(HMGA1) Gens und Detektion von Punktmutationen

Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung des Caninen High –
Mobility – Group A1 (HMGA1) Gens
und
Detektion von Punktmutationen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Claudia Beuing
Wuppertal - Elberfeld
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für Kleintiere der
Tierärztlichen Hochschule Hannover
Prof. Dr. J. Bullerdiek, Zentrum für Humangenetik
der Universität Bremen
1. Gutachter:
Prof. Dr. Ingo Nolte
2. Gutachterin/Gutachter:
Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung:
03. September 2010
Für meine wundervollen Söhne
Niklas und Moritz
INHALTSVERZEICHNIS
1.
Einleitung
1
2.
Literaturübersicht
3
2.1 Single Nucleotide Polymorphism
3
2.2 Proteine der High - Mobility - Group
5
2.3 Das THADA - Gen
9
2.4 Der canine Karyotyp
9
3.
13
Publikationen
3.1 Chromosomal Assignment of the Canine THADA Gene to CFA
13
10q25
3.2 Genomic Characterisation, Chromosomal Assignment and in
14
Vivo Localisation of the Canine High Mobility Group A1
(HMGA1) Gene
4.
Diskussion
15
5.
Zusammenfassung
19
6.
Summary
20
7.
Literaturverzeichnis
21
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
bp
dATP
dCTP
DNA
dNTP
g
GFP
h
H2O
HMG
HMGA1
HMGA1
kb
M
MgCl
min
ml
ng
PBS
PCR
sec
Taq
THADA
U
µl
Basenpaare
Desoxyadenosin-5´-Triphosphat
Desoxycytidin-5´-Triphosphat
Desoxyribonucleinacid
Desoxynukleosid-5´-Triphosphat
Erdbeschleunigung ( g = 981cm/sec-2)
Green Fluorescent Protein
Stunde
Wasser
High Mobility Group
HMGA1-Gen
Proteine des HMGA1-Gens
Kilo Basenpaare
Marker
Magnesiumchlorid
Minute
Milliliter
Nanogramm
Phosphate-buffered Saline
Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
Sekunden
Taq-Polymerase (DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus
aquaticus)
Thyroid adenoma associated
Units
Mikroliter
0
1. EINLEITUNG
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung der Struktur des
tumorrelevanten caninen HMGA1 Gens auf genomischer Ebene sowie der
Evaluation einer im Vorfeld beschriebenen Punktmutation im HMGA1 – Gen eines
Teckels in einer größeren Teckelgruppe. Weiterhin wurde erstmals die in vivo
Lokalisierung des caninen HMGA1 Proteins über Fluoreszenz vorgenommen sowie
der Genlokus verifiziert. Zusätzlich zu den HMGA1 Arbeiten wurde der Genlokus des
caninen THADA Gens, welches als tumorrelevantes Kandidatengen beim Menschen
gilt, beim Hund erstmals physikalisch bestimmt.
Die genaue Kenntnis der Struktur von krankheitsassoziierten Genen ist für die
Entwicklung von diagnostischen Ansätzen als auch die Charakterisierung von
Tumorentstehungsmechanismen in vielfacher Hinsicht von großem Interesse. So
stellt sie die Grundlage des Wissens über strukturelle Elemente dar, welche die
Funktion der entsprechenden Gene charakterisieren und regulieren. So können etwa
zytogenetisch charakterisierte Chromosomenbrüche mit strukturellen Veränderungen
von eventuell hiervon betroffenen Genen in Verbindung gebracht werden und deren
Effekte beschrieben werden. Dies bietet die Möglichkeit, in den verschiedenen
Tumorentitäten wiederkehrende strukturelle Veränderungen zu identifizieren und zu
evaluieren, ob diese Änderungen charakteristisch für die jeweiligen untersuchten
Gruppen sind.
Die letztlich funktionelle Einheit in der Zelle, also das ausführende Medium, ist das
Protein. Ein Protein oder eine Polypeptidkette stellt das mittels Translation
entstandene Produkt eines Gens, bzw. das funktionelle Element eines Gens in einer
Zelle dar. Zur genaueren Untersuchung der Funktionsweise eines Proteins ist es
wichtig zu wissen, wo sich das Molekül in der Zelle befindet. Eine Lokalisation (in
vivo) über Fluoreszenz in der Zelle bietet hier weitreichende Möglichkeiten zur
Charakterisierung der Proteinbiologie in vivo. Vorteil einer GFP vermittelten in vivo
Lokalisation ist hierbei der sichtbare Nachweis eines Proteins in der Zelle.
Zudem warf eine Untersuchung von Murua Escobar et al. (2004), bei der eine
Punktmutation auf einem Allel im Exon 7 des caninen HMGA1 – Gens bei einem
1
Teckel
nachgewiesen
werden
konnte
[1]
die
Fragestellung
nach
der
Auftrittswahrscheinlichkeit einer solchen Mutation in einer größeren Teckel –
Population auf, um somit die mögliche Relevanz dieser Mutation zu evaluieren.
Punktmutationen sind die am häufigsten vorkommenden genetischen Mutationen, da
diese lediglich auf dem Austausch einer einzelnen Base beruhen. Wird eine solche
Mutation in einer Population in einer Häufigkeit von mindestens einem Prozent
detektiert, so spricht man im Allgemeinen von einem sog. „Single Nucleotide
Polymorphism“ (SNP). Die Detektion dieser Punktmutationen ist für Genetik und
Medizin daher von großer Bedeutung, da bereits ein Austausch in der Basenabfolge
zur Änderungen einer Aminosäure in einem Protein oder zur Modulation funktioneller
genregulativer Elemente führen kann.
