Strukturelle und kinetische Untersuchungen zum Mechanismus und
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Strukturelle und kinetische Untersuchungen zum Mechanismus und Vorhersage der stereoselektiven Substraterkennung von Lipasen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität zu Marburg vorgelegt von Marco Bocola aus Lübeck Marburg/Lahn 2002 I Vom Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am 12.2.2002 angenommen. Tag der mündlichen Prüfung: 12.2.2002 Erstgutachter: Prof. Dr. G. Klebe Zweitgutachter: PD Dr. B. Hauer II Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von November 1997 bis Februar 2002 am Institut für pharmazeutische Chemie und Biochemie der Philipps-Universität in Marburg / Lahn unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. G. Klebe durchgeführt. III Für Denise Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. G. Klebe und Dr. Bernhard Hauer (BASF AG) für die sehr interessante Aufgabenstellung. Herrn Dr. T. Friedrich, Andreas Schädler und Volker Wengert sowie Dr. Markus Matuschek und Silvia Volkmer-Adamy danke ich für die Ermöglichung der fruchtbaren Aufenthalte und die Unterstützung bei der Fermentation und Reinigung der Lipasen in Ludwigshafen bei der BASF AG. Herrn Dr. M. T. Stubbs, Dr. Ulrich Graedler und Dr. Andreas Bergner danke ich für Hinweise zum kristallographischen Hintergrund der Arbeit und die anregenden, kritischen Diskussionen. Herrn Dr. Christoph Sotriffer danke ich für die Einführung und die kritischen Hinweise zur Durchführung und Auswertung der Molekulardynamischen Simulationen und der Konformationssuche. Ich danke allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Klebe für die stetige Diskussionsbereitschaft sowie freundliche Unterstützung und allzeit laufende Computer während dieser Arbeit. Insbesondere allen, die durch gutes Arbeitsklima dazu beigetragen haben, auch die Klippen der Forschung zu umschiffen ohne die Motivation zu verlieren. IV The World Is Made Up Of The Wills, The Won'ts, And The Cant's: The Wills Do Everything, The Won'ts Do Nothing, The Can'ts Can't Do Anything. From Walt Disney's "Black Hole" But Be Aware Of The Coulds The Coulds Could Model Everything From Marco's "Moloc Md-Movie" V Inhaltsverzeichnis : 1 Einführung........................................................................................................................... 1 1.1 Einleitung ................................................................................................................................................ 1 1.2 Motivation ............................................................................................................................................... 3 2. Biologisches System............................................................................................................ 4 2.1 Eigenschaften von Lipasen...................................................................................................................... 4 2.2 Vorkommen von Lipasen ........................................................................................................................ 5 2.2.1 Lipasebildende Bakterien ................................................................................................................ 5 2.2.1.1 Lipasen gram-negativer Bakterien .............................................................................................. 7 2.2.1.2 Lipasen gram-positiver Bakterien ............................................................................................... 7 2.3 Reinigung von Lipasen ........................................................................................................................... 7 2.4 Enzymmechanismus von Lipasen ........................................................................................................... 8 2.4.1 2.5 Enzymkinetik ........................................................................................................................................ 11 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4 2.5.5 2.6 Kinetischer Enzymmechanismus von Lipasen .............................................................................. 13 Burst-Kinetik................................................................................................................................. 14 Grenzflächenaktivierung ............................................................................................................... 15 Aktivitätsbestimmungen................................................................................................................ 17 Inhibition von Lipasen .................................................................................................................. 19 Struktur von Lipasen ............................................................................................................................. 20 2.6.1 2.6.2 2.6.3 3 Reaktionsmechanismus einer lipasekatalysierten Reaktion ............................................................ 8 Gemeinsame Raumstruktur der a/bHydrolasen ............................................................................ 20 Offene und geschlossene Raumstrukturen von Lipasen................................................................ 21 Lipasen mit bekannter Raumstruktur ............................................................................................ 23 Kenntnisstand über den Einsatz von Lipasen .................................................................... 24 3.1 Pharmazeutische und industrielle Einsatzmöglichkeiten von Lipasen .................................................. 24 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.2 Waschmittel................................................................................................................................... 24 Nahrungsmittel- und Kosmetikindustrie ....................................................................................... 24 Esterifikation und Interesterifikation............................................................................................. 25 Selektivität ............................................................................................................................................ 25 3.2.1 Stereospezifische Katalysen .......................................................................................................... 26 3.2.1.1 Kinetische Racematspaltung ..................................................................................................... 26 3.2.1.2 Stereospezifität für sekundäre Alkohole ................................................................................... 29 3.3 Computergestützte Vorhersage der Enantioselektivität ........................................................................ 31 3.4 Mutagenese von Lipasen....................................................................................................................... 33 3.4.1 3.4.2 Gerichtete Mutagenese.................................................................................................................. 33 Ungerichtete Mutagenese .............................................................................................................. 34 VI 4 Material und Methoden ..................................................................................................... 36 4.1 Röntgenstrukturanalyse......................................................................................................................... 36 4.1.1 Aufnahme von Röntgendaten........................................................................................................ 37 4.1.2 Erzeugung von Röntgenstrahlen ................................................................................................... 37 4.1.2.1 Röntgengenerator ...................................................................................................................... 37 4.1.2.2 Synchrotonstrahlung.................................................................................................................. 38 4.1.3 Proteinkristallisation...................................................................................................................... 39 4.1.3.1 Candida antarctica Lipase B .................................................................................................... 39 4.1.3.2 Bugkholderia plantarii Lipase................................................................................................... 39 4.1.4 Auswertung der Röntgendaten ..................................................................................................... 40 4.1.5 Strukturbestimmung von kleinen organischen Molekülen ............................................................ 41 4.1.5.1 Datensammlung ........................................................................................................................ 41 4.1.5.1 Strukturlösung ........................................................................................................................... 41 4.2 Proteinreinigung.................................................................................................................................... 42 4.2.1 Candida antarctica Lipase B ........................................................................................................ 42 4.2.2 Burkholderia plantarii Lipase ....................................................................................................... 42 4.2.2.1 Wildtyp und Produktionsstamm ................................................................................................ 42 4.2.2.2 Rekombinante Lipase ................................................................................................................ 43 4.2.2.3 Chromatofokussierung .............................................................................................................. 44 4.2.2.4 Metall-Chelat-Chromatographie ............................................................................................... 44 4.3 Aktivitätsbestimmung und Inhibition.................................................................................................... 45 4.3.1 Tributerintest ................................................................................................................................. 45 4.3.2 Photometrisches Essay .................................................................................................................. 45 4.3.3 Synthese der Inhibitoren................................................................................................................ 46 4.3.3.1 Synthese der Phosphonamide.................................................................................................... 46 4.3.3.2 Synthese der Phosphonester ...................................................................................................... 47 4.4 Bestimmung der Proteinkonzentration ................................................................................................. 48 4.4.1 4.4.2 4.5 Transiente Kinetik mittels Stopped-Flow-Spektrofluorometrie ........................................................... 48 4.5.1 4.5.2 4.6 Aufbau des Messsystems .............................................................................................................. 48 Reaktionsbedingungen .................................................................................................................. 49 Sodiumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektro phorese (SDS-PAGE).......................................... 51 4.6.1 4.6.2 4.6.3 4.7 Absorption bei 280 nm.................................................................................................................. 48 BCA-Mikrotiterplatten-Test.......................................................................................................... 48 Puffer für SDS-PAGE ................................................................................................................... 51 Molekulargewichtsmarker............................................................................................................. 52 Coomassie-Färbung....................................................................................................................... 52 Deglycosilierung ................................................................................................................................... 52 4.7.1 4.7.2 N-Glycosidase F............................................................................................................................ 52 Endoglycosidase H........................................................................................................................ 53 4.8 MALDI-TOF Massenspektrometrie...................................................................................................... 53 4.9 Konformationsanalyse........................................................................................................................... 54 4.9.1 4.9.2 4.10 Systematische Suche ..................................................................................................................... 54 Docking mit FLEXX..................................................................................................................... 54 Molekulardynamische Simulationen .................................................................................................. 55 4.10.1 Grundlagen.................................................................................................................................... 55 4.10.2 Kraftfelder ..................................................................................................................................... 56 4.10.3 Durchführung von Simulationen ................................................................................................... 57 4.10.3.1 Simulation mit MOLOC und MAB ............................................................................................ 57 4.10.4 Auswertung von MD-Simulationen .............................................................................................. 57 4.11 Homologiemodellierung........................................................................................................................ 58 VII 5. Ergebnisse Teil I Candida antarctica Lipase B ................................................................ 59 5.1. Proteinreinigung und Charakterisierung ............................................................................................... 59 5.2 Enzymkinetik ........................................................................................................................................ 62 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.3 Kinetische Racematspal-tung von Phenylethyl-amin mit CaL B .......................................................... 65 5.3.1 5.4 Temperaturabhängigkeit der kinetischen Racematspaltung .......................................................... 65 Kovalente Inhibition von Lipasen ......................................................................................................... 67 5.4.1 5.4.2 5.5 Michaelis-Menten-Kinetik ............................................................................................................ 62 Lösungsmittelabhängigkeit ........................................................................................................... 62 Aktivierung von Lipasen durch Detergenzien............................................................................... 63 Burst-Kinetik................................................................................................................................. 64 Inhibition von CaL B..................................................................................................................... 67 Nachweis der Inhibition von CaL B durch MALDI-TOF MS ..................................................... 68 Kristallstrukturen................................................................................................................................... 71 5.5.1 Struktur der Phenylethylamid-Inhibitoren..................................................................................... 71 5.5.1.1 Struktur des RpSc-Phenylethylamid-Inhibitor ........................................................................... 71 5.5.1.2 Struktur des SpSc -Phenylethylamid-Inhibitor ........................................................................... 72 5.5.2 Kristallstruktur der CaL B............................................................................................................. 74 5.5.2.1 Apo-Struktur CaL B .................................................................................................................. 74 5.5.2.2 Komplex von SpRc-Phenylethylamid-Inhibitor mit CaL B ....................................................... 76 5.5.2.4 Komplex von SpSc -Phenylethylamid-Inbibitor mit CaL B ....................................................... 79 5.6.1 Kraftfeldrechnungen...................................................................................................................... 82 5.6.2 Systematische Suche ..................................................................................................................... 83 5.6.3 Docking mit FLEXX ....................................................................................................................... 85 5.7 Molekulardynamische Simulationen .................................................................................................... 87 5.7.1 5.7.2 5.7.3 6 Michaelis-Komplex....................................................................................................................... 87 Acyl-Enzym und Amin ................................................................................................................. 89 Tetraedrisches Intermediat ............................................................................................................ 90 Diskussion und Ausblick Candida Antarctica Lip B ........................................................ 92 6.1 Reinigung und Kristallisation................................................................................................................ 92 6.2 Untersuchungen zum Katalysemechanismus ........................................................................................ 94 6.3 Komplex-Strukturen mit enantiomerenreinen Inhibitoren ................................................................... 98 6.4 Computergestütze Konformationssuche und MD-Simulationen......................................................... 101 6.5 Ausblick .............................................................................................................................................. 102 VIII 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase ........................................................... 103 7.1. Proteinreinigung und Charakterisierung der BpL .............................................................................. 103 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.2 BASF Produktionsstamm ............................................................................................................ 103 Wildtyp........................................................................................................................................ 109 Rekombinante Bpl-Mutante F142W .......................................................................................... 113 Enzymkinetik ...................................................................................................................................... 115 7.2.1 5.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 Michaelis-Menten-Kinetik .......................................................................................................... 115 Lösungsmittelabhängigkeit ......................................................................................................... 115 Aktivierung durch Detergenzien ................................................................................................. 115 Burst-Kinetik............................................................................................................................... 116 Fluoreszenzuntersuchung der BpL F142W ................................................................................. 116 7.3 Kovalente Inhibition von BpL............................................................................................................. 117 7.4 Röntgenstruktur der BpL Mutante F142W ........................................................................................ 118 7.4.1 7.5 Homologiemodellierung...................................................................................................................... 120 7.5.1 7.5.2 7.5.3 7.6 Burkholderia plantarii Lipase F142W ........................................................................................ 118 Homologiemodellierung mit MODELLER 4.............................................................................. 122 Manuelle Homologie-Modellierung............................................................................................ 122 Homologiemodellierung mit MODELLER 6.............................................................................. 122 Strukturbasierte fokussierte Mutagenese von BpL.............................................................................. 123 7.6.1 Rationale Auswahl relevanter Aminosäuren ............................................................................... 123 7.6.2 Auswahlstrategie für substratspezifisch fokussierte Mutationen ................................................ 126 7.6.2.1 Mutanten zur Aktivitätssteigerung gegenüber Phenylessigsäure-Estern ................................. 127 7.6.2.2 Mutanten zur Enantiomerentrennung von Methoxycyclohexanol .......................................... 130 8 9 Diskussion und Ausblick Burkholderia plantarii Lipase ................................................ 131 8.1 Reinigung und Kristallisation.............................................................................................................. 131 8.2 Kinetik und Inhibition ......................................................................................................................... 134 8.3. Struktur und Homologiemodellierung................................................................................................. 135 8.4. Strukturbasierte Vorhersage von Mutanten......................................................................................... 136 8. 5 Ausblick .............................................................................................................................................. 138 Zusammenfassung ........................................................................................................... 140 Anhang A Literaturverzeichnis ............................................................................................ 143 Anhang B Abkürzungsverzeichnis....................................................................................... 152 IX Kapitel 1 1 Einführung und Motivation tationsanalysen mit anschliessender Aktivitäts- EINFÜHRUNG und Stabilitätsuntersuchung. 1.1 Einleitung Durch die wachsende Zahl von Röntgenstruktu- Enzyme sind als Biokatalysatoren für die meis- ren homologer Enzyme ist auch ein strukturel- ten biochemischen Umsetzungen im Organis- ler Vergleich möglich geworden. Diese Studien mus verantwortlich. Damit ist es möglich, bio- führen zum Auffinden der essentiellen Amino- organische Reaktionen im physiologischen säuren für die Stabilität eines Faltungsmusters Medium bei niedriger Temperatur durchzufüh- bzw. die katalytische Funktion im aktiven Zent- ren. Sie sind chirale Polypeptide aus stereo- rum. In vielen Fällen kann sogar ein Einblick in chemisch einheitlichen L-Aminosäuren und die molekularen Mechanismen der Evolution daher prinzipiell in der Lage, Reaktionen ste- gewonnen werden und eine Basis für das Ver- reoselektiv zu katalysieren. ständnis der Substratspezifität und ProduktSelektivität unterschiedlicher Enzyme innerhalb Jeder Organismus hat im Verlauf der Evolution einer Enzymklasse, wie z. B. den Serin- einen perfekt an seine Lebensbedingungen an- hydrolasen, gewonnen werden. gepassten Satz von Proteinen entwickelt (Proteom). Vergleicht man Enzyme gleicher Funktion Aufgrund ihrer herausragenden Fähigkeiten als aus verschiedenen Organismen, so gibt es viele Katalysatoren und dem zunehmenden Ver- in der Aminosäuresequenz mehr oder weniger ständnis über die beschleunigten molekularen stark abweichende, aus einem gemeinsamen Elementarschritte haben Enzyme in der präpa- Vorläufer entstandene (homologe) Enzyme. Die rativen organischen Chemie zunehmend an unterschiedliche Spezifität und Aktivität dieser Bedeutung gewonnen (Liese & Filho, 1999; Enzyme spiegelt die Anpassung an die Umge- Schmid et al., 2001). bung und den speziellen Metabolismus des Erste Bestrebungen, diese herausragenden Fä- jeweiligen Organismus auf Aminosäureebene higkeiten in der Biokatalyse einzusetzen, wur- wider. den Anfang der 1980er Jahre unternommen. Viele Untersuchungen zur Struktur-Aktivitäts- Seitdem ist die Zahl der Veröffentlichungen Beziehung homologer Enzyme haben zum Ver- stark angestiegen und die Zahl der Publikatio- ständnis der Grundprinzipien beigetragen, wie nen entwickelt sich nahezu exponentiell, wie in die Natur ein Enzym auf sein Substrat ab- Abbildung 1.1 anhand der in der MEDLINE stimmt. abgelegten Literaturstellen exemplarisch dargestellt ist. In jüngerer Zeit werden diese Vergleiche durch Mutationsstudien ergänzt, wie z. B. das sukzes- Die Steigerung der Selektivität bei der Produkt- sive Ersetzen aller Aminosäuren durch Alanin bildung großtechnisch angewandter, organi- (Alanin-Scan) oder einzelne zielgerichtete Mu- scher Reaktionen ist ein wichtiges Forschungs1 Kapitel 1 Einführung und Motivation ziel in der modernen organischen Synthese. Im rum gegenüber nicht natürlichen Substraten, sie Rahmen der stereoselektiven Synthese haben sind nicht auf die Spaltung von Triglyceriden in sich Enzyme als chemo-, regio- und enantiose- wässrigen Medium beschränkt, sondern sind lektive Katalysatoren in den vergangenen zehn auch in organische Lösungsmitteln aktiv. Jahren vielfach bewährt. Moderne Verfahren setzen zunehmend immobiEnzymatische geführte Reaktionen erfüllen den liserte Lipasen als heterogene Katalysatoren Anspruch, ökologisch vorteilhafte Katalysato- ein. Dies verbessert ihre Applikation, die Stabi- ren einzusetzen (grüne Chemie). Die Reaktio- lität der Enzyme und vereinfacht die Aufarbei- nen können selektiv und bei niedrigen Tempe- tung der Produkte. raturen durchgeführt werden. Industrielle Enzym e Ihr weltweiter Einsatz in der chemischen Syn- ganze Zellen Oxidoreduktasen Lipasen these hat 1995 die Grenze von 1 MilliarOxygenasen de US Dollar überschritten (Jaeger & Reetz, 1998). Eine herausragende Rolle spielen dabei Lyasen Esterasen Hydrolasen (65 %) und Oxidoreduktasen (25 div. Hydrolasen %) (Theil, 1997), wobei der Enzymklasse der Nitrilasen Proteasen Lipasen die größte Bedeutung innerhalb der Abb. 1.2 : Häufigkeit des Einsatzes verschiedener Enzyme in Biotransformationen entnommen aus (Faber 1997) Hydrolasen zukommt, wie im Abbildung 1.2 veranschaulicht ist (Faber, 1997). Viele Lipasen aus Bakterien und Pilzen sind Biokatalyse kommerziell erhältlich und werden in großen Publikationen pro Jahr in der MEDLINE 1000 Mengen, bis zu einhundert Tonnen jährlich, in 900 der Leben- und Waschmittelherstellung zur 800 700 Fettspaltung bei niedrigen Temperaturen einge- 600 500 setzt. Heute befinden sich in nahezu allen 400 Waschmitteln rekombinante, durch Mutagenese 300 200 auf die Anforderungen in der Waschflotte op- 100 0 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 timierte Lipasen. 2000 Abb. 1.1: Jährliche Publikationen zum Thema Biokatalyse, Biotransformation und Biotechnologie in der MEDLINE (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Neuere Anwendungen im Tonnenmaßstab wurden in der Esterifikation von Biodiesel (Shimada et al., 1999) und in der Papier- Lipasen sind Serinhydrolasen, die in der Lage industrie bei der Entfernung von Triglyceriden sind, langkettige Fettsäureester regio- und ste- aus Zellulose gefunden (Nihon Seishi Co, Ja- reospezifisch zu spalten. Gleichzeitig haben pan). einige Lipasen ein relativ weites Substratspekt2 Kapitel 1 Einführung und Motivation Besonders in der Synthese von enantiomeren- gewünschten Eigenschaft zunehmende Bedeu- reinen Wirkstoffen und deren Vorstufen ist die tung erlangt (Jaeger & Reetz, 2000). kinetische Racematspaltung mit Hilfe von LipaDie kombinatorischen Möglichkeiten, ein En- sen ein beliebtes Werkzeug in der präperativen zym zufällig zu verändern, sind jedoch nahezu Chemie, da auch heute noch die Mehrzahl aller unendlich groß. Daher ist es wünschenswert, Pharmaka und Agrochemikalien, die ein oder mit den Methoden der Enzymkinetik und der mehrere stereogene Zentren enthalten, als Ra- Strukturaufklärung cemate oder Stereoisomerengemische verkauft erkenntnisgetrieben be- stimmte Bereiche im Enzym systematisch oder werden (Winkler, 1995). auch zufällig zu verändern, um so ein stärker Die Optimierung einer enzymatischen Synthese gerichtetes Anpassen des Enzym auf eine spe- eines nicht natürlichen Substrats erfordert je- zielle Anforderung zu ermöglichen (Cedrone, doch ein breites Screening nach dem jeweils Menez & Quemeneur, 2000). geeigneten Biokatalysator für die gewünschte 1.2 Reaktion und die Suche nach den besten Reak- Motivation tionsbedingungen. Dieser Prozess ist zum heuZiel dieser Arbeit ist es, Lipasen aus verschie- tigen Zeitpunkt der arbeitsintensivste Schritt bei denen bakteriellen und eukariotischen Orga- der geplanten Einführung enzymatischer Me- nismen aufzureinigen, zu kristallisieren und mit thoden in die chemische Synthese. Hilfe der Röntgenstrukturanalyse Lipasen im Um eine wissensbasierte Optimierung eines Komplex mit enantiomerenreinen, kovalent Prozesses zu erreichen, steht daher das Ver- gebundenen Übergangszustandsanaloga aufzu- ständnis der verschiedenen Einflussgrößen wie klären und mit enzymkinetischen Methoden den Enzymstruktur, Lösungsmittel und Immobili- Enzymmechanismus und die Enantioselektivität sierung auf die Stereoselektivität und Reak- der kinetischen Racematspaltung mit Lipasen tivität im Mittelpunkt des Interesses.Eine Hoff- besser zu verstehen. Mit Hilfe von molekular- nung für die Zukunft ist es, dass die Suche nach dynamischen Kraftfeldrechnungen,die sich an einer geeigneten Lipase für ein nicht natürliches Schnitten entlang des Enzymmechnaismus’ Substrat durch das gezielte Maßschneidern orientieren wurden Abschätzungen über den einer rekombinanten Lipase auf die vorgegebe- entropischen und enthalpischen Anteil der chi- ne Reaktion erfolgen kann (Svendsen, 2000). ralen Diskriminierungen zu erhalten. Gezielte Veränderungen eines Enzyms setzen Mit Hilfe dieses grundlegenen Verständnisses ein detailliertes Wissen über den Mechanismus wurde dann eine gezielte Strategie zur Anpas- der Enzymkatalyse und über die Substratspezi- sung einer Lipase an ein nicht natürliches Sub- fität voraus. Daher hat die ungerichtete Zu- strat entwickelt. fallsmutagenese mit anschliessendem Screening mit Hilfe von Hochdurchsatzmethoden nach der 3 Kapitel 2 2. Biologisches System brückennetz verbunden sind. Sie binden keine BIOLOGISCHES SYSTEM Cofaktoren, benötigen aber zur ihrer Aktivie- 2.1 rung eine Wechselwirkung mit einer hydro- Eigenschaften von phoben Oberfläche oder im Falle der Pan- Lipasen creaslipasen zusätzlich zur Gallensäure die Bindung einer Colipase. Lipasen sind Triacylglycerol-Hydrolasen (EC 3.1.1.3) und kommen als zelluläre und extra- In der Gruppe der Serin-Hydrolasen, zu der zelluläre Enzyme in allen Zelltypen und Orga- auch die Lipasen gerechnet werden, tritt eine nismen vor. Sie sind essentieller Bestandteil des hochkonservierte Sequenz aus fünf Amino- Fettstoffwechsels. Ihre natürlichen Substrate säuren (G-X-S-X-G) auf. Dabei handelt es sich sind langkettige Triacylglyceride, die neben den um einen Teil des aktiven Zentrums, um das Kohlenhydraten zu den wichtigsten Speicher- katalytische Serin. Diese Serin-Hydrolasen stoffen in der Natur zählen. bilden eine Gruppe von Enzymen mit ähnlicher Hefen können beispielsweise bis zu 80 % ihrer Struktur; sie nehmen den sogenannten „a/b- Trockenmasse als Fette enthalten (Candida Hydrolase-Fold“ an (Ollis et al., 1992; spec., Rhodotorula spec.), in pflanzlichen Sa- Schrag & Cygler, 1997). men sind es bis zu 70 %. Bakterien können Lipide im umgebenden Medium nur als Kohlenstoffquelle nutzen, indem sie Lipasen sekretieren. Ihre physiologische Bedeutung besteht in der Bereitstellung von freien Fettsäuren aus dem umgebenden Medium der Zelle. Triglyceride selbst können nicht durch die Zellmembran aus dem Medium aufgenommen, bzw. aus dem Darm resorbiert werden. In der Natur wirken Lipasen an der Grenzfläche zwischen Wasser und Fett oder direkt an der Oberfläche einer Micelle. Der Katalysemechanismus der Carbonesterspaltung ist analog wie in der Enzymklasse der Serinproteinasen. Er benötigt eine katalytische Triade, bestehend aus einem Serin, Histidin und einer Asparagin- oder seltener einer Glutaminsäure, die untereinander durch ein Wasserstoff4 Kapitel 2 Biologisches System fidbrücken zur Stabilisierung der Lipase gebil- 2.2 VORKOMMEN VON LIPASEN det. 2.2.1 Lipasebildende Bakterien Die Erkennung des Lipase-Foldase-Komplexes Unter den Bakterien gibt es zahlreiche Lipase- ist essentiell für die anschliessende Sekretion bildner. Genauer bekannt sind die Lipasen der der Lipase (Akrim et al., 1993) (Martinez, Gattungen Pseudomonas, Bacillus und Staphy- Ostrovsky & Nunn, 1999) durch das Xcp- lococcus (Jaeger et al., 1994). Transportersystem (zwölf Proteine). Bakterielle Lipasen werden nur bei der Anwe- Die Foldase Lip B verbleibt im periplasmati- senheit von Fetten als alleinige Nahrungsquelle schen Raum und kann das nächste Lipasemole- gebildet. Sie werden in einer inaktiven Vorläu- kül falten und transportieren. Dieses hochspezi- ferform (Proenzym) in der Zelle aus dem Gen fische System besteht aus insgesamt 27 Protei- lip A synthetisiert und dann in ihrer aktiven nen und sekretiert noch weitere Proteine wie die Form in das umgebende Medium in einem alkalische Phosphatase, Phospholipase C, E- mehrstufigen Typ-II-Secretin-Prozess abgege- lastase und Exotoxin A. Viele sekretierten Pro- ben (Lazdunski et al., 1990). Das Lipasegen teine sind als Virulenzfaktoren an der Pathoge- lip A bildet zusammen mit einem weiteren Gen nese von Bakterien aus der Familie der Pseu- lip B, einer lipasespezifischen Foldase, ein O- domonaden beteiligt. Reguliert wird die Sekre- peron. Die Transkription wird über die Anwe- tion über das sogenannte "quorum sensing". senheit von langkettigen Fettsäureresten im Das bedeutet, die Zelle reagiert auf die Anwe- Medium reguliert (Rosenau & Jaeger, 2000). senheit bestimmter chemischer Signalstoffe, wie z. B. auf N-Acyl-homoserin-Lactone und Es wird angenommen, dass die Prolipase aus kann so im gesamten Zellverband synchron die der Zelle ungefaltet durch das Translokations- Sekretine und Pilus-Gene aktivieren (Riedel et system Sec, bestehend aus sieben Proteinen, in al., 2001). das Periplasma transportiert wird (Abbildung 2.1). Dabei wird das Propetid mit der transport- Zur technischen Produktion großer Mengen der spezifischen Erkennungssequenz abgespalten. Lipasen als Biokatalysator ist es daher wün- Die prozessierte Lipase kann dann mit Hilfe schenswert, sie in weniger pathogenen Sys- eines lipasespezifischen Chaperons (LipB) kor- temen zu exprimieren. Die heterologe Expres- rekt gefaltet werden (Frenken et al., 1993b). sion von intrazellulär korrekt gefalteten Lipasen Diese Foldase ist in der inneren Zellmembran in E.coli gelang jedoch nur in Anwesenheit der verankert und bringt die gefaltete Lipase im Foldase LipB in Verhältnis eins zu eins Periplasma zunächst in Kontakt mit dem Multi- (Frenken et al., 1993a). enzymkomplex Dsb (sieben Proteine), einer Disulfid-Reduktase. Dort werden die Disul- 5 Kapitel 2 Biologisches System Wie kürzlich gezeigt werden konnte, scheinen Die in dieser Arbeit untersuchte Lipase aus Coexpressionen mit Thioredoxin möglicherwei- Pseudomonas glumae (auch Burkholderia plan- se einen Ausweg zu bieten (Tang et al., 2000). tarii) weist eine große Homologie von 84% und Aufgrund der Toxizität der aktiven Lipase in eine Strukturähnlichkeit mit der Lipase von Ps. der Zelle konnten bisher nur geringe Ausbeuten cepacia auf. erzielt werden. Die Expression in EinschlussAus den gram-positiven Organismen wurden körpern erfordert hingegen eine aufwendige vor allem die Staphylococcus- und Bacillus- Rückfaltung in vitro. Ausreichende Expressi- Arten am besten untersucht. Wie im nächsten onsergebnisse wurden durch die hohe Spezifität Kapitel beschrieben, unterscheiden sich die des Sekretionssystems bisher nur in homologen Lipasen gram-negativer und gram-positiver Systemen erreicht. Stämme deutlich voneinander. Molekulargenetische Untersuchungen wurden vor allem an Pseudomonas-Lipasen durchgeführt. Zu den untersuchten Lipasen gehören die Lipasen von Ps. cepacia, verschiedene Stämme von Ps. species, Ps. aeruginosa und Ps. fragi. 4. Sekretion 3. Disulfid-Bildung Xcp Dsb 2. Faltung Lip b PRO - LIPASE Sec 1. Transport Periplasma Cytoplasma Periplasma Abb. 2.1: vierstufiger Sekretionsmechanismus von Lipasen in gram-negativen Bakterien. 1. Transport durch Sec 2. Faltung durch Lip b 3. Disulfid-Bildung durch Dsb 4. Secretion durch Xcp 6 Kapitel 2 Biologisches System 2.2.1.1 Lipasen gram-negativer Bakterien Alanin statt des sonst üblichen Glycins. Eine derartige katalytische Sequenz findet man auch Das durchschnittliche Molekulargewicht von bei der Protease Subtilisin. Pseudomonas-Lipasen liegt bei ca. 30 kDa. Ihre Sequenz-Homologie untereinander übersteigt 2.3 Reinigung von Lipasen meist 60 %. Es gibt aber auch Ps.-Lipasen, die eine deutlich geringere Homologie untereinan- Lipasen werden als sekretierte Enzyme aus dem der aufweisen. Ein Stammbaum im Hinblick Kulturüberstand bzw. dem Pankreas des jewei- auf Sequenzähnlichkeit (aufgestellt auf der ligen Organismus gewonnen. Im Überstand Basis der Swissprot-Sequenzdatenbank) von 49 befinden sich normalerweise nur wenige Enzy- Lipasen bekannter Sequenz zeigt, dass nur die me, was die anschliessende Reinigung nach Lipase von Ps. fluorescens keine große Se- dem Abzentrifugieren des Zellmaterials verein- quenzähnlichkeit mit den übrigen Pseudomo- facht. Probleme können durch ebenfalls sekre- nas-Lipasen aufweist. tierte Proteasen, die die Lipasen verdauen können, auftreten. 