Koexpression von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), c

Aus dem Institut für Pathologie
an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil
Universitätsklinik
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. K.-M. Müller
Koexpression von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor),
c-Met - Rezeptor und
HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor / Scatter Factor)
in Pleurametastasen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Ramin Naim
aus Teheran (Iran)
2000
Dekan:
Referent:
Korreferent:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Prof. Dr. med. K.-M. Müller
Prof. Dr. med. G. Schulze-Werninghaus
Tag der mündlichen Prüfung:
24. April, 2001
gewidmet
meinen eltern
Abstract
Naim
Ramin
Koexpression von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), c-Met - Rezeptor und
HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor / Scatter Factor) in Pleurametastasen
Ziel dieser Untersuchung war die Charakterisierung angiogenetisch wirksamer Proteine in
Pleurametastasen. Es wurde Biopsiegut sekundärer Pleuratumoren von 71 Patienten aus dem
Einsendegut des Institutes für Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken
„Bergmannsheil“ immunhistochemisch hinsichtlich der Expression von HGF/SF (hepatischer
Wachstumsfaktor bzw. Scatter Faktor; HGF und SF bezeichnen dasselbe Protein), c-Met
(Rezeptor des HGF/SF) und VEGF/VPF (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, auch
VPF: Vascular Permeability Factor genannt) analysiert. Die in-situ Hybridisierung wurde zum
Nachweis von mRNA Trankripten von c-Met und VEGF eingesetzt.
Eine deutliche intrazytoplasmatische Expression, teils Überexpression von VEGF, c-Met und
HGF/SF konnte bei 83% bis 94% der pleuralen Metastasen von Mamma-, Lungen-,
Gastrointestinaltrakt- und Urogenitaltrakt-Karzinomen sowie verschiedenen anderen Tumoren
nachgewiesen werden. Eine Synthese von VEGF und c-Met war in Tumorzellen zu belegen
mit Hilfe der in-situ Hybridisierung. Es lag eine statistisch signifikante Koexpression (p<0,05)
von VEGF mit c-Met und HGF/SF im Tumorgewebe vor. Der Tyrosinkinaserezeptor c-Met
(Rezeptor des hepatischen Wachstumsfaktors) bildet zusammen mit dem zugehörigen
Liganden HGF/SF ein parakrines Signalsystem. Dieses System ist in den Prozeß der
Angiogenese eingebunden, wobei HGF/SF nach Synthese in mesenchymalen Zellen eine
angiogenetische Wirkung z.B. auf Gefäßendothelzellen und Gefäßwandmyozyten ausübt. Die
Befunde belegen die Bedeutung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), des
hepatischen Wachstumsfaktors (HGF/SF) und des c-Met in Tumoren im Zusammenspiel
bezüglich
ihrer
Wirksamkeit
nachgemessenen
Koexpression
bei
der
kann
Angiogenese.
eine
Unter
Berücksichtigung
autokrine/parakrine
Stimulation
der
dieser
angiogenetisch wirksamen Systeme diskutiert werden.
Eine
gleichzeitige
Überexpression
bzw.
ein
synergistischer
Effekt
dieser
Proteine
einschließlich VEGF ist über das Plasminogen-Urokinase-System möglich. Insbesondere unter
Berücksichtigung der Wirkung von VEGF auf eine Steigerung der Gefäßpermeabilität können
die hier erhobenen Untersuchungsergebnisse eine Grundlage möglicher zukünftiger palliativer
Therapiestrategien
mit
Pleuraergüssen darstellen.
antiangiogenetische n
Substanzen
bei
refraktären
malignen
1
EINLEITUNG ___________________________________________________________________5
1.1
DIE CHRONIK DER A NGIOGENESE _________________________________________________ 5
1.2
M ETASTASIERUNG ____________________________________________________________ 6
1.3
DIE PLEURAKARZINOSE ________________________________________________________ 9
1.4
ZIEL DER DURCHGEFÜHRTEN UNTERSUCHUNGEN ____________________________________ 10
2
ANATOMIE UND PHYSIOLOGIE DER PLEURA_______________________________________11
2.1
DIE A NATOMIE______________________________________________________________ 11
2.2
PLEURA VISCERALIS __________________________________________________________ 11
2.3
PLEURA PARIETALIS __________________________________________________________ 12
2.4
DIE BLUTGEFÄßE ____________________________________________________________ 13
2.5
DIE LYMPHGEFÄßE ___________________________________________________________ 13
2.6
DIE PLEURAFLÜSSIGKEIT ______________________________________________________ 14
2.7
PHYSIKALISCHE PHÄNOMENE IN DER PLEURAHÖHLE _________________________________ 14
2.8
DIE FUNKTIONEN DER PLEURA __________________________________________________ 15
2.9
STÖRUNG DES FLÜSSIGKEITSHAUSHALTES DER PLEURAHÖHLE __________________________ 15
2.10
DIE LYMPHANGIOSIS CARCINOMATOSA _________________________________________ 16
2.11
DIE M ORPHOLOGIE DER PLEURAKARZINOSE _____________________________________ 17
2.12
DAS A USBREITUNGSVERHALTEN SEKUNDÄRER PLEURATUMOREN _____________________ 18
2.13
DIE PLEURABIOPSIE ________________________________________________________ 18
3
VEGF ________________________________________________________________________19
3.1
EINFÜHRUNG IN DAS VEGF / VPF - SYSTEM UND IHRE REZEPTOREN ______________________ 19
3.2
DIE STRUKTUR VON VEGF _____________________________________________________ 20
3.3
DIE EXPRESSION DER VEGF-PROTEINE ____________________________________________ 20
3.4
3.5
3.3.1
VEGF in der Embryogenese ________________________________________________20
3.3.2
VEGF im adulten Gewebe _________________________________________________21
3.3.3
VEGF-Expression in pathologischen Veränderungen - insbesondere im Tumorgewebe ___22
3.3.4
Expression von VEGF in Tumorzellen, die von Endothelzellen abstammen ____________22
3.3.5
Ein Einblick auf die VEGF Genregulation_____________________________________23
DIE FUNKTION VON VEGF IN GEFÄßENDOTHELIEN ___________________________________ 24
3.4.1
Proliferationsstimulation und tubuläre Formation von Endothelzellen _______________24
3.4.2
Permeabilitätssteigerung an Gefäßen ________________________________________24
3.4.3
Andere biologische Aktivitäten des VEGF auf Endothelzellen ______________________24
3.4.4
VEGF-Effekte auf andere Zellen als Endothelien ________________________________25
DIE REGULATION DES TUMORWACHSTUMS DURCH SUPPRESSION DES VEGF-SYTEMS _________ 25
3.5.1
Suppression der Angiogenese ______________________________________________26
3.5.2
Die Kontrolle über Aszites-Bildung und Metastasierung __________________________26
1
4
SCATTER-FACTOR UND C-MET __________________________________________________28
4.1
SCATTER FACTOR____________________________________________________________ 28
4.1.1
Molekularbiologische Eigenschaften ________________________________________28
4.1.2
Die biologische Aktivität von SF ____________________________________________29
4.2
C-M ET ____________________________________________________________________ 30
4.3
DIE A KTIVITÄT VON SF AUF BLUTGEFÄßE IN VIVO UND IN VITRO _______________________ 30
4.3.1
4.3.1.1
Die Endothelzelle als SF-Produzent _________________________________________ 31
4.3.1.2
Die Endothelzelle als Zie lzelle des SF________________________________________ 31
4.3.2
4.4
5
Die Gefäßendothelzellen __________________________________________________30
DIE GEFÄßMUSKELZELLEN (SMC) UND DIE PERIZYTEN _____________________________ 32
4.3.2.1
SMC als SF-Produzent __________________________________________________ 32
4.3.2.2
SMC als Zielzellen des SF ________________________________________________ 33
SF IM TUMORGEWEBE _________________________________________________________ 33
4.4.1
Die Expression von SF und c-Met im Tumorgewebe ______________________________33
4.4.2
Die Herkunft des Tumor-SF ________________________________________________34
4.4.3
SF und Tumorangiogenese ________________________________________________34
MATERIAL UND METHODEN_____________________________________________________35
5.1
SEKUNDÄRE PLEURATUMOREN _________________________________________________ 35
5.2
EINTEILUNG DER PLEURATUMOREN ______________________________________________ 35
5.3
DIE IMMUNHISTOCHEMIE - DIE APAAP-M ETHODE __________________________________ 36
5.4
M ETHODEN-BESCHREIBUNG ____________________________________________________ 36
5.5
DIE A USWERTUNG ___________________________________________________________ 37
Tabelle 1: Immunreactive Score: SI- und PP-Einteilung _______________________________ 38
5.6
STATISTIK _________________________________________________________________ 38
5.7
DIE IN-SITU HYBRIDISIERUNG ___________________________________________________ 39
6
5.7.1
Definition _____________________________________________________________39
5.7.2
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) _________________________________39
ERGEBNISSE__________________________________________________________________41
6.1.1
Biopsien: Patientenzahl, Geschlechts- und Altersverteilung _______________________41
6.1.2
Verteilungsverhältnis der sekundären Pleuratumoren ____________________________44
Tabelle 2: Verteilung der einzelnen Biopsien auf Primärtumoren _________________________ 45
Zusammenfassung der wesentlichen Befunde (Teil I): __________________________________ 46
6.2
M AKROSKOPISCHE UND MIKROSKOPISCHE BEFUNDE _________________________________ 46
6.2.1
Ausgesuchte sekundäre Pleuratumoren mit differenzial-diagnostischen Kriterien _______46
6.2.1.1
Primärtumor: Lunge _____________________________________________________ 46
6.2.1.2
Primärtumor: Gastrointestinaltrakt __________________________________________ 47
6.2.1.3
Primärtumor: Mammakarzinom _____________________________________________ 47
2
6.2.1.4
Primärtumor: Nierenzellkarzinom ___________________________________________ 47
6.2.1.5
Die Lymphangiosis carcinomatosa _________________________________________ 48
Zusammenfassung der wesentlichen Befunde (Teil II): _________________________________ 48
6.3
DIE IMMUNHISTOCHEMISCHEN ERGEBNISSE ________________________________________ 49
6.3.1
SF, c-Met und VEGF _____________________________________________________49
6.3.1.1
Primärtumor: Lunge _____________________________________________________ 49
Tabelle 3: Ergebnisse der Immunhistochemie - Lunge ________________________________ 51
Zusammenfassung ____________________________________________________________ 52
6.3.1.2
Primärtumor: Gastrointestinaltrakt __________________________________________ 54
Tabelle 4: Ergebnisse der Immunhistochemie - Gastrointestinaltrakt _____________________ 56
Zusammenfassung ____________________________________________________________ 57
6.3.1.3
Primärtumor: Mamma____________________________________________________ 59
Tabelle 5: Ergebnisse der Immunhistochemie - Mamma _______________________________ 61
Zusammenfassung ____________________________________________________________ 61
6.3.1.4
Primärtumor: Urogenitaltrakt ______________________________________________ 63
Tabelle 6: Ergebnisse der Immunhistochemie - Urogenitaltrakt _________________________ 65
Zusammenfassung ____________________________________________________________ 65
6.3.1.5
Primäres Karzinom unbekannter Lokalisation __________________________________ 67
Tabelle 7: Ergebnisse der Immunhistochemie - Primäres Karzinom unbekannter Lokalisation ___ 69
Zusammenfassung ____________________________________________________________ 69
6.3.1.6
Verschiedene sekundäre Pleuratumoren______________________________________ 71
Pankreaskarzinom_____________________________________________________________ 71
Schilddrüsenkarzinom__________________________________________________________ 71
Kehlkopfkarzinom_____________________________________________________________ 72
Leiomyosarkom ______________________________________________________________ 72
Ewing-Sarkom _______________________________________________________________ 72
Tabelle 8: Ergebnisse der Immunhistochemie - Verschiedene Primärtumoren _______________ 73
6.3.1.7
Statistik der Immunhistochemie und Zusammenfassung der Ergebnisse______________ 74
Tabelle 9: Der exakte Test von R. A. Fisher in Übersicht ______________________________ 75
6.4
ERGEBNISSE DER IN-SITU HYBRIDISIERUNG _________________________________________ 76
6.5
ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE _____________________________________________ 78
7
DISKUSSION__________________________________________________________________80
7.1
M ETHODEN ________________________________________________________________ 80
7.1.1
Immunhistochemische Färbeverfahren________________________________________80
7.1.2
In-situ Hybridisierung ____________________________________________________80
7.1.2.1
7.2
Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung (FISH)____________________________________ 81
BEFUNDE __________________________________________________________________ 82
7.2.1
Häufigkeit _____________________________________________________________82
3
7.2.2
Verteilung _____________________________________________________________82
Tabelle 10: Vergleich eigener Resultate zu den Primärtumoren als Ursache pleuraler Metastasen mit
Angaben in der Literatur : ____________________________________________________ 84
7.3
7.2.3
Klinik pleuraler Metastasen _______________________________________________85
7.2.4
Lokalisation des malignen Ergusses _________________________________________86
7.2.5
Techniken zur Entnahme von Biopsien _______________________________________86
7.2.6
Die Thorakoskopie ______________________________________________________87
7.2.6.1
Die historische Entwicklung der Thorakoskopie _______________________________ 87
7.2.6.2
Die diagnostischen Vorteile der internistischen Thorakoskopie beim Pleuraerguß_______ 88
7.2.6.4
Therapeutische Vorteile der internistischen Thorakoskopie beim Pleuraerguß _________ 88
7.2.7
Morphologische Diagnostik _______________________________________________88
7.2.8
Charakterisierung pleuraler Metastasen ______________________________________89
DIE BEHANDLUNGSMÖGLICHKEITEN PLEURALER TUMOREN ___________________________ 90
7.3.1
Anti-VEGF-Therapie _____________________________________________________92
7.3.1.1
Konstruktion von VEGF-Rezeptor-Antagonisten _______________________________ 93
7.3.1.2
Bifunktionale VEGF-Toxine _______________________________________________ 93
7.3.1.3
Die Infektion der VEGF-exprimierenden Endothelzellen __________________________ 93
7.3.1.4
Angriff auf Rezeptorebene _______________________________________________ 93
7.3.2
Anti-SF- und Anti-c-Met-Therapie ___________________________________________94
8
ZUSAMMENFASSUNG __________________________________________________________95
9
LITERATUR___________________________________________________________________98
4
1
EINLEITUNG
1.1
DIE CHRONIK DER ANGIOGENESE
Der Prozeß der Angiogenese, das Wachstum der Blutgefäße, ist ein wichtiger Vorgang
während der Reproduktion, Entwicklung und Wundheilung. Während dieser Vorgänge
unterliegt die Angiogenese einer sehr hochentwickelten und bis heute noch nicht
vollständig nachvollziehbaren Regulation (Folkman 1991 und 1990, Hudlika 1986).
Seit langem beschäftigen sich viele Forscher mit den Blutgefäßen und dem Phänomen
der Gefäßbildung. 1616 stellte William Harvey (1578 - 1657) die These auf, daß
bestimmte
kommunizierende
Poren
zwischen
Venen
und
Arterien
existieren
(communicating „pores“) (Abb. 1, 2).
René Descartes (1596 - 1650) bezog sich in seinem Aufsatz „Le Discours de la
Méthode“ 1637 auf dieselbe Entdeckung, er schrieb: „petits passages aux extrémités des
artères par oú le sang qu`elles reçoivent du coer entre les petites branches des veines“
(Sherrington 1929).
Marcello Malpighi (1628 - 1694) entdeckte, daß die Verbindungen durch mikroskopisch
kleine Röhrchen, den Kapillaren, gebildet wurden (Malpighi 1686 - tom I). 11 Jahre
später teilte er diese Neuentdeckung der Royal Society in London mit, wobei er die
Kapillaren in einem Hühnerembryo beschrieb (Malpighi 1686 - tom II).
Antony van Leeuwenhoek (1632 - 1723) entdeckte auch in anderen Geweben
Kapillarstrukturen.
Stephen Hales (1677 - 1761) erkannte, daß die „kleinen kapillaren Gefäße“ dilatierten
oder sich zusammenzogen, wenn sie mit bestimmten Chemikalien behandelt wurden
(Hales 1733).
August Krogh (1874 - 1949), der an der Yale Universität tätig war, bestätigte die
Feststellungen von Charles-Marie-Benjamin Rouget (1824 - 1904). Dieser hatte ein
Netzwerk von verästelten, kontraktilen Zellen, die mit den Kapillaren in Verbindung
standen, entdeckt - heute bekannt als Rouget Zellen oder Perizyten (Rouget 1873 und
1879, Krogh 1922).
5
§
Abb. 1
Darstellung der äußeren Venen des Blutkreislaufs (nach William Harvey).
§
Abb. 2
Der englische Leibarzt William Harvey
entwickelte das Konzept eines Blutkreislaufs, in welchem das Herz als zentraler Antrieb arbeitet. In mit
Stichen bebilderten Werken korrigierte er zahlreiche
Irrtümer, beispielsweise daß das Herz an der Verdauung teilnehme (Quelle: Hudlika 1986).
5a
Arthur Tremain Hertig beschrieb 1935 die Organisation der Blutgefäße in der Plazenta
und verwies darauf, daß neben den Endothelzellen die Perizyten ebenfalls in die
Angiogenese einbezogen sind (Hertig 1935).
John Hunter (1728 - 1793) beschrieb die Angiogenese in seinem Buch „Treatise on the
blood, inflammation and gun shot wounds“, das nach seinem Tod 1794 erschien.
Theodor Billroth veröffentlichte
1856
in
Berlin
seine
Untersuchungen
und
Beobachtungen über die Entwicklung der Blutgefäße (Quelle: Georg Reimer, Berlin,
1856, 81 pp. + V plates) (Abb. 3).
Das „Wie?“ der Angiogenese wurde schon im späten 19. Jahrhundert bis in das frühe
20. Jahrhundert ausführlich beschrieben.
Die Forschung über das „Warum?“ der Angiogenese sowohl im physiologischen als
auch im pathophysiologischen Prozeß (Beispiel: während der Wundheilung oder im
Malignomen) begann in den frühen 70iger Jahren mit den Arbeiten von Judah Folkman
(Folkman 1971).
Er sah, daß Tumorzellen , die in isolierte Organe implantiert wurden, nicht größer als 1
bis 2 mm wurden. Ebenso blieb die Vaskularisation aus. Aufgrund dieser Tatsache
stellte er die Hypothese auf, daß das Tumorwachstum von einer neuinduzierten
Gefäßbildung abhängig sei (Folkman 1963 und 1971).
Heute geht man in der Krebsforschung davon aus, daß der Angiogenese in der
Tumorprogression und -metastasierung eine wesentliche Bedeutung zukommt.
1.2
METASTASIERUNG
Der Begriff „Metastase“ stammt aus dem Griechischen und kann als „Veränderung“
oder „Wanderung“ übersetzt werden. In der medizinischen Anwendung wird mit
„Metastase“ die Verschleppung einer Krankheit von einer Körperstelle an eine andere
bezeichnet. Im engeren Sinne werden unter dem Begriff „Metastasierung“ all diejenigen
Prozesse zusammengefaßt, die an der Verschleppung bösartiger Zellen oder infektiöser
Keime beteiligt sind und ihr An- und Weiterwachsen in entfernten Körperregionen
realisieren (Walther 1948).
6
§
Abb. 3
Theodor Billroth
Die Entwicklung der Blutgefäße (Quelle: Georg Reimer, Berlin, 1856, 81 pp. + V plates).
6a
Die Metastasierung ist ein eindeutiges Zeichen der Malignität eines Tumorgewebes und
ein ausgesprochen selektiver Vorgang, denn von den Millionen Zellen, die von einem
Tumorgewebe abwandern, führen nur wenige zu einer Metastase. Besonders diese
Tumormetastasen prägen in der Finalphase den Krankheitsverlauf eines malignen
Tumorleidens. Das Zusammenspiel der an der Metastasierung beteiligten Faktoren wird
von bestimmten Genen kontrolliert.
Bei der Metastasierung spielen folgende Faktoren eine entscheidende Rolle:
Kohäsionsverlust:
Verliert
die
Zelle
diejenigen
Genprodukte,
die
die
Zelladhäsionsmoleküle (auch Integrine genannt) exprimieren, so resultiert der
Koadhäsionsverlust des Zellverbandes.
Zellmotilität : Die Bildung von Motilitätsfaktoren führt bei den Tumorzellen zu einer
auto- und parakrinen Wirkung, die eine erhöhte Motilität zur Folge hat.
Intra-, Extravasation : Die Tumorzellen können Proteasen freisetzen, mit deren Hilfe sie
sich aus dem ursprünglichen Zellverband lösen und so ins Gewebe und in Gefäße
einbrechen können.
