Philipps fgä/BSWi Universität Marburg

Philipps fgä/BSWi
Universität
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Marburg
Influenza-A-Virus Hämagglutinin aktivierende Proteasen
im Atemwegsepithel des Schweins
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem Fachbereich Biologie
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Catharina Peitsch, geb. Freuer
aus Hildesheim
Marburg an der Lahn
2014
http://d-nb.info/1052956610
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
1
Summary
2
1
Einleitung
3
1.1
Influenza-A-Viren
3
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.1.4
1.1.4.1
1.1.4.2
1.1.4.3
1.1.4.4
1.1.4.5
1.1.5
1.1.5.1
1.1.5.2
1.1.6
1.1.6.1
1.1.6.2
1.2
1.3
1.4
Taxonomie
Virusmorphologie und Genomaufbau
Infektions-und Replikationszyklus
Wirtsspektrum und Ökologie der Influenza-A-Viren
Influenza bei Vögeln
Influenza beim Menschen
Influenza-Pandemien und Übertragungen im 20. und 21. Jahrhundert....
Influenza beim Schwein
Transmission von Influenza-A-Viren zwischen Schweinen und anderen
Spezies
Pathogenese und Klinik der Influenza
Humane Influenza
Porzine Influenza
Prophylaxe und Therapie
Mensch
Schwein
3
4
7
9
9
10
11
13
14
16
16
16
17
17
18
Das Oberflächenglykoprotein Hämagglutinin
18
1.2.1
1.2.2
1.2.2.1
1.2.2.2
1.2.2.3
19
20
21
22
22
Struktur des Hämagglutinins
Spaltung des Hämagglutinins
Multibasische Spaltstelle
Monobasische Spaltstelle
Aktivierungsproteasen des HA mit monobasischer Spaltstelle
HA-Aktivierungsproteasen im humanen Respirationstrakt
23
1.3.1
1.3.2
23
25
Die Serinprotease HAT
Die Serinprotease TMPRSS2
HA-Aktivierungsproteasen in den respiratorischen Geweben des Schweins
26
1.4.1
1.4.2
26
27
Anatomie des porzinen Respirationstraktes
HA-aktivierende Proteasekandidaten in den Atemwegen des Schweins..
1.5
Zielsetzung
27
2
Material
29
2.1
Antikörper
29
2.1.1
2.1.2
29
29
Primärantikörper
Sekundärantikörper
2.2
Bakterienkultur und Medien
29
2.3
Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
30
2.4
Enzyme
31
2.5
Fluorogene Peptide
31
2.6
Größen- und Mengenstandards
32
Inhaltsverzeichnis
2.7
Influenza-A-Virusstämme
32
2.8
Inhibitoren
32
2.8.1
2.8.2
2.8.3
32
32
32
2.9
Trypsin-ähnliche Proteaseinhibitoren
Neuraminidase (NA)-Hemmer
Peptidmimetische Proteaseinhibitoren
Kommerziell erhältliche Reaktionsansätze (Kits)
2.10 Oligonukleotide (Primer)
2.10.1
2.10.2
2.10.3
Klonierungsprimer
Sequenzierungsprimer
Primer für real-time PCR
34
34
34
34
35
2.11 Puffer und Lösungen
35
2.12 Vektoren und rekombinante Plasmide
37
2.13 Zellkultur
37
2.13.1
2.13.2
2.13.3
Verbrauchsmaterial
Zelllinien
Zellkulturmedien
37
38
38
3
Methoden
39
3.1
Molekularbiologische Methoden
39
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.1.6
3.1.7
3.1.8
3.1.9
3.1.10
39
40
40
41
42
42
42
42
43
43
3.2
3.3
Reinigung und Analyse von RNA
44
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
44
45
46
46
48
Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen und Gewebe
Einstufige RT (Reverse Transkription)-PCR
cDNA-Synthese
Quantitative real-time PCR (qPCR)
Relative Quantifizierung der real-time PCR-Daten
Zellkultur
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
3.4
Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR
Elektrophoretische Auftrennung von DNA im Agarosegel
Reinigung von DNA-Fragmenten
Verdau doppelsträngiger DNA mit Restriktionsendonukleasen
Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten mit alkalischer Phosphatase.
Ligation von DNA-Fragmenten mit T4-Ligase
Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Ze\\en
Transformation und Ausplattieren kompetenter Zellen
Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli
DNA-Sequenzierung
48
Kultivierung eukaryotischer Zellen
48
Langzeitlagerung von eukaryotischen Zellen
49
Isolierung primärer porziner Atemwegsepithelzellen
49
Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen mit Lipofectamine™ 2000. 51
Bestimmung der Zellvitalität mittels MTT
52
Virologische Methoden
53
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.4.4
3.4.5
3.4.6
3.4.7
53
54
54
55
55
56
57
Virusanzucht im Hühnerei
Virusanzucht in MDCK-Zellen
Anzucht von Influenzaviren mit ungespaltenem HA
Hämagglutinationstest (HA-Test)
Bestimmung des Virustiters mittels Avicel-Plaquetest
Immunohistochemischer Nachweis virusinfizierter Zellen (True Blue)
Untersuchung der Influenzavirusausbreitung in Säugerzellen
Inhaltsverzeichnis
3.4.8
3.5
Quantitative Untersuchung der Virusvermehrung in primären
respiratorischen Schweineepithelzellen
57
3.4.9
Infektion von Säugerzellen mit Influenza-A-Viren mit ungespaltenem HA.
