Biochemie – Tutorium 8

Biochemie – Tutorium 8
Nukleinsäuren, DNA &Replikation
IMPP-Gegenstandskatalog
3
Genetik
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
Nukleinsäuren
Molekulare Struktur, Konformationen und Funktionen der Desoxyribonukleinsäure (DNA); Exon, Intron
Molekulare Strukturen und Funktionen der Ribonukleinsäure (RNA)
Genetischer Code
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
Umsetzung genetischer Information
Transkription der DNA
Prozessieren der RNA
Translation
Regulation der Proteinbiosynthese
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
Weitergabe und Verteilung genetischer Information
Replikation der DNA
Zellzyklus, Mitose, Meiose
Meiotische Systeme, Kernphasenwechsel, Generationswechsel
Plasmatische Vererbung
Parasexuelle (parameiotische) Systeme, Phagen, Plasmide, Resistenzfaktoren
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.4.4
Veränderungen der genetischen Information
Somatische Mutationen, Mutationen der Keimbahn
Mutationstypen, Genom-, Chromosomen- und Punktmutationen, Ames-Test
Mutagene Faktoren und transponierbare genetische Elemente
Umordnung der Gene (Anikörperbildung)
3.5
3.5.1
3.5.2
Grundlagen der Molekularbiologie
Techniken der Molekularbiologie
Klonierung und Überexpression von Genen
Nukleinsäuren
• Die Nukleinsäuren sind Träger der
Erbinformation.
• Man unterscheidet DNA und RNA.
• Die Gesamtmenge der DNA einer Zelle enthält die
vollständige genetische Information und wird als
Genom bezeichnet.
• Ein für ein bestimmtes RNA-Molekül codierender
Abschnitt der DNA wird als Gen bezeichnet.
• In der Zelle gibt es verschiedene Arten von RNA.
Bausteine der Nukleinsäuren
• Nukleinsäuren bestehen aus:
– Heterozyklischen Basen
– Pentosen
– Phosphorsäure
Nukleobasen
• Pyrimidinbasen
– Uracil nur bei RNA
– Thymin nur bei DNA
• Purinbasen
Pentosen
• Nach Art der Zucker Einteilung in
Ribonukleinsäure (RNA) und
Desoxyribonukleinsäure (DNA)
• β-D-Ribofuranose
– RNA-Baustein
• β-D-Desoxyribofuranose
– DNA-Baustein
Nomenklatur
• Nukleoside
– Den Pyrimidinbasen wird die Endung –idin angehängt
– Den Purinbasen wird die Endung –osin angehängt
– Beispiele:
• Adenin + Ribose = Adenosin
• Thymin + Desoxyribose = Desoxythymidin
• Nukleotide
– Den Pyrimidin-Nukleotide erhalten die Endung –idylat
– Die Purin-Nukleotide erhalten die Endung -ylat
Nukleotidaufbau
• Pentose und Nukleobase sind über eine
glykosidische Bindung verknüpft (C1-N)
• Das Nukleosid bindet am C5 der Pentose
einen Phosphorsäurerest über eine EsterBindung
Desoxyribonucleotide
Ribonukleotide
Aufbau Nukleinsäuren
• Nukleinsäuren sind Polynukleotide
• Primärstruktur = Reihenfolge der
Nukleotide
• Verknüpfung der Nukleotide:
– Zucker der Nukleotide über
Phosphorsäurediesterbindungen
miteinander verknüpft ( Backbone,
führt zu negativer Ladung der DNA)
– Basen stehen frei
– Jeder Einzelstrang besitzt zwei Enden:
• 3´-Hydroxyl-Ende: Freie Hydroxygruppe an
der Ribose
• 5´-Phosphat-Ende: freie Phosphatgruppe
am C5 der Ribose
• DNA-Polymerasen können neue
Nukleotide nur an die OH-Gruppe am
3'-Ende anfügen, nicht aber am 5'Ende. Der Einzelstrang wächst also
immer von 5' nach 3'
Desoxyribonukleinsäure (DNA)
• Makromolekül aus 2
Polynukleotidketten 
Doppelstrang
• Basen liegen sich paarweise
gegenüber und sind durch
Wasserstoffbrückenbindungen
verknüpft
• Es gibt drei bekannte
Konformationen der DNA
Basenpaarung
• Je zwei Basen verbinden sich über
Wasserstoffbindungen
miteinander
• Basenpaarung: es stehen sich
immer je eine Purin- und eine
Pyrimidin-Base, entweder A-T
oder C-G gegenüber
• Adenin verbindet sich mit Thymin
• Cytosin verbindet sich mit Guanin
• zwischen einem A-T- (oder T-A-)-Basenpaar: 2 WBB
• zwischen einem C-G- (oder G-C-)-Basenpaar: 3 WBB
→ Bindung zwischen G und C (C und G) stärker als
zwischen A und T (T und A)
Komplementäres Prinzip
• Aufgrund der Basenpaarbildung ist die Basensequenz der
einen Kette, durch die andere Kette vorgeschrieben
 Prinzip der komplementären Basenpaarung
Räumliche Struktur der DNA
• Das DNA-Molekül kann in verschiedenen
Konformationen vorliegen:
– A-Form
– B-Form
– Z-Form
• Die häufigste Konformation ist die B-Form
B-Form
• Die DNA liegt meist in Form einer rechtsgängigen
schraubenartigen Doppelhelix vor, dabei winden
sich beide Einzelstränge um eine imaginäre
gemeinsame Achse.
