Die Rolle von MicroRNAs im Prostatakarzinom

Die Rolle von MicroRNAs im Prostatakarzinom
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat
vorgelegt von
Elke Andrea Nolte
aus München
2012
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.
Tag der mündlichen Prüfung:
16.10.2012
Vorsitzender der Prüfungskommission:
Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Lars Nitschke
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Helge Taubert
GEGEN ZIELSETZUNGEN IST NICHTS EINZUWENDEN,
”
SOFERN MAN SICH DADURCH NICHT VON INTERESSANTEN UMWEGEN
ABHALTEN LÄSST.“
Mark Twain
Meiner Familie.
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1 Summary
1
2 Zusammenfassung
3
3 Einleitung
5
3.1
Die Prostata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
3.2
Das Prostatakarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
3.2.1
Epidemiologie des Prostatakarzinoms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
3.2.2
Risikofaktoren für die Entstehung eines Prostatakarzinoms . . . . . . . . .
6
3.2.3
Klassifikation des Prostatakarzinoms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
3.2.3.1
Gleason Score . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
3.2.3.2
TNM-Klassifikation des Prostatakarzinoms . . . . . . . . . . . .
8
3.2.4
Genetik des Prostatakarzinoms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
3.2.5
Biomarker zur Diagnostik des Prostatakarzinom . . . . . . . . . . . . . . .
10
microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
3.3.1
Prozessierung und Funktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
3.3.2
miRNAs und Krebs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
3.3
4 Hypthesen und Arbeitsprogramm
17
5 Ergebnisse
19
5.1
Vergleich der miRNA Expressionsprofile in Prostatatumorgeweben und korrespondierendem Normalgewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1
Erstellung eines miRNA Expressionsprofils im Prostatakarzinom und Prostatanormalgewebe mittels Deep Sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.2
5.2
19
19
Validierung der relativen Expression von miRNAs, welche im Deep Sequencing als dereguliert gefunden wurden, in den Prostatazelllinien . . . . . . .
20
5.1.3
Analyse der Referenzgenstabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
5.1.4
miRNA Expression in Prostataprimärgeweben . . . . . . . . . . . . . . . .
23
5.1.5
miRNA microArray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
Datenbankanalyse zur Auswahl potentieller Ziel-mRNAs . . . . . . . . . . . . . . .
31
5.2.1
mRNA Expression von miRNA Zielgenen in den Prostatazelllinien . . . . .
33
5.2.2
mRNA Expression von miRNA Zielgenen in Prostataprimärgeweben . . . .
34
5.2.3
Proteinexpression von Sec23A in den Prostataprimärgeweben . . . . . . . .
36
II
Inhaltsverzeichnis
5.3
Funktionelle Analyse des miRNA-Knockdown von miR-200c und miR-375 in DU145
und LNCaP Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3.1
5.4
38
Analyse von Proliferation, Viabilität, Apoptose und Zytotoxizität nach
miRNA-Knockdown . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
5.3.2
Wundheilungsassay nach miRNA-Knockdown . . . . . . . . . . . . . . . .
40
5.3.3
Invasions- und Migrationsverhalten nach miRNA Knockdown . . . . . . . .
40
Funktionelle Analyse der ektopen Expression bzw. des Knockdowns von Sec23A in
DU145 und LNCaP Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.4.1
43
Analyse von Proliferation, Viabilität, Apoptose und Zytotoxizität nach ektoper Expression bzw. Knockdown von Sec23A . . . . . . . . . . . . . . .
43
5.4.2
Wundheilungsassay nach ektoper Expression bzw. Knockdown von Sec23A
44
5.4.3
Invasion- und Migrationsverhalten nach ektoper Expression bzw. Knockdown von Sec23A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
5.5
miRNA in situ Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
5.6
Diagnostisches Potential von miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
5.7
Assoziation von miRNA Expressionsprofilen und klinisch-pathologischen Parametern
54
5.8
ERG als Zielgen der miR-145 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
5.8.1
ERG mRNA Expression in Prostatazelllinien und primären Prostatageweben
55
5.8.2
ERG Protein Expression in Prostatazelllinien und primären Prostatageweben
57
5.8.3
Der ERG Genfusionsstatus beeinflusst die ERG mRNA Expression . . . . .
58
5.8.4
Korrelation von miR-145 und ERG mRNA- und Proteinexpression . . . . .
59
5.8.5
Analyse des Einflusses von ERG-2 Knockdown und ektoper Expression von
miR-145 auf Proliferation, Apoptose und Invasion . . . . . . . . . . . . . .
6 Diskussion
61
63
6.1
miRNA Profilerstellung im Prostatakarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
64
6.2
miRNA Zielgenanalysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
6.2.1
SEC23A als Zielgen der miRNAs miR-200c und miR-375 . . . . . . . . . .
65
6.2.2
MYO6 als Zielgen der miRNAs miR-143 und miR-145 . . . . . . . . . . .
71
6.2.3
Regulation von ERG durch miR-145 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
6.3
Diagnostisches Potential von miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
6.4
Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
7 Material
77
7.1
Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
7.2
Reagenzien für die Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
7.3
Transfektionsreagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
7.4
antisense Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
7.5
Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
7.6
miRCURY LNA MicroRNA Detection Probes for in situ hybridization . . . . . . .
79
Inhaltsverzeichnis
III
7.7
Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
7.8
Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
80
7.9
Kommerziell erhältliche Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
80
7.10 TaqMan® MicroRNA Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
7.11 TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
7.12 Oligonucleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
7.13 Expressionsvektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
7.14 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
83
7.15 Primärgewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
84
8 Methoden
8.1
89
RNA Extraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.1.1
RNA Extraktion mit Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform (TRIzol®) aus kryokonserviertem Primärgewebe und Zellkultur . . . . . . . . .
8.1.2
89
89
RNA Isolation aus Formalin-fixiertem, Paraffin eingebettetem Gewebe mit
dem MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
RNA Extraktion mit dem mirVana™ miRNA Isolation Kit
. . . . . . . . .
90
8.2
Photometrische Bestimmung der RNA Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . .
91
8.3
DNAseI Behandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
91
8.4
cDNA Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
91
8.4.1
miRNA spezifische cDNA Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
92
8.4.2
cDNA Synthese von Gesamt-RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
92
8.1.3
8.4.2.1
Kit (Applied Biosystems) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
92
cDNA Synthese mit dem DyNAmo™ cDNA Synthese Kit . . . .
92
Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
93
8.5.1
qRT-PCR mit TaqMan® Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
93
8.5.2
qRT-PCR mit SYBR Green I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
95
8.4.2.2
8.5
8.6
cDNA Synthese mit dem TaqMan® mRNA Reverse Transcription
Zellkultur
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
96
8.6.1
Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
96
8.6.2
Kultivieren und Passagieren von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
97
8.6.3
Auftauen von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
97
8.6.4
Einfrieren von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
97
8.6.5
Passagieren von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
97
8.6.6
Bestimmung der Zellzahl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
98
8.6.7
Transiente Transfektion von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
98
8.6.8
Transiente Transfektion von miRNA antisense Oligonukleotiden
98
8.6.9
Transiente Transfektion von antisense Oligonukleotiden zur Verhinderung
. . . . . .
der Genexpression von MYOSIN VI, SEC23A und ERG2 . . . . . . . . . .
99
IV
Inhaltsverzeichnis
8.7
Funktionelle Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
99
8.7.1
Migration und Invasion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
99
8.7.2
Wundheilungsassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
8.7.3
Analyse der Viabilität - MTT Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
8.7.4
Analyse der Proliferation - BrdU-ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
8.7.5
Analyse der Zytotoxizität - LDH-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
8.7.6
Analyse der Apoptose - Caspase 3/7 Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
8.8
miRNA In situ Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
8.9
miRNA Microarray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
8.10 Proteinbiochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
8.10.1 Gewinnung von Zelllysaten mit Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform
(TRIzol®) aus cryokonserviertem Primärgewebe und Zellkultur . . . . . . . 106
8.10.2 Messung der Proteinkonzentration (BCA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
8.10.3 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . 107
9 Literatur
109
10 Anhang
125
10.1 Abkürzungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
10.2 Plasmidkarten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
Abbildungsverzeichnis
131
Tabellenverzeichnis
133
Eigene Publikationen, wissenschaftliche Vorträge und Posterpräsentationen
135
Danksagung
137
Summary
1
1 Summary
Prostate cancer is the most frequent cancer in men in Germany. The causes of this disease are
mostly unknown, however, besides the patient’s age a genetic predisposition as well as factors like
nutrition are discussed. Methods for the diagnosis of prostate cancer are currently digital rectal
examination and measurement of the prostate specific antigen (PSA). However, both methods
have limitations as for the digital rectal examination only 2-5% of the tumors are found by this
examination method and the PSA level differs due to patient dependent causes like the size of
the prostate, urinary tract infections and therapeutic or diagnostic operations of the lower urinary
tract, leading to an increased PSA level which is not necessarily correlated to a malignant lesion of
the prostate. The goal is to find more precise markers for the diagnosis and later on the prognosis
of prostate cancer.
MicroRNAs (miRNA) are small regulatory RNAs of 19-22 nucleotides length, regulating the expression of approximately 30% of the human genes. Several publications already showed a central
role for miRNAs in physiologic and pathologic processes like cell differentiation, cell cycle control, proliferation, apoptosis and via the regulation of these processes an important role in cancer
development.
The first aim of this study was to obtain a global miRNA expression profile of prostate cancer,
therefore sequencing and miRNA microarray analyses were performed. With both techniques seven
miRNAs (miR-375, miR-200c, miR-106a, miR-106b, let-7a, miR-21, miR-20a) where found to be
upregulated and two miRNAs (miR-145, miR-221 ) were found to be downregulated. The expression
of the most deregulated miRNAs (miR-375, miR-200c, miR-145 ) and additionally miR-143 was
analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in prostate cell lines and
two collectives of primary prostate tissue. The pattern of deregulation (up or down in tumor)
predicted from sequencing and miRNA micorarray could be confirmed for all of the miRNAs.
Using a bioinformatical approach, target genes (MYO6, SEC23A, ERG) for the four miRNAs were
identified. The expression of the target genes was measured using qRT-PCR as well and an inverse
expression of target gene and related miRNA was found.
Moreover, the impact of the deregulated expression of miR-375, miR-200c and miR-145 as well as
for Sec23A and ERG was examined in vitro. Knockdown of miR-375 and miR-200c led to changes
in proliferation, viability, cytotoxicity, apoptosis and wound healing. The deregulation of Sec23A
showed a similar impact on the examined cell biological parameter.
For ERG the overall expression as well as the expression of different splice variants was examined.
2
Summary
The overall ERG expression and the expression of the ERG-2 splice variant were found to be
upregulated in prostate cancer. Knockdown of ERG-2 and ectopic expression of miR-145 led to
reciprocal effects in proliferation and invasion. On protein level a correlation between the protein
amount of ERG total and ERG-2 with the miR-145 expression was found.
As the expression of miRNAs showed a specific pattern for tumor and normal tissue binary logistic
regression was done to investigate the diagnostic potential of the miRNAs. A combination of the
miRNAs miR-375, miR-145 and miR-143 showed the best predictive value to discriminate between
normal and tumor tissue.
These findings underline the promising role of miRNAs as diagnostic markers in prostate cancer.
Moreover studying miRNAs and their target genes might lead to the identification of new tumorrelevant genes which might serve as therapeutic targets or prognostic markers in the future.
Zusammenfassung
3
2 Zusammenfassung
Das Prostatakarzinom ist in Deutschland die am häufigsten vorkommende Krebserkrankung beim
Mann. Die Ursachen dieser Erkrankung sind weitestgehend unbekannt, wobei neben dem Alter auch
eine genetische Prädisposition sowie Faktoren wie Ernährung diskutiert werden. Die Diagnostik des
Prostatakarzinoms findet bislang zum einen mittels digital rektaler Tastuntersuchung statt, wobei
hier nur etwa 2-5% der Tumore entdeckt werden und zum anderen über die Messung des prostataspezifischen Antigens (PSA). Der PSA Level wird jedoch von patientenabhängigen Größen wie
z.B. Prostatagröße, Harnwegsinfekte und therapeutische oder diagnostische Eingriffe am unteren
Harntrakt beeinflusst, sodass eine Erhöhung des PSA-Wertes nicht unbedingt mit einer bösartigen
Veränderung der Prostata zusammenhängt. Das Ziel ist, genauere Marker für die Diagnose und
Prognose zu finden.
MicroRNAs (miRNA) sind kleine RNAs von 19-22 Nukleotiden Länge, welche etwa 30% aller
menschlichen Gene regulieren. In mehreren Arbeiten wurde bereits gezeigt, dass miRNAs eine
zentrale Rolle bei physiologischen und pathologischen Prozessen, wie bei der Zelldifferenzierung,
Zellzykluskontrolle, Proliferation, Apoptose und über die Regulation dieser Prozesse auch bei der
Entstehung von Krebs spielen.
Das erste Ziel dieser Arbeit war die Erstellung eines globalen miRNA Expressionsprofiles im Prostatakarzinom. Hierzu wurden Sequenzierungs- und miRNA microArray-Analysen durchgeführt. Mit
beiden Ansätzen wurden sieben miRNAs (miR-375, miR-200c, miR-106a, miR-106b, let-7a, miR21, miR-20a) hochreguliert und zwei miRNAs (miR-145, miR-221 ) herunterreguliert gefunden. Die
Expression der am stärksten dereguliert exprimierten miRNAs (miR-375, miR-200c, miR-145 ) und
zusätzlich miR-143 wurde mittels quantitativer real-time Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) in
Prostatazelllinien und zwei Kollektiven von Primärgeweben untersucht und die Art der Deregulation
(hoch- bzw. herunterreguliert im Tumor) konnte für alle bestätigt werden.
Mittels bioinformatischer Recherche wurden für alle vier miRNAs Zielgene (MYO6, SEC23A, ERG)
identifiziert. Deren Expression wurde ebenfalls mittels qRT-PCR in Prostatazelllinien und einem
Kollektiv von Primärgeweben analysiert und für alle drei Zielgene konnte eine inverse Expression
zu der jeweiligen miRNA gefunden werden.
Außerdem wurde der Einfluss der Deregulation der miRNAs miR-375, miR-200c und miR-145,
sowie von Sec23A und ERG in vitro untersucht. Knockdown von miR-375 und miR-200c führte zu
einer Veränderung der zellbiologischen Paramter Proliferation, Viabilität, Zytotoxizität, Apoptose
4
Zusammenfassung
und Wundheilung. Ebenso konnte ein Einfluss der Deregulation von Sec23A auf die untersuchten
zellbiologischen Parameter festgestellt werden.
Für ERG wurde sowohl die Gesamt-ERG Expression als auch die Expression einzelner Spleißvarianten untersucht. Die Expression von Gesamt-ERG und für die ERG-2 Spleißvariante wurde im
Tumor hochreguliert gefunden. Nach ERG-2 Knockdown und ektoper Expression von miR-145
wurden ebenfalls reziproke Auswirkungen auf Proliferation und Invasionsverhalten festgestellt. Auf
Proteinebene wurde sowohl für die Gesamt-ERG-Proteinmenge als auch für ERG-2 eine Korrelation
mit der miR-145 Expression gefunden.
Da die miRNA Expression ein differenzielles Muster zwischen Tumor- und Normalgewebe zeigte,
wurde das diagnostische Potential der miRNAs mittels binärer logistischer Regressionsanalysen untersucht. Eine Kombination der miRNAs miR-375, miR-145 und miR-143 zeigte hierbei den besten
prädiktiven Wert zur Unterscheidung von Tumor- und Normalgewebe.
Diese Befunde unterstreichen die Funktion von miRNAs als vielversprechende diagnostische Marker für das Prostatakarzinom, sowie als Wegbereiter zur Identifizierung von neuen tumorrelevanten
Genen, welche in der Zukunft als mögliche therapeutische Ziele oder prognostische Marker dienen
können.
Einleitung
5
3 Einleitung
3.1 Die Prostata
Die Prostata (Vorsteherdrüse) befindet sich direkt unterhalb der Harnblase und umschließt den
Anfangsteil der Harnröhre. Sie besteht aus Bindegewebe, Muskelfasern und Drüsen. Die Hauptaufgabe der Prostata ist die Produktion eines milchigen Sekrets, welches für die Ernährung und
Fortbewegung der Spermien wichtig ist. Dieses Sekret bildet den größten Teil der Samenflüssigkeit.
Außerdem wird in der Prostata das männliche Geschlechtshormon Testosteron in seine aktive Form,
Dihydrotestosteron, umgewandelt. Beim Wasserlassen kommt der Prostata ebenfalls eine wichtige
Funktion zu. Sie verschließt Samenleiter und Drüsengänge und verhindert so das Eindringen von
Urin (Manski, 21.11.2010).
3.2 Das Prostatakarzinom
3.2.1 Epidemiologie des Prostatakarzinoms
Das Prostatakarzinom ist in Deutschland mit einer Neuerkrankungsrate von 149,1 Fällen pro
100.000 die am häufigsten vorkommende Krebserkrankung beim Mann. Die relative 5-JahresÜberlebensrate (Prozentsatz der Patienten, der nach Ablauf von 5 Jahren noch lebt) liegt zwischen 83% und 94%. Das Prostatakarzinom unterscheidet sich von anderen bösartigen Tumoren
durch sein langsames Wachstum, so dass ältere Männer überwiegend nicht an dem Prostatatumor versterben, sondern an anderen Erkrankungen. Der Krankheitsverlauf des Prostatakarzinoms
variiert zwischen einem schmerzfreien Verlauf ohne Symptome bis zu einem aggressiven Krebs,
der schnell metastasiert und schwere Schmerzen und verfrühten Tod verursacht. Die Ursachen für
diesen unterschiedlichen Krankheitsverlauf sind dagegen bis heute nicht verstanden. Ebenso gibt
es verschiedene Möglichkeiten, Prostatakrebs zu behandeln: abwarten und beobachten, operative
Entfernung der Prostata (Prostatektomie), Strahlen-, Hormon- und Chemotherapie (Robert Koch
Institut, 2010).
6
Einleitung
3.2.2 Risikofaktoren für die Entstehung eines Prostatakarzinoms
Die Ursachen für die Entstehung des Prostatakarzinoms und den Krankheitsverlauf beeinflussende Faktoren sind im Wesentlichen unbekannt, wobei bei jüngeren Männern eine genetische
Prädisposition diskutiert wird (Bratt, 2002). Das Prostatakarzinom ist eine Erkrankung des älteren
Mannes mit einem mittleren Erkrankungsalter von 69 Jahren, vor dem 50. Lebensjahr tritt eine
Erkrankung sehr selten auf (Lew und Garfinkel, 1990).
Eine Reihe von Untersuchungen zeigte zudem eine familiäre Häufung des Prostatakarzinoms. Es
wurde ein zwei- bis dreifaches Risiko für Männer beschrieben, deren Väter oder Brüder an einen
Prostatakarzinom erkrankten und ein bis zu fünffach erhöhtes Risiko, wenn mehrere Angehörige
an Prostatakrebs erkrankt waren (Steinberg et al., 1990; Spitz et al., 1991; Bratt, 2002). Studien belegen außerdem einen Zusammenhang zwischen der Häufigkeit des Prostatakarzinoms und
der ethnischen Abstammung eines Patienten (Baade, Youlden und Krnjacki, 2009). In den USA
wurde 2004 eine deutlich höhere Inzidenz für Afroamerikaner (226/100.000) als für kaukasische
Amerikaner (145,1/100.000) gezeigt (U.S. Cancer Statistics Working Group, 2010).
3.2.3 Klassifikation des Prostatakarzinoms
Zur Klassifikation und Prognoseerstellung des Prostatakarzinoms wird zum einen der Differenzierungsgrad mittels Gleason Score und zum anderen die Ausbreitung des Tumors mittels TNMKlassifikation beschrieben.
3.2.3.1 Gleason Score
Der Gleason Score ist ein System zur Einteilung von Prostatakarzinomen anhand von histologischen Mustern, welches 1966 vom Pathologen Donald F. Gleason entwickelt wurde (Gleason,
1966). Beurteilt wird die Drüsenmorphologie von 1 (sehr gut differenziert) bis 5 (entdifferenziert,
kein Drüsenmuster zu erkennen) (Abb. 3.1) vom vorherrschenden und dem zweithäufigsten Differenzierungsgrad und die Summe der beiden bildet der Gleason Score. Dieser umfasst somit Werte
von 2 (1+1) bis 10 (5+5) (Mellinger, Gleason und Bailar, 1967; Gleason und Mellinger, 1974;
Gleason, 1992). Der Gleason Score korreliert mit der Prognose des Tumors (Albertsen et al., 1998).
Einleitung
Abbildung 3.1. Einteilung der Drüsenmorphologie nach D.F. Gleason
Einteilung der Drüsenmorphologie nach D.F. Gleason (Gleason, 1966) von 1 (sehr gut differenziert) bis
5 (entdifferenziert, kein Drüsenmuster zu erkennen).
7
8
Einleitung
3.2.3.2 TNM-Klassifikation des Prostatakarzinoms
Die Beschreibung des Tumorausbreitung erfolgt mit der TNM-Klassifikation, welche zwischen 1943
und 1952 von Pierre Denoix entwickelt wurde. T“ beschreibt hier die Ausbreitung des Tumors in der
”
Prostata und der näheren Umgebung, N“ steht für die Anzahl und Lokalistation der befallenen
”
Lymphknoten und M“ bezeichnet Auftreten und Lokalisation von Fernmetastasen in anderen
”
Organen (Harmer, Denoix und Hamperl, 1968) (Tab. 3.1).
Tabelle 3.1. TNM-Klassifikation des Prostatakarzinoms
aus der 7. Auflage der TNM Klassifikation maligner Tumoren (Sobin, 2009)
T: Primärtumor, N: Lymphknotenstatus, M: Matastasierungsstatus.
Stadium
Primärtumor
Tx
T0
T1
Definition
T1a
T1b
T1c
T2
T2a
T2b
T2c
T3
T3a
T3b
T4
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
Kein Anhalt für einen Primärtumor
Klinisch nicht fassbarer Tumor, nicht tastbar oder durch
bildgebende Verfahren darstellbar
inzidentieller Tumor, histologisch <5% des rezidierten Gewebes
inzidentieller Tumor, histologisch >5% des rezidierten Gewebes
Tumor durch Nadelbiopsie diagnostiziert
Tumor auf die Prostata beschränkt
Tumor befällt die Hälfte eines Prostatalappens
Tumor befällt mehr als die Hälfte eines Prostatalappens
Tumor befällt beide Prosatalappen
Tumor breitet sich über die Prostatakapsel hinaus aus
Extrakapsuläre Ausbreitung (ein- oder beidseitig)
Tumor infiltriert Samenblasen
Tumor befällt weitere Nachbarstrukturen außer den Samenblasen
Lymphknotenstatus
Nx
N0
N1
regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
kein Anhalt für Lymphknotenmetastasen
regionärer Lymphknotenbefall
Fernmetastasen
Mx
M0
M1
M1a
M1b
M1c
Fernmetastasen können nicht beurteilt werden
kein Anhalt für Fernmetastasen
Fernmetastasen
extraregionärer Lymphknotenbefall
Knochenmetastasen
andere Manifestation
Einleitung
9
3.2.4 Genetik des Prostatakarzinoms
Bei der Entstehung und Progression des Prostatakarzinoms spielen verschiedene genetische Veränderungen eine Rolle.
So ist die Phospholipidphosphatase PTEN (Phosphatase and tensin homolog) auf Chromosom 10
in einer Region lokalisiert, welche häufig vom Verlust der Heterozygotie betroffen ist (Cairns et al.,
1997). Das Hauptsubstrat von PTEN ist PIP3 (Phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphat), welches
durch Abspaltung einer Phosphatgruppe durch PTEN inaktiviert wird. Dadurch fungiert PTEN als
Antagonist der Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) und damit als negativer Regulator des PI3K
Signalwegs, welcher Signale für Zellwachstum, -proliferation und -überleben übermittelt (Chow und
Baker, 2006; Vivanco und Sawyers, 2002). Durch den Verlust von PTEN bleibt PIP3 aktiv, welches
den AKT Signalweg aktiviert und dadurch zu vermindertem Zelltod führt (Sun et al., 1999).
Ein weiteres Gen, welches in einer chromsosomalen Region liegt, welche im Prostatakarzinom häufig
deletiert ist, ist der Tumorsuppressor NKX3.1 (He et al., 1997). NKX3.1 ist ein androgen-reguliertes
Homeoboxgen, welches für einen gewebsspezifischen Transkriptionsfaktor kodiert. Dieser spielt eine
wichtige Rolle bei der Differenzierung des Prostataepithels (Abate-Shen, Shen und Gelmann, 2008;
Erbaykent-Tepedelen et al., 2011). NKX3.1 wird durch Androgene im normalen Prostataepithel
heraufreguliert und beinflusst die Androgenrezeptor (AR) Transkription negativ. Über Stabilisierung
von p53 spielt NKX3.1 außerdem eine Rolle bei der Zellzykluskontrolle und der Regulation des
Zelltodes (Korkmaz et al., 2000; Lei et al., 2006; Prescott, Blok und Tindall, 1998).
Die Amplifikation des AR Gens ist eine andere genetische Veränderung. Diese kann die Ursache für
androgen-unabhängiges Wachstum des Prostatakarzinoms sein. Außerdem führen Mutationen im
AR zu einer veränderten Ligandenspezifität (Bubendorf et al., 1999; Koivisto et al., 1997; Visakorpi
et al., 1995).
Das Polycomb Group Protein EZH2 (Enhancer of zeste homologue 2 ) liegt im Prostatakarzinom
überexprimiert vor (Varambally et al., 2002). Dies führt über Inhibierung der Histondeacetylase zu
einer verstärkten Methylierung von Lysin 27 an Histon 3 (Cao, 2002). Ein Gen, welches durch
Hypermethylierung inaktiviert im Prostatakarzinom vorliegt, ist die Glutathion-S-Transferase Pi
(GSTπ) (Goessl et al., 2001). GSTπ ist ein entgiftendes Enzym, welches elektrophile Karzinogene
inaktiviert (Nelson, Marzo und DeWeese, 2001; Toffoli et al., 1992).
c-MYC ist ein Proto-Onkogen, welches für den Transkriptionsfaktor c-MYC kodiert. Die Induktion
von c-MYC fördert Zellproliferation und -transformation (Thompson, 1998). Dieses Gen liegt im
Prostatakarzinom amplifiziert vor (Nupponen et al., 1998; Sato et al., 1999).
Eine weitere genetische Veränderung sind Genarrangements. Im Prostatakarzinom konnten Genarrangements nachgewiesen werden, welche das androgenregulierte Gen der Transmembranprotease, Serine 2 (TMPRSS2) mit Mitgliedern der ETS Transkriptionsfaktorfamilie (ERG, ETV1,
ETV4 ) fusioniert. Die ETS Transkriptionsfaktoren, welche Heterodimere mit anderen Transkriptionsfaktoren bilden, sind wichtige Mediatoren der Zelldifferenzierung, Proliferation und onkogenen
10
Einleitung
Transformation (Wasylyk, Hagman und Gutierrez-Hartmann, 1998). In etwa 50% aller Prostatakarzinome liegt eine erhöhte Expression des ERG Gens (v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog (avian)) vor. Diese kann auf die Fusion des ERG Gens mit dem TMPRSS2 Gen
zurückgeführt werden, welches ERG unter die Kontrolle des Androgen-responsiven Promotors bringt
(Park et al., 2010). Die TMPRSS2-ERG Fusion ist die häufigste Fusion verglichen mit den Fusionen
TMPRSS2-ETV1 und TMPRSS2-ETV4 (Soller et al., 2006; Tomlins et al., 2005; Tomlins et al.,
2006; Yoshimoto et al., 2006) und ist die am häufigsten vorkommende genetische Veränderung beim
Prostatakrebs (Tomlins et al., 2005). TMPRSS2-ERG Fusionen sind spezifisch für das Prostatakarzinom (Perner et al., 2007) und in einigen Studien konnte eine Assoziation mit aggressiverem
Tumorverhalten gezeigt werden (Nam et al., 2007; Perner et al., 2006; Wang et al., 2006; Demichelis et al., 2007; Rajput et al., 2007).
Außerdem konnte die TMPRSS2-ERG Fusion im Urin nachgewiesen werden, so dass der Nachweis dieser Fusion als Biomarker für den nichtinvasiven Nachweis einen Prostatakarzinoms dienen
könnte (Laxman et al., 2006; Aubin et al., 2011; Tomlins et al., 2011).
3.2.5 Biomarker zur Diagnostik des Prostatakarzinom
In Deutschland beinhaltet das gesetzliche Früherkennungsprogramm für Männer ab 45 Jahren
einmal jährlich die Frage nach gesundheitlichen Veränderungen oder Beschwerden sowie die Untersuchung der Geschlechtsorgane und die Tastuntersuchung der Prostata vom Enddarm her (Robert
Koch Institut, 2010). Bei den Tastuntersuchungen werden allerdings nur etwa 2-5% der Prostatakarzinome entdeckt und von diesen entdeckten Tumoren sind etwa 50% nicht mehr heilbar (Ito
et al., 2001).
Eine weitere Möglichkeit zur Entdeckung von Prostatatumoren ist die Messung des prostataspezifischen Antigens im Blut. Das prostataspezifische Antigen (PSA) ist eine Serinprotease mit
einem Molekulargewicht von 33 kDa, welche von Prostataepithelzellen sekretiert wird. 1976 konnten Wang et al. das PSA in benignem, hypertrophen und malignem Prostatagewebe, jedoch nicht
in anderen humanen Geweben, nachweisen (Wang et al., 1979). Nachfolgende Studien belegten,
dass das PSA in humanem Serum detektierbar ist und bei Männern mit Prostatakarzinom der PSALevel erhöht ist (Papsidero et al., 1980; Kuriyama et al., 1980). Jedoch wird dieser Wert auch von
patientenabhängigen Größen wie z.B. der Prostatagröße, Harnwegsinfekten und therapeutischen
oder diagnostischen Eingriffe am unteren Harntrakt beeinflusst, so dass eine Erhöhung des PSAWertes nicht unbedingt mit einer bösartigen Veränderung der Prostata zusammenhängt (Rohde
et al., 2007).
Ein weiterer potentieller Biomarker ist DD3 (auch bekannt als PCA3) (Bussemakers et al., 1999).
Die nichtkodierende, prostataspezifische mRNA von DD3 ist deutlich überexprimiert im Prostatakarzinom (Kok et al., 2002). Marks et al. (2007) konnten außerdem zeigen, dass DD3 dem PSA
Einleitung
11
überlegen ist bei der Detektion von Prostatakrebs.
Die alpha-Methylacyl Coenzym A Racemase (AMACR) ist ebenfalls ein möglicher Biomarker für
das Prostatakarzinom. AMACR wurde auf Protein- und auf mRNA-Ebene im Tumor überexprimiert
gefunden (Xu et al., 2000). Der Zusammenhang zwischen diesem Enzym und der Entstehung von
Prostatakrebs ist deshalb besonders interessant, da AMACR bei der Oxidation von verzweigten
Fettsäuren eine Rolle spielt und die Hauptquellen für verzweigte Fettsäuren, wie Rindfleisch und
Milchprodukte, als Ernährungsfaktoren mit der Entstehung von Prostatakrebs in Verbindung gebracht wurden (Ferdinandusse et al., 2000; Chan et al., 2001).
Auch Einzelnukleotidpolymorphismen (singe nucleotide polymorphism = SNP) wurden mit der
Entstehung von Prostatakrebs assoziiert gefunden. Zheng et al. (2008) zeigten, dass fünf Risikoallele zusammen mit einer positiven Familienanamnese im Vergleich zu Menschen ohne Risikoallele
mit einem 9,5-fach höheren Risiko für eine Prostatakarzinomentwicklung assoziiert sind.
Weitere Marker sind EZH2 (Varambally et al., 2002), Hepsin und PIM1 (Dhanasekaran et al.,
2001), ebenso prognostische Marker, wie IGFBP-3 and COL1A2 (Singh et al., 2002), die in Zukunft eine nicht-invasive Sicherung der Diagnose Prostatakrebs“ sowie eine Aussage zur Prognose
”
ermöglichen können.