2.2.1.2 Lipasen gram-positiver Bakterien Besonderes Augenmerk gilt daher dem ersten Bis auf das aktive Zentrum und eine Region im Schritt des Reinigungsschemas, der Anreiche- N-terminalen Bereich zeigen die Lipasen aus rung der stark verdünnten Lipase und der Ab- gram-positiven Bakterien keine nennenswerten trennung vorhandener Proteasen. In vielen Fäl- Homologien mit den Lipasen aus gram- len wird zunächst über eine Ultrafiltration die negativen Bakterien. Proteinlösung ankonzentriert. Bei den bisher untersuchten Gattungen gibt es Aufgrund der lipophilen Eigenschaften von zwischen den einzelnen Lipasen gram-positiver Lipasen hat sich die Hydrophobe-Interaktions- Bakterien zudem deutliche Unterschiede. Chromatographie (HIC) als vorteilhaft heraus- Das aktive, reife Protein der Gattung Staphylo- gestellt und wird für fast alle Lipasen ange- coccus ist 44-48 kDa groß, die Sequenzhomo- wandt. Die unter Hochsalzbedingungen an das logie der Lipasen der einzelnen Stämme im Material gebundene Lipase kann mit reinem Präpro-Teil beträgt nur 25 %, die reifen Enzy- Wasser oder bei starker Bindung an das Säu- me zeigen dagegen bis zu 65 %-ige Homologie lenmaterial zusätzlich mit Alkohol oder Deter- zueinander. genz eluiert werden. In vielen Fällen kann auf diesem Wege die vollständige Trennung von Die Lipasen der Gattung Bacillus hingegen sind den übrigen Proteinen erreicht werden. Für die mit 20-22 kDa deutlich kleiner als die übrigen Feinreinigung sind in der Literatur viele Me- Lipasen. Auch in der konservierten Sequenz thoden beschrieben, wie die Gelfiltration oder (G-X-S-X-G) des aktiven Zentrums gibt es Ionenaustauscherchromatographie. Unterschiede: an Position 1 befindet sich ein 7 Kapitel 2 2.4 Biologisches System 2.4.1 Reaktionsmechanismus einer Enzymmechanismus lipasekatalysierten Reaktion von Lipasen Lipasen zählen zu der Klasse der Serin- Lipasen gehören zu den Hydrolasen und wer- Hydrolasen, da ein Serin im aktiven Zentrum den in die Enzymklasse 3 mit der EC- für die katalytische Wirkung essentiell ist (Bra- Klassifizierung 3.1.1.3. eingeordnet. Die durch dy et al., 1990). Dies konnte durch Hemmung diese Enzyme katalysierten hydrolytischen Re- mit dem serinaktiven Reagenz Diethyl-p- aktionen greifen u. a. Ester-, Glykosyl-, Peptid- nitrophenylphosphat (E 600) nachgewiesen und Säureanhydridbindungen an. Lipasen kata- werden (Gilbert, 1993). lysieren reversibel die Hydrolyse der Esterbindung von Glycerinestern aliphatischer Fettsäu- Die Spaltung der Esterbindung erfolgt über ren an einer Lipid-Wasser-Grenzschicht (Ab- einen intermediär ausgebildeten, kovalent an bildung 2.2). das Serin gebundenen Acyl-Enzym-Komplex (Abbildung 2.3). Entwickelt wird dieser durch den nukleophilen Angriff des aktivierten Serins O auf die Estercarbonylgruppe unter Abspaltung O des Glycerins. O O O + H2O Anschließend wird das Acylenzym durch den nukleophilen Angriff eines Wassermoleküls O wieder deacyliert; man erhält das freie Enzym und die abgespaltene Fettsäure. Als Reaktions- Lipase produkte entstehen Fettsäuren, Diacylglyceride, OH Monoacylglyceride und Glycerin. Dieser soge- O O O O + nannte Ping-Pong-Mechanismus ist allen Serin- HO Hydrolasen gemeinsam. O Neben der Spaltung von Ester- und Amid- Abb. 2.2: Schema einer lipasekatalysierten Esterspaltung anhand des natürlichen Substrats Triacylglycerol. In weiteren Schritten können auch die zwei verbleibenden Estergruppen gespalten werden. substraten kann auch die Übertragung von Acylresten unter Bindung kovalenter EnzymAcyl-Intermediate in einem Zwei-Schritt- Mechanismus stattfinden. Dabei wird zunächst der Acylrest an das Serin des aktiven Zentrums gebunden und im zweiten Schritt auf ein Nucleophil überführt. 8 Kapitel 2 Biologisches System Wird der Acylrest auf Wasser als nukleophil siert. Bei Candida antarctica Lipase B (CAL B) übertragen, handelt es sich um die oben be- beispielsweise wird das "Oxyanion" von den schriebene Hydrolyse, bei einer Übertragung Amidgruppen des Gln 106 und Thr 40 stabili- auf einen Alkohol um eine Umesterung, bei der siert, zusätzlich interagiert die Alkoholgruppe Übertragung auf ein Amin um eine Amidie- der Seitenkette des Thr 40 mit dem Sauerstoff, rung. wie in Abbildung 2.3 dargestellt. Abbildung 2.4 zeigt den detaillierten Reakti- Die Ausbildung des tetraedrischen "Oxyanion"- onsmechanismus der enzymatischen Hydrolyse. Intermediates stellt vermutlich den geschwin- Zunächst wird das Substrat im Michaelis- digkeitsbestimmenden Schritt der Hydrolyse Menten-Komplex (1) gebunden und über Was- dar (Kraut, 1977). serstoffbrücken zu Stickstoffatomen zweier Das vom Serin auf den Imidazolring des Histi- Peptidbindungen der Proteinhauptkette im so- dins übertragene Proton wird im Folgenden an genannten "Oxyanion-hole" polarisiert. Das den Ester-O weitergegeben. Anschließend er- Serin wird über das Histidin der Triade in einer folgt unter Bindungsspaltung die Freisetzung allgemeinen Basenkatalyse deprotoniert. Dann des Alkohols (3). Der Enzym-Acyl-Komplex erfolgt der nukleophile Angriff des Serins ent- (4) wird durch einen weiteren nucleophilen lang der Bürgi-Dunitz-Trajektorie und die gleichzeitige Umhybridisierung des Angriff eines Wassermoleküls hydrolysiert (5), sp2- wobei das Restsubstrat als Carbonsäure ab- Carbonylkohlenstoff von einer planaren in eine gespalten wird (6). tetrahedrale sp3-Geometrie. Der gebildete tetrahedrale Zwischenzustand (2) trägt eine negative Ladung am CarbonylSauerstoff, dem "Oxyanion". Dieses besetzt eine Tasche der Substratbindungsstelle, dem erwähnten "Oxyanionhole", und wird durch mindestens zwei Wasserstoffbrücken stabiliSer 105 G ln 1 0 6 HO Thr 40 Abb.2.3: Darstellung der Stabilisierung des tetraedrischen Zwischenzustands mit den Aminosäuren im oxyanion-hole von Candida antarctica Lipase B 9 Kapitel 2 Biologisches System Thr 40 Thr 40 N H O H O H O Ph O O R O R 1 N H + HN O + HN O N Ser 105 His 224 Ser 105 His 224 6 N Enzym + Säure Enzym + Ester Thr 40 Thr 40 N H O H 2 O H Ph R O H N N H Gln 106 OH O O O 5 R + HN H N N + HN O Gln 106 Ser 105 His 224 Ser 105 tetrahedrales Intermediat Tet 1 N His 224 tetrahedrales Intermediat Tet 2 Thr 40 O H N H Ph HO H2O R 3 4 O O Ser 105 N N His 224 Acyl-Enzym Abb. 2.4: Schematische Darstellung der Esterspaltung durch Lipasen: (1) Michaelis-Komplex mit dem Ester, (2) erster tetraedrischer Übergangszustand, (3) Bildung des Acylenzyms und Freisetzung des Alkohols, (4) Angriff des Wassermoleküls an das Acylenzym, (5) zweiter tetrahedraler Übergangszustand, (6) Freisetzung der Fettsäure 10 Kapitel 2 2.5 Biologisches System Das moderne "induced-fit"-Modell von D. E. Enzymkinetik Koshland aus den 1960er Jahren berücksichtigt Enzyme sind in der Lage, biochemische Reak- zusätzlich tionen extrem zu beschleunigen. Dabei spielen Modell Fischers die Flexibilität im Protein bei die Wechselwirkungen bestimmter Aminosäu- der Bindung und damit die induzierte Anpas- ren im aktiven Zentrum eine entscheidende sung an verschiedene Substrate (Koshland, Rolle bei der Substratbindung, der Stabilisie- 1994). zum starren Schlüssel-Schloss- rung eines Übergangszustandes, der anschliessenden Produktbildung und der nachfolgenden Die molekulare Erkennung ist in diesem Fall Produktfreisetzung. ein dynamischer Anpassungsprozess zwischen dem Substrat und den Aminosäuren in der Bin- Chemische Reaktionen können durch Enzyme detasche. 8 um einen Faktor von bis zu 10 beschleunigt Den Extremfall eines "induced fit" stellt die werden und verlaufen trotzdem sehr selektiv. Bewegung ganzer Domänen oder Teile der Ein Enzym erniedrigt wie jeder andere Kataly- Hauptkette eines Enzyms während der Katalyse sator die freie Aktivierungsenthalpie einer che- dar, z. B. um das gebundene Substrat vollstän- mischen Reaktion. Unter der Annahme eines dig vom umgebenden Solvens abzuschirmen. Gleichgewichts zwischen dem Reaktanden und Ein weiteres Modell geht auf M. J. S. Dewar dem Eyring- aus dem Jahr 1985 zurück und versucht, den Gleichung (Eyring & Polanyi, 1931), die den Unterschied zur Reaktion in Lösung in einem Zusammenhang zwischen der Geschwindig- Desolvatationsmodell zu erklären (Dewar & keitskonstanten kb einer bimolekularen Reakti- Storch, 1985). Übergangszustand gilt die on und der freien Aktivierungsenthalpie DG* Diese Modelle machen verständlich, warum ein herstellt. zu großes Substrat nicht umgesetzt werden kb = kT h e kann und ein zu kleines Substrat, das das Sol- DG * RT vens nicht vollständig aus der Bindetasche verdrängt, nur langsam reagiert. Diese ursprünglichen Modelle sind bis heute erweitert worden, Eyring - Gleichung aber im Grundsatz unangetastet geblieben. An- k=Boltzmann-Konstante, h=Planck’sches Wirkungsquantum, T=absolute Temperatur, R=allgemeine Gaskonstante gewandt auf den Übergangzustand, stabilisiert das Enzym so den produktiven Enzym- Es wurden verschiedene Modelle entwickelt, Substrat-Komplex und senkt dessen Energie. um diese Beschleunigung zu erklären. Der erste Dieser Vorgang wird in Anlehnung an die mo- bedeutende Beitrag wurde durch das Schlüssel- derne stereoelektronische Orbitaltheorie der Schloß-Prinzip von E. Fischer aus dem Jahre organischen Chemie "orbital steering" genannt. 1894 geleistet (Fischer, 1894). 11 Kapitel 2 Biologisches System Diese Theorien erklären die hohe Substrat- und Daraus folgt, dass "steady-state"-Messungen Produktselektivität enzymkatalysierter Reaktio- nur pauschal für die Gesamtreaktion zu inter- nen. pretieren sind und keine direkte Aussage über den detaillierten Reaktionsmechanismus erlau- Das minimale kinetische Schema für eine en- ben. Die beobachtete Reaktionsgeschwindigkeit zymkatalysierte Reaktion wurde 1913 von Mi- v im "steady-state"ist für jeden Reaktionsme- chaelis und Menten aufgestellt: k1 E+S ES chanismus durch den folgenden Ausdruck bestimmt: k2 E+P k-1 v /[ E 0 ] = Michaelis-Menten Kinetik k cat [ S ] K m + [S ] Die einzelnen kinetischen Konstanten, die den Aus diesem vereinfachten Schema mit irreversiblem Zerfall des ES-Komplexes, ohne Be- komplex zusammengesetzten Konstanten KM rücksichtigung der Produktbindung an das En- und kcat zugrunde liegen, können nicht be- stimmt werden. Aus diesen beiden kinetischen zym, erhält man für die kinetischen Konstanten Konstanten, KM und Kcat, die experimentell aus kcat = k2 und KM=(k2 + k-1)/k1. einfachen "steady-state"-Messungen zugänglich Eine noch weitergehende Vereinfachung stellt sind, lassen sich jedoch einige Abschätzungen die Annahme dar, dass k -1 > k2 ist, und somit für die einzelnen Teilschritte eines Mechanis- Km direkt der Dissoziationskonstanten Kd des mus ableiten. So kann kein Teilschritt der Hin- Enzym-Substrat-Komplex entspricht. reaktion langsamer sein als kcat. Ein realistischeres Schema für den kinetischen Der als Spezifizitätskonstante bezeichnete Pa- Ablauf von Haldane (1930) berücksichtigt die rameter kcat/Km definiert eine untere Grenze für Reversibilität der Reaktionsschritte und ist um eine die Existenz eines Enzym-Produkt-Komplexes zweiter Ordnung der Substratbindung. Die erweitert. wirkliche scheinbare Geschwindigkeitskonstante Geschwindigkeitskonstante muss jedoch um einen Faktor größer sein, der die E+S k1 ES k-1 k2 EP k-2 k3 k-3 Dissoziation bzw. Reaktion des ES-Komplexes E+P in den nächsten Zustand der Gesamtreaktion Haldane -Kinetik beinhaltet. Daher ist die genaue Bestimmung Die "steady-state"-Parameter für den quasi sta- der Substratspezifität einer enzymatischen Re- tionären Zustand im Fliessgleichgewicht er- aktion nur mit Hilfe transienter Methoden durch rechnen sich jetzt nach folgenden Gleichungen: k cat = Km = k2 k3 k 2 + k -2 + k 3 die Analyse der individuellen Reaktionsschritte unter direkter Beobachtung der intermediären und Zustände vor der Einstellung des Fliessgleich- k 2 k 3 + k -1 k - 2 + k - 1 k 3 k 1 ( k 2 + k -2 + k 3 ) gewichts möglich. 12 Kapitel 2 Biologisches System schnell gebildet wird. Dieser Schritt ist diffusi- 2.5.1 Kinetischer Enzym- onskontrolliert und daher den normalen kineti- mechanismus von Lipasen schen Methoden nicht zugänglich. Ultraschnelle Betrachtet man das vereinfachte kinetische kinetische Methoden im Mikrosekundenbereich Modell für eine typische Serin-Hydrolase, das wie z. B. Temperatur-Sprung- oder Druck- die Bildung eines Acyl-Enzyms und die Rever- Sprung-Techniken haben jedoch gezeigt, dass sibilität der einzelnen Reaktionsschritte bein- dieser Schritt für die meisten Enzyme nur von haltet, so erhält man folgendes Schema : der Viskosität des Lösungsmittels bzw. von der E+S k1 k2 ES k3 E-A EP k-3 k-2 k-1 k4 Temperatur E+ P (Cryoenzymologie) abhängt (Gutfreund, 1996). k-4 Im zweiten Schritt wird das Enzym acyliert und E = Enzym E-A =Acyl-Enzym S = Substrat P = Produkt der Alkoholrest abgespalten. Die Geschwindigkeit der Alkoholfreisetzung ist daher eine direk- Die kinetischen Konstanten Km und kcat sind in te Observable für die transiente Kinetik der diesem Schema durch die folgenden Ausdrücke Reaktion. Betrachtet man den Verlauf der Al- gegeben (Gutfreund): koholbildung vor der Ausbildung eines Fliess- k cat = k 2 k 3k 4 gleichgewichts mit Hilfe geeigneter kinetischer ( k 2 + k -2 )( k -3 + k 4 ) + k 2 k 3 + k 3 k 4 Methoden, so erhält man Aufschluss über die Geschwindigkeit der Acylierung und des nach- Km = k -1 ( k -2 ( k -3 + k 4 ) + k 3 k 4 ) + k 2 k 3 k 4 k 1 (( k 2 + k -2 )( k -3 + k 4 ) + k 2 k 3 + k 3 k 4 ) folgenden Schrittes. Beobachtet man die transiente Kinetik der Al- Mit Hilfe der transienten Kinetik ist es nun koholbildung und damit die Bildung von E-A, möglich, einzelne Teilreaktionen zu charak- so können entsprechend dem nachfolgend an- terisieren, indem man die Konzentration der gegebenen Schema getrennt die Geschwindig- Zwischenprodukte ES, EF oder EP als Funktion keitskonstanten k2, k-2, k3 und k-3 bestimmt der Zeit bestimmt. werden. Mit dieser Methode ist es möglich, die Damit werden einzelne Bindung verschiedener Substrate sowie den Geschwindig- Einfluss von Mutationen im aktiven Zentrum keitskonstanten innerhalb des kinetischen Me- direkt miteinander zu vergleichen, ohne auf die chanismus einer direkten Messung zugänglich. pauschalen Konstanten KM und kcat angewiesen Interessant ist die Frage nach dem geschwin- zu sein. digkeitsbestimmenden Schritt eines solchen mehrstufigen Mechanismus. Es wird allgemein angenommen, das der Michaelis-Menten-Komplex mit dem Ester sehr 13 Kapitel 2 Biologisches System k2 E+S k3 2.5.2 Burst-Kinetik E-X E-A k-3 k-2 Eine spezielle Variante der transienten Kinetiken sind die sogenannten "Burst"-Kinetiken. R-OH Der Name dieser Messungen resultiert aus der E + S = Enzym + Sunbstrat E-A = Acyl Enzym E-X nichtaufgelöste Teilschritte Tatsache, dass Enzyme, deren langsamster Schritt die Deacylierung des E-A Komplexes Essentiell für die Rückgewinnung aktiven En- ist, zunächst schnell ein Äquivalent Alkohol zyms ist die schnelle Freisetzung des Produkts. freisetzen und sich damit zu Beginn der Reakti- Aktuelle theoretische Untersuchungen der Par- on fast vollständig im acylierten Zustand befin- tialladungen an der solvens-zugänglichen Ober- den, fläche im aktiven Zentrum von Esterasen und Fliessgleichgewicht einstellt. Der typische Ver- Lipasen verweisen auf ein negatives elektrosta- lauf einer "Burst"-Kinetik ist in Abbildung 2.5 tisches Potential in der Bindetasche am pH- dargestellt. Optimum der untersuchten Enzyme. bevor sich anschliessend ein - Aus der Grösse und der Geschwindigkeit des Dieses negative Potential würde eine negativ sogenannten "Bursts" können dann unter An- geladene Säure, die als Produkt entsteht, absto- nahme des unten aufgestellten minimalen kine- ßen, und somit sollte eine Rückbindung des tischen Schemas die Enzymmenge und die ki- Produkts effizient verhindert werden ("product- netischen Parameter Ks k2 und k3 direkt be- catapult-model") (Neves Petersen, Fojan & stimmt werden. Petersen, 2001). P2 E + S = Enzym + Sunbstrat E-A = Acyl Enzym P1= Produktalkohol E+P2= Enzym + Produktsäure Dieses Schema lässt sich unter der Annahme ableiten, dass Substratbindung als schnelles vorgelagertes Gleichgewicht mit der Dissoziationskonstanten Ks beschrieben werden kann und die Rückreaktionen k-2 und k-3 vernachlässigt werden können. Zeit Abb. 2.5 Typische „burst“ kinetik der Alkoholfreistzung bei langsamer Deacylierung des Enzyms. Die Höhe des „burst“ ist von der eingesetzten Enzymmenge E abhängig. 14 Kapitel 2 Biologisches System ein "Deckel" den Zugang zum aktiven Zentrum 2.5.3 Grenzflächenaktivierung verschließt (Brzozowski et al., 2000). Lipasen unterscheiden sich von den anderen Enzymen ihrer Proteinfamilie durch ihre soge- Je nach betrachteter Lipase besteht der "lid" aus nannte Interphasen- einer (Pseudomonas glumae, humane Pankreas- aktivierung. Lipasen folgen im Gegensatz zu lipase) oder zwei a-Helices (Geotrichum can- Esterasen keiner einfachen Michaelis-Menten- didum). Die Innenseite des "lid" ist dabei li- Kinetik, sondern erfordern zusätzlich einen pophil, die Außenseite hydrophil, wie in Abbil- vorgelagerten Schritt zur Aktivierung des En- dung 2.8 dargestellt. Grenzflächen- oder zyms. Abbildung 2.6 zeigt eine Gegenüberstellung der jeweiligen Kinetik. Kinetische und thermodynamische Untersuchungen an micellären Systemen konnten diese Aktivierung durch ein einfaches Zwei- Zustands-Modell erklären (Cajal et al., 2000). Die Lipase liegt in der wässrigen Phase in einer inaktivien Konformation vor und wird in einem vorgelagerten Schritt aktiviert, bevor das Substrat binden kann. Abb. 2.6: Interphasenaktivierung einer Lipase im Vergleich mit einer Esterase; aufgetragen ist die jeweilige Enzymaktivität als Funktion der Substratkonzentration, die in Vielfachen der Substratlöslichkeit angegeben ist. Die gestrichelten Linien zeigen die Micellenbildung an (aus: Jaeger und Wohlfarth, 1993). Wasser E = Enzym S = Ester Ea =adsorbiertes Enzym Ea* = offenes ads. Enzym P1 = Produktalkohol P2 = Produktsäure "Steady-state"-Fluoreszenzuntersuchungen und Fluoreszenz-Korrelationspektroskopie bestätigten ein solches Zwei-Zustands-Modell der Aktivierung durch Micellen oder organische Lösungsmittel (Jutila et al., 2000). Diese Aktivierung wird auf ein bewegliches Strukturelement ("flap" oder "lid") (Berg et al., 1998) zurückgeführt (Abbildung 2.7), das wie 15 Kapitel 2 Biologisches System Abb. 2.7: Schema der Lipaseaktivierung. Gezeigt ist eine Lipase mit Substrat links in der geschlossenen und rechts in der aktiven, geöffneten Konformation. Durch das Öffnen des "lid" vergrößert sich Konformationen der Candida Rugosa Lipase daher die lipophile Oberfläche des Proteins, das aufgeklärt werden (Grochulski et al., 1993). Enzym kann besser an die Lipid-Wasser- Weitere Untersuchungen an verschiedenen Li- Grenzschicht anlagern und ermöglicht gleich- pasen zeitig einen Zugang zum aktiven Zentrum. (Brzozowski et al., 2000). Pancreaslipasen be- bestätigten diesen Mechanismus nötigen zusätzlich zur Grenzflächenaktivierung Dieses Phänomen der Grenzflächenaktivierung mittels (engl. "interfacial activation") konnte erstmals Gallensäuren noch eine Colipase (Hermoso et al., 1997) (Egloff et al., 1995). 1993 durch Röntgenstrukturanalyse der beiden Die zugängliche Oberfläche ändert sich z. B. bei der Rhizomucor miehei-Lipase von 10560 Å2 im geschlossenen Zustand auf 11816 Å2 in der offenen Form (Vasel et al., 1993). Gleichzeitig entsteht ein ausgedehnter hydrophober Bereich um das katalytische Zentrum herum. Der "Lid" scheint somit die Aktivität der Lipase zu kontrollieren; wenn keine hydrophobe Umgebung zugegen ist, bleibt er geschlossen und die Lipase ist nicht aktiv. In Gegenwart einer Phasengrenzfläche wird die katalytische Triade durch die Bewegung des helikalen „Lid“Abschnitts zugänglich und die Lipase wird aktiviert. Abb 2.8: Seitenansicht der geschlossenen amphiphilen ´lid´ Helix in Pseudomonas glumae über dem aktiven Zentrum. Die Aminosäuren des ´Lids´ sind nach ihrer Eigenschaft farbig markiert: grün=lipophil, magenta = hydrophil. Die hydrophilen Seitenketten weisen in der geschlossenen Konformation zum Solvens. 16 Kapitel 2 Biologisches System Da die Substratmoleküle an der Phasengrenz- tätsbestimmung von Lipasen gegenüber Mem- fläche eine gewisse Orientierung und somit eine branlipiden beruht auf der Messung der Ober- Ordnung vorweisen und zudem die Diffusion in flächenspannung das aktive Zentrum auf eine zweidimensionale Triglyceridfilmes mittels eines Tensiometers Oberfläche reduziert wird (Abbildung 2.9), (Ransac et al., 1999; Verger, 1976). Die fort- erklären sich die hohen Umsatzzahlen für Lipa- schreitende Hydrolyse der Triglyceride durch sen an Micellen (Brown, Yada & Marangoni, die Lipase führt zur Abnahme der Oberfläche 1993; Chapus et al., 1978; Ferrato et al., 1997). des Films. 2.5.4 Aktivitätsbestimmungen Die pH-Methode zur Aktivitätsbestimmung der eines monomolekularen Esterspaltung von Triacylglyceriden beruht auf Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Quantifizierung der freigesetzten Fettsäuren wurden eine Reihe von Methoden entwickelt. mittels kontinuierlicher pH-Messung. Man un- Man unterscheidet direkte Methoden, die unab- terscheidet zwei Methoden, die pH-statische hängig von der chemischen Natur des Substrats Messung, bei der die frei werdende Säure mit sind, chromogene und fluorogene Nachweisver- einer Base gegentitriert wird und der Verbrauch fahren, die auf der Anwesenheit von bestimm- der Base ein direktes Maß für die Aktivität dar- ten chromrophren Gruppen im Substrat beru- stellt, sowie die Messung der pH-Erniedrigung hen. Diese verändern ihr Absorptions- oder in ungepufferter Lösung durch die freigesetzte Emissionsspektrum durch die enzymatische Säure (Schmid & Verger, 1998). Spaltung signifikant. Am häufigsten wird die pH-Stat-Methode anDie erste veröffentlichte Methode zu Aktivi- gewandt, da unter definierten pH-Bedingungen sowohl in homogener Phase als auch mit micellären Substraten gemessen werden kann. Der Nachteil dieser beiden Methoden ist jedoch die Dauer eines Experimentes und der apparative Aufwand für die exakte pH-Bestimmung. Die pH-Drop-Methode ist durch die Firma Thermogen in jüngerer Zeit für HochdurchsatzAktivitätsmessungen als Methode zur Enatioselektivitätsbestimmung mit chromogenen Indika- Abb. 2.9 :Modell der Grenzflächenaktivierung von Lipasen. Der „Lid“ Wechselwirkt mit der Oberfläche einer Micelle und stabilisiert die aktive Konformation. toren als pH-Sonden kombiniert worden, um in Mikrotiterplatten mit Hilfe von Absorptionsmessung den pH-Verlauf vieler Reaktion parallel verfolgen zu können (Moris-Varas et al., 1999). Dieses Messprinzip unterliegt jedoch der 17 Kapitel 2 Biologisches System Beschränkung auf homogene, wässrige und die Anwendbarkeit dieser Methode begrenzt. schwachgepufferte Systeme. Ein Problem bei Das Gleiche gilt für hochempfindliche fluoro- der quantitativen Auswertung ist die nichtlinea- gene Substrate wie Umbelliferon-Carbonsäure- re Abhängigkeit der Indikatorabsorption vom Ester (Simons et al., 1996), die zur Freisetzung pH-Verlauf. von fluoreszierendem Umbelliferon führen. Weitere direkte Methoden beruhen auf der disZur Aktivitätsmessung von Glycerol-Estern kontinuierlichen Messung des Gehalts an Pro- wurden spezielle Methoden entwickelt, von dukt durch analytische Verfahren, wie z. B. denen der Rosorufin-Test(Cardenas et al., HPLC, Gaschromatographie oder NMR. Durch 2001) Wahl von geeigneten enantioselektiven Trenn- (1,2-O-dilauryl-rac-glycero-3-Glutar- säure-Resorufinylester) kommerziell erhältlich methoden ist auch die Unterscheidung von Ste- ist. reoisomeren im Produkt möglich. Um den kompletten Verlauf einer Reaktion zu erfassen, Weitere Aktivitätsmessungen beruhen auf spe- ist die Entnahme und Aufbereitung von vielen ziell synthetisierten fluorogenen Fettsäuren in Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten und Kombination mit fluoreszenzunterdrückenden ein hoher apparativer Aufwand nötig. Ein Vor- Fettsäuren im Triacyl-glycerolester. Bei der teil dieser Methode ist die generelle Anwend- Hydrolyse wird die fluorogene Fettsäure ab- barkeit, die Unabhängigkeit von der speziellen gespalten und so eine Änderung der Fluores- Substratstruktur und von dem verwendeten zenzeigenschaften erreicht. Diese Methode ist Lösungsmittel. besonders empfindlich, wenn die verbleibenden Chromogene Substrate, wie z. B. fluoreszenzunterdrückenden Diacyl- und Tria- para- cylglycerole in Micellen gebunden bleiben. Nitrophenyl-Ester mit Carbonsäuren unterschiedlicher Kettenlänge, sind kommerziell erhältlich und erlauben die kontinuierliche Aktivitätsmessung durch die einfache Quantifizierung des abgespaltenen para-Nitro- phenolat-Ions durch die Absorptionsmessung bei 405 nm. Der Alkoholteil des Ester ist somit für dieses Essay festgelegt und nur die Säure kann variiert werden. Durch die Kombination mit chiralen Carbonsäuren ist die direkte Bestimmung der Aktivität gegenüber Estern mit vorgegebener Stereochemie im Säureteil möglich, da Lipasen aber nur langkettige, unverzweigte Fettsäuren als Substrate akzeptieren, ist 18 Kapitel 2 Biologisches System 2.5.5 Inhibition von Lipasen O Als nichtkovalente Inhibitoren von Lipasen sind X vor allem Substratanaloge mit nichthydrolysierbaren Amido- oder Keto-Gruppen, wie z. B. alpha-Keto-triacylglycerol-Derivate das serinaktive Diethyl-p-nitro- phenylphosphat sowie Histidin-modifizierende Sulfone bekannt. Der promineteste Inhibitor, das Tetrahydro-Lipstatin wird als OrlistatÔ therapeutisch eingesetzt. Die ersten lipasespezifische Inhibitoren waren langkettige Phosphonsäure-Derivate der in Abbildung 2.10 gezeigten Grundstruktur, die analog dem tetraedrischen Übergangszustand an das katalytische Serin binden. In den letzten Jahren gelang auch die Synthese von Phosphonsäurederivaten mit enantiomerenreinen chiralen Alkoholen. Zu beachten ist, dass bei asymmetrischer Substitution am Phosphor ein Stereozentrum auftritt, so dass Diastereomere erhalten werden. Zur Untersuchung der Enantioselektivität gegenüber Acyl-glycerolen bzw. sekundären Alkoholen sind X P C5H11 R Abb. 2.10: typische kovalente Inhibitoren von Lipasen, links Boronsäure, rechts PhosphonsäureDerivate, abgeleitet vom Herbizid E605 X = para-nitro-Phenyl als Abgangsgruppe Als kovalent bindende Liganden sind Inhibitowie B OH bekannt (Simons et al., 1999). ren R Diacylglycerophosphonate (Stadler et al., 1996) und Menthylalkoholderivate(Grochulski et al., 1994a) synthetisiert worden. 19 Kapitel 2 2.6 Biologisches System verschiedener Lipasen ist die relative Lage der Struktur von Lipasen Aminosäuren der katalytischen Triade im Raum 2.6.1 Gemeinsame Raumstruktur sehr ähnlich, selbst bei fehlender Sequenzähn- der a/bHydrolasen lichkeit und wenn die verbleibende Struktur deutliche Unterschiede aufweist (Abb. 2.11). Lipasen haben zusammen mit Esterasen und Hydrolasen ein gemeinsames Faltungsmuster, Es gibt vier Gruppen von Enzymen, die eine die sogenannte a/b-Hydrolase Faltung. Der solche katalytische Triade enthalten und durch innere Aufbau ist ein mehrsträngiges b- konvergente Evolution eines stabilen und funk- Faltblatt, das von den verknüpfenden a-Helices tionellen aktiven Zentrums als strukturell verwandt angesehen werden können: eukaryoti- umgeben ist. sche Serin-Proteasen, Cystein-Proteasen, Subtilisine und a/b-"Hydrolase-fold" Enzyme. Das Serin der katalytischen Triade liegt in einer Haarnadelschleife zwischen einer a-Helix und einem b-Strang mit der hochkonservierter Sequenz aus den fünf Aminosäuren (G-X-S-X-G). Bei einer Überlagerung der Raumstrukturen Abb. 2.11: Vergleich des a/b-Hydrolase Faltungsmusters von Ca L B und Ps. Lipase (schwarz b-Faltblatt) aus (Theil, 1997). 20 Kapitel 2 Biologisches System mit und ohne kovalent gebundenem Inhibitor. 2.6.2 Offene und geschlossene Es ist nicht bekannt, welche Faktoren den offe- Raumstrukturen von Lipasen nen Zustand ohne gebundenen Liganden im Für verschiedene Lipasen gelang es inzwischen, Kristall stabilisieren können (Cygler et al., röntgenstrukturanalytisch 1994). hochaufgelöste Raumstrukturen zu ermitteln. Die meisten dieser Strukturen liegen im geschlossenem Zu- Abbildung 2.12 zeigt eine Überlagerung der stand vor, einige wenige vermitteln aber auch experimentell bestimmten Strukturen der Lipa- Einblicke in den offenen oder halboffenen Zu- se aus Rhizomucor miehei in offener (gelb) und stand. geschlossener (orangerot) Konformation. Die katalytische Triade ist in rot dargestellt, vom Der offene Zustand kann durch den Einbau verbleibenden Protein ist schematisch nur der eines kovalent gebundenen Inhibitors (z. B. Verlauf der ProteinHauptkette dargestellt. Diethylphosphat) erzwungen werden, der eine ähnliche Geometrie wie das Substrat im tetra- Das Vorliegen und die Bedeutung eines solchen hedralen Zwischenzustand besitzt. Von CRL beweglichen Strukturelements über dem akti- und CAL B gibt es offene Strukturen sowohl ven Zentrum wurde inzwischen auch für die Abbildung 2.12: offene („Lid“ gelb) und geschlossene („Lid“ orangerot) Struktur von RML, akt. Zentrum rot 21 Kapitel 2 Biologisches System Lipasen aus Geotrichum candidum (Schrag & Im Fall der CrL (Candida rugosa) (Grochulski Cygler, 1993), Candida rugosa (Grochulski et et al., 1994a) und CaL B (Candida antartica B) al., 1993; Grochulski et al., 1994b) Candida (Uppenberg et al., 1995) scheint dagegen keine antartica B (Uppenberg et al., 1995), Pseudo- Konformationsänderung in der Anordnung der monas glumae (Noble et al., 1993), Rhizopus katalytischen Reste und des "Oxyanion-hole" delemar, Penicillium camembertii (Derewenda stattzufinden. et al., 1994) und Humicola lanuginosa Für CAL B wird aufgrund von kinetischen Un- (Brzozowski et al., 2000; Lawson et al., 1994) tersuchung, die keine Interphasenaktivierung nachgewiesen. nachweisen konnten, die Funktionalität des Am Beispiel der Humicola lanuginosa-Lipase "Lid" in Frage gestellt (Martinelle, Holmquist konnte mit Hilfe von mehreren geschlossenen, & Hult, 1995). Bei der Cutinase, die Tri- halboffenen und offenen Strukturen unter ver- glyceride hydrolysiert, aber keinen "Lid" besitzt schiedenen ein und so als eine Art Zwischenstufe zwischen Mechanismus für die Bewegung des "Deckels" Lipasen und Esterasen angesehen werden kann, postuliert werden, der über die Isomerisierung zeigen Strukturuntersuchungen, dass sich die einer Disulfid-brücke und die Konformation- Konformation der katalytischen Reste nicht sänderung ändert (Martinez et al., 1994; Prompers et al., Kristallisationsbedingungen eines Arginins ausgelöst wird (Brzozowski et al., 2000). Ein besonderer Me- 1999). chanismus, der die Anwesenheit einer Colipase In Anwesenheit eines kovalent gebundenen erfordert, konnte für die humane Pankreaslipase Inhibitors wurde jedoch eine Anpassung der (van Tilbeurgh et al., 1993), die Pankreaslipase übrigen Reste in der Bindungstasche der Cuti- des Pferdes (Bourne et al., 1994), und Lipopro- nase (Carvalho, Aires-Barros & Cabral, 1999) tein-Lipase (Dugi et al., 1992) nachgewiesen ("induced fit") festgestellt. Untersuchungen der werden. Dynamikmit Hilfe der NMR-Spektroskopie am Ob dabei auch weitere Konformations- Protein-Rückrat der Cutinase (Prompers et al., änderungen im Inneren des aktiven Zentrums 1999) zeigen eine erhöhte Mobilität der Reste stattfinden, scheint für jede Lipase unterschied- in der Bindetasche auf einer Zeitskala im Milli- lich sein. Für RML (Rhizomucor miehei) und sekundenbereich, d. h. Bewegungen, die in der Pseudomonas glumae wurden solche Verände- Größenordung der Katalysegeschwindigkeit für rungen im Vergleich zu den offenen Strukturen einen Substratwechsel liegen. homologer Lipasen beobachtet. 22 Kapitel 2 Biologisches System Angegeben ist der jeweilige PDB-Code aus der 2.6.3 Lipasen mit bekannter Proteindatenbank sowie die vorliegende "Lid"- Raumstruktur Konformation zusammen mit der gegebenenIn der folgenden Auflistung (Tabelle 2.1) sind falls möglichen Präsenz eines kovalent gebun- die bakteriellen und pilzlichen Lipasen, von denen Inhibitors. denen bis zum Jahr 2000 die Raumstruktur aufgeklärt und veröffentlicht wurde, zusam- Trotz der grossen Zahl an Strukturen mit ge- mengefasst. humane bunden Inhibitoren ist bisher nur ein Beispiel Pankreaslipase, die im Komplex mit einer Coli- (Candida rugosa: 1lps/1lpo) mit chiralen Inhi- pase aufgeklärt werden konnte und die Cutina- bitoren bekannt, die einen direkten Vergleich se, von der eine Reihe Mutanten untersucht der beiden Bindungsmoden der gebundenen wurden, aufgeführt. Enantiomere ermöglichen. Zusätzlich ist die Tab. 2.1: Vorliegende Lipasestrukturen mit Abkürzung und PDB-Einträgen Name Organismus geschlossen offen mit Inhibitor (fett = chiral) CaL Candida antarctica B - 1tca 1tcb1tcc CrL Candida rugosa 1lpp 1crl 1lbs Tween80 1lbt n-Hexyl-ethyl-phosphonat 1lpn Dodecanesulfonat 1lps (1S)-Menthyl hexyl phosphonat 1lpo (1R)-Menthyl hexyl phosphonat GcL HlL Geotrichum candidum Humicola lanuginosa 1thg - 1tib 1du4 1dte 1dt3 1dt5 1tic,1dt5 1ein Polyoxyethylen-5-octyl-ether PcL Pseudomonas cepacia 1oil 2lip 3lip 4lip R-Dioctylglycero-3octylphosphonat 5lip R-Dibutylglycero-3butylphosphonat 1hqd 1-Phenoxy-2-acetoxy butan PgL (BpÖ) PaL RdL RmL Pseudomonas glumae (Burkholderia plantarii) Pseudomonas aeruginosa Rhizopus delemar Rhizomucor miehei HuPL human pancreatic Lipase + sus scrofa Colipase (pig) Fusarium solani Cutinase FsC 1tah 1qge 1cvl C. viskosum 1ex9 R-dioctylglycero-3octylphosphonat 1tic 1tgl 2tgl 3tgl - 4tgl Diethylphosphonat 5tgl n-Hexyl-ethyl-phosphonat 1lpa Diundecyl phosphatidyl cholin 1lpb Undecane-methyl phosphonat 1agy 1cex 1oxm (no LID) 2cut Diethyl-para-nitrophenyl phosphonat 33 Cutinase-Mutanten 1xzk Di(isopropyl) phosphonat 1cuu-1cuz 1ffa-1ffe 1xza-1xzj 1xzl n- Hexyl-ethyl-phosphonat 23 Kapitel 3 3 Kenntnisstand KENNTNISSTAND ÜBER DEN 3.1.1 Waschmittel EINSATZ VON LIPASEN Der größte Einzelmarkt für Lipasen ist ihr Einsatz als Waschmittelzusatz (Arbige und 3.1 Pharmazeutische und Pitcher, 1989). Hier werden sie zusammen mit industrielle Einsatzmög- anderen mikrobiellen Enzymen (Proteasen, lichkeiten von Lipasen Amylasen, Cellulasen) zum Erreichen gleicher Waschleistung bei niedrigerer Temperatur und Lipasen sind vor allem aus zwei Gründen inte- besserer ressante Untersuchungsobjekte: Zum einen Dazu werden Lipasen beispielsweise aus liegt ihre Bedeutung im medizinischen Be- Pseudomonas spec., vertrieben von den Firmen reich. Im Lipidstoffwechsel steuern sie den Genencor Abbau von Fetten und werden dabei durch (Boston et al., 1993; Lentius et al., 1993). Gallensäuren aktiviert. Störungen im Li- Novo Nordisks "Lipolaseâ", eine Lipase aus pidstoffwechsel führen zu Krankheiten. In Humicola Hinblick auf diesen Aspekt werden diagnosti- Aspergillus oryzae, ist seit vielen Jahren als sche Systeme, Hemmstoffe oder Aktivatoren Waschmittelzusatz auf dem Markt und wird in entwickelt. lipasehaltige Substitutionspräparate Mengen von mehreren 100 Tonnen eingesetzt. und Lipase-Inhibitoren haben deshalb auch Damit ist es das erste rekombinante Enzym, pharmakologische Bedeutung erlangt. Promi- dessen Verwendung im Haushaltsprodukten nentester Hemmstoff ist Tetrahydrolipstatin und Freisetzung in die Umwelt von den EU- ® Umweltverträglichkeit und Gist-Brocades, lanuginosa, eingesetzt. eingesetzt. exprimiert in (Orlista, Xenical ), das die Fettspaltung im Mitgliedsstaaten genehmigt wurde (Schmid & Darm durch die irreversible Hemmung der Verger, 1998). Pancreaslipase unterbindet und von Roche als 3.1.2 Nahrungsmittel- und Kosmetikindustrie Schlankheitsmittel auf den Markt gebracht wurde. Die industrielle Hydrolyse von Fetten ist von Zum Anderen sind aber die katalytischen Fä- großem wirtschaftlichen Interesse. Lipase- higkeiten für ihre Bedeutung verantwortlich. katalysierte Reaktionen können bei normalem Lipasen haben ein relativ weites Substratspekt- Druck am Temperaturoptimum des Enzyms rum; sie sind nicht auf die Spaltung von von ca. 30 - 60°C durchgeführt werden. Da- Triglyceriden beschränkt. Es gibt hochselekti- durch ergibt sich eine Energieersparnis und ve Lipasen, die zwischen Enantiomeren eines durch die größere Selektivität eine vereinfachte Substrats unterscheiden können. Viele Lipasen Aufarbeitung der Produkte. Eine weitere sind auch in organischen Lösungsmitteln stabil Einsatzmöglichkeit von Lipasen ist die enzy- und aktiv, wodurch sich weitere Einsatzmög- matische Herstellung von Monoacylglyceriden lichkeiten ergeben. als Detergenzien und Emulgatoren. 24 Kapitel 3 Kenntnisstand Wert nicht in einen Bereich zu verschieben, in 3.1.3 Esterifikation und Interesterifikation dem die meisten Lipasen inaktiviert werden. Esterifikation ist die Umkehrreaktion der 3.2 Hydrolyse. In einem System mit niedriger Wasseraktivität kann eine Lipase die Organisch-chemischen Esterverknüpfungen von freien Fettsäuren und oftmals Alkoholen katalysieren. Die Hauptanwendung von Lipasen Racematspaltung ist die durch und des Produkts weitere elegante Methode selektiv ein Produkt zu erhalten. Reaktionen wurde der Begriff der Selektivität eine weiter spezifiziert. Man unterscheidet drei vollständige Umsetzung erreicht werden kann. Eine Endprodukten Angesichts der großen Vielfalt chemischer leichter steuerbar als die Hydrolyse, da durch Entfernen verschiedenen können möglich, die Nebenreaktionen zu unterdrücken in organischem Medium. Die Esterifikation ist stetiges zu Reaktionen führen. Je nach Reaktionsführung ist es kinetische Esterifikation Selektivität verschiedene Aspekte: zur Vermeidung der Rückreaktion ist der Einsatz Estern des Vinylalkohols zur I . Chemoselektivität: Präacylierung des Enzyms, da der Die spontan zum von freiwerdende Ethanal Vinylalkohol (Acetaldehyd) Stöchiometrie Reaktionen ist der konkurrierenden unterschiedlich und die Summenformeln der möglichen Produkte sind weiterreagiert verschieden. Ein Beispiel bietet die Reduktion (Martinelle & Hult, 1995). von Trichlorethanal, die zu Acetaldehyd oder Ein vielversprechendes Einsatzgebiet von zu 2,2,2-Trichlorethanol führen kann. Lipasen ist die Interesterifikation, d. h. der Austausch einer Alkoholgruppe gegen eine II. Regioselektivität: andere. Speziell in der Nahrungsmittelindustrie ist ein solcher selektiver Austausch zur Fett- Die konkurrierenden Reaktionen haben die veredelung von Interesse. gleiche Stöchiometrie, die Produkte sind Konstitutionsisomere, z. B. 1-Chlorpropan und Für die Esterifikation gibt es zwei Probleme: 2-Chlorpropan bei der Addition von Chlorwasserstoff an Propen. Im Bereich der a) Um einen niedrigen Wassergehalt des Lipasen Reaktionssystems über die Dauer der Reaktion bevorzugt zu gewährleisten, muss Wasser im gleichem bedeutet an Regioselektivität, Position 1 oder 3 dass von Triacylglycerolen gespalten wird, nicht aber an Maß abgezogen werden, wie es durch die Position 2. Reaktion gebildet wird. b) Die Konzentration der freien Fettsäuren III. Stereoselektivität: muss niedrig gehalten werden, um den pH- Die entstehenden Produkte sind Stereoisomere. 25 Kapitel 3 Kenntnisstand 3.2.1.1 Kinetische Racematspaltung Man klassifiziert weiter in Diastereoselektivität und Enantioselektivität. Eine der Hauptanwendungen von Lipasen die Trennung von Enantiomerengemischen. In dieser Arbeit wird eine stereoselektive, enzymatisch katalysierte Reaktion untersucht. Typische Substrate für lipasekatalysierte Racematspaltungen sind Ester oder Amide 3.2.1 Stereospezifische Katalysen unverzweigter Carbonsäuren mit stereogenem Aufgrund zur Zentrum oder Carbonsäureester gebildet mit stereospezifischen Katalyse können mit Hilfe chiralen primären oder sekundären Alkoholen. von Lipasen auch optisch reine Produkte Weiterhin wird sogar die Hydrolyse von hergestellt werden, die synthetisch nur unter Carbonsäureamiden zu Aminen durchgeführt erheblich (Balkenhohl et al., 1997; Gotor, 1999; Reetz & werden ihrer Fähigkeit grösserem könnten, Aufwand z. B. hergestellt enatiomerenreine Dreisbach, 1994). sekundäre Alkohole. Das Die Mehrzahl von Pharmazeutika Agrochemikalien, die enthalten, heute Katalysator ist in als enantiomerenreiner der Lage, mit den Zentren spiegelsymmetrischen Formen eines chiralen racemische Substrates zueinander diastereomere Enzym- Gemische verkauft(Bommarius, Schwarm & Substrat-Komplexe auszubilden. Wenn die Drauz, 1998). Lipasen können aufgrund ihrer Bildung Stereospezifität geschwindigkeitsbestimmenden werden in chirale und Enzym als Verfahren eingesetzt dieser Komplexe dem Übergangs- werden, die dann nur die gewünschten zustand Enantiomere liefern (Mochizuki et al., 1993). entspricht, Die Entwicklung in diesem Bereich ist Substratenantiomere mittlerweile so weit fortgeschritten, dass Geschwindigkeit umgesetzt. Die Differenz der Lipasen inzwischen zu einem beliebten, häufig freien Enthalpie DDG* der diastereomeren verwendetem Werkzeug in vielen organisch- Übergangszustände chemischen Laboratorien geworden sind. resultierende Verhältnis der Geschwindigkeits- Folglich werden konstanten lipasekatalysierte immer mehr enzymkatalysierten werden k1/k2 die mit und ist ein Reaktion beiden unterschiedlicher das Maß daraus für die Stereoselektivität dieser Reaktion. Reaktionsschritte, insbesondere in organischen Lösungsmitteln, der in Das Racemat eines Esters mit einem stereoge- Syntheserouten eingebaut, vor allem dann, nen Zentrum im Alkoholteil kann enzymatisch wenn die optische Reinheit des Produktes von hydrolysiert werden. Unter der Voraussetzung, essentieller Bedeutung ist (Jaeger & Reetz, dass die Lipase den gewählten Carbonsäu- 1998; Kazlauskas, 1993). reester als Substrat mit ausreichend hoher Aktivität umsetzt, wird im Idealfall nur ein Stere26 Kapitel 3 Kenntnisstand oisomeres des Racemats vollständig zum Alkohol hydrolysiert; das andere Enantiomer bleibt unverändert als Ester zurück. Der enatiomerenreine freie Alkohol kann dann mit physikalischen Methoden vom Ester abgetrennt werden. 