• Beide Einzelstränge verlaufen in
entgegengesetzter Richtung.
• Die Doppelhelix wird durch die
Wasserstoffbrücken stabilisiert.
• In die B-Form sind Wassermoleküle eingelagert
B-Form
• Die schraubenförmige
Doppelhelix bildet
unterschiedlich große
senkrechte Abstände zwischen
den beiden Einzelsträngen aus:
– Große Furchen
– Kleine Furchen
A-Form
• Ebenfalls rechtsgängige Schraube
• Kürzere Windungslänge als bei B-Form
• Unterschied der Furchengröße stärker
ausgeprägt als bei der B-Form
• Basen liegen gewinkelt zur Schraubenachse
• B-Form ist Konformation, die im Zellkern
vorliegt, A-Form während der Transkription
Z-Form
• Basen sind nicht nach innen, sondern nach
außen orientiert.
• Die Z-Form ist linksgängig
• Vor allem in G-C-reichen Sequenzen
• Für chemischen Angriffe leichter zugänglich 
Orte bevorzugter Mutation („hot spots“)
– Karzninogene, wie z.B. Aflatoxine greifen das
Guanin in DNA-Abschnitten an, die eine ZKonformation aufweist.
Konformationen
A-Form
B-Form
Z-Form
Doppelhelix
Organisation
• Würde man sich die menschliche DNA als lineares
Makromolekül vorstellen, so hätte sie eine Länge
von ca. 1,8 m.
• Die menschliche DNA liegt mit Ausnahme der
mitochondrialen DNA im Zellkern.
• Damit die DNA in den Zellkern passt, liegt sie in
kondensierter Form als sog. Chromatin vor.
• Die DNA ist mit den sog. Histonproteinen
assoziiert.
 deutliche Verringerung des Volumens
• Durch Assoziation der DNA mit Histonen (basische
Proteine) entstehen sog. Nucleosomen.
• Die Nucleosomen sind perlenartig zu einer Faser
aufgewickelt, die in Form von Schleifen unter
Beteiligung von Nicht-Histonproteinen gefaltet ist 
Chromatin
• In eukaryoten Zellen ist das Chromatin in Form von
Chromosomen angeordnet.
Chromosomen
• Der somatische Chromosomensatz ist diploid
(d.h. er enthält zwei Kopien eines Chromosoms –
je ein väterliches und ein mütterliches). Er
besteht somit aus 46 Chromosomen.
• Gameten enthalten nur 23 Chromosomen, der
Chromosomensatz ist haploid.
Telomer
Telomer
• Chromosomenende
• mehrere tausend Wiederholungen einer
nicht codierenden Sequenz aus Nucleotiden
(TTAGGG)
• verhindern das Verkleben der
Chromosomenenden
• Problem: verkürzt sich mit jeder Replikation
Telomer
• Ca. 40 Zellteilungen, bis das Telomer
aufgebraucht ist.
• Danach ist die Zelle nicht mehr in der
Lage sich zu teilen  Einleitung der
Apoptose
• Dies gilt allerdings nur für somatische
Zellen.
