Molekulargenetik
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14.04.2015 Molekulargenetik - Gentechnik Organisation von Genen in einem Chromosom und Beispiel für den Aufbau eines Gens bei Wirbeltieren 1 14.04.2015 Wenige Gene, viele Schalter Die Anzahl der Gene sagt über die Komplexität eines Tieres wenig aus. Kleine Steuermoleküle namens miRNA, die die Aktivität von Genen an- und abschalten können, scheinen darüber viel bessere Auskunft zu geben. 2 14.04.2015 Genomische Zuchtwertschätzung Schema der PCR 3 14.04.2015 Ergebnis der Gelelektrophorese Single Nucleotide Polymorphism (SNP) auf DNA-Ebene Erfassung genetischer Variabilität auf der DNAEbene = genomischer Zuchtwert 4 14.04.2015 Ein SNP auf DNAEbene S..ingle N..ucleotide P..olymorphisms (EinzelnukleotidPolymorphismen) Veränderungen einzelner Basenpaare in in codierten Regionen eines DNA-Strangs begründen genetische Variationen für Leistungs- u. Fitnessmerkmale. Bsp: Basenfolge AAGCCTA AAGCTTA SNPs Wenn diese Punktmutation eine Keimzelle (Eizelle, Spermium) eines Tieres betrifft, können Nachkommen dieser Tiere diese Mutation erben und der SNP kann sich nach mehreren Generationen in der Population etablieren. Jedes Genom besitzt Vielzahl von SNPs. Beispiele: Mensch: (= 1 SNP je 1000 Basenpaare (bp) ..>4 Mio SNP bekannt) Rind: Bei ca. 3 Miard. Basenpaare des Ringergenoms wurden ca. 2,5 Mio. variable ( = polymorphe) Stellen gefunden. SNPs sind Stellen in der Erbsubstanz, in der die zugehörige Basenfolge in mehr als einer Variante vorkommt. Interessante Merkmale: Nutzungsdauer, Lebensleistung 5 14.04.2015 Nachweis der Hybridisierung durch Abfangen eines Fluoreszenzsignals. Die Ologonukleotidsonde trägt an ihren Enden zwei Marker. -Einer ist ein Fluoreszenfarbstoff - der andere ist eine „ abfangende Verbindung“ Hybridisiert die Sonde nun mit der Ziel-DNA (des zu untersuchenden Tieres bzw. Patienten), dann werden die beiden Enden des Oligonukleotides getrennt und der Fluoreszenzfarbstoff emittiert das Signal („molekulares Leuchtfeuer“) Nachweis der Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten DNA (eines Testtieres/ Patienten) mit einer zugehörigen Sonde auf einem DNA-Chip Prinzip der Arbeitsweise mit den DNAChips: Links: Ausschnittsvergrößerung des Chips. Die auftragenden Sonden tragen an den Enden die zugehörige Base. Der DNA-Strang des zu untersuchenden Tieres ist rot dargestellt. Falls es sich an die Sonde anlagert (= gelbes Signal); falls nicht: kein Signal (= dunkel, blau). Rechts oben: Die gelben Stellen markie-ren die Anlagerungen (Hybridisierung). Das zu untersuchende Tier trägt die Base A und G; rechts unten: Nachweis aller DNABereiche, an denen eine Hybridisierung stattfand, mittels sogenannter Fluoreszenzmarkierung; automatisch erfassbar über Laser-ScanningMikroskopie 6 14.04.2015 Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie Millionen von DNAMolekülen(oligos) in einer Zelle, >200.000 Zellen, >20.000 Gene markierte RNA Fragmente binden Messbares Signal spezifisch an DNA Moleküle 7 14.04.2015 Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie Hybridisierter Mikroarray Erfassung genetischer Variabilität auf DNA-Ebene = genomischer Zuchtwert Verwendung von DNA-Chips (z.B. 50.000 Marker / Chip) kann 50.000 SNPs erkennen. Anhand geeigneter Daten aus der Leistungsprüfung von Milchkühen können nun mithilfe von Assoziationsstudien die Effekte einzelner SNPs innerhalb der Population geschätzt werden. Der genomische ZW = die Summe der geschätzten Effekte aller erfassten SNPs bezüglich eines Merkmals. 