27 Kapitel 3 Kenntnisstand Als Kenngröße der Enantioselektivität einer Kennt man den E-Wert einer Reaktion, kann Reaktion kann dann der sogenannte ee-Wert man den Enantiomerenüberschuss zu einem (Enantiomerenüberschuss, enantiomeric ex- bestimmten Zeitpunkt bei gegebenem Umsatz cess, % ee) der Produkte bestimmt werden. Er c theoretisch berechnen. Umgekehrt ist es ist ein Maß für das Enantiomerenverhältnis in möglich, aus dem gemessenen Umsatz und einer Mischung zweier Enantiomere. Definiert dem experimentell bestimmten Enantiomere- ist er als: nüberschuss des Produkts P oder des verbliebenen Substrates S den E-Wert zu bestimmen. X - XB ee des Produkts: % ee P = A ´ 100 XA + XB E= XA, XB: molare Fraktionen der Produkt-Enantiomer (Chen & Tsai, 2000; Xie, Liu & Chen, 1998). Beide Enantiomere können in einer Ausbeute 100 % anfallen, wenn der Umsatz des langsa- Km ( R) Km (S ) = ln [1 - c (1 + eeP )] ln [1 - c (1 - eeP )] eeS eeS + eeP Ein Beispiel für die technische Anwendung meren Enatiomers praktisch gleich null ist und und Optimierung im Rahmen der Synthese das schnellere Enantiomer vollständig hydroly- eines Arzneistoffes ist die durch Candida an- siert wird. In der Realität wird dieser Idealfall tarctica Lipase B (NOVOZYM 435, Novo selten erreicht, da auch das weniger reaktive Nordisk A/S) katalysierte Racematspaltung Enantiomer teilweise hydrolysiert wird und die von Reaktion abgebrochen wird, bevor das schnelle (R,S)-Ibuprofen-2-Chlorethylester (Mustranta, 1992). Im Laufe der Entwicklung Enantiomer vollständig umgesetzt ist. Die E- konnte die Stereoselektivität durch geeignete nantiomerenreinheit der Produkte und der Lösungsmittel mit definiertem Wassergehalt verbleibenden Edukte ist daher auch vom Um- auf über 98% ee S(-)-Ibuprofen erhöht werden. satz der Reaktion zum Zeitpunkt des Abbruchs abhängig. Eine weitere Optimierung des Verfahrens gelang durch den Einsatz einer Lipase aus Can- Um Reaktionen ohne Angabe von kinetischen dida rugosa und durch Verwendung des Butyl- Parametern vergleichen zu können, wurde von esters in Hexan unter Zusatz von Phosphorpen- Sih der E-Wert (enatiomeric ratio) eingeführt. toxid als Trocknungsmittel, um das bei der Dieser Wert gibt das Verhältnis der Anfangs- Esterhydrolyse entstehende Reaktionswasser geschwindigkeiten beider Enantiomere an. Er aus dem Gleichgewicht zu entfernen (Lakshmi ist für jede biochemische Reaktion eine Kon- et al., 2000). Dadurch konnte die Ausbeute an stante für die gewählten Reaktionsbedingunk1 ( R ) = k 2 (S ) K kat c= von maximal 50 % und mit einem ee von E= K kat K kat K kat KM (R) KM (S ) (S)-Ibuprofen aus dem Racemat auf 49 % ge- æ DDG * ö ÷ = k × exp çç R T ÷ø è steigert werden. gen. 28 Kapitel 3 Kenntnisstand 3.2.1.2 Stereospezifität für sekundäre Cygler et al. erklären die Substratselektivität Alkohole anhand der räumlichen Geometrie der EnzymSubstrat-Komplexe. Sie benutzten dazu die Zur Vorhersage der bevorzugt umgesetzten Kristallstrukturen der Lipase von Candida Form eines chiralen Substrates hat Kazlauska rugosa mit kovalent gebundenen Inhibitoren, eine empirische Regel für sekundärer Alkohole die als Substratanaloga den Übergangszustand aufgestellt, die für viele Lipasen und Esterasen imitieren. Die Inhibitoren wurden von beiden gilt (Cygler et al., 1994). Später wurde sie auf enantiomeren Formen des chiralen Menthol a-substituierte, chirale Carbonsäuren erweitert abgeleitet, um die Gültigkeit der Kazlauska- (Ahmed et al., 1994). Regel für die kinetischen Racematspaltung Diese Regel besagt, dass das in Abbildung 3.1 strukturell zu untersuchen. (Cygler et al., abgebildete Enantiomer bevorzugt umgesetzt 1994) wird, wenn M ein Substituent mittlerer Größe Wie aus der Abbildung 3.2 hervorgeht, ist die ist und L ein größerer Substituent, der typi- Raumstruktur des langsamer reagierende (1S)- scherweise mindestens fünf Kohlenstoffatome Enantiomers durch eine Störung der Wasser- umfaßt, und dabei auch verzweigt sein kann. stoffbrückenbindungen zwischen dem Histidin Eine Erklärung dieser Regel durch Kazlauska des aktiven Zentrums und dem Substrat im et al. basiert auf der relativen Größe der Sub- tetraedrischen Übergangszustand gekennzeich- stituenten am Stereozentrum. net, womit die geringe katalytische Aktivität in Eine Teil der untersuchten Enzyme und Sub- Verbindung gebracht wird. Die Enantiopräfe- strate läßt sich nicht nach dieser Regel klassifi- renz wird in diesem Modell nicht durch eine zieren. Dies führt oft zu einer falschen Vorher- vom katalytischen Zentrum getrennte Bin- sage der Enantiopräferenz. Insbesondere die in dungsstelle für sekundäre Alkohole erklärt, dieser Arbeit untersuchten Stereopräferenzen sondern durch die Interaktion mit den essen- von Candida antarctica Lipase B gegenüber tiellen Teile des katalytischen Apparates. Da sekundären Aminen und Alkoholen folgen die räumliche Anordnung der katalytischen nicht der Kazlauskas-Regel. Reste für viele Lipasen und Esterasen sehr ähnlich ist, lässt sich eine allgemeine Gültig- H keit OH der Kazlauskas-Regel ableiten (Kazlauskas, 1994). Warum sie in manchen Fällen nicht anwendbar ist, ist aus diesem Mo- M dell heraus nicht zu verstehen. L Abb. 3.1: Kazlauskas Regel zur Enantiopräferenz von sekundären Alkoholen mit Lipasen 29 Kapitel 3 S Kenntnisstand O P O O Ser Glu341 O O R O His449 H O N P N O His449 O H N N H H O O Ser Abb. 3.2 Glu341 O O O O P P Ser209 O Ser209 : Kristallstruktur der Bindetasche von Candida Rugosa Lipase mit gebundenem R-Mentyl- Phosophonat-Inhibitor (gelb, schnelleres Enantiomer). Zusätzlich ist der S-Mentyl-Phosophonat-Inhibitor (rot, langsameres Enantiomer) aus einer zweiten Röntgenstruktur überlagert. Die Oberfläche des Enzyms wurde aus der Struktur mit gebundenem R-Menthyl berechnet. Es ist deutlich zu erkennen, wie die Isopropylgruppe des S-Mentyl-Restes mit dem Enzym in seiner aktiven Konformation kollidieren würde. Unten rechts ist der Unterschied der beiden Röntgenstrukturen als Schema wiedergegeben. Um die oben verdeutlichte Kollision zu vermeiden, liegt Histidin 449 in der Raumstruktur mit dem S-Mentyl Inhibitor in einer vom Substrat weggedrehten Konformation vor und verliert so die Wasserstoffbrücke zum Ester-Sauerstoff. Dies wird mit der geringeren katalytische Aktivität bei der Esterspaltung in Verbindung gebracht. (Cygler et al., 1994) 30 Kapitel 3 3.3 Kenntnisstand herangezogen werden (Orrenius et al., 1998b; Computergestützte Raza, Fransson & Hult, 2001). Vohersage der Enantioselektivität Andere Untersuchungen konnten zeigen, dass bereits die Analyses eines Torsionswinkels der Einfache quantitative Modelle und die Raum- sn2-Fettsäurekette in TriacylGlycerolen die strukturen mit gebundenen Inhibitoren haben korrekte Stereoselektivität im Hinblick auf sn1 viel zum Verständnis der Stereoselektivität oder sn3 für alle untersuchten Lipasen und lipasekatalysierter Reaktionen und den zu Triacylglycerole vorhersagen konnte (Scheib et Grunde liegenden Mechanismen beigetragen al., 1999). (Kazlauskas, 2000). Die momentan zur Verfügung stehenden MeFür Enzyme mit bekannter Raumstruktur wur- thoden der computergestützten Modellierung de ein Modell des tetraedrischen Übergangszu- von Enzymreaktionen sind aber noch nicht in standes für beide Enantiomere modelliert und der Lage, eine quantitative Vorhersage der dann die sterischen und geometrischen Eigen- Stereoselektivität schaften der beiden statischen Komplexe ver- (Kazlauskas, 2000). zu gewährleisten glichen (Uppenberg et al., 1995). Es gibt lediglich zwei Beispiele in der LitheEine qualitative Abschätzungen der Enantiose- ratur, die Stereoselektivität einer kinetischen lektivität mit computergestützten Methoden Racematspaltung auch quantitativ korrekt vor- konnte durch Abschätzung der relativen poten- hersagen, die im folgenden näher erläutert tiellen Energie des tetraedrischen Substrat- werden. Enzym-Komplexes in der Bindetasche mit Hilfe von Kraftfeldrechnungen erzielt werden Eine semiquantitative Methode zur Vorhersage (Haeffner, Norin & Hult, 1998). der Stereoselektivität der Lipase Pseudomonas cepacia gegenüber chiralen sekundären Alko- Die unterschiedlichen Konformationen für die holen wurde von T. Schulz et al. vorgeschla- jeweiligen Enantiomere wurden aus molekular- gen (Schulz, Pleiss & Schmid, 2000). Die Au- dynamischen Simulationen oder Docking- toren untersuchten das für die Katalyse essen- Experimenten erhaltenen (Tafi et al., 2000). tielle Wasserstoffbrückennetz zwischen dem Substrat im tetraedrischen Übergangszustand Da die Energiewerte aus den Kraftfeldrech- und dem benachbarten Histidin der katalyti- nungen des gesamten simulierten Enzym- schen Triade. Substrat-Komplexes die zu bestimmende Energiedifferenz zwischen den beiden Enantiomeren um mehrere Größenordnungen übersteigt, kann jedoch die Gesamtenergie des Systems nicht zur quantitativen Vorhersage 31 Kapitel 3 Kenntnisstand Die Korrelation der Länge der modellierten Eine weitere Grundannahme, deren Gültigkeit Wasserstoffbrücke zwischen dem Sauerstoff bisher nicht eindeutig bewiesen ist, beruht in der zu spaltenden Esterbindung und dem Stick- der Vermutung, dass das tetraedrische Inter- stoff des Histidins für das langsamere Enanti- mediat dem die Enantioselektivität bestim- omer dient bei dieser Abschätzung zur Unter- menden Übergangszustand der Reaktion ent- scheidung von stark und wenig enantioselekti- spricht. ven Reaktionen. Der tatsächliche Übergangszustand der ReaktiEin anderer Ansatz verfolgt die Simulation des on im Verlauf der Bindungs-spaltung oder - tetreadrischen Übergangszustandes in Candida verknüpfung ist mit den bisher angewandten antactica Lipase B mit aufwendigeren moleku- Kraftfeldrechnungen prinzipbedingt nicht zu- lardynamischen Methoden. Es wurde ebenfalls gänglich (Wang et al., 2001). Die Simulation nur eine Auswahl von essentiellen Wechsel- des gesamten Reaktionspfades erfordert die wirkungen zur Energiebetrachtung verwendet. Anwendung quantenmechanischer Rechnun- Durch eine geeignete Zahl von Parametern gen auf das Enzym-Substrat-System. Diese konnte der enthalpische Beitrag zur Enantiose- Rechnungen bedeuten allerdings einen extre- lektivität quantitativ richtig abgeschätzt wer- men Rechenaufwand für enzymatische Syste- den (Raza et al., 2001). Sie stimmen mit den me. am gleichen System gemessenen experimentelEine erfolgsversprechende Methode scheint len Daten für die Aktivierungsenthalpie über- daher die Entwicklung kombinierter Anwen- ein. (Ottosson & Hult, 2001). Diese Untersu- dung molekülmechanischer (MM) Methoden chungen der Temperaturabhängigkeit der kine- für das Enzym und quantenmechanischer Be- tischen Racematspaltung und die Auswertung rechnungen (QM) für die Atome des Reakti- der Aktivierungsentropie und -enthalpie konn- onszentrums zu sein (Kollman et al., 2001). ten zeigen, dass die erzielte Enantioselektivität auch von einem entropischen Faktor abhängen muss. Da dieser Faktor in der energetischen Auswertung der molekulardynamischen Simulation des tetradrischen Intermediates bisher nicht berücksichtigt wurde, war eine quantitative Vorhersage der Enantioselektivitäten nur eingeschränkt möglich. 32 Kapitel 3 3.4 Kenntnisstand des beweglichen "Lids". Die Mutationen wirk- Mutagenese von Lipasen ten sich jedoch negativ auf die katalytischen Rekombinant hergestellte Lipasen können Eigenschaften des Enzyms aus. durch gezieltes Einbringen von Punktmutationen in das zugehörige Gen und damit den ge- Die Verbesserung der Oxidationsempfindlich- richteten Austausch von Aminosäuren abge- keit von Lipasen gelang durch den kon- wandelt werden. servativen Austausch aller oxidierbaren Aminosäuren wie z.B. Methionin gegen Leucin Diese Technik wurde zunächst zur Identifika- (Patkar et al., 1998). tion von katalytischen Aminosäuren (Ser, His, Asp) eingesetzt (Frenken et al., 1992), wobei Die Temperaturstabilität von Lipasen konnte die Austausche der katalytisch essentiellen nach Bekanntwerden der dreidimensionalen Aminosäuren eine deutliche Reduktion der Struktur durch die Einführung zusätzlicher Aktivität bedingen. Disulfidbrücken (Yamaguchi et al., 1996) an Positionen, die analog zu bekannten Disul- Erst später gelang es, die Stabilität und ka- fidbrücken in homologen Enzymen waren, talytische Aktivität durch gezielte Verände- erhöht werden. rungen zu optimieren und eine Verbesserung 3.4.1 Gerichtete Mutagenese der Enzymeigenschaften auf einen bestimmten Anwendungszweck hin zu erreichen. Mit zunehmendem Verständnis der Struktur- Erste anwendungsbezogene Erfolge waren die Aktivitäts-Beziehungen, Verbesserung von Proteaseresistenz und En- mechanismen und der Selektivitätskriterien zymstabilität in peroxidhaltigen Waschflotten. von Lipasen ist es möglich geworden, die Li- Dabei gelang es NOVO NORDISK AS mit der pasen erkenntnisgetrieben an ein bestimmtes Lipase aus Humicola lanuginosa und UNILE- Substrat VER mit einer bakteriellen Lipase aus Pseu- (Svendsen, 2000). domonas glumae gezielte, stabilitätsverbes- oder eine der Funktion Reaktions- anzupassen Zahlreiche Veröffentlichungen adressieren die sernde Mutationen einzubringen. direkte Umgebung der katalytischen Amino- Zum Erhöhen der Proteasestabilität wurde säuren in der Bindetasche, um die Acylketten- gezielt die Umgebung der Spaltstellen durch längenspezifität gegenüber Triacylglyceriden Einführung von Prolinen und geladenen Ami- oder Acyl-p-Nitrophenolestern zu verändern nosäuren verändert. Der Austausch kurzer (Joerger & Haas, 1994; Mannesse et al., Loops gegen solche mit bekannter Proteaseu- 1995b; Martinelle et al., 1996). Diese Mutati- nempfindlichkeit führte ebenfalls zum Erfolg. onsstudien verfolgen zum Teil gegensätzliche Im Falle der Lipase aus Ps. glumae befand sich Strategien. eine Protease-Spaltstelle genau im Ankerpunkt 33 Kapitel 3 Kenntnisstand Zum Einen werden die oben erwähnten Erfolge Eine gezielte Anpassungen einer Lipase im in der Modellierung von Lipasen direkt zur Hinblick auf eine Erhöhung der Enantioselek- gezielten Vorhersage von Mutanten mit verän- tivität gegenüber primären oder sekundären derter Acylkettenlängenspezifität genutzt, um Alkoholen wurde bisher nicht in der Literatur gezielt Mutationen einzubringen (Klein et al., beschrieben. Es wurde gezeigt, dass auch Mu- 1997; Manetti et al., 2000; Scheib et al., 1998). tationen ausserhalb des aktiven Zentrums im Zum Anderen wird das strukturelle Wissen "Lid" des Enzyms einen starken Einfluss auf erfolgreich eingesetzt, um Aminosäuren im die aktiven Zentrum (Boston et al., 1997) durch matspaltungen haben können (Reetz, 2000). die Anwendung aminosäurespezifischer PCR- Die Gründe für dieses Verhalten können aber Mutagenese auszutauschen (Chang, Chen & beim derzeitigen Kenntnisstand über die en- Shaw, 1996). zymatischen Vorgänge auf molekularer Ebene Enantioselektivität kinetischer Race- noch nicht angegeben werden. Auf diesem Wege ist es der Firma Genencor International gelungen, mit Hilfe von amino- 3.4.2 Ungerichtete Mutagenese säurespezifisch degenerierten Primern eine Bibliothek von ca. 14.000 zufälligen Lipasen- Wenn nur wenig über die genauen Ansatz- mutanten einer Pseudomonas mendocina Lipa- punkte bekannt ist, gewinnen Ansätze zur Zu- se/Cutinase (LUMAFAST®) aufzubauen und fallsmutagenese mit anschliessender Selektion mit einem automatisierten zweistufigen Essay der Mutanten nach den gewünschten Eigen- die verbesserten Mutanten zu identifizieren. schaften (gesteuerte Evolution) an Bedeutung. Mit Hilfe von Hochdurchsatz-Aktivitäts- und – Im ersten Schritt wird in einem Essay die Ak- Enantioselektivitäts-Bestimmungen in Kombi- tivität des Enzyms qualitativ bestimmt. Erst in nation mit automatisierter Proteinexpression, einem zweiten Essay werden die als aktiv wie sie aus der Genomforschung bekannt ist, indentifizierten Enzyme quantitativ auf ihre ermöglicht es, mehrere hunderttausend Prote- Kettenlängenspezifität Acyl-p- inmutanten durchzumustern und die erhalte- Nitro-phenolaten in einem photometrischen nen, verbesserten Mutanten der ersten Genera- Aktivitätstest untersucht (Boston et al., 1997). tion einer erneuten Zufallsmutagenese zuzu- gegenüber führen (Abbildung 3.3) (Gaskin et al., 1997; Rubingh, 1997) . 34 Kapitel 3 Kenntnisstand Abb 3.3 Flussschema der Optimierung einer Lipase durch gerichtete Evolution (aus(Liebeton et al., 2000)) 1 Erzeugung von rekombinanten Enzymvarianten durch Zufallsmutagenese 2 Expression und Reinigung der Enzymvarianten 3 Hochdurchsatzaaktivitätstest zur Vorauswahl 4 Quantitativer Selektivitätstest 5 Selektion und Klonierung der besten Enzymvariante Die ersten Erfolge dieser Methode, der soge- Vorteil sein könnten. Die Auswahl des Essays nannten gerichteten Evolution, bestanden in zur Selektion der Mutanten ist die einzige der Anpassung der Enzyme an organische Lö- Möglichkeit, das Ergebnis rational zu beein- sungsmittel (Moore & Arnold, 1996). Da En- flussen. Auf diese Weise konnte erstmals auch zyme von der Natur auf eine wässrige Umge- die Enantioselektivität gegenüber einer chira- bung selektiert wurden, konnte in vielen Fällen len Säure gesteigert werden. Zur einfachen eine drastische Steigerung der Enzymaktivität Analyse der Aktivität wurde die 2-Methyl- unter diesen nicht natürlichen Bedingungen decansäure als p-Nitrophenylester eingesetzt erziehlt werden (Arnold et al., 2001). (Liebeton et al., 2000; Reetz, 2000). Die nachträgliche Analyse der Mutationen zeigte, dass Dieser Ansatz erfordert in Gegensatz zur ge- keiner der ausgetauschten Reste im aktiven richteten Mutagenese keine Informationen, wie Zentrum lokalisiert ist (Nardini et al., 2000). die Aminosäuren zur gewünschten Eigenschaft beitragen, oder welche Substitutionen von 35 Kapitel 4 4 Material und Methoden Grundlage der Röntgenstrukturanalyse ist die MATERIAL UND METHODEN Beugung und Interferenz von Röntgenstrahlen 4.1 an den Atomen genaugenommen ihren Elekt- Röntgenstrukturanalyse ronen. Die Beugung erfolgt nach dem BraggDie Röntgenstrukturanalyse ist neben der schen Gesetz: mehrdimensionalen NMR-Spektroskopie eine 2d sin Q = l etablierte Methode zur Aufklärung der 3DStruktur von kleinen organischen Molekülen an den Gitterebenen eines mit einem Abstand d bis hin zu Proteinen. Eine notwendige Voraus- regelmäßig aufgebauten Einkristalls. Der mi- setzung für die Strukturbestimmung mittels nimale Abstand dmin zwischen Gitterebenen Röntgenbeugung ist die Züchtung geeigneter eines Kristalls, der zur Beugung mit dem größ- Kristalle eines Moleküls oder Proteins. ten Winkel Qmax führt, wird als Auflösung einer Röntgenstruktur bezeichnet. Während die NMR-Spektroskopie in Lösung auf „kleinere“ Proteinstrukturen bis derzeit maximal 40 kDa limitiert ist, gibt es im Falle der Röntgenkristallographie keine obere Grenze für die Masse der untersuchbaren Proteine. In einer Röntgenstruktur ist die Betrachtung des Systems nur als einer über alle Konfiguration der Moleküle im Kristall gemittelten Struktur möglich. Bewegliche Bereiche, die von Elementarzelle zu Elementarzelle nicht immer wieder die gleichen Konformationen annehmen, können so prinzipbedingt nicht in Abb. 4.1 Schema der Beugung an zwei Ebenen eines Gitters mit dem Abstand d unter dem Winkel Q. Konstruktive Interferenz entsteht bei einem Gangunterschied 2x = nl der Elektronendichte wiedergegeben werden. In der NMR-Spektroskopie stellt sich dieses Problem anders, da es davon abhängt, ob im Rahmen der Zeitauflösung des NMR- Experiments multiple Konformationen als getrennte Signale auflösbar sind. Die 3D-Strukturen von organischen und metallorganischen Molekülstrukturen werden in der CSD (Cambridge Structural Databank), Proteinstrukturen in der PDB (Protein Data Bank) (Sussman et al., 1998) gesammelt. 36 Kapitel 4 Material und Methoden (multiple isomorphous replacement MIR) oder 4.1.1 Aufnahme von Röntgendaten die Messung vollständiger Datensätze eines Durch die Drehung des Kristalls im Röntgen- Kristalls strahl werden sukzessive alle reziproken Git- (multiple wavelength anomalous dispersion terebenen in Reflektionsstellung gebracht. Man MAD) kann dann zur Berechnung der initialen erhält das vollständige Beugungsmuster aller Phaseninformation verwendet werden. bei verschiedenen Wellenlängen Gitterebenen des Kristalls. Durch die Auswer- 4.1.2 Erzeugung von tung der Intensitäten aller Reflexe in den Beugungsbildern können mit Hilfe der Gitterkon- Röntgenstrahlen stanten und der Symmetrie der Einheitszelle 4.1.2.1 Röntgengenerator die Strukturfaktoren bestimmt werden. Prinzipiell kann aus den Strukturfaktoren Fobs und Die Strahlung in einem Röntgengenerator wird den Phaseninformationen a die Lage der streu- nach dem Prinzip der Kathodenstrahlröhre enden Atome im Raum berechnet werden. Da erzeugt, wobei die Kathode aufgeheizt wird, jedoch nur die Intensitäten und nicht die abso- bis Elektronen austreten können. Diese werden luten Phasen am Detektor aufgezeichnet wer- dann im Hochvakuum entlang eines angeleg- den, muss die fehlende Phaseninformation ten, elektrischen Feldes zur Anode hin be- errechnet werden. Dies ist für sehr gut aufge- schleunigt. Beim Aufprallen auf die Anode löste Röntgenstrukturen mit Hilfe von direkten werden die Elektronen abgebremst. Hierbei Methoden möglich. entsteht die charakteristische Röntgenstrahlung (Abbildung 4.2) und ein kontinuierlicher An- Für Proteinstrukturen kann alternativ ein ho- teil, die sogenannte Bremsstrahlung. mologes Modell des Proteins zur Strukturlösung verwendet werden (molecular replacement MR). Aus dieser Modellstruktur kann die benötigte Phaseninformation über eine inverse Fourier-Transformation berechnet werden, wenn die richtige Orientierung im PattersonRaum gefunden wurde. Für unbekannte Proteinstrukturen, für die noch kein homologes Modell bekannt ist, existieren weitere Techniken, wie das Einbringen von Schwermetallionen in den Kristall oder den Einbau von Selenomethionin in das Protein Bild 4.2: Charakteristische Strahlung für eine Kupferanode durch rekombinante Methoden. Die Auswertung mehrerer Derivatkristalle 37 Kapitel 4 Material und Methoden Der Primärstrahl (CuKa-Strahlung, l=1,543 Die Detektion der Intensitäten abgebeugter Å, Ni-Filter für l £ 1.5 Å) wurde mit einem Reflexe erfolgte über ein CCD-Detektorsystem Drehanoden-Generator (Rigaku RU300, MSC, (Marresearch), wobei der Kristall-Detektor- USA) erzeugt, der auf eine Leistung von 50 kV Abstand 150 - 250 mm betrug. Aufgrund der und 100 mA eingestellt und mit einem Spie- hohen Mosaizität der Kristalle wurde für CaL gelsystem (Yale Mirrors, MSC, USA) auf den B eine Drehung um 0,5° pro Aufnahme durch- Kristall fokussiert wurde. Die Detektion der geführt, um die Zahl der Reflexe pro Bild zu Intensitäten abgebeugter Reflexe erfolgte elek- verringern und Überlagerungen benachbarter tronisch (RAXIS-IV Image Plate System, Reflexe zu vermeiden. MSC, USA), wobei der Kristall-DetektorAbstand 100 - 150 mm betrug. 4.1.2.2 Synchrotonstrahlung Für die Messung von kleinen Kristallen oder zum Erreichen hoher Auflösungen kann besser intensive, kohärente Röntgenstrahlung mit Hilfe eines Elektronenspeicherrings (Synchrotron) erzeugt werden. Kontinuierlich beschleunigte Elektronen werden durch Magnete Abb. 4.3: Typische Intensitätsverteilung der Synchrotronstrahlung (Bremsstrahlung) auf einer Kreisbahn geführt und geben durch Änderung ihrer Bewegungsrichtung sogenannte Bremsstrahlung ab. Bei ausreichend hoher Geschwindigkeit der Elektronen ist ein Teil dieser Strahlung im Wellenlängenbereich der Röntgenstrahlung (Abbildung 4.3) und kann zu Beugungsexperimenten verwendet werden. Die Wellenlänge kann durch Monochromatoren für den jeweiligen Anwendungszweck (MR, MIR, MAD) abgestimmt werden. Die Aufnahmen erfolgten am HASYLAB des DESY, Hamburg an der Beamline BW6 der Max-Planck-Gesellschaft. Die Wellenlänge betrug 1,1 Å. 38 Kapitel 4 Material und Methoden 4.1.3 Proteinkristallisation 4.1.3.1 Candida antarctica Lipase B Zur Kristallisation wurde die Methode des Die Proteinlösung enthielt 10 mg/ml der ge- hängenden Tropfens (hanging drop) über einer friergetrockneten Candida antarctica Lipase B konzentrierten Reservoirlösung in einem abge- (CaL B) in 0,1 M Citrat bei pH 3,6. Als Kris- schlossenen System angewandt. Alle Lösungen tallisationsvermittler wurden steril filtriert. glycopyranosid (SIGMA, in iso-Propanol), das diente b-Octyl- in einer Endkonzentration von 0,6 % vorlag. Auf einem runden Deckglas wurden je 2 µl der Die Reservoirlösung enthielt 20 % PEG 4000, Proteinlösung mit 2 µl Reservoirlösung ver- 20 % iso-Propanol und 0,1 M Citrat bei pH 3,6 dünnt und das Deckglas umgedreht über dem (Uppenberg et al., 1994b). Die Kristalle bilde- Reservoir platziert (Abbildung 4.4). Die so ten sich nach einigen Monaten bei 20° C und gebildete Kammer wurde mit Silikonfett wuchsen bis zu einer Größe von 0,1 x 0.1 x (BayCon mittelviskos) abgedichtet. 0,02 mm als hexagonale Plättchen. 4.1.3.2 Bugkholderia plantarii Lipase Die verdünnte, wässrige Proteinlösung der rekombinant exprimierten Bugkholderia plantarii Lipase (Bpl) wurde mit einem Amicon Abb.4.4: Die gepufferte Proteinlösung hängt als Tropfen („hanging drop“) über einer konzentrierteren Reservoirlösung. Die beiden Lösungen stehen über die Dampfphase miteinander in Kontakt. Nach außen hin ist das System abgeschlossen Microkonzentrator auf eine Proteinkonzentra- Durch Dampfdiffusion erhöhte sich dann die Glycol 4000 (Hampton Screen Lsg. 41). Als Konzentration des anfangs verdünnten Präzipi- Kristallisationsvermittler diente in diesem Fall tanz langsam, wodurch die kontrollierte Kris- 0,8 % b-Dodecyl-glycopyranosid (SIGMA, in tallisation des Proteins erreicht werden konnte. DMSO). Die erhaltenen Kristallnadeln konnten Dabei durfte die Konzentration des Präzipitanz aufgrund ihrer geringen Größe nur am Syn- in der Reservoirlösung nicht zu groß gewählt chroton gemessen werden. tion von 5 mg/ml aufkonzentriert. Die Präzipitanzlösung enthielt 0,1 M HEPES pH 7,5 und 10 % v/v iso-Propanol, 20 % w/v Polyethylene werden, damit in der langsam ankonzentrierten, übersättigten Lösung nur wenig Kristallisationskeime entstanden, die dann geordnet zu Einkristallen ausreichender Größe heranwachsen konnten. 39 Kapitel 4 Material und Methoden net werden. Die Interpretation der Elektronen- 4.1.4 Auswertung der dichtekarten erfolgte durch die manuellen Kor- Röntgendaten rektur der Aminosäurepositionen im ProZur Aufnahme eines Beugungsbildes am gramm O. Die jeweils günstigsten Seitenket- Röntgengenerator wurde der Kristall für 10-25 tenkonformationen wurden mit der Funktion min mit dem Cu Ka Primärstrahl bestrahlt und "LEGO sidechain" aus einer Rotamerbibliothek dabei schrittweise um 1° gedreht. Aufnahmen ausgewählt. am DESY wurden bei einer Wellenlänge von 1,05 Å mit einer Bestrahlungsdauer von 10- Mit Hilfe dieses verbesserten Modells wurde 100 sec und einer Drehung um 0,5° oder 1° erneut das Programm CNS/XPLOR aufgerufen, gesammelt. Die Bestimmung der Kristallsym- um die Differenz zwischen den gemessenen metrie und die Datenreduktion erfolgte mit den Strukturfaktoramplituden Fobs und den für das SCALEPACK aktuelle Modell berechneten Fcalc zu minimie- (Otwinowski & W. Minor, 1997). Mit Hilfe ren. Die Übereinstimmung zwischen Fobs und des Programms STRATEGY wurde aus der Fcalc wird durch den kristallographischen R- Kristallsymmetrie der beste Startwinkel sowie Faktor ausgedrückt. Programmen DENZO und die benötigte Gradzahl für einen kompletten R= Datensatz bestimmt. å( F - F ) åF obs calc obs In dieser Arbeit wurde ausschließlich die Methode des molekularen Ersatzes (MR) ange- Die Abweichung des Modells von der beo- wendet, um die Proteinstruktur mit Hilfe von bachteten Elektronendichte wird durch die bereits bekannten Modellstrukturen aus der Änderung der Atomkoordinaten solange mi- PDB zu bestimmen. nimiert, bis die Differenz der gemessenen und den aus dem Modell berechneten Strukturamp- Da die Orientierung des Proteins in der neuen lituden möglichst klein geworden ist. Einheitszelle unbekannt war, musste das Strukturmodell zunächst korrekt in der neuen Kris- Gleichzeitig wird ein Energieterm minimiert, tallzelle durch Rotation und Translation plat- der die Struktur in der Nähe von Standartwer- ziert werden. Dies wurde mit Hilfe des Pro- ten hält. In einem Kraftfeld sind neben Bin- gramms AMoRe (Automated Molecular Repla- dungslängen und Bindungswinkeln noch wei- cement) (J.Navaza, 1994) aus dem CCP4 Pro- tere energetische Wechselwirkungen paramet- grammpaket durchgeführt. risiert. Das in CNS/XPLOR implementierte Kraftfeld CHARMM greift auf Parametersätze Nachdem das Suchmodell in der Einheitszelle zu, die aus hochaufgelösten niedermolekularen platziert worden war, konnte eine erste Elekt- Kristallstrukturen abgeleitet wurden (Engh & ronendichte mit dem Programm CNS (Brunger Huber, 1991). et al., 1998) / XPLOR (Brunger, 1992) berech40 Kapitel 4 Material und Methoden Zusätzlich wurden 10 % der gemessenen 50 mm, Belichtungszeit 120 s, Messtemperatur Strukturfaktoren zur Validierung der kristal- -140°C). Zur Datensammlung wurden jeweils lographischen Verfeinerung eingesetzt und mit vier Phi- und Omega-Scans (Drehwinkel 0,5°) Hilfe dieser, nicht in die Anpassung des Mo- mit dem Programm SMART der Firma Sie- dells eingehenden, Strukturfaktoren analog mens durchgeführt. Die Datenreduktion und zum R-Faktor der sogenannte Rfree berechnet. Zellverfeinerung erfolgte mit dem Programm Dieser Prozess der kristallographischen Ver- AXS SAINT Bruker (Madison 1997), eine Ab- feinerung (Kleywegt, 2000; Kleywegt & Brun- sorptionskorrektur mit dem Programm PLA- ger, 1996) wurde iterativ über mehrere Zyklen TON. durchgeführt, bis der R-Faktor und der freie R4.1.5.1 Strukturlösung Faktor nicht mehr verringert werden konnten. Der Wert von Rfree sollte je nach Auflösung Für kleine, organische Moleküle erreicht man nicht mehr als 5 - 10 % über dem R-Wert lie- in der Regel Auflösungen, bei denen die Ato- gen, da sonst ein zu starkes Anpassen des me als getrennte Maxima in der Elektronen- Modells (overfitting) vorliegen könnte. dichte identifizierbar sind. Hier sind direkte Methoden das am häufigsten angewandte Ver- 4.1.5 Strukturbestimmung von klei- fahren zur Strukturlösung. Nach Zuordnung nen organischen von einzelnen Atomen zu diskreten Maxima Molekülen im Patterson-Verfahren werden in verschiedenen Verfeinerungsstufen Auflösungen erreicht, 4.1.5.1 Datensammlung die eine weitgehend gesicherte strukturelle Die Datensammlung erfolgte bei 23° C auf dem hauseigenen Zuordnung der Protonen erlauben. Vierkreis-Diffraktometer Die Raumgruppenbestimmung wurde mit dem (AFC5R, Rigaku). Der Primärstrahl (CuKa- Programm Bruker/AXS-SHELXTL durchge- Strahlung, l=1,543 Å, Ni-Filter für l £ 1.5 Å) führt, die Strukturlösung durch direkte Metho- wurde mit einem Drehanoden-Generator (Ri- den mit dem Programm SHELXL-97, die Ver- gaku RU300, MSC,) erzeugt. Die Auswertung feinerung erfolgte mit dem Programmpaket teXsan erfolgte mit dem SHELXS-97 (Sheldrick, 1990). (MSC). Weitere Tieftemperatur-Messungen erfolgten an einem Vierkreis-Diffraktometer (Stoe) mit einem CCD-Flächendetektor (Siemens) an der Universität Marburg (FB Chemie, Arbeitsgruppe Prof. Dr. Massa). Als Messbedingungen wurden gewählt: Primärstrahl-Wellenlänge 0,71073 Å (Mo-Ka, Kristall-Detektor-Abstand 41 Programm Kapitel 4 4.2 Material und Methoden aus einem rekombinanten Expressionsstamm. Proteinreinigung 4.2.2.1 Wildtyp und Produktionsstamm 4.2.1 Candida antarctica Lipase B Die Bakterienstämme (in Glycerinkultur -80° C gelagert) für die Fermenterkulturen wurden Die kommerziell erhältliche, gefriergetro- in 4 x 5 ml Vorkultur Medium mit einer steri- cknete Rohlipase (NOVOZYM 525) mit darin len Platinöse überimpft und über Nacht bei 30° enthaltener Candida antarctica Lipase B wur- C in einem Brutschrank unter Schütteln (200 de zunächst in 25 mM TRIS/Acetat (Ac) pH U/min) angezogen und dann in 4 x 250 ml 7,0 gelöst, (10,4 g/ 280ml), so dass die Leitfä- Vorkultur Medium in 1l Schikane-Kolben higkeit 3 mSi/cm betrug. Die enthaltenen Verunreinigungen wurden mit Whatman ® noch einmal 24 Stunden unter identische Be- DE52 dingungen vermehrt. Mit diesen Vorkulturen Sepharose gebunden (Patkar et al., 1993). konnte dann ein Fermenter (INFORS HT) mit Nach 30 min Rühren wurde der lipasehaltige 14 l Fermenter Medium beimpft werden. Die Überstand abfiltriert. Die Leitfähigkeit der Fermentation wurde ebenfalls bei 30° C Lösung wurde für die anschliessende hydrophobe Interaktions-Chromatographie durchgeführt und nach ca. 24 h durch Kühlen (HIC) auf 4°C abgebrochen. mit Ammonium-Acetat auf 40 mSi eingestellt. Diese Lösung wurde über eine mit TOYO® TSK-Butyl gepackte Säule aufgetragen und die gebundene Lipase über einen Gradienten von 1 M NH4Ac zu demineralisiertem Wasser eluiert und dann im Vakuum gefriergetrocknet (lyophilisiert). 4.2.2 Burkholderia plantarii Lipase Die Burkholderia plantarii Lipase (BpL) liegt als sekretorisches Enzym (siehe Einleitung) im Medium der Fermentation vor. Die LipaseReinigung wurde daher aus dem Kulturüberstand der 15 L-Fermentationen in einem 20 L Fermenter (INFORS HT, wie in Abbildung 4.5 gezeigt) in Zusammenarbeit mit dem Biotechnikum im Hauptlabor der BASF AG durchgeführt. Untersucht wurde die Lipase vom Abb. 4.5 20 l Fermenter für die Lipasefermentation (INFORS HT) BASF-Produktionsstamm, vom Wildtyp und 42 Kapitel 4 Material und Methoden Medium: Vorkultur Lösung wurde für die anschliessende hydro- (Fermenter) phobe Interaktions-Chromatographie (NH4)2SO4 6 g/l (-) (Sugihara, Tani & Tominaga, 1991) mit Am- CaCl2 0,02 g/l (0,02 g/l) moniumacetat auf 40 mSi (ca. 3 Mol/l) einge- MgSO4x7H2O 1 g/l (1g/l) stellt. KH2PO4 3,5 g/l (3,5 g/l) In einer ersten Reinigungsstufe wurde die Li- K2HPO4 3,5 g/l (-) paselösung über Nacht mit 1 g/l TOYO® TSK- 5 g/l Butyl ausgerührt und über eine Filterfritte mit (NH4)2PO4 - Hefeextrakt 5 g/l ( 5g/l) je einem Liter 1 M NaCl, 0,1 M Nacl und Ölsäure 5 g/l - 0,01 M NaCl gewaschen, um die restliche Öl- (5 g/l) säure zu entfernen. Die Lipase wurde dann mit (Sojaöl) reinem Wasser und 25 % iso-Propanol eluiert. Spurensalz Lösung TRACE Titriplex III Zur Feinreinigung wurde nochmals die Leitfä- 10 ml/l higkeit der Lösung mit Ammoniumacetat auf 45 g/l 40 mSi eingestellt. Diese Lösung wurde über pH 4,0 eine mit TOYO® TSK-butyl gepackte Säule CaCl2 5,5 g/l (1 ml/mg Lipase) aufgetragen und die gebun- FeSO4 x 7H2O 3,75 g/l dene Lipase über einen Gradienten von 1 M MnSO4 x 1H2O 1,4 g/l NH4Ac zu demineralisiertem Wasser eluiert ZnSO4 x 7H2O 2,2 g/l und dann im Vakuum gefriergetrocknet (ly- CuSO4 x 7H2O 0,4 g/l ophilisiert). CoCl2 x 6H2O 0,45 g/l Na2MoO4 x 7H2O 0,26 g/l H3BO3 0,4 g/l Die Fermentation des rekombinanten Wildtyp KJ 0,26 g/l mit zusätzlichem Lipase-Gen auf einem p- 4.2.2.2 Rekombinante Lipase Bluescript-Plasmid mit Gentamycin-ResistenzGen erfolgte analog zum Wildtyp in HFP-Glu- Nach der Fermentation im Sojaölmedium wur- cosemedium mit 45 µg/ml Gentamycin. den die Zellen 30 min bei 10 000 g abzentrifugiert und der Überstand mit dem glei- HFP-Glucose Medium pH 7,2 chen Volumen iso-Propanol extrahiert, um das Pepton (Sojton, DIFCO) 10 g/l im Medium vorhandene Sojaöl und andere Tryptone (Casein, DIFCO) 10 g/l Hefe 5 g/l NaCl 3 g/l Glucose 20 g/l hydrophobe Substanzen zu entfernen. Die wässrige Phase wurde über eine Filterfritte G3 filtriert und das gelöste iso-Propanol mit Hilfe eines Rotationsverdampfers im Vakuum (40° C, 100 Torr) entfernt. Die Leitfähigkeit der 43 Kapitel 4 Material und Methoden Nach der Fermentation in Glucosemedium halb des Startpuffers eingestellt. Während der wurden die Zellbestandteile durch 20 min Elution bildet sich auf der Säule ein pH- Zentrifugation bei 10 000 g abgetrennt und die Gradient aus und der pH-Wert des Eluats sinkt Lösung über eine Glasfilterfritte G3 filtriert. kontinuierlich vom Startwert bis auf den pHWert des Elutionspuffers ab. Das Protein wird Zur Feinreinigung wurde die Leitfähigkeit der dabei im pH-Bereich seines isoelektrischen Lösung mit Natriumchlorid auf 40 mSi einge- Punktes auf der Säule fokussiert und eluiert. stellt. Diese Lösung wurde über eine mit Die theoretische Auflösung des Säulenmateri- TOYO® TSK-butyl gepackte Säule (1 ml/mg als wird vom Hersteller mit 0,1 pH-Einheiten Lipase) aufgetragen und die gebundene Lipase angegeben. über einen Gradienten von einem Säulenvolumen (SV) 1 M zu 0,1 M NaCl, 50 mM Tris pH Das Säulenmaterial wurde mit einem Säulen- 7 gewaschen und einem zweiten Gradienten volumen (SV) 25 mM Ethanolamin, pH 10,5 über 1 SV von 0,1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7 äquilibriert und anschliessend die Lipase, im zu demineralisiertem Wasser eluiert. Die dann gleichen Puffer gelöst, aufgetragen. Eluiert noch am Säulenmaterial gebundene Lipase wurde mit 10 SV PB94® / HAc pH 6,5. Die konnte mit 20 % Ethanol eluiert werden. Burkholderia plantarii Lipase wird bei einem pH von ca. 8,5 eluiert, der gemessene isoe- 4.2.2.3 Chromatofokussierung lektrische Punkt beträgt 6,8 (IEF). In einer weiteren Reinigungsstufe wurde für 4.2.2.4 Metall-Chelat-Chromatographie die BpL zusätzlich eine Chromatofokussierung im pH-Bereich von pH 10,5 - 6,5 über eine Die Abtrennung von hydrophoben Proteinen, Anionentauschersäule MONOâ P (1 ml, analy- die sich nicht durch eine HIC von der Lipase tisch) oder PBE94â (20 ml, präparativ) (beide trennen lassen, wurde für den Produktions- Pharmazia) durchgeführt. stamm mit Hilfe einer Metall-Chelat- Chromatographie durchgeführt, da die BurkDie Säule wird bei einem pH-Wert oberhalb holderia plantarii Lipase ein Calciumion ent- des isoelektrischen Punktes equilibriert und hält. Als Säulenmaterial wurde Nickel-Chelat- das Protein im gleichen Puffer aufgetragen. Sepharose verwendet. Die Lipase wurde in in Das deprotoniert vorliegende Protein bindet an 20 mM Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst und auf den Anionentauscher. Die Elution des Proteins eine 20 ml-Säule aufgetragen. Die Elution der erfolgt dann über ein speziell angepasstes Puf- Lipase erfolgte mit 1 M NaCl in 20 mM Phos- fersystem (POLYBUFFER® 94, Pharmazia) phatpuffer pH 6,0 (Protokoll BASF, Labor Dr. mit der gleichen Pufferkapazität wie die gela- T. Friedrich). denen Gruppen des Säulenmaterials. Der pH-Wert des Polybuffers wird auf einen Wert von 3 bis maximal 4 pH-Einheiten unter44 Kapitel 4 4.3 Material und Methoden Substratlösung (0,1 mM pNP-Acetat, 50 mM Aktivitätsbestimmung Tris, pH 7.0, 10 mM CaCl2 10 % CH3CN) ver- und Inhibition setzt und über 5 min die Absorption bei 405 nm in einer 1000 µl Mikroküvette in ei- 4.3.1 Tributerintest nem Einstrahlphotometer (Biorad) oder einer Die Enzymaktivität der Triacylglycerolspal- Mikrotiterplatte (BMG Polarstar) bei 25 °C tung kann mit einer Emulsion von Tributerin verfolgt. (Tributerin-Acylglycerol) in 1 % Acetonitril, 50 mM Na2HPO4 Puffer pH 7 in einem pH-Stat (Fa. Radiometer) durch automatische Gegentitration der entstehenden Säure mit 0,5 M NaOH bestimmt werden (Jaeger et al., 1994). 