Molekulargenetik

14.04.2015
Molekulargenetik - Gentechnik
Organisation von Genen in einem Chromosom und Beispiel für den
Aufbau eines Gens bei Wirbeltieren
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14.04.2015
Wenige Gene, viele Schalter
Die Anzahl der Gene sagt über die Komplexität eines Tieres wenig aus. Kleine
Steuermoleküle namens miRNA, die die Aktivität von Genen an- und abschalten
können, scheinen darüber viel bessere Auskunft zu geben.
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14.04.2015
Genomische Zuchtwertschätzung
Schema der
PCR
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Ergebnis der Gelelektrophorese
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
auf DNA-Ebene
Erfassung genetischer Variabilität auf der DNAEbene
=
genomischer Zuchtwert
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Ein SNP auf DNAEbene
S..ingle
N..ucleotide
P..olymorphisms
(EinzelnukleotidPolymorphismen)
Veränderungen einzelner
Basenpaare in in codierten
Regionen eines DNA-Strangs
begründen genetische
Variationen für Leistungs- u.
Fitnessmerkmale.
Bsp: Basenfolge
AAGCCTA
AAGCTTA
SNPs
Wenn diese Punktmutation eine Keimzelle (Eizelle, Spermium) eines
Tieres betrifft, können Nachkommen dieser Tiere diese Mutation erben
und der SNP kann sich nach mehreren Generationen in der Population etablieren.
Jedes Genom besitzt Vielzahl von SNPs.
Beispiele:
Mensch: (= 1 SNP je 1000 Basenpaare (bp) ..>4 Mio SNP bekannt)
Rind: Bei ca. 3 Miard. Basenpaare des Ringergenoms wurden
ca. 2,5 Mio. variable ( = polymorphe) Stellen gefunden.
SNPs sind Stellen in der Erbsubstanz, in der die zugehörige
Basenfolge in mehr als einer Variante vorkommt.
Interessante Merkmale: Nutzungsdauer, Lebensleistung
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14.04.2015
Nachweis der
Hybridisierung durch
Abfangen eines
Fluoreszenzsignals.
Die Ologonukleotidsonde
trägt an ihren Enden zwei
Marker.
-Einer ist ein
Fluoreszenfarbstoff
- der andere ist eine „
abfangende
Verbindung“
Hybridisiert die Sonde nun
mit der Ziel-DNA (des zu
untersuchenden Tieres
bzw. Patienten), dann
werden die beiden Enden
des Oligonukleotides
getrennt und der
Fluoreszenzfarbstoff
emittiert das Signal
(„molekulares
Leuchtfeuer“)
Nachweis der Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten DNA (eines Testtieres/
Patienten) mit einer zugehörigen Sonde auf einem DNA-Chip
Prinzip der Arbeitsweise mit den DNAChips:
Links: Ausschnittsvergrößerung des
Chips. Die auftragenden Sonden
tragen an den Enden die zugehörige
Base. Der DNA-Strang des zu
untersuchenden Tieres ist rot
dargestellt. Falls es sich an die Sonde
anlagert (= gelbes Signal); falls nicht:
kein Signal (= dunkel, blau).
Rechts oben: Die gelben Stellen
markie-ren die Anlagerungen
(Hybridisierung). Das zu untersuchende Tier trägt die Base A und G;
rechts unten: Nachweis aller DNABereiche, an denen eine Hybridisierung stattfand, mittels sogenannter
Fluoreszenzmarkierung; automatisch
erfassbar über Laser-ScanningMikroskopie
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14.04.2015
Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie
Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie
Millionen von DNAMolekülen(oligos) in einer Zelle,
>200.000 Zellen, >20.000 Gene
markierte RNA Fragmente binden
Messbares Signal
spezifisch an DNA Moleküle
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14.04.2015
Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie
Hybridisierter Mikroarray
Erfassung genetischer Variabilität auf DNA-Ebene
=
genomischer Zuchtwert
Verwendung von DNA-Chips (z.B. 50.000 Marker / Chip) kann
50.000 SNPs erkennen.
Anhand geeigneter Daten aus der Leistungsprüfung von Milchkühen
können nun mithilfe von Assoziationsstudien die Effekte einzelner
SNPs innerhalb der Population geschätzt werden.
Der genomische ZW = die Summe der geschätzten Effekte aller
erfassten SNPs bezüglich eines Merkmals.
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14.04.2015
Ableitung der SNP-Effekte
• Voruntersuchungen:
Schätzung der Effekte der
50.000 SNPs auf ein Merkmal (Milchleistung)
entspricht dem Vergleich der Tiere untereinander
(Gruppe A zu Gruppe B).
