Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung... 11 2. Zielsetzung
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Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung... ... ... ... 11 1.1 Asthma bronchiale 11 1.2 Immunpathogenese des allergischen Asthma bronchiale 12 1.2.1 Dendritische Zellen 13 1.2.2 B-Zellen und die Freisetzung von IgE 13 1.2.3 Mastzellen IS 1.2.4 Eosinophile Zellen 15 1.2.5 Neutrophile Zellen 16 1.2.6 Natürliche Killer T-Zellen 16 CD4+T-Zellen 1.2.7 17 1.2.7.1 Th2 Zellen 19 1.2.7.2 Th17 Zellen 20 1.2.7.3 Thi Zellen und die Rolle des T-box Transkriptionsfaktors T-bet 21 1.2.7.4 T regulatorische Zellen 23 1.2.8 CD8+ T-Zellen 24 1.3 Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Ausprägung des Asthma bronchiale 25 1.4 Interleukin-6 und der Interleukin-6 Rezeptor-Komplex 27 1.4.1 Interleukin-6 27 1.4.2 Der Interleukin-6 Rezeptor-Komplex 29 1.5 Therapiemöglichkeiten des Asthma bronchiale 2. Zielsetzung ... 32 .... ... ...35 3. Material und Methoden......................................................................................... 37 3.1. Material 37 3.1.1 Verwendete Mäuse 37 3.1.2 Chemikalien und Reagenzien 37 3.1.3 EUSA-Kits 39 3.1.4 Antikörper und Zytokine 40 3.1.5 Antikörper für Durchflusszytometrie 40 3.1.6 Beads zur magnetischen Zellseparation 41 3.1.7 Primer für qPCR 41 3.1.8 Veibrauchsmaterial 42 5 http://d-nb.info/1038660726 Inhaltsverzeichnis 3.1.9 Laborgeräte 43 3.1.10 Puffer und Lösungen 44 3.1.10.1 Puffer für die Genotypisierung der Mäuse 44 3.1.10.2 Puffer und Lösungen für die Zellisolation und Zellkultur 44 3.1.10.3 Pufferund Lösungen für ELISA 45 3.2 Methoden 46 3.2.1 Genotypisierung der Mäuse 46 3.2.2 Behandlungsprotokoll zur Induktion von allergischem Asthma 47 3.2.3 Messung der Atemwegshyperreaktivität 47 3.2.4 Gewinnung der Bronchoalveolären Lavage (BAL) 48 3.2.5 Entnahme der Organe 49 3.2.6 Gesamtzellisolation 49 3.2.7 Isolation der CD4+ T-Zellen/CD4+CD62L+ T-Zellen 50 3.2.8 Zellkultur 51 3.2.8.1 Kultur der Gesamtzellen der Lunge 3.2.8.2 Kultur der isolierten CD4+CD62L+ T 51 Zellen 3.2.9 Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) 52 53 3.2.9.1 Färbung mit Oberflächenmarkem 53 3.2.9.2 Färbung mit intrazellulären Maikem 54 3.2.10 Histologie 54 3.2.11 Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 55 - 3.2.12 RNA Extraktion 56 3.2.13 cDNA Synthese 57 3.2.14 Quantitative Real-Time PCR (qPCR) 57 3.2.15 Statistik 58 4. Ergebnisse .................... 59 4.1 Die Defizienz von T-bet führt zu einer gesteigerten Differenzierung naiver T-Zellen zu Thl7 Zellen 59 4.1.1 T-bet unterdrückt in vitro die Differenzierung naiver CD4* T-Zellen zu Thl7 Zellen ! 59 4.1.2 Gesteigerte IL-17A Produktion in T-bet defizienten Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas 60 4.1.3 Untersuchung von Th17-induzierenden Zytokinen in Wildtyp und T-bet knockout Mäusen im allergischen Asthmamodell 61 6 Inhaltsverzeichnis 4.1.4 Untersuchung von Th17-induzierenden Transkriptionsfaktoren in Wildtyp und T-bet knockout Mäusen im allergischen Asthmamodell 66 4.2 Analyse des Zytokins Interleukin-10 69 4.3 Untersuchung der T regulatorischen Zellen 71 4.4 Auswirkungen der Blockade des IL-6 Rezeptor Signalwegs in T-bet knockout Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas 73 4.4.