3.3 microRNAs
MicroRNAs (miRNA) sind kleine, ca. 22 Nukleotide (nt) lange RNAs, die zunächst in Caenorhabditis
elegans entdeckt wurden, wobei man davon ausging, dass diese kleinen RNAs eine Besonderheit
der Nematoden seien (Lee, Feinbaum und Ambros, 1993; Wightman, Ha und Ruvkun, 1993). Es
stellte sich jedoch heraus, dass einige dieser miRNAs in vielen Pflanzen, Tieren und dem Menschen
konserviert vorkommen (Kato und Slack, 2008; Pasquinelli et al., 2000). Bis heute wurden 175 C.
elegans miRNAs, 213 Arabidopsis thaliana miRNAs, 176 Drosophila melanogaster miRNAs 672
murine und 1048 humane miRNAs entdeckt (miRBase Version 17.0, April 2011, www.mirbase.org)
(Griffiths-Jones, 2004; Griffiths-Jones et al., 2006; Griffiths-Jones et al., 2008).
3.3.1 Prozessierung und Funktion
Die meisten miRNAs liegen in den Introns von proteinkodierenden oder -nichtkodierenden mRNA
Transkripten, in Pseudogenen oder in der 3’ untranslatierten Region (3’ UTR) von Genen (Bartel,
2004; Bentwich et al., 2005; Baskerville und Bartel, 2005). miRNAs werden zunächst als primary
miRNA (pri-miRNA) von der RNA Polymerase II transkribiert und liegen als Haarnadelstrukturen
mit 5’ Cap und Poly(A) Schwanz vor (Lee et al., 2004; Cai, Hagedorn und Cullen, 2004). Einige
12
Einleitung
miRNAs liegen in Clustern vor und werden zu einer gemeinsamen pri-miRNA translatiert (LagosQuintana et al., 2001; Lau et al., 2001). Die pri-miRNA wird von der RNase III Endonuklease
Drosha und dem Doppelstrangbindeprotein DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8 ;
bekannt als Pasha (partner of Drosha) in Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans) zu
einer 60-70 nt langen preliminary miRNA (pre-miRNA) prozessiert, welche aus einer imperfekten
Haarnadelstruktur besteht. Diese pre-miRNA wird anschließend vom Exportrezeptor Exportin-5
mit Hilfe des Co-Faktors Ran-GTP (RAS-related nuclear protein-guanosine triphosphate) vom
Nukleus in das Cytoplasma transportiert. Im Cytoplasma wird die pre-miRNA von der RNase III
Dicer in RNA-Duplexe gespalten (miRNA:miRNA*), welche den reifen miRNA Strang und den
komplementären Strang (miRNA*) enthalten. In Interaktion mit dem Doppelstrangbindeprotein
TRBP (human immunodeficiency virus transactivating response RNA-binding protein) werden die
doppelsträngigen RNA-Komplexe entwunden und die einzelsträngige, reife miRNA liegt vor (He
und Hannon, 2004) (siehe Abb. 3.2).
Abbildung 3.2. miRNA Prozessierung
Die RNA Polymerase II transkribiert die miRNA Gene zu langen primary miRNA (pri-miRNA) Transkripten. Diese liegen als Haarnadelstrukturen vor und werden von der RNase III Drosha und DGCR8
(DiGeorge syndrome critical region gene 8 ) zu preliminary miRNAs (pre-miRNA) prozessiert. Diese premiRNA wird durch Exportin-5 mit Ran-GTP als Co-Faktor ins Cytoplasma transportiert und dort von
der RNase III Dicer und TRBP (human immunodeficiency virus transactivating response RNA-binding
protein) zu miRNA:miRNA* Duplexen prozessiert. Ein Strang dieses Duplexes wird degradiert und der
andere Strang, die reife miRNA, wird in den RNA-induced silencing complex (RISC) geladen (Abb.
nach VandenBoom et al., 2008).
Einleitung
13
Die miRNAs spielen ebenso wie andere kleine RNAs (small interfering RNA (siRNA) und piwiinteracting RNAs (piRNA)) eine Rolle bei der negativen Regulation der Genexpression (Reinhart
und Bartel, 2002; Ambros et al., 2003) wobei die Funktion der miRNAs nicht auf bestimmte Entwicklungsstadien beschränkt ist (He und Hannon, 2004). Die miRNA wird in den RNA-induced
silencing complex (RISC) geladen, dieser Komplex bindet an die 3’ untranslatierte Region (UTR)
der Ziel-mRNA und reguliert die Genexpression posttranskriptionell durch Hemmung der Proteinsynthese (vorherrschender Mechanismus in Tieren) oder mRNA Abbau (vorherrschender Mechanismus in Pflanzen) (Bartel, 2004; Esquela-Kerscher und Slack, 2006; Lau et al., 2001; Lee und
Ambros, 2001; Lagos-Quintana et al., 2001). Die Entscheidung für translationale Inhibiton oder
mRNA Abbau wird getroffen aufgrund des Grades der Komplementarität zwischen der miRNA und
der Ziel-mRNA. Nahezu perfekte Komplementarität führt zum Abbau der mRNA, eine nur teilweise Komplementarität dagegen führt präferenziell zur translationellen Inhibition (Saxena, Jónsson
und Dutta, 2003; Zeng und Cullen, 2003). Die Nukleotide 2 bis 8 der miRNA bilden dabei die
“seed“-Sequenz, welche komplementär ist zur Erkennungssequenz der mRNA. Der zentrale Teil
der miRNA ist normalerweise nicht komplementär zur mRNA, die 3’-Region dagegen bindet mehr
oder weniger spezifisch an die mRNA und trägt mit zur Spezifität und Affinität des miRNA:mRNA
Komplexes bei (Brennecke et al., 2005).
Durch bioinformatische Berechnungen wird vorhergesagt, dass etwa 30 Prozent der proteinkodierenden Gene von miRNAs reguliert werden (Filipowicz, Bhattacharyya und Sonenberg, 2008;
Lewis, Burge und Bartel, 2005). Eine miRNA kann dabei mehrere verschiedene Zielgene regulieren
und eine mRNA kann von verschiedenen miRNAs reguliert werden (Bartel, 2009).
Im Ergebnis resultiert eine miRNA-vermittelte Genregulation jedoch immer in einer Reduktion der
Menge des entsprechenden Proteins.
3.3.2 miRNAs und Krebs
Durch die Regulation der Genexpression spielen miRNAs eine zentrale Rolle bei physiologischen
und pathologischen Prozessen, wie bei der Zelldifferenzierung, Zellzykluskontrolle, Proliferation,
Apoptose und bei der Immunantwort (Calin und Croce, 2006b; Calin und Croce, 2006a; Bartel,
2004).
Die ersten miRNAs, welche als dereguliert in einem Tumor beschrieben wurden, sind die miRNAs
miR-15/16. Diese sind in chronisch lymphatischen Leukämien vom B-Zell-Typ (B-CLL) herunterreguliert. Beide miRNAs liegen in der Chromosomenregion 13q14, welche in mehr als der Hälfte
der B-CLL deletiert ist, und haben als Ziel die mRNA von B-cell lymphoma 2 (Bcl-2 ) (Calin et al.,
2002). Eine Reduktion oder Deletion der miR-15/16 führt zu einem erhöhtem Bcl-2 Level und
14
Einleitung
verminderter Apoptose der B-Zellen (Cimmino et al., 2005). Seitdem wurde in einer Reihe weiterer Tumorentitäten eine Deregulation von miRNAs beschrieben, darunter Lunge (Yanaihara et al.,
2006), Pankreas (Roldo et al., 2006), Mamma (Iorio et al., 2005), Ovar (Iorio et al., 2007), Kolon
(Cummins et al., 2006) und Prostata (Porkka et al., 2007; Szczyrba et al., 2010), wobei sich ein
tumorspezifisches Muster von herauf- und herunterregulierten miRNAs ergibt.
miRNAs scheinen somit gewebsspezifisch als Tumorsuppressoren oder Onkogene zu wirken (Calin
und Croce, 2006b; Zhang et al., 2007). Wenn miRNAs, welche als Tumorsuppressoren fungieren,
vermindert exprimiert werden, können die entsprechenden Zielonkogene wieder translatiert werden
und es kommt zu verstärkter Proliferation, Invasion und Angiogenese und verringertem Zelltod und
damit zur Tumorentstehung. Wenn andererseits miRNAs, welche als Onkogene wirken, verstärkt
exprimiert werden, wird die Translation der entsprechenden Ziel-Tumorsuppressorgene inhibiert und
es kommt wieder zur Tumorentstehung (Esquela-Kerscher und Slack, 2006).
Die Mechanismen, welche einer miRNA Deregulation zugrunde liegen, sind weithin unbekannt,
es gibt jedoch Hinweise, dass transkriptionelle Deregulation, epigenetische Veränderungen, Mutationen, DNA Kopienzahlveränderungen und Defekte in der miRNA Biogenese Maschinerie eine
Rolle bei der veränderten Expression von miRNAs in humanen Tumoren spielen können (Deng
et al., 2008). Auffällig ist außerdem, dass miRNA Gene häufig in Genomregionen liegen, die anfällig
sind für strukturelle Aberrationen, wie Deletionen, Duplikationen oder Translokationen, wodurch
diese miRNAs mit der Tumorentstehung assoziiert sind (Calin et al., 2004). Weiterhin begünstigt
eine Mutation in den Genen der Mitglieder der miRNA Prozessierungsmaschinerie Drosha, DGCR8
und Dicer1 die Transformation von Zellen und die Entstehung von Tumoren. Kumar et al. (2009)
zeigten, dass in 37% der Mammatumore und in 62% der Nierentumore ein hemizygoter Verlust von
DICER1 vorliegt. Der Verlust einer Genkopie von DICER1 resultiert in einem Defekt der miRNA
Prozessierungsmaschinerie und damit in einer verminderten Expression von miRNAs in Tumoren. In
Wilms Tumoren, Neuroblastomen, Mamma-, Leber- und Kolonkarzinomen liegt häufig ein Verlust
von Mitgliedern der Argonaute Familie vor (Koesters et al., 1999).
Eine weitere Möglichkeit einer differentiellen miRNA Expression ist die Deregulation der miRNA
Transkription. So ist der Transkriptionsfaktor c-Myc in vielen humanen Tumoren amplifiziert und
überexprimiert, was eine der Ursachen für die Überexpression des miR-17-92 Clusters sein könnte
(O’Donnell et al., 2005; Chang et al., 2008).
Die Expression von miRNAs bildet ein tumorspezifisches Muster, so dass eine Nutzung der
miRNAs als Biomarker für die Detektion von Krebserkrankungen und die Vorhersage für den
Verlauf einer Therapie interessant scheint. So wurde im Mammakarzinom bereits eine Korrelation der miRNA Expression mit klinisch-pathologischen Parametern, wie mit der Östrogen- und
Progesteronrezeptorexpression, mit dem Tumorstadium, der vaskulären Invasion oder dem Proliferationsindex, beschrieben (Iorio et al., 2005). Außerdem wurde in Ovarialkarzinomen ein miRNA
Expressionsmuster beschrieben, welches mit der Histologie und der Invasivität korreliert (Iorio et al.,
Einleitung
15
2007). Darüber hinaus konnte die Kombination von zwei miRNAs (miR-205 und miR-183 ) in 84%
der Fälle korrekt zwischen Prostatatumor- und -normalgewebe diskriminieren (Schaefer und Jung,
2010; Schaefer et al., 2010b).
Eine weitere vielversprechende Möglichkeit ist die Vorhersage für den Behandlungserfolg oder das
Ansprechen auf eine Behandlung anhand des miRNA Expressionsmusters. So konnte für das Kolonkarzinom gezeigt werden, dass eine hohe miR-21 Expression assoziiert ist mit einem schlechten
Therapieansprechen und einer geringen Überlebensrate (Schetter et al., 2008). Auch für das Prostatakarzinom konnte bereits ein Zusammenhang zwischen miRNA Expression und Behandlungserfolg
belegt werden. So ist die Expression der miR-96 korreliert mit dem Auftreten eines Rezidivs nach
radikaler Prostatektomie (Schaefer et al., 2010a).
Hypthesen und Arbeitsprogramm
17
4 Hypthesen und Arbeitsprogramm
Um die Relevanz der Deregulation der miRNAs und der entsprechenden Zielgene sowie deren
Interaktion im Prostatakarzinom zu untersuchen, werden folgende Arbeitshypothesen aufgestellt.
Hypothesen
1. Es gibt charakteristische miRNA Expressionsprofile im Prostatakarzinom.
2. Die differenzielle miRNA Expression lässt sich auf Unterschiede zwischen Tumor- bzw. Normalgewebe festlegen.
3. Die Deregulation von miRNAs und deren Zielgenen hat einen Einfluss auf verschiedene zellbiologische Parameter in vitro.
4. Es lässt sich eine klinische Relevanz der Deregulation von miRNAs feststellen.
Arbeitsprogramm
zu 1. Es gibt charakteristische miRNAs Expressionsprofile im Prostatakarzinom.
Zur Erstellung eines miRNAs Expressionsprofiles im Prostatakarzinom sollten zunächst Deep
Sequencing und miRNA microArray Analysen durchgeführt werden. Die miRNA Expressionsprofile der miRNAs aus beiden Methoden sollten miteinander verglichen werden und die
Expression in Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe mittels quantitativer realtime
PCR validiert werden. Außerdem sollten für dereguliert gefundene miRNAs mittels bioinformatischer Recherche Zielgene identifiziert werden.
18
Hypthesen und Arbeitsprogramm
zu 2. Die differenzielle miRNA Expression lässt sich auf Unterschiede zwischen Tumorbzw. Normalgewebe festlegen.
Da miRNAs in verschiedenen Zelltypen exprimiert werden, sollte mittels miRNA in situ Hybridisierung die Spezifität der gefundenen miRNAs für Tumor- bzw. Normalgewebe bestimmt
werden.
Des Weiteren sollte untersucht werden, inwieweit die Expression der miRNAs mit den klinischpathologischen Paramtern Gleasongrad, Primärgleason und T-Stadium korreliert.
zu 3. Die Deregulation von miRNAs und deren Zielgenen hat einen Einfluss auf verschiedene zellbiologische Parameter in vitro.
Da in mehreren Arbeiten bereits gezeigt wurde, dass miRNAs eine zentrale Rolle bei physiologischen und pathologischen Prozessen, wie bei der Zelldifferenzierung, Zellzykluskontrolle, Proliferation und Apoptose spielen, sollte der Einfluss der Deregulation der gefundenen
miRNAs und deren Zielgene in vitro mittels zellbiologischer Assays (Proliferation, Apoptose,
Viabilität, LDH-Aktivität, Wundheilung, Invasion, Migration) in Prostatakarzinomzelllinien
untersucht werden.
zu 4. Es lässt sich eine klinische Relevanz der Deregulation von miRNAs feststellen.
Um das Potential von miRNAs als Biomarker für das Prostatakarzinom zu untersuchen, sollte
mittels logistischer Regression analysiert werden, ob durch miRNA Expressionsmuster bzw.
durch die Kombination von miRNA Expressionsmustern eine Unterscheidung von Tumor- und
Normalgewebe möglich ist. Somit ließe sich eine Bedeutung der miRNAs für die Diagnose
des Prostatakarzinoms belegen.
Ergebnisse
19
5 Ergebnisse
5.1 Vergleich der miRNA Expressionsprofile in Prostatatumorgeweben und
korrespondierendem Normalgewebe
Es wurde bereits in verschiedenen Tumorentitäten eine Deregulation von miRNAs beschrieben, darunter Lunge (Yanaihara et al., 2006), Pankreas (Roldo et al., 2006), Mamma (Iorio et al., 2005),
Ovar (Iorio et al., 2007) und Kolon (Cummins et al., 2006), wobei sich ein tumorspezifisches Muster
von herauf- und herunterregulierten miRNAs ergibt.
Zur Analyse der miRNA Expressionsprofile im Prostatakarzinom wurden verschiedene Techniken
angewandt. Mittels Deep Sequencing wurden zunächst deregulierte miRNAs definiert, deren Expression dann mittels quantitativer realtime Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction,
qRT-PCR) in Prostatazelllinien und Primärgeweben validiert wurde.
Außerdem wurde eine miRNA microArray Analyse durchgeführt und die hier als dereguliert gefundenen miRNAs mit denen aus dem Deep Sequening Ansatz verglichen.
5.1.1 Erstellung eines miRNA Expressionsprofils im Prostatakarzinom und
Prostatanormalgewebe mittels Deep Sequencing
Für das Deep Sequencing von Prostatakarzinom- und Prostatanormalgewebe wurden zunächst
je zwei cDNA Bibliotheken mit je fünf gepoolten Proben von Normal- und Tumorgewebe erstellt,
welche anschließend von der Firma Vertis Biotechnologie AG, Freising mit der 454 Methode (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim) sequenziert wurden.
Die Patientencharakteristika finden sich in Tab. 7.1.
Für die beiden Tumorgewebebibliotheken wurden 20068 und 20337 Sequenzen, für die beiden
Normalgewebebibliotheken 19395 und 20205 Sequenzen erhalten.
Es wurden nur miRNAs in die Anlayse einbezogen, welche mindestens 0,1% der gesamten miRNA
Sequenzen ausmachten. Ein Vergleich der beiden Tumorgewebebibliotheken in Kombination mit
den beiden Normalgewebebibliotheken in Kombination ergab, dass im Tumorgewebe 16 miRNAs
mindestens 1,5-fach hochreguliert und 17 miRNAs mindestens 1,5-fach herunterreguliert waren.
Die Ergebnisse sind in Tab. 5.1 zusammengefasst. Die stärkste Überexpression wurde für miR-375
20
Ergebnisse
gefunden (9-fach), gefolgt von einer 5-fachen für miR-148a und einer 4,5-fachen Hochregulation
für miR-200c. Die miR-200c repräsentierte mit 10% aller miRNA-Sequenzen die am stärksten
exprimierte miRNA im Tumorgewebe. Bei den herunterregulierten miRNAs zeigten miR-143 und
miR-145 die stärkste Deregulation (4-fach), gefolgt von miR-223 mit einer 3-fachen Herunterregulation.
Tabelle 5.1. Differentiell exprimierte miRNAs im Prostatakarzinom mit einer mindestens 1,5fachen Deregulation bei der Deep Sequencing Analyse.
Angegeben sind die relative Expression (in % der gesamten Sequenzen) und die Deregulation im Tumor.
Seq % = Prozentualer Anteil dieser miRNA an den gesamten miRNA Sequenzen.
hochregulierte miRNAs
miRNA
Seq %
Deregulation
im Tumor
herunterregulierte miRNAs
miRNA
Seq %
Deregulation
im Tumor
hsa-miR-375
1,35
9,12
hsa-miR-143
0,63
-4,17
hsa-miR-148a
0,74
4,93
hsa-miR-145
1,06
-3,85
has-miR-200c
9,93
4,54
hsa-miR-223
0,11
-3,03
hsa-miR-106a
0,72
2,76
hsa-miR-30e
0,15
-2,44
hsa-let-7c
0,49
2,74
hsa-miR-29a
0,57
-2,38
hsa-let-7f
1,61
2,71
hsa-miR-27b
4,16
-2,17
hsa-miR-106b
0,57
2,33
hsa-miR-152
0,20
-2,13
hsa-let-7a
1,88
2,20
hsa-miR-125a-5p
0,18
-2,08
hsa-miR-126*
0,35
1,87
hsa-miR-221
0,15
-2,04
hsa-miR-30b
0,91
1,87
hsa-miR-199a-5p
0,14
-2,04
hsa-miR-25
0,75
1,79
hsa-miR-101
0,17
-2,0
hsa-miR-21
5,02
1,73
hsa-miR-22
0,37
-1,82
hsa-miR-26b
5,45
1,65
hsa-miR-424
0,54
-1,72
hsa-miR-218
0,37
1,57
hsa-miR-27a
2,41
-1,72
hsa-miR-20a
0,79
1,54
hsa-miR-320
0,29
-1,59
hsa-miR-15b
1,59
1,51
hsa-miR-24
1,76
-1,54
hsa-miR-125b
1,10
-1,54
5.1.2 Validierung der relativen Expression von miRNAs, welche im Deep Sequencing als
dereguliert gefunden wurden, in den Prostatazelllinien
Zur Verifizierung der Ergebnisse aus dem Deep Sequencing wurde die Expression verschiedener
miRNAs in den Prostatakarzinomzelllinien DU145, LNCaP, PC3, in der Prostatanormalfibroblastenzelllinie PNF-08 und teilweise für die Karzinomzelllinie VCaP mittels qRT-PCR gemessen. Analysiert wurde die Expression der am stärksten hochregulierten miRNAs miR-375, miR-148a, sowie
Ergebnisse
21
von miR-200c, welche die am stärksten exprimierte miRNA war. Zusätzlich wurde miR-141 analysiert, welche in einem Cluster mit miR-200c vorliegt, und das miR-200-429-Cluster mit den
miRNAs miR-200a, 200b und -429, welche zur miR-200 Familie gehören. Darüberhinaus wurde die
Expression der beiden am stärksten herunterregulierten miRNAs miR-143 und -145 gemessen. Nach
Literaturrecherche wurden die miRNAs miR-101, -26a, -26b, -22 und -24 in den Validierungsansatz
mit einbezogen (Varambally et al., 2008; Su et al., 2009; Sander et al., 2008; Wong und Tellam,
2008; Li et al., 2010; Mishra et al., 2009). Die Ergebnisse sind in Tab. 5.2 zusammengefasst.
Die Herunterregulation von miR-143, miR-145, miR-22 und miR-24 in den Tumoren konnte in
allen Tumorzelllinien im Vergleich zu PNF-08 Zellen verifiziert werden. Die Überexpression von
miR-200c, miR-375, miR-148a und miR-141, welche in einem Cluster mit miR-200c vorliegt, konnte in je mindestens zwei Tumorzelllinien bestätigt werden.
miR-26b war im Sequenzierungsansatz als hochregulierte miRNA gefunden worden, bei den Zelllinien zeigte sich eine verminderte Expression dieser miRNA in allen Karzinomzelllinien. miR-26a war
im Deep Sequencing nicht als differentiell exprimierte miRNA gefunden worden, bei der Analyse
mittels qRT-PCR wurde miR-26a in PNF-08 Zellen am stärksten exprimiert gefunden. miR-200a,
miR-200b, miR-429 und miR-126 waren im Deep Sequencing nicht als deregulierte miRNAs gefunden worden. Bei der qRT-PCR wurden die vier miRNAs überexprimiert in DU145 und LNCaP
im Vergleich zu PNF-08 gefunden. PC-3 Zellen wiesen eine geringere Expression dieser miRNAs im
Vergleich zu PNF-08 Zellen auf.
22
Ergebnisse
Tabelle 5.2. Relative Expressionslevel der miRNAs in Prostatakarzinomzelllinien und Prostatanormalfibroblasten.
Die Expression in PNF-08 Zellen bzw. in LNCaP Zellen wurde als 1 gesetzt.
n.d. = nicht detektierbar, n.b. = nicht bestimmt
miRNA
miR-143
miR-145
miR-200a
miR-200b
miR-200c
miR-141
miR-429
miR-375
miR-26a
miR-26b
miR-101
miR-126
miR-24
miR-22
miR-148a
Zelllinie
PNF-08
LNCaP
DU145
PC-3
VCaP
1,000
1,000
n.d.
0,001
1,000
1,000
n.d.
1,000
2,005
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
1,000
0,002
0,001
1,000
1,000
1419,630
4546,44
1,000
7,810
1,000
0,538
2,941
10,204
0,005
0,063
3,728
n.d.
n.d.
0,471
1,119
635,870
536,022
0,590
20,480
0,446
0,23
0,224
3,378
0,396
0,342
0,477
0,001
0,002
0,018
0,012
1,05
2,449
0,013
4,13
1,405
0,266
3,491
0,296
0,764
0,418
0,008
n.d.
n.d.
n.b.
n.b.
845,66
132392,333
0,014
672,47
1,37
0,293
3,463
n.b.
0,0314
0,030
1,753
5.1.3 Analyse der Referenzgenstabilität
Für die Berechnung der relativen Expression der miRNAs in den Zelllinien wurde RNU6b als Referenzgen gewählt, da dieses in verschiedenen Studien zuvor bereits als Referenzgen verwendet
worden war (Jiang et al., 2005; Ambs et al., 2008; Prueitt et al., 2008; Noonan et al., 2009). Die
Wahl eines geeigneten Referenzgens ist von großer Wichtigkeit, da die Expression dieses Gens über
die Berechnung mit der 2−∆∆CT Methode (Formel 1) (Livak und Schmittgen, 2001) Einfluss hat
auf den Wert der Relativen Expression des Zielgens. Deshalb sollte das gewählte Referenzgen einen
konstanten Expressionslevel in der untersuchten Tumorentität vorweisen (Andersen, Jensen und
Ørntoft, 2004; Guénin et al., 2009).
∆∆CT = (C T, Zielgen −C T, Referenzgen )Referenzprobe −(C T, Zielgen −C T,Referenzgen )unbekannte Probe (1)
Vor der Analyse der miRNA Expression in den Prostataprimärgeweben sollte ein Vergleich der
Stabilität von RNU6b, RNU44 und den vier, als stark dereguliert gefundenen, miRNAs miR-200c,
miR-375, miR-145 und miR-143 in den Zelllinien zeigen, ob für die eigenen Studien RNU6b ebenfalls ein geeignetes Referenzgen ist.
Mittels NormFinder (Andersen, Jensen und Ørntoft, 2004) und DataAssist™ (Applied Biosystems)
wurde die Stabilität der Expression für diese sechs kleinen RNAs berechnet. Hierbei zeigte sich,
dass bei der Analyse mit NormFinder RNU6b das Referenzgen mit dem niedrigsten Stabilitätswert
Ergebnisse
23
und damit das am stabilste exprimierte Referenzgen war. Bei der Analyse mit DataAssist™ war
RNU44 das am stabilsten und RNU6b das am zweitstabilsten exprimierte Referenzgen (Tab. 5.3).
Für die weiteren Experimente wurde daraufhin RNU6b als Referenzgen zur Berechnung der relativen
Expression gewählt.
Tabelle 5.3. Stabilitätsberechnung der Kandidatenreferenzgene RNU6b und RNU44 im Vergleich zu miR-200c, miR-375, miR-145 und miR-143.
Der niedrigste Wert der Stabilitätsberechnung bezeichnet das am stabilsten exprimierte Gen.
Genname
RNU6b
RNU44
miR-375
miR-200c
miR-145
miR-143
NormFinder
DataAssist
Stabilitätswert
Stabilitätswert
0,036
0,096
0,080
0,217
0,183
0,146
4,494
4,379
4,815
7,360
6,202
5,905
5.1.4 miRNA Expression in Prostataprimärgeweben
Die Expression von miR-143, -145, den miRNAs der miR-200 Familie (miR-200a, -200b, -200c,
-141, -429 ), von miR-375, -26a, -26b, -101, -22, -24, -148a und -126 wurde im Kollektiv 1 mit 26
Paaren von cryokonserviertem Primärtumorgeweben und korrespondierendem Normalgewebe mittels qRT-PCR gemessen. Von einem Teil der miRNAs wurde zur Validierung die Expression mittels
qRT-PCR in einem zweiten Kollektiv (Kollektiv 2) gemessen. Kollektiv 2 beinhaltete 50 Paare von
Parrafin-eingebetteten, Formalin-fixierten Geweben (siehe Tab. 7.2). Während 50% der Proben in
Kollektiv 1 einen Gleasongrad 8 oder 9 aufwiesen, waren 80% der Proben in Kollektiv 2 mit Gleason
7 klassifiziert worden. Die Proben von Kollektiv 1 sind damit stärker maligne im Vergleich zu den
Proben von Kollektiv 2. Die Verteilung des Tumorstadiums war in beiden Kollektiven ähnlich, in
Kollektiv 1 wiesen 42,3% der Proben ein Tumorstadium von pT2a, pT2b bzw. pT2c auf, in Kollektiv 2 waren es 48%. Auch der Altersmedian war für beide Kollektive ähnlich (67,5 Jahre in Kollektiv
1, 65 Jahre in Kollektiv 2). Für die beiden Kollektive war zum Tumorgewebe das korrespondierende
tumorfreie (Normal-) Gewebe vorhanden, so dass ein direkter Vergleich der Expression von Tumorund Normalgewebe möglich war.
Zunächst wurden die Expression der bereits in den Zelllinien validierten miRNAs in den Primärgeweben des Kollektivs 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tab. 5.4 zusammengefasst.
miR-200a, -200b und -429, welche in vitro eine höhere Expression in den Tumorzelllinien aufwiesen,
zeigten im Gegensatz hierzu in den Primärgeweben des Kollektivs 1 eine verminderte Expression
24
Ergebnisse
im Tumor im Vergleich zum Normalgewebe. miR-200c, miR-141 und miR-375, welche in den
Tumorzelllinien überexprimiert gefunden wurden, waren auch in den Tumorgeweben des Kollektivs
1 stärker exprimiert. Jedoch war diese Überexpression nur für miR-375 signifikant (p=0,0019,
gepaarter t-Test)
miR-143 und miR-145, welche in den Tumorzelllinen eine geringere bzw. keine Expression aufwiesen, waren auch in den Primärgeweben von Kollektiv 1 im Tumor signifikant geringer exprimiert
(p=0,0022 bzw. p=0,0013, gepaarter t-Test).
miR-22 und miR-24 waren in allen Tumorzelllinen geringer exprimiert im Vergleich zu PNF-08
Zellen. Dieses Ergebnis konnte für das Kollektiv 1 bestätigt werden, in den Tumorgeweben waren
miR-22 und miR-24 signifikant niedriger exprimiert im Vergleich zu den korrespondierenden Normalgeweben (miR-22 : p=0,0003; miR-24 : p≤0,0001, gepaarter t-Test). miR-26a, miR-26b und
miR-101 waren im Tumor signifikant geringer exprimiert (miR-26a: p=0,0118, miR-26b: p=0,0319,
miR-101 : p=0,0097; gepaarter t-Test). Für miR-26a und miR-26b stimmt dieses Ergebnis mit den
in vitro Daten überein, für miR-101 war zwar in den DU145 geringer exprimiert im Vergleich zu
PNF-08, in den Zelllinien LNCaP, PC3 und VCaP wurde jedoch eine höhere Expression gefunden
(Tab. 5.2).
miR-148a war in den Tumoren des Kollektivs 1 stärker exprimiert im Vergleich zum korrespondierenden Normalgewebe, wodurch die Daten des Deep Sequencing bestätigt werden konnten. In
den Zelllinien war für miR-148a eine heterogene Expression gefunden worden. Für eine weitere
Validierung wurde die miRNA Expression von sieben ausgewählten miRNAs in Kollektiv 2 gemessen (Tab. 5.5). miR-143 und miR-145 waren im Deep Sequencing besonders stark dereguliert.
miR-200c war die miRNA, mit dem höchsten Anteil an den miRNA Sequenzen und miR-141 wurde
ausgewählt, da diese miRNA in einem Cluster mit miR-200c vorliegt. miR-375 war die miRNA mit
der stärksten Deregulation. miR-26a und miR-26b wurden weiter untersucht, da für diese miRNAs
übereinstimmende Daten zwischen den in vitro Analysen und den Primärgeweben des Kollektivs 1
gefunden worden waren.
Für die miRNAs miR-143 (p=0,0009) und miR-145 (p≤0,0001), ebenso wie für miR-26a
(p=0,0065) und miR-26b (p=0,0073, gepaarter t-Test) konnte die geringere Expression im Tumor
wie bereits in Kollektiv 1 bestätigt werden. Für miR-200c, miR-141 und miR-375 konnte die
Überexpression im Tumor validiert werden (miR-200c: p=0,0068, miR-141 : p=0,0098 , miR-375 :
p=0,0002, gepaarter t-Test).
Ergebnisse
25
Tabelle 5.4. Relative Expression der miRNAs im Prostatagewebe Kollektiv 1.
Mittelwert und p-Wert der Tumor- und korrespondierenden Normalgewebe von Kollektiv 1.
