Messung der elektrischen Aktivität biologischer Zellen

Messung der elektrischen Aktivität
biologischer Zellen mit
Feld-Effekt-Transistoren
Diplomarbeit
von
Matthias Issing
Technische Universität Berlin
Institut für Mikroelektronik
und Festkörperelektronik
2000
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Einleitung ...........................................................................................................4
1. Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen ................................6
1.1. Aufbau einer Zellmembran............................................................................................ 6
1.2. Membranspannung......................................................................................................... 8
1.2.1. Ionenaustausch über die Zellmembran ............................................................................... 8
1.2.2. Dynamisches Verhalten der Zellmembran ....................................................................... 10
1.3. Elektrisches Membranmodell ..................................................................................... 14
2. Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran.........................18
2.1. Modellbildung...............................................................................................................19
2.2. Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen ...............................................27
2.2.1. Messungen mit Elektroden................................................................................................. 27
2.2.2. Messungen mit Transistoren.............................................................................................. 27
3. Messungen der lokalen extrazellulären Spannung
mit Feld-Effekt-Transistoren .....................................................................28
3.1. Aufbau des Sensor-Chips .............................................................................................28
3.2. Arbeitspunkt der Transistoren....................................................................................31
3.3. Kleinsignalersatzschaltbild .........................................................................................32
3.4. Rauschen von Feld-Effekt-Transistoren ....................................................................35
4. Strom-Spannungs-Umsetzer.......................................................................40
4.1. Dynamisches Verhalten des IU-Umsetzers................................................................40
4.2. Rauschen von Operationsverstärkern......................................................................... 45
4.3. Verstärkung des Kleinsignalanteils ............................................................................51
4.3.1. Hochpaßfilter ....................................................................................................................... 51
4.3.2. Rückkopplung (Widerstand) .............................................................................................. 54
4.3.3. Rückkopplung (Stromquelle) ............................................................................................. 59
4.4. Schaltungsentwurf ........................................................................................................ 60
1
Inhaltsverzeichnis
5. Charakterisierung der EOS-Transistoren .................................................65
5.1. Kennlinien und Parameter ..........................................................................................65
5.2. Frequenzverhalten........................................................................................................ 71
5.2.1. Frequenzgangmessung der EOS-Transistoren ................................................................. 71
5.2.1.1. Lock-In Verstärker........................................................................................................... 72
5.2.1.2. Ablaufsteuerung der Frequenzgangmessung ................................................................. 74
5.2.1.3. Programmbeschreibung................................................................................................... 75
5.2.1.4. Messergebnisse.................................................................................................................. 81
6. Messung des intrazellulären Potentialverlaufs
an Herzmuskelzellen ...................................................................................84
6.1. Patch-Clamp-Technik ..................................................................................................85
6.2. Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen ..........................................87
7. Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen
mit EOS-Transistoren .................................................................................92
7.1. Ergebnisse der Messungen...........................................................................................93
8. Zusammenfassung .....................................................................................102
2
Inhaltsverzeichnis
Anhang
i. Simulationsmodell......................................................................................107
ii. Operationsverstärker.................................................................................111
ii.i. NF-Kenngrößen ......................................................................................................... 111
ii.i.i. Großsignalbandbreite......................................................................................................... 112
ii.ii. Kleinsignalmodell und Frequenzverhalten ............................................................ 112
ii.iii. Operationsverstärker Typ AD745........................................................................... 114
iii. Schaltungsaufbau .....................................................................................115
iii.i. Multiplexer................................................................................................................. 115
iii.ii. IU-Umsetzer.............................................................................................................. 116
iv. Kennlinien der EOS-Transistoren .........................................................118
iv.i. Ausgangskennlinien mit UGS=UDS ...................................................................... 118
iv.ii. Stromsteuerkennlinien............................................................................................. 134
v. Präparation von Herzmuskelzellen..........................................................142
v.i. Vorbereitung der Präparation .................................................................................... 143
v.ii. Durchführung............................................................................................................. 145
vi. Patch-Anleitung........................................................................................146
vii. Ergebnisse aus Messungen mit EOS-Transistoren
an Herzmuskelzellen...............................................................................147
Literaturverzeichnis ......................................................................................162
Danksagung....................................................................................................164
3
Inhaltsverzeichnis
5. Charakterisierung der EOS-Transistoren .................................................65
5.1. Kennlinien und Parameter ..........................................................................................65
5.2. Frequenzverhalten........................................................................................................ 71
5.2.1. Frequenzgangmessung der EOS-Transistoren ................................................................. 71
5.2.1.1. Lock-In Verstärker........................................................................................................... 72
5.2.1.2. Ablaufsteuerung der Frequenzgangmessung ................................................................. 74
5.2.1.3. Programmbeschreibung................................................................................................... 75
5.2.1.4. Messergebnisse.................................................................................................................. 81
6. Messung des intrazellulären Potentialverlaufs
an Herzmuskelzellen ...................................................................................84
6.1. Patch-Clamp-Technik ..................................................................................................85
6.2. Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen ..........................................87
7. Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen
mit EOS-Transistoren .................................................................................92
7.1. Ergebnisse der Messungen...........................................................................................93
8. Zusammenfassung .....................................................................................103
2
Inhaltsverzeichnis
Anhang
i. Simulationsmodell......................................................................................107
ii. Operationsverstärker.................................................................................111
ii.i. NF-Kenngrößen ......................................................................................................... 111
ii.i.i. Großsignalbandbreite......................................................................................................... 112
ii.ii. Kleinsignalmodell und Frequenzverhalten ............................................................ 112
ii.iii. Operationsverstärker Typ AD745........................................................................... 114
iii. Schaltungsaufbau .....................................................................................115
iii.i. Multiplexer................................................................................................................. 115
iii.ii. IU-Umsetzer.............................................................................................................. 116
iv. Kennlinien der EOS-Transistoren .........................................................118
iv.i. Ausgangskennlinien mit UGS=UDS ...................................................................... 118
iv.ii. Stromsteuerkennlinien............................................................................................. 134
v. Präparation von Herzmuskelzellen..........................................................142
v.i. Vorbereitung der Präparation .................................................................................... 143
v.ii. Durchführung............................................................................................................. 145
vi. Patch-Anleitung........................................................................................146
vii. Ergebnisse aus Messungen mit EOS-Transistoren
an Herzmuskelzellen...............................................................................147
Literaturverzeichnis ......................................................................................162
Danksagung....................................................................................................164
3
4
Einleitung
Bei allen lebenden Zellen liegt das Zellinnere auf einem niedrigeren elektrischen
Potential als der Raum, der die Zellen umgibt. Die Ursache dafür ist eine unterschiedliche Ionenverteilung zwischen der intrazellulären und extrazellulären Flüssigkeit. Transportprozesse über Ionen-Kanäle, die in der Zellmembran eingebettet
sind, halten den Konzentrationsunterschied aufrecht. Nervenzellen und Muskelzellen haben die Besonderheit, daß es bei Reizung zu einer kurzzeitigen Änderung der
Ionenkonzentration innerhalb der Zellen kommt und sich damit auch das elektrische
Potential in den Zellen ändert. Der zeitliche Verlauf des intrazellulären Potentials
wird als Aktionspotential bezeichnet. In Nervenzellen stellt es die weitergeleitete
Information dar, in Muskelzellen führt es zu einer Kontraktion.
Messungen der elektrischen Aktivität von Nervenzellen ermöglichen es, die Informationsweiterleitung einzelner Zelle zu untersuchen und Reaktionen der Zellen auf
eine Änderung der Umgebungsbedingungen (Einwirkung von Medikamenten, elektromagnetischen Bestrahlungen etc.) zu erkennen.
Die herkömmlichen Methoden zur Messung der elektrischen Aktivität einzelner
Zellen sind mit einem Eingriff in die Zelle verbunden, da direkt das intrazelluläre
Potential gemessen wird. Bei Messungen mit Patch-Pipetten oder Mikroelektroden
wird die Membran der Zelle durchbrochen, in die Zelle eingebrachte elektrisch empfindliche Fluoreszenzfarbstoffe haben auf die Zelle eine toxische Wirkung. Bei allen
bisher etablierten Verfahren sterben die Zellen nach kurzer Zeit ab. Aus diesem
Grund sind die Beobachtungen nur über einen kurzen Zeitraum möglich.
Wäre eine elektrische Beobachtung der Zellen über einen längeren Zeitraum
möglich, könnten die bisherigen Erkenntnisse an Langzeitbeobachtungen überprüft
werden. Langzeituntersuchungen an kultivierten neuronalen Netzen könnten neue
Zusammenhänge über die Informationsverarbeitung von Nervenzellen erkennen
lassen. In diesem Fall wäre es sogar denkbar, gezielt neuronale Netzwerke aufzubauen und die Kommunikation der Zellen untereinander zu untersuchen. Letztendlich würde es den Bau einer Schnittstelle zwischen Mikroelektronik und
Nervensystem ermöglichen.
Seit den 80er Jahren sind Verfahren bekannt, bei denen mit Metallelektroden
Spannungsänderungen an der Zellembran von außen registriert werden können.
Die Spannungsänderungen stehen in einem Zusammenhang mit der Änderung des
intrazellulären Potentials. Bei diesen Messungen werden die Zellen auf planare
Elektroden aufgelegt, so daß die Elektroden und die Zellmembran nur durch einen
dünnen Film einer extrazellulären Lösung voneinander getrennt werden. Da zwischen den Elektroden und der extrazellulären Lösung ein ohmscher Kontakt
besteht, laufen Elektrolyse-Reaktionen ab, bei denen toxische Stoffe entstehen, die
wiederum eine Langzeitregistrierung verhindern.
Neben den Elektroden, bei denen zum Elektrolyten ein ohmscher Kontakt besteht,
können rein kapazitiv wirkende Elektroden verwendet werden. Die Elektroden werden durch eine dünne Isolationsschicht vom Elektrolyten getrennt. Zur Impedanzwandlung und Verstärkung der kapazitiv eingekoppelten Signale unmittelbar im
Kontaktbereich mit der Zelle können mit Verfahren der Halbleiter-Technologie
Anordnungen hergestellt werden, bei denen direkt unterhalb der Zelle Transistoren
in die Oberfläche integriert sind. P. Fromherz vom MPI Martinsried/München konnte
erfolgreich mit solchen Feld-Effekt-Transistoren (Electrolyte-Oxide-SemiconductorTransistoren) extrazelluläre Spannungen an Blutegelneuronen messen. Bei seinen
Messungen waren die Signale erst nach einer Mittelwertbildung über mehrere Messungen erkennbar, da sie ohne Mittlung im Verhältnis zum Rauschen der Meßanordnung zu klein sind.
5
Zur Verkleinerung des Rauschanteils wurden von T. Kind an der TU-Berlin im
Rahmen seiner Promotion Bipolar-Transistoren entwickelt, bei denen auf einer
extrinsischen Basis eine kapazitive Elektrode aufgebracht ist. T. Kind führt mit diesen Transistoren Messungen an isolierten Herzmuskelzellen von Ratten durch,
konnte bis jetzt aber noch keine Kopplung zwischen Transistor und Zelle nachweisen.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, mit Feld-Effekt-Transistoren extrazelluläre Spannungen an isolierten Herzmuskelzellen von Ratten beim Ablauf von Aktionspotentialen
zu messen. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit soll eine Aussage getroffen werden,
inwieweit derartige Messungen an isolierten Herzmuskelzellen überhaupt möglich
sind. Außerdem sollen Vergleichswerte für die Messungen mit Bipolar-Transistoren
zur Verfügung gestellt werden.
Für die Versuche werden Feld-Effekt-Transistoren verwendet, die in der Halbleiter-Technologie der TU-Berlin hergestellt wurden und die auch von P. Fromherz
eingesetzt werden.
In Kapitel 1 werden die Grundlagen der elektrophysiologischen Vorgänge an Zellmembranen dargestellt und es wird das elektrische Membranmodell von Hudgkin
und Huxley eingeführt. Ein Modell zur Erklärung der lokalen extrazellulären Spannungen, die in einem Spalt zwischen einer Zelle und einer Oberfläche gemessen
werden können, wird in Kapitel 2 vorgestellt. Simulationsergebnisse aus diesem
Modell befinden sind am Ende des 2. Kapitels.
Die Feld-Effekt-Transistoren, die für die Messungen verwendet werden, sind auf
einem Sensor-Chip mit dem Namen „Cultus“ integriert. In Kapitel 3 werden der
Arbeitspunkt, das Kleinsignalersatzschaltbild und die Ursachen des Rauschens der
Transistoren diskutiert.
Für die Messungen wird ein rauscharmer Strom-Spannungs-Umsetzer benötigt,
der den Kleinsignalanteil vom Arbeitspunktstrom der Transistoren trennt, verstärkt
und in eine Spannung umsetzt. Bei den Messungen wird nur einer von 64 Transistoren auf dem Cultus-Chip betrieben. Für das Umschalten zwischen den Transistoren ist ein Multiplexer notwendig.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde speziell für diese Messungen ein Strom-Spannungs-Umsetzer und ein Multiplexer entwickelt, der in Kapitel 4 beschrieben ist. Es
werden in diesem Kapitel das dynamische Verhalten und die Rauscheigenschaften
des Strom-Spannungs-Umsetzers untersucht und verschiedene Schaltungsvarianten gegenübergestellt.
Das Kapitel 5 beinhaltet sämtliche Kennlinien und Parameter der EOS-Transistoren des „Cultus-Chips“, die für die Auswertung der Meßergebnisse notwendig sind.
Zur Untersuchung des Frequenzverhaltens der Transistoren wurden Frequenzgangmessungen durchgeführt.
Nach der Präparation der Herzmuskelzellen aus ausgewachsenen Ratten, die im
Anhang vi beschrieben ist, werden die Zellen auf den Chip aufgebracht und eine
Zelle über einem Transistor positioniert. Zur periodischen Erregung der Zelle und
zur Kontrolle des intrazellulären Potentials werden die Zellen mit der Patch-ClampTechnik kontaktiert. Die Vorgehensweise bei der Patch-Clamp-Technik und Meßergebnisse des Verlaufs der Aktionspotentiale an Herzmuskelzellen werden in Kapitel
6 beschrieben.
In Kapitel 7 werden schließlich die Messungen von extrazellulären Spannungen
an isolierten Herzmuskelzellen beim Ablauf von Aktionspotentialen erläutert und es
werden die Ergebnisse der Messungen vorgestellt.
Anschließend werden in Kapitel 8 die Ergebnisse zusammengefaßt und es wird
ein Ausblick auf künftige Forschungsarbeiten gegeben.
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Aufbau einer Zellmembran
1. Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Bei allen tierischen Zellen liegt das Zellinnere auf einem niedrigeren elektrischen
Potential als der extrazelluläre Raum, der die Zelle umgibt. Beide Bereiche werden
durch eine Zellmembran voneinander abgegrenzt, über die die Spannungsdifferenz
abfällt. Ursache für die unterschiedlichen Potentiale sind unterschiedliche Ionenkonzentrationen innerhalb und außerhalb der Zelle, die durch Prozesse in der Zellmembran gesteuert werden. Nervenzellen und Muskelzellen weisen die
Besonderheit auf, daß sich bei Reizung der Zellen die Ionenleitfähigkeit der Zellmembran ändern kann, so daß sich die Membranspannung nach einem zelltypischen Verlauf kurzzeitig abbaut und sogar umkehrt. Diese Potentialänderungen in
den Zellen werden als Aktionspotentiale bezeichnet. In Nervenzellen stellen die
Aktionspotentiale die weitergeleiteten Signale dar, in Muskelzellen führen sie zu
einer Kontraktion.
In diesem Kapitel wird der Aufbau einer Zellmembran skizziert und die elektrophysiologischen Austauschprozesse und Gleichgewichtszustände zwischen dem intrazellulären und extrazellulären Raum dargestellt. Es wird das elektrische
Membranmodell von Hudgkin und Huxley vorgestellt und mit diesem Modell eine
Simulation des intrazellulären Potentialverlaufs eines Neurons durchgeführt.
1.1.Aufbau einer Zellmembran
Alle tierischen Zellen werden von einer Zellmembran vollständig umschlossen,
die aus einer Doppelschicht von Lipiden, hauptsächlich Phospholipiden besteht.
Diese Moleküle bestehen aus einer hydrophilen Kopfgruppe, an die sich hydrophobe Kohlenwasserstoffketten anschließen. In einer wässrigen Lösung ordnen
sich die Lipide spontan in einer 4-5nm dicken Doppelschicht an, wobei die hydrophilen Kopfgruppen nach außen zeigen und die hydrophoben Kohlenwasserstoffketten im Inneren eine hydropobe Phase bilden. Die Lipiddoppelschicht der
Membran ist für viele Stoffe, vor allem für geladene Teilchen, ein Diffusionshindernis; ihr ohmscher Widerstand ist sehr groß. Der spezifische Widerstand liegt bei
10 2 bis 10 5 Ωcm 2 , dies entspricht einer spezifischen Leitfähigkeit von g M = 0,01 bis
10mS/cm 2 . Die flächenspezifische Kapazität der Membran beträgt c M = 0,5 bis
1,3µF/cm 2 . Die Durchbruchspannung liegt bei über 150mV. Stoffe, die sich in Lipiden lösen, können die Membran dagegen sehr gut passieren.
Zwischen den Phospholipiden sind regelmäßig Cholesterinmoleküle angeordnet,
die eine stabilisierende Wirkung auf die Membran haben. Unregelmäßig sind in die
Membran als Funktionsträger Glykolipide und Proteine eingebettet. Es ist zwischen
Proteinen zu unterscheiden, die sich von der Außen- zur Innenseite durch die
ganze Membran erstrecken und anderen Proteinen, die nur in der äußeren oder in
der inneren Schicht verankert sind. Die Proteine können mit intra- oder extrazellulären Substanzen reagieren. Für die Funktion von Nervenzellen und Muskelzellen
sind die Kanalproteine besonders wichtig. Durch sie können Ionen durch die Membran hindurch diffundieren.
6
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Aufbau einer Zellmembran
Abb. 1:
Aufbau einer Zellmembran. Bei den Proteinen, die die Phospholipiddoppelschicht ganz durchqueren, kann es sich um Kanalproteine handeln.
[1]
Das Zellvolumen besteht jeweils etwa zur Hälfte aus intrazellulären Organellen
und zur anderen Hälfte aus Cytosol. Die Organellen (z.B. Zellkern, Mitochondrien,
Lysosomen) werden durch Räume gebildet, die durch Membranen umschlossen
sind und spezielle Zellfunktionen ausführen. Das Cytoplasma zwischen den Organellen wird durch ein Cytoskelett strukturiert. Es stabilisiert die Form der Zelle,
fixiert die Lage der Organellen und ist Grundlage für Formänderungen und Bewegung. Das Cytosol ist eine wässrige Lösung und füllt das restliche Zellvolumen aus.
In dieser Phase sind die in der folgenden Betrachtung wichtigen anorganischen und
organischen Ionen gelöst.
Austauschprozesse
Die Ionen des Cytosols (intrazellulär) stehen über die Zellmembran im Austausch
mit der wässrigen Lösung (extrazellulär), die die Zelle umgibt. Die Ionenkonzentrationen befinden sich im Ruhezustand der Zelle in einem dynamischen Gleichgewicht. Der Ionenaustausch über die Zellmembran kann überwiegend nur durch
passiven Ionentransport über Kanal-Proteine oder durch aktive Transportmechanismen von Pump-Proteinen erfolgen. Die Ionenkanäle sind nur spezifisch für
bestimmte Ionensorten durchlässig. Die Doppellipidschicht selbst ist für Ionen fast
vollständig undurchlässig. Da die im Cytosol gelösten großen intrazellulären Anionen die Membran nicht passieren können und für sie keine Kanal-Proteine vorhanden sind, sind sie ein fester Bestandteil im Zellinneren.
Tab. 1: Intra- und extrazelluläre Ionenkonzentrationen einer Muskelzelle eines
Warmblüters. Es stellt sich ein Ruhepotential von V 0 = -90mV ein. [1]
Intrazellulär
Extrazellulär
Na+
12 mmol/l
Na+
145 mmol/l
K+
155 mmol/l
K+
4 mmol/l
Ca2+
10-8-10-7
Ca2+
2 mmol/l
4 mmol/l
Cl-
120 mmol/l
8 mmol/l
HCO3-
27 mmol/l
155 mmol/l
andere Kationen
5 mmol/l
ClHCO3A-
mmol/l
Die Tabelle (Tab. 1) enthält die typischen Ionenkonzentrationen der intra- und
extrazellulären Phase einer Muskelzelle. In der extrazellulären Lösung ist das häufigste Kation Na + , die Konzentration im Inneren der Zelle ist mehr als 10mal geringer. Genau umgekehrt stellt sich im dynamischen Gleichgewicht die Konzentration
7
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Membranspannung
der K + -Ionen ein. Die Konzentration in der extrazellulären Lösung ist mehr als
10mal geringer als die Konzentration in der intrazellulären Lösung. Den größten
Konzentrationsgradienten über die Zellmembran haben die Ca 2+ -Ionen. Die intrazelluläre Konzentration ist mehr als 10 000mal kleiner als die extrazelluläre.
1.2.Membranspannung
An der Membran von tierischen Zellen kann eine elektrische Potentialdifferenz
gemessen werden. Das Zellinnere liegt auf einem um 50 bis 100mV negativerem
Potential als die extrazelluläre Lösung. Die Membranspannung 1 entsteht durch eine
ungleiche Ionenverteilung zwischen der extra- und intrazellulären Flüssigkeit.
Gibbs-DonnanVerteilung
Im Zellinneren befinden sich große anionische organische Moleküle, die die Zelle
nicht verlassen können. Zur Ladungskompensation müssen ihnen Kationen gegenüberstehen, so daß sich die diffundierenden Ionen passiv ungleich verteilen
(Gibbs-Donnan-Verteilung [3] Gl.(1) und Gl.(2) 2 ). Die Verteilung der diffundierenden Ionen untereinander wird durch die Membrandurchlässigkeit bestimmt.
+
+
+
+
[ K + Na ]in > [ K + Na ] ex
-
(1)
-
[ Cl ] in < [ Cl ] ex
(2)
Neben dem passiven Ionentransport, der auf konzentrations- und potentailgetriebener Diffusion beruht, werden durch Pump-Proteine, Ionen entgegen dem Konzentrationsgradienten durch die Zellmembran transportiert. Der wichtigste aktive
Transportprozeß ist die Na-K-Pumpe, die Na + aus der Zelle heraus und K + in die
Zelle hinein transportiert. Sie stellt damit intrazellulär eine niedrige Na + -Konzentration und extrazellulär eine hohe K + -Konzentration sicher.
Zwischen den Diffusions- und den anderen Transportmechanismen besteht ein
dyamisches Gleichgewicht, so daß sich eine Ruhemembranspannung mit einer konstanten intrazellulären Ionenkonzentration einstellt.
1.2.1. Ionenaustausch über die Zellmembran
Bei ungeladenen Teilchen wird die Diffusion durch einen Konzentrationsgradieni
ten angetrieben. Die Teilchenflußdichte (Flux) jd in mol/(m 2 /s) für die Ionensorte i
i
ist dabei proportional dem räumlichen Gefälle der Teilchendichte C ( r ) .
i
i
i
j d = – D gradC ( r )
(3)
i
Für geladene Teilchen besteht zwischen dem Diffusionskoeffizienten D und der
i
Beweglichkeit µ durch die Zellmembran nach der Einsteinbeziehung folgender
Zusammenhang:
i
i
µ RT
D = -----------i
z F
1
(4)
Die Potentialdifferenz zwischen extra- und intrazellulärer Flüssigkeit wird in der Literatur als Membranpotential bezeichnet. Das Zellinnere ist im Ruhezustand immer negativ.
2
in: intrazelluläre Konzentration, ex: extrazelluläre Konzentration
8
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Membranspannung
Dabei ist R die Gaskonstante, T die absolute Temperatur, z i die Wertigkeit des
Ions und F die Faraday-Konstante. Die Durchlässigkeit der Membran im Ruhezui
stand wird auch durch die Permeabilität P Gl.(5) angegeben, wobei d als Dicke der
Membran eingeht. Die Diffusion von Ionen durch die Membran kann nur an Transportproteinen (Kanal-Proteinen) erfolgen, da die Doppellipidschicht für Ionen
undurchlässig ist.
i
i
P = D
----d
Nernst-Potential
(5)
Bei ungeladenen Teilchen führt die Diffusion zu einem Konzentrationsausgleich
über das gesamte Volumen. Die Diffusion von geladenen Teilchen infolge eines
Konzentrationsgefälles erzeugt dagegen durch Ladungsverschiebung ein elektrisches Feld, daß dem Diffusionsvorgang entgegenwirkt. Es stellt sich ein dynamischer Gleichgewichtszustand ein, in dem kein Netto-Flux mehr erfolgt. Die
Membranspannung im Gleichgewichtszustand für eine Ionensorte i wird als Gleichgewichtspotential oder Nernst-Potential V o i bezeichnet.
RT [ c i ] ex
V oi = ------- ln ------------z i F [ c i ] in
(6)
Die extrazelluläre Ionenkonzentration entspricht [c i ] ex und die intrazelluläre Konzentration [c i ] in . Für die Kaliumionen bedeutet dies folgendes: Die hohe intrazelluläre Kaliumkonzentration führt zu einer Diffusionsbewegung aus der Zelle heraus,
wobei positiv geladene Ionen die Zelle verlassen. Das Zellinnere lädt sich gegenüber dem umgebenden Raum negativ auf, so daß sich ein elektrisches Feld ausbildet, das der Diffusionsbewegung entgegenwirkt. Es stellt sich ein thermodynamischer Gleichgewichtszustand ein.
Die Nernst-Gleichung ermöglicht die Berechnung der Membranspannung nur für
eine Ionensorte. Sind verschiedene Ionen beteiligt, muß zur Berechnung des Membranpotentials berücksichtigt werden, daß die unterschiedlichen Ionen die Membran
unterschiedlich gut passieren können. Die Durchlässigkeit der Membran im Ruhezustand für unterschiedliche Ionen wird durch die Permeabilität Gl.(5) beschrieben.
Goldmann-Gleichung
Die Membranspannung, die sich bei gleichzeitiger Diffusion von K + - , Na + - und Cl -Ionen einstellt, kann nach der Goldmann-Gleichung Gl.(7) berechnet werden.
Dabei wird die Annahme getroffen, daß innerhalb der Membran die Spannung linear
abfällt und sie für die drei Ionensorten die Permeabilität P K , P Na und P Cl hat [3].
+
+
-
Pk [ K ] ex + P Na [ Na ] ex + PCl [ Cl ] in
V 0 = RT
------- ⋅ ln -----------------------------------------------------------------------------------------+
+
F
Pk [ K ] in + P Na [ Na ]in + P Cl [ Cl ] ex
(7)
Das Mischpotential oder Ruhepotential, das sich einstellt, führt zu keinem thermodynamischen Gleichgewichtszustand. Ist die Permeabilität der Membran für Kaliumionen größer als für Natriumionen und gelten die Ionenkonzentrationen von Tab.
1, fließen beim Ruhepotential dauernd K + -Ionen durch die Membran nach außen
und eine gleichgroße Zahl von Na + -Ionen von außen nach innen. Der Ladungsaustausch ist somit im Gleichgewicht; die Konzentrationsgradienten für K + und Na +
müßten aber infolge des Teilchenflusses langsam verschwinden. Die ursprüngliche
Ionenkonzentration läßt sich auf Dauer nur aufrecht erhalten, wenn gegen den Konzentrationsgradienten K + ins Zellinnere und in gleicher Menge Na + nach außen
transportiert werden. Einen solcher Transportprozeß kann im Gegensatz zu den
passiven Diffusionsprozessen nur durch einen aktiven Prozeß erfolgen.
aktive Transportprozesse
Bei aktiven Transportprozessen transportieren Membranproteine Ionen durch Aufwand von Energie über die Membran entgegen dem Konzentrationsgradienten oder
9
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Membranspannung
der elektrischen Feldstärke. Der wichtigste aktive Transportprozeß ist die Na-KPumpe, die pro Pumpzyklus netto 3 Na + -Ionen aus der Zelle entfernt und 2 K + Ionen in die Zelle hinein transportiert. Damit ist dieser Vorgang elektrogen, es wird
pro Zyklus eine positive Ladung aus der Zelle entfernt und das Membranpotential
wird etwas negativer als es sich aus der passiven Ionenverteilung (Goldmann-Gleichung) ergibt. Die Aktivität der Na-K-Pumpe wird durch die intrazelluläre Na + -Konzentration reguliert. Die Pumprate verlangsamt sich mit abnehmender Na+Konzentration in der Zelle, bis sich ein Gleichgewicht zwischen Pumprate und Na + Einstrom ausbildet. In der Tab. 2 sind die typischen Ionenkonzentrationen einer
Muskelzelle im intra- und extrazellulären Raum, sowie die Gleichgewichtspotentiale
der einzelnen Ionen nach der Nernst-Gleichung angegeben. Infolge des aktiven
Transportprozesses über die Zellmembran stellt sich ein Gleichgewichtspotential
von -90mV ein, das um 10mV negativer ist als der Wert, der sich aus der Goldmann-Gleichung ergibt.
Tab. 2: Typische Ionenkonzentrationen innerhalb und außerhalb einer Muskelzelle eines Warmblüters mit den Gleichgewichtspotential der einzelnen
Ionen (Nernst-Potentiale). Das tatsächliche Membranpotential beträgt V 0
= -90 mV (Goldmann-Gleichung). [1]
Dichte der Kanalund Pumpmoleküle
Ionen
Intrazellulär
Extrazellulär
Nernst-Potential
Na+
12 mmol/l
145 mmol/l
+ 66 mV
K+
155 mmol/l
4 mmol/l
-97 mV
Cl-
4 mmol/l
120 mmol/l
- 90 mV
Damit im Ruhezustand der Zelle die Konzentrationsgradienten von Kalium- und
Natriumionen über die Zellmembran aufrechterhalten werden können, muß die
durch passive Membranströme transportierte Ionenmenge der aktiv transportierten
Menge entsprechen. Durch ein Kanalprotein für Natrium- oder Kaliumionen fließen
bei jeder Öffnung, die weniger als eine Millisekunde andauert, mehrere zehntausend Ionen. Selbst im Ruhezustand der Membran passieren ca. 10 5 Ionen pro
Sekunde ein Kanalprotein. Da ein Pump-Protein im Ruhezustand nur etwa 100
Ionen pro Sekunde entgegen dem Konzentrationsgradienten über die Membran
transportiert, müssen ca. 1000mal mehr Pump-Proteine in der Membran eingebettet
sein als Membrankanalproteine. Auf 1µm 2 der Membran liegen im Durchschnitt bei
Ruhepotential ein Kalium- und ein Natrium-Kanal in geöffnetem Zustand vor, so
daß auf der gleichen Fläche etwa 1000mal mehr Pump-Proteine liegen müssen.
1.2.2. Dynamisches Verhalten der Zellmembran
Membranleitfähigkeit
Jede Abweichung des Membranpotentials von dem thermodynamischen Gleichgewichtspotential einer Ionensorte (Nernst-Potential) führt zu einer Nettoverschiebung
von Ionen in eine Richtung und somit zu einem Strom durch die Membran. Das Verhältnis zwischen flächenspezifischem Ionenstrom und Membranspannung wird als
flächenspezifische Membranleitfähigkeit g i der Ionensorte i bezeichnet.
ji
g i = ------VM
(8)
Bei Hyperpolarisation der Membran (Membranpotential kleiner Ruhepotential)
liegt ein lineares Verhältnis zwischen Ionenstrom und Membranspannung vor. Die
Membranleitfähigkeit ist weitgehend spannungsunabhängig. Im Bereich der Depolarisation zeigt die Membran dagegen ein nichtlineares Verhalten, die Leitfähigkeit
der Ionenkanäle ist stark spannungsabhängig. Abb. 2 zeigt qualitativ den spezifi-
10
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Membranspannung
schen Ionenstrom für Kalium- und Natriumionen durch die Zellmembran in Abhängigkeit der Membranspannung. In der Membran sind für Kalium- und Natrium
selektiv leitfähige Ionenkanäle angeordnet. Durch Depolarisation werden die Na +
und K + spezifischen Kanäle geöffnet und durch Hyperpolarisation wieder verschlossen. Die Aktivierung der K + -Kanäle erfolgt etwa um eine Größenordnung langsamer
als die der Na + -Kanäle. Dauert die Depolarisation jedoch länger als 1/10ms an, so
schließen sich die Na + Kanäle wieder. Die Inaktivierung der Na + -Kanäle erfolgt
über einen von der Öffnung unabhängigen und langsamer verlaufenden Prozeß.
Der Zustand der Inaktivierung läßt sich durch Hyperpolarisation nicht sofort rückgängig machen, erst nach Ablauf einer Relaxationszeit können die Kanäle durch
Depolarisation erneut aktiviert werden. Bei den K+ -Kanälen fehlt ein vergleichbarer
Prozeß der Inaktivierung, erst nach einer sehr viel längeren Zeit schließen sich
auch die K + -Kanäle, die Zeitkonstante ist aber so groß, daß sie in der Regel keine
Rolle spielt.
Abb. 2:
Aktionspotential
Abhängigkeit der Leitfähigkeit von der Membranspannung. Depolarisation ist auf der Abszisse nach rechts, Hyperpolarisation nach links
aufgetragen. Einströme (positive Ionen von außen nach innen) sind auf
der Ordinate nach unten, Ausströme nach oben aufgetragen. (Allgemeine Neurophysiologie) [2]
Die Menbranspannung kann von außen über einen Stromfluß durch eine Mikroelektrode (Kap. 6.1) beeinflußt werden. Wird das intrazelluläre Potential einer Muskelzelle oder einer Nervenzelle in Richtung positives Potential angehoben
(Depolar-isation) und dabei eine Reizschwelle überschritten, wird in der Zelle ein
Aktionspotential ausgelöst, das im Nerv das weitergeleitete Signal darstellt und am
Muskel zur Kontraktion führt. Es findet dabei eine Umpolarisation der Membran mit
einer sich anschließenden langsamen Repolarisationsphase auf das ursprüngliche
Ruhepotential statt. Den Verlauf eines Aktionspotentials zeigen die Abb. 3 und Abb.
4.
11
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Membranspannung
Abb. 3:
Zeitverlauf eines Aktionspotentials [1]
Die Depolarisation über die Reizschwelle verursacht die Öffnung der Natriumkanäle und damit einen starken Einstrom von Natriumionen. Dies führt zu einem steilen Anstieg des Potentials in Richtung auf das Na + -Ruhepotential, bis sich die
Kaliumkanäle verzögert öffnen und sich die Natriumkanäle durch Inaktivierung wieder schließen. Der Kaliumeinstrom treibt die Membranspannung wieder zum Ruhep o te n ti a l z u rü c k (R epol ari sati on). W egen der noch w i rksamen E rhöhung der
Leitfähigkeit der Kaliumkanäle gK kann es anschließend zu einer Hyperpolarisation
kommen. Während einer sich anschließenden Refraktärzeit ist die Zelle für etwa 1
bis 2ms nicht erregbar (absolute Refraktärzeit). Ihr folgt für etwa 2ms die relative
Refraktärperiode, in der nur ein Aktionspotential geringerer Höhe und Anstiegssteilheit ausgelöst werden kann. Eine überhöhte „Pumpaktivität“ der Na-K-Pumpe kann
auch eine Hyperpolarisation verursachen.
Intrazelluläre
Konzentrationsänderung
Im folgenden soll die intrazelluläre Konzentrationsänderung abgeschätzt werden,
die notwendig ist, um das intrazelluläre Potential um 100mV anzuheben. Geht man
von einer kugelförmigen Zelle mit einem Durchmesser von 50µm und einer Membrankapazität von 1µF/cm 2 aus, besitzt die gesamte Zelle eine Kapazität von etwa
100pF. Zur Änderung des intrazellulären Potentials um 100mV ist dann eine Verschiebung einer Ladungsmenge von 10 -11 C notwendig. Unter Berücksichtigung der
Elementarladung entspricht dies etwa 60 10 6 Ionen oder 10 -16 mol. Bei einem Zellvolumen von 65 000 µm 3 kommt es zu einer Konzentrationsänderung der Ionen um
etwa 10 -6 mol/l. Die Kanalströme, die den Ablauf eines Aktionspotentails bewirken,
ändern somit die Ionenkonzentration in der Zelle nur unwesentlich. Die Wiederherstellung des Konzentrationsgradienten der Ionen ist also für ein einzelnes Aktionspotential unerheblich.
12
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Membranspannung
Abb. 4:
Aktionspotentiale verschiedener Zellen im Warmblütergewebe (schematisch). Ordinate: intrazelluläres Potential, Abszisse: Zeit nach Beginn
des Aktionspotentials. [1]
13
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Elektrisches Membranmodell
1.3.Elektrisches Membranmodell
Modell von Hudgkin und Huxley
Die elektrischen Eigenschaften der Zellmembran wurden von Hodgkin und Huxley
[6] beschrieben. Als Grundlage dient das Ersatzschaltbild in Abb. 5 für ein Flächenelement der Zellmenbran. Die Ströme der Natrium- und Kaliumionen durch die
Ionenkanäle werden jeweils durch eine Reihenschaltung von einer Spannungsquelle mit einem spannungsabhängigen flächenspezifischen Leitwert g Na bzw. g K
dargestellt. Die Ströme der restlichen Ionen werden als Leckstrom zusammengefaßt und fließen durch einen spannungsunabhängigen flächenspezifischen Widerstand mit dem Leitwert g L . Die Kapazität der Zellmembran wird durch eine dazu
parallel geschaltete flächenspezifische Kapazität c M berücksichtigt. Der Stromanteil, der durch den aktiven Ionentransport der Pump-Proteine verursacht wird, ist
nicht berücksichtigt.
jM (t)
jG (t)
innen
jC(t)
gk
g Na
V 0K
V 0 Na
gL
cM
V M (t)
V 0L
außen
Abb. 5:
Ersatzschaltbild einer Zelle nach Hodgkin und Huxley
Die Reihenschaltung eines Leitwerts und einer Spannungsquelle zur Modellierung
eines Ionenkanals kann wie folgt begründet werden: Bei einer Membranspannung
V M fließt eine Stromdichte j elek i durch die Membrankanäle für die Ionensorte i mit
der spezifischen Leitfähigkeit g i .
i
i
i
i
j elek = g ⋅ VM
(9)
i
j diff = g ⋅ V0
(10)
Entgegen diesem Strom fließt ein Diffusionsstrom jdiffi , der durch das Konzentrationsgefälle der Ionen über die Membran verursacht und durch die Spannungsi
quelle dargestellt wird. Entspricht die Membranspannung dem Nernst-Potential V0 ,
ist der Nettostrom über die Membran gleich Null. Durch die Kombination beider
Anteile gilt für die Gesamtstromdichte j i durch die Ionenkanäle für die Ionensorte i
die Gl.(11). Das Nernst-Potential für die einzelnen Ionensorten wird jeweils durch
die Spannungsquelle dargestellt.
i
i
i
j = g ( VM – Vo )
(11)
Werden alle Ionenkanäle betrachtet, so addieren sich die Stromdichten der einzelnen Ionensorten j i zu einer Gesamtstromdichte j M .
jM =
∑i j
i
=
∑i g ( V M – V o )
i
i
(12)
14
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Elektrisches Membranmodell
Gesamtstromdichte j G und
Membrankapazität
Aus dem Ersatzschaltbild folgt somit für die Gesamtstromdichte jG durch die Zellmembran unter Berücksichtigung des kapazitiven Stroms die Differentialgleichung
(13).
dV M ( t )
Na
Na
K
K
L
L
j G ( t ) = c M ⋅ ----------------- + g ( V M ( t ) – V o ) + g ( VM ( t ) – Vo ) + g ( V M ( t ) – V o )
dt
(13)
Bei dieser Betrachtungsweise ist es wichtig zu beachten, daß bei einer abgeschlossenen Zelle, der von außen kein Strom über eine Patch-Pipette (Kap. 6.1)
zugeführt wird, der Gesamtstrom zwischen intrazellulärem und extrazellulärem
Raum immer Null ist 3 . Der Gesamtstrom durch die Ionenkanäle j M dient vollständig
zur Ladung der Membrankapazität. Ändert sich in der Zelle bei Ablauf eines Aktionspotentials die Membranspannung infolge einer Änderung der Leitfähigkeit der
Ionenkanäle, dient der Gesamtstrom durch die Ionenkanäle j M nur zur Ladung der
Membrankapazität cM . Die Gesamtstromdichte jG ist unter diesen Voraussetzungen
immer Null. Für eine abgeschlossene Zelle, in die kein Strom injiziert wird, gilt
Gl.(14).
dV M ( t )
Na
Na
K
K
L
L
j G ( t ) = c M ⋅ ----------------- + g ( V M ( t ) – V o ) + g ( VM ( t ) – Vo ) + g ( V M ( t ) – V o ) = 0
dt
spezifische Leitfähigkeit g i = f(V M )
(14)
Die spezifische Leitfähigkeit g i der Ionenkanäle ist wiederum eine nichtlineare
Funktion der Membranspannung. Die Abhängigkeit wurde von Hodgkin und Huxley
aus Messungen am Riesenaxon des Tintenfischs für die Natrium- und KaliumKanäle bestimmt und mit Ratengleichungen beschrieben, so daß der Ablauf eines
Aktionspotentials nachgebildet werden konnte.
K
K
4
g ( V M ) = g 0 ⋅ n ( V M, t )
g
Na
L
Na
3
( V M ) = g 0 ⋅ m ( V M, t ) ⋅ h ( V M, t )
L
g = go
(15)
(16)
(17)
Die Faktoren n,m und h beschreiben die Spannungsabhängigkeit der Leitfähigkeit
der Kanäle. Hodgkin und Huxley nehmen in ihrem Modell an, daß jeder Kanal aus
vier statistisch voneinander unabhängigen molekularen Ventilen besteht. Erst wenn
alle Ventile eines Kanals geöffnet sind, können ihn die entsprechenden Ionen pasK
Na
sieren und die Leitfähigkeit beträgt dann g 0 bzw. g 0 . Die Kaliumkanäle bestehen
aus vier identischen Ventilen, die jeweils mit einer Öffnungswahrscheinlichkeit n im
offenen Zustand vorliegen. Die Wahrscheinlichkeit, daß alle Ventile gleichzeitig
geöffnet sind ist n 4 . Die Membranleitfähigkeit für Kaliumionen ergibt sich aus der
K
maximalen Leitfähigkeit der Membran g 0 und der Öffnungswahrscheinlichkeit n.
Die Natriumkanäle bestehen aus vier Ventilen: Drei Ventilen mit der Öffnungswahrscheinlichkeit m und ein Ventil mit der Öffnungswahrscheinlichkeit h. Der Faktor m beschreibt die Aktivierung der Kanäle infolge einer Depolarisierung der
Membran. Das vierte Ventil mit der Öffnungswahrscheinlichkeit h beschreibt die
Inaktivierung der Ionenkanäle. Ein Natriumkanal liegt mit der Wahrscheinlichkeit
3
m ⋅ h in geöffnetem Zustand vor.
3
Die aktiven Transportprozesse über die Zellmembran werden nicht berücksichtigt.
15
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Elektrisches Membranmodell
Die Spannungsabhängigkeit der Faktoren n,m und h wird zu jedem Zeitpunkt t
mit den Differentialgleichungen (18) bis (20) beschrieben. Diese Gleichungen wurden aus empirischen Messergebnissen bestimmt.
dn- = ( α ( 1 – n ) – β n ) -----1----n
n
dt
ms
(18)
dm
1
------- = ( α m ( 1 – m ) – β m m ) ------dt
ms
(19)
dh
1
------ = ( α h ( 1 – h ) – β h h ) ------dt
ms
(20)
10 – V' α n = 0, 01 ---------------------------------10 – V' – 1
exp ---------------10
25 – V'
α m = 0, 1 ----------------------------------25 – V'
exp ---------------- – 1
10
V'