Fremdverkennung : Bleiben sie nach dem Einbruch in Gefäße in der Strombahn haften,
können sie sich vor dem Immunsystem schützen. Sie vermindern die eigene HLAExpression und umgeben sich mit einer Fibrinummantelung.
Absiedelung : Ob Tumorzellen sich in ein bestimmtes Organ absiedeln können, hängt
von den ortsspezifischen Anhaftungs- und Wachstumsbedingungen ab. Die Oberfläche
der Tumorzelle spielt ebenso eine wichtige Rolle (Schmähl 1981, Selberg 1982).
Man differenziert je nach der Struktur, innerhalb derer die Metastasierung erfolgt:
7
A)
Lymphogene Metastasierung : Die Verschleppung der Tumorzellen durch
Lymphgefäße; vermehren sie sich in diesen Gefäßen, so entsteht eine
Lymphangiosis carcinomatosa, die dann auch pathologisch-anatomisch
nachweisbar ist (Kap. 2.10).
B)
Hämatogene Metastasierung : Die Verschleppung auf dem Blutweg; es gibt
vier Grundtypen der hämatogenen Metastasierung:
§
Lungentyp: Die Krebszellen stammen primär aus der Lunge und bewegen
sich über die Lungenvene zum linken Herzen und von dort aus in den
großen Kreislauf.
§
Lebertyp: Der Tumor hat sich primär in der Leber manifestiert und die
Tumorzellen werden über die Lebervene forttransportiert.
§
Kavatyp: Der Primärtumor sitzt im Abflußgebiet der Hohlvene (Beispiel:
Nieren- oder Knochenkrebs).
§
Pfortadertyp: Fast bei allen Darmtumoren findet man diesen Typ; die
Tumorzellen gelangen über die Pfortader in die Leber, können dort in die
Lebervene einbrechen und als Lebertyp-Metastasierung fortwandern.
§
vertebralvenöser Typ: Frühzeitig metastatische Tumoraus-breitung über
das paravertebrale Venengeflecht.
C)
Kavitäre Metastasierung : Tumorzellen brechen in die Peritoneal- oder
Pleurahöhle, in den Liquorraum oder in die Sehnenscheide ein.
D)
Kanalikuläre Metastasierung : Diese seltene Metastasierungsform liegt vor,
wenn sie innerhalb eines epithelial ausgekleideten kanalikulären Systems
stattfindet (Grundmann 1981 und 1994).
8
1.3
Die
DIE PLEURAKARZINOSE
Pleurakarzinose
stellt
als
Manifestation
sekundärer
Pleuratumoren
eine
Veränderung der Pleurahöhle dar, die nicht nur aus klinischer Sicht, sondern auch aus
pathologisch-anatomischer Sicht in der Diagnostik bisweilen erhebliche Probleme
bereitet hat (Abb. 4a, 4b).
Klinisch manifestieren sich die Pleurakarzinosen in Form von Pleuraergüssen, die selten
einmalig sind und oft rezidivieren. Der Pathologe ist gefordert, aus Ergusspunktaten
oder aus wenigen Millimeter großen Biopsaten eine zuverlässige Diagnose mit
Hinweisen auf den meist klinisch noch nicht manifesten Primärtumor zu stellen.
Le Roux meinte, daß die meisten pleuralen Tumoren Metastasen eines primären
Lungentumors wären. Von 3000 Patienten mit Bronchialkarzinomen aus einer Studie
von 1962 hatten 220 (7%) Pleurametastasen - während von 3500 Patienten mit
Mammakarzinomen lediglich 27 (0,8%) Pleurametastasen aufwiesen (Le Roux 1985).
Reshad (Reshad 1985) fand heraus, daß unter 200 malignen Pleuraergüssen 123 (60%)
primäre Lungentumoren, 72 (35%) andere Primärtumoren überwiegend der Mamma
vorhanden waren; 5 hatten primäre Mesotheliome.
Untersuchungen haben bei malignem Pleuraerguß herausgestellt, daß die sekundären
malignen Pleuratumoren als Ursache überwiegen. Geschätzt wurden Zahlen von 15000
bis 30000 sekundären Pleurakarzinosen jährlich in den alten Bundesländern der
Bundesrepublik Deutschland (Kreuser 1984).
In Wien wurden in 5 Jahren 427 „Pleurakarzinosen“ diagnostiziert, wovon nur 13
primäre Mesotheliome, 222 sekundäre Pleurakarzinosen bei Bronchialkarzinom und
132 sekundäre Pleurakarzinosen bei Mammakarzinom waren. Das hieße, daß 30% aller
Pleurakarzinosen auf ein Mammakarzinom und 50% auf ein Bronchialkarzinom
zurückzuführen wären (Titscher 1981).
Die Unterscheidung zwischen der Manifestation eines primären oder eines sekundären
Pleuratumors kann große versicherungsmedizinische Konsequenzen haben, da das
Pleuramesotheliom nicht nur zu den berufsbedingten Erkrankungen (BK-Nr. 4105:
durch Asbest verursachtes Mesotheliom des Rippenfells, Bauchfells oder Perikards)
9
Abb. 4a
Makroskopischer Aspekt bei pleuraler Metastasierung (E.-Nr. 228/96)
Metastase in der Pleura mediastinalis bei primärem Adenokarzinom im Lungenoberlappen
(männlich, 69 Jahre): neugebildete, auf den Tumor zulaufende Gefäßsprossen.
Abb. 4b
Makroskopischer Aspekt bei pleuraler Metastasierung (E.-Nr. 28/96)
Makroskopischer Aspekt einer knotigen Pleurametastasierung mit deutlich erkennbaren
neugebildeten Gefäßsprossen in radiärer Ausrichtung auf die Tumorknoten, daneben pleurale
Mischstaubablagerungen bei Mischstaubpneumokoniose (Bergmann, 58 Jahre, Primärtumor der
Lunge).
9a
zählt, sondern mit 50% gewissermaßen die Liste der Berufskrankheiten anführt (Müller
1989).
1.4
ZIEL DER DURCHGEFÜHRTEN UNTERSUCHUNGEN
In der vorliegenden Untersuchung wird die Expression dreier Proteine, Scatter Factor
(SF) bzw. Hepatocyte Growth Factor (HGF), das c-Met und der Vascular Endothelial
Growth Factor (VEGF), mit wesentlicher Bedeutung in der Angiogenese in sekundären
Pleuratumoren analysiert im Hinblick auf eine mögliche Assoziation dieser
untereinander. Um zusätzliche Information über die Herkunft von c-Met und VEGF zu
bekommen, wird auch eine in-situ Hybridisierung vorgenommen.
10
2
ANATOMIE UND PHYSIOLOGIE DER PLEURA
2.1
DIE ANATOMIE
Zahlreiche pulmonale und extrapulmonale Erkrankungen betreffen die Pleura. Der
Pleuraerguß ist ein häufiges Symptom und Beschwerdebild, welches ein gezieltes
diagnostisches Vorgehen erfordert.
Der Pleuraspalt ist der Raum zwischen parietaler und viszeraler Pleura, der 10 bis 20
µm weit (Agostoni 1969) ist und eine 0,1 bis 0,2 ml klare, farblose Pleuraflüssigkeit pro
Kilogramm Körpergewicht enthält. Der Proteingehalt beträgt weniger als 1,5 g/dl
(Yamada 1933, Agostoni 1972).
Es finden sich pro Mikroliter ca. 1500 bis 4500 Zellen, vorwiegend Monozyten, wenige
Makrophagen
und
Lymphozyten,
vereinzelt
auch
Granulozyten,
aber
keine
Erythrozyten (Stauffer 1978, Yamada 1933).
Die gesamte Lunge sowie die Interlobärspalten werden vom viszeralen Blatt der Pleura
bedeckt. Mit dem parietalen Blatt werden die Thoraxinnenwand, das Mediastinum und
das Diaphragma ausgekleidet. Die viszerale Pleura schlägt an beiden Hili um und geht
in das parietale Blatt über (v. Hayek 1960) (Abb. 5).
2.2
PLEURA VISCERALIS
Die Pleura visceralis ist physiologisch 100 - 200 µm dick und kann histologisch in 5
Schichten differenziert werden:
§
eine Mesothelschicht
§
eine submesotheliale Bindegewebsschicht
§
eine elastische Schicht
§
eine relativ lockere subpleurale Bindegewebsschicht sowie
§
eine fibroelastische Schicht (v. Hayek 1960, Mariassay 1983).
11
Abb. 5
Anatomie und Topographie der Pleura
(Quelle: Atlas der Anatomie des Menschen - Sobotta, U&S).
11a
Die zur Pleurahöhle gerichtete Seite wird von einer einreihigen pleomorphen
Mesothelschicht, die ca. 4 bis 8 µm hoch ist, ausgekleidet. Diese besitzt Mikrovilli (ca.
300 pro µm² Zelle), welche einen Durchmesser von ca. 0,1 µm und eine Länge bis zu 3
µm haben. Die Zellen sind alle untereinander durch Desmosomen verbunden und sind
in der Lage, sich bei jeder Atembewegung zu verformen (Müller 1983 und 1994,
Agostoni 1969, Cooray 1949).
Bei Änderungen des Milieus sowie Verletzungen und entzündlichen Vorgängen können
die Mesothelien aktiv reagieren. Durch Migration und Mitose werden Defekte
wiederhergestellt. Dabei ist bemerkenswert, daß sie als freischwimmende Zellen in der
Pleurahöhle ihre Gestalt ändern in rund-ovale, zum Teil zusammengezogene Zellen
(Efrati und Nir 1976). Ob die reparativen Vorgänge jedoch von den Zellen der
Subserosa als Mesothelersatz ausgehen, ist noch ungeklärt (Brockmann und Müller
1991). Es folgt zum Lungengewebe hin eine äußere elastische Grenzlamelle, eine
dreischichtige, gefäßführende elastische Faserschicht (Tela subserosa) und eine innere
elastische Grenzlamelle, die etwas straffer entwickelt ist. Von dieser elastischen
Grenzlamelle besteht ein direkter Übergang zum elastischen und kollagenen Gewebe
der angrenzenden Alveolar- und Lobularsepten.
2.3
PLEURA PARIETALIS
Die Pleura parietalis hat wie die viszerale Pleura eine gleichartige Deckzellschicht, die
einer Basalmembran aufliegt; dieser Schicht folgt eine hauptsächlich kollagene
Zwischenschicht, in der vereinzelt elastische Fasern zu finden sind. Im Bereich der
Zwischenrippenräumen ist in dieser Zwischenschicht Fett eingelagert. Über elastische
Fasern besitzt die Pleura parietalis einen direkten Übergang in die Fascia endothoracica.
12
2.4
DIE BLUTGEFÄßE
Die Bindegewebsschicht enthält Blutgefäße, Nerven und Lymphgefäße. Noch ist nicht
sicher bekannt, welche Blutgefäße die Pleura viszeralis mit Blut versorgen; man nimmt
an, daß sie von den Bronchialarterien versorgt werden (McLaughlin 1961, Miller 1947).
Die parietale Pleura jedoch wird im Bereich der Rippen von den Interkostalarterien, im
apikalen Bereich von Ästen der A. subclavia und im Mediastinum von Ästen der
Bronchialarterien sowie der A. mammaria versorgt (Müller 1983 und 1994, Testut
1930).
2.5
DIE LYMPHGEFÄßE
Das Lymphsystem der Lunge befindet sich im subpleuralen Bindegewebe und besteht
aus einem oberflächlichem Plexus, das Netzstrukturen bildet (Müller 1983 und 1994). Es
ist im Bereich der Lungenunterlappen besonders ausgeprägt. Ein tiefer Plexus
umschließt die Bronchioli und Blutgefäße (Grant 1974, Miller 1947, Naigaishi 1972). Die
subpleuralen Lymphgefäße drainieren in die größeren zwischen Lungensegmenten und
Lungenlappen lokalisierten Gefäße (Naigaishi 1972).
Für das Verständnis der Pathogenese von Pleuraergüssen ist die Lymphdrainage des
Pleuraraumes sehr bedeutsam. Der Abfluß der Lymphe beginnt in den sogenannten
Stomata, ca. 2 bis 6 µm große Öffnungen, hauptsächlich im Bereich des unteren
Mediastinums, der parietalen infrakostalen Pleura und des Diaphragmas lokalisiert
(Miller 1947, Wang 1975).
Der Pleuraraum wird durch diese Stromata mit den Lymphgefäßen durch erweiterte
Lymphräume, den sogenannten Lakunen, verbunden. An den Enden der Lakunen
befindet sich ein ventilartiger Mechanismus, der atemsynchron öffnet und schließt,
wodurch die Lymphe in die Lymphgefäße gelangt (Courtice 1954, Wang 1975).
Der größte Abschnitt der Lungenunterlappen drainiert in die hinteren mediastinalen,
die viszerale Pleura in die mittleren mediastinalen Lymphknoten. Die Lymphdrainage
der vorderen Thoraxwandpleura und des anterioren Diaphragmas erfolgt über die
13
sternalen Lymphknoten, der mittlere Anteil der diaphragmalen Pleura über die
mittleren, der hintere über die posterioren mediastinalen Lymphknoten. Die Lymphe
der parietalen Pleura drainiert in die interkostalen Lymphknoten (Marsac 1982).
Durch strukturelle und funktionale Untersuchungen fand man heraus, daß große
Partikel und Zellen, die sich in der Pleurahöhle befinden, hauptsächlich durch
lymphatische Drainage nur an einigen Stellen der parietalen Pleura wegbefördert
werden (Wang 1975).
2.6
DIE PLEURAFLÜSSIGKEIT
Die Pleurahöhle enthält eine proteinreiche Flüssigkeit, die ständig vom Mesothel der
Pleura parietalis und visceralis, das makroskopisch als spiegelnd glatt imponiert,
sezerniert wird. Diese Flüssigkeit überzieht den kapillären Spalt der Pleurahöhle und
ermöglicht so die Verschiebbarkeit der Lunge gegenüber der Pleura mit einer
gleichzeitig wirksamen adhäsiven Kraft. Der Sekretion der Pleuraflüssigkeit ist die
ständige Resorption durch die Pleura parietalis und visceralis entgegengerichtet. Der
Erhalt des kapillären Spaltes hängt vom Gleichgewicht der Produktion und Resorption
der Pleuraflüssigkeit ab (Bakhle 1977).
2.7
PHYSIKALISCHE PHÄNOMENE IN DER PLEURAHÖHLE
Das Mesothel besitzt eine sehr lockere Interzellularverbindung, wodurch es für
Flüssigkeit leicht durchlässig ist. Besonders im Bereich der Pleura mediastinalis und
diaphragmatica weicht das Mesothel sogar zu Netzen mit weiten Maschen
auseinander, so daß das darunterliegende Bindegewebe mit dem Pleuraspalt direkt in
Verbindung steht. Dies ist ein wichtiger Unterschied zwischen dem Pleuramesothel und
den Alveolarepithelien der Interalveolarsepten (Bucher 1980).
Der interpleurale Druck ist ein Unterdruck, der bei Ruheatmung in mittlerer Höhe der
Pleurahöhlen zwischen -0,4 bis -0,5 kPa ( ca. -4 bis -5 cm H2O) beträgt und generell bei
tiefer Inspiration höher wird (Piiper 1975).
14
2.8
DIE FUNKTIONEN DER PLEURA
Die Pleura besitzt drei wichtige Funktionen:
1. Da innerhalb der Pleura ein atemabhängiger Unterdruck herrscht, bleibt
hierdurch die Lunge entfaltet.
2. Die
Pleura
hat
ebenso
eine
Stützfunktion
gegenüber
dem
elastisch
aufgespannten alveolären Lungengewebe
3. Eine optimale Beweglichkeit der Lunge wird durch die Pleuraflüssigkeit erreicht
(Rennard 1984, Lee und Olak 1994).
2.9
STÖRUNG
DES
FLÜSSIGKEITSHAUSHALTES
DER
PLEURAHÖHLE
Folgende Faktoren beeinflussen den Flüssigkeitshaushalt der Pleura:
1. Filtrationsdruck der in der Pleura parietalis lokalisierten Kapillaren
2. Der kolloidosmotische Druck
3. Der intrapleurale Unterdruck
4. Sekretionsdruck durch die Mesothelien
5. Resorption der Pleuraflüssigkeit durch das Lymphsystem
Die unter Punkt 1, 3 und 4 aufgeführten Zustände führen zum erhöhtem Einstrom von
Flüssigkeit in die Pleurahöhle.
Diesem Phänomen stehen der kolloidosmotische Druck und insbesondere das reich
ausgebildete Lymphgefäßsystem unter der parietalen und viszeralen Pleura entgegen,
das ebenso unter dem intrapleuralen Unterdruck steht und mit den Atembewegungen
rhythmisch schwankt. Dieses führt dazu, daß die proteinreiche Flüssigkeit besonders
leicht von den Lymphgefäßen aufgenommen und durch die Klappen geleitet wird, und
15
am Ende ins Blutgefäßsystem zurückgeführt wird. Es sind ebenso besondere netzartige
Öffnungen
des
Pleuramesothels
ausgebildet,
durch
die
in
den
Pleuraspalt
eingedrungene Zellen oder Partikel abtransportiert werden.
Eine Verlegung dieser Lymphdrainage durch massive Metastasierung tritt im Rahmen
der Pleurakarzinose auf, die zu einem Pleuraerguß führen kann. Dieser Pleuraerguß ist
ein Exsudat (Abb. 6).
Störungen, die zum Pleuraerguß führen, entstehen durch:
1. Erhöhung des kapillären Drucks im Körper- und Lungenkreislauf
2. Absenken des Proteingehalts des Blutes (und somit auch des kolloidosmotischen
Drucks)
3. Obstruktion der Lymphdrainage durch Tumormassen (Földi 1983, Guyton
1981).
2.10
DIE LYMPHANGIOSIS CARCINOMATOSA
Dieser Ausdruck beschreibt den Befall von Lymphgefäßen durch Tumorzellen.
Makroskopisch ist diese deutlich sichtbar als glasige Verdickung besonders der um die
sekundären Lobuli angeordneten Lymphgefäße, die auf der Lungenoberfläche ein weiß
prominentes Netz bilden.
In der mikroskopischen Darstellung kann man dieses Phänomen als ausgeweitete
Lymphgefäße mit bis zu mehreren 100 Zellen im Querschnitt enthaltenen
Tumorzellsträngen erkennen. Dabei kann hierdurch eine reaktive Fibrose (breite Züge
von Fibroblasten und Kollagenfasern) entlang der Tumorzellen entstehen, so daß das
morphologische Bild hierdurch stärker als durch die Tumorzellen selbst beeinflußt
werden kann (Müller 1983, Chrétien und Jaubert 1985).
16
Abb. 6
Flußdiagramm für das diagnostische Vorgehen beim Pleuraerguß
(Loddenkämper `82).
16a
2.11
DIE MORPHOLOGIE DER PLEURAKARZINOSE
Die Karzinose kann pleural oder bronchial, maximal aber broncho-pleuro-pulmonal
sein. Auch im letzteren kann der Prozeß auf den Thorax beschränkt bleiben, und es
muß noch keine Generalisation vorliegen. Einzelne größer als miliare Lungenherde sind
als Metastasen, d.h. hämatogen und nicht als Teil der lymphogenen Aussaat
anzusehen.
Die Pleurakarzinose kann längere Zeit die einzige Tumormanifestation sein.
Makroskopisch findet man eine fein- oder grobknotige, herdförmig oder diffuse
Manifestation. Manchmal ist die Pleura nicht verdickt, sondern hauchdünn (2 bis 3 mm
dick), sulzig, höckerig und selten auch schwartenähnlich. Im letzteren Fall ist eine
Verwechslung mit einem Mesotheliom möglich.
Mikroskopisch : Chrétien (1985) beschreibt drei unterschiedliche Typen der
Krebszellentwicklung als pleurale Antwort beim metastatischen Tumor:
§
endolymphatisch
§
nodulär und
§
papillär.
Beim endolymphatischen Typ weist die Pleuraoberfläche ein normales Mesothel auf.
Wo nun der Zeitpunkt des Auftritts des Exsudates liegt und ebenso welche Beziehung
es zu den Metastasen besitzt, ist weiterhin spekulativ.
Mögliche Pleurareaktionen können sich in der Pleurabiopsie (bei Thorakoskopie,
deutlich bei Nadelpunktion) zeigen:
§
papilläre Proliferation von Mesothelien
§
fibroblastische Proliferation und
§
exfoliierte maligne Mesothelien.
17
2.12
DAS
AUSBREITUNGSVERHALTEN
SEKUNDÄRER
PLEURATUMOREN
Häufig geht die initiale Metastasierung sekundärer Pleuratumoren über die Pleura
visceralis vonstatten. Die Sekundärmanifestation der Mammatumoren erfolgt meist auf
direktem Wege durch die Brustwand. Die im Bauchraum befindlichen Tumoren
metastasieren über die paraaortalen und parakavalen Lymphbahnen. Ein direkter Weg
transdiaphragmal ist ebenso möglich (Dail 1994).
