Entwicklung eines Testsystems für die Genotoxizität von

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Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Verfahrens, mit dem chemische Substanzen
auf eine mutagene oder genotoxische Wirkung getestet werden können.
Eine solche Detektion von primären DNA-Schädigungen oder Mutationen sollte über die
direkte Bindung von Reparaturenzymen erfolgen.
Im ersten Projekt wurde ein Erkennungsenzym des menschlichen Reparaturweges für
Fehlpaarungen, hMSH-2, in Bezug auf DNA- und Nukleotidbindung untersucht. Durch
Hybridisierung von amplifizierter behandelter DNA mit amplifizierter unbehandelter DNA
zeigen sich Mutationen als Fehlpaarungen, welche durch hMSH-2 100 fach affiner als
komplementäre DNA gebunden werden sollten.
hMSH-2 wurde rekombinant produziert und konnte nach Entwicklung eines eintägigen
Reinigungsprotokolls im Milligram-Massstab gereinigt werden. Es zeigte sich jedoch, dass
die Spezifität von hMSH-2 alleine für fehlgepaarte DNA nur bei einem Faktor vier liegt
und somit alleine nicht zur Detektion von Fehlpaarungen einsetzbar ist. Offensichtlich wird
die Spezifität des Systems durch weitere Faktoren, z.B. die Bildung eines Heterodimers
mit hMSH-6 bedingt.
Es konnte gezeigt werden, dass DNA-Bindungsdomäne und Nukleotidbindungsdomäne
funktionell gekoppelt sind. Eine Bindung von fehlgepaarter und in schwächerem Ausmaß
auch gepaarter DNA ergab in HPLC-Analysen eine Beschleunigung der ATPase-Aktivität.
Die Bindung von Nukleotid an nukleotidbefreites hMSH-2 konnte nicht ausreichend charakterisiert werden.
Die Dissoziation von mantADP aus dem Komplex mit hMSH-2 wurde durch die DNABindung beschleunigt. Dies stimmt mit den Daten von Gradia et al. (1997) für das hMSH2-hMSH-6-Heterodimer überein, die hieraus ein Schaltermodell mit ATP-Zustand (DNABindung aus) und ADP-Zustand (DNA-Bindung an) vorschlagen. Dieses muß jedoch angezweifelt werden, da vorausgesetzt wurde, dass ATPγS nicht hydrolysierbar ist. hMSH-2
alleine hydrolysiert aber schon ATPγS.
Eine Domänenanalyse durch tryptische Spaltung ergab eine Domäne von Leu341 bis
Arg621. Demnach wäre der C-terminale Teil, der das DNA-Bindungs- und das Walker AMotiv enthält, eine eigene Domäne ab AS 622. Ein Zufallsfragment ab AS660 konnte zwar
als GST-Fusionsprotein exprimiert werden, zeigte aber wie das unverkürzte Protein nur
eine geringe Spezifität für DNA-Fehlpaarungen und ist dieser Domänenanalyse zu Folge
außerdem zumindest N-terminal zu weit verkürzt.
Im zweiten Ansatz sollte zum Nachweis einer genotoxischen Wirkung von Substanzen die
zelluläre p53-Konzentration bei Behandlung von Zellen bestimmt werden. Der p53-Spiegel
steigt nach einer Schädigung der DNA an. Dadurch wird ein Halt des Zellzyklus oder bei
starken DNA-Schäden die Apoptose eingeleitet. Zur Quantifizierung der zellulären p5398
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Konzentration wurde ein direkter Sandwich-ELISA entwickelt. Die Nachweisgrenze des
Systems war mit 3 ng/ ml p53 niedriger als die p53-Konzentration in zellulären Extrakten.
Zu diesem Zeitpunkt wurde mit einem ähnlichen System gezeigt, dass der Anstieg des
zellulären p53-Spiegels als Parameter für eine genotoxische Wirkung einer Substanz dienen kann. Da jedoch nur DNA-Strangbrüche einen Anstieg des p53-Spiegels verursachen
und somit Primärschädigungen nicht detektierbar sind, lag die Nachweisgrenze dieses Systems erst bei hohen Dosen der eingesetzten Karzinogene.
Die Detektion von UV- oder chemisch induzierten Primärschädigungen gelang mit Enzymen des bakteriellen UvrABC-Ausschnittsreparatursystems.