Das canine HMGA1 – Gen stand für diese Arbeit deshalb im Blickpunkt des
Interesses, da ihm eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit verschiedenen
Erkrankungen einschließlich Tumoren zugesprochen wird [2, 3].
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an genomischer DNA von
Hunden und im Besonderen an Teckeln als Rasse vorgenommen. Sie ist in diesem
Zusammenhang besonders interessant, da diese Rasse für eine Reihe von
Erkrankungen prädisponiert ist, welche mit den High – Mobility – Group – Genen in
Verbindung gebracht werden können. Dazu gehören beispielsweise gutartige, als
auch bösartige Tumoren. So treten bei Tumoren der Mamma Adenokarzinome,
Adenome und benigne Mischtumoren nach Mischlingen am zweithäufigsten bei
Teckeln auf. Ebenso verhält es sich mit der Auftrittswahrscheinlichkeit von
Liposarkomen [4]. Eine Evaluation der Auftrittswahrscheinlichkeit der initial
beschriebenen HMGA1 Punktmutation in der Teckel - Population könnte zur Klärung
eines möglichen Zusammenhanges zwischen der beschriebenen Mutation und
rassespezifischen Prädispositionen führen.
Im weiteren Interesse lag die Lokalisation des caninen THADA – Gens. Ähnlich wie
das HMGA1 Gen werden strukturelle Aberrationen dieses Gens beim Menschen bei
der Entstehung von Schilddrüsentumoren diskutiert, und es wird daher als
Kandidatengen diskutiert [5]. Um Aussagen treffen zu können, ob das Auftreten von
2
spezifischen Aberrationen wahrscheinlich ist, ist das Mapping des Gens die
Grundvoraussetzung.
Da HMGA- sowie THADA - Gen im Zusammenhang mit der Pathogenese von
Neoplasien gesehen werden, ist die Kenntnis von Lokalisation und Struktur für die
Entwicklung möglicher Therapien von großer Bedeutung.
3
2. LITERATURÜBERSICHT
Genaufbau und strukturelle Aberrationen
Ein
eukaryontisches
Gen
besteht
auf
genomischer
Ebene
aus
mehreren
unterschiedlichen charakteristischen Elementen. Hierbei codieren Exons die Teile,
welche in mRNA umgeschrieben werden und werden durch die sogenannten Introns
getrennt [6]. Dieser modulartige Aufbau bietet den Vorteil, dass während der
Entwicklung der verschiedenen Spezies die Exons miteinander neu kombiniert
werden und so neue Gene entstehen konnten. Weiterhin sind bei den meisten
Genen für die Transkription typische regulatorische Elemente, wie Promotor, TATA –
BOX und Silencer zu finden.
Dieser modulartige Aufbau der eukaryontischen Gene hat jedoch auch Nachteile.
Beim sog. „crossing over“ kommt es beispielsweise zum Bruch und erneuten
Aneinanderlegen von jeweiligen am Prozess teilnehmenden Chromatiden. Diese
natürliche Rekombination ermöglicht/erweitert die Entstehung in sich einzigartiger
Individuen. Fehler während dieses Prozesses oder später an den hieran beteiligten
Chromosomenanteilen können jedoch dazu führen, dass Teile von Genen verloren
gehen oder neue Teile hinzukommen, welche die Funktion des jeweiligen Gens
beeinflussen können (gain und loss of function). Beispielsweise treten bei
verschiedenen Tumoren genetische Instabilitäten auf, die sich dadurch zeigen, dass
Chromosomen brechen und neu kombinieren, Teile verloren gehen oder amplifiziert
werden. Ein typisches Beispiel ist das sog. Philadelphia Chromosom. Dieses
verkürzte Chromosom 22 des Menschen wurde erstmals 1960 von Peter Nowell als
Chromosomenaberration beschrieben, welche mit der Entstehung von Tumoren in
Verbindung gebracht werden konnte. So kann es bei mehr als 95 Prozent aller Fälle
von Chronisch Myeloischer Leukämie nachgewiesen werden [7]. Dass es sich um
eine reziproke Translokation von Chromosom 22 mit Chromosom 9 handelt, wurde
im Jahre 1972 von Janet Rowley beschrieben [8]. Die für die zelluläre
Wachstumsregulation wichtige Aktivität des Enzyms Tyrosinkinase wird unter
Einfluss eines so neu entstehenden Fusionsproteins dauerhaft aktiviert, was
unkontrollierte Zellvermehrung zur Folge hat.
Um Analysen durchführen zu können, die beschreiben ob und wie ein Chromosom
bzw. Gen von solchen Mutationen betroffen ist, muss zunächst die Lage des Gens
4
festgestellt werden. Hierbei hat sich die Technik der „Fluoreszenz in situ
Hybridisierung“ (FISH) als besonders wertvoll erwiesen. Diese Technik beruht darauf,
dass spezifisch markierte Gen- bzw. DNA-Sonden auf Metaphase oder Interphase Chromosomen hybridisiert werden. Die Auswertung erfolgt über die Fluoreszenz der
markierten Sonden. FISH ermöglicht also die genaue Bestimmung über Lage eines
Genes auf den Chromosomen und die Analyse, ob Teile des Gens von strukturellen
Mutationen betroffen sind.
