2Phosphorylierungsstellen (Kapitel 4.3.3.4). Deshalb liegt die Vermutung nahe,
dass die DEK-DEK-Multimerisierung über Phosphorylierung geregelt werden
könnte. Um diesen Punkt näher zu untersuchen, wurde rekombinantes His-DEK
dephosporyliert und mit gereinigter CK2 wieder aufphosphoryliert. Diese
Ansätze wurden auf 5-30 % Sucrosegradientien in 100 mM NaCl aufgeschichtet
und für 14 Stunden sedimentiert. Die Gradienten wurden fraktioniert und alle
Fraktionen durch Immunblot analysiert (Abbildung 4-22, A, B). Es ist zu
erkennen, dass sich phosphoryliertes DEK fast völlig in der Pelletfraktion des
Gradienten befindet (+PCK2), wohingegen dephosphoryliertes DEK in Fraktion 2,
3 und 4 zu finden ist (-P). Die kleine Population, die sich in der Pelletfraktion
befindet, könnte durch eine nicht vollständige Dephosphorylierung entstanden
sein. Wurde nun das phosphorylierte DEK mit 800 mM NaCl inkubiert, so findet
man ein ähnliches Verhalten wie bei nicht phosphoryliertem DEK. Die ProteinProtein-Interaktion wird folglich durch hohe NaCl-Mengen zerstört. Das
Ergebnis der Sucrosegradienten erlaubt die Aussage, dass phosporyliertes
Ergebnisse
89
DEK multimerisiert. Die Phosphorylierung durch CK2 ist ein Trigger für die
Multimerisierung. Um nun genauer zu untersuchen, ob diese beobachtete
Multimerisierung Zwischenstufen, z.B DEK-Dimere enthält, wurde die Methode
der nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese angewandt (Abbildung 4-22, C).
Diese erlaubt eine Auftrennung von Proteinen in ihrem nativen Zustand. Da kein
SDS zur Anwendung kommt, folgt die Auftrennung im elektrischen Feld durch
den isoelektrischen Punkt (pI) der Proteine.
Der errechnete isoelektrische Punkt von DEK liegt bei 8.6. Es wurden mehrere
Gelsysteme getestet. Das beste Ergebnis lieferte das Standard-Lämmli-System
ohne SDS-Zugabe. In Abbildung 4-22, C wurde gereinigtes His-DEK mit und
ohne Phosphatasebehandlung und His-DEK, das mittels CK2 wieder
aufphosphoryliert wurde, aufgetrennt. Im Falle der dephosphorylierten Probe ist
das Monomer von DEK zu erkennen (C, +λ-PPase). Ist DEK phosphoryliert, so
sind hochmolekulare Komplexe zu erkennen. Dies bestätigt die Ergebnisse des
Gradienten, auch hier konnten nur hochmolekulare Komplexe detektiert
werden.
Ergebnisse
90
Abbildung 4-22 Sedimentationsanalyse und native Gelelektrophorese von phosphoryliertem und
dephosphoryliertem His-DEK
wtHis-DEK wurde mittels λ-Phosphatase dephosphoryliert (-P) und durch CK2 in vitro
aufphosphoryliert (+PCK2). Die beiden Ansätze wurden auf 5-30 % Sucrosegradienten in nE100
(100 mM NaCl) für 14 Stunden bei 36.000 rpm (SW-40) und 4°C zentrifugiert. Die Gradienten
wurden in 20 Fraktionen fraktioniert, die enthaltenen Proteine wurden gefällt und durch SDSPAGE (10 %) und Immunblot mit DEK-spezifischen Antikörpern analysiert. Die Pelletfraktionen
der Gradienten wurden in SDS gelöst und wie oben beschrieben analysiert.
B. Ansatz wie bei (+PCK2), sedimentiert in einem 5-30% Sucrosegradient in nE800 (800 mM NaCl).
C. Dephosphoryliertes His-DEK (+ λ-PPase), unbehandeltes His-DEK (- λ-PPase) und mit CK2
aufphosphoryliertes His-DEK (+ λ-PPase, + CK2) wurden auf einem Standard-LämmliPolyacrylamid-Gel ohne SDS aufgetrennt. Der Nachweis der Proteine erfolgte durch SilberFärbung.
A.
Wenn nun die DEK-Phosphorylierung ein Trigger für die Multimerisierung ist,
dann müsste rekombinantes His-DEK im Laufe einer Phosphorylierung durch
die CK2 multimerisieren. Dies wurde anhand einer Phosphorylierungszeitreihe
untersucht. Dafür wurde rekombinantes His-DEK dephosphoryliert und mit CK2,
[32P]γ–ATP und in der Anwesenheit von Protease- und Phosphataseinhibitoren
inkubiert. Nach verschiedenen Zeitpunkten wurden dem Ansatz Proben
entnommen und nach Trennung in Überstand (S) und Pellet (P) durch
Autoradiographie und Immunblot analysiert (Abbildung 4-23). In der Kontrolle
befindet sich nach 60 min. Inkubation etwa 50 % der DEK Population im Pellet
(P, control 60 min). Im CK2-Ansatz hingegen ist nach 60 min das gesamte
Protein im Pellet. Im Falle der Kontrolle könnte dieses Verhalten auf eine nicht
vollständige Dephopshorylierung einiger DEK-Moleküle zurückzuführen sein,
denn bei längerer Inkubation auf Eis oder höheren Temperaturen tendiert selbst
die dephosphorylierte DEK-Form zu einer Multimerisierung (siehe auch
Abbildung 4-13). Dennoch wird beim 30 min Wert ersichtlich, einem Zeitpunkt
bei dem dephosphoryliertes DEK noch nicht multimerisiert, dass die CK2
Ergebnisse
91
Phosphorylierung die Multimerisierung von DEK stimuliert. Aus der
Autoradiographie ist ebenfalls ersichtlich, dass es sich hierbei tatsächlich
ausschließlich um phosphoryliertes DEK handelt.
Abbildung 4-23 Sedimentationsverhalten von DEK in einer CK2-Phosphorylierungszeitreihe
Rekombinantes, dephosphoryliertes His-DEK wurde in CK2-Phosphorylierungspuffer in der Anwesenheit
32
von Protease- und Phosphataseinhibitoren und [ P]γ–ATP ohne (control) oder mit CK2 (CK2) für die
angegebenen Zeiten bei 30°C inkubiert. Aliquote der beiden Reaktion wurden entnommen und für 15
Minuten bei 14.000 rpm abzentrifugiert. Überstand (S) und Pellet (P) wurden durch SDS-PAGE,
Autoradiographie und Immunblotting mit DEK-spezifischen Antikörpern analysiert.
4.5.2
Effekte der CK2-Phosphorylierung auf die DEK-DNA-Bindung.
Wie im vorherigen Kapitel gezeigt, stimuliert die Phosphorylierung die DEKMultimerisierung. Es sollte weiter untersucht werden, ob die Phosphorylierung
auch einen Einfluss auf die DNA-Bindung hat. Dafür wurde die Methode des
South-Westerns und der Filterbindung gewählt. DEK wurde zuerst
dephosphoryliert (-P) und mittels CK2 in vitro aufphosporyliert (+PCK2). Die
Proben
wurden
durch
SDS-PAGE
aufgetrennt
und
auf
eine
Nitrocellulosemembran transferiert. Diese Membran wurde mit radioaktivmarkierter SV40-DNA inkubiert und in der Autoradiographie analysiert
(Abbildung 4-24, A, 32P-DNA). Zur Kontrolle der eingesetzten Proteinmenge
wurde mit der gleichen Membran ein Immunblot durchgeführt (A, α-DEK). In
Abbildung 4-24, A ist nun zu sehen, dass CK2-phosphoryliertes DEK eine sehr
Ergebnisse
92
schwache DNA-bindende Aktivität aufweist, wohingegen dephosporyliertes
DEK sehr gut an DNA bindet (32P-DNA). Die Phosphorylierung von DEK durch
die Protein Kinase CK2 führt zu einer drastischen Reduktion oder Inhibierung
der DNA-Bindung von DEK.
Diese Beobachtung wurde nun durch eine weitere Methode untersucht.
Verschiedene Mengen an dephosphoryliertem (-P) und CK2-phosphoryliertem
DEK (+PCK2) wurden mit radioaktiv-markierter SV40-DNA inkubiert. Die
Inkubation erfolgte bei 50 mM oder bei 100 mM NaCl. Die Ansätze wurden nun
auf Nitrocellulosefilter gebracht, gewaschen und anschließend getrocknet. Die
DEK-gebundene, radioaktive DNA wurde vermessen. Bei einer Ionenstärke von
50 mM NaCl ist kein signifikanter Unterschied zwischen de- und
phosphoryliertem DEK zu beobachten. Wurde die Ionenstärke auf 100 mM
NaCl erhöht, ist deutlich zu erkennen, dass die DNA-Bindung von DEK inhibiert
wird. Die verbleibende DNA-Bindung im Falle der phosphorylierten DEK
Population könnte, wie in dem South-Western Experiment auch, durch eine
Population von unter- oder dephosphorylierten DEK Molekülen erklärt werden.
Ergebnisse
93
Abbildung 4-24 Phosphorylierung durch die Protein Kinase CK2 inhibiert die DEK-DNA Bindung
A.
B.
South-Western Analyse. Dephosphoryliertes (-P) und CK2 phosphoryliertes DEK (+PCK2) wurden
über SDS-PAGE (10 %) aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Nach dem
Blocken der Membran wurde diese mit radioaktiv-markierter SV40-DNA (Hinf I-verdaut, mit
Klenow Polymerase End-markiert) inkubiert. Die Membran wurde gewaschen, getrocknet und
32
durch Autoradiographie ( P-DNA) analysiert. Der Nachweis von DEK erfolgte im Anschluss
durch DEK spezifische Antikörper (α-DEK).
Filterbindungs Assay. Radioaktiv-markierte, Hinf I verdaute SV40-DNA (10 ng) wurde ohne (0)
oder mit den angegebenen Verhältnissen (DEK/DNA) an dephosphoryliertem (-P) und CK2
phosphoryliertem DEK (+PCK2) inkubiert. Der Assay wurde bei 50 mM und 100 mM NaCl im
Ansatz durchgeführt. Die einzelnen Proben wurden nach 1 Stunde bei 37°C auf
Nitrocellulosefilter gebracht, mit dem entsprechenden Puffer gewaschen und getrocknet. Die
gebundene radioaktive DNA wurde in einem Szintillationszähler ermittelt.
Die Phosphorylierung des DEK-Proteins durch die CK2 schwächt oder inhibiert
die DNA-Bindung von DEK, wie in Abbildung 4-24 zu erkennen. Bisher wurde
gezeigt, dass sich die Phosphorylierungsstellen für die CK2 im C-terminalen
Bereich von DEK befinden und teilweise mit der zweiten DNA-Bindedomäne
überlappen (Abbildung 4-25). Nun war es interessant zu untersuchen, welche
Bereiche des DEK-Proteins durch die Phosphorylierung in der DNA-Bindung
gehemmt werden.
Abbildung 4-25
Schematische Darstellung der DEK-Aminosäuresequenz. Gezeigt sind die in vitro kartierten CK2-Stellen
und die in vivo identifizierten Phospopeptide. Die neu identifizierte zweite DNA-Bindedomäne ist hellgrün
eingezeichnet.
Ergebnisse
4.5.3
94
Einfluss der CK2-Phosphorylierung auf die Aktivität der beiden
DEK-DNA-Bindedomänen?
Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurden EMSAs mit CK2phosphorylierten DEK-Deletionsmutanten durchgeführt. Zuerst wurden die
einzelnen DEK-Fragmente in vitro mit gereinigter CK2 phosphoryliert und in der
Autoradiographie (32P) und im Immunblot (α-DEK) analysiert (Abbildung 4-26,
A). Wie erwartet, weisen wtDEK und die Mutanten, die den C-terminalen
Bereich beinhalten (∆87-187, 187-375) eine starke Phosphorylierung auf. Das
Fragment 270-375 zeigt eine schwächere Phosphorylierung, da drei CK2
Phosphorylierungsstellen (S-243, S-244 und S-251) fehlen (siehe auch
Abbildung 4-13). Bei den Fragmenten 87-187 und 310-375 ist keine
Phosphorylierung detektierbar. Dies bestätigt die massenspektroskopischen
Untersuchungen, die in diesem Bereich keine Phosphorylierungsstellen
identifizieren konnten (Abbildung 4-25). Das Fragment 1-187 wird schwach
phosphoryliert, was auf S-32 zurückzuführen ist.
Mit diesen CK2-phosphorylierten DEK-Fragmenten wurden EMSAs
durchgeführt. Hierfür wurde linearisierte SV40-DNA mit steigenden Mengen der
verschiedenen DEK-Fragmente inkubiert und auf einem Agarosegel analysiert
(Abbildung 4-26, B). Auffallend ist, dass die Fragmente ∆87-187, 187-375 keine
DNA-Bindung mehr zeigen (Abbildung 4-26, Spuren 8-10, 11-13) im Gegensatz
zu ihrer dephosphorylierten Form (siehe Abbildung 4-19 und Abbildung 4-21).
Das SAF-Box enthaltende Fragment 1-187 hingegen bindet unverändert an
DNA. Hier sind, wie schon beobachtet, die charakteristischen, großen DNAProteinkomplexe in den Taschen des Gels zu erkennen. Daraus lässt sich
schließen, dass phosphoryliertes Serin-32 keine Rolle bei der Regulation der
DNA Bindung spielt. Wie erwartet, zeigt das Fragment 310-375, das als
Negativ-Kontrolle
dient,
keine
DNA-Bindung.