2.13
DIE PLEURABIOPSIE
Sie ist bei allen Ergüssen unklarer Ätiologie indiziert. Als Kontraindikation sind
hämorrhagische Diathese und eine geringe Ergussmenge zu erwähnen. Die Sensitivität
bei der Pleurakarzinose beträgt 57% (Tomlinson 1987). Um die Treffsicherheit zu
erhöhen, sollten mindestens vier Biopsien pro Untersuchung entnommen werden
(Mungall 1982).
18
3
3.1
VEGF
EINFÜHRUNG IN DAS VEGF / VPF - SYSTEM UND IHRE
REZEPTOREN
Die Neovaskularisation beinhaltet die Begriffe Vaskulogenese und Angiogenese.
Die Vaskulogenese ist die Blutgefäßbildung von endothelialen Vorstufen im Mesenchym
während der Embryonalentwicklung.
Die Angiogenese ist die Ausbildung von neuen Gefäßästen aus schon vorbestehenden
kleinen Gefäßen.
Die Gefäßbildung ist nicht nur für die embryonale Entwicklung der Vertebraten von
Bedeutung, sondern auch unter physiologischen Bedingungen - bei der „schnellen“
vorübergehenden Angiogenese (Beispiel: während der Bildung des Corpus Luteum). Sie
tritt aber auch unter pathologischen Bedingungen auf, wie beispielsweise bei
entzündlichen Reaktionen, bei der Wundheilung und beim wachsenden Tumor in vivo.
Besonders bei der Krebsentwicklung spielt die Angiogenese eine sehr wichtige Rolle
(Shibuya 1995):
Tumor-Angiogenese: bei soliden Tumoren größer als 3 mm Durchmesser erhalten diese
Sauerstoff und Nährstoffe durch neugebildete Gefäße (Folkman 1990).
Permeabilität von Gefäßen: sobald sich Metastasen in der abdominalen (Mediastinum)
oder aber thorakalen (Pleura) Körperhöhle entwickeln, scheint eine abnormale
Steigerung der Gefäßpermeabilität hier statt zu finden, was zur Aszitesbildung im
Mediastinum und Pleuraerguß führt.
19
3.2
DIE STRUKTUR VON VEGF
Der vaskulär endotheliale Wachstumsfaktor VEGF/VPF wurde ursprünglich von
Senger als ein gefäßpermeabilitätsreguliernder Faktor isoliert. Sie fanden einen
heparinbindenden Faktor mit einem Molekulargewicht von 40 bis 45 kDa. Es bestand
aus einem Dimer von zwei 20-23 kDa schweren Untereinheiten. Dieser Faktor wurde
VPF (Vascular Permeability Factor) genannt, da er bei einer intrakutanen Injektion die
Gefäßpermeabilität steigern konnte (Senger 1983) (Abb. 7).
Unabhängig von diesen fand eine andere Arbeitsgruppe (Ferrara und Henzel 1989),
einen den Endothelzellen spezifischen Wachstumsfaktor in konditioniertem Medium
von Nebennierenmarkzellen. Dieser Faktor, den sie VEGF nannten, bewirkte bei
Anwendung auf andere Endothelzelltypen einen Zellzahlanstieg. VEGF konnte jedoch
nicht zur Proliferation von Fibroblasten oder Epithelzellen führen.
Molekulargenetische Versuche haben gezeigt, daß VPF und VEGF das gleiche Proteine
darstellen (Leung 1989, Keck 1989, Ferrara 1991 und 1992).
Im Folgenden wird zur Vereinfachung der vaskulär endotheliale Wachstumsfaktor als
VEGF bezeichnet.
3.3
DIE EXPRESSION DER VEGF-PROTEINE
3.3.1
VEGF in der Embryogenese
In den frühen Stadien der Embryogenese (8. Tag) wird VEGF mRNA in relativ hoher
Konzentration in den Trophoblasten Riesenzellen der Plazenta gefunden, jedoch in
niedrigerer Konzentration im Embryo. Nun steigt am 11. Tag der Embryogenese die
VEGF mRNA-Konzentration in der thorakalen Region des Embryos, wo die sehr frühen
Stadien der Herzentwicklung stattfinden, und erreicht hier in den nächsten Tagen (11.
bis 14. Tag) seine höchste Konzentration (Jackman 1993, Shifren 1994).
Zwischen dem 14. und 16. Tag sinkt die Konzentration der VEGF mRNA in der
kardialen Region, steigt jedoch im Lungenbereich, Gehirn und Nierenmark an. Es
20
wurde festgestellt, daß die relativ höhere Konzentration an VEGF mRNA in der Lunge,
Niere, Herz und Gehirn auch noch nach der Geburt vorhanden waren (Jakeman 1993).
Am 15. Tag wurde in dem den Nierenglomerulus umgebendem Epithel ebenso eine
starke VEGF mRNA-Expression festgestellt (Breier 1992).
3.3.2
VEGF im adulten Gewebe
In zahlreichen maturen Geweben konnten hohe VEGF-Konzentrationen nachgewiesen
werden, so z.B. im Alveolarepithel der Lunge, in Nierenglomeruli, in Herzmyozyten
und ebenfalls im Hypophysengewebe (Brown 1992, Ferrara 1991, Berse 1992, Ilijima
1993).
Da in diesen Geweben das Endothel sich in einem Wachstumsstillstand befindet, stellt
sich hier die Frage, welche biologische Rolle VEGF in diesen Geweben spielt. Eine
mögliche Antwort wäre, daß insbesondere in der Niere und der Lunge durch VEGFProduktion die Permeabilität und Integrität dieser Zellen aufrecht erhalten wird.
Eine spontane Neovaskularisation taucht während der Bildung des Corpus luteum,
dem Wachstum des Uterusendometriums und während der Plazentaentwicklung auf
(Sharkey 1993, Dissen 1994). Man konnte während all dieser Prozesse eine hohe VEGFmRNA-Konzentration sowie eine erhöhte VEGF-Proteinsynthese
§
in Cumulus oopherus Zellen (Phillips 1990)
§
in Luteal Zellen des Ovars (Ravindranath 1992)
§
und in Endometriumzellen des Uterus (Shweiki 1993)
feststellen, was die klare Beziehung von VEGF zur Angiogenese deutlich macht.
Weitere Experimente haben gezeigt, daß die Induktion von VEGF-mRNA durch
Östrogene
im
Rattenuterus
eine
enge
Korrelation
zur
Steigerung
der
Kapillarpermeabilität und Angiogenese in diesem Gewebe besitzt (Cullinan-Bove und
Koos 1993). Dabei exprimierten Granulosazellen hormonabhängig VEGF-mRNA
(Garrido 1993, Yan 1993).
21
§
Abb. 7
VEGF
Dreidimensional-molekulare Struktur des VEGF.
Disulfidbrückenbindungen: gelb
Polypeptidketten: grün
Rezeptorbindungsstellen: rot und blau
(Quelle: Oefner 1992)
21a
3.3.3
VEGF-Expression in pathologischen Veränderungen - insbesondere im
Tumorgewebe
Die Angiogenese findet in der Regel in späten Stadien der Wundheilung in Form von
Granulationsgewebe statt. Beispielsweise haben Keratinozyten in der Nähe von
Wundheilungsbereichen eine hohe Expressionsrate an VEGF-mRNA (Brown 1992).
In der Ovulation-Induktionsthrapie haben weibliche Patienten gelegentlich ein durch
das Ovar verursachtes Hyperstimulations-Syndrom, wodurch proteinreicher Aszites
durch dort befindliche Gefäße freigesetzt wird, aber auch zum Pleura- und
Perikarderguss führen kann. Mc Clure (1994) zeigte, daß die Flüssigkeit eine sehr hohe
VEGF-Konzentration besitzt, was impliziert, daß dies auf eine mögliche hormonelle
Stimulation durch VEGF zurückgeführt werden kann.
Eine abnorme Angiogenese
§
in der Retina von Diabetes mellitus Patienten (Aiello 1994)
§
im rheumatoiden Synovial-Gewebe (Miller 1994),
§
im vergrößerten Schilddrüsengewebe der Patienten mit Morbus Basedow (Fava
1994)
konnte dadurch charakterisiert werden, daß sie mit einer ebenso abnorm hohen VEGFExpression korreliert. Insgesamt scheint bei der pathologischen Angiogenese auch das
Rezeptorsystem des VEGF (flt-1, KDR etc.) eine wichtige Rolle zu spielen.
In vielen Tumorzelllinien wurde beobachtet, daß sie gegenüber dem umgebenden
normalen Gewebe eine erhöhte VEGF-mRNA-Konzentration besitzen (Tolnay 1997).
3.3.4
Expression von VEGF in Tumorzellen, die von Endothelzellen
abstammen
VEGF wirkt hauptsächlich auf Endothelzellen. Ebenso taucht VEGF in Tumorgewebe in
einer erhöhten Konzentration auf. Somit erscheint es nicht abwegig, daß VEGF - und
22
ebenso seine Rezeptoren - in diesen Zellen möglicherweise als Onkogene aktiviert
werden könnten.
Morii fand heraus, daß die Konzentration von VEGF-mRNA im menschlichen GehirnHämangioblastom relativ hoch ist (Morii 1993), was eine gewisse autokrine Stimulation
aufzeigt; dieses Phänomen ist jedoch mit Hilfe der Proteinstufen noch nicht vollständig
aufgeklärt.
Auf der anderen Seite hat man beim murinen Angiosarkom, welches durch chemische
Karzinogene induziert wurde, sehr geringe Mengen an VEGF und seinen Rezeptoren
festgestellt (Rosen 1990).
Somit scheint die Karzinogenese endothelialer Tumoren nicht hauptsächlich auf die
Wirkung von VEGF zu basieren.
3.3.5
Ein Einblick auf die VEGF Genregulation
Sehr viele verschiedene Substanzen können zu einer „up“-Regulation des VEGF-Gens
führen (Beispiel: cAMP, Östrogene, TGF-alpha, Prostaglandine, mutiertes p53-Gen)
(Claffey 1992, Kieser 1994, Garrido 1993, Yan 1993, Pertovaara 1994, Harada 1994).
Ebenso können hypoxische Zustände zu einer Induktion des VEGF-Gens führen,
welches Ladoux und Frelin am Beispiel von Kardiomyozyten gezeigt haben (1993).
Claffey postulierte, daß Bedingungen, die generell zu einer Umdifferenzierung einer
Zelle führen, mit einer erhöhten VEGF-Genaktivität einhergehen (1992).
Für die eigentliche Tumorentstehung erscheint das Phänomen der „up“-Regulation des
VEGF-Gens bei Hypoxie sehr bedeutsam, denn erst wenn Tumorzellen Anschluß an das
Gefäßsystem bekommen - also aus dem hypoxischen Zustand gleiten - können sie sich
„explosionsartig“
vermehren.
Diesen
Anschluß
erreichen
die
Tumorzellen
wahrscheinlich durch die Freisetzung von VEGF, wodurch sie die Angiogenese
einleiten.
Aber nicht nur aus der Sicht der Tumorangiogenese ist dieser Aspekt wichtig. Vielmehr
ist
dieses
Phänomen
eine
wichtige
biologische
Antwort
auf
die
niedrige
Sauerstoffbedingung in verschiedenen Zellen des höher entwickelten Organismus.
23
3.4
DIE FUNKTION VON VEGF IN GEFÄßENDOTHELIEN
3.4.1
Proliferationsstimulation und tubuläre Formation von Endothelzellen
VEGF besitzt die Fähigkeit, bei allen bisher bekannten Endothelzellen zum
Zellwachstum zu führen (Ferrara und Henzel 1989). Man hat ebenso festgestellt, daß
Lebersinusoidalzellen stark VEGF-abhängig sind. Das impliziert, daß VEGF nicht nur
als Wachstumsfaktor wirkt, sondern auch eine sehr wichtige physiologische Bedeutung
für einige Endothelzellen besitzt (Yamane 1994).
In vitro bewirkte VEGF bei Endothelzellen eine tubuläre Formation (Connolly 1989,
Goto 1993). Obwohl dieser Prozeß sehr komplex ist, vermutet man, daß VEGF einen
direkten Faktor der Angiogenese darstellt, sowohl in vivo als auch in vitro.
3.4.2
Permeabilitätssteigerung an Gefäßen
VEGF verursacht eine Permeabilitätssteigerung an den Gefäßendothelien (Senger 1983).
Die effektive Konzentration von VEGF ist bis zu 1000 Mal stärker als die von Histamin
und Bradykinin (Connolly 1989 und 1991).
Man nimmt an, daß die Permeabilitätssteigerung über eine Signaltransduktion, durch
aktivierte VEGF-Rezeptoren initiiert, an das Zytoskelettsystem weitergegeben wird,
wobei
die
Transzytose
und/oder
die
Auflockerung
des
Zellverbandes
der
Endothelzellen die Folgeerscheinung darstellt (Collins 1993). Der Mechanismus ist
jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt.
Es ist aber möglich, durch die Koinjektion von VEGF-Antikörper die VEGFPermeabilitätssteigerung aufzuheben (Sioussat 1993).
3.4.3
Andere biologische Aktivitäten des VEGF auf Endothelzellen
Der erste Schritt der Angiogenese ist die Auflockerung der interzellulären Matrix durch
Proteasen. In HUVEC-haltigem Gewebe (Human Umbilical Vein Endothelial Cells)
konnte beispielsweise beobachtet werden, daß VEGF sowohl auf mRNA- als auch auf
24
der Proteinstufe die Kollagenasegene stimuliert (Unemori 1992). Ebenso wurde
beobachtet, daß bei bestimmten Endothelzellen der Plasminogen-Aktivator (PA) und
der PA-Inhibitor auf VEGF-Stimulus „up-reguliert“ wurde (Pepper 1994). Dies wurde
jedoch in HUVEC nicht beobachtet (Bikfalvi 1991). Die unterschiedliche Antwort der
Endothelien ist noch nicht aufgeklärt.
Ku und Mitarbeiter (1993) berichteten, daß durch VEGF-Stimulation die Endothelien
der Herzkranzgefäße mit einer Stickstoffoxid (NO)-Freisetzung reagierten (NO ist
synonym
zu
EDRF
=
Endothelium
Derived
Relaxation
Factor),
was
zur
Koronargefäßdilation führte. Es konnte ebenso gezeigt werden, daß sowohl glatte
Muskelzellen als auch Kardiomyozyten bei einer Hypoxie mit der Expression von VEGF
mRNA reagieren (Ladoux und Frelin 1993). So ist anzunehmen, daß die durch VEGF
induzierte
NO-Bildung
für
die
Aufrechterhaltung
der
kontinuierlichen
Sauerstoffversorgung des Herzens obligat ist und somit eine physiologische Reaktion
des Organismus darstellt.
3.4.4
Obwohl
VEGF-Effekte auf andere Zellen als Endothelien
sich
die
Wachstums-
und
Permeabilitätsstimulation
des
VEGF
auf
Endothelzellen beschränkt, hat man dennoch eine in seltenen Fällen auftauchende
Migrationsstimulation auf menschliche Monozyten festgestellt (Clauss 1990). Zusätzlich
wurde die Steigerung des prokoagulanten Gewebsfaktors und ebenso der erhöhte
Einstrom von Kalziumionen in Monozyten nach VEGF-Bahandlung registriert (Clauss
1990).
VEGF induziert ebenfalls die Differenzierung von Osteoblasten, was die Möglichkeit
einer Beteiligung von VEGF beim Knochenumbau zeigt (Midy und Plouet 1994).
3.5
DIE
REGULATION
DES
TUMORWACHSTUMS
DURCH
SUPPRESSION DES VEGF-SYTEMS
25
3.5.1
Suppression der Angiogenese
Insgesamt ergib sich bisher zusammenfassend, daß
§
das schnelle Wachstum des Tumorgewebes in vivo erst durch Anschluß an das
Gefäßsystem durch Angiogenese initiiert wird,
§
das VEGF-System eine wichtige Rolle bei der Stimulation der TumorAngiogenese spielt.
Es muß daher möglich sein, durch artifizielle Suppression des VEGF-Systems die
Wachstumsrate des Tumors in vivo reduzieren zu können. Dabei könnten verschiedene
Stufen in der Signalkette des VEGF und seinem Rezeptorsystem Ansatzpunkte einer
Blockade darstellen durch
§
Chemikalien,
§
Antikörper oder
§
andere Peptide.
Kim und Mitarbeiter (1992 und 1993) haben gezeigt, daß es möglich ist, durch
monoklonale Antikörper gegen das N- oder C-terminale Ende des VEGF-Moleküls eine
Suppression der VEGF-Aktivität zu erreichen. Zudem können diese Antikörper eine
Herabsetzung des Tumorwachstums in Mäusen verursachen. Es wurden ähnliche
Ergebnisse auch durch den Einsatz von polyklonalen Antikörpern berichtet (Kondo
1993).
Eine andere Strategie ist die Rezeptormodulation des VEGF, wodurch die Wirkung
durch einen Bruch in der Signalkette nicht zur Geltung kommt (Kendall und Thomas
1993).
3.5.2
Die Kontrolle über Aszites-Bildung und Metastasierung
VEGF wurde ursprünglich von Senger und Mitarbeiter (1983) in von Tumoren
gebildeter Aszites-Flüssigkeit nachgewiesen. Es ist aber immernoch nicht geklärt, in
welchem Ausmaß VEGF für die Aszitesbildung verantwortlich ist. Der Beitrag des
26
VEGF für die Aszites- oder Pleuraergußbildung ist bei jedem Patienten unterschiedlich.
Wenn es jedoch gelingen würde, die Menge an VEGF anzugeben, die bei den
verschiedenen Patienten zur abnormen Gefäßpermeabilität führt, so könnte die
Behandlung der Patienten durch Blockade des VEGF- und des VEGF-Rezeptor-Systems
durchaus einen Ansatzpunkt darstellen.
27
4
SCATTER-FACTOR UND C-MET
4.1
SCATTER FACTOR
4.1.1
Molekularbiologische Eigenschaften
Scatter Factor (SF) ist ein Protein, das vom Mesenchym synthetisiert werden soll (nach
neueren Artikeln auch in epithelialen Tumoren) und die Fähigkeit besitzt,
Epithelzellverbände zu dissoziieren („to scatter“) (Stoker 1987, Rosen 1989). SF ist
identisch mit dem Hepatocyte Growth Factor (HGF) (Weidner 1991, Bhargava 1992),
der
mitogene
Wirkung
auf
Rattenhepatozyten
besitzt
und
dessen
Funktion
ursprünglich als hepatotroph bei der Leberreparatur definiert wurde (Miyazawa 1989,
Nakamura 1989). Im folgenden wird zur Vereinfachung von Scatter Factor (SF)
gesprochen, wobei damit auch HGF gemeint ist. SF ist ein heparinbindendes
Glykoprotein, das aus einer 60 kDa α-Kette und einer 30 kDa β-Kette besteht (Gherardi
1989, Rosen 1990, Weidner 1990).
Die α-Kette besitzt am N-terminalen Ende eine „Haarnadel“-ähnliche Schleife und vier
„Kringel“-ähnliche Komplexe (Disulfid-Brücken Bindungen, wodurch die ProteinLiganden-Bindung zustande kommt). Die β-Kette ist bezüglich der Aminosäuresequenz
mit Serinproteasen verwandt.
SF und das Proenzym Plasminogen besitzen eine 38 prozentige Homologie in der
Aminosäure-Sequenz, jedoch besitzt SF keine Proteaseaktivität aufgrund des
Unterschiedes von zwei essentiellen Aminosäuren an der katalytischen Triade der βKette (Nakamura 1989, Rosen 1990).
Nach seiner intrazellulären Transkription und Translation wird SF - mit einer
Signalsequenz versehen - nach außen abgegeben und durch den SF-Aktivator, eine
Serin-Protease ähnlich dem Hagemann-Faktor XII, physiologisch in seine aktive Form
übergeführt (Miyazawa 1993). Der SF-Aktivator wird in einer zymogenen Form
gebildet und nach einer Gewebsverletzung durch eine proteolytische Kaskade aktiviert
(Miyazawa 1994). Auch Plasminogen-Aktivatoren (tPA und uPA) können Pro-SF
28
spalten und aktivieren. Dies geschieht aber nur in einer sehr hohen Konzentration
gegenüber dem physiologischen Wert (Naldini 1992).
4.1.2
Die biologische Aktivität von SF
SF beeinflußt über die c-Met-Tyrosinkinase:
§
die Motogenese,
§
die Mitogenese,
§
die Morphogenese von bestimmten Zellen und
§
die Angiogenese (Weidner 1993, Zhu 1994).