2.1. Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Single
Nucleotide
Polymorphisms
sind
Mutationen
in
Form
einzelner
Basenaustausche auf Ebene der genomischen DNA, die mit einer Häufigkeit von
mehr als einem Prozent in einer Population vorkommen und stabil über mehrere
Generationen bestehen [9]. Diese zufällig über das Genom verteilten Austausche
einzelner Basen/Basenpaare können an beliebiger Position innerhalb und außerhalb
von Genen vorkommen und entsprechend sehr unterschiedliche Auswirkungen
haben. Liegen sie im Bereich der proteinkodierenden Sequenzen, ist möglicherweise
der Austausch einer Aminosäure die Folge, die die Funktion des Proteins
beeinflussen kann.
Auf Grund dieser Eigenschaft, Proteinstrukturen und somit deren Funktion verändern
zu können, sind SNPs neben möglichen Effekten auf die Genregulation sowohl an
der genotypischen als auch der phänotypischen Variationsbreite innerhalb einer
Spezies maßgeblich beteiligt.
Die Anzahl und Wahrscheinlichkeit beschriebener SNPs variiert je nach Spezies
erheblich, was sicherlich nicht allein auf das tatsächliche Vorkommen, sondern
ebenso auf die unterschiedliche Anzahl der durchgeführten Untersuchungen bei
einzelnen Spezies zurückzuführen ist. So ist zu erklären, dass Sachidanandam et al.
(2001) für den Menschen 1,42 Millionen SNPs
mit einem SNP pro 1,9 kb
detektierten, Kim und Misra (2007) hingegen über ca. 9 Millionen SNPs für das
humane Genom berichten [10, 11]. Für den Hund (Canis lupus familiaris) ist in der
Literatur eine Anzahl von 2,5 Millionen SNPs beschrieben, wobei die statistische
Wahrscheinlichkeit abhängig von der Rasse zwischen einem SNP pro 900bp und
1500bp differiert [12]. Das Genom des Huhnes (Gallus gallus domesticus) beinhaltet
2,8 Millionen SNPs mit einer Auftrittswahrscheinlichkeit von 5 SNPs pro kb [13].
5
Als Folge eines Basenpaaraustausches wird beispielsweise eine Prädisposition für
bestimmte Krankheiten beschrieben. So gilt ein Zusammenhang zwischen SNPs und
der
Entstehung
von
Tumoren,
wie
Plattenepithelkarzinomen,
Lungen-
und
Prostatatumoren als erwiesen [14-16]. Dies ist durch eine aus einem SNP
resultierende quantitative Dysregulation des Zellwachstums zu erklären.
Aguillon et al. (2006)
beschrieben, dass die Häufigkeit des Auftretens der
Rheumatoiden Arthritis signifikant erhöht war, wenn ein bestimmter SNP in der
Promotorregion des TNF – Gens nachweisbar war, da die Entwicklung von TNF auf
Grund dieses SNPs verändert war [17].
Einen weiteren Beleg für eine SNP - bedingte Prädisposition für bestimmte
Erkrankungen erbrachten Khurana et al. im Jahre 2006. Sie stellten fest, dass die
Wahrscheinlichkeit für Cerebralen Arteriospasmus auf Grund einer Punktmutation
signifikant erhöht ist [18].
Weiterhin konnte man drei verschiedene SNPs nachweisen, welche zu veränderten
Serumwerten einzelner Schilddrüsenparameter und daraus resultierend subklinisch
zu einer Hypo- beziehungsweise Hyperthyreose führen [19]. Zwei dieser Mutationen
sind lokalisiert in der extrazellulären Domäne des TSH-Rezeptors (Asp 36 His sowie
Pro 52 Thr) [20, 21]. Eine dritte befindet sich in der intrazellulären Domäne (Asp 727
Glu) [22].
Als Folge eines Basenpaaraustausches beschrieben Dykxhoorn et al. (2006) einen
Zusammenhang mit der Sichelzellanämie. Bei dieser autosomal-rezessiv vererbten
Erkrankung kommt es durch den Austausch einer Aminosäure in Codon 6 (GAG →
GTG) im
Hämoglobin
(HbS)
bei
abnehmendem
Sauerstoffpartialdruck
zur
sichelförmigen Verformung der betroffenen Erythrozyten. Diese funktionsunfähigen
Zellen werden in der Milz lysiert [23]. Eine Anämie und daraus resultierende Hypoxie
ist die Folge.
Auch
die
Phenylketonurie,
eine
der
häufigsten
angeborenen
Stoffwechselerkrankungen, wird durch SNPs hervorgerufen. Eine Mutation auf dem
humanen Chromosom 12 (12q22 bis 12q24) verursacht die Dysfunktion der hier
kodierten
Phenylalaninhydroxylase.
Hierbei
hängt
das
Ausmaß
der
Aktivitätseinschränkung des Enzyms maßgeblich von der Art der etwa 400
bekannten Mutationen dieses Gens ab. Somit ist auch die tolerierbare Menge an
aufgenommenem Eiweiß individuell verschieden. Kann die Aminosäure Phenylalanin
mangels funktionsfähigem Enzym nicht zu Tyrosin abgebaut werden, können
6
beispielsweise eine Beeinträchtigung der Hirnentwicklung sowie Epilepsie die Folge
sein [24].