Weiterhin
ist
beim
phosphorylierten wtDEK eine veränderte DNA Bindung im Vergleich zu der
dephosphorylierten Form, zu erkennen (siehe auch Abbildung 4-24). Es wurden
keine großen DNA-Proteinkomplexe beobachtet und man kann eine allgemein
schwache DNA-Bindung feststellen.
Zusammenfassend ist der C-terminale Bereich von DEK über CK2Phosphorylierung geregelt. Dieser Bereich bindet im dephosphorylierten
Zustand and DNA und im phosphorylierten Zustand kommt es zu einer
Multimerisierung von mehreren DEK-Molekülen. Dieser phosphorylierte Bereich
beeinflusst aber auch die DNA-Bindeeigenschaft der SAF-Box, was wieder für
ein funktionelles Modul in 270-350 spricht.
Ergebnisse
95
Abbildung 4-26 EMSAs mit CK2-phosphorylierten DEK-Fragmenten
A.
B.
400 ng der angegebenen dephosphorylierten DEK-Fragmente wurden mit gereinigter CK2 in der
32
Anwesenheit von Protease- und Phosphataseinhibitoren und [ P]γ–ATP in vitro phosphoryliert.
Die Fragmente wurden durch SDS-PAGE (10-18%) aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran
transferiert und durch Autoradiographie (32P) und Immunblot (α-DEK) analysiert. Die Position
eines Proteinstandards ist in kDa angegeben. Als Kontrolle wurde wtDEK wie oben, nur ohne
CK2 inkubiert (Spur „input Wt“).
175 ng (0.05 pmol) linearisierte SV40 DNA wurde mit je 9, 28 und 46 pmol der phosphorylierten
DEK-Fragemente (Spuren 2-4, 5-7, 8-10, 11-13 und 14-16) für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Ergebnisse
96
Die eingesetzte DNA ohne Protein ist in Spur 1 zu sehen. Die Komplexe wurden auf einem 0.6 %
Agarosegel in 0.5 x TBE aufgetrennt und durch EtBr-Färbung sichtbar gemacht.
C. Schematische Darstellung des DEK-Proteins mit den funktionellen Domänen. Die grüne Box
kennzeichnet die SAF-Box, die roten Boxen stellen die sauren Bereiche und die schwarze Box
die Kernlokalisationssequnz dar.
4.5.4
Effekte der CK2-Phosphorylierung auf die DEK-ChromatinInteraktion
Bisher wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung durch die Protein-Kinase
CK2 die DEK-DNA-Bindung durch die zweite DNA-Bindedomäne vollständig
inhibiert und einen allgemeinen inhibitorischen Effekt auf die DNA-Bindung im
DEK-Molekül ausübt. Dieser Effekt wurde bisher nur auf proteinfreier DNA
beobachtet. Nun sollte die Bindung von His-DEK an Chromatinsubstrate
untersucht werden. Hierfür wurden zunächst SV40-Minichromosomen
verwendet. Der SV40-Virus hat den Vorteil, dass er eukaryotische Zellen
infiziert und dann die Wirtsproteine verwendet, um sein Genom in eine der
Wirtszelle identische Chromatinstruktur zu verpacken. Diese sogenannten
Minichromosomen können nun unter verschiedenen Bedingungen aufgereinigt
werden, so dass Chromatinsubstrate gewonnen werden, die nur die „Core“Histone oder „Core“-Histone und H1 (und andere Chromatinproteine) enthalten
(Gruss, 1995). Hier wurden salzgewaschene SV40-Minichromosomen
verwendet, die nur die „Core“-Histone enthalten (25-28 Nukleosomen).
Waldmann et al. konnten zeigen, dass DEK an SV40-Minichromosomen bindet
und die Topologie verändern kann (Waldmann et al., 2002). Inkubation von
SV40-Minichromosomen mit DEK führt zu einem Schutz von 50 bp
nukleosomaler DNA nach Mikrokokken-Nuklease Verdau des Chromatins
(Tanja Waldmann, Dissertation).
Nun stellt sich die Frage, wie sich die Phosphorylierung auf die DEK-ChromatinInteraktion
auswirkt.
Zunächst
wurden
salzgewaschene
SV40Minichromosomen mit steigenden Mengen an dephosphoryliertem und
phosphoryliertem His-DEK inkubiert und mit Mikrokokken-Nuklease behandelt
(Abbildung 4-27. DEKdephos, DEKphos). Die gereinigten Produkte wurden auf
einem Agarosegel analysiert. Ohne DEK (-DEK) wurde die typische mono- bis
trinukleosomale Leiter beobachtet. Dephosphoryliertes DEK führte, wie schon
beschrieben, zu einer Verlängerung der geschützten DNA um 50 bp. Folglich
induziert die DEK-Bindung einen Schutz von ca. 50 bp, was auf eine
kompaktere Chromatinstruktur schließen lässt (DEKdephos , 50, Dreieck). Im
Gegensatz dazu resultiert eine Inkubation mit phosphoryliertem DEK in keinem
Schutz (DEKphos, 50). Bei höheren DEK-Mengen kann man einen etwas
verzögerten Abbau beobachten, was auf eine inhomogene DEK-Population
zurückzuführen sein könnte (DEKphos.150).
Ergebnisse
97
Abbildung 4-27 Mikrokokken-Nuklease Verdau von SV40-Minichromosomen
Dephosphoryliertes und phosphoryliertes His-DEK wurden mit je 1µg salzgewaschenen SV40
Minichromosomen in der Anwesenheit von 5 units Topoisomerase I in nE100 für 1 h bei 37°C inkubiert.
Die einzelnen Proben wurden mit 3 mM CaCl2 versetzt und mit 6 units Mikrokokken-Nuklease für 1, 2, und
3 min verdaut. Die Reaktion wurde abgestoppt, die DNA wurde gereinigt und auf einem 1,5 % Agarosegel
aufgetrennt und durch Sybr-Gold Färbung sichtbar gemacht.
Beruht dieser Effekt auf einer veränderten Bindung von phosphoryliertem DEK
an die Minichromosomen oder auf einer inhibierten DEK-Bindung? Dieser
Aspekt sollte im Folgenden untersucht werden.
Hierfür
wurde
dephosphoryliertes,
rekombinantes
His-DEK
mit
salzgewaschenen SV40-Minichromosomen in Puffer mit 50 mM NaCl (nE50)
und in der Anwesenheit von Topoisomerase I inkubiert. Das gebundene DEK
wurde dann wie beschrieben phosphoryliert. Als Kontrolle diente ein Ansatz
ohne CK2. Nach erfolgter in situ Phosphorylierung wurden die beiden Proben
auf 5-30 % Sucrosegradienten mit 100 mM NaCl für 3 Stunden aufgetrennt. Die
Gradienten wurden fraktioniert und die gereinigte DNA auf einem Agarosegel
analysiert. Die gefällten Proteine der einzelnen Fraktionen wurden durch SDSPAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie und durch Immunblot analysiert.
Wie GST-DEK verändert auch dephophoryliertes DEK die Topologie der
Minichromosomen und bleibt während der Zentrifugation am Chromatin
gebunden
(Abbildung
4-28,
(-P).
Eine
Phosphorylierung
von
Ergebnisse
98
chromatingebundenem His-DEK durch die CK2 resultiert in einer Ablösung
dieser Population von den Minichromosomen (+PCK2). Diese ungebundene
DEK-Population ist phosphoryliert (vergleiche α-DEK und 32P). Die noch
gebundene Restpopulation ist entweder schwach- oder nicht phosphoryliert
(+PCK2., Fraktion 13,14). Es fällt hier auf, dass die Topoisomerleiter erhalten
bleibt, obwohl DEK nicht mehr gebunden ist. Dies liegt daran, dass die
Topoisomerase unter den Gradientenbedingungen ebenfalls von den
Minichromosomen
abgelöst
wird
(Tanja
Waldmann,
persönliche
Kommunikation). Die frei werdenden Supercoils können folglich nicht mehr von
ihr relaxiert werden.
Der beobachtete Verlust des Schutzes von 50 bp für die phosphorylierte DEKPopulation in Abbildung 4-27, beruht folglich nicht auf einer veränderten
Bindung, sondern auf einer inhibierten DEK-Bindung an Chromatin.
Ergebnisse
99
Abbildung 4-28 Interaktion von dephosphoryliertem und phosphoryliertem His-DEK mit
salzgewaschenen SV40-Minichromosomen
A.
B.
Salzgewaschene SV40-Minichromosomen wurden mit dephosphoryliertem His-DEK (im molaren
Verhältnis von 60 DEK/DNA) in der Anwesenheit von Topoisomerase I für 1 Stunde bei 37°C
inkubiert. Der Ansatz wurde auf einen 5-30 %Sucrose Gradienten aufgeschichtet und bei 36.000
rpm (SW40) für 3 Stunden zentrifugiert. Aus den einzelnen Fraktionen wurde die DNA durch
Ethanolpräzipitation gefällt, auf einem 0.8 % Agarosegel in 0.5 x TBE aufgetrennt und durch EtBrFärbung sichtbar gemacht. Die Proteine wurden durch Wessel-Flügge Fällung präzipitiert und
32
durch SDS-PAGE, Autoradiographie ( P) und Immunoblotting mit DEK spezifischen Antikörpern
nachgewiesen (α-DEK). Form I DNA: supergecoilt; Form II: entspannte, zirkulär geschlossene
oder genickte DNA.
Ansatz wie in A, gefolgt von einer in situ-Phosphorylierung durch gereinigte CK2 (+PCK2).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung durch die CK2
nicht nur die DEK-DNA-Interaktion inhibiert, sondern auch die DEK-ChromatinInteraktion.
Nun sollte untersucht werden, ob gereinigte CK2 auch endogenes, nukleosomal
gebundenes DEK phosphorylieren kann. Dafür wurden HeLa S3-Kerne mit
Mikrokokken-Nuklease verdaut, wodurch etwa 50 % des chromatingebundenen
DEKs freigesetzt wird. Diese Population ist mit Mono- bis Oligonukleosomen
assoziiert (Kappes et al., 2001). Nach Ermittlung der optimalen Verdauzeit,
wurden dann die gewonnenen nukleosomalen Fragmente mit gereinigter CK2
und [32P]γ–ATP wie beschrieben phosphoryliert. Nach der Inkubation erfolgte
eine Immunfällung des endogenen DEKs. Die Immunkomplexe wurden durch
SDS-PAGE, Autoradiographie und Immunblot analysiert (Abbildung 4-29).
Die optimale Verdauzeit für die Mikrokokken-Nuklease lag bei 10 min. Hier
kommt es zu einer gleichmäßigen Verteilung von Mono- bis Oligonukleosomen
(Abbildung 4-29, A). Die freigesetzte DEK-Menge wurde im Immunblot überprüft
(A, DEK). Nach der Phosphorylierungsreaktion mit gereinigter CK2 ist deutlich
zu erkennen, dass auch endogenes, nukleosomal gebundenes DEK
phosphoryliert wird (Abbildung 4-29, B, 32P +CK2). In der Kontrolle ohne
gereinigte CK2 kommt es nur zu einer schwachen Phosphorylierung, die durch
die endogen vorhandene CK2 hervorgerufen werden könnte (32P -CK2). Hiermit
wurde gezeigt, dass endogenes nukleosomal gebundenes DEK auch in vitro
durch gereinigte CK2 phosphoryliert werden kann.
Ergebnisse
100
Abbildung 4-29 Gereinigte CK2 phosphoryliert endogenes, nukleosomal gebundenes DEK
A.
B.
Aus HeLa S3 Zellen wurden Kerne hypoton extrahiert und die Kernmembran mit NP-40 entfernt.
Die Kernsuspension wurde für die angegebene Zeit mit 10 units Mikrokokken-Nuklease (für 50µg
DNA) bei 14°C inkubiert. Einzelne Proben wurden entnommen, mit 8 mM EDTA versetzt und
durch Zentrifugation wurden die freigesetzten nukleosomalen Fragmente gewonnen. Die
gereinigte DNA wurde auf einem 0.8 % Agarosegel in 1x TAE aufgetrennt und durch EtBrFärbung sichtbar gemacht. Die Positionen der mono- di – tri und tetra nukleosomalen Fragmente
sind angegeben.
Kerne wurden wie in A für 10 min mit 10 units MNase behandelt. Die freigesetzten Fragmente
32
wurden mit Protease- und Phosphatase Inhibitoren, [ P]γ–ATP und ATP versetzt. Die
Phosphorylierungsreaktion wurde durch Zugabe von CK2 gestartet. Nach einer Stunde bei 37°C
wurden die Ansätze auf 450 mM NaCl eingestellt und DEK durch monospezifische, polyklonale
DEK Antikörper gefällt. Die Immunkomplexe wurden durch SDS-PAGE (10%), Autoradiographie
und Immunblot (monoklonaler DEK-AK) analysiert.
Wie oben gezeigt wurde, inhibiert die Phosphorylierung durch die CK2 die DEKChromatin-Bindung.
Dieser Befund steht in einem offensichtlichen Widerspruch zu vorherigen
Daten, denn zu keinem Zeitpunkt im Zellzyklus konnte lösliches DEK detektiert
werden (Kappes et al., 2001). Da DEK aber über den ganzen Zellzyklus
phosphoryliert
vorkommt,
scheint
auch
phosphoryliertes
DEK
chromatingebunden vorzukommen. In Kappes et al. (2001) wurde weder eine
Ergebnisse
101
Lokalisations- noch eine Mengenänderung von DEK im Zellzyklus festgestellt.
