Userguide - Hellma Analytics
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Userguide No 031 I BioPhotometer plus Verwendung der Mikrolitermesszellen von Hellma® TrayCell™ oder Implen® LabelGuard™ im BioPhotometer plus für Nukleinsäurebestimmungen Martin Armbrecht, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Zusammenfassung Die Verwendung der Mikrolitermesszellen von Hellma und Implen in Kombination mit dem BioPhotometer plus ermöglicht sehr hohe DNA bzw. RNA Konzentrationen in kleinsten Volumina zu bestimmen. Durch die einfache Handhabung und die komfortable Auswertung liegt eine preiswerte Alternative zu Spektrophotometern vor, welche auch in diesem Bereich messen können. Dieser UserGuide soll in erster Linie dazu dienen, den Umgang mit den Mikrolitermesszellen für reproduzierbare Ergebnisse zu optimieren. Einleitung Nach der Isolierung und Aufreinigung von DNA und RNA ist es meist notwendig für weitere Anwendungen die Konzentration der Nukleinsäure zu bestimmen. In der Regel erfolgt dieses photometrisch in einem Spektrophotometer. Da die Nukleinsäuren nach einer Isolierung meist in sehr hohen Konzentrationen und somit oberhalb des Messbereiches im Photometer liegen, ist es erforderlich, die Proben zunächst zu verdünnen. Die einzelnen Verdünnungsschritte müssen dabei sehr genau erfolgen, da ansonsten die Berechnung der Ausgangskonzentration schnell fehlerhaft werden kann. Problematisch ist, dass die Proben nach der Verdünnung meist unbrauchbar sind. Eine bequeme Alternative ist, Proben direkt ohne zusätzliche Verdünnung mittels so genannter Mikrolitermesszellen im BioPhotometer plus zu messen. Für die Messung sind nur wenige Mikroliter ausreichend (0,7 µl – 5 µl). Dabei werden hochkonzentrierte Proben mit einem sehr kleinen Lichtweg, wie z.B. 0,2 mm bzw. 1 mm statt der üblichen 10 mm Lichtweg gemessen. Bei einem verkürzten Lichtweg kann das Licht bei einer bestimmten Wellenlänge selbst bei hohen Konzentrationen die Probe durchdringen und reproduzierbar gemessen werden. Da beim BioPhotometer plus keine Aufwärmzeiten vorhanden sind, können die Messzellen direkt nach dem Einschalten für DNA bzw. und RNA-Messungen verwendet werden. Userguide No 031 | Seite 2 Messprinzip Abbildung 1 zeigt eine Übersicht des Messprinzips. Das Licht (a) des Photometers gelangt über ein Fenster (e) in das innere der Messzelle und wird über einen Spiegel (b) nach oben geleitet und gelangt durch ein weiteres Fenster (e) durch die Probe (c). Im Deckel wird das Licht über einen Spiegel (b) wieder in die Messzelle zurückgeleitet und über einen weiteren Spiegel aus der Küvette hinausgeleitet. Der Detektor des Photometers vermisst die verbleibende Lichtmenge (Absorption). Die für die Messung wichtige optische Schichtdicke (f) ergibt sich aus der Distanz zwischen Spiegel und oberen Austrittsfenster der Messzelle, welcher für die Konzentrationsbestimmung der Probe wichtig ist. Die optische Schichtdicke wird über den Deckel bestimmt: Je nach Konzentration und Probenvolumen können Deckel mit 0,2 bzw. 1 mm Lichtweg verwendet werden. Die Mikrolitermesszellen werden immer mit beiden Deckeln ausgeliefert (Abbildung 2a bzw. 2b), wobei der jeweilige verwendete Lichtweg auf dem Deckel der Traycell bzw. Labelguard gekennzeichnet ist (1). Abbildung 1: Schematischer Aufbau der Mikrolitermesszelle von Hellma (TrayCell) bzw. Implen (Labelguard). a) Licht, b) Spiegel c) Probe, d) Deckel, e) Fenster f) optische Schichtdicke. 