Als Selektionsvorteil konnte die Laktosetoleranz beim Menschen nachgewiesen
werden, welche aus einem SNP im LCT – Gen (Laktase – Gen) resultiert. Dieses
kodiert für das bei der Laktosespaltung essentielle Enzym Laktase. Dem Menschen
der Urzeit diente Rindfleisch als Nahrungsmittel, Milch konnte aufgrund der aus dem
Fehlen der Mutation resultierenden Intoleranz als solches nicht verwertet werden. Im
Laufe der Evolution stellte sich die Präsenz der genannten Mutation im Genom als
Vorteil heraus, da diese die Überlebenschance auch in Zeiten des Nahrungsmangels
erhöhte. So setzte sich dieses Merkmal insbesondere in Populationen mit
Milchtierhaltung durch [25].
Punktmutationen wurden beim Menschen auch bei ras – Genen (Onkogenen) im
Zusammenhang
mit
der
Entstehung
von
Tumoren
beschrieben.
Diese
Veränderungen konnten insbesondere an den Hotspots (Codon 12, 13 und 61)
lokalisiert werden, also Regionen, welche eine erhöhte Auftrittswahrscheinlichkeit für
Mutationen haben. Zwei Studien ergaben jedoch, dass für den Hund Mutationen an
ras – Genen bei den untersuchten spontan vorkommenden Tumortypen keine große
Rolle zu spielen scheinen [26, 27].
Schwanbeck et al. konnten 2000 nachweisen, dass der Austausch einer einzelnen
Aminosäure in den AT – Hooks des HMGA1 Gens zum Verlust der Bindungsfähigkeit
des Proteins an den Interferon β Gen Promotor führt. Der Funktionsverlust des
Gewebehormons Interferon ist die Folge [28].
Zur Erforschung verschiedener Krankheitsbilder sowie Entwicklung möglicher
Therapiemethoden ist daher die qualitative und quantitative Detektion von SNPs für
die Medizin von großem Interesse.
Es bleibt jedoch zu erwähnen, dass ein großer Teil aller Punktmutationen ohne
Konsequenz bleiben.
2.2. Proteine der High - Mobility – Group Familie
Die Proteine der High - Mobility - Group Familie erhielten ihren Namen auf Grund
ihrer charakteristisch hohen Mobilität in PAGE-Gelelektrophoresen. Unterteilt werden
7
diese Nicht-Histon-Proteine seit 2001 auf Grund ihrer Aminosäuresequenzmotive,
der funktionellen Domänen sowie des Molekulargewichtes in die Familien HMGA,
HMGB sowie HMGN. Bei HMGA sind drei AT-Hooks zu finden, welche als
Bindungsdomäne an die DNA dienen, HMGB weist zwei HMG-Boxen auf,
wohingegen HMGN eine nucleosomale Bindungsdomäne besitzt [29].
Die HMGA - Proteine binden mit ihren AT-Hooks an die AT-reichen Regionen der
Minor-Groove der DNA und beeinflussen so über Konformationsänderungen die
Transkription.
Daher werden
sie
als
architektonische
Transkriptionsfaktoren
bezeichnet [30]. Die HMGA – Familie beinhaltet die Proteine HMGA1 und HMGA2,
wobei bei HMGA2 mindestens zwischen den beiden Splicevarianten HMGA2a und
HMGA2b [31] und bei HMGA1 zwischen den Isoformen HMGA1a, HMGA1b und
HMGA1c unterschieden werden muss. Diese Isoformen des HMGA1 - Proteins
werden kodiert von den entsprechenden Splicevarianten des HMGA1 - Gens [32].
Das canine HMGA1 – Gen wurde im Vorfeld dieser Arbeit auf cDNA – Ebene
charakterisiert und so die beiden Splicevarianten HMGA1a und HMGA1b
beschrieben [1, 33].
HMGA1
–
Proteine
sind
in
Geweben
zu
finden,
welche
sich
in
Differenzierungsprozessen befinden. Daher sind diese unter physiologischen
Bedingungen primär in embryonalem Gewebe nachweisbar. In den meisten adulten
Geweben sind diese Proteine nur noch in geringer Menge zu detektieren [34]. Ein
vermehrtes Auftreten von HMGA1 – Proteinen lässt sich jedoch auch in
ausdifferenziertem Gewebe zum Beispiel in Endothelzellen der Gefäße nach
Verletzungen [35] sowie bei apoptotischen Prozessen [36] nachweisen. Auch der
Zusammenhang zwischen HMGA1 – Protein und Entstehung verschiedener
Erkrankungen, insbesondere Tumoren gilt als erwiesen [2, 3]. Im adulten Individuum
findet man eine hohe Expression von HMGA1 – Protein in verschiedenen
Tumorgeweben [37, 38]. Aberrationen des humanen HMGA1 – Gens werden als
Ursache für eine Reihe benigner Tumore, wie endometriale Polypen, Lipome,
chondroide Lungenhamartome und uterine Leiomyome verantwortlich gemacht [3943]. Zudem wird HMGA1 auch im Zusammenhang mit malignen Tumoren diverser
Organe, beispielsweise an Pankreas, Cervix, Prostata, Lunge, Kolorektum und
Schilddrüse genannt [37, 44-58].
