Einfluss unterschiedlicher Progesteronkonzentrationen auf die
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Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher Progesteronkonzentrationen auf die Maturation boviner Oozyten in vivo und in vitro INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Nicole Schlüter Münster Hannover 2013 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Christine Wrenzycki Klinik für Rinder, Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken jetzt: Justus-Liebig-Universität Gießen Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz, Professur für Molekulare Reproduktionsmedizin 1. Gutachterin 2. Gutachter Prof. Dr. Christine Wrenzycki Prof. Dr. Burkhard Meinecke Tag der mündlichen Prüfung: 30.09.2013 Die vorliegende Arbeit wurde gefördert durch den Förderverein Biotechnologie Forschung e.V. (FBF e.V.) Bonn. Meinen Großvätern Inhalt 1 Einleitung 1 2 Literatur 2.1 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) mit der Ovum-Pick-Up (OPU)-Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1 Die Entwicklung des OPU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2 Vergleich des OPU mit anderen Methoden zur Gewinnung von Eizellen bzw. Embryonen beim Rind . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Einfluss des OPU auf die Gesundheit des Donortieres . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Einfluss des OPU auf den ovariellen Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4 Einflüsse des Zyklusstandes auf die Ergebnisse des OPU . . . . . . . . . . . . 2.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Qualität der KOK . . . . . . . . . . . . . . 2.6 Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten . . . . . . . . . . . 2.7 Einfluss des Zyklusstandes auf die Entwicklungskompetenz boviner KOK . . . 2.8 Beeinflussung der follikulären Reifungsvorgänge durch peripheres Progesteron 2.9 In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.10 Beeinflussung der Eizell- und Embryonenqualität . . . . . . . . . . . . . . . . 2.11 Einfluss der Maturationsbedingungen auf die Eizell- und Embryonenqualität . . 2.12 Einfluss der Steroidsupplementation während der IVM . . . . . . . . . . . . . 2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.13.1 Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) . . . . . . . . . . . . . . 2.13.2 Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) . . . . . . . . . . . . . . . . 2.13.3 Glukosetransporter 1 (SLC2A1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.13.4 Hypoxia Inducible Factor 2α (HIF2α) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.14 MessengerRNA-Expression von Progesteronstoffwechsel-relevanten Genen in Oozyten und Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.14.1 Progesteronrezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.14.2 Progestin und AdipoQ Rezeptor 5 (PAQR5) . . . . . . . . . . . . . . . 2.15 Ziel des Projektes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 Material und Methoden 3.1 Ovum Pick-Up (OPU) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1 Auswahl der Versuchstiere und Feststellung des Versuchsbeginns . 3.1.2 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen im OPU-Verfahren . 3.1.3 Blutentnahme und Konservierung der Blutproben . . . . . . . . . . 3.1.4 Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blut . . . . . . . . . 3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 6 7 7 8 9 10 12 14 15 16 17 19 21 22 23 24 25 26 26 27 28 29 29 29 30 33 34 35 V Inhalt 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.3 3.4 Herkunft der Ovarien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe . . . . . In-vitro-Maturation (IVM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Progesteronbestimmung im Reifungsmedium und Einteilung der Versuchsgruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.5 Reifungskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.6 In-vitro-Fertilisation (IVF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.7 In-vitro-Kultur (IVC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.8 Beurteilung der Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.9 Archivierung von gereiften Oozyten für die mRNA-Analyse . . . . . . mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender Gentranskripte 3.3.1 Aufbereitung der Proben zur Isolierung der mRNA . . . . . . . . . . . 3.3.2 Reverse Transkription (RT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) . . . . . . . . . . . . Auswertung der Daten und statistische Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Ergebnisse 4.1 OPU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1.1 Zyklusverhalten und Gelbkörpereigenschaften . . . . . . . . . . 4.1.2 Follikelpunktion, Eizellausbeute und Oozytenqualität . . . . . . . 4.2 Progesteronsupplementation während der In-vitro-Maturation . . . . . . . 4.2.1 Progesteronanalyse im Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2.2 In-vitro-Produktion nach Progesteronzusatz im Reifungsmedium . 4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1 mRNA-Expression in OPU-KOK verschiedener Zyklusphasen . . 4.3.2 mRNA-Expression in gereiften Oozyten nach IVM mit P4-Zusatz 5 Diskussion 5.1 Zyklusverhalten während der OPU-Versuchsphase . . . . . . . . . . . . 5.1.1 Zwischenbrunsten und Bildung gelbkörperähnlicher Strukturen 5.1.2 Eigenschaften der gelbkörperähnlichen Gebilde . . . . . . . . . 5.2 Follikeleigenschaften, Eizellausbeute und Oozytenqualität . . . . . . . 5.3 MessengerRNA-Häufigkeiten in den OPU-Oozyten . . . . . . . . . . . 5.4 Progesteronsupplementation während der Eizellreifung . . . . . . . . . 5.4.1 Einfluss der Progesteronsupplementation auf die Genexpression 5.5 Einfluss des Progesterons auf die Eizellqualität in vivo und in vitro . . . 5.6 Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.7 Kritische Würdigung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Zusammenfassung VI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 35 37 37 38 38 39 39 39 40 40 40 41 42 . . . . . . . . . 45 45 47 48 50 50 51 53 53 54 . . . . . . . . . . 57 57 57 59 61 62 64 65 67 67 67 69 7 Summary 71 A Medien und Chemikalien A.1 Medien für das OPU . . . . . . . . A.2 Medien für die IVP . . . . . . . . . A.3 Medien für die Reifungskontrolle . . A.4 Medien für den Radioimmunoassay A.5 Medien für die RT-qPCR . . . . . . 73 73 73 77 78 78 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B Verzeichnis der Gesamtdaten B.1 Daten aus dem OPU-Versuch . . . . . . . . . . . B.1.1 Näherungsfunktionen und Berechnungen progesteronwertes . . . . . . . . . . . . B.1.2 Progesteronverläufe der Einzeltiere . . . B.1.3 Berechnungen aus den Funktionen . . . . B.2 Daten aus dem IVM-Versuch . . . . . . . . . . . B.2.1 IVP-Durchgänge der Versuchsgruppen . . B.2.2 P4 im IVM-Medium . . . . . . . . . . . B.2.3 Reifungskontrollen . . . . . . . . . . . . B.3 Daten aus der RT-qPCR . . . . . . . . . . . . . . B.3.1 OPU-Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . B.3.2 IVM-Versuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . für . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . den Verlauf des . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Serum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 81 97 97 99 100 100 105 107 109 109 110 Abbildungen 113 Tabellen 115 Literaturverzeichnis 119 Abkürzungsverzeichnis 159 VII text 1 Einleitung Die erfolgreiche Weiterentwicklung der In-vitro-Produktion (IVP) von Rinderembryonen, bestehend aus den drei methodischen Schritten der In-vitro-Maturation (IVM), In-vitro-Fertilisation (IVF) und In-vitro-Kultur (IVC) hat in den letzten Jahren Embryonen in großer Zahl verfügbar gemacht. Bei Verwendung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) aus Schlachthofovarien liegen die Effizienzen für die einzelnen Schritte bei 60-95 % für die IVM (A DONA et al. 2008), 70-90 % für die IVF (W RENZYCKI et al. 2007) und 25-40 % für die IVC (K ES KINTEPE und B RACKETT 1996, R IZOS et al. 2003). In Kombination mit der Ovum-Pick-Up (OPU)-Technologie zur Gewinnung von Eizellen von lebenden Tieren liegen die Entwicklungsraten zu einem transfertauglichen Embryo an Tag 7 ebenfalls bei 25-40 %. Somit steht mit der kombinierten OPU-/IVP-Technologie ein alternatives Verfahren zu den klassischen MOET-Programmen (Multiple Ovulation and Embryo Transfer, Superovulation mit anschließendem Embryotransfer) zur Verfügung (P IETERSE et al. 1991b). Nach dem Transfer von IVPEmbryonen auf Empfängertiere werden bei frisch transferierten Embryonen Trächtigkeitsraten von ca. 50 % (W RENZYCKI 2007) erziehlt, beim Transfer tiefgefrorener Embryonen durchschnittlich 40 % (G ALLI et al. 2001, L AZZARI et al. 2002, W RENZYCKI 2007). Trotz der enormen Verbesserung der IVP-Systeme weisen in vitro produzierte Embryonen nach wie vor eine schlechtere Qualität auf als in vivo gewonnene (N IEMANN et al. 2002, R I ZOS et al. 2002). Während die Qualität der Oozyte sich hauptsächlich auf die Anzahl der sich entwickelnden Blastozysten auswirkt (R IZOS et al. 2002), beeinflussen die Kulturbedingungen die Blastozysten hinsichtlich ihrer Genexpressionsmuster (W RENZYCKI et al. 2007, G AD et al. 2012), ihrer Fähigkeit, eine Trächtigkeit zu induzieren und ihrer Gefriertauglichkeit (L O NERGAN et al. 2001, R IZOS et al. 2003). Die für die IVP verwendeten KOK werden routinemässig aus Schlachthofovarien oder durch die transvaginale, ultraschallgeleitete Follikelpunktion (OPU) gewonnen und nach morphologischen Kriterien ausgewählt. Die Entwicklungskompetenz der Oozyten bis zur Blastozyste ist hierbei durch den Zyklusstand des Tieres, die follikuläre Entwicklungsphase sowie die Follikelgröße beeinflusst. Im Gegensatz zu fertilen Schlachttieren haben OPU-Spendertiere aufgrund des ein bzw. zwei Mal wöchentlich durchgeführten OPU keinen physiologischen Zyklus (G IB 1 1 Einleitung et al. 1994, B ONI et al. 1997, P ETYIM et al. 2003). Die Entfernung der antralen Follikel auf dem Ovar induziert eine neue Follikelwelle, es erfolgt jedoch keine natürliche Ovulation. Je nach Punktionsintervall unterbleibt auch die Ausbildung eines dominanten Follikels (G IBB ONS et al. 1994, G ARCIA und S ALAHEDDINE 1998, C ARLIN et al. 1999, P ETYIM et al. 2003, L OPES et al. 2006). Somit sind auch die mit diesen Prozessen einhergehenden hormonellen Veränderungen beeinflusst. Aus diesem Grund kann die Situation der Follikel auf den Ovarien von Tieren, bei denen OPU angewendet wird, nicht mit denen von zyklischen Tieren verglichen werden. Es konnte bereits ein Zusammenhang zwischen dem Gehalt an Progesteron in der Follikelflüssigkeit mit sowohl der Morphologie als auch der Entwicklungskompetenz der aus dem Follikel gewonnenen Eizelle hergestellt werden (H AZELEGER et al. 1995). Um die OPU-/IVP-Technologie weiter zu verbessern, ist es deshalb notwendig, mehr über die Zusammenhänge zwischen den hormonellen Veränderungen und der Eizellqualität sowie die Rolle des hormonellen Umfeldes während der Eizellreifung zu erfahren. BONS Zur Verbesserung der IVP von Rinderembryonen wurden in den letzten Jahren verschiedenste Versuche bezüglich der Supplementation der Medien der einzelnen Produktionsschritte durchgeführt. Steroidhormone als natürliche Sexualhormone, deren Konzentration sich während des natürlichen Zyklus und damit auch während des Heranreifens von Oozyten in vivo ständig verändert (S CHAMS und B ERISHA 2002), spielten dabei immer wieder eine Rolle (F UKUI et al. 1982, S IROTKIN 1992, RYAN et al. 1999, S ILVA und K NIGHT 2000, M INGOTI et al. 2002). Bisher konnten jedoch keine eindeutigen Ergebnisse bezüglich deren Einfluss gewonnen werden. Der Wechsel vom dominierenden Estradiol zur Progesterondominanz im Follikel im Zeitraum zwischen LH-Peak und Ovulation (D IELEMAN et al. 1983) sowie die Expression der Progesteronrezeptoren in Oozyte und Kumuluszellen (A PARICIO et al. 2011) lassen eine Rolle von Progesteron bei der Eizellreifung vermuten (L ONERGAN 2011, FAIR und L ONERGAN 2012). Nach wie vor ist diese Rolle von Progesteron jedoch nicht ausreichend definiert (L ONERGAN 2011, FAIR und L ONERGAN 2012). Es ist außerdem ungeklärt, ob die Beeinflussung der Oozyte durch Steroide, insbesondere Progesteron, auf direktem oder indirektem Wege erfolgt. Die Darstellung der mRNA-Expression bei Rinderembryonen ist in den letzten Jahren ein viel beachtetes Thema geworden (N IEMANN und W RENZYCKI 2000). Frühe kritische Schritte der Entwicklung, wie Zeitpunkt der ersten Teilung, Aktivierung des embryonalen Genoms, Kompaktierung und Blastozystenbildung und -expansion können durch die Kulturmedien und die In-vitro-Bedingungen sowie durch die Produktionsverfahren selbst in erheblichem Maße beeinflusst werden. Diese Veränderungen betreffen sowohl eine signifikante Hoch- oder Herrunterregulation sowie die De novo-Induktion oder Abschaltung von Genen, die für eine ungestörte embryonale, fetale und neonatale Entwicklung von Bedeutung sind. Es konnte gezeigt werden, daß sich das höhere Entwicklungspotenzial von in vivo gereiften Eizellen im Gegensatz zu dem in vitro gereifter Oozyten auch auf molekularer Ebene wiederspiegelt (W RENZYCKI et al. 2007). Obwohl die Ausgangsqualität die wohl entscheidene Rolle für die Genexpressionsmuster darstellt, haben Untersuchungen des Einflusses der Follikelumgebung bzw. der IVM-Bedingungen auf bovine Oozyten und die darauf folgenden embryonalen Entwicklungsstadien bis zur Blastozyste auf molekularer Ebene bisher erst in den letzten Jahren stattgefunden [eine Übersicht der Arbeiten findet sich bei FAIR und L ONERGAN (2012)]. In dieser Arbeit soll nicht nur der Einfluss der sich ändernden peripheren Progesteronkonzentration durch ein Corpus luteum während des natürlichen Zyklus auf die reifende Eizelle in vivo 2 untersucht werden, sondern auch die Effekte verschiedener Progesteronkonzentrationen als Zusatz zum IVM-Medium. Dabei sollen anhand von Genexpressionsmustern die Veränderungen auf molekularer Ebene Beachtung finden. Der Fokus liegt jedoch nicht nur auf qualitätsanzeigenden Gentranskripten, sondern auch auf der mRNA-Expression der Progesteronrezeptoren. 3 4 2 Literatur 2.1 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) mit der Ovum-Pick-Up (OPU)-Methode Das OPU ist eine flexibel einsetzbare und wiederholbare Technik, um Eizellen für die In-vitroProduktion (IVP) von Embryonen vom lebenden Tier zu gewinnen. Bereits 1991 wurde die Methode als Alternative zum konventionellen Multiple Ovulation and Embryo Transfer (MOET) bezeichnet (P IETERSE et al. 1991b). 2.1.1 Die Entwicklung des OPU Gegen Ende der 1980er Jahre wurde das für den Menschen entwickelte OPU-Verfahren an das Rind adaptiert (P IETERSE et al. 1988) und die Technik in den darauf folgenden Jahren kontinuierlich verbessert. Das beinhaltete unter anderem Versuche mit verschiedenen Punktionskanülen. Die Verwendung zweilumiger Kanülen, bei denen das eine Lumen der Entfernung des Follikelinhaltes, das andere Lumen zur Zufuhr von Spülflüssigkeit diente, lieferte allerdings widersprüchliche Ergebnisse (F RY et al. 1994, S ASAMOTO et al. 2003). Die Verwendung von Einmalkanülen, die nach jeder Punktion gewechselt werden, bietet sowohl aus hygienischer als auch ökonomischer Sicht ein praktikables Handling (B OLS et al. 1995). Auch der Durchmesser sowie die Länge des Anschliffes sind wichtige Parameter bei der Eizellgewinnung (B OLS et al. 1997, L OPES et al. 2006). Ebenso beeinflusst das Aspirationsvakuum die Ergebnisse des OPU, insbesondere hinsichtlich der Wiederfindungsraten (B OLS et al. 1995, 1997), aber auch bezüglich der Qualität der gewonnenen KOK (B OLS et al. 1995, 1996, WARD et al. 2000, L OPES et al. 2006). In Bezug auf die Anzahl der Kumuluszellagen kann neben der Anpassung des Aspirationsdruckes auch die Veränderung des Durchmessers der Punktionskanüle eine Optimierung bewirken (H ASHIMOTO et al. 1999, S ASAMOTO et al. 2003). 5 2 Literatur 2.1.2 Vergleich des OPU mit anderen Methoden zur Gewinnung von Eizellen bzw. Embryonen beim Rind Für die Gewinnung von KOK zur anschließenden IVP von Embryonen gibt es verschiedene Verfahren. Aus Ovarien vom Schlachthof können KOK mittels Aspiration der Follikel (WARE et al. 1989) oder durch Slicing der Ovarien (X U et al. 1992) gewonnen werden. Am lebenden Tier wurden die transvaginale endoskopische Follikelpunktion (R EICHENBACH et al. 1994), die ultraschallgeleitete Follikelpunktion über die sakroischiale Region (C ALLESEN et al. 1987) und die transvaginale, ultraschallgeleitete Follikelpunktion [OPU; P IETERSE et al. (1988)] entwickelt. Eine Gewinnung von in vivo produzierten Embryonen ist mittels Spülung des Uterus möglich (H AHN 1978), was im MOET-Verfahren Anwendung findet. Über einen endoskopischen Eingriff können tubale Embryonalstadien entnommen werden (B ESENFELDER et al. 2001). Im Nachfolgenden sollen lediglich die meistgenutzten Verfahren (Gewinnung von KOK aus Schlachthofovarien, MOET) mit der OPU-Methode verglichen werden. Der große Vorteil des OPU gegenüber der Separation von Eizellen aus Schlachthofmaterial ist die mehrfach mögliche Anwendung bei wertvollen Tieren (B OLS et al. 1995). Jedoch ist die Qualität der Eizellen aus Schlachthofovarien in der Regel höher, da bei ihnen der sogenannte „post-mortem-Effekt“ eintritt (B LONDIN et al. 1997), der eine verbesserte Entwicklungskompetenz bedingt, und die Anzahl der Kumuluszelllagen durchschnittlich höher ist (B UNGARTZ et al. 1995). Ein weiterer Nachteil beim OPU ist die begrenzte Anzahl an KOK, die eine Selektion bezüglich der Qualität oft nicht zulässt (M ERTON et al. 2003, C HAUBAL et al. 2006). Vorteilhaft gegenüber dem MOET ist, dass die OPU-Technik auch bei graviden Tieren angewandt werden kann (RYAN et al. 1990, M ERTON et al. 2003). Dies bedingt nicht nur eine erhebliche Verkürzung des Generationsintervalls (M ERTON et al. 2003), sondern auch eine höhere Anzahl von Embryonen pro Zeiteinheit (G OODHAND et al. 1999, M ERTON et al. 2003). Obwohl die Fähigkeit, eine Trächtigkeit hervorzurufen bei IVP-Embryonen gegenüber der in vivo generierter Embryonen geringer ist (M ERTON et al. 2003), ermöglicht das OPU mit anschließender IVP die Produktion von über 50 Kälber pro Donortier im Jahr (VAN WAGTENDONK - DE L EEUW 2006). Auch kann bei der IVP Sperma verschiedener Bullen eingesetzt werden (G ALLI et al. 2001, M ERTON et al. 2003). Ferner kann im Gegensatz zum MOET beim OPU vollständig auf den Einsatz von Hormonen verzichtet werden (B UNGARTZ et al. 1995, G ALLI et al. 2004, C HAUBAL et al. 2006). Weiterhin ist eine schnelle Rückkehr der Tiere in den normalen Zyklus nach OPU belegt (P IETERSE et al. 1991b). Es ist allerdings zu beachten, dass beim OPU ein intensiveres „Tier-Handling“ mit entsprechenden Fähigkeiten bei der Manipulation des Genitaltraktes, die Bereitstellung des kostenintensiven OPU-Equipments sowie entsprechender Laboreinrichtungen für die anschließende IVP Vorraussetzung sind (B ROADBENT et al. 1997). Dies bedingt einen höheren Kostenaufwand als beim MOET (B ROADBENT et al. 1997, G ALLI et al. 2004, VAN WAGTENDONK - DE L EEUW 2006). Beim OPU besteht weiterhin ein höheres Risiko der Übertragung von infertilen Haplotypen in die Folgegeneration, da durch OPU Fertilitätsstörungen des Donortieres in stärkerem Maße als beim MOET umgangen werden können (VAN WAGTENDONK - DE L EEUW 2006). 6 2.2 Einfluss des OPU auf die Gesundheit des Donortieres 2.2 Einfluss des OPU auf die Gesundheit des Donortieres Wie jeder Eingriff, sei er noch so minimal, ist auch das OPU nicht ohne Auswirkungen auf die betroffenen Tiere. So können zum Beispiel in seltenen Fällen bedingt durch die Epiduralanästhesie Veränderungen im Bereich der Injektionsstelle beobachtet werden, die sich in Form von Neovaskularisation und Knorpelmetaplasie an den Intervertebralscheiben darstellen (M C E VOY et al. 2006). Eine Beeinträchtigung der Allgemeingesundheit (S ANTL et al. 1998, P ETYIM et al. 2003), der Fertilität (A LLER et al. 2010) sowie der Gravidität bis zum dritten Trächtigkeitsmonat (M EINTJES et al. 1993) scheinen jedoch nicht aufzutreten. Ebenso bleiben die Milchproduktion sowie die somatischen Zellzahlen in Milch und Blutplasma unbeeinflusst (C HASTANTM AILLARD et al. 2003). Eine Rückkehr zum physiologischen Zyklus ca. 3-4 Tage nach der letzten Punktion (C HASTANT-M AILLARD et al. 2003) mit physiologischem Verhalten (P ETYIM et al. 2007) sowie die Möglichkeit, das MOET-Verfahren anzuwenden (B ROADBENT et al. 1997), ist gegeben. Grundsätzlich wird durch OPU der physiologische Zyklus gestört (S TUBBINGS und WAL 1995, B ONI et al. 1997, B OLS et al. 1998, P ETYIM et al. 2000). Durch die Aspiration der Follikel wird der Interöstrus verlängert (S TUBBINGS und WALTON 1995), da die jeweils abgesaugten Follikel durch eine neue Follikelwelle ersetzt werden müssen. Dies deckt sich mit der Beobachtung verspäteter oder gestörter Brunsten bei OPU während der Lutealphase von TAKUMA et al. (2010). Der Zeitpunkt des OPU, aber auch das Punktionsintervall sind wesentliche Faktoren, die auf den Zyklus Einfluss nehmen. So konnten Bage et al. (BAGE et al. 2003) bei einem diskontinuierlichen OPU-Regime mit Punktionen lediglich bis zum 12. Zyklustag keine Auswirkungen auf den Zyklus beobachten. Auch die Arbeitsgruppe von P IETERSE et al. (1991a) konnte bei OPU-Sitzungen an Tag 4, 10 und 16 des Zyklus eine normale Zyklusaktivität feststellen. Kontinuierliche, einmal wöchentlich stattfindende OPU-Sitzungen führen dagegen zu irregulären Zykluslängen (K LOSSOK et al. 1997), setzen die Zyklusaktivität aber nicht aus (G IBBONS et al. 1994, B ONI et al. 1997, G ALLI et al. 2001, P ETYIM et al. 2003). Bei zwei wöchentlichen Follikelpunktionen sind die Beobachtungen nicht einheitlich. P ETYIM et al. (2000) beschreiben gelegentlich auftretende Zyklusaktivität und Brunsten mit regulärer Zykluslänge, Östruslänge und physiologisch ablaufender Brunst. In den Untersuchungen der Arbeitsgruppen um B ONI et al. (1997) und G IBBONS et al. (1994) zeigte sich dagegen keine Zyklusaktivität. TON 2.3 Einfluss des OPU auf den ovariellen Zyklus In Bezug auf das Ovar konnten keine wesentlichen, makroskopisch erkennbaren Veränderungen festgestellt werden (P ETYIM et al. 2007), jedoch verändert sich die Struktur des Ovars (P ETYIM et al. 2001). In einigen Fällen können Vernarbungen und Verhärtungen der Ovarien auftreten. Verdickungen der Tunica albuginea (VAN DER S CHANS et al. 1991, P ETYIM et al. 2001) sowie Fibrosierungen und hämatomartige Follikel wurden beobachtet (P IETERSE et al. 1988, VAN DER S CHANS et al. 1991, P ETYIM et al. 2000). Jedoch sind jegliche Veränderungen 8 Monate nach der letzten Follikelpunktion nicht mehr sichtbar (C HASTANT-M AILLARD et al. 2003), so dass langfristig kein negativer Effekt auf die follikuläre und luteale Aktivität des Ovars besteht (P ETYIM et al. 2000, M C E VOY et al. 2002). Eine Beeinflussung der Ovarfunktion während längerer Zeiträume kontinuierlichen OPUs ist belegt (C ARLIN et al. 1999). So 7 2 Literatur führt das Absaugen aller Follikel zur Auslösung einer neuen Follikelwelle und kann diese sogar synchronisieren (G ARCIA und S ALAHEDDINE 1998). Dies geschieht auch, wenn lediglich die Follikel eines der beiden Ovarien abgesaugt werden (TAKUMA et al. 2008). Ein zweimal wöchentliches OPU-Regime erhöht die Follikelwellenfrequenz (B ONI et al. 1997), wobei eine neue Follikelwelle innerhalb von 2 (G ARCIA und S ALAHEDDINE 1998) bzw. 3 (B ONI et al. 1997) Tagen entsteht. B ONI et al. (1997) beschreiben ferner einen Anstieg der Follikelzahl über die ersten drei Monate und ein anschließendes Absinken im 4.-6. Monat. Auf ein bestehendes Corpus luteum (C.l.) gibt es anscheinend keinen Einfluss (P IETERSE et al. 1991a). Die Bildung C.l.-ähnlicher Strukturen aus punktierten Follikeln wird unter anderem durch P ETYIM et al. (2000) beschrieben. Für eine östrusnahe Punktion von Follikeln ist die Bildung physiologischer Gelbkörper (P ETYIM et al. 2001, 2003) beschrieben, wohingegen die östrusferne Punktion von Follikeln zu kleineren C.l.-ähnlichen Strukturen führt, deren Progesteronproduktion und Lebensdauer geringer ist (G IBBONS et al. 1994, P ETYIM et al. 2001, 2003). H AYASHI et al. (2006) konnten hingegen keine C.l.-Bildung bei der Punktion eines dominanten Follikels vor dem LH-Peak beobachten. Eine Punktion nach dem LH-Peak führte in dieser Studie zu normalen C.l.. Zusammen mit dem Zyklus werden auch die damit einhergehenden Hormonprofile, insbesondere von Progesteron (P4), durch fehlende bzw. unzureichende Gelbkörperbildung, Luteinisierendem Hormon (LH) und Follikel stimulierendem Hormon (FSH) beeinflusst (C ARLIN et al. 1999). In Bezug auf FSH konnte eine vermehrte Ausschüttung am Tag nach der Follikelpunktion festgestellt werden (P ETYIM et al. 2001). 2.4 Einflüsse des Zyklusstandes auf die Ergebnisse des OPU Die Ergebnisse des OPU in Bezug auf die Anzahl der punktierten Follikel und die Eizellausbeute werden durch vielfältige Faktoren beeinflusst. So sind das jeweils punktierte Individuum (L ANSBERGEN et al. 1995, B ONI et al. 1997, G ALLI et al. 2001, M ERTON et al. 2003, TA MASSIA et al. 2003), die Ernährung des Tieres (D OMINGUEZ 1995), das Alter (S U et al. 2012) bezogen auf den körperlichen Entwicklungsstand (G ALLI et al. 2001), eine etwaige Trächtigkeit (M ORENO et al. 1993, D OMINGUEZ 1995) und die Zeit seit dem letzten Partus (R IZOS et al. 2005) von Bedeutung. Nicht auszuwirken scheint sich hingegen die Anzahl der vorangegangenen Kalbungen (L ANSBERGEN et al. 1995). Von technischer Seite aus können die Modalitäten des Ultraschallequipments Einfluss nehmen (M ERTON et al. 2003). Einfluss auf die Anzahl der KOK besteht einerseits von Seiten des Durchführenden (L ANSBERGEN et al. 1995, M ERTON et al. 2003), andererseits auch durch technische Modalitäten. So konnten etwa der Aspirationsdruck und der Nadeldurchmesser (H ASHIMOTO et al. 1999) als Faktoren benannt werden. Die Berichte über den Einfluss des Zeitintervalls zwischen den OPU-Sitzungen sind nicht einheitlich. So konnten VAN DER S CHANS et al. (1991), G ARCIA und S ALAHEDDINE (1998), G OODHAND et al. (1999), C HAUBAL et al. (2006) und H ANSTEDT (2009) bei zweimal wöchentlich stattfindenden OPU-Sitzungen mehr Follikel aspirieren als bei einmal wöchentlicher Punktion. Die Forschungsgruppe um R AMOS et al. (2010) punktierte im einmal wöchentlichen Rhythmus mehr Follikel als bei zweimal wöchentlichen Sitzungen. Bezüglich der Eizellausbeute wirkt sich ein 2-Tages-Intervall des OPU offenbar ungünstig aus, jedoch sind bei 4-5-Tages- 8 2.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Qualität der KOK Intervallen anteilig mehr große Follikel vorhanden (B ONI et al. 1997), welche eine schlechtere Qualität der KOK aus den subordinaten Follikeln bewirken. Bezüglich hormoneller Beeinflussung scheint sich die Gabe von FSH positiv auf die Follikelzahl auszuwirken (D E ROOVER et al. 2008, A LLER et al. 2010). Auch eine Erhöhung der Eizellausbeute ist durch hormonelle Gaben (FSH, GnRH) möglich (B ORDIGNON et al. 1997, A LLER et al. 2010). Die Anzahl der vorhergehenden OPU-Sitzungen ist ebenfalls von Bedeutung. So ist die Follikelzahl bei Tieren, die vorher nie der OPU-Prozedur unterzogen wurden, größer (B OLS et al. 1998). Weiterhin scheint die Follikelzahl über längere Punktionszeiträume zunächst anzusteigen, um dann nach 4-6 Monaten wieder abzufallen (B ONI et al. 1997). Über den Einfluss des Zyklusstandes gibt es keine einheitlichen Erkenntnisse. P ETYIM et al. (2000) beobachteten eine geringere Anzahl an Follikeln bei Tieren, die ein C.l. aufwiesen, B OE DIONO et al. (1995) und D OMINGUEZ (1995) konnten dies jedoch nicht bestätigen. 2.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Qualität der KOK Bei der Beeinflussung der Eizellqualität sind zunächst einmal technische Parameter zu nennen. So ist belegt, dass ein hohes Vakuum einerseits zu weniger Kumuluszellen an den KOK führt (B OLS et al. 1995) und andererseits auch die Entwicklungsraten zur Blastozyste negativ beeinflusst (B OLS et al. 1996, WARD et al. 2000). Hinsichtlich des Punktionsintervalles ist zu berücksichtigen, dass bei einmal wöchentlichen Punktionen dominante Follikel ausgebildet werden können (G ARCIA und S ALAHEDDINE 1998, P ETYIM et al. 2003, L OPES et al. 2006). Bei einem Intervall von 3-4 Tagen entwickelt sich kein Follikel mit ausgeprägter Dominanz, was den potenziell negativen Effekt auf die Entwicklungskompetenz der subordinaten Follikel fehlen lässt (G IBBONS et al. 1994, B UNGARTZ et al. 1995). H ENDRIKSEN et al. (2004) erhielten bei Punktionsintervallen von 2-5 Tagen mehr IVPtaugliche KOK als bei 7-Tages-Intervallen. Im Gegensatz dazu konnte H ANSTEDT (2009) keinen Einfluss des Punktionsintervalles auf die KOK-Qualität, die IVP-Tauglichkeit sowie die Teilungs- und Entwicklungsraten feststellen. In dieser Studie wurde ein 7-tägiges Intervall mit 3- bis 4-tägigen Punktionsabständen verglichen. Beim 3- bis 4-Tages-Intervall liegt auch eine reduzierte Inzidenz von Atresie vor, da die Follikel bereits vor der Atresieinduktion, welche sich am fünften Tag der Follikelwelle strukturell manifestiert (A SSEY et al. 1994), entfernt werden (G ARCIA und S ALAHEDDINE 1998, G AL LI et al. 2001, L OPES et al. 2006). Während der Follikelatresie kommt es zu degenerativen Prozessen, welche mit dem Schrumpfen der Eizelle und der Granulosazellen bis zum völligen Verschwinden einhergeht (S CHNORR und K RESSIN 2001). Oozyten aus früh-atretischen Follikeln zeigten in einigen Studien ein gutes Entwicklungspotential (B LONDIN und S IRARD 1995, DE W IT et al. 2000), was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass die ersten atretischen Veränderungen denen der Eizellreifung ähneln (A SSEY et al. 1994). Während in einer Untersuchung keine Unterschiede in den Teilungs-und Entwicklungsraten von KOK aus ein- bzw. zweimal wöchentlich durchgeführtem OPU beobachtet werden konnten (C HAUBAL et al. 2006), schlossen andere Autoren in ihren Veröffentlichungen, dass 9 2 Literatur die Teilungs- und Entwicklungsraten von aus OPU-KOK entstandenen Embryonen durch die Dauer des Punktionsintervalles beeinflusst werden (H ANENBERG und VAN WAGTENDONK - DE L EEUW 1997, L OPES et al. 2006). So zeigten KOK aus zweimal wöchentlich durchgeführtem OPU höhere Entwicklungsraten als solche aus einmal wöchentlichen Punktionen (L OPES et al. 2006). Einige Autoren folgern daraus, dass ein einmal wöchentliches OPU-Regime für kommerzielle Embryotransfer-Programme inadäquat ist (L OPES et al. 2006). 