Hier wurden die Zellfraktionierungen in großen NaCl-Schritten durchgeführt. Um
nun die Möglichkeit nicht außer Acht zu lassen, dass die Phosphorylierung von
zellulärem DEK doch zu einer veränderten Lokalisation führt, wurden im
Folgenden Zellfraktionierungen in kleineren NaCl-Schritten durchgeführt.
4.5.4.1 Eine stärkere Phosphorylierung in der G1-Phase des Zellzyklus führt zu
keiner Lokalisationsänderung von DEK
Für die Zellfraktionierungen wurden Zellen verwendet, die 12 oder 15,5 Stunden
aus dem doppelten Thymidinblock entlassen wurden (G1-Phase des
Zellzyklus). Mit diesen HeLa S3-Zellen wurde zum einen eine konventionelle
Zellfraktionierung durchgeführt (Abbildung 4-30, A), das heißt nach Abtrennen
des Cytosols und des Nukleosols wurde die Chromatinfraktion mit 100, 150,
250, 300, 350, 400 und 450 mM NaCl extrahiert und zum anderen in kleineren
NaCl-Schritten (Abbildung 4-30, B). Wie bei den salzgewaschenen SV40Minichromosomen
beobachtet,
würde
man
durch
eine
stärkere
Phosphorylierung von DEK eine schwächere oder gar inhibierte
Chromatinbindung von DEK vermuten. In beiden Fällen konnte man keine
signifikanten Unterschiede in der Bindungsstärke von endogenem DEK
detektieren (Abbildung 4-30, A, B)
Ergebnisse
102
Abbildung 4-30 Zellfraktionierung von G1-Phase-Zellen
A.
B.
HeLa S3-Zellen wurden durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und für 12 und 15,5
Stunden aus dem Block entlassen. Die Zellen wurden mit hypotonem Puffer inkubiert um das
Cytosol freizusetzen (C). Nach einer Zentrifugation wurden die Kerne mit NP-40 lysiert. Dies führt
zu einer Freisetzung des Nuleosols und nicht NP-40 resistenten Proteine (N). Die gewonnene
Chromatinfraktion wurde nun in einer Reihe mit steigenden NaCl-Mengen extrahiert. Die Proteine
aus allen Fraktionen (entsprechende Aliquote) wurden durch eine Wessel-Flügge-Fällung
präzipitiert und durch SDS-PAGE (10 %) und Immunblot mit DEK-spezifischen Antikörpern
analysiert.
Wie in A. Die verwendeten NaCl-Schritte sind angegeben. Als Kontrolle wurden asynchron
proliferierende HeLa S3 Zellen parallel untersucht („interphase“).
Dieses Ergebnis bestätigt einerseits die früheren Arbeiten, andererseits lässt
sich dieser Befund mit den Beobachtungen der DEK-DNA- und DEK-Chromatin
Interaktionen in einem phosphorylierten Zustand nur schwer in Einklang
bringen. Diesem Widerspruch wird im folgenden Abschnitt nachgegangen.
Ergebnisse
4.5.5
103
Wie wird phosporyliertes DEK an Chromatin gebunden?
In Abbildung 4-28 wurden salzgewaschene SV40-Minichromosomen
verwendet, die nur noch die „Core“-Histone enthalten und sonst keine anderen
chromatingebundenen Proteine (Gruss and Knippers, 1995). In der Zelle jedoch
könnte das DEK-Protein mit anderen Proteinen in einem Komplex vorkommen.
So würde die Möglichkeit bestehen, dass phosphoryliertes DEK über andere
Proteine an das Chromatin gebunden wird. Um diese Vermutung zu
untersuchen, wurden native Oligonukleosomen, gewonnen durch MikrokokkusNuklease-Verdau von HeLa S3-Zellkernen eingesetzt (Abbildung 4-29). Zuerst
wurde die optimale Verdauzeit ermittelt (Abbildung 4-29, A) und die freigesetzte
DEK-Menge mittels Immunblot analysiert.
Dieses native oligonukleosomale Substrat wurde nun zum einen mit
rekombinanten, dephosphoryliertem His-DEK (Abbildung 4-31, A –P) und zum
anderen mit CK2 phosphoryliertem His-DEK (A, +PCK2) inkubiert. Die Ansätze
wurden für 14 Stunden auf einem 5-40 % Sucrosegradienten zentrifugiert,
fraktioniert und die gereinigte DNA und Proteine wie in Abbildung 4-28
analysiert.
Zu erkennen ist nun, dass dephosphoryliertes His-DEK, wie endogenes DEK (P, cellular DEK) mit den Nukleosomen ko-sedimentiert. Das Verhalten von HisDEK und DEK ist ebenfalls identisch. Betrachtet man nun den Gradienten mit
CK2 phosphoryliertem His-DEK, so fällt auf, dass dieses ebenfalls mit den
Nukleosomen ko-sedimentiert und sich wie endogenes DEK verhält (+PCK2). Im
Gegensatz zu salzgewaschenen Minichromosomen findet bei den nativen
Nukleosomen eine Bindung von phosphoryliertem DEK an Chromatin statt.
Aus diesem Befund lässt sich schließen, dass es einen weiteren Faktor, einen
Mediator, geben muss, der auch phosphoryliertes DEK an Chromatin bindet.
Dieses Experiment erklärt auch, warum keine Lokalisationsveränderung von
phosphoryliertem DEK in vivo beobachtet wurde.
Nun war es interessant, diese(s) potenzielle(n) Mediator Protein(e) zu
identifizieren. In der Literatur sind mehrere Interaktionspartner von DEK
beschrieben, zum einen der Transkriptionsaktivator AP-2α (Campillos et al.,
2003) und der Transkriptionsrepressor hDaxx (Hollenbach et al., 2002). Auch
wurde eine Interaktion mit den Histonen H2A und H2B berichtet (Alexiadis et
al., 2000a). Diese Interaktion konnte allerdings nicht reproduziert werden
(Scholten, 2004). Auch in dieser Arbeit gibt es keine Hinweise, dass DEK mit
H2A und H2B interagiert. Zumindest können diese beiden Proteine nicht die
Funktion des potenziellen Mediators vermitteln, da sie in den SV40Minichromosomen enthalten sind.
Im Verlauf dieser Arbeit wurde weiterhin gezeigt, dass die CK2Phosphorylierung zu einer DEK-DEK-Multimerisierung führt (Abbildung 4-22). In
Ergebnisse
104
der Zelle liegt immer eine Mischpopulation von phosphorylierten und
dephosphorylierten DEK-Molekülen vor. Nun liegt die Vermutung nahe, dass
DEK eventuell in seiner dephosphorylierten Form als Mediator für seinen
phosphorylierten Gegenpart dienen könnte.
Um dieser Hypothese nachzugehen, wurden salzgewaschene SV40Minichromosomen verwendet. Diese wurden zuerst mit dephosphoryliertem
His-DEK inkubiert (Abbildung 4-31, B, 1. –P), das wie oben beschrieben zu
einer Bindung von DEK an die Minichromosomen führt (Abbildung 4-28, A, -P).
Nach einer Stunde Inkubation erfolgte die Zugabe von radioaktivem, durch die
CK2-phosphoryliertem His-DEK zu der Reaktion (2. +PCK2). Die Auftrennung
wurde über 5-30 % Sucrosegradienten für 3 Stunden vorgenommen. Die
weitere Probenaufbereitung wurde analog zu Abbildung 4-28 durchgeführt.
Zu erkennen ist nun, dass phosphoryliertes His-DEK mit den Minichromosomen
ko-sedimentiert und deshalb an diese gebunden hat (Abbildung 4-31, B). Der
einzige Unterschied bei diesen Minichromosomen im Vergleich zu
Salzgewaschenen liegt darin, dass sie mit dephosphporyliertem DEK assoziiert
sind, das in diesem Falle tatsächlich als Mediator oder „Anker“ die
Chromatinbindung für phosphoryliertes DEK vermittelt. Rückblickend kann man
mit diesem Experiment auch das in vivo Verhalten der DEK-Chromatin-Bindung
über den Zellzyklus erklären. Da sich die Lokalisation von DEK zu keiner Zeit
ändert, es aber immer dephosphorylierte DEK-Moleküle gibt, bleibt
phosphoryliertes DEK dadurch an Chromatin gebunden. Dieser Befund schließt
allerdings eine Interaktion mit anderen Proteinen nicht aus. In den „Yeast-T
Two-Hybrid“-Untersuchungen wurden keine anderen Interaktionspartner als
DEK selbst gefunden (Kappes et al., 2004). Dieser Befund hier wäre eine
mögliche zusätzliche Erklärung.
Ergebnisse
105
Abbildung 4-31 Assoziation von dephosphoryliertem und phosphoryliertem His-DEK mit nativen
Oligonukleosomen
A.
B.
HeLa S3-Zellkerne wurden für 10 Minuten bei 14°C mit Mikrokokken-Nuklease verdaut.
Freigesetzte Oligonukleosomen wurden mit Protease- und Phosphataseinhibitoren und entweder
mit dephosphoryliertem (-P) oder mit CK2 aufphosphoryliertem His-DEK (+PCK2) für 1 Stunde bei
37°C inkubiert. Die Ansätze wurden auf 5-40 % Sucrosegradienten aufgeschichtet und für 14
Stunden bei 36.000 rpm und 4°C (SW-40) zentrifugiert. Nach dem Fraktionieren des Gradienten
wurde die gereinigte DNA über Agarosegelelektrophorese und EtBr-Färbung sichtbar gemacht
(oben). Die Position der nukleosomelen Fragmente ist rechts angegeben. Die gefällten Proteine
wurden über SDS-PAGE, Immunblot (α-DEK) mit DEK spezifischen Antikörpern und
Autoradiographie (32P) analysiert. Die Position eines Proteinstandards ist links, die Position von
endogenem und His-DEK ist rechts angegeben.
Salzgewaschene SV40 Minichromosomen wurden zuerst mit dephosporyliertem His-DEK
(molares Verhältnis DEK/DNA: 30) und Topoisomerase I für 1 Stunde bei 37°C inkubiert (1.-P).
Nach der Zugabe von in vitro CK2-phosphoryliertem His-DEK (molares Verhältnis DEK/DNA: 30)
(2. +PCK2) wurde der Ansatz für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Die weitere Behandlung
wurde analog zu Abbildung 4-28 durchgeführt. Gezeigt ist das Agarosegel (oben), der Immunblot
(α-DEK) und die Autoradiographie (32P).
Ergebnisse
106
Ergebnisse
4.6
107
DEK ist nur phosphoryliert auf Hancock-Chromatin zu
finden
Nun sollte die DEK-Chromatin-Assoziation mit einer anderen Methode
untersucht werden. Dafür wurde sogenanntes „Hancock-Chromatin“ hergestellt
(Hancock, 1974). Diese Methode beruht auf der salzfreien Gewinnung von
Zellkernen und schlussendlich von Chromatinkörperchen (chromatin bodies,
Abbildung 4-32, A). Während der Präparation kommt es zu einer
Größenzunahme der Kerne (bis zum Zehnfachen). Dadurch sind die
Chromatinfasern
einem
erheblichen
Torsionsstress
unterworfen.
Erstaunlicherweise war nur ein sehr geringer Teil von DEK mit den
Chromatinkörperchen aus asynchron proliferierenden Hela S3-Zellen assoziiert
(Abbildung 4-32, C, DMSO, chromatin bodies, α-DEK). Der Hauptteil befand
sich in den löslichen Fraktionen (S1, S2). Im Gegensatz dazu verhält sich
MCM3 wie in der Literatur beschrieben (z. B. (Ritzi et al., 1998), (Richter et al.,
1998). Eine Erklärung hierfür könnte die Präparationsmethode sein. In einem
Szenario, in dem dephosphoryliertes DEK durch seine beiden DNABindedomänen, an verschiedene Chromatinfasern oder Bereiche bindet, wäre
es möglich, dass DEK durch den Torsionsstress während der Präparation vom
Chromatin „abgesprengt“ wird. Dieser Effekt müsste sich noch verstärken, wenn
die Phosphorylierung von DEK durch den Einsatz von TBB unterdrückt werden
würde. Daher wurden die Zellen vor der Chromatinpräparation für drei Stunden
mit TBB behandelt. Tatsächlich reduziert sich die chromatingebundene DEKPopulation (Abbildung 4-32, C, chromatin bodies, TBB, α-DEK), wohingegen
MCM3 von dieser Behandlung unbeeinflusst bleibt (C, chromatin bodies, TBB,
α-MCM3).
Durch diese Methode konnte gezeigt werden, dass die CK2-Phosphorylierung
die Art der DEK-Bindung an Chromatin modelliert. Jedoch muss hier angeführt
werden, dass dies auch ein elektrostatischer Effekt sein könnte. Durch das
salzfreie Milieu sind die sauren Boxen des DEK-Proteins negativ geladen, und
es könnte so zu einer Ablösung von Chromatin kommen. Dennoch bestätigt
dies die vorherigen Daten, dass die CK2-Phosphorylierung die Art der DEKDNA-Bindung modelliert.
Ergebnisse
108
Abbildung 4-32 Hancock-Chromatin-Präparation
Asynchrone HeLa S3-Zellen wurden für drei Stunden mit 50 µM TBB oder einer gleichen Menge an DMSO
behandelt. Die Zellkerne wurden nun durch eine Inkubation in einem salzfreien Puffer gewonnen. Der
Überstand stellt das Cytosol dar (S1). Anschließend wurden die Kerne mit NP-40 behandelt, um Reste der
Kernmembran zu entfernen (S2). Nach zwei Zentrifugationen über ein Sucrosekissen erhielt man die
Chromatin-Körperchen (chromatin-bodies). Diese wurden durch Lichtmikroskopie und Hoechst-Färbung
auf ihre Qualität hin überprüft (A). Der DNA Gehalt wurde bestimmt. 5, 10 und 20 µg DNA und die
entsprechenden Aliquote von S1 und S2 wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Membran
transferiert und mit Poinceau gefärbt (B). Die Analyse des selben Blots erfolgte durch Western-Blot mit
DEK und MCM3 spezifischen Antikörpern (α-DEK, α-MCM3).