2a) Deckel für 0,2 mm Lichtweg. 2b) Deckel für 1 mm Lichtweg Konzentrationsbereich Sowohl für den 0,2 mm als auch den 1 mm Deckel empfiehlt es sich in einem Extinktionsbereich zwischen 0,1 bis maximal 1,5 E zu arbeiten. Wie in Tabelle 1 dargestellt wird ergeben sich daraus für die verschiedenen Nukleinsäuren folgende Konzentrationsbereiche im Vergleich zu einer Standardküvette mit 10 mm Lichtweg. Tabelle 1: Nukleinsäure-Konzentrationen bei Verwendung der empfohlenen Extinktionsbereiche (0,1 - 1,5 E) Nukleinsäure Faktor 1 mm Deckel [ng/µl] 0,2 mm Deckel [ng/µl] Küvette mit 10 mm Lichtweg [ng/µl] dsDNA 50 50 - 750 250 – 3750 5 – 75 ssDNA 37 37 - 555 185 – 2775 3,7 – 55,5 RNA 40 40 – 600 200 – 3000 4 – 60 Oligo 33 33 - 495 165 – 2475 3,3 – 49,5 Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, lassen sich deutlich höhere Konzentrationen mit den Mikrolitermesszellen bestimmen als in Küvetten mit 10 mm Lichtweg. Userguide No 031 | Seite 3 Einstellungen am BioPhotometer plus Die Mikrolitermesszellen können direkt ohne Verdünnungsfaktoren eingesetzt werden. Voraussetzung hierfür ist, dass die optischen Schichtdicken der Deckel in den Parametereinstellungen am BioPhotometer plus angepasst werden. Die Einstellungen werden nur für die jeweilige verwendete Methode gespeichert. Bei der Berechnung der Konzentration wird der verwendete Lichtweg automatisch berücksichtigt. Abbildung 3 zeigt die notwendigen Anpassungen am BioPhotometer plus für die direkte Verwendung des 0,2 bzw. 1 mm Deckels. a) b) Abbildung 3: Einstellung des Lichtweges auf 0,2 mm (a) bzw. 1 mm (b) (Bsp. dsDNA). Abhängig vom verwendeten Deckel müssen die entsprechenden optischen Schichtdecken im Parametermodus modifiziert werden. Zur Änderung der optischen Schichtdicken in den Geräteeinstellungen wählen Sie eine Methode in einer Methodengruppe aus (Bsp. Methode „dsDNA“ in der Gruppe „DNA“). Wenn der Pfeil im Display auf die gewünschte Methode zeigt, drücken Sie im Bedienfeld auf „parameter“. Drücken Sie die Pfeiltasten, bis im Display „Küvette“ erscheint, und wählen Sie die jeweilige optische Schichtdicke aus (s. Abbildung 3). Einstellung am BioPhotometer 6131 Bei Verwendung des BioPhotometers 6131 kann die optische Schichtdicke von 0,2 mm nicht direkt am Gerät eingestellt werden. Zur direkten Verwendung ohne Umrechnung kann dafür alternativ bei Verwendung des voreingestellten 10 mm Lichtweges eine virtuelle 50-fache Verdünnung eingegeben werden. Drücken Sie hierfür auf „Dilution“ und geben Sie für „Sample“ 1 µl und für „Diluent“ 49 µl ein. Diese Einstellungen führen ebenfalls zu dem korrekten Ergebnis. Umgang und Reinigung Es empfiehlt sich, während der Messungen Handschuhe zu tragen um Verschmutzungen am Lichteintritts- bzw. Austrittsfenster zu vermeiden. Vor jeder Messung sollte die Küvette immer bis zum Anschlag in den Küvettenschacht gedrückt werden. Positionsabweichungen