Expression von identifizierten clostridiellen Butanol
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Expression von identifizierten clostridiellen Butanol-Synthese-Genen im Zwischenwirt Escherichia coli Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Ulm vorgelegt von Stefanie Schuster aus Memmingen Ulm, 2010 Die vorliegende Arbeit wurde in dem Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie der Universität Ulm unter der Anleitung von Herrn Prof. Dr. Peter Dürre angefertigt. Amtierender Dekan: Prof. Dr. A. Groß Erstgutachter: Prof. Dr. P. Dürre Zweitgutachter: Prof. Dr. B. Eikmanns Tag der Promotion: 03.12.2010 Zwei Dinge sind zu unserer Arbeit nötig: Unermüdliche Ausdauer und die Bereitschaft, etwas, in das man viel Zeit und Arbeit gesteckt hat, wieder wegzuwerfen. Albert Einstein Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung.................................................................................................................1 2. Material und Methoden..........................................................................................13 2.1. Bakterienstämme ............................................................................................13 2.2. Plasmide .........................................................................................................15 2.3. Oligodesoxynukleotide ....................................................................................20 2.4. Materialien.......................................................................................................23 2.4.1 Gase..........................................................................................................23 2.4.2. Chemikalien..............................................................................................23 2.4.3. Enzyme ....................................................................................................26 2.4.4. Verwendete "Kits".....................................................................................27 2.4.5. Geräte ......................................................................................................27 2.5. Zellanzucht......................................................................................................29 2.5.1. Nährmedien..............................................................................................29 2.5.1.1. CGM ("Clostridial Growth Medium")...................................................31 2.5.1.2. LB (Luria-Bertani)-Medium.................................................................31 2.5.1.3. RCM ("Reinforced Clostridial Medium") .............................................32 2.5.1.4. SD-8-Medium.....................................................................................32 2.5.1.5. SOB-Medium .....................................................................................33 2.5.1.6. SOC-Medium .....................................................................................33 2.5.1.7. TM3a/Glucose-Medium......................................................................34 2.5.1.8. TY-Medium ........................................................................................35 2.5.2. Medienzusätze .........................................................................................35 2.5.2.1. Antibiotika ..........................................................................................35 2.5.2.2. Sonstige Medienzusätze....................................................................36 2.5.3. Anzuchtbedingungen................................................................................36 2.5.4. Stammhaltung ..........................................................................................37 2.5.5. Bestimmung von Wachstums- und Stoffwechselparametern ...................38 2.5.5.1. Trübungsmessung .............................................................................38 2.5.5.2. Messung des externen pH-Wertes ....................................................38 2.5.5.3. Glucose-Bestimmung.........................................................................38 2.5.5.4. Gaschromatographische Analytik des Produktspektrums..................39 2.6. Arbeiten mit Nukleinsäuren .............................................................................41 2.6.1. Behandlung von Lösungen und Geräten ..................................................41 I Inhaltsverzeichnis 2.6.2. Lösungen, Puffer, Wasser ........................................................................41 2.6.3. Isolierung von Nukleinsäuren aus Bakterien ............................................41 2.6.3.1. Isolierung von Gesamt-DNA aus Clostridien......................................41 2.6.3.2. RNase-Behandlung von wässrigen DNA-Lösungen ..........................42 2.6.3.3. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli.............................................42 2.6.3.4. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli mittels "peqGOLD Plasmid Miniprep Kit I" und "Zyppy™ Plasmid Miniprep Kit" ...............................43 2.6.4. Reinigung und Konzentrierung von Nukleinsäuren ..................................44 2.6.4.1. Phenol-Chloroform-Extraktion............................................................44 2.6.4.2. Ethanolfällung ....................................................................................45 2.6.4.3. Isopropanolfällung .............................................................................45 2.6.4.4. Dialyse von DNA-Lösungen...............................................................46 2.6.4.5. Reinigung und Konzentrierung von DNA aus Lösungen mittels "UltraClean™15 DNA Purification Kit" und "DNA Clean & Concentrator™-5 Kit".............................................................................46 2.6.4.6. Reinigung von DNA aus Agarose-Gelen mittels "UltraClean™15 DNA Purification Kit" und "Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit"...................47 2.6.5. Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäurefragmenten.................47 2.6.5.1. Nicht-denaturierende Agarose-Gelelektrophorese.............................47 2.6.6. Färbung von Nukleinsäuren in Agarose-Gelen.........................................49 2.6.7. Größenbestimmung von Nukleinsäuren ...................................................49 2.6.8. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren .......................................50 2.6.8.1. Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren .......50 2.6.8.2. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren im Agarose-Gel .......51 2.6.9. Enzymatische Modifikation von DNA........................................................51 2.6.9.1. Restriktionsspaltung von DNA ...........................................................51 2.6.9.2. Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten .......................................52 2.6.9.3. Ligation von DNA-Fragmenten ..........................................................53 2.6.10. Amplifikation von DNA durch Polymerase-Kettenreaktion......................53 2.6.10.1. Herstellung synthetischer Oligodesoxynukleotide............................53 2.6.10.2. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...................................................54 2.6.10.3. Einfügen von Restriktionsschnittstellen............................................56 2.6.10.4. TA-Klonierung von PCR-Produkten .................................................57 2.6.11. Sequenzierung von DNA ........................................................................57 2.7. DNA-Transfer in Bakterien ..............................................................................58 2.7.1. Transformation von E. coli........................................................................58 2.7.1.1. Transformation durch chemisch kompetente Zellen ..........................58 II Inhaltsverzeichnis III 2.7.1.2. Transformation durch Elektroporation................................................59 2.7.1.3. Blau-Weiß-Selektion rekombinanter E. coli-Klone .............................60 2.7.2. Transformation von Clostridien.................................................................61 2.7.2.1. Methylierung von Plasmid-DNA .........................................................61 2.7.2.2. Transformation durch Elektroporation................................................62 