8
2.3. Das THADA - Gen
Ein weiteres Gen, welches neben dem HMGA1 Gen beim Menschen als
Kandidatengen bei der Entstehung von Tumoren der Schilddrüse eine Rolle zu
spielen scheint, ist das so genannte THADA – Gen. Chromosomale Aberrationen im
THADA – Gens (2p21) treten gehäuft bei Adenomen der Schilddrüse auf [5]. Da
THADA im Bruchpunkt liegt, gilt es als Kandidatengen, welches möglicherweise eine
zentrale Rolle bei der Entstehung dieser Neoplasien spielt. Um später zu evaluieren,
ob das canine THADA – Gen in einem Bereich liegt, welcher von Aberrationen
betroffen ist, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Lokalisation des caninen THADA
– Gens über FISH Mapping.
2.4. Der canine Karyotyp
Grundvoraussetzung zu FISH Lokalisation von Genen ist die Verfügbarkeit einer
standardisierten Chromosomennomenklatur für den zu untersuchenden Organismus.
Letztlich ist somit die Möglichkeit der Erkennung und Wiedererkennung von
Chromosomen der Schlüssel. Im Falle des Hundes machen sowohl die hohe Anzahl
an Chromosomen, als auch deren große Ähnlichkeit dieser in Form und Größe den
Karyotyp des Hundes zu einem der kompliziertesten unter den Säugetieren. In Folge
dessen sind in der Literatur diverse Veröffentlichungen über die Darstellung eines
caninen Karyogramms mit verschiedenen Bandentechniken und unterschiedlicher
Chromosomenanordnung zu finden [59-63]. Hunde besitzen 78 Chromosomen,
davon
76
akrozentrische
Autosomen
und
zwei
metazentrische
Geschlechtschromosomen, wobei es sich entweder um zwei X-Chromosomen oder
jeweils ein X- sowie ein Y-Chromosom handeln kann. Das X-Chromosom stellt das
größte, das Y-Chromosom das kleinste Chromosom im Genom des Hundes dar [62].
Die erste Beschreibung des caninen Karyotyps erfolgte durch Selden et al. (1975)
[64] (Abb.1). Vergleichend ist die Nomenklatur nach Reimann et al. (1996) sowie die
Abbildung der Chromosomen nach Giemsa–Trypsin–Giemsa Färbung (GTGBanding) dargestellt.
9
Abb.1: Schematische Darstellung der Nomenklatur eines Karyotyps nach GTG-Banding (rechts), nach
SELDEN et al. (1975) (links) und REIMANN et al. (1996) (Mitte)
Zur Erstellung einer international anerkannten Bandennomenklatur für den caninen
Karyotyp wurde im August 1994 das „Committee for the Standardized Karyotype“
gegründet, da keine der bis zu diesem Zeitpunkt beschriebenen Nomenklaturen den
Ansprüchen einer Standardnomenklatur entsprach [65]. So gelang es, Empfehlungen
zur Verwendung von Nomenklaturen für den caninen Karyotyp zu erstellen. Für die
Chromosomen 1 bis 21 kann demnach die Nomenklatur des Standard Committee
verwendet
werden
[66].
Bei
Bandenauflösung empfiehlt sich die
Chromosomenpräparationen
mit
höherer
Nomenklatur von Reimann et al. 1996 [60].
Diese enthält zusätzliche Subbanden, welche eine genauere Zuordnung der Gene
ermöglichen. Für die kleineren Chromosomen 22 bis 38 wird ausschließlich die
Nomenklatur von Reimann et al. (1996) bevorzugt (Abb.2).
10
Abb. 2 : Ideogramm des caninen Karyotyps von REIMANN et al. (1996) mit 460 nummerierten Banden
Zusammenfassend ist die Verfügbarkeit einer Nomenklatur zusammen mit dem
Wissen über die genaue Struktur eines Genes und dessen Lokalisation die
Grundlage, um Analysen durchzuführen, die strukturelle Veränderungen von Genen
charakterisieren. In dieser Arbeit wurde sowohl das canine THADA Gen erstmals
lokalisiert, als auch die genauere Struktur des caninen HMGA1 und dessen
Lokalisation bestimmt. Dies ermöglicht beim HMGA1 Gen Aussagen, welche Teile
des Gens genau von Chromosomenabberationen betroffen sind.
Im Falle des caninen THADA-Gens ermöglicht die vorgenommene Lokalisierung
erste Aussagen, ob der Lokus des Gens überhaupt von wiederkehrenden
Chromosomenaberrationen betroffen ist.
11
Zusätzlich zu diesen strukturellen Arbeiten wurde für das caninen HMGA1 Gen die
Lokalisierung des Gens in vivo vorgenommen. Hierzu wurde ein HMGA1-GFP
Fusionsprotein verwendet, welches eine Fluoreszenzdetektion ermöglicht.
Das „Green Fluoreszenz Protein“ (GFP) wurde im Jahr 1961 von Osamu Shimomura
aus der Qualle Aequorea victoria erstmals isoliert [67]. Für die Entdeckung des GFP
erhielten Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien 2008 den Nobelpreis in
Chemie. Dieses Protein kann bei Wellenlänge 395nm sowie 475nm angeregt werden
und emittiert dann grünes Licht der Wellenlänge 509nm. Dieses 238 Aminosäuren
große Protein kann wie hier geschehen über DNA - Expressionsvektoren mit jedem
anderen Protein gekoppelt werden. Somit kann man über GFP-Fusionsproteine in
vivo darstellen, wo Proteine in Zellen vorliegen bzw. wohin sie transportiert werden.