SD = Standardabweichung
Kollektiv 1
Normal
miR-143
miR-145
miR-200a
miR-200b
miR-200c
miR-141
miR-429
miR-375
miR-26a
miR-26b
miR-101
miR-126
miR-22
miR-24
miR-148a
Tumor
Mittelwert
SD
Mittelwert
SD
p-Wert
6,229
2,344
403,5
464,1
386,8
1,364
0,6254
41,45
10,74
11,03
13,51
7,504
0,1636
0,3204
2,846
6,446
2,707
538,5
598,4
497,7
1,906
0,639
35,26
15,65
13,89
14,15
5,773
0,196
0,239
2,492
1,743
0,505
300,2
291,4
477,5
1,49
0,4635
91,93
6,23
6,366
6,016
5,271
0,0629
0,1065
5,254
1,392
0,608
368,6
256,2
626,6
1,603
0,51
72,88
10,03
11,6
5,7
8,032
0,091
0,096
6,115
0,0022
0,0013
0,188
0,1065
0,4271
0,5976
0,2521
0,0019
0,0118
0,0319
0,0097
0,1368
0,0003
≤ 0,0001
0,0925
Tabelle 5.5. Relative Expression der miRNAs im Prostatagewebe Kollektiv 2.
Mittelwert und p-Wert der Tumor- und korrespondierenden Normalgewebe von Kollektiv 2.
SD = Standardabweichung
Kollektiv 2
Normal
miR-143
miR-145
miR-200c
miR-141
miR-375
miR-26a
miR-26b
Tumor
Mittelwert
SD
Mittelwert
SD
p-Wert
14,71
1,044
0,2782
2,815
74,88
1,062
14,69
19,42
1,23
0,2405
4,55
91,35
1,334
19,84
6,298
0,4308
0,3766
5,712
127,1
0,5742
8,62
6,705
0,7676
0,2876
8,035
108,5
0,7545
11,22
0,0009
≤ 0,0001
0,0068
0,0098
0,0002
0,0065
0,0073
26
Ergebnisse
5.1.5 miRNA microArray
Die miRNA microArray Expressionsanalyse wurde mit 20 Paaren von korrespondierendem Tumorund Normalgewebe aus dem Patientenkollektiv 2 am Institut für Humangenetik, FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg, von Dr. Arif Ekici durchgeführt. Aus dem Kollektiv
2 wurden für die microArray Analyse die aggressivsten Fälle ausgewählt. Der Gleason-Score der
verwendeten Proben war für 18 Proben Gleason 7 und für 2 Proben Gleason 9. Das Alter der
Patienten lag zwischen 54 und 71 Jahren (Median: 65,5 Jahre). Die ausführlichen Patientencharakteristika der verwendeten Proben finden sich in Tab. 7.3.
Der microArray war ein GeneChip miRNA microarray V1.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)
mit 7815 spezifischen Sonden, darunter 678 humane miRNAs, wie sie in der miRBase Version 11.0
(www.mirbase.org) (Griffiths-Jones, 2004; Griffiths-Jones et al., 2006; Griffiths-Jones et al., 2008)
gelistet waren.
Mittels ANOVA Analyse wurde ein Set von 72 miRNAs identifiziert, welche eine signifikant unterschiedliche Expression zwischen Tumor- und Normalgewebe aufwiesen (p<0,05). Mittels Hauptkomponentenanalyse (principal component analysis, PCA) wurden die multidimensionalen Daten
in eine dreidimensionale Darstellung gebracht. Hierbei zeigte sich, dass Normal- und Tumorproben
tendenziell in verschiedenen Clustern zusammenliegen, diese jedoch nicht klar voneinander getrennt
sind (Abb. 5.1).
Des Weiteren wurde mit allen 72 miRNAs eine nicht-überwachte hierarchische Clusteranalyse
durchgeführt, um die Proben anhand der miRNA Expression in Gruppen einzuteilen. Lediglich eine
Tumorprobe wurde dem Cluster der Normalproben und eine Normalprobe dem Cluster der Tumorproben zugeteilt (Abb. 5.2).
Bevor miRNAs zur Validierung ausgewählt wurden, wurde eine Korrektur des Datensets auf multiples Testen durchgeführt. Bei einer False Discovery Rate (FDR) von 0,05 zeigten 25 miRNAs eine
signifikant differentielle Expression (p<0,05, ANOVA) (Tab. 5.6).
Ein Vergleich der 25 differentiell exprimierten miRNAs der microArray Analyse mit den 33 differentiell exprimierten miRNAs des Deep Sequencing (Kapitel 5.1.1) zeigte, dass 10 miRNAs in beiden
Analysen unabhängig voneinander als differentiell exprimiert gefunden wurden. Sieben miRNAs
(miR-375, miR-200c, miR-106a, miR-106b, let-7a, miR-21, miR-20a) wurden in beiden Ansätzen
hochreguliert gefunden, zwei miRNAs (miR-145, miR-221 ) wurden als herunterreguliert gefunden und eine miRNA (miR-101 ) zeigte ein inverses Expressionmuster (Abb. 5.3). Neun miRNAs,
welche in der microArray Analyse als differentiell exprimiert gefunden wurden, konnten auch im
Deep Sequencing gefunden werden, zeigten hier jedoch keine mindestens 1,5-fach unterschiedliche
Expression. Dies enstpricht einer Übereinstimmung von 47% der 19 miRNAs, welche bei beiden
Analysen gefunden wurden.
Diese hohe Übereinstimmung zwischen Sequenzierung und miRNA microArray ist insofern eine
gute Bestätigung der gefundenen Deregulation dieser miRNAs, da für die beiden Methoden un-
Ergebnisse
27
Tabelle 5.6. Differentiell exprimierte miRNAs in der miRNA microArray Analyse im PCa.
Angegeben ist die Veränderung beim Vergleich Tumor- gegen Normalgewebe und der p-Wert.
miRNA
Veränderung
p-Wert
(Tumor- vs. Normal)
(Tumor vs. Normal)
hsa-let-7a
1.53
0.0006
hsa-miR-101
1.13
0.0008
hsa-miR-106a
2.41
0.0002
hsa-miR-106b
1.70
0.0017
hsa-miR-1274b
1.87
0.0012
hsa-miR-136-star
-1.18
0.0004
hsa-miR-141
1.44
0.0003
hsa-miR-145
-1.44
0.0001
hsa-miR-17
2.69
<0.0001
hsa-miR-182
2.39
<0.0001
hsa-miR-1826
1.73
0.0014
hsa-miR-200b
1.54
0.0008
hsa-miR-200c
2.92
<0.0001
hsa-miR-20a
2.67
<0.0001
hsa-miR-20b
2.81
<0.0001
hsa-miR-21
1.40
0.0007
hsa-miR-214
-1.74
0.0007
hsa-miR-221
-2.16
<0.0001
hsa-miR-222
-2.91
<0.0001
hsa-miR-302d-star
-1.13
0.0013
hsa-miR-375
3.90
<0.0001
hsa-miR-378-star
-1.30
0.0011
hsa-miR-720
1.41
<0.0001
hsa-miR-768-3p
1.67
0.0012
hsa-miR-93
2.52
0.0001
28
Ergebnisse
Abbildung 5.1. Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis, PCA)
Hauptkomponentenanalyse (PCA), welche die Daten in einer dreidimensionalen Grafik darstellt. Die
blauen Punkte stellen die Normalgewebe, die roten Punkte die Tumorgewebe dar. Normal- und Tumorgewebe liegen in Clustern beieinander, sind jedoch nicht klar voneinander getrennt.
terschiedliche Gewebeproben hinsichtlich Malignität und Probenkonservierung verwendet wurden.
Für das Deep Sequencing wurden kryokonservierte, makrodissezierte gepoolte Tumorgewebe mit
gepoolten, nicht korrespondierenden, Normalgeweben verglichen. Beim miRNA microArray Ansatz
wurden Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Proben mikrodisseziert und jeweils Tumor- mit dem
korrespondierenden Normalgewebe verglichen. Für den Sequenzierungsansatz wurden Gewebeproben hauptsächlich mit pT2c Stadium verwendet, für die Array-Analyse wurden Gewebeproben mit
pT2c, pT3a und pT3a Stadium verwendet.
Ergebnisse
29
Abbildung 5.2. Hierarchische Clusteranalyse
Hierarchische Clusteranalyse der signifikant differentiell exprimierten 72 miRNAs der miRNA microArray
Analyse.
30
Ergebnisse
Abbildung 5.3. Venn Diagramm von Sequenzierung und miRNA microArray
Venn Diagramm der in der Sequenzierung und miRNA microArray Analyse differenziell exprimiert gefundenen miRNAs. Es konnten sieben miRNAs in beiden Analyseansätzen als überexprimiert und zwei
miRNAs übereinstimmend als herunterreguliert gefunden werden.
Ergebnisse
31
5.2 Datenbankanalyse zur Auswahl potentieller Ziel-mRNAs
Anhand von bioinformatischen Vorhersagen wurden für die miRNAs miR-143, miR-145, miR-200c,
miR-148a, miR-375, miR-22 und miR-24 Zielgene bestimmt. Diese miRNAs wurden ausgewählt,
da sie im Deep Sequencing Ansatz als dereguliert gefunden worden waren und diese Deregulation in qRT-PCR und/oder miRNA microArray bestätigt werden konnte. Es wurden Zielgene ausgewählt, welche mindestens eine potentielle Bindesequenz in der 3’ untranslatierten Region (3’UTR)
für eine oder mehrere dieser miRNAs enthalten. Für die Vorhersagen wurde das, im Internet frei
zugängliche, TargetScan (http://www.targetscan.org) und das ebenfalls frei verfügbare miRecords
(http://mirecords.biolead.org) verwendet, welches die Daten von 11 verschiedenen Vorhersageprogrammen (DIANA-microT, MicroInspector, miRanda, MirTarget2, miTarget, NBmiRTar, PicTar,
PITA, RNA22, RNAhybrid und TargetScan/TargertScanS) berücksichtigt. Diese Vorhersageprogramme beruhen auf dem Abgleich möglicher Bindestellen der miRNA in der 3’UTR des Zielgens.
Für die miRNAs miR-143, miR-145, miR-22 und miR-24 wurden bei der Vorhersage möglicher
Zielgene mit miRecords 410, 616, 421 bzw. 512 mögliche Interaktionspartner gefunden, welche
von mindestens vier Vorhersageprogrammen (TargetScan, Miranda, Pictar und ein weiteres) vorhergesagt wurden. Für die miRNAs miR-200c, miR-375 und miR-148a wurden 1072, 191 bzw. 583
mögliche Interaktionspartner vorhergesagt (http://mirecords.biolead.org, 24.08.2011).
In Tab. 5.7 sind jene Ziel-mRNAs aufgeführt, welche mittels qPCR und in vitro Experimenten
näher untersucht wurden. Diese Zielgene wurden ausgewählt, da sie eine mögliche tumorbiologische
Wirkung haben. Beim Vergleich der möglichen Zielgene fiel auf, dass MYOSIN VI (MYO6) als
potentielles Zielgen sowohl für miR-143 als auch für miR-145 gefunden wurde. In Abb. 5.4A ist
die 3’UTR von MYO6 mit den konservierten Bindestellen der miRNAs dargestellt. Zusätzlich zu
miR-143 und miR-145, welche zwei potentielle Bindestellen in der MYO6 -3’UTR besitzt, finden
sich auch für miR-23ab und miR-146 potentielle Bindestellen in der MYO6 -3’UTR. In Abb. 5.4B
sind die potentiellen Bindestellen für miR-145 und miR-143 in der MYO6 -3’UTR mit der Sequenz
der jeweiligen miRNA dargestellt. Die Zielgene MYO6 (miR-143, miR-145 ) (Szczyrba et al., 2010),
SEC23A (miR-375, miR-200c) (Szczyrba et al., 2011), ERG (miR-145 ), IPO7 (miR-22 ), CUL5
(miR-148a) und ZNF217 (miR-24 ) (J. Szczyrba, M.Hart, Virologie, Universität des Saarlandes;
Daten noch nicht publiziert) wurden mittels Luciferaseassay validiert und die Expression mit qRTPCR in Zellkultur und primärem Prostatanormal- und -tumorgewebe analysiert. Darüber hinaus
wurden die miRNAs und ihre Zielgene funktionell im Zellkultursystem untersucht.
Für ZEB1 und ZEB2 wurden lediglich mittels qRT-PCR Daten in Zellkultur und Prostataprimärgeweben erhoben, da diese Gene sowie deren Regulation durch miR-200c in der Literatur
bereits beschrieben waren (Peter, 2009; Katoh und Katoh, 2009; Hurteau et al., 2009; Hurteau
et al., 2007; Gregory et al., 2008). Da mit den eigenen qRT-PCR Daten für ZEB1 und ZEB2
die Literaturdaten bestätigt werden konnten, dienten diese Daten zur Validierung der eigenen
Methode.
32
Ergebnisse
Tabelle 5.7. Zielgene für die miRNAs miR-143, -145, -200c, -375, -24.
Zielgene für die die miRNAs miR-143, -145, -200c, -375, -24, welche in silico mittels miRecords von
mindestens vier Datenbanken gefunden wurden. Als Referenz ist eine ausgewählte Literaturstelle angegeben, welche u.a. als Grundlage für die tumorbiologische Wirkung herangezogen wurde.
miRNA
Zielgen
vollständiger Name
Referenz
miR-143
MYO6
Myosin VI
(Loikkanen et al., 2009)
miR-145
MYO6
Myosin VI
(Loikkanen et al., 2009)
ERG
v-ets erythroblastosis virus E26
(Wang et al., 2006)
oncogene homolog (avian)
miR-200c
CUL5
Cullin 5
(Fay et al., 2003)
ZEB1
zinc finger E-box binding homeo-
(Wellner et al., 2009)
box 1
ZEB2
zinc finger E-box binding homeo-
(Katoh und Katoh, 2009)
box 2
SEC23A
Sec23 Homolog A
(Boyadjiev et al., 2006)
ZNF217
Zingfingerprotein 217
(Krig et al., 2010)
miR-375
SEC23A
Sec23 Homolog A
(Boyadjiev et al., 2006)
miR-22
IPO7
Importin 7
(Li et al., 2000)
miR-24
ZNF217
Zingfingerprotein 217
(Krig et al., 2010)
DEDD
Death effector domain contai-
(Alcivar et al., 2003)
ning
miR-148a
CUL5
Cullin 5
(Fay et al., 2003)
DEDD
Death effector domain contai-
(Alcivar et al., 2003)
ning
ZNF217
Zingfingerprotein 217
(Krig et al., 2010)
Ergebnisse
33
Abbildung 5.4. 3’UTR von MYO6 mit potentiellen miRNA Bindestellen
A) Darstellung der 3’UTR von MYO6 mit den potentiellen miRNA Bindestellen. B) Potentielle Bindestellen der miR-145 und miR-143 in der MYO6 -3’UTR. (Quelle: www.targetscan.org)
5.2.1 mRNA Expression von miRNA Zielgenen in den Prostatazelllinien
Bei einer Deregulation einer miRNA wird davon ausgegangen, dass das entsprechende Zielgen
invers dereguliert ist. Um diese Annahme zu bestätigen, wurde von den jeweiligen Zielgenen die
Expression mittels qRT-PCR gemessen.
Die Expression von MYO6 war in LNCaP Zellen 74-fach und in DU145 Zellen 3-fach höher als in
PNF-08 Zellen . Die relative Expression von MYO6 in PC-3 Zellen war gleich hoch wie in PNF-08
Zellen. Die miRNAs miR-143 und -145 zeigten in den Zelllinien DU145, LNCaP und PC-3 eine sehr
geringe Expression (Tab. 5.2 und 5.8). Die Überexpression des Zielgens MYO6 in den Zelllinien
34
Ergebnisse
DU145 und LNCaP bestätigt damit die Annahme, dass das Zielgen invers zur jeweiligen miRNA
exprimiert wird.
Die Expression von ZEB1 und ZEB2 war in allen Karzinomzelllinien geringer im Vergleich zu PNF08 Zellen. Die Expression von SEC23A in DU145 Zellen war 1,5-fach, die in PC-3 Zellen 1,6-fach
höher als in PNF-08 Zellen, die Expression in LNCaP Zellen war nahzu gleich wie in PNF-08 Zellen.
miR-200c, welche sowohl ZEB1, ZEB2 als auch SEC23A als Zielgene reguliert, war in den Zelllinien
DU145 und LNCaP stark überexprimiert (Tab. 5.2 und 5.8), wozu die Herunterregulation von ZEB1
und ZEB2 passt, nicht jedoch die Überexpression von SEC23A in den Karzinomzelllinien.
Die Expression von ZNF217 in LNCaP Zellen war 6,3-fach, in DU145 Zellen 5,4-fach und in PC-3
Zellen 11-fach höher als in PNF-08 Zellen. Die hierzu gehörende regulatorische miRNA miR-24 war
in den drei Zelllinien DU145, LNCaP und PC-3 herunterreguliert (Tab. 5.2 und 5.8).
Die Expression von ERG war lediglich in VCaP detektierbar, in keiner anderen Zelllinie konnte eine
Expression gemessen werden. Die Expression von miR-145 war in VCaP Zellen zu gering, um sie
detektieren zu können (Tab. 5.2 und 5.8).
5.2.2 mRNA Expression von miRNA Zielgenen in Prostataprimärgeweben
Die Expression von ZEB1 (p≤0,0001, gepaarter t-Test), ZEB2 (p≤0,0001, gepaarter t-Test) und
SEC23A (p=0,0447, gepaarter t-Test) war in den Tumorgeweben signifikant geringer im Vergleich
zum korrespondierenden Normalgewebe (Tab. 5.9, Abb. 5.5A-C), wohingegen die Expression von
MYO6 (p=0,0001, gepaarter t-Test), ZNF217 (p=0,0007, gepaarter t-Test) und ERG (p=0,0447,
gepaarter t-Test) in den Prostatatumorgeweben signifikant höher war als in korrespondierenden
Normalgewebe (Tab. 5.9, Abb. 5.5D-F). Für CUL5, DEDD und IPO7 konnte kein signfikanter
Unterschied zwischen Tumor- und Normalgewebe gemessen werden. Für CUL5 wurde eine 1,2fach geringere Expression im Tumor im Vergleich zum Normalgewebe ermittelt, für DEDD konnte
eine 1,23-fach höhere und für IPO7 eine 1,16-fach höhere Expression im Tumor gemessen werden
(Tab. 5.9).
Tabelle 5.8. Relative Expression der Zielgene in den Zelllinien
Relative Expression von MYO6, ZEB1, ZEB2, SEC23A, ZNF217 und ERG in den Prostatazelllinien.
n.d. = nicht detektierbar, n.b. = nicht bestimmt
Gen
MYO6
ZEB1
ZEB2
SEC23A
ZNF217
ERG
PNF-08
DU145
LNCaP
PC-3
VCaP
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
n.d.
3,19
0,14
0,004
1,49
5,38
n.d.
73,58
0,001
0,0003
1,10
6,25
n.d.
0,98
0,45
0,023
1,63
11,00
n.d.
n.b.
n.b.
n.b.
0,08
n.b.
1,00
Ergebnisse
35
Abbildung 5.5. Relative Expression von ZEB1, ZEB2, SEC23A, MYO6, ZNF217 und ERG
Ermittlung der relative Expression von A) ZEB1, B) ZEB2, C) SEC23A, D) MYO6, E) ZNF217 und
F) ERG in 26 Prostatatumorgewebeproben und korrespondierendem Normalgewebe mittels qRT-PCR.
∗ p≤0,05, gepaarter t-Test
36
Ergebnisse
Tabelle 5.9. Relative Expression von CUL5, DEDD, ERG, IPO7, MYO6, SEC23A, ZEB1, ZEB2
und ZNF217 in den Prostatageweben.
Angegeben sind der Mittelwert der relativen Expression (RQ) der Normalgewebe, der Mittelwert der
RQ Tumorgewebe, das Ratio der RQ Tumor vs. RQ Normal und der p-Wert (gepaarter t-Test).
Gen
CUL5
DEDD
ERG
IPO7
MYO6
SEC23A
ZEB1
ZEB2
ZNF217
Mittelwert
RQ Normal
Mittelwert
RQ Tumor
Ratio Tumor
vs. Normal
p-Wert
1,955
1,155
0,223
2,527
19,41
1,660
5,928
7,462
3,166
1,632
1,424
2,219
2,925
87,78
0,764
2,560
2,419
7,757
0,83
1,23
9,95
1,16
4,52
0,46
0,43
0,32
2,45
0,0648
0,1543
0,0011
0,268
0,0001
0,0007
≤0,0001
≤0,0001
0,0447
5.2.3 Proteinexpression von Sec23A in den Prostataprimärgeweben
Zusätzlich zur mRNA Expression wurde für Sec23A die Proteinexpression in 19 Paaren von
primärem Tumor- und Normalgewebe erhoben. Der 2H4 anti-Sec23A Antikörper erkannte eine
Bande bei ca. 75kDa. Die Bandenintensität wurde mit ImageJ quantifiziert und gegen die Signalintensität von GAPDH normalisiert. Die Intensität von LNCaP Proteinextrakt wurde als 1
gesetzt. In 11 der 19 Fälle (57,9%) war die Sec23A Expression im Tumor reduziert im Vergleich
zum Normalgewebe. In 2 Fällen (10,5%) zeigte sich kein Unterschied und in 6 von 19 Fällen
(31,6%) war die Sec23A Expression im Tumor höher im Vergleich zum Normalgewebe. Insgesamt
konnten wir in der Mehrzahl der Fälle eine reduzierte Proteinexpression im Tumor im Vergleich
zum korrespondierenden Normalgewebe zeigen (p=0,1885) (Abb. 5.6, Szczyrba et al., 2011).
Ergebnisse
37
Abbildung 5.6. Sec23A Proteinexpression in Prostataprimärgeweben
A) Repräsentativer Blot für Sec23A und GAPDH für sechs Paare aus Tumor- und korrespondierendem
Normalgewebe. Über dem Blot angegeben sind die Fallnummern (Fall-Nr.), unter dem Blot angegeben
ist die relative Expression normalisiert auf GAPDH und bezogen auf LNCaP als Referenz. B) Boxplot
der relative Proteinexpression für Sec23A normalisiert auf GAPDH mit LNCaP als Referenz. (Szczyrba
et al., 2011)
38
Ergebnisse
5.3 Funktionelle Analyse des miRNA-Knockdown von miR-200c und miR-375 in
DU145 und LNCaP Zellen
miR-200c und miR-375 waren im Deep Sequencing überexprimiert im Tumor gefunden worden (Kapitel 5.1.1) und diese Überexpression konnte mittels qRT-PCR in den Zelllinien und in Primärgewebe
(Kapitel 5.1.2 und 5.1.4), sowie mittels microArray in einem Set von 20 Primärtumorgeweben mit
korrespondierendem Normalgewebe bestätigt werden (Kapitel 5.1.5). Zur Analyse des funktionellen
Einflusses dieser miRNAs auf Tumorzelllinien wurden DU145 und LNCaP mit anti-miRNA Oligonukleotiden gegen miR-200c und miR-375 transfiziert.
Es wurden anschließend die funktionellen Parameter Proliferation (mittels BrdU ELISA), Viabilität (mittels MTT Assay), Apoptose (mittels Caspase 3/7 Aktivität) und Zytotoxizität (mittels
LDH [Lactatdehydrogenase] Aktivität) gemessen. Die Analyse der funktionellen Parameter erfolgte
24 Stunden nach der Transfektion. Außerdem wurde das Wundheilungs- und Migrationsverhalten
sowie die Invasivität von DU145 Zellen nach miRNA-Knockdown untersucht.
5.3.1 Analyse von Proliferation, Viabilität, Apoptose und Zytotoxizität nach
miRNA-Knockdown
Nach Knockdown von miR-200c, miR-375 und miR-200c/miR-375 zeigten sowohl DU145 als auch
LNCaP Zellen eine erhöhte Proliferation im Vergleich zur Kontrolltransfektion (anti-miR-control)
(Abb. 5.7A). Ebenfalls zeigten DU145 und LNCaP Zellen eine erhöhte Vitalität nach Knockdown
von miR-200c, miR-375 und miR-200c/miR-375 im Vergleich zur Kontrolle mit einer signifikant
höheren Vitalität von LNCaP Zellen nach anti-miR-200c/miR-375 Transfektion (p=0,0022) (Abb.
5.7B).
Die LDH-Aktivität war für die, mit anti-miRNA Oligonukleotiden gegen miR-200c, miR-375
und miR-200c/miR-375 transfizierten, DU145 und LNCaP Zellen signifikant geringer als für die
kontrolltransfizierten Zellen (DU145: miR-200c p=0,0206, miR-375 p=0,0008, miR-200c/375
p=0,0008; LNCaP: miR-200c p=0,0244, miR-375 p=0,0008, miR-200c/375 p=0,0016, Student’s
t-Test) (Abb. 5.7C). Bei der Caspase 3/7 Aktivität zeigte sich in DU145 Zellen für den Knockdown
von miR-200c eine erhöhte Caspase 3/7 Aktivität von 11%, nach Knockdown von miR-375 und
miR-200c/miR-375 zeigten DU145 Zellen eine signifikant stärkere Apoptoseinduktion (p<0,001
und p<0,01, Student’s t-Test). Für LNCaP Zellen konnte nach Knockdown von miR-200c kein
Unterschied der Caspase 3/7 Aktivität gemessen werden, nach Knockdown von miR-375 und
miR-200c/miR-375 wurde eine etwa 20% geringere Caspase 3/7 Aktivität gemessen (Abb. 5.7D).
Ergebnisse
39
Abbildung 5.7. Proliferation, Viabilität, Zytotoxizität und Apoptose in DU145 und LNCaP
Zellen nach miRNA Knockdown.
DU145 und LNCaP Zellen wurden mit einer Kontroll-miRNA (anti-miR-control) und anti-miRNAs gegen miR-200c, miR-375 und beide miRNAs in Kombination transfiziert und A) Proliferation (BrdU
ELISA), B) Viabilität (MTT), C) Zytotoxizität (LDH-Aktivität) und D) Apoptose (Caspase 3/7 Aktivität) gemessen. Der Wert der Kontrolle (anti-miR-control) wurde als 100% gesetzt. ∗ p<0,05, ∗∗
p<0,01, ∗ ∗ ∗ p<0,001
40
Ergebnisse
5.3.2 Wundheilungsassay nach miRNA-Knockdown
DU145 Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesäht und mittels Cell Culture Inserts ein definierter
Spalt von 500 µm eingebracht. Die Zellen wurden nach der Transfektion mit anti-miRNA Oligonukleotiden gegen miR-200c und miR-375 bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. In jeder Kavität wurde
über eine Zeitraum von 30 h pro Stunde ein Foto gemacht. Für die Ermittlung des Maßes an
Wundheilungsverhalten wurde mit der Bildanalysesoftware ImageJ die Fläche des Spaltes gemessen
und die Veränderung in Relation (in Prozent) zum Zeitpunkt Null gesetzt.
DU145 Zellen zeigten nach Knockdown von miR-200c einen signifikanten Unterschied im Wundheilungsverhalten im Vergleich zu den Zellen, welche mit den Kontroll-anti-miRNA Oligonukleotiden
transfiziert wurden. Sowohl beim Knockdown von miR-200c als auch beim Knockdown von miR-375
war bereits nach 6 h ein beschleunigtes Wundheilungsverhalten im Vergleich zu den kontrolltransfizierten DU145 Zellen zu sehen, welches sich bis 18 bzw. 24h noch verstärkte. Nach 18 bzw. 24h
war der Spalt bei den DU145 Zellen mit miR-200c Knockdown signifikant mehr geschlossen im Vergleich zu den kontrolltransfizierten Zellen (Abb. 5.8A). Ebenso zeigten DU145 Zellen, welche mit
anti-miR-375 Oligonukleotiden transfiziert wurden, ein signifikant schnelleres Wundheilungsverhalten nach 24h (Abb. 5.8B). Beim kombinierten Knockdown von miR-200c und miR-375 zeigte sich
kein Unterschied zu den kontrolltransfizierten Zellen (Abb. 5.8C). Eine mögliche Erklärung hierfür
ist, dass sich die beiden anti-miRNAs gegenseitig inhibieren.
5.3.3 Invasions- und Migrationsverhalten nach miRNA Knockdown
Zusätzlich zum Wundheilungsverhalten wurde das Invasions- und Migrationsverhalten von DU145
Zellen nach Knockdown von miR-200c, miR-375 und miR-200c/miR-375 beobachtet. Hierzu wurden DU145 Zellen mit RPMI mit 2% FCS in mit BD Matrigel™ (Basement Membrane Extract)
beschichtete (Invasion) bzw. unbeschichtete (Migration) Zellkulturinserts eingebracht (Abb. 5.9)
und mit den anti-miRNA-Oligonukleotiden entsprechend der Transfektion in 24-Well-Platten transfiziert (Tab. 8.2). In den Wells befand sich RPMI mit 10% FCS als Lockstoff. Nach 48h wurden die
hindurch gewanderten Zellen mit Calcein-AM (Acetoxymethylester) markiert. Dieser Fluoreszenzfarbstoff wird durch die Membran lebender Zellen transportiert, wo dann die Acetoxymethylgruppe
abgespalten wird. Das Calcein ist dann in der Lage, an Calciumionen in der Zelle zu binden, was
in einer grünen Fluoreszenz resultiert, welche im Mikroplatten-Fluorometer bei einer Anregung bei
492 nm und einer Emission bei 515 nm gemessen wurde.
Beim Migrationsverhalten zeigten DU145 Zellen für keinen der miRNA Knockdowns eine signifikante Veränderung. Es wurde eine reduzierte Migration für alle drei miRNAs Knockdowns von
10% (anti-miR-200c), 7% (anti-miR-375) und 9% (anti-miR-200c/375) gefunden (Abb. 5.10A).
Ergebnisse
41
Abbildung 5.8. Wundheilungsverhalten von DU145 Zellen nach miRNA Knockdown
Wundheilungsverhalten von DU145 Zellen nach Knockdown von A) miR-200c, B) miR-375 und C)
miR-200c und miR-375 in Kombination. ∗ p≤0,05
42
Abbildung 5.9. Modell für Migration bzw. Invasion mittels Zellkulturinserts
Die Zellen wurden in die Zellkulturinserts mit Mangelmedium eingesät und transfiziert. In
die Zellkulturschale wurde Medium mit 10% FCS gegeben. Die Membran der Inserts hatte
8 µm Poren und war für den Migrationsassay unbeschichtet, für den Invasionsassay wurde
die Membran mit Basement Membrane Extract (BD Matrigel™) beschichtet.
Abbildung 5.10. Migrations- und Invasionsverhalten von DU145 Zellen nach Kockdown von miR-200c, miR-375 und miR-200c/miR-375
DU145 Zellen wurden in Zellkulturinserts ausgesät und mit anti-miRNAs gegen miR-200c,
miR-375 und beide miRNAs in Kombination transfiziert. Die hindurch gewanderten Zellen
wurden mit Calcein AM gefärbt, die Fluoreszenz gemessen und so das A) Migrations- und
B) Invasionsverhalten bestimmt. ∗ p≤0,05
Ergebnisse
Ergebnisse
43
Beim Invasionsverhalten zeigten DU145 Zellen nach Knockdown von allen drei miRNA eine
verstärkte Invasion von 22% (anti-miR-200c, p=0,0435), 19% (anti-miR-375 ) und 13% (anti-miR200c/375 ) (Abb. 5.10B).
5.4 Funktionelle Analyse der ektopen Expression bzw. des Knockdowns von
Sec23A in DU145 und LNCaP Zellen
miR-200c und miR-375 waren im Tumor überexprimiert gefunden worden. Als ein Zielgen beider
miRNAs konnte SEC23A mittels Luciferaseassay bestätigt werden (Szczyrba et al., 2011). Weiterhin
wurde eine geringere Expression von SEC23A im Tumor (invers zu den miRNAs) in Primärgeweben
von Kollektiv 1 mittels qRT-PCR gefunden.
Zur funktionelle Analyse der ektopen Expression bzw. des Knockdowns von Sec23A wurden DU145
und LNCaP Zellen mit dem Expressionsvektor für Sec23A bzw. der gegen Sec23A gerichteten siRNA
transfiziert. Es wurden anschließend die funktionellen Parameter Proliferation (mittels BrdU ELISA), Viabilität (mittels MTT Assay), Apoptose (mittels Caspase 3/7 Aktivität) und Zytotoxizität
(mittels LDH Aktivität) gemessen. Die Analyse der funktionellen Parameter erfolgte 24 Stunden
nach der Transfektion. Außerdem wurde das Wundheilungsverhalten von DU145 und LNCaP Zellen
nach ektoper Expression bzw. Knockdown von Sec23A untersucht.
