Die lipolytischen Enzyme LipA und LipB von Bacillus subtilis

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Extrazelluläre lipolytische Aktivität ist schon seit mehr als zwei Jahrzehnte für das Grampositive Bodenbakterium Bacillus subtilis bekannt. 1992 konnte von DARTOIS et al. das Gen
für eine sekretierte Lipase (lipA) kloniert und das korrespondierende Enzym in Grundzügen
biochemisch charakterisiert werden. Im Rahmen des Genomprojektes konnte fünf Jahre später
ein weiteres potentielles Lipasegen (lipB) aufgrund von Homologievergleichen im B. subtilis
168 Genom identifiziert werden.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der extrazellulären lipolytischer Enzyme von B. subtilis. Die Schwerpunkte lagen (1) in der Aufklärung der Proteineigenschaften, (2) Regulation der Genexpression und (3) Optimierung der Enzyme für biotechnologische Anwendungen.
1) Vergleichende biochemische Charakterisierung von LipA und LipB
Das potentielle zweite Lipasegen (lipB) von B. subtilis wurde erfolgreich kloniert, im homologen Wirt exprimiert und das Genprokukt gereinigt. In Stabilitäts- und Aktivitätsstudien
wurde das LipB-Protein als alkali- und moderat thermostabile Esterase [EC 3.1.1.1] charakterisiert, die sich im Substratspektrum deutlich von der Lipase LipA unterscheidet, indem v.a.
kurzkettige Substrate hydrolysiert wurden. Die ausschließlich extrazelluläre Lokalisation des
Enzyms wurde immunologisch durch Western-Blot Analysen nachgewiesen.
Durch zielgerichtete Mutagenese konnten die Aminosäuren Ser78, Asp134 und His157 als katalytische Triade von LipB identifiziert werden. Darüber hinaus wurde die Bedeutung des für
Bacillus- und Geobacillus-Lipasen typischen Ala-X-Ser-X-Gly Pentapeptid-Motivs untersucht. Dem Alaninrest in der ersten Position kommt eine essentielle Bedeutung für die Aktivität und Alkalistabilität des LipB-Proteins zu. Eine LipB-Variante mit dem „normalen“ Gly-XSer-X-Gly-Pentapeptid zeigte den Verlust der extremen Alkalistabilität zugunsten einer gesteigerten Stabilität bei niedrigem pH-Wert. Eine mögliche Verallgemeinerung dieser Ergebnisse für andere alkalistabile α/β-Hydrolasen mit dem gleichen Strukturmotiv wird diskutiert.
2) Regulation der lipA- und lipB-Genexpression
Die phänotypische Charakterisierung der ∆lipA-, ∆lipB- und ∆lipA ∆lipB-Mutanten ergab, daß
die entsprechenden Genprodukte für B. subtilis nicht essentiell sind. Weiterhin war der
Nachweis einer differentiellen Genexpression von lipA und lipB in vivo möglich. Auf transkriptionaler Ebene konnten mediumabhängige Unterschiede in der Expression der beiden lipGene nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde mit lacZ-Reportergenfusionen für beide
Gene eine maximale Expressionsaktivität mit Ende der logarithmischen Wuchsphase nachgewiesen, die weder einer Katabolit-Repression noch einer Streßfaktor-induzierten Regulation
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unterlag. Hingegen konnte eine regulatorische Wirkung von Aminosäuren für die lipA- und
von hydrophoben Substanzen für die lipB-Expression nachgewiesen werden. Auf posttranslationaler Ebene wurde die LipA-Aktivität durch den pH-Wert des Kulturmediums beeinflußt.
Die Ergebnisse lassen eine strikte Regulation von lipA und lipB vermuten, eingebunden in das
komplexe Wechselspiel der zahlreichen Regulatorproteine für extrazelluläre und degradative
Enzyme von B. subtilis.
3) Optimierung der B. subtilis Lipase LipA für biotechnologische Anwendungen
Durch gerichtete Evolution konnte die Enantioselektivität der Lipase LipA in der Hydrolyse
des Modellsubstrats pseudo-meso-1,4-Diacetoxycyclopenten von 38 % ee für das WildtypEnzym auf 70 % ee für die beste Variante gesteigert werden, wobei als bevorzugtes Reaktionsprodukt das 1R, 4S-Enantiomer gebildet wurde. Ebenso gelang eine Umkehrung der Enantioselektivität auf 39 % ee zugunsten der Bildung des 1S, 4R-Enantiomers. Da im Rahmen
dieses Projekts auch die Aufklärung der Röntgenstruktur der Lipase LipA gelang, konnte ermittelt werden, daß Substitutionen von oberflächenlokalisierten Aminosäuren für die Veränderungen in der Selektivität des Enzyms verantwortlich waren, wobei einige dieser Austausche anhand der LipA-Struktur rational nicht zu erklären und sicher auch nicht vorhersagbar
waren. Dieser und andere Befunde zeigten das Potential der gerichteten Evolution: sie kann
zur Entwicklung enantioselektiver Biokatalysatoren eingesetzt werden, auch wenn keinerlei
Kenntnisse der Struktur und/oder des katalytischen Mechanismus der entsprechenden Enzyme
vorliegen. Wenn allerdings die Struktur des zu evolvierenden Enzyms bekannt ist, sind sogar
die Aufklärungen struktureller Grundlagen der Enantioselektivität möglich.
Das hier evolvierte LipA-Protein ist mit 181 Aminosäuren ein kleines Protein, daher steht hier
auch nur ein vergleichsweise kleiner Sequenzraum zur Evolvierung zur Verfügung. Die in
dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß die Akkumulation von Mutationen über die
einzelnen Generationen die Enzymstabilität nachhaltig beeinträchtigte. Daraus ergibt sich die
Notwendigkeit, für die in vitro Evolution von kompakten Enzymen neue experimentelle Strategien zu entwicklen. Der Einsatz von Sättigungs- und Kassettenmutagenesen konnte als erfolgreiche Methoden genutzt werden, um mit wenigen Aminosäureaustauschen signifikante
Verbesserungen der Enantioselektivtät zu erzielen. Als methodisches Ergebnis der Arbeit resultiert der Vorschlag, für die effiziente Evolution kompakter Enzyme auf die fehlerhafte PCR
zu verzichten und stattdessen die Sättigungsmutagenese mit rekombinativen Techniken zu
kombinieren.
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