5
Diskussion
Das DEK-Protein ist mit 4-6 x106 Kopien/HeLa-Zellkern ein sehr häufiges,
chromatinassoziiertes Protein höherer Eukaryoten, das in den letzten Dekaden
der Chromatinforschung nur wenig Beachtung erfahren hat. Die genaue
Funktion von DEK ist bisher weitgehend unbekannt. Jedoch wurde es seit der
Entdeckung, 1992, als potenzielles Protoonkogen mit verschiedenen
funktionellen Aspekten in Zusammenhang gebracht, wovon einige
Beobachtungen mittlerweile an Gültigkeit verloren haben.
So ist z.B. die Assoziation von DEK mit dem EJC-Komplex und die damit
postulierte Rolle in post-Spleißprozessen auf eine Kreuzreaktion des
verwendeten Antikörpers zurückzuführen und dadurch nicht mehr haltbar (Le
Hir et al., 2000; McGarvey et al., 2000; Le Hir et al., 2001; Lykke-Andersen et
al., 2001; Devany et al., 2004; Scholten, 2004). Jedoch wurde in Experimenten,
unabhängig von diesem Antikörper, eine RNA-assoziierte DEK-Population
identifiziert, deren Funktion noch nicht geklärt ist (Kappes et al., 2001).
Die Rolle von DEK in der DNA-Reparatur, wie von Meyn et al. (1993) postuliert,
konnte in Experimenten in unserem Labor nicht gefunden werden (Meyn et al.,
1993a; Scholten, 2004).
Auch eine sequenzspezifische DNA-Bindung von DEK an die pets-site oder die
Y-Box, wie von der Markovitz-Gruppe (Fu and Markovitz, 1996; Fu et al., 1997;
Adams et al., 2003) beschrieben, konnte bisher weder in unserem Labor noch
in dem Labor von G. Grosveld (Grosveld, 2002) weiter bestätigt werden. Im
Gegensatz dazu zeigten Waldmann et al. (2003), dass DEK eher
strukturspezifisch als sequenzspezifisch an DNA bindet, da eine bevorzugte
Bindung an kruziform und supergecoilte DNA-Formen beobachtet wurde. Diese
Art der Bindung ist eine Eigenschaft die von Architekturproteinen erfüllt wird
(Zlatanova and van Holde, 1998). Viele dieser Proteine, wie z.B die HMGProteine, spielen neben der Funktion in der Zellkernarchitektur auch eine Rolle
in der Transkription (siehe Kapitel 1.3.2). Auch für DEK wurde eine noch
unbekannte Rolle bei der Transkriptionsregulation postuliert, wobei die beiden
Beobachtungen von Hollenbach et al. (2002) und Campillos et al. (2003)
unterschiedliche Funktionsweisen für DEK postulieren.
Eine Beobachtung, die von meherern Autoren gemacht wurde, ist die
Überexpression von DEK in malignen Zellen, und eine damit einhergehende
klinische Relevanz als potenzieller Tumormarker. Die Mechanismen, die der
unterschiedlichen DEK-Expression zu Grunde liegen, sind bisher jedoch noch
nicht verstanden.
Diskussion
5.1
110
DEK-mRNA, DEK-Neusynthese und Halbwertszeit von
DEK in HeLa Zellen
Neben der Überexpression von DEK in malignen Zellen konnte jedoch gezeigt
werden, dass innerhalb des HeLa-Zellzyklus die DEK-Protein-Menge keiner
Schwankung unterliegt (Kappes et al., 2001). Um diesen Befund zu erweitern,
wurden in dieser Arbeit weitere Studien zur DEK-Expression in HeLa-Zellen
durchgeführt.
Bei der Untersuchung der DEK-mRNA-Menge während des Zellzyklus konnten
in allen Zellzyklusphasen identische DEK-mRNA-Mengen detektiert werden
(Abbildung 4-1). Die Neusyntheserate von DEK wurde ebenfalls als konstant
vorgefunden (Abbildung 4-2). Die Expression und Neusynthese von DEK in
HeLa-Zellen ist demnach keiner offensichtlichen zellzyklusspezifischen
Regulation unterworfen und bestätigt weiterhin die Arbeit von Kappes et al.
(2001). Die vorhandenen DEK-Transkripte scheinen gleichmässig translatiert zu
werden, denn bisher gibt es keine Hinweise, dass die DEK-mRNA einer
speziellen Regulation unterliegt. Dies ist die erste Untersuchung der DEKExpression während des Zellzyklus. Alle bisherigen Studien verglichen die
DEK-Expression
zwischen
Krebszellen
und
dem
dazugehörigen
untransformierten Gewebe auf mRNA-Ebene (Hamaguchi et al., 1998; Kondoh
et al., 1999; Kroes et al., 2000; Larramendy et al., 2002; Makita et al., 2002;
Savli et al., 2002; Takahashi et al., 2002; Sanchez-Carbayo et al., 2003;
Daibata et al., 2004; Evans et al., 2004). Diese Studien zeigen alle eine
Überexpression von DEK in den untersuchten Krebsarten auf. Jedoch gibt es in
diesen Arbeiten auch Hinweise darauf, dass eine veränderte DEK-Expression in
nicht-transformierten Zellen in Abhängigkeit zum Proliferationsstatus der Zelle
steht. Generell scheint in stark proliferierenden Zellen die DEK-mRNA erhöht zu
sein, wohingegen eine Inhibition der Proliferation zu einer Abnahme führt.
Kondoh et al. (1999) konnten in proliferierenden HuH-7 (Leberkarzinomzellen)
und HepG2 (Leberzellen)-Zellen eine hohe Präsenz von DEK-Transkripten
beobachten. Eine Inhibition der Proliferation durch Serumentzug und durch
Kontaktinhibition schlug sich in einer Abnahme der DEK-mRNA-Menge nieder
und war in ausdifferenzierten Leberzellen nicht mehr zu detektieren. Durch NaButyrat-Behandlung von HuH-7-Zellen, die zu deren Ausdifferenzierung führt,
wurde ebenfalls eine Abnahme der DEK-mRNA festgestellt (Kondoh et al.,
1999). In einer weiteren Studie von Savli et al. (2002), die die Differenzierung
von HL-60-Zellen (AML-Zelllinie) durch ein Vitamin D-Analogon induzierten,
konnte ebenfalls eine differenzierungsabhängige Abnahme der DEK-mRNA
festgestellt werden (Savli et al., 2002).
Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, bleibt in proliferierenden HeLa-Zellen
die DEK-Menge konstant. Im Zusammenhang mit den oben genannten
Befunden lässt sich daher eher eine proliferationsspezifische als eine
Diskussion
111
zellzyklusspezifische Funktion von DEK vermuten. Dies spiegelt sich auch in
den Proteinmengen wider, denn ein Vergleich der DEK-Proteinmengen in
primären Zellen und deren transformierter Form zeigte eine erhöhte DEKMenge in den letzteren (Scholten, 2004). Auch in primären menschlichen BZellen ist nur ein Drittel der DEK-Menge im Vergleich zu HeLa-Zellen
vorhanden (H.G. Hu, Persönliche Kommunikation).
Der DEK-Promotor wird potenziell über die Proteine YY1 (Yin Yang 1) und NFY (nuclear factor 1) reguliert (Sitwala et al., 2002). Die Beteiligung dieser beiden
Transkriptionsfaktoren ist eine mögliche Erklärung für die erhöhte DEKExpression in malignen Zellen, da beide Faktoren in transformierten Zellen
einer unterschiedlichen Expression unterliegen (Sitwala et al., 2002b). Jedoch
ist nicht auszuschließen, dass die DEK-Expression auch durch andere Faktoren
kontrolliert wird, die durch die vorhandene Transformation der HeLa-Zellen
einer unterschiedlichen Regulation unterworfen sind. Daher wäre es interessant
auch in primären Zelllinien eine Untersuchung der DEK-Expression während
des Zellzyklus durchzuführen.
Die beobachtete DEK-Halbwertszeit von 20 Stunden (Abbildung 4-3) spricht
ebenfalls gegen eine zellzyklusspezifische Funktion von DEK, die durch
kontrollierte Proteindegradation vermittelt wird. Bisher gibt es keine Hinweise,
dass DEK z.B über den Proteasomenweg abgebaut wird. Wurden HeLa-Zellen
mit dem Proteasomen-Inhibitor MG-132 behandelt, so konnte keine
Akkumulation von DEK beobachtet werde (Daten nicht gezeigt).
In den „Pulse-Chase“-Experimenten zeigte sich, dass der Abbau von DEK bei
den 60 und 72 Stunden-Werten nicht der errechneten Halbwertszeit von 20
Stunden entspricht. Dies lässt vermuten, dass es unterschiedlich stabile DEKPopulationen in einer Zelle gibt. DEK ist ein hochmobiles Protein (Scholten,
2004), jedoch konnten sogenannte „DEK-Microdomänen“, die über Minuten
hinweg stabil bleiben, ermittelt werden. Dies könnte eine mögliche Erklärung für
einen verzögerten Abbau sein, denn DEK könnte je nach Assoziation mit
Chromatin (Kappes et al., 2001), RNA (McGarvey et al., 2000; Kappes et al.,
2001) und der Kernmatrix (Kappes, 2000) einer unterschiedlichen Stabilität
unterliegen.
Für DEK konnte hier weder eine veränderte mRNA-Menge noch eine
veränderte Neusynthese und, wie schon früher beschrieben, auch keine
veränderte Lokalisation innerhalb eines Zellzyklus gefunden werden (Kappes et
al., 2001). Auch ein regulierter Abbau von DEK konnte nicht festgestellt werden.
Diese Daten sind ein Hinweis darauf, dass DEK keine Funktion in der
Zellzykluskontrolle hat oder die DEK-Expression selbst Zellzyklus-abhängig
kontrolliert wird. Vielmehr scheint DEK in den Ausdifferenzierungs- und
Proliferationsstatus einer Zelle involviert zu sein.
Diskussion
5.2
112
DEK wird während des ganzen Zellzyklus phosphoryliert
Da DEK von Fornerod et al. (1995) als Phosphoprotein identifiziert wurde,
könnte eine mögliche Regulation von DEK in vivo über posttranslationale
Modifikation erfolgen. In dieser Arbeit erfolgte deshalb eine ausführliche
Charakterisierung der DEK-Phosphorylierung.
Tatsächlich zeigten „Pulse“-Exprimente mit synchronisierten HeLa-Zellen, dass
DEK zu allen Zeitpunkten im Zellzyklus phosphoryliert ist, allerdings ein
Maximum in der G1-Phase erreicht wird (Abbildung 4-4). Eine differenzielle
Phosphorylierung von rekombinantem His-DEK wurde ebenfalls durch die
Verwendung von G1- und S-Phase-Zellextrakten in vitro gezeigt (Abbildung
4-7). Hier konnte auch eine in etwa doppelt so starke DEK-Phosphorylierung in
G1-Phase-Zellextrakt im Gegensatz zu S-Phase-Zellextrakt gefunden werden.
Die Verwendung von Geminin in diesem Experiment zeigte weiterhin auf, dass
die verwendeten Extrakte eine spezifische Phosphorylierung ermöglichen. Denn
Geminin wurde im Gegensatz zu DEK hauptsächlich in S-Phase-Extrakt
phosphoryliert, was im Einklang mit publizierten Daten steht (Kulartz et al.,
2004). Die (differenzielle) Phosphorylierung könnte ein Mechanismus sein zur
zellzyklusabhängigen
Regulation
der
DEK-Funktionen.
Die
DEKProteinsequenz weist allerdings keine Konsensussequenzen (S/T-P,
Serin/Threonin gefolgt von Prolin) für Cyclin-abhängige-Kinasen (CDKs) auf,
und Versuche mit dem spezifischen CDK-Inhibitor Cip-1 zeigten keine Inhibition
der DEK-Phosphorylierung, weder in S- noch in G1-Phase-Zellextrakten (Daten
nicht gezeigt). Dahingegen wurden durch Sequenzvergleiche die ProteinKinasen CK2, PKC und GSK-3 als potenzielle Kandidaten für die DEKPhosphorylierung identifiziert (Abbildung 4-8). Im weiteren Verlauf dieser Arbeit
konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von DEK in vitro
und in vivo hauptsächlich durch die CK2 vermittelt wird (Abbildung 4-9,
Abbildung 4-10, Abbildung 4-11 und Abbildung 4-12). Eine Phosphorylierung
durch gereinigte CK2 konnte auch an nativem, nukleosomal gebundenem DEK
gezeigt werden (Abbildung 4-29). In geringerem Ausmaß konnte auch eine
Beteiligung der PKC gezeigt werden. Es wurde hingegen keine DEKphosphorylierende Aktivität für die GSK-3 festgestellt (Abbildung 4-9 und
Abbildung 4-10).
Welche Rolle nimmt die CK2 in der Zelle ein ?
Die Protein-Kinase CK2 (früher Casein Kinase II) ist eine evolutionär hoch
konservierte, ubiquitär exprimierte Serin/Threonin-spezifische Komponente des
Phospho-Proteasoms. Sie kommt in allen eukaryotischen Organismen außer in
Archea vor und wird in allen Geweben und Zellsubkompartimenten vorgefunden
(Faust and Montenarh, 2000). CK2 ist essenziell für die Zellviabilität und für die
Zellzyklusprogression (Ahmed et al., 2002; Litchfield, 2003).