2.6 Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten Grundlage einer erfolgreichen Produktion von Embryonen ist die Qualität bzw. die Entwicklungskompetenz der in der IVP eingesetzten Oozyten. Diese wird meist funktionell definiert und über die Fähigkeit zum Meioseabschluss, zur Befruchtung und anschließenden Teilung, der Entwicklung zur Blastozyste, der Fähigkeit der Induktion und Erhaltung einer Trächtigkeit, der Erhaltung der Gesundheit des Feten und schließlich der Geburt eines gesunden und fertilen Kalbes gemessen (L ONERGAN et al. 2001, S IRARD et al. 2006, A NGUITA et al. 2007). Dementsprechend kann die Entwicklung zur Blastozyste auch als Maß für die Qualität der eingesetzten KOK herangezogen werden. G ILCHRIST und T HOMPSON (2007) bezeichnen bereits die Fähigkeit der Eizelle, über Sezernierung bestimmter Faktoren ihre Umgebung zu beeinflussen als Teil ihrer Entwicklungskompetenz. Eine vollständige Beurteilung der Entwicklungskompetenz bis hin zur Geburt eines vitalen Kalbes ist in Versuchen kaum möglich. Optimal für die Effizienz der IVP wäre eine Beurteilung der KOK schon vor ihrer Gewinnung. Aus bisherigen Untersuchungen konnten beim Rind jedoch keine verlässlichen Indikatoren gefunden werden, um die Qualität von Eizellen aus Follikeln bestimmter Größe vorauszusagen (K ENDRICK et al. 1999). Zwar stellten PAVLOK et al. (1992) bei Eizellen aus Follikeln der Größen >2 mm bis 8 mm keine Unterschiede der Blastozystenraten fest, bei zwei Dritteln der eingesetzten Eizellen traten jedoch Unregelmäßigkeiten bei Fertilisation und Entwicklung zur Blastozyste auf. Die Autoren führen dies auf atretische Vorgänge in den Follikeln, denen diese Eizellen entstammten, zurück. Dies deckt sich mit früheren Untersuchungen von S CARAMUZZI et al. (1980) und M C NATTY et al. (1984), die jeweils eine höhere Inzidenz von Atresie in Follikeln < 5 mm festgestellt hatten. Auch Arbeiten von FAIR (2003) ergaben, dass die Entwicklungskompetenz zur Blastozyste erst ab einer Follikelgröße von 3 mm gegeben ist, da die Eizelle dann die Größe von 120 µm und somit meiotische Kompetenz (FAIR et al. 1995, A NGUITA et al. 2007) sowie die Fähigkeit der Entwicklung bis zur Blastozyste (OTOI et al. 1997) erreicht hat. Eine Beurteilung der KOK hinsichtlich ihrer Qualität findet daher in der Regel nach ihrer Gewinnung statt. Eine Einteilung aufgrund von morphologischen Kriterien zeigte sich als geeigneter Indikator (H AZELEGER et al. 1995, B ONI et al. 2002). Dabei gilt die Größe der Eizelle als Indikator für die meiotische Kompetenz (siehe oben). Die Anzahl der Kumuluszellen sowie die Beschaffenheit des Cumulus oophorus (M ADISON et al. 1992), aber auch Anzeichen von Degeneration der KOK wie Expansion der äußeren Kumuluszellagen und eine leichte Granulierung des Ooplasmas werden zur Beurteilung genutzt (B LONDIN und S IRARD 1995). Ebenso konnte inhomogenes und helles Ooplasma mit geringeren Entwicklungsraten in Zusammenhang gebracht werden (H AZELEGER et al. 1995). Kritiker führen jedoch den limitierten Erfolg 10 2.6 Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten dieser Methode an (C OTICCHIO et al. 2004). So könne anhand der genutzten Kriterien keine endgültige Aussage über die Entwicklungskompetenz gemacht werden (H AGEMANN 1999, M ERMILLOD et al. 1999). Zum Beispiel zeigen morphologisch gute KOK aus atretischen Follikeln eine geringere Entwicklungskompetenz als morphologisch ähnliche aus gesunden Follikeln (J EWGENOW et al. 1999, F ENG et al. 2007). Auch die Expansion des Cumulus oophorus wird als unzuverlässiges Kriterium beschrieben (RUSSELL et al. 2006). Insbesondere vor dem Schritt der In vitro-Reifung können Eizellen mit In vitro-Entwicklungskompetenz morphologisch stark variieren (DE L OOS et al. 1992). S ANTOS et al. (2008) nahmen eine Einschätzung der Entwicklungskompetenz über die Anzahl der Poren in der Zona pellucida sowie deren Durchmesser vor. Andere Autoren zogen die Dichte der Granulosazellen in der Follikelflüssigkeit (F ENG et al. 2007), den Gehalt an Wachstumshormonen (M ODINA et al. 2007), Aminosäuren (S INCLAIR et al. 2008) oder Progesteron (H AZELEGER et al. 1995) in der Follikelflüssigkeit oder die Aktivität des Enzyms Glucose6-Phosphatdehydrogenase mittels Brilliant-Kresyl-Blau-Färbung (B HOJWANI et al. 2007) für die Beurteilung heran. Während der IVP können die Formung (D OMINKO und F IRST 1992) des Polkörpers und eine frühe Vollendung der Kernreifung während der IVM (D OMINKO und F IRST 1997) sowie das Auftreten der Furchung nach der Fertilisation (WARD et al. 2001) als Hinweise auf die Entwicklungskompetenz dienen. Die Entwicklungskompetenz basiert auf multiplen Faktoren, von denen viele auf zellulärer bzw. molekularer Ebene angesiedelt sind und deshalb nur invasiv gemessen werden können (C OTICCHIO et al. 2004). Methoden zur Beurteilung der Kompetenz auf zellulärer und molekularer Ebene gehen zumeist mit der Zerstörung der Eizelle einher. Sie geben jedoch die Möglichkeit, objektive Parameter zur Beurteilung der Oozytenqualität zu finden (C OTICCHIO et al. 2004). Zur Umgehung dieser destruktiven Prozesse muss eine Korrelation zwischen invasiven, zerstörenden Methoden und nichtinvasiven, erhaltenden Methoden gefunden werden (A NGUITA et al. 2007). Eine gute Methode, ein weites Spektrum von Daten bezüglich der Eizellqualität zu erfassen, stellt die Analyse der MessengerRNA(mRNA)-Expression dar (L ECHNIAK 2002). Jedoch bedingt eine erhöhte mRNA-Expression bestimmter Gene nicht immer auch erhöhte Proteingehalte (G YGI et al. 1999), und Proteine sind nicht immer enzymatisch aktiv (S UMNER et al. 2003). Es wird deshalb nach Korrelationen zwischen der Kompetenz und den in der Follikelflüssigkeit bzw. dem IVM-Medium zu findenden Proteinen (E LLEDEROVA et al. 2004, G UPTA et al. 2009) und Metaboliten (S INGH und S INCLAIR 2007) gesucht. Mit der vollständigen Sequenzierung des bovinen Genoms entstand auch die Möglichkeit der globalen Analyse des Transkriptoms mit Hilfe von Microarray-Techniken. Im Gegensatz zur einzelnen Analyse der Gentranskripte mittels RT-qPCR kann hier eine Vielzahl von Genen gleichzeitig betrachtet werden. Globale Transkriptomanalysen boviner MII-Oozyten (M I SIRLIOGLU et al. 2006, K UES et al. 2008) sowie vergleichende Analysen reifer und unreifer Eizellen (M AMO et al. 2011) lieferten neue Informationen über die molekularen Veränderungen während der Eizellreifung und konnten das Vorhandensein aktiver Transkription während der Eizellreifung belegen (M AMO et al. 2011). O’S HEA et al. (2012) gelang über eine MetaAnalyse veröffentlichter Microarray-Daten die Identifizierung 63 potenzieller Markergene für die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten. 11 2 Literatur 2.7 Einfluss des Zyklusstandes auf die Entwicklungskompetenz boviner KOK Es gibt Hinweise auf den Einfluss des individuellen Tieres (TAMASSIA et al. 2003, G ALLI et al. 2004), der Rasse (L OPES et al. 2006), des Alters (S U et al. 2012) bezogen auf die Adoleszenz (PALMA et al. 1993, S TEEVES und G ARDNER 1999, R IZOS et al. 2005, M ALHI et al. 2007) und die damit verbundene Steroidbalance (S U et al. 2009), der Fütterung (D OMINGUEZ 1995, K ENDRICK et al. 1999, A DAMIAK et al. 2005), des Laktationsstatus (B UNGARTZ et al. 1995), insbesondere bei Hochleistung (L EROY et al. 2008), und einer etwaigen Trächtigkeit (M ORENO et al. 1993) auf die Kompetenz der KOK (siehe auch 2.1). Auch die Herkunft und die Methode der Gewinnung der KOK wirkt sich auf die Entwicklungsrate zur Blastozyste aus (G AD et al. 2012). Bei der Gewinnung von KOK aus Schlachthofovarien prägten B LONDIN et al. (1997) den Begriff des „post-mortem-Effektes“. Diese Autoren stellten fest, dass die Zeitspanne vom Tod des Tieres bis zur eigentlichen Eizellgewinnung über Veränderungen im follikulären Mikromilieu die Entwicklungskompetenz der Oozyten beeinflusst. Einer der Hauptfaktoren, die die Qualität von Eizellen beeinflussen, stellt das follikuläre Entwicklungsstadium dar. So besteht ein deutlicher Zusamenhang zwischen Follikelgröße und Entwicklungskompetenz der Oozyte. Eizellen aus kleinen Follikeln mit einem Durchmesser < 3 mm haben demnach ein signifikant geringeres Entwicklungspotential als solche aus größeren Follikeln (TAN und L U 1990, PAVLOK et al. 1992, L ONERGAN et al. 1994, B LONDIN und S IRARD 1995, R IZOS et al. 2002). Weiterhin ist die Entwicklungsrate bei Oozyten aus nicht-atretischen, intermediären und leicht atretischen Follikeln gleich (B LONDIN und S IRARD 1995). DE W IT et al. (2000) stellten sogar mit steigender Atresie ein zunehmendes Entwicklungspotential fest. A SSEY et al. (1994) prägten 1994 hierfür den Begriff der „Pseudomaturation“. Lediglich hoch atretische Follikel enthalten Oozyten mit herabgesetzter Kompetenz (DE W IT et al. 2000). Im Zusammenhang mit dem Follikelstadium wurde auch das hormonelle Umfeld der Eizelle im Follikel betrachtet. H AZELEGER et al. (1995) fanden dabei heraus, dass sich eine hohe Progesteronkonzentration in der Follikelflüssigkeit ungünstig auf die Eizellqualität auswirkt. Dies deckt sich mit den Erkenntnissen von B ELLIN und A X (1984), die mit steigender Atresie höhere Progesterongehalte in der Follikelflüssigkeit nachweisen konnten. Weiterhin ist bekannt, dass ein dominanter Follikel, insbesondere im späten Dominanzstadium, negativ auf die Qualität der Eizellen aus den subordinaten Follikeln einwirkt (H ENDRIK SEN et al. 2004, C HAUBAL et al. 2006). Auch bezüglich der Entwicklungskompetenz kann daher der Zeitpunkt bzw. das Intervall der Eizellgewinnung bedeutsam sein (siehe Kap. 2.2.3). Je länger die Dominanzphase, desto mehr degenerierte Oozyten und Embryonen treten auf (A H MAD et al. 1995, R EVAH und B UTLER 1996, C ERRI et al. 2009). R EVAH und B UTLER (1996) vermuten, das eine verfrühte nukleare Reifung der Eizellen dafür verantwortlich sei. Die Beobachtung von vermehrter Follikelatresie bei verlängerter Dominanzphase durch O USSAID et al. (2000) stützt diese These. Auch andere Autoren konnten höhere Teilungs- und Entwicklungsraten während der Wachstums- im Vergleich zur Dominanzphase feststellen (H AGEMANN 1999, M ACHATKOVA et al. 2004, N EMCOVA et al. 2006). Daher vermuten C ERRI et al. (2009) einen starken Einfluss der Länge der Dominanz auf die Entwicklungskompetenz bis Tag 6 der frühen Embryonalentwicklung. Ein weiterer Faktor, dem ein Einfluss auf die Entwicklungskompetenz zugeschrieben wird, ist die Anzahl der Follikel mit einer Größe von 2-5 mm auf dem Ovar. 12 2.7 Einfluss des Zyklusstandes auf die Entwicklungskompetenz boviner KOK Befinden sich demnach weniger als 10 Follikel der Größe 2-5 mm auf dem Ovar, so sind die Teilungs- und Entwicklungsraten zur Blastozyste der dort gewonnenen KOK deutlich verringert (G ANDOLFI et al. 1997, M ODINA et al. 2007). Bezüglich der C.l.-Präsenz zum Zeitpunkt der Eizellgewinnung gibt es keine eindeutigen Erkenntnisse. Einige Autoren beschreiben einen Einfluss des C.l. auf die Eizellqualität (B OE DIONO et al. 1995, L ANSBERGEN et al. 1995, S TUBBINGS und WALTON 1995), P ETYIM et al. (2003) und VASSENA et al. (2003) konnten dies jedoch nicht bestätigen. Auch in den Untersuchungen von DE W IT et al. (2000) wurde kein Einfluss des Zyklusgeschehens beobachtet. Weiterhin wurde der gezielte Einsatz von Hormonen zur Verbesserung der Entwicklungskompetenz untersucht. Dabei stellten B ORDIGNON et al. (1997) einen positiven Effekt von GnRH fest. Auch die Gonadotropine FSH und eCG wirken sich auf die Entwicklungsraten zu Embryonen aus (WANG et al. 1988, S ENDAG et al. 2008). Eine Aufstellung der untersuchten Parameter und deren Einfluss auf die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten findet sich in Tabelle 2.1. 13 2 Literatur Tabelle 2.1: Untersuchungen zu verschiedenen Parametern und deren Einfluss auf die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten Autor P LOURDE et al. (2012) L OPES et al. (2006) PALMA et al. (1993) S U et al. (2012) R IZOS et al. (2005) D OMINGUEZ (1995) K ENDRICK et al. (1999) A DAMIAK et al. (2005) B UNGARTZ et al. (1995) Parameter Herkunft der KOK in vivo vs. p. mortem Rasse Alter Alter 1 vs. 7-8 Jahre, Färse, Kuh Energiebilanz Reproduktionsphase TAN und L U (1990) PAVLOK et al. (1992) L ONERGAN et al. (1994) B LONDIN und S IRARD (1995) DE W IT et al. (2000) H AZELEGER et al. (1995) H ANSTEDT (2009) M ACHATKOVA et al. (2004) H ENDRIKSEN et al. (2004) C HAUBAL et al. (2006) N EMCOVA et al. (2006) C ERRI et al. (2009) B OEDIONO et al. (1995) DE W IT et al. (2000) P ETYIM et al. (2003) VASSENA et al. (2003) B ORDIGNON et al. (1997) S ENDAG et al. (2008) Kriterium ER Ergebnis in vivo ER↑ Morphologie Morphologie TR, ER TR, ER bei Holstein Qualität↑ bei Adulten Qualität↑ TR↑, ER↑ bei 1 Jahr alten TR↓ ,ER↓ bei Kühen ER↑ Defizit Qualität↓ ER Morphologie ER Morphologie, ER TR Morphologie, ER ER ER Morphologie Morphologie TR, ER Überversorgung ER↓ während Laktation Qualität↑, TR↑ < 2 mm TR↓, ER↓ > 6 mm TR↓, ER↓ < 2mm TR↓ < 2 mm Qualität↓, ER↓ < 2mm ER↓ ER↑ hohes P4 Qualität↓ erkennbarer Blutfluss Qualität↑, TR↑, ER↑ Morphologie, ER ER Qualität↓, ER↓ ER↓ TR, ER ER Morphologie ER ER Morphologie TR↑, ER↑ frühe Lutealphase ER ↑ keiner keiner ER↑ FSH Qualität↑ TR, ER Follikelgröße Atresie P4 in FF foll. Blutfluss DF C.l. GnRH FSH, eCG ER=Entwicklungsrate zur Blastozyste, TR=Teilungsrate, ↑= erhöht, ↓=verringert 2.8 Beeinflussung der follikulären Reifungsvorgänge durch peripheres Progesteron Nach wie vor gibt es keine klaren Beweise über den Effekt des peripher zirkulierenden Progesterons auf die Follikelentwicklung, die Fertilisation und die frühe Embryonalentwicklung (C ERRI et al. 2011b). 14 2.9 In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten Durch die Studien von S ANGSRITAVONG et al. (2002) wurde bekannt, dass die hohe Futteraufnahme während der Hochlaktation zu einem erhöhten Leberblutfluss sowie einer hohen Stoffwechselaktivität führt und sich dadurch die Menge an zirkulierendem P4 und E2 verringert. Den schnelleren metabolischen Abbau von P4 und E2 sehen die Autoren als Ursache für die herabgesetzte Fertilität hochleistender Milchkühe. W ILTBANK et al. (2006) beobachteten Veränderungen im Follikelwellenmuster infolge niedriger P4-Konzentrationen im Blut. Ausserdem scheint eine kurze P4-Exposition in kleineren ovulatorischen Follikeln zu resultieren, ohne dabei die Trächtigkeitsraten oder die Embryonenqualität zu beeinflussen (C ERRI et al. 2011b, D IAS et al. 2012). Zunehmend häufen sich die Hinweise, dass sowohl Zeitpunkt und Konzentration der P4-Exposition für die Beeinflussung der Fertilität insbesondere auf Follikel-/Eizellebene die entscheidende Rolle spielen (W ILTBANK et al. 2011). So assoziierten C ERRI et al. (2011a) Veränderungen in der Follikelflüssigkeitskomposition, der C.l.-Lebensdauer sowie eine geringere Fertilität mit niedrigen P4-Konzentrationen während der follikulären Entwicklung. Dabei waren die Estradiolgehalte der Follikelflüssigkeit des dominanten Follikels deutlich erhöht, während IGF-1 in geringeren Mengen enthalten war. Auch S HAHAM -A LBALANCY et al. (2001) und F ORTUNE et al. (2001) stellten erhöhte E2Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit nach niedrigen Blut-P4-Gehalten fest. Viele Autoren vermuten den Effekt des peripheren P4 in der Beeinflussung der LH-Ausschüttung (C ERRI et al. 2011b,a, R IVERA et al. 2011, P URSLEY und M ARTINS 2011). Schon I RE LAND und ROCHE (1982) entdeckten erhöhte LH-Pulsfrequenzen bei niedrigem Blut-P4. Spätere Arbeiten von ROBERSON et al. (1989), S IROIS und F ORTUNE (1990), C ERRI et al. (2011b), R IVERA et al. (2011) bestätigen dies. Eine hohe LH-Pulsfrequenz beschleunigt laut F ORTUNE et al. (2001) das Follikelwachstum und wird mit einer verfrühten Eizellreifung im Follikel (R E VAH und B UTLER 1996) und dementsprechend einer verminderten Eizellqualität (R EVAH und B UTLER 1996, D ENICOL et al. 2012) sowie einer schlechteren frühen Embryonalentwicklung (A HMAD et al. 1995, C ERRI et al. 2011b,a, R IVERA et al. 2011) in Verbindung gebracht. In der follikulären Wachstumsphase und während der Selektion des dominanten Follikels scheinen sich hohe periphere P4-Konzentrationen positiv auf die Entwicklungsraten und die Fertilität auszuwirken (C UNHA et al. 2008, B ISINOTTO et al. 2010, B ISINOTTO und S ANTOS 2011, NASSER et al. 2011, R IVERA et al. 2011, W ILTBANK et al. 2011, P URSLEY und M AR TINS 2011). Ein möglicher Einfluss des zirkulierenden P4 auf später ablaufende Vorgänge der frühen Embryonalentwicklung wird daher diskutiert (C ERRI et al. 2009, NASSER et al. 2011, R IVERA et al. 2011). 2.9 In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten Grundsätzlich besteht die IVP aus drei methodischen Schritten (siehe Abbildung 2.1). Zuerst die In-vitro-Reifung oder -Maturation (IVM), danach die In-vitro-Fertilisation oder -Befruchtung (IVF) und schlussendlich die mehrtägige In-vitro-Kultur [IVC; W RIGHT und B ONDIOLI (1981), BALL et al. (1984), N IEMANN und M EINECKE (1993), WARD et al. (2002), S IRARD et al. (2006)]. An dieser Stelle soll lediglich auf die Reifung (IVM) der Oozyten eingegangen werden. 15 2 Literatur Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der IVP beim Rind; modifiziert nach N IEMANN und M EINECKE (1993) Mittels OPU-Technik am lebenden Tier oder aus Schlachthofovarien post mortem per Aspiration oder Schneidemethode [Slicing, E CKERT und N IEMANN (1995)] gewonnene KOK werden anhand morphologischer Kriterien in IVP-taugliche und nicht-IVP-taugliche eingeteilt. IVPtaugliche KOK zeichnen sich durch mindestens eine vollständige Lage kompakten Kumulus und ein homogen dunkles Ooplasma aus (N IEMANN und M EINECKE 1993). Die Kumuluszellen sind wichtig für die Herstellung eines Mikromilieus aus Stoffwechselprodukten und Sekretionsprodukten, welches letzlich für die Penetration durch das Spermium wichtig ist (TANGHE et al. 2003). Eine Entfernung der Kumuluszellen vor der IVF wirkt sich negativ auf die Befruchtung der Eizellen aus (FATEHI et al. 2002). Im Anschluss an die Selektion der KOK beginnt die 24stündige IVM. Während dieser Zeit wird die zuvor im Ovar arretierte Prophase beendet und die meiotische Teilung fortgesetzt (N IEMANN und M EINECKE 1993, RÜSSE und S INOWATZ 1994, S IRARD et al. 2006, S IRARD und C OENEN 2006). Je nach Zustand der Eizellen und Mediumkomposition sind Maturationsraten von 66-95 % der eingesetzten Oozyten möglich (A DONA et al. 2008). 2.10 Beeinflussung der Eizell- und Embryonenqualität Ein wesentlicher Beitrag zum Erfolg der IVP wird durch die Qualität der eingesetzten KOK geleistet (siehe Kap. 2.2.3). Während die Eizellqualität die Ausbeute an Embryonen bestimmt, ist die Embryonenqualität unter anderem von den in den einzelnen Schritten eingesetzten Medien 16 2.11 Einfluss der Maturationsbedingungen auf die Eizell- und Embryonenqualität abhängig. Anfangs wurden komplexe Medien wie das Tissue Culture Medium 199 (TCM199) mit dem Zusatz von undefinierten Stoffen wie zum Beispiel Serum, semidefinierten Stoffen wie Bovines Serum Albumin (BSA) oder definierten Stoffen wie das Makromolekül Polyvinylalkohol (PVA) verwendet (E YESTONE und F IRST 1989). Obwohl diese Medien erfolgreich in der IVP eingesetzt wurden, erfolgte eine Weiterentwicklung der Kultursysteme, um die Embryonenqualität zu verbessern. Dies diente besonders dem Ziel, die Problematik des Large Offspring Syndromes (LOS) zu lösen. Das LOS wird durch signifikant höheres Geburtsgewicht, Polyhydramnion, Hydrops fetalis, verändertes Organwachstum, Defekte von Plazenta, Skelett und Immunsystem sowie eine hohe perinatale Mortalität charakterisiert (WALKER et al. 1996, K RUIP und DEN , DAAS 1997, YOUNG et al. 1998, R ENARD et al. 1999, S INCLAIR et al. 2000). Deshalb wurden einfache Medien entwickelt, die häufig auf Modifikationen des Synthetic Oviduct Fluid (SOF)-Mediums (T ERVIT et al. 1972) basieren, bei denen Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder PVA zugesetzt werden (K ESKINTEPE und B RACKETT 1996). Auch das Hamster Embryo Culture Medium (HECM) zählt zu diesen einfachen Medien. Bei Verwendung von TCM199, SOF oder HECM können Entwicklungsraten von mehr als 40 % erreicht werden (K ESKINTEPE und B RACKETT 1996, K RISHER et al. 1999, F ERGUSON et al. 2004). Es konnte gezeigt werden, dass die Entwicklungsraten in definierten Medien niedriger sind als bei der Verwendung semidefinierter (mit BSA-Zusatz) oder undefinierter (mit Serum-Zusatz) Medien (E CKERT und N IEMANN 1995, K ESKINTEPE und B RACKETT 1996, W RENZYCKI et al. 1999). Trotz dieser Verbesserungen ist die Qualität in vitro produzierter Embryonen immer noch deutlich schlechter als die in vivo gewonnener (N IEMANN et al. 2002, R IZOS et al. 2002). So können nach dem Transfer von IVP-Embryonen Trächtigkeitsraten von 30-40 % erziehlt werden, nach Embryotransfer oder nach künstlicher Besamung (KB) 50-70 % (M OORE und T HATCHER 2006). Im Allgemeinen wird auch von höheren Verlusten während der Trächtigkeit berichtet (H ASLER et al. 1995, G ALLI et al. 2001). M ARQUANT-L E G UIENNE et al. (1989) stellten eine geringere Anzahl an Zellen der Inner Cell Mass (ICM) bei IVP-Embryonen im Vergleich zu in vivo generierten fest. Die Qualität eines Embryos zeichnet sich nicht nur durch die Fähigkeit, eine Trächtigkeit zu induzieren und zu erhalten aus. Auch Parameter wie die Morphologie, die zeitliche Abfolge der Entwicklung sowie die Kryotoleranz sind qualitätsanzeigend (W RENZYCKI et al. 2005a). Eine langsamere Entwicklung in vitro (BARNES und E YESTONE 1990, G RIS ART et al. 1994) sowie eine geringere Kryotoleranz (RORIE et al. 1990, VOELKEL et al. 1992) konnten schon in den 1990er Jahren belegt werden. J IANG et al. (1992) zeigten in ihrer Arbeit, dass die Gesamtzellzahl des Trophoblasten ein gutes Kriterium zur Beurteilung der Qualität darstellt. Andere Autoren konnten einen Zusammenhang der Qualität mit der Fähigkeit zum Glukosestoffwechsel nachweisen (K RISHER et al. 1999, S TEEVES und G ARDNER 1999, H ER RICK et al. 2006). Auf molekularer Ebene konnte die Expression bestimmter Gentranskripte als Indikator für die Embryonenqualität identifiziert werden (W RENZYCKI et al. 2007). 2.11 Einfluss der Maturationsbedingungen auf die Eizell- und Embryonenqualität Wie vorhergehend angedeutet, nehmen die IVP-Bedingungen entscheidenden Einfluss auf die sich entwickelnden Embryonen und ihre spätere Güte. So kann allein die Dauer der Reifung die Ergebnisse bezüglich der Teilungs- und Entwicklungsraten wesentlich verändern (WARD et al. 17 2 Literatur 2002, PARK et al. 2005, AGUNG et al. 2006). Allgemein hat sich dabei herausgestellt, dass eine Reifungszeit von 18-24 h optimal ist. Längere Reifungszeiten führen zu einer sich negativ auswirkenden „Überreife“ (H YTTEL et al. 1986). Auch die Sauerstoffkonzentration während der Reifung wurde hinsichtlich ihres Einflusses untersucht. Die Ergebnisse differieren stark. Während H ASHIMOTO et al. (2000) höhere Entwicklungsraten bei 5 % O2 erzielten, wirkte sich die gleiche Sauerstoffkonzentration in Versuchen von P INYOPUMMINTR und BAVISTER (1995) und OYAMADA und F UKUI (2004) negativ aus. Die Untersuchungen von A BELE et al. (2012) konnten hinsichtlich der Teilungs- und Entwicklungsraten und der Embryonenmorphologie keinen Unterschied zwischen bei 20 % O2 gereiften und bei 5 % O2 gereiften KOK feststellen. Allerdings ist die Sauerstoffkonzentration wohl durchaus im Zusammenhang mit der Glukoseverfügbarkeit zu untersuchen. H ASHIMOTO et al. (2000) konnten bei sinkendem O2 und gleichzeitig steigender Glukosekonzentration erhöhte Entwicklungsraten beobachten. Die Komposition des IVM-Mediums kann die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten ebenfalls beeinflussen. So verändert der Gehalt an Serum (KORHONEN et al. 2010), Wachstumsfaktoren (I ZADYAR et al. 1998) oder Leptin (PAULA -L OPES et al. 2007) im Reifungsmedium die Ergebnisse hinsichtlich der Teilungs- und Entwicklungsraten. In den letzten Jahren wurden verschiedene Stoffe hinsichtlich ihres Einflusses auf die IVM geprüft. Die Tabelle 2.2 gibt eine Übersicht der untersuchten Zusätze und deren Effekt. 18 2.12 Einfluss der Steroidsupplementation während der IVM Tabelle 2.2: Effekte verschiedener Zusätze zum IVM-Medium auf die Entwicklungsraten in der IVP boviner Embryonen Autor L ONERGAN et al. (1994) A LI et al. (2004) TAKAGI et al. (1998) KONISHI et al. (1996) I ZADYAR et al. (1998) F UKUI (1989) B OEDIONO et al. (1994) L U et al. (1987), X U et al. (1988) H ARPER und B RACKETT (1993) L ONERGAN et al. (1996) S ALHAB et al. (2011) M AILLARD et al. (2010) PAULA -L OPES et al. (2007) A RIAS -A LVAREZ et al. (2011) C ORDOVA et al. (2011) A DONA et al. (2011) W IT und K RUIP (2001) J ORRITSMA et al. (2004) VAN H OECK et al. (2011) KORHONEN et al. (2010) KORHONEN et al. (2010) KORHONEN et al. (2010) WARZYCH et al. (2007) B OEDIONO et al. (1994) DE Substrat Follikelflüssigkeit (FF) FF kompetenter Follikel FF aus Zysten Granulosazellen FSH, Wachstumshormone FSH, LH, Estradiol (E2) LH ECS Effekt keiner positiv positiv positiv positiv keiner keiner positiv EGF positiv Adiponectin Leptin Leptin Leptin Leptin Cysteamin BDNF Harnstoff ungesättigte FS keiner positiv negativ bei 100 ng/ml keiner keiner keiner keiner negativ negativ FS-freie IVM Protein- und Hormon-freie IVM Serum-freie IVM Polyvinylpyrrolidon (PVP40) Glukose, FS, Cholesterol negativ negativ negativ negativ niedriger Gehalt positiv 2.12 Einfluss der Steroidsupplementation während der IVM Aufgrund ihrer ständigen Präsenz im Organismus während des Sexualzyklus sowie der sich verändernden Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit, rückten auch die Sexualsteroide Progesteron (P4), Testosteron (T) und Estradiol (E2) in den Fokus der Forschung. Die Erkenntnisse an verschiedenen Spezies liefern dabei wertvolle Hinweise auf deren Wirkungen, sind aber offenbar in Abhängigkeit von der Spezies sehr unterschiedlich. Bei Amphibien konnte mit Hilfe von markiertem Progesteron eine die meiotische Reifung auslösende Steroid-Eizell-Interaktion nachgewiesen werden (BANDYOPADHYAY et al. 1998). M OOR et al. (1980) stellten in ihren Studien an Schafoozyten fest, dass Änderungen im follikulären Steroidprofil während der Reifung zu Abnormalitäten führen, die sich besonders auf die IVF auswirken. Ein Zusatz von Steroiden zum Reifungsmedium von Schweinen ist offenbar nicht erforderlich, da laut D ODE und G RAVES (2002) die essentiellen Steroide durch die KOK 19 2 Literatur selbst sezerniert werden. Bei Zusatz von 100 µM Progesteron zum Reifungsmedium von Kaninchenoozyten findet eine reversible Blockade wesentlicher Reifeschritte statt, 10 µM scheinen dagegen keinen Effekt zu haben (S MITH et al. 1978). Beim Rind konnten bisher jedoch noch keine eindeutigen Aussagen über Beziehungen zwischen den Teilungs- und Entwicklungsraten oder der Embryonenqualität und der Präsenz dieser Hormone bzw. deren Konzentrationen im Reifungsmedium gemacht werden. Der Nachweis von Progesteronrezeptoren (PGR) an bovinen KOK gibt jedoch Hinweise auf eine Beteiligung von P4 bei Reifungsprozessen und der Erlangung der Entwicklungskompetenz (A PARICIO et al. 2011). Eine Übersicht der Arbeitsgruppen, die den Einfluss verschiedener Steroide während der IVM von Rinder-KOK untersucht haben sowie deren Ergebnisse findet sich in Tabelle 2.3. Tabelle 2.3: Effekte verschiedener Steroidsupplementationen im IVM-Medium für Rinder-KOK Autor Hormon F UKUI et al. (1982) P4 E2 P4 E2 P4 E2 T P4 T P4 T E2 RYAN et al. (1999) S IROTKIN (1992) S ILVA und K NIGHT (2000) M INGOTI et al. (2002) Konzentration (µmol/l) 3,2 3,2 0,32-3,2 0,32-3,2 0,16/0,8/3,2/16 0,016/0,16/0,32/1,6/3,2/16 0,032/0,32/3,2/16 0,3 0,1 3,2/8/16/32 3,2/8/16/32 3,2/8/16/32 Effekt keiner positiv positiv mit Gonadotropinen negativ positiv stimuliert Reinitiation keiner negativ keiner erhöht E2-Gehalt erhöht E2-Gehalt erhöht P4-Gehalt Einige Autoren (S ILVA und K NIGHT 2000) orientieren sich dabei an physiologisch in der Follikelflüssigkeit vorkommenden Konzentrationen. In Bezug auf den Steroidgehalt der Follikelflüssigkeit sind je nach Zeitpunkt der Entnahme im Zyklus (K RUIP und D IELEMAN 1985, W ISE 1987, E ISSA 1996), aber auch abhängig von der Größe der Follikel (K RUIP und D IELE MAN 1985, W ISE 1987, D E LOS R EYES et al. 2006, M ONNIAUX et al. 2008) sehr unterschiedliche Werte gemessen worden. Der Entwicklungsstand des einzelnen Follikels (wachsend, statisch, Atresiegrad, Dominanz) führt ebenfalls zu unterschiedlichen Steroidnachweisen (K RUIP und D IELEMAN 1985, M ARTIN et al. 1991, TAKAGI et al. 1993, P RICE et al. 1995). F ORTUNE und H ANSEL (1985) untersuchten sogar lediglich die Follikelflüssigkeit von präovulatorischen Follikeln im Zeitraum vom Proöstrus bis 24 h nach dem Östrus. D IELEMAN et al. (1983) teilten die Zeit vom Beginn des Östrus bis zur Ovulation anhand des LH-Peaks ein. Sie fanden dabei heraus, dass die Zeit vor dem LH-Peak durch hohe E2-Konzentrationen (6,05 µmol/l) gekennzeichnet ist und P4 erst nach dem LH-Peak ansteigt (P4 vor LH-Peak 0,39 µmol/l, nach LH-Peak 0,73 µmol/l). Alle untersuchten Steroidhormone (E2, P4, T) verringern sich im Zeitraum 6-12 h nach dem LH-Peak. Für E2 und T hält dies bis zur Ovulation an. Für P4 konnte allerdings ein massiver Anstieg in der Zeit 20 h nach LH-Peak (0,39 µmol/l) bis zur Ovulation 20 2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und Embryonen (1,51 µmol/l) gemessen werden. Geht man davon aus, dass physiologischerweise die Eizelle in der Zeit des Östrus bis zur Ovulation ihre zweite Reifeteilung vollzieht, so ist dieser Vorgang offensichtlich in ein Milieu mit wechselnden Steroidkonzentrationen eingebettet. In Bezug auf die Kultur der fertilisierten Oozyten gibt es ebenfalls Hinweise auf Beeinflussungen der präimplantatorischen Embryonalentwicklung durch Steroide, insbesondere P4 (R EGGIO et al. 1997, G OFF und S MITH 1998, S HIMADA und T ERADA 2002, F ERGUSON et al. 2004, M ERLO et al. 2006). Auch diesbezüglich sind die Ergebnisse allerdings nicht einheitlich und werden kontrovers diskutiert. 2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und Embryonen Der Begriff Transkription bezeichnet die durch verschiedene regulierende Mechanismen gesteuerte Synthese von RNA nach Vorlage der DNA. So entstehende mRNA dient als Matrize für die Proteinsynthese. Die jeweilige mRNA wird abhängig vom Wachstum und dem zeitlichen Entwicklungsverlauf in speziesspezifischen Mustern exprimiert (N IEMANN und W RENZYCKI 2000). Die präimplantatorische Embryonalentwicklung beruht auf der korrekten Umsetzung des genetischen Programms der Eizelle bzw. des Embryos in Form einer gut abgestimmten Expression maternaler bzw. maternaler und embryonaler Gene (K IDDER 1992) in einem geeigneten Umfeld. Der Embryo durchläuft während dieser frühen Entwicklungsphase die ersten Teilungen, die (Haupt-)Aktivierung des embryonalen Genoms im 8- bis 16-Zell-Stadium, die Kompaktierung zur Morula sowie die Ausbildung der Blastozyste und die damit verbundene erste Differenzierung der embryonalen Zellen in die ICM und das Trophektoderm (TE). Es ist bekannt, dass sich die Expression entwicklungsrelevanter Gentranskripte bei in vivo und in vitro generierten Embryonen deutlich unterscheidet (W RENZYCKI et al. 1998, K EPKOVA et al. 2011, P LOUR DE et al. 2012). Die Veränderungen in den Genexpressionsmustern können sich als Hoch- oder Herunterregulierung, De novo-Induktion oder Stillegung von Genen äußern (W RENZYCKI et al. 2005b). Dies kann eine verringerte Qualität der Embryonen bedingen, die sogar die Überlebensfähigkeit der Nachkommen nach einem Transfer beeinflussen könnte (W RENZYCKI et al. 2007) und zu abnormalen Entwicklungen, wie sie zum Beispiel unter dem Begriff des zuvor bereits erwähnten LOS zusammengefasst werden, führen (W RENZYCKI et al. 2005b). Dementsprechend können die den Veränderungen unterliegenden Transkripte als Marker für die Qualität und Entwicklungskompetenz angesehen werden (L EQUARRE et al. 1997, W RENZYCKI et al. 1999, 2001, N EMCOVA et al. 2006). In der IVP können die einzelnen Schritte der präimplantatorischen Embryonalentwicklung durch die Maturations- und Kulturbedingungen über eine veränderte Expression wichtiger Gentranskripte wesentlich beeinflusst werden (W RENZYCKI et al. 1999, N IEMANN und W RENZYCKI 2000, L ONERGAN et al. 2001, W RENZYCKI et al. 2001, N IEMANN et al. 2002, W REN ZYCKI et al. 2004, S AGIRKAYA et al. 2006, D RIVER et al. 2012, G AD et al. 2012). Dabei wird die Reichhaltigkeit an bestimmten Gentranskripten nicht nur durch das Basismedium, sondern auch durch Proteinsupplementation (W RENZYCKI et al. 1999, 2001, S AGIRKAYA et al. 2006, W RENZYCKI et al. 2007) oder Makromoleküle (WARZYCH et al. 2007) beeinflusst. Insbeson21 2 Literatur dere die Präsenz exogener Proteine scheint einen stadienabhängigen Einfluss auf den Zeitpunkt und die Schwere der Veränderungen in den Genexpressionsmustern zu haben (W RENZYCKI et al. 1999). Bisher gibt es nur lückenhafte Erkenntnisse über den Effekt der Reifungsumgebung auf die Genexpression. Dabei sind die während der Reifung ablaufenden Schritte der Polyadenylation der RNA, der Spindelformation sowie Anordnung und Trennung der Chromosomen besonders störanfällig (FAIR 2010). Längere Zeit wurde davon ausgegangen, dass während der Reifungsphase kaum aktive Translation stattfindet (FAIR et al. 1995), sondern vielmehr ein während der Wachstumsphase angelegter Vorrat an Transkripten die Entwicklung bis zur Aktivierung des embryonalen Genoms vorantreibt. M AMO et al. (2011) entdeckten in einer Studie, dass der angelegte Vorrat an Transkripten während der Reifung zwar schrumpfte, gleichzeitig aber eine Überexpression bestimmter Gene stattfand, die das Vorhandensein von Transkription vermuten lässt, welche offenbar den schwindenden Vorrat ergänzt bzw. aufstockt. Dies lässt Spekulationen über Einflüsse der Reifungsumgebung auf die Genexpression zu, wie sie auch schon durch andere Autoren vermutet wurden (W RENZYCKI et al. 1999, WATSON et al. 2000, L ONERGAN et al. 2003a,b, H UMBLOT et al. 2005, WARZYCH et al. 2007). K UES et al. (2008) und K ATZ JAFFE et al. (2009) wiesen einen Unterschied in den Genexpressionsmustern zwischen in vivo und in vitro gereiften Oozyten im Meiose-II-Stadium nach. In den Studien von H ANSTEDT (2009) zeigten Oozyten, die mittels der OPU-Technik in einem Intervall von 7 Tagen gewonnen wurden, eine Herrunterregulation von 4 qualitätsanzeigenden Genen gegenüber Eizellen, die im 3- bis 4-Tages-Intervall gewonnen wurden. WATSON et al. (2000) zeigten eine Beeinflussung der mRNA-Mengen durch die Komposition des IVM-Mediums. Supplementation des Reifungsmediums mit Serum (W RENZYCKI et al. 1999, C ALDER et al. 2001, 2005, S AGIRKAYA et al. 2007, WARZYCH et al. 2007), Makromolekülen [PVA; W RENZYCKI et al. (1999)] oder Leptin (PAULA -L OPES et al. 2007) wirkt sich ebenfalls deutlich auf die Transkription aus. Eine detaillierte Darstellung der einzelnen Supplemente sowie der beeinflussten Transkripte findet sich in dem Übersichtsartikel von W RENZYCKI et al. (2007). Im Folgenden sollen einige entwicklungsrelevante Gene, die sich als von äußeren Faktoren beeinflusst gezeigt haben [eine Übersicht der Veröffentlichungen findet sich bei W RENZYCKI et al. (2007)], näher beschrieben werden. Sie gelten als Markergene zur Einschätzung der Eizellbzw. Embryonenqualität bezüglich ihrer Herkunft bzw. der angewandten biotechnischen Verfahren. Davon sind Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) und Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) an der Follikulogenese beteiligt, Hypoxia Inducible Faktor 2-α (HIF2α) an der Stressprotektion und der Glukosetransporter 1 (SLC2A1) am Energiestoffwechsel. 