Aus der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe
Werbung
Aus der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe des Universität zu Lübeck Direktor: Univ. Prof. Dr. med. K. Diedrich Matrixmetalloproteinasen und Endometriose Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck - Aus der Medizinischen Fakultät - Vorgelegt von Antje Katrin Hofele aus Baden-Baden Lübeck 2007 1. Berichterstatter: Professor Dr. med. Eduard Malik 2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Bernhard Schaaf Tag der mündlichen Prüfung 27.02.08 zum Druck genehmigt: Lübeck, den 27.02.2008 gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach -Dekan der medizinischen Fakultät- 2 Inhaltsverzeichnis Abkürzungen 1. Einleitung 1.1 klinischer Hintergrund 1.2 Pathogenese der Endometriose 1.3 1.4 1.2.1 Entstehungstheorien 1.2.2 Bedeutung der Angiogenese Matrixmetalloproteinasen 1.3.1 Das Matrixmetalloproteinasen-System (MMPS) 1.3.2 Die Rolle des MMPS in der Pathogenese der Endometriose Die Chorioallantoismembran (CAM) des befruchteten Hühnereies als Kurzzeitgewebekultur 1.5 Fragestellung und Zielsetzung 2. Material und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Reagenzien und Chemikalien 2.1.2 Enzyme und Proteine 2.1.3 Geräte und sonstige Materialien 2.1.4 Puffer und Lösungen 2.1.5 Primer/Oligonukleotide 2.1.6 DNA-Längenstandards 2.1.7 Befruchtete Hühnereier 2.2 Patientinnen-Kollektiv 2.3 Gewebekultur auf der CAM 2.4 Extraktion der Gesamt-RNA 2.5 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäure-Lösungen 2.6 Reverse Transkription mit Bildung einer Komplemetär-DNA 2.7 Qualitative Polymerase Kettenreaktion (PCR) 2.8 Quantitative PCR 2.8.1 Herstellung der Kompetitoren 2.9 Gelelektrophorese 2.10 Konzentrationsbestimmung der mRNA 2.11 Berechnung und Statistik 3 3. Ergebnisse 3.1 Etablierung eines quantitativen Nachweises für MMP-1 und -2 3.1.1 Optimierung der PCR für MMP-1 und -2 3.1.2 Herstellung der internen Standards als Kompetitoren 3.2 MMP-1-mRNA-Expression 3.3 MMP-2-mRNA-Expression 4. Diskussion 5. Zusammenfassung 6 Literaturverzeichnis Anhang Danksagung Lebenslauf Vortrag 4 Abkürzungen und Einheiten % (v/v) Volumenanteil % (w/w) Gewichtsanteil Abb. Abbildung A Adenin amol -18 Ang ASRM bp CAM cDNA Attomol (10 Mol) Angiopoietin American Society of Reproductive Medicine Basenpaare Chorioallantoismembran komplementäre DNA °C Celsius C Cytosin DEPC Diethylpyrocarbonat DNA Desoxyribonucleinsäure dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat ds DNA EBAF doppelsträngige DNA endometrial bleeding-associated factor EGF epidermal growth factor EZM Extrazellulärmatrix fg fmol G GAPDH GnRH h HIF Femtogramm (10-15 Gramm) Femtomol (10-15 Mol) Guanin Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase Gonadotropin releasing hormon Stunden hypoxia inducible factor IL Interleukin µl Mikroliter (10-6 Liter) MCP min ml M-MLV monocyte chemoattractant protein Minuten Milliliter (10-6 Liter) moloney murine leukemiavirus 5 mm Millimeter mm3 Kubikmillimeter MMP Matrixmetalloproteinase MMPS Matrixmetalloproteinasensystem mRNA Boten-RNA ng nmol NK-Zellen PCR PDGF Nanogramm (10-9 Gramm) Nanomol (10-9 Mol) natürliche Killerzellen Polymerase-Kettenreaktion plateled derived growth factor PlGF placental growth factor pmol Pikomol (10-12 Mol) RNA Ribonukleinsäure RT reverse Transkription RTase reverse Transkriptase SD Standardabweichung sek Sekunden T Thymin Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer Taq DNA Polymerase TGF TIE-2-Receptor TIMP Thermus aquaticus DNA Polymerase transforming growth factor Tunica interna Endothelialzellenrezeptor Tissue-inhibitor der Matrixmetalloproteinasen TNF Tumornekrosefaktor Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan U uPA V VEGF Einheit für Enzymaktivität Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator Volt vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor 6 1 Einleitung 1.1 Klinischer Hintergrund Das Krankheitsbild der Endometriose wurde 1690 von Daniel Shroen erstmalig in der „Disputatio inauguralis Medica de Ulceribus Uteri“ beschrieben. Als Endometriose bezeichnet man das Auftreten von dem intrauterinen Endometrium ähnlichem Gewebe außerhalb der Gebärmutterhöhle. Dieses Gewebe entspricht dem eutopen Endometrium sowohl in der Morphologie als auch in der Funktion. Histomorphologisch lassen sich das typische endometriale Stroma und darin eingebettete Drüsen darstellen. Funktionell kommt es in den Gewebsherden zu zyklischen Veränderungen wie beim eutopen Endometrium. Die Endometriose ist eine der häufigsten benignen Erkrankungen der Frau im reproduktionsfähigen Alter. In der Literatur wird die Prävalenz der Erkrankung mit 5-28% der Frauen in der Reproduktionsphase angegeben (Portuondo et al. 1982, Ramney 1980, Ramzy 1989, Runnebaum et Rabe 1995, Simpson et al. 1980, Strathy et al. 1982). Die Prävalenz steigt bei Frauen mit ungewollter Sterilität je nach Autor auf 20-71% (Cornillie et al. 1990, Klein et Olive 1993, Martin et al 1989). Das klinische Erscheinungsbild der Endometriose variiert von völliger Beschwerdefreiheit bis zu starker Dysmenorrhoe, Dyspareunie, Miktions- und Defäkationsschmerzen. Beim Vorliegen einer ausgedehnten Erkrankung können auch zyklusunabhängige, chronische Unterbauchschmerzen auftreten. Die Prädilektionsorte sind die Sakrouterinligamente, die Fossa ovarica und die Ovarien. Die Ausprägung der Erkrankung kann von einzelnen peritonealen Herden bis zu einer völligen Verschwartung des kleinen Beckens, des sogenannten „frozen pelvis“ reichen. Der Schweregrad der Endometriose wird durch eine Pelviskopie unter Weißlichtbedingungen diagnostiziert. Dabei werden die Lokalisation und das Erscheinungsbild aller Endometrioseherde beurteilt und gemäß der ASRM-Klassifikation (American Society of Reproductive Medicine 1997) das Krankheitsstadium festgelegt. In Abhängigkeit von einer willkürlich festgesetzten Punktzahl werden die Patientinnen den Stadien I-IV zugeordnet. Zusätzlich soll das morphologische Erscheinungsbild der Endometrioseherde mitberücksichtigt und der prozentuale Anteil von weißen, roten und schwarz-braunen Läsionen dokumentiert werden. Das unterschiedliche Erscheinungsbild der Endometrioseläsionen gibt einen Hinweis auf die „Aktivität“ der Erkrankung. Der Begriff Aktivität soll nach Malik et al. „alle uns bekannten biologischen und histomorphologischen 7 Unterschiede innerhalb der Endometriosel€sionen in eine Rangordnung bringen, damit auf diese Weise eine Bedeutung f•r die Klinik und Pathogenese der Erkrankung abgeleitet Peritoneum werden kann‚ (Malik et al. 2002). Stadium I (gering): Stadium II (m€ƒig): Stadium III (schwer): Stadium IV (ausgedehnt): Endometriose 1-5 Punkte 6-15 Punkte 16-40 Punkte 40 Punkte < 1 cm 1-3 cm > 3 cm oberfl€chlich 1 2 4 tief oberfl€chlich 2 1 4 2 6 4 tief oberfl€chlich 4 1 16 2 20 4 4 partiell 4 16 komplett 16 20 < 1/3 Einschluƒ 1 1/3-2/3 Einschluƒ 2 >2/3 Einschluƒ 4 Ovar rechts links tief Douglas-Obliteration Ovar Verwachsung dicht rechts zart dicht 4 1 8 2 16 4 zart dicht 4 1 8 2 16 4 zart dicht 4 „ 16 1 zart 4„8 links Tube rechts links „8 2 „ 4 „ 16„ „ Falls das Fimbrienende der Tube komplett umschlossen ist: 16 Punkte Tab. 1: ASRM-Klassifikation der Endometriose (ASRM 1997) 8 1.2 Pathogenese der Endometriose 1.2.1 Entstehungstheorien Historisch werden zwei Entstehungsmechanismen angenommen. Von Meyer wurde 1919 die metaplastische Umwandlung des Zoelomepithels als Ursache der Endometriose angesehen. Diese Theorie berücksichtigt das metaplastische Potential des Zoelomepithels und postuliert eine durch noch unbekannte Faktoren hervorgerufene Metaplasie mit Bildung von endometriumähnlichen Drüsen und Stroma (Meyer 1919). Sampson stellte dagegen 1927 seine Transplantationstheorie auf, nachdem er beobachtete, daß Endometriumzellen während der Menstruation retrograd durch die Tuben ins kleine Becken gelangen. Gemäß seiner Theorie implantieren sich diese vitalen Endometriumfragmente auf dem Peritoneum (Sampson 1927). Die Meyer´sche Theorie wird durch Endometrioseerkrankungen von Patienten gestützt, bei denen keine retrograde Menstruation stattfinden kann. So beschrieb Rosenfeld Endometriome des Ovars bei einer Patientin mit einem Rokitansky-Küster-Hauser-Syndrom. Bei der Patientin war ein nur rudimentär angelegter, strangförmiger Uterus ohne Endometrium vorhanden (Rosenfeld 1981). Melicow fand Endometrioseherde im Utriculus prostaticus bei Männern, die zur Therapie eines Prostatakarzinoms hochdosiert mit Östrogenen behandelt wurden (Melicow 1967). Nisolle vereinigte beide Theorien und beschrieb 1997 die Endometriose des Ovars und die peritoneale Endometriose als zwei unterschiedliche Entitäten mit unterschiedlichen Entstehungsmechanismen. Danach bilden sich die Endometriome des Ovars gemäß der Meyer`schen Theorie durch Invagination des ovariellen Kortex mit anschließender Epithelmetaplasie, während die peritoneale Endometriose gemäß der Sampson`schen Transplantationstheorie entsteht (Nisolle et al. 1997). Nisolle forderte drei Voraussetzungen für die Transplantationstheorie: Erstens müssen überhaupt Endometriumzellen über die Tuben in die Bauchhöhle gelangen. Zweitens müssen vitale Endometriumzellen mit der Fähigkeit, sich auf Strukturen im kleinen Becken zu transplantieren, in diesem retrograd menstruierten Endometrium vorhanden sein. Drittens muß die anatomische Verteilung der Endometrioseherde mit den Prinzipien der Transplantation von Zellen durch Exfoliation übereinstimmen. Zur ersten dieser Forderungen liegen folgende Arbeiten vor: Halme et al. zeigten 1984, daß zum Zeitpunkt der Menstruation bei 90% aller Frauen vitale Endometriumfragmente in der 9 Bauchhöhle nachweisbar waren (Halme et al. 1984). Auch Liu kam in seiner Untersuchung 1986 zu dem Schluß, daß das Vorkommen von vitalen Endometriumfragmenten in der Bauchhöhle physiologisch zu sein scheint (Liu et Hitchcock 1986). Vitale Endometriumzellen wurden sowohl im Menstruationsblut (Keettel et al. 1951), als auch im Peritonealsekret bei Frauen in der I. Zyklushälfte nachgewiesen (Kruitwagen et al. 1991). Te Linde verlagerte die Cervix von Affen operativ nach intraabdominal und induzierte Endometriose durch die sich nun in die Bauchhöhle entleerende Menstruationsblutung (Te Linde et al. 1950). Zusätzlich findet sich eine erhöhte Inzidenz von Endometriose bei Frauen mit angeborenen Abflussbehinderungen des uterinen Ausflusstraktes z. B. durch Uterusfehlbildungen oder Zervixstenosen (Sanfilippo et al. 1986, Olive et al. 1987) sowie bei Frauen mit verkürzten Zyklen und mit Menorrhagien (Cramer et al. 1986). In all diesen Fällen ist mit einer verstärkten retrograden Menstruation zu rechnen. Die zweite Voraussetzung von Nisolle, welche nicht nur vitale, sondern transplantationsfähige Endometriumzellen fordert, wurde ebenfalls in einer Reihe von Untersuchungen bearbeitet. Transplantationsfähige Zellen müssen die Fähigkeit zur Adhäsion und Implantation besitzen. Es konnten eine Reihe von Adhäsionsproteinen im eutopen Endometriumgewebe nachgewiesen werden, welche zur Anheftung von epithelialen Zellen an Basalmembranen und von Stromazellen an die Extrazellulärmatrix notwendig sind (Foidart et al. 1993, Lessey et al. 1992, Tabibzadeh et al. 1992). Diese Proteine sind für die physiologische Interaktion von endometrialen Stroma- und Drüsenzellen notwendig, ermöglichen aber auch eine Anheftung von Endometriumfragmenten an das Peritoneum. In einer 1995 von Gaetje veröffentlichen Arbeit wurde das Invasionspotential von Endometriumzellen in vitro untersucht. Dabei zeigten die Endometriumzellen ein gleich hohes Invasionspotential wie metastatische Zelllinien des Blasenkarzinoms (Gaetje et al. 1995). Die letzte Forderung von Nisolle nach einer anatomischen Verteilung der Endometrioseherde gemäß der Prinzipien der Transplantation von Zellen durch Exfoliation wurde in einer Untersuchung von Jenkins bearbeitet, welcher die Prädilektionsstellen der Endometriose herausarbeitete. Es fand sich eine anatomische Verteilung der Endometrioseherde im kleinen Becken, die mit einer über die Tuben erfolgende Exfoliation von Endometriumzellen vereinbar war. Passend dazu variierte das Verteilungsmuster der Endometrioseherde in Abhängigkeit von der Flektion des Uterus. So fanden sich bei einer Retroflexio uteri vermehrt Läsionen im dorsalen Abschnitt des kleinen Beckens (Jenkins et al. 1986). Der Zusammenhang der peritonealen Endometriose mit einer retrograden Menstruation wie Sampson es postuliert, wird durch die oben genannten Arbeiten plausibel. Die retrograde 10 Menstruation tritt nach Halme bei 90% aller Frauen auf (Halme et al. 1984). Trotzdem leiden nur 10 bis 20% aller Frauen im reproduktiven Lebensabschnitt unter Endometriose (Mahmood et al. 1991). Die genauen Mechanismen für das Anwachsen von ektopem Endometrium und damit der Bildung eines Endometrioseherdes sind noch nicht hinreichend geklärt. 1.2.2 Bedeutung der Angiogenese Die Bildung von primitiven vaskulären Netzwerken mit Formierung von Lumina wird als Angiogenese bezeichnet (Risau 1997). Im Erwachsenenalter findet Angiogenese als physiologischer Prozeß bei den Wachstums- und Differenzierungsprozessen im weiblichen Reproduktionstrakt im Rahmen der Ovulation, Menstruation und Plazentation statt (Augustin et al. 1999). Gewebe mit physiologisch hoher angiogenetischen Aktivität sind das Corpus luteum und das Endometrium. Im adulten Organismus proliferieren Endothelzellen nur sehr langsam mit einem ZellTurnover von 1000-10000 Tagen (Greb et al. 2002). Es wird angenommen, daß der physiologische Ruhezustand der Endothelzellen durch einen Überschuß von antiangiogenetischen Faktoren stabilisiert wird. Kommt es zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zugunsten der angiogenesestimulierenden Faktoren kann die Proliferationsrate der Endothelzellen bis zu 2000-fach erhöht werden (Gimbrone et al. 1972). Es sind verschiedene Auslöser für eine Verschiebung dieses Gleichgewichtes bekannt. Zu diesen gehören mechanischer Streß, z. B. durch Druck proliferierender Zellen, genetische Mutationen, z. B. durch Aktivierung von Onkogenen oder Deletion von Tumorsupressorgenen, die eine Kontrolle über die Produktion angiogeneseregulierender Faktoren haben (Kerbel 2000, Carmeliet 1999). Ein weiterer wichtiger Stimulus der Angiogenese sind hypoxischen Zustände (Carmeliet et al. 2000). Gewebehypoxie führt zur Aktivierung von „hypoxia inducible factors“ (HIFs). Diese rufen eine Überexpression von proangiogenetischen Faktoren wie unter anderem vascular endothelial groth factor (VEGF), Stickoxidsynthase, platelet-derived-growth factor (PDGF) und Angiopoietin 2 (Ang-2) hervor (Semenza 1998). Entzündliche Prozesse sind ebenfalls typischerweise durch eine überschießende Angiogenese gekennzeichnet. Monozyten, Makrophagen, Thrombozyten, Mastzellen und Leukozyten geben eine Vielzahl proangiogenetischer Faktoren ab, wie z. B. 11 VEGF, PDGF, Ang-1, Tumornekrosefaktor-€ (TNF-€) und monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) (Rabinovitch 1999). Daß um einen Endometrioseherd ein Gefäßnetz gebildet wird, konnten Nisolle et al. durch folgende histologische Untersuchung zeigen: Nisolle hielt die makroskopisch rot erscheinenden, peritonealen Endometrioseherde für frische Implantate von retrograd menstruierten Endometriumzellen. Diese roten Läsionen waren morphologisch und morphometrisch (zyklusabhängige Expression von Ki-67 und Vimentin) mit dem eutopen Endometrium nahezu identisch (Nisolle et al. 1997). Nisolle biopsierte makroskopisch rot erscheinende peritoneale Endometrioseherde und verglich diese mit normalem Peritoneum. Es fand sich ein ausgedehntes Gefäßnetz zwischen dem Stroma der implantierten Endometrioseherde und dem Peritoneum. Eine weitere Arbeit von Nisolle et al. konnte zeigen, daß farblich unterschiedliche Endometrioseherde auch erhebliche Unterschiede bezüglich der Vaskularisation und der Mitoserate aufwiesen (Nisolle et al. 1993). Die stärkste Vaskularisation und mitotische Aktivität fand sich in roten Läsionen. Braun-schwarze und weiße Läsionen zeigten eine deutlich geringere Vaskularisation. Bezüglich der Mitoserate wiesen die weißen Läsionen die niedrigste Rate von allen drei Läsionsformen auf. Nisolle et al. korrelierten die höhere Vaskularisation und Mitoserate der roten Herde mit einer höheren Aktivität der Erkrankung in diesen Implantaten. Aus dieser Beobachtung lässt sich eine entscheidende Rolle der Vaskularisation und damit der Angiogenese für die Entwicklung der implantierten Herde ableiten. In verschiedenen Arbeiten zur Erforschung der Rolle der Angiogenese in der Pathogenese der Endometriose konnten eine ganze Reihe angiogenesestimulierender Faktoren in erhöhter Konzentration im Peritonealsekret von Endometriosepatientinnen nachgewiesen werden. Es fanden sich VEGF, Interleukine (IL-1, IL-5, IL-6, IL-8), Tumornekrosefaktor (TNF)-€, Leptin und Interferon • (McLaren et al. 1996b, Shifren et al 1996, Küpker et al. 1998, Mahutte et al. 2003, Smith 1997). Oosterlynck untersuchte die durch das Peritonealsekret von Patientinnen mit und ohne Endometriose ausgelöste Angiogenese auf der Chorioallantoismembran. Er konnte mit dem Peritonealsekret der Endometriosepatientinnen eine deutlich stärkere Angiogenese induzieren. Dies lässt ein erhöhtes angiogenetisches Potential im Douglassekret von Endometriosepatientinnen vermuten (Oosterlynck et al. 1993). Auch im eutopen Endometrium von Endometriosepatientinnen fand sich im Vergleich zum Endometrium gesunder Frauen ein erhöhter VEGF-Gehalt (Donnez et al. 1998). VEGF stimuliert die Endothelzellen zur Proliferation und bewirkt eine Permeabilitätsteigerung der Gefäßwand. Die dadurch in den Extrazellulärraum austretenden Proteine schaffen ein 12 günstiges Millieu für aussprossende Endothelzellen (Mott et Werb 2004). Mit den Angiopoietinen (Ang) wurden 1996 weitere Kofaktoren der Angiogenese beschrieben (Davis et al. 1996). Ang-2 findet sich ausschließlich im Ovar, der Plazenta und im Uterus, den Orten der physiologischen Neoangiogenese (Maisonpierre et al. 1997). Ang-2 führt bei gleichzeitigem Vorkommen von VEGF zu einer Steigerung der Neoangiogenese (Kressin et al 2002). Ang-2 konnte immunhistochemisch in Endometrioseherden nachgewiesen werden. Es fand sich sowohl in Stroma- als auch in Epithelzellen. Auffallend war eine verstärkte perivaskuläre Lokalisation des Proteins (Kressin et al. 1999). Die oben genannten Arbeiten lassen vermuten, daß im Endometrium der Endometriosepatientinnen eine pathologische Überexpression von angiogenesestimulierenden Faktoren vorliegt. Als Aktivitätsmarker von Endometrioseherden konnten angiogeneserelevante Faktoren wie VEGF (Donnez et al. 1998) und das Ang-2 (Kressin et al. 2001b) herausgearbeitet werden. Obwohl die Endometriose nicht zu den malignen Erkrankungen zählt, ist sie durch invasives Wachstum und eine Stimulation der Angiogenese gekennzeichnet. Es finden sich Parallelen in ihrer Pathogenese zu der Entwicklung von malignen Tumoren (Becker et al. 2004). Die entscheidende Rolle der Angiogenese beim Tumorwachstum ist allgemein anerkannt (Carmelit et Jain 2000). Die Forschungsergebnisse der letzten 10 Jahre weisen auf die Notwendigkeit einer ausreichenden Angiogenese hin, um retrograd menstruiertem Endometrium die Bildung von Endometrioseherden zu ermöglichen (Kressin et al. 2001a, Smith 2001). Die Angiogenese nimmt somit eine zentrale Stellung bei der Pathogenese der Endometriose ein (Gescher et al. 2003). Abb. 1: Aktivitätsmarker der Endometriose. Schematische Darstellung der die Angiogenese modulierenden Faktoren bei der Entstehung von Endometriose (Malik et al. 2002) 13 1.3 Matrixmetalloproteinasen 1.3.1 Das Matrixmetalloproteinasen-System Eine wichtige Voraussetzung für die Angiogenese ist die Veränderung der Extrazellulärmatrix (EZM) durch Proteolyse. Erst nach lokaler Auflösung der EZM kann die ausgesprosste Endothelzelle in den Extrazellulärraum vordringen und neue Stromgebiete bilden. Zusätzlich werden durch die Auflösung der EZM in der EZM gebundene proangiogenetische Wachstumsfaktoren freigesetzt, welche wiederum die Angiogenese stimulieren (Rundhaug 2005). Die Schlüsselenzyme für den Erhalt oder die Auflösung der EZM sind die Matrixmetalloproteinasen (MMP) und ihre endogenen Inhibitoren, die sogenannten „tissue inhibitors of matrix metalloproteinases“ (TIMP). Zusammen werden sie als das Matrixmetalloproteinasensystem (MMPS) bezeichnet und kontrollieren die Lokalisation und das Ausmaß des „Bindegewebsremodeling“ im Organismus (Curry et al. 2001). Das MMPS spielt bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen wie z. B. der Wundheilung eine wichtige Rolle. Gerät das MMPS aus dem Gleichgewicht kommt es zu ausgedehnten pathologischen Veränderung der EZM wie z. B. im Falle der Arthritis (Curry et al. 2001). Auch beim invasiven Wachstum von Tumoren ist das MMPS von Bedeutung, da die Homöostase des Extrazellulärraums ein wichtiger Faktor für die Invasion sowohl von Tumorzellen als auch von Endothelzellen zur Bildung von Blutgefäßen ist (Shapiro 1998). Die MMP´s gehören zu den extrazellulären Zinkproteasen. Sie verstoffwechseln eine Fülle von Bestandteilen der Zellmatrix und der Basalmembran, wie Laminin, Fibronektin, Kollagen und Proteoglykane. Es sind über 20 MMP´s entdeckt worden, welche je nach Substrat und Molekülstruktur in Untergruppen eingeteilt werden. Man unterscheidet vier Gruppen: Kollagenasen, Stromalysine, Gelatinasen und Membran-typ-MMP´s (Curry et al. 2001). Die MMP´s dieser vier Gruppen gleichen sich in Hinsicht auf ihre molekulare Struktur und in ihrer Funktion. Gemeinsam werden die MMP´s als Präproenzyme synthetisiert, welche als inaktive Pro-MMP´s in den Extrazellulärraum sezerniert werden. Erst im Extrazellulärraum werden sie von Proteinasen durch Abspaltung des Propeptidanteils aktiviert. Diese Proteinasen stammen aus dem Plasminogen-Aktivator/Plasmin-System oder sind selbst aktivierte MMP´s. Die aktivierten MMP´s spalten spezifische Bestandteile der EZM. Alle MMP´s zusammengenommen können sämtliche Bestandteile der EZM abbauen. Außer den EZM-Bestandteilen sind auch Wachstumsfaktoren und Zytokine, wie „insulin-like growth factor“-bindende Proteine und TNF-€ Substrate der MMP`s. Dadurch können MMP´s 14 auch das Zellwachstum modulieren, einerseits direkt durch eine Kontrolle der Zell/MatrixInteraktion und andererseits indirekt durch eine Regulation der Bioverfügbarkeit von Wachstumsfaktoren (Curry et al. 2001). Einteilung der Matrixmetalloproteinasen (nach Curry et al. 2001) Kollagenasen MMP-1, MMP-8, MMP-13 Gelatinasen MMP-2, MMP-9 Stromalysine MMP-3, MMP-7, MMP-10, MMP-11 Membran-Typ-MMP`s MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24, MMP-25 Tab. 2 Eine spezifische Inhibition der aktivierten MMP´s erfolgt durch die „tissue inhibitors of metalloproteinases“ (TIMP´s). Bisher konnten 4 verschiedene TIMP´s isoliert werden. Diese Inhibitoren wirken mit unterschiedlicher Spezifität auf die verschiedenen MMP´s und besitzen zusätzlich eine antiangionetische Wirkung (Gomez et al. 1997, Brew et al. 2000, Murphy et al. 1993). Eine unspezifische Hemmung der MMP´s erfolgt durch die Serumfaktoren €2-Makroglobulin und €1-Inhibitor-3, die auch ein breites Spektrum anderer Proteasen inaktivieren (Salamonsen et al. 1996). Im weiblichen Genitaltrakt konnte dem MMP-System eine wichtige Rolle bei der Follikelbildung, Ovulation sowie der Entwicklung und Regression des Corpus luteum zugeordnet werden (Bagavandoss 1998, Hägglund et al. 1999, Duncan et al. 1998, Curry et al. 2000). Auch bei der Invasion des Endometriums durch den Trophoblasten in der Frühschwangerschaft sind MMP´s von Bedeutung. So konnten Shimonovitz et al. aus kultivierten Trophoblastenzellen im ersten Triminon MMP-2 und MMP-9 isolieren (Shimonovitz et al. 1994). Der Menstruationszyklus erfordert einen ständigen steroidhormonabhängigen Auf- und Abbau des Endometriums. Dabei lassen sich auch zyklische Veränderungen der Expression von MMP´s und TIMP´s in den Zellen des Endometriums nachweisen. Die endometriale Expression von MMP´s wird durch Steroidhormone, verschiedene Wachstumsfaktoren und Zytokine reguliert (Tabizadeh et al. 1992, Guidice et al. 1994). Durch das Zusammenspiel dieser Faktoren wird die selektive Expression einzelner MMP´s verstärkt und die Expression oder Aktivität anderer MMP´s unterdrückt (Osteen et al. 1999). Verschiedene in-vitro Studien 15 konnten das Progesteron als potenten Inhibitor der endometrialen MMP-mRNA-Expression und der Proteinsekretion identifizieren (Lockwood et al. 1998, Marbaix et al. 1992). In weiteren Untersuchungen konnte die zyklusphasenabhängige Expression von spezifischen MMP´s und deren endometriale Lokalisation während des humanen Menstruationszyklus in folgender Weise herausgearbeitet werden: Das Endometrium besteht aus epithelialen Oberflächen- und Drüsenzellen, welche von gut vaskularisierten Stromazellen umgeben sind. MMP-7 ist eine epithelspezifische MMP. Sie verstoffwechselt Kollagen 4 und 10 sowie Fibronektin, Gelantin, Laminin und die MMP´s 1, 2 und 9. MMP-7 findet sich während der Proliferationsphase fokal in den glandulären Epithelzellen und ist an der Re-Epithelialisierung der lumenwärts gerichteten Endometriumoberfläche beteiligt (Rudolph-Owens et al. 1998). In den endometrialen Stromazellen konnten MMP-1, -2, -3, -9, -10 und -11 nachgewiesen werden. MMP-1 spaltet Kollagen 1, 2, 3, 7, 8 und 10, Gelatin, €-Makroglobulin, MMP-2 und MMP-9 (Curry et al. 2001). Physiologisch ist eine ausschließlich auf die perimenstruelle Zyklusphase beschränkte MMP-1-Expression (Salamonsen et al. 1996). Das aktive Enzym findet sich nur in der Mucosa functionalis uteri und sein Auftreten korreliert mit dem Nachweis von Abbauprodukten der EZM (Singer et al. 1999). Die MMP-1-Expression wird durch Progesteron gehemmt. Abfallende Progesteronspiegel induzieren erhöhte MMP-1mRNA- und Proteinspiegel und verstärken die Kollagenaseaktivität des Enzyms (Irwin et al 1996). Auch Zytokine wie IL-1€ und TNF-€ induzieren in vitro eine verstärkte Expression von MMP-1 in Endometriumzellen (Singer et al. 1999). MMP-2 verstoffwechselt in vitro die Substrate Gelatin, Laminin, Elastin, Fibronektin, Kollagen 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 und 11 sowie MMP-9 und MMP-13 (Curry et al. 2001). MMP-2 wird in den Endometriumzellen im Gegensatz zu MMP-1 während des gesamten Zyklus exprimiert. (Rodgers et al 1994). Freitas et al. konnten MMP-2 immunhistochemisch in endometrialen Endothelzellen von Kapillaren und Arterien in der Proliferations- und Sekretionsphase nachweisen. Zum Zyklusende war das immunhistologische Signal in Kapillaren und den sie ummantelnden glatten Muskelzellen am ausgeprägtesten (Freitas et al. 1999). Die Expression von MMP-2 wird ebenfalls durch ovarielle Steroidhormone und inflammatorische Zytokine beeinflusst. Allerdings handelt es sich um eine indirekte Wirkung des Progesterons auf MMP-2. Das Proenzym MMP-2 wird hauptsächlich durch die Membrantyp-1-MMP aktiviert. Die Expression von Membrantyp-1-MMP wird durch Progesteron vermindert und dadurch die Aktivierung von MMP-2 verlangsamt (Lockwood et al 1998, Zhang et al. 2000). 16 MMP-3 spaltet in vitro Kollagen 2, 3, 4, 9, 10 und 11, Fibronektin, Gelatin, Laminin, Elastin und die MMP´s 7, 8 und 13. Außerdem kann MMP-3 inaktives Pro-MMP-1 und Pro-MMP-9 aktivieren (Okada 1992). Im Endometrium findet sich MMP-3 hauptsächlich während der Menstruation in den Endothelien von Stromagefäßen. In Arealen von in Abstoßung befindlichem Endometrium konnte ein starkes immunhistochemisches Signal in perivaskulären glatten Muskelzellen nachgewiesen werden (Freitas et al. 1999). MMP-9 spaltet Kollagen 4, 5, 7, 10, und 14, Elastin, Fibronektin und Gelatin. MMP-9 findet sich charakteristischerweise während der Menstruation in Makrophagen, die sich in nekrotischen Arealen des Endometriums ansammeln (Freitas et al. 1999). MMP-Nr. Kollagensubstrat Zusätzliche Substrate MMP-1 I, II, III, VII, VIII, X MMP-2 I, II, III, IV, V, VII, X, XI Fibronektin, Gelatin, Laminin, Elastin, MMP´s 9, 13 MMP-3 II, III, IV, IX, X, XI Gelatin, Laminin, €-Makroglobulin, MMP´s 2, 9 Fibronektin, Gelatin, Laminin, Elastin, MMP`s 7, 8, 13, Pro-MMP-1, Pro-MMP-9 MMP-7 IV, X Fibronektin, Gelatin, Laminin, Elastin, MMP´s 1, 2, 9 MMP-9 IV, V, VII, X, XIV Fibronektin, Gelatin, Elastin MMP-10 III, IV, V Fibronektin, Gelatin, Laminin, Elastin, MMP´s 1, 8 MMP-11 ‚ Fibronektin, Laminin Tab. 3: (Curry et al. 2001) Am Zyklusende führt die abfallende Konzentration des Progesterons zu einer Abstoßung der funktionalen Schicht des Endometriums. In endometrialen Gewebekulturen führt das Fehlen von Progesteron zur Bildung großer Mengen von MMP´s. Dieser Anstieg wird zumindest teilweise auch durch lokale inflammatorische Zytokine verursacht (Marbaix et al. 1992). In vivo ist die Expression von endometrialen MMP´s während der Menstruation am höchsten (Rodgers 1993). MMP-2, -3 und -9 konnten zu diesem Zeitpunkt in den Endothelzellen oberflächlicher endometrialer Gefäße nachgewiesen werden. Daraus lässt sich eine durch MMP´s ausgelöste Degradierung der Gefäßwände während der Menstruation ableiten (Freitas et al. 1999). Der durch abfallende Progesteronserumspiegel ausgelöste Anstieg der MMP`S führt zu einer Degradierung der EZM mit nachfolgendem Gewebeuntergang und damit zur Menstruation (Marbaix et al. 1995, Marbaix 1996, Kokorine et al. 1996). 17 Physiologische Progesteronkonzentrationen (10-200 nM) bringen die Sekretion von MMP-1, 2 und MMP-9 in endometrialen Gewebekulturen fast zum Erliegen (Lockwood et al. 1998). Die Rolle des Progesterons in der Stabilisierung des Endometriums scheint einerseits in der Downregulation der MMP-Expression andererseits in einer Blockade der Wirkung von inflammatorischen Zytokine zu liegen (Marbaix et al 1992, Keller et al. 2000). Die TIMP…s als spezifische Inhibitoren der MMP…s konnten erstmalig von Rodgers et al. in Form von TIMP-1-mRNA sowohl in endometrialen Epithel- als auch in Stromazellen nachgewiesen werden. Die epitheliale Konzentration von TIMP-1-mRNA war gleichbleibend niedrig, w€hrend die Stromazellkonzentration in der Proliferations- und Sekretionsphase stetig anstieg und auch im Menstruationsgewebe noch erh†ht nachweisbar war (Rodgers et al. 1993). TIMP-2 und -3 konnten ebenfalls in niedriger Konzentration in den verschiedenen Zellkompartimenten des Endometriums isoliert werden, wobei sich nur geringf•gige zyklische Konzentrations€nderungen zeigten. TIMP1-3 finden sich auch in den endometrialen Gef€ƒzellen. Daraus wurde ein gef€ƒstabilisierender Effekt der TIMP…s abgeleitet (Zhang et al. 1997). Eine ‡nderung der TIMP-Konzentration durch Progesteronentzug konnte in einem In-vitro Modell zur Menstruation nicht nachgewiesen werden (Salamonsen 1997). Zyklusphase und Expressionsintensit€t Proliferation Sekretion sp€te Sekretion Menstruation MMP-1 ˆ/‰ MMP-1 ˆ MMP-1ˆ MMP-1 ‰ MMP-2 ‰‰ MMP-2 ‰‰ MMP-2 ‰‰ MMP-2 ‰‰ MMP-3 ‰ MMP-3 ˆ MMP-3 ˆ MMP-3 ‰‰ MMP-7 ‰‰ MMP-9 ˆ MMP-7 ˆ MMP-9 ˆ MMP-7 ‰ MMP-9 ˆ MMP-7 ‰‰‰ MMP-9 ‰ MMP-10 ˆ MMP-11 ‰‰ TIMP-1 ‰ TIMP-2 ‰ TIMP-3 ˆ/‰ MMP-10 ˆ MMP-11 ˆ TIMP-1 ‰ TIMP-2 ‰ TIMP-3 ‰ MMP-10 ‰ MMP-11 ‰ TIMP-1 ‰‰ TIMP-2 ‰ TIMP-3 ‰‰ MMP-10 ‰‰ MMP-11 ‰‰‰ TIMP-1 ‰‰‰ TIMP-2 ‰‰ TIMP-3 ‰ Hauptlokalisation im Endometrium Stromazellen der Mucosa functionalis uteri Stroma- und kapill€re Endothelzellen Endothelzellen und perivaskul€re glatte Muskelzellen glandul€re Epithelzellen endometrial eingewanderte Makrophagen Stromazellen Stromazellen Epithel-, Stroma-, Endothelzellen Epithel-, Stroma-, Endothelzellen Epithel-, Stroma-, Endothelzellen Tab. 4: Die relative Expression wird wie folgt ausgedr•ckt: nicht exprimiert: ˆ, gering exprimiert:‰, m€ƒig exprimiert: ‰‰, stark exprimiert: ‰‰‰ (Freitas et al. 1999, Curry et al. 2001) 18 Abb. 2: Physiologische Expression von MMP´s im weiblichen Zyklus bei Ovulation und Implantation (Hulboy et al. 1997) physiologische Inhibitoren der MMP´s spezifisch TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 unspezifisch Steroidhormone: Progesteron Proteaseninhibitoren z. B.: a2-Makroglobulin a1-Inhibitor-3 physiologische Aktivatoren der MMP´s spezifisch unspezifisch MMP-3 Proteasen z. B.: Plasminogenaktivator/PlasminMembrantypSystem MMP´s Inflammatorische Zytokine z.B.: Interleukin-1a, platelet-derived growth-factor, epidermal-growthfactor,Tumornekrosefaktor-a, Leptin Progesteronentzug Tab. 5: (Freitas et al. 1999, Loockwood et al 1998, Singer et al.1999, Mahutte et al. 2003). 