• Vergleichgruppe (Bsp.: Referenzgruppe = Gruppe A)
mit sicheren Zuchtwerten (> 90% Sicherh.) ca. 3000
Bullen
• Typisierung der Referenzbullen zwecks Ableitung
von Beziehungen zwischen genet. Buchstaben
(SNPs) und Merkmalen……= Effekt der SNPs auf
das Merkmal!
Schritte in der Genomanalyse
1. Genkartierung
Erstellung eines Orientierungsrasters zur Lokalisation von
Genen auf den Chromosomen mithilfe von genetischen
Markern
2. Kopplungsanalyse Herstellung von Beziehungen zwischen
Merkmalen und DNA-Markern
3. Einzelgencharakterisierung Aufklärung der Genstruktur bis
zur DNA-Sequenz für ein definiertes Merkmal
4. Gendiagnose Erkennung von Genvarianten, die Erbmerkmale
beeinflussen
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14.04.2015
dGW
ZW
• Vollgeschwister haben identisches Pedigree
• ZW von Vollgeschwister basiert auf den Ergebnissen der
Eigen- und Nachkommenleistung
• Beim dGW fließen die Buchstaben des Tieres ein!
• Identische dGWs sind nur bei eineiigen Zwillingen (Klone)
möglich!
•
• Vollgeschwister haben unterschiedliche SNP-Situationen
deshalb auch unterschiedliche dGWs.
• dGWs erreichen Sicherheit von 40 – 60% (abh. von h2)
• Vergleich der Sicherheiten des dGW und des ZW
Kuh-ZW hat niedrige Sicherheit, Bullen ZW hat hohe Sicherheit!
dGW
ZW
• Basis für dGW ist Blutprobe
• Sicherheit für Kalb ist höher als ZW (Pedigree)
Züchter kann mit dGW beste Jungtiere genauer
auswählen.
• Eigen- und Nachkommenleistung gehen nicht in
dGW ein!
• Bei Vorliegen von Nachkommenleistung ist ZW
genauer als dGW!
Kombination von dGW + ZW
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14.04.2015
Genomische Selektion
Konventionelle
Zuchtwertschätzung
ZW
Genomische
Zuchtwertschätzung
dGW
gZW
genomisch unterstützter Zuchtwert
Kombination des rein genomischen Zuchtwertes (dGW) mit dem Zuchtwert der
bisherigen Zuchtwertschätzung (ZW) zu einem genomisch unterstützten
Zuchtwert (gZW)
Kombination dGW & ZW
gZW
• Unterschiedliche Sicherheiten der Ausgangszuchtwerte (ZW
bzw. dGW) beeinflussen Sicherheit des gZW!
Einfluss des dGW
Steigende Anzahl Töchter
Einfluss des ZW
Ab Sicherheit von 90% des ZW wird gZW fast
ausschließlich von ZW bestimmt!
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14.04.2015
Verlauf der Sicherheit des genomisch unterstützten Zuchtwertes (gZW) der
Merkmale Milchmenge bzw. Nutzungsdauer eines Besamungsbullen bzw. einer Kuh.
Die Sicherheit des rein genomischen Zuchtwertes (gZW) wurde aus Gründen der
Vereinfachung im zeitlichen Verlauf konstant gehalten.
Genetische Kopplungsanalyse
Aufzeigen des Abstandes zwischen zwei Genorten
Grundlage der Kopplungsanalyse ist der Genaustausch (Crossing over)
und damit der Rekombinationsfrequenz.
Kopplungsanalysen beruhen auf Testkreuzungen von Doppel-, dreifachder Mehrfachheterozygoten.
Häufigkeit beobachteter
„Crossing over“ zw.
zwei untersuchtehn
„Loci“
=
Maß für die
Entfernung
zwischen
den „Loci“
Je enger die Kopplung, desto geringer der Anteil an
Neukombinationen
Genorte liegen enger zusammen
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14.04.2015
Kopplungsstärke Austauschwert (AW)
Zahl der Neukombinationen
Gesamtanzahl der Kombinationen
Maßstab in Genkarten, die auf Kopplungsanalyse beruhen ist
„Centi Morgan“ (cM)
1 cM
=
Chance von 1 %, dass in der natürlichen Rekombination während eines Generationswechsels ein bestimmter Genort von einem anderen getrennt wird.
