Skript zur Vorlesung „Molekulare Biotechnologie der Prokaryoten“ 1

Skript zur Vorlesung
„Molekulare Biotechnologie der Prokaryoten“
1. Einführung
Vorteile der Biotechnologie für die Chemieproduktion
- Spezifität und Selektivität
-
Lieferung des gewünschten Endprodukts ohne
-
Weiterverarbeitung aus einer Vorstufe
-
Stereoselektive Synthese chiraler Substanzen:
•
Keine Racemate
•
Keine aufwändigen Trennungsverfahren
•
Keine Verunreinigungen des Endprodukts
Vorteile rekombinanter Medikamente
Meilensteine der Molekularen Biotechnologie
2. Thermophile Bakterien
Eigenschaften thermostabiler Enzyme
Beispiele für technische Anwendungen thermophiler und hyperthermophiler
Enzyme
3. Psychrophile Bakterien
Wie werden psychrophile Organismen definiert?
Psychrophile Organismen wachsen optimal unter 15°C. Deren oberstes
Temperaturlimit ist 20°C.
Psychrotolerante Organismen tolerieren Temperaturen bis 0°C oder darunter.
Optimales Wachstum zeigen sie bei 20-25°C. Das obere Temperaturlimit liegt bei etwa
30°C.
Anpassungsstrategien psychrophiler Bakterien:
1. Durch die Synthese von RNA-Chaperone können RNA-Sekundärstrukturen
aufgelöst und so mRNAs für die Translation zugänglich gemacht werden.
2. Durch den Einbau langkettiger, vielfach ungesättigter Fettsäuren kann die
Fluidität der Membranstrukturen aufrechterhalten werden.
Eicosapentaensäure (EPA)
Docosahexaensäure (DHA)
3. Durch eine erhöhte Flexibilität der Proteinstruktur können kälteangepasste
Enzyme psychrophiler Organismen auch noch bei Temperaturen um den
Gefrierpunkt effizient arbeiten.
Eigenschaften kälteangepaßter Enzyme
Niedrigtemperaturexpressionssysteme zur Produktion kälteaktiver Enzyme
z.B. E. coli cspA-Promotersystem oder Pseudoalteromonas haloplanktis
4. Acidophile Bakterien
z.B. Picrophilus torridus (Fütterer, O. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,
9091-9096)
Technisch interessante Enzyme:
- Protein- oder Polysaccharid-abbauende Enzyme in der Getränkeindustrie
z.B. Glucoamylase, ein Stärke abbauendes Enzym, das optimal bei pH 2 arbeitet
und zudem bei hohen Temperaturen stabil sein sollte.
- Fett-spaltende Enzyme
Bakterielles Leaching (mikrobielle Erzlaugung):
Die Gewinnung von Schwermetallen (Kupfer, Zink, Cobalt, Nickel, Gold und
Uran) aus ihren Erzen durch Umwandlung von unlöslichen Erzmineralen zu
wasserlöslichen Salzen durch Mikroorganismen.
Die unlöslichen Metallsulfide werden durch eisenoxidierende Bakterien (z.B.
Acidithiobacillus ferrooxidans, pH = 2) in lösliche Sulfate umgewandelt und damit
in Lösung gebracht.
-
--
HS + 2O --> S0 + H
2
+
4
--
S° + H 0 + 1½O --> S0
2
2
4
+
+2H
5. Alkaliphile Bakterien
Nutzung von Enzymen alkaliphiler Bakterien in Detergenzien; viele Detergenzien
arbeiten im alkalischen Milieu:
Einsatz von z.B. alkaliphilen Proteasen, Lipasen und Amylasen
Single-Cell-Protein-Produktion mithilfe alkaliphiler Bakterien z.B. Spirulina
platensis
6. Halophile Bakterien
Klassische biotechnologische Nutzung halotoleranter Bakterien:
-
Leuconostoc mesenteroides zur Sauerkraut-Herstellung (2,5 % Salz)
-
Lactobacillus lactis zur Herstellung von Sojasauce (12-27 % Salz)
Wie haben sich halophile Organismen an hohe Salzkonzentrationen
angepaßt?
- bilden hohe Konzentrationen an osmoprotektiven Substanzen (compatible
solutes):
z.B. Ectoin (1,4,5,6-Tetrahydro-2-Methyl-4-Pyrimidincarboxylat), Glycinbetain,
Dimethylsufoniopropionat, Trehalose und Glyzerin
Was entsteht aus dem Abbau von Dimethylsulfoniopropionat (DMSP)?
Wirkmechanismus osmoprotektiver Substanzen?
Wie funktioniert die technische Produktion von Ectoin in Halomonas elongata?
Bacterial Milking
7. Strahlen-resistente Bakterien
Anpassungsstrategien von Deinococcus radiodurans
8. Magnetotaktische Bakterien
Beispiel: Magnetospirillum gryphiswaldense ein magnetotaktisches Bakterium aus
dem Ryck
Magnetotaktische Bakterien enthalten Magnetosomen mit denen sie sich
entsprechend des magnetischen Erdfeldes ausrichten können. In den
Magnetosomen befinden sich Magentitpartikel aus Fe3O4.
9. Klonierung und Screening von Enzym-kodierenden Genen aus
kultivierbaren Organismen bzw. Umweltproben
Alternative Methoden zur Erschließung der bisher nicht kultivierbaren mikrobiellen
Diversität?