4.3.2 Photometrisches Essay Die Enzymaktivität kann durch die photometrische Messung der Spaltung eines chromophoren p-Nitrophenylesters, bzw. p- Nitrophenylamids bestimmt werden. Detektiert wird das freie p-Nitrophenolat-anion (pNP) bei 405 nm. Es wurden verschiedene p- Nitrophenolester mit einer unterschiedlichen Kettenlänge der Säure (-Acetat C2, -Propionat C3, -Butyrat C4, -Caprylat C8, -Laurat C12 und -Palmitat C16, alle SIGMA) verwendet. Die Substrate wurden in wasserfreiem Acetonitril in einer Stammkonzentration von 100 mM gelöst und in einer Endkonzentration von 0,01 mM bis 10 mM verwendet. Die Endkonzentration an Acetonitril (CH3CN) betrug stets 10 %. Für Inhibierungsexperimente wurden verschiedene organische Lösungsmittel und Detergenzien bis zu einer Konzentration von 40 % verwendet. Zum Nachweis der Lipaseaktivität wurden jeweils 10 µl der Enzymlösung auf 500 µl 45 Kapitel 4 Material und Methoden 4.3.3 Synthese der Inhibitoren Anschliessend wird sofort der zweite Chlor- 4.3.3.1 Synthese der Phosphonamide substituent durch einen p-Nitrophenolatrest als Die Synthese der Inhibitoren durch Hans Die- Abgangsgruppe für die Reaktion mit dem En- ter Gerber erfolgte für die Phosphonamide zym ersetzt, um die Stabilität und die Kristalli- nach der im folgenden Schema aufgezeigten sationseigenschaften der Inhibitoren zu verbes- Strategie: sern. Die Diastereomerenmischung konnte Zur Synthese der Inhibitoren wurde zunächst durch fraktionierte Kristallisation getrennt aus Phosphortrichlorid und Formaldehyd- werden. diethylacetal das Ethoxymethylphosphonsäuredichlorid unter Zinkdichloridkatalyse gebildet. Des erste Chlorsubstituent wurde in der Kälte gegen das langsam zugetropfte enantiomerenreine Phenylethylamin ersetzt. Dabei wird ein zweites Stereozentrum gebildet und man erhält Diastereomere. H2N + (R,S) (R,S) H3C Cl O P O triethylamine 0- 5°C, N2 dichloromethane O (R,S) H3C HO NO2 Synthesestrategie für Phosphonat- Inhibitoren mit chiralen Amiden 46 NO2 NH Cl + O P O Kapitel 4 Material und Methoden 4.3.3.2 Synthese der Phosphonester Die Diastereomerenmischung der Phosphonester-Inhibitoren konnte nicht durch fraktio- Die Synthese der Inhibitoren durch Hans Die- nierte Kristallisation getrennt werden, obwohl ter Gerber erfolgte für die Phosphonester nach ein Serie von Inhibitoren mit unterschiedlichen der im folgenden Schema gezeigten Strategie: Abgangsgruppen als Ersatz für das p- Die Synthese der Inhibitoren mit einem chira- Nitrophenol gewählt wurde, um die Kristallisa- len Alkohol erwies sich als schwieriger, da die tionseigenschaften und die Stabilität positiv zu entstehenden Produkte hydrolyseempfindlich beinflussen. waren, weshalb eine andere Synthesestrategie entwickelt wurde. Im Fall der Inhibitoren mit gebundenem Phenylethylalkohol bzw. Methoxycyclohexanol wurden zunächst beide Chlorisubstituenten des Phosphonsäuredichlorids durch zwei Äquivalente p-Nitrophenol ersetzt und erst im letzten Schritt ein Äquivalent des chirale Alkohol eingebracht. Das entstehende Diastereomerengemisch wurde unter Argon gelagert. O Cl + 2eq. HO P O P O NO2 O Cl O triethylamine O dichlormethane 0 - 5°C, N2 NO2 NO2 + 1eq. triethylamine Synthesestrategie fürPhosphonatInhibitoren mit chiralen Alkoholen HO dichlormethane 20°C, N2 (R,S) H3C (R,S) O P O O O (S,R) H3C 47 NO2 Kapitel 4 4.4 Material und Methoden Eine Probe von je 50 µl Lipaselösung unbe- Bestimmung der kannter Konzentration und mehrere BSA Stan- Proteinkonzentration dardkonzentrationen werden mit je 200 µl frisch angesetzter BCA-Lösung (Lösung A+B 4.4.1 Absorption bei 280 nm im Verhältnis 1/50) gemischt und 30 min bei Die gereinigte, gefriergetrocknete Lipase wur- 60 °C inkubiert. Danach wird die Absorption de in 100 µl H2O /10 mM CaCl2-Puffer gelöst. bei 562 nm gemessen. Die Proteinkonzentration wurde durch Mes- 4.5 sung der Absorption bei 280 nm bestimmt. Die Transiente Kinetik molare Konzentration kann mit der Gleichung mittels Stopped-Flow- E= e* c* d Spektrofluorometrie 4.5.1 Aufbau des Messsystems errechnet werden, wobei E= Extinktion, e= Extinktionskoeffizient, c= Konzentration, d= Alle Schichtdicke ist. Der Wert Epsilon beträgt für Untersuchungen wurden an einem Stopped- CaL B 40330 M-1cm-1 (1 mg/ml = 1.22 OD280) und für Bgl 29990 M-1cm-1 Stopped-flow-spektrofluorometrischen flow Spektrofluorometer der Firma Hi-Tech- (1 mg/ml = 0.906 Scientific durchgeführt. OD280). Lichtquellen: Hg-Arc-lamp 100 W; Xe-Arc-lamp 75 W PSU 675 Stromquelle mit Zündspule 2x Glasfaser Lichtleiter OPL 61 4.4.2 BCA-Mikrotiterplatten-Test Alternativ kann die Proteinmenge für geringe Konzentrationen auch über einen photometri- Monochromator: Bentham M 300 Gitter-Monochromator (1800 Linien/mm) schen Test (Pierce BCA Protein-Essay-Kit) ermittelt werden. Im Gegensatz zum Lowry- Mischeinrichtung: SHU 61 multimixing sample handling unit SSU 60 Control unit oder Bradford-Test ist der BCA-Test auch für hydrophobe Proteine geeignet. Der hierbei verwendete Farbstoff BCA (Bicinchoninsäure) Detektionsystem: PM 60s side-on Photomultiplier ergibt nach Inkubation mit dem Protein eine Hochspannungsquelle: PSU 60/SC 60 (300-1200 V) konzentrationsabhängige, tiefblaue Färbung, die bei 562 nm über eine Verdünnungsreihe Digal-Analog-Wandler: CI 60 I/O -Unit, und Computer 486/66 mit ICS 486 Data Aqui. System D/A Wandler CIO-CTR -board (sampling rate 1MHz) mit bekannter Proteinkonzentration von 0 - 60 µg/ml BSA (Bovines Serum Albumin, Sigma) mit Hilfe einer Eichgerade quantifiziert wird. Software: Hi-Tech IS-2 Rapid kinetics V2.3b6 Die Reaktion wird gestartet, indem die beiden Reaktandenspritzen über ein Hochdruckzylin48 Kapitel 4 Material und Methoden 4.5.2 Reaktionsbedingungen Die Totzeit des verwendeten Systems beträgt 1 ms, das kleinste vom D/A - Wandler aufgelöste Zeitintervall beträgt 0,1 ms. Zur Rauschunterdrückung wurde ein bis zu 18faches "Oversampling" durchgeführt, d.h. 18 "Subsamples" wurden zu einem Messpunkt Abb. 4.6: Schema einer Stopped-Flow Apparatur (Price and Stevens, 1988) zusammengefasst. Es wurden typischerweise 512 Messpunkte pro Messung aufgenommen. Zusätzlich wurde jede Messung mindestens der pneumatisch bewegt werden. Dadurch viermal mit gleicher Einstellung aufgenommen werden die beiden Lösungen in die Misch- und die Spektren digital gemittelt. Um die kammer injiziert und verdrängen die alte Lö- Anfangszeit der Kinetik besser aufzulösen, sung aus der Messzelle in die Stopspritze. wurden Wenn die Stopspritze gefüllt ist und auf den "Samplingraten" im Zeitintervall 0-200 ms und Stopblock trifft, löst sie ein elektrisches Signal 200 ms–200 s verwendet. Die intrinsische Tryptophan-Fluoreszenz wur- (Trigger) aus, das den Nullpunkt der Reaktion z. T. zwei verschiedene (t0) anzeigt und den Messvorgang startet (Ab- de mit einer Wellenlänge von lexc = 285 nm bildung 4.6). Die Messzelle ist nun vollständig entlang der Hochachse der Messzelle angeregt. mit der gerade gemischten Reaktionslösung Die Fluoreszenz wurde im 90° Winkel dazu gefüllt und die Kinetik kann beobachtet wer- mit einem Photomultiplier mit gegenüberlie- den. gendem Spiegel detektiert. Um den Einfluss von Streulicht auszuschalten, wurde ein < Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Re- 320 nm „cut-off“-Filter vor dem Photomul- aktionslösung auf dem Weg von der Misch- tiplier (PM) verwendet. Die Spannung am PM kammer in die Messzelle bereits reagiert hat betrug mit der Xe-Lampe ca. 1000 V und bei und so zum Zeitpunkt t0 ein Teil der Reaktion Verwendung der Hg-Lampe zwischen 400 und bereits stattgefunden hat. Dies ist die soge- 500 Volt. Zur Unterdrückung des Rauschens nannte Totzeit eines Stopped-Flow-Systems, wurde ein elektronischer Filter mit einer Zeit- die vom apparativen Aufbau der Messzelle und konstante von 0.1 ms eingesetzt. Die Software dem Druck der Reaktandenspritzen, d.h. der zeichnet die Fluoreszenzintensität in einer Fliessgeschwindigkeit der Lösung abhängt. oszilloskopischen Skala von 0 bis 5 Volt auf, wobei 5 Volt keine gemessene Fluoreszenz bedeuten und die am A/D-Wandler anliegende Spannung bei einer Fluoreszenserhöhung sinkt. 49 Kapitel 4 Material und Methoden Die Absorptionsmessungen wurden für die Wasser gefüllt und das Gerät gespült. Falls das verwendeten bei erhaltene Signal bei jedem Schuss nicht kon- 407 nm (Hg-Linie) und einer Photomultiplier- stant blieb, musste die Messkammer mit 1 M spannung von 200-300 Volt durchgeführt. Zur Salzsäure , 1 M Natronlauge und anschließend Berechnung der absoluten Absorption aus den wieder 1 M Salzsäure für je 1 Minute inkubiert Messdaten muss das Messgerät zu Beginn und anschließend mit 20 ml Wasser gespült jeder Serie auf 0 % Absorption mit dem ver- werden, um anhaftende Luftblasen zu entfer- wendeten Messpuffer und 100 % Absorption nen. p-Nitrophenyl-Substrate durch Verschließen des Shutters am Photomultiplier abgeglichen werden. Die Stopvolumen Danach wurde der Puffer in beide Spritzen pro Injektion betrug 120 µl. gefüllt und das Mess-System nochmals gespült. Für jeden pH-Wert wurde eine vollstän- Verwendete Lösungen: dige Messreihe mit dem jeweiligen Substrat, Puffer: bestehend aus ca. 50-100 Stopped-Flow- 50 mM TRIS (pH 7-8) Messungen aufgenommen. Substrate: Die Konzentration der Enzymlösung in der 0.01 - 20 mM p-Nitrophenolacetat ersten Spritze bleibt konstant. Beginnend mit 0,5 µM - 1 mM p-Nitrophenolacetamid reinem Puffer in der zweiten Spritze wurde die Versorgungsspannung am Photomultiplier so Enzyme für Fluoreszenmessungen: justiert, dass für die Enzymfluoreszenz in der 0.3 -1 mg/ml Bpl sowie Mut Y142W IS 2-Software ca. 3 Volt angezeigt wurden. Enzyme für Absorptionsmessung: Durch Austausch der Substratlösung in der 0.001- 0,01 mg/ml CaL B, zweiten Spritze wurde das Enzym mit ver- BpL , sowie Mut Y142W schiedenen Substratkonzentrationen gemischt und die Stopped-Flow-Messung nach jedem Alle verwendeten Lösungen wurden durch Schuss auf der entsprechenden Zeitskala auf- Ultraschall entgast und über einen Sterilfilter gezeichnet. Die verwendeten Substratkonzent- (25µm, Biorad) filtriert. Alle Enzyme wurden rationen wurden für jede Messreihe so ge- in dem entsprechendem Puffer gelöst, unlösli- wählt, dass zwischen Substratsättigung und ches Protein abzentrifugiert und ebenfalls über Single-Turnover-Experimenten mit Substrat im einen Sterilfilter filtriert. Unterschuß mindestens fünf dazwischenliegende Zu Beginn jeder Messreihe wurden die Sprit- Konzentrationen konnten. zen mit filtriertem und entgastem destillierten 50 gemessen werden Kapitel 4 4.6 Material und Methoden SodiumdodecylsulfatPolyacrylamidgel-Elektro phorese (SDS-PAGE) Die Proteine und Molekulargewichtsmarker wurden in 15 %igen Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Zur Herstellung der Gele wurden folgende Lösungen verwendet: Lösungen Trenngel (für zwei Gele) Sammelgel (für zwei Gele) 30 %Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8) 4,2 ml 0,88 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 3,1 ml ----- 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 ----- 0,8 ml H2O bidest. 0,9 ml 2,4 ml 10 % SDS 60 µl 50 µl 10 % APS 60 µl 50 µl TEMED 4 µl 3 µl Elektrophoresepuffer (Lämmli): 4.6.1 Puffer für SDS-PAGE 25 mM Tris-HCl Proben und Probenpuffer wurden in gleicher 250 mM Glycin Menge zusammengegeben, vor dem Auftragen 0,1 % SDS 5 min bei 100°C gekocht, zentrifugiert und auf Eis gekühlt. In einer vertikalen Elektrophore- Probenpuffer: seapparatur liess man die Proben bei 80 Volt 50 mM 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 einlaufen, dann wurden sie bei 120 V ca. 2 2 % SDS Stunden aufgetrennt. 0,1 % Bromphenolblau (50 mg/ml) 10 % Glyzerin ad 9 ml H2O bidest. + 100 mM DTT 51 Kapitel 4 Material und Methoden 4.6.2 Molekulargewichtsmarker 4.7 Roche Diagnostics, Molekulargewichtsmarker 4.7.1 N-Glycosidase F Deglycosilierung für SDS-Gelelektrophorese, Die analytische Deglycosilierung der CaL B 14.4 kD-97.4 kD , 10µg Protein/10µl. wurde mit einem N-Glycosidase F DeglycosiMolekular- lations-Kit der Fa. Boehringer Mannheim (jetzt Protein gewicht Roche Molecular Biochemicals) durchgeführt. Phosphorylase B 97.4 kD Bovine serum albumin 66.2 kD N-Glycosidase F ist keine Glycosidase sondern eine Amidase. Die Deglycosilierung erfolgt durch hydrolytische Spaltung der N- glycosidischen Bindung des Asparagin-NAldolase 39.2 kD glycosids zum Aspartat. Triosephosphate isomerase 26.6 kD Lösungen: Trypsin inhibitor 21.5 kD 1 Lysozyme 14.4 kD 2 rekombinante N-Glycosidase F Denaturierungs-Puffer pH 8,6 (PO4-Puffer, ionisches Detergenz) 3 4.6.3 Coomassie-Färbung Kontroll Glycoproteine (hum.Transferrin, Ribonuklease B , a1-saures Glycoprotein ) Zur Färbung von Proteinen und Peptiden wurde die Coomassie-Blau-Lösung verwendet. 4 Das Gel wurde in der Färbelösung (40 % Me- Reaktionspuffer pH 7,2 (PO4-Puffer, nichtion. Detergenz) thanol, 10 % Essigsäure, 0,1 % Coomassie R250) kurz erhitzt und unter Schütteln ca. 30 min. inkubiert. Anschliessend erfolgte die Ent- Die Enzyme 1 und 3 wurden nach Hersteller- färbung in einer Lösung aus 40 % Methanol angaben in Wasser gelöst. Zur Lösung 2 wurde und 10 % Essigsäure, wobei die Lösung re- 1 % b-Mercaptoethanol zugegeben. gelmäßig ausgetauscht wurde. Das entwickelte Die maximale Proteinmenge zur Deglycosilie- Gel wurde in 20 - 30 % Ethanol aufbewahrt. rung beträgt 100 µg pro Ansatz. Nach jedem Schritt wurden die Lösungen im Vortexter gut vermischt. Im ersten Schritt wurde je 5 µl der Proteinlösung mit 5 µl Denaturierungpuffer (Lösung 2) versetzt und 3 min bei 95 °C inku52 Kapitel 4 Material und Methoden biert, danach kurz zentrifugiert. Im zweiten 4.8 Schritt wurden je 10 µl Reaktionspuffer (Lö- MALDI-TOF Massenspektrometrie sung 4) und 10 µl N-Glycosidase F (Lösung 1) hinzugegeben. Für den Kontrollversuch wur- Die kovalente Inhibiton der CaL B mit den den je 20 µl Reaktionspuffer (Lösung 4) hin- Phenylethylamid-Phosphonat-Inhibitoren wur- zugegeben. Anschliessend wurde 1 Stunde bei de durch massenspektrometrische Untersu- 37 °C inkubiert. chung an einem Voyager MALDI-TOF System 2048 (Applied Biosystems) durch Laserde- Die native Deglycosilierung erfolgte analog sorption mit Hilfe einer Sinadipin-Säure- ohne Zugabe des Denaturierungspuffers (Lö- Matrix (67 % Acetonitril) festgestellt. sung 2) durch eine Inkubation über 24 Stunden bei 37 °C. Die deglycosilierte Enzympräparation von CaL B wurde mit 10 % einer Inhibitorlösung 4.7.2 Endoglycosidase H (10 mg/ml Inhibitor in Acetonitril) und 10 % Die präparative Deglycosilierung erfolgte mit Acetonitril versetzt. Die Inkubationszeit bei dem Enzym Endoglycosidase H (Endo-b-N- 25 °C betrug für den R-Phenylethylamin- acetylglucosaminidase H, EC 3.2.1.96) von Inhibitor 2 Stunden und für den S- Phenylethy- Roche Molecular Biochemicals. Die Deglyco- lamin-Inhibitor 48 Stunden. Danach wurde der silierung von mannosereichen N-glycosidisch im Überschuss eingesetzte, nicht umgesetzte gebundenen Oligosacchariden erfolgt duch Inhibitor durch eine zweimalige Dialyse in Spaltung Zucker-Zucker- einem 50 µl Dialyse-Knopf (Hampton Re- Verknüpfung im Glycosid und belässt eine N- search) mit aufgespannter Dialysefolie, Aus- Acetylglucosamin-Einheit am Protein gebun- schlussgrösse 12-14 kDa (SpectraPor® 2, den. Roth), gegen das hundertfache Volumen einer der ersten 10 % Acetonitrillösung herausdialysiert und Die präparative native Deglycosilierung von anschliessend noch zweimal gegen reines 1 mg Lipase in 500 µl 50 mM Citratpuffer pH Wasser dialysiert, um den Puffer und das Ace- 5,5 erfolgte durch Zugabe von 100 mU En- tonitril vor den massenspektrometrischen Mes- doglycosidase H und anschliessender Inkuba- sungen zu entfernen. tion über 48 h bei 37 °C. 53 Kapitel 4 4.9 Material und Methoden mente werden an der Verknüpfungsstelle mit Konformationsanalyse Hilfe von Torsionswinkelbibliotheken (Klebe Als Startgeometrie wurde die experimentell & Mietzner, 1994) und direktionalen Wech- bestimmte selwirkungen Geometrie des Phosphonat- (Wasserstoffbrückenbindungen Inhibitors aus der Röntgenstruktur im Kom- und hydrophobe Wechselwirkungen) in die plex mit CaL B verwendet. Die analogen Bindetasche eingepasst. Die sterische Überlap- Strukturen pung mit den räumlich fixierten Proteinatomen des tetrahedralen Kohlenstoff- Intermediates wurden mit Hilfe des Program- wird dabei ausgeschlossen. mes MOLOC erzeugt. Anschliessend werden ähnliche Geometrien 4.9.1 Systematische Suche zusammengefasst und die freie Bindungsenthalpie mit Hilfe einer empirischen Bewer- Die systematische Suche nach möglichen Kon- tungsfunktion abgeschätzt. Alle gefundenen formationen des Substrats im kovalent gebun- Geometrien wurden zusätzlich mit der aus denen tetrahedralen Intermediat wurde mit Strukturdaten dem Programm SYBYL (TRIPOS) durchge- abgeleiteten Scoringfunktion DrugScore (Gohlke, Hendlich & Klebe, 2000) führt. Als drehbare Bindungen wurden die bewertet. Die gefundenen Resultate wurden beiden rotierbaren Bindungen (Abbildung 4.7) dann in einer Liste sortiert. Zusätzlich wurde des Phenylethylamin-Restes gewählt und in die RMS-Abweichung zu der Startstruktur 30° Schritten gedreht. (s.o.) berechnet. 4.9.2 Docking mit FLEXX Eine weitere Methode zur Generierung der möglichen Bindungsmoden stellt das Docking O eines Liganden in die Proteinbindetasche dar. N O Diese Suche wurde mit dem Programm FLEXX durchgeführt. Der Docking-Algo- H * O rythmus innerhalb von FLEXX (Rarey et al., Ser Abb. 4.7: Systematische Suche der möglichen Konformationen des Phenylethyl-Restes in der Bindetasche der CaL B. 1996) verfolgt eine sequentielle Strategie zum Einpassen eines Liganden in die Bindetasche. Ausgehend von einem Basisfragment, das in diesem Fall immer das kovalent gebundene, tetrahedrale Kohlenstoff oder Phosphoratom darstellt, wird der Ligand unter der Berücksichtigung einer Vielzahl von altenativen Torsionswinkel schrittweise aufgebaut, bis alle Ligandatome platziert sind. Die starren Frag54 Kapitel 4 Material und Methoden Startgeschwindigkeit fortbewegen. Berechnet 4.10 Molekulardynamische man der Kräfte im Potentialfeld, erhält man die Simulationen Beschleunigungen, die auf einzelne Teilchen wirken. Durch Integration der Newton'schen 4.10.1 Grundlagen Bewegungsgleichung wird dann die nächste Die Eigenschaften eines chemischen Systems Position zu einem kurz darauffolgenden Zeit- sind grundsätzlich nicht nur durch das globale punkt t1 = t0 + Dt bestimmt. Dieser Zeit- Energieminimum, sondern auch durch alle bei schritt Dt muss so gewählt werden, dass auch einer vorgegebenen Energie mögliche Konfi- die Bewegungen mit der höchsten Frequenz gurationen bestimmt (Zustanssumme). Die noch in einer kontinuierlichen Form (Abbil- chemischen Eigenschaften werden in erster dung 4.5) erfasst werden. Linie durch die Konfigurationen des Ensembles bestimmt, die am wahrscheinlichsten sind und damit auch am häufigsten eingenommen werden. Aufbauend auf diesen Grundlagen der statistischen Thermodynamik kann ein System durch die thermodynamische Zu- Abb. 4.5: Einfluss des Zeitschrittes auf die Stabilität und Zeitdauer einer MD-Simulation (links: zu klein, mitte: zu groß, rechts: optimal) aus Leach, A. 2001. standssumme aller in einem Gleichgewichtszustand signifikanten Konfigurationen beschrieben werden. Die schnellsten Bewegungen sind Valenz- Insbesondere Proteine sind in ihrer nativen schwingungen, die jedoch nur wenig mit den Funktion auf eine wässrige Umgebung und übrigen in Biomolekülen interessanten Frei- eine Temperatur von ca. 300 K optimiert, so heitsgraden, wie z. B. Torsionen, gekoppelt dass die Betrachtung von statistischen Fluktua- sind. Fixiert man die Bindungslängen, werden tionen und molekularen Bewegungen zum Zeitschritte von 1 - 2 fs möglich, wodurch Verständnis ihrer Funktion sinnvoller erscheint Simulationen über längere Zeiträume erre- als die alleinige Betrachtung des globalen Mi- chenbar werden. nimums. Eine konsekutiv durchlaufene Serie von Kon- Das Ziel einer molekulardynamischen (MD) figurationen wird als Trajektorie bezeichnet. Simulation ist es, ausgehend von einer Start- Sofern die Startkonfiguration repräsentativ für konfiguration des Systems mit Hilfe der New- die gewählten Gleichgewichtsbedingungen ist, ton'schen Bewegungsgleichungen dessen zeit- sollen die erzeugten Konfigurationen stabil um liche Entwicklung in einem vorgegebenen diese Konfiguration fluktuieren. Die statisti- Kraftfeld zu berechnen. Über das Kraftfeld sche Auswertung einer ausreichend langen wird dann ein Potential abgeleitet, in dem sich Trajektorie beschreibt in diesem Fall alle sta- die Atome von einer Startgeometrie mit einer tistisch relevanten Konfigurationen und damit 55 Kapitel 4 Material und Methoden die Eigenschaften des Gesamtsystems im ge- 4.10.2 Kraftfelder wählten Kraftfeld. Aus diesem Grund kann die Methode der MD-Simulation immer dann vor- Eine weitere Einschränkung ist die Wahl des teilhaft eingesetzt werden, wenn experimentel- Kraftfeldes zur Beschreibung des Systems und le Gleichgewichts- des Solvens. Es gibt heute mehrer etablierte experimenten durch dynamische Informationen Kraftfelder, die zur korrekten Beschreibung ergänzt werden sollen. von Biomolekülen parametrisiert worden sind, Strukturdaten aus wie z. B. AMBER, GROMOS, CHARMM. oder Grundsätzlich können mit Kraftfeldbeschrei- CFF. bungen ohne spezielle Parameterisierung keine chemischen Veränderungen eines Systems Schwierig ist die korrekte Beschreibung der erfasst werden, wie z. B. Reaktionen unter nicht kovalenten Wechselwirkungen und der Bindungsbruch und Neubildung oder die Aus- weitreichenden elektrostatischen Wechselwir- bildung von Übergangszuständen. Dies können kungen des Proteins und des Solvens. Die kor- neuere Methoden, wie die kombinierten quan- rekte Berücksichtigung der Ladungen und der tenmechanischen und molekülmechanischen induzierten Partialladungen sowie die Be- Simulationen (Bruice & Kahn, 2000; Gogonea schreibung von Wasserstoffbrückenbindungen et al., 2001) , für biomolekulare Systeme leis- im System ist daher von besonderem Interesse. ten, wie für andere Enzyme in der Literatur Zur Beschreibung des umgebenden Solvens (Kollman et al., 2001) gezeigt werden konnte. existieren spezielle Kraftfeldmodelle wie z. B. Die Zeitskala heutiger MD-Simulationen von TIP3P, die es erlauben, das Protein in einer komplexen be- Wasserhülle (Box) vollständig oder mit einer schränkt sich auf Bereiche von einigen Nano- Wasserkappe (Cap) über dem aktiven Zentrum sekunden, so dass viele komplexe dynamische zu beschreiben. Um Randeffekte zu minimie- Eigenschaften, die über die Bewegung von ren, muss die Wasserumgebung ausreichend Seitenketten und kleineren Bereichen der gross gewählt werden, was die Zahl der expli- Hauptkette hinausgehen, nicht ausreichend ziten Wassermolekülen in die Grössenordnung simuliert werden können. Insbesondere Protei- von mehreren Tausend ansteigen lässt. biochemischen Systemen ne mit beweglichen Strukturelementen stehen Die Untersuchung von Protein-Ligand-Kom- im Fokus des allgemeinen Interesses, daher ist plexen kann in diesen Kraftfeldern ein Prob- es wünschenswert, durch Weiterentwicklungen lem darstellen, da die chemischen Eigenschaf- der Methode und durch den zunehmenden ten der vielfältigen funktionellen Gruppen von Einsatz schnellerer Rechner auch längere Zeit- Ligandmolekülen oft nicht in den Kraftfeldern räume zu simulieren. vorparametrisiert sind. 56 Kapitel 4 Material und Methoden Ein alternativer Ansatz ist der Einsatz von 4.10.4 Auswertung von generischen Kraftfeldern, wie z. B. das MAB MD-Simulationen aus dem Programm MOLOC, das in der Lage ist, sowohl die Solvatisierung als auch die Die Analyse der Trajektorie wurde durch die korrekte Ausbildung von Wasserstoffbrücken statistische Auswertung einzelner geometri- für Biomoleküle und für eine breite Palette scher Parameter, wie z. B. interatomarer Ab- kleiner Moleküle implizit zu approximieren. stände von brückenbindungen potentiellen sowie Wasserstoffintramolekularer 4.10.3 Durchführung von Größen wie Torsionswinkel durchgeführt. Für Simulationen diese Größen wurde der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet und zusätzlich Mit Hilfe der MD Simulation wurde die Dy- der Verlauf und die statistische Häufigkeitsver- namik verschiedener Lipase-Ligand-Komplexe teilung über die gesamte Trajektorie ausgewer- unterschiedlicher Zustände entlang des Reakti- tet. onspfades untersucht und die Unterschiede im Hinblick auf die Stereochemie der Liganden Bei der Auswertung von Trajektorien muss die analysiert. Die Startstrukturen für beide Enan- Zeitskala berücksichtigt werden, auf der eine tiomere wurden, ausgehend von der Geometrie beobachtete Veränderung stattfindet. Schwie- der kovalent gebundenen experimentell be- riger zu beschreiben sind Prozesse, die über stimmten Inhibitorstruktur, durch Minimierung den Simulationszeitraum einen "Drift" zeigen, in der Bindetasche mit dem Programm MO- also eventuell langsamer ablaufen als der Si- LOC generiert. mulationszeitraum berücksichtigt oder deren Gleichgewichtsgeometrie 4.10.3.1 Simulation mit MOLOC und M AB nicht durch die Startstruktur beschrieben wurde. Problema- Für die MD-Simulation wurde das Protein in tisch in ihrer statistischen Interpretation sind einem Radius von 12 Å um den Liganden be- auch schnelle Vorgänge, die nur selten eintre- rücksichtigt, ausserhalb dieses Bereiches wur- ten, d. h., wenn das System zufällig zwischen den die Proteinatome räumlich fixiert. Zur zwei möglichen Zuständen wechselt. Energieberechnung des Wasserstoffbrücken- Grundsätzlich gilt, dass Trajektorienmittelwer- netzes wurde ebenfalls nur dieser ausgewählte te nur repräsentativ sind, wenn die Beobach- Bereich berücksichtigt. Als Zeitschritt wurde tungszeit der Simulation deutlich grösser ist als 1 fs gewählt und die Simulation bei 300 K über die Relaxationszeit dieser bestimmten Eigen- einen Zeitraum > 1,5 ns durchgeführt. Die schaft. Die statistische Auswertung der Trajek- erste Phase der Simulation (100 ps) diente der torie kann wertvolle Aufschlüsse über die dy- Equilibrierung der Gesamtenergie und der namischen Eigenschaften des Systems geben. Geometrie des Systems. Die Trajektorie wurde in Abständen von 1 ps aufgenommen. 57 Kapitel 4 Material und Methoden z.B. konservierte Aminosäuren und konser- 4.11 Homologiemodellierung vierte Strukturbereiche wie Loops, Turns und Zur Erzeugung eines Homologiemodells der Sekundärstrukturmuster Burkholderia plantarii Lipase in der offenen einstimmen. Das verwendete Alignment ist in Konformation der Tabelle 4.1 abgebildet. wurde das Programmpaket bestmöglich über- MODELLER (Sanchez & Sali, 2000) in den Als Basis wurde die Röntgenstruktur der Versionen 4 und 6a eingesetzt. Burkholderia plantarii Lipase (1tah) in einer Das Sequenzalignement wurde mit dem über geschlossenen Konformation verwendet. Die das Internet zugänglichen SAS-FASTA Algo- homologen Templatstrukturen in der offenen rithmus durchgeführt, der für Proteine mit Konformation sind Pseudomonas cepacia Li- bekannter Struktur ein Alignment basierend pase (84.0 % Sequenzhomologie, 5lip) und auf der Aminosäurehomologie und dem Fal- Pseudomonas aeruginosa Lipase ( 41.0 % tungsmuster durchführt. Dadurch ist sicherge- Sequenzhomologie, 1ex9). stellt, dass alle bekannten Informationen, wie 1tah Burkholderia plantarii Lipase, geschlossen -DTYAATRYPVILVHGLAGTDKFANVVDYWYGIQSDLQSHGAKVYVANLSGFQSDDGPNG RGEQLLAYVKQVLAATGATKVNLIGHSQGGLTSRYVAAVAPQLVASVTTIGTPHRGSEFA DFVQDVLKTDPTGLSSTVIAAFVNVFGTLVS--SSHNTD-QDALAALRTLTTAQTATYNR NFPSAGLGAPGS-CQTGAATETVGGSQHLLYSWGGTAIQPTSTVLGVTGATDTSTGTL-D VANVTDPSTLALLATGAVMINRASGQNDGLVSRCSSLFGQVISTSYHWNHLDEINQLLGV RGANAEDPVAVIRTHVNRLKLQGV* 5lip Pseudomonas cepacia Lipase, offen 84.0 % Sequenzhomologie ADNYAATRYPIILVHGLTGTDKYAGVLEYWYGIQEDLQQRGATVYVANLSGFQSDDGPNG RGEQLLAYVKTVLAATGATKVNLVGHSQGGLTSRYVAAVAPDLVASVTTIGTPHRGSEFA DFVQGVLAYDPTGLSSTVIAAFVNVFGILTS--SSNNTN-QDALAALKTLTTAQAATYNQ NYPSAGLGAPGS-CQTGAPTETVGGNTHLLYSWAGTAIQPTISVFGVTGATDTSTIPLVD PANALDPSTLALFGTGTVMVNRGSGQNDGVVSKCSALYGQVLSTSYKWNHLDEINQLLGV RGANAEDPVAVIRTHANRLKLAGV* 1ex9 Pseudomonas aeruginosa Lipase, offen 41.0 % Sequenzhomologie -STYTQTKYPIVLAHGMLGFDNILGV-DYWFGIPSALRRDGAQVYVTEVSQL---DTSEV RGEQLLQQVEEIVALSGQPKVNLIGHSHGGPTIRYVAAVRPDLIASATSVGAPHKGSDTA DFLRQI---PPGSAGEAVLSGLVNSLGALISFLSSGSTGTQNSLGSLESLNSEGAARFNA KYPQ---GIPTSACGEGAYK--VNGVSY--YSWSGSS--PLT-------------------NFLDPSDAFLGASSLTFKNGTA--NDGLVGTCSSHLGMVIRDNYRMNHLDEVNQVFGL TSLFETSPVSVYRQHANRLKNASL* Tab.4.1: SAS-FASTA –Sequenzalignment für die Homologiemodellierung mit MODELLER 58 Kapitel 5 5. Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B ERGEBNISSE TEIL I Chromatographie mit tert-Butyl-sepharose CANDIDA ANTARCTICA Die lipasehaltige Lösung wurde zur anschlies- LIPASE B senden hydrophoben Interaktions-Chromatographie (HIC) mit NH4Ac auf eine Leitfähig- 5.1. Proteinreinigung und keit von 40 mSi/cm eingestellt. Als Säulenmaterial wurde tert-Butyl-Sepharose Charakterisierung (Toyo® TSK-butyl 650M) verwendet. Ziel dieses Teils der Arbeit war die KristallisaDas Säulenmaterial wurde mit 1 M NH4Ac tion der Candida antarctica Lipase im Kom- equilibriert und anschliessend die Lipaselösung plex mit kovalent gebundenen Inhibitoren. Aus aufgetragen. Ungebundenes Material wurde diesem Grund ist die Reinigung der Proteine in mit 1M NH4Ac ausgewaschen. Die Lipase zur Kristallisation ausreichender Menge bis zur konnte mit reinem Wasser eluiert werden. Die analytisch festgestellten Homogenität verfolgt so erhaltene Lipaselösung wurde im Vakuum worden. gefriergetrocknet. Die Reinigung der Candida antarctica Lipase B (CaL B) erfolgte aus einer kommerziell er- Gelfiltration hältlichen Rohlipase-Suspension NOVOZYM Zur Feinreinigung wurde mit einem Teil der 525 (NOVO Nordisk A/S), abgewandelt nach CaL B zusätzlich eine Gelfiltration über einem Protokoll von S. Patkar (Patkar et al., Sephadex 60/20 durchgeführt um eventuell 1993). vorhandene Verunreinigungen abzutrennen. Es konnte nur eine Bande festgestellt werden, bei Vorreinigung über Ionenaustausch- der es sich um die CaL B handelte. Die so Chromatographie mit DE52-Sepharose erhaltene, feingereinigte Lipase wurde im Va- Die verdünnte Lipaselösung wurde mit What- kuum gefriergetrocknet. man ® DE 52-Sepharose versetzt und eine hal- be Stunde ausgerührt, um die enthaltenen Verunreinigungen zu binden. Die DE 52- Sepharose wurde über eine Filterfritte abgetrennt, und die nicht gebundene lipasehaltige Lösung wurde zur weiteren Reinigung bei 4°C aufbewahrt. 59 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B 1 Kontroll Proteine 2 KP/SDS + 1h 3 4 5 CaL B MM Cal/SDS + 1h 6 7 8 CaLB native Deglycosilierung +1h + 4h + 24h 97.4 66.2 39.2 26.6 21.5 14.4 kDa Abb. 5.1: SDS-PAGE (15 %) Kontrolle der Deglycosilierung von CaL B mit N-Glycosidase F (+) Es ist gezeigt, dass CaB L (Spur3) mit SDS nach 1h vollständig deglycosiliert werden kann (Spur 5), während die native Deglycosilierung 24 h Inkubation (Spur 8) erfordert. [1] Kontroll-Proteine (humanes Transferrin, Ribonuclease B, humanes -saures Glycoprotein); [2] Kontroll-Proteine/SDS deglyc. (+ 1h); [3] CaL B; [4] MolMarker; [5] CaL B/SDS deglyc. (+1h) [6] CaL B nativ deglyc. (+1h); [7] CaL B nativ deglyc. (+4h); [8] CaL B nativ deglyc. (+24h) Analytik rungstelle (N74-X-Thr) im Enzym gibt Die CaL B erwies sich in der SDS-PAGE als (Uppenberg et al., 1995). Frühere Untersu- sehr gut mit Coomassie anfärbbar und zeigte chungen anderer Lipasen zeigten, dass eine eine sehr breite Bande (Abbildung 5.1), ob- solche heterogene Massenverteilung mögli- wohl die Gelfiltration nur eine Bande lieferte. cherweise auf eine Glycosilierung zurück- Daher wurde mit Hilfe eines MALDI-TOF zuführen sein kann (Hedrich et al., 1993). Experimentes versucht, die Masse der Lipase genauer zu untersuchen. Deglycosilierung Aufgrund der heterogenen Massenverteilung Das in Abbildung 5.2 wiedergegebene Spekt- im Massenspektrum im MALDI-TOF (Abb. rum zeigt eine heterogene Massenverteilung 5.2a) wurde überprüft, ob die CaL B glycosi- von 34-39 kDa in der Lipase. Das theoretische liert vorliegt. Molekulargewicht beträgt 33022.4 (SWISSPROT). Aus der Sequenz und der Röntgenstruktur ist bekannt, dass es eine Glycosilie60 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Abb. 5.2a: MALDI-TOF-MS der glycosilierten CaL B. Die ermittelte Masse ist über einen Bereich von 34-40 kDa verteilt. Die theorethische Masse sollte dagegen 33 kDa betragen. Abb. 5.2b: ESI-MS der deglycosilierten CaL B nach nativer Deglycosilierung ohne SDSDenaturierung mit N-GlycosilaseF über 24 h. Die exakte Masse beträgt 33,094 kDa. Dazu wurde die Lipase nach dem im Kapitel Für die Kristallation wurde ein Protokoll zur 4.7 beschriebenen Protokoll mit Hilfe eines N- nativen Glycosidase F Deglycosilierungs-Kits (Roche Denaturierung erprobt. Die native Deglycosi- Diagnostics vormals Boehringer Mannheim) lierung erforderte eine längere Inkubationszeit. behandelt. Die Lipase und die mitgelieferten Nach 1 h und 4 h war ein Teil der Lipase noch Kontrollproteine wurden mit SDS denaturiert glycosiliert, erst nach 24 h Inkubation gelang und anschliessend deglycosiliert. Die an- die vollständige Deglycosilierung. Hochaufge- schliessende SDS-PAGE zeigt in Abbildung löste ESI-MS (Abbildung 5.2 rechts) ergab 5.1 deutlich, dass sich das Molekulargewicht eine nunmehr homogene Enzymmasse von nach der Inkubation mit der Deglycosidase 33094 Da ± 1 Da. verringert hat und die breit verschmierte Bande verschwunden ist. 61 Deglycosilierung ohne SDS- Kapitel 5 5.2 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Die Abhängigkeit der Aktivität von der Lö- Enzymkinetik sungsmittelkonzentration wurde durch eine 5.2.1 Michaelis-Menten-Kinetik nichtlineare Anpassung eines IC50-Wertes beschrieben, wobei dieser IC50 die Lösungsmit- Die steady-state-Parameter für das verwendete telkonzentration bestimmt, bei der 50 % relati- p-Nitrophenolat wurden bei 25°C in 5 % Ace- ve Aktivität, verglichen mit wässriger Lösung, tonitril, 25 mM Tris pH 7,0 10 mM CaCl2 ge- erreicht wird. Als Anpassungsfunktion wurde messen. die in dem Programm GraFit implementierte IC50-Funktion verwendet. Um die Reaktion zu verfolgen, wurde die Absorptionsänderung durch das bei der Hydrolyse y= entstehende p-Nitrophenolat in einem Photometer bei 405 nm aufgezeichnet und die Anfangsgeschwindigkeit über eine lineare Reg- 100 % æ x ö ÷÷ 1 + çç IC è 50 ø Fitfunktion IC 50 2 ression berechnet. Die Parameter KM und kcat Der aus drei Messungen errechnete Mittelwert wurden aus den gemessenen Anfangsge- und Messfehler wurde dabei explizit für die schwindigkeiten v für verschiedene Substrat- Anpassung berücksichtigt. In Abbildung 5.3 ist konzentrationen S über eine nichtlineare Reg- exemplarisch die relative Aktivität bei Zugabe vmax [ S ] angeK M + [S ] von Dioxan und die entsprechende Anpassung ression nach der Formel: v = wiedergegeben. passt (siehe Kapitel 2.5). Michaelis Menten Kinetik KM Vmax 100 mM 0,36 ± 0,04 34,7 ± 2,1 80 rel. Aktivität CaL B pH 7 5.2.2 Lösungsmittelabhängigkeit Zur Bestimmung des Einflusses organischer Parameter Value Std. Error IC 50 9.4300 0.2863 60 40 20 Lösungsmittel auf die Aktivität von Lipasen 0 wurde die Hydrolyse von p-Nitrophenyl-Acetat 0 in wässrigen Lösungsmittelgemischen unter- 10 20 30 40 % Dioxan sucht. Die Konzentration der untersuchten Lö- Abb.5.3 : Nichtlinearer Fit der Lösungsmittelabhängigkeit von CaL B mit Dioxan. sungsmittel variierte zwischen 5 % und 40 %. 62 50 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Die Aktivitätsbestimmung wurde für CaL B Dabei wurde festgestellt, dass es möglich ist, mit den in der folgenden Tabelle aufgeführten die Aktivität von CaL B gegenüber löslichen Lösungsmitteln bestimmt. Die Tabelle ist nach Substraten, wie dem verwendeten p-Nitro- zunehmender Inhibierung geordnet. phenylacetat, durch Zugabe von Triton X-100 oberhalb der kritischen Micellbildungs-Kon- CaL B IC 50 Fehler IC 50 Fehler zentration (CMC 0.22 - 0.24mM, » 0.015 %) mM (% Lsgm.) um den Faktor 3 zu erhöhen. Bei zunehmender Dioxan 9.4 0.28 1.03 0.03 Aceton 8.9 0.60 1.94 0.13 Detergenzkonzentration sinkt die Aktivität Acetonitril 7.6 0.31 2.36 0.10 dann wieder ab (Abb. 5.4). Methanol 7.4 0.92 2.93 0.36 Ethanol 5.4 0.14 1.49 0.04 Bei Messungen mit bis zu 0,2 % b-Octyl- THF 4.9 0.27 0.76 0.04 glycopyranosid wurde kein Einfluss des Deter- iso-Propanol 4.2 0.32 0.89 0.07 genz auf die Katalysegeschwindigkeit festgestellt. 5.2.3 Aktivierung von Lipasen durch Detergenzien Analog zur Inhibierung durch organische Lösungsmittel wurden kinetische Experimente mit den nichtionischen Detergenzien Triton X 100 und b-Octyl-glycopyranosid durchgeführt. A k t i vi tä t (% ) T r i to n X 1 0 0 Akt (%) 300 200 100 0 0.25 K o n z. ( % T r i to n X 1 0 0 ) Abb. 5.4: Aktivierung von CaL B durch Zugabe von Triton X 100. Durch Zugabe von kleinen Konzentrationen wird die gemessene Aktivität auf 300 % der Anfangsaktivität erhöht und nimmt bei weiterer Zugabe wieder ab. 63 0.5 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Beispielhaft ist ein nahezu linearer Verlauf der 5.2.4 Burst-Kinetik Reaktionsgeschwindigkeit für die Hydrolyse Um den geschwindigkeitsbestimmenden von p-Nitrophenyl-Acetat bei pH 7 in der Ab- Schritt der Ester- bzw. der Amidspaltung durch bildung 5.5 von 0 - 1 s (links) und von 1 - 5 s Lipasen zu bestimmen, wurden Stopped-Flow- (rechts) dargestellt. Nach 100 s ist das Substrat Experimente der Hydrolyse von verschiedenen fast vollständig hydrolysiert und die Reakti- Modellsubstraten mit einer Zeitauflösung von onsgeschwindigkeit geht auf null zurück. 1 ms bis 100 s durchgeführt. Auch bei der Zugabe von 5 % - 20 % AcetoBeobachtet wurde die Abspaltung des p-Nitro- nitril bzw. iso-Propanol wurde ein linearen phenolat-Anions bei 405nm im pH-Bereich Reaktionsverlaufes festgestellt. Die Reaktion von 7-9 mit den Substraten p-Nitrophenyl- wurde lediglich insgesamt verlangsamt. Acetat, -Propionat und p-Nitrophenyl- Acetamid im Konzentrationsbereich von 0,1 mM bis 2,5 mM. Für die untersuchten Bedingungen konnte für keines der verwendeten Substrate ein initialer "Burst" oder initialer "Lag" in der "pre-steadystate" Kinetik vor Einstellung eines Fliessgleichgewichts für die Reaktionsgeschwindigkeit beobachtet werden. 0.420 0.55 0.415 0.410 0.50 Abs E405 abs E405 0.405 0.400 0.395 0.390 0.45 0.40 0.385 0.380 0.35 0.375 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1 2 3 4 5 time Zeit [s] Zeit [s] time Abb. 5.5: Verlauf der Reaktionsgeschwindigkeit der Hydrolyse von p-Nitrophenol-Acetat in der Stopped-Flowspektrophotometrischen Beobachtung bei 405 nm. Links ist ein Zeitintervall von 0-1 s, rechts von1-5 s aufgetragen. Reaktionsbedingungen : 0,5 mg/ml CaL B + 1mM p-NPA 10 % Acetonitril, 50mM Tris pH 7. 