2.8. "ClosTron® Gene Knockout System"...............................................................64 2.8.1. Ein-Schritt-SOE-PCR ...............................................................................65 2.8.2. Restriktionsspaltung von DNA-Fragment und Vektor pMTL007 ...............66 2.8.3. Ligation von DNA-Fragment und Vektor pMTL007...................................67 2.8.4. Transformation von pMTL007 in C. acetobutylicum .................................67 2.8.5. Induktion der Integration in C. acetobutylicum..........................................67 2.8.6. Kontrolle der Integration mittels PCR .......................................................68 3. Ergebnisse ............................................................................................................69 3.1. Konstruktion eines Butanol-Synthese-Operons...............................................69 3.2. Synthese von 1-Butanol in E. coli ...................................................................74 3.2.1. Wachstumsversuche von E. coli mit dem Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald .......................................................................74 3.2.1.1. Synthese von 1-Butanol aus Butyrat..................................................75 3.3. Synthese von 1-Butanol in E. coli mit artifiziellen Butanol-Synthese-Operons 79 3.3.1. Klonierung der artifiziellen Butanol-Synthese-Gene in den single-copyVektor pSB3C5 und Transformation in E. coli..............................................79 3.3.2. Wachstumsversuche von E. coli mit den artifiziellen Butanol-SyntheseOperons .......................................................................................................81 3.3.2.1. Wachstumsversuche von E. coli mit dem Kontrollplasmid pGS20.....82 3.3.2.2. Synthese von 1-Butanol in TY-Medium..............................................83 3.3.2.3. Synthese von 1-Butanol in TY-Medium mit 2 % Glucose...................86 3.3.2.4. Synthese von 1-Butanol in TY-Medium mit 2 % Glucose (erneute Glucose-Zugabe beim Erreichen der stationären Phase) ......................90 3.3.2.5. Synthese von 1-Butanol in SD-8-Medium mit 2 % Glucose (erneute Glucose-Zugabe beim Erreichen der stationären Phase) ......................93 3.3.3. Klonierung der artifiziellen Butanol-Synthese-Gene in den E. coli/Clostridien-Schaukelvektor pIMP1 ....................................................97 3.3.4. Wachstumsversuche von E. coli mit den artifiziellen Butanol-SyntheseOperons .......................................................................................................97 3.3.4.1. Wachstumsversuche von E. coli mit dem Kontrollplasmid pIMP1......97 3.3.4.2. Synthese von 1-Butanol in TY-Medium mit 2 % Glucose...................98 3.4. Verstoffwechselung von 1-Butanol durch E. coli ...........................................102 Inhaltsverzeichnis IV 3.5. Wachstum von E. coli in Gegenwart von 1-Butanol ......................................103 3.6. Klonierung und Expression der Cytochrom-P450-Monooxygenase (CYP152A2) von C. acetobutylicum..................................................................104 3.7. Verwendung des "ClosTron® Gene Knockout Systems" zur Inaktivierung von CAC3330 in C. acetobutylicum ........................................................................106 4. Diskussion ...........................................................................................................113 5.a. Zusammenfassung ...........................................................................................146 5.b. Summary ..........................................................................................................148 6. Literatur ...............................................................................................................150 7. Anhang ................................................................................................................172 Abkürzungen V Abkürzungen α A. A Abb. ADP AG Apr ATCC ATP ß B. Bp bzw. c C C C. °C ca. C/I Cmr Co CO CO2 CoA d DDa DMF DNA DNase dNTP DSMZ ε E. Alpha Acetobacterium Adenin Abbildung Adenosin-5′-diphosphat Aktiengesellschaft Ampicillin-Resistenz American Type