=
Abstand wischen zwei Loci mit einem Austauschwert von 1%
= map unit (Karteneinheit)
1 cM entspricht 1 Million Basenpaare
pr
vg
11,0 cM
Genort für
Augenfarbe
Genort für
Flügelform
Austauschwert nach Kopplung von Doppelheterozygoter
(Drosophila)
Bm
ep
6,3
ru
2,7
10,5
Austauschwert nach Kreuzung von Dreifachheterozygoten
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14.04.2015
Kopplung (Linkage)
Zustand in dem von zwei Allelpaaren auf autosomalen Genorten
jeweils zwei Allele, die an verschiedenen Loci sitzen, in den
Gameten mit größerer Häufigkeit als erwartet gemeinsam
vorkommen.
Zwischen den Allelpaaren Aa und Bb besteht Kopplung, wenn A
und B bzw. a und b oder A und b bzw. a und B gehäuft in den
Gameten auftreten.
Maßstab der Kopplung:
Die Stärke der Kopplung wird quantitativ mit der
Rekombinationsrate (r) bestimmt.
0 < r < 0,5
Wert 0:
sehr enge Kopplung
Wert 0,5: sehr lockere Kopplung
Doppeltausch
Doppel – crossover
Mehrfachtausch
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14.04.2015
Gesetzmäßigkeit der Kopplungsvorgänge
P:
Freie Kombination
Kopplung
AABB x aabb
(AB) (AB) x (ab) (ab)
F1
AaBb
Gameten: AB, Ab
aB, ab
F2
A9
B- aaB- aabb
3
3
1
(AB) (ab)
(AB), (ab)
(AB)(AB) (AB)(ab)
(ab)(ab)
1
2
1
Gruppierung der Gene in der Nomenkladur
für humane Gene:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Enzyme und Proteine
Vererbte klinische Störungen
Blutgruppen
Zelloberflächenantigene
DNA-Segmente
Virus-assoziierte Marker
Marker mit noch unbekannter
Funktion
fragile Genbereiche
mitochrondriale Gene
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Chromosom 1
Chromosom 2
Das Erbgut des Rindes ist auf 29
verschiedenen Chromosomen und den
Geschlechtschromosomen X und Y
angeordnet. Dort befinden sich 50.000
verschiedene Gene. Davon kennt man
jedoch nur für etwa 200 Gene die Lage
auf dem Chromosom.
Dagegen sind derzeit weit mehr als 1.000
Marker auf der genetischen Karte bekannt, die über alle Chromosomen verteilt sind. Diese können verwendet werden, um unbekannte Gene bestimmten
Chromosomenregionen zuzuordnen.
Auf dem Chromosom 1, in der Nähe der
Marker B, C, D und E befindet sich z.B.
das Gen für die Hornlosigkeit.
A
B C
D
E
Marker
unbekanntes Gen
für Hornlosigkeit
Das Schweinegenome
• Jedes Schwein hat:
– 38 Chromosome
– 23,000 bis 30,000 Gene
• Gene mapping
– Kandidategene
• Speziell bekannte Gene mit großen Effekten
– QTL (Quantity trait loci)
• Gebite auf dem Chromosom, die mit einer
Leistung assiziieren.
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14.04.2015
Kandidatengene beim Schwein
IGF2 (Ch 2)
FUT1 (Ch 6)
H-FABP (Ch 6)
RYR1 (Ch 6)
PRKAG3 (Ch 15)
Muskelgewebe, Fett
Krankheitsresitenz
Wachstum, Fett
Stress, PSE
RN/Hampshire Gen,
Rendement Napole Gen
(Wasserbindungsvermögen, pH-Wert
im Muskel)...Hampshire-Faktor
Genetische Marker
…..sind polymorphe DNA-Sequenzen. Sie stellen
Referenzpunkte im Genom dar und deren Lokalisation
ist auf dem Chromosom bekannt.
Molekulare Marker sind hoch polymorph und leicht zu
charakterisieren. Sie dienen der Schätzung von
-Diversitäten
-Differenzierungen von Rassen
-genetischen Distanzen zwischen Rassen
-Identitäts- und Abstammungskontrollen
-Identifizierungen von Genorten für Merkmale
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Beispiel für Lokalisation eines Gens bei
verschiedenen Spezies
ob-Gen
Ort für die Bildung des Hormons Leptin in den Zellen des Fettgewebes
(Adipozyten). Beim Fehlen dieses Gens wird kein Leptin gebildet, es tritt
Fettleibigkeit (ob -Obesitas) auf.