64 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B + R/S Phenylethylamin 5.3 iso-Propylmethoxy-acetat R-Phenylethylmethoxy-acetamid S-Phenylethylamin Kinetische Racematspal- Aktivierungsenengie DR-S DG‡ der kinetischen tung von Phenylethyl- Racematspaltung. Die Enantioselektivität E einer kinetischen Racematspaltung ist nach amin mit CaL B Arrhenius über die Gleichung Die experimentellen Untersuchungen zur tech- D R - S DG ‡ ln E = RT nischen kinetischen Racematspaltung von racPhenylethylamin mit iso-Propyl-methoxy-acetat als Acylierungsmittel mit immobilisierter ® mit der Differenz-Aktivierungsenergie ver- 435) wurden in der knüpft. Berücksichtigt man die Beiträge von BASF AG (Labor Klaus Ditrich) durchgeführt. Enthalpie und Entropie zur freien Energie G, CaL B (NOVOZYM so kann man über einen linearisierten van't Hoff-Auftragung die enthalpischen und entropischen Beiträge aus der Temperaturabhängig- 5.3.1 Temperaturabhängigkeit der keit von E berechnen. kinetischen Racematspaltung Es wurde eine starke Abnahme der Enantioselektivität mit steigender Temperatur im Be- ES ‡ reich von 0°C - 90°C festgestellt. Die Enantioselektivität der kinetischen Racematspaltung ER ist durch das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten der beiden Enantiomere bestimmt. Berücksichtigt man die Eyring-Theorie Acyl Enzym des aktivierten Komplexes für diese enzymkatalysierte Reaktion, so ergibt sich das in der Abbildung 5.6 schematisierte thermodynamische Modell. E + S-Amid E + R-Amid Der Unterschied der Aktivierungsenergie für die Reaktion des acylierten Enzyms mit dem Abb. 5.6: Thermodynamisches Modell der kinetischen Racematspaltung mit Lipasen jeweiligen Enantiomer ergibt die Differenz65 Kapitel 5 ln E = - Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B D R -S DH ‡ 1 D R - S DS ‡ + R T R Die Temperaturabhängigkeit der unkatalysierten Reaktion wurde ebenfalls untersucht, um auszuschliessen, dass die racemisch ablaufende Aus dem in Abbildung 5.7 gezeigten van`t- Amidierung des freien Amins durch das Acy- Hoff-Diagramm über einen Temperaturbereich lierungsmittel eine Verringerung der Enantio- von 20° bis 90° C wurden folgende Werte für die thermodynamischen selektivität bei den enzymkatalysierten Reakti- Differenz-Aktivie- on verursacht. rungs-Parameter errechnet: Die nichtkatalysierte Reaktion produziert das DR-SDG‡ = -4,6 kcal/mol DR-SDH‡ = -7,9 kcal/mol -TDR-SDS‡ = 3,3 kcal/mol Amid mit einer Geschwindigkeitskonstanten von 6.0 x 10-7 min-1 bei 25°C und 6.2 x 10-5 min-1 bei 80°C. Bei noch höheren Temperaturen muss ein E- (298K) nantioselektivitätsverlust durch die zunehmend schneller ablaufende, nicht enzymatische Ne- Daraus geht hervor, dass der enthalpische Bei- benreaktionen berücksichtigt werden. Bei 120 trag zur Differenz-Aktivierungsenergie klar °C beträgt die Geschwindigkeitskonstante be- das schnellere R-Enantiomer bevorzugt, aber reits 3,9x10-4 min-1. Daher kann die Bildung der entropische Beitrag dem entgegenwirkt. von S-Amid im untersuchten Temperaturbe- Die Reaktion des langsameren Enantiomers reich vernachlässigt werden. mit dem Acyl-Enzym ist also entropisch begünstigt und damit verringert sich die Enatioselektivität bei steigender Temperatur. van't Hoff Diagram m 8,5 8 7,5 y =3935,1x - 5,4706 ln E 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 0,0027 0,0028 0,0029 0,003 0,0031 0,0032 0,0033 0,0034 1/T Abb. 5.7: Auswertung der experimentellen Temperaturabhängigkeit der kinetischen Racematspaltung von Phenylethylamin mit CaL B. 66 0,0035 Kapitel 5 5.4 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Kovalente Inhibition 5.4.1 Inhibition von CaL B von Lipasen Es zeigte sich, dass die Geschwindigkeit der in Abbildung 5.8 gezeigten irreversiblen Inhibie- In Zusammenarbeit mit der BASF AG, Labor rungsreaktion von der Stereochemie des Inhi- Dr. Ditrich, wurden von Hans Dieter Gerber bitors abhängt. Im Inhibitor liegen zwei Ste- verschiedene enantiomerenreine, diastereome- reozentren vor: eines am Phosphor und ein re Phosphonatinhibitoren des in Abbildung 5.8 zweites im Amid bzw. Alkoholrest. Nur die gezeigten Typs synthetisiert, die irreversibel Diastereomere mit S-Konfiguration am Phos- mit dem nukleophilen Serin im aktiven Zent- phor waren in der Lage, das Enzym nach 24 h rum reagieren und einen kovalenten Komplex vollständig zu inhibieren. mit der Lipase ausbilden. Interessant ist die Beobachtung, dass im direk- Ziel war die Bestimmung der Kristallstruktur ten Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeiten einer Lipase im Komplex mit den stereoche- der beiden Phosphonsäure-Amide die gleiche misch einheitlichen Phosphonatinhibitoren, um Stereopräferenz in der kinetischen Race- die Wechselwirkungen der beiden Stereoiso- matspaltung wie bei der Reaktion der Carbon- mere mit dem Enzym strukturell zu untersu- säure-Amide beobachtet wurde. In beiden Fäl- chen. len reagiert das SpRc-Amid schneller als die Verbindung mit dem SpSc-Amid. Serin 105 NO2 H O H O - pNP N P O (O) N P (O) O O O Abb. 5.8:kovalente Inhibierung von Lipasen durch Phosphonatinhibitoren unter Abspaltung von p-Nitrophenol 0,739 1,049 0,738 SpSc-Amid SpRc-Amid 1,048 1,047 0,736 Titel Y-Achse Abs E405 0,737 Dabs405= 0.01 0,735 0,734 0,733 1,046 1,045 1,044 1,043 0,732 1,042 0,731 1,041 0,730 1,040 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 time Titel X-Achse sec sec Abb. 5.9: Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeiten des Sc-Phenylethylamido-Phosphonat-Inhibitors (links) und des Rc-Phenylethylamido-Phosphonat-Inhibitors (rechts) mit CaL B im photometrischen Assay bei 405 nm 67 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B In Abbildung 5.9 ist beispielhaft der Verlauf als Abgangsgruppe war dagegen für beide der Anfangsgeschwindigkeit für beide Diaste- Alkoholenatiomere gleich langsam. reomere eines Sp-Phosphonat-Phenylethyl- 5.4.2 Nachweis der Inhibition von amid-Inhibitors im photometrischen Assay gezeigt. Die Auswertung der Reaktionsge- CaL B durch schwindigkeit durch eine lineare Regression MALDI-TOF MS ergab eine um den Faktor 1000 verlangsamte Der Nachweis der direkten kovalenten Bin- Reaktion des Sc-Phenylethylamid-Inhibitors dung des Inhibitors an die Candida antarctica mit CaL B gegenüber der Reaktion mit dem Lipase B konnte mit Hilfe der Massenspektro- schnellen Rc-Amid. metrie erbracht werden. Die Vollständigkeit der Inhibierung wurde Die Masse der mit Endo-H deglycosilierten durch Inkubation der Lipase über 24 h mit CaL B beträgt im MALDI-TOF 33205 Da ± 10 einem hundertfachen Überschuss des Inhibitors Da. Die zusätzliche Masse des gebunden Inhi- in einem Puffer mit 50 % Aceton untersucht bitors beträgt theoretisch 224,25 Da. (BASF Labor Dr. Friedrich, Volker Wengert). Anschliessend wurde der ungebundene Inhibi- Diese Massendifferenz konnte nach Inkubation tor durch mehrmalige Dialyse gegen Puffer der Lipase mit dem Inhibitor und anschliessen- entfernt und die Restaktivität nach der Dialyse der Dialyse mit Hilfe von MALDI-TOF Mas- untersucht. In Diagramm 5.10 sind die Ergeb- senspektren (Abbildung 5.11) nach dem in nisse der Inhibierung für die Lipase CaL B bei Abschnitt 4.8 beschriebenen Protokoll eindeu- pH 5,5 und pH 7 zusammengefasst. Die No- tig aufgelöst werden. Die Massendifferenz menklatur der Stereozentren benennt immer betrug zunächst das Stereozentrum am Phosphor und Phosphonamid-Inhibitor bzw. 218 ± 10 Da für dann das Stereozentrum des Amins bzw. des den SpSc-Phosphonamid-Inhibitor. 230 Da ± 10 für den SpRc- Phenylethylalkohols. Die vollständige Inhibierung innerhalb von 24 h gelang nur mit Inhibi- Die langsamere Inhibierungsgeschwindigkeit toren, die am Phosphoratom Sp-Konfiguration des Sc Phosphonamids wurde auch im MAL- aufweisen oder racemisch vorliegen. DI-TOF (Abbildung 5.11, unten) beobachtet. Die vollständige Inhibierung durch das Sc Die Geschwindigkeit der Inhibierung ist im Phosphonamid wurde erst nach 48 h festge- Fall des SpRc-Phosphonamid deutlich schneller stellt. (10-15 min) als im Fall des SpSc-Phosphonamid (3 h). Die gleiche Präferenz konnte auch für die Inhibtoren mit gebundenem Phenyletylester festgestellt werden. Die Reaktion der Inhibitoren mit p-Nitro-Naphthylalkohol 68 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Phenylethyl-Phosphonsäure Inhibitoren 10min 100% 15min 3h 10 min S-Phosphor 80% 60% Hemmung 40% 20% 0% -20% -40% -60% -80% Masse m/z R-Phosphor -100% CAL pH 5,5 CAL pH 7 RRamin RRamin (2.) SRamin SRamin (2.) RSamin SS- Rac,R- Rac,Samin alk alk Rac,R- Rac,Salk alk Naph naph -40% -52% 100% 90% -75% 100% 100% 93% 97% 97% 0 -71% 0 100% -77% 100% 100% 97% 80% 90% Abb. 5.10: Ergebnisse der Inhibierung von CaL B bei pH 5,5 und 7 in Abhängigkeit von der Stereochemie der diastereomeren Inhibitoren. Nach maximal 24 h konnte die Lipase nur von Inhibitoren mit Sp-Konfiguration am Phosphor (nach oben aufgetragen) vollständig inhibiert werden. Die Inhibitoren mit SpRc-Konfiguration am Amid oder Alkohol zeigten schon nach geringerer Zeit vollständige Inhibition. (kürzere Zeiten bis zur vollständigen Inhibierung sind jeweils oben am Balken indiziert) 69 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B 33205 Voyager Spec #1=>BC[BP = 33190.3, 8475] 100 8475.3 90 CaL B 33205 Da 80 70 33404 % Intensity 60 50 40 30 20 Voyager Spec #1=>BC[BP = 33413.5, 4633] 0 31012.0 33423 10 32759.4 100 34506.8 36254.2 38001.6 0 39749.0 Mass (m/z) 4632.8 90 80 +R-Amid 2h 33423 Da % Intensity 60 33619 33194 70 50 35445 30 20 35912 33803 40 Voyager Spec #1=>BC[BP = 33220.8, 7437] 32519.8 100 33435 0 31047.0 33232 10 33992.6 35465.4 36938.2 0 38411.0 Mass (m/z) 7437.5 90 +S-Amid 2 h 33435 Da 80 70 % Intensity 60 50 40 30 20 10 0 31113.0 32639.8 34166.6 35693.4 37220.2 0 38747.0 Mass (m/z) 10 90 +S-Amid 72 h 33426 Da 80 70 60 % In 50 te 40 30 20 10 Masse m/z Abb. 5.11: MALDI-TOF Massenspektren von deglycosilierter CaL B (oben) nach Inkubation über 2 h mit R-Phosphonamid (mitte) bzw. mit S-Phosphonamid nach 2 h und nach 72 h (unten). Die Inhibierung ist im Fall des S-Amids nach 2 h noch nicht vollständig. 70 Kapitel 5 5.5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B 5.5.1.1 Struktur des RpSc-Phenylethylamid- Kristallstrukturen Inhibitor In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, Für das RpSc-Diastereomer wurden nach dem Kristallstrukturen der Candida antarctica Li- Umkristallisieren blaß beigefarbene rhom- pase B in der nativen, offenen Konformation boedrische Kristalle mit einem Schmelzpunkt und im Komplex mit beiden Enantiomeren von 105-106,5 °C erhalten. Unter dem Polari- eines Phenylethylamid-Inhibitors zu bestim- sationsmikroskop wurden geeignete Einkristal- men. Die Identität und Stereochemie der syn- le thetisierten enantiomerenreinen Phenylethyla- ausgewählt. An einem Vierkreis- diffraktometer wurde ein Datensatz mit der mid-Inhibitoren konnte ebenfalls durch Rönt- Raumgruppe P21 bei Raumtemperatur am genstrukturanalyse gesichert werden. Fachbereich Pharmazie, Labor Dr. Milton T. Stubbs, und zusätzlich unter cryogenen Bedin- 5.5.1 Struktur der Phenylethylamid- gungen im Stickstoffstrahl bei 100K am Fach- Inhibitoren bereich Chemie, Labor Prof. Dr. Werner MasDie von Hans Dieter Gerber synthetisierten Diastereomerengemische der PracRc- sa, aufgenommen. bzw. PracSc-Phenylethyl-Phosphonamid-Inhibitoren Statistik konnten durch fraktionierte Kristallisation in CCl4 oder tert-Butylmethylether im Gemisch RpSc-Amid RpSc-Amid Inhibitor Inhibitor (RT) (cryo) 100 Temperatur (K) 298 mit Cyclohexan durch fraktionierte Kristallisa- Auflösung 7,4 - 0,89 14,23-0,87 tion getrennt werden. Wellenlänge (Å) 1,54178 0,71073 Raumgruppe P21 P21 Im NMR-Experiment (JEOL 400 MHz, Labor (Å) Zellparameter (Å) a 7,6042 7,4490 b 10,2113 10,2011 c 12,1265 24,0612 b 96,927 95,969 Zahl der Reflexe 1486 5558 mit Fo > 4 s Fo 1454 4669 R-Faktor (alle / 4 s Fo) 6,46 / 6,54 3,07 / 3,75 Dr. Kämpchen, FB Pharmazie) konnte keine Verunreinigung mit dem jeweils anderen Di(°) astereomer nachgewiesen werden (Reinheit laut NMR > 95 %). Die so erhaltenen Einkristalle der beiden getrennten Diastereomere konnten zur Röntgenstrukturbestimmung verwendet werden, um Die mit SHELLX verfeinerte Struktur des deren absolute Konfiguration und Konformati- RpSc-Diastereomers weist in der Hochtempera- on aufzuklären. tur-Modifikation eine fast ideale periplanare Anordnung der aromatischen Ringe der Phenylethylamid- und der 4-Nitrophenyl-Seitenkette auf, wie in Abbildung 5.12 gezeigt ist. Im 71 Vergleich zur Hochtemperatur- Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Modifikation zeigt die Tieftemperatur- (RT) Modifikation eine Verdopplung der c-Achse Temperatur (K) 298 durch die Unterscheidung von zwei sehr ähnli- Auflösung 7,4 - 0,89 chen periplanaren Geometrien. Die aromatischen Ringsysteme sind leicht gegeneinander (Å) Wellenlänge (Å) 1,54178 Raumgruppe P212121 Zellparameter (Å) 18.49150 verdreht. In der Hochtemperaturphase wird die 26.92420 c-Achse halbiert. Die verdoppelte Zelle ist in 7.42070 (°) Abbildung 5.14 gezeigt. Die beiden in der Tieftemperaturphase symmetrieunabhängigen Moleküle sind durch eine Translation um die 90.00 90.00 90.00 Gesamtzahl der Reflexe 3185 mit Fo > 3 s Fo 2182 R-Faktor (alle / 3 s Fo) 5,9 / 6,0 Die Struktur halbe Länge der c-Achse voneinander getrennt. In der Hochtemperaturphase wird aus dieser Verschiebung eine echte Translation entlang verfeinerte des SpSc- Phenylethylamid-Inhibitors weist für die bei- der halbierten c-Achse. Um die PO-NH Bin- den symmetrieunabhängigen Moleküle in der dung bildet sich eine s-trans Konformation aus. Elementarzelle zwei völlig verschiedene An- Durch die entgegengesetzte Orientierung der ordnungen der aromatischen Ringe der Pheny- P=O bzw. NH Gruppen ergibt sich eine Ver- lethylamid- und der 4-Nitrophenyl-Seitenkette kettung der Moleküle entlang der parallel zur auf, wie in Abbildung 5.13 gezeigt ist. Ein b-Achse verlaufenden 21-Achse. Monomer liegt, ähnlich wie im RpSc- Diastereomer, in einer periplanaren Geometrie 5.5.1.2 Struktur des SpSc-PhenylethylamidInhibitor vor, das benachbarte Molekül zeigt jedoch eine nahezu senkrechte Stellung der aromatischen Für das SpSc- Diastereomer und entsprechend Ringe zueinander. auch für das enantiomere RpRc-Diastereomer wurden nach dem Umkristallisieren farblose Auch das Wasserstoffbrückennetz wird deut- Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 86,5 - lich anders ausgebildet, wie in der Abbildung 87 °C erhalten. Unter dem Polarisationsmikro- 5.15 zu erkennen ist. Hier liegt die PO-NH skop wurden geeignete Einkristalle ausgewählt Bindung in einer S-cis Geometrie vor, so dass und an einem Vierkreisdiffraktometer ein Da- beide funktionellen Gruppen ihre Wasserstoff- tensatz in der orthorhombischen Raumgruppe brücken zur gleichen Seite ausbilden. Dadurch P212121 bei Raumtemperatur am Fachbereich ergibt sich eine zickzack-förmige Packung der Pharmazie, Labor Dr. Milton T. Stubbs aufge- unterschiedlichen Moleküle entlang der a- nommen. Diese Zelle bleibt bis 100K bestehen. Achse. Statistik SpSc-Amid-Inhibitor 72 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B RpSc SpSc Abb. 5.12: Konformationen des RpSc-Phenylethylamid- Abb. 5.13: Konformationen des SpSc-Phenylethyl- Inhibitors in der Tieftemperatur-Modifikation. Die amid-Inhibitors. Die Überlagerung der beiden aromatischen Seitenketten zeigen eine nahezu perfekte Moleküle zeigt die periplanare bzw. perpendikulare periplanare Anordnung zueinander. Die PO-NH Bin- Anordnung der aromatischen Ringe. Die PO-NH dung liegt in einer s-trans Geometrie vor. Bindung liegt in einer s-cis Geometrie vor. c c b a Abb. 5.14: Elementarzelle des RpSc-Phenylethylamid- Abb. 5.15: Elementarzelle des SpSc-Phenylethyl- Inhibitors in der Tieftemperatur-Modifikation. Die amid-Inhibitors. Die beiden symmetrieunabhängi- Moleküle in der linken Hälfte der Zelle zeigen peripla- gen Moleküle mit unterschiedlicher Geometrie sind nare Geometrie, die Moleküle in der rechten Teil der versetzt entlang der a-Achse angeordnet. Die direkt Elementarzelle eine leicht verdrehte Anordnung der benachbarten Moleküle sind über eine Wasserstoff- aromatischen Ringe zueinander. Durch beide Hälften brücke von der Amidgruppe eines Moleküls zum läuft je eine Wasserstoffbrückenkette entlang der Phosphonat-Sauerstoff eines benachbarten Mole- parallel zur b-Achse verlaufenden 21-Achse. küls verbunden. 73 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B beobachtet wurde, differiert die Struktur im 5.5.2 Kristallstruktur der CaL B Bereich der Kristallkontakte von den bekann5.5.2.1 Apo-Struktur CaL B ten Strukturen der CaL B mit orthorhombi- Die Struktur der nativen Lipase wurde aus scher (1tca, 1lbs) oder monokliner Symmetrie Kristallen der hexagonalen Raumgruppe P6322 (1tcb, 1tcc). Die abweichenden Aminosäure- durch die Methode des molekularen Ersatzes geometrien wurden manuell mit dem Pro- mit Hilfe des Programms AMORE gelöst. Die gramm O (Version 6.2) in die Elektronendichte Rotations- und Translationsfunktionen wurden eingepasst. Der in Marburg mit Hilfe eines mit AMoRe auf der Basis einer bekannten Drehanoden-Generators mit einem MSC R- Struktur der CaL B (1tca) berechnet. AXIS 4 Image-Plate-System bis 2.6 Å aufgenommene Datensatz der nativen CaL B zeigt native Struktur Marburg native Struktur DESY keine signifikanten Abweichungen in den er- 35-2,6 16-1,8 später unter Verwendung von Synchrotron- Wellenlänge (Å) 1,541 1,05 strahlung am DESY aufgenommenen, bis Raumgruppe P6322 P6322 Zellparameter (Å) a = 88.97 a = 89,25 b = 88.97 b = 89,25 hängig voneinander verfeinert wurden. In der c = 136,31 c =136,59 asymmetrischen Einheit befindet sich ein Lipa- g = 120 g = 120 semonomer, jeweils drei Lipasemonomere Gesamzahl beob. Reflexe 316712 688694 Gesamzahl symmetrieunabh. Reflexe 9926 25445 Statistik Auflösung (Å) (°) mittelten Atomkoordinaten zu dem ein Jahr 1,8 Å aufgelösten Datensatz, obwohl sie unab- bilden ein Trimer. Die Bindetasche ist zur dreizähligen Achse eines Trimers orientiert Vollständigkeit (%) insgesamt 95,3 äußere Schale 88,3 und über einen Solvenskanal mit dem umge83,5 benden Kristallwasser verbunden. 83,8 Rsym -Faktor Das aktive Zentrum liegt ca. 12 Å tief am Ende insgesamt 10,2 5,8 äußere Schale 46,0 29,7 einer schmalen Kavität (Abbildung 5.18). Am R-Faktor 20,7 19,2 Boden der Bindetasche befindet sich die kata- RMS der Bindungslängen 0,008 0,009 lytische Triade, gebildet aus Ser105, His224 RMS der Bindungswinkel 1,442 1,421 Zahl der Wassermoleküle 35 112 und Asp187 (Abbildung 5.16). Das katalytische Ser105 befindet sich an der Spitze des Die gesamte Struktur unterscheidet sich nur mittleren Faltblatts im Übergang zu einer im sehr wenig von der Geometrie in der CaL B spitzen Winkel zurückgefalteten Helix. Dieses Referenzstruktur (1tca, 1,55Å), das a/b Hydro- Strukturmerkmal wird als "nukleophiler Ellen- lase Faltungsmuster (Abbildung 5.16) ist iden- bogen" bezeichnet und ist durch die konser- tisch. Die RMS-Abweichung der überlagerten vierte Sequenz GXSXG gekennzeichnet. Die Hauptkette beträgt 0,5 Å. Da es sich um eine konservierten Glycine begünstigen den direk- Raumgruppe handelt, in der CaL B bisher nicht ten Übergang vom Faltblatt in die Helix. 74 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Lid-Helix a5 ASP187 HIS 224 SER 105 Bindetasche Lid-Helix a5 ASP187 HIS 224 SER 105 Abb. 5.16: Schematischer Verlauf der Hauptkette, dargestellt durch ein Bändermodell der Candida antarctica Lipase B, oben in einer Sicht auf das aktive Zentrum, unten in einer Seitenansicht. Das katalytische Ser 105 der katalytischen Triade liegt am Boden einer schmalen Bindetasche. Die "Lid"-Helix zeigt eine offene Konformation und befindet sich rechts oberhalb der Bindetasche. 75 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Alle Aminosäuren in der als flexibel ange- 5.5.2.2 Komplex von SpRc-Phenylethylamid- nommenen "Lid"-Region über dem aktiven Inhibitor mit CaL B Zentrum konnten mit niedrigen Temperatur- Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Komplex- faktoren eindeutig in die Elektronendichte struktur von CaL B mit dem SpRc-Phenyl- eingepasst werden. Insbesondere die "Lid"- ethylamid-Inhibitor sowohl durch Kokristalli- Helix a5 zeigte eine definierte, offene Kon- sation mit dem Inhibitor als auch durch Eindif- formation, die über Kristallkontakte stabilisiert fundieren ("Soaking") des Inhibitors in native wird. Kristalle erhalten. Diese Packung ermöglicht es, Inhibitoren in Der auf dem hauseigenen Drehanodengenera- native Kristalle einzudiffundieren ("Soaking") tor in Marburg aufgenommene Datensatz die- und so aus den ohne Gegenwart eines Inhibitors gewachsenen Kristallen ser Komplexstruktur aus der Kokristallisation Komplex- von CaL B mit Inhibitor erreichte nur eine strukturen mit gebundenem Inhibitor zu erhal- kristallographische Auflösung von 3,5 Å. ten. Eine weiterer Unterschied zu den bisher gelös- Statistik SpRc-Amid Komplex Marburg SpRc-Amid Komplex DESY Auflösung (Å) 10-3,5 16-2,0 Wellenlänge (Å) 1,5418 1,05 Raumgruppe P6322 P6322 Zellparameter (Å) a = 88.43 a = 89,62 b = 88.43 b = 89,62 c = 137,76 c =137,39 g = 120 g = 120 Gesamzahl beob. Reflexe 149947 1249255 Gesamzahl symmetrieunabh. Reflexe 4505 22182 97,2 97,8 97,3 97,5 insgesamt 20,1 7,9 äußere Schale 40,1 44,7 R-Faktor 16,1 17,9 RMS der Bindungslängen 0,007 0,008 RMS der Bindungswinkel 1,400 1,408 Zahl der Wassermoleküle 0 134 ten Strukturen ist die Art der Glycosilierung am Asparagin 74, die eine deutlich abweichende Geometrie zeigt (Abbildung 5.17). (°) 1TCA Asn 74 Vollständigkeit (%) insgesamt äußere Schale Rsym -Faktor Modell Abb. 5.17: 2Fo-Fc Elektronendichte in der Umgebung der Glycosilierungsstelle am Asparagin 74. Gezeigt ist die Referenzstruktur 1tca (Stabmolekül) und das manuell in die Elektronendichte eingepasste Modell (Linienmolekül) der Strukturbestimmung in dieser Arbeit. 76 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Die niedrige Auflösung und die schlechte Qualität der initialen Fo-Fc ten während der Verfeinerung mit niedrigen Differenz- individuellen Temperaturfaktoren lokalisiert Elektronendichte im aktiven Zentrum war un- werden. zureichend, die am Chiralitätszentrum befindDie übrige Struktur ist mit der nativen Struktur liche Methylgruppe konnte nicht in der 2Fo-Fc nahezu identisch und zeigt nur in direkter Um- Elektronendichte lokalisiert werden. gebung des Inhibitors kleine Veränderungen, Um die Aussagekraft dieser Strukturbestim- die auf die Bindung des Inhibitors zurückzu- mung im Hinblick auf die Bindung des Inhibi- führen sind. Die Aminosäuren Trp104 und tors genauer zu erfassen, wurde eine hochauf- Leu278 im aktiven Zentrum, die im direkten gelöste Strukturbestimmung an der Messstati- Kontakt mit der Methylgruppe am stereogenen on der Max-Planck Gesellschaft am Syn- Zentrum des Phenylethylamins stehen, zeigen, chrotron DESY in Hamburg durchgeführt. im Vergleich zur nativen Struktur ohne Inhibitor, eine leicht abweichende Geometrie. Beide Die besten Messdaten konnten mit deutlich Aminosäuren sind nach Bindung des Inhibitors grösser gewachsenen und besser streuenden im direkten van-der-Waals-Kontakt mit dessen nativen Kristallen erzielt werden, die erst einen Phenylethylaminrest (Abbildung 5.19). Sie Tag vor der Messung mit dem Inhibitor ver- sind durch eine induzierte Anpassung aus ihrer setzt ("gesoakt") worden waren. ursprünglichen Position weggerückt worden. Die am DESY vermessene Röntgenstruktur der Leu 278 steht im van-der-Waals Kontakt mit CaL B mit dem in den nativen Kristall eindif- dem Phenylring des Inhibitors, während im SpRc-Phenylethylamid-Inhibitor Trp104 durch die direkt auf das Indolsystem zeigt in der Fo-Fc Differenzelektronendichte ausgerichtete Methylgruppe des R-Amids der deutlich das kovalent an das Serin 105 im akti- Ring um 25 ° (Torsionswinkel über Ca-Cb-Cg- ven Zentrum gebundene Phosphoratom des Cd) nach hinten weggedreht wird, wie in Ab- Inhibitors. Die Elektronendichte in der Binde- bildung 5.20 in der Überlagerung mit der Apo- tasche ist in Übereinstimmung mit der erwarte- Struktur dargestellt ist. fundierten ten Position des Phosphonat-Sauerstoff-Atoms Die Aminofunktion des Inhibitors bildet eine in der Oxyanionen-Höhle. Ein langgestreckter Wasserstoffbrücke zum Stickstoff des katalyti- Bereich der 2Fo-Fc Elektronendichte für den schen His224 aus. Das Sauerstoffatom des Ethoxymethylrest in der Säurebindetasche Phosphonats wird in der Oxyanionen-Höhle erlaubt die eindeutige Positionierung des Inhi- durch Wasserstoffbrücken zur Amidfunktion bitors im aktiven Zentrum. Die Position des des Proteinrückrats der Reste Gly 103 und Thr chiralen Phenylethylaminrestes ist ebenfalls 40 und zusätzlich zur Alkoholfunktion der zweifelsfrei durch einen durchgehenden Elekt- Seitenkette des Thr 40 stabilisiert. ronendichtebereich gekennzeichet (Abbildung 5.21 rechts). Alle Atome des Inhibitors konn77 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B lipophil hydrophil SpRc-Amid Abb. 5.18: Oberflächendarstellung der Bindetasche von CaL B mit gebundenem Inhibitor. Die Farbcodierung nach steigender Lipophilie von blau bis braun ist am rechten Bildrand gezeigt. Trp104 Ala281 His224 Ile285 P Die Connolly-Oberflächen wurde mit MOLCAD in SYBYL 6.2 erstellt. Ser105 Thr40 Val154 Abb. 5.19: Schnittbild der Umgebung des Inhibitors in der Bindetasche von Cal B. Die Oberfläche des Inhibitors (orange) ist nahezu komplementär zur Oberfläche des Proteins. SpRc-Amid 78 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Der Ethoxymethylrest passt sich ideal der Phenylethylamid-Inhibitor erreichte nur eine Form der hydrophoben Säurebindetasche an. kristallographische Auflösung von 3,2 Å. Die Die Seitenkette knickt an der Position 2 in Qualität der initialen Dichte im aktiven Zent- einer gauche-Konformation zur Proteinober- rum war leider unzureichend, lediglich das fläche ab. Phosphoratom konnte zugeordnet werden. Daher wurde auch hier der Versuch unternommen, einen besser aufgelösten Datensatz 5.5.2.4 Komplex von SpSc-Phenylethylamid- mit Synchrotronstrahlung am DESY in Ham- Inbibitor mit CaL B burg zu erhalten. Es wurden mehrere mit dem SpSc-Inhibitor "gesoakte" Kristalle vermessen Die Komplexstruktur von CaL B mit dem und aus den beiden besten Datensätzen (SS 03, SpSc-Phenylethylamid-Inhibitor wurde durch SS 07) durch die gemeinsame Skalierung mit das Eindiffundieren ("Soaking") des Inhibitors dem Programm SCALEPACK ein Datensatz mit in Apo-Kristalle erhalten. verbesserter Statistik gewonnen, der bis 2,7 Å ausgewertet werden konnte. Statistik SpSc-Amid Komplex Marburg SpSc-Amid Komplex DESY Auflösung (Å) 34-3,2 16-2,5 Wellenlänge (Å) 1,5418 1,05 Raumgruppe P6322 P6322 Zellparameter (Å) a = 89.45 a = 89,37 bitors in der Fo-Fc Differenzelektronendichte b = 89.45 b = 89,37 eindeutig nachgewiesen werden. Im Unter- c = 137,29 c =137,70 schied 90 90 120 90 90 120 102679 261866 +355838 (°) Gesamzahl beob. Reflexe Gesamzahl symmetrieunabh. Reflexe Vollständigkeit (%) insgesamt 8857 Die erfolgreiche Inhibierung des Proteins kann durch die Lokalisation des kovalent mit dem Ser105 verbundenen Phosphoratoms des Inhi- zur Komplexstruktur des SpRc- Phenylethylamid-Inhibitors können aber nur die Position des Phosphonat-Sauerstoffatoms 11248 in der Oxyanionen-Höhle und die Ethoxymethyl-Seitenkette in der Säurebindetasche 85,6 98,8 76,3 94,3 insgesamt 24,0 14,6 äußere Schale 53,2 62,7 elektronendichte, noch in der 2Fo-Fc Elektro- R-Faktor 17,3 18,9 nendichte in diesem Bereich ein Streubeitrag RMS der Bindungslängen 0,007 0,007 zu erkennen, wie in Abbildung 5.21 links ge- RMS der Bindungswinkel 1,421 1,301 Zahl der Wassermoleküle 0 33 äußere Schale eindeutig der Differenzelektronendichte zugeordnet werden. Für den SpSc-Phenylethyl- Rsym -Faktor amid-Rest ist weder in der Fo-Fc Differenz- zeigt ist. Die Temperaturfaktoren für den nicht zuweisbaren Sc-Phenylethylamin-Rest sind Der auf dem hauseigenen Drehanodengenera- gegenüber den übrigen Inhibitoratomen wäh- tor in Marburg aufgenommene Datensatz der rend der Verfeinerung mit XPLOR von 40 Å2 Komplexstruktur von CaL B mit dem SpSc- auf über 60 Å2 angestiegen. 79 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Ile 285 Thr 40 Ala 281 SpRc-Phenylethylamid Leu 278 Trp104 Gln 106 Ser 105 His 224 Abb. 5.20: Vergleich der Apo-Struktur (grün) mit der des SpRc-Phenylethylamid-Komplexes (gelb) . Die Aminosäuren Trp104 und Leu278 in der Stereospezifitätstasche sind durch die Wechselwirkung mit der Methylgruppe des Inhibitors leicht verschoben worden. Das Amid zeigt eine Wasserstoffbrücke zum His224. In der Oxyanionen-Höhle werden drei HBrücken zum Phosphonatsauerstoff ausgebildet. SpSc-Phenylethylamid Auflösung 2,5 Å SpRc-Phenylethylamid Auflösung 2,0 Å 2Fo-Fc , 0,9 Sigma 2Fo-Fc , 0,9 Sigma Ser105 Ser105 Abb 5.21 Die Elektronendichte für den Komplex mit dem SpRc-Phosphonamid-Inhibitor (links) ist nur teilweise definiert. Für den SpRc-Phosphonamid-Inhibitor (rechts) sind alle Inhibitoratome eindeutig in der Elektronendichte definiert. 80 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Abb. 5.22: Histgramm der Torsionswinkelverteilung für eine Ethergruppe (links) bzw. eine n-Butylgruppe aus der CSD. Die Suche wurde mit dem Programm ConQuest (CCDC) durchgeführt. Für die Ethergruppe wurde ein vermehrtes Auftreten der gauche-Konformation in den untersuchten Kristallstrukturen festgestellt. Das legt den Schluss nahe, dass aus irgendei- stabilisiert werden. Die Seitenkette des Etho- nem Grund der Streubeitrag stark reduziert ist. xymethylrestes knickt an der Position 2 in In aller Regel ist dies auf eine Unordnung in einer gauche Konformation zum Solvens hin einem solchen Molekülteil zurückzuführen. ab, wie bereits in der Komplexstruktur mit dem Partielle Besetzung der Bindetasche kommt SpRc-Isomer beobachtet wurde. Diese bevor- nicht in Frage, da der Bereich um das Phos- zugte Konformation in der Säurebindetasche phoratom und die Ethoxymethylseitenkette gut wird vermutlich durch das Sauerstoffatom an zu lokalisieren sind. Die massenspektro- dieser Position zusätzlich begünstigt, da eine metrische Untersuchung hat zudem gezeigt, gauche Konformation im Vergleich zur trans dass das Protein durch den vollständigen SpSc- Anordnung für eine Ether-Funktion energe- Phenylethylamid-Inhibitor blockiert wird. tisch eher begünstigt ist als für eine n-ButylSeitenkette, die deutlich bevorzugt in der all- Die beobachtete Unordnung in dem Pheny- trans Konformation vorliegen sollte. Auswer- lethylteil könnte mit mehreren Konformationen tungen von Statistiken aus der CSD mit Con- im Zusammenhang stehen, die, gemittelt über Quest (CCDC, Cambridge) von 2250 linearen den gesamten Kristallverband, von diesem Fragmente X-CH2-CH2-O-CH2-X und 10.000 Molekülteil eingenommen werden. Die Geo- linearen n-Bytyl-Fragment (X- CH2-CH2-CH2- metrie der Aminosäure-Seitenketten in unmit- X) zeigen (Abbildung 5.22), dass nur für die telbarem Kontakt mit dem Sc-Phenylethylamid Ethergruppe eine signifikannte Häufigkeit von ist unverändert zur Apo-Struktur. Aufgrund der Stereochemie im 1 zu 3 für einen gauche-Torsionswinkel von SpSc-Phenylethylamid- 60-90° bzw. -60 - -90° gegenüber einer Häu- Inhibitor ist nicht die Methylgruppe am chira- figkeit von 1 zu 10 für n-Butyl gefunden wird. len Zentrum auf das Trp104 in der Stereospezifitätstasche ausgerichtet, sondern das Wasserstoffatom. Die Konformation des Phenylethylamid-Restes kann daher nicht ausreichend 81 Kapitel 5 5.6 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B feld MAB im Programm MOLOC durchge- Konformationsanalyse führt. Als Ausgangsstrukturen dienten dabei in der Bindetasche die kristallographisch bestimmten BindungsDa die Elektronendichte aus der röntgenstruk- moden der Komplexe. Für beide Inhibitoren turanalytischen Untersuchung des Komplexes wurden mehrere denkbare Orientierungen SpSc-Phenylethyl- (Orrenius et al., 1998a; Schulz et al., 2000; phosphonamid keinen eindeutigen Nachweis Uppenberg et al., 1995) des Phenylethyl- einer einzigen definierten Konformation des bausteins in der Bindetasche manuell einge- Inhibitors in der Bindetasche zuläßt, wurden stellt. Diese wurden als Startgeometrien für die unterschiedliche Methoden zur Suche nach Kraftfeldrechnung verwendet. der Lipase mit dem denkbaren Konformationen bzw. Bindungs- Für das SpRc-Phenylethylphosphonamid laufen moden des offensichtlich ungeordneten Mole- alle Minimierungen von unterschiedlichen külteils eingesetzt. Um die in der experimen- Startgeometrien in das gleiche lokale Mini- tellen Kristallstruktur gefundenen Unterschie- mum, dessen Bindungsmodus analog zur expe- de zu dem SpRc-Phenylethylphosphonamid rimentell eindeutig bestimmten Elektronen- herauszuarbeiten, wurden die gleichen Rech- dichte ist, wie in Abbildung 5.23 rechts gezeigt nungen auch an diesem Lipase-Komplex wird. Für das SpSc-Phenylethylphosphonamid durchgeführt. konvergieren die Startgeometrien in mehrere lokale Minima, die sich deutlich unterscheiden, 5.6.1 Kraftfeldrechnungen wie in Abbildung 5.23 links in der ÜberlageEine erste Suche nach möglichen Konformati- rung mehrerer Bindungsmoden zusammen mit onen der beiden Inhibitoren in der Bindetasche der experimentellen Elektronendichte veran- wurde durch die Minimierung mit dem Kraft- schaulicht wird. Insbesondere in dem Bereich, Abb.5.23: Vergleich der experimentellen Elektronendichte mit den durch Minimierung des manuell platzierten Inhibitors in der Bindetasche mit dem Kraftfeld MAB im Programm MOLOC vorgeschlagenen Geometrien. SpSc-Phosphonamid: viele lokale Minima SpRc-Phosphonamid: stabiles globales Minimum 82 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B in dem die Elektronendichte auf dem 0.9 s - Die systematische Suche führte im Fall des Konturnivau keinen Streubeitrag zuweist, wer- SpRc-Phenylethylphosphonamids zu 6 Lösun- den mehrere mögliche Orientierungen vorge- gen, wobei jeweils 3 paarweise zueinander schlagen. durch eine Drehung des Phenylrings um 180 ° ineinander übergehen, d.h. symmetriebedingt 5.6.2 Systematische Suche sind nur 3 unabhängigen Konfigurationen nachzuweisen (Abbildung 5.25 oben rechts). Eine systematische Konformationssuche wurde Alle drei Orientierungen liegen strukturell eng mit dem Programm SYBYL (Tripos) nach dem beieinander und stehen mit der experimentell im Methodenteil im Kapitel 4.10 beschriebe- ermittelten Elektronendichte im Einklang. nen Protokoll durchgeführt. Die in der Elektronendichte beider Komplexstrukturen eindeu- R-Amid 1 NH-CH 2 CH-CPhenyl tig definierte Geometrie des Methoxyethyl- Konf 1/2 150 120 / 300 restes und das Protein wurden während der Konf 3/4 150 30 / 210 Suche als starr angenommen. Konf 4/5 120 150 / 330 Die beiden verbleibenden frei drehbaren Bin- Für das SpSc-Phenylethylphosphonamid wur- dungen (Abbildung den 18 erlaubte Konfigurationen generiert. Aus 5.24) wurden in der Suche berücksichtigt, um den gleichen lokalen Symmetriegründen leiten so mögliche Konfigurationen dieses Restes in sich daraus 9 unabhängige Konfigurationen ab. der Bindetasche aufzufinden. Die Suche wurde Besonders hervorzuheben ist, dass die Drehung für beide diastereomeren Formen mit identi- um die Achse des Phenylrings (Abbildung 5.25 schen Parametern durchgeführt. Als Startstruk- oben links) eine nahezu uneingeschränkte Ein- SpRc-Phenyl- stellung aller möglichen Winkel erlaubt. Die tur des diente Phenylethylrestes im ethylphosphonamid stimmte Falle die des be- freie Rotation des Rings scheint somit aus SpSc- sterischen Gründen in der Bindetasche mög- experimentell Komplexstruktur, für das lich. Isomere wurde eine günstige Orientierung des Phenylethylrestes verwendet. O O H P N 1 2 * O Ser Abb. 5.24: Systematische Suche der möglichen Konformationen des Phenylethyl-rests in der Bindetasche der CaL B. 83 S-Amid 1 NH-CH 2 CH-CPhenyl Konf 1/ 2 120° 90° / 270° Konf 3/ 4 120° 120° / 300° Konf 5/ 6 120° 150° / 330° Konf 7/ 8 90° 30° / 210° Konf 9/10 90° 60° / 240° Konf 11/12 90° 90° / 270° Konf 13/14 90° 120° / 300° Konf 15/16 90° 150° / 330° Konf 17/18 90° 180° / 360° Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B SpSc-Phosphonamid systematische Suche SpRc-Phosphonamid SpSc-Phosphonamid kovalentes Docking SpRc-Phosphonamid Abb. 5.25: Ergebnisse der Konfigurationssuche für beide Phenylethyl-Phosphonamid-Enantiomere in der Bindetasche. Oben ist die Überlagerung der systematischen Suche dargestellt, in der Mitte und unten die Überlagerung der Ergebnisse aus dem kovalenten Docking in Seitenansicht und Aufsicht. In beiden Fällen wurden für das ScPhenylethylphosphonamid mehr mögliche Konfigurationen vorgeschlagen. Die vorgeschlagenen Konformationen aus dem kovalenten Docking mit FLEXX sind deutlich diverser, und es wurden beim Aufbau des Inhibitors in der Bindetasche auch abweichende Geometrien des Amids am Phosphorzentrum generiert. 84 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Für den SpSc-Phenylethylamid-Inhibitor wur- 5.6.3 Docking mit FLEXX den nach dem gleichen Protokoll 14 DockingEine weitere Möglichkeit zum Auffinden von Lösungen erzeugt. denkbaren Konfigurationen der kovalent gebundenen Inhibitoren in der Bindetasche bietet Die generierten Lösungen sind deutlich diver- ein Docking mit FLEXX. Die Bindetasche wird ser, wie in Abbildung 5.25 unten gezeigt. Be- als starr angenommen und die Inhibitoren wer- sonders auffällig ist die in zwei Lösung (Rang den, beginnend mit der kovalent an das Protein 13 und 14) vorgeschlagene invertierte Geomet- gebundenen Gruppe, fragmentweise, wie im rie der Amid-Bindung. In dieser invertierten Methodenteil unter 4.9.2 beschrieben, aufge- Geometrie geht die Wasserstoffbrücke der NH- baut. Funktion zum His224 verloren, da die NHFunktion in die Richtung der Oxyanionen- Die gefundenen Lösungen wurden mit der Höhle weist. Die Methyl-Gruppe des stereoge- regressionsbasierten Bewertungsfunktion in nen Zentrums zeigt hingegen auf das Trp104 in FLEXX und mit DRUGSCORE nach ihrer abge- der Stereospezifitätstasche. schätzten Bindungsenergie bewertet und so in Beide Bewertungsfunktionen setzen diese zwei eine energetische Rangfolge gebracht. Geometrien jedoch deutlich von den anderen Für den SpRc-Phenylethylamid-Inhibitor wur- gefundenen Lösungen ab. Die Bewertung der den nach einem automatischen Zusammenfas- übrigen Geometrien von Rang 1 bis 12 ist un- sen von ähnlichen Lösungen drei Docking- einheitlich; sie unterscheiden sich häuptsäch- Konformationen erzeugt, die in Abbildung lich in der Geometrie des Phenylrings. 5.25 unten rechts gezeigt sind. Von den drei generierten Konfigurationen sind zwei mit der Rang SpSc beobachteten Kristallstruktur nahezu identisch FlexX/ Drugscore FLEXXScore DRUGSCORE RMS (ModellStruktur) und die dritte Lösung ist durch einen ungünsti- 1 / 8 1.333 -357836 0.741 gen Winkel entlang der Amidbindung unwahr- 2 / 4 1.731 -366497 0.751 scheinlich. Die Energiebewertung (bzw. Score) 3 / 2 2.164 -370608 0.808 für diese Lösung ist für beiden Bewertungs- 4 / 7 2.635 -360018 0.994 5 / 12 3.252 -351766 1.138 6 / 3 3.744 -368515 1.046 7 / 1 4.112 -380237 1.174 funktionen deutlich von den beiden anderen Konfigurationen separiert. Rang SpRc FlexX/ Drugscore FLEXXScore DRUGSCORE 8 / 6 4.487 -361643 1.182 RMS 9 / 5 5.493 -363179 1.232 (KristallStruktur) 10 / 10 6.082 -354633 1.258 11 / 11 6.322 -353845 1.245 12 / 9 6.552 -356531 1.389 13 / 13 9.717 -315569 1.809 14 / 14 11.646 -304527 1.738 1/1 3.399 -360735 0.556 2/2 3.741 -357341 0.513 3/3 9.527 -320984 0.903 85 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Um zu evaluieren, ob die modellierten Geo- Dies steht im Einklang mit den experimentel- metrien der beiden tetrehedralen "Transition- len Befunden aus den im Kapitel 5.2.4. vorge- State"-analogen Phosphonamid-Inhibitoren für stellten "Burst"-Kinetiken, die eine Beteiligung die betrachtete kinetische Racematspaltung des tetrahedralen Intermediates am geschwin- von Phenylethyl-ethoxyacetamid repräsentativ digkeitsbestimmenden Schritt der Reaktion sind, wurde das gleiche Protokoll auch für das zeigen. tetrahedrale Intermediat der entsprechenden Es erscheint somit gerechtfertigt die Betrach- Carbonylverbindung angewendet. tung aus dem "Transition state"-analogen InhiFür das R-Phenylethyl-ethoxyacetamid- bitor als repräsentativ für den tatsächlichen Intermediat wurden 17 Lösungen gefunden. Übergangszustand der Reaktion anzunehmen Die ersten 13 sind wiederum der aus der Kris. tallstruktur direkt modellierten Referenzstruktur sehr ähnlich (durchschnittlicher RMS-Wert < 1 Å). Für das S-Phenylethyl-ethoxyacetamid-Intermediat wurden 29 Lösungen gefunden, die sich hauptsächlich durch die Position des Phenylrings in der Bindetasche unterscheiden oder einen Verlust der Wasserstoffbrücke zum His224 zeigen. Auch hier ergaben sich ähnliche Hinweise auf einen Unterschied im möglichen Konfigurationsraum zwischen beiden Enantiomeren. Das nicht-kovalente Docking zur Platzierung des planaren Substrates der Amidhydrolyse, des Phenylethyl-ethoxyacetamids in der Bindetasche führt für beide Enantiomere zu einem sehr ähnlichen Satz von 50 bis 70 Lösungen. Als Basisfragment wurde die Carbonylgruppe verwendet, die in allen Fällen korrekt in die Oxyanionen-Höhle platziert wurde. Es konnten keine signifikanten Unterschiede in den modellierten Geometrien der beiden Enantiomere für den nichtkovalenten Michaelis-Menten- Komplex festgestellt werden. 