19 1.3.2 Die Rolle des MMP-Systems in der Pathogenese der Endometriose Spuijbroek et al. fanden 1992 signifikant höhere Konzentrationen des aminoterminalen Propeptids von Typ III Prokollagen im Peritonealsekret von Frauen mit minimaler und milder Endometriose im Vergleich zu gesunden Patientinnen. Typ III-Kollagen ist eine der Hauptkomponenten des Bindegewebes, dessen Vorläufer ist Typ III Prokollagen. Dieses besitzt je eine Polypeptidkette am N-terminalen und am C-terminalen Ende (Prockop et al. 1979). Die Konversion von Prokollagen zu Kollagen erfordert die Abspaltung der aminoterminalen Peptidkette. Jeder aktiv invasiv in die EZM einwachsende Prozess kurbelt diesen metabolischen Schritt an und führt zu erhöhten Konzentrationen des aminoterminalen Propetids. Die Ergebnisse von Spuijbroek et al. lassen daher auf ein aktives, invasives Wachstum des retrograd menstruierten Endometriums mit einer Degradierung der EZM schließen (Spuijbroek et al. 1992). Damit kommt dem Metabolismus der EZM und dem MMPS eine Bedeutung bei der Pathogenese der Endometriose zu. In verschiedenen Tiermodellen wurden ebenfalls Hinweise für eine Rolle der MMP´s in der Pathogenese der Endometriose gefunden. Bruner et al. zeigten im Mausmodell, daß MMP`s maßgeblich an der Etablierung von Endometrioseherden beteiligt sind. Bei dieser Untersuchung wurde Nacktmäusen humanes Endometriumgewebe in die Bauchhöhle injiziert. Nach 2-4 Tagen konnten die ersten Endometrioseherde nachgewiesen werden. Die Anzahl der Endometrioseherde konnte durch eine 24-stündige Vorbehandlung der Endometriumfragmente mit Östrogen deutlich gesteigert werden. Im Gegensatz dazu hatte eine Behandlung mit Progesteron eine deutlich geringere Ausbildung von Endometrioseherden zur Folge. Auch die Behandlung mit TIMP-1 führte zu einer Reduktion der Endometrioseherde: Die mit Östrogen vorbehandelten Tiere entwickelten in 100% der Fälle peritoneale Läsionen, während sich bei gleichzeitiger TIMP-1-Applikation nur noch bei 10% der Tiere Endometrioseherde fanden (Bruner et al. 1997). Cox et al. verglichen im Rattenmodel die MMP-3-mRNA-Expression von eutopem und ektopem Endometrium. Die Autoren fanden deutlich höhere MMP-3-mRNA-Konzentrationen im ektopen Endometrium (Cox et al. 2001). In folgenden Untersuchungen am humanen Endometrium zeigte sich bei Endometriosepatientinnen im Vergleich zu gesunden Frauen eine erhöhte Expression von MMP´s, ein erhöhte Sensitivität auf MMP-Expression-aktivierende Faktoren und eine verminderte Expression von MMP-Inhibitoren: So konnte in der Zellkultur aus Endometrium von Endometriosepatientinnen mit dem die MMP-Expression steigernden IL-1 eine stärkere 20 MMP-Expression hervorgerufen werden als bei endometrialen Zellen von gesunden Frauen (Sillem et al. 2001). Chung et al. fanden bei Endometriosepatientinnen sowohl im eutopen als auch im ektopen Endometrium signifikant erniedrigte TIMP-3-mRNA-Konzentrationen. Zusätzlich waren erhöhte Mengen von MMP-9-mRNA in Endometrioseläsionen nachweisbar (Chung et al. 2001). Kokorine et al. konnten in roten peritonealen Endometrioseläsionen eine MMP-1-Expression nachweisen (Kokorine et al. 1997). Diese roten peritonealen Läsionen zeichnen sich durch eine starke Vaskularisation und einen hohen epithelialen mitotischen Index aus. Die Expression von MMP-1 in diesen Läsionen war entgegen der Expression von MMP-1 im eutopen Endometrium von gesunden Frauen nicht auf die Menstruation und die frühe Proliferationsphase beschränkt. Es fand sich in dem ektopen Endometrium zusätzlich eine MMP-1-Expression in der frühen und späten Sekretionsphase sowohl bei Frauen mit einem spontanen Menstruationszyklus Östrogen/Progesteronkombinationen. als auch bei Auffallend Frauen war, unter daß Einnahme Östrogen- von und Progesteronrezeptoren nur in ektopen endometrialen Zellen exprimiert wurden, welche keine Expression von MMP-1 zeigten (Kokorine et al. 1997). Wenzl und Heinzl konnten 1998 eine erhöhte MMP-2-Expression im ektopen Endometrium im Vergleich zum eutopen Endometrium nachweisen (Wenzl et Heinzl 1998). Die Ergebnissen der zitierten Arbeiten weisen auf eine wichtige Rolle des MMPS bei der Invasion von Endometriumfragmenten in die Peritonealmembran und bei der Vaskularisierung von peritonealen Endometrioseherden hin. 21 1.4 Die Chorioallantoismembran (CAM) des befruchteten Hühnereies als Kurzzeitgewebekultur Schon 1887 fand Gerlach die CAM des befruchteten Hühnereies geeignet zur Erforschung der Angiogenese (Gerlach 1887). Verschiedenen Autoren gelang die Verpflanzung von menschlichem Endometriumgewebe auf die CAM (Rubovits et al. 1951, Kunzi-Rapp et al. 1995). Wegen des noch unreifen Immunsystems des Hühnerembryos lassen sich bis zum 16.17. Entwicklungstag Zellen oder Gewebe auf der CAM kultivieren (Ausprunk et al. 1975). Die Transplantation von Endometrium auf die CAM entspricht einer Kultivierung außerhalb des Uterus auf einer Membran. Das transplantierte Endometrium ist ähnlichen Bedingungen ausgesetzt wie ein auf der Peritonealmembran wachsendes Endometriumfragment. So konnten Maas et al. 72h nach Transplantation von Endometriumgewebe auf die CAM endometrioseähnliche Läsionen nachweisen (Maas et al. 2001). Mit der CAM kann auf Tiermodelle zur Erforschung der peritonealen Endometriose verzichtet werden, da die CAM ein Ersatzmodell zur Peritonealmembran der Bauchhöhle darstellt. Für die Erforschung der Angiogenese ist die CAM zusätzlich besonders geeignet, da eine dynamische Beobachtung der Gefäßbildung im Zeitverlauf kontinuierlich möglich ist. Nach Transplantation von Gewebe auf die CAM kann die Angiogeneseinduktion nach Applikation verschiedenster, die Angiogenese stimulierender oder hemmender Faktoren, gut beurteilt werden, (Oosterlynck et al. 1993, Brooks et al. 1994a). Malik et al. etablierten erfolgreich auf der CAM kultiviertes Endometrium als geeignetes Endometriosemodell im Rahmen der Fluoreszenzdiagnostik der Endometriose (Malik et al. 2000a). Dabei konnten die am Modell gewonnenen Erkenntnisse auf die Anwendung am Menschen übertragen werden (Malik et al. 2000b). Kressin et al. wiesen im auf der CAM kultivierten humanen Endometrium im Zeitverlauf ansteigende VEGF-mRNA nach (Kressin et al. 2001a). In ihrer Arbeit zeigte sich das CAM-Model als geeignet zur Untersuchung der angiogenetischen Rolle des VEGF`s bei der peritonealen Endometriose. Die vorangegangenen Arbeiten zeigen, daß die Kultivierung von humanem Endometrium auf der CAM ein geeignetes in ovo-Model ist, um die intraperitonealen Vorgänge der Vaskularisation und die Expression von angiogenetischen Faktoren von peritonealen Endometrioseherden zu erforschen. 22 1.5 Fragestellung und Zielsetzung In dieser Untersuchung wird die CAM als Kurzzeitgewebekultur für humanes Endometrium genutzt, um die mRNA-Expression der angiogeneserelevanten Faktoren MMP-1 und MMP-2 zu untersuchen. Dabei werden die Konzentrationen von MMP-1- und -2-mRNA in humanen Endometriumfragmenten vor und nach Kultivierung auf der CAM unter normoxämischen Bedingungen bestimmt. Es sollen folgende Fragen untersucht werden: 1.) Werden die angiogenetisch-relevanten Faktoren MMP-1 und MMP-2 im humanen Endometrium vor und nach Transplantation auf die CAM des Hühnerembryos auf mRNAEbene exprimiert? 2.) Ändert sich das Expressionsmuster im Zeitverlauf der Kultivierung auf der CAM? 3.) Bestehen Unterschiede bezüglich der Fragen 1) und 2) zwischen dem Endometrium von Patientinnen mit und ohne histologisch nachgewiesene Endometriose? 23 2 Material und Methoden 2.1. Materialien 2.1.1 Reagenzien und Chemikalien Agarose GibcoBRL Life Technologies, Karlsruhe DEPC Sigma, Deisenhofen dNTPS Takara Biomedicals, Shiga, Japan EDTA Sigma, Deisenhofen Ethidiumbromid GibcoBRL Life Technologies, Karlsruhe Tris Merck, Darmstadt Trizol® Reagent GibcoBRL Life Technologies, Karlsruhe Allgemeine Laborchemikalien und Merck, Darmstadt Lösungsmittel in p.a. Qualität Roth, Karlsruhe Sigma, München 2.1.2 Enzyme und Proteine M-MLV Reverse Transcriptase (200 U/µ l) Taq DNA Polymerase (5 U/µl) Promega, Madison, USA GibcoBRL Life Technologies, Karlsruhe 2.1.3 Geräte und sonstige Materialien Axio Vision Release 2.05 Carl Zeiss Vision GmbH, München-Hallbergmoos DAB substrate kit for peroxidase Vector Labaratories, Burlingame, USA Easy Gel-Dokumentationssystem Herolab, Wiesloch Microcomputer Elektrophoresis Power supply Mikrozentrifuge MC-13 Trio-Thermoblock UV-Fotometer Gen Quant II Renner GmbH, Dannstadt Millipore/Amicon, Eschborn Biometra, Göttingen Pharmacia Biotech (jetzt Amersham Biosciences, Freiburg) Ultra-Turrax T25 Wizard PCR Preps Purification System IKA Labortechnik, Staufen Promega, Madison, USA 24 Zentrifuge Hettich Rotanta/RP Zentrifuge 2K15 Hettich Rotanta, Tuttlingen Sigma Laborzentrifugen, Osterode 2.1.4 Puffer und Lösungen DEPC-Wasser: 0,1% (v/v) DEPC in Wasser über Nacht rühren, autoklavieren 75% (v/v) Ethanol: 75% (v/v) Ethanol in DEPC-Wasser RT-Puffer (20 mM Tris-HCL, pH 8,3/ 2.5 mM Mg Cl2/ 100 µg bovines Serumalbumin pro ml) TAE-Puffer: 10 mM Tris-Acetat, pH 8,0 1 mM EDTA 2.1.5 Primer/Oligonukleotide Oligo-dT15 MWG Biotech, Ebersberg Alle als Startermoleküle der PCR verwendeten Primer stammten von der Firma MWG Biotech, Ebersberg. Name Sequenz 5`-MMP 1 5`-GTG GAC CAA CAA TTT CAG AGA G-3` 3`-MMP1 5`-TGT CCT TGG GGT ATC CGT GT-3` k-3`-MMP 1 5`-TGT CCT TGG GGT ATC CGT GTC = Tan Gen 60°C MMP 1 CGG ACT TCA TCT CTG TCG-3` 5`-MMP 2 5`-CAC CAC TGA GGA CTA CGA CCG-3` 3`-MMP 2 5`-AGT CCG CCA AAT GAA CCG GT-3` k-5`-MMP 2 5`-CAC CAC TGA GGA CTA CGA CCG = 60°C MMP 2 CCT TCA CTT TCC TGG GCA AC-3` 5`-Gapdh 5`-ATC CCT GCC TCT ACT GG-3` 3`-Gapdh 5´-TGG GTG TCG CTG TTG AAG TC-3´ 59°C GAPDH Tab. 6 Tan: Anheftungstemperatur (annealing) in der PCR = Kennzeichung der Deletion von 47 bp bei MMP-1 und von 80 bp bei MMP-2 im Vergleich zu deren cDNA 25 2.1.6 DNA-Längenstandards 100 bp DNA ladder (1µg/µl) GibcoBRL Life Technologies, Karlsruhe bp: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 2.1.7 befruchtete Hühnereier ( Lohmann Tierzucht GmbH Cuxhaven, Deutschland) 2.2 Patientinnenkollektiv Es wurden Endometriumproben von 10 Patientinnen im reproduktionsfähigen Alter durch Strichkürettage im Rahmen einer medizinisch indizierten Hysteroskopie und Laparoskopie gewonnen. Die Patientinnen waren über die möglichen Risiken einer Strichkürettage ausführlich informiert worden und hatten der Gewebeentnahme zu wissenschaftlichen Zwecken durch Unterschrift eines Aufklärungsbogens zugestimmt. Ein positives Votum der Ethikkommission der Universitätsklinik Lübeck lag vor. Alle Patientinnen befanden sich zum Zeitpunkt der Operation in der I. Zyklushälfte, welches in der histologischen Aufarbeitung der Gewebeproben durch einen Mitarbeiter in der Abteilung für Pathologie der Universität zu Lübeck bestätigt wurde, da alle Proben ein typisches Proliferationsphasenepithel zeigten. Keine der Patientinnen war in den letzten 3 Monaten hormonell behandelt worden, noch war ein Intrauterinpessar zur Kontrazeption genutzt worden. Bei vier der Patientinnen konnte bei der Laparoskopie eine peritoneale Endometriose durch Gewebeprobeentnahmen histologisch gesichert werden. Klinisch nach Inspektion des Situs wurden davon zwei Patientinnen als ASRM I, und je eine Patientin als ASRM II und ASRM III klasssifiziert. Bei sechs Patientinnen fand sich kein Hinweis für eine Endometriose. 26 2.3 Gewebekultur auf der CAM Die Gewebekultur der Endometriumfragmente auf der CAM wurden entsprechend der von Malik et al. und Kressin et al. beschriebenen Methode durchgeführt (Malik et al. 2000b, Kressin et al. 2001a). Die entnommenen Endometriumproben wurden in steriler physiologischer Kochsalzlösung aufbewahrt und innerhalb von drei Stunden nach Entnahme auf die CAM aufgesetzt. Zuvor wurde das Endometriumgewebe mit einem sterilen Skalpell in einer Petrischale in 1x1 mm messende Stücke zerkleinert. Nekrotisch erscheinende Gewebestücke wurden nicht verwendet. Die benötigten befruchteten Hühnereier stammten von einer entsprechenden Zuchtstation. Nach Erhalt der Eier wurde der spitze Pol mit Klebeband verklebt. Damit konnte verhindert werden, daß beim späteren Aufschneiden des Eies die Schale splitterte und Bruchstücke auf die CAM gelangten. Die Eier wurden anschließend mit dem stumpfen Ende nach oben bei 37° C und 60% Luftfeuchtigkeit bis Tag 5 oder 6 nach Befruchtung gelagert. Dann wurde mit einer Schere ein 3 x 3 cm großes Fenster auf dem spitzen, abgeklebten Pol des Eies in die Schale geschnitten. Dieses Fenster wurde mit einem Plexiglasdeckel verschlossen und dieser mit Isolierband an der Schale fixiert. Die Eier wurden mit dem Fenster nach oben gelagert und die Bebrütung fortgesetzt. Es wurden pro Patientin 24 Endometriumproben von je 1 mm3 Durchmesser auf die CAM von 6-10 Tage alten Hühnerembryonen transplantiert. Dazu wurde das in die Schale geschnittene Fenster erweitert und je eine Endometriumprobe nahe einer Y-förmigen Aufteilung eines CAM-Gefäßes platziert. Nach dem Aufbringen der Endometriumproben wurde der Plastikdeckel wieder aufgesetzt und mit Tape an der Schale fixiert. Vitale Endometriumimplantate zeigten eine weißliche oder rosige Färbung. Abgestoßene Implantate wurden innerhalb von 1-2 Tagen nach Transplantation auf die CAM schwarz. Durchschnittlich wurden 10% der auf die CAM transplantierten Endometriumproben avital und wurden aussortiert. Nach je 24 h, 48 h, 72 h und 96 h Kultivationszeit der Endometriumproben erfolgte die Explantation von je drei Präparaten pro Patientin. Zur Explantation wurde die CAM nahe am Implantat mit der Pinzette angehoben und das Implantat mit etwas anhaftenden CAM-Gewebe mit der Schere abgetrennt. Die Präparate wurden sofort nach Entnahme in flüssigem Stickstoff schockgefroren. So wurden pro Kultivationszeitpunkt (=Zeitverlauf) auf der CAM je drei Proben pro Patientin bearbeitet. Zusätzlich wurden je drei Proben pro Patientin sofort 27 nach der Strichkürettage ohne vorherige Transplantation auf die CAM schockgefroren (Zeitpunkt 0). Abb. 3: Humanes Endometrium nach 96 h Kultivierung auf der Chorioallantoismembran. Es findet sich ein konzentrisches auf das Implantat gerichtetes Wachstum von CAM-Gefäßen. 2.4 Extraktion der Gesamt-RNA Die RNA-Extraktion erfolgte mit der single-step-Methode mit einem Guanidinium-CyanatPhenol-Chloroform-Gemisch nach Chomczynski (Chomczynski und Sacchi 1987). Diese Methode hat sich besonders bei kleinen Probenvolumina bewährt und ist mit vier Stunden zeitsparend. Die explantierten und gefrorenen Gewebeproben wurden in 1 ml Trizol-Reagent (GibcoBRL Life Technologies, Karlsruhe) mit dem Ultra-Turrax T 25 (IKA Labortechnik, Staufen) in 30 Sekunden (sek) homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenisat für 15 Minuten (min) bei 2000 * g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, um eine möglichst vollständige Dissoziierung der Nukleoproteinkomplexe zu erreichen. Durch Zugabe von 200 µl Chloroform und Zentrifugation mit 10000 * g für 20 min bei 4 °C fand sich die Gesamt-RNA von DNA und Proteinen isoliert in der wässrigen Phase des Gemisches und konnte abpipettiert werden. 28 Nach Zugabe von 500 µl Isopropanolol und 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die RNA gefällt. Durch erneute Zentrifugation für 10 min bei 12000 * g bei 4 °C entstand ein RNA-Pellet. Dies wurde mit 1000 µl 75% (v/v) Ethanol gereinigt und für 5 min bei 7500 * g bei 4 °C erneut zentrifugiert. Nach Abtrocknung des Ethanols erfolgte die Lösung des Pellets in 20 µl DEPC-behandeltem Wasser. Die fertigen Proben wurden bis zur weiteren Bearbeitung bei –80 °C eingefroren. 2.5 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäure-Lösungen Es erfolgte eine photometrische Messung der Gesamt-RNA-Menge der Proben durch Bestimmung der Extinktion bei 260 nm Wellenlänge mit dem UV-Fotometer Gen Quant II (Pharmacia Biotech). Mit der gleichen Methode wurden auch die Konzentrationen der DNALösungen und der Kompetitoren (2.6.2) bestimmt. Bei 260 nm Wellenlänge und 1 cm Schichtdicke entspricht eine Absorption von 1,0 einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml und einer dsDNA-Konzentration von 50 µg/ml (Sambrook et al. 1989). Zusätzlich wurde der Quotient der Absorption bei 260 nm und 280 nm als Maß für Verunreinigungen durch Proteine und Phenol bestimmt. Als Richtwert galt hier ein Wert zwischen 1,8 und 2,0. 2.6 Reverse Transkription mit Bildung einer Komplementär-DNA (cDNA) Die reverse Transkription (RT) der RNA erfolgte nach der von Wolber et al. beschriebenen Methode (Wolber et al. 1999). Je 1 µg der Gesamt-RNA wurde mittels 500 ng eines Oligo-dtOligo-Primers als Startermolekül (MWG Biotech, Ebersberg) und 100 U reverser Transkriptase (RTase) in cDNA transkribiert. Verwendung fand als RTase moloney murine leukemia virus (M-MLV)-RTase (Promega, Madison, USA). Zunächst wurde je 1 µg mRNA mit 2,5 µl Oligo-dT-Primer ad 14,5 µl DEPC-ddH2O auf Eis pipettiert, gemischt, mit 10000 * g anzentrifugiert und 15 min im Wasserbad bei 68°C denaturiert. Hierdurch wurde eine Auflösung der Sekundärstruktur der RNA erreicht. 29 Anschließend folgte das Abkühlen der Proben 15 min auf Eis, um eine Renaturierung zu verhindern. Zur RT wurde den Proben je 10,5 µl RT-Mix zugegeben, bestehend aus RT-Puffer, 12,5 nmol dNTP`s (Takara Biomedicals, Shiga, Japan) und M-MLV-RTase. Nach Mischen und Anzentrifugieren bei 10000 * g erfolgte die Inkubation im Thermocycler (Biometra, Göttingen) über je 45 min bei zunächst 42°C, dann 52°C mit anschließender 10-minütiger Erhitzung auf 100°C. Hierdurch wurde die RTase inaktiviert. Darauf folgte die Abkühlung der cDNA-Proben auf 4°C. Die Proben wurden bei –20°C gelagert und konnten ohne weitere Bearbeitung zur PCR-Analyse eingesetzt werden. 2.7 Qualitative Polymerase Kettenreaktion (PCR) Es wurden die Konzentrationen von MMP-1-, MMP-2- und humaner Glyzerinaldehyd-3phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-cDNA durch qualitative PCR bestimmt. Die Bestimmung der GAPDH-cDNA-Konzentration war zur Normierung der Konzentration der MMP-1- und MMP-2-cDNA erforderlich. Dadurch konnte die Expression von MMP-1- und MMP-2-cDNA zu einem spezifisch humanen Parameter ins Verhältnis gesetzt, dessen Expression während des gesamten Menstruationszyklus konstant ist (Wolber et al. 2002). So konnten unterschiedlich große mRNA-Mengen, hervorgerufen durch unterschiedlich große von der CAM explantierten Endometriumimplantate miteinander verglichen werden. Für MMP-1- und MMP-2-cDNA wurden folgende in ihrer Sequenz humanspezifische Primer verwand (s. Tab. 6): 5`MMP-1, 5`-GTG GAC CAA CAA TTT CAG AGA G-3`; 3`MMP-1, 5`- TGT CCT TGG GGT ATC CGT GT-3`; 5`-MMP-2, 5`-CAC CAC TGA GGA CTA CGA CCG-3`; 3`MMP-2, 5`-AGT CCG CCA AAT GAA CCG GT-3`. Zur Bestimmung der GAPDH wurde ein Primer eingesetzt, welcher sowohl mit der cDNA von humaner, als auch Hühner-GAPDH reagieren kann. Um eine ungewünschte Amplifizierung von Hühner-cDNA zu vermeiden, wurden die PCR- Bedingungen so gewählt, daß der Primer sich ausschließlich an humane cDNA binden konnte. Hierzu diente das Protokoll von Kressin et al. (Kressin et al. 2001a). Der Primer für GAPDH-cDNA hatte folgende Sequenz (s. Tab. 6): 5`GAPDH, 5`-ATC ATC CCT GCC TCT ACT GG-3`; 3`GAPDH, 5`-TGG GTG TCG CTG TTG AAG TC-3`. 