Metabolische Vermittlerfunktion zwischen Fettgewebe und Gehirn
(Beeinflussung des Stoffwechsels (Kohlehydrate) und der Produktion von
Fortpflanzungs- und Wachstumshormonen)
Spezies
Lokalisation
Rind
Chromosom 4
Schwein
Chromosom 18
Mensch
Chromosom 7, Region q 31.3
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Milchleistung/
Milcheigenschaften
z. B. CASK, PRL, LGB
Rotfaktor
Wachstum
z. B. MC1R
z. B. MH
Erbdefekte
z. B. CD18, ASS, UMPS, GAA, TG, EPB3,
FECH, MANA, MANB, PYGM, PRNP,
CHS, PRG
Genetische Loci mit signifikantem Einfluss auf phänotypische
Merkmale beim Rind für die gendiagnostische Tests verfügbar sind
Fleischqualität/
Stressanfälligkeit
z. B. RYR1, HFABP, FABP4, RN
Wachstum
Futteraufnahme
z.B. MC4R
z.B. MC4R
Erbdefekte
Hautfarbe
z. B. RYR1, LDLR,
AR
VWF, GULO
z. B. KIT, MC1R
Fruchtbarkeit
Gesundheit
z. B. RARG, FSHB, RBP4,
ESR, PRLP
z. B. FUT1
Schlachtkörperzusammensetzung
z.B. MC4R, IGF2
Genetische Loci mit signifikantem Einfluss auf phänotypische Leistungen
beim Schwein für die gendiagnostische Tests verfügbar sind
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14.04.2015
positionelle
Kandidaten
QTL-Analysen:
Beobachtung der KoSegregation von Markern
und Merkmal in spez.
Familien
positionelle
Kandidaten
1. Polymorphismus
2. Assoziation
3.Funktionelle
Analyse
direkte
Kandidatengene:
biologische Funktion
eines Genprodukts
funktionelle Kandidaten:
Genaktivität in bestimmten Geweben,
Phänotypen, Entwicklungsstadien oder
Umwelten
Genotypisierung
Genotypisierung SNP
RNA
Proteine
Black Box
Intermeddärer
Phänotyp
Tier
Phänotypisierung
LP
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14.04.2015
Genom
Genotyp
Genvariaten
Transkriptom
Proteom
Struktur
Metabolom
DNA
RNA
Proteine
Intermediäre
Phänotypen
Tier
Hochauflösende Phänotypisierung, molekulare
Phänotypen, ‚omics‘-techniken
Genotyp – Phänotyp - Abbildung
Bedeutung der Leistungsprüfung
(Phänotypisierung) mit Hilfe causaler
Merkmale
d.h. weitgehender Ausschluss vom
Umweltfaktoren
Fruchtbarkeit (geb. Ferkel/S. & J)………………Ovulationsrate
305-Tage-Milchleistung……………………Sekretionsleistung
der Milchdrüse
Langlebigkeit/Nutzungsdauer……………….Resistenz, etc. etc.
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14.04.2015
Genotyp
Phänotyp
QTL-Analysen
Genomweite Assoziationsanalysen (GWA)
Genomische Selektion
DNA
RNA
Protein
intermediäre
Phänotypen
Tier
Genotypisierung
Marker
60k SNP-Chip
Phänotypisierung
Produktionsmerkmale:
Mast- und Schlachtleistung
Reproduktion
Leistungsprüfung
& Metabolomics,
Histologie, Labormed…
Funktionale Merkmale:
Adaptabilität, Gesundheit
Produktqualität
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14.04.2015
Reproduktion ist als biologischer Vorgang
essentiell für die Arterhaltung und –entwicklung
 Fitness
In der Tierzüchtung ist Fortpflanzung essentiell zur
Bestandsergänzung und Bereitstellung von Jungtieren
für die verschiedenen Nutzungsformen
 ökonomisch wichtiges Produktionsmerkmal
Reproduktion umfasst eine Reihe physiologischer
Vorgänge
Fruchtbarkeit – ein komplexes Merkmal
Erblichkeit
Umweltabhängigkeit
genetische Einflüsse:
paternal
maternal
embryonal/fötal
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Merkmale der Reproduktionsleistung - Schwein
Anzahl Ferkel/Sau/Jahr
Aufgezogene Ferkel
je Wurf
Aufzuchtverluste
Würfe/Sau/Jahr
Wurfabstand
Lebende-
geborene
Anzahl Nachkommen
Ferkel
je Geburt
Ovulationsrate
Befruchtungsrate
Säugedauer
Güstzeit
Reproduktionsfrequenz
Intervall
Absetzen
-Brunst
Fötale
Sterblichkeit
Konzenptionsrate
♂
Libido, Spermaqualität
Heritabilität der Reproduktionsmerkmale
Rind
Rastzeit/Güstzeit