86 Kapitel 5 5.7 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Die jeweils verwendeten Startstrukturen und Molekulardynamische Parameter sind im Methodenteil im Kapitel Simulationen 4.10 ausführlich beschrieben. Die Auswertung Um die Frage nach den statistisch relevanten erfolgte mit den im Programm MOLOC zur Bindungsmoden der beiden Enantiomere in der Verfügung stehenden Werkzeugen. Bindetasche weiter zu untersuchen, wurde die 5.7.1 Michaelis-Komplex Methode der molekulardynamischen (MD) Simulation verwendet. Die Simulationen wurden mit dem nichtkovalenten Michaelis-Komplex (Abbildung 5.26 Dazu wurde auf das bereits weiter vorne für rechts) mit beiden enantiomeren Formen des die Energieminimierung verwendete generi- Phenylethyl-ethoxy-acetamids in der Bindeta- sche "united atom" Kraftfeld MAB in der Va- sche der CaL B durchgeführt. riante DAB für die in MOLOC implementierte MD-Simulation zurückgegriffen. Die Trajektorie wurde über eine Zeitraum von 2,3 ns für den R-Amid-Komplex bzw. 3,9 ns Untersucht wurden die drei in Abbildung 5.26 für den S-Amid-Komplex im Abstand von 1 ps gezeigten, mit Kraftfeldmethoden zugängli- gesammelt, um eine möglichst vollständige chen Komplexe entlang des Reaktionspfades Abdeckung des erreichbaren Konfigurations- der kinetischen Racematspaltung, in denen für raumes zu gewährleisten. beide Stereoisomere der Phenylethyl-Gruppe eine Analyse der enantioselektiven Substrater- Die Simulation verhielt sich über den gesamten kennung durchgeführt werden konnte. simulierten Zeitraum stabil. Die Fluktuation der Gesamtenergie und auch die RMSAbweichung zur Startstruktur waren gering. Thr 40 O H H2 N N O H NH H N Ser 105 His 224 Acyl-Enzym + Amin acyl enzyme + amine R N H O N Gln 106 N H Ph O Ph R O O O N H O H Ph R Thr 40 Thr 40 N H Ser 105 tetrahedral tetrahedrales intermediate Intermediat NH His 224 N H OH Ser 105 N NH His 224 Enzym ++Amid enzyme amide (MM-Komplex) Abb. 5.26: Katalyseschema der kinetischen Racematspaltung von Phenylethylamin mit CaL B. Gezeigt ist das Reaktionsschema mit den für die chirale Erkennung relevanten Spezies, beginnend mit dem präacylierten Acyl-Enzym im Komplex mit dem freien Amin über das tetraedrische Intermediat zum Amid. 87 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B Tors 1 O N H R mit dem R-Amid und dem S-Amid festgestellt Ph OH Tors 2 werden. Einzig die Standardabweichung der 1 Rotation um die Achse des Phenylrings (TorsiNH N on-Phenyl, NH-C-Car=Car) war im Fall des SAmids sehr groß, was auf eine weitgehend His 224 Ser 105 ungehinderte Drehbarkeit des Phenylrings hinweist, die für das R-Amid nicht gegeben zu StandardAbweiczhung sein scheint. 2.910 0.118 In Abbildung 5.27 ist der zeitliche Verlauf der His224 -Amid NH S 2.824 0.086 beiden ausgewerteten Torsionswinkel abgebil- Torsion-Amid R 7.577 7.221 8.748 8.070 Torsion -Phenyl R 127.030 15.148 NH-C-Car=Car 95.545 85.825 Statistik Mittelwert MM-Komplex Å Abstand 1 C-NH=C=O R S S det. Es ist zu erkennen, dass für den Phenylring zwei statistisch relevante Konformationen auftreten, die über den Zeitraum der Simulation wieder ineinander übergehen können. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede der geometrischen Parameter zwischen der Simulation von CaL B im Komplex Torsion-S-Phenyl 200 150 Torsion S-Amid 100 50 0 -50 -100 -150 0 500 1K 1500 2K 2500 3K 3500 Zeit [ps] Abb. 5.27: Zeitlicher Verlauf der Torsionswinkel für das S-Phenylethyl-ethoxyamid über die Trajektorie. Für den Phenylring wurde ein Übergang zwischen zwei statistisch relevante Konformationen gefunden. 88 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B gewertet. Es zeigte sich, dass kein Unterschied 5.7.2 Acyl-Enzym und Amin im Abstand des Amin-NH2 zum CarbonylAnaloge Simulationen wurden mit dem Acyl- Kohlenstoff bzw. zum His224 Ne zwischen Enzym im Komplex mit dem nicht kovalent gebundenen Amin (siehe den Enantiomeren festgestellt werden konnte. Abbildung 5.26 links) mit beiden enantiomeren Formen des Phenylethylamins in der Bindetasche der CaL B durchgeführt. Die Trajektorie wurde über eine Zeitraum von 289 ps für den R-Amin Acyl-Enzym-Komplex bzw. 420 ps für den S-Amin Acyl-EnzymKomplex gesammelt. Ph H2 N R O 2 1 O N NH His 224 Ser 105 Statistik Mittelwert Acyl-Enzym + Amin Å Abstand 1 3.777 0.239 3.597 0.251 3.123 0.205 3.099 0.182 R C- Acyl -Amin NH Abstand 2 S R His224 -Amin NH S StandardAbweichung Die Simulation verhielt sich über den gesamten untersuchten Zeitraum stabil. Die Fluktuation der Gesamtenergie und auch die RMSAbweichung zur Startstruktur waren gering. Die Position des Amins in der Bindetasche relativ zu den katalytisch relevanten Gruppen His224 und dem Carbonyl Kohlenstoff der Acylgruppe am Ser105 wurde statistisch aus89 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B 5.7.3 Tetraedrisches Intermediat Analoge Simulationen wurden mit dem kovaStatistik lent an das Serin 105 gebundenen tetraedrischen Intermediat (siehe Abbildung 5.26, Mit- TeT1-Komplex Mittel wert StdAbw. Å Abstand 1 [Å] R 2.943 0.171 te) der Amidhydrolyse mit beiden enantiome- His224 -Amid NH S 4.174 0.427 ren Formen des Phenylethyl-ethoxy-acetamids Torsion -Phenyl ° R 99.048 54.054 durchgeführt. NH-C-Car=Car -101.56 95.019 -7.870 17.390 -147.310 49.557 S Torsion -Amid - Die Trajektorie wurde über einen Zeitraum von 2,2 ns für das R-Amid bzw. 3,2 ns für das S- O-C-NH-C °R S Die statistische Auswertung der Häufigkeits- Amid gesammelt. verteilung für die Wasserstoffbrückenbindung vom His224 zur NH-Funktion des Intermediates zeigt deutliche Unterschiede im Verhalten beider Enantiomere auf, wie in Abbildung 5.28 Tors 1 O im Histogramm zu erkennen ist. Während die Ph Wasserstoffbrücke vom His224 zum Amin Tors 2 N H R (Abstand 1) im R-Intermediat stabil bleibt, ist 1 O N Ser 105 sie in den meisten gesammelten Konformatio- NH nen für das S-Intermediat verloren gegangen. His 224 R-Amid S-Amid Häufigkeit Häufigkeit SAmid Abstand [Å*10] Amid - His224 Abstand [Å*10] Abb. 5.28: Häufigkeitsverteilung des Abstands 1 (His224 -Amid NH), der katalytischen Wasserstoffbrücke vom His224 zum Amid. Es wurden drei statistisch relevante Konformationen für das SAmid (links) beobachtet. Die Wasserstoffbrücke zu dem S-Amid (links) geht verloren. Das R-Amid (rechts) zeigt nur eine stabile Wasserstoffbrücke. 90 Kapitel 5 Ergebnisse I Candida antarctica Lipase B a- In Abbildung 5.29 ist die Überlagerung der tetraedrischen statistisch relevanten Geometrien für das te- Zustand zeigt sich auch im Torsionswinkel traedrische Intermediat für das S-Enantiomer über die Amin-Bindung (-O-C-NH-C), der für (links) bzw. das R-Enantiomer (rechts) gezeigt. das R-Phenylethylamid nahe 0 ° bleibt, aber im Es ist zu erkennen, dass die stereogene Me- Fall des S-Phenylethylamids mit einem Mit- thylgruppe telwert von -147,3± 49°, deutlich abweicht. mediates ideal in der Stereospezifitätstasche Die unterschiedliche Hydroxy-Amin-Funktion Geometrie im der des R-Phenylethylamid-Inter- durch das Trp104 stabilisiert werden kann. In dieser sogenannten unproduktiven Geometrie kann die Wasserstoffbrücke zum katalyti- Dieser Unterschied in der Stabilisierung des schen His224 nicht ausgebildet werden, aber tetraedrischen Intermediates in der Bindetasche die chirale Methylgruppe ist von der Oxyanio- von CaL B konnte auch für die Rotation des nen-Höhle weg in die Stereospezifitätstasche Phenylrings (Torsion Phenyl) beobachtet wer- des Trp104 ausgerichtet. den. RAmid SAmid His224 His 224 Abb. 5.29: Überlagerung der statistisch relevanten Konformationen des tetraedrischen Intermediates aus der MDSimulation des S-Amids (links) , Wasserstoffbrücke vom Amid zum unprotonierten Ne des His224 geht im Verlauf der Simulation im S-Amid verloren. 91 Kapitel 6 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B gelöst werden. Leider konnten die veröffent- DISKUSSION UND AUSBLICK lichten Protokolle zur Kristallisation aus diesen CANDIDA ANTARCTICA LIP Arbeiten (Uppenberg et al., 1994b) nicht er- B folgreich auf das vorhandene Proteinmaterial der CaL B übertragen werden. Die Diskussion mit den Autoren dieser Arbei- In dieser Arbeit ist es gelungen, Einblick in die ten (S. Patkar Novo Nordisk, T.A. Jones, Upp- strukturellen und kinetischen Determinanten sala University, pers. Mitteilung) führte zu für die beeindruckende Enantioselektivität von dem Schluss, dass die Aufreinigung des Prote- 99,9 % ee der immobilisierten Candida antarc- inmaterials für die veröffentlichten Arbeiten tika Lipase B (NOVOZYM 435) für die kineti- aus dem Wildtypstamm der Hefe Candida schen Racematspaltung (siehe Einleitung Ka- antarctica erfolgten (Patkar et al., 1993). Die- pitel 3.5.1) von Phenylethylamin (Balkenhohl ses Protein ist nicht mehr von der NOVO et al., 1997; Reetz & Dreisbach, 1994) zu NORDISK erhältlich. Das in dieser Arbeit gewinnen. verwendete, kommerziell erhältliche Material NOVOZYM 525 stammt hingegen aus der Diese enzymatisch katalysierte Reaktion wird heterologen, rekombinanten Expression der bei der BASF AG am Standort Ludwigshafen CaL B in Aspergillus oryzae (S. Patkar, pers. im technischen Maßstab mit mehreren hundert Mitteilung). Da Unterschiede in der Sequenz Tonnen Produkt/Jahr zur Produktion von op- ausgeschlossen werden konnten, wurde vermu- tisch reinen Aminen durchgeführt. tet, das die N-glycosidische Modifikation sich 6.1 Reinigung und vom damals verwendeten Wildtypenzym un- Kristallisation terscheiden könnte. Aus diesem Grund wurde ein Protokoll zur Die Grundvoraussetzung jeder Proteinstruktur- Deglycosilierung des Enzyms entwickelt (sie- bestimmung ist die erfolgreiche Kristallisation he Kapitel 5.1) und die exakte Masse des des Proteins. deglycosilierten und glycosilierten Proteins mit Die Reinigung des Enzyms aus einer kommer- MALDI-TOF- und ESI-Massenspektrometrie ziell erhältlichen Rohlipase (NOVOZYM 525, bestimmt und verglichen (Abbildung 5.2a bzw. Novo Nordisk AS) führte in zwei Reinigungs- b S.70).Es konnte gezeigt werden, dass eine stufen zu einer aktiven Lipase, die kein weite- extreme Hyperglycosilierung des Proteins res Fremdprotein enthielt. vorliegt, die bis zu 10 % der Enzymmasse ausmacht. Die Kristallstruktur der Candida antarctica konnte bereits 1994 im Labor von Alwyn T. Jones (Uppenberg et al., 1994a) erfolgreich 92 Kapitel 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B Frühere MALDI-TOF Untersuchungen an lierte CaL B führte unter den im Methodenteil pilzlichen Lipasen aus unterschiedlichen Or- genannten Bedingungen (20 % PEG 4000, ganismen (Hedrich et al., 1993) zeigten dage- 20 % iso-Propanol und 0,1 M Citrat bei pH gen ein definiertes Glycosilierungsmuster der 3,6) nach 12 Monaten Kristallwachstum zu Glycoproteine in Abhängigkeit vom untersuch- geeigneten Kristallen in der bisher nicht veröf- ten Organismus. Es ist anzunehmen, dass die fentlichten hexagonalen Raumgruppe P6322. heterologe Expression der Candida antarctica Die so ermittelte Struktur zeigt tatsächlich Lipase in Aspergillus Oryzae mit hoher Wahr- Abweichungen in der Geometrie des in Abbil- scheinlichkeit Ursache dieses "Unfalles" bei dung 5.17 abgebildeten kovalent an Asn 74 der Überexpression sein kann, da bekannt ist, gebundenen Glycosids. Es kann aber nur spe- dass sekretierte Fremdproteine im Golgi- kuliert werden, ob die Kristallisation in der Apparat oft mit einem mannosereichen Glycan neuen Raumgruppe oder die mannose-reiche versehen werden (Cereghino & Cregg, 2000). Hyperglycosilierung für die abgewandelte Konformation der N-glycosidisch gebundenen Der deutliche Einfluss einer solchen Hypergly- N-Acetyl-Glucosamid-Linker cosilierung auf die Kristallisation von Protei- ist. nen konnte bereits in vergleichenden Studien am Beispiel des HIV-Glycoprotein 1gezeigt werden (Kwong et al., 1999), da ein hochflexibler Rest aus Kohlenhydraten die Löslichkeit und das Aggregationsverhalten sehr stark beeinflussen kann. Die Entwicklung eines Protokolls zur quantitativen nativen Deglycosilierung der CaL B ohne Denaturierung führte allerdings nicht zum gewünschten Erfolg, da das deglycosilierte Protein nicht erfolgreich kristallisiert werden konnte. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit allen bereits gelösten Raumstrukturen der CaL B (Uppenberg et al., 1994a), die an Asn74 eine kovalente Glycosilierung über zwei in der Raumstruktur sichtbare Glucosaminreste zeigt. Die parallel verfolgte Suche nach neuen Kristallisationsbedingungen für die hyperglycosi93 verantwortlich Kapitel 6 6.2 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B rinproteasen wie Chymotrypsin oder Trypsin, Untersuchungen zum keinen "Burst" unter den untersuchten Bedin- Katalysemechanismus gungen aufweist. Es kann somit ausgeschlosDie Candida antarctica Lipase B (EC 3.1.1.3) sen werden, dass die Deacylierung des Acyl- ist eine Serinhydrolase (Brady et al., 1990; Enzyms Dodson, Lawson & Winkler, 1992) und besitzt Schritt der lipasekatalysierten Hydrolyse ist. wie alle Triacylglycerol-Lipasen eine klassi- der geschwindigkeitsbestimmende Da auch kein "initial Lag" beobachtet wurde, sche katalytische Triade (Blow, 1990; Dodson ist weiterhin unwahrscheinlich, dass die Sub- & Wlodawer, 1998), gebildet aus Ser105, stratbindung an die Lipase geschwindigkeits- His224 und Aspartat187 (Uppenberg et al., bestimmend ist. Der langsamste Elementar- 1994a). Der Mechanismus der enzymatischen schritt der Katalyse muss also nach der Sub- Hydrolyse von Estern bzw. Amiden durch stratbindung und vor der Deacylierung im Serinhydrolasen wurde mit zahlreichen Me- kinetischen Fliesschema liegen thoden von der Enzymkinetik (Gutfreund & Sturtevant, 1956) über Strukturuntersuchungen (Alden, Wright & Kraut, 1970; Wright, Alden E+ S k1 k2 ES k-2 k-1 & Kraut, 1969) bis hin zu quantenmechani- TeT1 schen ab initio molekulardynamischen Metho- k3 E-A k4 EP k-3 AcylEnzym E+P k-4 TeT2 den (De Santis & Carloni, 1999) untersucht und ist in der Einleitung zusammengestellt. Es wird daher eine direkte Beteiligung des Für die detaillierte Analyse der Struktur- tetraedrischen Intermediates TET1 beim Auf- Aktivitäts-Beziehungen ist es jedoch nötig, den bau des Acyl-Enzyms am geschwindigkeitsbe- tatsächlich geschwindigkeitsbestimmenden stimmenden Schritt postuliert. Es kann aber Elementarschritt der Katalyse für das unter- nicht mit Bestimmtheit gesagt werden, welcher suchte Enzym und Substrat zu kennen. Elementarschritt der Katalyse, der nukleophile Angriff des Serins auf das planare Carbonyl In dieser Arbeit konnte die Methode der tran- (k1/k-1) zum Ausbilden des tetraedrischen In- sienten Kinetik durch "stopped-flow" Untersu- termediates oder die Abspaltung der Alkohol- chungen der "burst" Kinetik (siehe Einleitung, gruppe aus dem tetraedrischen Intermediat Kapitel 2.5.2) erfolgreich eingesetzt werden, (k2/k-2) unter Ausbildung des Acyl-Enzym- um den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt Komplex, der tatsächlich geschwindigkeitsbe- im Katalysemechanismus von CaL B einge- stimmende und damit auch der enantioselekti- hend zu untersuchen. Das Ergebnis dieser vitätsbestimmende Schritt für die Umsetzung erstmals für Lipasen durchgeführten Studien von chiralen Alkoholen oder Amiden ist. (Kapitel 5.2.4, Abbildung 5.5) ist, dass die CaL B, im Gegensatz zu den klassischen Se94 Kapitel 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B Diese Vermutung wird auch durch kinetische Die Geometrie der tetrahedralen, aber ungela- Untersuchungen der Acylübertragung mit CaL denen B in wasserfreien organischen Lösungsmitteln vermutlich der Geometrie des Übergangszu- bestätigt (Ema et al., 1998; Martinelle & Hult, standes vom planaren Amid zum (am Carbo- 1995). nylsauerstoff negativ geladenen) tetrahedralen Phosphonamid-Komplexe entspricht Intermediat entlang der Reaktionskoordinate. Die Untersuchungen zur irreversiblen Inhibierung von CaL B mit Phosphonamiden bzw. Inhibitoren, deren Abgangsgruppe bei der Re- Phosphoestern zeigen interessanterweise eine aktion mit dem Enzym einen Chromophor (p- direkte des Nitrophenolat) oder Fluorophor (Umbelliferon) tetraedrischen Phosphonamid-Komplexes so- freisetzen, können so zum direkten photo- oder wohl von der Stereochemie des Phosphorzent- fluorometrischen Nachweis der Enantioselek- rums, als auch von der Stereochemie der unter- tivität verwendet werden. Allerding muss er- suchten chiralen Phenylethylamide bzw. Alko- wähnt werden, dass die Inhibitoren mit dem hole. Es ist bereits bekannt (Mannesse et al., deutlich grösseren p-Nitro-Naphthylalkohol als 1995a), dass nur das Sp-Phosphonamid in der Abgangsgruppe insgesamt nur sehr langsam Lage ist, das sterisch anspruchsvolle Pheny- mit dem Enzym reagierten und keine Abhän- lethylamid in die Alkoholbindetasche zu plat- gigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der zieren und gleichzeitig den Phosphonat- Stereochemie des Phenylethylalkohols mehr Sauerstoff korrekt in die Oxyanionen-Höhle zu festgestellt werden konnte. Hier scheint die orientieren. Bisher wurde nicht untersucht, ob Bindung des p-Nitro-Naphthyl-Inhibitors der es auch eine Korrelation der Reaktionsge- langsamste Schritt zu sein. Abhängigkeit der Bildung schwindigkeit der Inhibitoren mit der StereoEs ist prinzipiell für jedes Substrat neu zu prü- chemie des Alkohol-Substituenten, bzw. der in fen, welcher Schritt unter den gewählten Be- dieser Arbeit erstmals synthetisierten Amid- dingungen wie Substrat, pH, Ionenstärke, Ko- Substituenten gibt. faktoren etc. den geschwindigkeitsbestimmenDie gute Übereinstimmung der Enantioselekti- den Schritt darstellt. vität in der kinetischen Racematspaltung mit Das klassische Beispiel des Chymotrypsins den beobachteten Enantiopräferenzen für die zeigt dieses gravierende Problem bei der Ver- irreversible Inhibierung der CaL B mit den allgemeinerung von kinetischen Daten eben- diastereomeren Sp-Rc- bzw. SpSc-Inhibitoren falls auf. Es konnte gezeigt werden, dass für zum tetraedrischen "Transition-State"analogen die Hydrolyse von Estern, wie z.B. des auch in Komplex ist ein weiterer Hinweis auf die Be- dieser Arbeit verwendeten p-Nitrophenyl- deutung des tetraedrischen Intermediats für die acetats (Gutfreund & Sturtevant, 1956), die Struktur-Aktivitäts-Beziehung der CaL B. Deacylierung der geschwindigkeitsbestim- mende Schritt ist. Spätere Messungen mit p95 Kapitel 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B Nitroanilid wiederlegten aber diesen Schluss triellen Biokatalyse mit CaL B verwendete für die Hydrolyse von Amiden. Substrate wie das Phenylethylamid annehmen zu können. Auch die Anwesenheit von organi- Es ist daher unabdingbare Voraussetzung, schen Lösungsmitteln wurde untersucht. diesen Schritt für die Diskussion eines Katalysemechanismus’ für ein bestimmtes Substrat Ein weiterer Faktor, der zur Interpretation der zu kennen, um die experimentellen Daten rich- thermodynamischen Daten zur kinetischen tig interpretieren zu können. Racematspaltung nicht unterschätzt werden sollte, ist der Einfluss von organischen Lö- Aus diesem Grund wurden die Untersuchungen Schritt zum sungsmitteln auf die Katalyse. Bisherige Un- geschwindigkeitsbestimmenden sowohl für verschiedene tersuchungen haben gezeigt, dass CaL B in der p- biokatalytisch genutzten Acylübertragung (sie- Nitrophenylester, als auch für p-Nitrophenyl- he Kenntnisstand Kapitel 3.1.3) auf chirale anilid gemessen, um eine möglichst gute Über- sekundäre Alkohole und Amine (Garcia-Alles tragbarkeit der Ergebnisse auf das in der indus- Ser105 His224 EtOCH2 Ser P O O Trp104 OPhNO2 Phen Abb. 6.1: Modellierter, am Phosphor (orange) pentakoordinierter Übergangszustand bei der Reaktion des p-Nitrophenyl-Phenylethylamid-Inhibitors mit dem Serin105 in der Bindetasche von CaL B. Nur die S-Phosphor konfigurierten Inhibitoren platzieren den Phenylethylaminrest korrekt in der Stereospezifitätstasche zum Trp104 und können alle Wasserstoffbrückenbindungen vom kat. His 224 zum Amid und vom Phosphorsauerstoff in die Oxyanionen-Höhle ausbilden. Gleichzeitig wird das pNitrophenol als Abgangsgruppe zum Solvens ausgericht (roter Pfeil). 96 Kapitel 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B & Gotor, 1998; Martinelle & Hult, 1995) so- der CaL B (1tca Auflösung 1,55 Å) diskutiert. wohl durch das Substrat, als auch durch den Für die Thermomyces lannuginosa Lipase bei der Acylierung freigesetzten Alkohol, wie wurde hingegen in Anwesenheit von iso- z.B. Ethanol, bei der Acylübertragung kompe- Propanol, sowie mit Detergenzien die Aktivie- titiv gehemmt wurde (Garcia-Alles & Gotor, rung des Enzyms durch die Stabilisierung der 1998; Martinelle & Hult, 1995). "Lid"-Region in der offenen Konformation Mit dem in dieser Arbeit verwendeten Ansatz berichtet (Jutila et al., 2000; Zhu et al., 2001b). zum Studium der Lösungsmittelabhängigkeit Erst bei einer Konzentration von über 30 % Lipase-katalysierter Reaktionen in einem ein- wird diese Lipase durch iso-Propanol inhibiert. fach durchzuführenden photometrischen Test Es konnte nach dem heutigen Kenntnisstand sollte untersucht werden, ob es möglich ist, kein enzymunabhängiges Modell des Solven- auch für die Hydrolyse von löslichen Stan- seinfluss durch die Analyse der physikochemi- dardsubstraten, wie dem verwendeten p- schen Nitrophenylacetat, eine ähnliche Hemmung (Carrea & Riva, 2000). Die Aktivität von Lipa- nachzuweisen. Die in Kapitel 5.2.2 vorgestell- sen korreliert weder mit logP noch mit der ten Daten zur Inhibierung durch wasserlösliche Dielektrizitätskonstanten e, sondern die aufge- organische Lösungsmittel legen den Schluss stellten Modelle scheinen nur für jeweils ein nahe, dass es in der Bindetasche tatsächlich Enzym gültig zu sein. Daher kann ausge- eine bevorzugte Bindungstelle für iso-Propanol schlossen werden, dass es sich bei der beo- geben könnte, da diese Substanz die stärkste bachteten Inhibition von CaL B um einen En- Inhibierung zeigt. zym-unabhängigen Effekt wie die Solvatisie- Eigenschaften aufgestellt werden rungseigenschaften des Substrates oder die In der Elektronendichte des nativen Enzyms Verringerung der Wasseraktivität im Lösungs- konnte bei der Verfeinerung ein Bereich aus- mittelgemisch handelt. Die beobachtete Akti- gemacht werden, der entweder von zwei Was- vierung von CaL B durch Triton X 100 kann sermolekülen oder aber von einem iso- ebenfalls durch die bereits erfolgte Röntgen- Propanol Molekül (es befanden sich 20 % iso- strukturanalyse in Anwesenheit von Tween 80 Propanol in der Präzipitans-Lösung) besetzt (Uppenberg et al., 1994a) strukturell interpre- werden könnte. Diese putative Bindungsstelle tiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass befindet sich direkt im aktiven Zentrum zwi- ein Tween 80 Molekül an die "Lid"-Helix a5 schen den Restes Ile 285 und Leu 278, also bindet und die offene Form stabilisiert. In exakt an der Position des Phenylrings des Phe- Strukturen ohne zugesetztes Detergens ist die nylethylamid-Inhibitors in der Bindetasche "Lid"-Helix dagegen ungeordnet und in der (siehe Abbildung 5.20). Diese Vermutung Elektronendichte nicht sichtbar, wenn sie nicht einer Bindung von iso-Propanol wurde bereits durch in der 1994 veröffentlichten nativen Struktur Kristallkontakte stabilisiert werden kann, wie z.B. in der vorliegenden Arbeit in 97 Kapitel 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B Kapitel 5.4 für die native Lipase gezeigt wer- detasche anzunehmen. Daher liefert dieses den konnte. Ergebnis der Röntgenstrukturanalyse den Hinweis, dass die CaL B vermutlich nicht oder 6.3 Komplex-Strukturen mit zumindest deutlich schlechter in der Lage ist, enantiomerenreinen das langsamer reagierende S-Enantiomer im Inhibitoren tetraedischen Zustand zu stabilisieren. Diese Hypothese steht im Einklang mit dem klassi- Die erfolgreiche Strukturbestimmung der CaL schen Modell des Schlüssel-Schloss Prinzips B im Komplex mit beiden diastereomeren von Emil Fischer der enzymatischen Katalyse, Sp(Rc/Sc)- wonach die Stabilisierung des Übergangszu- Phenylethylamid-Inhibitor Komplexes in der stands entscheidend für die Erniedrigung der Bindetasche der CaL B sollte Informationen Aktivierungsenergie ist. Formen des tetraedrischen über die tatsächlichen Struktur-AktivitätsIn Abbildung 6.2 ist die optimale Einpassung beziehungen liefern, da alle kinetischen Daten der Methylgruppe am stereogenen Zentrum des auf die Beteiligung des tetraedrischen Interme- Rc-Phenylethylamid-Inhibitors (rechts) in der diates am enantioselektiven Schritt der Kataly- Stereospezifitätstasche gezeigt. Im Vergleich se hindeuten. Nach einigen Schwierigkeiten dazu ist in der linken Bildhälfte eine Überlage- bei der Züchtung von Kristallen in ausreichen- rung von zwei denkbaren Konformationen des der Qualität (siehe Abschnitt 1 der Diskussion) langsamer reagierenden Rc-Phenylethylamid- und der Gewinnung von Messdaten geeigneter Inhibitors gezeigt. kristallographischer Auflösung ist es gelungen, unter Verwendung von hochenergetischer Die Auswertung der von Dr. K. Ditrich (BASF Synchrotronstrahlung drei ausreichend aufge- AG, Hauptlabor) zur Verfügung gestellten löste Datensätze für das native Enzym und Daten zur Temperaturabhängigkeit der kineti- beide Komplexstrukturen am DESY in Ham- schen Racematspaltung von Phenylethylamin burg aufzunehmen. Die Auswertung lieferte zeigt in der Summe der freien Differenz- allerdings ein unerwartetes Ergebnis. aktivierungsenergie die Bevorzugung des RcEnantiomers um -4,6kcal/mol. Noch erstaunli- Obwohl mit Hilfe massenspektrometrischer cher ist die Absenkung des Übergangszustands Untersuchungen eindeutig nachgewiesen wur- um -7,9 kcal/mol durch den enthalpischen de, dass beide Inhibitoren kovalent an das En- Beitrag, d.h. die Katalysegeschwindigkeit wird zym binden, kann ein Teil des Sc-Inhibitors in durch die korrekte Konfiguration der chiralen der auf 0,9 s konturierten 2Fo-Fc Elektronen- Methylgruppe theoretisch um einen Faktor von dichte (Abbildung 5.21) nicht zugewiesen 105 beschleunigt, wenn angenommen wird, werden. Das langsamere Enantiomer scheint dass der entropische Einfluss vernachlässigt demnach eine Unordnung über mehrere Kon- werden könnte. Eine Reihe von Untersuchun- formationen in diesem Molekülteil in der Bin98 Kapitel 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B gen in der neueren Literatur zeigen, dass für eines Teils der "Transition-State"-analogen das Beispiel der CaL B gerade der entropische Inhibitoren andeutet und durch verschiedene Faktor einen grossen, negativen Einfluss auf Computersimulationen untermauert wird. die Enantioselektivität nimmt (Haeffner et al., Insgesamt wird aber der entropische Teil durch 1998; Ottosson & Hult, 2001). Bei der im Ka- den enthalpischen Teil überkompensiert. Es pitel 5.2 beschriebenen Auswertung des entro- wird ein Wert von -4,6 kcal für die freie Diffe- pische Anteils an der freien Differenzaktivie- DR-SDG# bestimmt. rungenthalpie DR-SDS# mit einem experimentell renzaktivierungsenergie bestimmten Wert von -TDR-SD S#= 3,3 Die optimale Passform, die zu einer enthalpischen Begünstigung des R-Substrates führt, kcal/mol bei 25°C zeigt sich, dass dieser Teil kostet ihrenPreis in einem hohen entropischen dem enthalpischen Beitrag entgegenwirkt. Verlust durch die starke Fixierung dieses Substrats im tetraedrischen Intermediat. Dies kann so interpretiert werden, dass bei der Bildung des tetraedrischen Intermediates des Die langsamer reagierenden S-Substrats weniger Bedeutung der Konformation des tetraedrischen Übergangszustandes für die Entropie verloren geht und damit die Bindung weitere Reaktion wird auch durch die Betrach- des S-Substrats entropisch begünstigt wird. tung der stereoelektronische Eigenschaften Dies korreliert mit der höheren Restmobilität verdeutlicht (Ema et al., 1998). Hierbei ist es dieses Substrats in der Bindetasche, was sich günstig, wenn der Sauerstoff in der Oxyanio- in der schlecht definierten Elektronendichte nen-Höhle in einer anti-Geometrie zur Methyl- S-Amin O R-Amin HN O Ser105 Stereospezifitätstasche NH O N O O NH O His224 Ser105 Stereospezifitätstasche NH N NH His224 Abb. 6.2: Hypothese zur unterschiedlichen Stabilisierung des kovalent an Ser 105 gebundenen tetraedrischen Phosphonamid-Inhbitors. Rechts ist die ideale Geometrie aus der experimentellen Röntgenstruktur der CaL B im Komplex mit dem R-Amid-Inhibitor gezeigt. Die chirale Methylgruppe wird in der Stereospezifitätstasche gebunden und das Amid bildet ein Wasserstoffbrücke zum katalytischen His224 aus. Links ist ein Ensemble aus unterschiedlichen Konformationen angedeutet, das in der Röntgenstrukturanalyse nicht aufgelöst werden konnte. 99 Kapitel 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B gruppe am stereogenen Zentrum steht, da sonst ungünstige Wechselwirkungen auftreten. 100 Kapitel 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B zur qualitativen computergestützen Vorhersage 6.4 Computergestütze Kon- der Enantioselektivität einer kinetischen Ra- formationssuche und cematspaltung von sekundären Alkoholen mit MD-Simulationen Ps. cepacia Lipase(Schulz et al., 2000) bzw. Candida rugosa Lipase (Schulz, Schmid & In dem Bereich, in dem der Sc-Inhibitor mit Pleiss, 2001) korreliert werden konnte, ge- einem Phenylethylrest binden sollte, ist die winnt im Zusammenhang mit der Restmobilität Elektronendichte nur schlecht definiert. Zu- des tetrahedralen Intermediats in der Bindeta- sammen mit den kinetischen und thermodyna- sche und dem postulierten Verlust eben dieser mischen Daten ergibt sich daraus die Hypothe- Wasserstoffbrücke noch mehr an Bedeutung. se, dass dieser Molekülteil im Protein eine hohe Mobilität zeigt. Dies wird durch alle ver- Gegenüber dem in der Literatur anhand von wendeten, computergestützten Methoden zur Strukturen der Candida rugosa Lipase im Konformationsanalyse untermauert. Sowohl Komplex mit R- bzw. S-Menthyl-Inhibitoren Docking Methoden (FLEXX) als auch die (Cygler et al., 1994) abgeleitetem Modell der systematische Suche nach möglichen Konfigu- "Kollision" der chiralen Gruppe mit dem kata- rationen durch die Rotation um die drehbaren lytischen Histidin (Abb.3.2) als enantioselekti- Bindungen im tetreadrischen Intermediat wei- vitätsbestimmendem Faktor kann unter Einbe- sen darauf hin, dass es deutliche Unterschiede ziehung aller experimentellen Ergebnisse ein im zugänglichen Konfigurationsraum der bei- erweitertes Modell aufgestellt werden. Dieses den enantiomeren Substrate in der Bindetasche Modell, das nicht nur die statische, durch die gibt. Insbesondere die aus der MD-Simulation Bindungsenergie aller beteiligten Spezies gezogenene Schluss- tetrahedralen folgerung, dass hauptsächlich das tetrahedrale sondern auch den Einfluss der durch die Rest- Intermediat am geschwindigkeits- und selekti- mobilität bestimmten Entropiebeitrags berück- vitätsbestimmenden Schritt der kinetischen sichtigt, gibt die experimentell bestinmmten Racematspaltung beteiligt ist, wird auch durch thermodynamischen Parameter qualitativ rich- die experimentellen "Burst"-Kinetiken und die tig wieder. festgelegte Intermediates Struktur des berücksichtigt, Geschwindigkeit der Inhibition durch die "Transition-State"-analogen Phosphonamide in Interessant ist vor allem die Tatsache, dass die Abhängigkeit der Stereochemie des Pheny- erst im September 2001 erschienene Analyse lethylamids gestützt. der experimentellen thermodynamischen Daten einer bereits lange bekannten Mutation Insgesamt zeichnet sich ein differenzierteres Trp104His (Patkar et al., 1998) einen extremen Bild der enantioselektiven Substraterkennung Anstieg des entropischen Beitrags zur Enantio- ab. Die Bedeutung der katalytischen Wasser- selektivität (Ottosson et al., 2001) zeigen. Da stoffbrücke vom Histidin zum Amid bzw. Es- dieser Term, wie oben ausgeführt, die tatsäch- ter, deren Länge bereits in einer anderen Studie 101 Kapitel 6 Diskussion und Ausblick Candida antarctica Lipase B lich beobachtete Enantioselektivität negativ schwindigkeit um einen Faktor von >1000 beeinflusst, sinkt der gemessene E-Wert des bewirkt. Die aufgestellte Hypothese, dass die Enzyms folglich von 970 auf 150 ab. Dieses chirale Gruppe in diesem Beispiel direkt auf Verhalten kann im Rahmen des postulierten das katalytische His224 zeigt, konnte durch die Modells zwanglos erklärt werden, denn die gut aufgelöste Röntgenstruktur des R-Phenyl- leichte Vergrösserung der Stereospezifitätsta- ethylamid-Inhibitors bestätigt werden. sche führt vermutlich zu einer deutlichen VerDies steht im Gegensatz zu den aus der Rönt- grösserung des zur Verfügung stehenden Kon- genstruktur der Candida rugosa Lipase im figurationsraumes für das S-Enantiomer. Komplex mit beiden enantiomeren Formen des Menthyl-Inhibitors gezogenen Schluss- folgerung, dass die unvorteilhafte sterisch re- 6.5 Ausblick pulsive Interaktion des langsameren Stereoisomers mit der katalytischen Triade die Ste- Das vorgeschlagene Modell der enantioselek- reoselektivität determiniert. Dieses Modell tiven Substraterkennung zeigt, dass selbst einvermeintlich gut untersuchter erscheint aus geometrisch-enthalpischen Grün- Enzym- den sehr plausibel. mechanismus, wie der Mechanismus der Serinhydrolasen, im Detail schwer zu interpretie- Im vorliegenden Beispiel ist aber keine Inter- ren ist. Insbesondere die bisherigen Arbeiten aktion des kleinen Methylrestes mit Resten der zur Computer-gestützten Vorhersage der Enan- Triade möglich, sondern es wurde die gegen- tioselektivitäten müssen neben den enthalpi- teilige Beobachtung gemacht, dass gerade im schen Beiträgen auch den Einfluss der Entro- schneller reagierenden R-Enantiomer die Me- pie einbeziehen, damit quantitativ korrekte thylgruppe zum His224 in die Stereospezifi- Vorhersagen tätstasche auf das Trp104 hin ausgerichtet ist. getroffen werden können (Kazlauskas, 2000; Rotticci et al., 2001) Aus diesem Grund müssen, wie in der vorliegenden Arbeit am Beispiel der CaL B gezeigt, Selbst wenn alle verfügbaren Informationen auch weitere Kriterien wie der zugängliche gesammelt werden und zusätzlich zur Struk- Konfigurationsraum und die korrekte Ausbil- turbestimmung der Einsatz von Computersi- dung des für die Katalyse erforderlichen Was- mulationen vorangetrieben wird, kann nur serstoffnetzes sowie die stereoelektronischen qualitativ erklärt werden, aus welchen Grün- Eigenschaften für die chirale Diskriminierung den die Konfiguration einer Methylgruppe die verantwortlich gemacht werden kinetische Diskriminierung in der Katalysege- 102 Kapitel 7 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase ERGEBNISSE TEIL II BURK- Analytik : HOLDERIA PLANTARII LIPA- Die Aktivität der Fraktionen wurde mit dem SE Tributerintest bzw. mit p-Nitrophenyl-Acetat (siehe Kapitel 4.3) festgestellt. Zur Kontrolle 7.1. Proteinreinigung und der Reinheit wurde eine SDS-Gelelektrophorese durchgeführt (Abbildung 7.1). Die Auf- Charakterisierung der trennung nach dem Molekulargewicht ergab BpL eine einzelne Proteinbande mit dem Moleku- Ziel dieser Arbeiten war die Expression und largewicht von ca. 33 kDa. Das theoretische Reinigung der BpL zur anschliessenden Kris- Molekulargewicht beträgt 33091.8 Da. tallisation Proteine. Der isoelektrische Punkt der Lipase wurde mit Hilfe einer nativen isoelektrischen Gele- Die Fermentation erfolgte in Kooperation mit der BASF (Dr. T. Friedrich) in einem 20 l lektrophorese (Pharmazia-IEF 5000V, pH 3- Fermenter (INFORS HT) im Biotechnikum des 10) untersucht. Die Auftrennung ergab eine zentralen Hauptlabors, Ludwigshafen. Die Hauptbande bei einem pH-Wert von ca. 6,8 sekretierte Lipase befand sich dabei nach 24 (Abbildung 7.2). Wird die gereinigte Lipase in Stunden stets im Medium der Fermentation einer höheren Konzentration auf das Gel auf- und wurde durch Zentrifugation von den Zel- getragen, so sind eine Reihe von schwächeren len abgetrennt. Banden im pH-Bereich von ca. 6,5 bis 6,8 zu erkennen. Iso-Propanol Extraktion: 7.1.1 BASF Produktionsstamm Das nach der Fermentation und anschliessenDie Fermentation erfolgte mit Sojaöl als Koh- der Zentrifugation noch im Medium vorhande- lenstoffquelle im Nährmedium, um die Induk- ne Sojaöl, die hydrolysierten Fettsäuren und tion der Lipasesekretion zu erreichen. Die Rei- andere hydrophobe Bestandteile wurde durch nigung erfolgte nach dem in Kapitel 4.2.1 be- eine Extraktion des zentrifugierten Mediums schriebenen Reinigungsprotokoll. Die Kristal- mit iso-Propanol entfernt. Das in der wässrigen lisation der BpL konnte mit keiner der aufge- Phase gelöste iso-Propanol konnte durch vor- reinigten Lipasepräparation aus dem BASF sichtiges Destillieren im Rotationsverdampfer Produktionsstamm erreicht werden. entfernt werden. 103 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase gesamt iso-Prop Metall HIC Protein extraktion chelat TSK-butyl Mol Marker kD 97,4 66,4 55,0 42,7 31,0 21,4 Abb. 7.1: SDS-Gelelktrophorese der Lipase des Produktionsstammes in verschiedenen Reinigungsstufen. pH 4,55 5,2 gesamt Protein 3 reine Lipase 5,85 Steigende Konzentration 6,55 6,85 7,35 8,15 8,45 9,3 pH gradient 10 Abb. 7.2:Isoelektrische Fokussierung der Lipase des Produktionstammes Pharmazia IEF, 5000V , pH 3- pH 10. 104 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Bindung an tert-Butyl-sepharose 20 mM Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst und auf Die Lipaselösung wurde mit NH4Ac versetzt eine 20 ml-Säule aufgetragen. Die Elution der und durch vorsichtiges Ausrühren über Nacht Lipase erfolgte mit 1 M NaCl in 20 mM Phos- an das hydrophobe Chromatographiematerial phatpuffer pH 6,0 (Protokoll BASF). tert-Butyl-sepharose (Toyo® TSK-Butyl 650 M) gebunden. Im Überstand konnte nach 12 Isoelektrische Chromatofokussierung: Stunden nur noch geringe Lipaseaktivität Zur Charakterisierung der im IEF entdeckten nachgewiesen werden. Der Überstand wurde Proteinmischung wurde ein Protokoll zur Auf- verworfen und die Lipase im Batchverfahren trennung der einzelnen Proteine nach ihrem mit 25 % iso-Propanol-Lösung vom Säulenma- isoelektrischen Punkt entwickelt. Die chroma- terial abgelöst. tographische Auftrennung erfolgte über eine zur isoelektrischen Chromatographie mit tert-Butyl-sepharose (ICF) Die vorgereinigte Lipaselösung wurde erneut (Mono®P, Pharmazia). mit NH4Ac versetzt und einer hydrophoben Anionenaustauschersäule Die Optimierung der analytische Auftrennung Interaktions-Chromatographie (HIC) unterwor- erfolgte mit einer vorgepackten 1 ml Chroma- fen. Als Säulenmaterial wurde wiederum tert® geeignete Chromatofokussierung tographiesäule MONO®P (Pharmazia) an ei- TSK-Butyl 650M) nem ÄCTA® FPLC System (Pharmazia) mit verwendet. Das Säulenmaterial wurde mit 3 M der Software UNICORN® (Pharmazia). Dabei Butyl-sepharose (Toyo NH4Ac äquilibriert und anschliessend die Li- wurde der pH-Wert des Startpuffers von pH 8 paselösung aufgetragen. Ungebundenes Mate- langsam auf pH 10,5 angehoben, bis das ge- rial wurde mit 1M NH4Ac ausgewaschen. Die samte Protein an das Säulenmaterial gebunden Lipase konnte mit einem Gradienten von 1 M werden konnte. Die Elution erfolgte mit 20 ml NH4Ac zu reinem Wasser eluiert werden. Der Polybufferâ94 (1 zu 13 verdünnt), pH 5-6,5 Verlauf der Elution ist im Diagramm 7.1 dar- (HAc). Die Lipasekonzentration betrug 0,1 mg gestellt. Die so erhaltene Lipaselösung wurde Lipase, gelöst im entsprechenden Startpuffer. im Vakuum gefriergetrocknet. Während der Chromatographie wurde die UVAbsorption bei 280 nm aufgezeichnet und der Metall-Chelat-Chromatographie pH-Wert der Fraktionen von je 1 ml mit einem Die Burkholderia plantarii Lipase enthält ein pH-Meter bestimmt. Calciumion und kann daher über eine MetallChelat-Chromatographie von anderen hydrophoben Proteinen abgetrennt werden. Die Reinigung erfolgte über eine Nickel-ChelatSepharose. Das lyophilisierte Protein wurde in 105 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Die Auswertung des Chromatogramms erfolgte Durch die insgesamt höhere Beladung der Säu- mit der Software UNICORN. Die detektierten le und der damit verbundenen Verbreiterung Absorptionspeaks wurden integriert, um den der eluierten Proteinbanden konnten nur noch Proteingehalt abzuschätzen. vier Proteinfraktionen voneinander getrennt werden. Der Durchlauf zeigte keinen Durch- 1. Lauf : (Diagramm 7.2) Startpuffer 25mM TRIS pH 8 Elutionspuffer PB94 pH 5 Durchlauf : 2 Peaks Elution : 2 Peaks bruch von nicht gebundenem Protein, so dass insgesamt die Kapazität des Säulenmaterials nicht überschritten wurde. Aktivitätsmessungen zeigten, dass es sich bei allen vier Proteinen um Iso-Lipasen handelte, da jeweils dieselbe Aktivität festgestellt wurde. 