Zuerst wurde versucht, die Bindung von UvrA alleine an DNA-Schädigungen zu deren
Nachweis einzusetzen. UvrA wurde aus genomischer E. coli DNA kloniert, exprimiert und
nach Entwicklung eines Protokolls gereinigt. Es wurde ein ELISA-Systeme konzipiert,
dass ein Farbsignal in Folge der Bindung von UvrA an DNA ergab. Hiermit konnte gezeigt
werden, dass ein ELISA-System mit einer Protein-DNA-Bindung statt nur AntikörperEpitop-Bindungen möglich ist.
Durch Titration von UV-geschädigter DNA mit UvrA konnten die Dissoziationskonstanten
in Lösung bei verschiedenen Ionenstärken bestimmt werden. Es zeigte sich jedoch wie
beim UvrA-ELISA nur eine drei- bis vierfach höhere Affinität für geschädigte DNA als für
ungeschädigte DNA.
UvrB dagegen bildet nach Transport im UvrA2B-Heterotrimer einen spezifischen, stabilen
Komplex mit einer DNA-Schädigung aus. UvrB wurde kloniert, exprimiert und gereinigt.
Es war gefaltet und zeigte eine thermische Entfaltung mit einem Schmelzpunkt bei 42 °C.
Die Bildung des Komplexes aus geschädigter DNA und UvrB konnte in Titrationsexperimenten bestätigt werden, wobei eine hohe Spezifität für geschädigte DNA besteht. Der
apparente Kd für diese Bindung liegt bei 160 nM.
Um die Bildung des stabilen Komplexes aus UvrB mit geschädigter DNA für den Nachweis von DNA-Schäden in genomischer DNA einsetzen zu können, wurde sowohl UvrB
mit einem Fluorophor markiert als auch ein weiteres ELISA-System konzipiert.
UvrB wurde mit CPM, einem Coumarin-Derivat, markiert und mit UvrA2 titriert. Es zeigte
sich eine Bindung mit einem Kd von 37 nM. Titration dieses Komplexes mit geschädigter
und ungeschädigter genomischer DNA führte zwar zu einer Bindung, wobei jedoch kein
signifikanter Unterschied zwischen geschädigter und ungeschädigter DNA feststellbar war.
Die Bildung des stabilen Komplexes von UvrB mit geschädigter DNA war also in Lösung
nicht im Hintergrund der Bindung von UvrA2B an ungeschädigte DNA nachweisbar.
Mit dem schließlich entwickelten UvrA2B-ELISA-System können chemische Substanzen
auf eine genotoxische Wirkung getestet werden. Hierbei wird genomische DNA immobilisiert und führt bei Bildung eines stabilen Komplexes aus UvrB und DNA-Schädigung zu
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einem Farbsignal. Unspezifische Bindung des UvrA2B-Komplexes an die DNA wird jedoch durch mehrere Waschschritte aufgehoben.
Mit diesem System konnten sowohl UV- als auch chemische induzierte DNA-Schäden
nachgewiesen und quantifiziert werden. Es wurden sowohl Cisplatin-Addukte, Methylierungen, Interkalationen und andere DNA-Addukte detektiert. Durch dieses System kann
folglich die ganze Bandbreite der durch das UvrABC-Reparatursystem erkannten DNASchäden, von DNA-Addukten über strukturelle Veränderungen bis zu Interkalationen,
nachgewiesen werden. Es muß jedoch noch an einer Standardisierung der Testbedingungen
und somit Stabilisierung des Systems gearbeitet werden.
Das entwickelte Testsystem ist als high throughput-System automatisierbar, kostengünstig
und schnell durchzuführen. Durch die Konzeption als ELISA-System besitzt es eine hohe
Sensitivität, so dass ein Cisplatin-Addukt auf 380.000 ungeschädigte Basen in genomischer
DNA nachgewiesen werden konnte. Diese Empfindlichkeit wird unter den etablierten Genotoxizitätstests bisher nur beim radioaktiven Postlabelling-Verfahren erreicht, welches
nicht automatisierbar ist. Die Verwendung von genomischer DNA bietet den Vorteil, dass
auch DNA-Proben aus behandelten Zellen oder Gewebe, Biopsiematerial oder Blut auf
Primärschädigungen getestet werden können.
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