Diskussion
113
Seit der Entdeckung, 1954, als Kasein-phosphorylierende Kinase (Burnett and
Kennedy, 1954), sind mittlerweile mehr als 300 Substrate der CK2 bekannt,
wobei sich die Phosphorylierung von Kasein als ein in vitro Artefakt
herausgestellt hat. Darunter befinden sich 87 Signaltransduktionsproteine, 60
Transkritionsfaktoren, 50 Proteine, die die DNA/RNA-Funktion beeinflussen, 38
Virale Proteine, 14 Cytoskelett und Strukturproteine, 9 Proteine des
Metabolismus und 49 verschiedene andere, nicht den oben genannten Gruppen
zugehörige Proteine (Meggio and Pinna, 2003). Durch die Vielzahl der
bekannten Substrate ist das Konsensusmotiv, das für eine Phosphorylierung
durch die CK2 benötigt wird, gut charakterisiert:–1(E/D/X)-0(S/T)-+1(D/E/X)+2(E/D/X)-+3(E/D/pS/pT)-+4(E/D/X). Die Positionen an Stelle +1 und +3 üben
die wichtigsten Funktionen aus und sind durch die Dominanz von sauren
Aminosäuren geprägt. Die CK2 bevorzugt Serine den Threoninen und kann als
Phosphatdonor sowohl ATP als auch GTP verwenden. Da die Position an Stelle
+3 auch durch eine phosphorylierte Aminosäure eingenommen werden kann,
reiht sich die CK2 in die Klasse der Kinasen ein, die durch ein „Pre-Priming“ zur
Phosphorylierung stimuliert werden. Es konnten auch Stellen gefunden werden,
die nicht dem Konsensus-Motiv entsprechen, ebenso wie Tyrosine, die durch
die CK2 phosphoryliert werden (Marin et al., 1999; Meggio and Pinna, 2003).
Die CK2 besteht als tetramerer Komplex aus zwei katalytischen (αα,α`α` oder
α`α, 38-42 kDa) und zwei regulatorischen Untereinheiten (ββ, 27 kDa). Es
wurden auch verschiedene Isoformen, wie z. B. die CK2 α``, im Menschen und
verschiedene Isoformen der β-Untereinheit in Saccharomyces cerevisiae
gefunden (Glover, 1998; Litchfield et al., 2001; Shi et al., 2001). Die katalytische
Untereinheit ist für die Herstellung der Substratspezifität verantwortlich, die
durch verschiedene basische Aminosäuren um das aktive Zentrum vermittelt
wird (Guerra et al., 1999). Die α-Untereinheit der CK2 ist im Gegensatz zu
anderen Kinasen auch in Abwesenheit der regulatorischen Untereinheit immer
aktiv. Die β-Untereinheit übt mehrere Funktionen aus. Zum einen kann sie die
Aktivität der α-Untereinheit modulieren, zum anderen die Substratspezifität und
die Stabilität des Holoenzyms beeinflussen. Jedoch kann die β-Untereinheit
unabhängig von der α-Untereinheit agieren, denn sie wurde als
Interaktionspartner mit verschiedenen anderen Protein identifiziert (Guerra et
al., 1999). Die CK2 spielt in vielen zellulären Prozessen eine wichtige Rolle.
Wie oben schon erwähnt, ist sie unabdingbar für die Progression durch den
Zellzyklus (Litchfield, 2003), für die Proliferation (Guerra and Issinger, 1999),
und für die Zellviabilität. Die CK2 spielt eine Rolle im Chromatinremodeling
(Barz et al., 2003), in der DNA-Reparatur (Loizou et al., 2004), in der Apoptose
und wird in vielen Tumorarten überexprimiert (Litchfield, 2003).
Durch den Einsatz des ATP/GTP-kompetitiven CK2-spezifischen Hemmstoffes
TBB konnte die DEK-Phosphorylierung auch in vivo hauptsächlich auf die CK2
zurückgeführt werden (Abbildung 4-12, B). Sowohl in asynchron (Abbildung
Diskussion
114
4-12, B) wie auch in synchron wachsenden Zellen (Daten nicht gezeigt) konnte
allerdings nie eine 100%-ige Inhibierung der Phosphorylierung, selbst bei
Einsatz von 75 µM TBB, erreicht werden. Daher stellt sich die Frage, wodurch
die verbleibende Phosphorylierung verursacht wird. Dies kann zum einem auf
eine nicht quantitative Hemmung der CK2, zum anderen auf die Beteiligung
anderer Kinasen, wie die PKC, zurückgeführt werden. Die Beteiligung der PKC
(verschiedene Isoformen, insbesondere PKCε) an der DEK-Phosphorylierung
konnte in dieser Arbeit experimentell gezeigt werden (Abbildung 4-9 und
Abbildung 4-10). Eine Hemmung der PKC durch TBB ist nicht bekannt (Sarno
et al., 2001), allerdings wurde nur die Isoform PKCα getestet. Der Einfluss auf
die anderen Isoformen wurde nicht untersucht. Falls keine Hemmung der
verschiedenen PKC-Isoformen durch TBB hervorgerufen wird, so könnte die
Restphosphorylierung in dem in vivo Experiment durch die PKC verursacht
werden. Die Rolle der PKC bei der DEK-Phosphorylierung wurde in dieser
Arbeit jedoch nicht weiter untersucht.
Bei den in vitro Phosphorylierungen (Abbildung 4-12, A) konnte dagegen eine
quantitative Hemmung der DEK-Phosphorylierung durch TBB erreicht werden,
jedoch wurde mehr TBB in G1-Phase-Extrakt als in S-Phase-Extrakt (Abbildung
4-12, A, 5µM TBB/S-Phase vs. 20 µM TBB/G1-Phase) benötigt. Dies kann
mehrere Ursachen haben. Eine unterschiedliche Zusammensetzung des CK2Holoenzyms kann einen Einfluss auf die Wirksamkeit von TBB ausüben (L.A.
Pinna, persönliche Kommunikation). Durch einen erhöhten ATP/GTP-Gehalt
der Extrakte kann die Wirksamkeit von TBB herabgesetzt werden. TBB hemmt
zwar hochspezifisch die CK2 (IC50 0,9 µM TBB, bei 100 µM ATP), allerdings
wurde auch eine geringere Hemmung der GSK-3 festgestellt (Hemmung um 40
% bei 10 µM TBB (Sarno et al., 2001). Eine Beteiligung der GSK-3 an der DEKPhopshorylierung konnte in dieser Arbeit zwar nicht gezeigt werden, jedoch
gehört die GSK-3 zu der Klasse der Protein-Kinasen, die ein „Pre-Priming“
benötigen, d.h die Stelle an Position +3 muss phosphoryliert sein, damit die
GSK-3 in Aktion tritt. Folglich könnte auch die GSK-3, die durch die Präsenz
anderer Kinasen in den Extrakten das benötigte Pre-Priming vorfinden könnte,
einen Beitrag zur DEK-Phosphorylierung leisten. Durch die erhöhten TBBMengen könnte sukzessive eine Hemmung der GSK-3 erfolgen.
Zusammenfassend kann die CK2 durch die hier dargestellten Experimente als
hauptverantwortliche Kinase für die DEK Phosphorylierung benannt werden.
Tatsächlich weist die Aminosäuresequenz von DEK überraschend viele
potenzielle Konsensussequenzen für eine Phosphorylierung durch die CK2 auf,
wobei Serin–32 die Bedingungen des Konsensusmotivs perfekt erfüllt. Bei
Betrachtung der Phosphorylierungsstellen fällt auf, dass sich diese auf die
sauren Boxen des DEK-Proteins beschränken (Abbildung 4-13). Eine
massenspektroskopische Kartierung der in vitro phosphorylierten Stellen ergab
Diskussion
115
folgende Stellen für die CK2-Phosphorylierung: S-32, S,243, S-244, S-251, S301, S-303, S-306 und S-307. Alle kartierten Stellen befinden sich in den
sauren Boxen des DEK Proteins. Drei potenziellen CK2-Stellen (S-230, S-231
und S-232) wurden in vitro nicht eindeutig phosphoryliert vorgefunden. Dieses
Experiment zeigt auf, welche Stellen tatsächlich durch die CK2 als
Phosphoakzeptorstellen verwendet werden können. Doch kann man hier keine
Aussage darüber treffen, zu welchem Zeitpunkt im Zellzyklus welche Stelle
phosphoryliert vorgefunden wird. In vorläufigen Experimenten, durchgeführt von
Catalina Damoc und Martina Baack, wurde DEK aus HeLa-Zellen immungefällt,
tryptisch verdaut und die Phosphopeptide über IMAC (ion metal affinity
chromatographie) angereichert. Dabei wurden die in vitro gefundenen
Phosphorylierungsstellen bestätigt und zusätzlich noch weitere Phosphopeptide
gefunden, die teilweise eine starke Phosphorylierung aufweisen. Eines dieser
Fragmente beinhaltet auch die potenziellen CK2-Phosphorylierungsstellen S230, S-231 und S-232, die in vitro nicht eindeutig phosphoryliert vorgefunden
wurden. Diese Daten bestätigen zum einen, dass die in vitro gefundenen
Phosphorylierungsstellen auch in vivo als Phosphorylierungsstellen verwendet
werden und zum anderen, dass DEK als ein stark phosphoryliertes Protein in
der Zelle vorliegt, wobei das Verhältnis von phosphorylierten und
dephosphorylierten DEK-Molekülen zu einem gegebenen Zeitpunkt in der Zelle
hier nicht ermittelt wurde. Jedoch sind weitere Untersuchungen nötig, um das
Phosphorylierungsmuster des DEK-Proteins während des Zellzyklus zu
untersuchen.
5.2.1
Kann eine erhöhte Phosphorylierung von DEK alleine durch die
CK2 hervorgerufen werden?
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die DEK-Phosphorylierung in der G1Phase ein Maximum erreicht (Abbildung 4-4). Wie oben schon erwähnt, wird
DEK hauptsächlich über die CK2 phosphoryliert. Daher stellt sich die Frage, ob
eine differenzielle Phosphorylierung von DEK alleine durch die CK2 möglich ist.
Das herausragende Merkmal der CK2 ist ihre konstitutive, Stimulusunabhängige Aktivität, die alleine durch die Expression geregelt wird. Diese
konstitutive Aktivität wird durch den N-terminalen Bereich der αα`-Untereinheit
vermittelt, der eine Assoziation mit dem aktiven Zentrum eingeht und dieses für
ATP/GTP als Phosphatdonor offen hält (Sarno et al., 2002). Im Vergleich zu
verwandten Kinasen, wie die CDKs, die nur als Holoenzym aktiv sind, ist die
katalytische α-Untereinheit auch als Dimer aktiv. Die Aktivität kann allerdings
durch die Assoziation mit der β-Untereinheit gesteigert oder sogar, wie im Falle
von N-terminalen Mutationen der α-Untereinheit, wieder hergestellt werden
(Sarno et al., 2002). Bisherige Ansichten gingen von einer festen Assoziation
der regulatorischen und der katalytischen Untereinheit zu einem tetrameren
Komplex in vivo aus. Diese Meinung wurde durch verschiedene Beobachtungen
Diskussion
116
relativiert. Durch neue Techniken wie FLIP (fluorescence loss in
photobleaching) und FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), die
eine Untersuchung der Lokalisation einzelner CK2-Untereinheiten zu jedem
Zeitpunkt in einer lebenden Zelle ermöglichen, stellte sich heraus, dass die
beiden Untereinheiten zum einen hoch mobil in der Zelle sind und zum anderen
verschieden lokalisiert sein können, auch unabhängig voneinander. Einmal
neusynthetisiert werden die beiden Untereinheiten (αα, αα`, α`α`;ββ)
unabhängig voneinander in den Kern transportiert, wo sie einer hohen Mobilität
unterliegen. Durch verschiedene Bindungspartner werden die Untereinheiten an
verschiedene Zielregionen gebracht oder können sich zum Holoenzym
zusammenlagern (Filhol et al., 2003; Filhol et al., 2004). In diesem Verhalten
kann man eine mögliche Regulation der CK2 durch örtlich und zeitliche
begrenzte Assoziation der Untereinheiten mit sich selbst oder der
Untereinheiten mit anderen Proteinen vermuten. Die β-Untereinheit hat
weiterhin einen regulatorischen Einfluss auf die Aktivität der katalytischen αUntereinheit der CK2. Entgegen der allgemein gültigen Meinung zeigten einige
Autoren, dass die Aktivität der CK2 in Zellsubkompartimenten
zellzyklusabhängig erheblich schwanken kann, obwohl die Aktivität gemessen
in Ganzzellextrakt gleich bleibt. So zeigten Wang et al., dass die Aktivität der
CK2 in der Kernmatrix-Fraktion einer starken zellzyklusabhängigen
Schwankung unterliegt (Wang et al., 2003). Das Zellzyklus regulatorische
Protein p27KIP1, wird beispielsweise nur in Anwesenheit der β-Untereinheit
durch die CK2 phosphoryliert (Tapia et al., 2004). Hier wurde ein „docking“Mechanismus der β-Untereinheit an das Protein vor der Phosphorylierung
postuliert. Studien zur DEK Phosphorylierung in dem Laboratorium von
Lorenzo. A. Pinna (Universität Padua, Italien) ergaben, dass DEK durch die αUntereinheit allein und durch das Holoenzym phosphoryliert wird (Km< 1 µM).