2.13.1 Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) Beim Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) handelt es sich um ein Polypeptid der Transforming Growth Factor (TGF)-β-Superfamilie. Von anderen Mitgliedern dieser Familie unterscheidet es sich durch Unterschiede im COOH-Terminus und durch das Fehlen des vierten und siebten der sieben Cysteine im Bereich des COOH-Endes (M C P HERRON und L EE 1993). Die Sequenz für GDF9 wurde zuerst bei der Maus entdeckt (M C P HERRON und L EE 1993). Ein Knockout dieses Gens führt bei weiblichen Mäusen zu kompletter Infertilität, da die Follikel- 22 2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und Embryonen entwicklung nur bis zum Primärfollikel stattfindet (D ONG et al. 1996). Auch eine Follikelatresie findet bei solchen Mäusen nicht statt. Dies lässt vermuten, dass der Block der Follikelentwicklung vor der Erlangung der Atresie-Fähigkeit stattfindet (D ONG et al. 1996). Bei Rindern führte die Immunisierung gegen GDF9 zu einer veränderten Follikelentwicklung bezüglich Anzahl und Größe der Follikel und teils erhöhten, teils verringerten Ovulationsraten (J UENGEL et al. 2009). Über die Regulation von Schlüsselfunktionen der Granulosazellen ist GDF9 an der Proliferation selbiger beteiligt (S PICER et al. 2006). Weiterhin ist es mitverantwortlich für die Kumuluszell-Expansion und die Erhaltung des die Eizelle umgebenden Mikromilieus (E LVIN et al. 1999). Bisher wurde vermutet, dass GDF9 ausschliesslich von Eizellen sezerniert wird (E RICKSON und S HIMASAKI 2000). Neuere Untersuchungen von H OSOE et al. (2011) konnten die Expression von GDF9 jedoch auch in Kumuluszellen nachweisen. Die mRNA von GDF9 ist ab dem Primordialfollikel (B ODENSTEINER et al. 1996) über die Reifung und Fertilisation bis zum 5- bis 8-Zell-Stadium nachweisbar (S ENDAI et al. 2001, P ENNETIER et al. 2004). In Studien von S OMFAI et al. (2011) verringerte sich der Gehalt von GDF9 in der Oozyte während der IVM unabhängig von der Medienkomposition. Eizellen aus Follikeln mit einer Größe von ≥5 mm enthalten deutlich mehr Transkripte von GDF9 als solche aus Follikeln ≤2 mm (D ONNISON und P FEFFER 2004). Bei der Eizellgewinnung mit dem OPU-Verfahren hat sich gezeigt, dass bei einer Punktion im 7-Tages-Intervall die Transkriptmenge von GDF9 in den Oozyten signifikant geringer ist als beim 3- bis 4-Tages-Intervall (H ANSTEDT 2009). Neuere Untersuchungen von C HU et al. (2012) zeigten eine höhere GDF9-Expression in 2-6 h vor dem LH-Peak gewonnenen Oozyten gegenüber 22 h nach dem LH-Peak. Beim Vergleich in vivo gereifter Eizellen mit in vitro gereiften ist eine deutliche Herunterregulierung des Gens festzustellen (L ONERGAN et al. 2003a). H USSEIN et al. (2006) zeigten, dass ein Zusatz von GDF9 zum In vitro-Reifungsmedium die Blastozystenrate tendenziell, in Kombination mit BMP15 signifikant erhöht. Eine Antagonisierung von GDF9 und/oder BMP15 senkte die Blastozystenrate in selbiger Studie deutlich herab. H OSOE et al. (2011) fanden heraus, dass in Ovarien von Kälbern wesentlich weniger GDF9-Transkripte vorhanden sind als in Eierstöcken adulter Tiere. Diese Autoren sehen hier einen möglichen Grund für die geringere Entwicklungskompetenz von Oozyten aus Kälberovarien. Auch G ENDELMAN et al. (2010) stellen eine Verbindung zwischen Entwicklungskompetenz und GDF9-Expression her. Diese Arbeitsgruppe stellte eine saisonal unterschiedliche Transkriptmenge in Zweizellembryonen fest und sehen hier den Grund für die geringere Entwicklungskompetenz von Eizellen, die in der heißen Jahreszeit gewonnen werden. 2.13.2 Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) Auch das Protein BMP15 gehört zur TGF-β-Superfamilie. Es unterscheidet sich von anderen Familienmitgliedern durch das Fehlen des vierten der sieben Cysteine in der COOH-terminalen Region, welches die kovalente Bindung von Dimeren bedingt (D UBE et al. 1998). Das Gen, auf dem BMP 15 kodiert, ist hochkonserviert und befindet sich auf dem X-Chromosom (D UBE et al. 1998). Bei Mäusen wird BMP15 nur in Oozyten beginnend im Primärfollikel bis über die Ovulation hinaus exprimiert (D UBE et al. 1998). Beim Rind konnten Transkripte für BMP15 von der Oozyte bis ins Blastozystenstadium hinein nachgewiesen werden (E L -S AYED et al. 2006). Dies deutet auf eine sowohl maternale als auch embryonale Expression hin. Neuere 23 2 Literatur Untersuchungen konnten auch die mRNA-Expression des Gens in Kumuluszellen darstellen (H OSOE et al. 2011). Versuche mit BMP15-Knockout-Mäusen ergaben eine Subfertilität bei weiblichen Mäusen, wohingegen die Fertilität männlicher Mäuse nicht beeinträchtigt schien. An den weiblichen Tieren konnten minimale histopathologische Defekte an den Ovarien, weniger Ovulationen und geringere Fertilisationsraten beobachtet werden (YAN et al. 2001). Eine zusätzliche partielle Ausschaltung des GDF9-Gens bewirkte weitere Veränderungen in Form von geschwächten Oozyten-Kumuluszell-Bindungen und einem Verbleiben der Eizelle im Follikel nach der Ovulation. Eine zusätzliche völlige Ausschaltung von GDF9 führte zu vermehrter ein- bzw. beidseitiger Zystenbildung (YAN et al. 2001). Eine kurzzeitige Immunisierung gegen BMP15 und GDF9 bewirkt bei Schafen eine erhöhte Ovulationsrate, die scheinbar ohne negative Effekte auf die Fertilisation, die embryonale und fetale Entwicklung oder die Trächtigkeitserhaltung vonstatten geht (J UENGEL et al. 2004). Auch gibt es bei Schafen natürliche Mutationen des BMP15-Gens, welche sich dosisabhängig in erhöhten Ovulationsraten oder infertilen Phänotypen zeigen (G ALLOWAY et al. 2000). In der IVM bewirkt der Zusatz von BMP15 eine geringere Kumuluszellapoptose (H USSEIN et al. 2006). Dies führte zu der Hypothese, dass BMP15 in vivo eventuell als antiatretischer Faktor auf die Follikel wirkt. Weiterhin verbessert der Zusatz von BMP15 die Entwicklungsraten zur Blastozyste, wohingegen ein Antagonist während der Reifungsphase die spätere Blastozystenformation hemmt (H USSEIN et al. 2006). H OSOE et al. (2011) wiesen einen geringeren Gehalt an BMP15-Transkripten in weniger entwicklungskompetenten Oozyten aus Kälbern gegenüber kompetenten Oozyten aus adulten Tieren nach. Dies lässt einen Zusammenhang zwischen der BMP15-Expression und der Entwicklungskompetenz boviner Eizellen vermuten. Andere Autoren (H ANSTEDT 2009) konnten zeigen, dass BMP15 in im 7-Tages-Intervall per OPU gewonnenen Eizellen gegenüber der Gewinung im 3- bis 4-Tages-Intervall herunter reguliert ist. 2.13.3 Glukosetransporter 1 (SLC2A1) Der Glukosetransporter 1 wurde erstmals durch M UECKLER et al. (1985) beschrieben und gehört zur Familie der Solute Carrier (SLC). Beim Rind sind 13 verschiedenen Isoformen bekannt, die sich alle durch ihre kinetischen Charakteristika, ihre gewebespezifische Verteilung sowie ihre Empfindlichkeit gegenüber hormonellen und anderen Stimuli unterscheiden (J OOST et al. 2002). Es handelt sich um Na+ -unabhängige Membranproteine mit einer transmembranalen Helix, einer intrazellulären Schleife, einem extrazellulären Element sowie einem intrazellulären C- und N-Terminus (M UECKLER et al. 1985). Die Glukosetransporter transportieren Glukose entlang eines Konzentrationsgradienten und regulieren den Transport zwischen intraund extrazellulärer Matrix (O LSON und P ESSIN 1996), wobei die Glukoseaufnahme durch eine wachstumsfaktorabhängige Rekrutierung der intrazellulären SLC2A1-Moleküle reguliert wird. Der SLC2A1 wird hauptsächlich an basolateralen Membranen wie an Blutgefäßen oder der Blut-Hirn-Schranke exprimiert (O LSON und P ESSIN 1996), konnte jedoch auch in unreifen Oozyten und allen Embryonalstadien nachgewiesen werden (W RENZYCKI et al. 1998, AUGUSTIN 24 2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und Embryonen et al. 2001). In der Entwicklung von der Oozyte zur Blastozyste wurde eine Abnahme der Expression während Reifung und Fertilisation und eine konstante Expression während des 2bis 8-Zellstadiums (L EQUARRE et al. 1997) beobachtet. Dem entsprechend zeigten verschiedene Studien der Stoffwechselaktivität während der frühen Embryonalentwicklung einen ersten Anstieg des Glucosemetabolismus im 8- bis 16-Zellstadium sowie einen weiteren Anstieg im Morulastadium bzw. bei der Blastulation (JAVED und W RIGHT 1991, R IEGER et al. 1992, K HURANA und N IEMANN 2000b). Dies deutet auf einen erhöhten Glukoseumsatz zum Zeitpunkt der Aktivierung des embryonalen Genoms und der Kompaktierung hin. Weiterhin wurde herausgefunden, dass die Expression des SLC2A1 sich je nach verfügbarer Glukosemenge verändert und bei Glukosemangel steigt (G ARDNER und K AYE 1995). L OPES et al. (2007) konnten einen Zusammenhang zwischen der SLC2A1-Expression und der Embryonenqualität in der Weise herstellen, dass eine hohe Transkriptmenge für eine gute Qualität spricht. In Versuchen von K NIJN et al. (2005) zeigten Embryonen aus in vitro gereiften Oozyten eine deutlich geringere SLC2A1-Expression als nach in vivo-Reifung. Auch andere Arbeitsgruppen konnten eine geringere Transkriptmenge von SLC2A1 in In vitro-produzierten Embryonen gegenüber In vivo-Embryonen feststellen (W RENZYCKI et al. 1999, L AZZARI et al. 2002, BALASUBRAMANIAN et al. 2007, R HO et al. 2007). Demgegenüber fanden P URPERA et al. (2009) eine höhere Transkriptmenge in in vitro produzierten Blastozysten als in in vivo produzierten. J IANG et al. (2011) konnten in in vitro produzierten, auf ein Empfängertier übertragenen Feten am 180. Trächtigkeitstag eine deutliche Herunterregulierung gegenüber in vivo erzeugten Feten nachweisen. Auch die Medienkomposition hat Einfluss auf die Transkriptmenge. So konnten S AGIRKAYA et al. (2007) zeigen, dass ein Zusatz von fetalem Kälberserum (Fetal Calf Serum, FCS) im IVM-Medium zu einer höheren Genexpression bezüglich SLC2A1 führt als synthetischer Serumersatz (Synthetic Serum Substitue, SSS). Der Zusatz von ungesättigten Fettsäuren (Non-Esterified Fatty Acids, NEFAs) während der IVM zeigte denselben Effekt (VAN H OECK et al. 2011). Bei der Supplementation des IVC-Mediums konnte beim Zusatz von Serum eine höhere Menge von SLC2A1 im Vergleich zu PVA detektiert werden (W RENZYCKI et al. 1999), eine Supplementation mit IGF-1 zeigte hingegen keine veränderte Expression von SLC2A1 (B LOCK et al. 2008). 2.13.4 Hypoxia Inducible Factor 2α (HIF2α) Bei den Hypoxia Inducible Transkriptionsfaktoren (HIF) handelt es sich um heterodimere DNABindungskomplexe (H ARVEY et al. 2004), die aus zwei Komponenten (HIFα und HIFβ) bestehen. Die Stabilität der HIFα-Untereinheit ist dabei abhängig vom Sauerstoffgehalt, Zytokinen und anderen Stimuli (WANG et al. 1995, S EMENZA 2001). Die HIFα-Untereinheit kommt in drei Formen [HIF1α (WANG et al. 1995), HIF2α (E MA et al. 1997, F LAMME et al. 1997, H OGENESCH et al. 1997, T IAN et al. 1997) und HIF3α (G U et al. 1998)] vor, wovon HIF1α erstmals durch WANG et al. (1995) am 3´Hypoxyresponsive-Element im Erythropoetin-Gen entdeckt wurde. HIF1α und HIF2α ähneln sich in ihrer Struktur. Sie besitzen eine Helix-LoopHelix-Domäne und ein Prolin-aktives Ende am N-Terminus sowie zwei transkriptaktivierende und eine inhibitorische Domäne am C-Terminus. 25 2 Literatur HIF regulieren adaptative Antworten auf Sauerstoffveränderungen und modulieren die Expression verschiedener Gene (S EMENZA 1998) für Angiogenese, Energiestoffwechsel, Zellproliferation und Vaskularisation (C OVELLO et al. 2005, H ARVEY et al. 2007). Sie konnten in alveolärem Lungenepithel, Gehirn, Herz, Leber und Niere nachgewiesen werden (E MA et al. 1997, F LAMME et al. 1997). In in vitro produzierten Blastozysten konnte die mRNA sowohl von HIF1α als auch HIF2α nachgewiesen werden, als Protein jedoch nur HIF2α (H ARVEY et al. 2004). HIF2α lokalisiert hauptsächlich in den Nuclei der ICM und dem TE (H ARVEY et al. 2004). Eine veränderte Expression HIF-regulierter Gene (SLC2A1) wurde in in vitro produzierten Blastozysten festgestellt (W RENZYCKI et al. 1998, 2001). Auch H ARVEY et al. (2007) beschrieben eine höchstwahrscheinlich durch HIF2 regulierte Veränderung der Genexpression in Blastozysten. Für die Expression von SLC2A1 ist die Regulation durch HIF belegt (H ARVEY et al. 2004). Die Expression von HIF2α selbst ist redox-reguliert (H ARVEY et al. 2004) 2.14 MessengerRNA-Expression von Progesteronstoffwechsel-relevanten Genen in Oozyten und Embryonen Im Folgenden sollen einige für die Wirkung von Progesteron relevante Gentranskripte näher beschrieben werden. Der Fokus liegt dabei auf den Progesteronrezeptoren (nPGR, PGRMC1, PGRMC2) sowie dem Progestin und AdipoQ Rezeptor 5 (PAQR5). 2.14.1 Progesteronrezeptoren Bei den Progesteronrezeptoren unterscheidet man die nuklearen Rezeptoren (nPGR) und die membranständigen Rezeptoren (mPGR). Es gibt drei Isoformen des nuklearen Rezeptors (A, B, C), die alle einen N-Terminus, eine DNA-Bindungsdomäne sowie eine C-Anschluss-LigandenBindungsdomäne besitzen. Der nPGR ist in Milchdrüse (K ARIAGINA et al. 2007), Ovidukt (G AVA et al. 2004) und Ovar (G AVA et al. 2004, D’H AESELEER et al. 2007) verschiedener Spezies belegt. Seine Expression im Ovar ist zellspezifisch und hormonell reguliert (PARK und M AYO 1991, NATRAJ und R ICHARDS 1993, A PARICIO et al. 2011). Dieser Rezeptor findet sich sowohl im C.l. (D UFFY et al. 1997, RUEDA et al. 2000) als auch in Granulosazellen (S HAO et al. 2006), im periovulatorischen Follikel (C ASSAR et al. 2002) und Oozyten von Schwein (S HIMADA et al. 2004) und Rind (D’H AESELEER et al. 2007). P ÖSCHKE und KÖLLE (2009) wiesen den Rezeptor per immunzytochemischem Nachweis in unreifen, reifen und fertilisierten bovinen KOK nach. Auch A PARICIO et al. (2011) konnten das Vorhandensein des nPGR in KOK bestätigen. Während der IVM beobachteten S ALHAB et al. (2011) nach 10stündiger Reifung eine Überexpression des nuklearen Progesteronrezeptors in den bovinen Kumuluszellen. Daraus kann auf eine eventuelle Beteiligung an der Regulation des Übergangs von der Metaphase I (MI) in die Metaphase II (MII) geschlossen werden. L UCIANO et al. (2010) hingegen halten die nPGR´s für die meiotische Teilung und Mitose für unbedeutend und schreiben dem Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Blastulation zu. Aus der Studie von A PARICIO et al. (2011) lässt sich schliessen, dass 26 2.14 MessengerRNA-Expression von Progesteronstoffwechsel-relevanten Genen in Oozyten und Embryonen die Wirkung von P4 während der IVM hauptsächlich durch die Rezeptorisoformen A und B vermittelt wird. Ausserdem konnten diese Autoren eine veränderte Rezeptorexpression bei der Supplementation von LH, FSH und P4 feststellen. Die Transkription in Embryonen von Mäusen (H OU und G ORSKI 1993), Schweinen (Y ING et al. 2000), Pferden (R AMBAGS et al. 2008) und Rindern (C LEMENTE et al. 2009) ist ebenfalls belegt. C LEMENTE et al. (2009) fanden heraus, dass der Rezeptor in allen Embryonalstadien ausser dem Morulastadium exprimiert wird und die Transkriptmenge in der Oozyte am höchsten, im 2- bis 4-Zellstadium und im 16-Zellstadium am geringsten ist. Bei den membranständigen Progesteronrezeptoren gibt es die Isoformen PGRMC1 und 2. Sie haben eine Größe von 28 kDA (FALKENSTEIN et al. 2001) und können Polymere von 140 kDa und größer bilden (L ÖSEL et al. 2005). Sie zeichnen sich durch eine kurze extrazelluläre Domäne am N-Terminus, einzelne Transmembrandomänen und ein zytoplasmatisches Ende aus (L Ö SEL et al. 2005). Membranständige PGR sind in der Leber (FALKENSTEIN et al. 1996, M EYER et al. 1996, S ELMIN et al. 1996, N OLTE et al. 2000), im Hypothalamus (K REBS et al. 2000) und im Linsenepithel (C ENEDELLA et al. 1999, Z HU et al. 2001) vorhanden. Ausserdem konnte das Vorkommen des Rezeptors im C.l. (B RAMLEY 2003, KOWALIK und KOTWICA 2008) und in Granulosazellen (PARK und M AYO 1991, NATRAJ und R ICHARDS 1993, S HAO et al. 2003) bestätigt werden. Dabei scheint die Expression im bovinen C.l. nicht nur während der Lutealphase zu variieren, sondern auch signifikant mit der Menge des gebildeten P4 zu korrelieren (KOWALIK und KOTWICA 2008). Auch L UCIANO et al. (2010) stellten eine Variation des PGRMC1-Vorkommens fest. Immunhistochemische Studien dieser Arbeitsgruppe zeigten zyklusabhängig unterschiedliche Lokalisationen im C.l.. N ILSSON und S KINNER (2009) gelang der Nachweis im fetalen Ovar, A PARICIO et al. (2011) belegten sein Vorkommen in bovinen KOK. Auch die Untersuchungen von L UCIANO et al. (2010) weisen auf eine Rolle des PGRMC1 in der Oozytenmaturation hin. Diese Autoren konnten eine unterschiedliche Lokalisation des Rezeptors während verschiedener Reifungsstadien beobachten und vermuten eine Beteiligung an der Trennung der Chromosomen. Im bovinen Embryo werden beide Isoformen des mPR exprimiert (D ODE et al. 2006). Dabei ist die Transkriptmenge in unreifen Oozyten offenbar am höchsten und im 2- bis 4-Zellstadium sowie im 16-Zellembryo am niedrigsten (C LEMENTE et al. 2009). Studien verschiedener Forschergruppen (L UCIANO und P ELUSO 1995, P ELUSO et al. 2001, C RUDDEN et al. 2006) zeigten eine antiapoptotische und antimitotische Wirkung des PGRMC1 auf Granulosazellen. Weiterhin scheinen die Progesteronrezeptoren an der Regulation verschiedener Gene, unter anderem HIF1α und HIF1β, beteiligt zu sein (K IM et al. 2009). 2.14.2 Progestin und AdipoQ Rezeptor 5 (PAQR5) Bei den Progestin und AdipoQ Rezeptoren handelt es sich um eine Familie G-Protein-gekoppelter Membranproteine mit sieben transmembranalen Domänen (Z HU et al. 2003a), die nach den ersten beiden beschriebenen Liganden (Progestin und AdipoQ) benannt wurden (C AHILL 2007). Es handelt sich um eine hochkonservierte Proteinfamilie, deren Mitglieder sich schon 27 2 Literatur bei Eukaryoten und Eubakterien finden (TANG et al. 2005). Bei Säugern existieren insgesamt 11 verschiedene Rezeptoren dieser Art, die sich in die Untergruppen α, β und γ einteilen lassen (Z HU et al. 2003a). Die einzelnen Familienmitglieder sind entweder ubiquitär anzutreffen (PAQR1, 2, 11) oder sehr organspezifisch (PAQR10). Ihre Expression unterliegt hormoneller Regulation (Z HU et al. 2003a, C AI und S TOCCO 2005). Auch PAQRs vermitteln nichtgenomische Progesteroneffekte, sind aber weder mit den nPR noch mit den mPR verwandt (Z HU et al. 2003b). PAQR5 gehört zur γ-Subfamilie und konnte in Lunge und Leber (N UTU et al. 2007), Nieren, Nervengewebe sowie weiblichen und männlichen Reproduktionsgeweben (Z HU et al. 2003a, D RESSING et al. 2011) nachgewiesen werden. PAQR5 zeichnet sich durch eine hohe Bindungsaffinität zu P4 mit begrenzter Kapazität und die γ-Subtyp-spezifische Progestinbindung aus (Z HU et al. 2003a). Es konnte eine Beteiligung des Rezeptors an der Reifung von Fisch- (Z HU et al. 2003b), Amphibien- (T HOMAS et al. 2002) und Säugeroozyten (Q IU et al. 2008) nachgewiesen werden. 2.15 Ziel des Projektes Die Rolle von Progesteron in der Eizellreifung ist nach wie vor unzureichend definiert (FAIR und L ONERGAN 2012). In dieser Arbeit soll der Einfluss des Steroidhormons Progesteron auf die reifende Eizelle insbesondere im Hinblick auf molekulare Veränderungen untersucht werden. Der direkte Vergleich von in vivo gereiften, durch die OPU-Methode gewonnenen Oozyten und in vitro unter dem Einfluss verschiedener Progesteronkonzentrationen gereiften Eizellen soll eventuelle Veränderungen in der Genexpression bezüglich qualitätsanzeigender Gentranskripte deutlich machen. Die Analyse der Expression der Progesteronrezeptoren gibt Aufschluss über die Rolle von Progesteron während der Reifung. Somit könnte diese Arbeit ein wertvoller Beitrag zum besseren Verständnis der Wirkung von Progesteron auf die reifende Eizelle sein. 28 3 Material und Methoden Die genaue Zusammensetzung der in den Versuchen eingesetzten Medien und Chemikalien ist in Anhang A beschrieben. 3.1 Ovum Pick-Up (OPU) Die Abbildung 3.1 zeigt die einzelnen Arbeitsschritte des OPU-Versuchsteiles. Die Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) erfolgt mittels OPU ab dem siebten Tag nach der Brunst (Brunst=Tag 0). Bei jeder OPU-Session erfolgt eine Blutprobenentnahme für die spätere Ermittlung des Serumprogesterongehaltes. Weiterhin werden morphologische Eigenschaften der C.l. sowie Anzahl und Größen der punktierten Follikel erfasst. Nach jeder OPU-Session erfolgt die Entfernung der Kumuluszellen und die Konservierung der Oozyten für die spätere RT-qPCR. Die einzelnen Arbeitsschritte sollen im Folgenden ausführlich erläutert werden. 3.1.1 Auswahl der Versuchstiere und Feststellung des Versuchsbeginns Die Versuchstiergruppe bestand aus insgesamt drei trockenstehenden Kühen sowie sechs Färsen der Rasse Deutsche Holstein, die alle einen physiologischen Zyklus aufwiesen. Durch routinemäßige tägliche Brunstkontrolle erfolgte zunächst eine Bestimmung des Zyklusstandes. Ab dem siebten Tag (±1) nach Brunst (= Tag 0) wurden die Tiere dann über einen Zeitraum von 5-6 Wochen regelmäßig dem OPU-Verfahren unterzogen. Im erstem Durchgang mit zweimal wöchentlichen OPU-Sitzungen bestand die Versuchsgruppe aus sechs Tieren, davon je drei Kühe und Färsen. Aufgrund auftretender Zwischenbrunsten wurde bei zwei Tieren der Punktionsdurchlauf an Tag 21 des Zyklus abgebrochen und nach erneuter natürlicher Brunst neu begonnen. Ein erneuter Durchgang des OPU-Versuches mit vier Tieren des ersten Durchganges erfolgte nach einer zweimonatigen Ruhepause. Bei zwei Tieren fand die Punktion zweimal wöchentlich statt, bei zwei Tieren dreimal. Drei Tiere, die vor Versuchsbeginn noch keiner OPU-Sitzung unterzogen worden waren, bildeten den dritten Versuchsdurchgang mit zweimal wöchentlichen Punktionen. 29 3 Material und Methoden Abbildung 3.1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs der OPU-Versuche 3.1.2 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen im OPU-Verfahren Das Equipment für das OPU bestand aus einem Ultraschallgerät, einem Sondenträger mit Nadelführung, einer Vakuumpumpe mit angeschlossenem Schlauchsystem mit Auffanggefäß sowie einem Wasserbad (Abbildung 3.2). Die ultraschallgeleitete Follikelpunktion wurde mit Hilfe eines Ultraschallgerätes der Marke GE Logiq Book XP und einer 7,5 MHz-Konvexsonde (Modell 8C-RS, Fa. GE, München) durchgeführt. Die Einstellungen des GE Ultraschallgerätes finden sich im Anhang. Der Sondenträger aus PVC wurde durch die Feinmechanik-Werkstatt des Institutes für Nutztiergenetik des Friedrich-Löffler-Institutes in Mariensee in Zusammenarbeit mit der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebaut. Dabei war die Ultraschallsonde in leicht geneigtem Winkel zur Nadelführung eingebettet, um den toten Winkel der Sonde im Bereich der Punktionslinie zu minimieren. Oberhalb der Sonde befand sich eine Führungsrinne für das Edelstahlrohr, welches die Nadelführung bildet. An dessen einem Ende war ein einschraubbarer Adapter angebracht, an dem die Punktionsnadel sowie am anderen Ende ein Schlauch zum Abführen des Punktates befestigt wurden. Der ableitende Schlauch aus Polyethylen mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm mündete nach Durchtritt durch einen Silikonstopfen in einem 50 ml Röhrchen (Fa. Greiner Bio-One, Frickenhausen), welches als Auffanggefäß fungierte und in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 39 ◦ C warm gehalten wurde. Zum Abführen des Punktates wurde mittels einer über ein Fußpedal bedienten Pumpe (Fa. Cook, Mönchengladbach) ein Vakuum von -75 mmHg generiert und über einen handelsüblichen PVC-Schlauch (Aussendurchmesser 8 mm, Innendurchmesser 5 mm) zugeführt. Der Durchfluss betrug durchschnittlich ca. 22 ml pro Minute. Zur Punktion wurden handelsübliche Einmalkanülen der Firma Braun aus Melsungen der Größe 20 G x 2“ (0,9 mm x 50 mm) und einem kurzen Anschliff verwendet. Der kurze Anschliff sollte hierbei 30 3.1 Ovum Pick-Up (OPU) Abbildung 3.2: OPU-Equipment: (1) Vakuumpumpe, (2) Ultraschallgerät, (3) Sondenträger; Wasserbad, Schlauchsystem und Auffanggefäß nicht abgebildet; Abbildung nach H ANSTEDT (2009) gewährleisten, dass die Öffnung der Kanüle vollständig auch in kleineren Follikeln verborgen ist, um Druck- und Flüssigkeitsverluste beim Absaugen zu verhindern. Zu Beginn jeder OPU-Sitzung wurde der Punktionsschlauch mehrfach intensiv mit ca. 10 ml PBS Complete gespült, um eine Verunreinigung des Punktates mit Rückständen von Reinigungsmitteln auszuschliessen. Ein erneutes Spülen nach dem Anbringen der Punktionsnadel sollte gewährleisten, dass sich der kapillare Spalt zwischen Nadel und Schlauchadapter schloss. Weitere Spülungen des Schlauchsystems erfolgten jeweils nach dem Absaugen aller Follikel eines Ovars bzw. nach Bedarf. Nach Applikation von 4 ml des Lokalanästhetikums Procainhydrochlorid ohne Sperrkörper (Procasel 2 % der Fa. Selectavet, Weyarn-Holzolling) in den epiduralen Spalt zwischen dem letzten Sakral- und dem ersten Schwanzwirbel wurde die Vulva trocken gereinigt und das Punktionsgerät vaginal eingeführt. Auf die rektale Exploration folgte eine transrektale Positionierung des jeweiligen Ovars vor der Ultraschallsonde, um das Ovar und seine Funktionskörper darzustellen. Die Größe der Follikel sowie Lokalisation (linkes oder rechtes Ovar), Größe und Beschaffenheit (Homogenität, Vorhandensein eines Hohlraumes und dessen Größe) des Gelbkörpers wurden ermittelt und protokolliert. Ein Absaugen des Inhaltes der Follikel ab einer Größe von 3 mm folgte. Das gewonnene, im Wasserbad bei 39 ◦ C warmgehaltene Punktat wurde zunächst mit Hilfe von warmer PBS Complete-Lösung durch ein Analysensieb mit einer Maschenweite von 50 µm gespült. Es erfolgte eine Überführung der auf dem Sieb verbliebenen KOKs und Zellbestandteile mittels PBS Complete in eine Petrischale der Größe 94 x 16 mm (Fa. Greiner Bio-One, Frickenhausen) um die KOKs unter einem Stereomikroskop (Fa. Olympus, Hamburg, Modell SZX-ILLK200) mit Wärmeplatte (Fa. Minitüb, Modell HAT 200) in einer 20fachen Vergrößerung herauszusuchen. 31 3 Material und Methoden Abbildung 3.3: OPU-Sondenträger mit Nadelführung sowie Vergrößerung des vorderen Teiles; Abbildung nach H ANSTEDT (2009) Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Follikelpunktion; Abbildung nach H ANSTEDT (2009) Nach erneuter Überführung der KOKs mit Hilfe einer 0,25 µl Glaspipette (Fa. Hirschmann, Eberstadt) und eines Pipettierhelfers (Fa. Brand, Wertheim) in eine 2 ml TCM air enthaltende Petrischale der Größe 35 x 10 mm (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) fand eine Beurteilung der KOK hinsichtlich ihrer Qualität sowie eine Einteilung in 5 Kategorien (siehe Tabelle 3.1) statt. Tabelle 3.1: Klassifizierungsschema für bovine KOK Klasse Mindestanzahl an KumulusZytoplasma Kumuluszelllagen beschaffenheit 1 3 Lagen keine Expansion homogen 2 1 Lage keine Expansion homogen 3 einzelne Zellen keine Expansion homo-/heterogen 4 keine Zellen keine Expansion homo-/heterogen 5 keine/einzelne Zellen expandiert homo-/heterogen leere Zonae deformiert 32 3.1 Ovum Pick-Up (OPU) Abbildung 3.5: Apparatur zur Separation von KOK aus Follikelpunktaten; Abbildung nach H ANSTEDT (2009) Abbildung 3.6: IVP-taugliche bovine Kumulus-Oozyten-Komplexe, 50fache Vergrößerung Kumulus-Oozyten-Komplexe der Kategorien 1-3 wurden tierindividuell in auf 37 ◦ C temperierte PBS Complete-Lösung mit Zusatz von 0,1 % Hyaluronidase (Sigma-Aldrich, H 3506) und 0,1 % Bovinem Serum Albumin (BSA-FAF, Sigma-Aldrich) gegeben und für 5 Min. inkubiert. Darauf folgte eine mechanische Entfernung der Kumuluszellen mittels eines Strippers (The Stripper, MXL3-STR, Mid Atlantic Diagnostics, Inc., Mount Laurel, USA) und einer StripperSpitze (Stripper Tip, Mid Atlantic Diagnostics, Inc., Mount Laurel, USA) mit einem Durchlass von 135 bzw. 125 µm. Nach dreimaligem Pipettieren durch Polyvinylalkohol (PVA 0,1 %) wurden die denudierten Oozyten einzeln in 0,5 ml fassende, nicht-DNA-bindende Reaktionsgefäße (Fa. Eppendorf, Hamburg) verbracht und bei -80 ◦ C eingefroren. 3.1.3 Blutentnahme und Konservierung der Blutproben Nach jeder OPU-Sitzung wurde den Tieren je ein Serumröhrchen (Fa. Sarstedt, Sarstedt) sowie ein EDTA-Röhrchen (Fa. Sarstedt, Sarstedt) Blut entnommen. Die Entnahme erfolgte aus der Vena bzw. Arteria coccygea mittels einer handelsüblichen Einmalkanüle der Größe 18 G x 1,5 “. Die Blutproben wurden innerhalb von 2 h bei 2000 x g und 4 ◦ C für 15 Min zentrifugiert (Hettich Zentrifuge Universal 30RF, Fa. Andreas Hettich GmbH u. Co. KG, Tuttlingen). Je 33 3 Material und Methoden 1 ml Serum bzw. EDTA-Plasma wurde in 2 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert. 3.1.4 Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blut Die Bestimmung des Serumprogesterongehaltes erfolgte mittels Radioimmunoassay (RIA Progesteron PITKPG-9, Fa. Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn). Das Prinzip des Verfahrens beruht auf der kompetitiven Bindung des P4 in der zu analysierenden Probe und einer mit 125 I radioaktiv markierten Variante von P4 an spezifische Antikörper, die an die Wandung eines Reaktionsgefäßes aufgebracht waren (Festphasen-Immunoassay). Die Menge des P4 in der Probe lässt sich anhand der Verdrängung des radioaktiven P4 mit Hilfe eines GammaCounts ermitteln, wobei die Anzahl der gemessenen Counts umgekehrt proportional zur eingesetzten Konzentration ist. Durch den Vergleich mit den eingesetzten Standards kann dann die Progesteronkonzentration der Proben aus der Standardkurve ermittelt werden. Zuerst wurden die asservierten Serumproben bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Messung erfolgte routinemäßig als Doppelbestimmung. Für die Messung wurde eine Standardreihe mit 0, 0,1, 0,5, 2, 10, 20 und 40 ng/ml Progesteron angelegt und je 100 µl der Standards sowie 100 µl der zu analysierenden Proben in Antikörper-beschichtete Röhrchen pipettiert. Nach Zugabe von 1,0 ml des radioaktiv markierten Progesterons (125 I Progesteron) in jedes Röhrchen erfolgte eine 3stündige Inkubation bei Raumtemperatur (15-28 ◦ C). Anschließend wurde die Flüssigkeit in den Röhrchen dekantiert und die Röhrchen für eine Minute zur Messung in den Gamma-Counter (LKB 1272 Clinigamma, Fa. Perkin-Elmer, Monza, Italien) verbracht. Anhand der gemessenen Counts pro Minute (cpm) der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve und die Berechnung der Progesteronkonzentration der Proben anhand dieser Kurve. Der Interassayvariationskoeffizient betrug 3,9 % und der Intraassayvariationskoeffizient 3,5 %. Die Spezifität des Antikörpers für Progesteron wurde vom Hersteller mit 100 % angegeben. Die vom Hersteller angegebenen Kreuzreaktivitäten des Antikörpers sind in Tabelle 3.2 aufgeführt. 