Zusätzlich zum „Auflösen“ von Epithelverbänden kann SF bei isolierten Epithelzellen
eine ungerichtete Migration durch die extrazelluläre Matrix sowie eine Chemotaxis
bewirken (Rosen 1990, Li 1994). SF erleichtert die Migration durch Verstärkung der
Transkription und Proteinexpression von uPA und uPA-Rezeptoren (uPAR), die sich an
der Zelloberfläche befinden (Pepper 1992, Grant 1993, Rosen 1994). Die an der
Oberfläche gebundenen uPA sind katalytisch aktiv und könnten so einen Weg für hier
migrierende Zellen durch Auflösung der extrazellulären Matrix „frei“ machen (Saksela
und Rifkin 1988). Offensichtlich kann SF in diesen Funktionen eine Tumorinvasion und
-metastasierung erleichtern. Wodurch dieser gesamte Mechanismus - durch SF initiiert in Gang gebracht wird, ist noch unklar.
SF
wirkt
auf
vielen
Zelltypen
mitogen,
insbesondere
auf
Epithel-
und
Gefäßendothelzellen und Melanozyten (Kan 1991, Rubin 1991, Halaban 1992).
SF ist ebenfalls ein sehr potenter morphogener Faktor. Er induziert bei Epithelzellen, die
in Kollagen Typ I-Gel inkubiert wurden, ein Netzwerk von verzweigenden Tubuli mit
konsequenter apikal-basolateraler Polarität (Montesano 1991, Santos 1992). Ähnlich
induziert SF bei Epithelzellen der Mamma die Ausbildung einer milchgangsähnlichen
Struktur (Tsarfaty 1992) (Abb. 8, 9).
29
Insgesamt kann SF verschiedene Differenzierungsvorgänge bei Zellen initiieren, die
insbesondere vom Zelltypus abhängig sind.
4.2
C-MET
Der Rezeptor des SF , das c-Met, ist ein Proteinprodukt des Proto-Onkogens c-met
(Bottaro 1991), das als transmembranöse Tyrosin-Kinase (TK) insbesondere durch
Epithelien und Fibroblasten exprimiert wird (Gonzatti-Haces 1988). Der c-Met-Rezeptor
ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 190 kDa, das aus einer 50 kDa αKette besteht und sich an der Zellwandoberfläche befindet, sowie aus einer 145 kDa βKette mit transmembranöser Lokalisation.
Die extrazelluläre Bindungsstelle, die transmembranöse sowie intrazelluläre Kinase und
der nicht-katalytische Phosphatrezeptor befinden sich auf der β-Kette (Ponzetto 1994).
Ursprünglich wurde das Proto-Onkogen c-Met in der Zellinie eines chemisch
behandelten menschlichen Osteosarkoms entdeckt (Cooper 1984). c-Met, der SFRezeptor,
wird
hauptsächlich
in
epithelialen
Zellen
gebildet.
Obwohl
auch
mesenchymale Zellen diesen Rezeptor exprimieren, wird c-Met hier in einem viel
niedrigeren Umfang produziert (Faletto 1993, Sonnenberg 1993). Untersuchungen
haben gezeigt, daß c-Met in vielen verschiedenen menschlichen Karzinomen und
Sarkomen überexprimiert wird (Di Renzo 1991, Rong 1993). Es wurde auch festgestellt,
daß die Tyrosinkinase-Aktivität mit dem Ausmaß einer malignen Zelltransformation
eng assoziiert ist (Ottenhoff-Kalf 1992). Ferner wurde gezeigt, daß die erhöhte
Expression von c-Met bei den Fibroblasten als Resultat eine erhöhte Invasivität aufwies,
sowohl in vivo als auch in vitro (Giordano 1993, Rong 1994).
4.3
DIE AKTIVITÄT VON SF AUF BLUTGEFÄßE IN VIVO UND IN
VITRO
4.3.1
Die Gefäßendothelzellen
30
4.3.1.1 Die Endothelzelle als SF-Produzent
Die Gefäßendothelzellen
§
produzieren SF und
§
können Zielobjekte von SF sein.
Die Endothelien produzieren in vitro und in vivo physiologisch geringe Mengen an SF
(Stoker 1987, Rosen 1989, Matsumoto 1993). Es wurde auch festgestellt, daß nach
Leberschädigung
sowohl
die
Lebersinusoid-Endothelien
als
auch
die
Alveolarendothelzellen der Lunge SF produzieren. Dieses konnte man durch in-situ
Hybridisierung bestätigen (Yanagita 1992, Noji 1990).
Hieraus kann man folgern, daß durch bestimmte Stimuli (Beispiel: Leberschädigung)
Endothelzellen zur Produktion von SF angeregt werden. Es ist möglich, daß parakrine
oder endokrine Signale, die im Zusammenhang mit einer Noxe auftreten, für die
Konzentrationserhöhung des SF - von Endothelzellen produziert - verantwortlich sind.
4.3.1.2 Die Endothelzelle als Zielzelle des SF
In der frühen Phase der Angiogenese löst sich in vivo die Basalmembran durch den
Einfluß von Endothelzellen an bestimmten Stellen auf. Die Endothelien wandern ins
Interstitium in Richtung eines angiogenetischen Stimulus und formen einen kapillären
Ast (Folkman 1985). Die verzweigenden Endothelzellen, die sich in der wandernden
Spitze
befinden,
proliferieren.
Hierbei
organisieren
sich
die
verzweigenden
Endothelzellen in ein anastomosierendes Netzwerk von Kapillargängen. In der
Schlußphase der angiogenetischen Reaktion kommt es zur Adhäsion der neugebildeten
glatten Muskelzellen, der Perizyten und der Basalmembran (Folkman 1985, AntonellìOrlidge 1989).
Die Stimulation der Endothelzellen zur Motilität, Proliferation und Bildung
kapillargangsähnlicher Formation in vitro korrelieren mit der Angiogenese in vivo
(Folkman 1985).
31
§
Abb. 8
Mikroskopisch
sichtbarer “Scatter-Effekt”
Die Beimischung von Scatter Factor (SF / HGF) in eine Fibroblasten-Kultur führt zum
“Auseinanderdriften” der Fibroblasten und zur mitotischen Teilung
(Quelle: Bussolino 1992).
§
Abb. 9
Wirkspektrum des hepatischen Wachstumsfaktors (HGF/SF)
(Quelle: Polverini 1995).
31a
Die Endothelien kleiner und großer Gefäße exprimieren c-Met und können so durch SF
stimuliert werden (Rosen 1990 und 1991, Bussolino 1992, Grant 1993, Naidu 1994).
SF wirkt chemotaktisch auf Endothelzellen und beeinflußt die Motilität (Rosen, 1990
und 1991). Rosen hat in einer Versuchsreihe gezeigt, daß Endothelzellen auf einen SFStimulus hin durch ein Matrixgel auf einen porösen Filter (stellt die Basalmembran dar)
penetrieren (Rosen 1991).
SF beeinflußt ebenso die DNA-Synthese und die Proliferation von bestimmten
Endothelzelltypen (Rubin 1991, Morimoto 1991). Die kapilläre Tubenformation scheint
eine von der Motilität und Proliferation unabhängige Variable zu sein (Grant 1989).
Sobald Endothelzellen auf der Oberfläche eines als Basalmembran funktionierenden
Matrixgels aufgebracht werden, stellen sie DNA-Synthese und Proliferation ein. Es
vollzieht sich eine zytoplasmatische „Verlängerung“, die mit dem Beginn einer kapillärtubulären Formation einhergeht.
Diese kapillär-tubuläre Formation konnte bei Gehirnarterien-Endothelzellen und
HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) durch SF bis zu einer zehnfach
höheren Geschwindigkeit beschleunigt werden (Rosen 1991, Grant 1993).
4.3.2 DIE GEFÄßMUSKELZELLEN (SMC) UND DIE PERIZYTEN
4.3.2.1 SMC als SF-Produzent
In vitro produzieren die Kalbsaorten-, die menschlichen Iliakalarterien- und die
Rattenarterien-SMC SF in einer vergleichsweise hohen Konzentration wie die
menschlichen Lungen-Fibroblasten (64 bis 128 Einheiten / 1000 000 Zellen / 48 h)
(Rosen 1989 und 1990). Die biologischen und chemischen Eigenschaften des von den
SMC produzierten SF sind denen des von den Fibroblasten produzierten SF sehr
ähnlich und es ist anzunehmen, daß beide Proteine identisch sind (Rosen 1990).
32
4.3.2.2 SMC als Zielzellen des SF
Die Psoriasis vulgaris (Schuppenflechte) ist eine chronische Hautkrankheit, die durch
die Proliferation von epidermalen Keratinozyten und Neovaskularisation im Stratum
papillare gekennzeichnet ist. Die Zellen der Gefäßwände (Perizyten, Endothelzellen)
sind im „psoriatischem Plaque“ immunhistochemisch positiv für das c-Met-Protein
(Grant 1993). Demnach können diese Zelltypen durch SF stimuliert werden.
Die SMC in Tumormikrogefäßen exprimieren SF. Die neugebildeten SMC und die
Perizyten (die auch als SMC der Mikrogefäße bezeichnet werden) sind die essentiellen
Komponenten der Angiogenese. Sie dienen dazu, die neugebildeten Gefäße zu
stabilisieren und bilden den Abschluß eines angiogenetischen Prozesses (AntonellìOrlidge 1989). SF reguliert dementsprechend auch die Abschlußphase der Angiogenese.
Die Fähigkeit von SMC, SF zu produzieren und ebenso die Zielzelle darzustellen, zeigt,
daß SF eine autokrine Funktion für diesen Zelltyp besitzt. Die SMC ruhen in vivo,
können aber durch eine Gefäßverletzung stimuliert werden. Dieses konnte durch die
„phänotypische Modulation“, die bei der Exzision von in vitro befindlichen Gefäß-SMC
auftritt, gezeigt werden (Campbell und Chamley-Campbell 1981). Die phänotypische
Modulation ist charakterisiert durch die Transition einer „ruhigen“ kontraktilen SMC in
eine aktive, synthetisierende und proliferative Variante.
Man hat aber auch gemessen, daß nicht-stimulierte SMC signifikante Mengen an SF in
vivo produzierten. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß SF eine mögliche
parakrine (SMC auf Endothelzelle) und autokrine (SMC auf SMC) Funktion - assoziiert
mit einer Gefäßverletzung – besitzt (Rosen und Goldberg 1997).
4.4
SF IM TUMORGEWEBE
4.4.1
Die Expression von SF und c-Met im Tumorgewebe
Die SF- und c-Met – Produktion wird sowohl im physiologischen als auch in
pathologischen Prozessen „up“- und „down“-reguliert (Sonnenberg 1993, Matsumoto
33
und Nakamura 1993, Joannidis 1994). SF wird ebenso in verschiedenen Tumorgeweben
(Beispiel: Mammakarzinom, Blasenkarzinom u.a.) überproduziert (Rosen 1994,
Yamashita 1994, Joseph 1995). Möglicherweise führen spezifische SF-induzierende
Proteine zur Überproduktion von SF und c-Met, die im Tumorgewebe in einer
unphysiologisch hohen Konzentration vorliegen (Li 1996).
4.4.2
Die Herkunft des Tumor-SF
Mesenchymale Zellen sind die Zelltypen mit der höchsten SF-Produktion in vitro
einschließlich
Fibroblasten,
glatte
Gefäßmuskelzellen,
Gliazellen,
Makrophagen,
Endothelzellen und ebenso T-Lymphozyten (Stoker 1987, Rosen 1989 und 1994, Noji
1990, Shiota 1992, Yanagita 1992, Naidu 1994). Viele dieser Zellen sind im
Tumorgewebe präsent und tragen ebenso zu einer Überproduktion des SF bei.
Li meinte, daß durch die Interaktion zwischen Stroma und Epithel, Fibroblasten SF
sezernieren und so Epithelzellen in vielen Organen (Haut, Gefäße u.a.) in ihrer
Entwicklung regulieren (Li 1996).
Durch viele Untersuchungen wurde deutlich, daß die SF-Konzentration im malignen
Gewebe einen wichtigen prognostischen Faktor darstellt (Yamashita 1994, Weidner
1991, Bosari, 1992, Toi 1993).
4.4.3
SF und Tumorangiogenese
Man geht davon aus, daß der Gehalt an SF im Tumor und die Gefäßdichte im Rahmen
einer Tumorangiogenese eine nicht zu vernachlässigende prognostische Aussagekraft
bei Brustkarzinomen besitzt (Weidner 1991, Bosari 1992, Toi 1993). Eine Korrelation
zwischen SF und der Gefäßdichte wäre hierbei vorhanden. In der Angiogenese müssen
jedoch auch weitere Proteine bzw. Faktoren, berücksichtigt werden (Beispiel: VEGF,
TGF, bFGF u. a.). Es ist möglich, daß SF mit anderen angiogenetischen Faktoren eine
additive oder synergistische Interaktion eingeht, wie beispielsweise mit VEGF. Der
angiogenetische Phänotyp eines Tumors wird durch die Balance der „pro“- und „anti“angiogenetischen Faktoren determiniert und ebenso seine Tendenz zu wachsen.
34
5
MATERIAL UND METHODEN
5.1
SEKUNDÄRE PLEURATUMOREN
Die in dieser Untersuchung ausgewerteten Pleurakarzinosen bzw. -metastasen sind in
einem Zeitraum von 3 Jahren (1994 bis 1997) gesammelt worden. Es handelt sich um
Pleurabiopsien, die durch bronchoskopischen, perkutanen, thorakoskopischen oder
thorakotomischen Eingriff als PE`s (PE: Probeexzision, operative Gewebeentnahme für
diagnostische Zwecke als Form der Biopsie) in das Institut für Pathologie an den
Berufsgenossenschaftlichen Kliniken „Bergmannsheil Bochum“ gelangt sind. Anhand
konventioneller Schnittpräparate in HE- (Hämatoxylin-Eosin) oder EvG-Färbung
(Elastika van Gieson) wurde die Diagnose gestellt. Unter Berücksichtigung klinischer
Angaben konnten die Absiedlungen verschiedenen Primärtumoren zugeordnet werden.
Von diesen Patienten lagen nicht nur archivierte histologische Befunde vor, sondern
auch Angaben zu personenbezogenen Daten.
5.2
EINTEILUNG DER PLEURATUMOREN
Insgesamt wurden 82 sekundäre Pleuratumoren ausgewertet. Da im Besitz des Instituts
ebenso 16 Primärtumor-Biopsien vorhanden waren, wurden diese als Vergleich zu den
sekundären Tumoren in die Auswertung miteinbezogen.
Zusätzlich wurden Pleurabiopsien untersucht, die bei langjährigem krankheitsfreien
Verlauf als sogenannte „dormant cells“ klassifiziert wurden.
Dabei ergab sich folgende Verteilung (Pleurakarzinosen nach Primärtumoren geordnet):
§
16 Mammakarzinome
§
21 Lungenkarzinome
§
18 Karzinome des Gastrointestinaltraktes
§
9 Karzinome des Urogenitaltraktes
35
§
§
5.3
verschiedene Primärtumoren:
-
Pankreaskarzinom
-
Kehlkopfkarzinom
-
Ewing-Sarkom
-
Leiomyosarkom
-
Schildrüsenkarzinom
9 ungeklärte Primärtumoren.
DIE IMMUNHISTOCHEMIE - DIE APAAP-METHODE
Diese Technik beruht auf einem indirekten Nachweis (des zu untersuchenden Proteins),
der durch einen Brücken-Antikörper, der den Primär-Antikörper mit den APAAPKomplex verbindet, erreicht wird. Der Komplex besteht aus einem Antikörper und
Enzym (Alkalische Phosphatase), gegen das der Antikörper gerichtet ist. Man kann
vereinfacht von einem Enzym-Antienzym Komplex sprechen.
5.4
METHODEN -BESCHREIBUNG
1. 3-4 µm dicke Schnittpräparate formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten
Gewebes werden auf einen speziellen Kapillarspalt-Objektträger der Firma
DAKO aufgezogen; anschließend werden die Präparate über Nacht bei 58° C im
Wärmeschrank getrocknet.
2. Die Schnittpräparate werden in Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden
Alkoholreihe rehydriert, anschließend in Tris-Puffer (pH = 7,6) für 10 Minuten
gespült.
3. Die Vorbehandlung der Schnittpräparate erfolgt in Abhängigkeit vom
verwendeten Primär-Antikörper.
4. Der Primär-Antikörper wird in der jeweiligen Gebrauchsverdünnung für 25
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert; die Antikörperverdünnung erfolgt mit
Hilfe eines Diluents (Firma DAKO). Die Präparate werden im Puffer (Puffer-Kit
36
K 5006, Firma DAKO) gespült. Bei polyklonalen Antikörpern wird anschließend
„mausifiziert“, d.h. es wird mit MAR (Maus anti-Rabbit-Serum, 1:150 in Diluent
verdünnt, Firma DAKO) für 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
5. Die Präparate werden gespült und anschließend für 25 Minuten bei
Raumtemperatur mit einem Sekundär-Antikörper (= LINK, APAAP-Kit K 5000,
Firma DAKO) inkubiert; beim Brücken-Antikörper handelt es sich um
Kaninchen anti-Maus Immunglobuline aller Isotypen.
6. Nach Spülung mit Puffer wird für weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur mit
einem APAAP-Komplex (APAAP-Kit K 500, Firma DAKO) inkubiert. Der
APAAP- Komplex besteht aus monoklonalen Maus-Immunglobulin G1Antikörpern, welche spezifisch an die alkalische Phosphatase (aus KälberMukosa gewonnen) gebunden ist.
7. Zur Verstärkung der Reaktion werden nach Spülung mit Puffer wiederholt
LINK und APAAP-Komplex für jeweils 10 Minuten Raumtemperatur
aufgegeben.
8. Zur Farbentwicklung wird ebenfalls der APAAP-Kit benutzt; das Chromogen
wird maximal 10 Minuten vor Gebrauch angesetzt. Der verwendete Farbstoff ist
Fast-Red. Die endogene Alkalische Phosphatase wird dabei durch Zugabe von
Levamisol (0,2 mmol, ebenfalls im APAAP-Kit vorhanden) geblockt. Die
Inkubationszeit beträgt 4 x 5 Minuten, wobei zwischendurch immer wieder mit
Puffer gespült wird.
9. Die Gegenfärbung erfolgt in Mayers-Hämatoxylin (Firma DAKO) für 1 Minute.
Anschließend werden die Präparate erst in Puffer, dann in Aqua dest. gebläut.
10. Die Schnittpräparate werden in aufsteigender Alkoholreihe dehydriert und über
Xylol mit Eukitt eingedeckt.
5.5
DIE AUSWERTUNG
Damit die immunhistochemischen Untersuchungsergebnisse einheitlicher und somit
vergleichbarer waren, wurde auf der Consensus-Tagung in Mainz 1986 der sogenannte
37
„Immunreaktive Score (IRS)“ ermittelt. Ursprünglich war diese Methode für den
immunhistochemischen Nachweis von Östrogen- und Progesteronrezeptoren im
Mammakarzinomgewebe entwickelt worden (Remmele und Stegner 1987).
Anhand dieser Methode untersucht man die Färbeintensität (SI) und den Prozentsatz
positiver Zellen (PP) im Gewebepräparat.
Wir haben diese Methode in einer abgewandelten Form übernommen.
1.
Die PP-Einteilung wurde modifiziert, d.h. die ursprüngliche Unterscheidung
zwischen <10% und < 50% positive Zellen wurde in der Auswertung nicht eingehalten,
da dieses unerheblich auf das Ergebnis war.
2.
Wir haben den immunreaktive Score nicht berechnet und haben die einzelnen
angiogenetischen Faktoren sowohl in der Färbeintensität (SI) als auch in der PPEinteilung gesondert betrachtet und anhand des Fisher-Tests eine Korrelation
untersucht.
Tabelle 1: Immunreactive Score: SI- und PP-Einteilung
SI-Einteilung
PP-Einteilung
0 = keine Farbreaktion
0 = keine positiven Zellen
1 = schwache Farbreaktion
1 = < 50 % positive Zellen
2 = mäßige Farbreaktion
2 = 50 - 80 % positive Zellen
3 = starke Farbreaktion
3 = > 80 % positive Zellen
Die Auswertung erfolgt mit Hilfe eines Lichtmikroskopes, wobei bei verschiedenen
Vergrößerungen (x250, x400) die Färbeintensität und der prozentuelle Anteil positiver
Zellen ermittelt wird.
5.6
STATISTIK
38
Die histomorphologischen Befunde der sekundären Pleuratumoren wurden nach
Methoden der deskriptiven Statistik ausgewertet. Unterstützend wurde hierzu der
„exakte Test von R. A. Fisher“ (Sachs 1984) hinzugezogen. Das Signifikanzniveau
wurde bei p=0,05 festgesetzt.