Culture Collection Adenosin-5′-triphosphat Beta Bacillus Basenpaar(e) beziehungsweise "Centi" (Präfix Hundertstel; 10-2) Cytosin Kohlenstoff Clostridium Grad Celsius circa Chloroform/Isoamylalkohol Chloramphenicol-Resistenz Kompanie Kohlenmonoxid Kohlendioxid Coenzym A Schichtdicke "Dexter" (rechts) Dalton N,N-Dimethylformamid "Deoxyribonucleic Acid" (Desoxyribonukleinsäure) Desoxyribonuklease Desoxynukleosid-5′-triphosphat Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen molarer Extinktionskoeffizient Escherichia Abkürzungen VI E EBS EDTA Emr et al. Extinktion "Exon Binding Site", Exon-Bindestelle Ethylendiamin-N,N,N′,N′-tetraessigsäure Erythromycin-Resistenz "et alii" (und andere) F Fa. FID g xg G G+C-Gehalt GmbH h h H2 H2O HCl IBS IEP Inc. IPTG k KG Kmr l L. Farad Firma Flammenionisationsdetektor Gramm x fache Erdbeschleunigung (9,81 m/s2) Guanin Gehalt an Guanin und Cytosin in einer DNA-Sequenz Gesellschaft mit beschränkter Haftung "Hekto" (Präfix Hundert; 102) Stunde(n) Wasserstoff Wasser Hydrochlorid (Salzsäure) "Intron Binding Site", Intron-Bindestelle "Intron Encoded Protein", Intron-kodiertes Protein Incorporated (eingetragen) Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid "Kilo" (Präfix Tausend; 103) Kommanditgesellschaft Kanamycin-Resistenz Liter Lactococcus µ m m M M M. "Mikro" (Präfix Millionstel; 10-6) Meter "Milli" (Präfix Tausendstel; 10-3) "Mega" (Präfix Million; 106) Molar (mol/l) Moorella MCS mesh min mod. "Multiple Cloning Site" (Multiple Klonierungsstelle) Maschengröße Minute(n) modifiziert Abkürzungen VII mol mRNA n N NaCl NAD+ NADH + H+ NADP+ NADPH + H+ NaOH NCIMB Ω OD600nm orf ori Mol (Stoffmenge; 6,022 x 1023 Teilchen) messenger RNA "Nano" (Präfix Milliardstel; 10-9) Äquivalentkonzentration Natriumchlorid β-Nicotinamidadenindinukleotid β-Nicotinamidadenindinukleotid (reduziert) β-Nicotinamidadenindinukleotid-2′-phosphat β-Nicotinamidadenindinukleotid-2′-phosphat (reduziert) Natriumhydroxid The National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria Ohm Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm "Open Reading Frame" (Offener Leserahmen) "Origin of Replication" (Replikationsursprung) p p P p. a. "Piko" (Präfix Billionstel; 10-12) Plasmid Promoter "pro analysi" (zur Analyse) P/C/I PCR pH ® RAM RNA RNase rRNA RT s SDS SOE sog. Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol "Polymerase Chain Reaction" (Polymease-Ketten-Reaktion) Negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration "registered" (eingetragenes Warenzeichen) "retrotransposition-activated selectable marker", durch Retrotransposition aktivierter Selektivmarker "Ribonucleic Acid" (Ribonukleinsäure) Ribonuklease Ribosomale RNA Raumtemperatur Sekunde(n) "Sodiumdodecylsulfate" (Natriumdodecylsulfat) "Splicing by Overlap Extension" so genannt Spr T T Tab. Spectinomycin-Resistenz Terminator Thymin Tabelle Abkürzungen VIII Taq Abkürzung für Thermus aquaticus Tm ™ U Schmelztemperatur trademark (Warenzeichen) Enzymeinheit(en) (1 U = Enzymmenge, die 1 µmol Substrat pro Minute umsetzt) unter anderem über Nacht Umdrehungen pro Minute Ultraviolettes Licht Volt Verdünnungsfaktor Volumen Volumen pro Volumen Wildtyp Gewicht pro Volumen 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-galactosid zum Beispiel u. a. ÜN Upm UV V VF Vol. (v/v) WT (w/v) X-Gal z. B. 1. Einleitung 1 1. Einleitung Rohölpreis [US$/Barrel] Biokraftstoffe aus erneuerbarer Biomasse stellen eine Alternative zu fossilen Brennstoffen dar. Aufgrund des steigenden Rohölpreises (Abb. 1), welcher im Juli 2008 einen Höchstwert von 145 US$ pro Barrel erreichte, was eine Preisverdopplung innerhalb eines Jahres bedeutete, und der Verknappung von Erdölreserven aufgrund des weltweit steigenden Energiebedarfs, wächst das Interesse an so genannten Biokraftstoffen. Unabhängig von steigenden Ölpreisen und der Verfügbarkeit führt die Verbrennung fossiler Treibstoffe zu einer massiven Anhäufung des Treibhausgases CO2 in der Atmosphäre, was zur globalen Erwärmung führt. Ein weiterer Anstieg der CO2-Emission könnte durch die Nutzung von Biokraftstoffen verhindert werden. Zeit [Jahr] Abbildung 1: Entwicklung des Rohölpreises der Marke West Texas Intermediate (WTI; Texas Light