12
3. VERÖFFENTLICHUNGEN
Im Folgenden sind die im Verlaufe der Arbeit entstandenen Publikationen aufgeführt.
3.1.
Am 23. Juli 2008 wurde in BMC Genetics veröffentlicht:
Genomic Characterisation, Chromosomal Assignment and in Vivo Localisation of
the Canine High Mobility Group
Claudia Beuing†1, Jan T Soller†1,2, Michaela Muth2, Sigfried Wagner2, Gaudenz
Dolf3, Claude Schelling4, Andreas Richter2, Saskia Willenbrock1,2, Nicola ReimannBerg1,2, Susanne Winkler2, Ingo Nolte1, Jörn Bullerdiek1,2 and Hugo Murua
Escobar*1,2
1 Clinic for Small Animals and Reserch Cluster of Excellence *REBIRTH*, University
of Veterinary Medicine Hanover, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hanover, Germany
2 Centre for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str. ZHG, 28359
Bremen, Germany
3 Institute of Animal Genetics, Nutrition and Housing, University of Berne,
Switzerland
4 Department of Animal Sciences, Swiss Federal Institute of Technology Zurich and
Vetsuisse Faculty Zurich, University of Zurich, Zurich, Switzerland
* Corresponding author
† Equal contributors
13
3.2.
Am 3. Juni 2008 wurde in Molecular Cytogenetics publiziert:
Chromosomal Assignment of the Canine THADA Gene to CFA 10q25
Jan T Soller†1,2, Claudia Beuing†2, Hugo Murua Escobar*1,2, Susanne Winkler1, Nicola
Reimann-Berg1, Norbert Drieschner1, Gaudenz Dolf3, Claude Schelling4, Ingo Nolte2,
Jörn Bullerdiek1,2
1 Centre for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str. ZHG, 28359
Bremen, Germany
2 Small Animal Clinic and Reserch Cluster of Excellence *REBIRTH*, University of
Veterinary Medicine Hanover, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hanover, Germany
3 Institute of Genetics, Vetsuisse Faculty, University of Berne, Bremgartenstr. 109a
PO Box 8466, 3001 Bern, Switzerland
4 Department of Animal Science, Swiss Federal Institute of Technology Zurich,
Vetsuisse Faculty Zurich, University of Zurich, Winterthurerstrasse 204, 8057 Zürich,
Switzerland
* Corresponding author
†
Equal contributors
14
4. DISKUSSION
Das Wissen über die Struktur von Genen und Proteinen ist Voraussetzung für eine
Nutzung als potenzielle therapeutische Ziele, Marker oder für die Aufdeckung von
Mechanismen, die an relevanten pathogenen Ereignissen beteiligt sind.
Die Beteiligung der Proteine der High Mobility Group A1 an verschiedenen
Zellprozessen wurde vielfach beschrieben [39-41, 68]. Diese Proteine induzieren
Konformationsänderungen auf genomischer DNA Ebene und regulieren so indirekt
die Bindung von unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren [30].
Beim Menschen wurden chromosomale Aberrationen des HMGA1 Genlocus auf HSA
6p21 als Grund für verschiedene gutartige mesenchymale Tumore beschrieben,
während hohe Konzentrationen von HMGA1 Proteinen mit einem malignen Potential
unterschiedlicher Tumortypen in Verbindung gebracht werden [39-41].
Da es im biologischen Verhalten und den jeweiligen Erscheinungsbildern von
Tumoren viele Parallelen zwischen Mensch und Hund gibt, wird der Hund als Model
für therapeutische und vorklinische Studien herangezogen [69, 70]. Das Genom des
Hundes wurde zwar vollständig sequenziert, die Struktur des HMGA1 - Gens konnte
jedoch bislang nicht evaluiert werden, was in der vorliegenden Arbeit erfolgte.
Um vergleichende Studien zwischen caninen und humanen Tumoren erstellen zu
können, ist das Verständnis/ die Kenntnis der jeweiligen caninen Kandidatengene
sowie deren Genprodukte eine Grundvoraussetzung. Die Struktur des HMGA1 –
Gens konnte nun in der vorliegenden Arbeit entschlüsselt und beschrieben werden.
Das Hauptziel der Studie war es, die genomische Struktur des caninen HMGA1 Gens zu charakterisieren, um einen Vergleich der Struktur mit den Gegenstücken
anderer Säugetiere zu ermöglichen und somit weitere Analysen zur evolutionären
15
Konservierung der Gene und eine vergleichende Analyse von eventuellen
chromosomalen Abberationen bei verschiedenen Arten zu erlauben.
Weitere Ziele dieser Arbeit bestanden in der in vivo Lokalisierung des caninen
HMGA1 Proteins und die Evaluation einer im Vorfeld beschriebenen Punktmutation,
die ein mutiertes Protein verursacht.
Während frühere Studien die Lokalisierung einer HMGA1 - Gen positiven BAC auf
CFA 23 [71] beschrieben, unterstützen die durchgeführten in silico Analysen und die
kürzlich veröffentlichte Genom Anordnung des Hundes [12] die in dieser
Untersuchung durch FISH beschriebene Zuordnung des hündischen HMGA1 - Gens
auf CFA 12q11.