Die Anwesenheit der β-Untereinheit steigert die Phosphorylierung jedoch um
den Faktor 100 (L.A. Pinna, persönliche Kommunikation).
Eine weiterer Regulationsmechanismus könnte durch die Beteiligung der
Protein-Phosphatase 2A (PP2A), ein direkter Gegenspieler der CK2,
eingebracht werden. Tatsächlich wurde die Beteiligung der PP2A an der DEKBindung in einem anderen Zusammenhang bei der Bindung von DEK an das
pets-Fragment postuliert (Faulkner et al., 2001).
Eine oszillierende DEK-Phosphorylierung, die alleine durch die CK2
hervorgerufen wird, kann durch die oben dargestellten Gründe nicht
ausgeschlossen werden. Durch die experimentell gezeigte Präsenz von DEK in
verschiedenen subnuklearen Kompartimenten, wie z.B in der Kernmatrix, in
Assoziation mit RNA und Chromatin, könnte durch die Zusammensetzung
dieser Komplexe eine veränderte CK2-Phosphorylierung hervorgerufen werden.
Auch eine Rolle der CK2-β-Untereinheit, wie für andere Proteine postuliert,
könnte, je nach Assoziation mit DEK, eine veränderte Phosphorylierung
Diskussion
117
hervorrufen. Um diese Spekulationen zu bestätigen, bedarf es jedoch weiterer
Experimente. Eine Beteiligung anderer Kinasen wie der PKC und GSK-3 ist
jedoch nicht auszuschliessen. Diese könnten in konzertierter Aktion mit der
CK2, vielleicht auch zu verschiedenen Zellzyklusphasen, DEK phosphorylieren
und damit einen synergistischen Einfluss auf die DEK-Funktion ausüben.
5.3
DEK – ein Protein mit mehreren Modulen
Das DEK-Protein bindet sequenzunspezifisch an proteinfreie- und nukleosomal
verpackte DNA, bevorzugt allerdings überkreuzte DNA-Strukturen wie sie in
supergecoilter und kruziformer DNA vorkommen (Alexiadis et al., 2000;
Waldmann et al., 2002; Waldmann et al., 2003). Eine weitere Eigenschaft von
DEK ist die Topologieveränderung von zirkulären DNA-Substraten (Alexiadis et
al., 2000; Waldmann et al., 2002). In dieser Arbeit wurden deshalb durch
Studien an DEK-Deletionsmutanten die Domänen für die DNA-Bindung und die
durch DEK hervorgerufene Topolgieveränderung untersucht.
5.3.1
Das SAF-Box enthaltende Fragment (87-187) des DEK-Proteins ist
für die DNA-Bindung und für die Topologieveränderung
verantwortlich.
Ein verantwortlicher Bereich für DNA-Bindung konnte auf dem SAF-Box
enthaltenden Fragment 87-187 lokalisiert werden (Abbildung 4-19). Ebenfalls
konnte dieses Fragment für die Topologieveränderung verantwortlich gemacht
werden (Abbildung 4-20). Das SAF-Box (Kipp et al., 2000) oder SAP-Box-Motiv
(nach SAF-A/B, Acinus und PIAS) (Aravind and Koonin, 2000) ist ein weit
verbreitetes DNA-Bindemotiv in chromatinassoziierten Proteinen mit
unterschiedlichen Funktionen. Es besteht aus 35 Aminosäuren, die durch ein
invariables Glycin in zwei Hälften geteilt werden. Die erste Hälfte bildet eine αHelix, der Bereich um das konservierte Glycin einen „Loop“, die zweite Hälfte
liegt wieder als α-Helix vor (Kipp et al., 2000). SAF-A ist durch die Bindung an
SAR/MAR-DNA über die SAF-Box in die Zellkernarchitektur und durch die Cterminale RGG-Box in den RNA-Metabolismus involviert (Romig et al., 1992a;
Fackelmayer et al., 1994a; Fackelmayer et al., 1994b; Goehring and
Fackelmayer, 1997). Dies ist Merkmal von vielen SAF-Box-Proteinen, die neben
der SAF-Box als SAR/MAR bindendes DNA-Bindemotiv noch weitere
funktionelle Module besitzen. Diese zusätzlichen Domänen bestimmen dann
meist die Funktion des Proteins. SAF-Box-Proteine sind in die
unterschiedlichsten Prozesse, wie DNA-Reparatur (Ku70, PARP) oder
Transkription (ThoI) involviert (Aravind and Koonin, 2000).
Die SAF-Box von DEK ist im Gegensatz zu den meisten anderen SAF-BoxProteinen in der Mitte des DEK-Moleküls lokalisiert (149-187). Hier konnte
gezeigt werden, dass der Bereich um die SAF-Box (87-187) tatsächlich für die
Diskussion
118
DNA-Bindung verantwortlich ist. Die Bindung mit dem Fragment 87-187 führt
wie die Bindung von wtDEK zu großen Nukleoprotein-Komplexen, die nicht
mehr in das Agarosegel einlaufen können (Abbildung 4-19). Durch die
Abwesenheit der DEK-Multimerisierungsdomäne (270-350) in den Fragmenten
1-250, 1-187 und 87-187 konnte die Beteiligung dieses Bereiches an der
beobachteten Komplexbildung ausgeschlossen werden. Daher muss sich auf
diesem Fragment eine weitere Multimerisierungsdomäne befinden, die in
Abwesenheit von DNA nicht detektiert werden kann. In Far-Western-Analysen
konnte nur eine C-terminale Multimerisierungsdomäne von 270-350 identifiziert
werden
(Kappes
et
al.,
2004;
Scholten,
2004).
Auch
aus
elektronenmikroskopischen Studien gibt es Hinweise, dass DEK DNA-abhängig
multimerisiert. Hier wurden lange, DEK-bedeckte Bereiche gefunden, die
jeweils von einem Punkt ausgehen (Waldmann et al., 2002) und für eine
kooperative Bindung von DEK an DNA sprechen. In NMR (nuclear magnetic
resonance) Untersuchungen von H. Matsuo (Universität Minneapolis, USA)
eines DEK-Fragments von 68-220 wurden nach DNA-Inkubation unlösliche
Komplexe gefunden. Diese waren bei einer Inkubation ohne DNA nicht zu
beobachten (H. Matsuo, persönliche Kommunikation). Auch dies ist ein Hinweis
auf die Präsenz einer DNA-abhängigen Multimerisierungsdömäne, N-terminal
der SAF-Box. Dafür spricht auch, dass die SAF-Box allein (149-187) in Lösung
nicht mehr an DNA binden kann. Erst, wenn viele SAF-Box-Moleküle durch
Immobilisierung an Sepharosebeads in räumliche Nähe gebracht werden, ist
wieder eine DNA-Bindung zu beobachten (F. Knoche, persönliche
Kommunikation).
Ein solcher Bindungsmechanismus könnte auch die Veränderung der DNATopologie erklären. Durch das gleichzeitige Binden von mehreren DEKMolekülen kann sich der Twist der DNA verändern. Dadurch entsteht eine hohe
Torsionsspannung im DNA-Molekül, was dann durch die Einführung von
Supercoils ausgeglichen werden kann. Tatsächlich kann das Fragment 87-187
die DNA-Topologie noch verändern (Abbildung 4-20), während 149-187, die
SAF-Box allein, dies nicht mehr kann (F. Knoche, persönliche Kommunikation).
Interessant ist zudem, dass dieser Mechanismus auch für SAF-A postuliert
wurde. Auch die SAF-Box von SAF-A bindet in EMSAs nicht mehr an DNA,
während, wie bei DEK, eine Immobilisierung der SAF-Box-Fragmente ausreicht,
um die DNA-Bindung wieder herzustellen. Für SAF-A wurde eine sogenannte
„Massenbindung“ postuliert (Zuckerkandl and Villet, 1988). Bei einer Bindung
von wtSAF-A an DNA kommt es immer zu einer Multimerisierung, die durch
eine kooperative Bindung verursacht wird (Romig et al., 1992b; Fackelmayer et
al., 1994b; Fackelmayer and Richter, 1994; Kipp et al., 2000).
Darüberhinaus ist von SAF-A bekannt, dass es spezifisch an die kleine Rinne
von AT-reicher SAR/MAR-DNA bindet. Für DEK wurde bisher keine bevorzugte
Diskussion
119
Bindung an SAR/MAR-DNA gezeigt (Tanja Waldmann, persönliche
Kommunikation), jedoch befindet sich eine Subfraktion von DEK in der
Kernmatrix (Kappes, 2000). Im Gegensatz dazu binden H1 oder HMGA zwar
spezifisch an SAR/MAR-DNA (siehe Kapitel 1.1 und 1.3.2.2), besitzen jedoch
keine SAF-Box.
Oben beschriebene DNA-Bindeeigenschaften und die Tatsache, dass DEK
struktur- und nicht sequenzspezifisch an DNA bindet, legen den Verdacht nahe,
dass es sich bei DEK um ein Protein handelt, das in die Zellkernarchitektur
involviert sein könnte, wie auch für SAF-A beschrieben. Tatsächlich vermittelt
das SAF-Box-Fragment von DEK (87-187) die Bindung an kruziform DNA
(Tanja Waldmann, persönliche Kommunikation).
Durch die Bindung an kruziform-DNA, die Supercoiling und DNA-Looping
Aktivität von DEK und den hier beschriebenen Eigenschaften, lassen sich
einige Parallelen zu den HMG-Proteinen aufzeigen. DEK besitzt zwar keines
der typischen DNA-Bindemotive, wie HMG-Box, AT-Hook oder NBD, und ist
deshalb nicht den klassischen HMG-Proteinen (HMGB, HMGA, HMGN; Kapitel
1.3.2) zuzuordnen. Jedoch könnten die Funktionsweisen dieser Proteine bei der
weiteren Untersuchung von DEK hilfreich sein. In Tabelle 5-1 sind einige
Funktionen der HMG-Proteine und DEK zusammengefasst.
Tabelle 5-1 Vergleich von DEK mit den HMG-Proteinen
Alle Informationen wurden aus Übersichtsartikeln entnommen (HMGN: (Bustin and Reeves, 1996), HMGA:
(Reeves and Nissen, 1990; Hill and Reeves, 1997; Reeves, 2001; Reeves and Beckerbauer, 2001),
HMGB: (Bustin and Reeves, 1996). Die Tabelle erhebt nicht den Anspruch der Vollständigkeit.
Diskussion
120
Aspekt
HMGN
HMGA
HMGB
DEK
Molekulargewicht (kDa)
10,6-19.7
10-15
24-25
43
Aminosäuren
89-113
96-197
209-215
375
Kopien/Zelle
10
5
10
4
10
6
4-6x10
6
DNA-Bindung
DNA-Bindemotiv
Bindung an kruziform-DNA
Bindung
an
HMG-Box (A, AT-Hook
Nukleosomen-
SAF-Box
B)
Bindemotiv
zweite
(NBD)
Bindedomäne
+
+
+
+
supergecoilte +
+
+
+
+-
+-
+
+(neg)
+(neg)
+(pos)
+
+
+?
DNA
Bindung an B-Form DNA
+-
Einführung von Supercoils +(neg)
durch Bindung
Bindung an nukleosomale ++
DNA
Bindung an gebogene DNA
+
+
+
n.u.
DNA-Bending
+
+
+
- (+)
DNA-Looping
+
+
+
+
Sequenzspezifität
- (+)
- (+)
- (+)
-
Interaktion mit Histonen
+
?
?
-+ ?
durch ++
++
++
++
der +
+
+
+-
bei +
+
+
(+)
++
++
++
-(+)
-(+)
-(+)
++
++
++
Regulation
Phosphorylierung
Assoziation
mit
Kernmatrix
Funktion
Transkriptionskontrolle
Mobilität im Zellkern
Expression
in
++
ruhenden -(+)
Zellen
Erhöhte
Expression
kanzerogenen Zellen
in ++
+
DNA-
Diskussion
121
DEK teilt viele Eigenschaften, soweit bisher bekannt, mit den HMGA und
HMGB-Proteinen, wovon die wichtigsten die Bindung an kruziform-DNA, die
Supercoilingaktivität
und
das
veränderte
Expressionsverhalten
in
transformierten Zellen sind.
HMGN interagiert mit den „Core“-Histonen, stabilisiert das Nukleosom und ist
das einzige Protein, das spezifisch die Struktur der nukleosomalen DNA
erkennt (Bustin and Reeves, 1996b). Eine Interaktion von DEK mit den „Core“Histonen ist noch nicht eindeutig gezeigt. Daher ist eine funktionelle Ähnlichkeit
zu den HMGNs nicht gegeben.
Für DEK konnte bisher keine DNA-Bending-Aktivität nachgewiesen werden
(Waldmann et al., 2003), jedoch wurde in den bisherigen Experimenten ein 123
bp DNA-Fragment verwendet. Wenn DEK nur eine schwache Bending-Aktivität
aufweist, könnte dies auf diesem kurzen Fragment nicht beobachtet werden. Es
sind weitere Experimente nötig, um diesen Punkt zu klären. Jedoch kann die
DEK-Bindung ein „Looping“ induzieren (Waldmann et al., 2002) und so
verschiedene DNA-Stränge oder Bereiche zusammenführen.
Durch die Beobachtung, dass DEK eine Rolle in der Transkription spielt, und
durch die vielen Ähnlichkeiten zu den HMGA und HMGB –Proteinen, könnte
deren Funktion für die weitere Untersuchung des DEK-Proteins ein gutes
Modell bilden.