der Messzelle im Schacht können somit zu Messabweichungen führen. Wie bei Messungen in Standardküvetten mit 10 mm Lichtweg sollten Proben (falls vorher gefroren) immer komplett aufgetaut sind und anschließend ausreichend durchmischt werden. Zwischen zwei Messungen müssen der Spiegel im Deckel sowie das Fenster auf der Oberseite der Messzelle gereinigt werden. Hierfür kann man herkömmliche Wattestäbchen oder auch normale Papiertaschentücher verwenden. Verbleibende Fussel sollten mit Druckluft entfernt werden. Druckluft ist im Bürobedarfsladen erhältlich. Bei stärkeren Verunreinigung muss der Spiegel auf der Deckelinnenseite (Abbildung 1 b) und das Fenster auf der Oberseite (Abbildung 1 e) mit 60 % Isopropanol gereinigt werden. Nähere Informationen zur Reinigung können bei der Firma Hellma (www.hellma-worldwide.com) erfragt werden. Userguide No 031 | Seite 4 Volumina Als einzusetzendes Volumen empfiehlt der Hersteller 3-5 µl für den 1 mm Deckel bzw. 0,7-3 µl für den 0,2 mm Deckel. Bei Verwendung des 0,2 mm Deckels mit sehr kleinen Flüssigkeitsmengen wie etwa 1 µl kann es vorkommen, dass sich im Lichtweg kleine Luftblasen bilden, wodurch Schwankungen bei Messungen der gleichen Probe auftreten können. Für sehr geringe Volumina unter 2 µl empfiehlt es sich daher, die Probe direkt auf den Spiegel in der Deckelinnenseite zu pipettieren (Abb.4b), statt wie sonst üblich auf das obere Messfenster (Abb. 4a). Da hier immer mit sehr kleinen Volumina gearbeitet wird, muss darauf geachtet werden, sehr genau zu pipettieren. Das gilt natürlich auch, wenn die „Blank“-Lösung pipettiert wird. Messablauf 1. Tragen Sie während des gesamten Messvorganges Handschuhe, um Verunreinigungen an der Messzelle zu vermeiden. optische Schichtdicke 2. Wählen Sie für Ihre Messung den Deckel mit der optischen Schichtdicke aus, der dem Konzentrationsbereich Ihrer Probe am ehesten entspricht (s. Tabelle 1). 3. Wählen Sie Ihre Mess-Methode (Bsp.: dsDNA). 4. Verändern Sie ggf. die voreingestellten Parameter im BioPhotometer plus (s. Einstellung am BioPhotometer plus, Abb. 3a bzw. Abb. 3b). Abbildung 5: Eingangsdisplay vor Blank-Messung 5. Führen Sie eine Nullwertbestimmung (Blank) mit der Flüssigkeit durch, in der Ihre Probe gelöst bzw. verdünnt ist. Pipettieren Sie hierfür den „Blank“ auf das obere Messfenster der Probe (Abb.4a) oder bei Verwendung des 0,2 mm Lichtweges auf den Spiegel in der Deckelinnenseite (Abb. 4b) a) b) Abbildung 6. Blank-Messung 6. Vor der „Blank“-Messung werden voreingestellte Parameter wie der verwendete Lichtweg im Display angezeigt (Abb. 5). Legen Sie den Deckel auf die Messzelle entsprechend der Einkerbung am Deckel und drücken Sie die Taste „Blank“ am BioPhotometer plus (Abb. 6). Abbildung 4: Beladung der Messzelle bei 1 mm Lichtweg (a) bzw. 0,2 mm Lichtweg (b) Userguide No 031 | Seite 5 7. Das Ergebnis der Blankmessung sollte 0 betragen (s. Abbildung 7). 