Trächtigkeitsrate
Besamungsindex
Schwergeburten
Trächtigkeitsdauer
Geschlechtsreife
Zwillingsrate/Ovulationsrate
Wurfgröße
Spermaqualität
Schwein
sehr gering
sehr gering
sehr gering
moderat
moderat
moderat
gering
moderat
gering
moderat
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14.04.2015
Einsatz von Reproduktionsbiotechnologie und
Molekulargenetik
 Reproduktionsbiotechnologie  Modifikation von
Ablauf und biologischer Effizient der Fortpflanzungsvorgänge; Erhöhung der Reproduktionsrate selektierter
Individuen
 Molekulargenetik  Identifizierung von Genen mit
Einfluss auf die Fruchtbarkeit; Selektion zur
nachhaltigen genetischen Verbesserung der
Reproduktionsleistung
Hypo
thalamus
Hypo
physe
GnRH
LH
FSH
Prolactin
Direkte Kandidatengene abgeleitet von der
Milchdrüse
hormonellen Steuerung der
Reproduktionsvorgänge
Activin
}
Inhibin
Östrogen
Progesteron
Androgen
Ovar
}
Uterus
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Kandidatengene für männliche Fruchtbarkeit
Gen
Biologische Funktion
GnRHR …vermittelt die Wirkung des Signals vom Hypothalamus an
die Hypophyse (Wise et al., 1984)
FSH-β
…stimuliert die Spermatogenese und beeinflusst die
Hodenmorphologie und -funktion (Zanella et al., 1999;Li et al., 1998)
PRLR
…stimuliert die Spermatogenese und beeinflusst die
Hodenmorphologie und -funktion (Hondo et al., 1995)
RLN
Relaxin-Konzentration in der Samenflüssigkeit ist korreliert
mit der Motilität der Spermien (Sasaki et al., 2001)
AR
…vermittelt die Wirkung der männlichen Sexualhormone
Androgenrezeptor (AR)
AR ist ein Kandidatengen für Reproduktionsmerkmale:
vermittelt die hormonale Antwort auf Androgene und reguliert die Expression des Zielgens;
beeinflusst Zellvermehrung und Differenzierung im Zielgewebe
1.
AR vorhanden in Hoden und Ovar
(Kimura et al., 1993; Pelletier et al., 2000; Duffy et al.,1999)
2.
positive Korrelation zwischen AR mRNA Expressionen und GranulosaZelldifferenzierung (Weil et al., 1998)
3.
AR fördert das Follikelwachstum und die Östrogensynthese durch die Verstärkung des
Effekts des Follikel- stimulierenden-Hormons, FSH (Keith et al., 1998; Weil et al., 1999)
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14.04.2015
Genomic hat zum Ziel die
Feststellung des Status quo zwecks
Nutzung für züchterische Selektion!
Es ist keine
genetische
Manipulation!
Androgenrezeptor
Sequenzanalyse: cDNA: 3.554 bp
Promotor: 2.459 bp
Polymorphismen: SNPs in Promotor und cDNA
INDEL in Promotor und Exon 1
(CCTTT)n im 5´-UTR
Assoziationen:
Frühreife:
Zitzenzahl:
Chi-square = 48.840; (p< 0.001)
Chi-square = 38.311 ; (p=0.032)
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Genorten für produktionsrelevante
Merkmale bei Nutztieren
Tierart
Merkmal
Chromosom
Rind
Doppellender
2
28
14.04.2015
29
14.04.2015
Kerntransfervorgang
in einer vorher
enukleierten
Empfängerzygote.
Im Anschluss an den
Transfererfolgt die
Fusion beider Anteile
Zygote nach
einer
Zentrifugation
und während der
Injektion in den
Vorkern
30
14.04.2015
Mikroinjektion von DNA-Konstrukten in Schweinezygoten. Die Zygoten
sind zentrifugiert worden, um die Vorkerne sichtbar zu machen. Es
werden 1 - 2 pl (10-12) in einen Vorkern injiziert.
Effizienz der Mirkoinjektion zur Erstellung
transgener Tiere
Injizierte Nachkommen /Feten
Zygoten
n
%
Transgene
n
%
26 0,2
Rind
15.019
432 /4269
10,1
Schaf
7.552
955
12,6
55
0,7
Schwein
13.988
1.264/13.446 9,4
93
0,7
31
14.04.2015
Was kostet ein
transgenes
Tier ?
Maus..................80 €
Schwein......20.000 €
Schaf...........48.000 €
Rind...........420.000 €
32
14.04.2015
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