α h = 0, 07 exp – ------
 20
R 1
V' = ( VM – VM ) ------mV
V'-
β n = 0, 125 exp  – ---- 80
(21)
V'
β m = 4 exp  – ------
18
(22)
1
β h = -----------------------------------30 – V'
exp ---------------- + 1
10
(23)
(24)
Dabei sind α und β Geschwindigkeitskonstanten, die von der Temperatur, der
Ca ++ -Konzentration, dem pH-Wert und der Membranspannung abhängen [2]. In den
Formulierungen von Hudgkin und Huxley geht nur die Membranspannung als explizite Größe ein. Die Differentialgleichungen (21) bis (23) beziehen sich auf die norR
m i e r t e u n d e i n h e i t e n l o s e G r ö ß e V ’ , d i e d e r D i f f e r e n z s p a n n u n g ( V M – V M )/mV
R
zwischen der Membranspannung V M und dem Membranruhepotential VM entspricht. Der stationäre Endwerte n ∞ ergibt sich aus der Gl. (25). Die stationären
Werte m ∞ und h ∞ ergeben sich analog. Diese Werte können als Anfangswerte für
Simulationen verwendet werden. Für die Zeitkonstanten des Faktors n gilt Gl. (26).
Für die Zeitkonstanten der anderen Geschwindigkeitskonstanten m und h gilt Gl.
(26) analog.
Simulation
αn
n ∞ = ----------------α n + βn
(25)
1
τ n = -----------------α n – βn
(26)
Abb. 6 zeigt eine Simulation der Membranspannung V M nach dem Modell von
Hudgkin und Huxley mit den ursprünglichen Werten, die für das Riesenaxon eines
Tintenfischs bestimmt wurden. Das Aktionspotential wurde durch einen Injektionsstromimpuls von 3nA für 1ms in die Zelle ausgelöst. Die Fläche der Zelle entspricht
A M . Die Leitfähigkeit der Na + - und K + -Kanäle während des Ablaufs eines Aktionspotentials ist in Abb. 7 dargestellt. Zur Simulation wurden die Ratengleichungen
(18) bis (20) und die Gleichung (27) integriert. Das Simulationsmodell ist im
Anhang i dargestellt.
dV M ( t )
I inj
Na
Na
K
K
L
L
c M ⋅ ----------------- + g ( VM, t ) ( V M ( t ) – Vo ) + g ( VM, t ) ( VM ( t ) – Vo ) + g ( V M ( t ) – V o ) = ------dt
AM
(27)
16
Elektrophysiologische Vorgänge an Zellmembranen
Elektrisches Membranmodell
60
40
Vm [mV]
20
0
-20
-40
-60
0
2
4
6
8
10
12
14
16
t [ms]
Abb. 6:
Aktionspotential nach dem Modell von Hudgkin und Huxley mit den
Werten für das Riesenaxon des Tintenfischs (c M =1µF/cm 2 , A M
=31416µcm 2 , g Na = 120mS/cm 2 , g K = 36mS/cm 2 , g L = 0.3mS/cm 2 , V Na =
65mV, V K = -62mV, V L = -39,4mV, V R = -50mV).
35
30
gNa
mS/cm2
25
20
15
10
gK
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
t [ms]
Abb. 7:
Leitfähigkeit der Na + - und K + -Kanäle bei Ablauf des Aktionspotentials
entsprechend Abb. 6.
17
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Elektrisches Membranmodell
2. Lokale extrazelluläre Spannungen an der
Zellmembran
Die Membranspannung einer Zelle kann durch verschiedene Verfahren direkt
gemessen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Patch-Clamp-Technik (Kap.
6.1) angewendet. Bei diesem Verfahren wird das Zellinnere durch eine Mikropipette
kontaktiert, die mit einem Elektrolyten gefüllt ist, dessen Zusammensetzung der
intrazellulären Flüssigkeit ähnlich ist. Über die Pipette kann das Potential in der
Zelle gemessen und ein definierter Strom eingeprägt werden. Zur Messung der
Membranspannung können aber auch Mikroelektroden oder Farbstoffe eingesetzt
werden. Alle genannten Methoden zur Messung des Spannungsabfalls über die
Membran haben den Nachteil, daß sie mit einem Eingriff in die Zelle verbunden
sind und somit die Messung der zellulären Aktivität nur für einen kurzen Zeitraum
ermöglichen.
Die intrazellulären Potentialänderungen können aber auch extrazellulär durch
einen Spannungsabfall im äußeren Elektrolyten gemessen werden, der durch einund ausströmende Ionen verursacht wird. Bei diesen Verfahren wird die Zelle mit
einer Oberfläche (oxidiertes Silizium) in Berührung gebracht, so daß zwischen Zelle
und Oberfläche nur ein dünner Film des Elektrolyten verbleibt. Ionen, die im Spalt
durch die Zellmembran ein- bzw. ausströmen, verursachen durch den Widerstand
des dünnen Elektrolyt-Films im Spalt einen Spannungsabfall. Auf Grund der hohen
Leitfähigkeit des Elektrolyten bilden sich diese lokalen Spannungen aber nur im
Bereich von wenigen Millivolt aus. Die Spannungen können mit Transistoren oder
planaren Elektroden, die in der Oberfläche integriert sind, registriert werden.
Im Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried/München wurden unter der
Leitung von Peter Fromherz detaillierte Untersuchungen über die Entstehung der
lokalen extrazellulären Spannungen, die Beschaffenheit des Spalts zwischen einer
Zelle und einer Oberfläche und die Registrierung der Spannungen mit integrierten
Transistoren durchgeführt [7]-[21].
Die ersten extrazellulären Messungen von Aktionspotentialen einzelner isolierter
Nervenzellen von Blutegeln gelang 1990 in der Arbeitsgruppe von P .Fromherz [7].
Er verwendete dafür p-Kanal-Feld-Effekt-Transistoren ohne metallisierte Gate-Elektrode mit einer Gategröße von 20µm mal 30µm. Bei diesen Messungen konnte er
drei unterschiedliche Signalverläufe registrieren: Signalverläufe, die der ersten
Ableitung des intrazellulären Signalverlaufs des Aktionspotentials entsprechen
(biphasische Signale, Typ A), Signalverläufe die dem intrazellulären Signal linear
folgen (monophasische Signale, Typ B) und Signalverläufe, die eine Mischform von
den beiden anderen Type darstellen (Typ AB). In den nachfolgenden Arbeiten
[8],[11],[12] von R. Weis aus seiner Arbeitsgruppe wurden die Übertragungseigenschaften der Zellmembran mit weiterentwickelten Feld-Effekt-Transistoren untersucht. Die Transistoren wurden in der Halbleiter-Technologie der TU-Berlin
hergestellt. Bei diesen Messungen wurden die Zellen auf Feld-Effekt-Transistoren
ohne Gate-Metallisierung aufgesetzt und es wurde das intrazelluläre Potential mit
der Patch-Clamp-Technik im Kleinsignalbereich mit Frequenzen von 0.1Hz bis
5000Hz moduliert. Die gemessene Modulation des Souce-Drain-Stroms in Amplitude und Phase ermöglicht Rückschlüsse auf den lokalen extrazellulären Spannungsverlauf im Spalt. Es wurde auf dieser Grundlage ein zweidimensionales
Kontaktmodell der Zellmembran mit einer Oberfläche entwickelt, das auf linearisierten Eigenschaften der Zellmembran im Kleinsignalbereich beruht. Mit diesem
Modell können zwar die Übertragung einer von außen vorgegebenen intrazellulären
Spannung auf die extrazelluläre Spannung im Spalt erklärt werden, jedoch nicht die
unterschiedlichen extrazellulären Spannungsverläufe im Spalt, die mit Feld-Effekt-
18
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Modellbildung
Transistoren beim Ablauf eines Aktionspotentials beobachtet werden. In den weiteren Publikationen von R. Schätzthauer[17], S. Vassanelli [18] und P. Fromherz [21]
wurde das Modell erweitert und die Verteilung der Ionenkanäle zwischen der freien
Membran und dem Kontaktbereich zu einer Oberfläche berücksichtigt, so daß die
unterschiedlichen Spannungsverläufe erklärt werden konnten.
2.1.Modellbildung
Die folgende Darstellung des Modells zur Beschreibung von lokalen extrazellulären Spannungen entspricht im Grundsatz den Ausführungen von P. Fromherz [21].
Wird eine Zelle auf eine Oberfläche aus oxidiertem Silizium aufgesetzt, bildet sich
zwischen der Siliziumdioxidoberfläche und der Zellmembran ein Spalt von 10100nm aus, der mit Elektrolyt gefüllt ist. Die Breite des Spalts hängt von der Zelle
und der gewählten Oberflächenbeschichtung ab [19], [20]. Das Silizium und die
extrazelluläre Flüssigkeit (Bad) werden auf Massepotential gehalten, das Cytoplasma in der Zelle liegt auf dem einheitlichen Potential V M . 4 Im Spalt bildet sich
ein ortsabhängiges Potential V J aus.
Die Abb. 8 zeigt das Ersatzschaltbild für ein vereinfachtes Modell in dem die Ortsabhängigkeit der Spannung im Spalt V J unberücksichtigt bleibt (Punkt-KontaktModell). Soll das Potentialprofil der Spannung VJ berücksichtigt werden, ist eine
separate Betrachtung für jedes differentielle Flächenelement im Spaltbereich
gemäß der Kabeltheorie notwendig [11]. Die Darstellung in dieser Arbeit beschränkt
sich auf das eindimensionale Punkt-Kontakt-Modell.
Im Punkt-Kontakt-Modell der Abb. 8 wird angenommen, daß die spezifische Membrankapazität c M auf der gesamten Oberfläche der Zelle konstant ist. Die spezifische Leitfähigkeit der Ionenkanäle für die Ionensorte i beträgt g i und ist gemäß
Gl.(15), (16) eine zeitabhängige Funktion der Membranspannung. Das NernstPotential V 0 i , ist abhängig vom Konzentrationsgradienten über die Zellmembran
Gl.(6). Strömen Ionen durch die Zellmembran, gleicht sich die Ionenkonzentration
im Spalt mit einer Zeitverzögerung der Ionenkonzentration im restlichen extrazellulären Raum an. Der Konzentrationsgradient im Spaltbereich über der Zellmembran
ist nicht identisch mit dem Gradienten im Bereich der freien Membran. Das NernstPotential hat für diesen Teil der Membran deshalb einen anderen Wert V J0 i . Aufgrund der vorliegenden Meßergebnisse [17] wird angenommen, daß sich die Dichte
der Ionenkanäle auf der Membranoberfläche und somit auch die mittlere spezifische Leitfähigkeit im Bereich der freien Membran A FM vom Kontaktbereich A JM
unterscheidet. Die Leitfähigkeiten der Zellmembran im freien Bereich wird mit gFM i
bezeichnet, die Leitfähigkeit im Kontaktbereich mit g JM i . Die Werte g FM i und g JM i
beziehen sich auf ein differenzielles Flächenelement. Sind die Ionenkanäle auch
innerhalb der freien Membranfläche und der Kontaktmembranfläche inhomogen
verteilt, können die Leitfähigkeiten g FM i bzw. g JM i als gemittelte Werte aufgefaßt
werden. Es wird für jede Sorte der Ionenkanäle ein Faktor µ J i eingeführt, der das
Leitfähigkeitsverhältnis zwischen den unterschiedlichen Membranbereichen
beschreibt.
i
g JM
i
µ J = --------i
g FM
(28)
Die Darstellung entspricht mit zwei Unterschieden dem Modell von Hodgkin und
Huxely:
4
Der spezifische Widerstand der extrazellulären Flüssigkeit wird nur im Spaltbereich berücksichtigt, im
freien Raum wird er vernachlässigt.
19
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Modellbildung
- Für den Teil der Zellmembran, der sich im Kontakt mit einer Oberfläche befindet, wird die Spannung im Spalt berücksichtigt. Es fällt in diesem Bereich eine
andere Spannung über die Membran ab als im freien Membranbereich.
- Die spezifische Leitfähigkeit der Zellmembran im Kontaktbereich bzw. die Dichte
der Ionenkanäle auf der Zellmembran im Kontaktbereich unterscheiden sich von
der restlichen Zellmembran.
- Im Spalt zwischen Oberfläche und Zellmembran herrscht eine andere Ionenkonzentration als in der extrazellulären Flüssigkeit.
IINJ /A M
g FM i
cM
V 0i
(1)
VM
V0i
g JM i
cM
VJ
(2)
gJ
c OX
Abb. 8:
Punkt-Kontakt-Modell einer Zelle mit einer oxidierten Siliziumoberfläche.
Die spezifische Kapazität der Zellmbran c M ist über die gesamte
Oberfläche A M der Zelle konstant. Silizium und Bad befinden sich auf
Massepotential, das Cytoplasma der Zelle befindet sich auf dem einheitlichen Potential V M . Die Dichte der Ionenkanäle auf der freien Membran
A FM und der Membran im Kontaktbereich A JM unterscheiden sich für
jede Ionensorte i um den Faktor µ J i , der auch den Verhältnissen der
Membranleitfähigkeiten g JM i /g FM i entspricht. Über eine Patch-Pipette
wird in die Zelle der Strom I INJ injeziert. Der Spalt zwischen
Zellmembran und Siliziumoxid hat eine Breite von 10-100nm, der gemittelte spezifische Widerstand im Spalt beträgt g J .
Betrachtet man eine freie Zelle, die kein Kontakt zu einer Oberfläche hat, folgt für
den Knoten (1) der Abb. 8 die Differentialgleichung (29). Die Leitfähigkeit der
Ionenkanäle für jede Ionensorte über die gesamte Membranfläche ist konstant und
i
entspricht g FM . Der intrazelluläre Potentialverlauf ist nur von dem Injektionsstrom
I INJ und dem Ionenstrom durch die Membrankanäle abhängig. Diese Darstellung
entspricht soweit der Darstellung von Hodgkin und Huxley Gl.(13).
I INJ
--------- =
AM
dV M
∑ gFM ( VM – V0 ) + cM ---------dt
i
i
(29)
i
Wird die Kontaktfläche der Zellmembran mit der Oberfläche berücksichtigt und für
das Verhältnis zwischen der Membran im Kontaktbereich und der gesamten Membranfläche der Faktor β eingeführt, Gl.(30), bestimmt sich die Membranspannung
nach dem Kirchhoffschen Gesetz im Knoten (1) gemäß Gl.(31). Im Spaltbereich
i
wird für jede Ionensorte ein anderes Nernst-Potenial VJ0 als im freien Membranbereich verwendet, da in diesem Bereich eine andere Ionenkonzentration als im freien
Bereich bestehen kann.
20
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Modellbildung
AJM
β = --------AM
(30)
I INJ = A FM ∑ g FM ( VM – V0 ) + A JM ∑ g JM ( VM – VJ – V J0 )
i
i
i
i
i
(31)
i
dV M
d ( V M – VJ )
+ AFM c M ---------- + A JM c M --------------------------dt
dt
Mit AJM = βAM und A FM = ( 1 – β )A M folgt:
I INJ
------------------------ =
( 1 – β )AM
β
(32)
g ( V – VJ – V J0 )
∑ gFM ( VM – V0 ) + ----------1 – β ∑ JM M
i
i
i
i
i
(33)
i
dV M
( VM – VJ )
β - c d--------------------------+ c M ---------- + ----------.
1–β M
dt
dt
Die lokale extrazelluläre Spannung V J wird durch den Spannungsabfall am Widerstand des Elektrolyten im Spalt gJ bestimmt, der proportional dem Strom durch den
Spalt ist. Für den Knoten (2) in Abb. 8 folgt für die Spannung V J die Differentialgleichung (34). Der Strom durch den Spalt hängt von dem Ladestrom der Membranund Bulkkapazität und dem Stromfluß durch die Ionenkanäle der Membran in diesem Bereich ab.
gJ VJ =
d ( V M – VJ )
dV J
– c OX --------∑ gJM ( VM – VJ – VJ0 ) + cM --------------------------dt
dt
i
i
(34)
i
Zur Vereinfachung der Gl.(33)und (34) können folgende Näherungen gemacht
werden:
1.
Die Membranleitfähigkeit ist sehr viel kleiner als die Leitfähigkeit des Elektroi
lyten im Spalt ∑ g JM « g J , so daß die Membranspannung im Spaltbereich
VM – VJ der intrazellulären Spannung VM entspricht. Die Größenordnung von
VJ liegt im Vergleich zu V M nur bei wenigen Prozent.
2.
Die Ionenkonzentration des Elektrolyten im Spaltbereich unterscheidet sich
nur wenig von der Ionenkonzentration im Bad, so daß auch im Spaltbereich
i
das Nernst-Potential der freien Membran V 0 verwendet werden kann. Diese
Annahme ist nur dann gerechtfertigt, wenn davon ausgegangen wird, daß
sich durch Diffusionsbewegung die Konzentration im Spalt sehr schnell der
Konzentration im Bad angleicht. Bei einer Membrankapazität von 1µF/cm 2
müssen über die Membran etwa 6000 Ionen/µm 2 verschoben werden, damit
sich die Membranspannung um 100mV ändert. Dies entspricht 10 -20 mol/
µm 2 . Geht man davon aus, daß zwischen Zellmembran und Oberfläche eine
Spaltbreite von 10nm besteht [19], kommt es im Spalt zu einer Änderung der
Ionenkonzentration um 1mmol/l. Die extrazelluläre Konzentration von Na +
Ionen beträgt 145mmol/l, von K + Ionen 4mmol/l.
3.
Für Änderungen des intrazellulären Potentials im Millisekundenbereich, in
dem sich Aktionspotentiale von Zelle abspielen, können die kapazitiven
–2
Ströme im Spaltbereich ( c OX + c M )dV J /dt mit c M ≈ 1µFcm und
–2
c OX ≈ 10nFcm vernachlässigt werden. Mit der spezifischen Leitfähigkeit des
–2
Elektrolyten im Spaltbereich von g J ≈ 1000mScm liegt die Zeitkonstante bei
τJ = 1µs .
Werden diese Näherungen in den Gl.(33)und (34) berücksichtigt, folgen die beiden Differentialgleichungen (35) und (36):
21
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Modellbildung
I INJ
------------------------ =
( 1 – β )A M
gJ VJ =
β
i
i
i
1
(35)
i
dV M
-.
∑ gJM ( VM – V0 ) + cM ---------dt
i
dV M
- g  ( V – V 0 ) + ------------ c M ----------∑  gFM + ----------1–β
1 – β JM M
dt
i
(36)
i
Beide Gleichungen sind von dem spezifischen Ladestrom der Membrankapazität
c M dV M /dt abhängig, so daß die Gleichungen (35) und (36) ineinander eingesetzt
werden können. Zusätzlich kann für die unterschiedliche Leitfähigkeit zwischen der
i
freien und bedeckten Membranfläche der Faktor µ J der Gl.(28) eingesetzt werden.
Die lokale extrazelluläre Spannung im Spalt kann somit in Abhängigkeit des Injektionsstroms, der Leitfähigkeit der freien Membranfläche und der intrazellulären
Spannung formuliert werden.
IINJ
i
i
i
1–β
V J = ------------ ------------------------–
g ( 1 – µJ ) ( VM – V0 )
g J ( 1 – β )AM ∑ FM
(37)
i
Je nach Anordnung der Ionenkanäle in der Membran im Kontaktbereich im Verhältnis zum freien Bereich sind unterschiedliche extrazelluläre Spannungsverläufe
V J ( t ) zu erwarten. Grundsätzlich sind fünf unterschiedliche Möglichkeiten der Verteilung der Ionenkanäle zwischen freier Zellmembran und der Membran im Kontaktbereich denkbar:
(1) Homogene Verteilung der Ionenkanäle zwischen freier Membran und der
Membran im Kontaktbereich (homogene Verteilung),
(2) vollständige Verarmung der Ionenkanäle im Kontaktbereich (vollständige
Verarmung),
(3) rein ohmscher Widerstand der Ionenkanäle im Kontaktbereich (linearer Übergang),
(4) Anreicherung/Verarmung aller Ionenkanäle im gleichen Verhältnis zwischen
freier Membran und der Membran im Kontaktbereich (konstante Anreicherung/Verarmung),
(5) unterschiedliche Verteilung der Ionenkanäle zwischen freier Membran und
der Membran im Kontaktbereich (unterschiedliche Anreicherung/Verarmung).
homogene Verteilung (1)
Eine homogene Verteilung der Ionenkanäle über die gesamte Zelloberfläche
i
µ J = 1 läßt in Gl.(37) den Stromanteil durch die Ionenkanäle der Membran vollständig verschwinden. Die extrazelluläre Spannung V J bildet nur noch den spezifischen
Injektionsstrom mit dem Skalierungsfaktor g J ab. Die Grundvoraussetzung zur Messung von Aktionspotentialen sind also Inhomogenitäten in der Verteilung der Ionenkanäle über die Zellmembran. Mit β « 1 gilt für eine homogene Verteilung der
Ionenkanäle:
IINJ
g J VJ = --------.
AM
(38)
Die Abb. 9 (ii) zeigt den extrazellulären Spannungsverlauf VJ ( t ) im Spalt bei
Ablauf eines Aktionspotentials bei homogener Verteilung der Ionenkanäle in einer
Simulation. Der Spannungsverlauf spiegelt nur den Injektionsstromimpuls wieder.
Bei homogener Verteilung wird also kein Aktionspotential sichtbar.
Trotzdem wurden in Messungen lokale extrazelluläre Spannungsverläufe festgestellt, die nicht dem Injektionsstrom entsprechen. Es ist deshalb davon auszugehen, daß der Kontakt der Zellmembran mit einer Oberfläche zu einer Verarmung/
Anreicherung oder Inaktivierung/Aktivierung der Ionenkanäle in der Zellmembran
22
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Modellbildung
führt oder die Ionenkanäle über die Membran generell inhomogen verteilt sind. Die
Verteilung der Ionenkanäle scheint jedoch von mehreren unterschiedlichen und
noch unbekannten Faktoren abzuhängen, da verschiedene Verläufe der extrazellulären Spannungen gemessen wurden, die auf grundlegend unterschiedliche Verteilungen hinweisen.
vollständige Verarmung (2)
Bei einer vollständigen Verarmung der Ionenkanäle im Kontaktbereich der Memi
bran g JM ≈ 0 ist die Spannung VJ ( t ) im Spalt proportional zur ersten Ableitung der
intrazellulären Spannung VM ( t ) . Die Leitfähigkeit des Elektrolyten im Spalt g J stellt
lediglich einen Skalierungsfaktor dar.
dV M
g J VJ = c M ---------dt
(39)
i
Vollständige Verarmung aller Ionenkanäle im Spalt bedeutet: µ J = 0 für alle
Ionenkanäle i. Die erste Ableitung der Membranspannung dV M ( t )/dt wird für β « 1
nur durch den Ionenstrom durch die freie Membranfläche und den Injektionsstrom
bestimmt.
dV M
IINJ
i
i
c M ---------- = --------–
g ( V – V0 )
dt
A M ∑ FM M
(40)
i
Die Spannung V J ( t ) bildet somit nur den Injektionsstrom und den Strom durch die
Ionenkanäle der freien Membranfläche ab.
IINJ
i
i
g J VJ = --------–
g ( V – V0 )
AM ∑ FM M
(41)
i
Das Simulationsergebnis für eine vollständige Verarmung der Ionenkanäle im
Kontaktbereich zeigt Abb. 9 (iii). In der Abbildung ist besonders auf den Skalierungsunterschied der Ordinate zu achten.
linearer Übergang (3)
Es kann davon ausgegangen werden [21], daß nur ein Teil der Ionenkanäle der
i
Zellmembran spannungsgesteuert sind g FM ( VM ) , ein anderer Teil ist dagegen
unabhängig von der intrazellulären Spannung V M . Dieser Anteil entspricht den
Leckströmen durch die Zellmembran. Im Falle des linearen Übergangs wird angenommen, daß im Kontaktbereich der Membran die spannungsabhängigen Ionenkanäle fehlen oder inaktiviert sind, während ein ohmscher Leitfähigkeitsanteil
L
g JM über die Membran in diesem Bereich verbleibt. Aus Gl.(36) folgt die Gleichung
(42).
dV M
L
i
g J VJ = g JM ( V M – V 0 ) + c M ---------dt
(42)
Der Verlauf von VJ ( t ) stellt eine lineare Funktion der intrazellulären Spannung
V M ( t ) dar, wenn der kapazitive Strom c M dV M /dt sehr viel kleiner als der lineare
L
i
Anteil g JM ( VM – V0 ) ist.
Dieses Verhalten konnte in der Simulation nicht dargestellt werden, da bei einer
intakten Membran der Leckstromanteil vernachlässigbar klein ist.
konstante Anreicherung/Verarmung (4)
Ist die Anreicherung oder Verarmung zwischen Kontaktbereich und freier Memi
i
bran für alle Ionenkanäle identisch, gilt für alle Leitwertverhältnisse g JM /g FM der
i
i
gleiche Faktor µ J mit g JM /g FM = µ J . Aus Gl. (35) und (36) folgen ohne Injektionsstrom die Gl.(43) und Gl.(44).
β
0 =  1 + ------------ µ J
1–β
dV M
- c ----------∑ gFM ( VM – V0 ) + ----------1 – β M dt
i
i
i
1
(43)
23
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Modellbildung
gJ VJ = µJ
dV M
∑ gFM ( VM – V0 ) + cM ---------dt
i
i
(44)
i
i
In diesem Fall kann die Leitfähigkeit g FM der Zellmembran eliminiert werden.
Durch Einsetzen der Gl.(44) in Gl.(43) wird die extrazelluläre Spannung durch
Gl.(45) beschrieben.
1
1 – ------------ µ J c dV
1–β
M
M
---------V J = ---------------------------- -----g J dt
β
1 + ------------ µ J
1–β
(45)
Für eine sehr kleine Kontaktfläche der Zellembran mit einer Oberfläche β « 1 vereinfacht sich der Ausdruck zu:
1 – µ c M dV M
V J = --------------J ---------------- .
1
g J dt
(46)
Der Spannungsverlauf im Spalt V J ( t ) entspricht bis auf einen konstanten Faktor
dem Spannungsverlauf bei vollständiger Verarmung der Ionenkanäle im Kontaktbereich Gl.(39). V J ( t ) folgt der ersten Ableitung der intrazellulären Spannung V M ( t ) .
Der Dichtefaktor µ J bewirkt nur eine Änderung der Amplitude des Signalverlaufs.
Eine vollständige Verarmung bedeutet µ J = 0 und Gl.(46) ist mit Gl.(39) identisch.
Partielle Verarmung µ J < 1 verkleinert die Amplitude des Signals, partielle Anreicherung µ J > 1 führt zu einer Invertierung der kapazitiven Antwort.
Das Simulationsergebnis für eine partielle Verarmung/Anreicherung der Ionenkanäle im Kontaktbereich der Membran ist in Abb. 10 dargestellt. Im Diagramm (vi)
sind die Na + Kanäle auf 50% im Kontaktbereich verarmt und die K + Kanäle auf
200% angereichert. Das Diagramm (vii) zeigt genau die umgekehrte Konstellation.
Simulationsmodell
Als Grundlage für die Berechnung des extrazelluläre Spannungsverlaufs V J ( t ) bei
unterschiedlichen Verteilungsverhältnissen der Ionenkanäle über die Zellmembran
wurden das Modells von Hodgkin und Huxley eingesetzt. Als spannungsgesteuerte
Ionenkanäle wurden die Kanäle für Natrium und Kalium mit den spezifischen LeitfäNa
K
higkeiten g FM und g FM berücksichtigt. Die spannungsunabhängige spezifische
L
Leitfähigkeit der Membran geht über g FM in das Modell ein. Die Verteilung der
Ionenkanäle zwischen dem Kontaktbereich und der freien Membran wird durch die
Na
K
L
Faktoren µ J , µ J , und µ J ausgedrückt. Der Membranspannungsverlauf wurde entsprechend Gl.(47) , die extrazelluläre Spannung im Spalt entsprechend Gl.(48)
simuliert. Die Abhängigkeit der spezifischen Leitfähigkeit von der Membranspannung wurde nach den Ratengleichungen von Hudgkin und Huxley berechnet
Gl.(15)-Gl.(24).
Membranspannungsverlauf V M ( t ) :
I INJ
Na
K
β Na Na
β K K
------------------------ =  1 + ------------ µ J  g ( V M – V 0 ) +  1 + ------------ µ J  g ( V M – V 0 )
( 1 – β )A M
1–β
1
–
β
FM
FM
(47)
dV M
L
β L L
1
+  1 + ------------ µ J  g ( V M – V 0 ) + ------------ c M ---------