Es wurde die SAS-Software als Rechenprogramm im Windows-NT-System benutzt.
5.7
DIE IN-SITU HYBRIDISIERUNG
5.7.1
Definition
Die in-situ Hybridisierung gehört zu den molekularbiologischen experimentellen
Techniken. Dabei kommt es zur Bindung von in der Zelle befindlichen mRNA an
einsträngige komplementäre cDNA, die man in die Zelle eingebracht hat, mit
Ausbildung stabiler Hybridmoleküle.
5.7.2
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
In dieser Arbeit wurde die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) - Technik für cMet und VEGF angewandt.
Dabei geht man folgenderweise vor:
1. Insertion des Gens in das E. coli Genom
2. Vervielfältigung dessen durch E. coli
3. Ausschneiden des Inserts (cDNA)
4. Markierung des Inserts mit Digoxigenin
5. Erhitzen auf 95° C (um DNA-Einzelstränge zu produzieren)
6. Dann sofortiges Abkühlen im 4° C - Bad (damit wieder kein Doppelstrang
entsteht)
7. Nun
Behandlung
der
immunhistochemisch
positiven
Zellen
mit
dem
Einzelstrang-DNA-Substrat (bei 42° C)
39
8. Inkubation mit Digoxigenin-Antikörpern und Fluorescein
Hat die Zelle nun c-Met- oder VEGF-Proteine produziert, so muß dort auch mRNA des
c-Met- oder VEGF-Gens vorhanden sein, so daß durch die Inkubation mit homologer
cDNA eine Markierung der mRNA durchgeführt werden kann. Das Ergebnis wird
durch die Reaktion mit Fluorescein sichtbar.
40
6
ERGEBNISSE
6.1.1
Biopsien: Patientenzahl, Geschlechts- und Altersverteilung
Im Institut der Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil
werden Biopsien der Pleura nicht nur unter wissenschaftlichen, sondern auch unter
gutachterlichen Gesichtspunkten untersucht. Hierbei handelt es sich besonders um die
Klärung
von
Berufskrankheiten
(BK).
Die
Begutachtung
kann
große
versicherungsrechtliche Folgen haben. Insbesondere bei der Unterscheidung eines
primären von einem sekundären Pleuratumor, wobei bei letzterem der Primärtumor
klinisch zu diesem Zeitpunkt noch stumm sein kann. So ergab sich, daß im bei einigen
Pleurakarzinosen kein Primärtumor bestimmt werden konnte.
1. Biopsiegut von 71 männlichen und weiblichen Patienten wurde untersucht (von
einigen Patienten wurden mehrere Biopsien aus verschiedenen Bereichen der
Pleura entnommen; daher insgesamt 82 Biopsien).
2. Das Durchschnittsalter aller Patienten lag zum Zeitpunkt der Biopsieentnahme
bei 65 ± 8 Jahren (Median: 67 Jahre).
3. Im Kollektiv befanden sich 41 männliche Patienten. Das Alter lag bei
durchschnittlich 63,5 ± 9 Jahren (Median: 67 Jahre). Der älteste Patient war 77
und der Jüngste 25 Jahre alt. Der Altersgipfel lag im männlichen Kollektiv bei 72
Jahren.
4. Die Zahl der weiblichen Patienten betrug 30. Das Durchschnittsalter lag bei 66 ±
6,5 Jahren (Median: 67 Jahre). Die älteste Patientin war 91, die jüngste 46 Jahre
alt; der Altersgipfel lag bei 70 Jahren.
Es zeigt sich somit, daß die männlichen Patienten im Durchschnitt 3 Jahre jünger waren
als die weiblichen Patienten zum Zeitpunkt der Biopsieentnahme. Es gab bei beiden
41
keinen Unterschied im Altersgipfel. Bezüglich des Medians ist auch kein Unterschied zu
erkennen.
42
DIAGRAMM 1: ABSOLUTE ALTERSVERTEILUNG: MÄNNER / FRAUEN:
86-95
Altersabschnitt
76-85
66-75
56-65
46-55
36-45
26-35
16-25
0
5
10
15
20
25
Anzahl der Patienten
Männer
Frauen
DIAGRAMM 2: PROZENTUALES ALTERSVERHÄLTNIS ZWISCHEN MÄNNER UND FRAUEN:
96-105
86-95
Altersabschnitt
76-85
66-75
56-65
46-55
36-45
26-35
16-25
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Prozentuales Verhältnis
Männer
Frauen
43
6.1.2
Verteilungsverhältnis der sekundären Pleuratumoren
Die am häufigsten in die Pleura metastasierten Tumoren im Kollektiv waren die
Lungentumoren. Mit 21 primär in der Lunge lokalisierten Karzinomen stellt dieses
Kollektiv
26
Prozent
der
metastasierenden
Primärtumoren.
Die
häufigsten
Lungentumoren waren insbesondere die kleinzellig differenzierten Bronchialkarzinome.
Unter den Tumoren waren auch häufig die Adenokarzinome vertreten. Nur wenige
plattenepitheliale Lungentumoren hatten sich in der Pleura manifestiert.
Zu den zweithäufigsten pleurapenetrierenden primären Karzinomen zählten die
gastrointestinalen Tumoren und die Mammatumoren. Die im Gastrointestinaltrakt
lokalisierten Tumoren befanden sich hauptsächlich im oberen Bereich, nämlich im
Ösophagus und besonders häufig im Magen, daneben auch im Kolon. Insgesamt waren
im Kollektiv 22 Prozent gastrointestinale Tumoren und 20 Prozent Mammakarzinome
vorhanden, die in der Pleura zu einer Sekundärmanifestation geführt haben.
Im Kollektiv waren 11 Prozent primär im Urogenitaltrakt lokalisierte Karzinome
vorhanden, wobei bei den Nierenmalignomen besonders das hellzellige Karzinom
dominierte (60%).
Ein Zehntel der Fälle zeigten pleurale Metastasen bei Pankreas-, Kehlkopf- und
Schildrüsenkarzinomen sowie bei Ewing- und Leiomyosarkomen. Diese Fallzahlen
waren allerdings sehr niedrig.
Bei ca. 11 Prozent der Fälle konnte trotz zusätzlicher Immunhistochemie der
Primärtumor nicht ermittelt werden. Diese waren ausschließlich Adenokarzinome.
Gesamtzahl: 82 sekundäre Pleuratumoren (Pleurakarzinosen)
44
Tabelle 2: Verteilung der einzelnen Biopsien auf Primärtumoren
Sekundäre Pleuratumore
Frauen
Männer
Gesamtanteil
Lunge
8
16
26%
Gastrointestinaltrakt
7
11
23%
Mamma
15
0
20%
Urogenitaltrakt
3
6
11%
Verschiedene
0
7
9%
Ungeklärte
1
8
11%
Summe
34
48
100
DIAGRAMM 3: PROZENTUALVERHÄLTNIS DER SEKUNDÄREN PLEURATUMOREN:
Verschiedene
9%
Ungeklärte
11%
Lunge
26%
Urogen.-Trakt
11%
Mamma
20%
GI-Trakt
23%
45
Zusammenfassung der wesentlichen Befunde (Teil I):
§
Frauen waren bei der Biopsieentnahme durchschnittlich 3 Jahre älter.
§
Das Durchschnittsalter lag bei beiden Geschlechtern bei 65 Jahren.
§
Die Männer waren mit 41 Patienten in der Mehrheit gegenüber 30 weiblichen
Patienten.
§
Der Altersgipfel war bei beiden ähnlich, nämlich zwischen 70 und 72 Jahren.
§
Die Pleurakarzinosen hatten ihren Ursprung hauptsächlich in der Lunge,
Gastrointestinaltrakt und Mamma.
§
Histologisch war die häufigste Diagnose das Adenokarzinom.
6.2
MAKROSKOPISCHE UND MIKROSKOPISCHE BEFUNDE
Die Unterscheidung sekundärer Pleuratumoren von primären Pleuratumoren, d.h. dem
Mesotheliom, bereitet dem Pathologen nicht selten Schwierigkeiten, da diese oft nicht
nur durch mikroskopische, sondern auch durch ähnliche makroskopische Befunde
imponieren. Es werden bei der Obduktion meist knotige Tumorherde auch mit
Infiltration
des
Lungengewebes
beobachtet,
was
nicht
selten
zu
einer
Kompressionsatelektase im angrenzenden Lungengewebe führt. Die Patienten klagen
dabei über Luftnot und geringeres Atemvolumen.
6.2.1
Ausgesuchte
sekundäre
Pleuratumoren
mit
differenzial-
diagnostischen Kriterien
6.2.1.1 Primärtumor: Lunge
Diese waren meist Adenokarzinome. In zahlreichen Präparaten waren heterogene
Differenzierungen vorhanden. Die entdifferenzierten Karzinosen waren oftmals kaum
46
vom Mesotheliom zu unterscheiden und Klarheit konnte nur durch zusätzliche
immunhistochemische Reaktion geschaffen werden.
6.2.1.2 Primärtumor: Gastrointestinaltrakt
Auch diese Karzinosen waren zumeist von adenoidem Charakter. Die ösophagalen und
gastralen Karzinome sowie die Kolonkarzinome waren die häufigsten Vertreter. Die
Pleurakarzinosen mit gastrointestinalem Primärtumor waren meist mit klinisch
manifesten Primärtumor assoziiert. Hierdurch wurde die Diagnose des Pleuratumors
erleichtert. Die Tumoren metastasierten im relativ fortgeschrittenen Stadium in die
Pleura. Im histologischen Präparat zeigte sich die Tendenz einer Karzinose zu einem
fokal nekrotischen Zerfall.
6.2.1.3 Primärtumor: Mammakarzinom
Da bei naher Lage der Mamma zur Pleura die kavitäre Form der Metastasierung
vorliegen kann, geht das Wachstum der Metastase oft von der Pleura parietalis aus. Die
Metastasen hatten in der Pleura meist eine polymorphe Struktur, teils durch solides,
teils durch tubuläres Wachstum gekennzeichnet. Ein weiteres Charakteristikum war
das
multifokal
ödematös
aufgelockerte
Bindegewebe
mit
zum
Teil
starken
Fibrosierungsprozessen. Häufig waren Primärmalignom und seine Pleurakarzinose
uniform bezüglich des Differenzierungsgrades.
6.2.1.4 Primärtumor: Nierenzellkarzinom
Auch hier bestand eine relativ vermehrte Fibrosierung einhergehend mit einem
Stromaödem. Angrenzend befand sich ein hochdifferenziertes Karzinom, das durch ein
papilläres Wachstumsmuster mit epitheloidem Charakter imponierte. Das umgebende
47
Stroma war häufig gefäßreich. Bei den Primärtumoren handelte es sich meist um
hellzellige Karzinome.
6.2.1.5 Die Lymphangiosis carcinomatosa
Da das bioptische Material häufig zu klein für die sichere Diagnose einer
Lymphangiosis carcinomatosa war, konnte diese nicht immer mit Sicherheit
diagnostiziert werden. Jedoch fanden sich besonders bei den Mammakarzinomen im
Bereich der parietalen Pleura und bei den Lungentumoren eine Lymphangiosis
carcinomatosa.
Zusammenfassung der wesentlichen Befunde (Teil II):
§
Adenokarzinome
stellen
den
größten
Anteil
der
hier
untersuchten
Pleurakarzinosen.
§
Bei allen Präparaten zeigten sich reaktive Veränderungen.
§
Es bestand meist eine chronische Begleitentzündung in Form einer (fibrosierenden)
Pleuritis.
§
Das Ausmaß der Entzündung korrelierte mit dem Ausmaß der Tumorzellnekrosen.
Die Entzündung war dann randständig betont und mit einem gemischtzelligem
Infiltrat gekennzeichnet.
§
Bei Karzinosen gastrointestinaler Tumoren war häufig ein Primärtumor klinisch
gesichert mit Metastasierung im fortgeschrittenem Stadium.
§
Metastasen der Nierenzellkarzinome waren häufiger höher differenziert.
48
6.3
DIE IMMUNHISTOCHEMISCHEN ERGEBNISSE
6.3.1
SF, c-Met und VEGF
Durch die Immunhistochemie markiert, ließen sich die Zellen, beziehungsweise die
Strukturen, die SF und c-Met oder VEGF enthielten, durch eine tiefpurpurne Färbung
(Fast Red) darstellen. In wenigen Fällen konnte aufgrund einer Überfärbung kein
zuverlässiges Urteil gefällt werden.
6.3.1.1 Primärtumor: Lunge
Im Kollektiv waren 24 Lungenbiopsien von 8 weiblichen und 16 männlichen Patienten
vorhanden. VEGF und SF zeigten in 20 Fällen eine positive Reaktion und in 4 Fällen
keine. c-Met besaß nur in 2 Fällen keine erkennbare Reaktion (Abb. 10).
a) VEGF:
Es fanden sich 6 schwache, 10 mäßige und 4 starke Reaktionen. 4 reagierten nicht.
Demgegenüber hatten 2 Biopsien unter 50%, 9 Biopsien 50 bis 80% und ebenso 8
Biopsien über 80% positiv reagierende Zellen. Dabei war auffällig, daß bei einer
mäßigen Farbreaktion (SI = 2) über 50% Tumorzellen eines Präparates eine Reaktion
zeigten. Dies war auch bei den zwei stark reaktiven Präparaten (SI = 3) ähnlich. Es
bestand somit eine Korrelation zwischen der Farbintensität (SI) und dem Prozentsatz
positiver Zellen (PP). Dies ließ sich auch anhand des „exakten Tests“ von R. A. Fisher
belegen: Bei einem Signifikanzniveau von p=0,05 konnte man durch den Test ein p <
0,001 ermitteln, was auf eine sichere Korrelation hinwies.
Die im Gewebe am stärksten gefärbten Zellen waren eindeutig die Tumorzellen. Im
Gegensatz zur c-Met-Immunhistochemie war das Bindegewebe in den meisten Fällen
nicht reaktiv oder sehr schwach reaktiv. Ebenso verhielt es sich bei den Fibroblasten
(Abb. 11).
49
b) c-Met:
Hier fanden sich 11 stark und 10 mäßig reagierende Präparate. Ein Präparat war
schwach reaktiv. Bei diesem waren weniger als 50% der Zellen positiv. Da bei der c-Met
Färbung 19 Präparate einen positiv gefärbten Tumorzellanteil von über 80% besaßen,
kann man daraus schließen, daß auch hier eine Korrelation zwischen SI und PP
vorhanden ist. Dieses wird durch den Fisher-Test bestätigt; p ist wieder kleiner 0,001.
Die Tumorzellen besaßen die stärkste Farbreaktion. Sie imponierten häufig durch
tubuläre Anordnung und durch fokale Färbereaktionen. Ähnlich verhielten sich die in
der Nähe befindlichen Endothelien der kleinen Gefäße. Das Bindegewebe zeigte häufig
eine mäßige Farbreaktion; die Fibroblasten waren fokal intensiv reaktiv, blieben
insgesamt in ihrer Reaktionsstärke hinter den Tumorzellen.
c) SF:
Bei der SF-Immunhistochemie zeigte sich größtenteils dasselbe Bild wie bei der c-MetFärbung. Der Fisher-Test zeigte hier ein p < 0,001.
Jedoch
waren
Biopsiepräparate
vorhanden,
bei
denen
sich
fokal
keine
Tumorzellreaktion zeigte. Hier waren die Fibroblasten insgesamt besser reaktiv als das
Bindegewebe. In entzündlichen Gebieten wiesen die Lymphozyten generell keine
Reaktion mit den SF-Antikörpern auf.
50
Tabelle 3: Ergebnisse der Immunhistochemie - Lunge
Färbeintensität (SI)
Prozentsatz
Primärtumor:
Positiver
Zellen
(PP) in %
Lunge
VEGF
c-Met
SF
VEGF
c-Met
SF
1
mäßig
mäßig
stark
> 80
> 80
> 80
2
mäßig
mäßig
stark
> 80
> 80
> 80
3
mäßig
mäßig
schwach
50 - 80
> 80
50 - 80
4
keine
stark
keine
-
> 80
-
5
schwach
mäßig
mäßig
50 - 80
> 80
> 80
6
schwach
mäßig
mäßig
50 - 80
> 80
> 80
7
mäßig
stark
stark
> 80
> 80
> 80
8
keine
keine
keine
-
-
-
9
keine
stark
mäßig
-
> 80
> 80
10
schwach
stark
mäßig
50 - 80
> 80
> 80
11
mäßig
mäßig
stark
-
> 80
> 80
12
stark
mäßig
stark
> 80
> 80
50 - 80
13
keine
stark
stark
-
> 80
50 - 80
14
mäßig
mäßig
mäßig
< 50
> 80
> 80
15
schwach
schwach
keine
< 50
< 50
-
16
mäßig
stark
mäßig
50 - 80
> 80
< 50
17
schwach
keine
keine
50 - 80
-
-
18
mäßig
stark
stark
> 80
> 80
> 80
19
stark
stark
mäßig
> 80
> 80
> 80
20
mäßig
mäßig
schwach
50 - 80
< 50
50 - 80
21
stark
stark
stark
> 80
> 80
> 80
22
stark
stark
mäßig
> 80
> 80
< 50
23
mäßig
stark
stark
50 - 80
> 80
> 80
24
schwach
mäßig
stark
50 - 80
50 - 80
> 80
51
Pleurametastasierung bei bekanntem Lungentumor (E.-Nr. 27968/96)
§ Abb. 10
EvG; x20
Disseminiert gelagerte Tumorzellverbände mit kräftiger desmoplastischer Reaktion (breite
Kollagenfaserbündel).
§ Abb. 11
VEGF - Reaktion; x20
Einzeln gelegene Gruppen von Tumorzellen mit starker feingranulärer intrazytoplasmatischer
Expression. Geringgradige positive Markierung auch benachbarter Stromazellen.
51a
Zusammenfassung
Bei einem Signifikanzniveau von p=0,05 war eine deutliche Korrelation zwischen der
Färbeintensität (SI) und dem Prozentsatz positiver Zellen (PP) bei allen drei
immunhistochemischen Färbungen vorhanden, dabei war p<0,001.
Tumorzellen waren immer stärker gefärbt als das umliegende Gewebe.
52
DIAGRAMM 4: SI & PP LUNGE
Färbeintensität (SI):
12
Anzahl
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
SI-Grad
VEGF
c-Met
SF
Prozentsatz positiver Zellen (PP):
20
Anzahl
15
10
5
0
0%
< 50%
50-80%
>80%
Positive Zellen
VEGF
c-Met
SF
53
6.3.1.2 Primärtumor: Gastrointestinaltrakt
Es befanden sich 18 Biopsiefälle aus dem Gastrointestinaltrakt im Kollektiv, wobei 7 von
weiblichen
und
11
von
männlichen
Patienten
stammen
(Abb. 12).
a) VEGF:
Bei diesem Faktor reagierten 8 (44%) stark, 4 (22%) mäßig und 3 (17%) schwach.
Weitere 3 (17%) Fälle zeigten keine Reaktion. Ungefähr 78% der Präparate war so
gefärbt, daß mehr als 50% - bei 8 sogar mehr als 80% - der Tumorzellen
immunhistochemisch positiv reagierten. Hier war auch nach dem Fisher-Test eine enge
Korrelation zwischen SI und PP vorhanden.
Auffallend war die häufige Nichtreaktion des Bindegewebes. Hingegen zeigten die
Fibroblasten und Myozyten eine mäßige Reaktion. Tumorzellen sind nach wie vor die
am stärksten reaktiven Zelleinheiten (Abb. 18, 19, 20, 21).
b) c-Met:
Hier waren 2 Biopsien nicht reaktiv. 5 waren schwach, 5 mäßig und 6 stark reagierend.
Auch hier war die Mehrzahl der Präparate, 8 (44%), dadurch gekennzeichnet, daß
mehr als 80% der Tumorzellen eine positive Reaktion aufwiesen.
Mikroskopisch waren die Endothelzellen sehr gut immunhistochemisch gefärbt. Eine
Korrelation zwischen SI und PP war vorhanden.
Wie bei den Lungenbiopsien waren auch hier die Tumorzellen generell stärker reaktiv
als das umliegende Gewebe. Auffällig war, daß die Fibroblasten eine fast ebenso gute
immunhistochemische Reaktion aufwiesen. Jedoch war bei einigen Präparaten fokal
keine Reaktion gegen jene vorhanden. Das Bindegewebe und die glatte Muskulatur
waren in variabler Form manchmal gut und manchmal kaum reaktiv.
Im Gegensatz zur SF-Immunreaktion der Lunge wiesen die Lymphozyten hier in den
entzündlichen Gebieten der Biopsie eine relativ gute Farbreaktion auf (Abb. 13, 16, 17).