5.4.1 Analyse von Proliferation, Viabilität, Apoptose und Zytotoxizität nach ektoper
Expression bzw. Knockdown von Sec23A
Nach Knockdown von Sec23A zeigten DU145 Zellen eine erhöhte Proliferation (um 17,6 ± 17,9%
höher im Vergleich zur Kontrolle), nach der ektopen Expression von Sec23A eine verminderte
Proliferation (um 14,5±13,5% niedriger im Vergleich zur Kontrolle). LNCaP Zellen zeigten nach
Knockdown von Sec23A keine Veränderung der Proliferation im Vergleich zur Kontrolle, nach
Überexpression von Sec23A zeigten LNCaP Zellen eine signifikant geringere Proliferation (um
28,7% im Vergleich zur Kontrolle, p=0,0065, Student’s t-Test) (Abb.5.11A).
DU145 Zellen waren sowohl nach Überexpression (um 24,5% im Vergleich zur Kontrolle, p=0,0033)
als auch Knockdown (um 13% im Vergleich zur Kontrolle, p=0,0043) von Sec23A signifikant weniger vital. LNCaP Zellen waren nach Knockdown von Sec23A ebenfalls signifikant weniger vital (um
24,8% im Vergleich zur Kontrolle, p=0,0295) und auch nach Überexpression von Sec23A zeigten
LNCaP Zellen eine geringere Viabilität (12%) (Abb.5.11B).
DU145 waren nach Knockdown von Sec23A im Mittel 48% stärker von Zytotoxizität betroffen
und nach ektoper Expression von Sec23A etwa 24% weniger letal, jedoch sind die Unterschiede
nicht signifikant. LNCaP Zellen zeigen keinen eindeutigen Unterschied bei der LDH-Aktivität (3%
44
Ergebnisse
mehr Zytotoxizität nach Knockdown und 10,5% weniger Zytotoxizität nach ektoper Expression).
(Abb.5.11C).
Die Messung der Apoptoserate in DU145 und LNCaP Zellen zeigte keinen Unterschied nach
Knockdown von Sec23A, jedoch eine höhere Caspase 3/7 Aktivität in beiden Zelllinien nach
Überexpression von Sec23A, die allerdings nicht signifikant unterschiedlich zur Transfektion mit
dem Kontrollvektor war (DU145: um 124,14 ± 63,77%, LNCaP um 57,2 ± 28,7%) (Abb.5.11D).
5.4.2 Wundheilungsassay nach ektoper Expression bzw. Knockdown von Sec23A
DU145 und LNCaP Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und mittels Cell Culture Inserts ein
definierter Spalt von 500 µm eingebracht. Die Zellen wurden nach der Transfektion mit einem Expressionsvektor für SEC23A (pCEP4-Sec23A) bzw. antisense Oligonukleotiden gegen SEC23A (si
Sec23A) bei 37°C und 5% CO2 kultiviert (Kapitel 8.6.7 und 8.6.9). Die Auswertung des Maßes an
Wundheilung erfolgte wie in Kapitel 5.3.2 beschrieben.
DU145 Zellen zeigten nach ektoper Expression von Sec23A bereits nach 6 h ein geringeres Wundheilungsverhalten als jene DU145 Zellen, welche mit dem Kontrollvektor (pCEP4) transfiziert wurden.
Nach 18h war dieser Unterschied signifikant und auch nach 24h und 30h zeigten DU145 Zellen
mit ektop exprimiertem Sec23A ein signifikant geringeres Wundheilungsverhalten (Abb. 5.12A+B).
In LNCaP Zellen mit ektop exprimiertem Sec23A war ebenfalls die Tendenz zu einem geringeren
Wundheilungsverhalten zu sehen, jedoch war diese nicht signifikant. Nach 18, 24 und 30h wurde
zwischen LNCaP Zellen mit überexprimiertem Sec23A und Kontrolle jeweils ein Unterschied von
3,2% gemessen. (Abb. 5.13A+B).
Für DU145 Zellen mit einem Knockdown von Sec23A war nach 6 h ein verstärktes Wundheilungsverhalten zu sehen, nach 18 und 24h war das Wundheilungsverhalten von DU145 Zellen mit
Knockdown von Sec23A signifikant stärker im Vergleich zu den kontrolltransfizierten Zellen (Abb.
5.12C+D). LNCaP Zellen, welche mit siRNA gegen Sec23A transfiziert wurden, zeigten ebenfalls
ein beschleunigtes Wundheilungsverhalten im Vergleich zu den kontrolltransfizierten Zellen, welches
jedoch nicht signifikant unterschiedlich war. Nach 12h wurde ein Unterschied von 2,2%, nach 18h
von 3,8%, nach 24h von 2,8% und nach 30h von 2,5% gemessen (Abb. 5.13C+D).
5.4.3 Invasion- und Migrationsverhalten nach ektoper Expression bzw. Knockdown von
Sec23A
Zusätzlich zum Wundheilungsverhalten wurde das Invasions- und Migrationsverhalten von DU145
Zellen nach Knockdown von Sec23A beobachtet. Die Analyse von Migrations- und Invasionsverhalten erfolgte wie in Kapitel 5.3.3 beschrieben. Die Transfektion erfolgte wie in Kapitel 8.6.7 und
8.6.9 beschrieben.
Ergebnisse
45
Abbildung 5.11. Proliferation, Viabilität, Zytotoxizität und Apoptose in DU145 und LNCaP
Zellen nach Transfektion des Sec23A Expressionsvektors bzw. der Sec23A siRNA.
DU145 und LNCaP Zellen wurden mit einem SEC23A Expressionsvektor (pCEP4-Sec23A) bzw. dem
leeren Kontrollvektor (pCEP4) und einem siRNA Pool gegen SEC23A bzw. einer Kontroll-siRNA (si
control) transfiziert und 24 h nach Transfektion A) Proliferation (BrdU ELISA), B) Viabilität (MTT),
C) Zytotoxizität (LDH-Aktivität) und D) Apoptose (Caspase 3/7 Aktivität) gemessen. ∗ p≤0,05; ∗∗
p≤0,01
46
Ergebnisse
Abbildung 5.12. Wundheilungsverhalten von DU145 Zellen nach Knockdown und ektoper Expression von Sec23A
A) Wundheilungsverhalten von DU145 Zellen nach ektoper Expression von Sec23A (pCEP4-Sec23A),
B) repräsentative Bilder des 500 µm Spaltes zum Zeitpunkt 0, 15 und 30h nach ektoper Expression von
Sec23A (pCEP4-Sec23A), C) Wundheilungsverhalten von DU145 Zellen nach Knockdown von Sec23A
(si Sec23A), D) repräsentative Bilder des 500 µm Spaltes zum Zeitpunkt 0, 15 und 30h nach Knockdown
von Sec23A (si Sec23A). ∗ p<0,05
Ergebnisse
47
Abbildung 5.13. Wundheilungsverhalten von LNCaP Zellen nach Knockdown und ektoper
Expression von Sec23A
A) Wundheilungsverhalten von LNCaP Zellen nach ektoper Expression von Sec23A (pCEP4-Sec23A),
B) repräsentative Bilder des 500 µm Spaltes zum Zeitpunkt 0, 15 und 30h nach ektoper Expression von
Sec23A (pCEP4-Sec23A), C) Wundheilungsverhalten von LNCaP Zellen nach Knockdown von Sec23A
(si Sec23A), D) repräsentative Bilder des 500 µm Spaltes zum Zeitpunkt 0, 15 und 30h nach Knockdown
von Sec23A (si Sec23A). ∗ p<0,05
48
Ergebnisse
Nach Knockdown von Sec23A zeigten DU145 Zellen ein um 9% vermindertes Migrationsverhalten
im Vergleich zur siRNA Kontrolle. Nach ektoper Expression von Sec23A zeigten DU145 Zellen eine
um 18% verstärkte Migration im Vergleich zur Leervektorkontrolle (Abb. 5.14A).
Bei der Beobachtung der Invasion von DU145 Zellen nach Knockdown bzw. ektoper Expression
von Sec23A konnten keine Unterschiede zur Kontrolle gefunden werden (Abb. 5.14B).
Abbildung 5.14. Migration- und Invasionsverhalten von DU145 Zellen nach ektoper Expression
bzw. Knockdown von Sec23A.
DU145 Zellen wurden in Zellkulturinserts ausgesät und mit mit einem Expressionsvektor für SEC23A
(pCEP4-Sec23A) und einem siRNA Pool gegen SEC23A (siSec23A) transfiziert. Die hindurch gewanderten Zellen wurden mit Calcein AM gefärbt, die Fluoreszenz gemessen und so das A) Migrations- und
B) Invasionsverhalten bestimmt.
Ergebnisse
49
5.5 miRNA in situ Hybridisierung
Solide Tumoren enthalten neben den malignen Zellen noch weitere Zellen wie Stromazellen und
Lymphozyten. Um die miRNA-exprimierenden Zellen im Tumor zu identifizieren, wurde in situ Hybridisierung der miRNAs durchgeführt. Hierfür wurden LNA™ modifizierte (Locked Nucleic Acid
Oligonukleotidsonden gegen miR-375, miR-200c, miR-143 und miR-145 verwendet.
In normalem Prostatagewebe wurde die stärkste Expression aller vier miRNAs in den Epithelzellen gefunden. miR-375 (Abb. 5.15A) und miR-143 (Abb. 5.15E) zeigten eine zytoplasmatische
Färbung der Epithelzellen, wohingegegen Nicht-epitheliale Zellen keine Färbung zeigten. miR-200c
(Abb. 5.15C) und miR-145 (Abb. 5.15G) zeigten ein perinukleäres Färbemuster. miR-145 konnte
auch in den endothelialen Zellen der Blutgefäße und in einigen Stromazellen gefunden werden.
Im korrespondierenden Tumorgewebe war die Expression von miR-375 (Abb. 5.15B) und miR-200c
(Abb. 5.15D) beschränkt auf die Tumorzellen, wohingegen die Expression von miR-143 (Abb.
5.15F) und miR-145 (Abb. 5.15H) eine größere Heterogenität aufwies.
Färbungen mit einer unspezifischen (scramble-miR) Kontrollsonde zeigten eine schwache Färbung,
welche mit keinem Färbemuster der vier spezifischen miRNA-Sonden übereinstimmte (Abb. 5.15I,J)
(Wach et al., 2011). Die miRNA Expression kann somit als spezifisch für epitheliale Zellen bzw. als
tumorspezifisch angesehen werden. Im Umkehrschluss bedeutet dies auch, dass die bereits gefundenen miRNA-Expressionsprofile tumorspezifisch sind und nicht von Stromazellen oder Lymphozyten
beeinflusst sind.
50
Ergebnisse
Abbildung 5.15. Nachweis der miRNA Expression in primären Prosatatagewebeschnitten mittels miRNA in situ Hybridisierung.
Primäre Prostatagewebeschnitte wurden mit Sonden gegen A,B) miR-375 in A) Normal- und B) Tumorgewebe, C,D miR-200c in C) Normal- und D) Tumorgewebe, E,F) miR-143 in E) Normal- und F)
Tumorgewebe, G,H) miR-145 in G) Normal- und H) Tumorgewebe und gegen die scramble Kontrollsonde in I) Normal- und J) Tumorgewebe.
Der Größenstandard entspricht 200 µm. Der markierte Ausschnitt ist als Vergrößerung im linken unteren
Bereich der jeweiligen Abbildung dargestellt.
Ergebnisse
51
5.6 Diagnostisches Potential von miRNAs
Da verschiedene miRNAs in Tumor- und Normalgewebe differentiell exprimiert gefunden wurden,
sollte überprüft werden, ob anhand der unterschiedlichen Expressionsmuster eine Unterscheidung
zwischen Tumor- und Normalgewebe möglich ist. Die miRNAs miR-375, miR-200c, miR-143 und
miR-145 wurden als potentielle Marker ausgewählt und mittels binärer logistischer Regression deren diagnostisches Potential analysiert. Im Patientenkollektiv 1, welches als exploratives Datenset
verwendet wurde, stellte sich heraus, dass miR-375 mit 67,3% korrekt klassifizierter Proben der
beste positiv diskriminierende Faktor und miR-145 mit 71,2% korrekt klassifizierter Proben der
beste negativ diskriminierende Faktor war. miR-200c war in diesem Kollektiv kein signifikant diskriminierender Faktor und wurde daher von den weiteren Analysen ausgeschlossen.
Mittels vollständiger logistischer Regression wurde eine Kombination der miRNAs miR-375, miR145 und miR-143 auf das explorative Datenset angewandt. In diesem Datenset war diese Kombination aus drei miRNAs in der Lage, 90,4% der Proben richtig zu klassifizieren. Diese miRNAKombination wurde daraufhin auf das Patientenkollektiv 2 (Testdatenset) angewandt und konnte
71% der Proben korrekt klassifizieren. Bei einer Kombination der beiden Datensets mit dann insgesamt 76 Patienten konnte dieses Set aus drei miRNAs 77,6% der Proben korrekt klassifizieren.
Um das Differenzierungspotential von miR-375, miR-145 und miR-143 genauer zu untersuchen,
wurden Receiver Operating Characteristics (ROC) Analysen durchgeführt. In Abb. 5.16 finden sich
die ROC Kurven die drei miRNAs einzeln sowie für die drei miRNAs in Kombination für Kollektiv
1 (Abb. 5.16A) und Kollektiv 2 (Abb. 5.16B). Für jede miRNA und für die Kombination von miR375, miR-145 und miR-143 wurden die Area under the curve (AUC), das 95% Konfidenzintervall,
der p-Wert und der Prozentsatz korrekt klassifizierter Proben ermittelt (Tab. 5.10). Die AUC (area
under the curve) ist bei der ROC Analyse das Maß für die Trennschärfe des Test. Der Wert der
für die AUC liegt zwischen 0 und 1, wobei ein Wert näher an 1 für eine höhere Trennschärfe
steht.In allen drei Datensets stellte sich heraus, dass eine Kombination der drei miRNAs das beste
diagnostische Potential besitzt.
Des weiteren wurde das diagnostische Potential a) des Ratios von miR-375 als bestem positiv
diskriminierendem Faktor und miR-145 als bestem negativ diskriminierendem Faktor und b) des
Ratios von miR-375 und miR-143 untersucht.
Der für das Ratio von miR-375/miR-145 errechnete Median im explorativen Datenset war in den
Normalgeweben 24,1 (0,57 bis 153,8) und in den Tumorgeweben 224,2 (19.84 to 2763). Die ROC
Kurve hatte eine AUC von 0,920 mit einem 95% Konfidenzintervall von 0,847 bis 0,993 und einem
p-Wert von <0.0001. Der für das Ratio von miR-375/miR-143 errechnete Median war in den
Normalgeweben 8,77 (0,22 bis 26,56) und in den Tumorgeweben 46,69 (7,36 to 309). Die ROC
Kurve hatte eine AUC von 0,932 mit einem 95% Konfidenzintervall von 0,861 bis 1,000 und einem
p-Wert von <0.001 (Tab. 5.10) (Wach et al., 2011).
52
Ergebnisse
Tabelle 5.10. Diagnostisches Potential von miRNAs
Es wurden Receiver Operating Characteristics Analysen durchgeführt, angegeben sind die Area under the curve (AUC), das 95% Konfidenzintervall (95% CI), der p-Wert und der Prozentsatz korrekt
klassifizierter Proben.
miRNA
AUC
95% CI
p-Wert
Korrekte Klassifikation (%)
Patientenkollektiv 1 = exploratives Datenset (N = 26)
375
0,753 0,623–0,883
0,002
67,3
200c
0,592 0,435–0,749
0,257
48,1
143
0,776 0,645–0,906
0,001
71,2
145
0,800 0,678–0,921 <0,0001
71,2
375, 143, 145
0,9556 0,903–1.000 <0,0001
90,4
Ratio(375/145) 0,920 0,847-0,993 <0,0001
Ratio(375/143) 0,932 0,861-1,000 <0,001
375
200c
143
145
375, 143, 145
375
200c
143
145
375, 143, 145
Patientenkollektiv 2 = Testdatenset (N = 50)
0,663 0,555–0,770
0,005
65,0
0,609 0,498–0,719
0,061
57,0
0,663 0,556–0,770
0,005
64,0
0,704 0,600–0,8,7 <0,0001
66,0
0,742 0,644–0,840 <0,0001
71,0
Kombiniertes Datenset (N = 76)
0,686 0,602–0,771 <0,0001
0,557 0,466–0,649
0,219
0,699 0,615–0,783 <0,0001
0,730 0,649–0,811 <0,0001
0,810 0,739–0,881 <0,0001
66,4
52,0
61,2
67,1
77,6
Ergebnisse
53
Abbildung 5.16. ROC Kurven der miRNAs in den zwei Kollektiven
A) ROC Kurven für das Patientenkollektiv 1 (N=26) für die miRNAs miR-143, miR-145, miR-375 und
alle drei miRNAs in Kombination, B) ROC Kurven für das Patientenkollektiv 2 (N=50) für die miRNAs
miR-143, miR-145, miR-375 und alle drei miRNAs in Kombination.
54
Ergebnisse
5.7 Assoziation von miRNA Expressionsprofilen und klinisch-pathologischen
Parametern
Die Expressionslevel der miRNAs miR-200c, miR-375, miR-145, miR-143, miR-141, miR-26a, miR26b und miR-101 wurden mit den klinisch-pathologischen Parametern Gleason Score, PrimärGleason Score, welche das vorherrschende Differenzierungsmuster des Tumors repräsentiert, und
T-Stadium korreliert (bivariate Korrelation, Spearman-Rho). Hierbei wurde im Patientenkollektiv
1 (N=26) eine positive Korrelation der miR-141 Expression mit dem Primär-Gleason Score und
Gleason Score gefunden (Gleason Korrelationskoeffizient ρ=0,601, p=0,001, Primär-Gleason Score
ρ=0,578, p=0,002, Spearman-Rho). Dies bedeutet, dass die Expression von miR-141 höher ist, je
höher der (Primär-) Gleason Score ist. Es konnte in diesem Kollektiv für keine der anderen miRNAs
eine Korrelation zwischen miRNA-Expression und klinisch-pathologischem Parameter festgestellt
werden.
Im Patientenkollektiv 2 (N=50) konnte die positive Korrelation der miR-141 -Expression mit
dem Gleason Score bestätigt werden (ρ=0,388, p=0,009, Spearman-Rho), allerdings nicht mit
dem Primär-Gleason Score. Des weiteren konnte eine positive Korrelation der miR-26a Expression mit Gleason Score (ρ=0,343, p=0,015, Spearman-Rho) und Primär-Gleason Score (ρ=0,519,
p<0,0001, Spearman-Rho), sowie eine positive Korrelation der miR-26b mit dem Primär-Gleason
Score (ρ=0,297, p=0,036, Spearman-Rho) gezeigt werden. Für keine der miRNAs im Patientenkollektiv 2 bestand eine Korrelation zwischen miRNA-Expression und T-Stadium.
Im kombinierten Datenset konnte die positive Korrelation der miR-141 -Expression mit Gleason Score (ρ=0,313, p=0,006, Spearman-Rho) und Primär-Gleason Score (ρ=0,336, p=0,003,
Spearman-Rho) bestätigt werden. Darüber hinaus zeigte sich eine positive Korrelation von miR200c mit dem Gleason Score (ρ=0,259, p=0,024, Spearman-Rho), eine negative Korrelation von
miR-375 mit dem Primär-Gleason Score (ρ=-0,255, p=0,026, Spearman-Rho) und von miR-26a
mit dem Primär-Gleason Score (ρ=0,306, p=0,007, Spearman-Rho).
Aus diesen Daten lässt sich die Hypothese ableiten, dass die beiden miRNAs miR-141 und miR26a mit der Tumorentwicklung zusammenhängen. Einerseits könnte die Expression der miRNAs
vom Differenzierungsgrad des Tumors abhängen, andererseits könnte auch die miRNA Expression
für die Tumordifferenzierung wichtig sein.
Ergebnisse
55
5.8 ERG als Zielgen der miR-145
Ein weiteres Zielgen der miR-145, welches durch bioinformatische Recherche vorhergesagt wurde (mirecords.biolead.org), ist die 3’UTR von v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog
(ERG).
Dies konnten wir durch Luciferase Assays bestätigen (Hart et al., 2012).
Des weiteren wurde die mRNA Expression von ERG und der ERG Spleißvarianten mittels qRT-PCR
sowie die Proteinexpression mittels Western Blot untersucht. Weitere miRNAs, welche in der 3’UTR
von ERG potentielle Bindestellen besitzen, sind miR-9, miR-27ab, miR-190, miR-128, miR-142-3p,
miR-30abcde und miR-219.
5.8.1 ERG mRNA Expression in Prostatazelllinien und primären Prostatageweben
Zunächst wurde die ERG Expression in den Prostatakarinomzelllinien VCaP, DU145, LNCaP und
PC-3 sowie PNF-08 mittels qRT-PCR gemssen. Aufgrund des niedrigen Expressionslevels konnten
für die Zelllinien DU145, LNCaP, PC-3 und PNF-08 keine Expressionsdaten für ERG erhoben
werden. Lediglich in VCaP Zellen konnte die Expression von ERG gemessen werden.
Des weiteren wurde die ERG Expression in den 26 Prostataprimärgewebepaaren des Kollektivs 1
gemessen. In 18 von 26 Fällen (69%) wurde eine höhere ERG Expression im Tumor im Vergleich
zum korrespondierenden Normalgewebe gemessen (p=0,0011, gepaarter t-Test) (Abb. 5.17A).
Für ERG sind verschiedene Spleißvarianten bekannt. In der Gendatenbank des National Center
for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) sind 4 verschiedene Spleißvarianten, in der SWISS-Prot Datenbank (www.uniprot.org) sind 6 Isoformen gelistet. Da die die
Nomenklatur bei NCBI und bei SWISS-Prot unterschiedlich ist, wurde die Nomenklatur dieser Arbeit an der SWISS-Prot Datenbank orientiert. Die jeweiligen entsprechenden Spleißvarianten und
Isoformen sind in Tab. 5.11 beschrieben. Für die SWISS-Prot Isoformen 7 und 8 ist keine entsprechende Variante bei NCBI vertreten. Es wurde die Expression für die Isoformen ERG-2, ERG-5 und
ERG-2/3 in Kombination gemessen. Da ERG-3 die längste Spleißvariante ist und keine einzigartige
Sequenz im Vergleich zu den anderen Varianten besitzt kann die Expression dieser Variante nur in
Kombination gemessen werden.
Für ERG-2 wurde in 84% der Fälle eine höhere Expression im Tumor (p=0,0021, Student’s t-Test)
gemessen, für ERG-5 in 96% eine niedrigere Expression im Tumor (p=0,0116, Student’s t-Test)
und für die Kombination aus ERG-2 und ERG-3 in 84% eine höhere Expression im Tumor, wobei
dieser Unterschied nicht signifikant war (p=0,2184, Student’s t-Test) (Abb. 5.17B).
56
Ergebnisse
Abbildung 5.17. Expression von ERG und der ERG Spleißvarianten
Mittels qRT-PCR wurde in 26 Paaren aus Tumorgewebe und korrespondierendem Normalgewebe A)
die relative ERG Expression und B) die relative Expression der ERG Spleißvarianten ERG-2, ERG-2/3
und ERG-5 ermittelt. ∗ p<0,05
Tabelle 5.11. NCBI Spleißvarianten und entprechende SWISS-Prot Isoformen
Angegeben sind die Anzahl der Aminosäuren (AA) und Molekulargewicht (MW in kDa) der entsprechenden Spleißvarianten.
NCBI
ERG-1
ERG-2
ERG-3
ERG-5
ERG-7
ERG-8
Variante
Variante
Variante
Variante
4
2
3
1
(NM
(NM
(NM
(NM
001136155.1)
004449.4)
001136154.1)
182918.3)
SWISS-Prot
AA
Isoform
Isoform
Isoform
Isoform
Isoform
Isoform
387
462
486
479
317
325
1
2
3
5
7
8
MW
AA
AA
AA
AA
AA
AA
43,97
52,03
54,61
53,84
35,29
36,54
kDa
kDa
kDa
kDa
kDa
kDa
Ergebnisse
57
5.8.2 ERG Protein Expression in Prostatazelllinien und primären Prostatageweben
Wie bereits beschrieben, liegt das ERG Protein in sechs verschiedenen Isoformen vor. Eine schematische Darstellung dieser Isoformen mit den jeweiligen deletierten Regionen findet sich in Abb.
5.18, die Anzahl der Aminosäuren und das Molekulargewicht wurden bereits in Tab. 5.11 aufgeführt. Zur Generierung eines ERG spezifischen Antiserums wurde ein rekombinantes GST-ERG
Abbildung 5.18. Schematische Darstellung der ERG Isoformen
Schematische Darstellung der sechs ERG Isoformen, wie sie in der SWISS-Prot Datenbank gelistet sind,
mit Angabe der Aminosäuren gesamt und der deletierten Regionen.
Fusionsprotein verwendet. Hierfür wurde mit den Primern 5‘-Erg-GST-Bam-CGG GAT CCA AGG
TCC ATG GGA AGC GCT AC und 3‘-Erg-GST-Xho-CCG CTC GAG GTA GTA AGT GCC CAG
ATG ein 300 bp Fragement der kodierenden Region von ERG amplifiziert. Diese Region kodiert für
die 100 C-terminalen Aminosäuren von ERG-5 und wurde in den XhoI-BamHI verdauten Vektor
pGEX-4T-1 (Amersham, GE Healthcare, Munich) kloniert. Die Immunisierung von Hasen und die
Aufreinigung der Antiseren erfolgte in der Arbeitsgruppe von Dr. Elisabeth Kremmer, HelmholtzZentrum, München. Der Spezifitätstest erfolgte mittels ELISA und Western Blot (Hart et al., 2012;
Pfuhl et al., 2008).
Für die Analyse der ERG Proteinexpression wurde zunächst die Proteinexpression der ERG Isoformen in den Prostatakarzinomzelllinien VCaP, LNCaP und DU145 sowie in Extrakten von PNF-08
mittels Western Blot analysiert. In PNF-08 Zellen konnte eine schwache ERG-3-spezifische Bande
bei 54,6 kDa und eine dominierende ERG-5 Bande bei 53,8 kDa detektiert werden. In Extrakten
von DU145 Zellen konnte nur ERG-2 bei 52 kDa detektiert werden, wohingegen diese ERG-2 spezifische Bande in VCaP Zellen nur schwach und in LNCaP Zellextrakten gar nicht zu erkennen war.
Die ERG-1 Isoform (43,9 kDa) wurde deutlich in VCaP und LNCaP Zellen exprimiert.
Des weiteren wurde das Kollektiv von 26 Paaren aus Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe auf die ERG Proteinexpression analysiert. Es wurden Banden auf der Höhe von etwa 52
58
Ergebnisse
kDa (ERG-2), 54 kDa (ERG-3 oder ERG-5) und eine Bande auf Höhe von 44 kDa (ERG-1) detektiert (Abb. 5.19). Beim Vergleich von Normal- und Tumorgewebe zeigten sich tumorassoziierte
Veränderungen der Expression der ERG-Isoformen. In den meisten Fällen konnte eine Verstärkung
des ERG-2 Signales und/oder das zusätzliche Erscheinen der ERG-1 Bande vermerkt werden. In
drei Proben wurde eine zusätzliche Bande bei etwa 35 kDa und in drei weiteren Fällen eine Bande bei 24 kDa gefunden. Der Ursprung dieser Banden bleibt jedoch unklar, da die SWISS-Prot
Datenbank zwar noch Isoformen bei 36,5 (ERG-8), 35,2 (ERG-7) und 24,0 kDa (TMPRSS2-ERG
prostate cancer specific protein isoform 1) angibt, diesen jedoch das Epitop fehlt, gegen welches
der Antikörper gerichtet ist (die 100 C-terminalen Aminosäuren von ERG-3).
Zur Quantifizierung der Proteinmenge wurden die Membranen mit einem anti-GAPDH Antikörper
inkubiert. Die relative ERG Proteinmenge wurde durch Normalisierung auf die endogene Kontrolle
der jeweiligen Probe ermittelt. In 15 von 26 Fällen (58%) war die Gesamtmenge des ERG-Proteins
(Summe der Färbungsintensität der Isoformen) im Tumor höher im Vergleich zum Normalgewebe
(p=0,015, gepaarter t-Test). ERG-3/5 (54 kDa) war in 19 von 26 (73%) Fällen im Tumor reduziert, ERG-2 war in 20 von 26 Fällen (81%) erhöht, ERG-1 (44 kDa) war in 19 von 26 Fällen
(73%) erhöht und trat spezifisch nur im Tumorgewebe auf. 12 von 26 Fällen (46.2%) zeigten eine
veränderte Expression aller drei Isoformen.
5.8.3 Der ERG Genfusionsstatus beeinflusst die ERG mRNA Expression
Die häufigste genetische Veränderung im Prostatakarzinom ist die Fusion von ERG mit dem
TMPRSS2 Gen, welches ERG unter die Kontrolle des androgen-responsiven TMPRSS2-Promotors
bringt (Tomlins et al., 2005). Die 26 Prostatatumoren des Kollektivs 1 wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Sven Perner (Institut für Prostatakarzinomforschung, Universitätsklinikum Bonn)
mittels break-apart Fluoreszence in situ hybridization (FISH) (Scheble et al., 2010) auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit der TMPRSS2-ERG Genfusion untersucht. Von den 26 vorhandenen
Gewebeproben konnten 5 aufgrund von unzureichendem Gewebe oder schwachem Hybridisierungssignal nicht ausgewertet werden. Von den verbleibenden 21 Proben zeigten 12 (57%) das Wildtypallel und 9 (43%) die TMPRSS2-ERG Fusion. Bivariate Korrelation zeigte eine direkte Korrelation
zwischen dem ERG Genfusionsstatus und der ERG mRNA Expression (p=0,002, Spearman-Rho;
N=20).
Die mRNA Expressionsanalyse von ERG belegte, dass Tumoren mit einer TMPRSS2-ERG Genfusion eine signifikant höhere ERG Expression aufweisen, als Tumoren ohne diese Genfusion (p=0,001,
Student’s t-Test) (Abb. 5.20A). Eine Analyse der Expression der Spleißvarianten ERG-2, ERG-2/3
und ERG-5 in fusionspositiven und fusionsnegativen Tumoren zeigte eine signifikant höhere ERG-2
Expression in den fusionspositiven Fällen im Vergleich zu den fusionsnegativen (p=0,0062, Student’s t-Test). Für ERG-2/3 und ERG-5 zeigte sich kein Expressionsunterschied (Abb. 5.20B).
Es konnte auch keine Korrelation zwischen dem ERG Fusionsstatus und der ERG Proteinexpression
gezeigt werden.
Ergebnisse
59
Abbildung 5.19. Beispielhafter Western Blot zur Detektion von ERG.
Dargestellt sind fünf repräsentative Paare von Tumor- (Tu) und korrespondierendem Normalgewebe
(No). Die Detektion erfolgte mittels eines C-Terminus-spezifischen Antiserums gegen ERG. Als Ladekontrolle wurde GAPDH verwendet. Auf der rechten Seite ist der Proteingrößenmarker eingezeichnet
(kDa).
5.8.4 Korrelation von miR-145 und ERG mRNA- und Proteinexpression
miR-145 war in 25 Fällen im Tumor herunterreguliert (p=0,0013, gepaarter t-Test) (Tab. 5.4).
Zwischen der miR-145 und der ERG mRNA Expression bestand keine Korrelation (Spearman-Rho
Test). Es fand sich jedoch eine positive Korrelation zwischen ERG-2 und ERG gesamt mRNA
Expression (p≤0,0001, Spearman-Rho Test).
Esquela-Kerscher und Slack (2006) haben bereits beschrieben, dass miRNAs primär einen Einfluss
auf die Proteinmenge ihrer Zielgene haben, jedoch nicht auf die mRNA Menge. Dies unterstützt
die eigenen Befunde der Korrelation zwischen miRNA, mRNA und Protein.