8 14.04.2015 Ableitung der SNP-Effekte • Voruntersuchungen: Schätzung der Effekte der 50.000 SNPs auf ein Merkmal (Milchleistung) entspricht dem Vergleich der Tiere untereinander (Gruppe A zu Gruppe B). • Vergleichgruppe (Bsp.: Referenzgruppe = Gruppe A) mit sicheren Zuchtwerten (> 90% Sicherh.) ca. 3000 Bullen • Typisierung der Referenzbullen zwecks Ableitung von Beziehungen zwischen genet. Buchstaben (SNPs) und Merkmalen……= Effekt der SNPs auf das Merkmal! Schritte in der Genomanalyse 1. Genkartierung Erstellung eines Orientierungsrasters zur Lokalisation von Genen auf den Chromosomen mithilfe von genetischen Markern 2. Kopplungsanalyse Herstellung von Beziehungen zwischen Merkmalen und DNA-Markern 3. Einzelgencharakterisierung Aufklärung der Genstruktur bis zur DNA-Sequenz für ein definiertes Merkmal 4. Gendiagnose Erkennung von Genvarianten, die Erbmerkmale beeinflussen 9 14.04.2015 dGW ZW • Vollgeschwister haben identisches Pedigree • ZW von Vollgeschwister basiert auf den Ergebnissen der Eigen- und Nachkommenleistung • Beim dGW fließen die Buchstaben des Tieres ein! • Identische dGWs sind nur bei eineiigen Zwillingen (Klone) möglich! • • Vollgeschwister haben unterschiedliche SNP-Situationen deshalb auch unterschiedliche dGWs. • dGWs erreichen Sicherheit von 40 – 60% (abh. von h2) • Vergleich der Sicherheiten des dGW und des ZW Kuh-ZW hat niedrige Sicherheit, Bullen ZW hat hohe Sicherheit! dGW ZW • Basis für dGW ist Blutprobe • Sicherheit für Kalb ist höher als ZW (Pedigree) Züchter kann mit dGW beste Jungtiere genauer auswählen. • Eigen- und Nachkommenleistung gehen nicht in dGW ein! • Bei Vorliegen von Nachkommenleistung ist ZW genauer als dGW! Kombination von dGW + ZW 10 14.04.2015 Genomische Selektion Konventionelle Zuchtwertschätzung ZW Genomische Zuchtwertschätzung dGW gZW genomisch unterstützter Zuchtwert Kombination des rein genomischen Zuchtwertes (dGW) mit dem Zuchtwert der bisherigen Zuchtwertschätzung (ZW) zu einem genomisch unterstützten Zuchtwert (gZW) Kombination dGW & ZW gZW • Unterschiedliche Sicherheiten der Ausgangszuchtwerte (ZW bzw. dGW) beeinflussen Sicherheit des gZW! Einfluss des dGW Steigende Anzahl Töchter Einfluss des ZW Ab Sicherheit von 90% des ZW wird gZW fast ausschließlich von ZW bestimmt! 11 14.04.2015 Verlauf der Sicherheit des genomisch unterstützten Zuchtwertes (gZW) der Merkmale Milchmenge bzw. Nutzungsdauer eines Besamungsbullen bzw. einer Kuh. Die Sicherheit des rein genomischen Zuchtwertes (gZW) wurde aus Gründen der Vereinfachung im zeitlichen Verlauf konstant gehalten. Genetische Kopplungsanalyse Aufzeigen des Abstandes zwischen zwei Genorten Grundlage der Kopplungsanalyse ist der Genaustausch (Crossing over) und damit der Rekombinationsfrequenz. Kopplungsanalysen beruhen auf Testkreuzungen von Doppel-, dreifachder Mehrfachheterozygoten. Häufigkeit beobachteter „Crossing over“ zw. zwei untersuchtehn „Loci“ = Maß für die Entfernung zwischen den „Loci“ Je enger die Kopplung, desto geringer der Anteil an Neukombinationen Genorte liegen enger zusammen 12 14.04.2015 Kopplungsstärke Austauschwert (AW) Zahl der Neukombinationen Gesamtanzahl der Kombinationen Maßstab in Genkarten, die auf Kopplungsanalyse