Die lipolytischen Enzyme LipA und LipB von Bacillus subtilis
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INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG............................................................................ 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 Charakteristika von Lipasen..................................................................................... Kinetik der Lipolyse – Enzymaktivität an Grenzflächen......................................... Molekulare Struktur und katalytischer Mechanismus von Lipasen und Esterasen.. Lipolytische Enzyme der Gattung Bacillus.............................................................. Die Lipase LipA aus Bacillus subtilis...................................................................... Industrielle Biokatalyse............................................................................................ Entwicklung neuer Biokatalysatoren mit gerichteter Evolution............................... Ziele dieser Arbeit.................................................................................................... 1 3 4 7 9 12 13 18 2 MATERIAL UND METHODEN.................................................. 19 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 Chemikalien und Enzyme......................................................................................... Bakterienstämme und Plasmide................................................................................ Oligonukleotide........................................................................................................ Anzucht und Lagerung von Bakterien...................................................................... Isolierung von Nukleinsäuren................................................................................... Gelelektrophorese von Nukleinsäuren...................................................................... Identifikation von Transkriptionsstartpunkten mittels „Primer-extension“Analyse..................................................................................................................... 2.8 In vitro Rekombination von DNA............................................................................ 2.9 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA.................................................... 2.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)........................................................................... 2.10.1 Standard-PCR-Reaktion.................................................................................... 2.10.2 Ortspezifische Mutagenese................................................................................ 2.10.3 Sättigungsmutagenese....................................................................................... 2.10.4 Zufallsmutagenese............................................................................................. 2.11 „DNA-Shuffling“ zur in vitro-Rekombination von DNA-Sequenzen.................... 2.12 Herstellung von lip-Deletionsmutanten in Bacillus subtilis.................................... 2.13 Nukleinsäure-Hybridisierungen.............................................................................. 2.14 Sequenzierung von DNA......................................................................................... 2.15 Bestimmung von Proteinkonzentrationen............................................................... 2.16 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)............................................ 2.17 Chromatographische Reinigung der Proteine LipA und LipB aus B. subtilis......... 2.17.1 Reinigung der Proteine LipA und LipB nach Überexpression im homologen Wirt B. subtilis................................................................................................... 2.17.2 Reinigung der LipB-Variante A76G nach Überexpression im heterologen Wirt E. coli........................................................................................................ 2.18 Aminoterminale Sequenzierung des LipB-Proteins................................................ 2.19 Herstellung eines LipB-spezifischen „polyklonalen Antiserums“.......................... 2.20 Immunologischer Nachweis von Proteinen............................................................. 2.21 Fraktionierung von Bacillus subtilis Zellen............................................................ 2.22 Bestimmung von Enzymaktivitäten........................................................................ 2.22.1 Spektroskopische Methoden zur Bestimmung von Lipase-/Esterase-Aktivität 2.22.2 Titrimetrische Methode zur Bestimmung von Lipase-/Esterase-Aktivität........ 19 19 22 24 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 30 30 30 30 30 31 31 31 31 32 32 32 32 I INHALTSVERZEICHNIS 2.22.3 Monolayer-Assay zur Bestimmung von Lipase-/Esterase-Aktivität................. 2.22.4 Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität...................................................... 2.23 Bestimmung von Enantioselektivitäten................................................................... 2.24 Bestimmung der pH- und Thermostabilität von LipA und LipB............................ 2.25 Nachweis der Fettsäurezusammensetzung bakterieller Membranen....................... 2.26 Computerprogramme und Online-Datenbanken..................................................... 3 ERGEBNISSE........................................................................... Klonierung, Überexpression, Reinigung und immunologischer Nachweis der in vivo Lokalisation von LipB aus Bacillus subtilis.................................................... 3.1.1 Spezifische Amplifikation der lipB-Gensequenz aus B. subtilis mittels PCR.. 3.1.2 Überexpression des lipB-Gens im homologen Wirt B. subtilis und chromatographische Reinigung des korrespondierenden Proteins................................... 