54
c) SF:
Beim SF zeigte die Mehrheit der Biopsien (11 Fälle = 61%) eine mäßige Reaktion. 6
(33%) waren stark reagierend, 1 Präparat zeigte keine immunhistochemische Färbung.
Bei 7 Präparaten besaßen weniger als 50% der Karzinosezellen eine Farbreaktion, bei 11
reagierten mehr als 50% der Tumorzellen mit einer Färbung.
Die Tumorzellen waren hier die reaktivsten Zellen. Das Bindegewebe und die
Fibroblasten waren selten gefärbt. Glatte Muskelzellen der Darmwand waren häufig
reaktiv. In wenigen Präparaten befindliche lymphozytäre Infiltrate waren nur fokal
schwach farbreaktiv (Abb. 14, 15).
55
Tabelle 4: Ergebnisse der Immunhistochemie - Gastrointestinaltrakt
FÄRBEINTENSITÄT (SI)
Primärtumor:
Prozentsatz Positiver Zellen
(PP) in %
Gastrointestinal-trakt
VEGF
c-Met
SF
VEGF
c-Met
SF
1
keine
schwach
keine
-
< 50
-
2
mäßig
schwach
mäßig
> 80
< 50
50 - 80
3
stark
keine
mäßig
50 - 80
-
50 - 80
4
stark
mäßig
mäßig
50 - 80
50 - 80
50 - 80
5
stark
mäßig
mäßig
> 80
50 - 80
50 - 80
6
keine
mäßig
stark
-
50 - 80
> 80
7
mäßig
mäßig
mäßig
> 80
> 80
< 50
8
mäßig
mäßig
mäßig
> 80
> 80
< 50
9
schwach
schwach
mäßig
50 - 80
50 - 80
< 50
10
schwach
schwach
mäßig
50 - 80
> 80
< 50
11
mäßig
schwach
mäßig
50 - 80
> 80
< 50
12
keine
keine
mäßig
-
-
< 50
13
stark
stark
stark
> 80
> 80
> 80
14
stark
stark
stark
> 80
> 80
> 80
15
stark
stark
stark
> 80
> 80
> 80
16
schwach
stark
stark
< 50
50 - 80
> 80
17
stark
stark
stark
> 80
> 80
> 80
18
stark
stark
mäßig
50 - 80
50 - 80
> 80
56
Zusammenfassung
Eine deutliche Korrelation war auch hier zwischen SI und PP vorhanden (p < 0,05).
Die meisten Präparate reagierten gut, 10% reagierten nicht.
Insgesamt gab es keine Korrelation zwischen dem Geschlecht und dem SI- oder PPGrad.
57
Pleurametastasierung bei primärem Karzinom im Gastrointestinaltrakt
(E.-Nr. 1915/96)
§ Abb. 12
HE; x10
Desmoplastische Reaktion in Nähe der Tumorabsiedlung.
§ Abb. 13
c-Met - Reaktion; x20
Mittelstarke c-Met - Expression der Tumorzellen; fehlende Reaktion in Stroma.
57a
Pleurametastasierung bei primärem Karzinom im Gastrointestinaltrakt
(E.-Nr. 19548/96)
§ Abb. 14
Scatter Factor (SF) - Reaktion; x20
Strangartige Tumorzellverbände mit deutlich positiver SF-Expression.
§ Abb. 15
Scatter Factor (SF) - Reaktion; x40
Feingranuläre zytoplasmatisch nachweisbare SF-Expression.
57b
Pleurametastasierung bei Gallengangskarzinom im Ductus Choledochus
(E.-Nr. 19548/96)
§
Abb. 16
c-Met - Reaktion; x40
Starke c-Met - Immunoreaktivität der Tumorzellen intrazytoplasmatisch mit umgebender
desmoplastischer Reaktion.
§
Abb. 17
c-Met - In-situ-Hybridisierung; x625
Punktförmiger Nachweis der c-Met - mRNA - Transkripte in den Tumorzellen (FISH).
57c
Pleurametastasierung bei primärem Karzinom im Gastrointestinaltrakt
(E.-Nr. 1537/96)
§ Abb. 18
VEGF - Reaktion; x40
§ Abb. 19
VEGF - In-situ-Hybridisierung; x625
Vergleich zwischen der VEGF-Immunoreaktion und der VEGF - in-situ-Hybridisierung. Deutlicher Nachweis der mRNA-Transkripte für VEGF in komprimiert gelagerten Tumorzellen
korreliert mit der mittelstarken VEGF-Immunoreaktion.
57d
Pleurametastasierung bei primärem Karzinom im Gastrointestinaltrakt
(E.-Nr. 1537/96)
§ Abb. 20
VEGF - Reaktion; x40
§ Abb. 21
VEGF - In-situ-Hybridisierung; x625
Mittelstarke VEGF-Immunoreaktion und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit Nachweis von VEGF-mRNA. Zentral traubenförmig gelagerte Tumorzellen im ausgeweiteter Gefäßstruktur mit starker VEGF-Syntheses.
57e
DIAGRAMM 5: SI & PP GASTROINTESTINALTRAKT
Färbeintensität (SI):
12
Anzahl
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
SI-Grad
VEGF
c-Met
SF
Prozentsatz positiver Zellen (PP):
8
Anzahl
7
6
5
4
3
2
1
0
0%
< 50%
50-80%
>80%
Positive Zellen
VEGF
c-Met
SF
58
6.3.1.3 Primärtumor: Mamma
Im Kollektiv befanden sich 15 Pleurakarzinose-Biopsien primärer Mammatumoren von
insgesamt 12 Patientinnen. Die jüngste Patientin war 56, die älteste 71 Jahre alt (Abb.
23).
a) VEGF:
9 Fälle (60%) zeigten eine gute, jeweils 2 (13%) eine starke und 2 schwache Reaktion. 2
waren nicht reaktiv. 6 Präparate (40%) waren durch Tumorzellen gekennzeichnet, von
denen mehr als 80% eine positive Farbreaktion aufwiesen. Bei weiteren 6 waren 50 bis
80% der Tumorzellen positiv. Es war also eine enge Korrelation zwischen SI und PP
vorhanden.
In dieser immunhistochemischen Reaktion dominierten wiederum die Tumorzellen. Das
Bindegewebe war häufig nicht bzw. fokal sehr schwach reaktiv. Die Fibroblasten
wiesen ein inhomogenes Bild auf - teilweise reagierten sie mäßig bis sehr schwach (Abb.
22, 24, 28, 29).
b) c-Met:
Es zeigten 11 Präparate (73%) eine mäßige, 2 eine starke und weitere 2 eine schwache
Reaktion. Weiterhin waren 10 (67%) Biopsien mit Tumorzellen charakterisiert, von
denen über 80% immunhistochemisch positiv reagierten.
Tatsächlich war auch hier eine Reaktionsdominanz der Tumorzellen zu sehen. Generell
wies das Bindegewebe keine Farbreaktion auf, die Fibroblasten waren teilweise
schwach bis sehr gut gefärbt (Abb. 25, 26).
c) SF:
Bei der Reaktion gegen SF waren 8 Biopsien (53%) stark positiv. 6 (40%) waren mäßig,
und eine Biopsie schwach in der Reaktion. 6 Präparate besaßen Tumorzellen, von
59
denen über 80% positiv reaktiv waren. Weitere 6 Präparate zeigten Tumorzellen, von
denen zwischen 50 und 80% der Zellen eine positive Reaktion aufwiesen.
Insgesamt waren die Tumorzellen im Vergleich zum umliegenden Gewebe sehr stark
reaktiv. Die Fibroblasten waren eher mäßig bis gut, und das Bindegewebe kaum
farbreaktiv (Abb. 27).
60
Tabelle 5: Ergebnisse der Immunhistochemie - Mamma
FÄRBEINTENSITÄT (SI)
Primärtumor:
Prozentsatz Positiver Zellen (PP)
in %
Mamma
VEGF
c-Met
SF
VEGF
c-Met
SF
1
mäßig
mäßig
stark
> 80
> 80
50 - 80
2
mäßig
schwach
mäßig
50 - 80
< 50
50 - 80
3
keine
mäßig
stark
-
> 80
> 80
4
schwach
mäßig
stark
> 80
> 80
> 80
5
keine
mäßig
schwach
-
< 50
50 - 80
6
schwach
schwach
mäßig
< 50
> 80
50 - 80
7
stark
stark
mäßig
> 80
> 80
> 80
8
mäßig
mäßig
stark
50 - 80
> 80
> 80
9
mäßig
mäßig
stark
> 80
> 80
50 - 80
10
mäßig
mäßig
stark
> 80
> 80
< 50
11
stark
stark
stark
50 - 80
> 80
> 80
12
mäßig
mäßig
mäßig
50 - 80
50 - 80
< 50
13
mäßig
mäßig
mäßig
50 - 80
50 - 80
< 50
14
mäßig
mäßig
mäßig
50 - 80
50 - 80
50 - 80
15
mäßig
mäßig
stark
> 80
> 80
> 80
Zusammenfassung
Eine mäßige Korrelation war zwischen SI und PP vorhanden (p < 0,05).
Bei dieser Organgruppe war eine relativ mäßige Reaktion typisch.
Umliegende Gewebe war zum Teil stärker reagierend als Tumorzellen selbst (Beispiel: cMet - Antikörperreaktion bei Fibroblasten).
61
Pleurametastasierung eines Mammakarzinoms - (E.-Nr. 2354/96)
§ Abb. 22
VEGF - Reaktion; x40
Pleurametastasierung bei primärem Karzinom in der Mamma (E.-Nr. 10914/96)
§ Abb. 23
HE; x10
Metastasierende Tumorzellverbände der Pleura bei invasivem duktalen Mammakarzinom.
61a
Pleurametastasierung bei primärem Karzinom in der Mamma (E.-Nr. 16362/96)
§ Abb. 24
VEGF - Reaktion; x20
§ Abb. 25
c-Met - Reaktion; x40
Mittelstark bis mäßige VEGF- und c-Met - Expression innerhalb der Tumorzellkonglomerate.
61b
Pleurametastasierung bei primärem Karzinom in der Mamma (E.-Nr. 15521/96)
§ Abb. 26
c-Met - Reaktion; x20
§ Abb. 27
Scatter Factor (SF) - Reaktion; x40
Deutliche immunhistochemische intrazytoplasmatische Expression von c-Met, schwache positive Reaktion von Bindegewebszellen. Ebenso eine deutliche Scatter Factor Expression der
Tumorzellen.
61c
Pleurametastasierung eines Mammakarzinoms - (E.-Nr. 2354/96)
§ Abb. 28
VEGF - Reaktion; x40
§ Abb. 29
VEGF - Reaktion; x20
Starke VEGF-Expression der Tumorzellen eines primären Mammakarzinoms bei lymphangtischer
Ausbreitung in der Pleura. Befund sogenannter “dormant cells”: Die Resektion des Tumors
fand 1985 statt, d.h. ca. 11 Jahre vor klinischer Manifestation der Pleurakarzinose. In Tumornähe gelegene stimulierte Mesothelzellen zeigen eine deutliche VEGF-Expression bei malignem
Pleuraerguß.
61d
DIAGRAMM 6: SI & PP MAMMA
Färbeintensität (SI):
12
10
Anzahl
8
6
4
2
0
0
1
2
3
SI-Grad
VEGF
c-Met
SF
Anzahl
Prozentsatz positiver Zellen (PP):
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0%
< 50%
50-80%
>80%
Positive Zellen
VEGF
c-Met
SF
62
6.3.1.4 Primärtumor: Urogenitaltrakt
Die meisten dieser Präparate stellten Absiedlungen hellzelliger Nierenkarzinome dar,
daneben Metastasen eines Ovarialkarzinoms und eines Urothelkarzinoms (Abb. 30, 31).
In dieser Versuchsreihe zeigten sich die intensivsten c-Met-Reaktionen.
a) VEGF:
Bei dieser immunhistochemischen Färbung reagierten 2 (22%) stark positiv, 4 (44%)
mäßig positiv und 1 (11%) Präparat schwach positiv. Zwei Biopsien waren nicht
reaktiv. Nur bei 4 bioptischen Fällen reagierten mehr als 80% der Zellen mit einer
positiven immunhistochemischen Färbung.
Hier waren die Tumorzellen die reaktivsten Zellen. Das Bindegewebe und ebenso die
Fibroblasten waren relativ reaktionsarm. Beim Ovarialkarzinom waren alle Zellen des
Präparates reaktionsarm. Das Bindegewebe und die Fibroblasten der Metastase des
Harnblasentumors zeigten keine Reaktion.
b) c-Met:
Es waren hier 4 (44%) stark, 3 (33%) mäßig und 2 (22%) Biopsien schwach reaktiv. Bei
7 (78%) Präparaten besaßen mehr als 80% der Zellen eine immunhistochemisch positive
Färbung!
Sämtliche Gewebsstrukturen waren gut reagierend gegenüber der c-Met-Färbung. Zum
Teil fanden hier die in der gesamten Untersuchung stärksten Reaktionen der Strukturen
statt. Unter den Zellen dominierten auch hier die Tumorzellen; die anderen Strukturen
(Myozyten, Fibroblasten und Lymphozyten) wiesen häufig eine relativ gute
Farbreaktion auf.
c) SF:
63
Ein ähnliches Bild bot sich auch bei der SF-Immunhistochemie. 6 (67%) Biopsien hatten
eine stark positive Reaktion, eine Biopsie war mäßig reaktiv. Weitere 2 waren nicht
reaktiv. Ebenso waren hier bei 5 (56%) Präparaten über 80% der Zellen reaktiv
bezüglich der Immunhistochemie.
64
Tabelle 6: Ergebnisse der Immunhistochemie - Urogenitaltrakt
FÄRBEINTENSITÄT (SI)
Primärtumor:
Prozentsatz Positiver Zellen
(PP) in %
Urogenitaltrakt
VEGF
c-Met
SF
VEGF
c-Met
SF
1
keine
mäßig
keine
-
> 80
-
2
keine
schwach
keine
-
> 80
-
3
schwach
stark
mäßig
< 50
> 80
< 50
4
mäßig
stark
stark
> 80
> 80
50 - 80
5
mäßig
stark
stark
> 80
> 80
> 80
6
mäßig
schwach
stark
> 80
< 50
> 80
7
stark
mäßig
stark
50 - 80
> 80
> 80
8
mäßig
mäßig
stark
< 50
< 50
> 80
9
stark
stark
stark
> 80
> 80
> 80
Zusammenfassung
Insgesamt
ist
eine
gute
Korrelation
zwischen
SI
und
PP
vorhanden
(p < 0,05).
Die Urogenitaltrakt-Gruppe zeigt generell eine gute c-Met- und SF-Reaktion.
Die VEGF-Reaktion ist schwächer ausgeprägt als bei den bisher besprochenen BiopsieGruppen.
Diese Tumorzellen haben die stärkste Reaktion.
65
Pleurametastasierung bei primärem Urothelkarzinom (E.-Nr. 28106/95)
§ Abb. 30
HE; x10
Hochdifferenzierte urothel-ähnliche Tumorformationen bei pleuraler Metastasierung.
§ Abb. 31
HE; x4
Inselartige Lagerung von Tumorzellen mit Bindegewebsreaktion, Brenner-Tumor ähnliches Bild.
65a
DIAGRAMM 7: SI & PP UROGENITALTRAKT
Färbeintensität (SI):
6
5
Anzahl
4
3
2
1
0
0
1
2
3
SI-Grad
VEGF
c-Met
SF
Prozentsatz positiver Zellen (PP):
7
6
Anzahl
5
4
3
2
1
0
0%
< 50%
50-80%
>80%
Positive Zellen
VEGF
c-Met
SF
66
6.3.1.5 Primäres Karzinom unbekannter Lokalisation
Bei diesen Präparaten handelt es sich um Fälle, bei denen ein Mesotheliom anhand
eingehender Histologie und Immunhistochemie sicher ausgeschlossen werden konnte,
jedoch eine sichere und eindeutige Diagnose hinsichtlich der Einordnung bei einem
anderen Orts lokalisierten Primärtumors nicht möglich war. Im Kollektiv waren
insgesamt 9 Biopsien vorhanden (8 männlich).
a) VEGF:
Bei der VEGF-Immunhistochemie waren 4 (44%) stark, 3 (33%) mäßig und eine Biopsie
schwach positiv. Eine Biopsie zeigte keine Reaktion. Bei 6 (67%) Präparaten waren über
80% der Zellen positiv reaktiv, bei 2 (22%) zeigten weniger als 50% der Zellen eine
Reaktion.
Da die Präparate unterschiedlicher Herkunft waren, zeigten sie eine unterschiedliche
Bindegewebs- und Zellreaktion. Manche waren stark positiv, manche aber auch
schwach
bis
nicht
reaktiv.
Hinsichtlich
der
Tumorzellreaktion
wiesen
die
Biopsiepräparate eine durchgehend gute Reaktion auf, was die Dominanz der
Tumorzellen bezüglich der Konzentration an VEGF unterstreicht.
b) c-Met:
Hier fanden sich 6 (67%) stark reagierende Biopsien. Jeweils eine Biopsie reagierte
schwach, eine mäßig und eine zeigte keine Reaktion. 5 Präparate besaßen Tumorzellen,
von denen über 80% immunhistochemisch reaktiv waren.
Wie bei der VEGF-Immunhistochemie zeigten sich auch hier unterschiedlich starke
Reaktionen des umliegenden Gewebes. Insgesamt war eine relativ gute c-Met-Färbung nicht nur der Tumorzellen - zu sehen (Abb. 32, 33).
c) SF:
67
Bei der PP-Auswertung zeigten die Präparate in der SF-Immunhistochemie dieselben
Resultate wie beim c-Met. Jedoch lag der Anteil der stark reagierenden Präparate bei 4
(44%). 3 Biopsien waren mäßig, eine schwach reaktiv und eine reagierte nicht.
68
Tabelle 7: Ergebnisse der Immunhistochemie - Primäres Karzinom unbekannter
Lokalisation
FÄRBEINTENSITÄT (SI)
Positiver
Zellen
(PP) in %
PRIMÄRTUMOR:
Primäres
Prozentsatz
Karzinom
unbekannter
Lokalisation
VEGF
c-Met
SF
VEGF
c-Met
SF
1
stark
stark
mäßig
> 80
> 80
< 50
2
schwach
stark
mäßig
> 80
> 80
> 80
3
stark
mäßig
mäßig
> 80
50 - 80
> 80
4
mäßig
stark
stark
< 50
50 - 80
> 80
5
keine
schwach
keine
-
< 50
-
6
stark
stark
stark
> 80
> 80
> 80
7
mäßig
keine
stark
> 80
-
> 80
8
stark
stark
stark
> 80
> 80
> 80
9
mäßig
stark
schwach
< 50
> 80
50 - 80
Zusammenfassung
Eine enge Korrelation ist zwischen SI und PP vorhanden (p < 0,05).
Jedoch ist insgesamt eine gute immunhistochemische Reaktion aller Biopsien
hinsichtlich der Tumorzellen kennzeichnend; 11% sind nicht reaktiv.
Das Gewebe besitzt aufgrund unterschiedlicher Herkunft der ungeklärten Tumoren
kein einheitliches Reaktionsverhalten gegenüber den Antikörpern.
69
DIAGRAMM 8: SI & PP PRIMÄRES KARZINOM UNBEKANNTER LOKALISATION
Färbeintensität (SI):
6
5
Anzahl
4
3
2
1
0
0
1
2
3
SI-Grad
VEGF
c-Met
SF
Prozentsatz positiver Zellen (PP):
6
Anzahl
5
4
3
2
1
0
0%
< 50%
50-80%
>80%
PositiveZellen
VEGF
c-Met
SF
70
Pleurametastasierung bei Primärtumor ungeklärter Lokalisation (E.-Nr. 26214/96)
§ Abb. 32
c-Met - Reaktion; x20
Immunhistochemisch deutlich positive Reaktion der Tumorzellen gegen c-Met.
§ Abb. 33
c-Met - In-situ-Hybridisierung; x625
Gleichzeitiger Nachweis einer c-Met - Synthese bei positiver c-Met-FISH im Tumorgewebe.
70a
6.3.1.6 Verschiedene sekundäre Pleuratumoren
Im Kollektiv waren
§
3 Pankreaskarzinome
§
1 Schildrüsenkarzinom
§
1 Kehlkopfkarzinom
§
1 Leiomyosarkom sowie
§
1 Ewing-Sarkom vorhanden.
Pankreaskarzinom
Bei dieser Organgruppe waren von 3 Biopsien bei der
•
VEGF-Färbung 2 mäßig und eine schwach reaktiv
•
c-Met-Färbung 2 stark und eine mäßig reaktiv
•
SF-Färbung 2 schwach und eine mäßig reaktiv.