Darüberhinaus konnte eine Korrelation der miR-145 Expression mit der Gesamt-ERG-Proteinexpression
(Summe der ERG Isoformen) (p=0,025, N=52), sowie der ERG-1 (p=0,002, N=52) und ERG-2
(p=0,024, N=52; Spearman-Rho Test) Proteinexpression gezeigt werden. Zwischen fusionspositiven und fusionsnegativen Tumoren konnte kein Unterschied der miR-145 Expression festgestellt
werden (Abb. 5.20C). Die Regulation von ERG durch miR-145 scheint somit ein genereller Prozess
zu sein, welcher nicht vom Fusionsstatus abhängt.
60
Ergebnisse
Abbildung 5.20. Relative Expression von ERG, den ERG Spleißvarianten und miR-145 in fusionsnegativen und fusionspositiven Tumoren.
Vergleich der A) ERG Expression, B) der ERG-2, ERG-2/3 und ERG-5 Expression und C) der miR-145
Expression in fusionsnegativen (Fusion neg) und fusionspositiven (Fusion pos) Tumoren.
Ergebnisse
61
5.8.5 Analyse des Einflusses von ERG-2 Knockdown und ektoper Expression von
miR-145 auf Proliferation, Apoptose und Invasion
DU145 und VCaP Zellen wurden einerseits für den ERG-2 Knockdown mit drei verschiedenen siRNAs gegen ERG-2 (ERG-2 *1, *2, *3) und einer ON-TARGETplus Non-targeting siRNA, sowie
andererseits für eine ektope Expression von miR-145 mit dem pSG5-miR-145 Expressionsvektor
und dem leeren pSG5 Vektor als Kontrolle transfiziert. Die siRNAs gegen ERG-2 wurden derart
konstruiert, dass sie spezifisch für die Spleißvariante ERG-2 sind und wurden dafür über die Spleißstellen gelegt. 24 h nach der Transfektion wurde mittels BrdU ELISA die Proliferation und über
die Caspase 3/7 Aktivität die Apoptoserate bestimmt.
Die Apoptoseraten zeigten für die Transfektion mit den siRNAs zur Kontrolltransfektion. In VCaP
Zellen wurde für den Knockdown mit der siRNA ERG-2 *1 eine 7% geringere Apoptoserate im
Vergleich zur Kontrolle gefunden. In DU145 wurde für den Knockdown mit den siRNA ERG-2 *2
und *3 eine 5% respektive 12% geringere Apoptoserate gefunden (Abb. 5.21A). Für die ektope Expression von miR-145 konnte die Apoptoserate nicht bestimmt werden, da miR-145 als potentielles
Zielgen Caspase-10, welche wiederrum durch Spaltung Caspase-3 und -7 aktiviert. Eine verringerte
Caspase-3/7 Aktivität wäre damit nicht gleich zu setzen mit einer geringeren Apoptoserate. Hierfür
sind in der Zukunft Analysen mit einem geeigneten System vonnöten.
In beiden Zelllinien wurde eine signifikant verminderte Proliferationsrate nach Transfektion mit
den drei siRNAs im Vergleich zur Kontroll-siRNA gemessen. Ebenso wurde eine geringere Proliferation nach ektoper Expression von miR-145 im Vergleich zum Kontrollvektor (pSG5) gemessen
(Abb. 5.21B):
ERG-2 *1: DU145 Zellen 18,73%, p=0,0171;
VCaP Zellen 21,06%, p=0,0056
ERG-2 *2: DU145 Zellen 24,72%, p=0,008;
VCaP Zellen 22,43%, p=0,0037
ERG-2 *3: DU145 Zellen 25,25%, p=0,0304;
VCaP Zellen 19,22%, p=0,0183
miR-145 : DU145 Zellen 6%;
VCaP Zellen 3%
DU145 zeigten nach Knockdown von ERG-2 eine signifikant geringere Invasivität mit einem
Rückgang der Invasionsrate im Mittel um 63,8% für die drei verschiedenen siRNAs, sowie eine
ebenfalls verminderte Invasivität nach ektoper Expression von miR-145 (Abb. 5.21C):
ERG-2 *1: 38,5%, p=0,0318
ERG-2 *2: 36,25%, p=0,0236
ERG-2 *3: 34,5%, p=0,0428
miR-145 : 12%
62
Ergebnisse
Abbildung 5.21. Apoptose, Proliferation und Invasion nach Knockdown von ERG-2 und ektoper
Expression von miR-145.
DU145 und VCaP Zellen wurden mit drei verschiedenen siRNA gegen ERG-2 bzw. einer KontrollsiRNA (si control) und einem Überexpressionsvektor für miR-145 (pSG-miR-145) bzw. dem leeren
Kontrollvektor (pSG5) transfiziert und (A) die Apoptoserate mittels Caspase 3/7 Aktivität und (B) die
Proliferation mittels BrdU ELISA gemessen. (C) Zur Messung der Invasivität wurden DU145 Zellen in
Transwellinserts ausgesäht und mit siRNA gegen ERG-2 sowie einem Überexpressionsvektor für miR145 (pSG-miR-145) bzw. dem leeren Kontrollvektor (pSG5) transfiziert. Zellen, welche nach 48 h durch
die, mit Matrigel beschichtete, Membran der Inserts gewandert waren, wurden mit Calcein-AM gefärbt
und im Plattenfluorometer die Fluoreszenz gemessen.
Diskussion
63
6 Diskussion
Krebs entsteht durch unkontrollierte Proliferation und das Überleben von beschädigten Zellen. Es
gibt mehrere Kontrollmechanismen, welche für eine korrekte Zellteilung, Differenzierung und Zelltod sorgen. Gerät dieses System außer Kontrolle, kommt es zur Krebsentstehung. miRNAs sind
Bestandteil des regulatorischen Netzwerks, welches für eine genau definierte Translation von Genen sorgt. Etwa ein Drittel aller proteinkodierenden Gene wird durch miRNAs reguliert (Lewis,
Burge und Bartel, 2005), so dass eine Störung der Translationsregulation durch miRNAs verschiedene zelluläre Prozesse beieinflussen kann, welche bei der Krebsentstehung häufig verändert sind,
wie Differenzierung (Chen et al., 2004; Poy et al., 2004; Esau et al., 2004), Proliferation (Bueno
und Malumbres, 2011) und Apoptose (Wang und Lee, 2009). Die Störung der miRNA Regulation kann durch verschiedende Mechanismen hervorgerufen werden. Es kann der miRNA Expressionslevel verändert sein, die miRNA Prozessierung kann gestört sein und es können Mutationen in der miRNA:mRNA Bindesequenz vorliegen (Cowland, Hother und Grønbaek, 2007). Somit
können miRNAs als Tumorsuppressor oder Onkogen agieren (Esquela-Kerscher und Slack, 2006;
Krutovskikh und Herceg, 2010), je nachdem, welche Gene reguliert werden. Jedoch sind miRNAs
nicht zwingend die Ursache einer veränderten Regulation, die Deregulation von miRNAs kann auch
Folge von genomischen (Calin et al., 2004), epigenetischen (Souza Rocha Simonini et al., 2010)
oder physiologischen Veränderungen während der Karzinogenese sein. So ist der Tumorsuppressor p53, welcher im Krebs häufig mutiert vorliegt (Harris und Hollstein, 1993), ein Regulator der
miRNA Prozessierungsmaschinerie (Boominathan, 2010).
Zur Rolle und Expression von miRNA im Prostatakarzinom gibt es bereits eine Reihe an Publikationen, welche sich zumeist entweder auf Sequenzierung- oder miRNA microArray Analysen stützen
(Volinia et al., 2006; Porkka et al., 2007; Ambs et al., 2008; Schaefer et al., 2010a). Die vorliegende
Arbeit befasste sich mit der Erstellung eines miRNA Expressionsprofils anhand von Deep Sequencing und miRNA microArray und der Analyse der in beiden Ansätzen gefundenen miRNAs sowie
die Valdierung der Ergebnisse mittels quantitativer realtime PCR. Außerdem wurde der Einfluss
der miRNA Deregulation auf Zellproliferation, Apoptose, Invasion und Migration untersucht, sowie
Zielgene ausgewählter miRNAs identifiziert und deren zellbiologischer Einfluss untersucht.
64
Diskussion
6.1 miRNA Profilerstellung im Prostatakarzinom
Mittels Deep Sequencing (Kapitel 5.1.1) und miRNA microArray (Kapitel 5.1.5) konnte ein spezifisches miRNA Profil für das Prostatakarzinom erstellt werden. Es wurden 9 miRNAs gefunden,
welche in beiden Ansätzen übereinstimmend dereguliert auftraten. miR-375, -let-7a, -106a, -106b,
-200c, -20a und miR-21 wurden in beiden Ansätzen hochreguliert gefunden, miR-221 und miR145 wurden in beiden Ansätzen herunterreguliert nachgewiesen (Abbildung 5.3). Einige dieser
miRNAs waren bereits in anderen Studien als dereguliert aufgefallen. Eine Übersicht liefert Tab.
6.1. Zwischen den verschiedenen Studien zeigten sich teilweise große Unterschiede, welche miRNAs
Tabelle 6.1. Vergleich verschiedener miRNA Expressionsstudien mit eigenen Daten
Bei den eigenen Daten sind die miRNAs aufgeführt, welche übereinstimmend im Sequenzierungsansatz
und in der miRNA microArray Analyse gefunden wurden. Alle vier anderen Studien beruhen auf Daten
aus einem microArray Ansatz. ⇑ hochreguliert, ⇓ herunterreguliert im Prostatakarzinom.
miRNA
miR-375
let-7a
miR-106a
miR-106b
miR-200c
miR-20a
miR-21
miR-221
miR-145
miRNA Expression in Prostatakarzinom vs. nicht-malignes Gewebe
eigene
Volinia
Porkka
Ambs et al.,
Schaefer
Daten
et al., 2006
et al., 2007
2008
et al., 2010a
⇑
⇑
⇑
⇑
⇓
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⇑
⇑
⇑
⇑
⇑
⇑
⇑
⇑
⇑
⇓
⇓
⇓
⇓
⇓
⇓
⇓
als dereguliert gefunden wurden, sowie hinsichtlich der Regulation und der Richtung dieser Regulation. Dies kann zum einen darauf beruhen, dass die vier Studien sich zwar alle auf eine microArray
basierte Analyse stützen, jedoch in verschiedenen Jahren (2006, 2007, 2008 und 2010) durchgeführt
wurden, so dass in den früheren Studien noch weniger miRNA Sequenzen bekannt waren und sich
darüber hinaus die Array Technik im Lauf der Jahre verändert hat. Zum anderen können diese
Unterschiede an der Zusammensetzung des jeweiligen Kollektives liegen. So bestand das Kollektiv
von Volinia et al. (2006) aus 56 Prostatakarzinom und sieben Normalproben, das Kollektiv von
Porkka et al. (2007) aus vier benignen Prostatahyperplasien und neun Tumorproben, das Kollektiv von Ambs et al. (2008) aus 60 Tumor- und 16 Normalproben und das Kollektiv von Schaefer
et al. (2010a) aus 76 PCa Proben mit korrespondierendem Normalgewebe. Das eigene Kollektiv
bestand für die Sequenzierung aus zwei Pools mit je 5 Prostatatumorproben und 2 Pools mit je 5
Normalproben. Für den miRNA microArray wurde ein Kollektiv von 20 Prostatakarzinom Proben
mit korrespondierendem Normalgewebe verwendet.
miR-221 wurde zusätzlich zu den eigenen Daten in weiteren drei Studien herunterreguliert im
Prostatakarzinom gefunden (Porkka et al., 2007; Ambs et al., 2008; Schaefer et al., 2010a) und für
Diskussion
65
diese miRNA konnte bereits eine prognostische und diagnostische Bedeutung nachgewiesen werden
(Spahn et al., 2010). Darüberhinaus wurde die Überexpression von miR-375 (Ambs et al., 2008;
Schaefer et al., 2010a) und die Herunterregulation von miR-145 (Porkka et al., 2007; Ambs et al.,
2008) in je zwei weiteren Studien gezeigt. Für die Deregulation von miR-106a, miR-106b, miR200c, miR-20a und miR-21 wurde jeweils eine bestätigende Studie gefunden, let-7a war ebenfalls
als dereguliert in einer weiteren Studie gefunden worden, allerdings entgegengesetzt zu den eigenen
Daten (Porkka et al., 2007).
6.2 miRNA Zielgenanalysen
Mittels bioinformatischer Recherche (mirecords.biolead.org, www.targetscan.org) wurden für verschiedene miRNAs potentielle Zielgene gefunden. Für miR-143 und miR-145 wurde MYO6 als
neues Zielgen identifiziert, für miR-145 wurde ERG, für miR-200c und miR-375 konnte SEC23A
als Zielgen identifiziert werden. Die Expression der miRNAs und der entsprechenden Zielgene wurde
mittels qRT-PCR gemessen. Für ERG und Sec23A wurde außerdem die Proteinexpression mittels
Western Blot bestimmt. Des weiteren konnten für Sec23A und ERG sowie für miR-200c, miR375 und miR-145 in vitro Analysen (Proliferation, Viabilität, Zytotoxizität, Apoptose, Invasion,
Migration, Wundheilungsverhalten) durchgeführt werden.
6.2.1 SEC23A als Zielgen der miRNAs miR-200c und miR-375
miR-200c und miR-375 waren im Deep Sequencing (Kapitel 5.1.1) und der miRNA microArray Analyse (Kapitel 5.1.5) als überexprimiert im Prostatakarzinom gefunden worden. Diese
Überexpression der beiden miRNAs im Tumor konnte mittels qRT-PCR in den Prostatazelllinien
und den Primärgeweben bestätigt werden. Außerdem konnte in ca. 60% der Primärgewebe eine
niedrigere Sec23A Proteinexpression gezeigt werden.
Die 3’UTR von SEC23A besitzt je eine Bindestelle für miR-200c und miR-375. Mittels Luciferaseassay konnte von uns bestätigt werden, dass beide miRNAs an die 3’UTR von SEC23A binden
(Szczyrba et al., 2011). Die Messung der Expression von SEC23A mittels qRT-PCR zeigte, dass
SEC23A im Tumor signifikant herunterreguliert war im Vergleich zum Normalgewebe (Kapitel
5.2.2).
Die funktionelle Analyse von miR-200c und miR-375 belegte, dass ein Knockdown von miR-200c
und miR-375 einzeln oder in Kombination eine verstärkte Proliferation von DU145 und LNCaP Zellen zur Folge hat. Dagegen ist im Magenkrebs miR-375 herunterreguliert und eine Überexpression
von miR-375 führt zu einer verminderten Proliferation und Viabilität der Magenzellen (Ding et al.,
66
Diskussion
2010; Tsukamoto et al., 2010).
Ein potentielles Zielgen der miR-200c ist EP300. In LNCaP Zellen konnte bereits gezeigt werden,
dass ein Knockdown von EP300 eine verminderte Proliferation zur Folge hat (Debes et al., 2003).
Ein Knockdown von miR-200c würde zu einer erhöhten Expression von EP300 führen und dadurch
die verstärkte Proliferation erklären. Weitere Zielgene von miR-200c sind CDK2 und E2F3, wodurch diese miRNA eine Rolle bei der Zellzykluskontrolle spielen könnte.
Die LDH-Aktivität war in den Zellen mit miRNA Knockdown signifikant geringer, jedoch war die
Apoptoserate von DU145 Zellen mit miR-375 bzw. miR-200c/375 Knockdown signifikant erhöht.
Demgegenüber war die Apoptoserate von LNCaP Zellen nach Knockdown von miR-375 bzw. miR200c/375 geringer im Vergleich zu den kontrolltransfizierten LNCaP Zellen (Kapitel 5.3.1).
Ein weiteres gemeinsames potentielles Zielgen der miR-200c und miR-375 ist die Proteinkinase 3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 (PDPK1). Diese phosphoryliert AKT2, welches
wiederum BAD (B-cell CLL/lymphoma 2 associated agonist of cell death) phosphoryliert (Harris, 2003). BAD ist ein positiver Regulator des programmierten Zelltods. Dephosphoryliertes BAD
bildet einen Komplex mit p53 und löst Apoptose aus (Jiang et al., 2006). Ein Knockdown von
miR-200c bzw. miR-375 würde damit zu einer erhöhten Expression von PDPK1 führen, so dass
über phosphoryliertes AKT2 BAD phosphoryliert wird und dadurch eine verminderte Apoptoserate
resultiert, wie in LNCaP Zellen gesehen. Die erhöhte Apoptoserate in DU145 Zellen nach miR375 Knockdown lässt sich möglicherweise dadurch erklären, dass die Proteinphosphatase protein
phosphatase 3, catalytic subunit, gamma isozyme (PPP3CC) ein weiteres potentielles Zielgen der
miR-375 ist. PPP3CC dephosphoryliert BAD. Der Knockdown von miR-375 würde somit zu einer
erhöhten Expression von PPP3CC führen und dadurch zu einer verstärkten Dephosphorylierung
von BAD, was wiederum eine erhöhte Apoptoserate zur Folge hat (Wang et al., 1999) (Abb. 6.1).
Für die erhöhte Apoptoserate nach miR-200c Knockdown bietet die vorhergesagte Regulation
von APAF-1 durch miR-200c eine mögliche Erklärung. APAF-1 bildet zusammen mit Caspase-9
das Apoptosom, wodurch die Caspase-9 und nachfolgend die Caspasen 3 und 7 aktiviert werden
(Bratton, 2001; Green, 2005; Zou et al., 1997). Knockdown von miR-200c würde dadurch in einer
erhöhten Expression von APAF-1 und damit in einer verstärkten Aktivierung der Caspasen 3 und 7
resultieren. Dass die DU145 Zellen nach miR-200c Knockdown keine so starke Caspase-3/7 Aktivität zeigen, wie nach Knockdown von miR-375 und miR-200c/375, wid möglicherweise verusacht
durch die überlebensfördernde Phosphorylierung von Caspase-9 durch AKT2 (Kim und Chung,
2002). Eine reduzierte miR-200c Expression würde daher auf der anderen Seite über PDPK1 und
AKT2 zu einer verstärkten Phosphorylierung von Caspase-9 und damit einer reduzierten Caspase-3
und Caspase-7 Aktivität führen, so dass es sich hier um zwei gegenläufige Effekte handelt, welche
beide durch miR-200c reguliert werden könnten (Abb. 6.1).
Beim Migrationsverhalten zeigten DU145 Zellen nur eine um ca. 10% reduzierte Migrationsrate nach miRNA Knockdown. Da miRNAs mehrere verschiedene Zielgene regulieren, lässt dies
vermuten, dass die beiden miRNAs miR-200c und miR-375 zwar Gene regulieren, welche die Migrationsfähigkeit der Zellen hemmen, jedoch auf der anderen Seite auch Gene regulieren könne,
Diskussion
67
Abbildung 6.1. Mögliches regulatorisches Netzwerk der Apoptoseregulierung mit den miRNAs
miR-200c und miR-375.
PDPK1 (3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 ) ist ein potentielles Zielgen der miRNAs miR200c und miR-375. PDPK1 phosphoryliert AKT2, welches wiederum BAD phosphoryliert und damit eine
verminderte Apoptoserate zur Folge hat. PPP3CC (protein phosphatase 3, catalytic subunit, gamma
isozyme) ist ein weiteres potentielles Zielgene der miR-375, welches BAD dephosphoryliert und dadurch
eine erhöhte Apoptoserate bedingt.
APAF-1 ist ein weiteres potentielles Zielgen der miR-200cc, welches im Komplex mit Caspase-9 die
Caspasen-3 und -7 aktiviert und dadurch verstärkt Apoptose induziert. Eine Aktivierung der Caspase-9
wird andererseits durch Phosphorylierung durch AKT2 verhindert.
welche im Gegenteil in einer verstärkten Migrationsfähigkeit der Zellen resultieren.
Beim Wundheilungsassay zeigten DU145 Zellen nach Knockdown von miR-200c und miR-375 ein
verstärktes Wundheilungsverhalten. Beim Doppel-Knockdown miR-200c/375 wiesen DU145 Zellen
kein verändertes Wundheilungsverhalten im Vergleich zur Kontrolltransfektion auf (Kapitel 5.3.2).
Da es sich beim Wundheilungsverhalten um eine Kombination aus Proliferation und Migration
handelt (Wong und Gotlieb, 1988; Coomber und Gotlieb, 1990; Zahm et al., 1997), stellt sich
die Frage, welcher der beiden Mechanismen in den vorliegenden Experimenten der Vorherrschende
ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Knockdown von miR-200c und miR-375 in
DU145 eine verstärkte Proliferation zur Folge hat. Im Gegensatz hierzu hat der Knockdown der
beiden miRNAs kaum Einfluss auf das Migrationsverhalten von DU145, so dass vermutet werden
kann, dass der vorherrschende Mechanismus beim beobachteten stärkeren Wundheilungsverhalten
von DU145 nach miRNA-Knockdown die Proliferation ist. Eine Ursache dafür, dass beim DoppelKnockdown von miR-200c/375 kein verändertes Wundheilungsverhalten zur Kontrolle beobachtet
wurde, könnte sein, dass sich die beiden anti-miRNAs gegenseitig inhibieren. Außerdem haben alle
miRNAs mehrere mRNAs als potentielles Ziel, so dass unterschiedliche Signalwege oder verschiedene Mitglieder eines Signalweges beeinflusst werden. Dies könnte dazu führen, dass die beiden
miRNAs an unterschiedlichen Stellen eines Signalweges wirken können und dadurch der Effekt der
einzelnen miRNA wieder aufgehoben wird.
Die Invasivität von DU145 Zellen war nach Knockdown von miR-200c und miR-375 erhöht (Kapitel 5.3.3). Diese verstärkte Invasivität könnte dadurch erklärt werden, dass miR-200c mit dem
Transkriptionsfaktor ZEB1 einen negativen Feed-back loop bildet (Gregory et al., 2008). Eine verminderte miR-200c Expression induziert ZEB1 welches wiederum E-Cadherin reprimiert (Hurteau
et al., 2009). miR-375 andererseits hat als potentielles Zielgen SLUG, welches wiederum E-Cadherin
68
Diskussion
reprimiert (Bolós et al., 2003; Hajra, Chen und Fearon, 2002). Repression von E-Cadherin induziert
epithelial-mesenchymale Transititon (EMT) (Bracken et al., 2008). EMT wiederum resultiert in
Invasion und Migration der Tumorzellen (Gregory et al., 2008) (Abb. 6.2).
Abbildung 6.2. Mögliches regulatorisches Netzwerk der EMT-Regulierung mit den
miRNAsmiR-200c und miR-375
ZEB1 ist ein bereits validiertes Zielgen der miR-200c (Gregory et al., 2008), welches E-Cadherin reprimiert. SLUG ist ein potentielles Zielgen der miR-375 und reprimiert ebenfalls E-Cadherin. Repression
von E-Cadherin resultiert in epithelial-mesenchymaler Transition und damit in Invasion.
Beim Knockdown bzw. der ektopen Expression von SEC23A zeigten DU145 Zellen keine signifikanten Unterschiede in der Proliferation, jedoch zeigte sich eine tendenziell erhöhte Proliferationsrate nach SEC23A Knockdown und eine verringerte Proliferation nach ektoper Expression von
SEC23A. LNCaP Zellen waren nach ektoper Expression von SEC23A signifikant weniger proliferativ im Vergleich zu LNCaP Zellen, welche mit dem Kontrollvektor transfiziert worden waren. Nach
Knockdown von SEC23A zeigte sich für LNCaP Zellen kein Unterschied in der Proliferationsrate.
Die Viabilität von DU145 Zellen war sowohl für den Knockdown als auch die ektope Expression von
SEC23A signifikant geringer im Vergleich zur entsprechenden Kontrolltransfektion. LNCaP Zellen
zeigten nach Knockdown von SEC23A eine signifikant geringere Viabilität, nach ektoper Expression
war die Viabilität ebenfalls verringert (Kapitel 5.4.1).
Für die Invasivität und das Migrationsverhalten konnte kein signifikanter Unterschied zwischen
Knockdown und ektoper Expression zur Kontrolltransfektion ermittelt werden (Kapitel 5.4.3). Das
Wundheilungsverhalten wies jedoch deutliche Unterschiede auf. DU145 Zellen zeigten ein signifikant beschleunigtes Wundheilungsverhalten nach Knockdown von SEC23A und ein signifikant
verlangsamtes Wundheilungsverhalten nach ektoper Expression von SEC23A. Da für DU145 nach
SEC23A Knockdown kein Unterschied der Migrationsrate beobachtet werden konnte, jedoch eine
verstärkte Proliferation, könnte dies der vorherrschende Mechansimus des Wundheilungsverhaltens sein. Nach ektoper Expression von SEC23A konnte zwar eine gering erhöhte Migrationsrate
von DU145 beobachtet werden, jedoch war die Proliferationsrate vermindert und die Apoptoserate erhöht, so dass diese beiden Mechanismen das verlangsamte Wundheilungsverhalten erklären
könnten.
Bei LNCaP Zellen waren die Unterschiede im Wundheilungsverhalten nicht signifikant, jedoch wurde die gleiche Tendenz beim Wundheilungsverhalten wie bei DU145 Zellen festgestellt. Auch war
beim Migrationsverhalten kein Unterschied gefunden worden. Lediglich die Proliferationsrate nach
ektoper Expression war vermindert und die Apoptoserate erhöht, so dass diese Befunde wiederum
Diskussion
69
das verlangsamte Wundheilungsverhalten nach ektoper Expression von SEC23A erklären könnten
(Kapitel 5.4.2).
Die nicht so deutlichen Unterschiede beim Wundheilungsverhalten von LNCaP können zum einen
auf die fast doppelt solange Verdopplungszeit von LNCaP Zellen (60 Std.) im Vergleich zu DU145
Zellen (30-40 Std.) zurückzuführen sein. Zum anderen weisen LNCaP Zellen eine fibroblastenartige
Gestalt auf, so dass der Spalt nicht so klar definiert ist wie bei der epithelialen Gestalt von DU145
Zellen.
Sec23A ist Bestandteil des Coat protein complex II (COPII), welcher an den sogenannten
Exit Sites im Endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert ist. Der COPII Komplex besteht
aus der SAR1 (secretion-associated, ras related) GTPase und den Sec23-Sec24 und Sec13-Sec31
Heterodimeren (Barlowe, d’Enfert und Schekman, 1993; Fromme, Orci und Schekman, 2008;
Lippincott-Schwartz, Roberts und Hirschberg, 2000). Das Sec23-Sec24 Heterodimer ist für die
Erkennung der zu transportierenden Proteine zuständig. Ein Funktionsverlust von Sec23A führt
zum Defekt des COPII vermittelten ER Proteintransports, zur Akkumulation von Proteinen im
ER und dadurch zu einer Veränderung des Vorhandenseins extrazellulärer Proteine (Sekretom).
Bislang war Sec23A nur im Zusammenhang mit einem Syndrom namens Kranio-lentikulo-suturale
Dysplasie (Cranio-lenticulo-sutural dysplasia=CLSD) bekannt, welches auf einen Funktionsverlust
von Sec23A und eine damit einhergehende Akkumulation von Kollagen im Endoplasmatischen
Retikulum (ER) zurückzuführen ist. Hierbei handelt es sich um ein autosomal-rezessiv vererebtes
Syndrom, welches charakterisiert ist durch sich spät schließende Fontanellen, früh entstehenden
grauen Star, Skelettdysplasien und Gesichtsdysmorphismus (Boyadjiev et al., 2006; Boyadjiev et al.,
2010).
Zum Einfluss von Sec23A auf die Tumorbiologie ist bislang neben unserer eigenen Publikation (Szczyrba et al., 2011) lediglich eine Studie über Brustkrebs erschienen, welche SEC23A
übereinstimmend zu den eigenen Ergebnissen als Zielgen der miR-200c fand und den Einfluss
von Sec23A auf das Tumorzellsekretom und Metastasierung untersucht hat (Korpal et al., 2011).
Korpal et al. (2011) konnten in einer Mausbrustkrebszelllinie mit SEC23A Knockdown eine globale
Reduktion der Sekretion von Proteinen zeigen. Darunter waren Proteine, welche in die Mechanismen der Zelladhäsion, Entzündungs- und Immunantwort, extrazelluläre Strukturorganisation und
Wundheilung involviert sind.
Eines dieser Proteine, welches nach SEC23A Knockdown reduziert im Zellkulturmedium gefunden wurde, war IGFBP4 (insulin-like growth factor binding protein 4 ). IGFBP4 spielt eine
wichtige Rolle bei der Tumorwachstumskontrolle in vivo und in vitro. In Mäusen waren Proliferation, anchorage-independent growth und Tumorentwicklung von M12 Prostatakarzinomzellen nach
IGFBP4 Überexpression inhibiert. Die Apoptose von IGFBP4 überexprimierenden Zellen war erhöht
(Damon et al., 1998; Zhou et al., 2003). Ektope Expression von SEC23A würde analog zur Studie
von Korpal et al. (2011) zu einer erhöhten Sekretion von IGFBP4 und diese zur Inhibition von
Proliferation und verstärkten Apoptose führen (Damon et al., 1998). Für die Zelllinien DU145 und
70
Diskussion
LNCaP wurde übereinstimmend zu diesem Modell eine verminderte Proliferation nach SEC23A
Überexpression und in DU145 Zellen eine verstärkte Proliferation nach SEC23A Knockdown gefunden. Ebenso konnte nach ektoper Expression von SEC23A eine erhöhte Apoptoserate in DU145
und LNCaP Zellen festgestellt werden. Da die Migrationsrate von DU145 Zellen nach SEC23A
Knockdown tendenziell erniedrigt war, das Wundheilungsverhalten von DU145 Zellen nach Knockdown jedoch verstärkt, scheint der vorherrschende Mechanismus beim Wundheilungsverhalten die
Proliferation der Zellen zu sein.
Mit SEC23A lässt sich das EMT Modell (Abb. 6.2) um ein weiteres Zielgen der miRNAs miR200c und miR-375 erweitern. Eine schematische Darstellung, welche die beiden miRNAs mit ihren
(potentiellen) Zielgenen in Beziehung setzt, findet sich in Abb. 6.3. Beide miRNAs beeinflussen
Abbildung 6.3. Schematische Darstellung von miR-200c, miR-375 und deren Zielgenen
Da SLUG bislang noch nicht als Zielgen nachgewiesen wurde, sondern diese Regulation auf in silico
Analysen beruht, ist der Pfeil in Grau dargestellt. Abgeleitet aus Korpal und Kang (2008) und Korpal
et al. (2011)
über verschiedene Zielgene die epithelial-mesenchymale und mesenchymal-epitheliale Transition
und damit Proliferation, Invasion und Metastasierung von Tumorzellen. Aus diesem Modell lässt
sich ableiten, dass eine hohe miR-200c bzw. miR-375 Expression über zwei verschiedene Zielgene (SLUG, ZEB1/2 ) zu einer hohen E-Cadherin Expression führen kann, welche wiederum den
epithelialen Phänotyp begünstigt und damit die Zelladhäsion. Auf der anderen Seite begünstigt
eine niedrige miR-200c und miR-375 Expression den mesenchymalen Phänotyp und die Expression
von SEC23A. Dadurch werden mehr Proteine wie IGFBP4 sekretiert, die Proliferation der Zellen
inhibiert und Metastasierung gefördert (Korpal et al., 2011; Durai et al., 2006).
Diskussion
71
6.2.2 MYO6 als Zielgen der miRNAs miR-143 und miR-145
Die miRNAs miR-143 und miR-143 waren mittels Deep Sequencing Analyse im Tumor als herunterreguliert gefunden worden (Kapitel 5.1.1). Dies konnte mittels qRT-PCR in den ProstatakarzinomZelllinien (Kapitel 5.1.2) und den Primärgeweben der beiden Patientenkollektive bestätigt werden (Kapitel 5.1.4). Bei der miRNA microArray Analyse (Kapitel 5.1.5) wurde nur miR-145 im
Prostatakarzinom herunterreguliert gefunden, miR-143 war im Prostatakarzinom ebenfalls geringer
exprimiert, jedoch mit p>0,05 bei einer false discovery rate von 5%.
Als potentielles Zielgen beider miRNAs wurde MYO6 identifiziert, dessen 3’UTR zwei potentielle Bindestellen für miR-145 und eine für miR-143 enthält. Dass MYO6 tatsächlich ein Zielgen
für beide miRNAs ist, konnte mittels Luciferaseassay bestätigt werden (Szczyrba et al., 2010).