30 Die erwartete Länge des PCR-Produktes von MMP-1-cDNA lag bei 485 Basenpaaren (bp), für MMP-2-cDNA bei 401 bp und für GAPDH-cDNA 256 bp. Als Matrize für die DNA-Polymerase diente die durch RT (s. 2.6) gewonnene cDNA aus den Endometriumproben. Das Gesamtvolumen pro PCR-Ansatz lag bei 50µl. Es wurde jeweils 1µl cDNA, 0,75 U Taq DNA Polymerase (GibcoBRL Life Technologies, Karlsruhe), 20 pmol von jedem Primer und dNTP´s im vom Enzymhersteller mitgelieferten Einfach-Puffer gemischt. Es wurde folgendes PCR-Protokoll angewandt: Programm für MMP1- und MMP2-cDNA: Denaturierung der cDNA (1x) 3 min bei 94°C Amplifizierung (32-35x) Denaturierung 1 min bei 94°C Primerannealing 1 min 30 sec bei 60°C Elongation 3 min bei 72°C Terminale Extension (1x) 7 min bei 72°C Programm für GAPDH-cDNA: Denaturierung der cDNA (1x) 3 min bei 94°C Amplifizierung (28x) Denaturierung 1 min bei 94°C Primerannealing 1 min 30 sec bei 59°C Elongation 3 min bei 72°C Terminale Extension (1x) 7 min bei 72°C Die durch PCR gewonnenen cDNA-Proben wurden mit Agarose-Gelelektrophorese analysiert (s. 2.9). 31 2.8 Quantitative PCR Die quantitative Bestimmung der jeweiligen cDNA-Konzetrationen von MMP-1, MMP-2 und GAPDH in den Endometriumproben erfolgte für jede Gewebeprobe und jeden Faktor mit einer kompetitiven PCR. Um eine Ziel-cDNA zu quantifizieren muß während der PCR eine synthetische cDNA von bekannter Konzentration als interner Standard (Kompetitor) mitamplifiziert werden. Benutzt man für die Ziel-cDNA und die cDNA des internen Standards unterschiedliche Primer, sind die Ergebnisse ungenau wegen der unterschiedlichen Effektivität der verschiedenen PrimerPaare. Hier bietet sich die Möglichkeit der kompetitiven PCR. Dabei wird eine cDNA als interner Standard synthetisiert, welche mit dem Primer der Ziel-cDNA amplifiziert werden kann. Bei dieser Methode konkurrieren die zu quantifizierende cDNA mit der synthetisierten cDNA bekannter Konzentration des internen Standards im selben Ansatz um die Primerpaare, Nukleotide und Polymerasen der PCR (Siebert et al. 1992). Um dennoch die PCR-Produkte von Standard-cDNA und Ziel-cDNA unterscheiden zu können, werden durch eine Deletion oder Insertion in der cDNA des Kompetitors zwei PCRProdukte unterschiedlicher Größe produziert, welche leicht durch eine Gelelektrophorese voneinander getrennt werden können. So kann in der exponentiellen Phase der Amplifikation die Menge der Ziel-cDNA gegen die Standard-Kurve extrapoliert werden. Das Mischungsverhältnis der PCR-Produkte spiegelt das Mischungsverhältnis der Ausgangsmoleküle wieder. Dieses Verfahren war wegen seiner hohen Sensitivität für die vorliegende Arbeit besonders geeignet, da aus den kleinen Endometriumimplantaten von der CAM nur eine geringe Menge an mRNA extrahiert werden konnte, welche für die Northern-Blot- oder RnaseProtektionsanalysen nicht ausreichten. Nach einer qualitativen PCR (s. 2.7) zur Eingrenzung der cDNA-Konzentration des untersuchten Faktors wurde die kompetitive PCR unter den gleichen Reaktionsbedingungen durchgeführt. Dem PCR-Ansatz wurde zusätzlich 1 µl Kompetitor mit bekannter Konzentration zugesetzt. Pro Probe und Faktor (MMP-1, MMP-2, GAPDH) wurden 4 Reaktionssätze mit verschiedener Kompetitorkonzentration in einer 1:2 Verdünnungsreihe bearbeitet. Das Konzentrationsfenster der Kompetitorverdünnung lieferte das Ergebnis der vorab durchgeführten qualitativen PCR. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese (2.9) analysiert. 32 2.8.1 Herstellung der Kompetitoren Die notwendigen internen Standards f•r die kompetitive PCR f•r MMP-1 und MMP-2 wurden mittels PCR unter den unter 2.7 beschriebenen Bedingungen hergestellt. Die cDNA des internen Standards zeichnet sich durch eine interne Deletion aus, welche eine Unterscheidung von der zu quantifizierenden cDNA unter Beachtung der L€nge der PCRProdukte von Ziel-DNA und internem Standard erm†glicht (Siebert et al. 1992). Als cDNA-Matrize diente das MMP-1- und MMP-2-PCR-Produkt. Es wurden statt der •blichen 3…-Primer spezielle 3…-Primer verwandt, die ein PCR-Produkt mit einer Deletion im Kompetitorfragment lieferten. Der MMP-1-cDNA-Kompetitor wies eine Deletion von 47 bp auf und lieferte somit ein 438 bp messendes PCR-Produkt. Der MMP-2-cDNA-Kompetitor zeigte eine Deletion von 81 bp und liefert ein PCR-Produkt von 320 bp. Der interne Standard f•r GAPDH zeichnete sich durch eine Deletion von 43 bp aus und lieferte ein 213 bp messendes PCR-Produkt. Dessen Herstellung war bereits in einer vorangegangenen Studie von Kressin et al. durch •berlappende PCR erfolgt (Kressin et al. 2001a). Die PCR-Produkte wurden in der Agarose-Gelelektrophorese (2.9) durch ihre Fragmentl€ngen identifiziert. Aus den PCR-Ans€tzen, welche ein kr€ftiges Signal in der Elektrophorese lieferten, wurde das PCR-Produkt mit dem Wizard PCR Peps Purification System, den Angaben des Herstellers (Promega, Madison, USA) folgend, gewonnen. Die Konzentration der Kompetitoren konnte anschlieƒend durch photometrische Messung der Extinktion (2.5) bestimmt werden. Die Kompetitor-L†sung wurde bei Š20‹C gelagert. A ŒŒ 5`-Primer 5` ~~~~ŒŒŒŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ Œ~~~~ 3` 3`~~~~Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ ŒŒŒ Œ~~~~5` ŒŒ 3`-Primer PCR 5` ŒŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ 3` 3` Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ ŒŒ 5` PCR-Produkt 33 B Deletion 5` ŒŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ 3` PCR-Produkt 3` Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ xxxŒ Œ ŒŒ 5` xxxŒŒ k-3`-Primer PCR 5` ŒŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ ŒŒ 3` 3` Œ Œ Œ Œ Œ Œ Œ xxxŒŒ 5` 5` ŒŒ 3` + Kompetitor 3`Œ Œ 5` + deletiertes Fragment Abb. 4: Herstellung der internen Standards f•r die kompetitive PCR. Teil A zeigt schematisch die RT-PCR, welche die MMP-1-cDNA bzw. MMP-2-cDNA lieferte. Teil B stellt dar, wie unter Verwendung des jeweiligen PCR-Produktes als Matritze und spezieller k-3`-Primer die Kompetitorfragmente erzeugt werden. Dies ist m†glich, weil die k3…-Primer zu zwei cDNA-Regionen komplement€r sind. Dadurch kommt es zur Deletion des zwischen diesen cDNA-Regionen liegenden DNA-Fragmentes. 2.9 Gelelektrophorese Die durch PCR gewonnenen cDNA-Proben wurden mit der Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Dazu wurde 2% (w/w) Agarose in TAE-Puffer durch Erhitzen gel†st. Das notwendige Ethidiumbromid zur Interkalierung mit der cDNA wurde nach Abk•hlung dem Agarosegel zugef•gt (Endkonzentration 0,5•g/ml). Die cDNA-Proben wurden bei einer Spannung von 90-120 V aufgetrennt. Es wurden den cDNA-Proben aus der PCR jeweils verschiedene Standardkonzentrationen bekannter Konzentration zugegeben. Als Standard wurde eine 100 bp DNA ladder (GibcoBRL Life Karlsruhe) verwendet. Um diejenige Konzentration des Standards zu ermitteln, bei der €quimolare Verh€ltnisse mit der cDNAProbe vorlagen, wurde die Fluoreszenzintensit€t der DNA-Banden sowohl mit dem bloƒen 34 Auge evaluiert, als auch mit Hilfe des PC-Programmes „Easy Win 2“ von Heralab bestimmt. Äquimolare Konzentration lag bei gleicher Fluoreszenzintensität der Banden von cDNAProben der PCR und Standard-DNA vor. 2.10 Konzentrationsbestimmung der mRNA Bei jedem Durchlauf der PCR wird die DNA-Menge verdoppelt. Es kommt zu einem exponentiellen Anstieg der DNA-Menge nach folgender Formel: N=N0 (1+ eff)n, wobei N0 für die Ausgangsmenge, eff für die Effektivität und n für die Anzahl der PCR-Zyklen steht (Wang et al. 1989). Wird während der PCR eine synthetische cDNA von bekannter Konzentration als interner Standard (Kompetitor) mitamplifiziert, kann die Ziel-cDNA in der exponentiellen Phase der Amplifikation gegen die Standard-Kurve extrapoliert werden. Es wurde die Kompetitorkonzentration notiert, bei welcher eine gleich intensive Fluoreszenz zwischen den mittels Gelelektrophorese entstandenen Banden von Ziel-cDNA und Kompetitor auftrat. Mittels dieser Äquivalenzkonzentration und unter Berücksichtigung der folgenden Faktoren: Molekulargewicht und Doppelsträngigkeit der cDNA des Kompetitors, Gesamtmenge der in der RT eingesetzten RNA, der RT-Effizienz (Wolber et al. 1999) und Einzelsträngigkeit der Ziel-cDNA wurde die mRNA-Konzentration in fmol berechnet. 2.11 Berechnung und Statistik Die Konzentration der MMP-1- und MMP-2-mRNA wurde zu der Konzentration der ebenfalls bestimmten humanen GAPDH-mRNA normiert. Die Expression dieses sogenannten „housekeeping gene“ ist während des gesamten Menstruationszyklus konstant (Wolber et al. 2002). Es wurde dadurch die Expression von MMP-1- und MMP-2-mRNA zu einem spezifisch humanen Parameter ins Verhältnis gesetzt und die ermittelte MMP-1- und MMP-2mRNA pro GAPDH-mRNA angegeben. So konnten unterschiedlich große mRNA-Mengen, hervorgerufen durch unterschiedlich große von der CAM explantierten Endometriumimplantaten miteinander verglichen werden. 35 Dieses MMP-1- bzw. MMP-2-mRNA / GAPDH-mRNA-Verhältnis wurde nicht durch Hühner-mRNA verfälscht, da die entsprechenden PCR-Bedingungen für die drei Gene spezifisch für humane Gene gewählt wurden. Damit konnte auch ein Einfluß von unterschiedlichen Mengen von Hühner-mRNA aus dem CAM-Gewebe, welche den explantierten Endometriumproben anhafteten, eliminiert werden. Ziel der Untersuchung war die Veränderung der MMP-1- und -2-mRNA-Expression im Verlauf der Kultivierung auf der CAM zu beurteilen. Es wurden dazu je drei Proben je Untersuchungszeitpunkt (0h, 24h, 48h, 72h, 92h) und Patientin analysiert und die mediane MMP-1/GAPDH- und MMP-2/GAPDH-mRNA-Ratio bestimmt. Diese Median-Werte wurden verglichen. Da die Werte normalverteilt waren, wurde der gebundene T-Test angewandt, um die Expression im Zeitverlauf zu beurteilen. Als statistisch signifikant galt ein p< 0,05. Zum Vergleich der Expression von MMP-1- und MMP-2-mRNA zwischen Patientinnen mit und ohne Endometriose wurde der ungebundene T-Test angewandt. Hier galt ebenfalls ein p< 0,05 als statistisch signifikant. 36 3 Ergebnisse 3.1 Etablierung eines quantitativen Nachweises für MMP-1 und MMP-2 3.1.1 Optimierung der PCR für MMP-1 und MMP-2 Die PCR mit der nach RNA-Extraktion (s. 2.4) aus den Endometriumproben und nachfolgender RT (s. 2.6) gewonnenen cDNA lieferte mit den als Primer verwendeten Oligonukleotiden 5`-MMP-1 und 3`-MMP-1 ein Produkt mit der erwarteten L€nge von 485 bp. Wurden zur PCR die Starteroligonukleotide 5`-MMP-2 und 3`-MMP-2 eingesetzt, erhielt man ein Fragment mit einer L€nge von 401 bp. MMP-2 M 600 bp + MMP-1 Ž + Ž • • Abb. 5: Qualitative PCR f•r MMP-2 und MMP-1. Die Gelektrophorese zeigt die erwarteten Banden f•r das MMP-2-PCR-Produkt bei 401 bp (grauer Pfeil) und f•r das MMP-1-PCRProdukt bei 485 bp (schwarzer Pfeil). M: 100 bp DNA-Molekulargewichtsstandard; + : PCR-Ansatz mit cDNA; Ž : Negativkontrolle ohne cDNA Um eine optimale Amplifikation w€hrend der PCR zu erreichen, ist die Anzahl der PCRZyklen von Bedeutung. Ziel ist eine Amplifikation der entsprechenden cDNA im linearen Bereich, da die Vervielf€ltigung der cDNA gem€ƒ einer exponentiellen Kurve nach der Formel N=N0 (1+ eff)n (s. 2.10) erfolgt. Die Amplifikation sollte vor der Plateauphase der PCR beendet sein, da in der linearen Phase entsprechend der genannten Formel ein mathematischer Zusammenhang zwischen den Ausgangsmolek•len und dem PCR-Produkt besteht. Es wurden je drei Ans€tze cDNA aus den Endometriumproben einer PCR von 23-43 Zyklen f•r MMP-1 und MMP-2 unterzogen. Die entstandenen PCR-Produkte wurden per Gelelekrophorese (s. 2.9) aufgetrennt und die Bandenintensit€t photometrisch gemessen. Mit steigender Zykluszahl nahm die Bandenintensit€t zun€chst zu. War die Plateauphase erreicht, 37 kam es zu keiner weiteren Steigerung der Intensit€t. Die gr†ƒten Unterschiede der Bandenintensit€t fanden sich in der linearen Phase der Amplifikation, so daƒ in diesem Bereich auch die beste Differenzierung der Banden in der Agarosegelelektrophorese m†glich war. M 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Zyklen • MMP-1 M 23 25 27 29 31 33 35 39 41 43 Zyklen • MMP-2 Abb. 6: Bestimmung der PCR-Zykluszahlen f•r MMP-1 (32) und MMP-2 (35): Gelelektrophorese mit MMP-1 und MMP-2. Oberhalb der Banden finden sich die jeweiligen Zykluszahlen. M: 100 bp DNA-Molekulargewichtsstandard ˆ MMP-1 • MMP-2 20 25 30 35 40 45 Zyklen Abb. 7: Densitomentrisch gemessene Bandenintensit€t in Abh€ngigkeit von der Zykluszahl (Mittlewert ‘ SD von Dreifachbestimmungen) der MMP-1- und der MMP-2-PCR. F•r die PCR f•r MMP-1 ergab sich ein Optimum von 32 Zyklen, f•r MMP-2 von 35 Zyklen. 38 Die Bedingungen der PCR sollten humanspezifisch sein, um eine Amplifikation von aus der CAM stammender H•hner-RNA mit einer m†glichen Verf€lschung der Ergebnisse zu vermeiden. Es wurde daher die etablierte PCR auf ihre Speziesspezifit€t hin getestet. Hierzu wurde mRNA aus reinem CAM-Gewebe extrahiert (s. 2.4) und nach RT (s. 2.6) als PCR-Matritze f•r die Primer 5…-MMP-1, 3…-MMP-1, bzw. 5…-MMP-2, 3`-MMP-2 sowie 5`GAPDH und 3`-GAPDH eingesetzt. Parallel erfolgte eine PCR mit humaner cDNA aus Endometriumproben und eine Negativkontrolle ohne cDNA. Wurde in der PCR aus der CAM stammende H•hner-cDNA als Matrize verwendet, erhielt man kein Signal in der Gelelektrophorese. Ebenso lieferte die Negativkontrolle kein Signal. MMP 2 M 1 2 MMP 1 3 4 5 GAPDH 6 7 8 9 600 bp • “ Abb. 8: ’berpr•fung der Speziesspezifit€t von Primer und PCR-Bedingungen. Agarosegel von PCR-Produkten f•r MMP-2 (Bahn 1-3, grauer Pfeil, 401 bp), MMP-1 (Bahn 4-6, schwarzer Pfeil, 485 bp) und GAPDH (Bahn 7-9, weiƒer Pfeil, 256 bp) mit cDNA aus Endometrium (Bahn 1, 4, 7) und aus CAM-Gewebe (Bahn 2, 5, 8); Negativkontrollen ohne cDNA (Bahn 3, 6, 9). Nur die PCR mit Endometrium-cDNA liefert Signale. M: 100 bp DNAMolekulargewichtsstandard. 3.1.2 Herstellung der internen Standards als Kompetitoren Die Amplifikation von MMP-1-cDNA mit dem Primer 5`-MMP-1 und dem kompetitorspezifischen Primer k-3`-MMP-1 f•hrte, wie erwartet, zu einem PCR-Produkt in Form eines einzelnen Fragmentes mit einer L€nge von 438 bp. Dieses Fragment diente als Matrize f•r eine weitere PCR mit den MMP-1-Primerpaaren. So konnten MMP-1Kompetitorfragmente mit der L€nge von 438 bp amplifiziert werden. Eine PCR von MMP-2-cDNA mit dem Primer 5`-MMP-2 und dem kompetitorspezifischen k3`-MMP-2 lieferte ein Fragment von 320 bp L€nge. Es wurde dieses Fragment als PCR39 Matrize mit den MMP-2-Primern verwendet, um ausschließlich MMP-2- Kompetitorfragmente zu erhalten. Eine PCR mit MMP-1-Kompetitor als cDNA-Matrize mit den MMP-2-Primern lieferte kein Signal in der Gelelektrophorese. Ebensowenig konnte mit MMP-2-Kompetitor und MMP-1Primern nach PCR ein Signal in der Gelelektrophorese erzeugt werden. 3.2 MMP-1-mRNA-Expression Durch kompetitive RT-PCR wurden die mRNA-Konzentrationen von MMP-1, MMP-2 und GAPDH in den Endometriumproben zum Zeitpunkt der Transplantation und im Verlauf der Kultivierung auf der CAM ermittelt. Die abgebildeten Gelelektrophoresen (s. Abb. 9-11) zeigen repräsentative Resultate der kompetitiven PCR. M Abb. 9 MMP-1 MMP-1 (485 bp) Komp (438 bp) MMP-2 (401bp) M Kompetitor ( 320 bp) Abb. 10 MMP-2 40 GAPDH (256 bp) M Kompetitor (213 bp Abb. 11 GAPDH Abb. 9, 10 und 11: Agarosegele mit PCR-Produkten von der kompetitiven PCR. Die oberen Banden entsprechen der cDNA, die von der Endometriumprobe stammt. Die unteren Banden entsprechen dem jeweiligen Kompetitor in einer 1:2 Verdünnungsreihe. Die Pfeile zeigen den Äquivalenzpunkt an, an dem gleiche Mengen an cDNA und Kompetitor vorhanden sind. M: 100 bp DNA-Molekulargewichtsstandard Die Konzentration der MMP-1- und MMP-2-mRNA wurde zu der Konzentration der ebenfalls bestimmten humanen GAPDH-mRNA normiert. Die Expression dieses sogenannten „housekeeping gene“ ist während des gesamten Menstruationszyklus konstant (Wolber et al. 2002). Es wurde dadurch die Expression von MMP-1- und MMP-2-mRNA zu einem spezifisch humanen Parameter ins Verhältnis gesetzt und die ermittelte MMP-1- und MMP-2mRNA pro GAPDH-mRNA angegeben. So konnten unterschiedlich große mRNA-Mengen, hervorgerufen durch unterschiedlich große von der CAM explantierten Endometriumimplantate miteinander verglichen werden. Direkt nach der Probengewinnung, d. h. zum Zeitpunkt 0 im Zeitverlauf fand sich am eutopen Endometrium von 6 gesunden Patientinnen (Gruppe A) nur in zwei Proben MMP-1-mRNA in einer Expression von 0,1 bzw. 0,217 amol MMP-1-mRNA pro amol GAPDH-mRNA. Im eutopen Endometrium von 4 Patientinnen mit nachgewiesener Endometriose (Gruppe B) war nur in einer Probe eine geringe Expression von MMP-1-mRNA von maximal 0,0542 amol MMP-1-mRNA pro amol GAPDH-mRNA nachzuweisen. Bei alleiniger Berücksichtigung der Mediane zeigte sich sowohl in Gruppe A als auch in Gruppe B keine MMP-1-mRNA-Expression. 