Die genomische Struktur des caninen HMGA1 - Gens besteht insgesamt aus 7
Exons und 6 Introns. Insgesamt umfasst das canine HMGA1 - Gensequenz 9524 bp.
Ein Teil des caninen Intron 2 blieb aufgrund einer vielfachen CG Wiederholung
unsequenziert, es konnte lediglich die Anzahl der Nukleotiden mit 311bp bestimmt
werden. Eine solche Sequenz existiert ebenso im menschlichen Genom.
Die
Exon/Intron
Struktur,
Größe
und
Homologien
zu
ihren
menschlichen
Gegenstücken wurden analysiert und bestimmt.
Die Identität zu der entsprechenden humanen Region beträgt 62,8 %, wobei die
Homologie zu den menschlichen Gegenstücken im Einzelnen bei den Exons
zwischen 74,6 % und 97,8 %, bei den Introns zwischen 58,9 % und 92,4 %
schwanken.
Die neu charakterisierten Sequenzen haben in Verbindung mit den in silico Analysen
aufgedeckt, dass das Exon 4, welches beim Menschen existiert, im caninen, wie im
Übrigen auch im entsprechenden Gen der Maus, fehlt.
Da die genomische Charakterisierung des caninen HMGA1 - Gens nicht verfügbar
war, als die Exonen in der Vergangenheit benannt wurden, beruhte die
Nummerierung
zu
der
Zeit
auf
den
entsprechenden
menschlichen
Exon-
Nummerierung, wie sie von Friedmann et al.[32] definiert wurden. Demzufolge sollte
die bisher verwendete canine Exon-Nummerierung in dem Sinne überarbeitet
16
werden, dass das bisherige canine Exon 5 nun als Exon 4 und fortlaufend bezeichnet
wird.
Bei der Charakterisierung des canine HMGA1 - CDS von zwölf Hunderassen zeigte
ein Dackel in Exon 6 eine Punktmutation von A nach G. Dies hatte einen
Aminosäurenaustausch von Threonin nach Alanin zur Folge [1].
Um die Häufigkeit dieser Mutation zu evaluieren, wurden DNA-Proben von 55
Dackeln untersucht.
Das mittels Sequenzierung und Restriktions-Fragment-Analyse ermittelte Ergebnis
zeigt deutlich, dass es sich um ein seltenes Ergebnis handelt. Bei der vorliegenden
Untersuchung des Genoms von 55 Teckeln wurde die gesuchte Punktmutation in
keinem Fall gefunden. Betrachtet man das Ergebnis dieser Untersuchung isoliert,
ergibt sich gemäß Sachs [72], Formel 6.28, ein Konfidenzintervall von 0,00% bis
2,69%. Bezieht man hingegen den bereits auf einem Allel nachgewiesenen SNP mit
in die Berechnung, so lässt sich eine wahre Wahrscheinlichkeit von 0,893%
vermuten. Der 95% - Vertrauensbereich liegt in diesem Fall bei 0,023% bis 4,9%.
Somit deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass die vormals gefundene Mutation
wahrscheinlich keine wichtige Rolle in der HMGA1 Pathogenese bei Dackeln spielt.
Bei verschiedenen Spezies werden deutliche Unterschiede im Hinblick auf Anzahl
und Wahrscheinlichkeit auftretender SNPs beschrieben, wobei diese Tatsache im
direkten Zusammenhang mit der Gesamtzahl der Studien für die unterschiedlichen
Spezies zu sehen ist. Es kann angenommen werden, dass ebenso wie bei dem
Menschen die Gesamtzahl der gefunden SNPs bei den einzelnen Spezies mit
entsprechend höherem Forschungsaufwand signifikant ansteigen wird.
Während 2001 Sachidanandam et al. [10] 1,42 Mio SNPs im menschlichen Genom
bei einem SNP pro 1,9 kb bestimmten, wird die Anzahl von berichteten SNPs in den
öffentlichen Datenbanken mit ca. 9 Mio. für das menschliche Genom geschätzt [11].
Für den Hund berichteten Lindblad-Toh et al. von 2,5 Mio SNPs, wobei die
Wahrscheinlichkeit abhängig von der Rasse zwischen einem SNP pro 1500 bp und
900 bp schwankt [12].
17
Mittels in vivo Lokalisierung des caninen HMGA1 Proteins unter Verwendung eines
GFP Fusionsproteins konnte der seinem menschlichen Gegenstück entsprechende
Ort (im Zellkern) nachgewiesen werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte das canine THADA – Gen auf der chromosomalen
Bande 10q25 lokalisiert werden. Es wurde untersucht, ob diese Lokalisation als
Hotspot zu sehen ist für chromosomale Mutationen der Schilddrüse. Durch die
vorgenommene Lokalisation ist es nun möglich zu untersuchen, ob das canine
THADA – Gen eine Rolle als Kandidatengen bei caninen Schilddrüsenadenomen
eine
Rolle.
Obgleich
es
bezüglich
zytogenetischer
Daten
canine
Schilddrüsenadenome betreffend in der Literatur noch mangelt, kann man aufgrund
der vorgenommenen Gen-Lokalistion und der beschriebenen zytogenetischen
Untersuchungen davon ausgehen, dass die Region, auf welcher das THADA – Gen
lokalisiert werden konnte, nicht als Hotspot für die Entstehung chromosomaler
Aberrationen gesehen werden kann.