3.1.3 Charakterisierung eines LipB-spezifischen polyklonalen Antiserums............. 3.1.4 Nachweis der ausschließlich extrazellulären Lokalisation des LipB-Proteins in B. subtilis....................................................................................................... 3.2 Biochemische Charakterisierung der lipolytischen Enzyme LipA und LipB aus Bacillus subtilis....................................................................................................... 3.2.1 Identifizierung der katalytisch aktiven Aminosäurereste von LipB durch Sequenzvergleiche mit Lipasen der Homologiefamilie I.4................................... 3.2.2 LipB-Varianten S78C, D134N und H157N sind katalytisch inaktiv................ 3.2.3 Ca2+-Ionen haben keinen Einfluß auf die Enzymaktivität von LipA und LipB 3.2.4 LipA und LipB zeigen maximale Stabilität im alkalischen pH-Bereich........... 3.2.5 LipA und LipB sind bis 45°C thermostabil....................................................... 3.2.6 Aktivitätssteigerung von LipA und LipB durch Detergentien.......................... 3.2.7 LipA und LipB haben unterschiedliche katalytische Spezifitäten.................... 3.3 Die Bedeutung des Konsensusmotivs Ala-X-Ser-X-Gly der extrazellulären Bacillus-Lipasen und Esterasen............................................................................... 3.3.1 Konstruktion des Lipase-Konsensusmotivs Gly-X-Ser-X-Gly in der LipBVariante A76G.................................................................................................. 3.3.2 LipB-Variante A76G besitzt eine veränderte spezifische Enzymaktivität........ 3.3.3 LipB-Variante A76G zeigt gesteigerte Stabilität bei pH 5................................ 3.4 Regulation und physiologische Funktion der Gene lipA und lipB.......................... 3.4.1 Konstruktion und Nachweis von lip-Deletionsmutanten in B. subtilis............. 3.4.2 Die Gene lipA und lipB von B. subtilis sind nicht essentiell............................. 3.4.3 LipA und LipB werden mediumabhängig gebildet........................................... 3.4.4 Unter Kulturbedingungen mit sinkendem pH-Wert wird enzymatisch inaktives LipA-Protein gebildet................................................................................. 3.4.5 In der spätlogarithmischen Wuchsphase ist die lipA- und lipB-Genexpression maximal............................................................................................................. 3.4.6 Aminosäuren reprimieren die lipA-Transkription............................................. 3.4.7 Hydrophobe Substanzen steigern die lipB-Transkription im Biofilm............... 3.4.8 Identifizierung der Transkriptionsstartpunkte des lipA- und lipB-Gens........... 3.5 Gerichtete Evolution der Enantioselektivität von LipA und LipB.......................... 3.5.1 Expressionssysteme für LipA und LipB zur Herstellung von Enzymbibliotheken im heterologen Wirt E. coli................................................................... 3.5.2 Heterologes LipA-Expressionssystem eignet sich für ein Hochdurchsatz-eeScreening mittels ESI-MS................................................................................. 33 33 33 34 34 34 35 3.1 35 35 36 38 39 41 41 42 43 44 45 46 47 51 51 52 53 56 56 58 59 62 64 65 66 67 70 70 72 II INHALTSVERZEICHNIS 3.5.3 3.5.4 3.5.5 3.5.6 3.5.7 Evolution der Enantioselektivität von LipA durch Zufallsmutagenese mittels fehlerhafter PCR................................................................................................ Weitere Optimierung von LipA-Varianten durch Sättigungsmutagenese........ Rekombination der enantioselektiveren Mutanten in vitro mittels DNAShuffling............................................................................................................ Reversion der Enantioselektivität von LipA durch Kassettenmutagenese........ Aktivitäts- und Stabilitätsverluste bei LipA-Varianten mit gesteigerter Enantioselektivität..................................................................................................... 4 DISKUSSION............................................................................ 4.1 Charakterisierung des LipB-Proteins von B. subtilis als extrazelluläres Enzym mit lipolytischer Aktivität....................................................................................... Vergleichende biochemische Charakterisierung von LipA und LipB.................... Alaninrest im LipB-Pentapeptid ist für Alkalistabilität des Enzyms essentiell...... Charakterisierung der lip-Deletionsmutanten......................................................... LipA- und LipB-Enzymaktivität wird auf transkriptionaler und posttranslationaler Ebene reguliert................................................................................. Regulation des lipolytischen Systems von B. subtilis – ein Ausblick..................... Entwicklung einer enantioselektiven Lipase mit Hilfe der gerichteten Evolution.. Verbesserungen der Enantioselektivität hauptsächlich durch oberflächenlokalisierte Aminosäuresubstitutionen............................................................................. Besonderheiten bei der gerichteten Evolution von LipA aus B. subtilis – Auswirkungen auf zukünftige Projekte......................................................................... 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5 6 7 8 ZUSAMMENFASSUNG.............................................................. SUMMARY............................................................................... LITERATUR............................................................................. ANHANG.................................................................................. 73 75 75 76 78 80 81 83 86 89 90 97 100 108 111 113 115 117 130 III