Reziprok zur niedrigen Expression der beiden miRNAs miR-143 und miR-145 im Prostatakarzinom
wurde für MYO6 eine höhere Expression im Prostatakarzinom im Vergleich zum Normalgewebe
gemessen (Kapitel 5.2.2). Myosin VI ist das einzige Mitglied dieser Proteinfamilie, welches sich
in Richtung des Minuspols des Aktinfilamentes bewegt (Wells et al., 1999) und ist essentiell für
die Tumorzellmigration (Yoshida et al., 2004). Durch die Bewegung in Richtung des Minuspols
kann Myosin VI Aktinfilamente in Ausstülpungen drücken, dem ersten Schritt zur Migration (Buss,
Luzio und Kendrick-Jones, 2002; Schober und Perrimon, 2002).
Xu et al. (2011) konnten zeigen, dass miR-143 eine Rolle als Tumorsuppressor spielt. Eine
Überexpression dieser miRNA induziert einen G1 Zellzyklusarrest und führt zu vermindertem
Zellwachstum und geringerer Migration (Xu et al., 2011; Peng et al., 2011). Überexpression von
miR-143 führt zu einer reduzierten Expression von MYO6 und dadurch zur Inhibition des migratorischen Effektes von Myosin VI (Yoshida et al., 2004).
miR-145 reguliert proapoptotische Gene wie TRAIL und IL-24. In Brustkrebs zeigte miR-145 ebenfalls einen proapoptotischen Effekt durch Regulation von Mitgliedern des TP53 Signalweges, auf
der anderen Seite wird diese miRNA wiederum selbst von TP53 reguliert (Spizzo et al., 2010; Feng
et al., 2011). Als Hauptursache für die niedrige Expression der miR-145 wird die Methylierung der
Promoterregion im Prostatakarzinom angenommen (Zaman et al., 2010). In der Promoterregion
befindet sich außerdem ein p53 response element, so dass die reduzierte Expression von miR-145
durch die Inhibition der p53 Bindung hervorgerufen werden könnte (Suh et al., 2011). Ebenso wie
für miR-143 zeigte eine Überexpression von miR-145 eine verminderte Migration in vitro (Peng
et al., 2011).
6.2.3 Regulation von ERG durch miR-145
Die Herunterregulation von miR-145 spielt eine essentielle Rolle bei der Prostatatumorentwicklung
(Zaman et al., 2010). Eine Überexpression von miR-145 führte zu reduzierter Migrationsfähigkeit
72
Diskussion
und Invasivität in vitro und zur verminderten Tumorentstehung und geringerer Entwicklung von
Knochenmetastasen aus PC-3 Zellen im Mausxenograftmodell (Peng et al., 2011). Außerdem führte
eine Überexpression von miR-145 in LNCaP, VCaP und DU145 Zellen zu reduziertem Zellwachstum
und verstärktem Zelltod (Wang et al., 2009; Chen et al., 2010).
ERG ist ein Mitglied der ets Transkriptionsfaktor-Familie (Reddy und Rao, 1991; Reddy,
Rao und Papas, 1987) für welches mehrere Spleißvarianten bekannt sind und bei SWISS-Prot
(www.uniprot.org, 28.11.2011) sind 6 Isoformen aufgelistet. Die Expression von ERG GesamtmRNA und den Spleißvarianten ERG2, ERG2/3 und ERG-5, für welche qRT-PCR Assays verfügbar
waren, wurde zunächst mittels qRT-PCR analysiert. Hierbei zeigte sich, dass ERG Gesamt-mRNA
im Tumor signifikant überexprimiert war, ERG2 war ebenfalls signifikant höher exprimiert im
Tumor, für ERG2/3 zeigte sich kein Expressionsunterschied und ERG-5 war im Prostatakarzinom
signifikant niedriger exprimiert (Kapitel 5.8.1). Die Überexpression der Gesamt-ERG mRNA im
Prostatakarzinom passt als reziproker Befund zur niedrigen Expression von miR-145 im Prostatakarzinom. Mittels Luciferaseassay konnten wir außerdem zeigen, dass miR-145 an die 3’UTR von
ERG bindet (Hart et al., 2012).
Die TMPRSS-ERG Fusion ist die häufigste genetische Veränderung im Prostatakarzinom, wodurch
ERG unter die Kontrolle des androgen-responsiven Promotors von TMPRSS2 kommt (Tomlins
et al., 2005). Bei der Analyse, ob der Genfusionsstatus (fusionspositiv oder fusionsnegativ) die ERG
Expression beeinflusst, konnte eine signifikant höhere ERG Gesamt-mRNA sowie ERG-2 Expression
in fusionspositiven Tumoren festgstellt werden. Für ERG-2/3 und ERG-5 wurde kein Unterschied
zwischen fusionspositiven und -negativen Tumoren gemessen (Kapitel 5.8.3). Ebenso konnte kein
Unterschied der miR-145 Expression zwischen fusionspositiven und -negativen Tumoren gefunden
werden, so dass davon ausgegangen werden kann, dass die Regulation von ERG durch miR-145
ein genereller Mechanismus ist, der nicht vom Fusionsstatus abhängt.
Die Analyse der ERG Proteinexpression zeigte deutliche Unterschiede zwischen Normal- und Tumorgewebe. Für die Tumorproben konnte ein spezifisches Muster festgestellt werden, mit einer
Verstärkung des ERG-2-Signales und/oder dem zusätzlichen Erscheinen der ERG-1 Bande (Kapitel
5.8.2).
Zwischen miR-145 und ERG mRNA Expression konnte keine Korrelation gefunden werden. Jedoch
war miR-145 mit der Gesamt-ERG-Proteinmenge, sowie der ERG-1 und ERG-2 Proteinexpression
korreliert (Kapitel 5.8.4). Dieses Ergebnis deckt sich mit der Beobachtung, dass in Säugetieren
miRNAs zwar die Proteintranslation beeinflussen, jedoch nicht notwendigerweise die RNA Menge
(Esquela-Kerscher und Slack, 2006).
Die in vitro Analyse des ERG-2 Knockdown zeigte in VCaP kaum Unterschiede in der Auswirkung
auf die Apoptoserate, in DU145 Zellen wurde eine um 12% verminderte Apoptoserate für eine der
siRNAs gegen ERG-2 gemessen. In der Literatur wird für die ektope Expression von miR-145 eine
erhöhte Zahl apoptotischer Zellen sowohl für VCaP als auch für DU145 Zellen gefunden (Wang
et al., 2009; Zaman et al., 2010). Dies korreliert zwar nicht mit der verminderten Apoptoserate
Diskussion
73
nach ERG-2 Knockdown. Jedoch wurde in der eigenen Arbeit nur die eine Spleißvariante ERG-2
spezifisch mittels siRNA herunterreguliert, so dass über den Einfluss der anderen Spleißvarianten
keine Aussage getroffen werden kann. Nach Knockdown von ERG-2 waren VCaP und DU145 Zellen signifikant weniger proliferativ. Übereinstimmend wurde für die ektope Expression von miR-145
eine geringere Proliferation gemessen. Ebenso ging die Invasivität von DU145 Zellen nach ERG-2
Knockdown signifikant zurück und die Invasivität von DU145 Zellen nach ektoper Expression von
miR-145 verringerte sich ebenfalls (Kapitel 5.8.5). In Brust- und Kolonkarzinomzellen konnte bereits gezeigt werden, dass eine Überexpression von miR-145 eine Hemmung des Zellwachstums zur
Folge hat. Dies erfolgt über Hemmung des Zielgens c-Myc und dessen nachgeschaltete Signalwege
der Biosynthese und des Metabolismus (Sachdeva et al., 2009; Feng et al., 2011).
Tomlins et al. (2008) konnten bereits zeigen, dass ein Knockdown von ERG eine verminderte Invasivität zur Folge hat. Diese verminderte Invasivität wird über Metalloproteinasen und Gene des
Plasminogenaktivatorsignalweges gesteuert (Tomlins et al., 2008). Jedoch wurde in der Arbeit von
Tomlins et al. (2008) eine unveränderte Proliferationsrate nach ERG Knockdown beobachtet, in unserer eigenen Arbeit wurde eine signifikant verminderte Proliferation nach ERG-2 Knockdown festgestellt. Allerdings wurde in der Arbeit von Tomlins et al. (2008) keine spezifisch gegen die ERG-2
Spleißvariante gerichtete siRNA verwendet. In unserer Arbeit wurde spezifisch die ERG-2 Spleißvariante herunterreguliert. Eine mögliche Schlussfolgerung ist, dass ERG-2 alleine ausreichend ist,
für die beobachtete und beschriebene verminderte Invasionsrate. Jedoch führt der Knockdown von
ERG-2 zu einer Reduktion der Proliferation, welche bei einem Knockdown von möglicherweise mehreren ERG Spleißvarianten nicht beobachtet werden konnte (Tomlins et al., 2008). Möglicherweise
hat der Kockdown von einer oder mehreren der anderen ERG Spleißvarianten einen fördernden
Effekt auf die Proliferation, so dass der reduzierende Effekt des ERG-2 Knockdown wieder ausgeglichen wird.
Es wurde bereits gezeigt, dass die TMPRSS2-ERG Fusion EMT erleichert (Gupta et al., 2010; Leshem et al., 2011). Die ERG-2 Spleißvariante scheint somit wichtig zu sein für die Invasionsfähigkeit
und Proliferation von Zellen.
Zusammen mit den Protein- und mRNA-Daten ergibt sich damit für die einzelnen ERG Spleißvarianten folgendes Muster:
6.3 Diagnostisches Potential von miRNAs
Die differentielle Expression von miRNAs in Tumor- und Normalgewebe bietet die Möglichkeit,
miRNAs als diagnostische und/oder prognostische Faktoren zu nutzen (Schaefer et al., 2010b).
Mittels bivariater logistischer Regression und Receiver Operating Characteristics (ROC) Kurven
wurde das diagnostische Potential der miRNAs miR-375, miR-200c, miR- 145 und miR-143 analysiert (Kapitel 5.6). Die AUC (area under the curve) ist bei der ROC Analyse das Maß für die
74
Diskussion
Variante
mRNA Expression
Tu vs. No
Proteinexpression
Tu vs. No
Hypothetische Funktion
im Tumor
ERG-1
n.b.
hoch
ERG-2
hoch
hoch
ERG-3(*)
ERG-2/3
kein Unterschied
niedrig
ERG3/5 niedriger
Förderung des
Tumorzellwachstums
fördert Proliferation,
Invasion
Hemmung des
Tumorzellwachstums
Hemmung des
Tumorzellwachstums
ERG-5
ERG3/5 niedriger
(*) ERG-3 mRNA bzw. Proteinexpression konnte jeweils nur in Kombination mit einer
anderen Spleißvariante (ERG-2 ) bzw. Isoform (ERG-5) untersucht werden.
Trennschärfe des Test. Der Wert der für die AUC liegt zwischen 0 und 1, wobei ein Wert näher an
1 für eine höhere Trennschärfe steht.
Im Patientenkollektiv 2 mit 50 Proben war miR-375 mit 67,3% (AUC=0,753) korrekt klassifizierter Proben der am besten positiv unterscheidende Faktor, miR-145 war mit 71,2% (AUC=0,800)
der am besten negativ diskriminierende Faktor. Die Kombination aus miR-375, miR-143 und miR145 war in der Lage, 90,4% (AUC=0,9556) der Proben richtig zu klassifizieren. Diese miRNA
Kombination konnte im Patientenkollektiv 1 (N=26) 71% (AUC=0,742) der Proben korrekt klassifieren und bei einer Kombination der beiden Patientenkollektive konnte eine korrekte Klassifikation
von 77,6% (AUC=0,81) erreicht werden. Für die beiden Datensets und die Kombination der Patientenkollektive war jeweils die Kombination der drei miRNAs der beste diskriminierender Faktor
für die Unterscheidung von Normal- und Tumorgewebe.
In Kopf-und-Hals Plattenepithelkarzinomen zeigte das Ratio aus verschiedenen miRNAs ein besseres prädiktives Potential für die Unterscheidung von Tumor- und Normalgewebe als die einzelnen
miRNAs (Avissar et al., 2009). Analog zur Studie von Avissar et al. (2009) wurde das Ratio von
miR-375/miR-145 und das Ratio von miR-375/miR-143 verwendet. Für das Ratio miR-375/miR145 wurde eine AUC von 0,920 und für das Ratio miR-375/miR-143 eine AUC von 0,932 ermittelt.
Somit kann für die eigenen Daten festgestellt werden, dass die Kombination aus den drei miRNAs
miR-375, miR-143 und miR-145 die höchste Trennschärfe erzielt im Vergleich zum Ratio aus zwei
miRNAs bzw. zur den einzelnen miRNAs.
Eine Korrelationsanalyse verschiedener miRNAs mit den klinischen Parametern Gleason Score,
Primär-Gleason Score und T-Stadium in beiden Patientenkollektiven sowie dem kombinierten Datenset zeigte eine übereinstimmende Korrelation von miR-141 mit dem Gleason Score (Kapitel 5.7).
In einer Studie wurde beim Vergleich von den klinisch validierten Biomarkern Lactatdehydrogenase,
zirkulierenden Tumorzellen und PSA mit zirkulierender miR-141 diese miRNA bei der Vorhersage
des klinischen Verlaufs von metastasiertem Prostatakarzinom als gleichwertig zu den Biomarkern
gefunden (Gonzales et al., 2011). Außerdem wurde zirkulierende miR-141 als neuer Biomarker im
Diskussion
75
Kolonkarzinom beschrieben, wo diese miRNA mit einer schlechten Prognose assoziiert ist (Cheng
et al., 2011).
In der Literatur wurden bereits weitere miRNAs mit prognostischem und diagnostischem Potential
beschrieben. Im Prostatakarzinom wurde miR-96 assoziiert gefunden mit dem biochemischen Rezidiv (Schaefer et al., 2010a) und in Nierenzellkarzinomen war miR-32 assoziiert mit einer schlechten
Prognose (Petillo et al., 2009).
Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass zahlreiche miRNAs im Prostatakarzinom eine differentielle Expression im Vergleich zum Normalgewebe aufweisen. Über die
Regulation von Zielgenen haben miRNAs einen Einfluss auf verschiedene zellbiologische Paramter,
wie Proliferation, Apoptose, Migration und Invasion.
Außerdem besitzen miRNAs ein diagnostisches Potential, da über die differentielle Expression Tumor
von tumorfreiem Gewebe unterschieden werden kann. Möglicherweise haben miRNAs dadurch das
Potential, als neuer Biomarker die Diagnostik und, über die Assoziation mit klinisch-pathologischen
Parametern, auch die Prognosemöglichkeiten des Prostatakarzinoms zu verbessern.
6.4 Ausblick
In der Zukunft sind weitere Untersuchungen notwendig, um die Rolle der miRNAs im Prostatakarzinom näher zu charakterisieren. Zum einen sollen weitere Zielgene für die, in unserer Arbeit
gefundenen, deregulierten miRNAs bestätigt und beschrieben werden. Insbesondere soll untersucht
werden, ob SLUG tatsächlich ein Zielgen der miR-375 ist und dadurch das Bindeglied zwischen
miR-375 und E-Cadherin darstellt.
Zum anderen sollen weitere miRNA Expressionsprofile erstellt werden:
1. Vergleich von niedrig- und hochaggressiven Tumoren.
2. Vergleich von metastasiertem und nicht-metastasierten Gewebe.
3. Vergleich von Primärtumor und Metastase.
Außerdem sollen in einem neuen Kollektiv mit die miRNA Expressionsdaten mit den Patientenüberlebensdaten korreliert werden, so dass möglicherweise über miRNA Expression eine Aussage
für das Überleben getroffen werden kann.
Darüberhinaus gibt es bereits erste Untersuchungen des Vorhandenseins von miRNAs in Serum, Urin
und Blut (Tzimagiorgis et al., 2011; Brase et al., 2010; Simpson et al., 2009). In unserer Arbeitsgruppe sollen in der Zukunft auch Serum, Blut und insbesondere Urinproben gesammelt werden. Ein
Vergleich der Expressionsprofile im Urin mit den Expressionsprofilen der Prostatatumoren und der,
ebenfalls in unserer Arbeitsgruppe vorhandenen, Expressionsdaten zu Nierenzellkarzinomen bietet
die Möglichkeit, über den Urin mögliche urologische Tumoren zu detektieren und zu identifizieren.
Material
77
7 Material
7.1 Chemikalien
Soweit nicht anders angegeben, wurden alle verwendeten Chemikalien von der Carl Roth GmbH &
Co. KG (Karlsruhe) bezogen.
Weitere verwendete Chemikalien:
Aquatex® (aequeus Mounting agent)
Merck KGaA, Darmstadt
DNAse I recombinant, RNase-free
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Fast Red TR Salt
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Fast SYBR® Green Master Mix
Applied Biosystems, Darmstadt
Magermilchpulver
AppliChem GmbH, Darmstadt
N,N-Dimethylformamid
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Naphtol-AS-MX-Phosphate
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Nuclear Fast Red Solution
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
peqGold Universal Agarose
Peqlab Biotechnologies, Erlangen
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix
Applied Biosystems, Darmstadt
Tetramisole hydrochloride
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Triton-X-100
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Trizol® Reagent
Invitrogen GmbH, Darmstadt
Tween-20
AppliChem GmbH, Darmstadt
7.2 Reagenzien für die Zellkultur
DPBS w/o Mg2+, with Calcium
Pan Biotech GmbH, Aidenbach
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Pan Biotech GmbH, Aidenbach
Fötales Rinderserum (FCS)
Pan Biotech GmbH, Aidenbach
Fötales Rinderserum aktivkohleabsorbiert (CTS) Pan Biotech GmbH, Aidenbach
Hepes buffer solution 1M
Pan Biotech GmbH, Aidenbach
78
Material
L-Glutamin
Pan Biotech GmbH, Aidenbach
Matrigel
BD Biosciences, Heidelberg
MEM NEAA 100x
Pan Biotech GmbH, Aidenbach
Penicillin/Streptomycin
Pan Biotech GmbH, Aidenbach
RPMI 1640
Pan Biotech GmbH, Aidenbach
Trypsin 0,25 % / EDTA 0,02 % in PBS
without
Ca2+
and
Pan Biotech GmbH, Aidenbach
Mg2+
7.3 Transfektionsreagenzien
jetPRIME
siPORTTM
Peqlab Biotechnologies, Erlangen
NeoFXTM
Transfection Agent
Nanofectin
Applied Biosystems, Darmstadt
PAA, Coelbe
7.4 antisense Oligonukleotide
Anti-miRTM miRNA Inhibitor -200c
Applied Biosystems, Darmstadt
Anti-miRTM
miRNA Inhibitor -375
Applied Biosystems, Darmstadt
Anti-miRTM
miRNA Inhibitors
Negative Control #1
Applied Biosystems, Darmstadt
MYO6 ON-TARGETplus SMARTpool
Thermo Fisher Scientific,
Lafayette, CO, USA
ON-TARGETplus Non-targeting Pool
Thermo Fisher Scientific,
Lafayette, CO, USA
SEC23A ON-TARGETplus SMARTpool
Thermo Fisher Scientific,
Lafayette, CO, USA
ERG2 *1 (UGCUAGAAACACAGAUUUA)
Thermo Fisher Scientific,
Lafayette, CO, USA
ERG2 *2 (GAAACACAGAUUUACCAUA)
Thermo Fisher Scientific,
Lafayette, CO, USA
ERG2 *3 (ACACAGAUUUACCAUAUGA)
Thermo Fisher Scientific,
Lafayette, CO, USA
Material
79
7.5 Antikörper
Antikörper
Spezies
Verdünnung im
Herkunft
Western Blot
anti-Sec23A GLSK 2H4
Ratte
1:15
Elisabeth
Kremmer,
Helmholtz-Zentrum-München
anti-GAPDH 14C10
Kaninchen 1:1000
New England Biolabs GmbH,
Frankfurt a.M.
anti-ERG 7. Serum
Kaninchen 1:100
Elisabeth
Kremmer,
Helmholtz-Zentrum München
anti-rabbit IgG Peroxi-
Ziege
1:5000
Dianova GmbH, Hamburg
Ziege
1:5000
Dianova GmbH, Hamburg
dase
anti-rat IgG Peroxidase
7.6 miRCURY LNA MicroRNA Detection Probes for in situ hybridization
Die MiRCURY LNATM MicroRNA Detection Probes for in situ hybridization und MiRCURY LNATM
MicroRNA Detection Control Probes wurden von Exiqon A/S, Vedbaek, Dänemark gekauft. Die
MicroRNA Detection Probes waren am 5’-Ende DIG-markiert.
miRNA Sonde
Sequenz
Scramble-miR (Kontrolle)
GTGTAACACGTCTATACGCCCA
U6, hsa/mmu/rno
CACGAATTTGCGTGTCATCCTT
miR-143
GAGCTACAGTGCTTCATCTCA
miR-145
AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC
miR-200c
TCCATCATTACCCGGCAGTATTA
miR-375
TCACGCGAGCCGAACGAACAAA
7.7 Geräte
Concentrator Plus
Eppendorf AG, Hamburg
LAS-1000 Luminescent Image Analyzer Berthold Technologies GmbH
& Co. KG, Bad Wildbad
Mikroskop Axiovert 200
Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena
80
Material
MJ Research PTC-200 Thermo Cycler
MJ Research
(heute Bio-Rad Laboratories GmbH, München)
NanoDrop ND-1000
Peqlab Biotechnologies, Erlangen
SpectraMax 190 Absorbance
Microplate Reader
Molecular Devices, Ismaning
StepOnePlus Real-Time PCR System
Applied Biosystems, Darmstadt
Tecan GENios FL
Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz
Thermomixer comfort
Eppendorf AG, Hamburg
Tischkühlzentrifuge (5415R)
Eppendorf AG, Hamburg
Tischzentrifuge (5424)
Eppendorf AG, Hamburg
Tischzentrifuge (Rotina 420 R)
Hettich Zentrifugen,Tuttlingen
Wasserbad (GFL 1002, GFL 1083)
GFL - Gesellschaft für
Labortechnik MbH, Burgwedel
7.8 Verbrauchsmaterialien
Culture Insert
ibidi GmbH, Martinsried
Invasion Chamber with 8.0 µM pores
BD Biosciences, Heidelberg
Invasion Chamber with 8.0 µM pores
Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen
MicroAmp® Fast Optical 96-Well
Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml
Applied Biosystems, Darmstadt
MicroAmp® Optical Adhesive Film
Applied Biosystems, Darmstadt
Polypropylenröhrchen (15 ml, 50 ml)
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml)
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Zellkultur Multiwell Platte 6, 24, 96 well
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Zellkulturflasche (25
cm2 ,
75
cm2 )
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
7.9 Kommerziell erhältliche Kits
MasterPureTM Complete DNA and RNA
Purification Kit
Epicentre Biotechnologies, Madison, WI
mirVanaTM
Applied Biosystems, Darmstadt
miRNA Isolation Kit
ZytoChemPlus (AP) Polymer Bulk Kit
Zyotmed Systems GmbH, Berlin
TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems, Darmstadt
Material
81
TaqMan® Reverse Transcription Reagents
Applied Biosystems, Darmstadt
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric)
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Caspase-Glo® 3/7 Assay
Promega GmbH, Mannheim
DyNAmo® cDNA Synthesis Kit
New England Biolabs, Frankfurt a.M.
7.10 TaqMan® MicroRNA Assays
Die TaqMan® MicroRNA Assays wurden von Applied Biosystems, Darmstadt gekauft. Es wurden
Assays für die folgenden miRNAs verwendet:
miRNA
Sequenz der reifen miRNA
Assay ID
hsa-miR-101
UACAGUACUGUGAUAACUGAA
002253
hsa-miR-126
UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG
002228
hsa-miR-141
UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG
000463
hsa-miR-143
UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC
002249
hsa-miR-145
GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU
002278
has-miR-148a
UCAGUGCACUACAGAACUUUGU
000470
hsa-miR-200a
UAACACUGUCUGGUAACGAUGU
000502
hsa-miR-200b
UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA
002251
hsa-miR-200c
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGG
000505
hsa-miR-22
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU
000398
hsa-miR-24
UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG
000402
hsa-miR-26a
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU
000405
hsa-miR-26b
UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU
000407
hsa-miR-375
UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA
000564
hsa-miR-429
UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU
001024
hsa-miR-9
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA
000583
RNU6b
CGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAA 001093
GCGTTCCATATTTTT
7.11 TaqMan® Gene Expression Assays
Die TaqMan® Gene Expression Assays wurden von Applied Biosystems, Darmstadt gekauft.
82
Material
Assay ID
Gen
Referenzsequenz(en)
Amplikonlänge
Hs00180143 m1
CUL5
NM 003478.3
117 bp
Hs00172768 m1
DEDD
NM 001039711.1
76 bp
NM 001039712.1
NM 032998.2
Hs01562062 m1
ERG
NM 182918.3,
199 bp
NM 001136154.1,
NM 001136155.1,
NM 004449.4
Hs01562061 m1
ERG Spleißvariante 2
NM 004449.4
83 bp
Hs01554627 m1
ERG Spleißvarianten 2/3
NM 004449.4,
63 bp
Hs01573964 m1
ERG Spleißvariante 5
NM 182918.3
128 bp
Hs00255188 m1
IPO7
NM 006391.2
102 bp
Hs99999905 m1
GAPDH
NM 002046.3
122 bp
7.12 Oligonucleotide
Die Synthese der Oligonukleotide (Primer) für die qRT-PCR wurde durch die Firma biomers.net
GmbH, Ulm, durchgeführt. Um die Amplifikation geringer genomischer DNA zu verhindern, wurden
die Primer für die mRNA Expressionsanalysen Intron-übergreifend gelegt.
Gen
Sequenz
Verwendung
E-Cadherin 5’-gaacgcattgccacatacac-3’
Amplifikation der cDNA von E-Cadherin
GAPDH
5’-catgagaagtatgacaacagcct-3’
Amplifikation der cDNA von GAPDH
MyosinVI
5’-actccatcctgacaagccac-3’
Amplifikation der cDNA von MyoVI
Sec23A
5’-tgcgttcctctggggtggca-3’
Amplifikation der cDNA von Sec23A
ZEB1
5’-cagcagaagctgagaagcc-3’
Amplifikation der cDNA von ZEB1
ZEB2
5’-tgtgcgaactgtaggaacca-3’
Amplifikation der cDNA von ZEB2
ZNF217
5’-ttgtgtgcctgctggtagtc-3’
Amplifikation der cDNA von ZNF217
7.13 Expressionsvektoren
Für den Expressionsvektor pSG5-miR-145 wurde die hsa-miR-145 mit den Primern miR-145 -EcoRI
5’-GGA ATT CCC AGA GCA ATA AGC CAC ATC C-3’ und miR-145-BamHI 5’-CGG GAT CCG
Material
83
GAA CAT GGT TCA TAA GCC CTC T-3’ PCR-amplifiziert und in den Vektor pSG5 (Stratagene,
Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co. KG, Waldbronn; Vektorkarte siehe Anhang)
kloniert (Szczyrba et al., 2010).
Für den Expressionsvektor pCEP4-SEC23A wurde der open reading frame von SEC23A mit den
Primern SEC23A-Xho1 5’-CCG CTC GAG CAA TGA CAA CCT ATT TGG-3’ und SEC23A-SAC1
5’-CGG GAT CCT CAA GCA GCA CTG GAC ACA GC-3’ PCR-amplifiziert und in den Vektor
pCEP4 (Invitrogen, Karlsruhe; Vektorkarte siehe Anhang) kloniert (Szczyrba et al., 2011).
Für den Expressionsvektor pMIR-ERG wurde ein 1 Kilobasenfragement der 3’UTR von ERG mit
den Primern 5´ERG-Spe-GAC TAG TGG AGG GAG TTA CTG AAG TC und ERG-3’-Sac-CGA
GCT CCG ATT GTC TCT TTT GTC G amplifiziert und in den SpeI/SacI verdauten pMIR-RNLTK Vektor kloniert, so dass das Firefly Luciferase (Phototinus pylaris) Gen unter die Kontrolle
der ERG 3’UTR gebracht wurde. Der pMIR-RNL-TK Vektor ist ein Derivat des pMIR-REPORT
Vektors (Applied Biosystems), in welchem der originale CMV Promotor durch den HSK-TK Promotor des pRL-TK Plasmids (Promega) ersetzt wurde. Ein Renilla reniformis Luciferase Gen unter
der Kontrolle eines SV40 Promotors wurde vom pRL-SV40 Plasmid (Promega) PCR-amplifiziert
und in die SspI Klonierunsstelle des pMIR-REPORT kloniert. Die Firefly kodierende Sequenz wird
von einer Multiple Cloning Site (MCS) am 3’ Ende flankiert. Das Plasmid trägt außerdem eine
Ampicillin-Resistenz. Außerdem wurde ein Vektor mit der mutierten Bindestelle für miR-145 generiert. Dafür wurde ortsgerichtete Mutagenese gemäß dem Protokoll für das QuickChange Site
Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) mit den Primern 5´PmlI-TCA AAT GAA AAT TCG CAC
GTG TTG TCT GAT ATT TAA und 3´PMLI-TTA AAT ATC AGA CAA CAC GTG CGA ATT
TTC ATT TGA durchgeführt (Hart et al., 2012).
7.14 Software
GraphPad Prism 5
GraphPad Software, La Jolla, USA
FujiFilm Image Reader LAS-1000 Pro V2.6
Berthold Technologies GmbH
& Co. KG, Bad Wildbad
ImageJ
National Institutes of Health
Magellan™ Data Analysis Software 6
Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz
Openlab 5.0
PerkinElmer, Massachusetts, USA
Softmax Pro 5.4.1
Molecular Devices, Ismaning
SPSS Statistics 19
IBM Deutschland GmbH, Ehningen
StepOnePlus™ Software
Applied Biosystems, Darmstadt
84
Material
7.15 Primärgewebe
Die Studie wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt und gemäß der Erklärung von Helsinki (World Medical Association Declaration of Helsinki, Ethical Principles for Medical Research
Involving Human Subjects) durchgeführt. Es wurden Gewebeproben nach radikaler Prostatektomie
von Prostatatumorgewebe und angrenzendem Normalgewebe gesammelt.
Für den Deep Sequencing Ansatz wurden je zwei Pools mit je fünf Gewebeproben von Normalgewebe bzw. Tumorgewebe generiert. Die Proben wurden in der Pathologie des Universitätsklinikum
des Saarlandes von Prof. Dr. Rainer Grobholz zur Verfügung gestellt. Die Patientencharakteristika
Alter bei Diagnosestellung, der Gleasongrad (Epstein et al., 2005) und die TNM-Klassifikation (tumor, node, metastasis) (Union Internationale contre le Cancer, UICC) wurden erfasst (siehe Tab.
7.1).
Für den qRT-PCR Ansatz wurden zwei unterschiedliche Kollektive verwendet. Die Proben von
Kollektiv 1 wurden 2005 und 2006 am Universitätsklinikum Regensburg (Prof. Dr. Wolf Wieland),
die Proben von Kollektiv 2 zwischen 1994 und 1996 am Universitätsklinikum Münster (PD Dr.
Elke Eltze) . Bei keinem der Patienten waren zum Zeitpunkt der Operation Metastasen entdeckt
worden.
Patientenkollektiv 1 bestand aus 26 kryokonservierten Proben. Alle Proben wurden von einem
Pathologen makrodisseziert, um einen Tumoranteil größer 70% in der Tumorprobe und Tumorfreiheit in der korrespondierenden Normalprobe zu gewährleisten. Patientenkollektiv 2 bestand aus 50
Formalin-fixierten, Paraffin eingebetteten Proben. Von den Gewebeproben wurden 10 µM Schnitte
angefertigt, welche durch einen Pathologen mikrodisseziert wurden. Für jeden Patienten wurden
die oben genannten Charakteristika erhoben (siehe Tab. 7.2).
Für die miRNA microArray Analyse wurden aus von den Gewebeproben aus Kollektiv 2 die 20
Proben mit korrespondierendem Normalgewebe ausgewählt, welche den höchsten Malignitätsgrad
(pT3a, pT3b sowie pT2b und pT2c mit gleichzeitig Primärgleason 4) aufwiesen (siehe Tab. 7.3).