1–β
1–β
dt
FM
Lokaler extrazellulärer Spannungsverlauf VJ ( t ) im Spalt:
dV M
Na Na
Na
K K
K
L L
L
g J VJ = µ J g FM ( VM – V0 ) + µ J g FM ( V M – V 0 ) + µ J g FM ( V M – V 0 ) + c M ---------dt
(48)
24
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Modellbildung
60
(i)
40
VM [mV]
20
0
-20
-40
-60
0
2
4
6
0,016
8
10
12
14
(ii)
0,012
VJ [mV]
16
t [ms]
0,008
0,004
0,000
0
2
4
6
0,5
8
10
12
14
16
t [ms]
0,4
(iii)
VJ [mV]
0,3
0,2
0,1
0,0
-0,1
-0,2
0
2
4
6
0,3
8
10
12
14
t [ms]
(iv)
0,2
VJ [mV]
16
0,1
0,0
-0,1
0
2
4
6
0,2
8
10
12
14
16
t [ms]
0,1
(v)
VJ [mV]
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
t [ms]
Abb. 9:
Simulation der extrazellulären Spannung im Spalt bei unterschiedlicher
Verteilung der Ionenkanäle zwischen freier Membranfläche und der
Membranfläche im Kontaktbereich. (i) intrazellulärer Spannungverlauf
25
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Modellbildung
mit den unrsprünglichen Werten von Hodgkin und Huxley für das
Riesenaxon des Tintenfischs (Werte analog Abb. 6 ). Extrazellulärer
Spannungsverlauf bei: (ii) homogene Verteilung der Ionenkanäle über
die Membran µ J = 1 . (iii) vollständige Verarmung der Ionenkanäle im
Kontaktbereich µ J = 0 . (iv) Verarmung aller Kanäle im Kontaktbereich
auf 50% der freien Membranfläche µ J = 0, 5 . (v) Anreicherung aller
Kanäle im Kontaktbereich auf 200% µ J = 2 . Die Größe des Kontaktbereichs wurde im Verhältnis zur freien Membranfläche vernachlässigt
( β = 0 ), für den spezifischen Widerstand im Spalt wurde
2
g J = 700mS/cm eingesetzt.
2,0
(vi)
VJ [mV]
1,5
1,0
0,5
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
t [ms]
0,0
(vii)
VJ [mV]
-0,5
-1,0
-1,5
-2,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
t [ms]
Abb. 10: Partielle Verarmung/Anreicherung einzelner Ionenkanäle im Kontaktbereich der Membran. (vi) Verarmung der Na + Kanäle auf 50%, Anreicherung der K + -Kanäle auf 200%. (vii) Anreicherung der Na + -Kanäle auf
200%, Verarmung der K + -Kanäle auf 50%.
26
Lokale extrazelluläre Spannungen an der Zellmembran
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen
2.2.Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen
Die Langzeitregistrierung der elektrischen Aktivität einzelner Zellen in vitro ist nur
möglich, wenn das intrazelluläre Potential der Zelle ohne eine zerstörende Wirkung
gemessen werden kann. Alle etablierten Verfahren, bei denen die Messung des
Spannungsabfalls über die Membran mit einem Eingriff in die Zelle verbunden ist,
ermöglichen die Messung der zellulären Aktivität nur für einen kurzen Zeitraum. Die
mechanische Belastung der Zellmembran durch die Kontaktierung des intrazellulären Raums mittels Patch-Clamp Technik (Kap. 6.1) oder Mikroelektroden bzw. die
toxische Wirkung von Farbstoffen führen nach kurzer Zeit zu einer Zerstörung der
Zelle.
Langzeitmessungen an einzelnen Zellen können durch Messung von lokalen
extrazelluläre Spannungen durchgeführt werden, die bei elektrischer Aktivität der
Zelle in einem dünnen Spaltbereich zwischen der Zellmembran und einer Oberfläche entstehen. Die extrazellulären Spannungen an Zellmembranen können mit verschiedenen Messverfahren registriert werden.
2.2.1. Messungen mit Elektroden
Von W. Regehr [25], R.J.A. Wilson [26], W. Gross [24], J. Pine [23] und anderen
wurden Messungen der extrazellulären Spannungen mit planaren Elektroden unterschiedlicher Materialien durchgeführt. Die verwendeteten Elektroden sind dabei in
die Oberfläche integriert, auf der die Zellen aufliegen. Bei diesen Messungen
besteht ein ohmscher Kontakt zwischen dem Elektrolyten und dem Elektrodenmaterial im Spaltbereich. Fließt bei den Messungen ein ohmscher Gleichstromanteil
über die Elektroden, laufen an den Kontaktbereichen chemische Elektrolyse-Reaktionen ab, bei denen i.d.R. toxische Stoffe entstehen, so daß Langzeitregistrierungen in Zellkulturen nicht möglich sind.
Neben den Elektroden, bei denen ein ohmscher Kontakt besteht, können rein
kapazitive Elektroden verwendet werden. Durch eine dünne Isolationsschicht werden die Elektroden vom Elektrolyten isoliert, so daß bei Spannungsänderungen im
Spalt nur ein Verschiebungsstrom (Lade- bzw. Entladestrom) in den Elektroden verursacht wird.
2.2.2. Messungen mit Transistoren
Zur Impedanzwandlung und Verstärkung der kapazitiv eingekoppelten Signale
unmittelbar im Kontaktbereich, können mit den Verfahren der Halbleiter-Technologie Messanordnungen hergestellt werden, bei denen direkt unterhalb der Zelle
Transistoren in der Oberfläche integriert sind. Prinzipiell können bei diesem Verfahren Feld-Effekt-Transistoren oder Bipolar-Transistoren verwendet werden. P. Fromherz vom MPI Martinsried/München konnte erfolgreich mit Feld-Effekt-Transistoren
extrazelluläre Spannungsverläufe an Blutegelneuronen messen [21], wobei die
Gatekapazität als kapazitive Elektrode diente. Messungen mit Bipolar-Transistoren,
bei denen auf die extrinsische Basis eine kapazitive Elektrode aufgebracht wurde,
wurden von T. Kind an der TU-Berlin durchgeführt [29].
27
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Aufbau des Sensor-Chips
3. Messungen der lokalen extrazellulären
Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Zur Messung der lokalen extrazellulären Spannungen werden Feld-Effekt-Transistoren verwendet, die auf einem Sensor-Chip integriert sind. Der Chip (Cultus 1.1,
Abb. 11) wurden von T. Kind entworfen und in der Halbleiter-Technologie der TUBerlin hergestellt. Der Sensor-Chip wurde auch bei den Versuchsreihen von P.
Fromherz [8], [9] verwendet.
3.1.Aufbau des Sensor-Chips
Transistor-Array
Auf einem Chip sind insgesamt 64 Transistoren in 16 Reihen angeordnet. Die
Kanalgeometrie der Transistoren der verschiedenen Reihen unterscheidet sich in
den Weiten und Längen. Es werden damit zum einen unterschiedliche Verhältnisse
der Kanalweite zur Kanallänge und somit unterschiedliche Übertragungsleitwertfaktoren der Transistoren und zum anderen unterschiedliche absolute Größen der
Gatebereiche realisiert. Die Werte der W/L-Verhältnisse des Kanals variieren von
0,2 bis 6, die Größen der Gatebereiche von 2µmx1,8µm bis 40µmx40µm (Tab. 3).
Abb. 11: Array mit 64 Feld-Effekt-Transistoren ohne Gate-Metallisiering (EOSTransistoren). Der Chip hat eine Größe von 10mmx10mm und wurde
von T.Kind an der TU-Berlin entwickelt. In jeder Reihe sind 4 identische
Transistoren angeordnet, die Transistoren der unterschiedlichen Reihen
28
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Aufbau des Sensor-Chips
unterscheiden sich in den Kanalgeometrien. Für jeden Transistor ist
eine separate Drainzuleitung nach außen geführt, die Sourcezuleitungen sind für 4 bis 8 Transistoren zusammengefaßt.
Die Zuleitungen der Transistoren bestehen aus p + -leitendem, hochdotiertem Sili19
–3
zium (Bor, N A = 10 cm ) mit einem Schichtwiderstand von 15Ω/ , die durch eine
Siliziumdioxidschicht von etwa 500nm vom Elektrolyten isoliert sind. Für jeden
Transistor ist eine separate Drainzuleitung nach außen geführt. Die Sourcezuleitungen sind immer für die 4 Transistoren einer Reihe zusammengefaßt. Die Ausnahme
bilden dabei die mittleren Transistoren, bei denen die Sourcezuleitungen von
jeweils 8 Transistoren zusammengefaßt sind. Der außenliegende Transistor einer
Reihe besitzt zwei parallele Drainzuleitungen, um bei Messungen durch Parallelschaltung der Zuleitungen den Einfluß des Zuleitungswiderstands identifizieren zu
können. Die Reihen der Transistoren sind gemäß Abb. 11 nummeriert. Die Transistoren einer Reihe werden durch die Buchstaben von a bis d unterschieden, wobei
sie in der Reihenfolge von links nach rechts benannt sind.
Tab. 3: Kanalgeometrie der Transistoren in den verschiedenen Reihen. Die
Kanalgeometrie der Transistoren in einer Reihe unterschiedet sich nicht.
Reihe
1
2
3
4
5
6
7
8
Weite [µm]
8
12
6
4
4
4
8
2,0
Länge [µm]
2
2
2
2
2
3
3
1,8
Reihe
9
10
11
12
13
14
15
16
Weite [µm]
40
5
10
2,0
2,0
40
4
20
Länge [µm]
40
5
10
1,8
1,8
40
20
4
Der Chip ist in einen PGA-Sockel eingeklebt und die Zuleitungen der Transistoren
sind mit Bonddrähten mit den Sockelkontakten verbunden. Zur Aufnahme des Elektrolyten ist auf dem Chip eine Plexiglasschale mit einem Loch über dem TransistorArray mit Siliconkleber aufgeklebt.
50µm
8nm
500nm
15 Ω/
Source
Drain
30Ω/
15 Ω/
Bulk
Abb. 12: Schnitt durch einen EOS-Transistor (schematische Zeichnung). Über
dem Kanalbereich und den Drain- und Sourcediffusionen beträgt die
Oxiddicke 8nm.
EOS-Transistoren
Bei den Transistoren handelt es sich um p-Kanal-Feld-Effekt-Transistoren, die
keine Gate-Metallisierung besitzen (Electrolyte-Oxide-Semiconductor-Transistor).
Das Gate wird durch den Elektrolyten gebildet, der den gesamten Chip überdeckt.
Der Elektrolyt wird vom Kanalbereich durch eine 8nm dicke Siliziumdioxidschicht
isoliert. Der Vorteil von p-Kanal-Transistoren liegt im Vergleich zu n-Kanal-Transistoren darin, daß Defekte und Risse im dünnen Gateoxid durch anodische Oxidation wieder zuwachsen können und somit Kurzschlüsse zum Elektrolyten vermieden
werden. Die Drain- und Sourcegebiete werden durch hochdotierte Bereiche mit
einem Schichtwiderstand von 30Ω/ gebildet. Die dünnen Oxidfensteröffnung (8nm
29
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Aufbau des Sensor-Chips
Oxiddicke) hat bei den Transistoren-Reihen 5 und 13 nur die Ausmaße des Kanalbereichs, bei allen anderen Transistoren ist das Oxid auch über den hochdotierten
Drain- und Soucegebieten auf 8nm gedünnt. Die unterschiedliche Oberflächentopographie kann den Kontakt der Zelle mit der Oberfläche und somit die Spaltbreite
beeinflussen.
Abb. 13: Aufsicht auf einen EOS-Transistor mit kleinem Oxidfenster (links) und
großem Oxidfenster (rechts). Das dicke Oxid (500nm) ist durch die
vertikale Schraffur dargestellt.
Verschaltung der
Transistoren
Das gesamte Bulk von allen Transistoren liegt immer auf dem gewählten SourcePotential. Mit einem Multiplexer kann jeweils ein Transistor eingeschaltet werden.
Bei den anderen ausgeschalteten Transistoren können entweder die Source- und
Drain-Anschlüsse auf Masse-Potential gelegt werden oder die Zuleitungen werden
hochohmig geschaltet. Werden die Zuleitungen der ausgeschalteten Transistoren
auf Masse gelegt, sperren zwar die Source-Bulk- und Drain-Bulk-Dioden, es hat
sich aber gezeigt, daß in diesem Fall ein nicht zu vernachlässigender Sperrstrom
zwischen Bulk und Masse fließt. Wird ein Transistor eingeschaltet, werden die
Zuleitungen gemäß Abb. 14 verbunden.
U SG
Zelle
S
U DS
Bad
D
U DG
+
Oszilloskop
IU-Umsetzer
(Transimpedanzverstärker)
Abb. 14: Verschaltung der p-Kanal-Transistoren: Das Bad liegt auf MassePotential. Die lokale extrazelluläre Spannung, die im Spalt zwischen
Transistor und Zellmembran bei Potentialänderungen innerhalb der
Zelle entsteht, überlagert sich dem Badpotential als Kleinsignalanteil.
Mit den beiden Spannungsquellen läßt sich die Drain-Source- und die
Gate-Source-Spannung einstellen. Der Transimpedanzverstärker setzt
den Kleinsignalanteil des Drain-Source-Stroms in eine Spannung um
und verstärkt dieses Signal.
Das Bad wird durch eine Silber-Chlorid-Elektrode auf konstantem Masse-Potential gehalten. Der Kontaktwiderstand zwischen Elektrode und Bad beträgt bei der
verwendeten Elekrode etwa 2,5KΩ. Der Widerstand ist abhängig von der Oberfläche der Elektrode, die mit dem Elektrolyten in Kontakt steht. Die extrazelluläre
Lösung Anhang v hat eine spezifischen Leitfähigkeit von 15,8mS/cm, so daß der
Widerstand vernachlässigt werden kann. Die lokale extrazelluläre Spannung im
30
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Arbeitspunkt der Transistoren
Spalt V J zwischen Zelle und Gatebereich des Transistors entsteht durch den Spannungsabfall am Abdichtwiderstand (siehe Abb. 8: spezifischer Abdichtleitwert g J )
zwischen der Zellmbran und der Substratoberfläche. Die lokale extrazelluläre Spannung bezieht sich somit auf das Badpotential (Masse-Potential) und überlagert sich
diesem Potential als Kleinsignalanteil. Der Drain-Anschluß wird durch einen StromSpannungs-Umsetzer (Transimpedanzverstärker) auf dem virtuellen festen Potential der Spannungsquelle U DG gehalten.
Bei diesem Aufbau ist das Bad (Elektrolyt), das dem Gate der Transistoren entspricht, auf Masse-Potential gelegt. Diese ungewöhnliche Beschaltung ist notwendig, da das Bad mit einem Elektrolyten-Zu- und -Abfluß verbunden ist, der nur auf
Masse-Potential liegen kann.
3.2.Arbeitspunkt der Transistoren
Großsignalbereich
Bei den Transistoren handelt es sich um p-Kanal-Transistoren, so daß sie zu leiten beginnen, wenn der Source-Anschluß auf einem höheren Potential liegt als der
Gate- und Drain-Anschluß. Da das Gate (Bad) auf Masse-Potential liegt, muß an
dem Source-Anschluß gegenüber Masse eine positive Spannung angelegt werden.
Wird der Drain-Anschluß über den Operationsverstärker auch auf einem virtuellen
Masse-Potential gehalten ( U DG = 0 ), befindet sich der Transistor mit U SG = U SD im
Sättigungsbereich. Der Arbeitspunkt der Transistoren kann in den Triodenbereich
wandern, wenn auch der Drain-Anschluß auf ein positiveres Potential gegenüber
Masse angehoben wird.
Bei den durchgeführten Messungen wurde zur Vereinfachung ein Arbeitspunkt bei
U SG = U SD gewählt, da in diesem Fall der Drain-Anschluß auf virtuellem MassePotential liegt und die Spannungsquelle U DG wegfällt.
Der Arbeitspunkt des Transistors kann mit den Spannungsquellen U SG und U DG
eingestellt werden. Die Transistoren befinden sich im Sperrbereich für:
U GS > U TH mit U TH < 0 bzw.
(49)
U SG < U TH .
(50)
Für den Triodenbereich gilt:
U GS < U TH und U DS > U GS – U TH bzw.
(51)
U SG > U TH und U DG > – U TH mit U DS = U DG – U SG .
(52)
Für den Sättigungsbereich gilt:
U GS < U TH und U DS < U GS – U TH bzw.
(53)
U SG > U TH und U DG < – U TH .
(54)
Für den Drain-Source-Strom I DS im Großsignalbereich gelten die bekannten
Zusammenhänge:
31
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Kleinsignalersatzschaltbild
U DS
I DS = – β  UGS – U TH – --------- U