Telomerase
• Lösung: Das Enzym Telomerase kann die
Telomere wieder verlängern
• Benutzt interne RNA-Sequenzen zur
Synthese von Telomeren
• Besonders bei Embryonalzellen,
bestimmte Stammzellen und Tumorzellen
nachweisbar
Telomerase
Prokaryotische DNA
• In prokaryotischen Zellen liegt die
doppelsträngige DNA meist nicht als linearer
Strang, sondern als zirkuläres Molekül vor. (5´Ende und 3´-Ende verbinden sich über
Phophorsäurediester-Bindung)
• Abhängig von der Sequenzlänge werden
Bakterienchromosom und Plasmide
unterschieden.
• Die prokaryotische DNA ist
nicht in einem Zellkern
lokalisiert.
• Die Plasmide und
Bakterienchromosomen
liegen frei im Plasma.
• Um Platz einzusparen wird
die prokaryotische DNA zu
sog. Supercoils
aufgewickelt.
Replikation (= Reduplikation)
• Als Träger der genetischen Information muss bei
jeder Zellteilung eine genaue Kopie der DNA
erstellt werden, sodass beide Tochterzellen
jeweils wieder auf den gleichen genetischen
Informationspool zurückgreifen können.
• Der Vorgang der Verdopplung wird als Replikation
bezeichnet.
• Die Replikation findet während der sog. S-Phase
des Zellzyklus statt.
Eukaryoten vs. Prokaryoten
• Die DNA der EUKARYOTEN:
– größer(wenige Milliarden Basenpaare bei Eukaryoten gegenüber
einigen Millionen bei Prokaryoten)
– linarer Form (Prokaryoten –ringförmig)
– stärker „verpackt“
– die DNA-bindenden Proteine haben stärkeren Einfluss
• mehrere Origins der Initation der Eukaryotischen Replikation
• geringere Geschwindigkeit der Replikation
• Replikationszeitbeträgt mehrere Stunden (Prokaryoten –wenige
Minuten)
• Die Ende der Eukaryotischen Chromosomen(Telomeren)werden
verkürzert. (lineare Form!)
• Der Prozeß läuft im Zellkern (bei Prokaryonten in Cytoplasma).
• Bei den beteiligten Proteinen handelt es sich in der Regel um solche
mit gleicher Funktionalität, aber unterschiedlichem Aufbau.
Semikonservatives Prinzip
• Bei der Replikation der DNA
erfolgt eine lokale Aufspaltung
des DNA-Doppelstrangs in beide
Einzelstränge.
• Jeder Einzelstrang dient
anschließend als Matrize für die
Synthese eines neuen Strangs
mit entsprechend
komplementärer Basenpaarung.
• D.h. am Ende eines
Replikationszyklus sind zwei
neue Doppelstränge entstanden,
die je einen neuen und einen
alten Einzelstrang enthalten.
Ablauf der Replikation
• Die Replikation kann in der Stadien unterteilt
werden:
– Initiation
– Elongation
– Termination
• Die gleiche Einteilung wird auch für
Transkription und Translation verwendet.
Initiation
• Während der Initiation muss die Startstelle
der Replikation (origin) von entsprechenden
Proteinkomplexen erkannt werden.
• Anschließend müssen die DNA-Doppelstränge
lokal entwunden und in die beiden
Einzelstränge getrennt werden.
Helicase
• Die lokale Entwindung der DNA ist ein ATP-abhängiger,
enzymkatalysierter Prozess.
• Die verantwortlichen Enzyme werden als Helicasen
bezeichnet.
• Die Helicasen brechen die Wasserstoffbrücken
zwischen den Basenpaaren unter ATP-Verbrauch.
• Beide Stränge werden am Replikationsursprung (origin)
zu einer Replikationsblase geöffnet, die an jedem Ende
eine Replikationsblase besitzen.
• Die Reassoziation der beiden getrennten Einzestränge
zum Doppelstrang wird durch Anlagerung sog.
Einzelstrang-Bindungsproteine verhindert.
Topoisomerase
• Eine Folge der lokalen Entwindung der DNA ist die
zunehmende Verdrillung des gesamten DNADoppelstrangs, welche zur Ausbildung einer sog.
Supercoil führen würde, die zur topologischen
Hemmung der Replikation führt.
• In einer ATP-abhängigen Reaktion wird durch die
Topoisomerase die Superspiralisierung dadurch
behoben, dass einer der beiden Einzelstränge
durchtrennt, die DNA entspannt und anschließend
wieder verknüpft wird.
• Hinter der Replikationsgabel erzeugt die
Topoisomerase wieder Spiralisierung durch eine
analoge Reaktion.