34 3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen Tabelle 3.2: Kreuzreaktivität des im RIA genutzten Antikörpers Substrat Kreuzreaktivität in % Kortikosterone 0,9 Kortisol 0,03 Danazol 0,006 11-Deoxykortikosteron 2,2 11-Deoxycortisol 0,01 DHEA-SO4 0,002 20alpha-Dihydroprogesteron 0,2 17alpha-Hydroxyprogesteron 3,4 Medroxyprogesteron 0,3 5beta-Pregnen-3alphaol-20-one 0,05 5alpha-Pregnan-3,20-dione 9,0 5beta-Pregnan-3,20-dione 3,2 Pregnenolon 0,1 5-Pregnen-3beta-ol-20-one-sulfat 0,05 Testosteron 0,1 3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen Der in Abbildung 3.7 dargestellte Arbeitsablauf wird im Folgenden ausführlich erläutert. 3.2.1 Herkunft der Ovarien Einmal wöchentlich wurden Ovarien frisch geschlachteter Tiere an einem Schlachthof gesammelt, wobei Ovarien von Tieren, deren Schlachtkörper sichtbare krankhafte Veränderungen aufwiesen, ausschieden. Weiterhin beschränkte sich die Auswahl auf Ovarien von Tieren, die weder trächtig noch juvenil waren und an deren Ovarien keine zystischen Veränderungen sichtbar waren. Die Lagerung der Ovarien nach dem Abschneiden bis zur weiteren Bearbeitung erfolgte in 37 ◦ C warmem PBS Complete in einem Thermobehälter. 3.2.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe Zuerst fand eine dreimalige Spülung der Ovarien mit je 350 ml Natrium-Chlorid (NaCl)-Komplett-Lösung, die zuvor im Wasserbad auf 37 ◦ C erwärmt worden war, statt. Zur Isolation der Oozyten aus den Ovarien fand die Slicing-Methode (N IEMANN und M EINECKE 1993) Anwendung. Hierbei wird das mit einer Arterienklemme fixierte Ovar in eine Petrischale mit ca. 100 ml PBS Complete getaucht. Das Schneiden erfolgt dann mit einem Block bestehend aus zehn parallel im Abstand von 3-5 mm zueinander befestigten Rasierklingen. Auf diese Weise werden oberflächliche und tiefe Follikel eröffnet und die KOK zusammen mit der Follikelflüssigkeit herausgespült. Anschließend giesst man die so gewonnene Flüssigkeit gemeinsam mit 35 3 Material und Methoden KOK aus Schlachthofovarien Selektion nach morpholog. Kriterien IVM +/-Progesteron RT-qPCR IVM-Medium gereifte KOK Denudierung Reifungskontrolle IVF P4-Analyse IVC Morulae/Blastozysten an Tag 7 und 8 Beurteilung der Teilungs-und Entwicklungsraten Abbildung 3.7: Schematische Darstellung des IVP-Versuchsteils dem bereits in der Petrischale enthaltenen PBS Complete durch ein herkömmliches Sieb in ein Becherglas, um überschüssige Gewebestücke zu entfernen. Die Petrischale und das Sieb werden noch zweimal mit je ca. 50 ml PBS Complete gespült, um noch eventuell in der Petrischale vorhandene KOK zu erhalten. Dann erfolgt eine 10minütige Sedimentation der Flüssigkeit im Becherglas. Um ein Auskühlen der Flüssigkeit zu verhindern bzw. zu verlangsamen, steht das Becherglas auf Styropor. Nach dem Absaugen des Flüssigkeitsüberstandes bis auf ca. 100 ml mit einer herkömmlichen Vakuumpumpe erfolgt eine gleichmäßige Verteilung des Sediments auf Falconröhrchen (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) mit je 15 ml Fassungsvermögen und eine erneute 10minütige Sedimentation auf einer Wärmeplatte mit einer Temperatur von 37 ◦ C. Das Sediment in jedem Reagenzgefäß wird nun mittels einer Pasteurpipette abgesaugt, in eine Petrischale überführt und auf ca. 80 ml mit PBS Complete aufgefüllt. Das Heraussuchen der KOK aus dem verdünnten Sediment erfolgt unter einem Stereomikroskop (Fa. Olympus, Hamburg, Deutschland) mit Wärmeplatte (Fa. Minitüb, Modell HAT 200) bei 20facher Vergrößerung. Nach Durchsicht aller Reagenzgefäße und Überführung der KOK mit Hilfe einer 0,25 µl fassenden Glaspipette und eines Pipettierhelfers in 2 ml TCM air erfolgte die Selektion der KOK bezüglich ihrer Qualität. Eine Übersicht der Klassifizierungskriterien ist in Tabelle 3.1 zu sehen. Als für die In-vitro-Produktion taugliche KOK wurden solche der Kategorien 1, 2 und 3 angesehen. 36 3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen 3.2.3 In-vitro-Maturation (IVM) Zunächst wurde eine 40 µM Progesteronstocklösung aus Progesterone minimum 99 % (Fa. Sigma) und unvergälltem Ethanol (EtOH; Rotipuran ≥ 99,8 %, Fa. Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) hergestellt und aliquotiert. Dem Reifungsmedium des jeweiligen Versuchsdurchlaufes wurde die Progesteronlösung zugesetzt, sodass die Endkonzentrationen im Reifungsmedium, in Anlehnung an D IELEMAN et al. (1983), 0,16 µM, 0,48 µM, 0,95 µM oder 1,4 µM betrugen. Um während der In-vitro-Reifung der Oozyten den Einfluss verschiedener Progesteronkonzentrationen zu ermitteln, erfolgte eine Modifizierung des konventionellen Invitro-Maturationssystems mit Ölüberschichtung. Ein Diffundieren des lipophilen Progesterons in die Ölphase wurde verhindert, indem einzelne, mit 200 µl Reifungsmedium gefüllte Wells einer 96-Well-Plate (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) ohne Ölüberschichtung Anwendung fanden. Je zwei Wells standen in einer Petrischale. Die Petrischale enthielt ca. 10 ml destilliertes Wasser, um Verdunstungsverluste gering zu halten. Der aufgelegte Deckel der Petrischale diente der Vermeidung von Schmutzeinträgen in die Kultur. Die Kontrollwells enthielten Reifungsmedium ohne jeglichen Zusatz (Normalkontrolle) sowie Reifungsmedium mit 2 µl, 4 µl oder 8 µl unvergälltem Ethanol ≥ 99,8 % (Alkoholkontrolle). Die Medien wurden für mindestens eine Stunde im Brutschrank (HeraCell, Fa. Heraeus, Thermo Fisher Scientific, USA) bei 39 ◦ C und 5 % CO2 und gesättigter Feuchtigkeit äquilibriert. Als IVP-tauglich angesehene KOK wurden in Gruppen zu 30-40 KOK durch je eine Reihe mit 3 Tropfen aus 100 µl Reifungsmedium ohne Zusatz, die mit Siliconöl (Fa. Serva, Deutschland) überschichtet waren (sogenannte „Waschdrops“), pipettiert (nachfolgend "waschen"genannt) und in die Gefäße mit dem Reifungsmedium überführt. Die Maturation erfolgte für 24 h bei 39 ◦ C, 5 % CO2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im Brutschrank. Der Zeitraum von der Entnahme der Ovarien am Schlachthof bis zum Beginn der In-vitro-Reifung betrug maximal 6 h. 3.2.4 Progesteronbestimmung im Reifungsmedium und Einteilung der Versuchsgruppen Zur Kontrolle der eingesetzten Progesteronzugaben zum Reifungsmedium wurde das Medium nach der Entnahme der gereiften KOK zunächst in 0,5 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert. Die Bestimmung des Progesterongehaltes im Medium erfolgte wie bei den Blutproben (siehe Kapitel 3.1.4) mittels Radioimmunoassay. Da jedoch die zugegebenen Progesteronmengen den Messbereich des Assays überschritten, war eine Verdünnung der Proben (1:5, 1:10, 1:20) mit Boratpuffer erforderlich. Um etwaige Veränderungen des Progesterongehaltes im Medium durch die KOK oder das Milieu im Brutschrank zu detektieren, wurden auch Medienansätze ohne KOK (Leerkontrollen) in den Brutschrank verbracht, dort für 24 Stunden inkubiert und dann asserviert. Zusätzlich fand auch eine Analyse von reinem, nicht inkubiertem Reifungsmedium statt, um Kontaminationen der Medienkomponenten mit Progesteron auszuschließen. Die endgültige Einteilung der einzelnen IVP-Durchgänge in die Versuchsgruppen erfolgte anhand der im Medienansatz und den Leerkontrollen gemessenen 37 3 Material und Methoden Progesterongehalte in die Gruppen < 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml und 450 ng/ml, entsprechend 0,16 µM, 0,48 µM, 0,95 µM und 1,43 µM. 3.2.5 Reifungskontrolle An einer repräsentativen Anzahl an KOK fand eine Kontrolle der Reifung nach der IVM statt. Nach Verbringen der KOK auf einen Objektträger mit vorsichtig angedrücktem Deckgläschen erfolgte eine Fixierung in Essiglösung (Fixierlösung) für 24 h. Danach wurde die Färbelösung (Lacmoid-Arbeitslösung) eingebracht und nach 10 Min mit Fixierlösung wieder entfernt. Die Beurteilung des Kernreifestadiums erfolgte unter dem Mikroskop (Zeiss, Axiostar plus, Carl Zeiss, Jena) bei 40facher Vergrößerung unter Einsatz eines Phasenkontrastfilters 2. Oozyten, welche das Meiosestadium II (MII), erkennbar an Metaphasenplatte und ausgeschleustem Polkörperchen erreicht hatten, galten als gereift, solche, die in der Meiosephase I (MI) verblieben waren, galten als unreif. 3.2.6 In-vitro-Fertilisation (IVF) Die gereiften KOK wurden dreimal in 100 µl Waschdrops aus FertTALP-Gebrauchslösung gewaschen und anschließend in Gruppen von 15-20 KOK in die Fertilisationstropfen pipettiert. In einer Petrischale mit dem Durchmesser von 35 mm waren jeweils vier Tropfen von 100 µl aufgebracht und mit Silikonöl überschichtet. Die Fertilisationstropfen waren zur Äquilibrierung mindestens eine Stunde vor dem Umsetzen der KOK bei 39 ◦ C und 5 % CO2 in den Brutschrank verbracht worden. Das Tiergefriersperma eines IVF-gestesteten Bullen wurde für die Fertilisation zunächst 10 Sekunden lang in 30 ◦ C warmem Wasser aufgetaut. Direkt nach dem Auftauen erfolgte eine Überprüfung der Motilität der Spermien und danach die Zentrifugation für 16 Min bei 380 x g in einer Zentrifuge (Mini Spin plus, Fa. Eppendorf, Hamburg) mit einem 90 %igen R Gradienten aus Sperm Filter (Gynemed GmbH und Co., Lensahn) und FertTALP-Lösung in einem Eppendorfgefäß. Der Überstand wurde nach Ende der Zentrifugation bis auf 50 µl abgenommen und verworfen. Das im Eppendorfgefäß verbliebene Pellet wurde in 750 µl FertTALPGebrauchslösung resuspendiert und erneut für 3 Min bei 380 x g zentrifugiert. Daraufhin wurde der Überstand wieder bis auf 50 µl abgesogen und verworfen. Eine erneute Resuspendierung erfolgte mit 750 µl HHE-Lösung. Abschließend wurden die Spermien nochmals bei 380 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde nun bis auf 100 µl abgenommen und die Spermatozoen im offenen Eppendorfgefäß im Brutschrank bei 39 ◦ C und 5 % CO2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre aufbewahrt. Schließlich wurde die Dichte der Spermiensuspension mittels einer Thomakammer ermittelt. Anhand der Dichte wurde die erforderliche Menge der Spermalösung errechnet, um pro Fertilisationsdrop mit 20 KOK 100 000 Spermien zuzugeben. Der Zusatz der Spermien erfolgte 24 h nach Maturationsbeginn direkt in die Fertilisationstropfen mit den KOK. Es folgte eine 19stündige Kokultur von Spermien und KOK in einem Brutschrank (HeraCell, Fa. Heraeus, Thermo Fisher Scientific, USA) mit 39 ◦ C und 5 % CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre. 38 3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen 3.2.7 In-vitro-Kultur (IVC) Die vermeintlichen Zygoten wurden 19 h nach Beginn der Fertilisation in eine Petrischale mit 35 mm Durchmesser mit 2 ml auf 37 ◦ C erwärmten TCM air verbracht und die Kumuluszellen mittels eines Strippers (The Stripper, MXL3-STR, Mid Atlantic Diagnostics, Inc.) und einer Stripper-Spitze (Stripper Tip, Mid Atlantic Diagnostics, Inc.) mit einem Durchlass von 135 bzw. 125 µm mechanisch unter stereomikroskopischer Sichtkontrolle bei 20facher Vergrößerung entfernt. Zur Temperaturerhaltung des Mediums wurde auf einer Wärmebank (Modell HAT 200, Fa. Minitüb GmbH, Tiefenbach) bei einer Temperatur von 37 ◦ C gearbeitet. Die von den Kumuluszellen vollständig befreiten Zygoten wurden nach drei Medienausdünnungsschritten in Gruppen à sechs Stück in 30 µl Tropfen SOFaa-Kulturmedium unter Öl (Fa. Serva, Heidelberg) bei 39 ◦ C, 5 % CO2 , 5 % O2 , 90 % N2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre für insgesamt sieben Tage (= 8 Entwicklungstage) kultiviert. 3.2.8 Beurteilung der Embryonen An Tag 7 und 8 (IVF = Tag 0, Beginn der IVC = Tag 1) erfolgten die Kontrollen hinsichtlich der Teilungs- und Entwicklungsrate. Die Teilungsrate bezeichnet den Anteil (in %) der gefurchten Embryonen an den in die In-vitro-Kultur eingebrachten vermeintlichen Zygoten, die Entwicklungsrate ergibt sich dementsprechend aus dem Anteil (in %) der Embryonen im Morula- oder Blastozystenstadium an den in die Kultur eingesetzten vermeintlichen Zygoten. Abbildung 3.8: a: 8-Zell-Embryo, b: Morula, c: expandierte Blastozysten, d: geschlüpfte Blastozysten 3.2.9 Archivierung von gereiften Oozyten für die mRNA-Analyse Jeweils 3-5 Oozyten der einzelnen Gruppen der IVP-Durchgänge wurden vor dem Umsetzen in das Fertilisationsmedium entnommen und in eine Petrischale (35 mm Durchmesser) mit vorgewärmtem TCM air verbracht. Diese KOK wurden dann unter dem Stereomikroskop auf einer Wärmeplatte mechanisch mit Hilfe eines Strippers denudiert, dreimal in PVA 0,1 % gewaschen und einzeln in 0,5 ml nicht-DNA-bindenden Eppendorf-Cups bei -80 ◦ C eingefroren. 39 3 Material und Methoden 3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender Gentranskripte 3.3.1 Aufbereitung der Proben zur Isolierung der mRNA Zur Analyse der Transkripte aus den einzelnen Eizellen wurde der Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit (Fa. Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Zuerst erfolgte ein Prewash der DynabeadsLösung mit entsprechender Separation von Flüssigkeit und Dybnabeads im Magnetic Particle Concentrator (MPC). Jeder zu analysierenden Eizelle wurden 150 µl des Lysis/Binding-Puffers sowie 1 µl Kaninchen-Globin-mRNA (1 pg/µl ) zugegeben. Die Kaninchen-Globin-mRNA dient als externer Standard. Die Proben wurden nun für 10 Sekunden gevortext, zentrifugiert und 10 Min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden jeder Probe 10 µl der vorher gewaschenen, in Lysis/Binding-Puffer befindlichen Dynabeads zugegeben und erneut für 5 Min bei Raumtemperatur auf einem Thermoblock unter leichtem Schütteln inkubiert. Während dieser Zeitspanne erfolgte die Bindung des PolyA-Endes der mRNA an die Dynabeads. Als nächstes wurden die Proben erneut im MPC separiert, und nach Verwerfen des Überstandes ausserhalb der MPC mit 100 µl Washing- Buffer A (Dynabeads mRNA Micro Kit, Fa. Invitrogen, Karlsruhe) resuspendiert. Nach einer erneuten Separation und Entfernung des Überstandes wurde mit 100 µl Washing-Buffer B resuspensiert und dieser Vorgang ein weiteres Mal durchgeführt. Nach einem letzten Separationsvorgang wurde mit 11 µl sterilem H2 O (Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg) resuspensiert. Die Trennung der mRNA von den Dynabeads erfolgte in einem Thermomixer (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei 65 ◦ C für 3 Min. Im Anschluss wurden die Proben auf Eis in den MPC verbracht. Nach Abnahme des Überstandes erfolgte sofort die Reverse Transkriptase Reaktion. 3.3.2 Reverse Transkription (RT) Für die Reaktion der Reversen Transkriptase wurde ein Endvolumen von 20 µl verwendet. Es wurden ein Globinstandard, eine Negativ-Kontrolle des Standards, eine Negativ-Kontrolle der Probe, die Probe selbst sowie eine Negativ-Kontrolle mit sterilem Wasser (Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg) anstelle von mRNA mitgeführt, um Kontaminationen der Reaktionsansätze ausschließen zu können. Der Master-Mix (MM) wurde für alle Proben gemeinsam angesetzt (Zusammensetzung siehe Anhang A.33). Diesem wurden 11 µl mRNA aus der vorhergehenden mRNA-Isolierung zugegeben, die Negativkontrollen wurden mit sterilem Wasser (Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg) auf dieses Volumen aufgefüllt. Im PCR-Cycler (IQ Multicolor Real-Time PCR Detection System, Fa. Bio-Rad, München) wurde daraufhin die in den Proben vorhandene mRNA in cDNA umgewandelt. Dabei fand zunächst eine 10minütige Inkubation bei 25 ◦ C statt. Dann erfolgte die Reverse Transkription der mRNA in cDNA bei 42 ◦ C für 60 Min. Zur Denaturierung verblieben die Proben dann noch 5 Min bei 99 ◦ C, um danach sofort bis zur Polymerase-Kettenreaktion auf Eis verbracht zu werden. 40 3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender Gentranskripte 3.3.3 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) Die in Tabelle 3.4 aufgelisteten Gene wurden in der RT-qPCR auf die Intensität ihrer mRNAExpression hin untersucht. Die Selektion der Primer erfolgte mit Hilfe der Software Primer3 unter Vorgabe der Amplifikatgröße (150-250 bp), des GC-Gehaltes (40-60 %) und der Annealingtemperatur (59,5-60,5 ◦ C). Die Quantifizierung der Gentranskripte fand in der RT-qPCR durch die Sichtbarmachung der Fragmente mittels Fluoreszenzen statt. Die eingesetzten Embryonenäquivalente variieren je nach untersuchtem Gentranskript, wobei ein Embryonenäquivalent 20 µl des Reaktionsansatzes entspricht (siehe Tabelle 3.3). Das Endvolumen für die PCR betrug 20 µl. Dabei bestand jeder Ansatz aus dem kommerziell erhältlichen Reaktionsmix, den jeweilig benötigten 5´- und 3´-Primern für die zu untersuchenden Transkripte sowie der cDNA aus der RT und sterilem Wasser (Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg). Für alle Ansätze erfolgte zunächst eine 10minütige Denaturierung bei 95 ◦ C. Danach fanden 43 Zyklen mit folgendem Aufbau statt [vgl. auch H ANSTEDT (2009), K UZMANY et al. (2011), B EILBY et al. (2011), S TINSHOF et al. (2012)]: - Spaltung der cDNA für 15 Sekunden bei 95 ◦ C (Denaturierung) - Anlagerung der Primer für 30 Sekunden bei 60 ◦ C (Annealing) - Extension für 30 Sekunden bei 72 ◦ C (Verlängerung) Anschließend wurde eine Schmelzkurve zur Verifikation der PCR-Fragmente durch eine schrittweise Erhöhung um 0,5 ◦ C alle zehn Sekunden erstellt. Die Starttemperatur betrug hierbei 55 ◦ C und die Endtemperatur 95 ◦ C. Die Verifizierung der Größe der spezifischen Fragmente wurde mittels Agarosegelelektrophorese in einem 2 %igen Agarosegel in TBE-Puffer (90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH=8,3), welches mit 2 µl Ethidiumbromid gefärbt war, durchgeführt. Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte für 4 min bei 100 Volt und anschließende 35 min bei 80 Volt. Tabelle 3.3: Eingesetzte Oozyten- bzw. Embryonenäquivalente (EÄ; 1 EÄ = ˆ 20 µl des Reaktionsansatzes) für die jeweiligen Gentranskripte Gen EÄ GDF9 0,05 BMP15 0,0125 HIF2α 0,05 SLC2A1 (GLUT1) 0,1 PGR 0,1 PGRMC1 0,025 PGRMC2 0,025 PAQR5 0,05 Globin 0,05 41 3 Material und Methoden 3.4 Auswertung der Daten und statistische Analyse Alle Daten sind, soweit nicht anders angegeben, als arithmetisches Mittel mit Standardabweichung (n̄± SD) bzw. Standardfehler (± SEM) dargestellt. Die Erstellung der Kurven zum Progesteronverlauf der einzelnen Tiere erfolgte unter Verwendung von Gnuplot 4.4.3 für Windows. Aufgrund des physiologischerweise zyklischen Verlaufes liegt eine Sinusfunktion zugrunde, deren Verlauf durch die Manipulationen des Versuches (OPU) exponentiell abfällt. Die Startparameter für den Least Square Fit (LSF) wurden anhand der Daten so gewählt, dass die Konvergenz des Algorithmus gewährleistet war. Anhand der erstellten Funktion der Form f (x) = a·(sin((x+b)·c)+1)·exp−d·x erfolgte dann eine Berechnung der Maxima (Max) und Minima (Min) sowie der Punkte mit y=1 (entspricht P4=1 ng/ml) im Bereich -5 ≥ x ≤ 52. Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit dem Computerprogramm SigmaStat 2.0 der Fa. Jandel Scientific, San Rafael, USA. Die Analyse der Daten aus dem OPU und der IVP fand mittels ANOVA und Tukey Test statt. Alle Daten wurden mittels Komolgorow-SmirnowTest auf Normalverteilung geprüft. Die anschließende Varianzanalyse wurde mit dem Levene Median Test durchgeführt. Unterschiede von P ≤ 0,05 galten als statistisch signifikant. 42 Globin PAQR5 PGRMC1 PGRMC1 SLC2A1 (Glut1) PGR HIF2α BMP15 GDF9 Gen Tabelle 3.4: Verwendete Primer Primersequenz Primervom 5´- zum 3´-Ende position F:TCC TTT GGT TTT GCT GCT TT 57 R:GTT CCC TGT GCC CAT CAT AC 260 F:GCA GCC AAG AGG TAG TGA GG 634 R:CAA TAC TGC CTG CTT GAC GA 827 F:GCG ACG ACA GAA TCA CAG AA 1043 R:TGT CTC CAG CCA CAC ATA GC 1236 F:CAG GAG ATG AAG GAG GAG AGC 894 R:CAC AAA TAG CGA CAC GAC AGT 1151 F:TAC CTT AGG CCG GAT TCA GA 1570 R:CAA TCG TTT CTT CCA GCA CA 1766 F:GGA AGA GAT GCA TCC AGA GG 425 R:TGG CTC CTC CTT GTC TGA GT 631 F:AGT CAG GGG CCT TCA GAA CTG CA 693 R:TCA GGA TGA AGC CCC ACC AGA CAT T 899 F:ACA CCT TCA GCT CCA TGT CC 327 R:GTA GCA GGA GAG CCA GAT GC 529 F:GCA GCC ACG GTG GCG AGT AT 241 R:GTG GGA CAG GAG CTT GAA AT 555* *Intron an Position 281-357 257 203 207 X04751 XM_605853 NM_001099060.1 NM_001075133.1 NM_001205356 197 207 M60448 AB018399 DQ463368 DatenbankNr. NM_174681 256 194 194 Amplifikatgröße (bp) 204 3.4 Auswertung der Daten und statistische Analyse 43 3 Material und Methoden 44 4 Ergebnisse 4.1 OPU Da alle sechs Tiere im ersten Versuch nach Regression des bestehenden, nach der natürlichen Brunst gebildeten Gelbkörpers [nachfolgend „natürliches C.l.“(nat. C.l.) genannt] Zwischenbrunsten und daran anschließend die Bildung von Gelbkörpern [im Folgenden „induziertes C.l.“(ind. C.l.) genannt] während des OPU-Zeitraumes zeigten, wurde der Versuch über die geplanten 5-6 Wochen durchgeführt, sodass die Datenerhebungen zwei nahezu vollständige Zyklen wiederspiegeln. Ein Tier wurde aufgrund von Zystenbildung aus der Auswertung ausgeschlossen. Im zweiten Versuch fand die OPU-Prozedur an vier der bereits im ersten Durchlauf genutzten Tieren statt, wobei zwei Tiere zweimal und zwei Tiere dreimal wöchentlich der OPU-Prozedur unterzogen wurden. Bei den zweimal wöchentlich punktierten Tieren wurde eines aufgrund falscher Zyklusbeobachtung und daraus resultierendem falschen Versuchsstart ausgeschlossen. Ein Tier der dreimal wöchentlich Punktierten zeigte einen persistierenden Gelbkörper mit P4 ≥ 3 ng/ml über den gesamten Punktionszeitraum und ging deshalb ebenfalls nicht in die Auswertung ein. Das zweite Tier der dreimal wöchentlich punktierten zeigte ebenso wie alle zweimal punktierten eine Zwischenbrunst mit physiologischer Zykluslänge. In die weiteren Auswertungen der Daten ging dieses Tier jedoch nicht ein, da aufgrund der methodischen Abweichung (dreimal wöchentliche Punktion statt zweimal) bei nur einem Tier die Vergleichbarkeit der Daten fraglich ist. Im dritten Versuchsdurchlauf erfolgte die OPU-Prozedur zweimal wöchentlich an drei nie zuvor punktierten Tieren. Eines dieser Tiere zeigte weder Zwischenbrunst noch die Bildung eines ind. C.l.s und wurde daher aus den weiteren Auswertungen ausgeschlossen. Die Ergebnisse beziehen sich daher auf 7 Tiere und 8 OPU-Durchgänge (ein Tier zweimal genutzt, siehe auch Tabelle 4.1). Die Gesamtdaten der OPU-Versuche aller Tiere finden sich in Anhang B.1 Tabellen B.1 -B.32. 45 4 Ergebnisse Versuch 1 2 3 Tier 28.01.-25.02.10 25.01.-25.02.10 18.02.-15.03.10 25.03.-29.04.10 01.02.-15.02.10 15.03.-22.04.10 22.02.-08.03.10 15.03.-22.04.10 11.02.-11.03.10 31.05.-15.07.10 07.06.-15.07.10 04.06.-09.07.10 Betty Crazy Frieda Betty1 Crazy1 Frieda1a Frieda1b Hera1a Hera1b Queen1a Queen1b Rosa1 Hera2 Queen2 Crazy2 02.06.-09.07.10 28.10.-09.12.10 25.10.-29.11.10 25.10.-09.12.10 Queen Hera Rosa Hera Queen Crazy Rosa2 Stella3 Tiffy3 UFO3 17 13 11 14 49 61 52 58 kein ind. C.l.; nicht gewertet 3x wöchentl. OPU; persistierendes C.l.; nicht gewertet 3x wöchentl. OPU; nicht gewertet Tabelle 4.1: Tiernutzung und Auswertung im OPU-Versuchsteil OPU-Sessions eingefrorene Bezeichnung Datum Bemerkung (Anzahl) Oozyten 9 11 Versuchsstart falsch; nicht gewertet 10 19 8 19 Zyste; nicht gewertet 11 27 5 9 Versuch abgebrochen; nicht gewertet 12 39 5 9 Versuch abgebrochen; nicht gewertet 12 32 9 24 14 59 Versuchsstart falsch; nicht gewertet 12 46 15 53 Rosa Stella Tiffy UFO 46 4.1 OPU 4.1.1 Zyklusverhalten und Gelbkörpereigenschaften Da alle Tiere während der OPU-Versuchsphase regelmäßig Brunsten zeigten, wurde der Punktionszeitraum anhand der Serumprogesteronwerte in verschiedene Phasen eingeteilt. Als Grenzwert für ein funktionelles C.l. wurde dazu 1 ng/ml (S RIKANDAKUMAR et al. 1986) angenommen. So ergaben sich für jedes Tier eine Lutealphase des nach der natürlichen Brunst entstandenen C.l., eine daran anschließende Follikelphase sowie eine weitere Lutealphase (ind. C.l.), die an die während des OPU aufgetretene Brunst anschloss. Ein Beispiel für die mittels Gnuplot 4.4.3 erstellte Funktion ist in Abbildung 4.1 zu sehen. Die Funktionsparameter für die Progesteronkurve der einzelnen Tiere sowie eine Auflistung der errechneten Kurvenpunkte findet sich in Anhang B.1.1 Tabelle B.33 sowie B.1.3 Tabellen B.34 und B.35. Abbildung 4.1: Graphische Darstellung des Progesteronprofils während des Versuchszeitraumes; + an den Punktionstagen gemessene Werte, – Näherungsfunktion Insgesamt gingen die Ergebnisse aus 8 OPU-Durchgängen von 7 Tieren in die Auswertungen ein. Die durchschnittliche Zykluslänge des ersten Zyklus betrug 23,9 ±1,1 (n̄± SD, n=8) Tage, der zweite Zyklus während der OPU-Versuchsphase unterschied sich in seiner Länge (23,5 ±1,7 Tage; n̄± SD, n=8) nicht vom ersten. Dabei wurde der Tag der Brunst jeweils als Tag 0 des neuen Zyklus angesehen. Der Mittelwert des gebildeten Progesterons während der beiden C.l.-Phasen betrug für das natürliche C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml und für das induzierte C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml (n̄± SD, n=8, P ≤0,05, siehe Abbildung 4.2). Die Querschnittsflächen der jeweiligen C.l. unterschieden sich ebenfalls signifikant (nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm2 , ind. C.l. 140,6 ±55,9 mm2 ; n̄± SD, n=8, P ≤0,05, siehe 47 4 Ergebnisse Abbildung 4.2). Die Länge der Lutealphasen zeigte jedoch keine statistischen Unterschiede (nat. C.l. 17,0 ±2,3 Tage, ind. C.l. 14,4 ±2,9 Tage, n̄± SD, n=8, siehe Abbildung 4.2). Der mittlere Serumprogesterongehalt und die mittlere Querschnittsfläche der beiden C.l. waren nicht korreliert. Auch die mittlere Querschnittsfläche des natürlichen C.l.s korrelierte nicht mit der des induzierten C.l.s. Bezüglich des mittleren Serumprogesterongehaltes während der Gelbkörperphasen bestand insofern ein tendenzieller Zusammenhang zwischen dem natürlichen C.l. und dem induzierten C.l., als dass eine hohe P4-Produktion während der natürlichen Lutealphase auch eine höhere P4-Produktion des induzierten C.l.s bedingte. 7 20 350 a 6 300 18 a 250 4 b 3 Fläche in mm2 P4 (ng/ml) 5 b 200 150 4,6 246,7 2 100 2,8 1 140,6 50 0 ind. C.l. 14 12 10 17,0 8 14,4 6 4 2 0 0 nat. C.l. Länge der C.l.- Phase (Tage) 16 nat. C.l. ind. C.l. nat. C.l. ind. C.l. Abbildung 4.2: Serumprogesterongehalt (links; n̄±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05), Fläche (Mitte; n̄±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05) und Lutealphasenlänge (rechts; n̄±SD, n=8) des natürlichen und induzierten C.l. 4.1.2 Follikelpunktion, Eizellausbeute und Oozytenqualität Während der natürlichen C.l.-Phase wurden insgesamt 326 Follikel (32 OPU-Sitzungen), in der Follikelphase 208 Follikel (21 OPU-Sitzungen) und in der induzierten C.l.-Phase 307 Follikel (21 OPU-Sitzungen) punktiert. Die Verteilung der Follikelgrößen [Anteile kleiner 3-5 mm, mittelgroßer 5-8 mm, großer ≥ 8 mm Follikel an der Gesamtfollikelzahl (%)] ist der Tabelle 4.2 zu entnehmen. Die entsprechenden Mittelwerte der punktierten Follikel je OPU-Sitzung und die Verteilung auf die einzelnen Größenkategorien finden sich in Tabelle 4.3. Bezüglich der Anzahl der punktierten Follikel und ihrer Größenverteilung in den einzelnen Zyklusphasen konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. 48 4.1 OPU Tabelle 4.2: Punktierte Follikel (n) und Größenverteilung während der Zyklusphasen Zyklusphase Anteile der Follikelgrößen (%) (n) 3-5 mm 5-8 mm ≥8 mm natürliches C.l. 77,6 18,4 4,0 (n=326) (n=253) (n=60) (n=13) Follikelphase 75,5 16,3 8,2 (n=208) (n=157) (n=34) (n=17) induziertes C.l. 73,0 21,5 5,5 (n=307) (n=224) (n=66) (n=17) Tabelle 4.3: Punktierte Follikel pro OPU-Sitzung (n̄±SD) in den einzelnen Zyklusphasen Zyklusphase Follikelgröße Follikel (OPU-Sitzungen) 3-5 mm 6-8 mm >8 mm natürliches C.l. 10,2 ±3,4 7,9 ±3,1 1,9 ±1,2 0,4 ±0,6 (32) Follikelphase 9,9 ±3,6 7,5 ±3,6 1,6 ±1,1 0,8 ±0,8 (21) induziertes C.l. 9,9 ±2,9 7,2 ±2,7 2,1 ±1,3 0,5 ±0,7 (21) Die mittlere Wiederfindungsrate (Anzahl KOK/Anzahl punktierte Follikelx100) betrug 38,7 % (326 punktierte Follikel, 126 KOK) in der natürlichen C.l-Phase, 39,9 % (208 punktierte Follikel, 83 KOK) während der Follikelphase und 30,6 % (307 punktierte Follikel, 94 KOK) in der induzierten C.l.-Phase. In Bezug auf die Anzahl der gewonnenen KOK und deren Qualität zeigten sich in den einzelnen Zyklusphasen keine statistisch signifikanten Unterschiede. Die Anzahl der gewonnenen KOK aus den einzelnen Zyklusphasen und deren Verteilung auf die Qualitätskategorien sind der Tabelle 4.4 zu entnehmen. Die Mittelwerte der Anzahl der gewonnenen KOK pro OPU-Sitzung und deren Verteilung auf die Qualitätskategorien sind in Tabelle 4.5 dargestellt. Tabelle 4.4: Gewonnene KOK (n) und Anteile an den einzelnen Kategorien (%) Zyklusphase Anteile der Qualitätskategorien (%) IVP(n) 1 2 3 4 5 tauglich untauglich natürliches C.l. 22,2 27,0 32,5 8,7 9,6 81,7 18,3 (n=126) (n=28) (n=34) (n=41) (n=11) (n=12) (n=103) (n=23) Follikelphase 19,3 22,9 42,2 3,6 12,0 84,4 15,6 (n=83) (n=16) (n=19) (n=35) (n=3) (n=10) (n=70) (n=13) induziertes C.l. 24,5 33,0 27,6 2,1 12,8 85,1 14,9 (n=94) (n=23) (n=31) (n=26) (n=2) (n=12) (n=80) (n=14) 49 4 Ergebnisse Tabelle 4.5: Gewonnene KOK der einzelnen Kategorien pro OPU-Sitzung in den Zyklusphasen (n̄±SD) Zyklusphase Kategorie KOK (OPU-Sitzungen) 1 2 3 4 5 natürliches C.l. 3,9 ±2,7 0,9 ±1,1 1,1 ±1,0 1,3 ±1,1 0,3 ±0,8 0,4 ±0,7 (32) Follikelphase 4,0 ±2,9 0,8 ±0,9 0,9 ±0,9 1,7 ±2,4 0,1 ±0,4 0,5 ±0,8 (21) induziertes C.l. 3,0 ±2,0 0,8 ±0,9 1,0 ±1,2 0,8 ±0,9 0,1 ±0,3 0,4 ±0,6 (21) 4.2 Progesteronsupplementation während der In-vitro-Maturation 4.2.1 Progesteronanalyse im Medium Im IVM-Medium ohne P4-Zusatz wurde kein P4 detektiert (P4 < 0,1 ng/ml). Die Ausgangskonzentrationen sowie der P4-Gehalt des supplementierten Mediums nach 24stündiger Inkubation mit/ohne Oozyten sind der Tabelle 4.6 zu entnehmen. Die P4-Konzentration nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten zeigte sich proportional zur Ausgangskonzentration. Dargestellt sind hier lediglich die P4-Gehalte der Medien der in die weitere Auswertung eingegangenen IVPDurchgänge. Die Gesamtdaten zu den Medien sind den Tabellen B.43-B.46 in Anhang B.2.2 zu entnehmen. Die sehr unterschiedlichen Probenanzahlen (n) resultieren aus der Problematik, stark unterschiedliche P4-Konzentrationen (< 50 ng/ml - 450 ng/ml) zu analysieren, was mehrere Verdünnungsschritte erforderte. Aufgrund des geringen Probenvolumens konnte in einigen Fällen die vollständige Analyse nicht durchgeführt werden. Solche Proben wurden von der Auswertung ausgeschlossen. 