2. Lauf : (Diagramm 7.3) Startpuffer 25mM TRIS pH 9 Elutionspuffer PB94 pH 6 Durchlauf : 2 Peaks Elution : 5 Peaks Das Molekulargewicht der so aufgetrennten Iso-Lipasen ist auf einem SDS-Gel nicht unterscheidbar. Die N-terminale Ansequenzierung der Proteine im Proteinlabor der BASF (T. Brugger) zeigte in allen untersuchten Fraktionen die für die 3. Lauf : (Diagramm 7.4) Startpuffer : 25mM Ethanolamin pH 10,5 Elutionspuffer PB94 pH 6,5 Durchlauf : 0 Peaks Elution : 7 Peaks Burkholderia plantarii Lipase erwartete Sequenz. N-terminale Sequenzierung 1pmol (BASF) Nach der gelungenen analytischen Proteintren- SDS- Bande ca. 33kDa , 25AS nung wurde versucht, eine Menge von insgesamt 4 mg Lipase zur Kristallisation mit dieser ADTYAATRYPVILVHGLAGTDKFAN Methode aufzutrennen. Angegeben ist jeweils die N-terminale AS4. Lauf: (Diagramm 7.5) Startpuffer 25mM Ethanolamin pH 10,5 Elutionspuffer PB94 pH 6,5 Durchlauf : 0 Peaks Elution : 4 Peaks Sequenz im Einbuchstabencode. 106 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Diagramm 7.1: Chromatogramm der IEC des Produktionsstammes über MONO®P Startpuffer 25 mM TRIS pH 8 , Elution mit PB94 pH 5 Diagramm 7.2: Chromatogramm der IEC des Produktionsstammes über MONO®P Startpuffer 25 mM Ethanolamin pH 9, Elution mit PB94 pH 6 107 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Diagramm 7.3: Chromatogramm der IEC des Produktionsstammes über MONO®P Startpuffer 25mM Ethanolamin pH 10,5 , Elution mit PB94 pH 6 0 Diagramm 7.4: Chromatogramm der präparativen IEC über des Produktionsstammes über MONO®P Startpuffer 25mM Ethanolamin pH 10,5 , Elution mit PB94 pH 6 , 4 mg Lipase 108 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Molekulargewichtsdifferenz von 74 Da könnte 7.1.2 Wildtyp durch eine Abspaltung des N-terminalen AlaDie Fermentation des Wildtyps erfolgte mit nins (71 Da) bei einem Teil der Proteinmenge Sojaöl als Kohlenstoffquelle im Medium, um hervorgerufen worden sein. die Induktion der Lipasesekretion zu erreichen. In 14 l Medium waren ca. 300 mg Lipase ent- Die N-terminale Ansequenzierung nach dem halten aus dem nach vier Reinigungsschritten Blot auf eine PVDF-Mebran ergab die eindeu- noch 60 mg Lipase erhalten wurde. Die Reini- tige Identifizierung der Bande bei 33 kDa als gung erfolgte nach dem in Kapitel 4.2.2 be- Burkholderia schriebenen Reinigungsprotokoll. terminale Sequenz des zweiten Proteins mit plantarii Lipase. Die N- einem Gewicht von ca. 60 kDa konnte durch Auch mit der aus dem Wildtypstamm gereinig- Sequenzvergleiche in der Swiss-Prot Daten- ten Lipase konnten in keiner Reinigungsstufe bank nicht eindeutig zugeordnet werden. Kristalle erhalten werden. N-terminale Sequenzierung 1pmol (BASF) Analytik Die Aktivität der Fraktionen wurde mit dem Tributerintest bzw. mit p-Nitrophenyl-Acetat Erste Bande ca. 33kDa, 25AS festgestellt. Zur Kontrolle der Reinheit wurde eine SDS-Gelelektrophorese ADTYAATRYPVILVHGLAGTDKFAN durchgeführt (Abbildung 7.3). Die Auftrennung nach dem Molekulargewicht ergab zwei einzelne Prote- Zweite Bande ca. 60kDa 25 AS inbanden mit dem Molekulargewicht von ca. STPDFTNFPPTSFDAVASVTG - LRM KP L AY T A G 33 kDa und ca. 60 kDa. Das theoretische Molekulargewicht der BpL beträgt 33091.8 Da. Die exakte Masse wurde in der mas- Angegeben ist jeweils die N-terminale AS- senspektrometrischen Abteilung der BASF Sequenz im Einbuchstabencode. Nicht eindeu- (Dipl. Ing. Sabine Bomm) mit der Methode der tig bestimmbare AS sind durch ein Minus ge- Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie kennzeichnet, alternative Aminosäuren sind (ESI-MS) untersucht. In Abbildung 7.4 ist das untereinander aufgeführt. Massenspektrum einer Lipase dargestellt. Mit Hilfe dieser Methode konnten innerhalb der Auflösungsgrenzen von ca. 5 Da zwei verschiedene Lipasen mit einer Masse von 33094 und 33168 identifiziert werden. Die errechnete 109 Kapitel 7 Spur 1 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase 2 3 4 MM 202 133 77 41,8 30,6 17,8 6,9 kDa Abb. 7.3: SDS- PA-Gel-Elektrophorese : Gezeigt ist die SDS-PAGE von verschiedenen Lipasepräparationen aus dem Expressionstamm Spur (1) ungereinigt (2) hochgereinigt und dem Wildtyp in Spur (3) ungereinigt. In Spur (4) ist ein pH Marker (Biorad Kaleidoscope). Abb. 7.4: ESI-MS der BpL nach der IEC Peak 1b Fraktion 4 bei 13,27 ml Peak 2 unbekanntes Protein Peak 1 a/b Lipase Diagramm 7.5: Chromatogramm der IEC des Wildtyps über MONO®P Startpuffer 25mM Ethanolamin pH 10,5 , Elution mit PB94 pH 6 0,1 mg Lipase Peak 1 bei 12,06ml pH 8,5 Lipase Peak 2 bei 16,75ml pH 7,1 unbekanntes Protein 110 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Iso-Propanol Extraktion Proteine mit deutlich abweichendem isoelektri- Das nach der Fermentation noch im Medium schen Punkt getrennt werden. Auch in der aus vorhandene Sojaöl, die hydrolysierten Fettsäu- dem Wildtyp gereinigten Lipase wurde ein ren und andere hydrophobe Bestandteile wur- kleiner Peak in einem Abstand von ca. 0.5 pH- den durch eine Extraktion des zentrifugierten Einheiten in der analytischen IEC festgestellt. Mediums mit iso-Propanol entfernt. Das in der wässrigen Phase gelöste iso-Propanol konnte Peak 1 pH 8,5 Lipase Peak 2 pH 7,1 unbekanntes Protein durch vorsichtiges Destillieren im Rotationsverdampfer entfernt werden. Die präparative Chromatofokussierung konnte aufgrund des deutlichen Unterschieds der isoelektrischen Punkte der zu trennenden Proteine Bindung an tert-Butyl-sepharose mit Hilfe einer selbstgepackten Säule (XK16, Die Lipaselösung wurde mit NH4Ac versetzt 20 ml) mit PolybufferâExchanger (PBEâ) er- und durch vorsichtiges Ausrühren über Nacht folgen (Diagramm 5.5). Diese Säulenmaterial an das hydrophobe Chromatographiematerial besitzt die gleichen Eigenschaften wie das tert-Butyl-sepharose (Toyo® TSK-butyl) ge- vorher verwendete MONO®P, lediglich die bunden. Im Überstand konnte nach 12 Stunden erreichbare analytische Trennschärfe ist laut nur noch geringe Lipaseaktivität nachgewiesen Herstellerangaben mit max. 0,2 pH Einheiten werden. Der Überstand wurde verworfen und Auflösung geringer. die Lipase im Batchverfahren mit 25 % isoPropanol vom Säulenmaterial abgelöst und das Chromatographie mit tert-Butyl-sepharose iso-Propanol abdestilliert. Die vorgereinigte Lipaselösung wurde erneut mit 1 M NaCl versetzt und einer hydrophoben Chromatofokussierung: Interaktions-Chromatographie (HIC) unterwor- Die analytische Chromatofokussierung erfolgte fen, um den Polybuffer 94 zu entfernen. Als nach dem für den Produktionsstamm etablier- Säulenmaterial wurde wiederum tert-Butyl- ten Protokoll. Als Startpuffer wurde 25 mM sepharose (Toyo® TSK-butyl) verwendet. Das Ethanolamin pH 10,5 verwendet. Eine Probe Säulenmaterial wurde mit 1M NaCl äqui- der aus dem vorangegangenen Schritt erhaltene libriert und anschliessend die Lipaselösung Lipaselösung wurde 1:10 mit dem Startpuffer aufgetragen. Ungebundenes Material wurde verdünnt und auf ein 1 ml Säule MONO®P mit einem Gradienten von 1 M zu 0,1 M NaCl (Pharmazia) aufgetragen. Anschliessend wurde ausgewaschen. Die Lipase konnte mit einem mit 1 ml Startpuffer ungebundenes Material Gradienten von 0,1 M NaCl zu reinem Wasser ausgespült und mit 20 ml PB94 pH 6,5 das eluiert werden. Der Verlauf der Elution ist im Protein eluiert. Wie aus dem Chromatogramm Diagramm 7.5 dargestellt. in Abbildung 5.6 ersichtlich, konnten zwei 111 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Die so erhaltene 30 ml Lipaselösung mit einem a) Ölsäure Vorkultur-Medium Gehalt von 2 mg/ml Burkholderia plantarii Lipase und einer Aktivität von 0,1 mOD405/min Zusatz OD600 gegen p-Nitrophenylacetat wurde zur weiteren -- 0,34 8 Verwendung bei 6°C gelagert. C4+C6+C8+Palm. 0,67 13 C4 (nicht gewachsen) -- -- Die aus dem Wildtyp erhaltenen Lipasepräpa- C4 + Palm 0,93 20 rationen konnten nicht kristallisiert werden. C6 0,58 3 C6 + Palm 2,35 20 C8 1,27 3 C8 + Palm 2,0 42 Fermentationsbedingungen: (12 h) Aktivität U/ml (24h) C4-8 = N-Acyl-Homoserinlacton mit Acylkettenlänge 4-8 Da die Ausbeute an Protein mit 300 mg aus 14 Palm = Palmitinsäure l Medium um eine Größenordnung geringer b) Sojaöl Fermenter-Medium war als die aus dem Produktionsstamm erhaltenen Menge, wurde versucht, die Lipasepro- Zusatz OD600 gezeigt werden (Riedel et al., 2001), dass ins- -- 0,8 14 besondere C4+C6+C8+Palm. 1,8 6 C4 1,2 20 C4 + Palm 1,2 9,5 C6 0,9 11 induzieren können. Analog dazu wurde ver- C6 + Palm 0,9 9,6 sucht, die Proteinmenge im Medium zu stei- C8 1,1 11 gern, indem zusätzlich zum Ölsäuremedium N- C8 + Palm 1,1 7 duktion zusätzlich zu induzieren. Es konnte langkettige N-Acyl-ho- moserinlactone (HSL) als Signalmolekül im "Quorum-Sensing" die Sekretion von Lipasen Acyl-HSL mit verschiedenen (24 h) Aktivität U/ml (24h) C4-8 = N-Acyl-Homoserinlacton mit Acylkettenlänge 4-8 Acyl- Palm = Palmitinsäure Kettenlängen (C4, C6 und C8) zugegeben Die Erhöhung der Aktivität in der Versuchen wurden. im Vorkultur-Medium (a) zeigt Palmitinsäure Gleichzeitig wurde der Einfluss der Anwesen- als essentiellen Faktor; das konnte in den Ex- heit von Palmitinsäure (Bestandteil des Soja- pressionen im Fermentationsmedium mit Soja- öls) im Medium untersucht. öl (b) nicht bestätigt werden. Sojaöl enthält bereits 5 – 10 % veresterte Palmitinsäure, so Die Ergebnisse von verschiedenen 100 ml dass vermutlich diese Komponente eine Stei- Testkulturen, die jeweils über 24 h bei 30 °C gerung der Sekretion im Fermenter-Medium bei 200 U/min fermentiert wurden, sind in der bewirkt. Durch Zugabe von C4-N-Acyl HSL nachfolgenden Tabellen zusammengefasst. Die konnte die Lipaseausbeute nochmals um den Zelldichte wurde über die OD600 bestimmt, die Faktor 1,5 gesteigert werden. Bei der Testfer- Aktivität in Tributerin-Units (siehe 4.3.1). mentation in 14 l Medium wurde nahezu eine Verdopplung der Aktivität festgestellt. 112 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Es konnte kein Unterschied zum Wildtypen- 7.1.3 Rekombinante zym festgestellt werden. Bpl-Mutante F142W Die Fermentation der rekombinant, homolog 7.1.2.1 Abtrennung der Zellen im Wildtyp exprimierten Lipase erfolgte mit Die Zellbestandteile wurden durch eine Zentri- Glucose als Kohlenstoffquelle im Medium. fugation des Fermentermediums und eine anDas Lipase-Gen Lip A wurde von Dr. Markus schliessende Filtration über eine Filterfritte Matuschek (BASF AG, ZHF) auf einem von erreicht. Die Lipase verbleibt im Medium. pML131 abgeleitetem Plasmid (Labes, Puhler & Simon, 1990) mit einem zusätzlichen Gen- 7.1.2.2 Hydrophobe Interaktions- tamycin-Resistenzgen in den Wildtyp eingebracht. Die Chromatographie über TSK-butyl Induktion der Lipasesekretion Der Fermenterüberstand wird mit 1 M NaCl erfolgte konstitutiv, das chromosomale Wild- versetzt und einer hydrophoben Interaktions- typ-Gen wurde ohne Anwesenheit von Fettsäu- Chromatographie (HIC) unterworfen. Als Säu- ren nicht exprimiert. In 14 l Medium waren ca. lenmaterial wurde tert-Butyl-sepharose (Toyo® 30 mg Lipase enthalten, woraus nach zwei TSK-Butyl 650 M) verwendet. Das Säulenma- Reinigungsschritten noch ca. 10 mg der Lipa- terial wurde mit 1 M NaCl äquilibriert und se-Mutante F142W erhalten wurde. Die Reini- anschliessend die Lipaselösung aufgetragen. gung erfolgte nach dem in Kapitel 4.2.2 be- Ungebundenes Material wurde mit 1 M NaCl schriebenen Reinigungsprotokoll. Mit der re- ausgewaschen. Die Lipase konnte mit einem kombinanten, homolog im Wildtypstamm ohne Gradienten von 1 M NaCl zu reinem Wasser Zugabe von Fettsäuren exprimierten Lipase- eluiert werden. Die noch am Material gebun- Mutante konnten nach zwei Reinigungsstufen dene Lipase konnte mit 20 % Ethanol eluiert Kristalle erhalten werden. werden. Der Verlauf der Elution ist im Diagramm 7.6 dargestellt. Insgesamt wurden aus Analytik 10 l Fermenterüberstand ca. 10 mg Lipase Die erhaltenen Lipase wurde anhand der SDS- isoliert. Gelelektrophorese als homogenes Protein mit einem Molekulargewicht von 32 kDa identifi- Die so erhaltene Lipaselösung wurde bei 6°C ziert (Abbildung 7.5). Die analytische Chroma- bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. tofokussierung über MONO® P zeigte ebenfalls nur eine Bande bei einem pH-Wert von 8,5. Dies entspricht dem erwarteten Wert für die Burkholderia plantarii Lipase. 113 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase 3 4 1 2 7 5 6 1 2 3 4 5 6 7 Diagramm 7.6: Elutionsdiagramm der Enzymreinigung von BPL F142W über TSK-butyl. Die Absorbtion bei 280nm wurde kontinuiertlich aufgezeichnet (blaue Kurve). Die Elution erfolgte mit einem Gradienten von 1M NaCl zu 0,1M NaCl und zu reinem Wasser (braune Kurve). Ab einem Volumen von 1000ml wurde mit 20 % EtOH die gebundene Lipase eluiert. Insgesamt wurden 20 Fraktionen gesammelt (magenta markiert). Die mit 1-7 markierten Banden wurden über das in Abb 7.5 gezeigte SDS-Gel charakterisiert. 1 Vorlauf 1 2 Vorpeak 3 Frac 1-4 Marker 97,4 66,2 39,2 4 5 6 7 Frac 8-9 Frac12-13 Frac14-19 Frak 6-7 f 12 13 f 16 18 26,6 21,4 14,4 Abb. 7.5: SDS- Page (10 % Polyacrylamid,Coomassie) der Enzymreinigung von BPL F142W über TSKButyl Auftrag : je 5 µl Protein-Lösung + 10 µl SDS Probenpuffer, Marker Roche, 10 µl (10 µg pro Protein). 114 Kapitel 7 7.2 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Enzymkinetik IC 50 BpL Fehler % Lsgm. IC 50 Fehler mM Die im Kapitel 5.2 für die CaL B beschriebe- Methanol 17 0.29 6.74 0.12 nen Methoden konnten auch für die Bestim- Ethanol 14.2 1.00 3.93 0.28 Acetonitril 10.6 0.78 3.30 0.24 Aceton 14.1 0.76 3.07 0.17 iso-Propanol 12 0.64 2.54 0.14 THF 11.1 0.46 1.73 0.07 Dioxan 14.1 0.81 1.55 0.09 BpL F142W IC 50 Fehler IC 50 Fehler Acetonitril 11.2 1.17 3.48 0.36 Aceton 15.3 0.95 3.33 0.21 Ethanol 11.9 0.9 3.29 0.25 mung der kinetischen Parameter der Burkholderia plantarii eingesetzt werden. 7.2.1 Michaelis-Menten-Kinetik Die steady-state-Parameter für das verwendete p-Nitrophenolat wurden bei 25 °C mit 10 % Acetonitril, 25 mM Tris pH 7,5 10 Mm CaCl2. wie bereits in Kapitel 5.2 für die CaL B gemessen. BpL % Lsgm. mM Methanol 7.9 2.09 3.13 0.83 KM Vmax Dioxan 18.4 0.9 2.02 0.10 mM p-NPA Ans 405/min THF 11.8 0.6 1.84 0.09 0.167 ± 0.036 0.080 ± 0.0056 iso-Propanol 5.5 0.63 1.16 0.13 7.2.3 Aktivierung durch 5.2.2 Lösungsmittelabhängigkeit Detergenzien Zur Bestimmung des Einflusses organischer Analog zu der oben beschrieben Aktivitätsbe- Lösungsmittel auf die Aktivität von Lipasen stimmung unter Zugabe von organischen Lö- wurde die Hydrolyse von p-Nitrophenyl-Acetat sungsmitteln wurde der Einfluss von Deter- in wässrigen Lösungsmittelgemischen unter- genzien sucht. Die Konzentration der untersuchten Nitrophenylacetat untersucht. auf die Hydrolyse von p- Lösungsmittel variierte zwischen 5 % und Für die BpL war keine Aktivierung durch die 40 %. (Volumenprozent) Anwesenheit der nichtionischen Detergenzien Die Aktivitätsbestimmung wurde für BpL und Triton X 100 und b-Octyl-glycopyranosid die Mutante BpL F142W für die in der nach- festzustellen. Die Zugabe beliebiger Konzent- folgenden Tabelle aufgeführten Lösungsmittel rationen von Triton X 100 im Bereich von bestimmt. Die Tabelle ist nach zunehmender 0,01-0,5 % führte zu einer Verringerung der Inhibierung geordnet. Aktivität um den Faktor 10, b-Octyl- glycopyranosid zeigte keinen Einfluss. 115 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Durch die Mutation in der "Lid"-Region sollte 7.2.4 Burst-Kinetik es ermöglicht werden, die KonformationsändeUm den geschwindigkeitsbestimmenden rung des Deckels der Lipase von der geschlos- Schritt der Ester- bzw. Amidspaltung durch sene in die offenen Konformation der "Lid"- Lipasen zu bestimmen, wurden für die BpL Helix durch eine Änderung im Fluoreszenz- Stopped-Flow-Experimente der Hydrolyse von spektrum beim Übergang vom Tryp142 in eine verschiedenen einer solvensexponierte Lage (Aung et al., 2000) in Zeitauflösung von 1 msec bis 100 sec durchge- der offenen Konformation zu beobachten. Un- führt, wie bereits für die CaL B in Kapitel 5.2 tersuchungen beschrieben wurde. Für die untersuchten Be- spektrums zeigten keinen signifikanten Unter- dingungen konnte für keines der verwendeten schied im Vergleich zum Wildtypenzym. Das Substrate ein initialer "Burst" oder initialer Fluoreszenz-Emmisionsspektrum bei der An- "Lag" in der "pre-steady-state"-Kinetik für die regungswellenlänge von 280nm wird durch die Reaktionsgeschwindigkeit beobachtet werden. Anwesenheit eines zusätzlichen Tryptophan- Die BpL-Mutante rings nicht ausreichend verändert. Die Gesamt- F142W zeigte keine signifikanten Unterschie- fluoreszenz verändert sich durch das Einbrin- de im Reaktionsverlauf; es konnte kein initialer gen eines zusätzlichen Tryptophans nicht, da "Burst" oder "Lag" festgestellt werden. bereits 3 Tryptophanreste und 10 Tyrosinreste ebenfalls Modellsubstraten untersuchte mit des Fluoreszenz-Emmisions- im Wildtypenzym vorhanden sind. Es kann Wie in der Einleitung in Abschnitt 2.5.2 ausge- aber davon ausgegangen werden, dass sich die führt wurde, kann damit ausgeschlossen wer- Konformation des Enzyms in Lösung in der den, dass die Deacylierung des Acyl-Enzyms Umgebung dieser 3 Tryptophane im Vergleich unter den untersuchten Reaktionsbedingungen zum Wildtyp durch die Mutation nicht verän- der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der dert hat. Einen Ansatz, die Veränderung der lipasekatalysierten Hydrolyse ist. Da auch kein Fluoreszenz des zu beobachten, wäre daher das "initial Lag" beobachtet wurde, ist unwahr- Einbringen von zusätzlichen Mutationen, um scheinlich, dass die Substratbindung bzw. ein die im Wiltypenzym vorhandenen Tryptophan- vorhergehender Isomerisierungsschritt wie z.B. reste gegen nichtfluoresziernde Phenylalanin- die Überführung der Lipase vom geschlosse- reste auszutauschen, so dass nur das ge- nen in den offenen Zustand der Lipase ge- wünschte Trp142 im Enzym vorhanden ist. schwindigkeitsbestimmend ist. Diese Strategie konnte bereits erfolgreich mit einer anderen Lipase für Untersuchungen der 7.2.5 Fluoreszenzuntersuchung der BpL F142W Fluoreszenzlebensdauer-änderung eines Tryp- Die Mutante F142W der Burkholderia plantarii tophanrestes in der "Lid"-Region beim Über- Lipase enthält ein zusätzliches Tryptophan in gang in die offene Konformation angewandt der "Lid-Region" (siehe auch Kapitel 7.4 werden (Zhu, Jutila & Kinnunen, 2000; Zhu et Röntgenstruktur der BpL Mutante F142W). al., 2001a). 116 Kapitel 7 7.3 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase mer mit Sp-Konfiguration aus dem Gemisch Kovalente Inhibition von mit dem Enzym reagiert. BpL Nur die Diastereomerengemische mit racemiDie im Kapitel 5.3. beschriebenen Phosphon- scher Konfiguration am Phosphor und R- Inhibitoren wurden nach dem gleichen Proto- Konfiguration koll ebenfalls zur Inhibition der Burkholderia des Phenylethylalkohol-rests waren in der Lage, das Enzym vollständig zu plantarii Lipase eingesetzt. inhibieren. Die Pheneylethylamid-Inhibitoren Es zeigte sich, dass die Geschwindigkeit der zeigten nur schwache Inhibierung, wie im Dia- Inhibierungsreaktion von der Stereochemie des gramm 7.6 dargestellt ist. Inhibitors abhängt. Im Inhibitor liegen zwei Inhibitoren mit Naphtylamin reagieren in 24 h Stereozentren vor, eines am Phosphor und ein nicht vollständig mit dem Enzym und es wurde zweites im Amid-bzw. Alkoholrest. Im Fall der keine Abhängigkeit von der Stereochemie des Alkohole konnten die Diastereomerengemi- Alkohol-Rests beobachtet. sche nicht getrennt werden und es wurden am Phosphor racemische Gemische eingesetzt. Es kann aber davon ausgegangen werden, dass, wie im Kapitel 5.3 gezeigt, nur das Diastereo- Phenylethyl-Phosphonsäure Inhibitoren 100% 90% 80% Hemmung 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% BpL pH 7 RRamin RRamin (2.) SRamin SRamin (2.) RSamin SSamin Rac,R- Rac,Salk alk 0% 30% 0% 19% 20% 15% 100% 5% Rac,R- Rac,Salk alk Naph naph 67% 90% Diagramm 7.6: Ergebnisse der Inhibierung von BpL bei pH 7 in Abhängigkeit von der Stereochemie der diastereomern Inhibitoren. Nach maximal 24h konnte die Lipase nur von Inhibitoren mit ScKonfiguration am Phenylethylalkohol vollständig inhibiert werden. (O% = nicht detektiert) 117 Kapitel 7 7.4 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase gute Übereinstimmung mit der bereits bekann- Röntgenstruktur der BpL ten Struktur des Wildtyps (Abbildung 7.10a). Mutante F142W Die Mutantion in der "Lid Helix" hat keinen In dieser Arbeit ist es gelungen, Röntgenstruk- Einfluss auf das a/b-Hydrolase Faltungsmus- turen einer Mutante (F142W) der Burkholderia ter. Es wurde, analog zum Wildtyp, die ge- plantarii Lipase in der geschlossenen Konfor- schlossene Konformation erhalten. mation zu bestimmen. BpL F142W Statistik DESY 7.4.1 Burkholderia plantarii Lipase F142W Die Mutante F142W war die erste Lipase aus Auflösung (Å) 30-4,0 Wellenlänge (Å) 0,90497 Raumgruppe C2 Zellparameter (Å) 168.260 dem rekombinanten Wildtypstamm, die in 42.240 ausreichenden Mengen fermentiert, gereinigt 123.180 (°) und kristallisiert werden konnte. 90 92,4 90 Gesamzahl beob. Reflexe 80552 Die Struktur des am DESY (Beamline BW7 Gesamzahl symmetrie-unabh. Reflexe 7526 des Vollständigkeit (%) insgesamt 99,6 konnte bis zu einer Auflösung von 4,0 Å ver- äußere Schale 98,9 messen werden. Die Struktur der nativen Lipa- Rsym -Faktor insgesamt 22,6 äußere Schale 34,6 EMBL) aufgenommenen Datensatzes se wurde aus Kristallen in der Raumgruppe C2 R-Faktor 38,1 mit der Methode des molekularen Ersatzes RMS der Bindungslängen 0,011 durch eine bekannte Modellstruktur der BpL in RMS der Bindungswinkel 1,995 der Raumgruppe P212121 (1tah) mit dem Pro- Zahl der Wassermoleküle 0 gramm CNS gelöst. Die Unterschiede zum Wildtyp werden durch kleine Änderung der Kristallkontakte in der In der Einheitszelle befindet sich ein Dimer neuen Raumgruppe C2 der Mutante im Ver- aus zwei, leicht unterschiedlichen Lipasemo- gleich zu P212121 im Wildtyp bedingt. Der nomeren. Die Mittelungen aufgrund einer Erfolg der Mutation kann durch die Differenz- nichtkristallographischen Symmetrie erbrachte elektronendichte an der Aminosäureposition aber keine Verbesserung des Modells. Zur 142 identifiziert werden. Der Einfluss der Mu- weiteren Verbesserung der initialen Phasen tation auf die lokale Geometrie der "Lid"- wurde eine Maske mit den Modellkoordinaten Region ist nur gering. Die Elektronendichte generiert, um durch die Kombination aus den der solvensexponierten Seite der "Lid"-Helix Modellphasen und den experimentellen Phasen von AS 151-160 ist jedoch nur sehr schlecht eine verbesserte Elektronendichte zu erhalten. definiert und diese Aminosäuren scheinen Die Kristallstruktur der Mutante F142W zeigt einen reduzierten Ordnungsgrad zu besitzen. 118 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Abb. 7.8: Lage der "Lid"-Helix in der geschlossenen Kristallstruktur der BpL Mutante F142W (rot). Das aktive Zentrum wird durch die "Lid"-Helix vollständig ausgefüllt. Zur Orientierung ist die lösungsmittelzugängliche Oberfläche des Bindetasche aus der offenen Struktur von PcL (2lip, grün).eingezeichnet. Phe 142 CLOSED OPEN Phe 142 Active Site Abb. 7.9: Lokale Umgebung des Phe142 in der geschlossenen und offenen Konformation der BpL. Durch die Rotation der "Lid"- Helix wird der Rest Phe 142 an die Oberfläche des Proteins gebracht. 119 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Durch die insgesamt sehr schlechte Auflösung verweist mit Ausnahme der "Lid"-Region auf und einen sehr hohen R-Faktor von 38 % nach gute Übereinstimmung im a/b-Hydrolase- der Verfeinerung ist die Aussagekraft dieser Faltungsmuster. Struktur im Detail als gering einzuschätzen. Da Neuere Untersuchungen konnten die Struktur es sich im Kristall um die geschlossenen Kon- der offenen PcL auch im Komplex mit ver- formation handelt, können keine Aussagen schiedenen, kovalent gebundenen Triacylgly- über die Bindetasche des aktiven, offenen En- cerol-Inhibitoren (Lang et al., 1998) oder chi- zyms getroffen werden. ralen 7.5 Homologiemodellierung sekundären Alkohol-Phosphonat- Inhibitoren (Luic et al., 2001) lösen. Kürzlich ist die Struktur einer weiteren homologen Li- Die Röntgenstruktur der Burkholderia planta- pase aus Pseudomonas aeruginosa (PaL) im rii Lipase ist in Oxford im Labor von Louise Komplex mit einem Triacylglycerol veröffent- Johnson (Noble et al., 1993) gelöst worden. licht worden (Nardini et al., 2000). Diese Lipa- Die "Lid"-Helix zeigt in dieser Röntgenstruk- se gehört jedoch zu der Klasse I.1 der bakteri- tur eine geschlossene, katalytisch inaktive ellen Lipasen. Sequenzvergleiche mit FASTA- Konformation. Die in der vorliegenden Arbeit SAS zeigen eine Homologie von 41 % mit BpL. gelöste Struktur der Mutante F142W zeigt Die Länge der Aminosäurekette ist mit 284 ebenfalls die geschlossene Konformation. Für Aminosäuren in dieser Lipase deutlich gerin- die Protein-Ligand- ger, so dass nicht alle Bereiche des Faltungs- Wechselwirkungen ist jedoch die Geometrie musters überlagert werden können. Es fehlen der Aminosäuren in der offenen, aktiven Kon- die b-Faltblattbereiche b3 und b4 und die formation nötig. Um dennoch Einblicke in eine a-Helix E im kanonischen a/b Hydrolase mögliche Geometrie der Bindetasche in der Faltungsmuster (Abbildung 7.12). Auf der offenen Konformation zu erhalten, bietet sich Grundlage dieser Röntgenstrukturen von zwei die Homologiemodelierung der auf der Basis homologen Lipasen (PcL, 5lip und PaL, 1ex9) der Röntgenstruktur hinreichend ähnlicher in der offenen Konformation mit gebundem Proteine in der offenen Konformation an. Wie Inhibitor wurde versucht, ein Homologiemo- in der Einleitung im Kapitel 2.6 ausgeführt dell der offenen Form von BpL zu erstellen. Betrachtung der wurde, konnte die Kristallstruktur einer bakteriellen Lipase der Lipase-Klasse I.2 von Pseudomonas cepacia (PcL) in der offenen Konformation gelöst werden (Kim et al., 1997; Schrag et al., 1997). Diese Lipase zeigt eine bemerkenswerte Sequenzhomologie von 84 % mit BpL und die Überlagerung der ProteinAbb. 7.12 : Kanonisches a/b Hydrolase Faltungsmuster für bakterielle Typ I.2 Lipasen strukturen (siehe Einleitung Abbildung 2.12) 120 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Abb. 7.13: Sequenzalignment bekannter bakterieller Lipasen der Klasse I.1 und I.2. Dunkel hervorgehoben sind identische Aminosäuren (blau = katalytische Triade), gelb unterlegt konservierte Austausche von ähnlichen Aminosäuren. Für Lipasen mit bekannter Röntgenstruktur sind zusätzlich die Sekundärstrukturen annotiert. (aus Nardini et al. 2000) 121 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase 7.5.1 Homologiemodellierung wurde analog zu Geometrien in den homolo- mit MODELLER 4 gen Strukturen aufgebaut. Die Konformationen der abweichenden Seitenketten wurden mit der Aufgrund der hohen Homologie und des struk- Rotamerbibliothek "LEGO sidechain" erstellt turell abgesicherten Sequenzalignment (Abbil- und deren Geometrie mit Hilfe des "REFI zo- dung 7.15) war es möglich, ein Strukturmodell ne"-Befehls minimiert. Das so erhaltene Mo- für die BpL in der offenen Konformation zu dell wurde für die im folgenden Teil durchge- erstellen. führte Modellierung der Substratbindung verwendet. Es zeigte sich jedoch, dass MODELLER in der Version 4 nicht in der Lage war, die Amino- 7.5.3 Homologiemodellierung mit säuren korrekt auf das Faltungsmuster abzubil- MODELLER 6 den. Visuelle Analyse der Homologiemodelle zeigte, dass die Probleme in der korrekten Mo- Die Autoren des Programms MODELLER haben dellierung von Schleifen auf der Oberfläche Ende 2000 darauf hingewiesen, dass die Prob- der Lipase auftraten. Das Programm MODELLER leme bei der Modellierung von "Loop"- in der Version 4 benötigte zum Aufbau von Geometrien (Sanchez & Sali, 1997) an der zwei Loops jeweils eine Aminosäure mehr, Oberfläche von Proteinen durch die Verwen- und begann das jeweils nächste Strukturele- dung verbesserter Bibliotheken behoben wer- ment mit einem Versatz um eine Aminosäure- den konnten (Fiser, Do & Sali, 2000). Daher position. Das mit MODELLER 4 erstellte Homo- wurde zum Ende dieser Arbeit nochmals ver- logiemodell erwies sich durch diesen "Frames- sucht, ein Homologiemodell durch die automa- hift" als gänzlich unbrauchbar für die Model- tische Modellierung mit dem Programm MO- lierung der Bindetasche in der offenen Kon- DELLER 6a zu erstellen. formation. Die Homologiemodellierung wurde mit identischen Sequenzalignment und unter Verwen- 7.5.2 Manuelle Homologie- dung von Standardparametern durchgeführt. Modellierung Die so erhaltenen Homologiemodelle zeichneDa mit dem zum Beginn der Arbeit verfügba- ten sich durch die korrekte Wiedergabe der ren Programm MODELLER 4 kein geeignetes Geometrie aus den Kristallstrukturen der ho- Homologiemodell für die BpL erhalten werden mologen Proteine in den kritischen "Loop"- konnte, wurde durch die manuelle Überlage- Bereichen aus. Das aktive Zentrum konnte rung mit den homologen Proteinen (PcL, 5lip zufriedenstellend modelliert werden. und PaL, 1ex9) unter Verwendung des ProDie Überlagerung der Bindetasche des manuell gramms O erstellt. unter Berücksichtigung des in der RefeDie offene Konformation des "Lid"-Bereichs renzstruktur gebundenen Liganden aufgebau122 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase ten Homologiemodells zeigt noch bestehende 7.6 Limitierungen der Homologiemodellierung. Strukturbasierte fokussierte Mutagenese Die Seitenketten der Aminosäuren in der Bin- von BpL detasche wurden von der im Programm MODELLER implementierte Version des CHARMM- 7.6.1 Rationale Auswahl Kraftfelds so ausgerichtet, dass der Platz in der relevanter Aminosäuren als leer angenommene Bindetasche bestmöglich ausgefüllt wird. Die so modellierte Binde- Das modellierte Strukturmodell der Burkholde- tasche ist daher nicht optimal geeignet, um die ria plantarii Lipase in der offenen Konforma- Umgebung eines möglichen Liganden zu be- tion wurde verwendet, um die möglichen schreiben. Wechselwirkungen einzelner Aminosäureseitenketten mit potentiellen Substratmolekülen Dieses prinzipielle Problem lässt sich nur zu untersuchen. durch einen kombinierten Ansatz umgehen, der automatisch sowohl Protein- als auch Ligan- Die strukturelle Untersuchung der Aminosäu- dinformation bei der Homologiemodellierung ren im Hinblick auf ihre Orientierung zum berücksichtigen kann (Schafferhans & Klebe, aktiven Zentrum der BpL hebt interessante 2001). Positionen in der Umgebung des Alkoholbzw. des Acylrestes des Substrats in der Bindetasche hervor. Zusätzlich wurden bekannte Aminosäurepositionen im "Lid"-Bereich aus Ergebnissen der gesteuerten Evolution einer homologen Lipase (PaL, (Liebeton et al., 2000) ) hinzugenommen. Basierend auf Sequenzalignments und der Strukturüberlagerung aller Lipasen mit bekannter Raumstruktur in offener Konformation mit gebundenem Inhibitor aus der PDB (Tabelle 2.1) wurde das aktive Zentrum der Lipasen mit bekannter Raumstruktur verglichen. Zusätzlich wurden die beiden Komplex- Strukturen der CaL B verwendet. Die Überlagerung erfolget mit Hilfe der drei hochkonservierten Aminosäuren der katalytischen Triade im Programm SYBYL. 123 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Die Substitutionsmuster der Acyl-Bindetasche bekannten Lipasen konserviert sind. Sie sollten und der Stereospezifitätstasche in der Alkohol- daher für eine Differenzierung der Sub- Binderegion in einer Vielzahl Lipasen wurden stratspezifität mögliche Angriffspunkte darstel- im Hinblick auf die Substraterkennung und die len. mögliche Differenzierung der Substratspezifi- Bindetasche wurden die Aminosäuren so aus- tät ausgewertet. Besonderes Augenmerk wurde gewählt, dass es durch den Austausch möglich auf Positionen gerichtet, die im Sequenza- sein sollte, Lipasen auch für nichtgeradkettige lignment (Abb. 7.13) über verschiedene Lipa- Säuren als potentielles Substrate masszu- sen wenig konserviert sind. Durch die Analyse schneidern. Nach den oben beschriebenen der Daten aus einer Vielzahl verwandter Lipa- Auswahlkriterien wurden die in der folgenden sen erscheint es unwahrscheinlich, dass die Tabelle markierten Amiosäurepositionen als Stabilität dieser Enzyme durch Mutationen an besonders kritisch für die Substraterkennung diesen Positionen stark beeinträchtigt wird, da und Bindung ausgewählt. In der hochkonservierten Säure- diese Aminosäurepositionen nicht über alle 1 a ADTYAATRYP aA A AA aA A VILVHGLAGT DKFANVVDYW YGIQSDLQSH A GAKVYVANLS a GFQSDDGPNG LTSRYVAAVA PQLVASVTTI a aa GTPHRGSEFA A 61 RGEQLLAYVK QVLAATGATK VNLIGHSQGG 121 DFVQDVLKTD l PTGLSSTVIA AFVNVFGTLV l l l SSSHNTDQDA la a l LAALRTLTTA QTATYNRNFP 181 SAGLGAPGSC QTGAATETVG GSQHLLYSWG GTAIQPTSTV LGVTGATDTS TGTLDVANVT 241 DPSTLALLAT GAVMINRASG aa QNDGLVSRCS SLFGQVISTS YHWNHLDEIN 301 EDPVAVIRTH VNRLKLQGV AA A A A A QLLGVRGANA Tab. 7. 5: Strukturbasierte Auswahl der 31 Aminosäureposition zur Mutagenese aus der Sequenz von BpL. Klassifizierung : A=Alkohol-Bindetasche, a=acyl-Bindetasche, l="Lid"-Region 124 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Homologiemodell der Burkholderia plantarii Lipase mit gebundener Fettsäure l Abb. 7.15: Strukturbasierte Auswahl von 31 Aminosäurepositionen zur fokussierten Mutagenese oben : Oberflächendarstellung des aktiven Zentrums; unten: Detailansicht der ausgewählten Aminosäuren; grün: Alkohol-Bindetasche, rot: Acyl-Bindetasche, gelb: "Lid"-Region 125 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase zur Stabilisierung des negativ geladenen 7.6.2 Auswahlstrategie für substrat- tetraedrischen Intermediats beiträgt. spezifisch fokussierte Mutationen Mit Hilfe dieses Modells der Substratbindung Anhand der vorgeschlagenen Positionen wurde im vermuteten geschwindigkeitsbestimmenden eine fokussierte Mutagenese erprobt, um die Schritt (siehe Kapitel 7.2.4) wurden für jede BpL für ein bestimmtes Substrat maßzuschnei- der 31 ausgewählten Aminosäurepositionen dern. Im Gegensatz zur ungerichteten Mutage- die zu erwartenden Wechselwirkungen mit nese kann durch eine rationale Auswahl der dem jeweiligen Substrat qualitativ abgeschätzt. Aminosäuren die Zahl der möglichen Mutan- Aus dieser Betrachtung resultierte dann für ten stark verringert werden, um eine kombina- jedes Substrat eine Priorisierung der auszutau- torische Explosion der möglichen Mutations- schenden Aminosäuren. So konnte die Zahl der varianten zu vermeiden. Bereits für ein Protein Möglichkeiten an jeder individuellen Position mit 200 AS gibt es mehr Möglichkeiten die unter Berücksichtigung der Ladung, des loka- Sequenz aus den 20 proteinogenen Aminosäu- len Wasserstoffbrückennetzes und des zur Ver- ren aufzubauen, als Atome im Universum zur fügung stehenden Raums weiter eingeschränkt Verfügung stehen. Da es für die 31 ausgewähl- werden. ten Aminosäuren aber rechnerisch immer noch Die so aus den 31 betrachteten Aminosäuren 2031 Möglichkeiten gibt, mußte die Zahl der ausgewählten Reste im Hinblick auf substrat- relevanten Positionen möglicher Austausche spezifisch fokussierte Mutationen befinden weiter eingeschränkt werden. sich direkt in der relevanten Bindetasche für Zur Auswahl der interessantesten Aminosäu- das jeweilige Substrat oder sind an der Positio- repositionen in der Alkohol- und der Acyl- nierung dieser Seitenketten beteiligt. Bindetasche wurde der tetrahedrale Komplex Ein weiterer Ansatz ist die Auswahl von Ami- des jeweiligen Substrats mit dem Homologie- nosäuren, die aufgrund ihrer Position am De- modell der BpL unter Verwendung des Pro- ckel über dem aktiven Zentrum die Beweg- gramms MOLOC aufgebaut und mit dem Kraft- lichkeit dieses Strukturelements erhöhen und feld MAB minimiert. Die Startgeometrie des damit potentiell die offene, katalytisch aktive kovalent am Ser87 gebundenen, tetrahedralen Konformation begünstigen. Es ist zu vermuten, Intermediats wurde auf der Basis der experi- dass dieser Aktivierungsschritt durch die De- mentellen Strukturen von Lipasen mit tetrahedralen Phosphonat-Inhibitoren ckelbewegung unabhängig von der Stereoche- manuell mie des Substrats ist und daher kaum diskrimi- aufgebaut. nierend für die Stereoselektivität sein kann. Aminosäuren, deren Austausch die katalyti- Somit kann die Selektivität allein dadurch sche Aktivität erhöhen sollen, betreffen die erhöht werden, dass der geschwindigkeitsbe- Umgebung der Oxyanion-Höhle, die essentiell stimmende Schritt durch die gesteigerte Mobi126 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase BpL WT lität des Deckels weg von diesem Schritt zur Bindung des Substrats bzw. der Ausbildung des tetrahedralen Intermediats als geschwindigkeits- bzw. selektivitätsbestimmenden Schritt verschoben wird. 7.6.2.1 Mutanten zur Aktivitätssteigerung L 17 H 86 Vorschläge Alle AS= x T, A,F W Doppel S,T mutante Y 29 F 52 L x S117 A,T ,M x L167 A,V x L265 A,V,M x V266 A,L,M x Zahl der Mutanten gegenüber PhenylessigsäureEstern Varianten min max CaLB PcL (PaL) 4 1 4 1 T 40 T 18 W104 3 2 4 3 4 4 min 4608 3 S 47 20 20 20 20 20 max 3840000 LàS V 266 Der Austausch von Ser117, Val266 und insbesondere Leu265 und Leu167 gegen Aminosäu- Phenylessigsäure-Ethylester sind typische Sub- ren mit kleinerer oder anders verzweigter hyd- strate von Esterasen und werden von Lipasen rophober Seitenkette könnte mehr Raum in der nicht gespalten, da die Säurebindetaschen der Acylbindetasche schaffen, um die katalytisch Lipasen zu klein sind, um den aromatischen aktive Phenylrest des Phenylessigsäure-Ethylesters Konformation des Phenylessigsäu- reesters zu stabilisieren. Aktivitätssteigerung aufzunehmen. Der Ethylrest ist zu kurz, um könnte durch eine zusätzliche H-Brücke in der stabilisierende Wechselwirkungen mit den Oxyanion-Höhle erzielt werden. Analog zu flankierenden Aminosäuren der Alkoholbinde- CaL B könnte durch Thr in der Position 17 tasche auszubilden. eine weitere OH-Gruppe platziert werden, die Die experimentell bestimmte Aktivität von mit dem negativ geladenen Sauerstoff des Sub- BpL gegenüber diesem Substrat ist nicht mess- strats interagiert. Die vorgeschlagene Mutation bar, so dass versucht wurde, mit Hilfe der fo- Leu17Ala sollte der Oxyanionen-Höhle die kussierten Mutagenese erstmals aktive Mutan- ausreichende Flexibilität zur Anpassung an das ten zu generieren. Substrat gewähren, während die Mutation Leu17Phe die Konformation im aktiven Zent- Daher wurde der Austausch folgender Amino- rum durch Wechselwirkungen mit dem dahin- säuren vorgeschlagen. Die räumliche Lage der terliegenden Phe52 stabilisieren könnte. Die Aminosäuren relativ zum Substrat ist in Abbil- Randomisierung der Mutation an der Position dung 7.16 gezeigt. 