41 Nach 24- und 72-stündiger Kultur auf der CAM kam es in allen Zeitverläufen zu einem deutlichen Anstieg der MMP-1-mRNA-Expression, welcher aber weder in Gruppe A noch in Gruppe B statistisch signifikant war. Es fand sich ein signifikanter Anstieg der Expression von MMP-1-mRNA verglichen zum Zeitpunkt 0 in der Probengruppen A (ohne Endometriose) nach 48h (p = 0,036) und nach 96h (p = 0,039). In der Probengruppe B (mit Endometriose) waren die Anstiege der MMP-1-mRNAExpression nach 48 und 96h aufgrund der geringen Anzahl von nur 4 Proben statistisch nicht signifikant (siehe Tabelle 7 und 8). Der ungebundene T-Test zeigte keinen signifikanten Unterschied der MMP-1-mRNAExpression im Endometrium von Gruppe A und Gruppe B (p = 0,446 ). Es wurde daher der MMP-1-mRNA-Expressionsanstieg im Endometrium im Gesamtkollektiv (Gruppe A und Gruppe B) ermittelt. Hier ergab sich ein statistisch signifikanter Anstieg im Zeitverlauf (p< 0,05) nach 24h, 48h, 72h und 96h (siehe Tab. 9). Proben von Patientinnen ohne Endometriose (Gruppe A) Zeit MMP-1-mRNA/GAPDHmRNA-Ratio in h Median Minimum Maximum Signifikanz 0 0 0 0,217 des Anstiegs 24 2,965 0,362 173,522 p = 0,121 48 5,423 0 54,234 p = 0,036 72 13,559 0 144,625 p = 0,094 96 6,552 0 48,815 p = 0,039 Tab. 7 42 Proben von Patientinnen mit Endometriose (Gruppe B) Zeit MMP-1-mRNA/GAPDH-mRNA-Ratio in h Median Minimum Maximum Signifikanz 0 0 0 0,0542 des Anstiegs 24 3,584 0 43,386 p = 0,183 48 7,866 0 217,007 p = 0,142 72 30,418 0,651 162,755 p = 0,199 96 17,198 10 72,046 p = 0, 165 Tab. 8 0 24 48 72 96 Zeit in Stunden Abb. 12: Konzentration von MMP-1-mRNA nach 0h, 24h, 48h, 72h, 96h Kultivierung auf der CAM. Die Werte für die MMP-1-mRNA-Expression sind auf den GAPDH-Gehalt der einzelnen Proben normiert. Boxplot zeigt den Median mit 25er und 75er Perzentile, Fehlerbalken entsprechen der 10er und 90er Perzentilen 43 Signifikanzen der MMP-1Zeitverlauf in h Mediane mRNA-Expression von Gruppe A und B 24 3,244 p = 0,046 48 5,423 p = 0,006 72 14,463 p = 0,031 96 6,552 p = 0,027 Tab. 9 5.2. MMP-2-mRNA-Expression MMP-2-mRNA ließ sich zum Zeitpunkt 0 in allen Proben nachweisen. Es zeigte sich ein Median von 1,52 (0,069-6,5) amol MMP-2-mRNA/amol GAPDH-mRNA in der Gruppe A und von 0,287 (0-5,78) amol MMP-2-mRNA/amol GAPDH-mRNA in der Gruppe B. Somit fand sich in den Endometriumproben vor Transplantation auf die CAM für MMP-2-mRNA eine deutliche Expression im Gegensatz zur MMP-1-mRNA. Nach Transplantation auf die CAM war MMP-2-mRNA im Zeitverlauf in beiden Gruppen weiterhin nachweisbar (s. Tab. 10 und 11). Es kam aber nach 24h, 48h und 72h in beiden Gruppen zu keiner signifikanten Änderung im Vergleich zur MMP-2-mRNA Expression zum Zeitpunkt 0. Die MMP-2-mRNA-Expression blieb somit konstant. Nach 96h kam es nur in der Gruppe A mit einem Median von 5,59 ( 0-32,51) amol MMP-2mRNA/amol GAPDH-mRNA zu einem statistisch signifikanten Expressionsanstieg (p = 0,036). Bezüglich der Gruppe A und B ließen sich keine statistisch signifikanten Unterschiede bei der Expression von MMP-2-mRNA nachweisen (p = 0,058). Es wurde daher auch der MMP-2-mRNA-Expressionsanstieg im Endometrium im Gesamtkollektiv (Gruppe A und Gruppe B) ermittelt. Hier ergab sich ein statistisch signifikanter Anstieg im Zeitverlauf (p< 0,05) nach 96 h (siehe Tab. 12). 44 Proben von Patientinnen ohne Endometriose (Gruppe A) Zeit in h MMP-2-mRNA/GAPDH-mRNA-Ratio Median Minimum Maximum Signifikanz 0 1,518 0,069 6,504 des Anstieges 24 1,590 0,014 11,561 p = 0,134 48 4,336 0,347 46,244 p = 0,186 72 3,524 0 28,899 p = 0,143 96 5,059 0 32,511 p = 0,036 Tab. 10 Proben von Patientinnen mit Endometriose (Gruppe B) Zeit MMP-2-mRNA/GAPDH-mRNA-Ratio in h Median Minimum Maximum Signifikanz 0 0,287 0 5,781 des Anstieges 24 1,887 0 5,781 p = 0,164 48 3,740 0 69,366 p = 0,153 72 6,467 0 86,749 p = 0,143 96 7,879 0 86,749 p = 0,182 Tab. 11 45 0 24 48 72 96 Zeit in Stunden Abb. 13: Konzentration von MMP-2-mRNA nach 0h, 24h, 48h, 72h, 96h Kultivierung auf der CAM. Die Werte für die MMP-2-mRNA-Expression sind auf den GAPDH-Gehalt der einzelnen Proben normiert. Boxplot zeigt den Median mit 25er und 75er Perzentile, Fehlerbalken entsprechen der 10er und 90er Perzentilen Signifikanzen der MMP-2Zeitverlauf in h Mediane mRNA-Expression von Gruppe A und B 24 1,8865 p = 0,373 48 4,336 p = 0,067 72 4,119 p = 0,0503 96 5.059 p = 0,034 Tab. 12 46 4 Diskussion MMP-1-mRNA war nur in drei Proben zum Zeitpunkt 0h nachweisbar. 48h und 96h nach Transplantation kam es zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Expression in allen Proben. MMP-2-mRNA war zum Zeitpunkt der Transplantation in allen Proben nachweisbar. Nach 96 h kam es zu einem statistisch signifikanten Anstieg der MMP-2-mRNA-Expression in allen Proben. Sowohl für die Expression von MMP-1-, als auch von MMP-2-mRNA fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Proben der gesunden und der an Endometriose erkrankten Frauen. Wie sind diese Ergebnisse unter Berücksichtigung der publizierten Arbeiten zur Relevanz angiogenetischer Faktoren bei der Pathogenese der Endometriose zu bewerten ? Die retrograde Menstruation mit anschließender Implantation der Endometriumfragmente auf dem Peritoneum wird als Ursache für die Entstehung von peritonealen Endometrioseherden angenommen (Sampson 1927). Der genaue Mechanismus der Adhäsion der Endometriumzellen an den Mesothelzellen mit nachfolgender Implantation ist ungeklärt. Grundsätzlich müssen folgende Schritte stattfinden: zunächst kommt es zur Adhäsion der Endometriumzellen auf dem Mesothel. Anschließend folgt die Invasion des Mesothels durch die Endometriumzellen mit Bildung eines Implantates. Zuletzt muß eine Angiogenese zur ausreichenden Blutversorgung des Implantates stattfinden, da jedes proliferative Gewebe von mindestens 0,15-0,25 mm Größe auf eine Sauerstoffversorgung durch Blutgefäße angewiesen ist (Denekamp 1984). Bezüglich der Adhäsion konnten in Endometriumfragmenten aus der Bauchhöhle und in Mesothelzellen Adhäsionsmoleküle, wie E-Cadherin und Integrine nachgewiesen werden, welche möglicherweise bei der Interaktion von Endometriumzellen mit Mesothelzellen und von Endometriumzellen mit der EZM eine Rolle spielen (Van der Linden et al. 1994, Beliard et al. 1997, Witz et al. 1999). Der Nachweis der aktiven Invasion des Mesothels durch die Endometriumzellen gelang den Autoren Spuijbroek und Gaetje (Spuijbroek et al. 1992, Gaetje et al. 1995). Spuijbroek konnte eine signifikant erhöhte Konzentration des aminoterminalen Propeptids des Typ IIIProkollagens im Peritonealsekret von Frauen mit milder Endometriose im Vergleich zu gesunden Frauen nachweisen. Dieses Propeptid ist bei Prozessen mit aktiv invasivem Wachstum in den Extrazellulärraum erhöht und dient deswegen als Marker für eine Invasion. Auch Gaetje et al. fanden in Zellkulturen Hinweise für ein invasives Wachstum bei der 47 Entwicklung von Endometrioseherden. Bei Gaetjes Untersuchung zeigten sich erhöhte Invasionsindizes bei Zellen von peritonealen Endometrioseherden und bei Karzinomzellen aus Metastasen, im Vergleich zu Endometriumzellen von gesunden Frauen und nicht metastatischen Karzinomzellen (Gaetje et al. 1995). Bezüglich des angiogenetischen Potentials des humanen Endometriums liegen verschiedene Arbeiten vor. Nisolle et al. konnten eine erhöhte Gefäßdichte in der Region von peritonealen Endometrioseherden nachweisen (Nisolle et al 1993). Kressin et al. gelang es, den wichtigen Angiogenesekofaktor VEGF im eutopen und ektopen humanen Endometrium nachzuweisen. Die Autoren transplantierten humanes Endometrium von gesunden Frauen auf die Hühnerchorioallantoismembran und kultivierten die Proben auf der CAM über 72 h (Kressin et al. 2001a). Das humane Endometrium besitzt demnach das Potential zur Adhäsion, Invasion und kann Kofaktoren der Angiogenese exprimieren. Welche Bedeutung kommt den in dieser Arbeit auf mRNA-Ebene nachgewiesenen MMP-1 und MMP-2 zu? Bruner et al. konnten durch intrabadominale Injektion von humanen Endometriumfragmenten bei Nacktmäusen das Wachstum von peritonealen Endometrioseherden hervorrufen. Wurden die Nacktmäuse mit dem spezifischen MMPInhibitor TIMP-1 behandelt, entwickelten sich statt in 100% lediglich nur noch in 10% der Mäuse Endometrioseherde. Eine Inhibition des MMPS reduzierte in dieser Arbeit die Bildung von Endometriumimplantaten (Bruner et al. 1997). Nap et al. konnten die Bildung von Endometrioseherden nach Transplantation von humanen Endometrium auf die CAM durch Zugabe des industriell gefertigten MMP-Inhibitor III signifikant verringern (Nap et al. 2004). Die genannten Arbeiten lassen auf eine wichtige Rolle des MMPS bei der Pathogenese der Endometriose schließen. Invasion ist immer mit der Auflösung von Basalmembranen verbunden. Die Substrate der MMP-2 als Gelatinase sind die Basalmembranbestandteile Typ-IV-Kollagen, Laminin und Fibronektin (Curry et al. 2001). Der Abbau von Basalmembranen findet als physiologischer Prozeß bei der Implantation des Trophoblasten statt. Humane Trophoblasten können MMP-2 und MMP-9 bilden (Autio-Hermainen et al. 1992, Shimonovitz et al. 1994), wobei der stark invasiv wachsende Trophoblast im ersten Triminon der Schwangerschaft die größten Mengen dieser beiden Gelatinasen sezerniert (Polette et al. 1994). Patientinnen mit Präeklampsie zeigen nur eine oberflächliche Invasion des Zytotrophoblasten und eine Invasion in uterine Arteriolen findet so gut wie gar nicht statt. Bei diesen Patientinnen findet sich eine außergewöhnlich niedrige MMP-Expression in den Trophoblasten. Hieraus lässt sich eine 48 wichtige Rolle der Gelatinasen bei invasiven Prozessen im Endometrium ableiten (Hulboy et al. 1997). In der Sekretionsphase fand sich in der Arbeit von Freitas im humanen Endometrium der stärkste Anstieg von MMP-2 zwischen dem 25-28 und 1-2 Zyklustag (Freitas et al. 1999). In den durch retrograde Menstruation in die Bauchhöhle gelangten Endometriumfragmenten findet sich demnach eine hohe Konzentration von MMP-2, welche als Gelatinase Basalmembranbestandteile verstoffwechselt und die Vorraussetzung für das invasive Wachstum von Zellen schafft. In der vorliegenden Arbeit war MMP-2-mRNA in allen Endometriumproben zum Zeitpunkt der uterinen Gewebeentnahme nachweisbar und entsprach damit der in verschiedenen Arbeiten beschriebenen physiologischen MMP-2-Expression im Endometrium der Proliferationsphase (Curry et al. 2001, Freitas et al. 1999). Nach der Transplantation auf die CAM fand sich erst nach 96h ein signifikanter Anstieg der mRNA-Konzentration in den Endometriumproben. Der zunächst fehlende Anstieg der Expression von MMP-2-mRNA in den Proben auf der CAM im Zeitverlauf in dieser Arbeit widerspricht nicht den Ergebnissen aus der Arbeit von Freitas, welcher einen Anstieg der MMP-2-Menge am Zyklusende fand (Freitas et al. 1999). Schließlich wird bei der Kultivierung der Endometriumproben auf der CAM das Endometrium nicht dem lutealphasentypischen Anstieg des Progesteronserumspiegels mit anschließendem Progesteronserumspiegelabfall ausgesetzt. Alle in dieser Arbeit transplantierten Endometriumproben stammten aus der I. Zyklushälfte. In dieser Zyklusphase ist der Plasmaprogesteronspiegel niedrig und liegt bei durchschnittlich 120-150 pg/ml Progesteron. Nach Transplantation der Proben auf die CAM wurde die Progesteronkonzentration im CAM-Millieu in der vorliegenden Arbeit nicht bestimmt. Die Steroidhormonkonzentrationen der CAM wurden jedoch von Tanabe et al. untersucht. Die Autoren ermittelten auf der CAM Progesteronwerte von 150-185 pg/ml (Tanabe et al. 1986). Daraus lässt sich schließen, daß sich die Endometriumproben auf der CAM nach Transplantation in keinem signifikant unterschiedlichem endokrinen Millieu im Bezug auf das Progesteron als vor der Transplantation befanden und damit auch kein sprunghafter Anstieg der MMP-2-mRNA-Expression zu erwarten war. Progesteron gilt als potenter Inhibitor der Expression von MMP´s im humanen Endometrium (Lockwood et al. 1998). Singer et al. konnten aber an Fibroblasten-Kulturen aus humanem Endometrium zeigen, daß sich die MMP-2-mRNA-Expression nicht durch die Zugabe von Progesteron in das Kulturmedium erniedrigte. Auch die Konzentration von Pro-MMP-2 konnte nicht durch die Zugabe von Progesteron ins Kulturmedium gesenkt werden (Singer et 49 al. 1999). Trotzdem führen Progesteronserumkonzentrationen in der Lutealphase von über 10 ng/ml zu einer verringerten MMP-2-Aktivität im humanen Endometrium (Lockwood et al. 1998). Zur Erklärung muß der Mechanismus der Bildung von aktiven MMP-2 betrachtet werden. Schon die Autoren Murphy und Strongin wiesen in ihren Studien auf die Möglichkeit hin, daß die Lokalisation auf der Zelloberfläche die proteolytische Aktivität des Enzyms MMP-2 verstärkt (Murphy et al. 1992, Strongin et al. 1993). Als wichtiger membranständiger Aktivator der MMP-2 konnte durch Foda die Membran-Typ-1-MMP identifiziert werden. Diese spaltet durch Proteolyse aus der inaktiven Pro-MMP-2 die aktive MMP-2 ab (Foda et al. 1999). Progesteron inhibiert direkt die Membran-Typ-1-MMP im humanen Endometrium. So kommt es zu einer indirekten Inhibition der Bildung von aktivem MMP-2 durch Progesteron auf der Protein- und nicht auf der Transskriptionsebene (Zhang et al. 2000). In der vorliegenden Arbeit war das auf die CAM transplantierte Endometrium nicht dem physiologischen Progesteronentzug am Zyklusende ausgesetzt. Vielmehr waren die Progesteronwerte vor und nach der Transplantation gleichbleibend niedrig. Sowohl vor wie nach der Transplantation fand damit keine progesteronvermittelte Inhibition für MMP-2 auf Proteinebene statt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression bestimmt, aber nicht den posttranskriptionellen Veränderungen Rechnung getragen. Die Konzentration von aktiver MMP-2 wurden nicht bestimmt. Es fand sich kein sprunghafter Anstieg der MMP-2-mRNAExpression im Endometrium nach Transplantation auf die CAM. Aber es kam zu einem Anwachsen der Endometriumproben. Somit kann angenommen werden, daß die konstante Expression von MMP-2-mRNA zur Bildung von aktiver MMP-2 führte, welche wiederum zur Degradierung von Basalmembranen und damit für das invasive Wachstum der Endometriumzellen in die CAM von Bedeutung gewesen sein könnte. Dieser aktiven MMP-2 könnte wiederum durch ihre Interaktion mit Integrinen eine zusätzliche Bedeutung in der zellulären Invasion zukommen. Zelluläre Invasion wird durch eine Kombination aus Adhäsion, Migration und Proteolyse der extrazellulären Matrix ermöglicht (Lester and McCarthy 1992). Bei den Integrinen handelt es sich um Adhäsionsmoleküle in Form von Extrazellulärmatrix-Rezeptoren. Sie bestehen aus nicht kovalent gebundenen a und ß-Ketten, welche eine Reihe von Heterodimeren bilden. Diese extrazellulären Integrine sind bei der Zelladhäsion und Migration von Bedeutung (Hynes 1992). Dem Vitronektin-Rezeptor Integrin avß3 konnte sowohl in Melanomzellen bei der Bildung von Metastasen als auch in vaskulären Endothelzellen bei der Angiogenese eine wichtige Funktion zugeordnet werden (Filardo et al. 1995, Brooks et al. 1994b). Invasion erfordert die Auflösung der EZM. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß eine unkontrollierte 50 Degradierung der EZM den Invasionsprozeß stören kann, da die invadierenden Zellen spezifische Matrixbestanteile zur Existenz und zur Migration benötigen (Ruoslahti 1992, Montgomery et al. 1994). Es wurde die Hypothese der „kontrollierten“ Proteolyse aufgestellt, bei welcher eine Koordination der Adhäsion, Migration und EZM-Degeneration zu einer kontrollierten, zellulären Invasion führt. Dazu wurden Proteinasen gefordert, die auf bestimmten Regionen der Zelloberfläche lokalisiert sein sollten und mit Matrixrezeptoren interagieren (Albelda 1993, Mignatti and Rifkin 1993). Es gelang, auf der Zelloberfläche lokalisierte Proteinasen zu identifizieren. So fanden sich Urokinase-Plasminogenaktivator und MMP-2 auf der Oberfläche verschiedenster Zelltypen in vivo und in vitro (Emonard et al. 1992 und Blasi et al. 1993). Brooks et al. konnten 1996 eine Verbindung von MMP-2 mit Integrin avß3 auf der Zelloberfläche von angiogenetischen Endothelzellen und in Melanomzellen nachweisen (Brooks et al. 1996). Die Interaktion zwischen dem Integrin, welche die Zellmotilität auf der EZM ermöglicht, und der MMP-2 als Proteinase der EZM schien das Invasionspotential von Zellen zu fördern. Am eutopen humanen Endometrium und im Endometrium im Menstruationsblut konnten Van der Linden und Mitarbeiter die Expression von Integrinen nachweisen (Van der Linden et al. 1994). Somit könnte die beschriebene Interaktion zwischen Integrin und MMP-2 das Invasionspotential des in der vorliegenden Arbeit auf die CAM transplantierten humanen Endometriums weiter erhöhen. Der Erhalt der Homöostase einerseits und die kontrollierte Proteolyse der EZM andererseits ist eine notwendige Vorraussetzung sowohl für die Invasion der Mesothelzellschicht des Peritoneums durch Endometriumzellen und als auch für die Invasion der Endothelzellen in den Extrazellulärraum zur Angiogenese. Bei der Homöostase des Extrazellulärraums spielen die Kollagenasen des MMPS eine entscheidende Rolle (Curry et al. 2001). MMP-1 spaltet als Kollagenase fibrilläres Kollagen. Dadurch kommt es zu einer Destabilisierung der TripelHelix-Struktur des Kollagenmoleküls des Extrazellulärraumes. Dies führt zu einer Denaturierung des Kollagens in Gelatin, welches von einer großen Menge von Gewebsproteinasen unter anderem auch der Gelatinase MMP-2 abgebaut werden kann. So sind MMP-1 und MMP-2 z. B. kurz vor dem Eisprung an dem Ort der zukünftigen Follikelruptur signifikant erhöht nachweisbar (Tadakuma et al. 1993, Russel et al. 1995). Die Spaltung des fibrillären Kollagens ist demnach der Auftakt zur Lyse des Extrazellulärraumes. Kurz vor Beginn der Menstruation kommt es zu einem physiologischen Progesteronabfall im Serum. Dieser führt zu einem Anstieg der MMP-Konzentrationen, insbesondere auch der MMP-1 und -2-Konzentration im Endometrium (Hampton and Salamonson 1994). Es wird 51 demnach die Vorraussetzungen zur Lyse des Endometriums durch eine physiologische Hochregulierung der MMP´s geschaffen. MMP-1 scheint eine besonders wichtige Rolle in der Lyse des Endometriums zu spielen. So findet sich MMP-1-mRNA zu Beginn der Menstruation in Stromazellen nahe von in Abstoßung befindlichem Endometrium. Zunächst zeigt sich diese MMP-1-mRNA-Verteilung nur