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität 74 4.4.2 Histologische Untersuchung des Entzfindungsgrades in Paraffinschnitten der Lunge 75 4.4.3 Bestimmung des IgE Spiegels im Serum 4.4.4 Analyse der CD19+ B-Zellen 76 77 4.4.5 Analyse der eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in der bronchoalveolären Lavage 78 4.4.6 Analyse der CD4+ T-Zellen 80 4.4.7 Untersuchung der Th2 Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 in der Lunge 81 4.4.8 Analyse der T regulatorischen Zellen 83 4.4.9 Untersuchung des Zytokins IL-10 in Gesamtzeiten der Lunge 84 4.4.10 Untersuchung der Thl7 Zellen nach a-IL-6R Antikörperbehandlung 85 4.4.10.1 Analyse des Zytokins IL-17A in Gesamtzellen der Lunge 85 4.4.10.2 Untersuchung Th17-induzierender Zytokine 86 4.4.10.3 Untersuchung Th17-induzierender Transkriptionsfaktoren 91 4.5 Untersuchung geschlechtsspezifischer Unterschiede in Wildtyp und T-bet knockout Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas 94 4.5.1 Analyse des IgE Spiegels im Serum 94 4.5.2 Untersuchung der IL-17A Produktion in der Lunge 95 4.5.3 Analyse des Zytokins IL-6 in Gesamtzellen der Lunge 96 4.5.4 Untersuchung der Batf mRNA Expression im Lungengewebe 97 4.5.5 Untersuchung der 11-21 mRNA Expression in der Lunge 98 4.5.6 Analyse der ll-23rezeptor mRNA Expression in der Lunge 4.5.7 Analyse des Zytokins IL-10 in Gesamtzellen der Lunge S. Diskussion 99 100 103 5.1 Die T-bet Defizienz führt zu einer verstärkten Differenzierung naiver T-Zellen zu Thl7 Zellen 104 Inhaltsverzeichnis 5.1.1 T-bet defiziente Mäuse zeigen in vitro eine verstärkte Differenzierung naiver TZellen zu Thl 7 Zellen 105 5.1.2 T-bet ko Mäuse weisen im murinen Asthmamodell eine gesteigerte Differenzierung naiver T-Zellen zu Thl7 Zellen auf 10S 5.2 T-bet defiziente Mäuse weisen eine gesteigerte Produktion von IL-10 auf 110 5.3 T-bet defiziente Mäuse zeigen im murinen Modell allergischen Asthmas eine reduzierte Anzahl an Treg Zellen 111 5.4 Die Blockade des IL-6R Signalwegs in T-bet defizienten Mäusen fuhrt zu einer Verbesserung einiger charakteristischer Symptome des Asthma bronchiale 112 5.4.1 Die Behandlung der T-bet defizienten Mäuse mit dem a-IL-6R Antikörper hat keine Auswirkung auf die AHR 113 5.4.2 Die a-IL-6R Antikörperbehandlung der T-bet defizienten Mäuse führte zu einer Verringerung des EntzOndungsgrades in der Lunge, des IgE Spiegels im Serum und der eosinophilen Granulozyten 114 5.4.3 Die Blockade des IL-6R Signalwegs führte in T-bet defizienten Mäusen zu einer verringerten Anzahl CD4+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen 117 5.4.4 Die Behandlung der T-bet defizienten Mäuse mit dem a-IL-6R Antikörper führte zu einer Reduktion der Th2 Zytokine 118 5.4.5 Die Blockade des IL-6R Signalwegs in T-bet ko Mäusen hatte keinen Effekt auf die Anzahl der T regulatorischen Zellen 119 5.4.6 Verminderte Produktion von IL-10 in a-IL6R Antikörper behandelten T-bet defizienten Mäusen 120 5.4.7 Die Blockade des IL-6R Signalwegs in T-bet defizienten Mäusen führte zu einer verringerten Differenzierung naiver T-Zellen zu Thl7 Zellen 121 5.5 Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Differenzierung von Thl7 Zellen 124 5.5.1 Weibliche wt und T-bet ko Mäuse weisen im murinen Asthmamodell einen höheren IgE Serumgehalt auf 124 5.52 T-bet defiziente Weibchen zeigen im Modell allergischen Asthmas eine stärkere Differenzierung naiver T-Zellen zu Thl7 Zellen 125 6. Zusammenfassung.............. 129 7. Summary 133 8. Abbildungsverzeichnis..........................................................................................137 9. Tabellenverzeichnis.........................».................«..........................................™..™ 141 10. Formelverzeichnis........................................................................................... 143 11. Abkürzungsverzeichnis 145 12. Literaturverzeichnis149 8 Inhaltsverzeichnis 13. Publikationen....................................................................................................... 171 14. Danksagung.... ....... ... ...» ...... 173 9