In der Arbeit von Campillos et al. (2003) bestehen erste Hinweise darauf, dass
DEK wie ein „Transkriptions-Architekturprotein“ agieren könnte. Die Autoren
zeigten in Ko-Transfektionsassys eine gesteigerte Aktivität des AP-2αabhängigen APOE-Promotors in HepG2-Zellen bei gleichzeitiger Anwesenheit
von DEK. In EMSAs konnte zwar eine gesteigerte Bindung von AP-2α in der
Anwesenheit von DEK an die DNA gezeigt werden, jedoch wurde kein ternärer
Komplex von DEK und AP-2α gefunden. Die Autoren postulieren eine
transiente Bindung von DEK an AP-2α, was zu einer Stimulation der DNABindung von AP-2α führt, ohne jedoch direkt an der DNA-Bindung beteiligt zu
sein. In mehreren Arbeiten konnte aber überzeugend gezeigt werden, dass
DEK allein an DNA bindet. Daher könnte die von Campillos et al. beobachtete
DEK-Aktivität eher auf eine Veränderung der DNA-Struktur zurückzuführen
sein. Dies wiederum könnte die Bindung von AP-2α selbst stimulieren oder erst
ermöglichen. Genau solch ein Mechnismus wird für die HMGB-Proteine
postuliert. Sie sind hoch mobil im Zellkern, und es wird vermutet, dass sie
transient die DNA-Struktur verändern, um dann Transkriptionsfaktoren die
Bindung an ihre DNA-Sequenzen zu ermöglichen oder zu erleichtern (Agresti
and Bianchi, 2003).
HMGA-Proteine gehören zu den am stärksten phosphorylierten Proteinen in der
menschlichen Zelle, wobei die Phosphorylierung von der Zellzyklusphase und
von verschiedenen Stimuli abhängt. Hier beeinflussen kombinatorische
Diskussion
122
Phosphorylierungen die Art und die Bindungsstärke an DNA. Die
Phosphorylierungsstellen befinden sich unmittelbar vor den AT-Hooks und im
C-terminalen Bereich. HMGAs werden hauptsächlich durch cdc2, CK2, und
PKC phopshoryliert. HMGAs unterliegen einer hohen Expression in
proliferierenden Zellen, haben ihr Expressionsmaximun in Zellen der
Embryonalentwicklung und sind in ausdifferenziertem Gewebe oder in
proliferationsinaktiven Zellen kaum zu detektieren (Lundberg et al., 1989). Die
Überexpression von HMGAs wurde in verschiedensten Tumorarten berichtet
und korreliert mit dem Stadium des Tumors, so dass die Stärke der HMGAExpression als Marker für das Stadium der Transformation und der
beginnenden Metastasierung verwendet wird. Die erhöhte Expression von
HMGAs in transformierten Zellen beeinflusst die Expression weiterer Gene und
trägt somit zu einer weiteren Tumorprogression bei. Dadurch werden die HMGA
Proteine auch als Onkogene eingestuft. Jedoch führt eine Überexpression von
HMGA-Genen nicht zwingend zu einer Transformation, anders als bei
klassischen Onkogenen. Bei HMGA lässt sich die erhöhte Expression durch die
Promotorstruktur und die daran bindenden Aktivatoren erklären. Hier wurden 4
Promotorelemente gefunden, die ja nach Zelltyp und Stimulus, unabhängig
voneinander die Transkription beeinflussen können (Übersicht in (Bustin and
Reeves, 1996; Reeves, 2001; Reeves and Beckerbauer, 2001).
Ein weiterer interessanter Aspekt ist, dass die HMG-Proteine das Histon H1 an
der Ein- und Austrittsstelle der DNA am Nukleosom kompetitiv ersetzen können
(Catez et al., 2004). Dies führt zu einer generellen Auflockerung des
Chromatins, was wiederum eine Erleichterung der Transkription und Replikation
darstellt. Für DEK gibt es Hinweise, wenn auch noch sehr spekulativ, dass es
auch an diese Stelle binden könnte, z.B. durch die bevorzugte Bindung an
kruziform DNA. Denn auch an der Ein- und Austrittsstelle der nukleosomalen
DNA kommt es zu Überkreuzungen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass
DEK zu einem Schutz von 50 bp an nukleosomaler DNA führt, was eine
potenzielle Bindung an der Ein- und Austrittsstelle der nukleosomalen DNA
impliziert. Daher könnte die Kompetition mit H1 ein weiterer Mechanismus sein,
wie DEK seine Funktion in der Zelle ausübt.
5.3.2
Der Bereich 270-350 stellt eine zweite DNA-Bindedomäne von DEK
dar
Während der Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften der
verschiedenen DEK-Fragmente konnte eine weitere zweite DNA-Bindedomäne,
die sich zwischen 270-350 erstreckt, gefunden werden (Abbildung 4-21). Ein
neuer funktioneller Bereich des DEK-Proteins konnte dadurch identifiziert
werden. Die DNA-Bindung, die durch diesen Bereich vermittelt wird, generiert
keine großen Nukleoproteinkomlexe, sondern eine Bindung die keine
Multimerisierung vermuten lässt. Selbst bei höheren Mengen an Protein führt
Diskussion
123
eine Bindung mit der zweiten DNA-Bindedomäne zu keinen großen Komplexen.
Diese zweite DNA-Bindedomäne ist nicht an Einführung von Supercoils und der
Stimulation von intermolekularen Wechselwirkungen beteiligt (Kappes et al.,
2004). DEK besitzt demnach zwei funktionell unterschiedliche DNABindedomänen.
Interessant ist, dass der Bereich der zweiten DNA-Bindedomäne mit der zuvor
identifizierten Multimerisierungsdomäne überlappt (Kappes et al., 2004;
Scholten, 2004). Daher scheint es sich hier um einen bifunktionellen Bereich
von DEK zu handeln. Weiterhin befinden sich hier die meisten identifizierten
Phosphorylierungsstellen. Wird dieser Bereich auf Sekundärstrukturmerkmale
hin untersucht, so kann mit Hilfe des Programmes „Coils“ (www.expasy.ch) eine
potenzielle „Coiled-coil“-Domäne (322-350) identifiziert werden.
In Abbildung 5-1 sind die identifizierten Domänen von DEK zusammengefasst.
Abbildung 5-1 Funktionelle Domänen des DEK-Proteins
Darstellung der in dieser Arbeit identifizierten Domänen des DEK-Proteins. Die SAF/SAP-Box ist in grün,
die sauren Boxen in rot und die NLS in schwarz dargestellt. Phosphorylierung ist durch P gekennzeichnet.
Die Funktion des jeweiligen Bereiches ist rechts angegeben.
5.4
Phosphorylierung durch die Protein Kinase CK2 –
Regulation der DEK-Funktion ?
In dieser Arbeit konnte anschaulich gezeigt werden, dass die CK2Phosphorylierung zu einer Multimerisierung von DEK führt (Abbildung 4-22 und
Abbildung 4-23). Die Multimerisierungsdomäne von DEK wurde auf den Bereich
von Aminosäure 270-350 kartiert (Kappes et al., 2004; Scholten, 2004), wobei
es sich um eine Multimerisierung und nicht um eine Dimerisierung handelt,
denn es konnten keine Zwischenstufen gefunden werden (Abbildung 4-22, C).
Eine entscheidene Rolle der CK2 bei der DEK-Multimerisierung konnte etabliert
Diskussion
124
werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die CK2-Phosphorylierung die
DEK-DNA-Bindung inhibiert (Abbildung 4-24). Die CK2-Phosphorylierung greift
daher regulierend in funktionelle Aspekte von DEK ein und unterscheidet
zwischen DNA-Bindung und Multimerisierung.
Die meisten CK2-Phosphorylierungsstellen wurden im C-terminalen Bereich
von DEK identifiziert, wo sich diese bifunktionelle Domäne befindet. Tatsächlich
stellte sich heraus, dass die zweite DNA-Bindedomäne im phosphorylierten
Zustand keine DNA-Bindung mehr aufweist (Abbildung 4-26). Das Fragment 1187 degegen zeigte unveränderte DNA-Bindung, trotz einer Phosphorylierung
an Serin-32. Das Gesamtmolekül jedoch weist durch eine CK2Phosphorylierung eine veränderte DNA-Bindung auf (Abbildung 4-26), denn es
kommt zu keinen großen Nukleoproteinkomplexen mehr. Daher scheint sich der
Einfluss der Phosphorylierung im C-terminalen Bereich auf das ganze Molekül
auszuwirken und auch die DNA-Bindung durch die SAF-Box zu schwächen.
Diese Rest-DNA-Bindung konnte auch durch South-Western und
Filterbindungsexperimente mit phosphoryliertem DEK gefunden werden
(Abbildung 4-24). Hier konnte zwar bei 50 mM NaCl keine veränderte Bindung
zwischen de- und phosphoryliertem DEK beobachtet werden. Bei 100 mM NaCl
jedoch wurde die Bindung stark inhibiert. Weiterhin könnte die Stärke der DNABindung auch abhängig sein von der Zahl der phosphorylierten Serine in und
vor der zweiten DNA-Bindedomäne. Die Phosphorylierung könnte hier, je nach
Ausmaß, einen unterschiedlich starken inhibitorischen Effekt auf das
Gesamtmolekül ausüben, impliziert durch die zweite DNA-Bindedomäne.
Welcher Mechanismus könnte dieser Beobachtung zugrunde liegen?
Es gibt Hinweise, dass ein Motiv, ähnlich dem CK2-Konsensusmotiv, die
Ausbildung von Sekundärstrukturen in nativ ungefalteten Proteinen hemmt
(Zetina, 2001). Die CK2-Phosphorylierung an diesen Motiven könnte die
ungefaltete Konformation einer α-Helix aufrechterhalten. In einer weiteren
Studie konnte gezeigt werden, dass die CK2-Phosphorylierug in einer α-Helix
die Konformation zerstörte (Steinmetz et al., 2001). Weitere Beobachtungen
von verschiedenen Autoren zeigten auf, dass eine generelle Veränderung der
Sekundärstruktur und der Thermostabilität durch eine CK2-Phosphorylierung
erreicht wird. Dadurch wurde die Sekundärstruktur des p27KIP1-Proteins, welche
in einem unphosphorylierten Zustand α-Helices aufweist, zerstört (Tapia et al.,
2004). Auch in dem HMG-Motiv-Protein SSRP1 aus Zea Maize wurde durch
eine CK2-Phosphorylierung an zwei Serinen in der C-terminalen HMG-Box,
eine veränderte Faltung der α-helikalen Struktur der HMG-Box gefunden (Krohn
et al., 2003). Die Thermostabilität wurde durch CK2-Phosphorylierungen in
HMGB-Proteinen erhöht, was ebenfalls eine Strukturveränderung impliziert
(Wisniewski et al., 1999; Stemmer et al., 2002). Der C-terminale Bereich von
DEK weist ebenfalls Strukturähnlichkeiten zu einer „Coiled-coil“-Domäne auf.
Diskussion
125
Diese potenzielle Domäne erstreckt sich über den Bereich 322-350 und liegt
damit in der zweiten DNA-Bindedomäne oder Multimerisierungsdomäne. Die
Phosphorylierung hatte in den oben genannten Studien nicht nur eine
Konsequenz für die Proteinstabilität und die Sekundärstruktur, sondern es
wurden auch veränderte DNA-Bindungseigenschaften beobachetet. Im Falle
der HMGB-Phosphorylierung wurde eine reduzierte Affinität für lineare DNA,
aber nicht für supergecoilte DNA gefunden (Stemmer et al., 2002). In
Drosophila HMGB-Proteinen wurde durch eine CK2-Phosphorylierung im Cterminalen Bereich die Affinität für lineare und kruziforme DNA gewährleistet.
Eine Dephosphorylierung erhöhte die Affinität für die kruziform-DNA
(Wisniewski et al., 1999). Eine Phosphorylierung des C-terminalen Bereich des
SSRP1 Proteins ermöglichte eine spezifische Erkennung von UV-geschädigter
DNA (Krohn et al., 2003).
Durch die beiden DNA-Bindedomänen des DEK-Proteins, sind zwei Module
vorhanden, die unterschiedlich an DNA binden und unterschiedlich reguliert
werden können. Auch die HMGBs und HMGAs binden mit einer verschiedenen
Anzahl an DNA-Bindemotiven an DNA, wobei die DNA-Bindung durch den
sauren C-terminalen Bereich stark beinflusst wird. Der C-terminale Bereich von
DEK hat ebenfalls, je nach posttranslationaler Modifikation, einen Einfluss auf
die DNA-Bindung.
Durch die in dieser Arbeit gezeigte Präsenz zweier voneinander unabhängiger
DNA-Bindedomänen könnte eine Regulation der DNA-Bindungsstärke und der
Affinität für bestimmte DNA-Formen durch die Phosphorylierung in der zweiten
DNA-Bindedomäne erfolgen.
5.4.1
Einfluss der CK2-Phopshorylierung auf die DEK-ChromatinBindung
Dephosphoryliertes
His-DEK
bindet
an
salzgewaschene
SV40Minichromosomen und führt zu einer Topologieveränderung (Abbildung 4-28).
Wurde allerdings dieses chromatingebundene DEK durch die CK2 in situ
phosphoryliert, wurden die vorher gebundenen DEK-Moleküle abgelöst
(Abbildung 4-28). Wie auch schon für die Bindung von phosphoryliertem DEK
an proteinfreie DNA gefunden, kommt es auch im Chromatin-Kontext zu einer
Inhibierung der Bindung von DEK durch Phosphorylierung. Dies steht zunächst
im Gegensatz zu den in vivo Daten. Denn hier ist selbst bei einer erhöhten
Phosphorylierung von DEK in der G1-Phase keine veränderte Lokalisation oder
geschwächte Chromatinbindung von DEK zu beobachten (Abbildung 4-30).