10. Tragen Sie Ihre Probe wie in Abb. 4 für die „BlankMessung“ beschrieben auf und betätigen Sie die „Sample“Taste (Abb. 10). Das Ergebnis (Abb. 11) wird automatisch im Display angezeigt. Dabei wird der verwendete Lichtweg automatisch mit einbezogen. Abbildung 7: Ergebnis der Blankmessung 8. Entfernen Sie anschließend alle Flüssigkeitsreste mit einem Wattestäbchen oder Papiertaschentuch von der Deckelinnenseite (Abb. 8a) und vom Messfenster (Abb. 8b). a) b) Abbildung 10: Betätigen der „Sample“-Taste Abbildung 8: Reinigung des oberen Messfensters (a) und der Deckelinnenseite (b) 9. Entfernen Sie ggf. Fussel oder Staub mit einem Druckluftsprayer von dem Spiegel (Abb. 9a) und dem Messfenster (Abb. 9b). a) b) Abbildung 11: Ergebnis-Beispiel 11. (Optional) Wenn erforderlich, kann die Probe vom oberen Messfenster mit einer Pipette abgenommen und somit wieder gewonnen werden. 12. Entfernen Sie anschließend alle Flüssigkeitsreste mit einem Wattestäbchen oder Papiertaschentuch von der Deckelinnenseite (Abb. 8a) und vom Messfenster (Abb. 8b). Abbildung 9: Entfernen von Fusseln oder Staub von der Deckelinnenseite (a) und oberen Messfenster (b) mittels Druckluftsprays 13. Säubern Sie ggf. beide Bereiche zusätzlich mit 60 % Isopropanol. Userguide No 031 | Seite 6 Literatur [1] Chris Voolstra, Anja Jungnickel, Lars Borrmann, Roland Kirchner, Andrea Huber Spektrophotometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren - Der LabelGuardTM ermöglicht die Quantifizierung von Probenmengen im Submikroliter-Bereich mit handelsüblichen Spektrophotometern, Application Note – Implen GmbH, www.implen.com Produkt Bestellnummer BioPhotometer plus 230 V / 50-60 Hz Netzstecker Europa, weitere Netzanschlussvarianten erhältlich 6132 000.008 Thermodrucker DPU 414 Inkl. Netzteil und Druckerkabel 230 V 6131 011.006 Thermopapier 5 Rollen 0013 021.566 Bestellinformationen – Hellma GmbH & Co. KG Product Bestellnummer Hellma TrayCell, 68,5 mm, 8,5 mm, (inkl. Deckel für Schichtdicken von 0,2 mm und 1 mm) 105.800-UVS Z 8.5 mm Deckel für TrayCell, optische Schichtdicke 1,0 mm 665.703 Deckel für TrayCell, optische Schichtdicke 0,2 mm 665.704 Bestellinformationen - Implen GmbH Produkt Bestellnummer LabelGuard Mikroliter Messzelle, Paket mit 0,2 und 1 mm Pfadlänge Deckel, 0,7 - 5 μl Probenvolumen LG100UV-G LabelGuard Mikroliter Messzelle, Deckel mit 1 mm Pfadlänge, 3-5 μl Probenvolumen LG100UV LabelGuard Mikroliter Messzelle, Deckel mit 0,2 mm Pfadlänge, 0,7 - 4 μl Probenvolumen LG101UV Implen® ist eine eingetragene Marke der Implen GmbH LabelGuardTM ist eine geschützte Marke der Implen GmbH Hellma® ist eine eingetragene Marke der Hellma GmbH & Co.KG TrayCellTM ist eine geschützte Marke der Hellma GmbH & Co.KG Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH ∙ Peter-Henlein Str. 2 ∙ 50389 Wesseling-Berzdorf ∙ Deutschland Tel: +49 2232 418-0 ∙ Fax: +49 2232 418-155 ∙ E-mail: [email protected] ∙ www.eppendorf.de Eppendorf Austria ∙ Brünner Straße 73 ∙ 1210 Wien ∙ Österreich Tel: +43 1 29017560 ∙ Fax: +43 1 290175620 ∙ E-mail: [email protected] ∙ www.eppendorf.at Vaudaux-Eppendorf AG ∙ Im Kirschgarten 30 ∙ 4124 Schönenbuch ∙ Schweiz Tel: +41 61 482 1414 ∙ Fax: +41 61 482 1419 ∙ E-mail: [email protected] ∙ www.eppendorf.ch Application Support Tel: +49 1803 666 789 ∙ E-mail: [email protected] eppendorf® ist eine eingetragene Marke der Eppendorf AG. 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