Material
85
Tabelle 7.1. Patientencharakteristik für Pool 3 und 4
Patientencharakteristik für die Sequenzierungspools 3 + 4 mit Alter bei Diagnosestellung, Gleasongrad,
Primärgleason und T-Stadium der TNM Klassifikation (Anzahl und Angabe in Prozent der Gesamtprobenzahl).
Charakteristikum
Patientenzahl
Alter (Jahre)
Median
Altersspanne
T Stadium
pT2a
pT2b
pT2c
pT3a
pT3b
pT4
Gleasongrad
6
7
Primär Gleason
3
4
Pool 3
Pool 4
5
5
66
60-72
64
62-73
0
0
4
0
1
0
0%
0%
80%
0%
20%
0%
0
0
4
0
0
1
0%
0%
80%
0%
0%
20%
0
5
0%
100%
1
4
20%
80%
3
2
60%
40%
3
2
60%
40%
86
Material
Tabelle 7.2. Patientencharakteristik von Kollektiv 1 und 2
Patientencharakteristik für die Kollektive 1 und 2 mit Alter bei Diagnosestellung, Gleasongrad,
Primärgleason und T-Stadium der TNM Klassifikation (Anzahl und Angabe in Prozent der Gesamtprobenzahl).
Charakteristikum
Patientenzahl
Alter (Jahre)
Median
Altersspanne
T Stadium
pT2a
pT2b
pT2c
pT3a
pT3b
Gleasongrad
5
6
7
8
9
Primär Gleason
2
3
4
5
Kollektiv 1
Kollektiv 2
26
50
67,5
46-75
65
52-74
4
0
7
7
8
15,4%
0,0%
26,9%
26,9%
30,8%
0
3
21
21
5
0,0%
6,0%
42,0%
42,0%
10,0%
2
5
7
8
5
7,7%
19,2%
26,9%
30,8%
19,2%
6
1
41
0
2
12,0%
2,0%
82,0%
0,0%
4,0%
1
12
4
9
3,8%
46,2%
15,4%
34,6%
0
33
17
0
0,0%
66,0%
34,0%
0,0%
Material
87
Tabelle 7.3. Patientencharakteristik für die Gewebeproben für die miRNA microArray Analyse
Patientencharakteristik der Proben aus Kollektiv 2, welche für die miRNA microArray Analyse verwendet wurden, mit Alter bei Diagnosestellung, Gleasongrad, Primärgleason und T-Stadium der TNM
Klassifikation (Anzahl und Angabe in Prozent der Gesamtprobenzahl).
Charakteristikum
miRNA microArray
Patientenzahl
Alter (Jahre)
Median
Altersspanne
T Stadium
pT2b
pT2c
pT3a
pT3b
Gleasongrad
7
9
Primär Gleason
3
4
20
65,5
54-71
1
6
8
5
5%
30%
40%
25%
18
2
90%
10%
3
17
15%
85%
Methoden
89
8 Methoden
8.1 RNA Extraktion
8.1.1 RNA Extraktion mit Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform (TRIzol®) aus
kryokonserviertem Primärgewebe und Zellkultur
Die von den Fachärzten der Pathologie klassifizierten, kryokonservierten Primärgewebestücke wurden mit einem Mikropistill in 0,5 ml TRIzol® Reagent homogenisiert und gemäß dem Protokoll für
das TRIzol® Reagent von Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA RNA und Proteine (Kapitel 8.10.1)
isoliert. Zu den homogenisierten Geweben wurden je 0,5 ml TRIzol® Reagent zugegeben und 5
Min. bei RT inkubiert. Um RNA aus Zellkultur zu isolieren wurden zu den Zellen je 25 cm2 Zellkulturflasche 1 ml TRIzol® Reagent zugegeben und 5 Min. bei RT inkubiert. In 15 ml Falconröhrchen
wurde Chloroform (200 µl pro 1 ml TRIzol® Reagent) vorgelegt. Das Gewebe bzw. die Zellen in
TRIzol® Reagent wurden zum Chloroform hinzupipettiert, die Falconröhrchen wurden 15 Sekunden
invertiert, 3 Min. bei RT inkubiert und anschließend bei 4754 x g, 4°C für 25 Min. ohne Bremse
zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues 15 ml Falconröhrchen mit Isopropanol (0,5 ml pro
1 ml TRIzol® Reagent) überführt, 10 Min. bei RT inkubiert und erneut bei 4754 x g, 4°C für 25
Min. mit Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet mit 75% Ethanol
(1 ml pro 1 ml TRIzol® Reagent) gewaschen. Hierzu wurde bei 4754 x g, 4°C für 15 Min. mit
Bremse zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand verworfen und das Pellet bei RT getrocknet. Die RNA wurde in H2 O mit 0,1% (v/v) DEPC bei 37°C im Wasserbad für 30 Min. gelöst und
anschließend bei -80°C aufbewahrt.
8.1.2 RNA Isolation aus Formalin-fixiertem, Paraffin eingebettetem Gewebe mit dem
MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies,
Madison, WI)
Die Formalin-fixierten, Paraffin eingebetteten Gewebe wurden von einem Pathologen in 10 µM
Schnitte geschnitten, mikrodisseziert und in 300 µl Tissue and Cell Lysis Solution bis zur Aufarbeitung bei -80°C eingefroren. Die RNA Isolation erfolgte gemäß dem Protokoll des MasterPure
Complete DNA and RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI).
90
Methoden
Zum Gewebe in Tissue and Cell Lysis Solution wurden 167 ng/µl Proteinase K zugegeben, die
Lösung gemischt und bei 65°C für 30 Min. inkubiert. Alle 5-10 Min. wurde die Lösung gemischt.
Anschließend wurden 150 µl MCP Protein Precipitation Reagent hinzugegeben und gemischt. Die
Zellbruchstücke, Paraffin und Protein wurden bei 10.000xg und 4°C für 10 Min. pelletiert und
der Überstand in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Zum Überstand wurden 500 µl Isopropanol
gegeben und durch Invertieren gut gemischt. Die gesamten Nukleinsäuren wurden durch Zentrifugation bei 10.000 x g und 4°C für 10 Min. pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen, das
Pellet wurde in 200 µl DNAse I Lösung (1x DNAse I Puffer + 5 U DNAse I) resuspendiert und
bei 37°C für 10 Min. inkubiert. Es wurden 200 µl 2x T and C Lysis Solution zugegeben, gemischt
und 200 µl MCP Protein Precipitation Reagent zugegeben und gemischt. Die Lösung wurde anschließend 5 Min. auf Eis inkubiert. Die DNA und Proteine wurden bei F10.000 x g und 4°C für 10
Min. pelletiert. Der Überstand mit der RNA wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt, 500 µl
Isopropanol zugegeben und durch Invertieren gemischt. Nach Zentrifugation für 10 Min. bei 10.000
x g und 4°C wurde der Überstand abgenommen und das Pellet mit 500 µl 70% EtOH gewaschen.
Nach erneuter Zentrifugation für 10 Min. bei 10.000 x g und 4°C wurde der EtOH abgenommen
und das RNA Pellet in 50 µl H2 O DEPC resuspendiert. Zum Lösen der RNA wurde diese bei 37°C
für 30 Min. im Wasserbad inkubiert.
8.1.3 RNA Extraktion mit dem mirVana™ miRNA Isolation Kit
Zur Trennung von kleinen und großen RNA nach der Transfektion von Überexpressionsvektoren und
dem Knockdown mit anti-miRNA bzw. siRNA Oligonukleotiden in Zellkultur wurde die RNA Extraktion mit dem mirVana™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Darmstadt) durchgeführt.
Hierzu wurden die Zellen nach der Transfektion mit Trypsin von der Zellkulturflasche gelöst und
bei 300 x g 8 Min. zentrifugiert. Das Pellet wurde in 400 µl Lysis and Binding Solution aufgenommen, es wurden 40 µl Homogenate Additive hinzugegeben und die Lösung wurde 10 Min. auf Eis
inkubiert. Anschließend wurden 400 µl Acid-Phenol:Chloroform zugegeben und 10 Min. bei 4754 x
g ohne Bremse bei RT zentrifugiert. Die klare Phase wurde abgenommen, mit 1/3 Volumen 100%
EtOH gemischt, auf einen Filter gegeben und 30 Sek. bei 10.000 x g zentrifugiert. An den Filter war
jetzt die große RNA-Fraktion gebunden. Der Durchfluss wurde mit 2/3 Volumen 100% EtOH gemischt und auf einen frischen Filter gegeben. Zur Bindung der kleinen RNA-Fraktion an den Filter
wurde erneut 30 Sek. bei 10.000 x g zentrifugiert. Auf alle Filter (große und kleine RNA-Fraktion)
wurden 700 µl Waschlösung 1 gegeben und 30 Sek. bei 10.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss
wurde verworfen und die Filter zweimal mit je 500 µl Waschlösung 2 gewaschen. Der Durchfluss
wurde verworfen und die Filter nochmal 1 Min. bei 10.000 x g zentrifugiert. Die Filter wurden in
ein frisches Reaktionsgefäß umgesetzt und die RNA mit H2 O 0,1% (v/v) DEPC von den Filtern
eluiert. Hierzu wurden 60 µl H2 O DEPC, welches vorher auf 95°C erwärmt wurde, auf die Filter
pipettiert, 1 Min. bei RT inkubiert und anschließend 1 Min. bei 10.000 x g zentrifugiert.
Methoden
91
8.2 Photometrische Bestimmung der RNA Konzentration
Die Bestimmung der Konzentration der gewonnen RNA wurde photometrisch mit dem NanoDrop
ND-1000 (Peqlab) durchgeführt. Hierfür wurde die Absorption der RNA-Lösung bei 260 nm (A260)
gemessen mit H2 O 0,1% DEPC als Nullwert. Eine A260 von 1 entspricht dabei einer RNAKonzentration von 40 µg/µl.
8.3 DNAseI Behandlung
Um eventuelle Verunreinungen der RNA-Lösung mit DNA zu vermeiden, wurde nach der RNA
Extraktion die RNA-Lösung einer Behandlung mit RNAse freier DNAse I (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim) unterzogen.
10 − 50 µg RNA wurden mit dem entsprechenden Volumen 10x DNaseI Buffer und 10 U DNaseI
recombinant, RNAse-free gemischt. Der Ansatz wurde 20 Min. bei 37°C im Wasserbad inkubiert.
Zum Abstoppen der Reaktion wurde EDTA pH 8,0 zugegeben (Endkonzentration in der Lösung
8 mM) und der Ansatz 10 Min. bei 75°C inkubiert.
8.4 cDNA Synthese
Bei der cDNA Synthese wird mit Hilfe des Enzyms M-MuLV Reverse Transkriptase an der RNA
eine komplementäre DNA (c = complementary) synthetisiert. Hierzu benötigt die Reverse Transkriptase einen kurzen komplementären DNA-Abschnitt (Primer), welcher an die RNA bindet. So
wird ein cDNA Strang produziert, der mit dem ursprünglichen RNA Strang hybridisiert ist. Dieser RNA Strang wird vom Enzym RNAse H abgebaut und die DNA-Polymerase synthetisiert den
komplementären Strang zum schon bestehenden cDNA Strang.
92
Methoden
8.4.1 miRNA spezifische cDNA Synthese
Die miRNA spezifische cDNA Synthese wurde mit dem TaqMan® miRNA Reverse Transcription
Kit (Applied Biosystems) durchgeführt. Die cDNA Synthese erfolgte in 15 µl Ansätzen.
1x
Ansatz
10 ng
Gesamt-RNA
1x
Puffer
1,5
nM dNTP
3,8 U
RNAse Inhibitor
40 U
Reverse Transkriptase
1x
RT Primer (miRNA spezifisch)
Reaktionsbedinungen
16°C
30 Min.
42°C
30 Min.
85°C
5 Min
8.4.2 cDNA Synthese von Gesamt-RNA
8.4.2.1 cDNA Synthese mit dem TaqMan® mRNA Reverse Transcription Kit (Applied
Biosystems)
Die cDNA Synthese von Gesamt-RNA wurde mit dem TaqMan® mRNA Reverse Transcription Kit
(Applied Biosystems) durchgeführt. Die cDNA Synthese erfolgte in 20 µl Ansätzen.
1x
Ansatz
200 ng
RNA
1x
Puffer
Reaktionsbedinungen
11 nM
MgCl2
25°C
10 Min.
1 nM
dNTP
48°C
30 Min.
0,2 nM
Random Hexamer Primer
95°C
5 Min.
8U
RNAse Inhibitor
25 U
Reverse Transkriptase
Anschließend wurden die Ansätze 1:1 mit H2 O DEPC verdünnt.
8.4.2.2 cDNA Synthese mit dem DyNAmo™ cDNA Synthese Kit
Die cDNA Synthese von Gesamt-RNA wurde mit dem DyNAmo™ cDNA Synthese Kit (Finnzymes)
durchgeführt. Die cDNA Synthese erfolgte in 20 µl Ansätzen.
Methoden
93
1x
Ansatz
200 ng
RNA
1x
Puffer
300 ng
Random Hexamer Primer
25 U
Reverse Transkriptase m-MuLV
Reaktionsbedinungen
25°
10 Min.
37°C
30 Min.
85°C
5 Min.
Anschließend wurden die Ansätze 1:1 mit H2 O DEPC verdünnt.
8.5 Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR)
Die qRT-PCR beruht auf dem Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und bietet zusätzlich
die Möglichkeit der Quantifizierung der Expression der Zielgene anhand von Fluoreszenzmessungen
während jedem PCR-Zyklus. Die Messung der Zunahme der Fluoreszenz erfolgt am Ende der
Zyklen in der exponentiellen Phase der qRT-PCR. Für den Anfang der exponentiellen Phase wird
der CT - Wert (Threshold Cycle = Schwellenwertzyklus) angegeben, also der Wert, der den Zyklus
beschreibt, bei dem die Fluoreszenz das erste Mal über die Hintergrund-Fluoreszenz steigt.
8.5.1 qRT-PCR mit TaqMan® Assays
Bei der qRT-PCR mit TaqMan®Assays entsteht die Fluoreszenz dadurch, dass von einer Sonde,
welche an einem Ende mit einem Quencher (3’-Ende) und am anderen Ende mit ein Reporterfluoreszenzfarbstoff (5’-Ende, z.B. FAM) markiert ist, durch eine Taq-Polymerase mit einer zusätzlichen
5’3’-Exonuclease-Aktivität die Sonde während der Synthese des Gegenstrangs am 5’-Ende abgebaut
wird und Quencher und Fluoreszenzfarbstoff getrennt werden, wodurch der Fluoreszenzfarbstoff frei
wird (Chen et al., 2005). Die steigende Reporter-Fluoreszenz bei jedem Syntheseschritt wird dann
gemessen (Abb. 8.1). Für die Quantifizierung wurde außerdem eine interne Kontrolle (z.B. RNU6b,
GAPDH) benötigt. Anhand dieser internen Kontrolle können dann Variationen der Ausgangsmenge
der eingesetzten cDNA ausgeglichen werden (Normalisierung). Die relative Expression wurde anhand der 2−∆∆CT Methode berechnet (Livak und Schmittgen, 2001). Die Expression jeder Probe
wurde in Triplikaten gemessen.
1x
Ansatz
cDNA (mRNA)
5 ng
cDNA (miRNA)
333 pg
TaqMan Fast MasterMix (2x)
1x (5 µl)
TaqMan Assay (20x)
1x (0.5 µl)
H2 O
ad 10 µl
94
Methoden
Abbildung 8.1. Schematische Darstellung der Entstehung der Fluoreszenz bei der qRT-PCR
mit zweifach markierten Sonden
A) Sowohl die zweifach markierten Sonden als auch die PCR Primer binden an die Zielsequenz während
des Annealingschritts. Die räumliche Nähe von Fluorophor und Quencher verhindert die Fluoreszenz. B)
Während des Extensionsschrittes verlängert die Taq DNA Polymerase die Primer. Wenn das Enzym auf
die Probe trifft, wird durch die 5’-3’-Exonuclease-Aktivität der Polymerase das Fluorophor von der Probe
abgespalten. C) Die Sondenfragmente werden von der Zielsequenz freigesetzt und die Polymerisation des
Stranges wird fortgesetzt. Das Fluoreszenzsignal des freien Fluorophors wird gemessen. (Aus: TaqMan
Universal Master Mix Protocol, Introduction 1-3, Applied Biosystems, 2002/2010)
Methoden
95
Die Reaktion wurde in einem StepOnePlus™ Realtime PCR System (AppliedBiosystems)
durchgeführt.
Reaktionsbedinungen
1. Zyklus
95°C 20 Sek. (Denaturierung der DNA und Polymerase Aktivierung)
40 Zyklen
95°C 1 Sek. (Denaturierung)
60°C 20 Sek. (Elongation)
8.5.2 qRT-PCR mit SYBR Green I
Bei der qRT-PCR mit SYBR Green I bindet der SYBR Green I Farbstoff an doppelsträngige DNA
und fluoresziert dadurch stärker. Die Zunahme der Fluoreszenz korreliert mit der Zunahme der
Target-DNA von Zyklus zu Zyklus. Bei einer Schmelzkurvenanalyse wird die DNA aufgeschmolzen, indem die Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird (60°C bis 95°C). Bei einer für das
Fragment spezifischen Schmelztemperatur denaturiert der Doppelstrang zu zwei einzelsträngigen
Molekülen. Dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff (SYBR Green I) freigesetzt und es wird eine Fluoreszenzabnahme registriert. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen
höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung
möglich. Für die Quantifizierung wurde außerdem eine interne Kontrolle (GAPDH) benötigt. Anhand dieser internen Kontrolle können dann Variationen der Ausgangsmenge der eingesetzten cDNA
ausgeglichen werden (Normalisierung).
Die Expression jeder Probe wurde in Triplikaten gemessen.
1x
Ansatz
cDNA
50 ng
SybrFast MasterMix (2x)
1x (5 µl)
Vorwärtsprimer (100µM)
250 nM (0.5 µl)
Rückwärtsprimer (100µM)
100 nM (0.2 µl)
H2 O
ad 10 µl
Die Reaktion wurde in einem StepOnePlus™ Realtime PCR System (Applied Biosystems)
durchgeführt.
Reaktionsbedinungen
1. Zyklus
95°C 5 Min. (Denaturierung der DNA und Polymerase Aktivierung)
40 Zyklen
95°C 3 Sek. (Denaturierung)
60°C 30 Sek. (Elongation)
Schmelzkurve
96
Methoden
8.6 Zellkultur
In den Experimenten wurden kontinuierliche, adherente Zelllinien verwendet. Die verwendeten Zelllinien DU145, LNCaP and PC-3 stammen von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSMZ). Die Zelllinie VCaP stammt von der American Type Culture Collection
(ATCC). Die Zelllinie PNF-08 wurde von Prof. Dr. Gerhard Unteregger, Klinik und Poliklinik für
Urologie und Kinderurologie der Universität des Saarlandes, zur Verfügung gestellt. Als Kulturmedium für die Zelllinien DU145, LNCaP und PC-3 wurde RPMI 1640 mit Glutamin, hitzeinaktiviertem
FCS, Penicillin/Streptomycin, Hepes und nicht-essentiellen Aminosäuren verwendet. Die Zelllinien VCaP und PNF-08 wurden in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) mit Glutamin,
hitzeinaktiviertem FCS, Penicillin/Streptomycin, Hepes und nicht-essentiellen Aminosäuren kultiviert. Die Zellen wurden in Gewebezuchtflaschen im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert.
Alle Zellkulturarbeiten wurden steril in einer Zellkulturwerkbank durchgeführt. Alle Medienflaschen,
Pipettierhilfen, Pipetten und Reaktionsgefäßständer wurden vor Verwendung mit 70% Ethanol desinfiziert.
8.6.1 Zelllinien
DU145
Die Zelllinie DU145 wurde aus einer Metastase des zentralen Nervensystems eines 69 Jahre alten
Mannes mit Prostatakrebs etabliert. Es handelt sich um epitheliale Zellen, die adhärent als Monolayer wachsen (Mickey et al., 1980).
LNCaP
Die Zelllinie LNCaP wurde aus einer Lymphknotenmetastase eines 50 Jahre alten Mannes mit
Prostatakrebs etabliert. Die fibroblastoiden Zellen wachsen als Einzelzellen und in Zellhaufen. Die
Zellen wurden als androgen sensitiv beschrieben (Mickey et al., 1980; Akao, Nakagawa und Naoe,
2006; Horoszewicz et al., 1983).
PC-3
Die Zelllinie PC-3 stammt von einer Knochenmarkmetastase, welche von einem 62 Jahre alten
Mann mit Prostatakrebs isoliert wurde. Die Zellen wurden als nicht androgen sensitiv beschrieben.
Die epithelialen Zellen wachsen als Monolayer oder in Multilayerfoci (Kaighn et al., 1979).
PNF-08
Die normale humane Prostatafibroblastenzelllinie wurde von einem nichtmalignen Prostatagewebe
generiert und von Prof. Gerhard Unteregger (Urologische Universitätsklinik, Homburg/Saar) zur
Verfügung gestellt.
Methoden
97
VCaP
Die Zelllinie VCaP wurde aus einer Wirbelkörpermetastase eines Patienten, mit hormonrefraktärem
Prostatakrebs etabliert. Die Zelllinie wurde als androgen sensitiv beschrieben. Die Zellen exprimieren Prostataspezifisches Antigen (PSA) (Korenchuk et al., 2001).
8.6.2 Kultivieren und Passagieren von Zellen
8.6.3 Auftauen von Zellen
Die Zellen wurden bei 37° im Wasserbad aufgetaut, mit 8 ml RPMI 1640 Medium bzw. DMEM mit
10% FCS gemischt und 8 Min. bei 300 x g und RT zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Medium
aufgenommen und in 75cm2 Zellkulturflaschen überführt.
8.6.4 Einfrieren von Zellen
Die Zellen wurden in 10% DMSO, 40% FCS, 50% RPMI 1640 bzw. DMEM Medium aufgenommen
und in einer Einfrierbox zunächst für 24h bei -80°C langsam eingefroren. Anschließend wurden die
Zellen bei -80°C gelagert.
8.6.5 Passagieren von Zellen
Die Zellen wurden alle 2-4 Tage, je nach Teilungsrate, passagiert. Hierzu wurden die Zellen mit 3 ml
PBS gewaschen und anschließend mit 2,5 ml Trypsin/EDTA pro 75 cm2 von der Zellkulturflasche
abgelöst. Das Trypsin wurde durch Zugabe von RPMI 1640 bzw. DMEM mit 10% FCS inaktiviert.
Die Zellen wurden in ein 15 ml Falconröhrchen überführt und 8 Min. bei 300 x g und Raumtemperatur pelletiert. Das Zellpellet wurde in RPMI 1640 bzw. DMEM mit 10% FCS aufgenommen und
die Zellzahl bestimmt.
Die Zellen wurden folgendermaßen pro 75 cm2 eingesät:
DU145
2·106 Zellen
LNCaP
3·106 Zellen
PC-3
1·106 Zellen
VCaP
2·106 Zellen
98
Methoden
8.6.6 Bestimmung der Zellzahl
Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte mittels Neubauer-Zählkammer. Hierzu wurden 12 µl der
Zellsuspension mit 12 µl Trypanblau vermischt und von der 1:1 Mischung 12 µl in die NeubauerZählkammer überführt. Dies geschah durch Ansetzten der Pipettenspitze an der Kante der
Zählkammer, wobei die Suspension durch Kapillarkräfte zwischen Deckglas und Kammer gesaugt wurde. Anschließend wurden unter dem Mikroskop die großen Eckquadrate der Zählkammer
ausgezählt. Die Zellzahl wurde folgendermaßen berechnet:
Zellzahl pro ml =
Summe(Zellzahl der vier Großquadrate)
· 104
4
(2)
8.6.7 Transiente Transfektion von DNA
Der Plasmidtransfer in die Zelle erfolgte mit jetPRIMETM (Peqlab Biotechnologies, Erlangen),
einem nicht-liposomalen Molekül. Die Zellen wurden am Vortag in 6-Well-, 96-Well-Platte oder
Transwellinserts ausgesäht (Tab. 8.1). Das Verhältnis von DNA zu jetPRIMETM Reagenz betrug
1:2 (w/v), d.h. für 1 µg DNA wurden 2 µl jetPRIMETM Reagenz verwendet. Die DNA wurde im
jetPRIMETM Puffer resuspendiert und die ensprechende Menge jetPRIMETM Reagenz zugegeben
(Tab. 8.1). Die Suspension wurde kurz gemischt und 10 Min. bei RT inkubiert. Anschließend
wurde der Transfektionsmix tropfenweise auf die Zellen pipettiert. Der Transfektionsmix und das
Medium wurden durch Kippen der Platten gemischt. Die Inkubation erfolgte über 24h und 48h im
Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 .
Tabelle 8.1. Angaben zu Zellzahl, Mediummenge, DNA-Menge, jetPRIMETM Reagenz und Puffermenge je nach verwendeter Zellkulturplatte
Zellkulturplatte
Zellzahl
Medium
DNA Menge
6-Well-Platte
96-Well-Platte
Transwellinserts
250.000
6000
50.000
2 ml
60 µl
200 µl
2 µg
1 µg
0.5 µg
jetPRIME
Reagenz
4 µl
2 µl
1 µl
jetPRIME
Puffer
200 µl
100 µl
50 µl
8.6.8 Transiente Transfektion von miRNA antisense Oligonukleotiden
Die transiente Transfektion von miRNA antisense Oligonukleotiden in der Zellkultur erfolgte mittels des lipid-basierten siPORT™ NeoFX™ Transfection Agent und Anti-miR miRNA Inhibitors
(Applied Biosystems). Die Zellen wurden am Vortag in 6-Well-, 96-Well-Platte oder Transwellinserts ausgesät. Für den Transfektionsansatz wurde die entprechende Menge OptiMEM® mit
Methoden
99
der antisense-miRNA und anschließend dem siPORT™ NeoFX™ Transfection Agent gemischt
(Tab. 8.2) und 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Transfektionsansatz tropfenweise auf die Zellen gegeben und durch Kippen der Platte verteilt. Die Zellen wurden
im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
Tabelle 8.2. Angaben zu Zellzahl, Mediummenge, antisense-miRNA Endkonzentration, OptiMEM®
und siPORT™ je nach verwendeter Zellkulturplatte
Zellkulturplatte
6-Well-Platte
96-Well-Platte
Transwellinserts
Zellzahl
250.000
6000
50.000
Medium
2,5 ml
60 µl
200 µl
antisense-miRNA
30 nM
30 nM
30 nM
OptiMEM
ad 200 µl
ad 20 µl
ad 50 µl
siPort
5 µl
0.5 µl
1 µl
8.6.9 Transiente Transfektion von antisense Oligonukleotiden zur Verhinderung der
Genexpression von MYOSIN VI, SEC23A und ERG2
Die transiente Transfektion von Oligonukleotiden zur Verhinderung der Genexpression von MYOSIN VI, SEC23A und ERG2 in der Zellkultur erfolgte mittels jetPRIMETM Reagenz. Die Zellen
wurden am Vortag in 6-Well-, 96-Well-Platte oder Transwellinserts ausgesät.Für den Transfektionsansatz wurde die entprechende Menge jetPRIMETM Puffer mit den antisense Oligonukleotiden
und dem jetPRIME ReagenzTM gemischt (Tab. 8.3) und 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde der Transfektionsansatz tropfenweise auf die Zellen gegeben und durch Kippen
der Platte verteilt. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
Tabelle 8.3. Angaben zu Zellzahl, Mediummenge, Konzentration der antisense Oligonukleotide,
jetPRIMETM Reagenz und jetPRIMETM Puffer je nach verwendeter Zellkulturplatte
Zellkulturplatte
Zellzahl
Medium
6-Well-Platte
96-Well-Platte
Transwellinserts
250.000
6000
50.000
2 ml
60 µl
200 µl
antisense Oligonukleotide
10 nM
10 nM
10 nM
jetPRIME
Reagenz
4 µl
2 µl
1 µl
jetPRIME
Puffer
200 µl
100 µl
50 µl
8.7 Funktionelle Analysen
8.7.1 Migration und Invasion
Zur Messung der Fähigkeit zur Migration und der Invasivität der Zellen nach Transfektion wurden
die Zellen zunächst über 24h in Mangelmedium inkubiert. Das Mangelmedium für DU145 Zellen
100
Methoden
war RPMI 1640 mit 2% FCS, das Mangelmedium für LNCaP Zellen war RPMI 1640 mit 10% CTS.
Es wurden je 50.000 Zellen pro Insert in 200 µl RPMI 1640 mit 2% FCS (DU145 Zellen) bzw. 10%
CTS (LNCaP Zellen) in Transwellinserts ausgesät und, wie unter Abschnitt 8.6.7, 8.6.8 und 8.6.9
beschrieben, in Duplikaten transfiziert. Die Transwellinserts waren entweder unbeschichtet oder mit
50 µl Basement Membrane Extrakt (1:3 verdünnt mit RPMI ohne Zusätze) beschichtet. Je Well
wurden 500 µl RPMI mit 10% FCS zugegeben. Nach 48h wurden die Zellen mittels Cell Dissociation
Solution von der Unterseite der Membran gelöst. Hierzu wurden die Wells und Inserts zunächst mit
1x PBS gespült und anschließend wurden je Well 400 µl einer Cell Dissociaton Solution mit Calcein
AM (1:5000) zugegeben. Die Inkubation erfolgte für 1 h im Brutschrank bei 37◦ C und 5% CO2 .
Anschließend wurde die Unterseite der Inserts mit Cell Dissociation Solution/Calcein AM gespült
und die Zelllösung à 200 µl je Well in Duplikaten in eine schwarze 96-Well-Platte überführt. Als
Nullwert wurden zwei Wells mit Cell Dissociation Solution/Calcein AM ohne Zellen mitgeführt.
Die Messung erfolgte mit dem Tecan Platten Leser mit Magellan Software.
8.7.2 Wundheilungsassay
Der Wundheilungsassay erlaubt es, die Wanderung von Zellen zu beobachten. Mit Hilfe von Culture
Inserts (ibidi GmbH, Martinsried) wurde ein definierter Spalt von 500 µM in eine Kultur von Zellen
eingebracht. Es wurde je ein Culture Insert pro Well in eine 6-Well-Platte eingesetzt. Je Well des
Culture Inserts wurden 24500 Zellen der Zelllinie DU145 bzw. 28700 Zellen der Zelllinie LNCaP in
70 µl RPMI 1640 mit 10% FCS ausgesät. Außerhalb des Culture Inserts wurden 301.000 DU145
Zellen bzw. 352.600 Zellen LNCaP in 2 ml RPMI 1640 mit 10% FCS ausgesät. Die Zellen wurden
24h im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die Culture Inserts wurden vorsichtig mit
einer Pinzette entfernt, das Medium wurde abgenommen und 2 ml frisches RPMI 1640 mit 10%
FCS wurde zugegeben. Die Zellen wurden, wie unter Abschnitt 8.6.7, 8.6.8 und 8.6.9 beschrieben, transfiziert. Mit einem Axiovert 200 Mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging GmbH) und der
Openlab 5.0 Software wurde über 30 h alle 60 Min. ein Foto von jedem Well aufgenommen. Mit
Hilfe von ImageJ konnte die Spaltbreite vermessen werden. Hierfür wurde ein Rahmen entlang der
Zellgrenzen gelegt und die Fläche gemessen (Abb. 8.2). Aus diesen Werten wurde der Prozentsatz
an Wundheilung berechnet.
Wundheilung (%) =
t0 − tx
· 100
t0
t0 : Spaltbreite zum Zeitpunkt 0
tx : Spaltbreite zum Zeitpunkt x (6h, 12h, 18h, 24h, 30h)
(3)
Methoden
101
Abbildung 8.2. Auswertung mittels ImageJ
Für die Auswertung des Wundheilungsverhaltens wurde ein Rahmen entlang der Zellgrenzen gelegt und
die Fläche gemessen.