17 in Kombination mit der Position 52 könnte die Wechselwirkung dieser benachbarten Aminosäuren optimieren, um so die Oxyanionen-Höhle optimal an das gegebene Substrat anzupassen. Eine Doppelmutation der direkt benachbarten His86Trp und Tyr29Ser Reste reduziert das 127 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase Volumen der kleinen Alkohol-Bindetasche analog der CaL B unter Erhalt der Wasserstoffbrücke zwischen den beiden Resten. Dadurch sollte eine Stabilisierung des gebundenen Alkohols erreicht werden könnte, und so die Aktivität der Lipase gesteigert werden. Im Zeitrahmen dieser Arbeit wurden bei der BASF (Labor Dr. M. Matuschek) die LipaseMutanten Leu17Ala und Leu167Ala hergestellt und die Aktivität mit dem EsteraseSubstrat Phenylessigsäure-Ethylester in einem pH-Shift Essay qualitativ untersucht (BASF AG, Labor Dr. Hauer). Dabei wurde für den Wildtyp keine, für die Mutante T17A eine geringe und für die Mutante Leu167Ala eine deutliche Aktivität nachgewiesen. Es müssen jedoch noch weitere quantitative Experimente durchgeführt werden, um diese qualitativen Ergebnisse zu verifizieren. Bp-Lipase Aktivität Kontrolle ohne Enzym WT -- - L17A + - L167A ++ - 128 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase kat. Triade Asp 263 His 285 Ser 87 Val 266 Leu 265 Ser 117 His 86 Tyr 29 Leu 167 Leu 17 AlkoholBindetasche Säure-Bindetasche Phe 52 (rot) (grün) Ább. 7.16: Mutationsvorschläge zur Aktivitätssteigerung gegenüber Phenylessigsäure-estern kat. Triade (blau) Asp 263 His 285 AlkoholBindetasche (grün) His 86 Trp 30 Tyr 29 Leu 17 Phe 52 Ább. 7.17: Mutationsvorschläge zur Enantiomerentrennung gegenüber Methoxycyclohexanol 129 Kapitel 7 Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase 7.6.2.2 Mutanten zur Enantiomerentren- gegen kleinere Aminosäuren, um so eine bes- nung von Methoxycyclohexanol sere Anpassung an das Substrat über die räumliche Fixierung der Position 86 in der Bindeta- Die BpL wird von der BASF AG zur kineti- sche zu ermöglichen. Eine Mutation von schen Racematspaltung von rac-Methoxy- Tyr29Phe sollte zeigen, ob die postulierte H- cyclohexanol mit Vinyllaurat als Acylierungs- Brücke vom Alkohol zur 2-Methoxygruppe mittel eingesetzt. Ziel war es daher, die Aktivi- tatsächlich von Bedeutung für die korrekte tät und die Selektivität des Enzyms zu optimie- Substraterkennung ist. ren. Das Wechselwirkungsmuster zwischen Protein und Ligand erscheint bereits optimal Weitere Aktivitätssteigerungen könnten durch zur Enantiomerentrennung geeignet. Die Mo- zusätzliche H-Brücken oder eine verbesserte dellierung 1S,2S– Geometrie in der Oxyanionen-Höhle durch den Methoxycyclohexanol in der mit dem MAB- Austausch an der Position 17 und der räumlich Kraftfeld minimierten Geometrie eine Wasser- dahinterliegenden Aminosäure Phe52 erzielt stoffbrücke zum Tyr29 ausbilden kann. Diese werden, ähnlich wie dies bereits bei den Vor- Stabilisierung könnte eine rationale Erklärung schlägen für eine Aktivitätssteigerung gegen für die beobachtete Selektivität für das 1S,2S- das Substrat Phenylessigsäure-Ethylester ge- gegenüber dem 1R,2R-Methoxycyclohexanol zeigt werden konnte. zeigt, dass das geben. Im Zeitrahmen dieser Arbeit wurden bei der Es wurden folgende Aminosäuren für eine BASF (Labor Dr. M. Matuschek) die Lipase- fokussierte Mutagenese ausgewählt. Mutanten L17A hergestellt und die Aktivität BpL WT mit dem racemischen Substrat 2-Methoxy- Vorschläge Varianten CaLB Pcl random = x min max H 86 W x Y 29 F x W 30 H,F L 17 T,A,F x F52 S,T,Y x Zahl der Mutanten 2 2 20 20 cyclohexanol mit Vinyllaurat als Acylierungsmittel (im molaren Verhältnis 1:0,65 zur W104 S 47 3 3 4 20 T 40 4 20 min max Racematspaltung eingesetzt) untersucht. Die spezifische Aktivität im Hinblick auf die kineT 18 tische Racematspaltung konnte für die Mutante Leu17Ala gegenüber dem Wildtyp um den Faktor 7,3 gesteigert werden. In der folgenden 192 480.000 Die vorgeschlagene Mutation von His86Trp Tabelle sind die gemessenen spezifischen Ak- sollte die Selektivität noch weiter verbessern. tivitäten für die Mutante Leu17Ala gezeigt. Diese Mutation reduziert das Volumen der L17A Lipase kleinen Alkohol-Bindetasche (Stereospezifi- WT-Lipase Leerwert (ohne Enzym) tätstasche). Ein weiterer Vorschlag ist der 17,6 ± 3,7 2,4 ± 0,9 0,6 ± 0,1 (Menge des gebildeten Methoxycyclohexyllaurats nach 96 h in Gew. %, Mittelwert aus 8 Messungen ) gleichzeitige Austausch des räumlich hinter der Position 86 liegenden Tryptophans Trp30 130 Kapitel 8 Diskussion und Ausblick Teil II Burkholderia plantarii Lipase mationen über die möglichen Probleme bei der 8 DISKUSSION UND AUSBLICK Kristallisation zu erhalten. BURKHOLDERIA PLANTARII Von Anne Cleasby, eine der Autoren der oben LIPASE zitierten Arbeit, wurde die Information erhalten, dass die Homogenität in der anlytischen 8.1 Reinigung und IEF ein entscheidender Parameter für die er- Kristallisation folgreiche Kristallisation der BpL war. Ziel dieser Arbeit war es, die Burkholderia Die im daraufhin erstellten IEF-Gel offensicht- plantarii Lipase zu Fermentieren und soweit lichen Inhomogenitäten konnten durch die zu reinigen, dass eine erfolgreiche Kristallisa- Chromatofokussierung mit MONO®P nur teil- tion durchgeführt werden konnte. Diese Ziel ist weise abgereinigt werden. weder mit der sekretierten Lipase aus dem Bei den im analytischen IEF-Gel und in der Produktionsstamm noch mit dem Wildtyp er- Chromatofokussierung gefundenen Proteine reicht worden. Obwohl alle nach dem derzeiti- handelt es sich jedoch nach den Ergebnissen gen Stand der Technik verfügbaren Methoden der N-terminalen Ansequenzierung und der angewandt worden sind, um die leicht und in Aktivitätsbestimmung ebenfalls um die Bp- großen Mengen aus der Fermentation (bis zu Lipase. Diese Heterogenitäten im auf maxima- 2000 mg/l) zugängliche Lipase aus dem Pro- le Lipaseausbeute gezüchteten Produktions- duktionsstamm zu reinigen, ist es bisher nicht stamm könnten durch Isoenzyme infolge einer gelungen, diese Lipasepräparationen zu kristal- Genduplikation hervorgerufen sein. lisieren. Auch die Optimierung der Fermentation und Reinigung der Bp-Lipase aus dem Es wurden verschiedene Versuche unternom- Wildtypstamm brachte nicht den gewünschten men, die Lipasemodifikationen abzutrennen, Erfolg. dies konnte aber nur in analytischen Mengen erreicht werden. Eine Erklärung der unter- Erst mit der rekombinanten, homologen Ex- schiedlichen pression der BpL Mutante F142W in Burkhol- isoelektrischen Eigenschaften konnte auch durch die hochaufgelöste Mas- deria plantarii gelang die Kristallisation der senspektrometrie nicht gegeben werden. Lipase. Die Lipase aus dem Wildtyp konnte ebenfalls Da es sich nicht um eine de-novo-Struktur- erfolgreich fermentiert (10 mg/l) werden, und bestimmung, sondern um die Reproduktion es gelang, die Ausbeute der sekretierten Lipase einer erfolgreichen Kristallisation im Labor durch Zugabe von N-Acyl-Homoserinlactonen von Louise Johnson in Oxford handelte (Noble zu erhöhen. et al., 1993), wurde Kontakt mit dieser Arbeitsgruppe aufgenommen, um weitere Infor131 Kapitel 8 Diskussion und Ausblick Teil II Burkholderia plantarii Lipase Die Rolle dieser sogenannten "quorum sen- dieser Lipasepräparation führte nicht zur er- sing" Signalmoleküle in der Sekretionskaskade folgreichen Kristallisation der Burkholderia von Lipasen und anderen hydrolytischen Prote- plantarii Lipase, obwohl sie nach dem heuti- inen ist lange bekannt und spielt u. a. eine Rol- gen Stand der Analytik bis zur Homogenität le bei der Invasion von Pseudomonaden in gereinigt werden konnte. Ob die sich in der Eukarioten. Die Rolle der Lipasen und Cutina- analytischen IEF abzeichenden Unterschiede sen bei der Invasion dieser Bakkterien in für die Probleme bei der Kristallisation ver- Pflanzen ist gut untersucht. Das bei der Reini- antwortlich sind, kann nicht eindeutig festge- gung des Wildtyps aufgefallenen, unbekannte stellt werden, da die Lipase aus dem Wildtyp sekretierte Protein wurde nicht näher unter- diese Inhomogenitäten nicht zeigt und trotz- sucht, es könnte aber ein interessanten Ansatz- dem nicht zur Kristallisation gebracht werden punkt für Arbeiten zur Pathogenität dieser konnte. Ein möglicher Ansatzpunkt für die Bakterien sein. In diesem Zusammenhang soll weitere Vorgehensweise lieferte die Analyse erwähnt werden, dass es sich bei dem erstmals der Kristallisationsbedingungen und die Aus- in Japan (Tanaka, Katoh & Fujita, 1994) cha- wertung der Kristallkontakte in Röntgenstruk- rakterisierten Bakterium Burkholderia planta- tur verwandten Enzyme. Nahezu alle bekann- rii um einen reispathogen Stamm handelt. ten Kristallisationsbedingungen für Lipasen enthalten nichtionische Detergenzien als Adju- Mit Hilfe des in dieser Arbeit entwickelten vanzien. Reinigungsprotokoll standen ca. 100 mg WTLipase für die weiteren Untersuchungen zur Verfügung. Aber auch die weitere Reinigung Abb. 8.1: Darstellung der Kontaktfläche im Dimer der Struktur 1tcb der CaL B. Die Kristallkontakte werden über zwei b-Octyl-Glycopyranisidmoleküle (CPK-Darstellung) vermittelt. 132 Kapitel 8 Diskussion und Ausblick Teil II Burkholderia plantarii Lipase Typischerweise werden b-Octyl- oder b- Die Fermentation in einem sojaölfreien Medi- Dodecyl-glycopyranoside in Konzentrationen um kann nur mit Hilfe rekombinanter Metho- zwischen 0,1 % und 0,6 % zugesetzt. den erzielt werden, da die Genregulation der genomischen Lipase über das Wachstum auf Insbesondere die Analyse der in dieser Arbeit Fettsäuren als alleinige Kohlenstoffquelle be- ebenfalls untersuchten Struktur der Candida ruht. antarctica Lipase B lieferte wertvolle Hinweise. Die Kristallisationsbedingungen für CaL B Die Analyse der bisher erfolgreich kristallisier- enthalten b-Octyl-glycopyranosid. Weder in ten bakteriellen Lipasen und ihrer Reinigung der im Kapitel 5 vorgestellten Struktur, noch in und Expression bestätigt diese Vermutung. der mit 1,5 Å am höchsten aufgelösten Struk- Auch die erstmalige Kristallisation der BpL ist tur der CaL B ist jedoch dieses Molekül in der aus rekombinantem Material durchgeführt Kristallstruktur zu finden (Uppenberg et al., worden. Am Ende dieser Arbeit ist es im Labor 1994a). Die in der PDB abgelegte Struktur der Dr. Matuscheck (BASF AG, ZHF) gelungen, CaL B 1tcb (2,1Å) zeigt jedoch die Positionen rekombinantes Protein in geringen Mengen zur von zwei b-O-Glycopyranosid-Moleküle an Verfügung zu stellen. Es wurde ein vereinfach- der Grenzfläche eines engen Dimers in der tes Reinigungsprotokoll mit hoher Ausbeute asymmetrischen Einheit. Der Kristallkontakt entwickelt, mit dem eine Menge von ca. 10 mg wird über den lipophilen Schwanz und die einer Bpl-Mutante für die initiale Strukturbe- Kopfgruppe des Glycosids vermittelt, wie in stimmung bereitgestellt werden konnte. Abbildung 8.1 dargestellt ist. Die Fermentation der Lipase im Sojaölmedium kann also bereits die Ursache dafür sein, dass diese essentiellen Interaktionsstellen teilweise von Fettsäuren blockiert sind, die auch durch die sorgfältige Proteinreinigung nicht mehr entfernt werden können. Das in Abb. 7.4 gezeigte Massenspektrum zeigt mehrere Banden mit höherem Molekulargewicht, die auf fest gebundene Fettsäure-Moleküle hindeuten können, wie bereits aus früheren massenspektrometrischen Untersuchungen an Pseudomonas Lipasen (Hedrich et al., 1993) bekannt ist. 133 Kapitel 8 8.2 Diskussion und Ausblick Teil II Burkholderia plantarii Lipase geschwindigkeit besstimmend sein muss. Dies Kinetik und Inhibition konnte für bakterielle Lipasen bisher nicht Die technische Bedeutung der hier untersuch- eindeutig gezeigt werden. ten BpL liegt in ihren katalytischen Eigenschaften, die vorteilhaft in der kinetischen In Analogie zu den Untersuchungen an der Racematspaltung von sekundären Alkoholen Candida antarctica Lipase B läßt sich daher eingesetzt werden können (Jaeger & Reetz, die Annahme aufstellen, dass die Schritte zum 1998). Aufbau des Acyl-Enzyms über das teraedrische Intermediat die Geschwindigkeit und Die Vorhersage der katalytischen Eigenschaf- damit auch die Selektivität der Enzymkatalyse ten gegenüber einem gegebenem Substrat er- bestimmen. fordert allerdings detaillierte Kenntnis über den zu Grunde liegenden Katalysemechanis- Unterstützt wird dieser experimentelle Befund mus, wie bereits in der Diskussion zum Me- durch aktuelle Theorien aus der elektrostati- chanismus der CaL B in Kapitel 6 ausgeführt schen Betrachtung von Lipasen und Esterasen wurde. (Fojan et al., 2000). Berechnungen des elektrostatischen Potentials in der Bindetasche aus Erschwerend kommt hinzu, dass bakterielle Strukturdaten zeigen, dass Lipasen, im Ver- Lipasen in wässriger Umgebung meist in einer gleich zu Esterasen, in der Nähe ihres pH- geschlossenen, inaktiven Konformation vorlie- Optimums vermutlich ein stark negatives Po- gen (Berg et al., 1998). In Abbildung 8.2 ist tential in der Bindetasche aufweisen. Dadurch der für Lipasen angenommenen Mechanismus wird das Produkt der Deacylierung, eine nega- gezeigt. Die in dieser Arbeit auf die BpL an- tiv geladenen Fettsäure, elektrostatisch abge- gewandten, transienten kinetischen Methoden stoßen. Dieses Modell wird daher als "elektro- können statisches Katapult" bezeichet (Fojan et al., das Fehlen eines initialen "Bursts"nachweisen, so dass nicht die Deacy- 2000; Neves Petersen et al., 2001). lierung (Schritt 5), sondern, wie bei der CaL B einer der vorherigen Schritte für die Gesamt"Lid" geschlossen "Lid" offen Lid closed Lid open k1 E k -1 E+P E+S k -2 TET1 k -7 E k 6 k -6 k2 ES k7 k3 k -3 E -- A Acylenzyml k5 k -5 EP TET2 Abb. 8.2: Kinetisches Schema der Hydrolyse von Ester durch Lipasen. Im Schritt 1 erfolgt der Übergang von der geschlossenen in die offenen, aktive Form mit gebundem Substrat. ES = tetraedrisches Intermediat TET1 E--A = Acyl-Enzym EP= tet. Intermediat TET2 134 Kapitel 8 Diskussion und Ausblick Teil II Burkholderia plantarii Lipase Auch in der untersuchten BpL befindet sich in 8.3. Struktur und Homologie- der Bindetasche in der Nähe der Triade ein modellierung Glutamat-Rest. Aufgefallen ist dieser Rest bereits durch die durchgeführten Mutagene- Zur Klärung der geometrischen Beiträge zur sestudien, da dieser Rest in der Lage ist die Enatioselektivität lipasekatalysierter Reaktio- Mutation des katalytischen Aspartats der Tria- nen sollte ebenfalls die Kokristallisation der de teilweise zu kompensieren (Noble et al., BpL mit den dafür synthetisierten Phosphonat- 1993). Inhibitoren angestrengt werden. Interessanterweise zeigen auch die Versuche Im Rahmen dieser Arbeit konnte jedoch nur zur irreversiblen Hemmung dieser Lipase eine die Struktur der BpL-Mutante F142W ohne ausgeprägte Stereopräferenz des Phenylethy- Inhibitor in einer geschlossenen Konformation lalkohols bei der irreversiblen Bildung des gelöst werden. Die Qualität der Struktur ist tetraedrischen Diese jedoch unzureichend, lediglich das Vorhanden- Tatsache deutet ebenfalls darauf hin, dass es sein der Mutation konnte durch die Struktur sich beim Aufbau des tetraedrischen Interme- bestätigt werden. Wie in der schon bekannten diats, auch bei der BpL, um den geschwindig- Struktur des Wildtyps in der geschlossenen keits- und selektivitätsbestimmenden Schritt Konformation ist das aktive Zentrum nicht der Katalyse handelt. zugänglich und der Erfolg eines "soaking" Inhibitor-Komplexes. Experiments, das erfolgreich bei der CaL B Die Instabilität der Phosphonester im Ver- angewendet werden konnte, schließt sich daher gleich zu den für die CaL B benötigten Phos- aus. phonamiden erforderte die Entwicklung einer abgewandelten Synthesestrategie. Die Ziel der vorliegenden Untersuchung ist der synthetisierten Inhibitoren konnten nicht frak- erfolgreiche Einsatz dieses Enzyms in der Bio- tioniert kristallisiert werden, daher konnten sie katalyse. Die Fragestellung lautete daher, ob es nur als Mischung aus den Sp- und Rp- möglich ist, dieses Enzym auf ein gegebenes Diastereomeren mit definierter Stereochemie Substrat über eine gerichtete Mutagenese maß- am Alkoholrest isoliert werden. zuschneidern. . In der Literatur existieren bisher nur wenig Beispiele, in denen eine Verbesserung der katalytischen Eigenschaften durch gerichtete Mutagenese erzielt wurde. In jüngerer Zeit wurde dagegen oft die Methode der ungerichteten Evolution zur Optimierung von Proteinen angewandt. 135 Kapitel 8 Diskussion und Ausblick Teil II Burkholderia plantarii Lipase Zum jetzigen Zeitpunkt fehlen allerdings noch 8.4. Strukturbasierte Vorher- die exakten strukturellen und thermodynami- sage von Mutanten schen Daten zum vollständigen Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen. Das erstellte Homologiemodell in der offenen Konformation im Komplex mit dem modellier- Da ein Expressionssystem und kinetische Me- ten tetraedrischen Intermediat wurde erfolg- thoden aus einer Kooperation mit der Abtei- reich zur Vorhersage der katalytischen Eigen- lung Biokatalyse der BASF AG (Dr. Bernhard schaften von Mutanten eingesetzt. Hauer, ZHF) verfügbar sind, wurde bevor die experimentellen Ergebnisse der Strukturanaly- Zur Erstellung des Homologiemodells wurden se bereitstehen, bereits computergestützte Me- alle verfügbaren Informationen herangezogen, thoden zur Vorhersage von Mutantionen ein- insbesondere die in dieser Arbeit gelösten gesetzt. Strukturen der CaL B im Komplex mit den tetraedrischen Phosphonamid-Inhibitoren und Mit Hilfe der in dieser Arbeit gewonnen Er- weiteren bekannten Komplexstrukturen aus der kentnisse über die Enantioselektivität von Li- PDB. Zur Modellierung wurde das Kraftfeld pase-katalysierten Reaktionen und den vorlie- MAB eingesetzt, da bereits am Beispiel der genden Strukturinformationen aus homologen CaL B gute Erfahrung mit der Reproduktion Lipasen wurde daher ein Homologiemodell der der Geometrie des Inhibitors in der Kristall- BpL in der offenen Konformation erstellt. Ü- struktur gesammelt wurden. ber die Modellierung des vermutlich selektivitätsbestimmenden tetreadrischen Intermediats Die graphische Auswertung der minimierten mit dem Programm MOLOC konnte dann ein Geometrien in der Bindetasche erlaubt Plausi- Modell für die Substraterkennung generiert bilitätsbetrachtungen zur Identifizierung von werden. denkbaren Mutationen, die eine Verbesserungen der katalytischen Eigenschaften gegenüber einem gegebenem nichtnatürlichen Substrat erreichen sollten. Es wurde versucht, alle zum heutigen Zeitpunkt verfügbaren Informationen über konservierte Aminosäuren in der Bindetasche und detailierte Studien über den Mechanismus von Serinproteasen in die wissensbasierte Auswahl einfließen zu lassen. Es wurden zwei Modellsubstrate ausgewählt, für die bei der BASF bereits ein Assay zum 136 Kapitel 8 Diskussion und Ausblick Teil II Burkholderia plantarii Lipase experimentellen Nachweis der erziehlten Akti- zur relevanten Acylbindetasche weisenden vität und Selektivität der vorgeschlagenen Aminosäuren Leu167 und Leu17 durch Ala- Mutationen vorhanden war. nin. Damit konnte erstmals die Aktivität einer Lipase für dieses Substrat erreicht werden. Ein Ziel war es, die Burkholderia plantarii Lipase zur Spaltung von Phenylessigsäure- Die Bedeutung der Aminosäure an der Position Ethylester maßzuscheidern. Dieses Substrat 17 in BpL für die Katalyse ist bereits seit lan- mit einem aromatischen Acylrest und einem gem bekannt, da sie zusammen mit Gln 88 die kleinen Alkohol ist ein typisches Esterase- Oxyanion-Höhle ausbildet. Untersuchungen substrat, für das Lipasen keine Aktivität zei- über die Konservierung diese Aminosäureposi- gen. tion (Pleiss, Scheib & Schmid, 2000) und bisherige Mutagenesestudien (Beer et al., 1996) Diese Topologie ist exakt konträr zum steri- haben gezeigt, dass ein Austausch dieser Ami- schen Anspruch typischet Lipase-Substrate. nosäure unvorteilhaft für die katalytische Akti- Natürliche Substrate von Lipasen zeichnen vität zu sein scheint. sich durch langkettige, unverzweigte Säurereste und sterisch anspruchsvolle Alkoholreste Das Ziel dieser Studien war es bisher jedoch aus, wie z. B. im Triacylglycerolester. immer, für den Mechanismus relevante Aminosäuren durch den Aktivitäsverlust gegenüber Die Anpassung auf dieses "falsche" Substrat dem natürlichen Substrat zu identifizieren. mit inversem Raumbedarf gelang durch den Daher sollte gerade dieser Austausch von Vor- gezielten Austausch von den im Modell direkt teil für ein nichtnatürliches Substrat sein, was 1R-2R-Methoxycyclohexanol His 86 1S-2S-Methoxycyclohexanol His 86 His 285 His 285 Tyr 29 Tyr 29 Leu 17 Leu 17 Abb.8.3: Vergleich der mit MOLOC/MAB minimierten Geometrien des tetraedrischen Methoxycyclohexanol Intermediats in der Bindetasche der BpL. Die Geometrie der 1S-2S-Diastereomers erscheint für die Katalyse günstiger, da die katalytische Wasserstoffbrücke vom Estersauerstoff zum His 187 eine ideale Geometrie zeigt. Im 1R2R-Diastereomer (links) ist der Estersauerstoff hingegen vom His285 abgewandt und es liegt ein unproduktiver Bindungsmodus vor. 137 Kapitel 8 Diskussion und Ausblick Teil II Burkholderia plantarii Lipase durch die experimentelle Überprüfung bestä- wird ein Ausrichtung zum katalytischen His tigt werden konnte. Die Vorhersagekraft des in 285 vorgeschlagen. Zusätzlich kann eine Was- dieser Arbeit generierten Models konnte auch serstoffbrücke vom Methoxyrest zum Tyr 29 für ein zweites Substrat gezeigt werden. ausgebildet werden. Die Lipase sollte für die enantioselektive Kata- Diese Umkehr der Katzlauskas-Regel durch lyse der kinetischen Racematspaltung von die Anwesenheit von zusätzlichen Sauerstoff Methoxycyclohexanol optimiert werden. Das Atomen im sekundären Alkoholen wurde be- Wildtypenzym zeigt bereits eine hohe Selekti- reits in der Literatur (Tuomi & Kazlauskas , vität, aber eine geringe Aktivität gegenüber 1999) postuliert. diesem sekundären Alkohol. Eine weitere Besonderheit dieses Alkohols ist 8. 5 Ausblick die Verletzung der empirischen KazlauskasRegel für die kinetische Racematspaltung von Zum Abschluß der Arbeiten zur strukturbasier- sekundären Alkoholen (siehe auch Abschitt ten Vorhersage von Mutanten fehlt immer 3.1.5.2). Das Enzym zeigt eine Selektivität noch die eigentliche Voraussetzung für diesen zugunsten des 1S-2S-Methoxycyclohexanol hohen Anspruch, die Raumstruktur der Burk- obwohl das 1R-2R-Enantiomer nach den empi- holderia plantarii Lipase im Komplex mit den rischen Regeln als schnelles Enantiomer vor- zu diesem Zweck synthetisierten Methoxycyc- hergesagt wurde, da der Methoxy-Rest in die lohexanol-Phosphonat-Inhibitoren. Stereospezifitätstasche zum His 86 weist, wenn keine zusätzlichen Wechselwirkungen Es ist in zwei Beispielen gelungen, Mutanten angenommen werden. mit maßgeschneiderten katalytischen Eigenschaften vorherzusagen und auch den experi- Die Modellierung des tetraedrischen Interme- mentelle Nachweis für die Korrektheit dieser diats mit dem Programm MOLOC erlaubt erste Vorhersagen zu erbringen. Aber ob die Schlüs- Rückschlüsse auf eine mögliche rationale Er- se aus dem erstellten Homologiemodell tat- klärung dieses überraschenden kinetischen sächlich den strukturellen Gegebenheiten ent- Verhaltens. sprechen, kann nur eine zukünftige Kristallstrukturanalyse der Komplexe klären. In der Abbildung 8.3 ist die mit MOLOC /MAB minimierten Geometrie der beiden enatiome- Es stellt sich damit auch die Frage, ob es über- ren Formen des diastereomeren tetraedrischen Intermediats von haupt möglich sein wird, alle relevanten Para- Methoxycyclohexanol- meter für die Selektivität einer komplexen laureat gezeigt. Besonders auffällig ist die enzymkatalysierten Reaktion mit Hilfe einer vorgeschlagenen Geometrie der zu spaltenden statischen Struktur erfassen zu können. Esterbindung. Nur für das 1S-2S-Enantiomer 138 Kapitel 8 Diskussion und Ausblick Teil II Burkholderia plantarii Lipase Auch der vermeintlich gut untersuchte und ebenso wie das komplexe Zusammenspiel von verstandene Katalysemechanismus von Serin- (organischem) Solvens und protonierbaren Hydrolasen bietet Raum für weitere Detailstu- Gruppen im Enzym (Hacking et al., 2000). Die dien und zukünftige kinetische, thermodyna- zunehmende technische Anwendung von En- mische und strukturelle Untersuchungen von zymen unter nichtnatürlichen Bedingungen Mutanten. Es wäre zudem interessant, z.B. die fordert das bisher erworbene Wissen über die Relevanz der Wasserstoffbrücke zum Tyr 29 Mechanismen der enzymatischen Katalyse und durch Mutagenesestudien und thermodynami- die Leistungsfähigkeit von biologischen Kata- sche Messungen auszuleuchten, da diese In- lysatoren in einer heute noch nicht abzusehen- formationen zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht de Weise heraus. Erste Erfolge der evolutiven zur Verfügbar stehen. Proteinoptimierung mit Hilfe der ungerichteten Mutagenese konnten zeigen, dass es prinzipiel Insbesondere die Struktur und Dynamik des möglich ist Enzyme unter nichtnatürlichen "Lids" und seine Rolle in der Katalyse sind Bedingungen auf eine gewünschte Eigenschaft weitgehend unverstanden. Einen vielverspre- hin zu optimieren (Arnold et al., 2001). Dieser chenden Ansatz dazu bieten die in dieser Ar- Ansatz ersetzt das fehlende Wissen über die beit begonnenen Fluoreszenuntersuchungen zugrundeliegenden Mechanismen durch einen von Tryptophanmutanten zusammen mit kine- enormen technischen und zeitlichen Aufwand tischen Methoden wie die Stopped-Flow- bei der Durchmusterung aller möglichen Mut- Spektrofluorometrie, um die Geschwindigkeit anten hinsichtlich der gewünschten Eigen- und die Funktion einzelner Schritte innerhalb schaften. Die Zahl der möglichen Mutanten eines katalytischen Mechanismus isoliert be- eines Proteins mit n Aminosäuren beträgt 20n. trachten zu können. Es ist praktisch nicht möglich, alle Varianten Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zur zu screenen. Daher wäre es von Vorteil, die Vorhersage von Mutationen beruht auf der Methode der evolutiven Optimierung auf die impliziten Annahme, dass die mit den verwen- zur Substraterkennung relevanten Aminosäu- deten Kraftfeldmethoden zugängliche Geomet- ren zu beschränken oder sogar einen rein ratio- rie des tetraedrischen Intermediats dem tat- nalen Ansatz anzuwenden. sächlich geschwindigkeitsbestimmenden Es bleibt abzuwarten, inwieweit die umfassen- Schritt weitestgehend entspricht (Kazlauskas, de Betrachtung der kinetischen, thermodyna- 2000). Der eigentliche nukleophile Angriff des mischen und strukturellen Parameter enzyma- Serin für den Bindungsaufbau bzw. die an- tischer Prozesse wie die Substraterkennung schliessende Bindungsspaltung und die dazu und die Stabilisierung von Übergangszustän- erforderlichen stereoelektronischen Anforde- den zu differenzierteren und hoffentlich auch rungen (Ema et al., 1998) müssen bei diesem vermehrt rationalen Ansätzen des "Enzym- Ansatz zwangsläufig unberücksichtigt bleiben, Design" führen kann (Cedrone et al., 2000). 139 Kapitel 9 9 Zusammenfassung Es erscheint aus diesem Grund wünschens- Zusammenfassung wert, die Methode der strukturbasierten, geLipasen aus Bakterien und Hefen werden in richteten Mutagenese anzuwenden, um mass- der präparativen organischen Chemie als Bio- geschneiderte Biokatalysatoren durch ein rati- katalysator zur kinetischen Racematspaltung onales Proteindesign zu erreichen. Die grund- eingesetzt. Erste strukturelle Untersuchungen legende Voraussetzung für die erfolgreiche von Cygler et al. aus dem Jahr 1994 bestätigen Anwendung eines solchen computerunterstütz- die empirische Katzlauskas Regel, nach der die ten Proteindesigns ist die detaillierte Kenntnis Enantiopräferenz aus sterischen Betrachtungen des Enzymmechanismus und ein hinreichend abgeleitet werden kann. Die energetischen, genaues räumliches Modell des Enzyms. kinetischen und strukturellen Grundlagen der enantioselektiven Substraterkennung von Lipa- In der vorliegenden Arbeit wurden im ersten sen für sekundäre Alkohole und Amine sind Teil die kinetischen und strukturellen Determi- nicht im Detail bekannt. nanten für die Enantioselektivität von Lipasen am Beispiel der kinetischen Racematspaltung Nach dem heutigen Stand der Technik ist die von 1-Phenylethylamin mit Candida antarctica initiale Suche nach einer geeigneten Lipase als Lipase B untersucht. Biokatalysator für eine gegebene Reaktion und die Optimierung der Reaktionsbedingungen Zu diesem Zweck wurden von Hans-Dieter der zeitaufwendigste Schritt in der Entwick- Gerber lung lipasekatalysierter Reaktionen. Ein alter- übergangszustandsanaloge nativer Ansatz ist die Anpassung einer bereits Inhibitoren synthetisiert. Die Stereochemie der bekannten Lipase durch die Methode der unge- Inhibitoren wurde durch Kristallstrukturen richteten Mutagenese in einem evolutiven An- aller Diastereomere bestätigt. Es konnte ge- satz. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich zeigt werden, das die Lipase in abhängig von eine Lipase, für die bereits optimale Reakti- der Stereochemie des Inhibitors unterschied- onsbedingungen bekannt sind, an ein bestimm- lich schnell gehemmt wird. Die kovalente Bin- tes Substrat anzupassen. Dabei ist es nicht dung der Phenylethylamid-Inhibitoren konnte erforderlich den Mechanismus des Enzyms zu durch MALDI-TOF massenspektrometrische kennen (Reetz, 2000), da die Aminosäuren Untersuchungen eindeutig gezeigt werden. zufällig ausgetauscht werden und die Mutanten (AG Klebe) enantiomerenreine Phosphonamid- Die kinetische Relevanz des tetraedrischen nach ihren katalytischen Eigenschaften ausge- Übergangszustandes für die Reaktion wurde wählt werden. Diese Methode erfordert eben- durch die Bestimmung des geschwindigkeits- falls einen enormen technischen und zeitlichen bestimmenden Schrittes mit Stopped-Flow Aufwand bei der Erzeugung und Durchmuste- spektroskopischen Methoden bestätigt. rung der Lipasevarianten. Die thermodynamischen Parameter der kineti140 Kapitel 9 schen Zusammenfassung Racematspaltung von rac-Phenyl- Interpretation des reduzierten Streubeitrages ist ethylamin wurden mit Hilfe von van't Hoff in Übereinstimmung mit den thermodynami- Daten aus der Temperaturabhängigkeit der schen Daten, die ebenfalls auf eine höhere Reaktion bestimmt. Die Analyse der entropi- Restmobilität des langsameren S-Enantiomers schen und enthalpischen Beiträge zur freien hindeuten. Differenzaktivierungsenthalpie DR-SDG # der Unter diesem Gesichtspunkt wurden compu- kinetischen Racematspaltung ergaben eine tergestützte Methoden zur Untersuchung des enthalpische Favorisierung des schneller rea- zugänglichen Konformationsraumes der beiden gierenden R-Phenylethylamins. Interessanter- Enantiomere im tetraedrischen Übergangszu- weise ist der entropische Beitrag gegenläufig, stand angewendet. Die durchgeführten Kon- durch den entropischen Beitrag wird das lang- formationssuchen in der Bindetasche und die samere Enantiomer bevorzugt und die resultie- MD-Simulationen weisen ebenfalls auf die rende Enantioselektivität sinkt mit steigender schlechtere Stabilisierung sowie den Verlust Temperatur. Das langsamer reagierende S- der katalytischen Wasserstoffbrücke zum His Phenylethylamin scheint daher im geschwin- 224 für das S-Phenylethylamid hin. digkeitsbestimmenden Übergangszustand eine höhere Restmobilität zu besitzen. Aus diesen experimentellen Daten und den Hinweisen der computergestützten Methoden Zur Klärung der strukturellen Beiträge zur konnte ein konsistentes Modell der enantiose- Enantiopräferenz der CaL B gegenüber Pheny- lektiven Substraterkennung von Lipasen im lethylamin wurde die Kristallstruktur der Lipa- tetraedrischen se in der offenen Konformation in einer neuen Übergangszustand abgeleitet werden, welches sowohl sterisch-enthalpische hexagonalen Raumgruppe durch die Methode als auch entropische Beiträge berücksichtigt. des molekularen Ersatzes gelöst. Die Komplexstruktur mit dem R-Phenylethylamid- Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Lipase Inhibitor zeigt, dass der Inhibitor in der schma- aus Burkholderia plantarii betrachtet. Es konn- len Bindetasche perfekt eingeschlossen werden te erfolgreich ein Reinigungssystem für diese kann (Abb. 5.19). Diese optimale Passform, bakterielle Lipase der Klasse I.2 etabliert wer- die für eine enthalpischen Begünstigung des R- den. Es wurde festgestellt, dass nur die Lipase Substrates spricht, führt zu einem hohen entro- aus dem Wildtyp bis zur Homogenität gerei- pischen Verlust durch die starke Fixierung nigt werden konnte, während die aus dem Pro- dieses Substrats im tetraedrischen Intermediat. duktionsstamm gewonnenen Lipase Inhomo- Die Komplexstruktur der CaL B mit dem S- genitäten in der isoelektrischen Fokussierung Phenylethylamid-Inhibitor zeigt dagegen keine zeigt. Die Kristallisation dieser Lipase gelang Elektronendichte für die Phenyl-Gruppe des nur aus der sojaölfrei, rekombinant im Wild- Phenylethylamid-Inhibitors, was auf eine Un- typstamm exprimierter Lipasepräparation. ordnung dieses Molekülteils hindeutet. Diese 141 Kapitel 9 Zusammenfassung Die erfolgreich gelöste Kristallstruktur der Es konnte in ersten Experimenten von Dr. M. BpL konnte leider keinen Aufschluß über die Matuschek (BASF AG) gezeigt werden, dass Bindetasche der Lipase geben, da das Enzym mit Hilfe dieses struktur- und mechanismus- in einer geschlossenen Konformation vorliegt. basierten Ansatzes die spezifische Aktivität der Der für bakterielle Lipasen der Klasse I.2 typi- BpL für trans-2-Methoxycylohexanol tatsäch- sche "Lid" bedeckt das aktive Zentrum (Abb. lich gesteigert werden konnte. Der Austausch 7.8). Im Zeitrahmen dieser Arbeit gelang es der Aminosäure Leu17, die an der Stabilisie- nicht, die Struktur der BpL im Komplex mit rung des tetraedrischen Intermediates in der den von Hans Dieter Gerber (AG Klebe) syn- Oxyanionen-Höhle beteiligt ist, durch Ala thetisierten 2-Methoxycyclohexanol-Phos- bewirkte eine Steigerung der spezifischen Ak- phonsäure-Inhibitoren zu bestimmen. Aus tivität um 700%. Auch für das zweite gewählte diesem Grund wurde ein Homologiemodell der Modellsubstrat Burkholderia plantarii Lipase auf der Basis ein typisches Esterasesubstrat für das Lipasen von homologen Strukturen aus der PDB in keine katalytische Aktivität besitzen, konnte einer offenen Konformation erstellt. in einem ersten Vorversuch erstmals eine katalytische Ziel dieser Arbeiten war es, die rekombinante Phenylessigsäure-ethylester, Aktivität der BpL-Mutanten Leu17Ala sowie Leu167Ala gezeigt werden. BpL durch eine strukturbasierte gerichtete Diese Aminosäuren befinden sich in direkter Mutagenese für zwei gegebene Modellsubstra- Nachbarschaft zum Phenylring der Phenyles- te masszuschneidern. Auf der Grundlage der sigsäure im ersten Teil dieser Arbeit gewonnenen Er- und zur Oxyanionen-Höhle im tetraedrischen Übergangszustand (Abb. 7.16). kenntnisse über den Mechanismus der enantioselektiven Substraterkennung im tetraedrischen In der vorliegenden Arbeit wurde darüberhi- Übergangszustand wurden die beiden Modell- naus ein Ansatz zur Kombination der klassi- substrate im tetraedrischen Übergangszustand schen gerichteten Mutagenese mit der zufälli- analog zur Röntgenstruktur der CaL B model- gen, ungerichteten Mutagenese vorgeschlagen. liert. Dieser rationale Ansatz der fokussierten Mutagenese reduziert die nahezu unendliche Zahl Mit Hilfe dieses computergestützten Modells der möglichen Mutationen durch die struktur- wurden dann durch graphische Auswertung basierte Auswahl relevanter Aminosäuren auf Aminosäuren priorisiert, welche an der Stabili- eine kleinere Zahl von Enzymvarianten. sierung des tetraedrischen Intermediates beteiligt sind. Diese Aminosäurepositionen wurden Die vollständige Durchmusterung dieses Se- aufgrund der physikochemischen Eigenschaf- quenzraumes mit den Methoden der ungerich- ten als potentielles Ziel von ortsgerichteten teten Mutagenese kann dann wertvolle Auf- Mutationen zur Verbesserung der katalytischen schlüsse für eine weitere rationale Auswahl Eigenschaften ausgewählt. von Mutationen liefern. 142 Anhang A Literaturverzeichnis ANHANG A LITERATURVERZEICHNIS Akrim, M., Bally, M., Ball, G., Tommassen, J., Teerink, H., Filloux, A. & Lazdunski, A. (1993). Xcp-mediated protein secretion in Pseudomonas aeruginosa: identification of two additional genes and evidence for regulation of xcp gene expression. Mol Microbiol 10, 431-43. Alden, R. A., Wright, C. S. & Kraut, J. (1970). A hydrogen-bond network at the active site of subtilisin BPN'. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 257, 119-24. Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K. & Gershenson, A. (2001). 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Abbildung aqua demin. deionisiertes Wasser APS Ammoniumperoxodisulfat BSA Rinderserumalbumin °C Grad Celsius Cm Chloramphenicol d Tag(e) Da Dalton DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure g Maßeinheit der Erdbeschleunigung h Stunde(n) HEPES N-(2-(Hydroxyethyl)piperazin)-N‘-2-ethansulfonsäure IPTG Isopropyl-thio-b-galaktosid kat. katalytisch kb Kilobasen Kcat maximale Katalysegeschwindigkeit bei Substratsättigung KM Michaelis Konstante (Substratkonzentration bei halbmaximaler Katalysegeschwindigkeit) Km Kanamycin LB Luria-Bertani (Komplexmedium) min Minute(n) nm Nanometer OD(600) optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PEG Polyethylenglykol PCR Polymerase Chain Reaction PDB Protein Data Bank RMS engl. root mean square RT Raumtemperatur S Svedberg-Einheit s Sekunde(n) SDS Natriumdodecylsulfat Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA TBE Tris-Borat-EDTA TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan 152 Anhang B Abkürzungsverzeichnis U Unit u/min Umdrehungen pro Minute v/v Volumen pro Volumen wt Wildtyp w/v Gewicht pro Volumen w/w Gewicht pro Gewicht Lipasen AcL Acinobacter calcoacidum Lipase BcL (PcL) Burkholderia cepacia Lipase (vorher Ps. cepacia Lipase) BpL (BgL, PgL) Burkholderia plantarii Lipase (vorher Burkholderia glumae oder Pseudomonas glumae Lipase) CaL B Candida antarctica Lipase B CrL Candida rugosa Lipase CvL Chromobacterium viscosum Lipase FsC Fusarium solani Cutinase GcL Geotrichium candidum Lipase HlL Humincola lanuginosa Lipase HuPL Human pancreatic Lipase PaL Pseudomonas aeruginosa Lipase PfL Ps. fluorescens Lipase PfrL Ps. fragi Lipase PlL Ps. luteola Lipase PvL Ps. vulgaris Lipase PwL Ps. wisconsin Lipase RdL Rhizopus delmar Lipase RmL Rhizomucor mihei Lipase VcL Vibrio cholerae Lipase 153 Anhang B Abkürzungsverzeichnis Aminosäuren Name Dreibuchstabencode Einbuchstabencode Glycin Gly G Alanin Ala A Valin Val V Leucin Leu L Isoleucin Ile I Prolin Pro P Phenylalanin Phe F Tyrosin Tyr Y Tryptophan Trp W Cystein Cys C Methionin Met M Serin Ser S Threonin Thr T Lysin Lys K Arginin Arg R Histidin His H Aspartat Asp D Glutamat Glu E Asparagin Asn N Glutamin Gln Q 154 Erklärung VERÖFFENTLICHUNGEN : Aus der vorliegenden Arbeit sind bisher folgende Posterbeiträge, Publikationen und Patente hervorgegangen: M. Bocola, H. D. Gerber, K. Ditrich, T. Friedrich, C. Sotriffer,M.T. Stubbs, B. Hauer, G. Klebe Substrate flexibility as a putative stereoselectivity criterion X-ray structures, thermodynamics and molecular modeling of Candida antarctica Lipase B Poster BIOTRANS 2001, Darmstadt Hauer, B. Klebe, G. Bocola, M. Matuschek, Stürmer, R. Enzymvarianten von Lipasen Durch rationales Protein Design wurden Lipasevarianten erhalten, die eine erhöhte spezifische Aktivität bei der Umsetzung von racemischen trans-2-Methoxycyclohexanol mit Vinyllaurat aufweisen. Deutsche Patentanmeldung, in Zusammenarbeit mit der BASF AG M. Bocola, H.-D. Gerber, B. Hauer, T. Friedrich, K. Ditrich, G. Klebe Titrimetric determination of enantiopreference of lipases using enantiopure phospho-analog transition state inhibitors ChemBioChem (to be submitted) M. Bocola, M.T.S. Stubbs, C. Sotriffer, B. Hauer, T. Friedrich, K. Dittrich, G. Klebe Residual mobility of the transition state determines enantiopreference of Candida antarctica Lipase B towards phenylethylamine substrates: Evidence from X-ray crystallography, kinetic data and molecular dynamics. ChemBioChem (to be submitted) 155