beruhen ist „Centi Morgan“ (cM) 1 cM = Chance von 1 %, dass in der natürlichen Rekombination während eines Generationswechsels ein bestimmter Genort von einem anderen getrennt wird. = Abstand wischen zwei Loci mit einem Austauschwert von 1% = map unit (Karteneinheit) 1 cM entspricht 1 Million Basenpaare pr vg 11,0 cM Genort für Augenfarbe Genort für Flügelform Austauschwert nach Kopplung von Doppelheterozygoter (Drosophila) Bm ep 6,3 ru 2,7 10,5 Austauschwert nach Kreuzung von Dreifachheterozygoten 13 14.04.2015 Kopplung (Linkage) Zustand in dem von zwei Allelpaaren auf autosomalen Genorten jeweils zwei Allele, die an verschiedenen Loci sitzen, in den Gameten mit größerer Häufigkeit als erwartet gemeinsam vorkommen. Zwischen den Allelpaaren Aa und Bb besteht Kopplung, wenn A und B bzw. a und b oder A und b bzw. a und B gehäuft in den Gameten auftreten. Maßstab der Kopplung: Die Stärke der Kopplung wird quantitativ mit der Rekombinationsrate (r) bestimmt. 0 < r < 0,5 Wert 0: sehr enge Kopplung Wert 0,5: sehr lockere Kopplung Doppeltausch Doppel – crossover Mehrfachtausch 14 14.04.2015 Gesetzmäßigkeit der Kopplungsvorgänge P: Freie Kombination Kopplung AABB x aabb (AB) (AB) x (ab) (ab) F1 AaBb Gameten: AB, Ab aB, ab F2 A9 B- aaB- aabb 3 3 1 (AB) (ab) (AB), (ab) (AB)(AB) (AB)(ab) (ab)(ab) 1 2 1 Gruppierung der Gene in der Nomenkladur für humane Gene: • • • • • • • • • Enzyme und Proteine Vererbte klinische Störungen Blutgruppen Zelloberflächenantigene DNA-Segmente Virus-assoziierte Marker Marker mit noch unbekannter Funktion fragile Genbereiche mitochrondriale Gene 15 14.04.2015 Chromosom 1 Chromosom 2 Das Erbgut des Rindes ist auf 29 verschiedenen Chromosomen und den Geschlechtschromosomen X und Y angeordnet. Dort befinden sich 50.000 verschiedene Gene. Davon kennt man jedoch nur für etwa 200 Gene die Lage auf dem Chromosom. Dagegen sind derzeit weit mehr als 1.000 Marker auf der genetischen Karte bekannt, die über alle Chromosomen verteilt sind. Diese können verwendet werden, um unbekannte Gene bestimmten Chromosomenregionen zuzuordnen. Auf dem Chromosom 1, in der Nähe der Marker B, C, D und E befindet sich z.B. das Gen für die Hornlosigkeit. A B C D E Marker unbekanntes Gen für Hornlosigkeit Das Schweinegenome • Jedes Schwein hat: – 38 Chromosome – 23,000 bis 30,000 Gene • Gene mapping – Kandidategene • Speziell bekannte Gene mit großen Effekten – QTL (Quantity trait loci) • Gebite auf dem Chromosom, die mit einer Leistung assiziieren. 16 14.04.2015 Kandidatengene beim Schwein IGF2 (Ch 2) FUT1 (Ch 6) H-FABP (Ch 6) RYR1 (Ch 6) PRKAG3 (Ch 15) Muskelgewebe, Fett Krankheitsresitenz Wachstum, Fett Stress, PSE RN/Hampshire Gen, Rendement Napole Gen (Wasserbindungsvermögen, pH-Wert im Muskel)...Hampshire-Faktor Genetische Marker …..sind polymorphe DNA-Sequenzen. Sie stellen Referenzpunkte im Genom dar und deren Lokalisation ist auf dem Chromosom bekannt. Molekulare Marker sind hoch polymorph und leicht zu charakterisieren. Sie dienen der Schätzung von -Diversitäten -Differenzierungen von Rassen -genetischen Distanzen zwischen Rassen -Identitäts- und Abstammungskontrollen -Identifizierungen von Genorten für Merkmale 17 14.04.2015 Beispiel für Lokalisation eines Gens bei verschiedenen Spezies ob-Gen Ort für die Bildung des Hormons Leptin in den Zellen des Fettgewebes (Adipozyten). Beim Fehlen dieses Gens wird kein