Bei der Mehrzahl der immunhistochemisch gefärbten Präparate zeigten über 80% der
Tumorzellen eine positive Reaktion. Sie waren sehr reaktiv. Das Bindegewebe zeigte
ebenso eine gute Farbreaktion, die Fibroblasten sind teilweise sehr reaktiv. Insgesamt
sind alle Zellen reaktiv. Eine Korrelation zwischen SI und PP war vorhanden (p < 0,05).
Schilddrüsenkarzinom
Bei dieser Karzinose zeigten bei der VEGF-Immunhistochemie die Tumorzellen und das
umliegende Gewebe keine Reaktion; jedoch waren bei der Reaktion gegen c-Met und SF
alle Zellen gleichermaßen stark positiv. Eine Korrelation zwischen SI und PP war
vorhanden (p < 0,05).
71
Kehlkopfkarzinom
Hier war die Immunhistochemie bei allen Faktoren schwach reaktiv; jedoch zeigten
über 80% der Tumorzellen eine Reaktion. Das Bindegewebe und die darin enthaltenen
Strukturen waren reaktionsarm. Eine Korrelation zwischen SI und PP war nicht
vorhanden (p < 0,05).
Leiomyosarkom
Die SF- und die VEGF-Immunhistochemie zeigten keine positive Reaktion. c-Met
hingegen wies eine mäßige Farbreaktion fast aller Tumorzellen auf. Hier waren die
Tumorzellen und die Fibroblasten gleichermaßen sehr reaktiv. Eine Korrelation
zwischen SI und PP war nicht vorhanden (p < 0,05).
Ewing-Sarkom
Hier zeigte die SF-Färbung keine Reaktion; hingegen waren VEGF und c-Met jeweils
mäßig positiv. Das Bindegewebe war sehr schwach, die Fibroblasten mäßig bis schwach
reaktiv. Eine Korrelation zwischen SI und PP war vorhanden.
72
Tabelle 8: Ergebnisse der Immunhistochemie - Verschiedene Primärtumoren
FÄRBEINTENSITÄT (SI)
Primärtumor
Prozentsatz Positiver Zellen
(PP) in %
VEGF
c-Met
SF
VEGF
c-Met
SF
Nr.1
mäßig
stark
schwach
50 - 80
> 80
< 50
Nr.2
schwach
stark
schwach
< 50
> 80
< 50
Nr.3
mäßig
mäßig
mäßig
> 80
> 80
> 80
II.Schilddrüsen-
keine
stark
stark
-
> 80
50 - 80
III.Kehlkopf-karzinom schwach
schwach
schwach
< 50
> 80
> 80
IV.Leiomyosarkom
keine
mäßig
keine
-
> 80
-
V.Ewing-Sarkom
mäßig
mäßig
keine
> 80
> 80
-
I.Pankreas-karzinom
karzinom
73
6.3.1.7 Statistik der Immunhistochemie und Zusammenfassung der Ergebnisse
Als
statistisches
Hilfsmittel
wurde
für
die
Auswertung
der
verschiedenen
Farbreaktionen der „exakte Test“ von R. A. Fisher benutzt. Dieser Test besitzt die
Fähigkeit, mit einem relativ kleinen Versuchskollektiv (Bei dieser Untersuchung: 26
Biopsien von Lungenmetastasen) aussagefähiges und eindeutiges statistisches Ergebnis
zu liefern. Als Alternative wäre der Chi-Quadrat-Test ebenso möglich gewesen; jedoch
wäre die Validität aufgrund des kleinen Kollektives begrenzt.
Ziel war es, die Beziehung zwischen der jeweiligen Farbreaktion (SI) der
Immunhistochemie und dem Prozentsatz positiver Zellen (PP) zu ermitteln.
Desweiteren
sollte
die
Beziehung
zwischen
den
angiogenetischen
Faktoren
untereinander anhand der Farbreaktion (SI) und dem Prozentsatz positiver Zellen (PP)
festgestellt werden.
Das Signifikanzniveau lag bei p
=
0,05,
d.h.,
mit
einer
95
prozentigen
Wahrscheinlichkeit kann davon ausgegangen werden, daß eine Beziehung oder eine
Korrelation zwischen den untersuchten Größen vorhanden ist. Trifft dies zu, so muß p
kleiner als 0,05 sein. Dabei ist es irrelevant, in wieweit p kleiner als 0,05 ist.
Insgesamt wurde deutlich, daß bei allen drei angiogenetischen Faktoren eine klare
Korrelation zwischen der Reaktivität (SI) und dem Prozentsatz positiver Zellen (PP)
vorhanden war. Je stärker die Biopsiereaktion mit den Antikörpern war, desto mehr
Zellen erschienen als tiefpurpurfarben. Dabei war p häufig kleiner als 0,001.
Verglich man nun die Reaktivität (SI) der einzelnen angiogenetischen Faktoren
miteinander, so ergab sich folgendes Ergebnis:
VEGF-SI mit c-Met-SI => p < 0,01
VEGF-SI mit SF-SI => p < 0,001
74
c-Met-SI mit SF-SI => p < 0,05
Da das Signifikanzniveau p nie größer als 0,05 war, lag eine Korrelation zwischen den
einzelnen Faktoren vor.
Ein Vergleich der Prozentsätze positiver Zellen (PP) der einzelnen Faktoren ergab
folgendes:
VEGF-PP mit c-Met-PP => p = 0,085
VEGF-PP mit SF-PP => p< 0,01
c-Met-PP mit SF-PP => p < 0,05
Hier war eine Korrelation zwischen VEGF-PP und SF-PP sowie zwischen c-Met-PP und
dem SF-PP zu erkennen. Zwischen VEGF-PP und c-Met-PP bestand lediglich eine
Tendenz, jedoch keine signifikante Korrelation (p = 0,085). Bei Ausschluß der Gruppe
variabler
Primärtumoren
(d.h.
Pankreaskarzinom,
Schildrüsenkarzinom,
Kehlkopfkarzinom, Leiomyosarkom sowie Ewing-Sarkom - Kap. 6.3.1.6) in der
Korrelationsbestimmung, war auch zwischen VEGF-PP und c-Met-PP eine signifikante
Korrelation vorhanden (p < 0,05).
Tabelle 9: Der exakte Test von R. A. Fisher in Übersicht
VEGF
c-Met
SF
VEGF
-
(SI): p<0,01
(SI): p<0,001
c-MET
(PP): p=0,085
-
(SI): p<0,05
SF
(PP): p<0,01
(PP):p<0,05
-
75
6.4
ERGEBNISSE DER IN-SITU HYBRIDISIERUNG
Die in-situ Hybridisierung wurde für c-Met und VEGF durchgeführt. Hierbei wurden
jeweils 7 Präparate aus dem Gesamtkollektiv
untersucht. Es wurden Präparate
verwendet, die immunhistochemisch für c-Met und VEGF reaktiv waren. Anhand der
in-situ Hybridisierung konnten die c-Met und VEGF kodierenden mRNA-Transkripte in
Tumorzellen
in
unterschiedlicher
Signalintensität
semiquantitativ
nachgewiesen
werden,
beurteilt
die
wurde
(+ = schwach, ++ = mäßig, +++ = stark fluoreszierend). Eine Synthese von c-Met und
VEGF in Tumorzellen konnte hierdurch bestätigt werden.
Daneben fanden sich auch RNA-Transkript-Signale z.B. in Gefäßendothelzellen oder
auch Perizyten und Stromazellen. Eine eigenständige Synthese in Tumorzellen war
demnach hier auch zu sichern.
Tabelle 10: In-situ Hybridisierung - Signalintensität
Signalintensität
Lunge
E26214/96
Gastrointestinaltrakt
E1537/96
Mamma
E19737/94
ungeklärte Primärtumoren
E19548/96
Urogenitaltrakt
E16895/96
Gastrointestinaltrakt
Präparat 12
Lunge
Präparat 8
c-Met
VEGF
++
++
+++
+++
+++
+++
+
+
++
++
-
-
-
76
6.5
ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE
§
Das Signifikanzniveau wurde bei p = 0,05 angesetzt.
§
Es
lag
eine
statistisch
signifikante
Korrelation
zwischen
den
einzelnen
angiogenetischen Faktoren (VEGF, c-Met und SF) bezüglich der Stärke der
immunhistochemischen Reaktion vor.
§
Auch für die prozentuale Verteilung immunhistochemisch positiver Zellen ergab
sich eine statistisch signifikante Korrelation, lediglich für die prozentuale
Immunreaktivität hinsichtlich VEGF und c-Met zeigte sich zwar eine Tendenz der
immunhistochemischen
Korrelation,
jedoch
keine
statistisch
signifikante
Korrelation.
§
Von 82 Pleurabiopsien zeigten 67 (83%) pleurale Metastasen eine positive
immunhistochemische Reaktion gegen VEGF.
§
Die VEGF-Expression war intrazytoplasmatisch in den Tumorzellen lokalisiert.
§
In 76 (93%) der 82 Biopsien der Pleurametastasen war auch eine c-Met-Expression
nachweisbar.
§
Bei 73 (89%) der 82 Fälle war eine positive Reaktion mit dem Antikörper gegen SF
nachweisbar.
§
Eine Überexpression lag überwiegend in malignen Zellen vor, jedoch zeigten auch
Endothelzellen benachbarter Gefäße eine Expression von c-Met (siehe Lunge).
§
Das Bindegewebe war hauptsächlich in der Lunge reaktiv für alle drei
angiogenetischen Faktoren. Das Bindegewebe der Mammatumor-Biopsien war
häufig reaktionslos.
§
Die Fibroblasten waren in Metastasen der Mammatumoren meistens genauso stark
reaktiv wie die Tumorzellen selbst. Insgesamt verhielten sich die Fibroblasten relativ
variabel gegenüber der immunhistochemischen Reaktionen (schwach bis sehr
reaktiv).
§
In entzündlichen Gebieten waren die Lymphozyten häufig reaktiv.
78
§
Die hier untersuchten Sarkome verhielten sich ähnlich: Das Leiomyosarkom war
zwar - wie auch das Ewing-Sarkom - reaktiv gegen die c-Met - Immunhistochemie,
jedoch fiel die Reaktion gegen SF und VEGF negativ aus.
§
Insgesamt können die obigen Ergebnisse mit vergleichbarer immunhistochemischer
Expression von VEGF, c-Met und SF in Tumorzellen pleuraler Metastasen als
Hinweis auf ein mögliches Zusammenspiel dieser angiogenetisch wirksamen
Faktoren im Rahmen der Tumorangiogenese gelten.
79
7
7.1
DISKUSSION
METHODEN
Bei der Untersuchung des Kollektivs wurden die Verfahren der immunhistochemischen
Färbung und der Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) angewandt.
7.1.1
Immunhistochemische Färbeverfahren
Das Probenkollektiv bestand aus 82 Biopsien pleuraler Metastasen von primär in
anderen Organen lokalisierten Tumoren. Die immunhistochemischen Reaktionen
wurden durch eine „Fast Red“-Reaktion farblich sichtbar gemacht und semiquantitativ
ausgewertet. Dabei ist die Intensität der Färbung nur bedingt ein Anhaltspunkt für die
Stärke der Immunreaktion. Die Auswertung wurde durch den (von uns modifizierten
siehe Kap. 5.5) „Immunreactive Score (IRS)“ (nach Remmele und Stegner 1987)
vorgenommen und um eine objektivere Evaluation zu erhalten, von zwei voneinander
unabhängigen Beobachtern durchgeführt. Hierbei ergab sich keine signifikante
Abweichung zwischen den beiden Auswertungen. Da die immunhistochemische
Färbung maschinell und nicht manuell erfolgte, konnte eine höchstmögliche
Standardisierung erreicht werden. Durch häufige Kontrollen wurden zufällige und
systemische Fehler weitgehend eliminiert.
7.1.2
In-situ Hybridisierung
Anhand der Fluoreszenz- bzw. nicht-radioaktiven in-situ Hybridisierung (FISH) war
es möglich, die Synthese von den hier untersuchten angiogenetisch wirksamen
Faktoren, endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) und c-Met (Rezeptor des HGF/SF),
auf mRNA Ebene zu untersuchen.
80
Die Hybridisierung basiert auf der Fähigkeit, denaturierte (einzelsträngige) DNA mit
entsprechenden komplementären Sequenzen unterhalb des Schmelzpunktes Tm zu
renaturieren.
In-situ
Hybridisierungstechniken
erlauben
eine
Detektion
von
spezifischen
Nukleinsäuresequenzen in morphologisch erhaltenen Chromosomen, Zellen oder
Gewebeschnitten. Wir haben letztere untersucht. Im Gegensatz zur Filterhybridisierung
wird die Nukleinsäure nicht aus den Zellen extrahiert, sondern direkt in der intakten
Zelle nachgewiesen (in-situ = in natürlicher Lage). Somit stellt die in-situ Hybridisierung
ein
Verfahren
dar,
Nukleinsäurestranges
wodurch
anhand
der
einer
genetische
chemischen
Informationsgehalt
„Kreuzung“
mit
eines
analogen
Nukleinsäuren ermittelt werden kann. Dabei entstehen Hybridmoleküle, die durch
fluoreszierende Stoffe optisch sichtbar gemacht werden können.
7.1.2.1 Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung (FISH)
Die Handhabung dieser Methode hat gegenüber der radioaktiven in-situ Hybridisierung
Vorteile bezüglich einer ungefährlicheren Durchführung und einer besseren Qualität
der Signale, was zur Verdrängung der radioaktiven in-situ Hybridisierung geführt hat.
Die Signale können wie bei der immunhistochemischen Färbereaktion semiquantitativ
ausgewertet werden.
Insgesamt ist festzuhalten, daß anhand der immunhistochemischen Reaktionen die hier
untersuchten angiogenetischen Faktoren in den pleuralen Metastasen qualitativ
bestimmt werden konnten; eine quantitative Bestimmung ist nicht zulässig. Bei einer
weiterführenden positiven Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) war es möglich zu
folgern, daß die Synthese der Faktoren – und nicht eine Speicherung - in den pleuralen
Metastasen stattgefunden hat, da zu den Proteinen die jeweiligen mRNA erfaßt werden
konnten.
81
7.2
BEFUNDE
7.2.1
Häufigkeit
Im Untersuchungsgut, das aus 82 Pleurabiopsien von 41 männlichen und 30 weiblichen
Patienten bestand, fanden sich am häufigsten pleurale Metastasen primärer
Lungenkarzinome (26%). Pleurale Metastasen gastrointestinaler Tumoren waren mit
23%,
die
der
Mammakarzinome
mit
20%
im
Kollektiv
vorhanden.
Die
Häufigkeitsverteilung im Probenkollektiv stimmte größtenteils mit dem Ergebnis von
Chernow und Sahn (1977) überein.
7.2.2
Verteilung
Mehr als 50% aller Pleurakarzinosen bei Frauen waren auf ein Mammakarzinom
zurückzuführen. Farcchia zeigte anhand statistischer Erhebungen, daß ungefähr 50%
aller Patientinnen mit Mammakarzinomen ein „malignes Pleuraexsudat“ entwickelten
(Fracchia 1974).
Bei Männern war eine deutliche Dominanz der primären Lungentumoren für pleurale
Metastasen zu erkennen. Bei 39% der bioptisch gesicherten Pleurakarzinosen waren
Neoplasien der Lungen die Primärtumoren. Mit 27% stellten gastrointestinale Tumoren
die zweithäufigste Tumorengruppe für Pleurakarzinosen beim Mann dar.
In ungefähr 20% der Fälle konnte der Primärtumor der gesicherten pleuralen
Metastasierungen im männlichen Patientengut nicht abschließend diagnostiziert
werden.
Chrétien zeigte in seinem Untersuchungsgut, daß bei „jungen“ Patienten (bis 30.
Lebensjahr) mit Pleuraergüssen ganz vorwiegend entzündliche Veränderungen als
Ursache vorlagen, während bei den über 50 Jahre alten Patienten maligne Tumoren
dominierten (Chrétien 1985). Das Durchschnittsalter lag bei den untersuchten Patienten
zwischen 63 und 65 Jahren und ist mit dem Ergebnis von Chrétien vergleichbar.
82
Tabelle 11: Vergleich eigener Resultate zu den Primärtumoren als Ursache
pleuraler Metastasen mit Angaben in der Literatur :
Primärtumoren mit sekundären Pleuraergüssen
Lunge
Mamma
GI-
Urogenital-
Trakt
trakt
Verschiedene
Ungeklärt
Mesotheliom
26%
20%
23%
11%
9%
11%
*
36%
25%
*)
5%
10%
*)
*)
13%
14%
*)
*)
5%
48%
5%
Reshad 1985 60%
30%
Eigene
Resultate
1998
(n=82)
Sahn 1988
(n=1783)
Chrétien
1985
(n=163)
5%
5%
(n=200)
Hausheer
35%
23%
Titscher 1981 52%
31%
*)
6%
10%
*)
*)
1985
(n=811)
14%
3%
(n=427)
*)Diese Daten wurden entweder bei der Auswertung nicht berücksichtigt oder nicht ins
Kollektiv aufgenommen.
84
7.2.3
Klinik pleuraler Metastasen
Pleurale Metastasen manifestieren sich in der Initialphase klinisch meist als
Pleuraerguß. Obwohl heute bei erheblich verbesserter Tumordiagnostik durch
radiologische
und
klinisch-chemische
Verfahren
Neoplasien
in
frühen
Entwicklungsstadien erkannt werden können, wird die Manifestation sekundärer
Pleuratumoren oft erst über den Pleuraerguß erkannt. Radiologisch imponieren
Pleuraergüsse bei Aufnahme im Stehen als Verschattungen der kostophrenischen
Winkel. Im Liegen können Ergüsse übersehen werden. Bei Unsicherheit kann die
diagnostische Klärung auch mittels Sonographie, Computertomographie, NMR und die
Mikroskopie mit Probeentnahme erfolgen (Woodring 1984).
Mattay fand heraus, daß bei 1868 untersuchten Patienten mit Pleuraergüssen 785 (42%)
Folge bösartiger Tumoren waren (Mattay 1990). Chernow führte aus, daß eine kurative
Therapie beim malignen Pleuraerguß in der Regel nicht mehr möglich ist (Chernow
1977).
Klinische Symptome eines Pleuraergusses können sein:
•
Schmerzen
•
Lungenatelektasen
•
Belastungsdyspnoe
•
Kurzatmigkeit
•
Husten
Der Pleuraerguß besitzt benigne und maligne Ursachen. In über 90% lassen sie sich auf
folgende Erkrankungen zurückführen:
Benigne Ursachen:
•
(Links-) Herzinsuffizienz
•
Herzoperationen (Durchgangssyndrom)
•
Leberzirrhose mit Aszites
•
Pneumonien
•
Lungenembolien
85
Maligne Ursachen:
•
Primäre und sekundäre Tumoren in der Pleura
7.2.4
Lokalisation des malignen Ergusses
Amnamnestisch imponierte bei mehr als 50% der Patienten der Erguß einseitig, wobei
der Erguß bei Mammakarzinomen am häufigsten war (in über 80% der Fälle). In der
Literatur werden verschiedene Zahlen bezüglich der mit Mammakarzinomen
assoziierten Ergüsse beschrieben:
Raju fand in 83% der Fälle eine einseitige und in 9% einen kontralateralen Erguß (Raju
1970).
Chrétien hingegen beziffert den einseitigen Erguß mit 50%, den kontralateralen mit 40%
und den beidseitigen Erguß mit 10% (Chrétien 1985).
Huzly führte 1991 aus, daß eine simultane Doppelseitigkeit sehr verdächtig auf
ausgedehntere pleurale Dissemination des Primärtumors bzw. eine Generalisation sei.
Dies sei Anlaß für ausgedehntere Untersuchungen einschließlich Knochenmarksanalyse
der Beckenkammstanze, Szintigraphie des Skelettes, CT und NMR. Bei allen anderen
Tumoren sei die Seitenlokalisation uninteressant. Er meinte weiterhin, daß eine pleurale
Manifestation andernorts lokalisierter Primärtumoren in 2 bis 21% der Fälle auftrete
(Huzly 1991).
7.2.5
§
Techniken zur Entnahme von Biopsien
Bei Pleuraergüssen unklarer Ätiologie muß die Klärung durch Analyse von Punktat
oder
Biopsiematerial
erfolgen.
Die
Biopsieentnahme
kann
unterschiedlich
durchgeführt werden. Dabei ist die Sensitivität unterschiedlich.
§
Bei einer (ersten) zytologischen Untersuchung der Biopsie beträgt die Sensitivität
ungefähr 66% (Loddenkemper 1998).
86
§
Die Nadelblindbiopsie besitzt bei sekundären malignen Pleuratumoren lediglich eine
Sensitivität von ca. 57% (Tomlinson 1987). Sahn beziffert sie sogar mit nur 46%
(1988).
§
Eine Kombination von Ergußzytologie und Nadelbiopsie sichert in 73% die Diagnose
(Sahn 1988).