im Bereich der oberflächlichen Funktionalis, im weiteren Verlauf der Menstruation wurde in der gesamten Funktionalis MMP-1-mRNA exprimiert (Hulboy et al. 1997). In den menstruierten Endometriumfragmenten finden sich weiterhin große Mengen von MMP-1. So konnten Koks et al. im antegrad menstruiertem Endometrium hohe Konzentrationen von MMP-1 nachweisen (Koks et al. 2000). Im Endometrium vor Kultivierung auf der CAM konnte in der vorliegenden Arbeit nur bei einer Patientin mit Endometriose und bei je zwei Patientinnen ohne Endometriose MMP-1mRNA in geringer Konzentration nachgewiesen werden. Dies entspricht dem physiologischen MMP-1-Verlauf im eutopen Endometrium, wie er von Salamonsen et al. und Marbaix et al. 1995 beschrieben wurde. Hiernach findet sich MMP-1 am eutopen Endometrium nur in der perimenstruellen Zyklusphase (Salamonsen et al. 1996, Marbaix et al. 1995). Die drei Patientinnen bei denen die Endometriumproben eine geringe MMP-1-mRNA-Expression zeigten, befanden sich in der Proliferationsphase. Wegen der hohen Sensitivität der RT-PCR konnte möglicherweise in der vorliegenden Arbeit MMP-1-mRNA in geringer Konzentration in dieser Zyklusphase nachgewiesen werden, wo die in den bisherigen Studien angewandte Northern blot-Technik als weniger sensitive Methode keine Expression zeigten. Das auf die CAM transplantierte Endometrium zeigte einen sprunghaften Anstieg der MMP1-mRNA-Expression schon nach 24-stündiger Kultivierung. Dieser Anstieg der MMP-1mRNA-Expression setzte sich bis zu 72 h nach Kultivierung auf der CAM fort, um dann wieder etwas abzufallen. Dieser Verlauf der MMP-1-mRNA-Expression war sowohl bei den Proben von Patientinnen ohne als auch mit nachgewiesener Endometriose zu messen. Es gab zwischen den beiden Probenkontingenten keine signifikanten Unterschiede in der MMP-1mRNA-Expression. Die Transplantation von eutopen Endometriumfragmenten auf die CAM soll die Situation der retrograden Menstruation von Endometriumfragmenten mit Implantation auf das Peritoneum simulieren. In verschiedenen In-vitro-Studien wurde Progesteron als potenter Inhibitor der endometrialen MMP-1-mRNA-Expression identifiziert. Lockwood et al. konnte in Zellkulturen von humanen, endometrialen Zellen eine Verstärkte Expression von MMP-1mRNA durch Progesteronentzug oder Gabe von RU 486 als starkem Antiprogesteron provozieren. Auf Proteinebene fand sich ein 5-facher Anstieg von Pro-MMP-1 innerhalb von 52 4 Tagen Kultivierungszeit nach Zugabe von RU 486, während erst nach 4-8 Tagen Kultivierung unter Progesteronentzug ein ähnlich kräftiger Pro-MMP-1-Anstieg zu verzeichnen war (Lockwood et al. 1998). Singer et al. konnte gleichfalls an FibroblastenZellkulturen aus humanem Endometrium den hemmenden Einfluß des Progesterons auf die Expression von MMP-1-mRNA und die Synthese des Enzyms darstellen. Es zeigten sich deutliche Anstiege der MMP-1-mRNA-Expression und der Enzymproduktion, wenn das Progesteron-haltigem Kulturmedium gegen ein Progesteron-freies Medium ausgetauscht wurde. Es wurde bereits erläutert, daß die auf die CAM transplantierten Endometriumproben im Bezug auf die Progesteronkonzentration vor und nach Transplantation einem gleichbleibend progesteronarmen Millieu ausgesetzt waren. Trotzdem kam es zu einem Anstieg der MMP-1mRNA-Expression gepaart mit einem Einwachsen des Transplantates in die CAM. Nach 96 h war das Implantat vital und wurde über ein konzentrisch auf das Implantat zuwachsendes Gefäßnetz mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt. Zu diesem Zeitpunkt fand sich eine abfallende aber immer noch deutliche Expression der MMP-1-mRNA. Ein möglicher Stimulus des Anstiegs der MMP-1-mRNA nach Transplantation könnten lokale Zytokine im transplantierten Endometrium sein. Interleukine, insbesondere Interleukin (IL)-1a und transforming growth-factor (TGF) konnten in Stromazellen, epithelialen Zellen und endothelialen Stromazellen des humanen Endometrium nachgewiesen werden. IL-1a findet sich im Zytoplasma endometrialer Drüsenzellen spezifisch in der Proliferationsphase (Tabibzadeh et al. 1992). Auch Tumornekrosefaktor (TNF)-a konnte in endometrialen Stromazellen in der Proliferationsphase nachgewiesen werden (Tabizadeh et. al 1991). Die in der vorliegenden Arbeit auf die CAM transplantierten Endometriumproben stammten von Patientinnen in der ersten Zyklushälfte, so daß das Vorliegen der Zytokine IL-1a und TNF-a in den Proben angenommen werden darf. In der bereits zitierten Arbeit von Singer et al. wurde in humanen endometrialen Fibroblasten durch Zugabe der Zytokine IL-1a und TNF-a eine kräftige MMP-1-mRNA-Expression hervorgerufen. Auffallend war, daß durch eine kombinierte Zugabe beider Zytokine die MMP-1-mRNA-Expression noch weiter gesteigert werden konnte (Singer et al. 1999). Diese MMP-1-mRNA-Expression konnte in der Arbeit von Singer ohne vorherige Progesteronexposition und nachfolgendem Progesteronentzug hervorgerufen werden. Somit waren die endometrialen Fibroblasten in der Zellkultur von Singer et al. einem vergleichbar progesteronarmen Millieu ausgesetzt, wie das in der vorliegenden Arbeit kultivierte Endometrium auf der CAM. Durch Zugabe der beiden Zytokine fand sich in den Fibroblasten ein rascher Anstieg der MMP-1-Expression innerhalb 53 der ersten 24h welcher über 48h konstant hoch blieb. Länger als 48h wurde die MMP-1mRNA-Expression nicht beobachtet. Es finden sich Parallelen in der Expression von MMP-1-mRNA in der vorliegenden Arbeit mit der Expression in der Studie von Singer et al.. Möglicherweise könnten demnach die genannten Zytokine bei der Expression von MMP-1-mRNA in den auf die CAM transplantierten Endometriumproben bei fehlendem Progesteronentzugsstimulus eine ursächliche Rolle spielen. Diese These wird durch die Arbeit von Hudelist et al. gestützt, die in peritonealen Endometrioseläsionen eine erhöhte Konzentration von IL-1a kombiniert mit einer erhöhten MMP-1-Proteinexpression im Vergleich zum eutopen Endometrium nachweisen konnten (Hudelist et al. 2005). Es fand sich in den auf der CAM kultivierten Endometriumproben eine starke Expression von MMP-1-mRNA. Die Kollagenase MMP-1 schafft über die Lyse des fibrillären Kollagens des Extrazellulärraumes die Voraussetzung zur Invasion der endometrialen Endothelzellen in die CAM. Dadurch ist die MMP-1 auch an der Neoangiogenese bei Tumoren beteiligt (Brooks et al. 1996, Ribatti et al. 1999, Karelina et al. 2001). Die Notwendigkeit einer ausreichenden Angiogenese zur Gewährleistung der Sauerstoffversorgung eines Implantates einer gewissen Größe wurde von Denekamp et al. beschrieben (Denekamp et al. 1984). Nach Transplantation der Endometriumproben auf die CAM konnte eine konzentrisch auf das Implantat zuwachsende Vaskularisation beobachtet werden. Die während der Kultivierung der Endometriumproben auf der CAM beobachtete Vaskularisation könnte mit der physiologischen Angiogenese der CAM in Verbindung stehen oder in Folge einer Entzündungsreaktion auf das gewebefremde Implantat entstanden sein. Da die CAM auch für die Kultivierung anderer Gewebe außer dem humanen Endometrium genutzt wurde, konnte gezeigt werden, daß nicht jedes auf die CAM transplantierte Gewebe in gleichem Maße eine Angiogenese induziert. Spanel-Borowski transplantierte Organgewebeproben von Goldhamstern auf die CAM und konnte nur mit ovariellem Gewebe eine verstärkte Vaskularisation induzieren (Spanel-Borowski 1989). Die Studie von Maas et al. bestätigte die CAM als Modell zur Studie der Endometrium-induzierten Angiogenese: Maas et al. verglichen den Gefäßdichteindex von Endometriumgewebe und Mausdermis nach Transplantation auf die CAM. Es konnte nur durch die Transplantation von Endometrium ein statistisch signifikanter Anstieg des Gefäßdichteindexes erreicht werden (Maas et al. 1999). Unspezifischen Entzündungsreaktionen auf der CAM kann durch eine Transplantation von Gewebe in der frühen Entwicklungsphase der CAM (Tag 10) vorgebeugt werden, da zu diesem Zeitpunkt das Immunsystem der CAM noch unreif ist. Insofern kann die beobachtete 54 Vaskularisation auf der CAM in der vorliegenden Arbeit als durch das transplantierte Endometrium induziert angesehen werden. Die Angiogenese wird durch ein komplexes Zusammenspiel verschiedenster Faktoren gesteuert. Damit eine Endothelzelle aussprossen kann, muß die Basalmembran des Endothels aufgelöst werden. Hierzu Bedarf es einer Gelatinase, wie MMP-2. Zum weiteren Einsprossen muß die EZM durch Proteolyse aufbereitet werden (Aznavoorian et al. 1993). Dafür werden Kollagenasen wie MMP-1. benötigt. Es darf angenommen werden, daß der gemessene Expressionsanstieg von MMP-1-mRNA und die zunächst konstante, nach 96h ansteigende Expression von MMP-2-mRNA zusammen mit einer Vielzahl anderer im transplantierten Endometrium exprimierten Faktoren auch für die Induktion der Angiogenese auf der CAM verantwortlich sind. Der Stimulus zur Induktion der Angiogenese durch das transplantierte Endometrium könnte die Hypoxie im Endometriumfragment sein. Der physiologische Mechanismus zur Stimulation der Expression von MMP-1 und aktiver MMP-2, nämlich der Abfall des prämenstruellen Progesteronserumspiegels konnte in dieser Arbeit aus bereits dargelegten Gründen nicht wirksam werden. Die vorliegende Arbeit demonstriert gemäß der Sampson´schen Theorie der retrograden Menstruation ein dynamisches Modell der Endometriose, an dem die Implantation von Endometriumfragmenten mit der Ausbildung von peritonealen Endometrioseherden untersucht werden kann. Der Nachweis der MMP-1-mRNA- und MMP-2-mRNAExpressionen im transplantierten Endometrium stützt die These, daß retrograd menstruiertes Endometrium das Potential zur Adhäsion, Invasion und Induktion einer Angiogenese besitzt. Anderen Untersuchern gelang es, signifikante Unterschiede zwischen der Expression von angiogenetischen Faktoren im Endometriumgewebe von gesunden Frauen und von Patientinnen mit Endometriose darzustellen: Donnez et al. konnten den Angiogenesekofaktor VEGF in erhöhter Konzentration im ektopen und eutopen Endometrium von Frauen mit Endometriose im Vergleich zu gesunden Frauen nachweisen (Donnez et al. 1998). Chung et al. zeigten, daß eutopes und ektopes Endometrium von Endometriosepatientinnen signifikant weniger TIMP-3-mRNA enthält (Chung et al. 2001). Cox et al. fanden im Rattenmodel erhöhte MMP-3-Spiegel nur im ektopen Endometrium im Vergleich zu eutopen Endometrium (Cox et al. 2001). Während Ramon et al. auch im eutopen Endometrium der Sekretionsphase von Endometriosepatientinnen eine erhöhte Expression von MMP-3-mRNA und UrokinaseTyp Plasminogen Aktivator (uPA) im Vergleich zu gesunden Frauen nachweisen konnte (Ramon et al. 2004). Diese Untersuchungen lassen auf eine gestörte Regulation des Metabolismus der EZM und der Angiogenese bei Endometriosepatientinnen schließen. In der 55 vorliegenden Arbeit konnte kein signifikanter Unterschied der Expression von MMP-1mRNA und MMP-2-mRNA im transplantierten Endometrium von gesunden und endometriosekranken Frauen dargestellt werden. Gescher et al. untersuchten die Expression von VEGF ebenfalls im auf die CAM transplantierten humanen Endometrium der Proliferationsphase. Auch in ihrer Arbeit zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Expression von VEGF nach 24h und 72h Kultivationszeit. Ein Unterschied in der VEGF-Expression von Patientinnen mit und ohne Endometriose fand sich aber auch in dieser Arbeit nicht (Gescher et al. 2005). Sowohl in der vorliegenden Arbeit als auch in der Arbeit von Gescher et al. sind die Endometriumproben in der Proliferationsphase gewonnen worden. In der bereits zitierten Arbeit von Ramon et al zeigte sich im Endometrium der Proliferationsphase ebenfalls kein Unterschied der MMP-3-mRNA-Expression zwischen Endometriosepatientinnen und der gesunden Kontrollgruppe. Uzan et al fanden sogar eine fehlende Nachweisbarkeit von MMP3 in immunhistochemischen Untersuchungen von Proliferationsphasenendometrium von Endometriosepatientinnen im Gegensatz zu einer deutlichen Nachweisbarkeit bei gesunden Frauen (Uzan et al. 2004). Die Ergebnisse der zitierten Arbeiten und der vorliegenden Arbeit lassen den Schluß zu, daß das Endometrium der Proliferationsphase von Endometriosepatientinnen sich nicht von dem gesunder Patientinnen unterscheidet. Möglicherweise erfolgt die entscheidende Stimulation zur pathologischen Steigerung des angiogenetischen Potentials erst in der zweiten Zyklushälfte. In der Sekretionsphase wird die Expression angiogeneserelevanter Faktoren wie den MMP`s und dem VEGF durch hohe Progesteronspiegel gehemmt. Trotzdem konnten Ramon et al. und Donnez et al. erhöhte MMP bzw. VEGF-Spiegel im Endometrium der Sekretionsphase von Endometriosepatientinnen nachweisen. Somit scheint eine verminderte Hemmwirkung des Progesterons auf die genannten proangiogenetischen Faktoren vorzuliegen. Bruner et al. konnten eine derartig verminderte Hemmwirkug des Progesterons auf die MMP3- und MMP-7-Expression an Endometriumproben von Endometriosepatientinnen in folgender Untersuchung zeigen: Es wurden Endometriumproben von Endometriosepatientinnen und von gesunden Frauen mit Östrogen und Progesteron in vitro inkubiert und anschließend in die Peritonealhöhle von Nacktmäusen injiziert. Es zeigte sich im Gegensatz zu den Proben der gesunden Frauen keine Suppression von MMP-3 und MMP7 und es entwickelten nur die Nacktmäuse Endometrioseherde, welche das Endometrium der Endometriosepatientinnen erhalten hatten. Wurden die Endometriumproben der Endometriosepatientinnen außer mit Östrogen und Progesteron zusätzlich mit Retinolsäure 56 und TGF-ß behandelt, fand sich eine deutlich verringerte MMP-3- und 7-Expression und eine geringere Bildung von Endometrioseherden nach intraabdominaler Injektion. (Bruner et al. 1997). Eine Blockade der TGF-ß2-Expression durch einen spezifischen Antikörper gegen TGF-ß2 führte trotz Progesterongabe zu einer überschießenden MMP-Expression und zur Ausbildung von peritonealen Endometrioseherden nach Injektion in die Bauchhöhle von Nacktmäusen (Bruner-Tran et al. 2002). Osteen et al konnten in ihrer Arbeit eine verminderte progesteronvermittelte Hemmung der MMP-3-Expression im Endometrium der Sekretionsphase von Endometriosepatientinnen nachweisen. Ursächlich für diese verminderte Progesteronsensitivität war eine verminderte Expression von Retinolsäure aus Stromazellen und eine damit verbundene geringere Expression von TGF-ß2. Die Blockade des TGF-ß2 führte zum kräftigsten Anstieg der MMP-Expression (Osteen et al. 2005). Als natürlicher endogener Inhibitor für TGF-ß2 konnte endometrial bleeding-associated factor (EBFA) identifiziert werden (Kothapalli et al. 1997). Tabizadeh et al. fanden eine inadäquate Expression von EBFA im Endometrium von infertilen Frauen mit Endometriose (Tabizadeh et al. 2000). Endometriosepatientinnen zeichnen sich demnach durch einen gestörten Mechanismus der Progesteron-vermittelten MMP-Hemmung aus. Zusätzlich konnten Igarashi et al. eine Veränderung der Expression von Progesteronrezeptorisotypen am Endometrium von Endometriosepatientinnen nachweisen (Igarashi et al. 2005). Das Verhältnis von Progesteronrezeptor-A (PR-A) zu Progestreonrezeptor-B (PR-B) war vermindert. PR-A gilt als Repressor für die über PR-B vermittelte Progesteronwirkung (Attia et al. 2000). Aus den zitierten Arbeiten kann auf eine multifaktorielle Regulationsstörung des MMPS im humanen Endometrium von Endometriosepatientinnen geschlossen werden. Weitere Untersuchungen müssen folgen, um die Bedeutung der Faktoren, die an der Regulation der Angiogenese in peritonealen Endometrioseherden beteiligt sind, weiter zu erforschen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß das Endometrium/CAM-Modell zur Endometrioseforschung geeignet ist, da mit der Expression von MMP-1-mRNA und MMP-2mRNA zwei angiogenetisch relevante Faktoren auf mRNA-Ebene im ektopen auf die CAM transplantierten Endometrium nachgewiesen werden konten. Diese Arbeit setzt damit die Arbeiten von Maas et al. über die Korrelation der induzierten Angiogenese mit der Expression angiogeneserelevanter Faktoren im ektopen Endometrium (Maas et al. 1999) und die Arbeit von Kressin et al. über die Expression des angiogeneserelevanten Faktors VEGF auf mRNAEbene im ektopen Endometrium fort (Kressin et al. 2001b). Auch die Angiopoietine 1 und 2 konnten im auf die CAM transplantierten Endometrium nachgewiesen werden (Drenkhahn et al. 2004). Zusammen mit den genannten Vorarbeiten konnte gezeigt werden, daß mit dem 57 Endometrium/CAM-Modell unter Verzicht auf Tierversuche die Expression angiogeneserelevanter Faktoren und deren Modulation kostengünstig untersucht werden kann. Der besondere Vorteil des Modells liegt in der Möglichkeit, die Angiogenese als dynamischen Prozeß kontinuierlich beobachten zu können. Zusätzlich kann durch die technisch einfache Applikation Angiogenese-modulierender Substanzen z. B. TIMP, anti-VEGF etc. die Interaktion der auf der CAM untersuchten Parameter gezielt beeinflusst werden. Damit besteht die Möglichkeit, Erkenntnisse zur Pathogenese der Endometriose zu gewinnen und Therapieprinzipien auf der CAM zu erproben. 