Leptin gebildet, es tritt Fettleibigkeit (ob -Obesitas) auf. Metabolische Vermittlerfunktion zwischen Fettgewebe und Gehirn (Beeinflussung des Stoffwechsels (Kohlehydrate) und der Produktion von Fortpflanzungs- und Wachstumshormonen) Spezies Lokalisation Rind Chromosom 4 Schwein Chromosom 18 Mensch Chromosom 7, Region q 31.3 18 14.04.2015 Milchleistung/ Milcheigenschaften z. B. CASK, PRL, LGB Rotfaktor Wachstum z. B. MC1R z. B. MH Erbdefekte z. B. CD18, ASS, UMPS, GAA, TG, EPB3, FECH, MANA, MANB, PYGM, PRNP, CHS, PRG Genetische Loci mit signifikantem Einfluss auf phänotypische Merkmale beim Rind für die gendiagnostische Tests verfügbar sind Fleischqualität/ Stressanfälligkeit z. B. RYR1, HFABP, FABP4, RN Wachstum Futteraufnahme z.B. MC4R z.B. MC4R Erbdefekte Hautfarbe z. B. RYR1, LDLR, AR VWF, GULO z. B. KIT, MC1R Fruchtbarkeit Gesundheit z. B. RARG, FSHB, RBP4, ESR, PRLP z. B. FUT1 Schlachtkörperzusammensetzung z.B. MC4R, IGF2 Genetische Loci mit signifikantem Einfluss auf phänotypische Leistungen beim Schwein für die gendiagnostische Tests verfügbar sind 19 14.04.2015 positionelle Kandidaten QTL-Analysen: Beobachtung der KoSegregation von Markern und Merkmal in spez. Familien positionelle Kandidaten 1. Polymorphismus 2. Assoziation 3.Funktionelle Analyse direkte Kandidatengene: biologische Funktion eines Genprodukts funktionelle Kandidaten: Genaktivität in bestimmten Geweben, Phänotypen, Entwicklungsstadien oder Umwelten Genotypisierung Genotypisierung SNP RNA Proteine Black Box Intermeddärer Phänotyp Tier Phänotypisierung LP 20 14.04.2015 Genom Genotyp Genvariaten Transkriptom Proteom Struktur Metabolom DNA RNA Proteine Intermediäre Phänotypen Tier Hochauflösende Phänotypisierung, molekulare Phänotypen, ‚omics‘-techniken Genotyp – Phänotyp - Abbildung Bedeutung der Leistungsprüfung (Phänotypisierung) mit Hilfe causaler Merkmale d.h. weitgehender Ausschluss vom Umweltfaktoren Fruchtbarkeit (geb. Ferkel/S. & J)………………Ovulationsrate 305-Tage-Milchleistung……………………Sekretionsleistung der Milchdrüse Langlebigkeit/Nutzungsdauer……………….Resistenz, etc. etc. 21 14.04.2015 Genotyp Phänotyp QTL-Analysen Genomweite Assoziationsanalysen (GWA) Genomische Selektion DNA RNA Protein intermediäre Phänotypen Tier Genotypisierung Marker 60k SNP-Chip Phänotypisierung Produktionsmerkmale: Mast- und Schlachtleistung Reproduktion Leistungsprüfung & Metabolomics, Histologie, Labormed… Funktionale Merkmale: Adaptabilität, Gesundheit Produktqualität 22 14.04.2015 Reproduktion ist als biologischer Vorgang essentiell für die Arterhaltung und –entwicklung Fitness In der Tierzüchtung ist Fortpflanzung essentiell zur Bestandsergänzung und Bereitstellung von Jungtieren für die verschiedenen Nutzungsformen ökonomisch wichtiges Produktionsmerkmal Reproduktion umfasst eine Reihe physiologischer Vorgänge Fruchtbarkeit – ein komplexes Merkmal Erblichkeit Umweltabhängigkeit genetische Einflüsse: paternal maternal embryonal/fötal 23 14.04.2015 Merkmale der Reproduktionsleistung - Schwein Anzahl Ferkel/Sau/Jahr Aufgezogene Ferkel je Wurf Aufzuchtverluste Würfe/Sau/Jahr Wurfabstand Lebende- geborene Anzahl Nachkommen Ferkel je Geburt Ovulationsrate Befruchtungsrate Säugedauer Güstzeit Reproduktionsfrequenz Intervall Absetzen -Brunst Fötale Sterblichkeit Konzenptionsrate ♂ Libido, Spermaqualität Heritabilität der Reproduktionsmerkmale Rind Rastzeit/Güstzeit