50 4.2 Progesteronsupplementation während der In-vitro-Maturation Tabelle 4.6: Progesterongehalt des Mediums (n̄±SD) der einzelnen Versuchsgruppen vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten P4 Gruppe Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten ≤ 50 ng/ml 26,7 ±18,5 ng/ml 32,9 ±23,0 ng/ml 17,9 ±11,4 ng/ml (≤ 0,16 µM) 0,09 ±0,06 µM 0,1 ±0,07 µM 0,06 ±0,04 µM (n=7) (n=12) (n=9) 150 ng/ml 133,6 ±50,2 ng/ml 129,8 ±30,3 ng/ml 33,1 ±12,0 ng/ml (0,48 µM) 0,42 ±0,0,16 µM 0,41 ±0,10 µM 0,1 ±0,04 µM (n=11) (n=33) (n=30) 300 ng/ml 297,9 ±39,3 ng/ml 210,7 ±63,4 ng/ml 88,0 ±119,8 ng/ml (0,95 µM) 0,95 ±0,13 µM 0,67 ±0,20 µM 0,28 ±0,38 µM (n=9) (n=9) (n=13) 450 ng/ml 406,7 ±57,5 ng/ml 470,8 ±62,3 ng/ml 62,4 ±24,1 ng/ml (1,43 µM) 1,29 ±0,18 µM 1,5 ±0,20 µM 0,20 ±0,08µM (n=6) (n=3) (n=11) 4.2.2 In-vitro-Produktion nach Progesteronzusatz im Reifungsmedium Nach der 24stündigen Reifung waren die mit Progesteronzusatz gereiften KOK mit deutlich kompakteren Kumuluszellschichten umgeben als die der Kontrollgruppen (siehe Abbildung 4.3). Abbildung 4.3: a: gereifte Oozyten der Kontrollgruppe; b: mit EtOH gereift; c: mit P4 gereift; Maßstab in allen Bildern gleich Die Reifungskontrollen zeigten keine statistischen Unterschiede (P >0,05) in den Reifungsraten zwischen den einzelnen Versuchsgruppen oder in Relation zu den Kontrollgruppen (siehe Tabelle 4.7, Gesamtdaten siehe Anhang B.2.3 Tabellen B.47 -B.51). Die Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen der jeweiligen Versuchsgruppen sowie die der Kontrollgruppen sind in Tabelle 4.8 dargestellt. Bezüglich der Teilungsraten gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede. Mit < 50 ng/ml P4 gereifte KOK zeigten sowohl an Tag 7 als auch an Tag 8 der Entwicklung eine signifikant herabgesetzte Entwicklungsrate gegenüber den Kontrollgruppen (P ≤0,05). Die Daten zu den IVP-Durchgängen der einzelnen Versuchsgruppen befinden sich 51 4 Ergebnisse in Anhang B.2.1 Tabellen B.36 -B.42. Weiterhin zeigten mit 300 ng/ml gereifte KOK eine gegenüber der EtOH-Kontrolle signifikant geringere Entwicklungsrate (P ≤0,05). Im Vergleich mit der zusatzfreien Kontrolle bestand eine Tendenz zur herabgesetzten Entwicklung in dieser Gruppe (P=0,084). Tabelle 4.7: Prozentuale Anteile der Meiosestadien M I und M II in den Reifungskontrollen (n̄±SD; P > 0,05) Wiederholungen MI M II Gruppe Oozyten(n) (%) (%) Kontrolle 3 17,8 ±3,5 82,2 ±3,5 (n=82) (n=15) (n=67) EtOH 3 11,9 ±1,8 88,1 ±1,8 (8 µl) (n=84) (n=10) (n=74) P4=150 ng/ml 3 17,8 ±3,6 82,2 ±3,6 (0,39 µM) (n=85) (n=15) (n=70) P4=300 ng/ml 3 14,5 ±3,2 85,5 ±3,2 (0,73 µM) (n=86) (n=12) (n=74) P4=450 ng/ml 3 17,2 ±3,1 82,8±3,1 (1,51 µM) (n=87) (n=15) (n=72) Tabelle 4.8: Teilungs- (TR) und Entwicklungsraten (ER) der einzelnen Versuchsgruppen (n̄±SD) Wiederholungen TR ER d7 ER d8 Gruppe Oozyten (%) (%) (%) Kontrolle 26 55,9 ±11,6 20,7 ±6,6b 25,4 ±8,0b (681) (381) (141) (173) c EtOH 29 53,7 ±11,1 21,4 ±10,3 27,9 ±9,2c (723) (388) (155) (202) a P4 < 50 ng/ml 6 45,2 ±9,9 10,7 ±5,4 15,8 ±5,4a (< 0,16 µM) (177) (80) (19) (28) P4=150 ng/ml 11 49,7 ±11,6 18,3 ±8,2ab 22,4 ±8,5ab (0,39 µM) (322) (160) (59) (72) d P4=300 ng/ml 5 48,2 ±15,9 15,5 ±5,0 18,0 ±7,2d (0,73 µM (278) (134) (43) (50) ab P4=450 ng/ml 7 48,3 ±10,2 16,9 ±3,2 22,4 ±10,6ab (1,51 µM) (290) (140) (49) (65) innerhalb einer Spalte: a:b, a:c mit P≤0,05; c:d mit P=0,084 52 4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene 4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene 4.3.1 mRNA-Expression in OPU-KOK verschiedener Zyklusphasen Es konnten statistisch signifikante Unterschiede für die Expression der mRNA von GDF9, HIF2α, BMP15, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5 in Abhängigkeit von der Zyklusphase nachgewiesen werden. Bezüglich der Expression des Glukosetransporters SLC2A1 gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede. Im Folgenden soll lediglich die Expression der signifikant veränderten Gentranskripte dargestellt werden. Eine ausführliche Auflistung aller Daten findet sich in Anhang B.3.1. Eizellen aus der Phase des induzierten C.l. zeigten gegenüber Eizellen der natürlichen C.l.Phase eine signifikant verringerte Transkriptmenge von GDF9. Weiterhin bestand eine statistische Tendenz (P=0,075) zur verringerten Expression von GDF9 im Vergleich zur Follikelphase (siehe Abbildung). Bezüglich HIF2α zeigte sich eine signifikant geringere Expression bei Eizellen aus der induzierten C.l-Phase gegenüber dem natürlichen C.l. (siehe Abbildung 4.4). Eizellen der induzierten C.l.-Phase wiesen ausserdem eine signifikant geringere Transkriptmenge von BMP15 gegenüber Eizellen der anderen Zyklusphasen auf (siehe Abbildung 4.4). Abbildung 4.4: mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich GDF9, BMP15 und HIF2α; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz Bezüglich der Progesteronrezeptoren gab es signifikant weniger Transkripte in den Oozyten der induzierten C.l.-Phase im Vergleich zu den anderen Zyklusphasen im Hinblick auf 53 4 Ergebnisse PGRMC1 und PGRMC2. Die Transkriptmenge des nuklearen Rezeptors PGR war in den Oozyten der induzierten C.l.-Phase signifikant geringer im Vergleich zur Follikelphase, und in Relation zur natürlichen C.l.-Phase tendenziell verringert (P=0,059). Die Eizellen der induzierten C.l.-Phase enthielten gegenüber den Oozyten der natürlichen C.l.-Phase eine signifikant verringerte Menge an PAQR5 (siehe Abbildung 4.5). Abbildung 4.5: mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich der Progesteronrezeptoren; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz 4.3.2 mRNA-Expression in gereiften Oozyten nach IVM mit P4-Zusatz Die relative Transkriptmenge in den Eizellen der Versuchsgruppen verglichen mit unreifen Oozyten bzw. den Kontrollgruppen war bei GDF9, HIF2α, PGR, PGRMC2 und PAQR5 signifikant verändert. Bezüglich SLC2A1, BMP15 und PGRMC1 konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede in der mRNA-Expression festgestellt werden. Im Folgenden soll lediglich auf die statistisch signifikant veränderten Transkripte eingegangen werden. Eine ausführliche Auflistung aller Daten findet sich in Anhang B.3.2. 54 4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene Im Vergleich zu unreifen Eizellen zeigten Oozyten der Gruppen < 50 ng/ml, 150 ng/ml und 300 ng/ml eine signifikant verringerte relative Transkriptmenge von GDF9 (siehe Abbildung 4.6). Bezüglich HIF2α war die Transkriptmenge in Oozyten der Gruppen 150 ng/ml und 450 ng/ml gegenüber den unreifen Oozyten signifikant herabgesetzt, bei den Oozyten der Gruppe 300 ng/ml zeigte sich eine Tendenz (P=0,066; siehe Abbildung 4.6). Abbildung 4.6: mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich GDF9 und HIF2α; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz Der nukleare PGR wies signifikant niedrigere Transkriptmengen in den unreifen Oozyten sowie den Oozyten der Gruppen EtOH, < 50 ng/ml, 150 ng/ml und 450 ng/ml gegenüber der zusatzfreien Kontrollgruppe N auf (siehe Abbildung 4.7). Die Oozyten der Gruppe 300 ng/ml tendierten ebenfalls zu niedrigeren Werten (P=0,086). Oozyten der Progesterongruppen < 50 ng/ml, 150 ng/ml und 450 ng/ml zeigten eine signifikant verringerte Expression von PGRMC2 gegenüber der zusatzfreien Kontrolle N (siehe Abbildung 4.7). Ausserdem enthielten Eizellen der Gruppe 150 ng/ml tendenziell weniger PGRMC2-Transkripte als Eizellen der Alkoholkontrolle EtOH (P=0,063). Der Rezeptor PAQR5 war in den Gruppen EtOH, 150 ng/ml und 450 ng/ml gegenüber unreifen Eiztellen signifikant verringert. Auch die Gruppen < 50 ng/ml und 300 ng/ml tendierten zu niedrigeren PAQR5-Transkriptgehalten (P=0,071 und P=0,067; siehe Abbildung 4.7). 55 4 Ergebnisse Abbildung 4.7: mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich der Progesteronrezeptoren; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz 56 5 Diskussion 5.1 Zyklusverhalten während der OPU-Versuchsphase Im OPU-Versuchsteil der vorliegenden Arbeit wurden 7 Tiere zweimal wöchentlich über einen Zeitraum von 5-6 Wochen der OPU-Prozedur zur Gewinnung von Eizellen unterzogen. Während dieses Zeitraumes zeigten alle Tiere regelmässige Brunsten mit physiologischer Zykluslänge sowie die Bildung gelbkörper-ähnlicher, progesteronproduzierender Strukturen. 5.1.1 Zwischenbrunsten und Bildung gelbkörperähnlicher Strukturen Um eine physiologische Brunst hervorzurufen bedarf es einerseits eines dominanten Follikels, andererseits aber auch der hormonellen Konstellation, die nicht nur zu den äusseren und inneren Anzeichen der Brunst führt, sondern den dominanten Follikel letztlich ovulieren und einen Gelbkörper entstehen lässt. Durch Ergebnisse verschiedener Forschungsgruppen (P IETERSE et al. 1991b, B ERGFELT et al. 1994, B ONI et al. 1997, P ETYIM et al. 2000) ist belegt, dass das Absaugen aller Follikel durch OPU eine FSH-Ausschüttung bedingt und somit eine neue Follikelwelle auslöst. Das Auftreten dominanter Follikel bei zweimal wöchentlichen OPU-Sessions wurde, in Abhängigkeit vom OPU-Intervall, ebenfalls mehrfach beschrieben (B ERGFELT et al. 1994, G INTHER et al. 1996, P ETYIM et al. 2000, 2001, 2003) und konnte auch im vorliegenden Versuch zu verschiedenen Zeitpunkten des Zyklus beobachtet werden. Dies kann mit einem durch OPU beschleunigten Follikelwachstum (B ONI et al. 1997) zusammenhängen. Laut H AYASHI et al. (2008) ist nach der Luteolyse und somit dem Wegfall des hemmenden Einflusses des Gelbkörpers eine erhöhte Ausschüttung von Wachstumshormonen zusammen mit einem erhöhten basalen LH-Level für ein schnelleres Follikelwachstum verantwortlich. Dies deckt sich mit den Erkenntnissen von C ARLIN et al. (1999), die ebenfalls ein erhöhtes basales LH- und FSH-Level bei niedrigen Progesteronwerten durch zweimal wöchentliches OPU über einen Zeitraum von 16 Wochen verursachen konnten. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit haben einige Autoren beobachtet, dass das wiederkehrende Absaugen aller Follikel den Zyklus ausser Kraft setzt (G IBBONS et al. 1994, B ONI et al. 1997). Diese 57 5 Diskussion Autoren konnten, wie auch später C ARLIN et al. (1999), weder dominante Follikel noch Ovulationen bei zweimal wöchentlich sattfindendem OPU feststellen. Eine unbemerkte Ovulation nicht punktierter Follikel, wie sie bei B ERGFELT et al. (1994) als Ursache für Zwischenbrunsten beschrieben wurde, konnte in der vorliegenden Arbeit durch eine Ultraschallkontrolle nach jeder OPU-Session ausgeschlossen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden weder FSH noch LH gemessen, daher ist eine eindeutige Klärung der Ursachen für die Zwischenbrunsten und die auftretenden dominanten Follikel hier nicht möglich. Ein beschleunigtes Follikelwachstum durch die oben beschriebenen hormonellen Veränderungen könnten dies jedoch erklären. Auf die während des OPU-Versuchszeitraumes beobachtete Brunst folgte bei allen Tieren die Bildung gelbkörperähnlicher Strukturen. Da am Tage der Brunst eine OPU-Session erfolgte ist davon auszugehen, dass der jeweilige Brunstfollikel punktiert wurde. Die Bildung gelbkörperähnlicher Gebilde nach Follikelpunktionen wurde in der Vergangenheit mehrfach beschrieben (P ETYIM et al. 2000, 2001, 2003). Schon 1994 hielten B ERGFELT et al. (1994) eine Gelbkörperbildung nach der Punktion reifer Follikel für möglich. Hiermit übereinstimmend stellten (P ETYIM et al. 2000) die Bildung C.l.-ähnlicher Strukturen nach Punktion dominanter Follikel bei Tieren, die äussere Brunstanzeichen zeigten, fest. Diese Autoren setzen die östrusnahe Follikelpunktion mit einer künstlichen Ovulation gleich. Die auf diese Weise induzierten Gelbkörper waren zwar kleiner, konnten von den Autoren aber als funktionelle Gelbkörper eingestuft werden. Auch bei der östrusfernen Follikelpunktion bildeten sich in den Studien von P ETYIM et al. (2000) gelbkörperähnliche Strukturen. Dabei handelte es sich entweder um kurzlebige C.l. mit einem nur vorübergehenden Anstieg von Progesteron oder um C.l. mit normaler Lebensdauer und insgesamt niedrigen P4-Werten. Im Gegensatz dazu konnte in früheren Studien von P IE TERSE et al. (1988, 1991a,b) keine Luteinisierung punktierter Follikel festgestellt werden. Im vorliegenden Versuch wird davon ausgegangen, dass die jeweiligen Brunstfollikel punktiert wurden. Das entspricht der durch P ETYIM et al. (2000) beschriebenen künstlichen Ovulation per OPU. Die auch in diesem Versuch beobachtete C.l.-Bildung lässt vermuten, dass keine Spontanovulation zur Luteinisierung erforderlich ist. Auch B ERGFELT et al. (1994) und H AYA SHI et al. (2006) halten dies für möglich. B ERGFELT et al. (1994) argumentieren, dass weder die Follikelwand noch die Granulosazellen durch die Punktion derart beschädigt werden, dass die Luteinisierungsvorgänge gestört ablaufen. Physiologischerweise gehen der Spontanovulation und der folgenden Luteinisierung des Follikels der LH-Peak voraus. Mit unzureichenden oder ausbleibenden LH-Peaks werden verspätete Ovulationen und anovulatorische Zyklen sowie subfunktionale Gelbkörper in Verbindung gebracht (L EE et al. 1988, R IEGER et al. 1989, B LOCH et al. 2006, H AYASHI et al. 2006). Ist der LH-Peak jedoch einmal erfolgt, so findet laut H AYASHI et al. (2006) die Luteinisierung unabhängig von der Ovulation in jedem Fall statt. Folglich wäre für eine erfolgreiche Luteinisierung weniger eine Ovulation als die hormonelle Konstellation, insbesondere der LH-Peak, essentiell. Im Gegensatz dazu beobachteten W ISE et al. (1994) die Selbstluteinisierung von Follikeln ohne vorherigen LH-Peak. Es ist bekannt, dass LH die Granulosa- und Thekazellen stimuliert und sie auf die Luteinisierung vorbereitet (S MITH et al. 1994). Diese Vorgänge finden bereits während der präovulatorischen Follikelentwicklung statt, die durch das Hormon LH wesentlich mitgeprägt ist (S MITH et al. 1994, A ERTS und B OLS 2010). Dies entspricht auch den 58 5.1 Zyklusverhalten während der OPU-Versuchsphase Schlussfolgerungen von D IAZ et al. (2002), die das pulsatil ausgeschüttete LH als essentiell für ein normales luteales Wachstum einstufen. So könnten funktionelle Gelbkörper durchaus auch ohne einen LH-Peak entstehen. Ob und wann in der vorliegenden Studie LH-Peaks stattgefunden haben, wurde nicht untersucht. Dementsprechend lässt sich auch keine Aussage über die Notwendigkeit des LH-Peaks für die Luteinisierung treffen. Inwiefern die oben erwähnten, durch OPU eventuell erhöhten basalen FSH- und LH-Level die Luteinisierung begünstigen, bleibt ebenfalls offen. Dass in einigen Fällen am Tage der Brunst unmittelbar vor der OPU-Session eine Spontanovulation stattgefunden hat ist höchst unwahrscheinlich. Letztlich ist dies jedoch nicht vollständig auszuschliessen, da durch die häufigen Punktionen im Abstand von 3-4 Tagen stets mehrere blutgefüllte Follikel auf den Ovarien zu sehen waren. Ein kürzlich spontan rupturierter Follikel, der sich anschließend mit Blut aufgefüllt hat, ist davon nicht zu unterscheiden. 5.1.2 Eigenschaften der gelbkörperähnlichen Gebilde Die Progesteronproduktion der zu Beginn des Versuches bestehenden, natürlichen Gelbkörper entspricht den Ergebnissen früherer Studien (S CHAMS et al. 1977, D IAZ et al. 1986, K ASTELIC et al. 1990, R IBADU et al. 1994, F IELDS und F IELDS 1996, S IANANGAMA und R AJAMAHEN DRAN 1996, T OM et al. 1998, H ERZOG et al. 2010). Dagegen zeigten die während der OPUVersuchsphase induzierten, gelbkörperähnlichen Strukturen eine signifikant geringere mittlere Progesteronproduktion (natürliches C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml vs. induziertes C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml, P ≤0,05) bei einer Lebensdauer von 14,4 ±2,9 Tagen. Laut F ORDE et al. (2011) dauert die physiologische Lutealphase 14-18 Tage. Die im vorliegenden Versuch entstandenen induzierten Gelbkörper liegen somit noch im physiologischen Bereich. Auch P ETYIM et al. (2000) beschreiben das Auftreten funktioneller C.l. mit geringerer oder normaler Progesteronproduktion und normaler Lebensdauer nach Follikelpunktion. Ursache für die geringe Progesteronproduktion könnte eine inadäquate präovulatorische Follikelentwicklung sein. S IANANGAMA und R AJA MAHENDRAN (1996) beobachteten bei induzierten C.l. eine geringere P4-Produktion, die, wie in der vorliegenden Arbeit, ebenfalls mit einer geringeren C.l.-Größe einherging. Allerdings wurden diese Gelbkörper durch hCG-Gaben zu unphysiologischen Zeitpunkten im Zyklus hervorgerufen. Demgegenüber wurde im vorliegenden Versuchsaufbau keine hormonelle Manipulation vorgenommen. Die OPU-Prozedur war der einzige artifizielle Einfluss. Veränderungen des hormonellen Milieus sind dennoch nicht auszuschliessen, da Langzeit-OPU zu veränderten P4-, LH- und FSH-Profilen führen kann (C ARLIN et al. 1999). Immer wieder durch OPU ausgelöste FSH-Schübe (P IETERSE et al. 1991b, B ERGFELT et al. 1994, B ONI et al. 1997, P ETYIM et al. 2000) führen zu einem beschleunigten Follikelwachstum (P ETYIM et al. 2000, H AYASHI et al. 2008), welches das Vorkommen der C.l. erklären könnte. Der Zeitpunkt der Luteinisierung, normalerweise durch die Spontanovulation nach dem LH-Peak bestimmt, wird jedoch durch die artifizielle Ovulation per OPU vorverlegt. Dementsprechend könnte die Luteinisierung ohne vorherigen LH-Peak erfolgt sein. S MITH et al. (1994) bringen sowohl das präovulatorisch ausgeschüttete FSH als auch LH mit den morphologischen, endokrinologischen und biochemischen Vorgängen der Luteinisierung in Verbindung. Weiterhin zeigten D IELEMAN et al. (1983), dass im Zeitfenster vom LH-Peak bis hin zur Ovulation wesentliche hormonelle und 59 5 Diskussion strukturelle Veränderungen im präovulatorischen Follikel stattfinden. So konnte in der Phase 6-20h nach dem LH-Peak ein Größenwachstum der Granulosazellen belegt werden (D IELE MAN et al. 1983). Aus den Granulosazellen entstehen im weiteren Verlauf der Luteinisierung die sogenannten large luteal cells [LLCs; M ILVAE et al. (1991), N ISWENDER et al. (2000)], deren Progesteronproduktion wesentlich für die über längere Zeit hohen Serumprogesterongehalte verantwortlich ist (M ILVAE et al. 1991, D IAZ et al. 2002). Demnach könnte eine unzureichende oder fehlende LH-Exposition oder eine verkürzte Zeit zwischen LH-Peak und künstlicher Ovulation über die Beeinflussung der follikulären Zellen letztlich zu geringerer Progesteronproduktion der induzierten C.l. führen. Weiterhin zeigten die induzierten, gelbkörperähnlichen Gebilde eine signifikant geringere Querschnittsfläche (nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm2 , ind. C.l. 140,6 ±55,9 mm2 , P ≤0,05) als ihre natürlichen Pendants. Verschiedene Autoren vermuten Zusammenhänge zwischen der Größe des ovulatorischen Follikels und dem daraus resultierenden Gelbkörper (O USSAID et al. 2000, VASCONCELOS et al. 2001, P ERRY et al. 2005, E CHTERNKAMP et al. 2009, C ERRI et al. 2011b). P ERRY et al. (2005) stellten fest, dass eine GnRH-induzierte Ovulation bei Follikeln ≤ 11 mm eine geringere Fertilität in Bezug auf die Etablierung und Unterhaltung einer Trächtigkeit durch geringe Progesteronwerte zur Folge hatte. Durch die Abstände der OPU-Sitzungen von 3 bzw. 4 Tagen konnten die Follikel, aus denen die Gelbkörper entstanden, hier höchstens 4 Tage lang wachsen. Dies entspricht der Wachstumszeit der Follikel in einem 3-Welligen Zyklus (S IROIS und F ORTUNE 1988). Im vorliegenden Versuch stammten die induzierten Gelbkörper vermutlich aus den jeweiligen Brunstfollikeln. Deren Größen variierten je nach Individuum von 9 mm bis 15 mm. In allen Fällen waren die Progesteronwerte und die gemessenen Querschnitte jedoch geringer als im Vergleich zum vorhergehenden, natürlichen Gelbkörper. Ein Zusammenhang mit der Größe der Brunstfollikel zum Zeitpunkt der Punktion ist daher nicht zu vermuten. Die geringere Größe des C.l. könnte jedoch ebenfalls eine Folge der verkürzten finalen Wachstumsphase des dominanten Follikels vor der induzierten Ovulation sein. Die Größe des C.l. wird einerseits durch die Größe der LLC´s, andererseits über die Anzahl der Small Luteal Cells (SLCs) determiniert (FARIN et al. 1986, N ISWENDER et al. 2000). Deren Vorläuferzellen, die Theka- und Granulosazellen, werden, wie oben schon beschrieben, durch LH stimuliert und beginnen schon vor der Ovulation sich zu verändern. So könnte neben der Progesteronproduktion auch die Größe des Gelbkörpers durch die intrafollikulären Vorgänge vor der Ovulation beeinflusst werden. Anders als in den Studien von P IETERSE et al. (1991a), R IBADU et al. (1994), O USSAID et al. (2000), P ERRY et al. (2005), C ERRI et al. (2009), H ERZOG et al. (2010), L ÜTTGENAU et al. (2011), R IZOS et al. (2012) konnte kein statistischer Zusammenhang zwischen der Größe der Gelbkörper und ihrer Progesteronproduktion hergestellt werden. Andere Studien weisen allerdings darauf hin, dass nicht die Größe, sondern vielmehr Reife und Alter des ovulatorischen Follikels die Steroidsynthesekapazitäten des resultierenden C.l. determinieren (C ERRI et al. 2011b). Die Progesteronproduktion bzw. die Lebensdauer eines Gelbkörpers haben eine Schlüsselrolle in der Regulation der Zykluslänge (N ISWENDER et al. 2000). Sowohl die Zykluslänge als auch die Länge der Lutealphasen beider beobachteter Zyklen zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede. Verschiedene Autoren konnten zeigen, dass die luteale Funktionsdauer sowie die Produktion von Progesteron weitgehend autoreguliert sind (ROTCHILD 1981, PATE 1988, 1996, S KARZYNSKI und O KUDA 1999, S KARZYNSKI et al. 2000, S CHAMS und B E - 60 5.2 Follikeleigenschaften, Eizellausbeute und Oozytenqualität 2002, A ROSH et al. 2004, KOTWICA et al. 2004, L ISZEWSKA et al. 2005). Weiterhin reguliert Progesteron die Lebensdauer des Gelbkörpers (S CHAMS und B ERISHA 2002). Im vorliegenden Fall war die Menge des produzierten Progesterons der induzierten, gelbkörperähnlichen Strukturen im Mittel zwar geringer als die der natürlichen Gelbkörper, konnte jedoch trotzdem die Aufrechterhaltung der Gelbkörperaktivität über eine physiologische Zeitspanne hin gewährleisten. RISHA Als subfunktional gelten C.l. mit normaler Lebensdauer und P4-Konzentrationen ≤1,5 ng/ml an Zyklustag 10 (S CHRICK et al. 1992, B URNS et al. 1997, P ETYIM et al. 2000) oder C.l. mit normaler P4-Sekretion und kurzen Zykluslängen (P ETYIM et al. 2000). Dies trifft auf die hier induzierten, gelbkörperähnlichen Strukturen nicht zu. Daher ist davon auszugehen, dass sich trotz zweimal wöchentlichem OPU Gelbkörper mit physiologischen Eigenschaften gebildet haben, welche sich jedoch von ihren natürlichen Pendants entsprechend unterscheiden. 5.2 Follikeleigenschaften, Eizellausbeute und Oozytenqualität Die mittlere Anzahl der punktierten Follikel pro OPU-Sitzung betrug 10,2 ±3,4 in der natürlichen C.l.-Phase, 9,9 ±3,6 in der Follikelphase und 9,9 ±2,9 in der induzierten C.l.-Phase. Es gab keinen statistischen Unterschied zwischen den einzelnen Zyklusphasen. Bezüglich der Anzahl punktierter Follikel konnten andere Forschungsgruppen bei zweimal wöchentlichen OPUSitzungen teilweise weniger (P ETYIM et al. 2003, C HAUBAL et al. 2006, D E ROOVER et al. 2008, H ANSTEDT 2009) und teilweise mehr Follikel (B ONI et al. 1997, G ARCIA und S A LAHEDDINE 1998, R AMOS et al. 2010) pro OPU-Session punktieren. Diese Variation in den Punktionsergebnissen lässt sich auf den Einfluss des Individuums auf die Follikelanzahl zurückführen (L ANSBERGEN et al. 1995). Im Gegensatz zu den Ergebnissen von P ETYIM et al. (2000) konnte kein Einfluss der Zyklusphase auf die Follikelanzahl festgestellt werden. Dies entspricht den Beobachtungen von D OMINGUEZ (1995) und B OEDIONO et al. (1995). In Bezug auf die Anzahl der KOK pro OPU-Session konnten in dieser Arbeit ähnliche Ergebnisse erzielt werden wie in den Arbeiten anderer Autoren (H ANENBERG und VAN WAGTEN DONK - DE L EEUW 1997, P ETYIM et al. 2000, 2003, C HAUBAL et al. 2006, L OPES et al. 2006, D E ROOVER et al. 2008). R AMOS et al. (2010) und G ALLI et al. (2001) erhielten mehr KOK pro OPU-Session. Hier sei auf den nachgewiesenen Einfluss des Punkteurs auf die Eizellausbeute hingewiesen (L ANSBERGEN et al. 1995, M ERTON et al. 2003). Weiterhin kann bei mehreren wöchentlichen OPU-Sitzungen durch die erneute Punktion blutgefüllter, alter Follikel oder durch das Durchstechen C.l.-ähnlicher Strukturen Blut in das Schlauchsystem gelangen, was die Wiederauffindung von Eizellen im Punktat durch die Bildung von Blutkoagula erschwert (P ETYIM et al. 2000). Dies erklärt auch die in dieser Arbeit relativ geringen Wiederfindungsraten [vergleiche auch P IETERSE et al. (1991b), P ETYIM et al. (2003), C HAUBAL et al. (2006), D E ROOVER et al. (2008)]. Ein Einfluss der Zyklusphase auf die Anzahl der KOK wurde, entsprechend den Beobachtungen von B OEDIONO et al. (1995), nicht festgestellt. Die Anzahl der IVP-tauglichen KOK entsprach den Ergebnissen anderer Autoren (L OPES et al. 2006, H ANSTEDT 2009). Im Hinblick auf die morphologische Qualität der gewonnenen KOK zeigten sich ebenfalls keine Unterschiede zwischen den einzelnen Zyklusphasen. Auch DE W IT et al. (2000), VASSENA et al. (2003) und P ETYIM et al. (2003) konnten keine Unter61 5 Diskussion schiede in der Eizellqualität bezogen auf den Zyklusstand des Donortieres feststellen. Ebenso hatten die in jeder Zyklusphase auftretenden dominanten Follikel offenbar keinen Einfluss auf die morphologische Qualität der KOK. Um, analog zu B OEDIONO et al. (1995), L ANSBERGEN et al. (1995), S TUBBINGS und WALTON (1995) bzw. H ENDRIKSEN et al. (2004) und C HAU BAL et al. (2006), einen Einfluss den Zyklusstandes oder eines dominanten Follikels auf die Teilungs- und Entwicklungsraten sowie die Qualität der resultierenden Embryonen zu verifizieren, wären weiterführende Untersuchungen mit einer vollständigen IVP notwendig. 5.3 MessengerRNA-Häufigkeiten in den OPU-Oozyten Da verschiedene äussere Faktoren sich nicht immer auf das morphologische Erscheinungsbild der Eizelle auswirken (H AGEMANN 1999, J EWGENOW et al. 1999, M ERMILLOD et al. 1999, C OTICCHIO et al. 2004, F ENG et al. 2007), wurde in den vergangenen Jahren der Fokus auf die Veränderungen auf molekularer Ebene gerichtet. Dabei konnten verschiedene Gentranskripte als Marker für Qualität und Entwicklungskompetenz identifiziert werden (W RENZYCKI et al. 2007). Bei der Interpretation von Daten aus der RT-PCR-Analyse ist jedoch zu beachten, dass sich nicht alle Veränderungen in der mRNA-Expression auch auf funktionaler Ebene bzw. in der Expression der Proteine wiederfinden. Um einen möglichen Einfluss der Zyklusphase auf die Qualität bzw. die Entwicklungskompetenz der Oozyten zu detektieren, wurden die mRNA-Häufigkeiten von vier qualitätsanzeigenden Genen (GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α) in den Eizellen der verschiedenen Zyklusphasen gemessen. Oozyten der induzierten C.l.-Phase zeigten verringerte Transkriptmengen von GDF9, HIF2α und BMP15. Der Glukosetransporter SCL2A1 war nicht verändert. Ein verringerter GDF9-Gehalt wurde von verschiedenen Autoren mit einer verminderten Eizellqualität in Verbindung gebracht (TAN und L U 1990, PAVLOK et al. 1992, B ORDIGNON et al. 1997, H UMBLOT et al. 2005). Die Untersuchungen von D ONNISON und P FEFFER (2004) ergaben eine verringerte Transkriptmenge in Eizellen aus Follikeln ≤ 2 mm gegenüber Follikeln mit ≥ 5 mm. Auch in vitro gereifte Oozyten enthalten weniger GDF9 als in vivo gereifte (L ONERGAN et al. 2003a). Bei Mäusen konnten ausserdem Störungen der Kumuluszellfunktionen bei veränderter GDF9-Expression nachgewiesen werden (YAN et al. 2001). Somit scheint die GDF9-Expression ein Indikator für die Entwicklungskompetenz zu sein. In Bezug auf die vorliegende Studie würde das bedeuten, dass Eizellen, die während der induzierten Gelbkörperphase gewonnen wurden, eine geringere Entwicklungskompetenz aufweisen. Bezüglich der BMP15-Expression in unreifen, in vivo gewonnenen Oozyten gibt es keine vergleichbaren Studien. In Versuchen von E L -S AYED et al. (2006) enthielten Embryonen, die sich nicht zu einem Kalb entwickelten, weniger BMP15 als solche, deren Entwicklung bis zum gesunden Kalb vonstatten ging. Dies könnte einen Einfluss von BMP15 auf die Entwicklungskompetenz des Embryos implizieren. Inwiefern schon der Gehalt der Oozyte an BMP15 für die spätere embryonale Entwicklung relevant ist, bleibt jedoch offen. Genprodukte des HIF2α-Gens sind an der Stressprotektion beteiligt. Eine Herunterregulation der Genexpression, wie es hier der Fall ist, könnte sich dementsprechend negativ auf die Anpassungsfähigkeit an das Reifungsmilieu und damit auf die In-vitro-Kompetenz auswirken. 62 5.3 MessengerRNA-Häufigkeiten in den OPU-Oozyten Weiterhin wurde die Regulation anderer Gene durch HIF2α belegt (S EMENZA 1998, H ARVEY et al. 2007). Eine veränderte HIF2α-Expression könnte demnach weitreichende Konsequenzen für das Entwicklungspotential haben. Weiterhin wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss von Progesteron auf die Eizellreifung die Transkriptmengen der Progesteronrezeptoren PGR, PAQR5, PGRMC1 sowie PGRMC2 ermittelt. Sämtliche Progesteronrezeptoren waren in den Oozyten der induzierten Gelbkörperphase herunterreguliert. Bezüglich des PGR ist bekannt, dass seine Expression durch umgebendes Progesteron in vitro verändert wird (A PARICIO et al. 2011). Ein Einfluss des Mikromilieus als Ursache für diese Veränderung ist also zu vermuten. Reife Oozyten enthalten laut L UCIANO et al. (2010) und S ALHAB et al. (2011) mehr PGR als unreife, was auf eine aktive Transkription während der Reifung hindeutet. Im vorliegenden Versuch wurden nur unreife Eizellen der Kategorien I-III für die mRNA-Analyse genutzt. Ob eine geringere Ausgangsmenge an PGR, wie hier in den Eizellen der induzierten Gelbkörperphase, durch eine höhere Transkription während der Reifung kompensiert werden kann, ist fraglich. Falls nicht, könnte es nachhaltige Folgen für die embryonale Entwicklung haben und somit auf eine geringere Entwicklungskompetenz hindeuten. Der Rezeptor PAQR5 zeichnet sich durch eine hohe Bindungsaffinität zu P4 mit begrenzter Kapazität aus (Z HU et al. 2003b). Ausserdem unterliegt er einer hormonellen Regulation (Z HU et al. 2003b, C AI und S TOCCO 2005). Die verringerte Expression könnte hier ein Ausdruck der Regulation sein. Für ein tieferes Verständnis der zugrunde liegenden Regelkreise und eventuell weitere beteiligte Hormone sind jedoch weitere Versuche notwendig. So bleibt in diesem Fall unklar, ob der Rezeptor als eine Reaktion auf ein Überangebot an P4 vermindert exprimiert wurde oder ob eine zur P4-Konzentration proportionale Expression zu einem früheren Zeitpunkt vorliegt. Auch die membranständigen Rezeptoren PGRMC1 und PGRMC2 sind in ihrer Expression variabel (KOWALIK und KOTWICA 2008). Verschiedene Autoren (L UCIANO et al. 2010, S AL HAB et al. 2011) sprechen dem PGRMC1 eine Rolle bei der Reifung, genauer bei der Trennung der Chromosomen, zu. Eine wie hier vorliegende verminderte Expression könnte den Ablauf der Reifung stören und die Teilungs- und Entwicklungsraten verringern. Analog dazu wird dem PGRMC2 eine Rolle bei der Blastulation zugeschrieben (L UCIANO et al. 2010). Veränderungen in der Transkriptmenge könnten die embryonale Entwicklung empfindlich stören und zu verminderten Blastozystenraten führen. Allgemein ist noch zu wenig über die Progesteronrezeptoren, ihre Aufgaben und ihre Regulation bekannt. Der Nachweis der P4-Rezeptoren in unreifen und reifen Eizellen lässt jedoch eine Rolle von P4 bei den Reifungsvorgängen vermuten (A PARICIO et al. 2011). Die Tatsache, dass im vorliegenden Versuch sämtliche Veränderungen in den mRNA-Expressionsmustern bei Oozyten der induzierten Gelbkörperphase vorlagen, wirft die Frage nach der Ursache auf. Ob die verringerte P4-Produktion des induzierten Gelbkörpers und somit die geringerte periphere P4-Konzentration diese Veränderungen bewirkt hat, kann nur vermutet werden. Nach wie vor ist unklar, ob und wie peripher zirkulierendes P4 die Komposition der Follikelflüssigkeit beeinflusst. Eine Analyse der endokrinologischen Situation im Follikel über die Follikelflüssigkeit 63 5 Diskussion in Abhängigkeit von der Zyklusphase bzw. dem peripheren P4 könnte diesen Zusammenhang klären. Insgesamt werden deutliche Unterschiede in den Genexpressionsmustern der Eizellen aus den verschiedenen Zyklusphasen deutlich. Diese lassen auf eine verminderte Qualität der Eizellen der induzierten Gelbkörperphase schließen. Inwiefern die zyklusabhängigen Veränderungen des peripheren P4 oder die endokrinologischen Veränderungen durch die OPU-Prozedur die veränderte Genexpression bewirken und welche Folgen dies für die Entwicklungskompetenz hat, bedarf weiterer Untersuchungen. 