57
3.4.10
Infektion von Säugerzellen in Anwesenheit verschiedener
Proteaseinhibitoren und NA-Hemmer
58
3.4.11
Ankonzentrierung von Influenzaviren mittels Ultrazentrifugation
58
Proteinbiochemische und immunologische Methoden
59
3.5.1
Lyse von Zellen und Vorbereitung der Proben für die SDS-PAGE
59
3.5.2
Nachspaltung des Influenzavirus HA transient HA-exprimierender
Säugerzellen mit exogenem Trypsin
59
3.5.3
Auftrennung von Proteinen mittels SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese
59
3.5.4
Transfer von Proteinen auf PVDF-Membranen (Elektroblotting)
60
3.5.5
Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Membranen
(Western Blot)
60
3.5.6
Immunologischer Nachweis von Proteinen mittels indirekter
Immunfluoreszenz
61
3.5.7
Messung der Proteaseaktivität auf der Zelloberfläche durch Spaltung
fluorogener Substrate
62
3.5.8
Messung der proteolytischen Aktivität im Zellkulturüberstand primärer
porziner Atemwegsepithelzellen
63
4
Ergebnisse
64
4.1
Etablierung primärer Atemwegsepithelzellen als in vitro Modellsysteme für die
Untersuchung von Influenzavirusinfektionen im Schwein
64
4.1.1
4.2
4.3
Isolierung und Charakterisierung primärer porziner
Atemwegsepithelzellen
64
4.1.2
Untersuchungen zur proteolytischen Aktivierung von Influenza-A-Viren
durch endogene Proteasen in primären Atemwegsepithelzellen des
Schweins
66
4.1.3
Vergleichende Studien zur proteolytischen Aktivierung von Influenza-A­
Viren in primären respiratorischen Schweineepithelzellen bei Zugabe
von exogenem Trypsin
68
Untersuchungen zur Expression der Proteasen swTMPRSS2 und swAT in den
respiratorischen Geweben des Schweins
71
4.2.1
Identifizierung der Serinproteasen swTMPRSS2 und swAT im Schwein...
71
4.2.2
Nachweis der Expression von swTMPRSS2 und swAT auf mRNAEbene in den Atemwegen des Schweins
72
4.2.3
Quantitative PCR Analyse swTMPRSS2- bzw. swAT-spezifischer mRNA
in respiratorischen Schweineepithelzellen
73
Untersuchungen zur HA-Aktivierung durch die porzinen Proteasen swTMPRSS2
und swAT
75
4.3.1
Klonierung der porzinen Proteasen swTMPRSS2 und swAT in den
eukaryotischen Expressionsvektor pCAGGS und Expression in
Säugerzellen
75
4.3.2
Spaltung des Influenzavirus HA durch Koexpression von swTMPRSS2
und swAT in Säugerzellen
76
Proteolytische Aktivierung von Influenza-A-Viren durch swTMPRSS2
und swAT
77
4.3.3
Inhaltsverzeichnis
4.4
4.5
Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation der porzinen Proteasen
swTMPRSS2 und swAT
80
4.4.1
Lokalisation rekombinant exprimierter swTMPRSS2 und swAT
80
4.4.2
Spezifizierung der intrazellulären Lokalisation von swTMPRSS2 und
swAT
81
4.4.3
Nachweis der Expression und Lokalisation endogener swTMPRSS2 und
swAT in primären trachealen und bronchialen Schweineepithelzellen
83
Untersuchungen zur proteolytischen Aktivität und Virusaktivierung auf der
Zelloberfläche durch membrangebundene swTMPRSS2 und swAT
4.5.1
Untersuchungen zur enzymatischen Aktivität rekombinant exprimierter
swTMPRSS2 und swAT auf der Zelloberfläche
4.5.2
Untersuchungen zur Aktivierung von Influenza-A-Viren mit
ungespaltenem HA auf der Oberfläche transient swAT- und
swTMPRSS2-exprimierender Säugerzellen
Untersuchungen zur Aktivierung eintretender Influenza-A-Viren mit
ungespaltenem HA auf der Zelloberfläche primärer PTEZ und PBEZ
4.5.3
4.6
Untersuchungen zur Hemmung der Influenzavirusreplikation mittels Inhibition der
proteolytischen Aktivierung des HA durch swTMPRSS2 und swAT
85
85
86
88
90
4.6.1
Inhibition der multizyklischen Virusreplikation durch peptidmimetische
Proteaseinhibitoren in transient swTMPRSS2- oder swATexprimierenden Zellen
90
4.6.2
Hemmung der Replikation humaner Influenza-A-Viren in primären PBEZ
durch peptidmimetische Proteaseinhibitoren
93
4.7
Ergebniszusammenfassung
96
5
Diskussion
97
5.1
Proteolytische Aktivierung von Influenza-A-Viren in primären
Atemwegsepithelzellen des Schweins
97
5.2
Porzine HA-Aktivierungsproteasen swTMPRSS2 und swAT
99
5.3
Subzelluläre Lokalisation der porzinen Proteasen und der Aktivierung des
Influenzavirus Hämagglutinins durch swTMPRSS2 und swAT
104
Bedeutung von swTMPRSS2 und swAT bei einer Influenza-A-Virusinfektion im
Schwein
108
HA-Aktivierungsproteasen swTMPRSS2 und swAT als Angriffspunkte für eine
Influenza-Therapie
111
Das Schwein als Modellsystem für die Untersuchung von Influenza-AVirusinfektionen
114
5.4
5.5
5.6
Literaturverzeichnis
Anhang
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
116
125
132
134
Lebenslauf
137
Veröffentlichungen
138
Erklärung
Danksagung
140
141