• Topoisomerasen sind wichtige Zielstrukturen
für Azneimittel.
– Bakterielle Topoisomerase wird auch als Gyrase
bezeichnet: Hemmung durch bestimmte
Arzneistoffe (Gyrasehemmer)
• Ciprofloxacin, Novobiocin
– Humane Topoisomerase wird durch bestimmte
Zytostatica gehemmt. (Anwendung bei
Tumortherapie)
• Camptothecin
Elongation
• Die für die Elongation verantwortlichen Enzyme
werden als Polymerasen bezeichnet.
• Der Mechanismus der Kettenverlängerung beruht
auf einem nucleophilen Angriff der freien 3´-OHGruppe des zu verlängernden DNA-Strangs an die
Pyrophosphatbindung zwischen dem α- und βPhosphat des anzuknüpfenden
Desoxyribonukleotids.
 Die Verlängerung eines DNA-Strangs kann nur
vom 5´-Ende zum 3´-Ende hin erfolgen!
Substrate für die DNA-Polymerasen
• Als Substrate für die DNA-Polymerasen
dienen:
– Purinnukleotide
• dATP
• dGTP
– Pyridinnukleotide
• dCTP
• dTTP
• Alle DNA-Polymerasen benötigen einen als
Matrize bezeichneten DNA-Einzelstrang,
dessen Basensequenz die Reihenfolge der
Desoyribonukleotide für die Verlängerung
bestimmt.
 Dadurch wird gewährleistet, dass der
neusynthetisierte Strang komplementär ist.
Primase
• DNA-Polymerasen sind nicht in der Lage, ein
freies 3´-OH-Ende zu synthetisieren.
• Sie benötigen zum Start der Kettenverlängerung
einen sogenannten Primer (kurzes, zu Matrize
komplementäres RNA-Oligonukleotid mit freiem
3´-OH-Ende), an den neue Desoxyribonukleotide
angehängt werden können.
• Primer werden durch sog. Primasen gebildet.
Primasen sind RNA-Polymerasen, die einen zu
einem DNA-Einzelstrang komplementären RNAStrang synthetisieren können.
• Bei den Prokaryoten ist die Primase ein
eigenständiges Enzym, bei den Prokaryoten
eine Teilaktivität der DNA-Polymerase α
Leitstrang und Folgestrang
• Durch die antiparallele Orientierung der beiden
Einzelstränge und die Eigenschaft der
Polymerasen, DNA-Stränge nur in 5´-3´-Richtung
zu verlängern, kann die Replikation nur in einem
Strang kontinuierlich verlaufen.
• Dieser Strang wird auch als Leitstrang oder
Führungsstrang bezeichnet.
• Der andere Strang, bei dem die Elongation
diskontinuierlich verläuft, ist der sog. verzögerte
oder Folgestrang.
Elongation am Leitstrang
• Die Richtung der DNA-Polymerisierung entspricht
nur am Leitstrang der Wanderungsrichtung der
Replikationsgabel.
• Dieser Strang wird, nachdem einmal ein
Primermolekül synthetisiert wurde, kontinuierlich
verlängert.
Elongation am Folgestrang
• Bei dem Folgestrang verläuft die
Polymerisationsrichtung entgegengesetzt zur
Wanderungsrichtung der Replikationsgabel.
• Am Folgestrang erfolgt die Synthese
diskontinuierlich in Stücken von einigen
tausend Basen.
• Diese Zwischenprodukte werden als OkazakiFragmente bezeichnet.
Okazaki-Fragmente
• Sie entstehen dadurch, dass nach der Synthese eines
derartigen Fragmentes jeweils wieder an der
Replikationsgabel ein neuer Primer synthetisiert wird,
der anschließend solange verlängert wird, bis er an das
vorher synthetisierte Okazaki-Fragment stößt.
• Um aus den Okazaki-Fragmenten einen
kontinuierlichen DNA-Strang zu bilden, müssen
zunächst durch eine 5´-3´-Exonukleaseaktivität
die RNA-Primer entfernt werden.
• Anschließend werden die entstandenen Lücken
durch die Polymerase aufgefüllt.
• Die reinen DNA-Fragmente werden anschließend
durch eine Ligase zu einem kontinuierlichen DNAStrang verknüpft.
Termination
• Die Termination der Replikation findet statt,
sobald zwei Replikationsblasen ineinander
übergehen.
• Der Mechanismus der Termination ist noch
weitgehend unbekannt.