2  DS
2
β
I DS = – --- ( U GS – U TH )
2
(Triodenbereich)
(55)
(Sättigungsbereich)
(56)
W
β = K p ----L
(57)
K p wird als Übertragungsleitwertparameter bezeichnet und ist eine transistorspezifische Kenngröße, W gibt die Weite und L die Länge des Kanalbereichs an.
Die Änderung des Drain-Source-Stroms I DS bei einer konstanten Drain-SourceSpannung U DS in Abhängigkeit von der Gate-Source-Spannung U GS ergibt sich aus
der Ableitung der Gl.(55) und (56) nach U GS .
∂I DS
------------∂U GS
∂I DS
------------∂U GS
= – βUDS
(Triodenbereich)
(58)
= – β ( U GS – U TH )
(Sättigungsbereich)
(59)
U DS = const
U DS = const
Im Triodenbereich liegt eine lineare Abhängigkeit zwischen der Gate-SourceSpannung U GS und dem Drain-Source-Strom I DS vor, während im Sättigungsbereich
eine nicht lineare Beziehung besteht.
Kleinsignalbereich
Im kleinen Aussteuerungsbereich können jedoch für einen festen Arbeitspunkt
( U GS = U GSArb , U DS = U DSArb ) die Kennliniengleichungen linearisiert werden. Für
den Übertragungsleitwert g m , der die Änderung des Drain-Source-Stroms bei einer
differentiellen Änderung der Spannung am Gate beschreibt, folgen analog der
Gl.(58) und (59) für den Trioden- bzw. Sättigungsbereich die Gl.(61) und (62).
∂I DS
g m = ------------∂U GS
(60)
U GS = U GSArb, U DS = U DSArb
g m = – β U DSArb
(Triodenbereich)
(61)
g m = – β ( UGSArb – U TH )
(Sättigungsbereich)
(62)
Zur Realisierung einer hohen Kleinsignalverstärkung sollten die Transistoren in
einem Arbeitspunkt mit einem möglichst großen Übertragungsleitwert g m betrieben
werden. Bei der Messung von Spannungsänderungen am Gate, deren Amplitude
kleiner als 1mV ist, kann die Kleinsignallinearisierung durchgeführt werden. Es
spielt somit keine Rolle, ob der Arbeitspunkt im Trioden- oder Sättigungsbereich
liegt. Bei den durchgeführten Messungen wurde für den Arbeitspunkt
U SG = U SD = +2,5V gewählt.
3.3.Kleinsignalersatzschaltbild
Das Kleinsignalverhalten der Transistoren kann durch das Kleinsignalersatzschaltbild der Abb. 15 beschrieben werden. Die Transistoren befinden sich in
Sourceschaltung, d.h. Bulk- und Sourceanschluß sind miteinander verbunden, so
daß die Gate-Source-Kapazität C GS und Gate-Bulk-Kapazitäten C GB zusammengefaßt werden können. Der Drain-Source-Strom wird durch eine spannungsgesteuerte
Stromquelle mit dem Übertragungsleitwert g m und der Ausgangsleitwert g d durch
32
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Kleinsignalersatzschaltbild
einen parallelgeschalteten Widerstand dargestellt. Die Drain-Bulk-Kapazität C DB
wird durch die Diffusionskapazität zwischen dem Drain-Gebiet sowie der diffundierten Drainzuleitung und dem Bulk gebildet.
Zelle
C ZS
C GS
S'
G
C ZD
C GD
S
D'
D
RS
gd
C DB
RD
Abb. 15: Schematisch Darstellung des Kleinsignalersatzschaltbilds im Schnitt
durch den Kanal eines EOS-Transistors. Die Drain- und SourceAnschlüsse liegen auf festem Potential, der Drain-Source-Strom kann
mit einen IU-Umsetzer gemessen werden.
Die Zuleitungswiderstände sind für Drain und Source mit R D und R S berücksichtigt. Zwischen den Zuleitungen und dem Elektrolyten mit festem Potential bilden
sich über die isolierende Siliziumdioxidschicht (500nm) die Zuleitungskapazitäten
C ZD und C ZS aus. Die Source- und Drain-Knoten direkt am Kanalgebiet werden mit
S und D bezeichnet, die Source- und Drain-Anschlüsse mit Berücksichtigung der
Zuleitungskapazitäten und Zuleitungswiderstände sind mit S’ und D’ benannt. Die
Source- und Drain-Anschlüsse liegen jeweils auf festem Potential. Der DrainSoure-Strom i D ist aber dennoch durch den IU-Umsetzer meßbar (Abb. 14).
u GD
G
D
iD
C GD
u GS
u DS
C GS +C GB
gd
g m u GS
C DB
S
Abb. 16: Kleinsignalersatzschaltbild für die EOS-Transistoren ohne Berücksichtigung der Zuleitungswiderstände und Zuleitungskapazitäten.
Zur Vereinfachung der Kleinsignalschaltung bleiben zunächst die Zuleitungswiderstände unberücksichtigt. In diesem Fall entspricht die lokale extrazelluläre
Spannung im Spalt v J der Spannung u GS zwischen Gate und Source des Transistors. Im Kleinsignalbereich führt eine Modulation von u GS zu einer linearen Modulation des Drain-Source-Stroms i D , die mit einem Transimpedanzverstärker (Abb.
14) in eine Spannung umgesetzt wird. Werden die Zuleitungswiderstände nicht
berücksichtigt, liegt der Drain- und Source-Knoten (D und S) auf festem Potential
(Abb. 16) und es gilt im Kleinsignalersatzschaltbild u DS = 0 . Aus dem Kirchhoffschen-Gesetz folgt für den Drainknoten die Übertragungsfunktion Z ( jω ) .
iD
Z ( jω ) = --------- = g m – jωCGD
u GS
(63)
33
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Kleinsignalersatzschaltbild
Es wird deutlich, daß mit steigender Frequenz die Gate-Drain-Kapazität den
Übertragungsleitwert dämpft.
u GD
G
u RD
C ZD
D
C GD
uJ
u GS
u DS
C GS +C GB
gd
RD
D'
RS
S'
iD
g m u GS
C DB
S
C ZS
u RS
Abb. 17: Kleinsignalersatzschaltbild der EOS Transistoren mit Zuleitungswiderständen R D , R S und der Zuleitungskapazitäten C ZD , C ZS. Die Zuleitungskapazitäten spielen aufgrund der langen Zuleitungen und der
dünnen Oxidschicht (500nm) eine wichtige Rolle.
Die Zuleitungswiderstände R D und R S der verwendeten Transistoren liegen
jeweils bei etwa 1KΩ und die Zuleitungskapazitäten C ZD und C ZS in der Größenordnung von 500pF (Kap. 5). Werden sie im Kleinsignalersatzschaltbild berücksichtigt,
folgt für den Drain-Knoten (D) die Gl.(64).
1
g m u GS + u RD  ------- + jωCZD + u DS ( g d + jωC DB ) – u GD jωC GD = 0
RD
(64)
Die Drain-Source-Spannung U DS fällt über die Zuleitungswiderstände R D und R S
ab und die Gate-Source-Spannung U GS setzt sich aus der Gate-Drain- und der
Drain-Source-Spannung zusammen.
u DS = u RD – u RS
(65)
u GS = u GD + u DS
(66)
Für den Strom i D , der im IU-Umsetzer in eine Spannung umgesetzt wird gilt:
u RD = – iD R D .
(67)
Mit der Gleichung für den Masseknoten Gl.(68) folgt mit Gl.(67) für den Spannungsabfall am Sourcezuleitungswiderstand R S und Gl.(66) die Gl.(69).
1
i D – u RD jωC ZD – u RS  ------ + jωCZS + u GD jωC GD + u GS jωC GS = 0
R

(68)
R S + jωRS R D ( C ZD + CGD )
jωR S ( CGD + CGS )
u RS = id ----------------------------------------------------------------- + u GS ----------------------------------------------------1 + jωRS ( C ZS + CGD )
1 + jωRS ( C ZS + C GD )
(69)
S
Aus Gl.(64), Gl.(65), Gl.(67) und Gl.(69) folgt die Übertragungsfunktion Z R ( jω ) .
34
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Rauschen von Feld-Effekt-Transistoren
id
g m + jω [ R S g d ( CGD + CGS ) + R S g m ( C ZS + CGD ) – C GD ]
Z R ( jω ) = --------- = ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------...
u GS
1 + g d ( R S + R D ) + jω[R S ( C ZS + C DB + 2C GD ) + R D ( C ZD + C DB + C GD )
2
+ω R S [ C GD ( C ZS + C GD ) + ( C GD + CGS ) ( C DB + CGD ) ]
- ...
... ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------2
+R S RD g d ( C ZS + C ZD + 2C GD )] + ω [R S R D ( C ZS + C GD ) ( CZD + C DB + CGD )
(70)
... ---------------------------------------------------------------------– ( C ZD + CGD ) ( C DB + CGD )
Die lokale extrazelluläre Spannung im Spalt u J bezieht sich nun auf das feste
Masse-Potential und nicht auf den Source-Knoten (S), so daß sich der Zusammenhang der Gl.(71) ergibt.
id
u J = u GS + u RS = ----------------- + u RS
Z R ( jω )
(71)
Mit Gl.(69) kann nun die Übertragungsfunktion zwischen dem Drain-Strom id und
der lokalen extrazellulären Spannung im Spalt u J aufgestellt werden. Auf die explizite Darstellung der Übertragungsfunktion soll hier verzichtet werden. In Kap.5 wird
eine numerische Simulation des Frequenzverhaltens der Transistoren durchgeführt.
3.4.Rauschen von Feld-Effekt-Transistoren
Das Rauschen der Transistoren spielt bei kleinen Aussteuerungen der GateSource-Spannung eine sehr wichtige Rolle und begrenzt die Meßbarkeit von kleinen Signalen. Nähere Untersuchungen über das Rauschen der entwickelten EOSTransistoren werden in der Diplomarbeit von D.Kim [30] durchgeführt. Dabei wird
auch untersucht, ob der Elektrolyt, der das Gate der Transistoren bildet, einen
besonderen Einfluß auf das Rauschverhalten hat.
thermisches Rauschen
Bei MOS-Feld-Effekt-Transistoren wird das Rauschen hauptsächlich durch das
thermische Rauschen der Bahnwiderstände (Zuleitungswiderstände) und des
Kanals bestimmt.
C GD
G
C ZD
D
D'
RD
S V,RD (f)
RS
S V,RS (f)
g m U GS
uJ
gd
C GS +C GB
S i(f)
C DB
S'
S
C ZS
Abb. 18: Rauschersatzschaltbild des Feld-Effekt-Transistors. Das thermische
Rauschen des Kanals wird durch die Rauschstromquelle mit der
Spektralfunktion S i (f) und das thermische Rauschen der Bahnwiderstände durch zwei Rauschspannungsquellen mit den Spektralfunktionen S V,RD (f) und S V,RS (f) berücksichtigt.
An jedem elektrischen Leiter mit dem Widerstand R kann eine thermische
Rauschspannung und als Folge davon ein Rauschstrom gemessen werden. Das
thermische Rauschen wird auch als Nyquist, Johnson- oder weißes Rauschen
35
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Rauschen von Feld-Effekt-Transistoren
bezeichnet. Die Ursache dieses Rauschens ist die statistische Bewegung der
Ladungsträger im Leiter. Die thermische Rauschspannung kann mit der Spektralfunktion
2
S v ( f ) = 4kTR
(72)
– 23
beschrieben werden, wobei k = 1, 38066 ⋅ 10 J/K die Boltzmann-Konstante und T
2
den Wert der absoluten Temperatur bezeichnet. S v ( f ) gibt das mittlere Rausch2
spannungsquadrat je Hertz Bandbreite an (Einheit: V Hz ). Der Effektivwert V r der
Rauschspannung mit den Frequenzanteilen im Intervall [ f, f + ∆f ] (Bandbreite B) ist
dementsprechend:
Vr =
2
vr =
f + ∆f 2
Sv ( f ) df
∫f
2
S v ( f )B .
=
(73)
Ein Widerstand von 1kΩ erzeugt bei Raumtemperatur auf einer Bandbreite von
10kHz eine effektive Rauschspannung von Vr = 400nV .
Das Rauschen eines ohmschen Widerstands kann entweder durch eine Reihenschaltung von einem rauschfreien Widerstand und einer Rauschspannungsquelle
2
mit der Spektralfunktion S v ( f ) oder einer Parallelschaltung eines rauschfreien
2
Widerstands mit einer Rauschstromquelle mit der Spektralfunktion S i ( f ) dargestellt
werden.
2
S i ( f ) = 4kT
--------R
(74)
2
2
S i ( f ) hat die Einheit A /Hz für den Effektivwert I r des Rauschstroms folgt analog
die Gl.(75).
Ir =
2
ir =
f + ∆f 2
S i ( f ) df
∫f
2
S i ( f )B
=
(75)
S v(f)
S i(f)
R
R
Abb. 19: Ersatzschaltbilder zur Modellierung des Rauschverhaltens eines
ohmschen Widerstands. Das Rauschverhalten kann entweder durch
Reihenschaltung eines rauschfreien Widerstands mit einer Rauschspannungsquelle (links) oder durch Parallelschaltung eines rauschfreien
Widerstands mit einer Rauschstromquelle (rechts) dargestellt werden.
2
2
Die Spektralfunktionen S v ( f ) und S i ( f ) für das thermische Rauschen sind unabhängig von der Frequenz f. Da alle Spektralanteile im gleichen Maße zum Rauschen beitragen, wird das thermische Rauschen auch als „weißes Rauschen“
bezeichnet.
Bahnwiderstände
Im Ersatzschaltbild der Abb. 18 wird das thermische Rauschen der Bahnwiderstände durch zwei Rauschspannungquellen mit den Spektralfunktionen
36
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Rauschen von Feld-Effekt-Transistoren
2
2
S V, RD ( f ) = 4kTR D und S V, RS ( f ) = 4kTR S
(76)
erfaßt. Abschätzungen und Messungen (Kap. 5.1) haben ergeben, daß auf dem
verwendeten Sensor-Chip die Drain-Zuleitungswiderstände zu den Transistoren
maximal RD = 1kΩ und die Source-Zuleitungswiderstände maximal RS = 0, 2kΩ
betragen. Die Spektralfunktion der thermische Rauschspannung für den DrainZuleitungswiderstand hat bei Zimmertemperatur ( T = 300K ) somit den Wert:
2
– 17 2
S V, RD ( f ) = 4kTR D = 1, 6 ×10
V Hz .
(77)
Für die äquivalente Rauschstromquelle gilt:
2
2
– 23 A
4kT
S i, RD ( f ) = --------- = 1, 6 ×10 ------- .
RD
Hz
Kanal
(78)
Das thermische Rauschen des stromführenden Kanals wird durch Parallelschal2
tung einer Rauschstromquelle S i ( f ) berücksichtigt. Die Spektralfunktion für das
Rauschen des Kanals gleicht der Spektralfunktion einer Rauschstromquelle für das
thermische Rauschen eines Widerstandes, wobei G dem ohmschen Leitwert des
Kanals entspricht.
2
S i ( f ) = 4kTG
(79)
Bei sehr kleinen Spannungen U DS - solange die Kanaleinschnürung vernachlässigbar klein ist - gilt für den ohmschen Leitwert des Kanals:
----- Q' n .
G = µs W
L
(80)
µ s ist die Beweglichkeit der Ladungsträger und Q' n die Flächenladungsdichte im
Kanal. Mit zunehmender Kanaleinschnürung wird die Beweglichkeit µ s und die Flächenladungsdichte Q' n im Kanal ortsabhängig und es muß ein Mittelwert für den
ohmschen Leitwert verwendet werden. Nach umfangreichen Rechnungen [5] folgt
für die Spektralfunktion der Rauschstromquelle im Triodenbereich des Transistors
die Gl.(81).
2
2
α x U DS
α x UDS
2
S i ( f ) = 4kTβ U GS – U TH – ---------------- + -----------------------------------------------------------------12 ( U GS – U TH – α x U DS /2 )
2
W
γ
mit β = µ s c' ox ----- und α x = 1 + ---------------------------- .
L
2 Φ–U
(81)
(82)
BS
γ ist der Substratstreufaktor und Φ das Oberflächenpotential beim Einsatz starker Inversion. Im Sättigungsbereich gilt:
2
S i ( f ) = 4kT 2--- β ( UGS – U TH ) = 4 2--- kTg m .
3
3
(83)
2
Das thermische Rauschen des Kanals S i ( f ) im Sättigungsbereich ist proportional
zum Übertragungsleitwert g m , so daß der Effektivwert des thermischen Rauschstromanteils I r proportional zu g m ist. Ein höherer Arbeitspunkt und somit ein
37
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Rauschen von Feld-Effekt-Transistoren
höherer Übertragungsleitwert g m verbessert also das Verhältnis zwischen dem
Effektivwert des Signals und dem Effektivwert des thermischen Rauschstroms.
Bei den durchgeführten Messungen wurden die Transistoren im Sättigungsbereich betrieben. Im gewählten Arbeitspunkt liegt bei den Messungen der Übertrag u n g s l e i t w e r t i n d e r G r ö ß e n o r d n u n g v o n g m = 100µS ( K a p . 5 . 1 ) . F ü r d a s
thermische Rauschen des Kanals folgt nach Gl. (83):
2
2
– 24 A
2
S i ( f ) = 4 --- kTg m = 1, 1 ×10 ------- .
3
Hz
Schrotrauschen
(84)
Der Ladungstransport über pn-Übergänge ist nicht kontinuierlich sondern erfolgt
in Einheiten der Elementarladung e . Das Rauschen, das durch den gequantelten
Ladungstransport verursacht wird, bezeichnet man als Schrotrauschen. Für kleine
Frequenzen ( f « 1/t f ) 1 ist das Schrotrauschen näherungsweise frequenzunabhängig.
2
S i ( f ) ≈ 2eI
(85)
Im eingestellten Arbeitspunkt der Transistoren fließt ein Strom in der Größenordnung von I = 100µA . Für das Schrotrauschen ergibt sich für die Spektralfunktion
der Wert
2
S i ( f ) ≈ 2eI ≈ 3, 2 ×10
– 23 A
2
------- .
Hz
(86)
Für den Effektivwert des Rauschstroms im Frequenzintervall ∆f gilt entsprechend
Gl.(75):
Ir =
2
ir =
2eI ∆f
(87)
Mit steigendem Drain-Source-Strom I steigt der Effektivwert des Rauschstroms
I r nur mit der Wurzel an, so daß bezüglich des Schrotrauschens ein hoher Arbeitspunkt des Transistors sinnvoll erscheint.
1/f-Rauschen
Das 1/f-Rauschen dominiert das Rauschverhalten in Bereichen niedriger Frequenzen, während das thermische Rauschen und das Schrotrauschen erst bei steigenden Frequenzen immer mehr an Bedeutung gewinnt. Das 1/f-Rauschen wird
durch die Generation und Rekombination von Ladungsträgern in Sperrschichten
und durch Schwankungen der Oxidladungen hervorgerufen. Die Spektralfunktion
wird durch Gl.(88) beschrieben, wobei K F und AF experimentell zu bestimmende
Parameter sind und I/A die Stromdichte durch die Raumladungszone beschreibt.
2
I
S i ( f ) =  ---
 A
AF K
------Ff
(88)
Die Größenordnung des 1/f-Rauschens der verwendeten Transistoren kann vorläufig nicht abgeschätzt werden, da keine Werte für die Faktoren K F und A F vorliegen. Aufschluß darüber kann erst eine Rauschmessung der Transistoren erbringen.
Das thermische Rauschen der Bahnwiderstände und das Schrotrauschen des pnÜbergangs liegen etwa eine Größenordnung über dem Rauschen des Kanals. Auf
1
Die Größe tf bezeichnet die Zeit, die die Ladungsträger zum Durchlaufen der Sperrschicht benötigen. t f
liegt im allgemeinen in der Größenordnung von Pikosekunden.
38
Messungen der lokalen extrazellulären Spannung mit Feld-Effekt-Transistoren
Rauschen von Feld-Effekt-Transistoren
e i n e r B a n d b r e i t e v o n B = 10kHz e r g i b t s i c h b e i e i n e r S p e k t r a l f u n k t i o n v o n
2
– 23 2
S i ( f ) = 5 ×10 A /Hz ein Effektivwert des Rauschstroms von
Ir =
2
S i ( f )B = 0, 7nA .
(89)
Es wird bei den Messungen erwartet, daß der Ablauf eines Aktionspotentials über
dem Gate-Bereich der Transistoren eine Spannungsänderung in der Größenordnung von 0,1mV hervorruft. Bei dem vorgesehenen Arbeitspunkt führt diese Spannungsänderung zu einer Änderung des Drain-Source-Stroms unter 10nA. Ein
Effektivwert des Rauschstroms von I r = 0, 7nA kann die Messergebnisse deutlich
beeinträchtigen.
39
Strom-Spannungs-Umsetzer
Dynamisches Verhalten des IU-Umsetzers
4. Strom-Spannungs-Umsetzer
Eine Änderung der Spannung im Elektrolyten über dem Gateoxid der EOS-Transistoren führt bei einem fest eingestellten Arbeitspunkt zu einer Modulation des
Drain-Source-Stroms (Gl.(55) bzw. Gl.(56)). Gemäß der Meßanordnung in Abb. 14
bedeutet eine Änderung der lokalen extrazellulären Spannung eine Änderung der
Gate-Source-Spannung. Die lokale extrazelluläre Spannung im Gate-Bereich der
Transistoren liegt günstigstenfalls in der Größenordnung von 0,1mV (Abb. 9), so
daß sich die Modulation des Drain-Source-Stroms bei einem Übertragungsleitwert
v o n g m = 100µS ( T r a n s i s t o r 3 ) i m A r b e i t s p u n k t U DS = U GS = 2, 5V u n t e r 1 0 n A
abspielt. In diesem Arbeitspunkt fließt ein Drain-Source-Strom von etwa
I DS = 100µA . Zur Messung der Modulation des Drain-Source-Stroms muß aus dem
gesamten Strom der Kleinsignalanteil herausgefiltert und in eine Spannung umgesetzt werden.
Transimpedanzverstärker
Ein Strom-Spannungs-Umsetzer wird auch als Transimpedanzverstärker bezeichnet und entspricht einer stromgesteuerten Spannungsquelle mit einer Übertragungsfunktion Z c . Im Idealfall hat die Übertragungsfunktion keinen Imaginärteil, so
daß die Bandbreite unendlich groß ist. Der Eingangs- und Ausgangswiderstand des
Verstärkers ist idealerweise unendlich klein.
ii
Ra
Ri
Z c ii
Abb. 20: Strom-Spannungs-Umsetzer (Transimpedanzverstärker) mit der
Übertragungsfunktion Z c , dem Eingangswiderstand Ri und dem
Ausgangswiderstand R a . Im Idealfall hat Z c keinen Imaginärteil und
Eingangs- sowie Ausgangswiderstand sind Null.
Bei einem realen Strom-Spannungs-Umsetzer können diese Anforderungen nur in
einer beschränkten Bandbreite ausreichend erfüllt werden. Mit zunehmenden Frequenzen spielen parasitäre Kapazitäten eine immer wichtigere Rolle und verschlechtern die dynamischen Eigenschaften des Umsetzers. Das Eingangssignal
wird an mehreren Stellen mit Rauschsignalen überlagert.
Im folgenden wird zunächst in Kap. 4.1 das dynamische Verhalten des beschalteten Operationsverstärkers beschrieben, der als Strom-Spannungs-Umsetzer verwendet wird. Kap. 4.2 führt anschließend in die Grundlagen zur Berechnung des
Rauschverhaltens von Operationsverstärkern ein. In Kap. 4.3 werden schließlich
mehrere Möglichkeiten dargestellt, um den Kleinsignalanteil von dem gesamten
Signal zu trennen und es wird das Rauschverhalten der verschiedenen Schaltungsvarianten untersucht.
4.1.Dynamisches Verhalten des IU-Umsetzers
Am Ausgang eines Operationsverstärkers stellt sich eine Spannung ein, die durch
die Differenz der Eingangsspannungen am nichtinvertierenden und invertierenden
Eingang des Operationsverstärkers bestimmt wird.
40
Strom-Spannungs-Umsetzer
Dynamisches Verhalten des IU-Umsetzers
u out = Ad ( U + – U - )
(90)
A d ist die Leerlaufverstärkung (Open-Loop-Gain) und liegt normalerweise bei
Werten zwischen 10 3 und 10 6 . Die Ausgangsspannung u out folgt jedoch nur mit
einer Zeitverzögerung der Eingangsspannungsdifferenz. Dieses Verhalten wird
durch das Gain-Bandwidth-Product fA bzw. ω A eines Operationsverstärkers charakterisiert.
du out
------------- = ω A ( U + – U - )
dt
(91)
ω A = 2πf A
(92)
Die Abb. 21 zeigt einen Operationsverstärker, der mit dem Rückkopplungswiderstand Rf beschaltet ist. C f stellt die Rückkopplungskapazität dar, die sich aus der
Summe der parasitären Kapazität des Rückkopplungswiderstandes 2 und einer parallel geschalteten Kapazität ergibt. Durch Vergrößerung der Kapazität im Rückkopplungszweig kann die Stabilität des Operationsverstärkers erhöht und die
Bandbreite eingeschränkt werden. C in ist die parasitäre Eingangskapazität, in der
alle Kapazitäten am Eingang des Verstärkers zusammengefaßt sind 3 .
uf
Cf
iin
Rf
(1)
+
u in
C in
u out
Abb. 21: Operationsverstärker als IU-Umsetzer mit dem Rückkopplungswiderstand Rf , der Rückkopplungskapazität C f und der parasitären Eingangskapazität C in . Die Rückkopplungskapazität C f ist zum Teil als
parasitäre Kapazität im Widerstand R f enthalten, eine zusätzliche
Kapazität C f erhöht die Stabilität der Schaltung.
Bei kleinen Frequenzen stellt sich am Operationsverstärker die Ausgangsspannung u out so ein, daß die Eingangsspannungsdifferenz u in Null wird und der Eingangsstrom i in über den Rückkopplungswiderstand R f abfließt. Durch die Größe
von R f wird der Skalierungsfaktor zwischen Strom und resultierender Spannung
bestimmt. Die Eingangsströme in den Operationsverstärken liegen bei Operationsverstärkern mit Feld-Effekt-Transistoren an den Eingängen in der Größenordnung
von 10 -14 A und können vernachlässigt werden.
Die Übertragungsfunktion Z c des IU-Umsetzers läßt sich im Frequenzbereich aus
der Summe der Ströme im Knoten (1) der Abb. 21 berechnen (Gl.(94)). Dabei
bestimmt das Gain-Bandwidth-Product fA des Operationsverstärkers gemäß Gl.(93)
2
Die parasitären Kapazitäten des Rückkopplungswiderstandes spielen bei sehr hohen Widerständen
eine immer wichtigere Rolle.
3
Die Eingangskapazität bei den verwendeten EOS-Transistoren wird durch die sehr hohe Zuleitungskapazität bestimmt, sie liegen in der Größenordnung von 100pF.
41
Strom-Spannungs-Umsetzer
Dynamisches Verhalten des IU-Umsetzers
den Zusammenhang zwischen Ausgangsspannung u out und der Differenzspannung
u in am Eingang des Operationsverstärkers.
1 - u mit τ = -----1- = ----------1 und s = jω .
u out = – ------A
sτ A in
ωA
2πf A
(93)
1
iin – u in sC in + u f  ----- + sC f = 0
Rf
(94)
Als Übertragungsfunktion Z c des IU-Umsetzers folgt:
u out
Rf
Z c ( s ) = --------= ------------------------------------------------------------- = Rf T ( s ) mit
2
i in
τ A Rf C t s + ( τ A + τ f )s + 1
(95)
u in = u out – u f , C t = Cin + C f und τ f = R f C f .
(96)
T ( s ) ist eine dimensionslose Übertragungsfunktion und kann mit zwei in Reihe
–1
–1
geschalteten Tiefpaßfiltern mit den Eckfrequenzen f 1 = ( 2πτ 1 ) und f 2 = ( 2πτ 2 )
verglichen werden.
1
T ( s ) = -------------------------------------------( τ1 s + 1 ) ( τ 2 s + 1 )
(97)
Ist τ A « τ f , so sind für die Eckfrequenzen folgende Näherungen gültig:
τ1 ≅ τf
(98)
C
τ 2 ≅ -----t τ A
Cf
(99)
ξ=0,2
ξ=0,5
1
ξ=1
ξ=5
relative Amplitude
f1
0,1
ξ=10
0,01
1E-3
100
f2
1k
10k
100k
Frequenz [Hz]
1M
10M
42
Strom-Spannungs-Umsetzer
Dynamisches Verhalten des IU-Umsetzers
Abb. 22: Amplitudenfrequenzgang eines gemäß Abb. 21 beschalteten Operationsverstärkers mit einem Rückkopplungswiderstand von R f = 1MΩ und
einer Eingangskapazität von C in = 100pF für unterschiedliche Werte
der Dämpfungskonstanten ζ . Das Gain-Bandwidth Product des Operationsverstärkers (AD745) beträgt fA = 20MHz ( τ A = 8ns ), die Zeitkonstante τ 0 beträgt τ 0 = 0, 9µs .
Zur Verbesserung der Frequenzantwort des IU-Umsetzers kann nun versucht
werden, die Knickfrequenz f 1 zu vergrößern bzw. die Zeitkonstante des Rückkopplungszweigs τ f zu verkleinern. Dies kann durch eine Verkleinerung der Rückkopplungskapazität C f erreicht werden, wobei aber gemäß Gl.(99) die Zeitkonstante τ 2
vergrößert wird und sich die zweite Knickfrequenz f 2 zu kleineren Frequenzen verschiebt. Liegen die beiden Zeitkonstanten τ 1 und τ 2 in vergleichbaren Größenordnungen, ist die Näherung der Gl.(98) und (99) nicht mehr anwendbar und es muß
für die Übertragungsfunktion T ( s ) die Gleichung für einen gedämpften harmonischen Oszillator angesetzt werden.
1
T ( s ) = ---------------------------------------2 2
τ 0 s + 2ζτ0 s + 1
(100)
Die Parameter τ 0 und ξ können durch einen Koeffizientenvergleich mit Gl.(95)
bestimmt werden. ξ ist die Dämpfungskonstante eines harmonischen Oszillators.
τ0 =
τA Rf Ct
τA + τf
ζ = 1--- --------------2 τ0
(101)
(102)
Wird die Kapazität im Rückkopplungszweig C f unter einen bestimmten Punkt verkleinert, erhöht sich die Bandbreite des IU-Umsetzers nicht mehr. Es tritt vielmehr
ein Resonanzfall ein ( ζ « 1 ). Abb. 23 zeigt die Sprungantwort des IU-Umsetzers bei
verschiedenen Dämpfungskonstanten ξ .
43
Strom-Spannungs-Umsetzer
Dynamisches Verhalten des IU-Umsetzers
ξ=0,2
ξ=1
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,03
0,04
t [ms]
ξ=0,5
ξ=1
ξ=5
ξ=10
0,00
0,01
0,02
t [ms]
Abb. 23: Antwort im Zeitbereich auf eine Sprungfunktion mit unterschiedlichen
Werten der Dämpfungskonstanten ζ . Für Werte ζ < 1 kommt es zu
einem Überschwingen des Signals.
Um eine resonanzfreie Strom-Spannungs-Umsetzung zu erreichen, sollte die
Rückkopplungskapazität C f so gewählt werden, daß eine Dämpfungskonstante ζ
kleiner 1 vorliegt. Bei einer Eingangskapazität von C in = 100pF am IU-Umsetzter,
einem Rückkopplungswiderstand von Rf = 10kΩ bzw. Rf = 1MΩ und einem GainBandwidth-Product f A = 20MHz ( τA = 8ns ) muß eine Kapazität von Cf = 18pF bzw.
C f = 1, 8pF zum Rückkopplungswiderstand parallel geschaltet werden, um eine
Dämpfungskonstante von ζ = 1 zu erreichen. Je höher die Verstärkung des Operationsverstärkers mit dem Rückkopplungswiderstand R f eingestellt wird, desto stabiler arbeitet der Operationsverstärker.
44
Strom-Spannungs-Umsetzer
Rauschen von Operationsverstärkern
4.2.Rauschen von Operationsverstärkern
Das Rauschen von Operationsverstärkern wird durch äquivalente Rauschspannungs- und Rauschstromquellen an den differentiellen Eingängen in den Datenblätt e r n s p e z i f i z i e r t . S vn1 u n d S vn2 s i n d d i e S p e k t r a l f u n k t i o n e n v o n
Rauschspannungsquellen, S in1 und S in2 sind die Spektralfunktionen von Rauschstromquellen, mit denen das Rauschen des Operationsverstärkers gemäß Abb. 24
modelliert werden kann.
S vn1
S in1
S in2
+
S vn2
Abb. 24: Rauschmodell eines Operationsverstärkers. S vn1 und S vn2 sind Rauschspannungsquellen, S in1 und S in2 sind Rauschstromquellen, die das
Rauschen des Operationsverstärkers am invertierenden bzw. nichtinvertierenden Eingang widerspiegeln.
In den Datenblättern von Operationsverstärkern wird in der Regel für die Rauschspannungsquellen S vn1 und S vn2 die mittlere Wurzel der Summe der Quadrate
(rms) S vn angegeben. Die Angabe bezüglich der Rauschstromquellen S in bezieht
sich auf die Rauschstromquelle S in1 und S in2 an jedem Eingang.
2
(103)
S in = S in 1 = S in2
(104)
S vn =
2
( S vn1 + S vn2 )
45
Strom-Spannungs-Umsetzer
Rauschen von Operationsverstärkern
Abb. 25: Spektralfunktionen für die äquivalente Rauschspannungsquelle S vn
(oben) und die äquivalenten Rauschstromquellen S in1 = S in2 (unten) des
Operationsverstärkers AD745 [Auszug aus den Datenblättern].
Zur Berechnung einer äquivalenten Rauschspannungsquelle, die das Rauschen
am Ausgang eines rückgekoppelten Operationsverstärkers widerspiegelt, muß das
thermische Rauschen der Widerstände berücksichtigt werden. Das thermische Rauschen eines Widerstands kann gemäß Gl.(72) durch eine Reihenschaltung eines
rauschfreien Widerstands mit einer Rauschspannungsquelle modelliert werden. Wie
es in Abb. 27 gezeigt ist, werden zur Berechnung des Ersatzschaltbilds zunächst
die Rauschquellen durch einfache Signalquellen ersetzt. Anschließend wird die
Gleichung quadriert und es werden die Quadrate der Signalquellen durch die korrespondierenden Rauschquellen ersetzt. Die Mischterme, die sich bei der Quadrierung ergeben, fallen weg, da zwischen den Rauschquellen keine Korrelation
besteht [27].
46
Strom-Spannungs-Umsetzer
Rauschen von Operationsverstärkern
R2
R1
S vt1
S vt2
S vn1
S in1
S in2
+
S vn2
Abb. 26: Rauschquellenersatzschaltbild für die Verschaltung eines Operationsverstärkers mit negativer Rückkopplung. Der nichtinvertierende Eingang
des Operationsverstärkers liegt auf festem Potential. Das thermische
Rauschen der Widerstände wird mit den Rauschspannungsquellen S vt1
und S vt2 berücksichtigt.
R2
U t2
Iin +I 1
R1
U t1
U1
Un
U in
Iin
-
I1
Uo
I2
+
Up
U2
Abb. 27: Die Rauschquellen der Abb. 26 sind durch Spannungs- bzw. Stromquellen zur Berechnung des Ersatzschaltbilds ersetzt.
Für eine sehr große Leerlauf-Differenzverstärkung (open loop gain) des Operationsverstärkers gilt
Un = Up ,
(105)
so daß die Schaltung (Abb. 27) durch folgende drei Gleichungen beschrieben
wird:
Up = U2
(106)
U n = U 1 + U t1 – Iin R1 + U in
(107)
U 0 = – U t2 – R 2 ( I in + I1 ) + U t1 – I in R 1 + Uin .
(108)
47
Strom-Spannungs-Umsetzer
Rauschen von Operationsverstärkern
Durch Kombination und Vereinfachung der Gleichungen (106) bis (108) ergibt
sich für die Ausgangsspannung U 0 am Operationsverstärker die Gl.(109).
R
R
U 0 =  1 + -----2- ( U 2 – U 1 ) – -----2- ( U in – U t1 ) – U t2 – I 1 R 2