Die durchgeführten Charakterisierungen des caninen HMGA1 Gens und Proteins
erlaubt eine vergleichende Analyse von Abweichungen bezüglich der Gene und
Proteine von Menschen und Hunden als Grundlage für die Aufdeckung von
Mechanismen, die an HMGA1 bezogenen Pathogenesen bei beiden Spezies beteiligt
sind. Die durchgeführten Lokalisationen des caninen HMGA1 und THADA Gens
ermöglichen die Untersuchungen, ob die Loki dieser Gene von chromosomalen
Abberationen betroffen sind.
18
5. ZUSAMMENFASSUNG
Claudia Beuing
Charakterisierung des Caninen High – Mobility – Group A1 (HMGA1) Gens und
Detektion von Punktmutationen
In der vorliegenden Arbeit wurden molekularbiologische Untersuchungen am caninen
HMGA1 – Gen sowie des THADA – Gen durchgeführt.
Dabei ging es zum einen um die Evaluierung einer bereits bei einem Teckel
gefundenen Punktmutation auf dem HMGA1 – Gen.
Bei der vorliegenden Untersuchung des Genoms von 55 Teckeln wurde die gesuchte
Punktmutation in keinem Fall gefunden. Man kann also sagen, dass das Vorkommen
der gesuchten Genveränderung als sehr unwahrscheinlich einzuschätzen und die
Relevanz für die Gesamtpopulation an Teckeln als fraglich anzusehen ist.
Im weiteren Verlauf der Arbeit konnten große Teile der genomischen Struktur des
HMGA1 – Gens charakterisiert sowie dessen genaue Lokalisation auf CFA 12q11
(Canis familiaris) festgelegt werden.
Die in vivo Lokalisierung des caninen HMGA1 Proteins zeigte, dass dieses
entsprechend seinem humanen Gegenstück im Nukleus lokalisiert ist.
Das canine THADA – Gen konnte auf der chromosomalen Bande 10q25 lokalisiert
werden. Die vorliegende Untersuchung ergab, dass das canine THADA – Gen auf
einer chromosomalen Region lokalisiert ist, welche bei Hunden keinen Hotspot für
chromosomale Aberrationen darstellt.
19
6. SUMMARY
Claudia Beuing
Genomic characterisation of the canine High – Mobility – Group A1 (HMGA1) gene
and detection of pointmutations
In the present dissertation a molecular biological investigation of the canine HMGA1
– gene as well as the THADA – gene was conducted.
This consisted on one hand of the evaluation of a previously described point
mutations of the HMGA1 – gene in the dachshund.
In the present study of the genomes of 55 dachshunds the targeted pointmutation
was not found in a single case. One can therefore say that the occurrence of the
gene mutation under investigation is very improbable and the relevance for the
general population of dachshunds is to be regarded as questionable.
On the other hand in the further stages of the study part of the genomic structure of
the HGMA1 – gene were characterized and its precise localization on the CFA 12q11
(Canis familiaris) was performed.
The in vivo localization of the canine HMGA1 proteins showed that equivalently to its
human counterpart the protein is located in the nucleus.
The canine THADA – gene could be localized on chromosomal band 10q25. The
present study shows that the canine THADA – gene is located in a region, which
does not represent a hotspot for chromosomal aberration in dogs.
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DANKSAGUNG
Ich danke Herrn Prof. Dr. I. Nolte und Prof. Dr. J. Bullerdiek für die Überlassung des
interessanten Themas sowie die jederzeit gewährte fachliche Unterstützung bei der
Erstellung der Arbeit.
Besonderer Dank gilt Herrn Dr. Hugo Murua Escobar für die großartige Hilfe und sehr
starken Nerven bei Erklärungen und der Lösung von für mich scheinbar unüberwindbaren
Problemen. Und natürlich für jede Menge Spaß!
Meiner Arbeitsgruppe danke ich für die vielen fachlichen Hilfestellungen und die lieb
gemeinten Versuche, einer Tierärztin die Molekularbiologie nahe zu bringen.
Michaela Muth gab mir nicht nur fachliche Unterstützung, sondern war auch und im
Besonderen in sehr schweren Zeiten mit viel Herz und Verständnis immer für mich da.
Meinem Schwesterherz Diana Brunnhuber, meinem Lieblingsschwager Martin K.S.
Brunnhuber, Lieblingstante Jutta Hüppop und Lieblingsonkel Dr. Egbert Casper danke ich für
die vielen seelischen Aufbauarbeiten und technischen Hilfestellungen, die mir aus manchem
Tief halfen.
Ein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern Wolfgang und Brigitte Oehm, die mich auf
beispiellose Art jederzeit unterstützen und immer an mich glauben.
Ich danke „Mima“ für die täglichen Telefonate, die vielen „Noteinsätze“ bei der Betreuung von
Niklas und Moritz und die liebevolle Fürsorge, mit der sie zu jeder Zeit für uns da ist.
„Pipa“ danke ich für die zahllosen Gespräche, sachlich fundierten und gleichzeitig liebevollen
Ratschläge und das Gefühl jederzeit von einem guten Freund begleitet zu werden. Am
allermeisten aber für die Einstellung, dass ein Glas höchstens halb voll, nie aber halb leer
sein kann.
Last but not least danke ich meinen Söhnen Niklas und Moritz, die mir mit ihrer wundervollen
Art jeden Tag neuen Mut gaben, an meinem Ziel festzuhalten.
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