Prinzip der 454-Pyrosequenzierung?
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ist ein künstliches Chromosom, das auf
dem single-copy F-Plasmid von E. coli beruht.
Screening von (Meta)Genombibliotheken
1. Sequenz-basiertes Screening über PCR-Techniken (z.B. Inverse- oder
Vektoretten-PCR) oder Koloniehybridisierungen
2. Aktivitäts-basiertes Screening
10.
Expressionssysteme
Genetische Optimierung von E. coli Sicherheitsstämmen
1. Ausschaltung von DNA-Restriktions-/Modifikationssystemen
2. Ausschaltung von DNA-Rekombinationssystemen
3. Ausschaltung der periplasmatischen Endonuklease I, spaltet Duplex-DNASequenzen, dadurch verbesserte Plasmid-Preparation
Beispiele für gentechnisch genutzte Plasmidvektoren?
Stabilisierung von plasmidhaltigen Zellen durch:
1. Resistenz-Marker
2. Auxotrophie-Marker
3. Verhinderung der Bildung von Plasmid-Multimeren
4. aktive Verteilung der Plasmide auf die Tochterzellen
5. Suizidsysteme
hok/sok Suizidsystem?
Regulation des lac-Promotors?
Optimierung des Codon usage rekombinanter Gene:
1.
Co-Expression der seltenen tRNAs
2.
Austausch der seltenen Codons durch gezielte Mutagenese
3.
Austausch der seltenen Codons durch Gensynthese
Einsatz von Fusiontags/Proteinfusionen:
1.
Förderung der Translationseffizienz
2.
Unterstützung der korrekten Proteinfaltung
3.
Proteinisolation
z.B. Thioredoxin, GST-tag (GST = Glutathione-S-Transferase),
Maltosebindeprotein (MBP), His-tag und Strep-tag
Protein A als Affinitäts-tag:
Protein A ist ein bakterielles Zellwandprotein von Staphylococcus aureus mit einer
spezifischen Affinität zur Fc-Region von Immunglobulinen der G-Klasse (IgG).
Die Affinitätschromatographie an Protein A-Sepharose ist eine der verbreitesten
Methoden zur Antikörperreinigung.
Anwendung von Intein-Sequenzen zur Freisetzung von Fusions-tags ohne
Nutzung einer externen Protease:
Inteine sind interne Proteinsequenzen die autokatalytisch herausgeschnitten
werden, um das reife Protein zu erhalten. Dabei werden mindestens zwei Exteine
generiert, die wieder miteinander verbunden werden müssen.
Dieser Vorgang wird auch als Protein-Splicing bezeichnet.
= autokatalytisches Ausschneiden einer Peptidsequenz (das INTEIN) aus einer
Proteinvorstufe und die Ligation der flankierenden Peptidfragmente (die
EXTEINE) unter Ausbildung des reifen Proteins.
Kriterien für die Auswahl eines industriell genutzten Expressionssystems
1. in Abhängigkeit von der Patentsituation
2. in Abhängigkeit von notwendigen Proteinmodifizierungen:
z.B. Proteinglykosylierungen, Proteinprozessierungen (N-terminales Methionin),
Kofaktor-Regenerierung, Proteinfaltung
3. in Abhängigkeit von der gewünschten Lokalisation des Proteins
4. in Abhängigkeit vom erzielten Expressionsniveau (Ausbeute)
11.
Proteinsekretion
Die drei Hauptstrategien der bakteriellen Proteinsekretion:
1. Sec-Weg, sekretiert Polypeptide post-translational
2. Signal Recognition Particle (SRP) Pathway, sekretiert Polypeptide cotranslational
3. Tat Pathway
Signalpeptide zeigen eine dreiteilige Struktur:
(N) positiv-geladene N-Domäne mit vor allem Lysin und/oder Arginin),
(H) hydrophobe H-Domäne,
(C) C-Domäne mit spezifischer SPase-Schnittstelle
Bottlenecks der Proteinsekretion in B. subtilis?
12.
Synthetische Biologie - Designer-Bugs
1. Schritt: Definition „Essential genome“ (Minimalgenom)
2. Schritt: Synthese und Fusion großer DNA Fragmente
Das „Venter-Experiment“: Gibson et al. Creation of a Bacterial Cell Controlled
by a Chemically Synthesized Genome Science (2010)
13.
Industrielle Fermentationsprozesse
Das Scale-up (Maßstabsvergrößerung) Problem:
In großen Bioreaktoren können Nährstoff-, pH- sowie Sauerstoff-Gradienten entstehen.
Des Weiteren erfahren die Zellen einen erheblichen physikalischen Streß. Solche
Imbalanzen im Bioreaktor können die Physiologie und Produktivität der Wirtszellen
negativ beeinflussen.
Bioprozeß-relevante Markergene
- Gene, die streng reguliert sind und deren Expression spezifisch durch definierte
Änderungen in den physikalischen bzw. Nährstoff-Bedingungen eines Bioprozesses
induziert wird.
Wie kann während einer Fermentation die Expression prozesskritischer Markergene
bestimmt werden?
14.
Patente
Ein Patent sichert eine Erfindung die
1. neu und damit nicht Stand der Technik ist
2. nicht nahe-liegend ist und
3. gewerblich anwendbar ist.