Welche Rolle könnten hierbei die Interaktionspartner H2A und H2B spielen
(Alexiadis et al., 2000)? In Alexiadis et al. wurde die DEK-abhängige
Topologieveränderung nur für Chromatin und nur in der Anwesenheit von H2A
Diskussion
126
und H2B gefunden. Die Veränderung war nicht abhängig von den N-terminalen
Armen der Histone, wie in Topologie-Assays mit vernetzten Histonaktameren
gezeigt. In weiteren Arbeiten von Waldmann et al. (2002) konnte gezeigt
werden, dass DEK auch die Topologie von proteinfreier DNA verändern kann.
Die Notwendigkeit von H2A und H2B ist hier also nicht gegeben. In FarWestern-Studien mit rekombinant exprimierten Histonen, konnte keine
Interaktion von DEK mit Histonen nachgewiesen werden (Scholten, 2004).
Bisher gibt es folglich keine eindeutigen Hinweise darauf, dass die Interaktion
von DEK mit den Histonen essenziell für eine Bindung ist. Jedoch findet man
eine Assoziation von DEK mit Mononukleosomen, die durch MikrokokkenNuklease Verdau aus Zellkernen gewonnen wurden (Kappes et al., 2001). Wie
In Kapitel 5.3.1 schon diskutiert, könnte die Ein- und Austrittsstelle der DNA im
Nukleosom eine mögliche Bindestelle für DEK sein. Dadurch ist es möglich,
dass DEK, unabhängig von einer Interaktion mit den Histonen selbst (globuläre
Domäne, N-terminale Arme), an nukleosomale DNA bindet.
Die Histone können auch in vivo nicht für die Bindung von phosphoryliertem
DEK an das Chromatin verantwortlich sein. Denn sowohl der DEK-typische
Schutz von zusätzlichen 50 bp bei Mikrokokkus-Nuklease-Verdaus (Abbildung
4-27), wie auch das oben beschriebene Experiment sprechen dagegen.
Allerdings darf nicht ausser Acht gelassen werden, dass posttranslationale
Modifikationen der N-terminalen Histonarme eine DEK-Bindung im
phosphorylierten Zustand ermöglichen könnten. Der posttranslationale Zustand
der Histone übt bei der Bindung der HMG-Proteine und Histon H1 (und auch
anderen Kernproteine) eine weiteren Einfluss auf die DNA-Bindung aus. Auch
andere posttranslationale Modifikationen von DEK selbst könnten eine Rolle
spielen. So kann DEK beispielsweise auch acetyliert werden (D. Markovitz,
persönliche Kommunikation) Ähnliches wurde auch für HMGA-Proteine
beschrieben, die acetyliert und phosphoryliert werden (Reeves, 2001; Reeves
and Beckerbauer, 2001). Für HMGA1 konnte sowohl ein Einfluss der
Acetylierung der „Core“-Histone als auch eine Auswirkung der Acetylierung und
der Phosphorylierung von HMGA1 selbst auf die Mobilität und auf die
Bindungsstärke gezeigt werden (Harrer et al., 2004).
Eventuelle posttranslationale Modifikationen der „core“-Histone kommen in
salzgewaschenen SV40 Minichromosomen nicht definiert vor. Jedoch sind
diese Modifikationen in nativen oligonukleosomalen Chromatinfragmenten
vorhanden.
Diskussion
5.4.2
127
DEK bleibt in vivo auch im phosphorylierten Zustand mit
Chromatin assoziiert.
Von nativem DEK war bekannt, dass es mit Mono-bis Oligonukleosomen
assoziiert ist (Kappes et al., 2001). Hier konnte gezeigt werden, dass sowohl
phosphoryliertes wie auch dephosphoryliertes His-DEK an diese
Oligonukleosomen binden kann (Abbildung 4-31). Eine Dephosphorylierung
während der Inkubation konnte durch deutliche Signale in der Autoradiographie
ausgeschlosssen werden. Phosphoryliertes DEK muss in Folge dessen eine
Interaktion mit anderen Proteinen eingehen, um mit Chromatin assoziiert zu
bleiben. Dabei könnte es sich um verschieden modifizierte Histone oder um
noch nicht identifizierte Interaktionspartner von DEK handeln.
Dadurch, dass die CK2-Phosphorylierung die Multimerisierung von DEK
stimuliert, allerdings zu einem gegebenen Zeitpunkt in der Zelle, immer nur ein
Teil der DEK Population phosphoryliert ist, lag die Vermutung nahe, dass die
phosphorylierte DEK-Form über eine Multimerisierung mit einem
unphosphoryliertem DEK-Molekül am Chromatin zurückgehalten wird.
Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass phosphoryliertes DEK über
chromatingebundenes dephosporyliertes DEK am Chromatin zurückgehalten
wird und als „Anker“ für sich selbst dient (Abbildung 4-31, B). Diese
Beobachtung schließt die Existenz von anderen „Mediator“ Proteinen natürlich
nicht aus. In Yeast-Two-Hybrid-Untersuchungen konnten jedoch nur Cterminale Fragmente als Interaktionpartner für DEK identifiziert werden
(Scholten, 2004). Da der Einfluss der Phosphorylierung in diesem Assay nicht
bekannt ist, könnte der Befund hier eine gewisse Erklärung dafür liefern.
5.4.3
Regulation der DNA-Bindung und Multimerisierung von DEK durch
die CK2- ein Modell
Die bisherigen Beobachtungen erlauben die Aufstellung eines Modells, wie die
Phosphorylierung die DEK-Aktivität regeln könnte (Abbildung 5-2).
Diskussion
128
Abbildung 5-2 Modell einer möglichen Regulation der DEK-Funktion durch CK2Phosphorylierung
Darstellung einer möglichen Regulation der DNA-Bindeeigenschaften von DEK durch Phosphorylierung.
Die SAF/SAP-Box-Domäne ist in grün (SAP), die zweite DNA-Bindedomäne in hellgrün (2.nd) und
Phosphorylierung in roten Punkten dargestellt. Die graphische Darstellung der DEK-Moleküle ist frei
gewählt.
DEK bindet im unmodifizierten Zustand durch beide DNA-Bindedomänen
(SAP/SAF-Box, 2.nd: zweite DNA-Bindedomäne) an verschiedene Bereiche
eines DNA-Moleküls (Abbildung 5-2, A) oder an verschiedene DNA-Moleküle
(Abbildung 5-2, B). Durch die Bindung kann eine DNA-Strukturveränderung
erfolgen, die sich durch DNA-Looping (A) und Stimulation von DNA-DNAKontakten auswirken kann (B). Kommt es nun zu einer Phosphorylierung im
Diskussion
129
Bereich der zweiten DNA-Bindedomäne (Abbildung 5-2 A, B, rote Punkte), so
wird diese von der DNA abgelöst. Einhergehend damit wird die DNA-Bindung
des ganzen DEK-Moleküls verändert. So könnte es zu einer Freisetzung von
DEK-induziertem DNA-Looping (A) und von gebundenen DNA-Strängen (B)
kommen.
Hier konnte weiterhin gezeigt werden, dass phosphoryliertes DEK durch ein
unphosphoryliertes, noch gebundenes DEK-Molekül an Chromatin
zurückgehalten werden kann (Abbildung 5-2, C).
DEK wurde sowohl in Eu- als auch in Heterochromatin, doch fünffach
angereichert in Euchromatin gefunden (Kappes et al., 2001). Freies DEK wurde
zu keinem Zeitpunkt im Zellkern detektiert, obwohl es in der G1-Phase des
Zellzyklus zu einer stärkeren Phosphorylierung kommt. Man könnte sich nun
vorstellen, dass DEK im unphosphorylierten Zustand über weite
Chromatinbereiche bindet und durch eine Phosphorylierung vom Chromatin
gelöst wird, dann allerdings über flankierende unmodifizierte DEK-Moleküle
gebunden bleibt. Das Chromatin könnte dadurch zugänglicher für Regulatoren,
wie z.B Transkriptionsfaktoren werden. Nun könnte DEK dephosphoryliert
werden, um die zuvor freigegebenen DNA-Sequenzen wieder zu verschliessen.
Diese Komplexe, bestehend aus de- und phosphoryliertem DEK, könnten auch
zu einer schnellen Rekrutierung von DEK an andere Bereiche des Chromatins
dienen und für die Ausbildung der beobachteten DEK-Microdomänen
verantwortlich sein (Scholten, 2004).
Zusammenfassend konnte diese Arbeit einen weiteren Beitrag zum
funktionellen Verständnis des DEK-Proteins beitragen. Durch die Identifizierung
der Regulation der DEK-Aktivitäten über Phosphorylierung erschliesst sich ein
ganz neuer Aspekt, der eine wichtige Grundlage für weitere Untersuchungen
bildet.
6
Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden drei experimentelle Ansätze gewählt, um
neue Einblicke in die Biochemie des DEK-Proteins zu erhalten.
•Untersuchungen der DEK-Expression ergaben gleichmäßige mRNA-Mengen
und eine einhergehende, gleichbleibende Neusynthese im HeLa-Zellzyklus.
Dies bestätigt frühere Arbeiten, die eine gleichbleibende DEK-Menge während
des ganzen Zellzyklus gezeigt haben. DEK wurde weiterhin als stabiles Protein
identifiziert, das eine durchschnittliche Aufenthaltsdauer von 20 Stunden in der
Zelle aufweist.
•In EMSA-Studien mit DEK-Deletionsmutanten konnte zum einen gezeigt
werden, dass ein Fragment, das die SAF-Box enthält (87-187), für die DNABindung und Topologieveränderung verantwortlich ist. Zum anderen wurde eine
neue, zweite DNA-Bindedomäne identifiziert, die im C-terminalen Bereich (270350) des DEK-Proteins lokalisiert ist. Die beiden DNA-Bindedomänen
unterscheiden sich in der Art der DNA-Bindung maßgeblich voneinander.
Dieser Bereich konnte ebenfalls als DEK-Multimerisierungsdomäne identifiziert
werden und hat folglich eine duale Funktion.
•Studien der DEK-Phosphorylierung zeigten, dass DEK während des ganzen
Zellzyklus phosphoryliert wird, wobei das Maximum in der G1-Phase zu finden
ist. Als hauptverantwortliche Kinase konnte die Protein-Kinase CK2 in vitro und
in vivo identifiziert werden. Eine Kartierung der CK2-Phosphorylierungsstellen in
der
DEK-Aminosäuresequenz,
ergab,
dass
sich
die
meisten
Phosphorylierungsstellen im C-terminalen Bereich des Proteins befinden. Dies
wurde durch massenspektrometrische Untersuchungen von rekombinantem
His-DEK in vitro gefunden. Die Relevanz dieses Befundes wurde durch die
Identifizierung von Phosphopeptiden in vivo, die mit den CK2 Stellen
überlappen, erweitert.
Die CK2-Phosphorylierung ist maßgeblich an der Regulation der DEKAktivitäten beteiligt. So unterscheidet sie zwischen DNA-Bindung und DEKMultimerisierung. Dies wurde besonders anschaulich im Falle des
bifunktionellen Bereiches 270-350 gezeigt. Ein allgemein inhibitorischer Effekt
auf die DEK-DNA-Bindung des wt-Proteins konnte durch die Phosphorylierung
beobachtet werden. Ein Modell der Regulation der DEK-Funktion durch die
Phosphorylierung konnte aufgestellt werden.
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Abkürzungen
8
139
Abkürzungen
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Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
A
aa
Bp
°C
Ci
CK2
cpm
Da
DMEM
DNA
DTT
EMSA
FACS
FCS
FLIP
FRAP
g
GSK-3
GST
h
Hepes
His
HMG
ICD
IgG
IMAC
L
LB
m
M
MALDI
MAR
mRNA
NBD
NP 40
PAGE
PBS
PKC
RNA
RT
A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
Alanin
Arginin
Asparagin
Asparaginsäure
Cystein
Glutamin
Glutaminsäure
Glycin
Histidin
Isoleucin
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
Leucin
Lysin
Methionin
Phenyalanin
Prolin
Serin
Threonin
Tryptophan
Tyrosin
Valin
Ampere
Aminosäure
Basenpaare
Grad Celsius
Curie
Casein Kinase 2
counts per minute
Dalton
Dulbecco`s modified Eagle Medium
Desoxyribonukleinsäure
Dithiothreitol
Electrophoretic Mobility Shift Assay
fluorescence activated cell sorting
Fötales Kälberserum
fluorescence loss in photobleaching
fluorescence recovery after photobleaching
Gramm / Erdbeschleunigung
Glykogen Synthase Kinase 3
Gluthation-S-Transferase
Stunde
N-2-Hxdroxyethylpiperazin-N`-2-Etansulfonsäure
Histidin
High Mobilty Group
inter chromosome domain
Immunglobulin
ion metal affinity chromatographie
Liter
Luria Broth Bakterienmedium
Meter
Molar
Matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation
matrix-associated region
messenger Ribonekleinsäure
Nukleosomen-Bindedomäne
Nonidet P40
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
phosphatgepufferte Salzlösung
Protein Kinase C
Ribonukleinsäure
Raumtemperatur
Abkürzungen
140
SAF-A
SAR
SDS
SV40
TBB
U
UV
V
Wt
scaffold attachment factor A
scaffold-associated region
Natriumdodecylsulfat
Simian Virus 40
4,5,6,7 – tetra -bromobenzatriazole
units
Ultraviolett
Volt
Wildtyp
Griechische und lateinische Vorsatzzeichen:
kilo
milli
micro
nano
pico
k
m
µ
n
p
103
10-3
10-6
10-9
10-12