R 
R
1
äquivalentes Ausgangsrauschen
(109)
1
Die Signalquellen in Gl.(109) können nach Quadrierung der gesamten Gleichung
durch die korrespondierenden Rauschquellen (Abb. 26) ersetzt werden. Da zwischen den Rauschquellen keine Korrelation besteht, fallen die Mischterme weg. Für
eine äquivalente Rauschquelle am Ausgang der Schaltung, die das Rauschen der
gesamten Schaltung repräsentiert, gilt:
R 2 2
R 2 2
2
2
2
2
2
S vno =  1 + -----2- ( S vn1 + S vn2 ) +  -----2- S vt1 + S vt2 + S in1 R 2 .



R
R 
1
(110)
1
Mit Gl.(103) und Gl.(104) folgt:
R 2 2
R 2 2
2
2 2
2
S vno =  1 + -----2- S vn +  -----2- S vt1 + S vt2 + S in R 2 .



R
R 
1
(111)
1
2
Die Gl.(111) zeigt, aus welchen Anteilen sich das Rauschen S vno am Ausgang der
Schaltung zusammensetzt. Die beiden äquivalenten Eingangsspannungsrausch2
2
quellen S vn1 und S vn2 des Operationsverstärkers liegen am Ausgang mit dem Qua2
drat des nichtinvertierenden Verstärkungsfaktors ( 1 + R 2 /R 1 ) an. Das thermische
Rauschen des Widerstands R 1 wird mit dem Quadrat des Verstärkungsfaktors
2
( R2 /R1 ) übertragen, während das Rauschen des Widerstands R2 und der Ein2
gangsrauschstromquelle S in ohne einen Verstärkungsfaktor zum gesamten Rau2
schen S vno beiträgt.
äquivalentes Eingangsrauschen
2
Wird die Gl.(111) durch ( R2 /R1 ) dividiert, ergibt sich das Quadrat der Spektralfunktion für eine äquivalente Eingangsrauschquelle der Schaltung:
R 2 2
2
2
2
2
2 2
S vni =  1 + -----1- S vn + S vt1 + S it2 R 1 + S in R 1

R 
(112)
2
2
2
2
2 S vt2
mit S it2 R1 = R1 --------.
2
R2
(113)
Die äquivalente Eingangsrauschquelle repräsentiert das Rauschen der gesamten
Schaltung am Eingang. Der Effektivwert der äquivalenten Eingangsrauschspannung
liegt am Ausgang um den Faktor ( R 2 /R 1 ) verstärkt vor.
Rauschen des IUUmsetzers
Wird der Operationsverstärker als IU-Umsetzer (Abb. 21) betrieben, kann im
Ersatzschaltbild am invertierenden Eingang eine zusätzliche Rauschstromquelle
eingesetzt werden, die das Eingangsrauschen mit der Spektralfunktion S iin am IUUmsetzer widerspiegelt. Mit dieser Rauschquelle kann z.B. das Rauschen des
EOS-Transistors simuliert werden. Der tatsächliche Eingangsstrom in den IUUmsetzer muß nicht berücksichtigt werden, da das thermische Rauschen der
Widerstände und das Rauschen des Operationsverstärkers vom Stromfluß unabhängig ist.
48
Strom-Spannungs-Umsetzer
Rauschen von Operationsverstärkern
R2
S iin
S vt2
S vn1
S in1
S in2
+
S vn2
Abb. 28: Rauschquellenersatzschaltbild für einen Operationsverstärker, der als
IU-Umsetzer betrieben wird. Das Eingangsrauschen wird durch die
Rauschstromquelle S iin modelliert.
R2
U t2
Iin +I 1
Iin
U1
Un
-
I1
Uo
I2
+
Up
U2
Abb. 29: Die Rauschquellen der Abb. 28 sind durch Spannungs- und Stromquellen ersetzt.
Zur Berechnung einer äquivalenten Rauschquelle am Ausgang der Schaltung
werden die Rauschquellen wieder durch Signalquellen ersetzt und es wird die Ausgangsspannung U o in Abhängigkeit der Signalquellen berechnet. Für einen idealen
Operationsverstärker mit unendlich großer Differenzverstärkung gilt: U n = U p und
es ergeben sich aus der Abb. 29 die Gleichungen (114) bis (116).
Up = U2
(114)
U n = U 1 + ( I in + I 1 )R 2 + U t2 + U o
(115)
U o = U 2 – U 1 – I in R 2 – I1 R 2 – U t2
(116)
2
Für die Spektralfunktion S vno der äquivalenten Rauschquelle am Ausgang des IUUmsetzers gilt (analog zu Gl.(110)):
49
Strom-Spannungs-Umsetzer
Rauschen von Operationsverstärkern
2
2
2
2
2
2
2
2
S vno = S vn1 + S vn2 + S iin R2 + S in 1 R 2 + S vt2 .
2
2
(117)
2
Mit S vt2 = S it2 R 2 und Gl.(103) und Gl.(104) folgt:
2
2
2
2
2
2
S vno = S vn + ( S iin + S in + S it2 )R2
(118)
(119)
2
Wird die Gl.(119) durch R 2 dividiert, erhält man das äquivalente Eingangsrau2
schen S ini des IU-Umsetzters.
2
1- S 2 + S 2 + S 2 + S 2
S ini = ----iin
in
it2
2 vn
R2
(120)
2
D i e ä q u i v a l e n t e E i n g a n g s r a u s c h q u e l l e S ini i s t e i n e R a u s c h q u e l l e , d i e d a s
gesamte Rauschen der Schaltung am Eingang des Operationsverstärkers repräsen2
tiert. Das Rauschen der äquivalenten Eingangsrauschquelle S ini wird in einer
rauschfreien Schaltung in eine Spannung umgesetzt und liegt am Ausgang in gleicher Weise wie ein Eingangssignal verstärkt vor.
2
Das äquivalente Eingangsrauschen S ini wird umsokleiner, je größer der Rückkopplungswiderstand R 2 gewählt wird. Somit wird das Verhältnis zwischen Aus2
2
gangsrauschen S vno und Eingangsrauschen S iin des Transistors mit steigendem
2
Widerstand R 2 immer günstiger. Dies ist plausibel, da das Spannungsrauschen S vn
des Operationsverstärkers im Gegensatz zu den anderen Rauschquellen nicht mit
dem Widerstand R 2 verstärkt wird, so daß bei höheren Verstärkungen der Anteil
dieses Rauschens am gesamten Rauschen immer geringer wird.
50
Strom-Spannungs-Umsetzer
Verstärkung des Kleinsignalanteils
4.3.Verstärkung des Kleinsignalanteils
Die Modulation des Source-Drain-Stroms 4 iSD durch den EOS-Transistor wird
sich bei den erwarteten extrazellulären Spannungen in der Größenordnung von
0,1mV nur im Bereich von wenigen Nano-Ampère abspielen. Zur Strom-SpannungsUmsetzung und Verstärkung des Kleinsignalanteils des Source-Drain-Stroms i SD
sind drei unterschiedliche schaltungstechnische Realisationen denkbar:
(1) Hochpaß
(2) Rückkopplung (Widerstand),
(3) Rückkopplung (Stromquelle),
die in den Abb. 30, Abb. 31 und Abb. 35 dargestellt sind.
Für die durchgeführten Messungen an Herzmuskelzellen (Kap. 6) wurde ein IUUmsetzer verwendet, der nach Schaltungsvariante (1) arbeitet.
4.3.1. Hochpaßfilter
Bei der in Abb. 30 abgebildeten Schaltung wird der gesamte Source-Drain-Strom
I SD durch den Operationsverstärker (OP 1 ) in eine äquivalente Spannung umgesetzt. Bei Offsetströmen, die im gewählten Arbeitspunkt je nach Transistortyp in der
Größe von I SD = 30µA bis I SD = 500µA liegen, kann nur ein kleiner Verstärkungsfaktor realisiert werden, damit der Operationsverstärker (OP 1 ) nicht übersteuert.
Der nachgeschaltete Hochpaß R 1 , C 1 mit einer 3dB-Grenzfrequenz von 2Hz unterdrückt den Gleichspannungsanteil, damit im zweiten Operationsverstärker (OP 2 )
der Kleinsignalanteil des Source-Drain-Stroms i SD mit einem hohen Verstärkungsfaktor verstärkt werden kann. Ein Stromsignal in der Größe von 1nA wird bei einer
Beschaltung gemäß Abb. 30 durch den ersten Operationsverstärker in eine Spannung von 10µV umgesetzt, der zweite Operationsverstärker verstärkt das Signal um
den Faktor 10 4 und es liegt am Ausgang ein Signal von 100mV an.
C f1
R f1
I SD
U in
C1
+
OP 1
U out1
R f2
R1
+
OP 2
U out
U DG
Abb. 30: Der gesamte Source-Drain-Strom wird im ersten Operationsverstärker in
eine Spannung umgesetzt. Aufgrund des hohen Offsetstroms kann nur
ein kleiner Verstärkungsfaktor realisiert werden. Der Hochpaß C 1 , R 1
unterdrückt den Gleichspannungsanteil. Der Kleinsignalanteil kann im
zweiten Operationsverstärker mit einem großen Verstärkungsfaktor
verstärkt werden ( Rf1 = 10kΩ , C f1 = 18pF , C1 = 10µF , R 1 = 10kΩ ,
R2 = 100MΩ und C f2 = 4, 7pF ).
4
Im folgenden wird nicht mehr vom Drain-Source-Strom sondern vom Source-Drain-Strom gesprochen,
da dieser bei p-Kanal-Transistoren größer Null ist und der Stromflußrichtung entspricht.
51
Strom-Spannungs-Umsetzer
Verstärkung des Kleinsignalanteils
Wird der EOS-Transistor eingeschaltet, liegt am invertierenden Eingang des
ersten Operationsverstärkers (OP 1 ) eine Stromsprungfunktion an.
 0 für t < 0
I ( t ) = I SD σ ( t ) mit σ ( t ) = 
 1 für t ≥ 0
(121)
Aufgrund der sehr kleinen Zeitkonstante τ f1 = R f1 C f1 = 180ns von OP 1 liegt am
Ausgang U out1 quasi auch ein Spannungssprung an.
U out1 ( t ) = U SD σ ( t ) mit U SD = – I SD Rf1
Übertragungsfunktion
(122)
Gemäß der Übertragungsfunktion des zweiten Operationsverstärkers (OP 2 )
Gl.(123) wird der Spannungssprung mit einer abklingenden e-Funktion mit der Zeitkonstante τ 1 = R 1 C1 = 100ms auf den Ausgang U out übertragen (Gl.(126)).
U out ( s )
τ2 s
-------------------- = ---------------- mit τ 1 = R1 C 1 und τ 2 = R 2 C 1
U out1 ( s )
τ1 s + 1
(123)
Für den Spannungssprung am Ausgang von OP1 in der s-Ebene gilt:
U SD
Uout1 ( s ) = ---------.
s
(124)
Für den Ausgangssignalverlauf von OP 2 folgt im Frequenzbereich die Gl.(125), im
Zeitbereich die Gl.(126).
τ 1
U out ( s ) = USD ----2- ------------τ1
1
s + ----τ1
τ2
1
U out ( t ) = U SD ----- exp  – ----- t .
τ
τ
1
(125)
(126)
1
Die Spannung am Ausgang von OP 2 kann nur dann dem Ausdruck der Gl.(126)
folgen, wenn die Ausgangsspannung von OP 2 nicht begrenzt ist. Bei einem Spannungssprung von U SD = – 1V am Ausgang von OP 1 müßte sich rechnerisch am
3
Ausgang von OP 2 eine Spannung von U out = 10 V einstellen. Liegt die maximale
Ausgangsspannung von OP 2 z.B. bei 10V, ist erst nach einer Zeit von t = 100s die
entsprechende Ladung über den hochohmigen Widerstand Rf2 = 100MΩ in den
Kondensator C 1 geflossen. Beim Einschalten eines Transistors wird erst nach einer
Zeitverzögerung t = 100s der Kleinsignalanteil am Ausgang U out sichtbar. Der
Transistor muß aus diesem Grund rechtzeitig vor der Messung eingeschaltet werden.
Rauschen
Bei kleinen Eingangssignalen der Operationsverstärker begrenzt das Rauschen
die Meßbarkeit der Signale. Als Operationsverstärker wurde der Typ AD745 verwendet (Anhang ii), dessen maximales Input-Spannungs-Rauschen S vn = 4nV/ Hz
und Input-Strom-Rauschen S in = 40fA/ Hz beträgt. Für eine äquivalente Rauschquelle am Ausgang von OP 1 ergibt sich bei einem Aufbau gemäß Abb. 30 analog
2
Gl.(119) die Spektralfunktion S vnout1 .
2
2
2
2
2
2
S vnout1 = S vn + ( S isd + S in + S itf1 )Rf1
(127)
52
Strom-Spannungs-Umsetzer
Verstärkung des Kleinsignalanteils
2
S itf1 ist die Spektralfunktion für das Rauschen des Rückkopplungswiderstands
R f1 , die sich nach Gl.(74) ergibt. Für R f1 = 10kΩ gilt:
2
2
– 24 A
S itf1 = 4kT
--------- = 1, 6 ×10 ------.
R f1
Hz
(128)
2
S isd ist das äquivalente Eingangsrauschen der EOS-Transistoren, das zum Vergleich der verschiedenen Schaltungstypen nicht berücksichtigt wird. Das äquiva2
lente Ausgangsrauschen S vnout1 von OP 1 wird nach Gl.(129) durch das Rauschen
des Rückkoppelungswiderstands R f1 bestimmt, da das Input-Strom-Rauschen des
Operationsverstärkers um drei Größenordnungen und das Input-Spannungs-Rauschen um eine Größenordnung kleiner ist.
2
1, 6 ×10
V /Hz
– 19 2
1, 6 ×10
2
2
+






– 17 2
2
R f1 S in
+
V /Hz
R f1 S itf1
– 16 V
= 1, 8 ×10





2
S vn
2
S vnout1 =
1, 6 ×10
– 16 2
2
(129)
------Hz
V /Hz
Auf einer Bandbreite von B = 10kHz entspricht dies nach Gl.(73) der effektiven
Rauschspannung:
V rout1 =
2
S vnout1 B = 1, 3µV .
(130)
Ein Stromeingangssignal von i SD = 1nA erzeugt zum Vergleich am Ausgang von
OP 1 eine Spannung von U out1 = 10µV .
2
Das äquivalente Rauschen S vnout am Ausgang des zweiten Operationsverstärkers
(OP 2 ) ergibt sich analog zur Gl.(111). Dabei wird das Rauschen am Ausgang des
2
ersten Operationsverstärkers S vnout1 mit dem Quadrat des Verstärkungsfaktors
2
( Rf2 /R 1 ) auf den Ausgang von OP 2 übertragen.
R f2 2 2  R f2 2 2
R f2 2 2
2
2 2
2
S vn + ------- S vt1 + S vtf2 + S in R f2 +  ------S
S vnout =  1 + ------




R
R
R  vnout1
1
1
.
(131)
1
2
2
–9 2
1, 6 ×10 V /Hz
















S vt1 ist die Spektralfunktion für das Rauschen des Widerstands R 1 , S vtf2 ist die
Spektralfunktion für das Rauschen des Rückkoppelungswiderstands Rf2 . Mit
R 1 = 10kΩ u n d Rf2 = 100MΩ b e t r ä g t d e r E f f e k t i v w e r t d e r R a u s c h s p a n n u n g
V rout = 19mV am Ausgang von OP 2 auf einer Bandbreite von B = 10kHz .
2
R f2 2 2
f2 2
2 2
2
 ------R
S
------S
S in R f2
S vtf2
 R  vn
 R  vt1
2
1
1
+
+
+
S vnout ≈
–8 2
1, 6 ×10 V /Hz
1, 6 ×10
– 12 2
V /Hz
1, 6 ×10
– 11 2
V /Hz
2
1







+
f2 2
R
------S
 R  vnout1
–8 2
≈ 3, 6 ×10 V /Hz
(132)
–8 2
1, 8 ×10 V /Hz
V rout =
2
S vnout B = 19mV
(133)
Das Rauschen der zweiten Verstärkungsstufe wird durch das Rauschen des
Widerstands R1 dominiert. Zum Vergleich entspricht ein Stromeingangssignal in die
Schaltung von i SD = 1nA am Ausgang einem Signal von U out = 100mV .
Bezugspotential
Wird gemäß Abb. 14 der Transistor nicht in einem Arbeitspunkt U DS = U GS betrieben, dann ist U DG > 0 und der nichtinvertierende Eingang des OP 1 muß auf diesem
Potential liegen. Im Arbeitspunkt U DS = U GS , der für die Messungen gewählt
53
Strom-Spannungs-Umsetzer
Verstärkung des Kleinsignalanteils
wurde, ist UDG = 0 , so daß der nichtinvertierende Eingang von OP 1 dem MassePotential entspricht.
4.3.2. Rückkopplung (Widerstand)
In der Schaltung der Abb. 31, die in [28] dargestellt ist, wird das Ausgangssignal
U out über einen Integrator (OP 3 ) mit einer großen Zeitkonstante auf den Eingang
zurückgekoppelt, so daß der Offsetstrom i off über den Widerstand R 2 abfließt.
Über den Rückkoppelungswiderstand R f1 des ersten Operationsverstärkers (OP 1 )
fließt nur noch der Kleinsignalanteil. Aus diesem Grund kann mit dem ersten Operationsverstärker eine sehr hohe Verstärkung durchgeführt werden. Der Operationsverstärker OP 2 dient zur weiteren Verstärkung und Invertierung des Signals.
C f3
R3
R2
OP 3
U DG
Ioff
C f1
R f1
ISD
U in
R f2
R1
+
OP 1
U out1
C1
+
OP 2
U out2
U out
U DG
Abb. 31: Am Eingang des OP 1 wird der Offsetstrom ioff über einen Rückkopplungszweig (OP 3 ) mit einer sehr großen Zeitkonstanten vom SourceDrain-Strom i SD abgezogen. Die Verstärkung des ersten Operationsverstärkers OP 1 kann sehr groß gewählt werden, da nur der Kleinsignalanteil verstärkt und in eine Spannung umgesetzt wird. OP 2 dient zur
weiteren Verstärkung und Invertierung des Signals ( R f1 = 10MΩ ,
C f1 = 1pF , R 1 = 1kΩ , Rf2 = 10kΩ , R 3 = 100MΩ , C f3 = 220nF ,
R2 = 10kΩ ).
Bezugspotential
Werden die Transistor nicht in einem Arbeitspunkt U DS = U GS betrieben, dann ist
U DG > 0 und die nichtinvertierenden Eingänge der Operationsverstärker müssen auf
dem Potential U DG liegen. Das Ausgangssignal des OP 2 bezieht sich in diesem Fall
auf U DG und nicht auf Masse. Über den Kondensator C 1 kann der Kleinsignalanteil
gegen Masse gemessen werden. Im Arbeitspunkt U DS = U GS ist UDG = 0 , so daß
alle nichtinvertierenden Eingänge auf Masse-Potential liegen.
54
Strom-Spannungs-Umsetzer
Verstärkung des Kleinsignalanteils
u2
R2
ioff
(1)
iSD
u in
i1
R f1
+
OP 1
u out1
Abb. 32: Kleinsignalersatzschaltbild für den Eingang des Strom-SpannungsUmsetzers (OP 1 ) in Abb. 31. Bei einer endlichen Verstärkung des
Operationsverstärkers wird der Kleinsignalanteil über den Widerstand
R2 gedämpft.
Dämpfung des
Eingangssignals
Nachteilig für diese Schaltungsvariante wirkt sich die Dämpfung des Eingangssignals durch den Widerstand R2 aus. Ist die Verstärkung der Operationsverstärker
nicht unendlich, kann die Eingangsspannung u in von OP 1 nicht auf Null geregelt
werden, so daß ein Teil des Kleinsignalstroms i DS über den Widerstand R2 abfließt
und das Eingangssignal vor der ersten Verstärkung gedämpft wird. Abb. 32 zeigt
das Kleinsignalersatzschaltbild für die Beschaltung des ersten Operationsverstärkers (OP 1 ). Der Widerstand R2 liegt an einem quasi festen Potential, das durch den
Integrator OP 2 (Abb. 31) eingestellt wird. i off ist der Kleinsignalanteil des Offsetstroms, der den Kleinsignalanteil des Source-Drain-Stroms i DS verkleinert. Über
den Rückkoppelungswiderstand R f1 fließt nur der Differenz-Strom i 1 . Für den Knoten (1) gilt:
i 1 = i DS – i off .
(134)
Die Open-Loop-Verstärkung des verwendeten Operationsverstärkers AD745
(Anhang ii) beträgt minimal v 0 = 1000 , so daß die Eingangsspannung u in nicht Null
ist.
u out1
u in = – ----------v0
(135)
u in fällt auch über den Widerstand R2 ab ( u 2 = u in ) und bestimmt den Kleinsignalanteil des Offsetstroms zu
u in
u out 1
i off = ------ = – -------------- .
R2
v0 R2
(136)
Aus der Gl.(137) folgt für die Spannung zwischen dem Ein- und Ausgang des
Operationsverstärkers mit den Gl.(134), (135) und (136) die Gl.(138).
(137)
u in – u out1 – i 1 R f1 = 0
1
u out1 = – i DS R f1 ------------------------------------Rf1
1
1 + ----- 1 + ------v 
R 
0
2
(138)
55
Strom-Spannungs-Umsetzer
Verstärkung des Kleinsignalanteils
Die begrenzte Open-Loop-Verstärkung des Operationsverstärkers führt zu einer
Dämpfung des Kleinsignalanteils des Drain-Source-Stroms. Der Dämpfungsfaktor
steigt mit sinkendem Verstärkungsfaktor des OP 1 und mit sinkendem Widerstand
R 2 an. Der Widerstand R2 muß umsokleiner gewählt werden, je größer der Offsetstrom ist. Bei einem Rückkoppelungswiderstand von Rf1 = 10MΩ , einem Widerstand R2 = 10kΩ und einer Open-Loop-Verstärkung von v 0 = 1000 wird das Signal
i DS vor der Verstärkung um den Faktor 0,5 gedämpft.
Rauschen
Die Beschaltung des ersten Operationsverstärkers (OP 1 ) unterscheidet sich zur
Abb. 30 darin, daß am invertierenden Eingang über den Widerstand R 2 der Offsetstrom i off gegen ein quasi festes Potential abfließt. Der Einfluß des thermischen
Rauschens von Widerstand R 2 soll in der folgenden Betrachtung dargestellt werden. Das Rauschen des Widerstands wird im Rauschquellenersatzschaltbild durch
die Parallelschaltung eines rauschfreien Widerstands mit einer Rausch-Stromquelle
dargestellt (Abb. 19).
S it2
R2
R f1
S iin
S vtf1
S vn1
S in1
S in2
+
S vn2
Abb. 33: Rauschquellenersatzschaltbild für die Beschaltung des ersten Operationsverstärkers (OP 1 ). Das Rauschen des Widerstands R2 wird durch
die Parallelschaltung eines rauschfreien Widerstands mit einer RauschStromquelle modelliert.
56
Strom-Spannungs-Umsetzer
Verstärkung des Kleinsignalanteils
It2
R2
I2
R f1
U tf1
Iin +I 1 +I t2-I 2
Iin
U1
Un
-
I1
Uo
I2
+
Up
U2
Abb. 34: Die Rauschquellen der Abb. 33 sind durch Spannungs- bzw. Stromquellen zur Berechnung des Ersatzschaltbilds ersetzt.
Bei einer unendlich großen Differenzverstärkung des Operationsverstärkers gilt:
U n = U p und das Ersatzschaltbild (Abb. 34) wird durch die Gl.(139) bis Gl.(141)
beschrieben.
Up = U2
(139)
U n = U 1 + ( I sd + I 1 + I t2 – I 2 )Rf1 + U tf1 + U out1
(140)
Un = U1 + I2 R2
(141)
Durch Kombination der Gleichungen (139) bis (141) ergibt sich für die Ausgangsspannung U out1 :
R f1
U out1 =  1 + ------( U – U 1 ) – I sd R f1 – I 1 R f1 – I t2 R f1 – U tf1 .
R  2
(142)
2
Wird die Gleichung (142) quadriert, die Mischterme weggelassen (Kap. 4.2) und
die Signalquellen durch die korrespondierenden Rauschquellen ersetzt, folgt für die
2
äquivalente Rauschquelle S vnout1 am Ausgang der Schaltung die Gl.(143).
R f1 2 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
S vnout1 =  1 + ------( S vn1 + S vn2 ) + S isd R f1 + S in1 R f1 + S it2 Rf1 + S vtf1

R 
(143)
2
2
2
2
Mit S vtf1 = S itf1 Rf1 und Gl.(103) und (104) folgt:
R f1 2 2
2
2
2
2
2
2
S vnout1 =  1 + ------S + ( S isd + S in + S it2 + S itf1 )Rf1 .