5 Zusammenfassung Die Endometriose ist mit einer Prävalenz von 5-28% eine der häufigsten benignen Erkrankungen der prämenopausalen Frau mit schweren Komplikationen, wie Infertilität und chronische Schmerzen. Nach der allgemein anerkannten Theorie nach Sampson entsteht Endometriose durch retrograde Menstruation von Endometriumfragmenten, welche sich auf dem Peritoneum implantieren und die Bildung von Gefäßnetzen zur Versorgung des Implantates induzieren. Retrograde Menstruation findet sich bei 90% aller Frauen. Trotzdem leiden nur knapp 30% aller Frauen unter Endometriose. In vorangehenden Arbeiten fanden sich Hinweise für eine erhöhte Expression von angiogenetischen Faktoren und erhöhte Invasionsindizes im Endometrium von Endometriosepatientinnen. Eine wichtige Voraussetzung für invasives Wachstum und für die Angiogenese ist die Veränderung der Extrazellulärmatrix (EZM) durch Proteolyse. Die Schlüsselenzyme sowohl für die Homöostase als auch für den Abbau der EZM sind die Matrixmetalloproteinasen (MMP`s). In der vorliegenden Arbeit wurde die Chorioallantoismembran (CAM) des Hühnerembryos als Kurzzeitgewebekultur für humanes Endometrium genutzt, um die mRNA-Expression von MMP-1 und MMP-2 zu untersuchen. Es wurden die Konzentrationen von MMP-1- und -2 mRNA durch Reverse Transkriptase und kompetitive PCR in Endometriumproben aus dem Cavum uteri von 10 Frauen vor und nach 24-, 48- ,76- und 96-stündiger Kultivierung auf der CAM bestimmt. 4 der 10 Proben stammten von Patientinnen mit peritonealer Endometriose. Zum Zeitpunkt der Gewebsentnahme (Zeitpunkt 0) fand sich nur in wenigen Proben eine geringe MMP-1-mRNA-Expression. Es zeigte sich ein statistisch signifikanter Anstieg der MMP-1-mRNA-Expression im Zeitverlauf nach 24h, 48h, 72h und 96 Stunden. MMP-2mRNA ließ sich zum Zeitpunkt 0 in allen Proben nachweisen. Nach 96h fand sich ein statistisch signifikanter Anstieg der MMP-2-mRNA-Expression. Sowohl für die MMP-1- als 58 auch für die MMP-2-mRNA-Expression konnte zwischen den Proben der gesunden Frauen und der Endometriosepatientinnen kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Die vorgelegte Arbeit zeigt, daß die Kultivierung von humanem Endometrium auf der CAM ein geeignetes in ovo-Modell ist, die intraperitonealen Vorgänge der Vaskularisation und die Expression von angiogenetischen Faktoren in Endometrioseherden zu erforschen. Es konnten zwei Faktoren, die sowohl bei der Invasion des Endometriums in das Peritoneum, als auch für die Vaskularisation der Implantate von Bedeutung sind, im humanen Endometrium nach Transplantation nachgewiesen werden. MMP-1 und MMP-2 spielen somit in dem genannten Zusammenhang bei der Pathogenese der Endometriose eine wichtige Rolle. 59 5 Zusammenfassung Die Endometriose ist mit einer Prävalenz von 5-28% eine der häufigsten benignen Erkrankungen der prämenopausalen Frau mit schweren Komplikationen, wie Infertilität und chronische Schmerzen. Nach der allgemein anerkannten Theorie nach Sampson entsteht Endometriose durch retrograde Menstruation von Endometriumfragmenten, welche sich auf dem Peritoneum implantieren und die Bildung von Gefäßnetzen zur Versorgung des Implantates induzieren. Retrograde Menstruation findet sich bei 90% aller Frauen. Trotzdem leiden nur knapp 30% aller Frauen unter Endometriose. In vorangehenden Arbeiten fanden sich Hinweise für eine erhöhte Expression von angiogenetischen Faktoren und erhöhte Invasionsindizes im Endometrium von Endometriosepatientinnen. Eine wichtige Voraussetzung für invasives Wachstum und für die Angiogenese ist die Veränderung der Extrazellulärmatrix (EZM) durch Proteolyse. Die Schlüsselenzyme sowohl für die Homöostase als auch für den Abbau der EZM sind die Matrixmetalloproteinasen (MMP`s). In der vorliegenden Arbeit wurde die Chorioallantoismembran (CAM) des Hühnerembryos als Kurzzeitgewebekultur für humanes Endometrium genutzt, um die mRNA-Expression von MMP-1 und MMP-2 zu untersuchen. Es wurden die Konzentrationen von MMP-1- und -2 mRNA durch Reverse Transkriptase und kompetitive PCR in Endometriumproben aus dem Cavum uteri von 10 Frauen vor und nach 24-, 48- ,76- und 96-stündiger Kultivierung auf der CAM bestimmt. 4 der 10 Proben stammten von Patientinnen mit peritonealer Endometriose. Zum Zeitpunkt der Gewebsentnahme (Zeitpunkt 0) fand sich nur in wenigen Proben eine geringe MMP-1-mRNA-Expression. Es zeigte sich ein statistisch signifikanter Anstieg der MMP-1-mRNA-Expression im Zeitverlauf nach 24h, 48h, 72h und 96 Stunden. MMP-2mRNA ließ sich zum Zeitpunkt 0 in allen Proben nachweisen. Nach 96h fand sich ein statistisch signifikanter Anstieg der MMP-2-mRNA-Expression. Sowohl für die MMP-1- als auch für die MMP-2-mRNA-Expression konnte zwischen den Proben der gesunden Frauen und der Endometriosepatientinnen kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Die vorgelegte Arbeit zeigt, daß die Kultivierung von humanem Endometrium auf der CAM ein geeignetes in ovo-Modell ist, die intraperitonealen Vorgänge der Vaskularisation und die Expression von angiogenetischen Faktoren in Endometrioseherden zu erforschen. Es konnten zwei Faktoren, die sowohl bei der Invasion des Endometriums in das Peritoneum, als auch für die Vaskularisation der Implantate von Bedeutung sind, im humanen Endometrium nach Transplantation nachgewiesen werden. MMP-1 und MMP-2 spielen somit in dem genannten Zusammenhang bei der Pathogenese der Endometriose eine wichtige Rolle. 60 6 Literaturverzeichnis Albelda SM (1993) Role of integrins and other cell adhesion molecules in tumor progression and metastasis. Lab Invest 68:4-17 American Society for Reproductive Medicine (1997) Revised American Society for Reproductive Medecine classification of endometriosis. Fertil Steril 67:817-821 Attia GR, Zeitoun K, Edwards D, Johns B, Carr BR, Bulun SE (2000) Progesteron Receptor Isoform A But Not B Is Expressed in Endometriosis. J Clin End & Metab 85/8:2897-2902 Augustin HG, Kuhn W (1999) Zyklische Angiogeneseprozesse im Ovar. Vorraussetzung für ungestörte Reproduktionstätigkeit und experimentelles Modell für tumorangiogene Prozesse. Gynäkologe 32: 582-589 Ausprunk DH, Knighton DR, Folkman J (1975) Vascularization of normal and neoplastic tissue grafted to the chick chorioallantois. Role of host and pre-existing graft blood vessels. Am J Pathol 79: 597-628 Autio-Harmainen H, Hurskainen T, Niskasaari K, (1992) Simultaneous expression of 170 kilodalton type IV collagenase and type IV a–1(IV) chain genes by cells of early human placenta and gestional endometrium. Lab. Invest. 67: 191-200 Aznavoorian S, Murhy AN, Stetler-Stevenson WG, Liotta L (1993) Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis. Cancer 71:1368-1383 Bagavandoss P (1998) Differential distribution of gelatinases and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in the rat ovary. J Endocrinol 158:221-228 Becker CM, Bartley J, Mechsner S, Ebert AD, (2004) Angiogenese und Endometriose Zentralbl Gynäkol 126:252-258 61 Beliard A, Donnez J, Nisolle M, Foidart JM (1997) Localization of laminin, fibronectin, Ecadherin and integrins in endometrium and endometriosis. Fertil Steril 67:266-272 Blasi F (1993) Urokinase and urokinase receptor : a paracrine/autocrine system regulating cell migration and invasion. Bioessays 15,105-111 Brew K, Dinakarpandian D, Nagase H (2000) Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochem Biophys Acta 1477:267-283 Brooks PC, Montgomery AM, Rosenfeld, Reisfeld RA, Hu T, Klier G, Cheresh DA (1994a). Integrin €vƒ3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell 79: 115711-115764 Brooks PC, Clark RAF, and Cheresh DA (1994b) Requirement of integrin avß3 for angiogenesis. Science 264:569-571 Brooks PC, Stromblad S, Sanders LC (1996) Localization of matrix metalloproteinase MMP2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin €vƒ3. Cell 85: 683-693 Bruner KL, Matrisian LM, Rodgers WH, Gorstein F, Osteen KG (1997) Suppression of matrix metalloproteinases inhibits establishment of ectopic lesions by human endometrium in nude mice. J Clin Invest 99: 2851-2857 Bruner-Tran KL, Eisenberg E, Yeaman GR, Anderson TA, McBean J, Osteen KG (2002) Steroid and cytokine regulation of matrix metalloproteinase expression in endometriosis and the establishment of experimental endometriosis in nude mice J Clin Endocrinol Metab 87:4782-91 Carmeliet P (1999) Controlling the cellular brakes. Nature 401:657-658 Carmeliet P, Jain RK (2000) Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407: 249-257 Chomczynski P, Sacchi N (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analyt Biochem 162:156-159 62 Chung HW, Wen Y, Chun SH, Nezhat C, Woo BH, Lake PM (2001) Matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-3 mRNA expression in ectopic and eutopic endometrium in women with endometriosis: a rationale for endometriotic invasivness. Fertil Steril 75: 152-159 Cornillie FJ, Oosterlynck D, Lauweryns JM, Konickx PR (1990). Deeply infiltrating pelvic endometriosis: histology and clinical significance. Fertil Steril 53: 978-983 Cox KE, Piva M, Sharpe-Timms KL (2001) Differential regulation of matrix metalloproteinases-3-gene expression in endometric lesions compared with endometrium Biol Reprod 65: 1297-1303 Cramer DW, Wilson E, Stillman RJ, Berger MJ, Belisle S, Schiff I (1986) The relation of endometriosis to menstrual characteristics, smoking and exercise. J Am Med Assoc 255:19041908 Curry TE Jr, Nothnick WB (2000) Changes in ovarian TIMP expression during follicular growth, ovulation and the luteal period in the rat. In: Hawkes S, Edwards D, Kokha R (eds.). Tissue Inhibitors of Metalloproteinases in Development and Disease. Amsterdam: Harwood Academic Publishers 119-126 Curry TE, Osteen KG (2001) Cyclic changes in the matrix metalloproteinase system in the ovary and uterus. Biolo Reprod 64: 1285-1296 Davis S, Aldrich TH, Jones PF (1996) Isolation of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, by secretion-trap expression cloning. Cell 87: 1161-1169 237: 173-185 Denekamp J (1984) Vascular endothelium as the vunerable element in tumors. Acta Radiol Oncol 23:217-225 Donnez J, Smoes P, Gillerot S, Casanas-Roux F, Nisolle M (1998) Vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis. Hum Reprod 13: 1686-1690 63 Drenkhahn M, Gescher D, Wolber EM, Meyerhoefer-Malik A, Malik E (2004) Expression of angiopoietin 1 and 2 in ectopic endometrium on the chicken chorioallantoic membrane. Fertil Steril 81/Suppl. 1: 869-875 Duncan WC, McNeilly AS, Illingworth PJ (1998) The effect of luteal “rescue” on the expression and localization of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in the human corpus luteum. J Clin Endocrinol Metab 83:2470-2478 Emonard HP, Remacle AG, Noel AC, Grimaud JA, Stetler-Stevenson WG, Foidart JM (1992) Tumor cell surface-associated binding site for the Mr 72,000 type IV collagenase. Cancer Res 52:5845-5848 Filardo EJ, Brooks PC, Deming SL, Damsky C, and Cheresh DA (1995) Requirement of the NPXY motif in the integrin ß3 subunit cytoplasmic tail for melanoma cell migration in vitro and in vivo. J Cell Biol 130:441-450 Foda HD, George S, Rollo E, Drews M, Conner C, Cao J, Reynold A, Panettieri JR, Zucker S (1999) Regulation of gelatinases in human airway smooth muscle cells: mechanism of progelatinase A activation. Am J Physiol 277:L174-L182 Foidart JM, Beliard A, Donnez J (1993) Endometriosis and invasion. In: Brosens I, Donnez J, editors. The current status of endometriosis research and management. Carnforth: Parthenon Publishing, 35-39 Freitas S, Meduri G, Le Nestour E, Bausero P, Perrot-Applanat M (1999) Expression of Metalloproteinases and Their Inhibitors in Blood Vessels in Human Endometrium. Biol Reprod 61:1070-1082 Gaetje R, Kotzian S, Hermann G, Baumann R, Starzinski-Powitz A (1995) Invasiveness of endometriotic cells in vitro. Lancet 150:1463-1464 Gerlach L (1887) Über neue Methoden auf dem Gebiet der experimentellen Embryologie. Anat Anz 2: 538-609 64 Gescher DM, Haensel A, Meyerhöfer-Malik A, Malik E (2003) Die Bedeutung der Angiogenese für die Pathogenese der Endometriose Zentralbl Gynäkol 125:243-246 Gescher DM, Siggelkow W, Meyerhoefer-Malik A, Malik E (2005) A priori implantation potential does not differ in eutopic endometrium of patients with and without endometriosis Arch Gynecol Obstet 272: 117-123 Gimbrone MA, Leapman SB, Cotran RS, Folkman J (1972) Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. J Exp Med 136:261-276 Gomez DE, Alonzo DF, Yoshiji H, Thorgeisson UP (1997) Tissue inhibitors of matrixmetalloproteinases: structure, regulation and biological functions. Eur J cell Biol 74:111-122 Greb RR, Löbbecke K, Paletta JRJ, Kiesel L (2002) Immunmodulation der Endometriose. Gynäkologe 35:238-242 Guidice L (1994) Growth factors and growth modulators in human uterine endometrium: their potential relevance to reproductive medecine. Fertil Steril 61:1-17 Hägglund AC, Ny A, Leonardsson G, Ny T (1999) Regulation and localization of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in the mouse ovary during gonadotropin induced ovulation. Endocrinology 140:4351-4358 Halme J, Hammond MG, Hulka JF, Raj SG, Talbert LM (1984). Retrograde menstruation in healthy women and in patients with endometriosis. Obstet Gynecol 64: 151-154 Hampton AL and Salamonsen LA (1994) Expression of messenger ribonucleic acid encoding matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors is related to menstration. J Endocrinol 141:R1-R3 Hudelist G, Lass H, Keckstein J, Walter I, Wieser F, Wenzl R, Mueller R, Czerwenka K, Kubista E, Singer CF. (2005) Interleukin 1a and tissue-lytic matrix metalloproteinase-1 are 65 elevated in ectopic endometrium of patients with endometriosis. Hum Reprod 20 (6): 16951701 Hulboy DL, Rudolph LA, Matrisian LM (1997) Matrix metalloproteinases as mediators of reproductive function. Mol Hum Reprod 3/1: 27-45 Hynes, RO (1992) Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell 69: 11-25 Igarashi TM, Bruner-Tran KL, Yeaman GR, Lessey BA, Edwards DP, Eisenberg E, (2005) Reduced expression of progesterone receptor-B in endometrium of women with endmetriosis and in co-cultures of endometrial cells exposed to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin Fertil Steril 84(1):67-74 Irwin JC, Kirk D, Gwatkin RB (1996) Human endometrial matrix metalloproteinase-2, a putative menstrual proteinase. Hormonal regulation in cultured stromal cells and messenger RNA expression during the menstual cycle. J Clin Invest 97:438-447 Jenkins S, Olive DL, Haney AF (1986) Endometriosis: pathogenetic implications of the anatomic distribution. Obstet Gynecol 67: 335-338 Karelina TV, Goldberg GI, Eisen AZ (2001) Matrix metalloproteinases in blood vessel development in human fetal skin and in cutaneous tumors. J Invest Dermatol 105: 411-417 Keller NR, Sierra-Rivera E, Eisenberg E, Osteen KG (2000) Progesterone exposure prevents matrix metalloprotease-3 (MMP-3) stimulation by interleukin-1€ in human endometrial cells. J Clin Endocrinol Metab 85:1611-1619 Kerbel RS (2000) Tumorangiogenesis: past, present and the near future. Carcinogenesis 21:505-515 Keetel WC, Stein RJ (1951) The viabilityof the cast-off menstrual endometrium. Am J Obstet Gynecol 61/2:440-2l 66 Klein NA, Olive DL, (1993). Management of endometriosis-associated infertility. In: Schlaff WD, Rock JA (Hrsg.). Decision making in reproductive endocrinology. Oxford, Blackwell Scientific, S. 488-494 Kokorine I, Marbaix E, Henriet P, Okada Y, Donnez J, Eeckhout (1996) Focal cellular origin and regulation of interstitial collagenase (matrix-metalloproteinase-1) are related to menstrual breakdown in the human endometrium. J Cell Sci 109:2151-2160 Kokorine I, Nisolle M, Donnez J (1997) Expression of interstitial collagenase (matrixmetalloproteinase-1) is related to the activity of human endometriotic lesions. Fertil Steril 68: 246-251 Koks CA, Groothuis PG, Slaats P (2000) Matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in antegradely shed menstruum and peritoneal fluid. Fertil Steril 73: 604-612 Kothapalli R, Buyuksal I, Wu SQ, Chegini N, Tabizadeh S (1997) Detection of ebaf, a novel human gene of transforming growth factor beta superfamily association of gene expression with endometrial bleeding. J Clin Invest 99:2342-50 Kressin P, Wolber EM, Wodrich H, Meyerhöfer-Malik A, Diedrich K, Malik E (1999) A modified chorioallantoic membrane (CAM) assay for testing antiangiogenetic strategies in a model of experimentally induced endometriosis. Hum Reprod 14 Abstract Book 1:18 Kressin P, Wolber EM, Wodrich H, Meyerhöfer-Malik A, Buchweitz O, Diedrich K, Malik E (2001a) Vascular endothelial growth factor mRNA in eutopic and ectopic endometrium Fertil Steril 76: 1220-1224 Kressin P, Moubayed P, Diedrich K, Malik E (2001b) Expression of angiopoietin 2 in endometriotic lesions. Human Reprod 16 (Abstract Book 1):171 Kressin P, Diedrich K., Malik E, (2002) Endometriose und Angiogenese Gynäkologe 35:224-231 Kruitwagen RF, Poels LG, Willemsen WN, De Ronde IJ, Jap PH, Rolland R (1991) Endometrial epithelial cells in peritoneal fluid during the early follicular phase. 