5.4 Progesteronsupplementation während der Eizellreifung Bezüglich der Reifungsraten wurden keine statistischen Unterschiede zwischen den Oozyten der einzelnen Gruppen festgestellt. Die Erlangung des Meiosestadiums II wird demnach durch den Zusatz von Progesteron weder gestört noch gefördert. Dies entspricht den Ergebnissen von F UKUI et al. (1982). S IROTKIN (1992) hingegen stellten einen positiven Einfluss von P4 auf die Eizellmaturation fest. Diese unterschiedlichen Ergebnisse könnten eine Folge der Verwendung unterschiedlicher Medien sein. So enthielt das IVM-Medium im Versuch von S IROTKIN (1992) FCS. Im vorliegenden Versuch waren die Teilungsraten in allen Gruppen konstant. Lediglich die Entwicklungsraten der Gruppe < 50 ng/ml waren an Tag 7 und 8 signifikant verringert. Dies widerspricht den Ergebnissen von S IROTKIN (1992), die bei P4-Supplementation (0,16 µmol/l, 0,8 µmol/l, 3,2 µmol/l, 16 µmol/l) einen positiven Effekt bezüglich der Oozytenreifung feststellen konnten. Auch K ARLACH (1987) stellten einen positiven Effekt auf die Teilungs- und Entwicklungsraten fest. Die Studie von S ILVA und K NIGHT (2000) hingegen ergab ebenfalls keine Beeinflussung der Teilungsraten durch P4. Eine Konzentration von 0,3 µmol/l zeigte jedoch einen negativen Einfluss auf die Entwicklungsrate. Die in der vorliegenden Studie verwendeten, wesentlich höheren P4-Konzentrationen (0,93 µmol/l, 1,42 µmol/l) scheinen jedoch keinen Einfluss auf die Teilungs- und Entwicklungsraten zu haben. Auch hier sei auf den Einfluss des verwendeten Kulturmediums hingewiesen. F UKUI et al. (1982) beobachteten verschiedene Effekte von Progesteron in Abhängigkeit vom eingesetzten Medium. Dementsprechend sollte beachtet werden, dass das in den Versuchen von S ILVA und K NIGHT (2000) verwendete Medium Estrous Cow Serum (ECS) enthielt, während bei S IROTKIN (1992) FCS und im vorliegenden Versuch BSA mit eCG und hCG benutzt wurden. In welchem Maße die eingesetzten Medien die Progesteronwirkung beeinflussen, bleibt unklar. Der P4-Gehalt des Mediums wurde in der vorliegenden Arbeit vor und nach der Reifung gemessen und eine zur Ausgangskonzentration proportionale Reduktion der eingesetzten Konzentrationen beobachtet. Dies deutet auf einen aktiven Progesteronstoffwechsel und eine Regulation des Steroidmilieus durch die KOK hin. Es ist weithin akzeptiert, dass die Kumuluszellen wichtige Aufgaben bei der Regulation des Mikromilieus während der Reifung übernehmen. Sowohl die Synthese (M INGOTI et al. 2002, S CHOENFELDER et al. 2003, WANG et al. 2006, N UTTINCK et al. 2008, A PARICIO et al. 2011, S ALHAB et al. 2011) als auch die Fähigkeit zum Abbau (N UTTINCK et al. 2008) von P4 durch KOK sind belegt. Da in P4- 64 5.4 Progesteronsupplementation während der Eizellreifung supplementierten Medienportionen, die ohne Oozyten für 24 h inkubiert wurden, keine Reduktion der P4-Konzentration gemessen wurde, ist ein chemischer Zerfall auszuschließen. 5.4.1 Einfluss der Progesteronsupplementation auf die Genexpression Von den hier untersuchten, qualitätsanzeigenden Gentranskripten SCL2A1, GDF9, BMP15 und HIF2α waren lediglich GDF9 und HIF2α bei den mit P4 gereiften Oozyten signifikant verändert. Die Expression des Glukosetransporters SCL2A1 zeigte im vorliegenden Versuch keine statistischen Unterschiede zwischen den Oozyten der Versuchsgruppen bzw. im Vergleich zu den unreifen Eizellen. Dies entspricht der Beobachtung anderer Autoren, die einen Anstieg des Glukosestoffwechsels erst im 8- bis 16-Zellstadium beobachteten (JAVED und W RIGHT 1991, R IEGER et al. 1992, K HURANA und N IEMANN 2000a). Eine Abnahme des Transkriptes, wie sie durch L EQUARRE et al. (1997) beschrieben wurde, konnte hier nicht bestätigt werden. Allerdings scheint das SCL2A1-Gen in seiner Expression durch die Reifungsumgebung beeinflusst zu sein (G ARDNER und K AYE 1995, S AGIRKAYA et al. 2007, VAN H OECK et al. 2011). Bezüglich GDF9 konnte eine signifikant verringerte Menge des Transkriptes in den Progesteronruppen gegenüber den unreifen Eizellen festgestellt werden. Der Vergleich der ohne Zusatz gereiften Kontrollgruppe mit unreifen Oozyten ergab keinen Unterschied. Dies widerspricht den Beobachtungen anderer Autoren, nach denen sich der Gehalt an GDF9 in den Oozyten während der Maturation verringert (S OMFAI et al. 2011, C HU et al. 2012). Die Expression von BMP15 war in Oozyten aller untersuchten Gruppen gleich. Ob dies einem nicht vorhandenen Einfluss der Reifungsumgebung, einer fehlenden Transkription oder einem fehlenden Verbrauch während der Reifung geschuldet ist, bleibt unklar. Zwar gibt es Hinweise auf einen Einfluss der BMP15-Expression auf die Entwicklungskompetenz der Oozyte (H OSOE et al. 2011), dieser könnte allerdings auch erst in den frühen Embryonalstadien relevant werden, die hier nicht untersucht wurden. Transkripte des HIF2α Gens wurden sowohl in den unreifen als auch den gereiften Oozyten nachgewiesen, wobei die Oozyten der Gruppen 150 ng/ml, 300 ng/ml und 450 ng/ml im Vergleich zu den unreifen Oozyten geringere Mengen des Transkriptes aufwiesen. Dies lässt einen konzentrationsabhängigen Einfluss von Progesteron auf die Expression vermuten. Ein regulatorischer Einfluss von HIF2α auf die Expression von SCL2A1 (W RENZYCKI et al. 1998, 2001, H ARVEY et al. 2004) wurde hier nicht offensichtlich. Für die untersuchten Progesteronrezeptoren ergaben sich veränderte Transkripthäufigkeiten im Hinblick auf den nukleären Progesteronrezeptor PGR, den membranständigen Progesteronrezeptor PGRMC2 und PAQR5. In Bezug auf PGR fällt zunächst die signifikant niedrigere Transkriptmenge in unreifen Oozyten gegenüber den ohne Zusatz gereiften Oozyten auf. Dies spricht für eine aktive Transkription während der Reifung. Auch S ALHAB et al. (2011) beobachteten eine steigende mRNAExpression von PGR in Oozyten während der Maturation und berichten sogar von einer Überexpression nach 10 h Reifung. In der Studie von C LEMENTE et al. (2009) zeigten hingegen unreife Oozyten die höchste Expression von PGR. Unter Progesteroneinfluss gereifte Eizellen enthielten signifikant weniger Transkripte des PGR-Gens. Offenbar ist die Expression des Re- 65 5 Diskussion zeptors je nach Progesterongehalt der Reifungsumgebung variabel und wird dem Steroidmilieu angepasst, in diesem Fall durch Herunterregulation. Dies entspricht den Ergebnissen von A PA RICIO et al. (2011), die auf Proteinebene eine geringere Menge von PGR bei Progesteronzusatz (100 ng/ml, 500 ng/ml) verzeichneten. Im Hinblick auf eine potenzielle Rolle bei der Blastozystenformation (L UCIANO et al. 2010) könnte sich dies kritisch auf die Entwicklungsraten und die weitere Embryonalentwicklung auswirken. Von den membranständigen Progesteronrezeptoren unterlag der PGRMC1 in diesem Versuch keiner Veränderung. Es konnte weder ein Unterschied zwischen unreifen und gereiften KOK noch ein Einfluss der Medienzusätze festgestellt werden. Dies widerspricht den Ergebnissen von C LEMENTE et al. (2009), die die höchste Transkriptmenge für PGRMC1 und PGRMC2 in unreifen Oozyten ermittelten und einen sinkenden Gehalt während Reifung und Fertilisation beobachteten. L UCIANO et al. (2010) schreiben dem PGRMC1 eine bedeutende Rolle während der Reifung, speziell bei der Trennung der Chromosomen, zu. Basierend auf dieser Annahme ist zu folgern, dass Progesteron auf diesen Mechanismus wohl keinen erkennbaren Einfluss hat, da das Meiose II-Stadium und damit die nukleäre Reifung in diesem Versuch bei allen Versuchsgruppen unabhängig vom Progesteroneinfluss in gleichem Maße vollendet wurden. Etwaige Veränderungen bezüglich der zytoplasmatischen Reifung wurden hier jedoch nicht untersucht. Auch PGRMC2 soll laut (C LEMENTE et al. 2009) in der unreifen Oozyte zu seiner höchsten Expression kommen und während der Reifung bis hin zur Aktivierung des embryonalen Genoms weniger werden. Dies hat sich in der vorliegenden Studie nicht bestätigt. Es konnte kein Unterschied zwischen unreifen und ohne Zusatz gereiften Oozyten festgestellt werden. Bei P4-Supplementation zeigte sich jedoch bei allen eingesetzten Konzentrationen eine Herunterregulation des Rezeptors. Da dem Rezeptor eine Rolle in der frühen embryonalen Entwicklung zugeschrieben wird (L UCIANO et al. 2010), könnte dies wesentlichen Einfluss auf die Entwicklungsraten und die Embryonenqualität haben. Bezüglich PAQR5 konnten keine Unterschiede zwischen reifen und unreifen Oozyten festgestellt werden. Dies spricht gegen eine Beteiligung an der Oozytenreifung, wie in anderen Spezies belegt wurde (T HOMAS et al. 2002, Z HU et al. 2003b, Q IU et al. 2008). In allen Versuchsgruppen mit P4 sowie der EtOH-Kontrolle war, verglichen mit unreifen Oozyten, eine geringere Menge an PAQR5 vorhanden. Dies könnte einen Effekt des Alkohols auf die PAQR5Expression anzeigen. Insgesamt scheinen die Prozesse der Eizellreifung während der IVM weitgehend vom Progesteron unbeeinflusst abzulaufen. Auf molekularer Ebene führt Progesteron jedoch zu einschneidenden Veränderungen in der Genexpression von GDF9, HIF2α sowie den Progesteronrezeptoren PGR, PGRMC2 und PAQR5. Besonders letztere könnten durch ihre verringerte Expression zu massiven Störungen in der frühen embryonalen Entwicklung führen und sich somit auf die Embryonenqualität auswirken. Um die genauen Mechanismen sowie die Auswirkungen auf die Embryonen und deren molekulare Struktur näher zu beschreiben, sind jedoch weitere Untersuchungen notwendig. 66 5.5 Einfluss des Progesterons auf die Eizellqualität in vivo und in vitro 5.5 Einfluss des Progesterons auf die Eizellqualität in vivo und in vitro Trotz der unterschiedlichen Herkunft der Oozyten in den beiden Versuchsteilen lassen sich auf Genexpressionsebene Parallelen erkennen. Sowohl GDF9 und HIF2α als auch die Progesteronrezeptoren zeigen sich in beiden Fällen massiv beeinflusst. Progesteronzusatz während der In-vitro-Maturation führt offensichtlich ebenso zu einer Herunterregulation dieser Transkripte wie die induzierte Gelbkörperphase. Obwohl diesbezüglich noch weitere Untersuchungen notwendig sind, deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf einen negativen Einfluss von P4 auf die Entwicklungskompetenz der Eizelle hin. 5.6 Schlussfolgerungen Aus den Ergebnissen dieser Arbeit lassen sich folgende Erkenntnisse festhalten: Zweimal wöchentliches OPU • stört den natürlichen Zyklus und das endokrinologische Profil • kann zu C.l.-ähnlichen Strukturen führen Der Zyklusstand des Tieres • hat keinen Einfluss auf die Anzahl und Größenverteilung der Follikel • hat keinen Einfluss auf Anzahl oder Morphologie der Oozyten • beeinflusst die mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene und somit die Entwicklungskompetenz der Oozyten Eine Progesteronsupplementation während der IVM • hat keinen Einfluss auf die Eizellreifung • führt zu veränderten Genexpressionsmustern in den reifen Oozyten • verringert die Entwicklungsraten in der IVP 5.7 Kritische Würdigung der Arbeit Die Eignung des Versuchsaufbaues für die Fragestellung der Arbeit soll hier kritisch betrachtet werden. Das OPU-Verfahren gilt allgemein als einfaches, wiederholbares und minimal invasives Verfahren zur Gewinnung von Eizellen, welches die Gesundheit des Tieres weitestgehend unbeeinflusst lässt (siehe auch Kap. 2.1.1 und 2.2). Da ohne hormonelle Stimulation gearbeitet werden kann, lässt sich die Eizelle aus ihrer physiologischen Umgebung heraus gewinnen und betrachten. Die regelmässige Anwendung der OPU-Prozedur bewirkt jedoch offensichtlich einschneidende Veränderungen im endokriologischen Profil (siehe Kap. 5.1.1), sodass in der Folge keine physiologische Situation mehr vorliegt. Die Veränderungen in der Genexpression der OPU-Oozyten könnten dementsprechend auch eine Folge des Eingriffes in die physiologischen Vorgänge durch das OPU sein. Die Ergebnisse beim OPU sind in hohem Maße von 67 5 Diskussion der durchführenden Person abhängig (M ERTON et al. 2003). Um die Variation gering zu halten wurden die OPU-Sessions immer von derselben Person durchgeführt. Um die hier vorgestellten Ergebnisse zu untermauern oder zu ergänzen, könnte eine Gewinnung und Analyse von Follikelflüssigkeit aufschlussreich sein. Leider ist es mit dem OPU-Equipment verfahrenstechnisch noch nicht möglich, aus einem Follikel sowohl die Eizelle als auch die Follikelflüssigkeit zu gewinnen, da zur Lösung der Eizelle von der Follikelwand ein Unterdruck nötig ist, der zur Vaporisierung der sehr geringen Mengen an Follikelflüssikeit führt [vgl. auch H ANSTEDT (2009)]. Einen der wichtigsten Einfluss nehmenden Faktoren stellt in der IVP die Komposition der Medien in den einzelnen IVP-Schritten dar. Im vorliegenden Versuch wurde dem auf TCM199 basierenden Medium unter anderem die semi-definierte Komponente BSA zugesetzt. Um zu prüfen, ob die beobachteten Effekte sich tatsächlich auf das zugegebene P4 bezogen, wurden zu allen Zeitpunkten (vor der IVM, nach der IVM mit/ohne Eizellen) Kontrollen der Medien bezüglich unerwünschter Progesterongehalte untersucht. Die Reifungskontrollen und Entwicklungsraten der Kontrollgruppen lassen auf eine ausreichende Versorgung der Eizellen bzw. Embryonen schließen. Es bleibt jedoch offen, inwiefern die zytoplasmatische Reifung durch P4 beeinflusst wird. Die real-time RT-PCR ist die bevorzugte Methode für die Ermittlung quantitativer mRNAExpression in kleinen Probenmengen wie Oozyten und präimplantatorische Embryonen (G ÁL et al. 2006), da sie die Ermittlung der exakten Menge der Transkripte erlaubt. Die RT-PCR hingegen ermöglicht lediglich den Vergleich der relativen Menge einer mRNA zwischen verschiedenen Proben, da die Effizienz der Amplifikation für die Primer in den einzelnen Zyklen nicht bekannt ist (T EMELES et al. 1994). Um etwaige Schwankungen durch die durchführende Person zu vermeiden, wurden die PCR-Analysen von einer erfahrenen Mitarbeiterin durchgeführt. Die ausgewählten qualitätsanzeigenden Gene haben sich in ihrer Expression bereits von unterschiedlichen Faktoren beeinflusst gezeigt (W RENZYCKI et al. 2007). Bei der Interpretation von Daten aus der PCR-Analyse ist jedoch zu beachten, dass eine Relevanz auf funktioneller Ebene (Proteinebene) nur angenommen werden kann [vgl. auch D RALLMEYER (2008)]. Die hier analysierten OPU-Oozyten stellen weiterhin eine relativ kleine Stichprobenmenge dar. Zum Zeitpunkt des höchsten, des niedrigsten und wiederum des höchsten Progesteronwertes gewonnen, sind diese Eizellen auch als eine Momentaufnahme zu betrachten. Die jeweilige Zyklusphase umfasst jedoch längere Zeiträume mit ansteigenden und wieder abfallenden P4Werten. Um ein vollständiges Bild zu erhalten und zu beurteilen, ob und zu welchem Zeitpunkt das periphere P4 sich auf die Eizelle auswirkt, wäre eine umfassendere Analyse einer größeren Anzahl von Oozyten aus dem gesamten Zyklus notwendig. Hier wäre eventuell auch die jeweilige Größe des Follikels, aus dem die Eizelle stammt, interessant, da in Abhängigkeit der Größe ein unterschiedliches follikuläres Mikromilieu (K RUIP und D IELEMAN 1985) die jeweilige Oozyte beeinflusst. Je nach follikulärem Entwicklungsstadium unterscheiden sich die Eizellen in ihrer Qualität (TAN und L U 1990, PAVLOK et al. 1992, L ONERGAN et al. 1994, R IZOS et al. 2002). Es wäre also möglich, dass Progesteron zu verschiedenen Zeitpunkten der follikulären Entwicklung unterschiedlich auf die Eizelle und ihre Qualität einwirkt. 68 6 Zusammenfassung Nicole Schlüter Einfluss unterschiedlicher Progesteronkonzentrationen auf die Oozytenmaturation in vivo und in vitro In dieser Arbeit sollte der Einfluss verschiedener Progesteronkonzentrationen auf die Eizellreifung untersucht werden. Dazu wurden im ersten Versuchsteil Oozyten mittels der OPUMethode in unterschiedlichen Zyklusstadien gewonnen. Als Beginn des Versuches wurde Tag 7 (Brunst=Tag 0) des Zyklus gewählt. Einer morphologischen Beurteilung der erhaltenen KOK folgte eine Analyse der mRNA-Expression hinsichtlich GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5. Weiterhin fand eine Analyse des Serumprogesterongehaltes an bei jeder OPU-Session entnommenen Blutproben statt. Alle Versuchstiere zeigten trotz zweimal wöchentlichem Absaugen aller Follikel > 2mm einen physiologischen Zyklus mit Bildung von C.l. (ind. C.l.) während des Versuchszeitraumes. Diese Gelbkörper zeichneten sich durch eine geringere Größe (ind. C.l. 140,6 ±155,9 mm2 , nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm2 ; P ≤0,05) sowie eine geringere P4-Produktion (ind. C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml, nat. C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml; P ≤0,05) gegenüber den natürlich entstandenen, zu Beginn des OPUVersuches bestehenden C.l. (nat.C.l.), aus. Der Zyklusstand beeinflusste weder die Follikelanzahl und -größe noch die Eizellausbeute und -qualität. Hinsichtlich der mRNA-Expression bestand eine verringerte Transkriptmenge von GDF9, BMP15, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5 bei Eizellen aus der induzierten Gelbkörperphase. Im zweiten Versuchsteil wurden aus Schlachthofovarien gewonnene KOK unter Zugabe verschiedener P4-Konzentrationen (< 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml, 450 ng/ml) in vitro gereift und einer vollständigen IVP unterzogen. Gereifte Oozyten der Versuchsgruppen wurden hinsichtlich der Erlangung des Meiose II-Stadiums beurteilt und ebenfalls mittels RT-qPCR auf die Expression der oben genannten Gene untersucht. Die unterschiedlichen Progesteronzusätze zeigten keinen Einfluss auf die Reifung und die Teilungsraten. Die Entwicklungsraten der Gruppe < 50 ng/ml waren an Tag 7 (10,7 ±5,4 %) und 8 (15,8 ±5,4 %) gegenüber der zusatzfreien Kontrollgruppe (d7: 20,7 ±6,6 %, d8: 25,4 ±8,0 %) signifikant verringert. Unter Progesteroneinfluss gereifte Oozyten zeigten im Vergleich zu unreifen Oozyten eine signifikant verringerte Expression von GDF9, HIF2α, PGR, PGRMC2 und PAQR5. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass zweimal wöchentliche OPU-Sessions den natürlichen Zyklus beeinflussen und die Bildung von C.l. mit veränderten Eigenschaften verursachen kann. Die Ergebnisse des OPU sowie die morphologischen Eigenschaften der KOK sind vom Zyklusstand unbeeinflusst, es gibt jedoch Veränderungen auf molekularer Ebene, die sich negativ auf die Entwicklungskompetenz auswirken können. 69 6 Zusammenfassung Die hier untersuchten Parameter zur In-vitro-Reifung von Oozyten zeigten sich durch die Anwesenheit von Progesteron nicht beeinflusst. Allerdings führt die Progesteronexposition während der Reifung zu einer veränderten Genexpression, die sich negativ auf die embryonale Entwicklung auswirken kann. 70 7 Summary Nicole Schlüter Influence of different progesterone concentrations on bovine oocyte maturation in vivo and in vitro The influence of different progesterone concentrations on oocyte maturation was investigated. In the first part of the experiments oocytes were retrieved by twice-weekly OPU. The first OPU-session was performed on day 7 of the natural cycle (oestrus = day 0). Cumulus-oocytecomplexes (COC) were classified by morphological criteria and mRNA expression of GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5 was measured via RT-qPCR. Bloodsamples were taken at every OPU-session and serum progesterone levels measured by radioimmunoassey (RIA). Despite twice weekly removal of all follicles > 2mm from the ovaries all animals showed a natural cycle and formation of C.l. (induced C.l.) during the OPU period. Induced C.l. were smaller (ind. C.l. 140,6 ±55,9 mm2 , nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm2 ; P ≤0,05) and produced less progesterone (ind. C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml, nat. C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml; P ≤0,05) than their natural counterparts at the beginning of the experiment. There was neither an influence of the cycle on number or size of follicles nor on number and quality of retreived oocytes. Messenger RNA expression levels showed a reduced abundance of GDF9, BMP15, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5 transcripts in oocytes of the induced c.l.-phase. In the second part of the experiments oocytes from slaughterhouse ovaries were matured in vitro with different progesterone concentrations (< 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml, 450 ng/ml) followed by in vitro production of embryos. Matured oocytes were rated for meiosis II stages and the expression of GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5 was measured. There was no influence of progesterone on maturation and cleavage rates. Oocytes of the < 50 ng/ml group showed a significant reduction of developmental rates on day 7 and 8 when compared to those of the control group (d7: 10,7 ±5,4 % vs. 20,7 ±6,6 %; d8: 15,8 ±5,4 % vs. 25,4 ±8,0 %). Oocytes from all progesterone treatment groups contained less transcripts of GDF9, HIF2α, PGR, PGRMC2 und PAQR5 compared to immature oocytes. In conclusion, twice-weekly OPU has an influence on the natural cycle in cattle and may induce C.l.s with different characteristics. The cycle has no influence on OPU results and morphological quality of COC. There are alterations in the molecular structure of the oocyte that may influence their developmental competence. Supplementation of progesterone did not show an influence on oocyte maturation and cleavage rates. Gene expression in oocytes matured in progesterone supplemented medium was altered and may have negative effects on early embryonic development. 71 72 A Medien und Chemikalien A.1 Medien für das OPU Tabelle A.1: Zusammensetzung der PBS-Lösung Substrat Einheit Menge Firma Dulbecco´s phosphate buffered saline g/l 9,7 Sigma-Aldrich Penicillin IE/ml 50,0 Sigma-Aldrich Streptomycinsulfat µg/ml 50,0 Sigma-Aldrich Natrium-Pyruvat µg/ml 36,0 Sigma-Aldrich D-Glukose mg/ml 1,0 Riedel-deHaen CaCl2 xH2 O µg/ml 133,0 Sigma-Aldrich Produkt-Nr. D 5773 PENK S 6501 P 3662 16301 C4901 Tabelle A.2: Zusätze für die PBS-Gebrauchslösung (PBS Complete) Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Heparin IE/ml 2,2 Serva 24900 BSA (Fraktion V) mg/ml 1,0 Sigma-Aldrich A 9647 A.2 Medien für die IVP PBS-Lösung: siehe oben Tabelle A.3: Zusammensetzung des TCM air Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. TCM199 g/100 ml 1,5 Sigma-Aldrich M 2520 Gentamycinsulfat mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632 Na-Pyruvat mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662 NaHCO3 mg/100 ml 35,0 Riedel-deHaen 31437 ad. X ml H2 O ml 100,0 Fresenius Ampuwa BSA (FAF) mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030 Tabelle A.4: Zusammensetzung der NaCl-Lösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. NaCl g 9,0 Sigma-Aldrich S 5886 Aqua bidest. l 1 73 A Medien und Chemikalien Tabelle A.5: Zusammensetzung der NaCl-Complete-Lösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. NaCl g 9,0 Sigma-Aldrich S 5886 Aqua bidest. l 1 Penicillin g 0,06 Sigma-Aldrich P 3414 Tabelle A.6: Zusammensetzung des Reifungsmediums Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. TCM199 g/100 ml 1,51 Sigma-Aldrich M 2520 Gentamycinsulfat mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632 Natrium-Pyruvat mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662 NaHCO3 mg/100 ml 35,0 Riedel-deHaen 31437 ad. X ml H2 O ml 100,0 Fresenius Ampuwa BSA (FAF) mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030 PMSG IE/ml 10,0 Intervet Suigonan HCG IE/ml 5,0 Intervet Suigonan Tabelle A.7: Zusammensetzung der FertTALP-Stocklösung Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt(mM) Nr. NaCl mg/100 ml 665,8 114,0 Sigma-Aldrich S 5886 KCl mg/100 ml 23,9 3,2 Sigma-Aldrich P 5405 NaHCO3 mg/100 ml 210,0 25,0 Riedel-deHaen 31437 NaH2 Po4 x H2 O mg/100 ml 4,1 0,3 Merck 1.065.800.500 CaCl2 x 2 H2 O mg/100 ml 29,4 2,0 Sigma-Aldrich C 4901 MgCl2 mg/100 ml 4,8 0,5 Sigma-Aldrich M 8266 Phenolrot mg/100 ml 1,0 0,01 µl/ml Sigma-Aldrich P 5530 Penicillamin mg/100 ml 0,3 20,0 Sigma-Aldrich P 4875 Na-Laktat 60 % mg/100 ml 186,0 10,0 Sigma-Aldrich L 4263 ad. X ml H2 O ml 100,0 Fresenius Ampuwa Tabelle A.8: Zusammensetzung der FertTALP-Gebrauchslösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. FertTALP-Stocklösung ml 10,14 Gentamycinsulfat µg 50 Sigma-Aldrich G 3632 BSA (Fraktion V) mg 60,0 Sigma-Aldrich A 9647 Na-Pyruvat µg 280,0 Sigma-Aldrich P 3662 74 A.2 Medien für die IVP Tabelle A.9: Zusammensetzung der Epinephrin-Lösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Epinephrin mg 1,83 Sigma-Aldrich E 4250 Na-Metabisulfit mg 40,00 Fluka 71928 Na-Laktat (60 %) mg 132,0 Sigma-Aldrich L 4263 H2 O ml 40,0 Fresenius Ampuwa Tabelle A.10: Zusammensetzung der Hypotaurin-Lösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Hypotaurin mg 1,09 Sigma-Aldrich H 1384 H2 O ml 10,0 Fresenius Ampuwa Tabelle A.11: Zusammensetzung der Heparin-Lösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Heparin mg 2,82 Serva 24900 H2 O ml 10,0 Fresenius Ampuwa Tabelle A.12: Zusammensetzung der HHE-Stocklösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Hypotaurin-Lsg. ml 10,0 Epinephrin-Lsg. ml 4,0 H2 O ml 26,0 Fresenius Ampuwa Tabelle A.13: Zusammensetzung der HHE-Gebrauchslösung Substrat Einheit Menge HHE-Stocklsg. µl 80,0 Heparin-Lsg. µl 40,0 Tabelle A.14: Zusammensetzung des Fertilisationsmediums Substrat Einheit Menge HHE-Gebrauchslsg. µl 120,0 FertTALP-Gebrauchslsg. ml 2,0 75 A Medien und Chemikalien Tabelle A.15: Zusammensetzung der Spermfilter-Gebrauchslösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Spermfilter µl 900,0 Gynemed 3SF0010 FertTalp-Gebrauchslsg. µl 100 Tabelle A.16: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung A Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt(mM) Nr. NaCl g/100 ml 6,3 108,0 Sigma-Aldrich S 5886 KCl g/100 ml 0,5 7,2 Sigma-Aldrich P 5405 KH2 PO4 g/100 ml 0,2 1,2 Sigma-Aldrich P 5655 MgSO4 g/100 ml 0,2 1,5 Sigma-Aldrich M 2643 H2 O ml 98,4 Sigma-Aldrich W 1503 Na-Laktat ml 0,6 4,2 Sigma-Aldrich l 4263 Tabelle A.17: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung B Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt(mM) Nr. NaHCO3 g/100 ml 2,10 25,0 Sigma-Aldrich S 4019 Phenolrot g/100 ml 0,01 10 mg/100 ml Sigma-Aldrich P 5530 H2 O ml 100,00 Sigma-Aldrich W 1503 Tabelle A.18: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung C Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt(mM) Nr. Na-Pyruvat mg 80,0 0,73 Sigma-Aldrich P 3662 H2 O ml 10,00 Sigma-Aldrich W 1503 Tabelle A.19: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung D Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt(mM) Nr. CaCl2 x 2 H2 O mg 262,0 1,78 Sigma-Aldrich C 7902 H2 O ml 10,00 Sigma-Aldrich W 1503 76 A.3 Medien für die Reifungskontrolle Tabelle A.20: Zusammensetzung der Glutamin-Stocklösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Glutamin mg 292,0 Sigma-Aldrich G 6392 H2 O ml 10,00 Sigma-Aldrich W 1503 Tabelle A.21: Zusammensetzung des Kulturmediums (SOFaa-Medium) Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt(mM) Nr. myo-Inositol mg 50,0 2,77 Sigma-Aldrich I 7508 tri-Na-Zitrat mg 10,0 0,34 Sigma-Aldrich S 4641 Gentamycin mg 5,0 50 µg/ml Sigma-Aldrich G 3632 H2 O ml 78,0 Sigma-Aldrich W 1503 SOF-Stocklsg. A ml 10,0 SOF-Stocklsg. B ml 10,0 SOF-Stocklsg. C ml 1,0 SOF-Stocklsg. D ml 1,0 Glutamin-Stocklsg. µl 100,0 4,2 BME 50x ml 3,0 10 µg/ml Sigma-Aldrich B 6766 MEM 100x ml 1,0 30 µg/ml Sigma-Aldrich M7145 A.3 Medien für die Reifungskontrolle Tabelle A.22: Zusammensetzung der Fixierlösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Essigsäure 100 % ml 20 Carl Roth GmbH 3738.1 Ethanol ≥99,8 % ml 60 Carl Roth GmbH 9065.1 Tabelle A.23: Zusammensetzung der Lacmoid-Stocklösung Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Lacmoid g 1 Sigma-Aldrich 274720-10G Essigsäure 100 % ml 45 Carl Roth GmbH 3738.1 Tabelle A.24: Zusammensetzung der Lacmoid-Arbeitslösung Substrat Einheit Menge Lacmoid-Stocklösung ml 5 H2 O bidest. ml 5,5 77 A Medien und Chemikalien Tabelle A.25: Zusammensetzung des PVA 0,1 % Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr. Polyvinylalkohol mg 10 Sigma-Aldrich P8136-250G PBS-Stocklösung ml 100 A.4 Medien für den Radioimmunoassay Substrat NaCl H2 O bidest. Tabelle A.26: NaCl-Lösung Einheit Menge Firma g 0,9 Sigma-Aldrich ml 100 Tabelle A.27: Boratpuffer Substrat Einheit Menge Firma NaCl-Lösung 0,9%ig 1 l Borax wasserfrei g 4,02 Fluka Produkt-Nr. S 5886 Produkt-Nr. 71996-250G A.5 Medien für die RT-qPCR Tabelle A.28: Herkunft der bei der RT-PCR eingesetzten Medien Substanz Firma Produkt-Bez. MgCl2 Invitrogen 18067-017 PCR-Puffer Invitrogen 1867-017 dNTPs Eurogentec NU-0010-50 Primer Applied Biosystems RNAse-Inhibitor Applied Biosystems N8080119 MuLV RT Applied Biosystems N8080018 mRNA Globin Sigma-Aldrich R1253-20UG Master-Mix RT-qPCR Eurogentec H2 O Fresenius Ampuwa Tabelle A.29: Tris-HCl Substanz Konzentration pH Tris-HCL 10 mM 7,5 78 A.5 Medien für die RT-qPCR Tabelle A.30: Lysis/Bindingpuffer Substanz Konzentration pH Tris-HCL 100 mM 7,5 LiCl 500 mM EDTA 10 mM 8,0 LiDS 1 %ig DTT(Dithiothreitol) 5 mM Tabelle A.31: Waschpuffer A Substanz Konzentration pH Tris-HCL 10 mM 7,5 LiCl 0,15 mM EDTA 1 mM 8,0 LiDS 1 %ig Tabelle A.32: Waschpuffer B Substanz Konzentration pH Tris-HCL 10 mM 7,5 LiCl 0,15 mM EDTA 1 mM 8,0 Tabelle A.33: Zusammensetzung des Mastermixes für die Reverse Transkription Komponente Volumen Endkonzentration 10 x PCR Puffer 2 µl 1x MgCl2 (50 mM) 2 µl 5 mM dNTPS (10mM) 2 µl 1 mM Hexamer Primer (50 µM) 1 µl 2,5 µM RNase Inhibitor (20IE/µl) 1 µl 20 U Reverse Transkriptase (50IE/µl) 1 µl 50 U Tabelle A.34: Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die RT-qPCR Komponente Konzentration einfacher Ansatz Master-Mix RT-qPCR 10 µl Primer Forward 0,2 µM 0,4 µl Primer Reverse 0,2 µM 0,4 µl cDNA 2-0,25 µl H2 0 ad 20 µl 79 80 B Verzeichnis der Gesamtdaten B.1 Daten aus dem OPU-Versuch Tabelle B.1: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Betty1“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet Datum Zyklustag 28.01.2010 01.02.2010 04.02.2010 08.02.2010 11.02.2010 15.02.2010 18.02.2010 22.02.2010 25.02.2010 8 12 15 19/1 22/4 26/8 29/11 33/15 36/18 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 3 7 5 4,1 8 0,7 11 0,2 14 0,5 18 2,8 22 3,4 26 6,3 31 3,7 Ovar links links links links links links Größe (cmxcm) 2 x 2,5 2 x 1,5 2 x 1,5 2 x 1,0 1,5 x 1,5 1,5 x 1,5 C.l. Homogenität ja ja ja ggr. Inhomogen ggr. Inhomogen inhomogen Hohlraum (cm) nein nein nein nein nein 0,5 (rechts?) (1,5 x 1) (inhom.) nein Tabelle B.2: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy1“ Datum Zyklustag 25.01.2010 28.01.2010 01.02.2010 04.02.2010 08.02.2010 11.02.2010 15.02.2010 18.02.2010 22.02.2010 25.02.2010 8 11 15 18 22/1 25/4 29/8 32/11 36/15 39/18 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 1 3,1 2 4,6 4 4,1 7 4,4 10 0,1 13 0,1 17 0,7 21 1,0 25 2,5 30 1,4 Ovar links links links links links Größe (cmxcm) 2 x 1,5 2 x 1,5 2 x 2,5 2 x 1,5 1 x 1,5 0 0 0 0 0 C.l. Homogenität ja ja ja ggr. Inhomogen ja Hohlraum (cm) nein nein nein nein nein Tabelle B.3: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von "Frieda1a“; nicht gewertet, C.l. aus Zyste Datum Zyklustag 18.02.2010 22.02.2010 25.02.2010 01.03.2010 04.03.2010 08.03.2010 11.03.2010 15.03.2010 6 10 13/1 17/5 20/8 24/12 27/15 31/19 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 24 1,9 28 0,9 33 0,1 36 1 39 2,7 42 3,3 44 4,8 45 1,7 Ovar rechts rechts rechts links??? links links links links Größe (cmxcm) 2x1,5 1,5 x 1,5 1x1 1,5 x 1,5 2x1 2x2 2 x 1,7 1,5 x 1,5 C.l. Homogenität ja inhomogen inhomogen ja ggr. Inhomogen ja ja ja Hohlraum (cm) 0,7 cm 0,2 cm 0 0,5 nein 0,1 nein 0,1 81 B Verzeichnis der Gesamtdaten Tabelle B.4: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Frieda1b“ Datum Zyklustag 25.03.2010 29.03.2010 01.04.2010 05.04.2010 08.04.2010 12.04.2010 15.04.2010 19.04.2010 22.04.2010 26.04.2010 29.04.2010 7 11 14 18 21 25/1 28/4 32/8 35/11 39/15 42/18 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 54 1,4 57 2,2 60 2,1 63 1,2 66 0,1 69 0,2 72 0,6 75 1 78 1,3 79 1,8 80 0,1 Ovar links links links links links rechts rechts rechts rechts rechts Größe (cmxcm) 1,5 x 1,5 1 x 1; 1,5 x 1,5 1,5 x 1,5; 1x1,5 1,5 x 1,5 1 x 1; 1x1 0 0,8 x 0,8 1x1 1x1 0,8 0,5 x 0,5 C.l. Homogenität ja ja;ja ja;ja inhomogen inhomogen Hohlraum (cm) 0,2 nein; nein nein; nein nein nein ja ja ja inhomogen Rest-CL 0,2 0,2 0,2 nein Tabelle B.5: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1a“, Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen Datum Zyklustag 01.02.2010 04.02.2010 08.02.2010 11.02.2010 15.02.2010 7 10 14 17 21/0 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 6 2,9 9 4,7 12 6,3 15 4,9 19 0,5 Ovar links links links/links links/links Größe (cmxcm) 1 x1,5 1 x 1,5 1 x1 ,5 / 1 x 1 1,5x1,5/1x1 0 C.l. Homogenität ja ja ja ja Hohlraum (cm) nein 0,4 nein nein Tabelle B.6: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1b“ Datum Zyklustag 15.03.2010 18.03.2010 22.03.2010 25.03.2010 29.03.2010 01.04.2010 05.04.2010 08.04.2010 12.04.2010 15.04.2010 19.04.2010 22.04.2010 7 10 14 17 21/1 24/4 28/8 31/11 35/15 38/18 42/22 45/25 82 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 47 3 49 3,8 51 4,7 53 7,5 56 0,8 59 0,2 62 1 65 2,8 68 3,3 71 3,3 74 4 77 0,9 Ovar links links links links rechts? rechts rechts rechts rechts Größe (cmxcm) 1,5 x 2 2x2 2x2 2 x 1,5 0 0 0 1x1 1,2 x 1,2 1, 4 x 1,4 2x2 1x1 C.l. Homogenität inhomogen ja central heller ja Hohlraum (cm) nein 0,2 0.2 0,2 inhomogen ja ja ja inhomogen nein nein nein nein nein B.1 Daten aus dem OPU-Versuch Tabelle B.7: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1a“, Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen Datum Zyklustag 22.02.2010 25.02.2010 01.03.2010 04.03.2010 08.03.2010 5 8 12 15 19/0 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 29 3,2 34 2,5 37 5,1 40 2,1 keine Ovar rechts rechts rechts rechts C.l. Homogenität ja ja ja ggr. Inhomogen Größe (cmxcm) 1,5 x 1,5 1,5 x 1,5 1,5 x 1,5 2 x 1,5 0 Hohlraum (cm) 0.8 0,7 0,8 0,1 Tabelle B.8: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1b“ Datum Zyklustag 15.03.2010 18.03.2010 22.03.2010 25.03.2010 29.03.2010 01.04.2010 05.04.2010 08.04.2010 12.04.2010 15.04.2010 19.04.2010 22.04.2010 7 10 14 17 21/1 24/4 28/8 31/11 35/14 38/17 42/21 45/23 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 46 3,0 48 3,5 50 7,9 52 2,9 55 0,4 58 0,4 61 2,9 64 3,7 67 4,8 70 3,7 73 0,3 76 0,2 Ovar links links links links links? links links links links links Größe (cmxcm) 1 x 1,5 +1 x 2 1,5 x 1,5+1,5 x 1,5 1 x 1,5 + 1 x 1,5 1x1; 1x1 0 0 1,5 x 1,5 1 x 1,5 + 1 x 1,5 1,5 x 1,5 1,2 x 1,2 1,2 x 1,2 0,8 x 0,8 C.l. Homogenität ja; ja ja; ja ja;ja ja;ja Hohlraum (cm) nein; nein nein; nein nein; nein nein; nein inhomogen ja ja ggr. Inhomogen ggr. inhomogen nein nein nein nein nein Tabelle B.9: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa1“ Datum Zyklustag 11.02.2010 15.02.2010 18.02.2010 22.02.2010 25.02.2010 01.03.2010 04.03.2010 08.03.2010 11.03.2010 5 9 12 16 19 23/1 26/4 30/8 33/11 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 16 2,6 20 5 23 4,4 27 4,3 32 0,6 35 0,1 38 0,3 41 2,8 43 3,3 Ovar links links links links links links rechts rechts Größe (cmxcm) 2 x 1,5 2 x 2,5 1,5 x 1,5 1,8 x 1,5 2x1 Rest-CL 1x1 0 1 x 1,5 1 x 1,5 C.l. Homogenität ja ja ja ja inhomogen inhomogen inhomogen inhomogen Hohlraum (cm) 0,4 0,5 0,5 x 0,7 0,3 nein nein nein 0,2 nein 83 B Verzeichnis der Gesamtdaten Datum 7? 