R  vn
2
(144)
57
Strom-Spannungs-Umsetzer
Verstärkung des Kleinsignalanteils
2
– 27 2
















F ü r R f1 = 10MΩ g i l t f ü r d i e S p e k t r a l f u n k t i o n S itf1 = 1, 6 ×10 A /Hz u n d f ü r
2
– 24 2
R 2 = 10kΩ ist S it2 = 1, 6 ×10 A /Hz .
R f1 2 2
2 2
2 2
2 2
 ------S
Rf1 S in
Rf1 S itf1
Rf1 S it2
 R  vn
2
2
S vnout1 ≈
+
+
+
(145)
1, 6 ×10
– 11 2
S vnout1 ≈ 1, 8 ×10
– 10 2
2
1, 6 ×10
V /Hz
– 19 2
– 13 2
1, 6 ×10
V /Hz
V /Hz
– 10 2
1, 6 ×10
V /Hz
(146)
V /Hz
Am Ausgang von OP 1 liegt für ein Stromeingangssignal in die Schaltung von
i SD = 1nA ein Spannungssignal von U out1 = 10mV an. Wird die begrenzte Differenzverstärkung des Operationsverstärkers v 0 = 1000 berücksichtigt, beträgt das
Spannungssignal am Ausgang nur U out1 = 5mV . Der Effektivwert der Rauschspannung beträgt auf einer Bandbreite von B = 10kHz :
V rout1 =
2
S vnout1 B = 1, 3mV .
(147)
– 15 2
1, 6 ×10
V /Hz
















Für die zweite Verstärkungsstufe mit OP2 gilt die Gl.(132) analog. Mit den Widerstandswerten der Abb. 31 ergibt sich am Ausgang der Schaltung eine effektive
Rauschspannung auf einer Bandbreite B = 10kHz von Vrout = 13mV .
2
R f2 2 2
f2 2
2 2
2
 ------R
S
------S in R f2
S vtf2
vn
R 
 R  S vt1
2
1
1
+
+
+
S vnout ≈
1, 6 ×10
– 17 2
V /Hz
– 16 2
1, 6 ×10
V /Hz
– 19 2
1, 6 ×10
V /Hz
2
1