8.7.3 Analyse der Viabilität - MTT Assay
DU145 bzw. LNCaP Zellen wurden in 96-Well-Platten à 6000 Zellen pro Kavität ausgesät, 24h
später, wie unter Abschnitt 8.6.7, 8.6.8 und 8.6.9 beschrieben, transfiziert und weitere 24h später
die Viabilität der Zellen bestimmt. Zu den Zellen wurde MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide) mit einer Endkonzentrion von 1 mg/ml zugegeben. Das gelbe MTT
wird von den Mitochondrien lebender Zellen zu blauem Formazan reduziert. Nach 4 h Inkubation
im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 wurden 200 µl DMSO zugegeben und die Formazankristalle
1 h bei RT gelöst. Die optische Dichte (OD) dieser Lösung wurde im Spektrophotometer bei einer
Wellenlänge von 570 nm gemessen. Die Viabilität der Zellen wurde folgendermaßen berechnet:
Viabilität (%) =
OD Probe
· 100
OD Kontrolle
(4)
OD Probe: Absorptionswert von Proben, welche mit anti-miRNA bzw. siRNA transfiziert wurden.
OD Kontrolle: Absorptionswert von Proben, welche mit der Kontroll-anti-miRNA bzw. der KontrollsiRNA transfiziert wurden.
102
Methoden
8.7.4 Analyse der Proliferation - BrdU-ELISA
Beim BrdU-ELISA wird die Zellproliferation mittels Nachweis des Einbaus von 5’-Bromo-2’desoxyuridin (BrdU) als Analog für Thymidin während der DNA-Neusynthese von proliferierenden
Zellen gemessen. Die Detektion von BrdU erfolgt mittels eines Peroxidase-gekoppelten BrdUspezifischen Antikörpers. Gemessen wird die Umsetzung eines farbigen Substrates (Tetramethylbenzidin) durch die Peroxidase. Die Menge an farbigem Produkt wird durch Absorptionsmessung
im Spektrophotometer gemessen, wobei die Menge an farbigem Produkt proportional der Menge des eingebauten BrdU und damit proportional der Zellproliferation ist. DU145 bzw. LNCaP
Zellen wurden in 96-Well-Platten à 6000 Zellen pro Kavität ausgesät, 24h später in Triplikaten,
wie unter Abschnitt 8.6.7, 8.6.8 und 8.6.9 beschrieben, transfiziert und weitere 24h später der
BrdU-ELISA Test nach Angaben des Herstellers (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) durchgeführt. Die Messung am Spektrophotometer erfolgte bei einer Wellenlänge von 370 nm und einer
Referenzwellenlänge von 492 nm. Die Proliferation (%) wurde mit folgender Formel berechnet:
Proliferation (%) =
OD Probe
· 100
OD Kontrolle
(5)
OD Probe: Absorptionswert von Proben, welche mit anti-miRNA bzw. siRNA transfiziert wurden.
OD Kontrolle: Absorptionswert von Proben, welche mit der Kontroll-anti-miRNA bzw. der KontrollsiRNA transfiziert wurden.
8.7.5 Analyse der Zytotoxizität - LDH-Test
Der LDH-Test zur Bestimmung der Zytotoxizität beruht auf der Messung der Aktivität von Lactatdehydrogenasen, welche durch die beschädigte Plasmamembran von Zellen in das Medium gelangen.
Die Messung der LDH-Aktivität erfolgt enzymatisch, wobei die Reaktion in zwei Schritten erfolgt
(Abb. 8.3). Im ersten Schritt wird, durch die LDH-katalysierte Oxidation von Lactat zu Pyruvat,
NAD+ zu NADH/H+ reduziert. Im zweiten Schritt werden zwei Wasserstoffatome von einem Katalysator auf das Tetrazoliumsalz 2-[4-Iodophenyl-]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetratzoliumchlorid
(INT) übertragen, welches zu Formazan reduziert wird. Die Menge an rotem Formazan ist proportional zur Enzymaktivität und damit zur Menge an lysierten Zellen.
DU145 bzw. LNCaP Zellen wurden in 96-Well-Platten à 6000 Zellen pro Kavität ausgesät, 24h
später in Triplikaten, wie unter Abschnitt 8.6.7, 8.6.8 und 8.6.9 beschrieben, transfiziert und weitere
24h später der LDH-Test nach Angaben des Herstellers (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)
durchgeführt. Hierzu wurden 100 µl des Zellüberstandes in eine neue 96-Well-Platte überführt und
100 µl der Reaktionslösung mit Katalysator und INT-Farbstoff im Verhältnis 1:45 zugegeben. Die
Reaktionslösung wurde jeweils kurz vor dem Test vorbereitet. Die 96-Well-Platte wurde 30 Min. bei
Methoden
103
Abbildung 8.3. Enzymatische Bestimmung der LDH-Aktivität.
Die Reaktion verläuft in zwei Schritten. Im ersten Schritt wird durch die Lacatatdehydrogenase Lactat
zu Pyruvat oxidiert und NAD+ zu NADH/H+ reduziert. Im zweiten Schritt wird durch einen Katalysator 2H+ auf das Tetrazoliumsalz 2-[4-Iodophenyl-]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetratzoliumchlorid (INT)
übertragen, welches zum roten Formazan reduziert wird.
Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Messung der Absorption erfolgte im Spektrophotometer
bei eine Wellenlänge von 490 nm und einer Referenzwellenlänge von 670 nm. Die Zytotoxizität (%)
wurde anhand folgender Formel berechnet:
Zytotoxizität (%) =
OD Probe - OD Kontrolle Min.
· 100
OD Kontrolle Max. - OD Kontrolle Min.
(6)
OD Probe: Absorptionswert von transfizierten Proben
OD Kontrolle Min.: Absorptionswert von nicht behandelten Proben
OD Kontrolle Max.: Absorptionswert von Proben, die mit 1% (v/v) Triton-X-100 behandelt wurden; galt als 100% toxisch
8.7.6 Analyse der Apoptose - Caspase 3/7 Assay
Zur Messung der Apoptose wurde die Aktivität der Caspasen 3 und 7 gemessen. Diese CysteinAspartat spezifischen Proteasen (Caspase) spielen eine zentrale Rolle bei der Apoptose von
Säugerzellen. DU145 bzw. LNCaP Zellen wurden in schwarze 96-Well-Platten à 6000 Zellen pro
Kavität ausgesät, 24h später in Triplikaten, wie unter Abschnitt 8.6.7, 8.6.8 und 8.6.9 beschrieben,
transfiziert und weitere 24h später der Apoptose-Test nach Angaben des Herstellers (Promega
GmbH, Mannheim) durchgeführt. Zu den Zellen wurde das luminogene Substrat mit DEVD Sequenzmotiv zugegeben. Durch Spaltung des Substrats durch die Caspasen wird Aminoluciferin
freigesetzt, welches ein Substrat für die Luciferase ist, so dass in einer darauf folgenden Luciferasereaktion Licht emittiert wird (Abb. 8.4). Die Lumineszenz ist proportional zur Caspaseaktivitität
und damit zur Apoptosererate.
104
Methoden
Abbildung 8.4. Caspase 3/7 Aktivitätsnachweis
Spaltung des luminogenen Substrates mit DEVD Sequenzmotiv durch die Caspase-3/7. (aus Promega
Corporation, 2009)
8.8 miRNA In situ Hybridisierung
Entparaffinieren der Schnitte
Die Schnitte wurden zunächst 1 Stunde bei 60°C im Wärmeschrank inkubiert, um das überschüssige
Paraffin ablaufen zu lassen. Anschließend wurden die Schnitte für 10 Min. in 100% Xylol, 10 Min.
in 100% EtOH, 5 Min. in 70% EtOH und 2 Min. in H2 O 0,1% (v/v) DEPC inkubiert.
Deproteinieren der Schnitte
Um die Schnitte zu Deproteinieren wurden sie zunächst 15 Min. in 1x PBS (10x PBS: 1,37 M
NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2 HPO4 , 20 mM KH2 PO4 , pH 7,4) gewaschen. Anschließend erfolgte der Proteinverdau mit Proteinase K (50 µg/ml) für 30 Min. bei Raumtemperatur. Die Schnitte
wurden erneut 15 Min. in 1x PBS gewaschen und anschließend 10 Min. in 4% Formaldehydlösung
bei 4°C fixiert. Es erfolgte ein weiterer Waschschritt für 15 Min. in 1x PBS, anschließend wurden
die Schnitte in Essigsäureanhydrid/Triethanolamin (0,25% (v/v) Essigsäureanhydrid, 1,165% (v/v)
Triethanolamin, immer kurz vor Gebrauch angesetzen) für 5 Min. inkubiert, um unspezifischen Hintergrund zu blockieren und anschließend erneut 15 Min. in 1x PBS gewaschen.
Prähybridisierung
Zur Prähybridisierung der Schnitte wurden diese 2 Stunden in Prähybrdisierungspuffer (200 µl pro
Schnitt)(50% (v/v) Formamid, 5x SSC, 50 µg/ml Heparin, 50 µg/ml Hefe-tRNA, 2% (w/v) blocking
powder (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim), 0.1% (v/v) Tween 20, 5 mM EDTA, auf 50°C
erhitzen bis zum Lösen des blocking powder s, in Aliquots bei -80°C aufbewahren) mit Deckglas bei Hybridisierungstemperatur inkubiert. Die Hybridisierungstemperatur lag 21-22°C unter der
Schmelztemperatur (Tm) der miRNA Sonden (Tab. 8.4). Die Schnitte wurden in einer feuchten
Kammer mit Formamid/SSC im Wasserbad inkubiert.
Methoden
105
Hybridisierung
Die Sonden wurden auf 5 µM in H2 O 0,1% (v/v) DEPC verdünnt und bei 80°C für 5 Min. linearisiert. Die linearisierte Sonde wurde 1:80 mit Hybridisierungspuffer (50% (v/v) Formamid, 20 mM
Tris-HCl pH 8,0, 0.3 M NaCl, 10% (w/v) Dextran Sulfat, 0.5 Mg/mL (w/v) Hefe-tRNA, 1x Denhardts solution, in Aliquots bei -80°C aufbewahren) verdünnt und à 200 µl auf die Schnitte gegeben.
Die Schnitte wurden mit Deckglas in einer feuchten Kammer mit Formamid/SSC bei Hybridisierungstemperatur im Wasserbad über Nacht inkubiert (Tab. 8.4).
Waschen der Schnitte
Die Schnitte wurden zunächst in 5x SSC (20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0) für 20
Min. auf dem Orbitalschüttler gewaschen. Dann erfolgte ein Waschschritt mit Waschpuffer 1 (50%
(v/v) Formamid, 0,1% (v/v) Tween-20, 1x SSC) für 1 Stunde bei Hybridisierungstemperatur (Tab.
8.4). Lediglich für die Sonde für miR-200c wurde die Waschtemperatur auf 45°C erniedrigt, um
das Signal zu verstärken. Anschließend wurden die Schnitte für 15 Min. in Waschpuffer 2 (0,2x
SSC) und dann für 15 Min. in 1x PBS bei RT auf dem Orbitalschüttler gewaschen.
Immunologische Detektion
Zur Detektion der miRNA Sonden wurden die Schnitte für 1 Stunde in Blockierungspuffer 1 (0,5%
(w/v) blocking powder, 10% (w/v) hitzeinaktiviertes Ziegenserum, 0,1% (v/v) Tween-20, in 1x
PBS auf 50°C erhitzen bis zum Lösen des blocking powder s, in Aliquots bei -20°C aufbewahren)
und dann für 2 Stunden mit dem anti-DIG-Antikörper (1:250 verdünnt in Blockierungspuffer 2
(0,5% (w/v) blocking powder, in 1x PBS, auf 50°C erhitzen bis zum Lösen des blocking powder s,
bei 4°C aufbewahren)) inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte je zweimal 30 Min. in Waschpuffer 3 (0,1% (v/v) Tween-20 in 1x PBS), zweimal 20 Min. in 1x PBS und 5 Min. in NTT-Puffer
gewaschen.
Farbreaktion
Die Schnitte wurden mit NBT/BCIP/Levamisol (Stock Lösung NBT/BCIP 1:50 in NTT Puffer
verdünnen + 2 mM Levamisol; NTT Puffer: 100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 0,1% (v/v)
Tween-20)) über Nacht im Dunkeln bei RT in einer feuchten Kammer mit H2 O 0,1% (v/v) DEPC
inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte für je 5 Min. in KTBT Stopplösung (50 mM
Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM KCl, 1% (v/v) Tween-20, 150 mM NaCl), 1x PBS und H2 O 0,1%
(v/v) DEPC gewaschen. Abschließend erfolgte liegend die Gegenfärbung mit Nuclear Fast Red. Die
Schnitte wurden getrocknet und mit Aquatex eingedeckt.
8.9 miRNA Microarray
Die miRNA Microarray Experimente wurden von Dr. Arif Ekici, Humangenetisches Institut, Universitätsklinikum Erlangen durchgeführt. Hierfür wurden GeneChip miRNA Microarrays V1.0 (Affy-
106
Methoden
Tabelle 8.4. Schmelztemperatur und (Prä-)Hybridisierungstemperatur der miRNA Sonden
miRNA Sonde
miR-200c
miR-375
miR-145
miR-143
scramble miRNA
mmU6
Schmelztemperatur
74°C
81°C
78°C
72°C
78°C
75°C
Hybridisierungstemperatur
52°C
60°C
57°C
51°C
57°C
54°C
metrix, Santa Clara, CA, USA) gemäß der Herstellerangaben verwendet. Dieser Array trug 7815
sequenzspezifische Proben, welche miRNAs von 71 Organismen abdecken, davon 678 humane
miRNAs, wie sie in der miRBase v11.0 (http://www.mirbase.org) gelistet sind. Die hybridisierten
Microarrays wurden gescannt und die Signalintensität mit der Partek Software Version 6.2 (Partek
Inc., St. Louis, MO, USA) analysiert.
8.10 Proteinbiochemische Methoden
8.10.1 Gewinnung von Zelllysaten mit Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform
(TRIzol®) aus cryokonserviertem Primärgewebe und Zellkultur
Nach der RNA-Isolation (siehe 8.1.2) wurde zur Interphase und Phenol-Chloroform Phase 100%
EtOH (0,3 ml pro 1 ml TRIzol®) gegeben, gemischt und bei RT 3 Min. inkubiert. Die DNA wurde
bei 2000 x g und 4°C für 5 Min. pelletiert. Der Überstand wurde in eine frisches Reaktionsgefäß
überführt, mit Isopropanol (1,5 ml pro 1 ml TRIzol®) gemischt und 10 Min. bei RT inkubiert. Die
Proteine wurden bei 12000 x g bei 4°C für 10 Min. gefällt. Der Überstand wurde verworfen und das
Pellet mit 0,3 M Guanidinhydrochlorid in 95% EtOH (2 ml pro 1 ml TRIzol®) gewaschen. Nach
Inkubation von 20 Min. bei RT, wurde die Proteine bei 7500 x g bei 4°C für 5 Min. pelletiert. Der
Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Anschließend wurde das Proteinpellet mit 100% EtOH (2
ml pro 1 ml TRIzol®) gewaschen, bei 7500 x g bei 4°C für 5 Min. zentrifugiert und das Pellet 2
Min. vakuumgetrocknet. Das Proteinpellet wurde in 1% SDS bei 50°C resuspendiert, unlösliche
Zellrückstände wurden durch Zentrifugation bei 10.000 x g bei 4°C für 10 Min. abgetrennt und der
Proteinüberstand in ein frisches Reaktionsgefäß überführt.
8.10.2 Messung der Proteinkonzentration (BCA)
Die Messung der Proteinkonzentration mit Roti-Quant® Universal (Carl Roth GmbH & Co. KG,
Karsruhe) beruht auf der Biuret-Reaktion. Dabei werden Cu2+ Ionen zu Cu+ Ionen reduziert,
Methoden
107
wobei die Farbentwicklung direkt proportional ist zur Proteinkonzentration. Die Messung erfolgte
bei 492 nm im Spektrophotometer. Die Proteinmenge wurde anhand einer Standardkurve mit BSA
(bovines Serumalbumin) berechnet.
8.10.3 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen
Die Proteinsuspensionen wurden nach dem Molekulargewicht in einem SDS(sodium dodecyl sulfate)-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Hierzu wurde ein denaturierendes SDS Gel mit
Trenn- und Sammelgel gegossen. Die Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel ist in Tab. 8.5
zusammengefasst.
Tabelle 8.5. Übersicht der verwendeten Einzelkomponenten zur elektrophoretischen Auftrennung von
Proteinen mittels SDS-Gelelektrophorese
Komponente
1 M Tris-HCl pH 8,8 (ml)
1 M Tris-HCl pH 6,8 (ml)
H2 O (ml)
30% Acrylamid/ Bisacrylamid (ml)
10% SDS (ml)
APS (15 mg/ml) (ml)
TEMED (µl)
Trenngel (8%)
11,7
9,5
8,3
0,31
0,78
28,2
Sammelgel (4%)
1,49
8,4
1,68
0,12
0,6
12
Es wurden 20 µg der Proteinlösung mit der entsprechenden Menge 5-fach konzentriertem Ladepuffer (312,5 mM Tris pH 6,8, 10% (w/v) SDS, 25% (v/v) Glycerin, 1 mM EDTA, 500 mM
DTT, 0,005% (w/v) Bromphenolblau, 0,005% (w/v) Pyronin Y) gemischt, bei 95°C für 5 Min.
denaturiert und aufgetragen. Der Gellauf erfolgte für 3 h bei konstant 40 mA, als Laufpuffer diente
die entsprechende Verdünnung einer 5-fach konzentrierten Stammlösung (5x SDS-Laufpuffer: 1,25
M Glycin, 125 mM Tris, 0,5% (w/v) SDS, ohne pH-Einstellung).
Anschließend wurden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine NitrozelluloseMembran übertragen. Die Semi-Dry Transferkammer wurde entsprechend den Angaben des Herstellers aufgebaut, dabei kamen folgende Lösungen zum Einsatz: Anodenpuffer 1 (2,5 mM Tris,
30% (v/v) Methanol, ohne pH-Einstellung), Anodenpuffer 2 (300 mM Tris, ohne pH-Einstellung),
Kathodenpuffer (40 mM 6-Aminohexansäure). Der Transfer erfolgte für 90 Min. bei konstanter
Stromstärke. Die Stromstärke (mA) entsprach dabei der Fläche des Acrylamidgels in cm2 (1 cm2
=
b 1 mA).
Um die Übertragung der Proteine auf die Membran zu bestätigen, wurde eine reversible Färbung
mit Ponceau S durchgeführt. Hierzu wurde die Membran zunächst kurz mit deionisiertem Wasser
108
Methoden
gewaschen und anschließend für 1 Min. mit der Färbelösung inkubiert. Um den an die Proteine
gebunden Farbstoff wieder zu entfernen, wurde die Membran für 5 Min. unter Schütteln mit 1x
TBST (10x TBST: 200 mM Tris pH 7,4, 1,5 M NaCl, 1% (v/v) Tween 20) gewaschen. Für die
Detektion der Proteine mit spezifischen Antikörpern wurde die Membran über Nacht mit einer 5%
(v/v) Magermilchpulverlösung (MMP in 1x TBST) inkubiert, um die freien Bindungsstellen auf
der Membran zu blockieren.
Am nächsten Tag wurde die Membran 1 h mit dem Primärantikörper (entsprechende Verdünnung
in 5% (w/v) MMP/TBST mit 0,1% Natriumazid) inkubiert, anschließend 3 Mal 10 Min. mit 1x
TBST gewaschen und dann mit dem Sekundärantikörper (entsprechende Verdünnung in 5% (w/v)
MMP/TBST mit 0,1% Natriumazid) 1 h inkubiert. Die Membran wurde erneut 3 mal 10 Min. mit
1x TBST gewaschen und anschließend mit deionisiertem Wasser 30 Sek. neutralisiert. Die Detektion erfolgte mittels Chemilumineszenz (Roti®-Lumin, Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe) am
LAS-1000 Lumineszenzdetektionssystem (Berthold Technologies GmbH, & Co. KG, Bad Wildbad).
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109
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Anhang
125
10 Anhang
10.1 Abkürzungen
A
Ampère
A260
Absorption bei 260 nm
A280
Absorption bei 280 nm
Abb.
Abbildung
AK
Antikörper
APS
Ammoniumpersulfat
AUC
area under the curve
bp
Basenpaare
BCA
bicinchoninic acid assay
BSA
Bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
ca.
circa
Ca2+
Calcium
cDNA
complementary DNA
CT
Threshold Cycle = Schwellenwertzyklus
CTS
charcoal treated serum (Fötales Rinderserum, aktivkohleadsorbiert)
Da
Dalton
DEPC
Diethylpyrocarbonat
d.h.
das heißt
DIG
Digoxigenin
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimethylsulfoid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNase
Desoxyribonuklease
dNTP
Desoxyribonucleosidtriphosphat
DTT
Dithiothreitol
ECL
Enhanced Chemiluminescence
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
126
Anhang
et al.
et alii (und andere)
etc.
et cetera
EtOH
Ethanol
evtl.
eventuell
FCS
fetal calf serum
g
Erdbeschleunigung (9,81 m/s2 ); Gramm
GAPDH
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
h
Stunde
HEPES
hydroxyethylpiperazine-ethanesulfonic acid
ID
Identifikator
kDa
Kilodalton
LNA
locked nuceic acid
M, mM
Molar (1 mol/l), Millimolar
m
Milli-
µ
Mikro-
Mg2+
Magnesium
Min.
Minute
miRNA
microRNA
MMP
Magermilchpulver
mRNA
messenger RNA
N
Anzahl der Fälle
NEAA
non-essential aminoacids
nm
Nanometer
No
Normalgewebe
p-Wert
Irrtumswahrscheinlichkeit
PBS
phosphat buffered saline
PCa
Prostatakarzinom
PCR
Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
pH
potentia Hydrogenii
qRT-PCR
quantitative realtime PCR
RISC
RNA induced silencing complex
RNA
Ribonukleinsäure
RNAse
Ribonuklease
ROC
Receiver operating charakteristics
rpm
Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
RT
Raumtemperatur
SDS
Sodiumdodecylsulfat
Sek.
Sekunde
Anhang
127
siRNA
small interfering RNA
Tab.
Tabelle
Taq
Thermus aquaticus
TBS
Tris buffered saline
TBST
tris buffered saline with tween 20
TEMED
Tetramethylethylendiamin
TNM
tumor, nodes, metastasis
Tu
Tumorgewebe
Tris
Trishydroxymethylaminomethan
U
Unit (Einheit der Enzymaktivität)
3’UTR
3’ untranslatierte Region
u.a.
unter anderem
V
Volt
v/v
Volumen pro Volumen (volume per volume)
vgl.
Volt
vgl.
vergleiche
WB
Western Blot
w/v
Gewicht pro Volumen (weight per volumen)
128
Anhang
10.2 Plasmidkarten
Abbildung 10.1. pCEP4 Vektorkarte
Invitrogen, Karlsruhe
Anhang
Abbildung 10.2. pSG5 Vektorkarte
Stratagene, Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co. KG, Waldbronn
129
130
Anhang
Abbildung 10.3. pMIR-REPORT Vektorkarte
Applied Biosystems, Darmstadt
Abbildungsverzeichnis
131
Abbildungsverzeichnis
3.1
Einteilung der Drüsenmorphologie nach D.F. Gleason . . . . . . . . . . . . . . . .
7
3.2
miRNA Prozessierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
5.1
Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis) . . . . . . . . . . . . .
28
5.2
Hierarchische Clusteranalyse
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
5.3
Venn Diagramm von Sequenzierung und miRNA microArray . . . . . . . . . . . .
30
5.4
3’UTR von MYO6 mit potentiellen miRNA Bindestellen . . . . . . . . . . . . . .
33
5.5
Relative Expression von ZEB1, ZEB2, SEC23A, MYO6, ZNF217 und ERG
. . . .
35
5.6
Sec23A Proteinexpression in Prostataprimärgeweben . . . . . . . . . . . . . . . .
37
5.7
Proliferation, Viablity, Zytotoxizität und Apoptose in DU145 und LNCaP Zellen
nach miRNA Knockdown. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
5.8
Wundheilungsverhalten von DU145 Zellen nach miRNA Knockdown . . . . . . . .
41
5.9
Modell für Migration bzw. Invasion mittels Zellkulturinserts . . . . . . . . . . . . .
42
5.10 Migrations- und Invasionsverhalten von DU145 Zellen nach Kockdown von miR200c, miR-375 und miR-200c/miR-375
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
5.11 Proliferation, Viabilität, Zytotoxizität und Apoptose in DU145 und LNCaP Zellen
nach Transfektion des SEC23A Expressionsvektors bzw. der SEC23A siRNA. . . . .
45
5.12 Wundheilungsverhalten von DU145 Zellen nach Knockdown und ektoper Expression
von Sec23A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
5.13 Wundheilungsverhalten von LNCaP Zellen nach Knockdown und ektoper Expression
von Sec23A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
5.14 Migration- und Invasionsverhalten von DU145 Zellen nach ektoper Expression bzw.
Knockdown von Sec23A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
5.15 Nachweis der miRNA Expression in Gewebeschnitten mittels miRNA in situ Hybridisierung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50
5.16 ROC Kurven der miRNAs in den zwei Kollektiven . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
5.17 Expression von ERG und der ERG Spleißvarianten . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
5.18 Schematische Darstellung der ERG Isoformen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
5.19 Beispielhafter Western Blot zur Detektion von ERG . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
5.20 Relative Expression von ERG, den ERG Spleißvarianten und miR-145 in fusionsnegativen und fusionspositiven Tumoren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
5.21 Apoptose, Proliferation und Invasion nach Knockdown von ERG-2 und ektoper
Expression von miR-145. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
132
Abbildungsverzeichnis
6.1
Mögliches regulatorisches Netzwerk der Apoptoseregulierung mit den miRNAs miR200c und miR-375. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2
67
Mögliches regulatorisches Netzwerk der EMT-Regulierung mit den miRNAs miR200c und miR-375
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
68
6.3
Schematische Darstellung von miR-200c, miR-375 und deren Zielgenen . . . . . .
70
8.1
Schematische Darstellung der Entstehung der Fluoreszenz bei der qRT-PCR mit
zweifach markierten Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
94
8.2
Auswertung mittels ImageJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
8.3
LDH-Aktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
8.4
Caspase 3/7 Aktivitätsnachweis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
10.1 pCEP4 Vektorkarte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
10.2 pSG5 Vektorkarte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
10.3 pMIR-REPORT Vektorkarte
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
Tabellenverzeichnis
133
Tabellenverzeichnis
3.1
TNM-Klassifikation des Prostatakarzinoms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
5.1
Differentiell exprimierte miRNAs im Deep Sequencing Ansatz. . . . . . . . . . . .
20
5.2
Relative Expressionslevel der miRNAs in Prostatakarzinomzelllinien und Prostatanormalfibroblasten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3
22
Stabilitätsberechnung der Kandidatenreferenzgene RNU6b und RNU44 im Vergleich zu miR-200c, miR-375, miR-145 und miR-143. . . . . . . . . . . . . . . . .
23
5.4
Relative Expression der miRNAs im Prostatagewebe von Kollektiv 1. . . . . . . . .
25
5.5
Relative Expression der miRNAs im Prostatagewebe von Kollektiv 2. . . . . . . . .
25
5.6
Differentiell exprimierte miRNAs in der miRNA microArray Analyse im PCa. . . . .
27
5.7
Zielgene für die miRNAs miR-143, -145, -200c, -375, -22, -24, -148a. . . . . . . .
32
5.8
Relative Expression der Zielgene in den Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
5.9
Relative Expression von CUL5, DEDD, ERG, IPO7, MYO6, SEC23A, ZEB1, ZEB2
und ZNF217 in den Prostatageweben. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
5.10 Diagnostisches Potential von miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
5.11 NCBI Spleißvarianten und entprechende SWISS-Prot Isoformen . . . . . . . . . . .
56
6.1
Vergleich verschiedener miRNA Expressionsstudien mit eigenen Daten . . . . . . .
64
7.1
Patientencharakteristik für die Tumorgewebe-Sequenzierungspools 3 und 4 . . . . .
85
7.2
Patientencharakteristik von Kollektiv 1 und 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
86
7.3
Patientencharakteristik für die Gewebeproben für die miRNA microArray Analyse .
87
8.5
Übersicht der verwendeten Einzelkomponenten zur elektrophoretischen Auftrennung
von Proteinen mittels SDS-Gelelektrophorese
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Eigene Publikationen, wissenschaftliche Vorträge und Posterpräsentationen
135
Eigene Publikationen, wissenschaftliche Vorträge und
Posterpräsentationen
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Strissel PL, Ellmann S, Löprich E, Thiel F, Fasching PA, Stiegler E, Hartmann A, Beckmann MW,
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under revision Juni 2012
136
Eigene Publikationen, wissenschaftliche Vorträge und Posterpräsentationen
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Nolte E*, Szczyrba J*, Wach S, Kremmer E, Stöhr R, Hartmann A, Wieland W, Wullich B, Grässer
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Nolte E, Wach S, Szczyrba J, Stöhr R, Hartmann A, Wieland W, Grässer FA, Wullich B, Taubert
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Kongress der American Association for Cancer Research (AACR), Chicago, IL, April 2012
Wissenschaftliche Vorträge:
Nolte E*, Szczyrba J*, Wach S, Kremmer E, Stöhr R, Hartmann A, Wieland W, Wullich B,
Grässer FA. SEC23A ist ein Zielgen von miR-200c und miR-375 im Prostatakarzinom und beein”
flusst das Zellwachstum in vitro.“ 8. Jahrestagung des Deutschen Prostatakarzinomkonsortiums,
Otzenhausen, 10.-11. Dezember 2010
Nolte E*, Szczyrba J*, Wach S, Kremmer E, Stöhr R, Hartmann A, Wieland W, Wullich B, Grässer
FA. SEC23A ist ein Zielgen von miR-200c und miR-375 im Prostatakarzinom und beeinflusst das
”
Zellwachstum in vitro.“ 3. Symposium Urologische Forschung der Deutschen Gesellschaft für Urologie, Jena, 17.-19. November 2011
* Beide Autoren trugen gleichermaßen zur Publikation bei.
Preis:
AUF-Forschungspreis, Arbeitskreis Urologische Forschung der Deutschen Gesellschaft für Urologie,
Jena, 17.-19. November 2011
Danksagung
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Danksagung
Ich bedanke mich ganz herzlich bei Prof. Dr. med. Bernd Wullich für die Möglichkeit, meine
Promotionsarbeit in seiner Arbeitsgruppe Molekulare Urologie anfertigen zu können. Vielen Dank
für das stete Interesse am Fortgang meiner Arbeit, für die Diskussion der Ergebnisse, für die
Möglichkeit, meine eigenen Ideen einzubringen und auch für die vielfältigen Möglichkeiten, meine
Arbeit bei Kongressen zu präsentieren.
Vielen Dank an Prof. Dr. rer. nat. Lars Nitschke für die freundliche Übernahme der Betreuung und
Begutachtung meiner Promotionsarbeit.
Vielen Dank an Prof. Dr. rer. nat. Helge Taubert für die Unterstützung bei der Versuchsplanung,
für die Diskussion und Interpretation meiner Ergebnisse, sowie die Übernahme der Begutachtung
meiner Promotionsarbeit.
Ein ganz besonderer Dank gebührt Sven. Mit den Diskussionen über erwartete und unerwartete
Ergebnisse, mit deiner Unterstützung bei den Versuchen und bei der Fehleranalyse hast du mir mit
deinem ungeheuren Wissenschatz so manches Mal aus der Klemme geholfen. Vielen Dank auch für
den ”Freitagsirrsinn”.
Ganz herzlicher Dank geht an die anderen Laborkollegen Anne, Katrin und Omar für eine tolle
Arbeitsatmosphäre.
Prof. Dr. Friedrich Grässer, Jarek und Martin aus dem Institut für Virologie der Universität des
Saarlandes sage ich danke für eine ganz besondere Kooperation.
Ein goßes Dankeschön an PD Dr. rer. nat. Robert Stöhr für das geduldige Heraussuchen, Schneiden und Vorbereiten der Proben.
Meinen Eltern danke ich von ganzem Herzen dafür, dass ihr immer an mich geglaubt habt,
mir das Studium ermöglicht habt und mich auch während der Promotion immer unterstützt habt.
Danke an meinen Bruder Simon für das geduldige Korrekturlesen, auch wenn du nicht allzu viel
vom Inhalt verstanden hast. Es ist immer wieder unglaublich, was sich für Fehler einschleichen
können. Meinem Mann Marc danke ich: für deine Geduld, wenn ich mal wieder nicht geduldig bin,
für dein Interesse an meiner Arbeit und auch für so manchen Tritt in den Hintern.