Trächtigkeitsrate Besamungsindex Schwergeburten Trächtigkeitsdauer Geschlechtsreife Zwillingsrate/Ovulationsrate Wurfgröße Spermaqualität Schwein sehr gering sehr gering sehr gering moderat moderat moderat gering moderat gering moderat 24 14.04.2015 Einsatz von Reproduktionsbiotechnologie und Molekulargenetik Reproduktionsbiotechnologie Modifikation von Ablauf und biologischer Effizient der Fortpflanzungsvorgänge; Erhöhung der Reproduktionsrate selektierter Individuen Molekulargenetik Identifizierung von Genen mit Einfluss auf die Fruchtbarkeit; Selektion zur nachhaltigen genetischen Verbesserung der Reproduktionsleistung Hypo thalamus Hypo physe GnRH LH FSH Prolactin Direkte Kandidatengene abgeleitet von der Milchdrüse hormonellen Steuerung der Reproduktionsvorgänge Activin } Inhibin Östrogen Progesteron Androgen Ovar } Uterus 25 14.04.2015 Kandidatengene für männliche Fruchtbarkeit Gen Biologische Funktion GnRHR …vermittelt die Wirkung des Signals vom Hypothalamus an die Hypophyse (Wise et al., 1984) FSH-β …stimuliert die Spermatogenese und beeinflusst die Hodenmorphologie und -funktion (Zanella et al., 1999;Li et al., 1998) PRLR …stimuliert die Spermatogenese und beeinflusst die Hodenmorphologie und -funktion (Hondo et al., 1995) RLN Relaxin-Konzentration in der Samenflüssigkeit ist korreliert mit der Motilität der Spermien (Sasaki et al., 2001) AR …vermittelt die Wirkung der männlichen Sexualhormone Androgenrezeptor (AR) AR ist ein Kandidatengen für Reproduktionsmerkmale: vermittelt die hormonale Antwort auf Androgene und reguliert die Expression des Zielgens; beeinflusst Zellvermehrung und Differenzierung im Zielgewebe 1. AR vorhanden in Hoden und Ovar (Kimura et al., 1993; Pelletier et al., 2000; Duffy et al.,1999) 2. positive Korrelation zwischen AR mRNA Expressionen und GranulosaZelldifferenzierung (Weil et al., 1998) 3. AR fördert das Follikelwachstum und die Östrogensynthese durch die Verstärkung des Effekts des Follikel- stimulierenden-Hormons, FSH (Keith et al., 1998; Weil et al., 1999) 26 14.04.2015 Genomic hat zum Ziel die Feststellung des Status quo zwecks Nutzung für züchterische Selektion! Es ist keine genetische Manipulation! Androgenrezeptor Sequenzanalyse: cDNA: 3.554 bp Promotor: 2.459 bp Polymorphismen: SNPs in Promotor und cDNA INDEL in Promotor und Exon 1 (CCTTT)n im 5´-UTR Assoziationen: Frühreife: Zitzenzahl: Chi-square = 48.840; (p< 0.001) Chi-square = 38.311 ; (p=0.032) 27 14.04.2015 Genorten für produktionsrelevante Merkmale bei Nutztieren Tierart Merkmal Chromosom Rind Doppellender 2 28 14.04.2015 29 14.04.2015 Kerntransfervorgang in einer vorher enukleierten Empfängerzygote. Im Anschluss an den Transfererfolgt die Fusion beider Anteile Zygote nach einer Zentrifugation und während der Injektion in den Vorkern 30 14.04.2015 Mikroinjektion von DNA-Konstrukten in Schweinezygoten. Die Zygoten sind zentrifugiert worden, um die Vorkerne sichtbar zu machen. Es werden 1 - 2 pl (10-12) in einen Vorkern injiziert. Effizienz der Mirkoinjektion zur Erstellung transgener Tiere Injizierte Nachkommen /Feten Zygoten n % Transgene n % 26 0,2 Rind 15.019 432 /4269 10,1 Schaf 7.552 955 12,6 55 0,7 Schwein 13.988 1.264/13.446 9,4 93 0,7 31 14.04.2015 Was kostet ein transgenes Tier ? Maus..................80 € Schwein......20.000 € Schaf...........48.000 € Rind...........420.000 € 32 14.04.2015 33