+
f2 2
R
S
 ------R  vnout1
–8 2
≈ 1, 8 ×10 V /Hz
(148)
–8 2
1, 8 ×10 V /Hz
V rout =
2
S vnout B
= 13mV
(149)
Das Rauschen des Operationsverstärkers und der Widerstände in der zweiten
Verstärkungsstufe spielen keine Rolle. Das äquivalente Ausgangsrauschen wird nur
durch das Rauschen am Ausgang des ersten Operationsverstärkers (OP1)
bestimmt, dessen Effektivwert am Ausgang des zweiten Operationsverstärkers
(OP 2 ) um den Faktor ( R f2 /R 1 ) verstärkt vorliegt.
58
Strom-Spannungs-Umsetzer
Verstärkung des Kleinsignalanteils
4.3.3. Rückkopplung (Stromquelle)
Zur Vermeidung der Dämpfung des Eingangssignals, wurde im Rahmen dieser
Arbeit die Schaltung der Abb. 35 entwickelt. Der Widerstand R2 in der Abb. 31 kann
durch eine spannungsgesteuerte Stromquelle ersetzt werden, die durch einen Integrator geregelt wird. Als Stromquelle wird ein nMOS-Transistor gemäß Abb. 35 verwendet. In der Praxis wirkt sich bei dieser Schaltung das Rauschen des nMOSTransistors negativ auf das Ausgangsrauschen aus. Es muß aus diesem Grund ein
sehr rauscharmer Typ verwendet werden.
C f1
R f2
R f1
ISD
R1
C1
+
U in
OP 1
+
U out1
OP 2
U out
U out2
U DG
Ioff
C f3
R f4
R2
R3
D
OP 5
+
nMOS
OP 4
OP 3
U DG
S
R4
-U DD
Abb. 35: Der Offsetstrom wird durch eine spannungsgesteuerte Stromquelle vom
Drain-Source-Strom IDS abgezogen. Als Stromquelle dient ein nMOSTransistor, der durch einen Operationsverstärker geregelt wird (OP 5 ).
OP 4 dient der Invertierung des Signals ( R3 = Rf4 = R 4 = 10kΩ ).
59
Strom-Spannungs-Umsetzer
Schaltungsentwurf
4.4.Schaltungsentwurf
Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde eine Platine entwickelt, auf der ein Multiplexer zur Umschaltung zwischen den einzelnen Transistoren und zwei StromSpannungs-Umsetzer untergebracht sind.
Multiplexer
Auf dem Cultus-Chip befinden sich insgesamt 64 Transistoren, von denen für
Messungen jeweils zwei Transistoren gleichzeitig ausgewählt werden können. Die
Multiplexer-Schaltung ist in Abb. 36 schematisch dargestellt.
zweite DrainZuleitungen
off
(9)
Cultus-Chip
on
Drain
a
b
c
d
Source
(1)
(5)
on
on
b
Source
off
off
(2)
(6)
on
on
a
Source
off
(3)
off
(7)
on
on
c
off
(4)
off
on
d
off
on
(8)
a
b
c
d
off
Source U
SG
Drain extern 2
Drain extern 1
IU-Umsetzer 1
IU-Umsetzer 2
Abb. 36: Schematische Darstellung des Multiplexers. Mit den DIP-Schaltern (5)
und (6) wird der Source-Anschluß des ausgewählten Transistors mit der
Spannungsquelle U SG verbunden. Die DIP-Schalter (1)-(4) und (7), (8)
dienen zur Auswahl der entsprechenden Drain-Zuleitung. Die
Darstellung umfaßt nur die linken Transistoren (1 bis 4 und 9 bis 12) des
Cultus-Chips.
Der Source-Anschluß für die vier Transistoren einer Reihe wird über die DIPSchalter 5 (5) und (6) mit der Spannungsquelle U SG verbunden. Mit den DIP-Schal-
60
Strom-Spannungs-Umsetzer
Schaltungsentwurf
tern (1) bis (4) kann die Drain-Zuleitung des entsprechenden Transistors ausgewählt werden. Zwei Transistoren können nur dann gleichzeitig betrieben werden,
wenn sie in einer Reihe liegen.
Die Drain-Zuleitung des jeweiligen Transistors wird über die DIP-Schalter (7) und
(8) mit dem Eingang des Strom-Spannungs-Umsetzers verbunden. Neben den beiden Strom-Spannungs-Umsetzern (IU-Umsetzer 1, IU-Umsetzer 2), die auf der Platine untergebracht sind, können die Drain-Zuleitungen mit den Eingängen von zwei
externen Strom-Spannungs-Umsetzern (Drain extern 1, Drain extern 2) verbunden
werden. Für die letzten Transistoren (d) einer Reihe sind auf dem Chip jeweils zwei
Drain-Zuleitungen vorgesehen. Sie können mit den DIP-Schaltern (9) zueinander
parallel geschaltet werden, um den Einfluß des Zuleitungswiderstands zu untersuchen.
Abb. 37: Multiplexer und Verstärker sind in einem Gehäuse direkt unter dem
Cultus-Chip angeordnet. Oben: PGA-Sockel für den Cultus-Chip. In der
Mitte: DIP-Schalter des Multiplexers. Rechts und links: BNC-Ein- und
Ausgänge.
5
Die DIP-Schalter haben drei Stellungen (Tristate-DIP-Schalter): on, hochohmig, off.
61
Strom-Spannungs-Umsetzer
Schaltungsentwurf
C 9 ,C 11
R 1,R 25
R 39 ,R 42
OP 4-1 ,OP 4-2
J 2 ,J 3
U DG
C 11 ,C 12
R 3 ,R 32
R 37 ,R 40
ISD
C 1,C 10 R ,R
2
33
+
+
OP 1-1 ,OP 1-2
OP 2-1 ,OP 2-2
U outA
U DG
U DG
R 5,R 35
R 4 ,R 34
+V
C 13 ,C 14
R 11 ,R 19
+
U outB
OP 3-1 ,OP 3-2
R 8 ,R 29
J 1,J 4
U DG
R 12 ,R 20
R 6 ,R 28
-V
R 14 ,R 22
C 4 ,C 8
R 7 ,R 27
-V opp
R 9 ,R 30
+
OP 5-1 ,OP 5-2
R 17 ,R 36
C 3 ,C 7
R 13 ,R 21
+
+V
R 15 ,R 23
R 18 ,R 26
C 2 ,C 5
R 10 ,R 31
+V opp
R 16 ,R 24
-V
Abb. 38: Schaltplan des IU-Umsetzers. Durch Wahl der Jumperstellungen (J1 bis
J4) können unterschiedliche Schaltungsvarianten zur Verstärkung des
Kleinsignalanteils realisiert werden.
Die Abb. 36 stellt die Verschaltung nur für die Transistoren der linken Seite (1 bis
4 und 9 bis 12) des Cultus-Chips dar. Der Multiplexer für die Transistoren der rechten Seite ist analog aufgebaut. Der Bulk-Anschluß ist für alle Transistoren identisch
und ist auf der Platine nach außen geführt. Das Platinen-Layout und die Zuordnung
der einzelnen Schalter ist im Anhang dargestellt.
62
Strom-Spannungs-Umsetzer
Schaltungsentwurf
Strom-Spannungs-Umsetzer
Auf der Platine sind zwei Strom-Spannungs-Umsetzer vorgesehen. Der Schaltplan der IU-Umsetzer ist in Abb. 38 dargestellt. Die beiden IU-Umsetzer unterscheiden sich nur im Typ der Eingangs-Operationsverstärker OP 1 (IU-Umsetzer 1:
AD745, IU-Umsetzer 2: LMC648). Für die Eingangs-Operationsverstärker wurden
spezielle, besonders rauscharme Operationsverstärker ausgewählt. Bei den Operationsverstärkern OP 2 bis OP 5 wurden die weniger rauscharmen Operationsverstärker (TS274) verwendet. Mit der vorgegebenen Schaltung können die in Kap. 4.3
beschriebenen Schaltungsvarianten (Hochpaß und Rückkopplung über Widerstand) realisiert werden. Dazu sind die Jumper (J 1 bis J 4 ) entsprechend zu setzen.
Eine dritte Schaltungsvariante sollte einen manuellen Abgleich des Offsetstroms
I SD ermöglichen. Dazu ist auf der Platine eine fein einstellbare Spannungsquelle
vorhanden, die mit dem nichtinvertierenden Eingang des Operationsverstärkers
OP 3 verbunden werden kann. Es hat sich jedoch gezeigt, daß der Offsetstrom I SD
im Verhältnis zum Kleinsignalanteil aufgrund von Änderungen des Lichteinfalls auf
den Transistor und Änderungen der Temperatur sehr stark schwankt, so daß ein
manueller Abgleich des Offsetstroms nicht möglich ist. Die Versorgungsspannung
der Operationsverstärker wird durch RC-Glieder mit einer Grenzfrequenz von
f g = 16Hz geglättet.
Strom-Spannungs-Umsetzer
bei den Messungen an Zellen
Für die durchgeführten Messungen wurde ein Strom-Spannungs-Umsetzer verwendet, der auf einer zweiten Platine untergebracht ist (Abb. 39). Es handelt sich
dabei um die erste Schaltungsvariante (Hochpaßfilter, Kap.4.3). Der erste Operationverstärker OP1 setzt dabei den gesamten Source-Drain-Strom I SD in eine äquivalente Spannung um und der nachgeschaltete RC-Hochpaß mit einer
Grenzfrequenz von f g = 2Hz unterdrückt den Gleichspannungsanteil. Vom zweiten
Operationsverstärker wird nur der Kleinsignalanteil iSD des Source-Drain-Stroms
verstärkt. Für den Kondensator C Tantal wird ein Tantal-Kondensator verwendet, da
Tantal-Kondensatoren rauschärmer als Elektrolyt-Kondensatoren sind. Bei den
Operationsverstärkern OP 1 und OP 2 handelt es sich um die besonders rauscharmen Operationsverstärker vom Typ AD745. Durch die in Abb. 39 dargestellte
Beschaltung der Operationsverstärker wurde ein Verstärkungsfaktor von v = 10000
realisiert. Durch die hohe Verstärkung wird die Bandbreite der Schaltung stark
reduziert. Das Ergebnis einer Frequenzgangmessung ist in Kap. 7 dargestellt.
C=4,7pF
C=4,7pF
R=10k Ω
R=100M Ω
C Tantal =10 µ F
ISD
+
OP 1 (AD745)
R=10k Ω
+
OP 2 (AD745)
Abb. 39: Für die Messungen wurde ein IU-Umsetzer verwendet, der den Kleinsignalanteil durch einen Hochpaß (Kap. 4.3) vom Offsetstrom trennt. OP 1
und OP 2 sind die besonders rauscharmen Operationsverstärker vom
Typ AD745.
Für die Spannungsversorgung der Operationsverstärker werden zwei Blei-Akkus
( V 0 = 12V ) verwendet. Direkt vor dem Eingang der Operationsverstärker ist für die
negative und positive Betriebsspannung jeweils ein RC-Tiefpaß mit einer 3dBGrenzfrequenz von f g = 2Hz geschaltet, damit Einstreuungen in den Zuleitungen
von den Akkus zum Verstärker gedämpft werden. Um das Rauschen der verwendeten Elektrolyt-Kondensatoren zu verringern, wird jeweils ein Tantalkondensator zur
eigentlichen Kapazität parallel geschaltet. Die Source-Gate-Spannung U SG wird
63
Strom-Spannungs-Umsetzer
Schaltungsentwurf
durch einen einstellbaren Festspannungsregler (TL 317 LP) erzeugt und wiederum
durch einen RC-Tiefpaß geglättet.
-V opp =-12V
U SG =2,5V
R=100 Ω
R=100 Ω
C Tantal =10 µF
C Tantal =10 µ F
C Elko =1000 µ F
C Elko =1000 µ F
+
C Elko =1000 µ F
U SG (Source-Anschluss)
C Tantal =10 µF
R=100 Ω
+V opp =12V
Abb. 40: Als Spannungsquelle für die Betriebsspannung der Operationsverstärker
und für die Source-Gate-Spannung werden Blei-Akkus verwendet. In
unmittelbarer Nähe zum Verstärker ist jeweils für die positive und
negative Betriebsspannung und für die Source-Gate-Spannung ein RCTiefpaß angeordnet.
64
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Kennlinien und Parameter
5. Charakterisierung der EOS-Transistoren
5.1.Kennlinien und Parameter
IDS
D
Bad
U DS
S
Abb. 41: Bestimmung des Übertragungsleitwertfaktors und der Einsatzspannung.
Für einen p-Kanal-Transistor gilt im Arbeitsbereich: U DS, I DS < 0 .
250µ
200µ
[A]
150µ
DS
U TH
Der Übertragungsleitwertfaktor β und die Einsatzspannung U TH der Transistoren
lassen sich mit der in Abb. 41 dargestellten Meßanordnung bestimmen. Wird die
Spannung U DS variiert und der Strom IDS gemessen, so erhält man die Ausgangskennlinie des Transistors (Abb. 42).
-I
Übertragungsleitwertfaktor β ,
Einsatzspannung
100µ
50µ
0
0,0
0,5
1,0
1,5
-U
DS
[V] (U
2,0
DS
=U
GS
2,5
3,0
)
Abb. 42: Ausgangskennlinie von Transistor 5 (p-Kanal) mit U DS = U GS .
In der Meßanordnung gilt für p-Kanal-Transistoren:
U GS = U DS < U GS – U TH mit U TH < 0 ,
(150)
d.h. der Transistor befindet sich für U GS < U TH im Sättigungsbereich, so daß für
den Drain-Source-Strom gilt:
65
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Kennlinien und Parameter
β- ( U – U ) bzw. – I
I DS = – -TH
DS =
2 DS
2
β
--- ( U DS – U TH ).
2
(151)
Wird – IDS über – U DS aufgetragen (Abb. 42), ergibt sich eine Gerade mit der
Steigung β/2 , die die Abszisse bei U DS = – U TH schneidet. Aus der Steigung und
dem Achsenabschnitt lassen sich die Werte für den Übertragungsleitwertfaktor β
und die Einsatzspannung U TH bestimmen.
16m
14m
10m
8m
sqrt(-I
DS
) [sqrt(A)]
12m
6m
4m
2m
0
0,0
0,5
1,0
1,5
-U
DS
[V] (U
DS
2,0
=U
GS
2,5
3,0
)
Abb. 43: Aus der Steigung der Gerade läßt sich der Übertragungsleitwertfaktor β
und aus dem Schnittpunkt der verlängerten Geraden mit der Abszisse
läßt sich die Einsatzspannung U TH des Transistors bestimmen.
Übertragungsleitwert g m
Der Übertragungsleitwert g m für die Kleinsignalbeschreibung in einem festen
Arbeitspunkt ( U DSArb = – 2, 5V ) läßt sich aus dem Übertragungsleitwertfaktor β
gemäß Gl.(152) berechnen.
g m = – βU DSArb
(152)
66
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Kennlinien und Parameter
Genauer kann der Wert jedoch aus der Steigung der Transferstromkennlinie für
d e n A r b e i t s p u n k t U DSArb = – 2, 5V i m P u n k t U GS = – 2, 5V e r m i t t e l t w e r d e n . D i e
Kennlinie ist für den Transistor 5 in der Abb. 44 dargestellt.
250µ
200µ
-I
DS
[A]
150µ
100µ
50µ
0
0,0
0,5
1,0
1,5
-U
GS
[V] (U
DS
2,0
2,5
3,0
=-2,5V)
Abb. 44: Transferstromkennlinie von Transistor 5 mit UDSArb = – 2, 5V . Aus der
Steigung der Kennlinie im Punkt U GS = – 2, 5V wird der Übertragungsleitwert g m = 121, 1µS bestimmt.
Die Kennlinien für alle Transistoren enthält der Anhang iv. In der folgenden
Tabelle sind die Werte für β , U TH , g m und den Übertragungsleitwertparameter K p
zusammengefaßt. Für den Zusammenhang zwischen dem Übertragungsleitwertfaktor β und dem Übertragungsleitwertparameter K p gilt:
W
β = K p ----- .
L
(153)
Die Werte für den Übertragungsleitwert g m wurden aus der Steigung der Transferstromkennlinie im Punkt U DS = U GS = – 2, 5V bestimmt.
67
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Kennlinien und Parameter
Tab. 4: Parameter der unterschiedlichen Transistortypen (1 bis 16) des CultusChips. Der Übertragungsleitwert g m bezieht sich auf den Arbeitspunkt
U DS = U GS = – 2, 5V .
Zuleitungswiderstände
Transistor
W/L
β [10-6 A/V2]
Kp [10-6 A/V2]
UTH [V]
gm [µS]
1
4
239
59,75
-0,29
340,7
2
6
394
65,67
-0,32
486,5
3
3
183
61
-0,32
255,8
4
2
110
55
-0,33
161,3
5
2
72
36
-0,32
121,1
6
1,33
60
45,11
-0,35
101,3
7
2,67
143
53,56
-0,31
222,7
8
1,11
48
43,24
-0,49
78,2
9
1
50
50
-0,32
89,9
10
1
47
47
-0,32
79,3
11
1
51
51
-0,33
85,2
12
1,11
47
42,34
-0,40
75,8
13
1,11
27
27
-0,47
49,2
14
1
56
56
-0,35
92,5
15
0,2
7
35
-0,33
14,3
16
5
391,7
Die Zuleitungen der Transistoren bestehen aus hochdotiertem, p + -leitendem Silizium mit einem Schichtwiderstand von R = 15Ω/ . Die Drain-Zuleitungen haben
eine Breite von 100µm und für die mittleren Transistoren eine Länge von maximal
5,5mm. Die Source-Zuleitungen für die äußeren Transistoren haben eine Breite von
500µm und eine maximale Länge von 4mm. Die Source-Zuleitungen für die mittleren Transistoren (4, 5, 12, 13) sind 1000µm breit und 4,4mm lang.
L
R = ----- R
W
(154)
Die Abschätzungen für die Zuleitungswiderstände nach Gl.(154) sind in Tab. 5
aufgelistet. Für den Transistor 9a wurde ein Drain-Zuleitungswiderstand von
R = 484Ω und für den Transistor 4a ein Drain-Zuleitungswiderstand von R = 786Ω
gemessen.
Tab. 5: Zuleitungswiderstände der EOS-Transistoren
parasitäre Kapazitäten
W [µm]
L [µm]
R [Ω]
Drain-Zuleitung
100
5500
825
Source-Zuleitung
(4, 5, 12, 13)
1000
4400
66
Source-Zuleitung
(Rest)
500
4000
120
Die parasitären Kapazitäten der Zuleitungen und die parasitären Kapazitäten in
den EOS-Transistoren bestimmen das Frequenzverhalten der Transistoren. Die
Drain- und Source-Zuleitungen bilden über die dünne Oxidschicht zum Elektrolyten
68
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Kennlinien und Parameter
die Kapazitäten C ZD und C ZS aus (Abb. 15). Die Oxidkapazität berechnet sich nach
Gl.(155) und Gl.(156).
C' ox
– 12 As
3, 9 ⋅ 8, 854 ×10 ------ε 0 εSiO
Vm2
= ----------------- = ----------------------------------------------------d ox
d ox
(155)
(156)
C ox = WLC' ox
Zuleitungskapazitäten
In Tab. 6 sind Abschätzungen für die Zuleitungskapazitäten exemplarisch für die
Transistoren 3, 4 und 5 dargestellt. Der Transistor 3 unterscheidet sich von den
Transistoren 4 und 5 durch eine schmale Source-Zuleitung. Die Transistoren 3 und
4 haben im Vergleich zum Transistor 5 über den Drain- und Source-Diffusionen
eine dünne Oxidschicht mit der Dicke von 8nm (Abb. 13), so daß der kapazitive Beitrag dieser Bereiche zu den Zuleitungskapazitäten C ZD und C ZS extra betrachtet
werden muß. In das Ersatzschaltbild gehen die Zuleitungskapazitäten nur mit dem
Faktor 0,5 ein, da sie über die gesamte Zuleitung gleichmäßig verteilt sind.
Tab. 6: Abschätzungen für die Kapazitäten der Zuleitungen für die Transistoren 3,
4 und 5. Die flächenspezifische Oxidkapazität für eine Oxiddicke von
–5
2
d ox = 500nm nach Gl.(155) beträgt C' ox = 6, 9 ×10 F/m und für eine
–3
2
Oxiddicke von d ox = 8nm ist C' ox = 4, 3 ×10 F/m .
W [µm]
L [µm]
Cox [pF]
Drain-Zuleitung ( d ox = 500nm )
100
3700
25
Drain-Diffusion ( d ox = 8nm )
100
50
21
Source-Zuleitung ( d ox = 500nm )
500
3600
124
Source-Diffusion ( d ox = 8nm )
100
50
21
Transistor 3:
C ZD (gesamt)
46
CZS (gesamt)
145
Transistor 4:
Drain-Zuleitung ( d ox = 500nm )
100
4150
29
Drain-Diffusion ( d ox = 8nm )
100
50
21
CZD (gesamt)
50
Source-Zuleitung ( d ox = 500nm )
1000
4000
276
Source-Diffusion ( d ox = 8nm )
100
50
21
CZS (gesamt)
297
Tranisitor 5:
Drain-Zuleitung ( d ox = 500nm )
100
4150
CZD (gesamt)
Source-Zuleitung ( d ox = 500nm )
CZS (gesamt)
Drain-Bulk-Kapazität
29
29
1000
4000
276
276
Die Drain-Bulk-Kapazität wird durch die Sperrschichtkapazität an den Drain-Diffusionen gebildet. Die Drain-Zuleitungen bestehen aus p + -dotiertem Silizium mit
19
–3
16
–3
N A = 1 ×10 cm . Die Störstellenkonzentration im Bulk beträgt N D = 1 ×10 cm .
Die Diffusionsspannung über den pn-Übergang berechnet sich nach Gl.(157) [31].
Die Weite w RLZ der Raumladungszone beträgt bei einem abrupten pn-Übergang
und einer Sperrspannung von U DB = – 2, 5V nach Gl.(158) w RLZ = 1, 4nm .
69
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Kennlinien und Parameter
 N A N D
 10 19 10 16 
U D = U T ln  -------------- = 25mV ⋅ ln  ----------------------------- = 0, 8V
 n2 
 ( 1, 5 ×1010 ) 2
i
w RLZ ( U DB ) =
w RLZ ( -2,5V ) =
(157)
2ε 0 ε SiO 1
1
---------------------2  ------- + ------- ( U D – U DB )
q
NA N D
– 14 F
2 ⋅ 3, 9 ⋅ 8, 854 ×10 ------– 19
3
– 16
3
cm
------------------------------------------------------------ ( 10 cm + 10 cm ) ( 0, 8V + 2, 5V )
– 19
1, 602 ×10 C
w RLZ ( -2,5V ) = 1, 4nm
(158)
(159)
(160)
Für die Sperrschichtkapazität gilt:
C' RLZ
– 12 As
3, 9 ⋅ 8, 854 ×10 -------ε 0 ε SiO
Vm
2
= ----------------- = ------------------------------------------------------ und C RLZ = WLC' RLZ .
w RLZ
w RLZ
(161)
Bei den Drain-Zuleitungen handelt es sich nicht um einen abrupten pn-Übergang
sondern um einen Übergang nach einer Gauß-Funktion. Die Weite der Raumladungszone wird damit weit über dem berechneten Wert in Gl.(160) liegen. Abschätzungen [32] ergeben eine Weite der Raumladungszone von w RLZ = 1µm .
Die Sperrschichtkapazität der Drain-Zuleitungen U DB der Transistoren 3,4 und 5
ist in Tab. 7 berechnet. Für die Source-Zuleitungen spielt die Sperrschichtkapazität
keine Rolle, da das Bulk auf Source-Potential liegt.
Tab. 7: Sperrschichtkapazitäten der Zuleitungen. Die flächenspezifische Sperr–6
2
schichtkapazität beträgt C' RLZ = 24, 7 ×10 F/m .
W [µm]
L [µm]
CRLZ [pF]
100
3700
9,1
100
4150
10,2
Transistor 3:
Drain-Zuleitung CDB
Transistor 4 und 5:
Drain-Zuleitung CDB
Gate-Source- und
Gate-Drain-Kapazitäten
Die Gate-Source- und die Gate-Drain-Kapazitäten bilden sich zwischen dem Elektrolyt und dem Kanalbereich über die dünne Oxidschicht (8nm) aus. Die Kapazität
unterscheidet sich bei den verschiedenen Transistoren durch die Kanalgeometrie.
Zur Vereinfachung wird die Oxidkapazität zwischen Elektrolyt und Kanalbereich
bestimmt und jeweils zur Hälfte der Gate-Source- und Gate-Drain-Kapazität zugerechnet.
Tab. 8: Oxidkapazitäten zum Kanalbereich. Die Werte ergeben sich aus Gl.(155)
und Gl.(156). Die flächenspezifische Oxidkapazität für eine Oxiddicke von
–3
2
d ox = 8nm beträgt C' ox = 4, 3 ×10 F/m .
W [µm]
L [µm]
Cox [pF]
CGS,CGD [pF]
Transistor 3 (Kanal)
6
2
0,05
0,025
Transistor 4, 5 (Kanal)
4
2
0,04
0,02
70
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
5.2.Frequenzverhalten
Die großen parasitären Kapazitäten der Zuleitungen der EOS-Transistoren führen
dazu, daß Spannungsänderungen am Gate mit steigenden Frequenzen immer kleinere Änderungen des Source-Drain-Stroms bewirken und sich die Phasenbeziehung zwischen der Gate-Source-Spannung und dem Source-Drain-Strom ändert.
Zur Untersuchung des Frequenzverhaltens der Transistoren wurden Amplitudenfrequenzgang- und Phasenfrequenzgangmessungen durchgeführt.
5.2.1. Frequenzgangmessung der EOS-Transistoren
Meßaufbau
Die Abb. 45 zeigt den Meßaufbau für die Frequenzgangmessung der EOS-Transistoren. Der Aufbau entspricht der Verschaltung der Transistoren zur Messung der
extrazellulären Spannungen an Zellen (Abb. 14). Die Transistoren werden im
Arbeitspunkt U DS = UGS = – 2, 5V betrieben. Der Drain-Anschluß der Transistoren
wird über einen IU-Umsetzer auf virtuellem Masse-Potential gehalten. Der Kleinsignalanteil des Source-Drain-Stroms wird vom IU-Umsetzer in eine Spannung umgesetzt und verstärkt.
-U DS
Frequenzgenerator
+2,5V
Lock-InVerstärker
S
Phase
~
Amplitude
D
Frequenzgang
Software veetest
IUWandler
HPIB-Schnittstelle
Frequenz
Abb. 45: Meßaufbau zur Frequenzgangmessung der Cultus-Transistoren. Die
Frequenzgangmessung wird über die HPIB-Schnittstelle gesteuert,
wobei das Programm „veetest“ von Hewlett Packard verwendet wird.
Am Gate der Transistoren wird gegenüber dem Masse-Potential eine Sinusspannung angelegt, die durch einen Frequenzgenerator erzeugt wird. Es wird bei diesen
Messungen die Spannung U GS im Kleinsignalbereich nicht nur über dem Gate der
Transistoren sondern im gesamten Elektrolyten geändert, der die Transistoren und
die Zuleitungen überdeckt. Bei Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen
an Zellen liegt dagegen die Spannung U GS nur über dem Gate-Bereich der Transistoren an und der Elektrolyt über den Zuleitung liegt auf festem Masse-Potential.
Zur Messung des Amplitudenfrequenzgangs wird für unterschiedliche Frequenzen
mit dem Lock-In-Verstärker die Amplitude des Ausgangssignals des IU-Umsetzers
bestimmt. Die Amplitude des Signals bei unterschiedlichen Frequenzen wird auf die
Amplitude bei einer frei gewählten Kalibrierungsfrequenz (100Hz) bezogen und in
dB über dem Logarithmus der Frequenz dargestellt. Der Amplitudenfrequenzgang
für ausgewählte Transistoren ist in den Abb. 57 und Abb. 59 dargestellt.
Zur Messung des Phasenfrequenzgangs wird für unterschiedliche Frequenzen die
Phasenverschiebung zwischen dem Signal des Frequenzgenerators (Referenzsignal) und dem Ausgangssignal des IU-Umsetzers gemessen und über dem Logarithmus der Frequenz dargestellt. Der Frequenzgenerator und der Lock-InVerstärker wird durch ein Software-Programm über die HPIB-Schnittstelle gesteuert, so daß die Messung automatisch für unterschiedliche Frequenzen durchgeführt
71
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
72
werden kann. Der Phasenfrequenzgang für ausgewählte Transistoren ist in den
Abb. 58 und Abb. 60 dargestellt.
5.2.1.1. Lock-In Verstärker
Für die Messungen wird ein Lock-In Verstärker des Models 5208 der Princeton
Applied Research Corporation [4] verwendet. Der Lock-In Verstärker dient im Meßaufbau zur Bestimmung der Amplitude und der Phasenverschiebung des Ausgangssignals des IU-Umsetzers in Bezug auf ein Referenzsignal.
Signal-Mixer
ω it+ϑ-ϕ
Input-Meßsignal
ωrt+ϑ
2ωrt-ωit+ϑ+ϕ
Intermediate
frequency
amplifier
∆=ϑ−ϕ
ωit+∆
PhasenDetektor
Tiefpaß
ωrt-ωit+ϕ
0°
Output ϕ
Phasenschieber ϕ
Zeitkonstante
Phasenschieber ϕ
ωit
ωrt-ωit
90°
Tiefpaß
Tiefpaß
X
ωrt+ωit
ωrt-ωit
ω rt
Input-Referenz
ω rt
ReferenzMixer
SinusOszillator
ω it
Y
X2
Output
Amplitude
Intermediate
frequency
generator
Σ
Y2
Output ∆
Phase
Abb. 46: Funktionsdiagramm des Lock-In-Verstärkers.
Die Abb. 46 zeigt ein Funktionsdiagramm des Lock-In-Verstärkers. Als Eingangssignal erhält der Lock-In Verstärker das Ausgangssignal des IU-Umsetzers und ein
Referenzsignal, bezüglich dessen die Phasenverschiebung ermittelt werden soll.
Bei dem Input-Meßsignal ( ω r t + ϑ ) muß es sich um ein Sinussignal handeln, das
bezüglich des Referenzsignals ( ω r t ) um einen Winkel ϑ in der Phase verschoben
ist. Die Frequenzen beider Signale müssen identisch sein.
Referenz-Mixer
Das Signal des Frequenzgenerators wird als Referenzsignal dem Lock-In-Verstärker zugeführt (Input-Referenz). Ein spannungsgesteuerter Oszillator (Voltage Controlled Oszillator) erzeugt aus dem Referenzsignal ein phasengleiches Sinussignal
( ω r t ), das im Referenz-Mixer mit einem internen Sinussignal ( ω i t ) (intermediate frequency) mit einer Frequenz von 1,005 MHz multipliziert wird. Die Multiplikation wird
durchgeführt, damit sich die Phasenverschiebung zwischen Meßsignal und Referenzsignal nach dem Signal-Mixer nur noch auf die interne Frequenz ( ω i t ) bezieht.
Es entsteht nach Anwendung der Additionstheoreme 6 Gl.(162) ein Differenzsignal
( ω r t – ω i t ) und ein Summensignal ( ω r t + ω i t ) .
6
Additionstheoreme:
sin x sin y = 1--- [ cos ( x – y ) – cos ( x + y ) ]
2
sin x cos y = 1--- [ sin ( x – y ) + sin ( x + y ) ]
2
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
sin ( ω r t ) sin ( ω i t ) = 1--- [ cos ( ω r – ω i )t – cos ( ω r + ω i )t ].
2
(162)
In einem anschließenden Phasenschieber wird das Ausgangssignal des Referenz-Mixers um einen beliebigen Winkel ϕ verschoben. Das Summensignal
( ω r t + ω i t + ϕ ) wird durch einen Tiefpaßfilter unterdrückt.
Signal-Mixer
Der Signal-Mixer multipliziert das Input-Meßsignal ( ω r t + ϑ ) mit dem phasenverschobenen Differenzsignal ( ω r t – ω i t + ϕ ) des Referenz-Mixers. Das Input-Meßsignal mit der Amplitude A muß mit dem Referenzsignal in der Frequenz identisch
sein, es ist aber zum Referenzsignal um den zu bestimmenden Winkel ϑ phasenverschoben.
1
--- A sin ( ω r t + ϑ ) cos ( ( ω r – ω i )t + ϕ )
2
(163)
= 1--- A [ sin ( ω i t + ϑ – ϕ ) + sin ( 2ω r t – ω i t + ϑ + ϕ ) ]
4
intermediate frequency amplifier
Bei der Multiplikation Gl.(163) entsteht wiederum ein Differenzsignal
( ω r t + ϑ ) – ( ω r t – ω i t + ϕ ) = ω i t + ϑ – ϕ = ω i t + ∆ mit ∆ = ϑ – ϕ
(164)
und ein Summensignal
( ω r t + ϑ ) + ( ω r t – ω i t + ϕ ) = 2ω r t – ω i t + ϕ + ϑ .
(165)
Die Resonanzfrequenz des nachfolgenden Verstärkers (intermediate frequency
amplifier) liegt genau bei ω i t , so daß nur das Differenzsignal ( ω i t + ∆ ) verstärkt
wird und das Summensignal wegfällt. Das Verstärkerausgangssignal wird im ersten
Kanal des Phasen-Detektors mit der internen Frequenz ω i t , im zweiten Kanal mit
der um genau 90° verschobenen internen Frequenz ω i t multipliziert.
Abb. 47: Amplitudengang in [dB] des intermediate frequency amplifier [4]
73
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
0°-Phasen-Detektor:
1
1
--- A sin ( ω i t + ϑ – ϕ ) sin ( ω i t ) = --- A [ cos ( ϑ – ϕ ) – cos ( 2ω i t + ϑ – ϕ ) ]
4
8
(166)
90°-Phasen-Detektor:
1--- A sin ( ω t + ϑ – ϕ ) cos ( ω t ) = 1--- A [ sin ( ϑ – ϕ ) + sin ( 2ω t + ϑ – ϕ ) ]
i
i
i
4
8
Real- und Imaginärteil
Zeitkonstante
Ein Tiefpaßfilter unterdrückt die Summenfrequenz ( 2ω i t + ϑ – ϕ ), so daß das
Input-Meßsignal in den Realteil x und Imaginärteil y bezüglich des um den Phasenwinkel ϕ verschobenen Referenzsignals aufgespalten wird.
1
x = --- A cos ∆ mit ∆ = ϑ – ϕ
8
(168)
y = 1--- A sin ∆
8
(169)
Die Zeitkonstante, die vom Benutzer am Lock-In Verstärker eingestellt werden
kann, bestimmt die Frequenz des Tiefpaßfilters. Um so größer die Zeitkonstante
gewählt wird, desto größer wird die Rauschunterdrückung. Im Idealfall liegt hinter
dem Filter nur noch ein Gleichspannungsanteil vor, dessen Wert sich mit dem Realund Imaginärteil des Meßsignals ändert. Die Amplitude des Meßsignals ergibt sich
aus:
1--- A =
8
Autoset
(167)
2
 1--- A ( ( sin ∆ ) 2 + ( cos ∆ )2 ) .
8 
(170)
Die Amplitude A, die Phasenverschiebung ϕ und der Winkel ∆ können mit dem
Lock-In Verstärker bestimmt werden. Der Verstärker bietet die Möglichkeit automatisch die Phasenverschiebung ϕ so zu wählen, daß sie genau der Phasenverschiebung zwischen dem Meßsignal und dem Referenzsignal entspricht. Dazu ändert der
Lock-In Verstärker den Winkel ϕ, bis der Realteil x ein Maximum erreicht. Der Winkel ∆ und der Imaginärteil y werden in diesem Fall Null.
5.2.1.2. Ablaufsteuerung der Frequenzgangmessung
Die Frequenzgangmessungen werden automatisiert durchgeführt, um Verläufe mit
möglichst vielen Meßpunkten zu erhalten. Die Messungen werden über die HPIBSchnittstelle gesteuert, wobei das Programm „veetest“ von Hewlett Packard verwendet wird.
Phasenfrequenzgang
Der Lock-In-Verstärker bietet grundsätzlich zwei Möglichkeiten, die Phasenverschiebung zwischen Meßsignal und Referenzsignal für unterschiedliche Frequenzen zu bestimmen.
Die erste Möglichkeit besteht darin, bei jeder Frequenz erneut die Autoset-Funktion des Lock-In-Verstärkers durchzuführen, wobei die absolute Phasenverschiebung zwischen Meßsignal und Referenzsignal ermittelt wird. Dieser Vorgang läuft
vergleichsweise langsam ab, da zur Bestimmung der Phase die interne Phasenver-
74
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
schiebung ϕ des Lock-In-Verstärkers so lange erhöht wird, bis der Realteil x ein
Maximum erreicht.
Sehr viel schneller kann der Winkel ∆ bestimmt werden, der sich direkt aus dem
Imaginärteil y und Realteil x ergibt. Um die absolute Phasenverschiebung ϑ zu
errechnen, muß dann eine Kalibrierung durchgeführt werden, wobei dabei die AutoSet-Funktion des Lock-In-Verstärkers genutzt wird. Die Auto-Set-Funktion wird am
Anfang jeder Frequenzgangmessung durchgeführt. ϕ ist die Phasenverschiebung
zwischen Meßsignal und Referenzsignal bei der Kalibrierungsfrequenz. Wird für
jede beliebige Frequenz der Winkel ∆ bestimmt, kann daraus die Phasenverschiebung berechnet werden.
ϑ = ∆+ϕ
Amplitudenfrequenzgang
(171)
Zur Aufnahme des Amplitudenfrequenzgangs kann direkt die Amplitude des Meßsignals aus dem Lock-In-Verstärker ausgelesen werden. Das Ausgangssignal entspricht dem Effektivwert der Amplitude.
5.2.1.3. Programmbeschreibung
Abb. 48 stellt die Bedienungsoberfläche, Abb. 54 und Abb. 55 den gesamten
Signalfluß zur Steuerung der Frequenzgangmessung dar. Die einzelnen Objekte
sind fortlaufend nummeriert. An der linken Seite gehen in die Objekte die Eingangsgrößen ein, an der rechten Seite liegen nach der Verarbeitung die Ausgangsgrößen
an. Zusätzlich besitzen alle Objekte an der oberen Seite einen Steuereingang, der
optional verwendet werden kann. Ein Objekt wird nur dann aktiviert, wenn an allen
Eingängen die Eingangsgrößen anliegen. Ist der Steuereingang angeschlossen, so
muß auch an diesem Eingang ein Signal anliegen, damit die Anweisungen im inneren des Objekts ausgeführt werden. Sobald die Bearbeitung des Objekts abgeschlossen ist und die Daten an den Ausgängen gültig sind, liegt am
Steuerungsausgang an der unteren Seite des Objekts ein Signal an.
Abb. 48: Bedienungsoberfläche zur Steuerung der Frequenzgangmessung.
Entwickelt mit veetest von HP.
75
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
Funktionsgenerator Grundeinstellungen (71)
Vor Beginn der Messung wird der Funktionsgenerator HP3314 in eine Grundeinstellung gebracht, die in den Objekten 72 und 73 spezifiziert ist. Der Funktionsgenerator HP3314 wird unter der Adresse 707 angesprochen.
Abb. 49: Funktions-Generator: Grundeinstellungen (71)
Spannungquelle
U DS (69)
In Objekt 69 wird die Spannung U DS eingestellt, die in Objekt 70 angegeben ist.
Dabei ist zu beachten, daß für einen p-Kanal-Transistor Source gegenüber Drain
auf positiverem Potential liegen muß, d.h. daß U DS negativ ist. Im Schaltungsaufbau liegt Drain auf Masse-Potential, so daß die an der Spannungsquelle eingestellte Spannung (-U DS ) entspricht. Als Spannungs- bzw. Stromquelle dient der
Parameter-Analyzer HP4145a mit der Adresse 730. Es können in Objekt 69 der verwendete Kanal des Parameter-Analyzers und die Betriebsart (Spannungsquelle
oder Stromquelle) ausgewählt werden. Die Begrenzung gibt beim Betrieb als Spannungsquelle den maximalen Strom, beim Betrieb als Stromquelle die maximale
Spannung an. Für diese Messung wird der Kanal 1 (SMU1) als Spannungsquelle
betrieben.
Messung I DS (75)
Zur Kontrolle des Arbeitspunkts wird in Objekt 75 der konstante Strom im eingestellten Arbeitspunkt gemessen. Den Wert stellt der Parameter-Analyzer direkt zur
Verfügung. Der ausgegebene Stromwert entspricht (-I DS ).
Abb. 50: Auslesen von I DS aus dem Parameter-Analyzer HP4145a (75)
Daten speichern
(53)
Das Objekt „Bemerkungen in File schreiben“ (53) legt einen Lock-File an, in dem
alle eingegebenen Werte und alle gemessenen Werte im ASCII-Format gespeichert
werden. Mittels vordefinierter Objekte wird der File-Name und ein Bemerkungstext
bei der Ausführung des Objekts abgefragt.
Abb. 51: Bemerkungen in File schreiben (53)
76
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
Einstellungen
Funktionsgenerator für Kalibrierung (41)
Bei der Kalibrierung wird die absolute Phasenverschiebung ϕ zwischen dem Meßsignal und dem Referenzsignal bestimmt, um die bei den nachfolgenden Messungen gemessene relative Phasenverschiebung bezüglich des Meßsignals bei der
Kalibrierungsfrequenz in eine absolute Phasenverschiebung umzurechen. Bei den
durchgeführten Frequenzgangmessungen wurde als Kalibrierungsfrequenz 100Hz
gewählt, da bei dieser Frequenz der Lock-In-Verstärker genaue Ergebnisse liefert
und die Phasenverschiebung des Transistors noch klein ist.
Abb. 52: Lock-In-Verstärker Grundeinstellungen (7)
Lock-In-Verstärker Autoset (7)
Zur Bestimmung der absoluten Phasenverschiebung wird die Autoset-Funktion
des Lock-In-Verstärkers durchgeführt. In Objekt 7.0 wird neben anderen Grundeinstellungen diese Funktion gestartet. Die nachfolgende Schleife (Objekt 7.1 bis 7.4)
wird so lange durchlaufen, bis der Lock-In-Verstärker ein positives Quittungssignal
nach Abschluß der Autoset-Funktion sendet.
Phasenverschiebung bei Kalibrierung (57)
Aus den Werten des Lock-In-Verstärker wird in Objekt 57 durch mehrere Umrechnungen die Phasenverschiebung ϕ bei der Kalibrierungsfrequenz berechnet. Dabei
kann ϕ einen Wert zwischen +/-180° annehmen.
Objekt 13 stellt den Beginn einer Schleife dar, wobei die Frequenz in logarithmischen Schritten nach jedem Durchlauf erhöht wird, bis die maximale Frequenz
erreicht ist. In Objekt 9 wird der Funktionsgenerator auf die aktuelle Frequenz eingestellt. Worauf mit dem Lock-In-Verstärker die Phasenverschiebung und die
Amplitude bestimmt werden kann.
Messung Lock-InVerstärker (6)
Bevor der Wert für die Amplitude aus dem Lock-In-Verstärker ausgelesen werden
kann, muß der richtige Meßbereich des Verstärkers gewählt werden. Dazu stellt der
Verstärker eine Auto-Range-Funktion zur Verfügung, die automatisch den besten
Meßbereich einstellt. Diese Funktion wird mit Objekt 6.5 gestartet. Zur Meßbereichseinstellung erhöht der Lock-In-Verstärker so lange die Empfindlichkeit seines
Meßbereichs, bis das Ausgangssignal übersteuert ist. Anschließend wird die Empfindlichkeit wieder um einen Bereich zurückgesetzt. Die Zeit, die der Verstärker
benötigt, um den richtigen Meßbereich einzustellen, nimmt mit höheren Frequenzen
ab, dies wird im Objekt „Wartezeit“ (6.7) berücksichtigt. Die Amplitude gibt den
Effektivwert des Signals an, der in einen Scheitelwert umgerechnet wird (6.6). Die
Phase entspricht der relativen Phasenverschiebung bezüglich des Signals bei der
Kalibrierungsfrequenz.
77
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
Abb. 53: Messung Lock-In-Verstärker (6)
dB-Umrechnung
Die Amplitude wird in Objekt 16 in einen dB-Wert umgerechnet, der sich auf den
in Objekt 68 angegebenen Wert bezieht.
Darstellung der
Daten (15,17)
In den Diagrammen 15 und 17 wird der Amplitudenfrequenzgang in dB und der
Phasenfrequenzgang logarithmisch dargestellt. In Objekt 67 wird die absolute Phasenverschiebung errechnet.
Daten speichern
(54)
Die Meßwerte werden in folgender Reihenfolge in die Datei geschrieben: Frequenz, Amplitude, Amplitude in dB, Phasenverschiebung. Es wird dabei nur die
relative Phasenverschiebung und die Phasenverschiebung bei der Kalibrierungsfrequenz gespeichert.
78
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
Frequenz
Amplitude
Phase
Abb. 54: Flußdiagramm (Teil1) zur Ablaufsteuerung der Frequenzgangmessung.
Entwickelt mit der Software „veetest“.
79
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
Frequenz
Amplitude
Phase
Abb. 55: Flußdiagramm (Teil2)
80
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