10? ?/1 ?/4 8 11 15 18 22 25 29/1 32/4 36/8 39/11 Zyklustag Blutprobe Nr. P4 ng/ml 101 8,9 103 12 106 0,5 112 0,2 116 1,3 122 3,9 126 4,5 132 5,2 139 4,3 142 0,8 146 0,7 152 1,3 156 2,2 158 3,0 Ovar rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts Rechts links links Größe (cmxcm) 2x2 1,5 x 1,8/0,8x0,8 1x1 0 1,5 x1,5 2x2 1,8x1,8 1,8 x 1,5 1,8x1,8 Rest-C.l. 0 1x1 1x1 ja ja inhomogen inhomogen inhomogen ja ggr. Inhom. inhomogen nein nein Hohlraum (cm) nein nein/nein nein 0 0,5 1; 0,5;0,5 1 0,4 0,4 nein C.l. Homogenität ja ja/inhomogen inhomogen Tabelle B.10: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera2“, unklarer Versuchsstart, nicht gewertet 31.05.2010 03.06.2010 07.06.2010 10.06.2010 14.06.2010 17.06.2010 21.06.2010 24.06.2010 28.06.2010 01.07.2010 05.07.2010 08.07.2010 12.07.2010 15.07.2010 Datum 7 10 14 17 21 24/1 28/5 31/8 35/11 38/14 42/18 45/21 Zyklustag Blutprobe Nr. P4 ng/ml 107 4,2 113 6,8 117 8,1 123 9,0 127 9,3 133 0,3 138 1,6 143 1,4 147 7,2 153 6,6 157 5,1 159 0,5 links rechts/links rechts/links/links rechts Ovar links links links links links links 1,2x1,2/2x1,8 1x1/0,8x0,8/1x1 1x1 Hämatom ja/nein inhom/ja/ja ggr. Inhom. C.l. Größe (cmxcm) Homogenität 2x2 ja 1,8 x 1,5 ja 2x2 ja 1,5 x 1,8 ja 1,2x 1,2 ja 1,8 x 1,5 ja 0 0,2/nein nein/nein/0,4 nein Hohlraum (cm) nein 0,2 nein nein nein nein Tabelle B.11: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen2“ 07.06.2010 10.06.2010 14.06.2010 17.06.2010 21.06.2010 24.06.2010 28.06.2010 01.07.2010 05.07.2010 08.07.2010 12.07.2010 15.07.2010 84 Tabelle B.12: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa2“; dreimal wöchentliche Punktion, nicht gewertet Blutprobe C.l. Datum Zyklustag Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm) 02.06.2010 7 102 4,2 links/rechts 1x1/0,8x0,8 ja/ja nein/nein 04.06.2010 9 104 7,3 links/rechts 1,5x1,8/1,4x1 ja/inhomogen 0,4/0,1 07.06.2010 12 108 7,3 rechts/links 1,5x1,5/1,5x2 ggr.inhom./ja nein/0,5 09.06.2010 14 110 9,1 rechts/links 1,4x1,4/1,4x1,4 inhomogen/ja nein/0,4 11.06.2010 16 114 9,6 rechts/links 1,4x1,4/1,8x1,6 inhomogen/ja nein/0,4 14.06.2010 19 118 5,6 rechts/links 1x1/1x1,5 inhom/ja nein 16.06.2010 21 120 7,1 links 1,5x1,8 ggr.inhom. nein 18.06.2010 23 124 7,0 links 1,5 x 1,5 ggr. Inhom. nein 21.06.2010 26/1 128 0,2 0 23.06.2010 28/3 130 0,1 0 25.06.2010 30/5 134 0,3 0 28.06.2010 33/8 136 1,1 0 30.06.2010 35/10 140 1,5 0 02.07.2010 37/12 144 1,8 0 05.07.2010 40/15 148 1,9 0 07.07.2010 42/17 150 2,6 0 09.07.2010 44/19 154 2,0 0 B.1 Daten aus dem OPU-Versuch 85 B Verzeichnis der Gesamtdaten Datum 5 8 10 12 15 19 22 24 26/1 29/4 31/6 33/8 36/11 38/13 40/15 Zyklustag Blutprobe Nr. P4 ng/ml 105 2,8 109 4,9 111 5,9 115 7,5 119 7,0 125 7,8 129 7,2 131 5,2 135 5,1 137 3,1 141 5,0 145 3,9 149 4,7 151 4,2 155 3,6 Ovar rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts rechts Größe (cmxcm) 1,4X1,4 1,8x1,8 1,5x2 2x2 1,5x1,5 1,5x1,8 1,5x1,5 1,5 x 1,8 1,5 x 1,8 1,5x1,8 2x2 1,5x1,5 2x1,5 2x1,8 1,8x1,8 C.l. Homogenität ja ja ja ja ja ja ggr. inhom. ja ja ggr. inhom. ja ggr. inhom. inhom. ja inhom. Hohlraum (cm) nein nein nein nein nein nein nein nein nein nein nein nein nein nein nein Tabelle B.13: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy2“; dreimal wöchentliche Punktion, persistierendes C.l.; nicht gewertet 04.06.2010 07.06.2010 09.06.2010 11.06.2010 14.06.2010 18.06.2010 21.06.2010 23.06.2010 25.06.2010 28.06.2010 30.06.2010 02.07.2010 05.07.2010 07.07.2010 09.07.2010 86 B.1 Daten aus dem OPU-Versuch Tabelle B.14: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Stella3“ Datum Zyklustag 28.10.2010 01.11.2010 04.11.2010 08.11.2010 11.11.2010 15.11.2010 18.11.2010 22.11.2010 25.11.2010 29.11.2010 02.12.2010 06.12.2010 09.12.10 7 11 14 18 21 25 28/1 32/5 35/8 39/12 42/15 46/19 49/22 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 205 1,5 208 4,2 211 5,7 214 5,8 216 0,2 220 0,1 221 0,0 226 0,1 229 0,2 232 2,5 234 3,4 236 2,0 238 0,2 Ovar rechts rechts rechts rechts rechts 0 0 0 0 0 links? links? 0 Größe 1,3x1,7 2,2x2,7 2,6x1,8 2,6x2 1,8x1,3 0 0 0 0 0 0 2x1,3 0 C.l. Homogenität ja ja ja ja inhomogen 0 0 0 0 0 0 ja 0 Hohlraum 0,3x0,5 0,5x0,3 0,5x0,2 nein nein 0 0 0 0 0 0 nein 0 Tabelle B.15: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „UFO3“; kein induziertes C.l., nicht gewertet Datum Zyklustag 25.10.2010 28.10.2010 01.11.2010 04.11.2010 08.11.2010 11.11.2010 15.11.2010 18.11.2010 22.11.2010 25.11.2010 29.11.2010 02.12.2010 06.12.2010 09.12.10 7 10 14 17 21 24 28 31 35/1 38/4 42/8 45/11 49/15 52/18 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 201 2,4 203 6,8 206 6,4 209 6,7 212 7,2 217 0,2 218 0,1 223 0,1 224 0,3 227 0,2 230 0,9 233 0,8 235 1,5 237 0,6 Ovar rechts rechts rechts rechts rechts rechts 0 0 0 0 0 0 0 0 Größe 1,7 x 1,2 2x2,6 2,3x1,7 2,3x1,7 2,3x1,7 1,8x1,2 0 0 0 0 0 0 0 0 C.l. Homogenität ja ja ja ja inhomogen inhomogen 0 0 0 0 0 0 0 0 Hohlraum nein nein nein nein nein nein 0 0 0 0 0 0 0 0 87 B Verzeichnis der Gesamtdaten Tabelle B.16: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Tiffy3“ 88 Datum Zyklustag 25.10.2010 28.10.2010 01.11.2010 04.11.2010 08.11.2010 11.11.2010 15.11.2010 18.11.2010 22.11.2010 25.11.2010 29.11.2010 7 10 14 17 21 24 28/1 31/4 35/8 38/11 42/15 Blutprobe Nr. P4 ng/ml 202 3,0 204 6,4 207 8,0 210 10,4 213 7,0 215 0,4 219 0,6 222 1,1 225 3,8 228 3,8 231 2,3 Ovar rechts rechts rechts rechts rechts rechts 0 0 rechts rechts rechts Größe 2,2 x 1,5 2,5x1,4 3x1,8 2,2x1,6 2,3x1,5 1,7x1,6 0 0 1,4x1 1,4x1 1,4x1 C.l. Homogenität ja ja ja ggr. Inhom. hgr. Inhom. inhomogen 0 0 ja ja inhomogen Hohlraum nein nein nein nein nein nein 0 0 nein nein nein 25.01.2010 28.01.2010 01.02.2010 04.02.2010 08.02.2010 11.02.2010 15.02.2010 18.02.2010 22.02.2010 25.02.2010 Datum 28.01.2010 01.02.2010 04.02.2010 08.02.2010 11.02.2010 15.02.2010 18.02.2010 22.02.2010 25.02.2010 Datum 3 mm 4 1 2 2 1 2 1 1 2 1 3 mm 3 1 2 3 0 2 1 2 2 4 mm 2 2 2 3 2 2 3 2 3 1 4 mm 1 2 2 0 1 0 1 4 0 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 2 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 2 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 9 mm 0 0 0 0 1 0 0 0 0 10 mm 0 0 0 2 0 0 0 0 1 > 10 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 2 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 5 0 3 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 5 mm 1 5 2 2 2 2 1 4 3 2 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 0 0 0 1 0 0 1 0 0 4 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 3 0 2 3 0 1 1 2 1 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 mm 1 0 1 0 2 0 0 1 0 0 > 10 mm 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 1 0 0 1 0 3 0 2 1 0 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 2 0 1 1 0 2 1 0 1 0 3 1 1 0 1 3 0 2 1 0 3 0 2 0 1 3 1 1 1 0 Tabelle B.18: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy1“ 5 mm 1 2 1 0 2 1 2 3 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2, 835+836 2, 842+843 2, 864-866 2, 874 2, 899+900 2, 904-906 2, 796 2, 800-802 2, 806-807 Box Nr. 2, 875 2, 895 2, 798-799 2, 808 2, 828 2, 837 2, 844-847 Box Nr. Tabelle B.17: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Betty1“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet B.1 Daten aus dem OPU-Versuch 89 B Verzeichnis der Gesamtdaten Datum 18.02.2010 22.02.2010 25.02.2010 01.03.2010 04.03.2010 08.03.2010 11.03.2010 15.03.2010 Datum 25.03.2010 29.03.2010 01.04.2010 05.04.2010 08.04.2010 12.04.2010 15.04.2010 19.04.2010 22.04.2010 26.04.2010 29.04.2010 4 mm 1 1 1 2 3 1 2 1 4 mm 2 2 3 1 3 1 3 0 3 2 3 5 mm 2 1 1 3 4 3 1 0 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 1 0 0 4 0 1 0 0 0 2 1 0 1 0 0 1 1 2 2 1 0 2 2 1 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 2 0 0 0 0 1 1 0 0 5 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 2 0 0 1 0 1 0 0 0 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 mm 0 0 0 1 0 0 0 0 10 mm 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 2 > 10 mm 1 0 1 0 0 0 0 0 > 10 mm 0 2 0 0 0 1 1 2 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 2 1 0 1 0 3 2 1 0 0 3 1 1 0 0 3 2 1 0 0 3 1 0 2 0 4 0 2 1 1 3 0 1 2 0 0 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 2 1 1 0 0 2 1 0 1 0 3 0 2 1 0 4 0 2 1 1 3 1 1 1 0 1 0 1 0 0 4 2 0 1 0 1 1 0 0 0 2 1 0 1 0 3 0 2 0 0 3 0 0 1 1 Tabelle B.20: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1b“ 5 mm 2 1 1 2 1 0 2 0 3 2 0 5 0 0 1 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 Box Nr. 2, 878+879 2, 901-903 2, 907-909 2, 927-929 2, 952+953 Box Nr. 2a, 1013+1014 2a, 1033+1034 2a, 1043-1045 2a, 1050-1053 2a, 1067-1069 2a, 1070 2b, 1088-1090 2b, 1098 2b,1112+1113 2b, 1147-1149 2b, 1154-1156 Tabelle B.19: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1a“; nicht gewertet, C.l. aus Zyste 3 mm 3 0 2 1 3 1 2 2 3 mm 1 1 3 2 1 4 3 2 1 1 3 90 15.03.2010 18.03.2010 22.03.2010 25.03.2010 29.03.2010 01.04.2010 05.04.2010 08.04.2010 12.04.2010 15.04.2010 19.04.2010 22.04.2010 Datum 01.02.2010 04.02.2010 08.02.2010 11.02.2010 15.02.2010 Datum 3 mm 1 1 1 2 1 5 2 2 3 3 2 3 3 mm 1 3 1 2 1 4 mm 2 2 2 2 1 4 2 4 3 7 2 3 4 mm 0 1 1 1 2 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 mm 0 0 0 0 0 10 mm 1 0 1 1 1 > 10 mm 0 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 1 0 1 0 0 2 0 1 1 0 1 1 0 0 0 4 1 2 0 1 3 0 1 2 0 5 mm 2 3 2 3 1 1 3 1 0 3 1 2 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 1 0 0 0 1 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 2 2 0 0 1 0 1 1 0 0 9 mm 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 10 mm 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 > 10 mm 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 4 2 2 0 0 6 0 1 4 0 5 0 2 1 0 3 1 0 2 0 1 0 0 1 0 5 1 3 1 0 1 1 0 0 0 2 0 0 2 0 7 1 4 1 0 7 2 2 2 0 1 0 0 1 0 6 2 2 2 0 Tabelle B.22: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1b“ 5 mm 0 3 1 1 0 5 0 1 2 0 0 0 0 0 1 1 0 0 5 0 0 0 0 0 2, 976-978 2a, 998-1000 2a, 1003-1007 2a, 1010+1011 2a, 1035 2a, 1038-1042 2a, 1049 2a, 1065+1066 2b, 1073-1078 2b, 1084-1087 2b, 1099 2b,1116-1121 Box Nr. 2, 809 2, 826+827 2, 838 2, 848-850 2, 867+868 Box Nr. Tabelle B.21: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1a“; Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen B.1 Daten aus dem OPU-Versuch 91 B Verzeichnis der Gesamtdaten 3 mm 2 2 4 3 0 1 2 2 2 2 3 3 mm 1 1 3 2 0 4 mm 2 1 2 1 2 2 2 1 1 2 1 4 mm 1 2 4 2 0 5 mm 2 3 3 2 1 2 3 1 4 2 3 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 0 0 1 2 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 2 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 2 0 1 9 mm 0 0 0 0 0 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 mm 0 0 1 0 0 10 mm 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 > 10 mm 0 0 0 0 0 > 10 mm 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 2 2 0 0 0 3 1 2 0 0 1 1 0 0 0 5 2 2 1 0 0 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 3 1 1 1 0 3 1 1 1 0 1 0 1 0 0 2 2 0 0 0 3 1 1 0 1 3 2 0 1 0 5 2 3 0 0 2 0 1 0 0 3 1 1 0 1 7 1 4 0 0 2 0 1 0 0 Tabelle B.24: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1b“ 5 mm 1 3 0 1 0 5 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2 1 5 0 0 0 0 0 2a, 995-997 2a, 1001+1002 2a, 1012 2a, 1031+1032 2a, 1036+1037 2a, 1046-1048 2a, 1060-1064 2b, 1071+1072 2b, 1081-1083 2b, 1094-1097 2b, 1114+1115 Box Nr. 2, 896 2, 910-912 2, 922 2, 934-937 Box Nr. Tabelle B.23: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1a“; Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen Datum 22.02.2010 25.02.2010 01.03.2010 04.03.2010 08.03.2010 Datum 18.03.2010 22.03.2010 25.03.2010 29.03.2010 01.04.2010 05.04.2010 08.04.2010 12.04.2010 15.04.2010 19.04.2010 22.04.2010 92 3 mm 3 1 2 1 3 7 5 1 3 4 mm 3 4 1 3 4 3 0 2 1 5 mm 3 2 0 2 0 2 4 2 2 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 0 0 1 2 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 2 1 0 1 1 0 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 mm 0 0 0 0 1 1 0 0 0 > 10 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 2 0 1 0 1 4 1 1 0 2 2 0 1 1 0 2 0 0 2 0 5 2 2 0 0 1 0 1 0 0 5 2 2 0 0 3 0 3 0 0 4 1 1 2 0 5 0 0 0 0 1 0 1 0 0 2, 851+852 2, 869+870 2, 876+877 2, 897+898 2, 913-916 2, 921 2, 930-933 2, 954-956 2, 965-968 Box Nr. 04.06.2010 07.06.2010 09.06.2010 11.06.2010 14.06.2010 18.06.2010 21.06.2010 23.06.2010 25.06.2010 28.06.2010 30.06.2010 02.07.2010 05.07.2010 07.07.2010 09.07.2010 Datum 3 mm 6 1 4 6 4 6 8 3 5 2 5 3 5 1 3 4 mm 2 3 5 3 3 3 10 6 4 4 3 5 5 5 3 5 mm 1 3 4 1 2 4 0 4 4 1 2 3 4 1 3 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 0 0 0 2 0 0 2 0 0 4 0 0 3 0 0 1 0 1 2 0 1 1 0 0 0 0 0 2 0 2 0 1 0 1 1 0 4 0 1 5 0 1 2 0 2 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 > 10 mm 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 6 1 4 0 0 4 1 3 0 0 2 1 0 1 0 6 0 3 1 0 1 0 0 1 0 6 1 1 4 0 11 4 3 3 0 3 1 1 1 0 3 1 0 2 0 5 1 1 3 0 2 0 1 1 0 6 1 2 1 1 4 2 0 0 0 4 2 2 0 0 1 0 1 0 0 5 1 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 1 2 0 0 2b, 1266-1271 2b, 1273-1276 2b; 1292-1293 2c, 1324-1327 2c, 1333 2c, 1377-1382 2c; 1390-1396 2c; 1402-1404 2c; 1436-1437 2c; 1441-1445 2c; 1457-1458 2d; 1493-1496 2d; 1501 2d; 1508-1511 2d; 1548 Box Nr. Tabelle B.26: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy2“; dreimal wöchentliche Punktion, persistierendes C.l., nicht gewertet 11.02.2010 15.02.2010 18.02.2010 22.02.2010 25.02.2010 01.03.2010 04.03.2010 08.03.2010 11.03.2010 Datum Tabelle B.25: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa1“ B.1 Daten aus dem OPU-Versuch 93 B Verzeichnis der Gesamtdaten Datum 07.06.2010 10.06.2010 14.06.2010 17.06.2010 21.06.2010 24.06.2010 28.06.2010 01.07.2010 05.07.2010 3 mm 6 7 6 3 7 2 4 3 4 3 mm 2 4 1 3 8 2 4 5 8 6 6 3 3 3 1 3 5 4 mm 5 5 4 5 2 7 5 3 5 4 mm 3 2 0 3 3 5 3 2 3 7 4 3 6 4 5 6 4 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 2 0 2 0 1 1 0 2 1 0 4 1 1 1 1 0 1 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 mm 1 0 1 0 0 0 0 0 1 > 10 mm 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 6 2 2 1 0 8 2 3 3 0 3 1 0 2 0 13 3 4 4 0 2 2 0 0 0 3 0 2 1 0 5 2 1 1 0 4 2 1 1 0 0 0 0 0 0 Tabelle B.27: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen2“ 5 mm 1 3 1 5 1 0 0 2 1 5 mm 2 0 1 2 3 1 1 3 0 1 4 3 0 3 3 1 1 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 2 1 0 0 2 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 2 0 2 0 0 1 0 0 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 > 10 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 5 0 1 3 1 1 0 0 0 0 2 1 0 1 0 2 0 2 0 0 5 1 1 3 0 1 0 0 1 0 3 1 2 0 0 0 0 0 0 0 3 0 3 0 0 7 3 1 1 0 4 1 0 1 1 1 0 1 0 0 4 2 2 0 0 6 1 2 1 0 1 0 0 1 0 7 2 3 1 0 7 1 2 4 0 5 1 0 0 2 0 0 1 0 0 5 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 1 0 1 0 Box Nr. 2b, 1283-1287 2b, 1302-1307 2c, 1334-1336 2c, 1367-1376 2c; 1385+1386 2c; 1433-1435 2c; 1446-1450 2d; 1484-1487 2c; 1387-1389 2c; 1397-1401 2c; 1438-1439 2c; 1440 2c; 1459-1462 2d; 1488-1492 2d; 1497 2d; 1502-1507 2d; 1549-1553 2b, 1255-1259 2b, 1272 2b, 1281-1282 2b, 1290 2c, 1328-1331 2c, 1332 2c, 1351-1353 Box Nr. Tabelle B.28: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa2“; dreimal wöchentliche Punktion, nicht gewertet Datum 02.06.2010 04.06.2010 07.06.2010 09.06.2010 11.06.2010 14.06.2010 16.06.2010 18.06.2010 21.06.2010 23.06.2010 25.06.2010 28.06.2010 30.06.2010 02.07.2010 05.07.2010 07.07.2010 09.07.2010 94 28.10.2010 01.11.2010 04.11.2010 08.11.2010 11.11.2010 15.11.2010 18.11.2010 22.11.2010 25.11.2010 29.11.2010 02.12.2010 06.12.2010 09.12.10 Datum 31.05.2010 03.06.2010 07.06.2010 10.06.2010 14.06.2010 17.06.2010 21.06.2010 24.06.2010 28.06.2010 Datum 3 mm 4 4 3 9 10 6 3 3 2 0 3 3 5 3 mm 2 4 3 15 4 10 2 6 3 4 mm 5 6 4 3 3 4 1 7 4 4 5 6 5 4 mm 3 3 5 7 5 7 4 8 7 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 mm 2 0 0 0 1 1 0 0 0 > 10 mm 0 0 1 0 1 0 0 0 0 5 mm 3 2 1 0 1 5 3 3 2 2 4 5 0 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 1 0 2 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 2 1 1 2 0 2 1 0 0 2 0 1 2 1 0 9 mm 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 > 10 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 7 2 0 1 4 3 0 0 1 1 2 0 0 1 1 6 1 0 3 2 13 1 0 10 0 5 1 2 0 0 3 0 1 2 0 5 3 1 1 0 8 0 0 5 1 2 0 1 1 0 4 0 2 2 0 8 3 4 1 0 5 0 1 4 0 5 0 1 0 0 2 2 0 0 2 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 5 1 0 0 0 1 0 6 2 1 2 1 0 4 0 2 1 0 1 18 5 6 5 0 1+1* 4 2 1 0 0 1 3 0 3 0 0 0 2 2 0 0 0 0 8 3 2 2 0 1 7 2 2 2 0 1 Tabelle B.30: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Stella3“ 5 mm 1 1 1 5 4 7 2 4 4 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 1 0 0 2 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 2 0 1 0 0 0 2 0 1 Box Nr. 2b, 1254 2b, 1260-1265 2b; 1277-1280 2b, 1302-1307 2c, 1337-1340 2c, 1364-1366 2c; 1383-1384 2c; 1428-1432 2c; 1451-1456 Box Nr. 2d; 1783-1789 2d; 1798 2d; 1806 2e; 1822-1827 2e; 1839-1849 2e; 1852-1856 2e; 1867-1869 2e; 1878-1881 2e; 1889-1894 2e; 1906+1907 2e; 1929-1932 2e; 1939-1946 2e; 1951-1955 Tabelle B.29: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera2“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet B.1 Daten aus dem OPU-Versuch 95 B Verzeichnis der Gesamtdaten Datum 3 mm 2 2 3 5 1 6 6 3 3 6 2 3 mm 8 2 2 4 1 6 3 4 4 0 3 2 1 2 4 mm 4 3 2 6 6 1 6 2 3 3 3 4 mm 2 5 0 3 2 1 4 0 3 3 4 5 3 3 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 1 0 1 1 1 0 1 0 1 2 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 0 1 4 0 0 9 mm 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 10 mm 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 > 10 mm 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 10 5 2 1 1 7 0 2 3 1 2 0 2 0 0 6 2 2 2 0 3 0 0 3 0 8 0 0 5 1 5 1 2 2 0 6 0 0 3 1 3 0 0 2 0 5 2 1 1 0 5 1 1 3 0 Tabelle B.31: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Tiffy3“ 5 mm 2 1 2 1 4 3 2 3 4 1 2 5 mm 1 3 1 0 2 0 1 2 3 4 1 4 2 3 punktierte Follikel 6 mm 7 mm 8 mm 2 0 0 3 0 0 3 1 1 2 0 1 2 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 2 0 0 0 0 2 2 0 0 1 1 0 3 0 1 9 mm 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 10 mm 0 0 0 0 1 0 1 0 2 0 1 0 0 0 > 10 mm 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 Eizellen (n) der Kategorie Anzahl (n) 1 2 3 4 9 6 0 2 1 5 1 0 3 1 6 2 1 1 2 2 0 0 1 0 5 1 3 1 0 3 0 0 2 0 1 0 1 0 0 4 0 1 3 0 6 1 2 1 0 4 1 0 2 0 6 1 2 3 0 6 2 2 1 1 2 0 1 1 0 4 1 1 2 0 5 1 1 0 0 0 2 0 2 1 1 0 5 0 0 0 1 0 1 0 0 2 1 0 0 0 0 Box Nr. 2d, 1764-1771 2d; 1778-1782 2d; 1796+1797 2d; 1800-1805 2e; 1819-1821 2e; 1828-1835 2e; 1850+1851 2e; 1859-1861 2e; 1875-1877 2e; 1885-1888 2e; 1901-1905 Box Nr. 2e; 1863-1866 2e; 1870-1874 2e; 1882-1884 2e; 1895-1900 2e; 1923-1928 2e; 1937-1938 2e; 1947-1950 2d, 1756-1763 2d; 1773-1777 2d; 1790-1795 2d; 1799 2e; 1814-1818 2e; 1836-1838 Tabelle B.32: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „UFO3“; kein induziertes C.l., nicht gewertet 25.10.2010 28.10.2010 01.11.2010 04.11.2010 08.11.2010 11.11.2010 15.11.2010 18.11.2010 22.11.2010 25.11.2010 29.11.2010 Datum 25.10.2010 28.10.2010 01.11.2010 04.11.2010 08.11.2010 11.11.2010 15.11.2010 18.11.2010 22.11.2010 25.11.2010 29.11.2010 02.12.2010 06.12.2010 09.12.10 96 B.1 Daten aus dem OPU-Versuch B.1.1 Näherungsfunktionen und Berechnungen für den Verlauf des Serumprogesteronwertes Die Tabelle B.33 bezieht sich auf die mit Hilfe von Gnuplot ermittelte Näherungsfunktion für den Verlauf des Serumprogesterongehaltes der Einzeltiere während des Versuchszeitraumes mit der allgemeinen Funktionsgleichung f (x) = a · (sin((x + b) · c) + 1) · e(−d·x) . Tabelle B.33: Die Funktionsparameter mit ihren Standardfehlern (Asymptotic Standard Error) für die einzelnen Tiere Parameter Tier Betty a 4.12882 ± 1.008 (24.41%) Crazy 4.37484 ± 1.017 (23.25%) Frieda 1.39476 ± 0.2418 (17.34%) Hera 3.66531 ± 0.9774 (26.67%) Queen 1 3.42064 Queen 2 6.71004 Rosa 3.0473 Stella 3.92724 ± 0.7365 (21.53%) ± 1.795 (26.75%) ± 0.6587 (21.62%) ± 1.073 (27.33%) Tiffy 9.32713 ± 2.183 (23.4%) UFO 10.4009 ± 4.307 (41.41%) b -0.237424 c 0.255471 ± 2.08 (876.1%) -8.36155 ± 0.02276 (8.91%) 0.27077 ± 0.8619 (10.31%) -6.5418 ± 0.02112 (7.8%) 0.268788 ± 0.9339 (14.28%) -8.3315 ± 0.01365 (5.077%) 0.266554 ± 1.155 (13.87%) -7.88606 ± 0.01671 (6.269%) 0.303657 ± 0.8206 (10.41%) -9.70609 ± 0.01387 (4.569%) 0.274973 ± 1.011 (10.42%) -5.46793 ± 0.01613 (5.867%) 0.265753 ± 1.019 (18.64%) -8.74304 ± 0.02276 (8.563%) 0.23994 ± 1.265 (14.47%) -10.1215 ± 0.01829 (7.622%) 0.266051 ± 0.6969 (6.885%) -9.80193 ± 0.01708 (6.421%) 0.21255 ± 1.113 (11.36%) ± 0.0223 (10.49%) d 0.015388 ± 0.009855 (64.05%) 0.0395779 ± 0.01188 (30.02%) 0.01741 ± 0.007619 (43.76%) 0.0146267 ± 0.0106 (72.49%) 0.00843052 ± 0.008891 (105.5%) 0.0168831 ± 0.01055 (62.48%) 0.0143687 ± 0.013 (90.48%) 0.0270885 ± 0.01163 (42.93%) 0.0394403 ± 0.01118 (28.35%) 0.0641817 ± 0.02217 (34.54%) B.1.2 Progesteronverläufe der Einzeltiere Für die abgebrochenen, nicht beendeten Versuchsdurchläufe Hera 1a, Frieda 1a und Queen 1a wurden aufgrund der unvollständigen Daten keine Graphiken erstellt. 97 B Verzeichnis der Gesamtdaten Abbildung B.1: Graphische Darstellung des Progesteronprofils der Einzeltiere während des Versuchszeitraumes; Zyklustag = Tag nach natürlicher Brunst; + gemessene Werte, – Näherungsfunktion 98 life span 17 12 18 16 18 17 19 19 17,0 ±2,3 nat. C.l. P4 MW Fläche qmm 4,1 274,9 1,7 225,0 4,7 133,3 4,4 255,3 7,5 232,5 4,1 237,6 3,5 313,7 7,0 301,1 4,6 246,7 ±1,9 ±56,0 Zyklus 2 (Tage) 23 23 24 21 23 24 27 23 23,5 ±1,7 life span 11 9 16 15 18 15 15 16 14,4 ±2,9 gemessenes P4-Max 1 Tag ng/ml 11 4,6 11 2,2 17 7,5 14 7,9 21 9,3 9 5 18 5,8 17 10,4 14,8 6,6 ±4,2 ±2,7 P4-Max 2 Tag ng/ml 36 2,0 35 1,5 37 4,2 34 5,1 38 7,1 35 3,7 41 2,6 39 4,0 36,9 3,8 ±2,4 ±1,8 gemessenes P4-Max 2 Tag ng/ml 36 2,5 39 1,8 42 4,0 35 4,8 35 7,2 30 2,8 42 3,4 38 3,8 37,1 3,8 ±4,0 ±1,7 Zyklus 1 (Tage) 23 23 24 23 25 23 26 24 23,9 ±1,1 ∆Max 3,1 0,8 1,8 1,0 3,3 1,5 2,7 6,1 2,5 ±1,7 beobachteter Zyklus (Tage) 21 24 20 20 23 22 27 27 23,0 ±2,8 ind. C.l. P4 MW Fläche qmm 1,7 117,8 1,4 62,8 2,9 147,7 3,8 175,5 4,4 218,0 3,1 116,2 2,7 204,2 2,7 82,5 2,8 140,6 ±1,0 ±55,9 Tabelle B.35: Vergleich der berechneten und gemessenen Werte Zyklus 1 (Tage) 23 23 24 23 25 23 26 24 23,9 ±1,1 P4-Max 1 Tag ng/ml 13 5,1 12 2,3 14 6,0 13 6,1 15 10,4 11 5,2 14 5,3 15 10,1 13,4 6,3 ±1,4 ±2,7 Tier Crazy 1 Frieda 1 b Hera 1b Queen 1b Queen 2 Rosa 3 Stella 3 Tiffy 3 Mittelwert ±SD Tabelle B.34: Berechnungen aus den Funktionen Berechnungen aus den Funktionen Tier Crazy 1 Frieda 1b Hera 1b Queen 1b Qeen 2 Rosa 3 Stella 3 Tiffy 3 Mittelwert ±SD B.1.3 Zyklus 2 (Tage) 23 23 24 21 23 24 27 23 23,5 ±1,7 B.2 Daten aus dem IVM-Versuch 99 B Verzeichnis der Gesamtdaten 116,8 45 50 19 33 30 Tabelle B.37: IVP-Durchgänge der Gruppe P4=150 ng/ml P4 Medium (ng/ml) Teilung Anzahl (n) Ansatz leer mit Oozyten geteilte (n) % d7 (n) 135,3 128,3 52,4 29 17 58,6 5 115,3 116,2 45,4 15 5 33,3 4 143,1 139,7 23,5 50 18 36,0 4 140,6 18,6 25 18 72,0 3 23,8 40 17 42,5 6 21,6 37 22 59,5 12 32,2 62 31 50,0 14 29,9 27 18 66,7 4 27,8 13 4 30,8 1 31,3 24 10 41,7 6 65,3 58 25 43,1 6 12,5 8,6 10,5 Tabelle B.36: IVP-Durchgänge der Gruppe P4 <50 ng/ml P4 Medium (ng/ml) Teilung Anzahl (n) Ansatz leer mit Oozyten geteilte (n) % d7 (n) 15,7 20,6 7,5 21 46,7 8 52,6 24 48,0 5 53,9 37,9 6 31,6 1 33,4 12 36,4 1 17 56,7 4 B.2 Daten aus dem IVM-Versuch B.2.1 IVP-Durchgänge der Versuchsgruppen Datum 27.01.2010 09.02.2010 16.02.2010 24.02.2010 20.01.2010 Datum 20.04.2010 29.06.2010 15.02.2011 09.03.2010 22.06.2010 06.07.2010 13.07.2010 20.07.2010 14.09.2010 15.12.2010 31.05.2011 Entwicklung % d7 d8 (n) 17,2 7 26,7 6 8,0 7 12,0 3 15,0 8 32,4 12 22,6 15 14,8 6 7,7 2 25,0 6 10,3 8 Entwicklung % d7 d8 (n) 17,8 9 10,0 7 5,3 3 3,0 5 13,3 4 % d8 24,1 40,0 14,0 12,0 20,0 32,4 24,2 22,2 15,4 25,0 13,8 % d8 20,0 14,0 15,8 15,2 13,3 100 01.03.2011 15.03.2011 01.06.2011 02.06.2010 27.07.2010 21.09.2010 07.06.2011 Datum 17.08.2010 01.02.2011 11.04.2011 03.05.2011 15.06.2010 Datum Entwicklung % d7 d8 (n) 10,7 7 22,6 17 17,2 13 11,1 3 13,3 10 Entwicklung % d7 d8 (n) 18,3 13 12,0 6 17,2 8 16,1 5 13,6 8 21,2 15 18,9 10 Tabelle B.38: IVP-Durchgänge der Gruppe P4=300 ng/ml P4 Medium (ng/ml) Teilung Anzahl (n) Ansatz leer mit Oozyten geteilte (n) % d7 (n) 267,4 180,2 23,2 56 18 32,1 6 346,7 328,2 62 39 62,9 14 358,5 55,3 58 33 56,9 10 330,5 327,3 40,0 27 7 25,9 3 35,8 75 37 49,3 10 Tabelle B.39: IVP-Durchgänge der Gruppe P4=450 ng/ml P4 Medium (ng/ml) Teilung Anzahl (n) Ansatz leer mit Oozyten geteilte (n) % d7 (n) 407,1 77,9 60 28 46,7 11 464,2 525,3 122,4 25 8 32,0 3 330,5 484,3 54,5 29 17 58,6 5 301,7 65,8 31 12 38,7 5 64,2 59 26 44,1 8 65,4 33 18 54,5 7 48,9 53 31 58,5 10 % d8 21,7 24,0 27,6 16,1 13,6 45,5 18,9 % d8 12,5 27,4 22,4 11,1 13,3 B.2 Daten aus dem IVM-Versuch 101 B Verzeichnis der Gesamtdaten Datum 02.02.2010 03.03.2010 17.03.2010 14.04.2010 04.05.2010 04.08.2010 10.08.2010 07.09.2010 05.10.2010 12.10.2010 26.10.2010 23.11.2010 30.11.2010 07.12.2010 05.01.2011 18.01.2011 18.04.2011 24.05.2011 21.06.2011 25.08.2010 >40 209,1 206,8 190,6 172,2 417,0 402,8 15,3 40,8 69,0 26,6 0 51 30 0 20 0 PILZ % d7 (n) 38,2 2 30,4 2 33 1 53,7 3 41,9 2 43,4 4 48,1 0 38,6 6 60 7 50 6 46,2 1 46,4 13 PILZ PILZ 31,3 1 PILZ 0 0 39,2 8 0 0 0 15,7 0 0 12 0 Tabelle B.40: Nicht gewertete IVP-Durchgänge der P4-Gruppen P4 Medium (ng/ml) Teilung Entwicklung Anzahl (n) Ansatz leer mit Oozyten geteilte (n) % d7 d8 (n) 119,7 >40 36,2 55 21 3,6 2 >40 27,8 46 14 4,3 4 101,7 30,8 12 4 8 1 87,0 26,3 41 13 7,3 3 174,3 162,2 19,0 31 13 6,5 3 25,3 53 23 7,5 2 281,9 194,0 29,8 27 13 0 2 40,9 44 17 13,6 7 48,8 45 27 15,6 9 >40 42,5 22 11 27,3 9 37,8 13 6 7,7 2 >40 56 26 23,2 13 32,9 64,1 >40 16 5 6,25 1 17,1 297,6 281,5 198,7 277,3 629,9 504 410,3 252 % d8 3,6 8,6 8 7,3 9,7 7,5 7,4 15,9 20 40,9 15,4 23,2 6,25 0 23,5 0 102 B.2 Daten aus dem IVM-Versuch Tabelle B.41: IVP-Durchgänge der zusatzfreien Kontrollgruppe; Durchgänge mit Entwicklungsraten < 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet Datum Anzahl (n) 12.01.2010 19.01.2010 26.01.2010 02.02.2010 09.02.2010 23.02.2010 02.03.2010 09.03.2010 16.03.2010 06.04.2010 13.04.2010 20.04.2010 27.04.2010 04.05.2010 11.05.2010 01.06.2010 15.06.2010 22.06.2010 29.06.2010 06.07.2010 13.07.2010 20.07.2010 27.07.2010 03.08.2010 10.08.2010 17.08.2010 19.10.2010 23.11.2010 01.02.2011 01.03.2011 15.03.2011 29.03.2011 11.04.2011 18.04.2011 02.05.2011 24.05.2011 30.05.2011 01.06.2011 07.06.2011 27 28 17 29 28 27 27 21 20 21 28 24 25 17 30 21 33 28 24 22 24 21 14 26 26 31 20 27 23 27 32 29 30 26 26 22 30 25 30 Teilungsrate % (n) 33,3 (9) 71,4 (20) 58,8 (10) 37,9 (11) 67,9 (19) 37,0 (10) 59,3 (16) 61,9 (13) 45,0 (9) 61,9 (13) 57,7 (16) 45,8 (11) 68,0 (17) 58,8 (10) 46,6 (14) 57,1 (12) 39,4 (13) 57,1 (16) 25,0 (6) 31,8 (7) 41,7 (10) 57,1 (12) 7,1 (1) 61,5 (16) 46,2 (12) 58,1 (18) 35,0 (7) 59,3 (16) 69,6 (16) 51,9 (14) 3,1 (1) 58,6 (17) 73,3 (22) 50,0 (13) 50,0 (13) 72,7 (16) 70,0 (21) 56,0 (14) 56,7 (17) Entwicklung % (n) d7 % (n) d8 18,5 (5) 18,5 (5) 17,9 (5) 17,8 (5) 17,6 (3) 23,5 (4) 13,8 (4) 24,1 (7) 21,4 (6) 21,4 (6) 3,7 (1) 7,4 (2) 11,1 (4) 14,8 (4) 14,3 (3) 19 (4) 0,0 (0) 0,0 (0) 14,3 (3) 33,3 (7) 25,0 (7) 28,6 (8) 4,1 (1) 4,1 (1) 36,0 (9) 36,0 (9) 5,9 (1) 5,9 (1) 16,6 (5) 30,0 (9) 23,8 (5) 23,8 (5) 12,1 (4) 15,2 (5) 3,6 (1) 7,1 (2) 4,2 (1) 8,3 (2) 9,1 (2) 9,1 (2) 25 (6) 29,2 (7) 19 (4) 23,8 (5) 0,0 (0) 0,0 (0) 19,2 (5) 19,2 (5) 3,8 (1) 11,5 (3) 3,2 (1) 9,7 (3) 20,0 (4) 25,0 (5) 37,0 (10) 48,1 (13) 4,3 (1) 21,7 (5) 18,5 (5) 18,5 (5) 0,0 (0) 0,0 (0) 20,7 (6) 27,6 (8) 26,7 (8) 33,3 (10) 19,2 (5) 26,9 (7) 15,4 (5) 23,1 (6) 31,8 (7) 40,9 (9) 26,7 (8) 26,7 (8) 16,0 (4) 24,0 (6) 16,7 (5) 16,7 (5) 103 B Verzeichnis der Gesamtdaten Tabelle B.42: IVP-Durchgänge der Alkohol(EtOH-)kontrollgruppen; Durchgänge mit Entwicklungsraten < 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet 104 Datum EtOH µl Anzahl (n) 12.01.2010 19.01.2010 26.01.2010 02.02.2010 09.02.2010 16.02.2010 23.02.2010 02.03.2010 09.03.2010 16.03.2010 13.04.2010 27.04.2010 04.05.2010 25.05.2010 07.06.2010 15.06.2010 22.06.2010 29.06.2010 06.07.2010 13.07.2010 20.07.2010 27.07.2010 03.08.2010 10.08.2010 17.08.2010 07.09.2010 14.09.2010 05.10.2010 26.10.2010 23.11.2010 05.01.2011 01.02.2011 01.03.2011 15.03.2011 29.03.2011 11.04.2011 18.04.2011 02.05.2011 24.05.2011 30.05.2011 07.06.2011 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 8 8 8 8 8 8 8 8 8 25 24 24 30 24 12 24 30 24 25 25 20 24 31 23 35 24 29 20 28 20 28 29 30 34 25 31 26 21 31 14 20 23 18 28 30 18 30 18 29 33 Teilungsrate % (n) 40,0 (10) 58,3 (14) 50,0 (12) 40,0 (12) 62,5 (15) 50,0 (6) 45,8 (11) 43,3 (13) 58,3 (14) 32,0 (8) 52,0 (13) 75,0 (15) 66,6 (16) 32,3 (10) 65,2 (15) 25,7 (9) 54,2 (13) 51,7 (15) 60,0 (12) 28,6 (8) 65,0 (13) 75,0 (21) 55,2 (16) 46,7 (14) 38,2 (13) 48,0 (12) 54,8 (17) 53,8 (14) 61,9 (13) 41,9 (13) 50,0 (7) 70,0 (14) 52,2 (12) 55,6 (10) 39,3 (11) 63,3 (19) 44,4 (8) 43,3 (13) 44,4 (8) 44,8 (13) 69,7 (23) Entwicklung % (n) d7 % (n) d8 16,0 (4) 16,0 (4) 8,3 (2) 8,3 (2) 29,2 (7) 25,0 (6) 6,7 (2) 16,7 (5) 16,7 (5) 16,7 (5) 8,3 (1) 16,7 (2) 0,0 (0) 20,8 (5) 13,3 (4) 16,6 (5) 4,2 (1) 4,2 (1) 8,0 (2) 16,0 (4) 8,0 (2) 20,0 (5) 55,0 (11) 55,0 (11) 25,0 (6) 37,5 (9) 3,2 (1) 3,2 (1) 17,4 (4) 30,4 (7) 5,7 (2) 5,7 (2) 16,6 (4) 25,0 (5) 6,9 (2) 10,3 (3) 15,0 (3) 20,0 (4) 3,6 (1) 10,7 (3) 30,0 (6) 30,0 (6) 46,4 (13) 46,4 (13) 0,0 (0) 0,0 (0) 16,6 (5) 16,6 (5) 11,8 (4) 26,5 (9) 28,0 (7) 28,0 (7) 16,1 (5) 22,6 (7) 15,4 (4) 34,6 (9) 9,5 (2) 28,6 (6) 25,8 (8) 32,3 (10) 7,1 (1) 7,1 (1) 30,0 (6) 30,0 (6) 26,1 (6) 30,4 (7) 27,8 (5) 27,8 (5) 14,3 (4) 35,7 (10) 20,0 (6) 40,0 (12) 22,2 (4) 33,3 (6) 13,3 (4) 20,0 (6) 16,7 (3) 22,2 (4) 20,7 (6) 27,6 (8) 24,2 (8) 27,3 (9) B.2 Daten aus dem IVM-Versuch B.2.2 P4 im IVM-Medium Tabelle B.43: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe < 50 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten P4 (ng/ml) Datum Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten 20.01.10 10,5 27.01.10 15,7 20,6 7,5 09.02.10 52,6 16.02.10 53,9 37,9 12,5 24.02.10 33,4 8,6 17.02.11 15,8 24,7 20,2 17,3 14,8 25,6 31.03.10 23,8 59,3 7,5 48,8 86,5 4,9 25.08.10 14,1 15,3 26,6 13.10.10 30,9 11,2 42,5 Tabelle B.44: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 300 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten P4 (ng/ml) Datum Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten 15.06.10 133,2 35,8 17.08.10 267,4 180,2 23,2 01.09.10 240,1 171,6 35,7 01.02.11 346,7 328,2 381,5 11.08.10 281,9 194,0 29,8 01.12.10 297,6 209,1 32,9 08.12.10 281,5 206,8 64,1 19.01.11 277,3 172,2 17,1 11.04.11 358,5 55,3 03.05.11 330,5 327,3 41,0 02.06.10 301,7 65,8 33,7 105 B Verzeichnis der Gesamtdaten Tabelle B.45: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 150 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten Datum 02.02.10 Ansatz 197,5 34,1 69,5 03.03.10 09.03.10 17.03.10 20.04.10 22.06.10 30.06.10 06.07.10 13.07.10 20.07.10 16.02.11 14.09.10 28.04.10 135,3 30.04.10 125,9 155,7 174,3 198,7 05.05.10 05.01.11 15.12.10 115,3 143,1 12.05.10 19.05.10 26.05.10 08.06.10 07.04.10 14.04.10 24.11.10 31.05.11 06.10.10 106 27.10.10 146,6 P4 (ng/ml) Leerkontrolle mit Oozyten 105,0 36,2 151,0 35,2 105,5 23,8 119,7 21,7 104,4 27,8 176,3 23,6 140,6 18,6 101,7 30,8 87,0 117,2 128,3 52,4 31,3 116,2 45,4 21,6 32,2 29,9 139,7 23,5 27,8 130,6 32,1 117,4 162,2 190,6 161,1 186,0 172,3 161,1 155,9 128,9 140,9 137,0 117,3 92,8 91,0 87,0 136,9 104,1 116,8 75,1 19,0 41,0 31,3 34,4 36,2 22,3 26,3 64,3 65,3 29,5 48,8 23,4 37,8 B.2 Daten aus dem IVM-Versuch Tabelle B.46: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 450 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten P4 (ng/ml) Datum Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten 01.03.11 407,1 77,9 15.03.11 464,2 525,3 122,4 01.06.11 330,5 484,3 54,5 02.06.10 65,8 27.07.10 64,2 21.09.10 65,4 08.06.11 48,9 49,2 39,0 22.06.11 410,3 402,8 69,0 451,5 64,3 406,3 B.2.3 Reifungskontrollen Durchgänge, bei denen mehr als 10 % der Eizellen nicht auszuwerten waren wurden nicht gewertet. Tabelle B.47: Gereifte Eizellen der Kontrollgruppe Datum Anzahl (n) 25.08.2011 26.08.2011 08.09.2011 22.09.2011 23.09.2011 29.09.2011 25 23 32 31 36 26 Meiosestadium I n (%) II n (%) 12 (85,7%) 3 (14,3%) 18 (85,7%) 3 (14,3%) 18 (85,7%) 3 (14,3%) 23 (82,1%) 5 (17,9%) 26 (78,8%) 7 (21,2%) 15 (78,9%) 4 (21,1%) nicht auswertbar (n) 10 (41,7%) 2 (8,7%) 11 (34,3%) 3 (9,7%) 3 (8,3%) 7 (26,9%) Tabelle B.48: Gereifte Eizellen der Alkoholkontrolle Datum Anzahl (n) 01.09.2011 02.09.2011 15.09.2011 29.09.2011 14.10.2011 38 31 34 28 30 Meiosestadium I n (%) II n (%) 27 (84,4%) 5 (15,6%) 25 (86,2%) 4 (13,8%) 15 (83,3%) 3 (16,7%) 23 (88,5 %) 3 (11,5%) 26 (89,7%) 3 (10,3%) nicht auswertbar (n) 6 (15,8%) 2 (6,5%) 16 (47,1%) 2 (7,1%) 1 (3,3%) 107 B Verzeichnis der Gesamtdaten Tabelle B.49: Gereifte Eizellen der Gruppe P4 150 ng/ml Datum Anzahl (n) 15.09.2011 22.09.2011 23.09.2011 13.10.2011 29 31 26 35 Meiosestadium I n (%) II n (%) 14 (82,3%) 3 (17,7%) 25 (86,2%) 4 (13,8%) 19 (79,2%) 5 (20,8%) 26 (81,3%) 6 (18,7%) nicht auswertbar (n) 12 (41,4%) 2 (6,5%) 2 (7,7%) 3 (8,6%) Tabelle B.50: Gereifte Eizellen der Gruppe P4 300 ng/ml Datum Anzahl (n) 08.09.2011 30.09.2011 06.10.2011 14.10.2011 30 20 40 34 Meiosestadium I n (%) II n (%) 17 (85,0%) 3 (15,0%) 15 (83,3%) 3 (16,7%) 33 (89,2%) 4 (10,8%) 26 (83,9%) 5 (16,1%) nicht auswertbar (n) 10 (33,3%) 2 (10%) 3 (7,3%) 3 (8,8%) Tabelle B.51: Gereifte Eizellen der Gruppe P4 450 ng/ml 108 Datum Anzahl (n) 02.09.2011 16.09.2011 07.10.2011 33 30 32 Meiosestadium I n (%) II n (%) 26 (83,9%) 5 (16,1%) 23 (85,2%) 4 (14,8%) 23 (79,3%) 6 (20,7%) nicht auswertbar (n) 2 (6,1%) 3 (10,0%) 3 (9,4%) BMP15 79,55 144,39 485,68 322,90 258,13 ±91,65 BMP15 145,40 80,66 92,66 137,27 542,64 36,86 105,70 163,03 ±64,74 Tabelle B.53: Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der Follikelphase Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 837 Betty1 3,17 N/A 71,20 20,59 3,30 17,19 3,37 1031 Queen 1b 1,26 0,22 256,69 12,41 1,78 11,66 2,29 1067 Frieda1b 9,15 0,71 822,49 73,20 6,52 84,67 15,18 1828 Tiffy3 4,94 0,42 586,08 45,10 6,61 43,56 9,22 Mittelwert 4,63 0,45 434,12 37,83 4,55 39,27 7,52 ±SEM ±1,68 ±0,14 ±167,61 ±13,68 ±1,20 ±16,66 ±2,97 Tabelle B.54: Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der induzierten C.l.-Phase Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 13.03.2012 895 Betty1 4,39 N/A 292,82 21,92 3,67 19,34 4,70 14.03.2012 1071 Queen1b 1,19 N/A 139,47 14,36 1,85 14,76 2,74 15.03.2012 1147 Frieda1b 3,30 N/A 149,48 20,73 1,47 16,61 3,13 19.03.2012 1885 Tiffy3 1,72 0,27 306,74 12,91 1,08 15,57 2,97 20.03.2012 1072 Queen1b 7,38 N/A 1100,43 75,26 12,85 87,06 15,82 20.03.2012 1148 Frieda1b 0,48 N/A 13,12 0,40 0,36 6,47 3,69 20.03.2012 1886 Tiffy3 2,47 0,04 133,51 19,08 1,83 17,68 3,56 Mittelwert 2,99 0,16 305,08 23,52 3,30 25,36 5,23 ±SEM ±0,88 ±0,12 ±137,93 ±9,05 ±1,64 ±10,40 ±1,78 Analysedatum 13.03.2012 14.03.2012 15.03.2012 19.03.2012 BMP15 273,21 105,70 394,49 505,65 319,76 ±85,70 Tabelle B.52: Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der natürlichen C.l.-Phase Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 13.03.2012 798 Betty1 6,12 0,11 542,64 34,15 6,08 28,72 5,15 14.03.2012 1001 Queen1b 1,61 0,12 256,69 22,22 2,78 21,76 3,82 15.03.2012 1033 Frieda1b 7,69 0,07 597,94 106,44 10,08 69,74 15,39 19.03.2012 1800 Tiffy3 9,59 0,67 937,05 68,21 7,68 72,10 11,98 Mitelwert 6,25 0,24 583,58 57,76 6,66 48,08 9,09 ±SEM ±1,70 ±0,14 ±139,55 ±18,93 ±1,53 ±13,27 ±2,76 B.3 Daten aus der RT-qPCR B.3.1 OPU-Oozyten B.3 Daten aus der RT-qPCR 109 B Verzeichnis der Gesamtdaten B.3.2 Tabelle B.55: Transkripthäufigkeiten in unreifen Eizellen aus Schlachthofovarien Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 19.10.2011 622 5,219 N/A 1229,500 36,857 3,467 42,632 13,213 25.10.2011 528 19,505 0,793 432,261 17,701 2,650 25,559 7,391 27.10.2011 620 2,049 0,265 249,841 7,647 1,390 14,171 3,084 14.12.2011 504 8,190 0,699 736,150 43,528 4,671 46,976 11,826 14.12.2011 530 100,696 18,049 2011,221 74,742 13,966 104,972 42,045 20.12.2011 566 3,451 0,132 253,735 9,278 1,314 9,944 2,574 20.12.2011 676 3,516 0,372 324,901 14,359 2,304 30,355 6,207 20.12.2011 696 8,839 0,803 794,474 38,689 3,716 40,053 15,604 Mittelwert 18,93 3,02 754,01 30,35 4,18 39,33 12,74 ±SEM ±11,84 ±2,51 ±215,50 ±8,05 ±1,46 ±10,48 ±4,50 BMP15 99,419 645,313 1308,643 684,46 ±349,62 BMP15 462,675 197,507 94,018 303,143 711,074 111,729 164,718 425,748 308,83 ±75,28 IVM-Versuch Tabelle B.56: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Kontrollgruppe Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 18.10.2011 2029 1,122 0,139 353,473 14,475 1,288 13,227 5,961 20.10.2011 1999 3,326 3,147 691,630 63,288 5,872 68,777 16,494 26.10.2011 2027 4,671 5,751 2140,684 42,632 7,381 91,383 25,525 Mittelwert 3,04 3,01 1061,93 40,13 4,85 57,80 15,99 ±SEM ±1,03 ±1,62 ±548,14 ±14,15 ±1,83 ±23,22 ±5,65 Tabelle B.57: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 2 ng/ml Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15 18.10.2011 2047 1,311 0,763 222,949 14,831 1,215 26,919 7,731 172,514 20.10.2011 2025 5,913 0,338 577,572 40,053 2,628 53,961 12,243 282,843 26.10.2011 2044 4,359 0,699 394,493 42,928 3,147 51,051 19,078 431,691 Mittelwert 3,86 0,60 398,34 32,60 2,33 43,98 13,02 295,68 ±SEM ±1,35 ±0,13 ±102,39 ±8,93 ±0,58 ±8,57 ±3,30 ±75,09 110 Tabelle B.60: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe >50 ng/ml Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 08.03.2012 2031 0,66 0,08 107,18 20,03 2,72 39,50 7,18 12.03.2012 2032 5,83 1,78 489,06 69,74 6,89 66,43 9,74 18.10.2011 2039 3,15 N/A 143,74 17,84 1,91 17,24 7,55 20.10.2011 2033 4,90 1,99 114,87 18,56 1,61 30,99 5,91 26.10.2011 2036 9,88 0,69 446,91 48,63 6,04 50,35 22,38 Mittelwert 4,88 1,14 260,35 34,96 3,83 40,90 10,55 ±SEM ±1,53 ±0,45 ±85,25 ±10,44 ±1,10 ±8,37 ±3,02 BMP15 161,33 353,08 143,74 180,25 389,06 245,49 ±51,90 Tabelle B.59: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 8 ng/ml Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15 19.10.2011 2187 3,373 2,758 205,623 34,389 7,081 42,928 16,958 215,846 25.10.2011 2100 4,146 4,632 681,110 26,755 2,871 51,688 16,700 347,711 27.10.2011 2143 9,612 9,480 906,956 79,611 9,480 158,121 37,920 1086,061 Mittelwert 5,71 5,62 597,90 46,92 6,48 84,25 23,86 549,87 ±SEM ±1,96 ±2,00 ±206,69 ±16,49 ±1,93 ±37,02 ±7,03 ±270,78 Tabelle B.58: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 4 ng/ml Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15 19.10.2011 1991 1,640 1,314 154,756 27,548 3,349 23,165 7,484 141,421 25.10.2011 1973 3,074 0,358 171,252 24,933 2,809 33,128 11,081 170,069 27.10.2011 1988 5,723 1,281 543,739 61,682 5,763 86,628 20,775 620,277 Mittelwert 3,48 0,98 289,92 38,05 3,97 47,64 13,11 310,59 ±SEM ±1,20 ±0,31 ±127,00 ±11,84 ±0,91 ±19,70 ±3,97 ±155,06 B.3 Daten aus der RT-qPCR 111 B Verzeichnis der Gesamtdaten BMP15 153,69 111,73 201,17 839,77 326,59 ±172,03 BMP15 197,25 174,11 194,53 175,32 185,30 ±6,14 Tabelle B.62: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 300 ng/ml Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 12.03.2012 1982 1,86 2,03 132,87 30,99 5,48 42,04 9,47 21.03.2012 1984 2,09 0,80 98,62 26,06 2,92 25,17 5,63 18.10.2011 1986 2,33 1,06 292,50 27,33 2,89 44,09 10,95 26.10.2011 1981 9,67 6,70 1108,09 104,25 10,01 151,57 29,12 Mittelwert 3,99 2,65 408,02 47,16 5,33 65,72 13,79 ±SEM ±1,90 ±1,38 ±237,15 ±19,06 ±1,68 ±28,93 ±5,23 BMP15 428,71 68,78 269,45 153,93 230,22 ±77,90 Tabelle B.61: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 150 ng/ml Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 08.03.2012 2015 4,77 1,33 172,91 37,89 5,15 33,68 5,67 08.03.2012 2016 2,32 1,00 209,94 16,84 1,81 18,30 4,15 08.03.2012 2017 1,49 2,15 193,19 35,60 2,72 35,11 9,15 21.03.2012 2019 2,16 1,10 263,90 22,85 2,15 31,21 6,04 Mittelwert 2,69 1,40 209,99 28,30 2,96 29,58 6,25 ±SEM ±0,72 ±0,26 ±19,50 ±5,05 ±0,75 ±3,84 ±1,05 Tabelle B.63: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 450 ng/ml Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 12.03.2012 2049 4,77 0,08 736,15 46,98 5,95 57,83 9,61 12.03.2012 2091 1,81 1,81 57,04 16,49 2,15 13,30 2,26 21.03.2012 2050 3,44 2,18 565,69 30,99 4,33 39,50 6,38 25.10.2011 2092 2,69 0,16 111,91 14,28 1,55 30,40 8,61 Mittelwert 3,18 1,06 367,70 27,19 3,50 35,26 6,72 ±SEM ±0,63 ±0,55 ±167,55 ±7,57 ±1,01 ±9,28 ±1,63 112 Abbildungen 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 Schematische Darstellung der IVP beim Rind; modifiziert nach N IEMANN und M EINECKE (1993) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs der OPU-Versuche . . . . . . . . OPU-Equipment: (1) Vakuumpumpe, (2) Ultraschallgerät, (3) Sondenträger; Wasserbad, Schlauchsystem und Auffanggefäß nicht abgebildet; Abbildung nach H ANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . OPU-Sondenträger mit Nadelführung sowie Vergrößerung des vorderen Teiles; Abbildung nach H ANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Schematische Darstellung der Follikelpunktion; Abbildung nach H ANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Apparatur zur Separation von KOK aus Follikelpunktaten; Abbildung nach H ANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IVP-taugliche bovine Kumulus-Oozyten-Komplexe, 50fache Vergrößerung . . Schematische Darstellung des IVP-Versuchsteils . . . . . . . . . . . . . . . . a: 8-Zell-Embryo, b: Morula, c: expandierte Blastozysten, d: geschlüpfte Blastozysten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Graphische Darstellung des Progesteronprofils während des Versuchszeitraumes; + an den Punktionstagen gemessene Werte, – Näherungsfunktion . . . . . Serumprogesterongehalt (links; n̄±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05), Fläche (Mitte; n̄±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05) und Lutealphasenlänge (rechts; n̄±SD, n=8) des natürlichen und induzierten C.l. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a: gereifte Oozyten der Kontrollgruppe; b: mit EtOH gereift; c: mit P4 gereift; Maßstab in allen Bildern gleich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich GDF9, BMP15 und HIF2α; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich der Progesteronrezeptoren; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich GDF9 und HIF2α; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich der Progesteronrezeptoren; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . B.1 Graphische Darstellung des Progesteronprofils der Einzeltiere während des Versuchszeitraumes; Zyklustag = Tag nach natürlicher Brunst; + gemessene Werte, – Näherungsfunktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 30 31 32 32 33 33 36 39 47 48 51 53 54 55 56 98 113 Abbildungen 114 Tabellen 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 3.4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 A.1 A.2 A.3 A.4 A.5 A.6 A.7 A.8 A.9 A.10 A.11 A.12 Untersuchungen zu verschiedenen Parametern und deren Einfluss auf die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Effekte verschiedener Zusätze zum IVM-Medium auf die Entwicklungsraten in der IVP boviner Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Effekte verschiedener Steroidsupplementationen im IVM-Medium für RinderKOK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 19 20 Klassifizierungsschema für bovine KOK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kreuzreaktivität des im RIA genutzten Antikörpers . . . . . . . . . . . . . . . Eingesetzte Oozyten- bzw. Embryonenäquivalente (EÄ; 1 EÄ = ˆ 20 µl des Reaktionsansatzes) für die jeweiligen Gentranskripte . . . . . . . . . . . . . . . . Verwendete Primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 35 Tiernutzung und Auswertung im OPU-Versuchsteil . . . . . . . . . . . . . . . Punktierte Follikel (n) und Größenverteilung während der Zyklusphasen . . . . Punktierte Follikel pro OPU-Sitzung (n̄±SD) in den einzelnen Zyklusphasen . Gewonnene KOK (n) und Anteile an den einzelnen Kategorien (%) . . . . . . . Gewonnene KOK der einzelnen Kategorien pro OPU-Sitzung in den Zyklusphasen (n̄±SD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Progesterongehalt des Mediums (n̄±SD) der einzelnen Versuchsgruppen vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . Prozentuale Anteile der Meiosestadien M I und M II in den Reifungskontrollen (n̄±SD; P > 0,05) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Teilungs- (TR) und Entwicklungsraten (ER) der einzelnen Versuchsgruppen (n̄±SD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 49 49 49 Zusammensetzung der PBS-Lösung . . . . . . . . . . Zusätze für die PBS-Gebrauchslösung (PBS Complete) Zusammensetzung des TCM air . . . . . . . . . . . . Zusammensetzung der NaCl-Lösung . . . . . . . . . . Zusammensetzung der NaCl-Complete-Lösung . . . . Zusammensetzung des Reifungsmediums . . . . . . . Zusammensetzung der FertTALP-Stocklösung . . . . . Zusammensetzung der FertTALP-Gebrauchslösung . . Zusammensetzung der Epinephrin-Lösung . . . . . . . Zusammensetzung der Hypotaurin-Lösung . . . . . . . Zusammensetzung der Heparin-Lösung . . . . . . . . Zusammensetzung der HHE-Stocklösung . . . . . . . 73 73 73 73 74 74 74 74 75 75 75 75 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 43 50 51 52 52 115 Tabellen A.13 A.14 A.15 A.16 A.17 A.18 A.19 A.20 A.21 A.22 A.23 A.24 A.25 A.26 A.27 A.28 A.29 A.30 A.31 A.32 A.33 A.34 Zusammensetzung der HHE-Gebrauchslösung . . . . . . . . . . . Zusammensetzung des Fertilisationsmediums . . . . . . . . . . . Zusammensetzung der Spermfilter-Gebrauchslösung . . . . . . . Zusammensetzung der SOF-Stocklösung A . . . . . . . . . . . . Zusammensetzung der SOF-Stocklösung B . . . . . . . . . . . . Zusammensetzung der SOF-Stocklösung C . . . . . . . . . . . . Zusammensetzung der SOF-Stocklösung D . . . . . . . . . . . . Zusammensetzung der Glutamin-Stocklösung . . . . . . . . . . . Zusammensetzung des Kulturmediums (SOFaa-Medium) . . . . . Zusammensetzung der Fixierlösung . . . . . . . . . . . . . . . . Zusammensetzung der Lacmoid-Stocklösung . . . . . . . . . . . Zusammensetzung der Lacmoid-Arbeitslösung . . . . . . . . . . Zusammensetzung des PVA 0,1 % . . . . . . . . . . . . . . . . . NaCl-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Boratpuffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Herkunft der bei der RT-PCR eingesetzten Medien . . . . . . . . Tris-HCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Lysis/Bindingpuffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Waschpuffer A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Waschpuffer B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zusammensetzung des Mastermixes für die Reverse Transkription Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die RT-qPCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.1 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Betty1“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.2 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy1“ . . . . . . . . . B.3 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von "Frieda1a“; nicht gewertet, C.l. aus Zyste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.4 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Frieda1b“ . . . . . . . . . B.5 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1a“, Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.6 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1b“ . . . . . . . . . B.7 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1a“, Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.8 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1b“ . . . . . . . . B.9 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa1“ . . . . . . . . . . B.10 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera2“, unklarer Versuchsstart, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.11 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen2“ . . . . . . . . . B.12 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa2“; dreimal wöchentliche Punktion, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 75 75 76 76 76 76 76 77 77 77 77 77 78 78 78 78 78 79 79 79 79 79 81 81 81 82 82 82 83 83 83 84 84 85 B.13 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy2“; dreimal wöchentliche Punktion, persistierendes C.l.; nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . B.14 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Stella3“ . . . . . . . . . . B.15 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „UFO3“; kein induziertes C.l., nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.16 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Tiffy3“ . . . . . . . . . . B.17 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Betty1“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.18 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy1“ . . . . . . . . . . . B.19 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1a“; nicht gewertet, C.l. aus Zyste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.20 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1b“ . . . . . . . . . . . B.21 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1a“; Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.22 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1b“ . . . . . . . . . . . B.23 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1a“; Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.24 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1b“ . . . . . . . . . . B.25 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa1“ . . . . . . . . . . . . B.26 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy2“; dreimal wöchentliche Punktion, persistierendes C.l., nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . B.27 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen2“ . . . . . . . . . . . B.28 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa2“; dreimal wöchentliche Punktion, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.29 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera2“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.30 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Stella3“ . . . . . . . . . . . . B.31 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Tiffy3“ . . . . . . . . . . . . B.32 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „UFO3“; kein induziertes C.l., nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.33 Die Funktionsparameter mit ihren Standardfehlern (Asymptotic Standard Error) für die einzelnen Tiere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.34 Berechnungen aus den Funktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.35 Vergleich der berechneten und gemessenen Werte . . . . . . . . . . . . . . . . B.36 IVP-Durchgänge der Gruppe P4 <50 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.37 IVP-Durchgänge der Gruppe P4=150 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.38 IVP-Durchgänge der Gruppe P4=300 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.39 IVP-Durchgänge der Gruppe P4=450 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.40 Nicht gewertete IVP-Durchgänge der P4-Gruppen . . . . . . . . . . . . . . . . B.41 IVP-Durchgänge der zusatzfreien Kontrollgruppe; Durchgänge mit Entwicklungsraten < 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . 86 87 87 88 89 89 90 90 91 91 92 92 93 93 94 94 95 95 96 96 97 99 99 100 100 101 101 102 103 117 Tabellen B.42 IVP-Durchgänge der Alkohol(EtOH-)kontrollgruppen; Durchgänge mit Entwicklungsraten < 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . B.43 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe < 50 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.44 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 300 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.45 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 150 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.46 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 450 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.47 Gereifte Eizellen der Kontrollgruppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.48 Gereifte Eizellen der Alkoholkontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.49 Gereifte Eizellen der Gruppe P4 150 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.50 Gereifte Eizellen der Gruppe P4 300 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.51 Gereifte Eizellen der Gruppe P4 450 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.52 Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der natürlichen C.l.-Phase . . . . . B.53 Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der Follikelphase . . . . . . . . . B.54 Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der induzierten C.l.-Phase . . . . . B.55 Transkripthäufigkeiten in unreifen Eizellen aus Schlachthofovarien . . . . . . . B.56 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Kontrollgruppe . . B.57 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 2 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.58 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 4 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.59 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 8 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.60 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe >50 ng/ml B.61 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 150 ng/ml . B.62 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 300 ng/ml . B.63 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 450 ng/ml . 118 104 105 105 106 107 107 107 108 108 108 109 109 109 110 110 110 111 111 111 112 112 112 Literaturverzeichnis A BELE , E., S TINSHOFF , H., H ANSTEDT, A., W ILKENING , S., M EINECKE -T ILLMANN , S. und W RENZYCKI , C. (2012): Influence of selected (pre-)maturational parameters on in vitro development and sex distribution of bovine embryos. Zygote, pages 1–9. A DAMIAK , S. J., M ACKIE , K., WATT, R. G., W EBB , R. und S INCLAIR , K. D. (2005): Impact of nutrition on oocyte quality: Cumulative effects of body composition and diet leading to hyperinsulinemia in cattle. Biology of Reproduction, 73(5):918–926. A DONA , P. R., DE B EM , T. 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Bovines serum Albumin bzw. . . . . . . . . . . . . beziehungsweise C.l. . . . . . . . . . . . . . Corpus luteum ca. . . . . . . . . . . . . . circa CO2 . . . . . . . . . . . . Kohlenstoffdioxid cpm . . . . . . . . . . . . Counts pro Minute DF . . . . . . . . . . . . . Dominanter Follikel DNA . . . . . . . . . . . Desoxyribonukleinsäure DTT . . . . . . . . . . . Dithiothreitol E2 . . . . . . . . . . . . . . 17-β-Estradiol eCG . . . . . . . . . . . . Equines Choriogonadotropin ECS . . . . . . . . . . . . Estrus Cow Serum EDTA . . . . . . . . . . Ethylendiamintetraessigsäure EGF . . . . . . . . . . . . Epidermal Growth Factor ER . . . . . . . . . . . . . Entwicklungsrate et al. . . . . . . . . . . . et alii, und andere 159 Abkürzungsverzeichnis EtOH . . . . . . . . . . . Ethanol EÄ . . . . . . . . . . . . . Embryonenäquivalent Fa. . . . . . . . . . . . . . Firma FAF . . . . . . . . . . . . Fatty Acid Free, Fettsäurefrei FCS . . . . . . . . . . . . Fetal Calf Serum, fetales Kälberserum FF . . . . . . . . . . . . . Follikelflüssigkeit FS . . . . . . . . . . . . . Fettsäuren FSH . . . . . . . . . . . . Follikel stimulierendes Hormon G . . . . . . . . . . . . . . Gauge g . . . . . . . . . . . . . . . Erdschwerebeschleunigung GDF9 . . . . . . . . . . Growth and Differentiation factor 9 GnRH . . . . . . . . . . Gonadotropin-Releasing-Hormon h . . . . . . . . . . . . . . . Stunde H2 O . . . . . . . . . . . . Wasser HCl . . . . . . . . . . . . Salzsäure HECM . . . . . . . . . Hamster Embryo Culture Medium HHE . . . . . . . . . . . Heparin-Hypotaurin-Epinephrin HIF2α . . . . . . . . . . Hypoxia Inducible Factor 2α ICM . . . . . . . . . . . . Inner Cell Mass, innere Zellmasse IE . . . . . . . . . . . . . . Internationale Einheiten IVC . . . . . . . . . . . . In-vitro-Kultur IVF . . . . . . . . . . . . In-vitro-Fertilisation IVM . . . . . . . . . . . In-vitro-Maturation IVP . . . . . . . . . . . . In-vitro-Produktion KOK . . . . . . . . . . . Kumulus-Oozyten-Komplex l . . . . . . . . . . . . . . . Liter 160 LH . . . . . . . . . . . . . Luteinisierendes Hormon LOS . . . . . . . . . . . . Large Offspring Syndrome LSF . . . . . . . . . . . . Least Sqaure Fit Max . . . . . . . . . . . . Maximum MgCl2 . . . . . . . . . . Magnesiumchlorid MI . . . . . . . . . . . . . Meiosestadium I MII . . . . . . . . . . . . Meiosestadium II Min . . . . . . . . . . . . Minimum ml . . . . . . . . . . . . . . Milliliter MM . . . . . . . . . . . . Master Mix mm . . . . . . . . . . . . Millimeter mmHG . . . . . . . . . Millimeter Quecksilber, Druckeinheit MOET . . . . . . . . . Multiple Ovulation and Embryo Transfer MPC . . . . . . . . . . . Magnetic Particle Concentrator mPGR . . . . . . . . . . membranständiger Progesteronrezeptor mRNA . . . . . . . . . Messenger Ribonukleinsäure N2 . . . . . . . . . . . . . Stickstoff Na . . . . . . . . . . . . . Natrium NaCl . . . . . . . . . . . Natriumchlorid ng . . . . . . . . . . . . . . Nanogramm nPGR . . . . . . . . . . nuklearer Progesteronrezeptor O2 . . . . . . . . . . . . . Sauerstoff OPU . . . . . . . . . . . Ovum-Pick-Up PAQR . . . . . . . . . . Progestin und AdipoQ Rezeptor PBS . . . . . . . . . . . . Phosphate Buffered Saline, Phosohat-gepufferte Salzlösung PCR . . . . . . . . . . . . Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion 161 Abkürzungsverzeichnis pg . . . . . . . . . . . . . . Pikogramm PGR . . . . . . . . . . . Progesteronrezeptor PGRMC1 . . . . . . . membranständiger Progesteronrezeptor 1 PGRMC2 . . . . . . . membranständiger Progesteronrezeptor 2 PVA . . . . . . . . . . . . Polyvinylalkohol PVC . . . . . . . . . . . Polyvinylchlorid PVP . . . . . . . . . . . . Polyvinylpyrrolidon qPCR . . . . . . . . . . quantitative Polymerase-Kettenreaktion RIA . . . . . . . . . . . . Radioimmunoassay RNA . . . . . . . . . . . Ribonukleinsäure SD . . . . . . . . . . . . . Standardabweichung SEM . . . . . . . . . . . Standardfehler SLC2A1 . . . . . . . . Glukose Transporter 1 SOF . . . . . . . . . . . . Synthetic Oviduct Fluid SSS . . . . . . . . . . . . Synthetic Serum Substitute, synthetischer Serumersatz T . . . . . . . . . . . . . . . Testosteron TALP . . . . . . . . . . Tyrode´s Albumin Laktat Pyrovat TCM199 . . . . . . . . Tissue Culture Medium 199 TE . . . . . . . . . . . . . Trophektoderm TGF . . . . . . . . . . . . Transforming Growth Factor TR . . . . . . . . . . . . . Teilungsrate vs. . . . . . . . . . . . . . versus, gegenüber ◦ C . . . . . . . . . . . . . Grad Celsius 162 Veröffentlichungen Auszüge dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: N. Schlüter, A. Hanstedt, C. Wrenzycki: „Einfluss der Progesteronkonzentration während wiederholter OPU-Sitzungen auf die Eizellqualität“ (Vortrag, 38. Jahrestagung der AET-d 2011) N. Schlüter, A. Hanstedt, K. Knauer, H. Stinshoff, C. Wrenzycki: „Influence of peripheral progesterone concentration on oocyte quality in repeated OPU sessions“ (Poster, 37th Annual Conference of the IETS 2012) N. Schlüter, A. Hanstedt, K. Knauer, H. Stinshoff, C. Wrenzycki: „Influence of peripheral progesterone concentration on morphological oocyte quality in repeated OPU sessions“ (Poster, 45. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung 2012) 163 164 Danksagung Bei einem Projekt wie diesem gibt es immer eine Reihe von Personen und Einrichtungen, ohne die die Durchführung nicht möglich gewesen wäre. An dieser Stelle sei all jenen ein herzlicher Dank ausgesprochen. Erwähnen möchte ich hier besonders • Prof. Dr. Christine Wrenzycki, die dieses Projekt ins Leben gerufen und in seiner Gesamtheit geleitet und begleitet hat • die AG Biotechnologie der Klinik für Rinder Hannover • die Firma Masterrind, die die Versuchstiere zur Verfügung gestellt hat • Vion Bad Bramstedt, aus deren Schlachthof die Ovarien für die IVP stammten • den Förderverein Biotechnologie Forschung e.V. für die finanzielle Unterstützung • Sandra Wilkening für die PCR • Dr. Marion Piechotta und ihrem Team für die Hilfe bei den P4-Analysen • die Tierpfleger der Rinderklinik • Doris für die Medien und die Unterstützung im IVF-Labor • meine Kollegen aus der Tierarztpraxis Schomacker, die für meine Dissertation den einen und anderen Dienst für mich übernommen haben • Alexander Meyer für die Auswertungen mittels Gnuplot • Björn Guth für die Berechnungen aus den P4-Kurven • Dr. Ana Hanstedt für Korrekturen, produktive Diskussionen, unendliche Geduld bei den Reifungskontrollen und ihr offenes Ohr • Katharina Knauer, zweite Hälfte des Chaos-Kommandos, für die tatkräftige Unterstützung beim OPU und unvergessliche Tage in OPU-Stall und Labor • Johanna Bennemann, Leidensgenossin, für gemeinsames Jammern und Dampf ablassen, gegenseitiges Mut machen und Daumen drücken... und für´s Durchhalten -wir haben´s geschafft! • Philipp Gringel für die Hilfe bei LATEX und 4 Jahre langes Mitzittern, Freuen, Trösten, Motivieren und für seine Ruhe bis zum Schluss! • meine Eltern, ohne deren finanzielle und mentale Unterstützung diese Doktorarbeit nicht realisierbar gewesen wäre Danke! 165