§
Mit thorakoskopisch gewonnenem Material wird eine Sensitivität bis zu 95%
angegeben (Ganzemeier 1988).
§
Bei Kombination von thorakoskopischer Pleurabiopsie mit einer Ergußzytologie
kann eine diagnostische Sensitivität von ebenfalls 95% erreicht werden (Ganzemeier
1988).
7.2.6
Die Thorakoskopie
7.2.6.1 Die historische Entwicklung der Thorakoskopie
§
1910 Diagnostische Thorakoskopie (Jacobaeus)
§
1915 Therapeutische Thorakoskopie (Jacobaeus)
§
1937 Therapeutische Thorakoskopie beim Spontanpneumothorax (Sattler)
§
1961 Operative Thorakoskopie zur Sympathektomie (Wittmoser)
§
1972 Direkte Thorakoskopie (Maaßen)
§
1982 Erweiterte Thorakoskopie
§
1990 Interventionelle Thorakoskopie (Inderbitzi)
§
1991 Thoracoscopic laser assisted lung resection (Landreneau)
§
1992 Imaged thoracoscopic surgery (Lewis)
§
1992 Minimal invasive Thoraxchirurgie (Loddenkemper 1998)
87
7.2.6.2 Die diagnostischen Vorteile der internistischen Thorakoskopie beim
Pleuraerguß
§
Schnelle und sichere bioptische Diagnostik (incl. Tbc-Kultur und HormonrezeptorStatus).
§
Biopsien nicht nur von der Brustpleura, sondern auch von Zwerchfell, Lunge und
Mediastinum.
§
Ausschluß einer malignen oder tuberkulösen Ätiologie mit hoher Sicherheit.
§
Goldstandard für wissenschaftliche Untersuchungen.
(Loddenkemper 1998)
7.2.6.4 Therapeutische
Vorteile
der
internistischen
Thorakoskopie
beim
Pleuraerguß
§
Komplette sofortige Entfernung des Ergusses
§
Eröffnung von gekammerten Flüssigkeitshöhlen
§
Einschätzung des Reexpansionspotentials der Lunge
§
Talkpuderung zur Pleurodese (nicht-chirurgischer Goldstandard)
§
Früher Therapiebeginn (z.B. bei Tbc)
(Loddenkemper 1998)
7.2.7
Morphologische Diagnostik
Die beste Tumorsicherung (Goldstandard) wird durch morphologische Auswertungen
von Biopsien unter Einsatz immunhistochemischer Zusatzuntersuchungen erzielt. Bei
der Diagnose ist thorakoskopisch gewonnenes Material (4-5 mm im Durchmesser) der
perthorakalen Nadelblindbiopsie (Ramel-Biopsie) deutlich überlegen.
Seit 15 Jahren werden immunhistochemische Methoden bei der Diagnostik von
malignen Pleuraergüssen eingesetzt (Müller 1998, Loy 1990). Hierbei werden mit Hilfe
von monoklonalen Antikörpern maligne Zellen im Erguß durch Markierung z.B. von
88
Oberflächenantigenen nachgewiesen. Die Spezifität beträgt 100%, die Sensitivität
schwankt zwischen 75 und 100% (Brockmann 1991, Loy 1990, Pavesi 1988).
Mit
gezieltem
Einsatz
immunhistochemischer
Markerprofile
kann
die
Dignitätsbestimmung und histogenetische Ableitung pleuraler Tumoren dem Kliniker
wesentlich sicherer mitgeteilt werden. Mit Antikörpern, die gegen Zytokeratine,
Vimentin, HEA, BMA 120, Leu-M-1 sowie Calretinin gerichtet sind, ist die
versicherungsmedizinisch relevante Frage der Abgrenzung primärer Mesotheliome zu
Pleurakarzinosen insbesondere primärer Adenokarzinome im Regelfall zuverlässig
möglich (Müller 1998). Das Untersuchungsgut besitzt für den Pathologen die höchste
diagnostische Wertigkeit.
In dieser Arbeit war die Anzahl pleuraler Metastasen primärer Mammatumoren mit
einem Anteil von 20% (15 Biopsien) gegenüber den Metastasen der gastrointestinalen
Tumoren (23% mit 18 Biopsien) vergleichsweise unterrepräsentiert, wenn man davon
ausgeht, daß gerade bei den Mammakarzinomen der Pleuraerguß unklarer Genese das
Initialsymptom einer Pleurametastasierung darstellt (Pfitzner 1989).
Die Pleurametastasen der Lungenkarzinome stellten im eigenen Untersuchungsgut mit
26% (24 Fälle) den größten Anteil an sekundären Pleurakarzinosen. Dabei betrug das
Verhältnis der Männer zu den Frauen 2:1. Der in dieser Arbeit beschriebene Anteil
unklarer maligner Ergüsse korrelierte mit 11% (9 Fälle) durchaus mit dem von Sahn
gewonnenen Untersuchungsergebnis; er bezifferte sie mit 7% (Sahn 1988).
7.2.8
Charakterisierung pleuraler Metastasen
Beurteilt man die pleuralen Metastasen verschiedener Primärtumoren, so ergeben sich
folgende Beobachtungen:
§
Pleuraergüsse bei Primärtumoren der Lunge manifestierten sich anamnestisch
häufig in frühen Stadien der Tumorenbildung - insbesondere bei den kleinzelligen
Bronchialkarzinomen und bei den Adenokarzinomen. Daher muß von einer
frühzeitigen Metastasierung in die Pleura ausgegangen werden. Meyer kam nach
Untersuchungen von metastasierenden Bronchialkarzinomen zu einem ähnlichen
89
Resultat. Er fand heraus, daß diese Tumorgruppe frühzeitig eine Pleurakarzinose
durch Tumorembolien in den Ästen der Pulmonalarterie bildet (Meyer 1966).
§
Hingegen war bei der Pleuramanifestation gastrointestinaler Tumoren (n=18),
insbesondere der Magentumoren, anamnestisch eine multiple Metastasierung in
verschiedenen Organen des Patienten vorausgegangen, so daß hier eine pleurale
Metastasierung in einem relativ fortgeschrittenen Stadium diskutiert werden muß.
§
Die Mammatumoren waren im Probenkollektiv unterrepräsentiert, obgleich diese
Tumorgruppe nach Fracchia eine der häufigsten Ursachen des Pleuraergusses
darstellen (Fracchia 1974).
§
Unter
den
untersuchten
Biopsien
waren
Adenokarzinome
verschiedener
Primärtumoren am stärksten vertreten.
Nach Huzly sind Ausbreitungsweg und Stadium pleuraler Metastasierung vom Sitz des
Primärtumors abhängig:
Beim primär bronchialen und bronchopulmonalen Tumor verläuft der Weg vom
Bronchus zum Lungenparenchym und von dort aus zur Pleura visceralis. Diese
Tumoren metastasieren relativ früh über die Lymphbahnen. Bei einem extrapulmonalen
Karzinom wie z.B. beim Magenkarzinom, findet eine Metastasierung nach dem
Kavatyp statt; dabei können Lunge und Bronchus isoliert oder simultan oder sukzedan
befallen werden. Im Anschluß kann auch eine Pleurabeteiligung erfolgen. Diese
Manifestation ist in einem relativ fortgeschrittenen Stadium vorzufinden (Huzly 1991).
Unsere Beobachtungen bestätigen die Befunde von Huzly.
7.3
DIE BEHANDLUNGSMÖGLICHKEITEN PLEURALER TUMOREN
Kreuser und Huzly schätzen die Neuinzidenz pleuraler Metastasen in Deutschland auf
15000 bis 30000 pro Jahr (Kreuser 1984, Huzly 1991). Dabei ist nicht auszuschließen,
90
daß ein großer Teil kausal behandelbarer Fälle der Diagnostik entgeht. Isolierte große
Pleuratumoren stellen eine dringliche Indikation zur notwendigen Operation dar. Diese
können infolge schnellen Wachstums die Respiration des Patienten erheblich behindern
und zusätzlich kann der enorme Eiweißverlust durch die Ergußbildung (Exsudat)
erheblich sein und zu sekundären Erkrankungen (z.B. Hypalbuminämie mit Ödemen,
Hyperlipoproteinämie, Hypercholesterinämie) führen. Hier entfällt die sogenannte
Pleurodese. Die Pleurodese stellt im Idealfall eine Sklerosierung des Pleuraspaltes mittels
Verklebung durch eine aseptische Entzündung dar, die z.B. durch Talkum erreicht
werden kann.
Pleurapunktionen als Entlastung sind nur kurzfristig wirksam (Huzly 1991). Ebenso
zeigt eine allgemeine zytostatische Behandlung bei metastasierenden pleuralen
Prozessen nur in wenigen Fällen ausreichende Wirkung, so daß eine systemische
Therapie oft nur mit lokalen Maßnahmen zum Erfolg führt (Feiereis 1983).
Die Bestimmung der Ursache eines Pleuraergusses sollte so gut wie möglich erfolgen.
Hiervon hängt häufig das weitere Vorgehen des Klinikers ab. In den Frühstadien kann
die Abgrenzung zwischen Pleuramesotheliom, pulmonalen und extrapulmonalen
Karzinomen sehr schwierig sein (Battifora 1985). Auch im eigenen Probenkollektiv war
es gelegentlich erst nach immunhistochemischen Untersuchungen möglich, Hinweise
auf die Lokalisation des Primärtumors an den Kliniker weiterzuleiten. Fracchia meinte,
daß bei weiblichen Patienten mit unklarem Erguß in ungefähr 50% der Fälle ein
Mammakarzinom die Ursache darstellt (Fracchia 1974).
Die sicherste Methode der Therapie der Pleuraexsudation als Folge metastatischer
Prozesse ist laut (nicht-chirurgischer) Autoren die operative Pleurektomie. Jedoch wird
auch erwähnt, daß die Pleurektomie ein Eingriff mit größerem Risiko für den Patienten
darstellt als eine nicht-operative Methode. Von daher sollte versucht werden, initial die
Drainage und die Pleurodese der operativen Form vorzuziehen. Versagen diese, so
kann immer noch die operative Pleurektomie erfolgen.
91
7.3.1
Anti-VEGF-Therapie
Die „Angriffszelle“ von VEGF ist das Endothel der Kapillaren. Die Expression von
VEGF in normalen Geweben ist durchaus als physiologisch einzustufen und sogar
notwendig. VEGF wird aber in Tumorzellen offensichtlich eindeutig vermehrt
exprimiert, wie auch in eigenen Untersuchungen bestätigt werden konnte. Plate konnte
anhand seiner Versuchsreihen bezüglich des hochaffinen Tyrosinrezeptors von VEGF,
dem flt-1, zeigen, daß im Gegensatz zum normalen Hirnkapillarendothel dieser in
Tumorkapillarendothelien von Hirntumoren stark exprimiert wurde (Plate 1992). Mit
Eingriff in das VEGF-Rezeptorsystem könnte eine mögliche therapeutische Strategie
erfolgreich sein. Millauer transfizierte normale Gefäßendothelzellen von Tumoren in
vivo mit einem Retrovirus, das in seinem Genom die negative Mutation des VEGFRezeptors flt-1 enthielt. Es resultierte eine Suppression des Tumorwachstums in den
Versuchstieren (Millauer 1994).
Kim wies durch Gabe von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen VEGF
gerichtet waren, eine therapeutische Wirksamkeit nach, wodurch das Tumorwachstum
inhibiert wurde. Dabei stellte sich heraus, daß in Korrelation zum Ausmaß der VEGFSynthese in verschiedenen Tumoren eine stärkere Tumorinhibition mittels Antikörper
meßbar war (Kim 1993).
Gegenwärtig orientieren sich die therapeutischen Strategien an
§
den molekularen Mechanismen der VEGF-Synthese
§
der VEGF-Sekretion
§
der
rezeptorvermittelten
Signaltransduktion
von
VEGF
an
der
Kapillarendothelzellen von Tumoren
Dabei liegen folgende Möglichkeiten einer Tumorinhibition vor:
92
7.3.1.1 Konstruktion von VEGF-Rezeptor-Antagonisten
Diese orientieren sich an den verschiedenen VEGF-Aminosäuresequenzen, die die
Bindung von VEGF am Rezeptor kompetitiv hindern.
7.3.1.2 Bifunktionale VEGF-Toxine
VEGF-Toxine sind Giftstoffe, die in der Lage sind, die Synthese von VEGF zu
unterbinden. Sie können ebenso mittels Endozytose die Kapillarendothelzelle direkt
schädigen (Stetler-Stevenson 1997).
7.3.1.3 Die Infektion der VEGF-exprimierenden Endothelzellen
Man versucht die Endothelproliferation durch Generation rekombinanter Retroviren,
die ausschließlich diese infizieren, zu unterbinden (Millauer1994).
7.3.1.4 Angriff auf Rezeptorebene
Die
VEGF-Rezeptor-Dimerisierung,
die
Tyrosinkinase-Inhibitoren
und
andere
rezeptorinhibierende Konstruktionen erlauben einen Eingriff in die Signaltransduktion
von VEGF (Rosen 1997).
Insgesamt ergeben sich bei der Anti-VEGF-Therapie eine Vielzahl an Möglichkeiten, die
sich derzeit in Anfangsstadien der Forschung befinden.
93
7.3.2
Anti-SF- und Anti-c-Met-Therapie
Grundsätzlich gilt für die Anti-SF- und Anti-c-Met-Therapie (SF = hepatischer
Wachstumsfaktor; c-Met = Rezeptor des SF) dasselbe wie für die Anti-VEGF-Therapie.
Die Antikörpertherapie gegen SF oder anderseits die Blockade seines Rezeptors c-Met
stellen
Ansatzpunkte
dar.
Man
nimmt
an,
so
die
Tumorproliferation
und
Neovaskularisation, die durch den hepatischen Wachstumsfakor SF und seinem
Rezeptor c-Met positiv beeinflußt werden, regulieren zu können.
Eine andere Strategie ist die Inhibition der SF-Synthese. Polverini meinte, daß
möglicherweise auch entzündliche Krankheiten (Beispiel: Psoriasis) auf diese Weise
therapiert werden könnten, da das SF - c-Met-System - wie in tumorösen Prozessen
auch - eine erhöhte Expressionsdichte zeigt (Polverini 1995).
Die Inhibition der Angiogenese als neues therapeutisches Prinzip in der Behandlung
maligner Tumoren ist sicherlich zukunftsweisend und es ist zu erwarten, daß sie in die
klinische Anwendung gelangen wird (Marné 1997).
94
8
ZUSAMMENFASSUNG
Ziel dieser Untersuchung war die Charakterisierung der Koexpression angiogenetisch
wirksamer Proteine in pleuralen Metastasen primär andernorts lokalisierter bösartiger
Tumoren. Bei den angiogenetischen Faktoren handelt es sich um
§
HGF / SF =
hepatischer Wachstumsfaktor bzw. Scatter
Faktor;
(HGF und SF bezeichnen dasselbe Protein)
§
c-Met
=
Rezeptor des HGF / SF
§
VEGF / VPF
=
vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor;
auch VPF (Vascular Permeability Factor)
genannt
Geprüft wurden hierbei Hypothesen bezüglich charakteristischer Expressionsmuster
und Koexpressionen der einzelnen angiogenetischen Faktoren. Es wurde Biopsiegut
sekundärer Pleuratumoren von 71 Patienten aus dem Einsendegut des Institutes für
Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken „Bergmannsheil“ analysiert.
Mit den Methoden der Immunhistochemie und in-situ Hybridisierung konnten
folgende Resultate dokumentiert werden:
1. Eine deutliche intrazytoplasmatische Expression, teils Überexpression von VEGF, cMet und HGF/SF konnte beim Großteil der pleuralen Metastasen primär andernorts
lokalisierter
bösartiger
Tumoren
(Mamma,
Lunge,
Gastrointestinaltrakt,
Urogenitaltrakt und verschiedene andere Tumoren, wie Pankreas-, Kehlkopf- und
Schilddrüsenkarzinom) nachgewiesen werden.
2. Die Expression der Faktoren war nicht an die histogenetische Abstammung des
Tumors gebunden.
95
3. Die Synthese von HGF/SF und c-Met fand überwiegend in Tumorzellen statt. Dies
konnte durch die in-situ Hybridisierung bestätigt werden. Ebenso kam es in den
Endothelzellen der Gefäße, die sich in Tumorzellnähe befanden, zu verstärkter
Expression aller Faktoren.
4. Es lag eine statistisch signifikante Koexpression (p<0,05) von VEGF mit c-Met und
HGF/SF
durch
das
Tumorgewebe
sowie
durch
die
Endothelien
der
tumorgebundenen Gefäße vor. Daher kann hier eine autokrine Stimulation dieser
angiogenetisch wirksamen Systeme diskutiert werden. In HGF/SF-positiven Zellen
fand sich, vergleichsweise zu HGF/SF-negativen Befunden, immunhistochemisch
eine vermehrte c-Met Expression (p<0,05).
5. Auf der anderen Seite war beim Vergleich der prozentual reaktiven Zellen (PP)
lediglich eine Tendenz feststellen, jedoch keine signifikante Korrelation. Eine
mögliche Erklärung ist der unterschiedliche Expressionsmuster der Tumorzellen
verschiedener Abstammung. Unterschiedliche Tumortypen könnten im Rahmen der
Angiogenese verschiedene für sie typische angiogenetische Proteine (hier HGF/SF
und VEGF) synthetisieren, jedoch könnten ebenso unterschiedliche Tumoren durch
die Expression eines Rezeptors (hier c-Met) durch verschiedene Liganden stimuliert
werden. Daher liegt die Schlußfolgerung nahe, daß zwar die Färbeintensität (SI) der
Tumorzellen bezüglich c-Met und VEGF korreliert (p<0,05), die prozentual
reaktiven Tumorzellen (PP) jedoch nur eine Tendenz (p=0,085) aufzeigen.
Folgende Schlußfolgerungen sind aus diesen Ergebnissen abzuleiten:
1. Anamnestisch war bei allen Patienten, deren Biopsien hier untersucht wurden, zum
Zeitpunkt der Biopsieentnahme ein Pleuraerguß vorhanden. Die verstärkte VEGFExpression durch Tumorzellen beim Prozeß der pleuralen Metastasierung kann u.a.
als eine Erklärungsmöglichkeit für die Entwicklung des Pleuraergusses bei der
Tumoraussaat sein. VEGF, auch (VPF/Vascular Permeability Factor) genannt,
96
erhöht die Gefäßpermeabilität im und um das Tumorgewebe – z.T. durch eine
entzündliche Begleitreaktion – hierdurch kommt es zum Pleuraerguß.
2. Die obigen Befunde belegen die Bedeutung des vaskulären endothelialen
Wachstumsfaktors (VEGF), des hepatischen Wachstumsfaktors (HGF/SF) und des cMet in Tumoren im Zusammenspiel bezüglich ihrer Wirksamkeit bei der
Angiogenese.
Der
Tyrosinkinaserezeptor
c-Met
(Rezeptor
des
hepatischen
Wachstumsfaktors) bildet zusammen mit dem zugehörigen Liganden HGF/SF ein
parakrines Signalsystem. Dieses System ist offensichtlich in den Prozeß der
Angiogenese eingebunden, wobei gerade HGF/SF nach Synthese in mesenchymalen
Zellen (Makrophagen, Mastzellen, aber auch Endothelzellen) eine angiogenetische
Wirkung
z.B.
Insbesondere
auf
muß
Gefäßendothelzellen
der
bevorzugte
und
Gefäßwandmyozyten
autokrine
Mechanismus
ausübt.
zwischen
überexprimiertem c-Met und HGF/SF in malignen Tumoren bei Nachweis der
Proteine in denselben Tumorzellen auch beim Prozeß der pleuralen Metastasierung
angenommen
werden.
Eine
gleichzeitige
Synthesestimulation
dieser
unterschiedlichen drei Proteine ist zudem über das Plasminogen-Urokinase-System
möglich (siehe 3.4.3 und 4.1.1). Zumindest scheint ein synergistischer Effekt in der
Angiogenese im Prozeß der metastatischen Absiedelung maligner Tumorzellen in
der Pleura wahrscheinlich.
Die hier erhobenen Untersuchungsergebnisse können eine Grundlage möglicher
zukünftiger palliativer Therapiestrategien bei malignen Pleuraergüssen darstellen. Die
lokale Instillation anti-angiogenetisch wirksamer Substanzen z.B. im Rahmen der
diagnostischen Pleurapunktion ist als therapeutischer Ansatz bei therapierefraktären
schmerzhaften
malignen
Pleuraergüssen
denkbar.
Ob
möglicherweise
auch
blockierende Antikörper gegen HGF/SF-produzierenden Tumorzellen in Zukunft eine
therapeutische Bedeutung erlangen, steht zur Diskussion.
97
9
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