5.2.1.4. Messergebnisse
Bevor die Frequenzgangmessungen der EOS-Transistoren durchgeführt werden
können, muß der Amplituden- und Phasenfrequenzgang des IU-Umsetzers einschließlich des gesamten Messaufbaus bestimmt werden. Das Frequenzverhalten
des IU-Umsetzers wird dabei durch die Kapazitäten an seinem Eingang stark beeinflußt (Kap. 4.1), die hauptsächlich durch die parasitären Kapazitäten der EOS-Transistoren gebildet werden. Um diesen Einfluß zu berücksichtigen, wird für jeden
EOS-Transistor eine Messung des Amplituden- und Phasenfrequenzgangs des IUUmsetzers durchgeführt, wobei der jeweilige EOS-Transistor in einem konstanten
Arbeitspunkt als kapazitive Last an den Eingang des IU-Umsetzers gelegt wird
(Abb. 56). Mit einem Frequenzgenerator wird über einen Widerstand ein sinusförmiges Stromsignal unterschiedlicher Frequenz in den IU-Umsetzer eingeprägt. Das
Spannungssignal des Frequenzgenerators dient dem Lock-In-Verstärker als Referenzsignal.
-U DS
+2,5V
Lock-InVerstärker
S
Frequenzgenerator
Phase
Amplitude
D
~
Frequenzgang
Software veetest
IUWandler
HPIB-Schnittstelle
Frequenz
Abb. 56: Meßaufbau zur Frequenzgangmessung des IU-Umsetzers. Der entsprechende Transistor wird in einem festen Arbeitspunkt betrieben, so daß
er für den IU-Umsetzer nur eine kapazitive Last darstellt.
Der Meßaufbau für die Frequenzgangmessungen der EOS-Transistoren entspricht der Darstellung in Abb. 45. Die in Abb. 57 bis Abb. 60 abgebildeten Amplituden- und Phasenverläufe der EOS-Transistoren sind bereits um den Amplitudenund Phasenfrequenzgang des IU-Umsetzers korrigiert. Es wurden jeweils die ersten
Transistoren einer Reihe (Transistoren a) vermessen.
Die Ergebnisse der Messungen lassen sich in zwei unterschiedliche Frequenzgangverläufe einteilen. Bei den Transistoren der Reihen 3, 4, 5 und 7 liegt die 3dBKnick-Frequenz bei knapp 100kHz, während bei den Transistoren der Reihen 9, 10
und 11 die 3dB-Knick-Frequenz schon bei 10kHz erreicht wird. Der Frequenzgangverlauf der Transistoren scheint im wesentlichen von der Größe der Gate-Bereiche
unabhängig zu sein. Die Transistoren der Reihen 3, 4, 5 und 7 unterscheiden sich
vielmehr von den Transistoren der Reihen 9, 10 und 11 durch die Lage auf dem
Cultus-Chip. Sie liegen auf der gegenüberliegenden Seite (Abb. 11).
An dieser Stelle soll auf eine weitere Interpretation der Messergebnisse verzichtet werden, da bei den Messungen der lokalen extrazellulären Spannungen an
Herzmuskelzellen (Kap. 7) die obere Grenze der Bandbreite des IU-Umsetzers
unterhalb von 1kHz liegt. Die Messergebnisse zeigen, daß in diesem Frequenzbereich der Frequenzgang der EOS-Transistoren eine zu vernachlässigende Rolle
spielt.
81
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
1
0
Amplitude [dB]
-1
-2
Transistor 3a
Transistor 4a
Transistor 5a
Transistor 7a
-3
-4
-5
-6
10
100
1k
10k
100k
Frequenz [Hz]
Abb. 57: Amplitudenfrequenzgang der Transistoren aus den Reihen 3, 4, 5 und 7.
Die Messungen wurden jeweils an den ersten Transistoren einer Reihe
(Transistoren a) durchgeführt.
-165
-180
-195
Phase [DEG]
-210
-225
Transistor 3a
Transistor 4a
Transistor 5a
Transistor 7a
-240
-255
-270
-285
10
100
1k
10k
100k
Frequenz [Hz]
Abb. 58: Phasenfrequenzgang der Transistoren (a) aus den Reihen 3, 4, 5 und 7.
82
Charakterisierung der EOS-Transistoren
Frequenzverhalten
1
0
-1
Amplitude [dB]
-2
-3
-4
Transistor 9a
Transistor 10a
Transistor 11a
-5
-6
-7
-8
10
100
1k
10k
100k
Frequenz [Hz]
Abb. 59: Amplitudenfrequenzgang der Transistoren (a) aus den Reihen 9, 10 und
11.
-165
-180
-195
Phase [DEG]
-210
-225
Transistor 9a
Transistor 10a
Transistor 11a
-240
-255
-270
-285
10
100
1k
10k
100k
Frequenz [Hz]
Abb. 60: Phasenfrequenzgang der Transistoren (a) aus den Reihen 9, 10 und 11.
83
Messung des intrazellulären Potentialverlaufs an Herzmuskelzellen
6. Messung des intrazellulären Potentialverlaufs an Herzmuskelzellen
Das intrazelluläre Potential von Zellen kann durch die Patch-Clamp-Technik
gemessen und von außen über einen Injektionsstrom gesteuert werden. Zur Kontrolle der Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit Feld-Effekt-Tansistoren, die in Kap. 7 beschrieben werden, ist es notwendig, eine Zelle gezielt zu
stimulieren und den intrazellulären Potentialverlauf zu messen.
In diesem Kapitel wird zunächst nur die Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen mit der Patch-Clamp Technik beschrieben. Auf zeitgleiche Messungen mit Feld-Effekt-Transistoren wird erst in Kap. 7 eingegangen. Die Messungen
werden auf einem Aufbau (Abb. 61) durchgeführt, der dem Aufbau in Kap. 7 entspricht.
Abb. 61: Meßplatz mit Auflichtmikroskop, Mikromanipulator, Multiplexer- und
Verstärkereinheit für die Messung der elektrischen Aktivität von
Herzmuskelzellen mit EOS-Transistoren.
Für die Messungen werden Herzmuskelzellen von erwachsenen (adulten) Ratten
verwendet. Die Zellen werden kurz vor den Messungen isoliert und können in einer
Nährlösung ca. 12 Stunden aufbewahrt werden. Zur Präparation der Zellen wird das
Herz aus der Ratte herausgeschnitten und vom Blut gereinigt. Durch eine anschließende Spülung des Herzens mit einem Enzym (Collagenase) über die Aorta wird
das Bindegewebe zwischen den Muskelzellen aufgelöst, so daß die einzelnen Zellen in einer Lösung als Emulsion vorliegen. Im Anhang v befindet sich eine ausführliche Präparationsanleitung.
Das Funktionsprinzip eines Patch-Clamp-Verstärkers wird in Kap. 6.1 dargestellt.
In Kap. 6.2 wird die Vorgehensweise bei Messungen von Aktionspotentialen an
Herzmuskelzellen beschrieben. Eine detaillierte Patch-Anleitung für Herzmuskelzellen enthält der Anhang vi.
84
Messung des intrazellulären Potentialverlaufs an Herzmuskelzellen
Patch-Clamp-Technik
6.1.Patch-Clamp-Technik
Die Patch-Clamp-Technik ermöglicht es, das intrazelluläre Potential in Nervenzellen oder Muskelzellen zu messen und gleichzeitig den Strom I über die Zellmembran zu steuern (Current-Clamp-Mode, CC) oder aber ein intrazelluläres Potential
vorzugegeben, das durch einen Strom I in der Zelle eingestellt wird (VoltageClamp-Mode, VC).
Die Zelle wird bei Patch-Clamp-Messungen mit einer Mikro-Pipette aus Glas mit
einem Öffnungsdurchmesser von 2-4µm kontaktiert. Die Pipette ist dabei mit einem
Elektrolyten (intrazelluläre Lösung) gefüllt, dessen Zusammensetzung der intrazellulären Flüssigkeit der Zelle ähnlich ist. Der Elektrolyt in der Pipette ist mit einem
Silberchlorid-Draht mit dem Eingang eines IU-Umsetzers verbunden.
Bei den Messungen ist eine „dichte“ Verbindung zwischen der Pipettenöffnung
und dem Zellinneren notwendig. Dazu wird die Pipette so auf die Zellmembran aufgesetzt, daß die Membran an der Pipettenöffnung abdichtet und kein Strom aus der
Pipette in den Elektrolyten, der die Zelle umgibt, fließen kann. Der Widerstand zwischen der Pipette und dem extrazellulären Elektrolyten sollte im Giga-Ohm-Bereich
liegen (Giga-Seal). Ist eine Abdichtung in dieser Größenordnung erreicht, kann
durch kurzen Unterdruck in der Pipette die Zellmembran durchgerissen werden, so
daß eine Verbindung zwischen dem Elektrolyten in der Pipette und dem Zellinneren
besteht. Über den Voltage-Clamp-Modus eines Patch-Clamp-Verstärkers kann die
Spannung in der Zelle gesteuert und der dazu notwendige Strom I gemessen werden oder es kann über den Patch-Clamp-Verstärker im Current-Clamp-Modus der
Stromfluss I in die Zelle vorgegeben und das intrazelluläre Potential gemessen
werden.
IU-Wandler
Rf
Vp
I
+
A
V0
+
B
V Iout
V com
Abb. 62: Voltage-Clamp-Modus des Patch-Clamp-Verstärkers.
Voltage-Clamp
Die Abb. 62 zeigt schematisch die Verschaltung des Patch-Clamp-Verstärkers im
Voltage-Clamp-Modus. Die Ausgangsspannung V0 am Operationsverstärker A stellt
sich so ein, daß die Spannung in der Pipette V p mit der vorgegebenen Spannung
V com identisch ist ( V p = V com ) 1 . Die Spannung V 0 ist proportional zum Strom I der
durch die Pipette aus der Zelle fließt und kann verstärkt am Ausgang von Operationverstärker B, bezogen auf V com , gemessen werden.
1
com = command
85
Messung des intrazellulären Potentialverlaufs an Herzmuskelzellen
Patch-Clamp-Technik
IU-Wandler
Rf
Vp
I
+
A
V0
+
V Iout
B
V com
C
V Icom
Regler
V out
Abb. 63: Current-Clamp-Modus des Patch-Clamp-Verstärkers.
Current-Clamp
Im Current-Clamp-Modus Abb. 63 des Patch-Clamp-Verstärkers wird der gleiche
IU-Umsetzer verwendet. Die Spannung in der Pipette Vp wird nicht mehr von außen
vorgegeben, sondern durch eine Rückkopplung des Ausgangssignals des IUUmsetzers gesteuert. Die Differenz zwischen der Spannung V Icom , die proportional
dem vorgegebenen Strom Icom ist, und der Ausgangsspannung V Iout des IU-Umsetzers, die proportional zum Strom I durch die Pipette ist, wird über einen Regler C
als Kommando-Spannung Vcom für den Operationsverstärker A vorgegeben. Die
Spannung Vcom = V out entspricht der Spannung in der Zelle, die sich einstellt, wenn
der vorgegebene Strom I com aus der Zelle heraus fließt 2 .
2
Die Spannungen V Icom und V Iout beziehen sich auf V com = V out .
86
Messung des intrazellulären Potentialverlaufs an Herzmuskelzellen
Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen
6.2.Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen
Die Abb. 64 zeigt eine aus einer adulten Ratte isolierte Herzmuskelzelle. Bei der
Päparation wird das Bindegewebe zwischen den einzelnen Herzmuskelzellen durch
ein Enzym (Cologenaes) aufgelöst.
Abb. 64: Präparierte Herzmuskelzelle aus einer adulten Ratte. Die Zelle (ca.
80µm lang und ca. 20µm breit) ist von roten Blutkörperchen umgeben.
In der rechten oberen Ecke befindet sich eine bereits abgestorbene
Herzmuskelzelle.
Beim Patchen von Muskel- bzw. Nervenzellen wird in der Regel mit UnterlichtMikroskopen gearbeitet, damit die Patch-Pipette direkt von oben der Zellmembran
angenähert werden kann. Zwischen der Zellembran und der Pipettenöffnung sollte
nach Möglichkeit ein rechter Winkel bestehen, damit sich zwischen Pipette und
Membran eine gute Abdichtung ausbilden kann. Der Cultus-Chip ist lichtundurchlässig, so daß für die Messungen mit EOS-Transistoren nur mit einem AuflichtMikroskop gearbeitet werden kann (Abb. 61). Für die Messungen wird ein Objektiv
verwendet, das in den Elektrolyten eintaucht, damit Oberflächenreflektionen das
Bild nicht beeinträchtigen. Durch diese Anordnung besteht zwischen der Objektivunterkante und der Zellmembran ein nur ca. 2mm dicker Spalt (Abb. 65).
Pipette
Objektiv
ca. 2mm
Plexiglasschale
Zelle
Chip
Abb. 65: Aufbau zum Patchen mit einem Auflicht-Mikroskop. Um die Pipette
möglichst senkrecht auf die Zellmembran aufzusetzen, muß die Pipette
doppelt gebogen werden.
Um senkrecht mit der Pipette auf der Zelle aufsetzen zu können, hat sich eine
doppelt gebogene Pipette bewährt (Abb. 65). Zur Herstellung solcher Pipetten
wurde von T.Kind [29] ein Pipetten-Biegeverfahren entwickelt.
87
Messung des intrazellulären Potentialverlaufs an Herzmuskelzellen
Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen
Vorbereitungen
Die Messungen können nicht in der Nährlösung durchgeführt werden, sondern es
ist eine spezielle Lösung (extrazelluläre Lösung) notwendig, die den Abdichtungsvorgang zwischen der Pipette und der Zellmembran begünstigt. Im ersten Schritt
wird die Plexiglasschale über dem Chip mit extrazellulärer Lösung gefüllt. Als Masseelektrode wird ein Silberchloriddraht eingetaucht und ein Zu- und Abfluß (Flow)
für extrazelluläre Lösung so justiert, daß die extrazelluläre Lösung in der Plexiglasschale ausgetauscht werden kann.
Herzmuskelzellen
hinzugeben
Ist der Aufbau soweit vorbereitet, kann ein Tropfen Nährlösung mit Herzmuskelzellen hinzugegeben werden. Die Zellen setzen sich langsam auf der Chipoberfläche ab (Abb. 66). In einem folgenden Spülvorgang (Spülung mit mind. 10ml
extrazellulärer Lösung) wird über den Flow die extrazelluläre Lösung ausgetauscht,
damit sich die hinzugegebene Nährlösung stark verdünnt. Nach abgeschlossenem
Spülvorgang wird der Flow abgeschaltet und der Zu- und Abfluß kann entfernt werden.
Abb. 66: Der Cultus-Chip ist bedeckt mit extrazellulärer Lösung. Auf der ChipOberfläche haben sich Herzmuskelzellen abgesetzt. Die großen
schwarzen Kreise sind Luftblasen, die an der Chip-Oberfläche haften.
Herzmuskelzellen
auswählen
Für die Messungen muß aus den auf der Chip-Oberfläche abgesetzten Herzmuskelzellen eine geeignete Zelle ausgewählt werden. Es eignen sich Zellen besondersgut, die schon genau über dem Gate von EOS-Transistoren liegen, damit die
Zellen später nicht umgesetzt werden müssen. Die Oberfläche der Zellen sollte
keine stark ausgeprägte „Maiskolben-Struktur“ aufweisen. Langsames Zucken der
Zellen ist unproblematisch, da die Lösung in der Pipette die Substanz EGTA enthält. EGTA bindet die Ca 2+ Ionen in der Zelle, so daß eine Kontraktion nicht mehr
möglich ist.
Pipette füllen
Parallel zum Spülvorgang kann die gebogene Pipette mit intrazellulärer Lösung
gefüllt werden. Dazu wird sie in intrazelluläre Flüssigkeit eingetaucht (Halterung),
so daß sie sich über Kapillarwirkung von unten füllt. Ist die Flüssigkeit von der
unteren Öffung bis zum zweiten Knick in die Pipette eingedrungen, kann der restliche Teil von oben über eine Kanüle mit intrazellulärer Lösung aufgefüllt werden.
Luftblasen lösen sich ggf. durch leichtes Klopfen.
88
Messung des intrazellulären Potentialverlaufs an Herzmuskelzellen
Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen
Abb. 67: Direkt über dem Gate eines EOS-Transistors liegt eine Herzmuskelzelle
(rechts oben). Die drei runden Objekte sind abgestorbene Zellen.
Pipette eintauchen
Die gefüllte Pipette wird nun am Patch-Clamp-Verstärker eingesetzt und senkrecht ausgerichtet. Bevor die Pipette in die Flüssigkeit eingetaucht wird, muß unbedingt ein Überdruck (ca. 15cm Wassersäule) in der Pipette erzeugt werden, damit
sich kein Schmutz an der Öffnung festsetzen kann. Der Überdruck wird durch eine
30ml Spritze hergestellt und über eine Wassersäule kontrolliert.
Der Patch-Clamp-Verstärker wird beim Eintauchen der Pipette im Voltage-ClampSearch-Modus betrieben. Der Search-Modus führt zu einem automatischen Offsetabgleich. Der Offsetabgleich muß dennoch durch eine manuelle Regelung am
Patch-Clamp-Verstärker eingestellt werden, um den Verstärker anschließend in den
Voltage-Clamp-Modus zu schalten. Ein Testimpuls (10mV, 10ms) ermöglicht mit der
Patch-Clamp-Software die Bestimmung des Pipettenwiderstandes. Gute Erfahrungen beim Patchen an Herzmuskelzellen wurden mit Pipetten mit einem Widerstand
zwischen 1, 7MΩ und 2, 2MΩ gemacht.
Abb. 68: Zwischen der Zellmembran einer Herzmuskelzelle und der Pipettenöffnung (im Kreismittelpunkt) hat sich ein Giga-Seal ausgebildet. Durch
kurzen Unterdruck in der Pipette wurde die Zellmembran durchgerissen.
89
Messung des intrazellulären Potentialverlaufs an Herzmuskelzellen
Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen
Absenken der
Pipette
Die Position der Pipette wird über einen Mikromanipulator gesteuert. Beim Absenken wird die Pipettenöffnung mit der Schärfenebene des Mikroskops verfolgt. Der
Abstand zwischen Zelloberfläche und Pipettenöffnung läßt sich durch Verstellen
der Schärfenebene ermitteln. Die Pipette wird soweit abgesenkt bis sich die Zellmembran deutlich eindellt und sich der Pipettenwiderstand um ca. 3 – 4MΩ erhöht.
Das letzte Heranfahren erfolgt mit der langsamsten Geschwindigkeit des Mikromanipulators. Liegt die Pipettenöffnung gut auf der Zellmembran auf, wird der Überdruck in der Pipette abgelassen und ein Unterdruck von ca. 10cm Wassersäule
eingestellt.
Seal
Bei Erfolg wächst innerhalb weniger Minuten der Widerstand zwischen Pipette
und Bad (Seal-Widerstand) an. Die Empfindlichkeit des Patch-Clamp-Verstärkers
und die dazugehörige Softwareeinstellung muß dementsprechend nachgeregelt
werden. Ab einem Seal-Widerstand von 100MΩ kann die Haltespannung des PatchClamp-Verstärkers abgesenkt werden. Vor dem Durchreißen der Membran muß sie
der intrazellulären Spannung (ca. -80mV) angepaßt sein.
Mit dem Anstieg des Seal-Widerstands kann am Patch-Clamp-Verstärker die
Kapazität der Pipette kompensiert werden. Itterativ wird am Kapazitätsabgleich des
Patch-Clamp-Verstärkers (C-Slow, C-Fast) eine Einstellung gesucht, bis das tatsächliche Stromsignal, das in die Zelle fließt, dem vorgegebenen rechteckigen
Testimpulssignal entspricht.
Stimulus [A]
1n
0
10
20
30
40
50
60
70
50
60
70
time [ms]
40
intracelluläre Spannung [mV]
20
0
-20
-40
-60
-80
10
20
30
40
time [ms]
Abb. 69: Stimulationsimpuls (oben). Typischer Verlauf des Aktionspotentials von
isolierten Herzmuskelzellen (unten).
90
Messung des intrazellulären Potentialverlaufs an Herzmuskelzellen
Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen
Durchreißen der
Membran
Hat der Seal-Widerstand eine Größenordnung von 1GΩ erreicht (Giga-Seal),
kann die Zellmembran durchgerissen werden. Der Unterdruck in der Pipette wird
dazu abgelassen und mit einer kleinen Spritze (5ml) wird ohne Wassersäule ein
sehr kurz anhaltender Unterdruck erzeugt (Spritze vollständig durchziehen). Ist die
Membran durchgerissen, übersteuert der Patch-Clamp Verstärker. Der Verstärker
und die Software muß möglichst schnell auf Current-Clamp-Modus umgestellt werden. Bei einem „guten“ Seal liegt das intrazelluläre Ruhepotential bei -60 bis 80mV. Durch einen negativen Haltestrom kann bei einem „schlechten“ Seal das
intrazelluläre Potential abgesenkt werden.
Stimulation der
Zelle
Zur Stimulation der Zelle wird im Current-Clamp-Modus ein Stromimpuls in die
Zelle injeziert, der über die Patch-Clamp-Software gesteuert werden kann. Die
Amplitude und Länge des Impulses wird so eingestellt, daß der Impuls gerade ausreichend ist, die Zelle bis über die Reizschwelle zu depolarisieren. Zur Erregung
von Herzmuskelzellen lieferten Impulse einer Länge von ca. 3-5ms und einer Höhe
von ca. 1nA (Abb. 69 oben) die besten Ergebnisse.
Die Abb. 69 (unten) stellt den Verlauf eines typischen Aktionspotentials dar, das
an isolierten Herzmuskelzellen von adulten Ratten gemessen wurde. Nach der
Depolarisation der Zelle infolge des Stimulationsimpulses bis auf -30mV fällt das
intrazelluläre Potential kurzzeitig leicht ab, steigt anschließend aber in einem steilen Aufstrich (ca. 2ms) schnell bis auf einen Überschuß von ca. +30mV an. Die
Repolarisation erfolgt für Herzmuskelzellen typischerweise mit zwei Wendepunkten
im Kurvenverlauf. Nach ca. 40ms ist das Membranruhepotential wieder erreicht.
91
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Messung von Aktionspotentialen an Herzmuskelzellen
7. Messungen von lokalen extrazellulären
Spannungen mit EOS-Transistoren
In diesem Kapitel werden Messungen beschrieben, bei denen es erstmals gelungen ist, lokale extrazelluläre Spannungen an isolierten Herzmuskelzellen mit FeldEffekt-Transistoren zu messen. Die Signale, die mit den Transistoren aufgenommen werden konnten, stehen in einem eindeutigen Zusammenhang mit dem Ablauf
von Aktionspotentialen innerhalb der Herzmuskelzellen. Bei den Versuchen wurde
der Cultus-Chip eingesetzt, der in Kap.3 beschrieben und dessen EOS-Transistoren in Kap. 5 charakterisiert wurden.
Bei der Durchführung der Messungen werden die Herzmuskelzellen mit der
Patch-Clamp Technik kontaktiert, so daß die Zellen zum Ablauf eines Aktionspotentials stimuliert und der Membranspannungsverlauf registriert werden kann (Kap. 6).
Gleichzeitig wird die Modulation des Source-Drain-Stroms des EOS-Transistors
unterhalb der Zelle über einen IU-Umsetzer in eine Spannung umgesetzt, verstärkt
(Kap. 4) und aufgezeichnet.
Abb. 70: Multiplexer- und Verstärkereinheit im Meßaufbau. Oberhalb der DIPSchalter (blau) befindet sich der Cultus-Chip.
Schwierigkeit der
Messungen
Die Schwierigkeit der Messungen liegt besonders darin, daß mehrere Anforderungen gleichzeitig erfüllt sein müssen:
(1) Erfolgreiches Patchen der Herzmuskelzelle, d.h. periodische Erzeugung von
stabilen Aktionspotentialen über einen längeren Zeitraum.
(2) Die Zelle muß das Gate des gewünschten EOS-Transistors abdecken und es
darf nur ein schmaler Spalt zwischen der Zellembran und der Gateoxid-Oberfläche bestehen.
(3) Der EOS-Transistor unterhalb der Zelle, die Multiplexer- und Verstärkereinheit und die Aufzeichnungssoftware muß zu dem Zeitpunkt, wenn Punkt (1)
und (2) erfüllt ist, funktionsfähig sein.
92
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Ergebnisse der Messungen
Im Rahmen dieser Arbeit waren viele Versuche notwendig, um diese drei Anforderungen gleichzeitig zu erfüllen.
Die periodische Erzeugung von stabilen Aktionspotentialen durch einen PatchClamp über einen längeren Zeitraum konnte nach anfänglichen Mißerfolgen regelmäßig und zuverlässig erreicht werden.
Liegt durch Zufall eine Herzmuskelzelle über dem Gate eines EOS-Transistors,
kann diese Zelle für die Messungen verwendet werden. Ist dies nicht der Fall, muß
eine andere Zelle nach erfolgreichem Patchen mit der Pipette angehoben und auf
dem Gate eines Transistors wieder abgesetzt werden. Dabei besteht jedoch die
Gefahr, daß die Zelle an der Chip-Oberfläche haftet und der Seal beim Anheben
der Zelle verloren geht. Die nachfolgenden Meßergebnisse wurden mit Herzmuskelzellen erzielt, die sich durch Zufall auf dem Gate eines Transistors abgesetzt
haben. Als besonders wichtig hat sich erwiesen, daß der jeweilige Transistor für die
Messungen schon vor Beginn des Patchen eingeschaltet wird, da das Betätigen der
DIP-Schalter des Multiplexers starke Erschütterungen hervorruft und der IU-Umsetzer Zeit benötigt, den Arbeitspunktstrom des Transistors zu kompensieren.
7.1.Ergebnisse der Messungen
Bei mehreren voneinander unabhängigen Messungen konnte im Rahmen dieser
Arbeit eine Kopplung zwischen einer Herzmuskelzelle und dem darunterliegenden
EOS-Transistors festgestellt werden. Die aufgenommenen Signalverläufe des Transistorstroms stehen dabei in einem Zusammenhang mit dem Ablauf eines Aktionspotentials in der Zelle. Es wurden bei den Messungen grundsätzlich unterschiedliche Signalverläufe festgestellt.
Die Transistoren werden bei den Messungen in einem Arbeitspunkt von
U GS = U DS = – 2, 5V betrieben. Der Arbeitspunktstrom kann aus den Kennlinien
(Anhang iv) abgelesen werden. Bei den Transistoren der Reihe 5 beträgt der Strom
im Arbeitspunkt I SD ≈ 150µA .
Der intrazelluläre Signalverlauf und der Verlauf des Ausgangssignals des IUUmsetzers wird während der Messungen mit der Hilfe der Patch-Clamp-Software
(ISO2) aufgezeichnet, so daß eine spätere Auswertung und Mittelwertbildung möglich ist.
Die Abb. 71 zeigt die Lage einer Herzmuskelzelle (Zelle 7) über einem EOS-Transistor (5b) in verschiedenen Einstellungen der Schärfenebene des Mikroskops. Im
oberen Bild liegt die Oberfläche der Zellmembran in der Schärfenebene, die Öffnung der Pipette ist schwach zu erkennen. Im unteren Bild ist die Schärfe auf die
Oberfläche des Chips eingestellt. Der Gate-Bereich ist deutlich sichtbar. Da die
Unterseite der Zellmembran noch zu erkennen ist, kann angenommen werden, daß
die Zelle auf der Siliziumoberfläche aufliegt.
93
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Ergebnisse der Messungen
Abb. 71: Eine Herzmuskelzelle (Zelle 7) liegt über dem Gate des EOS-Transistors 5b (unterschiedliche Schärfenebenen von oben nach unten). Bild
oben: Die Oberfläche der Zelle liegt in der Schärfenebene. Direkt über
dem Gate ist die Patch-Pipettenöffnung zu erkennen. Bild unten: Die
94
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Ergebnisse der Messungen
Siliziumoberfläche liegt in der Schärfenebene, die Zellunterseite ist
schemenhaft sichtbar. Im Verlauf der Messungen wird die Zelle mit der
Pipette auf das Gate gedrückt.
Bei beiden Messungen hat sich gezeigt, daß erst nach einem leichten Andrücken
der Zelle mit der Pipette eine Kopplung zwischen Zelle und Transistor meßbar wird.
Das Ausgangssignal des IU-Umsetzers, daß den Kleinsignalanteil des Transistorstroms widerspiegelt, enthält einen im Verhältnis zum Signal hohen Rauschanteil.
Ein eindeutiger Signalverlauf ist erst nach Mittelung über mehrere Aktionspotentiale
sichtbar.
Die Abb. 72 zeigt die Signale bei einer Mittelung über 7 Aktionspotentiale. Die
Daten stammen von Messungen an der Herzmuskelzelle (Zelle 7) der Abb. 71. Im
oberen Diagramm der Abb. 72 ist der Stimulationsimpuls dargestellt, in der Mitte
der Verlauf der intrazellulären Spannung und das untere Diagramm zeigt den Verlauf des Kleinsignalanteils des Transistorstroms 3 . Trotz des starken Rauschanteils
ist ein deutlicher Zusammenhang zwischen dem intrazellulären Spannungsverlauf
und dem Transistorsignal zu erkennen.
Im Verlauf der Messungen ändert sich der intrazelluläre Verlauf des Aktionspotentials und der Verlauf des Transistorsignals leicht. Die Signalverläufe zu unterschiedlichen Zeitpunkten sowie Mittelungen über unterschiedlich viele Perioden
sind im Anhang vii enthalten.
3
Der Kleinsignalanteil des Transistorstroms wurde aus dem Ausgangssignal des IU-Umsetzers berechnet. Dazu wurde der Umsetzungsfaktor 0,1V/nA verwendet.
95
Stimulus [A]
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Ergebnisse der Messungen
1n
0
10
20
30
40
50
60
70
50
60
70
50
60
70
time [ms]
40
intracelluläre Spannung [mV]
20
0
-20
-40
-60
-80
10
20
30
40
time [ms]
2n
Strommodulation Transistor [A]
1n
500p
0
-500p
-1n
10
20
30
40
time [ms]
Abb. 72: Messung an Zelle 7 mit Transistor 5b. Mittelwert über 7 Messungen
(Bilder 813-819 in iso-Datenaufzeichnung).
96
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Ergebnisse der Messungen
Die Abb. 73 zeigt die Positionierung der Herzmuskelzelle (Zelle 16) über dem
Transistor (5c). Obwohl die Zelle das Gate des EOS-Transistors nur mit dem Rand
abdeckt, kann zeitgleich zum Aktionspotential ein Transistorsignal beobachtet werden.
Abb. 73: Herzmuskelzelle (Zelle 16) liegt über dem Gate des EOS-Transistors 5c.
Obwohl die Zelle den Gatebereich nur mit dem Rand abdeckt, werden
gute Messergebnisse erzielt. Bild oben: Die „Maiskolben-Struktur“ der
Zelloberfläche und die Pipettenöffnung ist gut erkennbar. Bild unten:
Der Gatebereich des EOS-Transistors liegt fast vollständig unter der
Zelle.
Damit das Ruhepotential der Zelle bei knapp -80mV gehalten werden kann, wird
ein negativer Ruhestrom von -200pA in die Zelle eingeprägt. Ein negativer Ruhestrom ist notwendig, um das Ruhepotential zu halten, wenn der Seal zwischen
Pipette und Membran leicht „undicht“ ist.
Das Diagramm der Abb. 75 enthält die Ergebnisse der Messungen an Zelle 16. In
Abb. 75 wurde der Mittelwert über den Ablauf von 73 Aktionspotentialen gebildet.
97
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Ergebnisse der Messungen
Abb. 74: Nach verstärktem Andrücken der Herzmuskelzelle (Zelle 16) mit der
Patch-Pipette krümmt sich die Zelle leicht. Ihre elektrische Aktivität wird
dadurch aber nicht beeinflußt.
Die Transistorsignale an Zelle 7 (Abb. 72) und an Zelle 16 (Abb. 75) haben einen
grundlegend unterschiedlichen Verlauf. Die „Peaks“, zeitgleich zum Aufstrich des
Aktionspotentials, haben ein entgegengesetztes Vorzeichen.
Genaue Aussagen über die Ursache der unterschiedlichen Signalverläufe bzw.
eine Anpassung an das in Kap. 2 beschriebene Modell können erst nach weiteren
Messungen gemacht werden.
Im weiteren Verlauf der Messung wird die Pipette immer weiter abgesenkt, um
die Zelle an die Siliziumoberfläche anzudrücken und den Spalt zwischen der Zellmembran und Chip-Oberfläche zu verkleinern. Es ist zunächst eine Verbesserung
der Kopplung erkennbar, bis schließlich die Zelle abstirbt (Abb. 76). Die Zelle
„knäult“ sich zu einer kleineren Kugel zusammen, kann aber weiterhin rein passiv
umgeladen werden (Abb. 77). Es scheint sich um eine kapazitive und ohmsche
Umladung zu handeln. Der kapazitive Anteil geht aus der Anstiegszeit des Signals
hervor. Der ohmsche Anteil des Membranstroms läßt sich aus dem neuen „Ruhepotential“ bestimmen, das sich intrazellulär messen läßt. Bei beiden Messungen, die
durchgeführt wurden, kann in diesem Fall ein sehr starkes Transistorsignal beobachtet werden. Die Amplitude ist so groß, daß der IU-Umsetzer übersteuert. Das
Signal ist ohne Mittelung eindeutig sichtbar. Die Ursache dieser starken Kopplung
zwischen Zelle und Transistor muß noch näher untersucht werden.
98
Stimulus [A]
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Ergebnisse der Messungen
1n
0
-1n
10
20
30
40
50
60
70
50
60
70
50
60
70
time [ms]
40
intracelluläre Spannung [mV]
20
0
-20
-40
-60
-80
10
20
30
40
time [ms]
Strommodulation Transistor [A]
500p
0
-500p
-1n
10
20
30
40
time [ms]
Abb. 75: Messung an Zelle 16 mit Transistor 5c. Mittelwert über 73 Messungen
(Bilder 101-173 in iso-Datenaufzeichnung).
99
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Ergebnisse der Messungen
Abb. 76: Abgestorbene Herzmuskelzelle (Zelle 7) über dem Gate des EOSTransistors 5b. Im Verlauf der Messungen wurde die Zelle mit der
Pipette zu stark angedrückt. Bild oben: Die Oberfläche der abgestorbenen Zelle und Pipettenöffnung ist sichtbar. Bild unten: Das Gate des
EOS-Transistors liegt in der Schärfenebene.
100
Stimulus [A]
Messungen von lokalen extrazellulären Spannungen mit EOS-Transistoren
Ergebnisse der Messungen
1n
0
-1n
10
20
30
40
50
60
70
50
60
70
50
60
70
time [ms]
20
intracelluläre Spannung [mV]
10
0
-10
-20
10
20
30
40
time [ms]
2n
Strommodulation Transistor [A]
0
-2n
-4n
-6n
-8n
-10n
-12n
10
20
30
40
time [ms]
Abb. 77: Messung an Zelle 16 mit Transistor 5c. Zelle ist abgestorben. Keine
Mittelwertbildung (Bild 515 in iso-Datenaufzeichnung).
101
Zusammenfassung
Ergebnisse der Messungen
8. Zusammenfassung
Diese Arbeit gibt zunächst eine Einführung in die Grundlagen der elektrophysiologischen Vorgänge an Zellmembranen und es wird das elektrische Membranmodell
von Hudgkin und Huxley erläutert, das eine Simulation der elektrischen Aktivität
einer Zelle ermöglicht.
Die Voraussetzung für die Messung der elektrischen Aktivität biologischer Zellen
mit Feld-Effekt-Transistoren sind lokale extrazelluläre Spannungen in einem Spalt
zwischen der Zellmembran und einer Oberfläche. Die elektrischen Vorgänge in
einem solchen Spalt werden anhand eines Modells von P.Fromherz erklärt. Es wird
gezeigt, daß sich lokale extrazelluläre Spannungen nur ausbilden können, wenn die
Ionenkanäle auf der Zellmembran inhomogen verteilt sind. Der zeitliche Verlauf der
lokalen extrazellulären Spannungen bei elektrischer Reizung einer Zelle wird durch
eine numerische Simulation berechnet.
Für die Messung der lokalen extrazellulären Spannungen werden Feld-EffektTransistoren ohne Gate-Metallisierung (EOS-Transistoren) verwendet, die auf
einem Sensor-Chip integriert sind. Werden erregbare biologische Zellen auf den
Kanalbereich der Transistoren aufgesetzt, führen lokale extrazelluläre Spannungen
im Spalt zwischen der Zellmembran und der Siliziumoxidoberfläche zu einer Modulation des Transistorstroms. Die Modulation des Stroms liegt in der Größenordnung
von 1nA. Zur Messung dieser Signale wird ein extrem rauscharmer Strom-Spannungs-Umsetzer mit einem hohen Umsetzungsfaktor benötigt.
Im Rahmen dieser Arbeit wird ein diesen Anforderungen entsprechender StromSpannungs-Umsetzer entwickelt und es werden das dynamische Verhalten und die
Rauscheigenschaften des Umsetzers untersucht. Zur Wahl des Arbeitspunktes der
Transistoren und zur Auswertung der Meßergebnisse werden alle Parameter und
Kennlinien der Transistoren bestimmt. Der Arbeitspunkt, das Kleinsignalersatzschaltbild und die Ursachen des Rauschens der Transistoren werden diskutiert.
Die Messungen werden an Herzmuskelzellen von ausgewachsenen Ratten durchgeführt. Die Zellen müssen aus dem Herzen isoliert und auf die Transistoren aufgesetzt werden. Die Vorgehensweise bei der Präparation und die Handhabung der
Zellen wird in der Arbeit detailliert beschrieben.
Für die Messungen werden die Herzmuskelzellen mit der Patch-Clamp-Technik
kontaktiert, so daß die Zellen zum Ablauf eines Aktionspotentials periodisch stimuliert und der intrazelluläre Potentialverlauf registriert werden kann. Gleichzeitig
werden die Spannungsänderungen in dem Spalt zwischen der Zelle und der Siliziumoxidoberfläche mit den darunterliegenden EOS-Transistoren detektiert.
Zwischen dem Potentialverlauf in der Zelle und dem gemessenen Signalverlauf
mit einem EOS-Transistor kann ein Zusammenhang hergestellt werden. Ein eindeutiger Signalverlauf ist nach einer Mittelwertbildung über nur fünf Perioden erkennbar. Bei unterschiedlichen Messungen werden jedoch unterschiedliche
Signalverläufe beobachtet. Diese Unterschiede können mit dem Modell über die
Entstehung von lokalen extrazellulären Spannungen und der Verteilung der IonenKanäle auf der Zellmembran erklärt werden.
Eine deutlich stärkere Kopplung zwischen Zelle und Transistor kann bei allen
Messungen beobachtet werden, sobald die Zellen abgestorben sind und sie durch
die Patch-Pipette nur noch passiv umgeladen werden. In diesen Fällen kann ohne
Mittelwertbildung ein deutlicher Signalverlauf festgestellt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es damit erstmals gelungen, eine Kopplung zwischen
isolierten Herzmuskelzellen von ausgewachsenen Ratten und Feld-Effekt-Transi-
102
Zusammenfassung
Ergebnisse der Messungen
storen nachzuweisen. Mit dem Nachweis der Kopplung zwischen Herzmuskelzellen
und Feld-Effekt-Transistoren konnte die Zielsetzung dieser Arbeit erreicht werden.
Ausblick
Zur Verbesserung zukünftiger Messungen kann versucht werden, entweder das
Signal zu vergrößern oder den Rauschanteil zu verkleinern. Eine Vergrößerung des
Signals kann durch eine bessere Kopplung zwischen Zelle und Transistor erreicht
werden. Dies ist durch den Einsatz von Haftvermittlern denkbar. Zur Verkleinerung
des Rauschanteils des Meßaufbaus müssen zunächst die dominierenden Rauschquellen identifiziert werden. Das Rauschen des Signals kann entweder im IUUmsetzer bzw. Verstärker, im Aufbau des Chips oder in den EOS-Transistoren
selbst entstehen. Eine Verringerung des Rauschens des IU-Umsetzers kann durch
den Einsatz eines zweiten Patch-Clamp-Verstärkers erreicht werden. Das Rauschen der EOS-Transistoren kann eventuell durch Wahl eines anderen Arbeitspunktes (Subthreshold-Bereich) verkleinert werden.
Aufschlüsse über die Rauschquellen werden sich aus der Diplomarbeit von D.
Kim ergeben, in der das Rauschen der EOS-Transistoren im Mittelpunkt steht.
Zusätzlich sind die Ergebnisse der Messungen von T. Kind mit Bipolar-Transistoren
abzuwarten.
Das dargestellte Modell über die Entstehung von lokalen extrazellulären Spannungen könnte in einem Versuch mit einer idealen Spaltabdichtung bestätigt werden. Eine ideale Spaltabdichtung könnte mit einer zweiten Patch-Pipette mit einem
größeren Durchmesser simuliert werden, die auf die Zellmembran aufgesetzt wird.
Das Potential in der zweiten Patch-Pipette, das mit einem Patch-Clamp-Verstärker
gemessen werden kann, entspricht dann der lokalen extrazellulären Spannung in
einem Spalt.
Um weitere begründete Aussagen über den Zusammenhang zwischen den FeldEffekt-Transistor-Signalen und dem intrazellulären Potentialverlauf treffen zu können, sollte zunächst auf der hier beschriebenen Grundlage eine große Anzahl weiterer Messungen durchgeführt werden.
103
Zusammenfassung
Ergebnisse der Messungen
104
Zusammenfassung
Ergebnisse der Messungen
105