67 Fertil Steril 55:297-303 Küpker W, Schultze-Mosgau A, Diedrich K (1998) Paracrine changes in the peritoneal environement of women with endometriosis. Hum Reprod 4:719-723 Kunzi-Rapp K (1995) Die Chorionallantoismembran des befruchteten Hühnereies. Ein in vivo-Modell in der photodynamischen Therapie. Medizinische Doktorarbeit der Universität Ulm Lessey BA, Damjanovich L, Coutifaris C, Castelbaum A, Albelda SM, Buck CA (1992) Integrin Adhesion molecules in the human endometrium: correlation with the normal and abnormal menstrual cycle. J Clin Invest 90:188-95 Lester BR, McCarthy JB (1992) Tumor cell adhesion to the extracellular matrix and signal transduction mechanisems implicated in tumor cell motility, invasion, and metastasis. Cancer Metastasis Rev 11:31-44 Liu, DT, Hitchcock A (1986) Endometriosis: its association with retrograde menstruation, dysmenorrhoea and tubal pathology. Br J Obstet Gynaecol 93: 859-862 Lockwood CJ, Krikun G, Hausknecht VA (1998) Matrixmetalloproteinase and matrixmetalloproteinase inhibitor expression in endometrial stroma cells during progestin initiated decidualisation and menstruation related progestin withdrawal. Endocrinology 139 : 4607-4613 Maas JWM, Le Noble FAC, Dunselman GAJ, Goeij AFPM, Striuker Boudier HAJ, Evers JLH (1999) The chick embryo chorioallantoic membrane as a model to investigate the angiogenic properties of human endometrium. Gynecol Obstet Invest 48:108-112 Maas JWM, Groothuis PG, Dunselmann GAJ, de Goeij AF, Struijker-Boudier HA und Evers JL (2001) Development of endometriosis-like lesions after transplantation of human endometrial fragments onto the chickembryo chorioallantoic membrane. Hum Reprod, 16 (4): 627-31 68 Mahmood TA, Templeton A (1991) Prevalence and genesis of endometriosis. Hum Reprod 6: 544-549 Maisonpierre PC, Suri C, Jones PF, (1997) Angiopoitin-2, a natural antagonist for for TIE2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 277: 55-60 Mahutte NG, Matalliotakis IM, Goumenou AG, Vassiliadis S, Koumantakis GE, Arici A (2003) Inverse correlation between peritoneal fluid leptin concentrations and the extent of endometriosis. Hum Reprod, 18 (6): 1205-1209 Maisonpierre PC, Suri LJ, Jones PF (1997) Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 277:55-60 Malik E, Meyhöfer-Malik A, Berg C, Böhm W, Kunzi-Rapp K, Diedrich K, Rück A (2000a) Fluororescence diagnosis of endometriosis on the chorioallantoic membrane using 5aminolevulinic acid. Hum Reprod 15: 584-585 Malik E, Berg C, Meyhöfer-Malik A, Buchweitz O, Moubayed P, Diedrich K (2000b) Fluorescence diagnosis of endometriosis using 5-aminolevulinic acid. Surg Endosc 14: 452455 Malik E, Kressin P, Buchweitz O, Dietrich K (2002) Endometriose und Aktivität. Gynäkologe 35:232-237 Marbaix E, Donnez J, Courtoy PJ, Eeckhout Y (1992) Progesterone regulates the activity of collagenase and related gelatinases A and B in human endometrial explants. Proc Natl Acad Sci USA 89:11789-11793 Marbaix E, Kokorine I, Henriet P, Donnez J, Courtoy PJ, Eeckhout Y (1995) The expression of interstitial collagenase in human endometrium is controlled by progesterone and by estradiol and is related to menstruation. Biochem J 305:1027-1037 Marbaix E, Kokorine I, Donnez J, Eeckhout Y, Courtoy PJ (1996) Regulation and restricted expression of interstitial collagenase suggest a pivotal role in the initiation of menstruation. Hum Reprod 11(2 Suppl):134-143 69 Martin DC, Hubert GD, Vander Zwaag R. El-Zeky FA (1989). Laparoscopic appearance of peritoneal endometriosis. Fertil Steril 51: 63-67 McLaren J, Prentice A, Charnock-Jones DS, Smith SK (1996) Vascular endothelial growth factor (VEGF) concentrations are elevated in peritoneal fluid of women with endometriosis. Hum Reprod 11: 220-223 Melicow MM, Pachter MR, (1967) Endometrial carcinoma of the prostatic utricle (uterus masculinus). Cancer 20:1715-1722 Meyer R, (1919) Über den Stand der Frage Adenomyositis und Adenomyome im allgemeinen und insbesondere über Adenomyositis serosoepithelialis und Adenomyometritis sarcomatosa. Zentralbl Gynäkol, 43:745 Mignatti P and Rifkin DB (1993) Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. Phyiol Rev 73:161-195 Montgomery AMP, Reisfeld RA, Cheresh DA (1994) Integrin avß3 rescues melanoma cells from apoptosis in three-dimensional dermal collagen. Proc Natl Acad Sci USA 91:8856-8860 Mott JD, Werb Z (2004) Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Curr Opin Cell Biol 16/5:558-5564 Murphy I, Willenbrock F, Ward RV, Cockett MI, Eaton D, Andrew R, Docherty JP (1992) The C-terminal domain of 72 kDa gelatinase A is not required for catalysis but is essential for membrane activation and modulates interactions with tissue inhibitors of metalloproteinases. J Biochem 283:637-641 Murphy AN, Unsworth metalloproteinases-2 EJ, inhibits Stetler-Stevenson bFGF-induced WG human (1993) Tissue microvascular inhibitor endothelial of cell proliferation. J Cell Physiol 157:351-358 70 Nap AW, Dunselman GA, de Goeij AF, Evers J, Groothuis PG (2004) Inhibiting MMP activity prevents the development of endometriosis in the chicken chorioallantoic membrane model Hum Reprod 19/10:2180-2187 Nisolle M, Casanas-Roux F, Anaf V, Mine JM, Donnez J (1993) Morphometric study of the stromal vascularisation of the peritoneal endometriosis. Fertil Steril 59: 681-684 Nisolle M, Donnez J (1997). Peritoneal endometriosis, ovarian endometriosis, and adenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three different entities. Fertil Steril 68: 585-596 Okada Y, Enghild JJ, Salvesen G, Nagase H (1992) Matrix metalloproteinase-3 (stromalysin) activates the precursor for the human matrix metalloproteinase-9. J Biol Chem 267:3581-3584 Olive DL, Henderson DY (1987) Endometriosis and müllarian anomalies. Obstet gynecol 137:39-43 Oosterlynck DJ, Meuleman C, Sobis H, VandePutte M, Koninckx PR (1993) Angiogenetic activity of peritoneal fluid from women with endometriosis. Fertil Steril 59: 778-782 Oosteen KG, Keller NR, Feltus FA, Melner MH (1999) Paracrine regulation of matrix metalloproteinase expression in normal human endometrium. Gynecol Obstet Invest 48:2-13. Osteen KG, Bruner-Tran KL, Eisenberg E (2005) Reduced progesteron action during endometrial maturation: a potential risk factor for the development of endometriosis. Fertil Steri 83:529-37l Polette M, Nawrocki B, Pintiaux A (1994) Expression of gelatinases A und B and their tissue inhibitors by cells of early and term human placenta and gestational endometrium. Lab invest 71: 838-846 Portuondo JA, Herran C, Echanojauregui AD, Riego AG (1982). Peritoneal Flushing and biopsy in laparoscopically diagnosed endometriosis. Fertil Steril 38: 538-541 71 Prockop DJ, Kivirikko KI, Tuderman L, Guzman NA (1979) The biosynthesis of collagen and its disorders. N Engl J Med 301:12-23 Rabinovitch M (1999) Pulmonary hypertension: pathophysiology as a basis for clinical decision making. J Heart Lung Transpl 18:1041-1053 Ramney B (1980). Etiology, prevention an inhibitionof endometriosis. Clin Obstet Gynecol 23: 875-882 Ramon L, Gilabert-Estellés J, Castelló, Gilabert J, España, Romeu A, Chirivella M, Aznar J, Estellés A (2004) mRNA analysis of several components of the plasminogen activator and matrix metalloproteinase systems in endometriosis using a real time quantitative RT-PCR assay Hum Reprod 20/1: 272-278 Ramzy I (1989). Pathology. In: Schenken RS (Hrsg.) Endometriosis. Contemporary concepts in clinical management. Lippincott, Philadelphia, S. 49-81 Ribatti D, Nico B, Vacca A (1999) Temporal expression of the matrix metalloproteinases MMP-2 correlates with fibronectin immunoreactivity during the development of the vascular system in the chick embryo chorioallantoic membrane. J Anat 195: 39-44 Risau W. (1997) Mechanisms of angiogenesis. Nature 386: 671-674 Rodgers WH, Matrisian LM, Giudice LC (1994) Patterns of matrix metalloproteinase expression in cycling endometrium imply differential functions and regulation by steroid hormones. J Clin Invest 94: 946-953 Rodgers WH, Osteen KG, Matrisian LM, Navre M Giudice LC, Gorstein F (1993) Expression and localization of matrilysin, a matrix metalloproteinase, in human endometrium during the reproductive cycle. Am J Obstet Gynecol 168:253-260 Rosenfeld DL, Lecher BD (1981) Endometriosis in a patient with a Rokitansky-KüsterHauser syndrome. Am J Obstet Gynecol 139/1:105 72 Rubovits FE, Abrams BS (1951) Human ovarian grafts onto the Chorio-allantoic-membrane of developing chick embryos. Proc Soc Biol Med 77: 447-451 Rudolph-Owens L, Slayden OD, Matrisian LM, Brenner RM (1998) Matrix metalloproteinase expression in Macaca mulatta endometrium: evidence for zone specific regulatory tissue gradiants. Biol Reprod 59:1349-1359 Rundhaug JE (2005) Matrix metalloproteinases and angiogenesis. J Cell Mol Med 9 (2): 267285 Runnebaum B, Rabe T (1995). Die Endometriose der Frau aus immunologischer und biologischer Sicht. Frauenarzt 1: 93-97 Ruoslahti E (1992) Control of cell motility and tumor invasion by extracellular matrix interactions. Br J Cancer 66:239-242 Russell DL, Salamonsen LA, Findlay JK (1995) Immunization against the N-terminal peptide of the inhibin Alpha43-subunit (AlphaN) disrupts tissue remodeling and the increase in matrix metalloproteinase-2 during ovulation. Endocrinology 136: 3657-3664 Salamonsen LA, Butt A, Hammond FR, Garcia S, Zhang J (1997) Production of endometrial matrix metalloproteinases, but not their tissue inhibitors, is modulated by progesterone withdrawal in an in vitro model for menstruation. J Clin Endocrinol Metab 82:1409-1415 Salamonsen LA, Wooley DE (1996) Matrixmetalloproteinases in normal menstruation. Hum reprod 11 Suppl 2 : 124-133 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratry manual. New York: Cold Spring Harbour Press, 2. Auflage Sampson JA (1927). Peritoneal endometriosis due to dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavitiy. Am J Obstet Gynecol 14: 422-469 73 Sanfilippo JS, Wakim NG, Schikler KN, Yussman MA (1986) Endometriosis in association with uterine anormaly. Am J Obstet Gynecol 154:39-43 Semenza GL (1998) Hypoxia–inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis. Curr Opin Genet Dev 8:588-594 Shapiro SD (1998) Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences. Curr Opin Cell Biol 10: 602-608 Shifren JL, Tseng JF, Zaloudek CJ (1996) Ovarian steroid regulation of vascular endothelial growth factor in the human endometrium: implications for angiogenesis during the menstrual cycle and the pathogenesis of endometriosis. J Clin Endocrinol Metab 81:3112-3118 Shimonovitz S, Hurwitz A, Dushnik M, Anteby E, Geva-Eldar T, Yagel S (1994) Developmental regulation of 72 kD and 92 kD type IV collagenases in human trophoblasts: a possible mechanism for control of trophoblast invasion. Am J Obstet Gynecol 171:832-838 Siebert PD, Larrick JW (1992) Competitive PCR. Nature 359: 557-558 Sillem M, Prifti S, Koch A, Neher M, Jauckus J, Runnebaum B (2001) Regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors in uterine endometrial cells of patients with and without endometriosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 95 :167-174 Simpson J, Elias S., Malinak L., Buttram VJ (1980). Heritable aspects of endometriosis. 1. Genetic studies. Am J Obstet Gynecol 137: 327-331 Singer CF, Marbaix E, Lemoine P, Courtoy PJ, Eeckhout Y (1999) Local cytokines induce differential expression of matrix metalloproteinases but not their tissue inhibitors in human endometrial fibroblasts. Eur J Biochem 259:40-45 Smith SK (1997) Angiogenesis. Semin Reprod Endocrinol 15:221-227 Smith SK (2001) Regulation of angiogenesis in the endometrium. Trends Endocrinol Metab 12: 147-151 74 Spanel-Borowski K (1989) Vascularization of ovaries from golden hamsters following implantation into the chick chorioallantoic membrane. Exp Cell Biol 57:219-227 Spuijbroek MD, Dunselman GA, Menheere PP, (1992) Early endometriosis invades the extracellular matrix. Fertil Steril 58 929- 933 Strathy JH, Molgaard CA, Coulam CB, Melton LJ (1982). Endometriosis and Infertility: a laparoscpic study of endometriosis among fertile and infertile women. Fertil Steril 38: 67-672 Strongin AY, Marmer BL, Grant GA, Goldberg GI (1993) Plasmamembrane-dependent activation of the 72 kDa type IV collagenase is prevented by complex formation with TIMP2. J Biol Chem 268:14033-14039 Tabibzadeh S (1991) Ubiquitous expression of of TNF-a/Cachektin in human endometrium. Am J Reprod Immunol 26:1-4 Tabibzadeh S, Sun XZ, (1992) Cytokine expression in human endometrium throughout the menstrual cycle. Hum Reprod 7:1214-1221 Tabizadeh S, Mason JM, Shea W, Cai Y, Murray MJ, Lessey B (2000) Dysregulated expression of ebfa, a novel, molecular defect in the endometria of patients with infertility. J Clin Endocrinol Metab 85:2526-36 Tadakuma H, Okamura H, Kitaoka M (1993) Association of immunolocalization of matrix metalloproteinase-1 with ovulation in hCG-treated rabbit ovary. J Reprod Fertil 98: 503-508 Tanabe Y et al. (1986) Ontogenetic Steroidogenesis by Testes, Ovary and Adrenals of Embryonic and Postembryonic Chickens (Gallus domesticus). Gen. Comp.Endocrinol. 63: 456-463 Te Linde RW, Scott RB (1950) Experimental endometriosis. Am J Obstet Gynecol 60:1147-1173 75 Uzan C, Cortez A, Dufournet C, Fauvet R, Siffroi JP, Daraï E (2004) Eutopic endometrium and peritoneal, ovarian and bowel endometriotic tissues express a different profile of matrix metalloproteinases-2, -3 and –11, and of tissue inhibitor metalloproteinases-1 and 2 Virchows Arch 445:603-609 Van der Linden PJ, de Goeij AF, Dunselman GA, Van der Linden EP, Remackers FC, Evers JL (1994) Expression of integrins and E-cadherin in cells from menstrual effluent, endometrium, peritoneal fluid, peritoneum and endometriosis. Fertil Steril 1994;61:85-90 Wang AM, Doyle MV, Mark DF (1989) Quantiation of mRNA by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci Biochemistry 86: 9717-9721 Wenzl RJ, Heinzl H (1998) Localization of matrix metalloproteinases-2 in uterine endometrium and ectopic implants. Gynecol Obstet Invest 45: 253-257 Witz CA, Montoya-Rodriguez IA, Schenken RS (1999) Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil Steril 71:56-60 Wolber EM, Dame C, Fahnenstich H (1999) Expression of the thrombopoitin gene in human fetal and neonatal tissues. Blood 94: 97-105 Wolber EM, Kressin P, Meyerhöfer-Malik A, Diedrich K, Malik E (2002) Differential regulation of matrix metalloproteinases-1 and matrix metalloproteinases-2-mRNA in ectopic endometrium on the chick chorioallantoic membrane. RBM Online 6/2:238-243 Zhang J, Salomonsen LA (1997) Tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)-1, -2 and –3 in human endometrium during the menstrual cycle. Mol Hum Reprod 3:735-741 Zhang J, Hampton AL, Nie G (2000) Progesterone inhibits activation of latent matrix metalloproeteinase (MMP)-2 by membrane-type 1 MMP: enzymes coordinately expressed in human endometrium. Biol Reprod 62:85-94 76 7 Anhang Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, bedanken. An erster Stelle danke ich Herrn Professor Dr. med. Eduard Malik, meinem Doktorvater, für das interessante Thema dieser Arbeit, die stete Unterstützung, seine Geduld und das in mich gesetzte Vertrauen. Ich danke Herrn Doktor med. Kressin für die ausführliche Einarbeitung in die Thematik und Methodik. Ich möchte mich ganz herzlich bei Frau Doktor med. Annette Meyerhöfer-Malik und Frau Inga Jensen für die Betreuung des CAM-Modells und die fachliche Unterstüzung bedanken. Zusätzlich Danke ich Frau Doktor med. Dorothee Gescher für die gründliche Durchsicht und die konstruktive Kritik an der ersten schriftlichen Fassung dieser Arbeit. Herrn Professor Wolfgang Jelkmann danke ich für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes in seinem Institut für Physiologie. Zuletzt möchte ich meinen Freunden und meiner Familie für ihre Unterstützung bei PCFragen und die unermüdliche Anfeuerung zur Fertigstellung der Arbeit danken. 77 Lebenslauf Antje Katrin Hofele, Ärztin, ledig, röm. katholisch Geburtsdatum: 03.01.1970 in Baden-Baden Eltern: Mutter: Karin Hofele, Beruf: Pharmazeutin, Vater: Hans-Georg Hofele, Beruf: Studiendirektor Schulbildung: 1976-1980 Vincenti-Grundschule Baden-Baden 1981-1988 École Européenne de Woluwé, Brüssel/Belgien 07/1988 Europäisches Abitur Studium: 1988-1989 Musikstudium, Fagottklasse, Academie de Musique, Brüssel/Belgien 1989-1992 Beginn des Medizinstudiums an der Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg im Breisgau Physikum 1991 Erstes Staatsexamen 1992 1992-1995 Abschluß des Studiums an der Universität Hamburg Zweites Staatsexamen 1994 Drittes Staatsexamen 1995 Ärztliche Tätigkeit: 1995-1997 Ärztin im Praktikum in der Abteilung für Anästhesie und operative Intensivmedizin des Allgemeines Krankenhaus Barmbek, Hamburg unter der Leitung von Herrn Dr. med. P.Hoffmann 1997-2001 Assistenzärztin in der Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe des Allgemeinen Krankenhauses Barmbek zunächst unter der Leitung von Herrn 78 Professor Martin, ab März 1999 unter Leitung von Herrn Professor SchmidtRhode. 2001-2003 Assistenzärztin in der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Uniklinik Lübeck unter Leitung von Herrn Professor Diedrich. 29.11.2003 Facharztanerkennung für Frauenheilkunde und Geburtshilfe Seit 1.11.2003 Fachärztin in der Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe des Allgemeinen Krankenhauses Barmbek unter der Leitung von Herrn Professor Schmidt-Rhode, ab dem 01.04.2007 unter der Leitung von Herrn Professor Faridi. 79 Vortrag Vortrag auf der 119. Tagung der Norddeutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe in Kiel mit dem Titel: Vergleich der MMP-1- und MMP-2-mRNA-Expression des Endometriums von Patientinnen mit und ohne Endometriose unter Zuhilfenahme des Modells der Chorioallantoismembran. 80