Sweet) von 1946 bis zur Finanz- und Wirtschaftskrise 2008 (http://research.stlovisfed.org/fred2/series/OILPRICE/downloaddata?cid=98) Die Herstellung von Biokraftstoffen erfolgt auf chemischem oder biotechnologischem Wege. Während Bioethanol sowie Biodiesel bereits in großem Maßstab produziert werden (50 Milliarden Liter Bioethanol und 7 Milliarden Liter Biodiesel im Jahr 2007), haben im Juni 2006 zwei der weltweit größten Konzerne, BP und DuPont, eine Kooperation über die fermentative Herstellung von Biobutanol abgeschlossen. In Zusammenarbeit mit British Sugar sollen zukünftig jährlich etwa 30000 Tonnen Biobutanol in Wissington hergestellt werden (www.bp.com/liveassets/bp_internet/globalbp/STAGING/global_assets/downloads/B/B io_bp_dupont_fact_sheet_jun06.pdf). 1. Einleitung 2 Zudem beabsichtigen die Virgin Gruppe zusammen mit Gevo, Inc. (www.gevo.com/what.php) sowie einige kleinere Unternehmen, wie Cobalt Biofuels (www.cobaltbiofuels.com/), Green Biologics, Ltd. (www.greenbiologics.com/biofuels.asp) oder METabolic Explorer (www.metabolicexplorer.com/contenu.php?rub=product&ssrub=2), Biobutanol zu produzieren. Dennoch stellen derzeit die meisten Länder, die Vereinigten Staaten oder Brasilien, hauptsächlich Bioethanol als Biokraftstoff her (80 % des weltweit produzierten Bioethanols wurden im Jahr 2007 in den Vereinigten Staaten und in Brasilien hergestellt). Europäische Länder wie z. B. Deutschland, Frankreich und Italien stellen ebenso große Mengen an Biodiesel her (70 % des gesamten Biodiesels wurden 2007 in europäischen Ländern produziert) (http://www.ethanolrfa.org/industry/statistics/; http://www.ebio.org/uploads/080407PRbioethanolproduction2007.pdf; http://www.ebbeu.org/EBBpressreleases/EBB%20press%20release%202007%20stats%20final25062 008.pdf). Hierbei stellt die Bioethanol-Fermentation den größten biotechnologischen Prozess dar. Am häufigsten wird Bioethanol durch die Fermentation von z. B. Zucker oder Stärke durch Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Im Jahr 2007 wurden weltweit insgesamt 49,6 Milliarden Liter Bioethanol als Biotreibstoff bzw. als Zusatz genutzt (http://www.ethanolrfa.org/industry/statistics/). Bereits 1860 konnte der von Nikolaus August Otto entwickelte Otto-Motor sowohl mit Benzin als auch mit Ethanol als Kraftstoff betrieben werden. Auch Henry Fords "Modell T" ("Tin Lizzie"), welches zwischen 1908 und 1927 produziert wurde, konnte mit Ethanol betrieben werden. Biodiesel wird chemisch aus pflanzlichen Ölen oder tierischen Fetten erzeugt und kann in reiner Form oder als Zusatz verwendet werden. Dieser Biotreibstoff entsteht aus Triglyceriden, die u. a. durch basische Katalyse (Fukuda et al., 2001; Meher et al., 2006) oder Lipasen (Sharma et al., 2001) in Gegenwart von Methanol in FettsäureMethylester (FAME) umgewandelt werden (Alkoholyse), wobei Glycerin als Nebenprodukt entsteht (Christi, 2007) (Abb. 2). Für diesen Prozess kann ebenso Ethanol oder Butanol verwendet werden. Die resultierenden Produkte werden dann als FAEE (Fettsäure-Ethylester) sowie FABE (Fettsäure-Butylester) bezeichnet. 2007 wurden weltweit mehr als 6,7 Milliarden Liter Biodiesel produziert (http://www.ebio.org/uploads/080407PRbioethanolproduction2007.pdf; http://www.ebbeu.org/EBBpressreleases/EBB%20press%20release%202007%20stats%20final25062 008.pdf). Rudolph Diesel testete bereits im Jahr 1900 Erdnussöl als Biotreibstoff. 1. Einleitung 3 Katalysator Triglyceride 3 Methanol Glycerin 3 FAME (Biodiesel) Abbildung 2: Herstellung von Biodiesel durch Alkoholyse (Noack et al., 2009) Wie Ethanol kann Butanol chemisch oder biotechnologisch hergestellt werden. Auf biotechnologischem Weg wird Butanol über die so genannte ABE (Aceton-ButanolEthanol)-Fermentation mit einigen Clostridien, v. a. mit Clostridium acetobutylicum und Clostridium beijerinckii gewonnen (Jones und Woods, 1986; Dürre, 2005; 2007; 2008; Noack et al., 2009). Am besten untersucht ist C. acetobutylicum (Girbal et al., 1998; Dürre, 1998). Hierbei handelt es ich um ein Gram-positives, stäbchenförmiges, strikt anaerobes und Endosporen-bildendes Bodenbakterium (Abb. 3). Bei der Fermentation von zuckerhaltigen Substraten werden während der exponentiellen Wachstumsphase die Säuren Acetat, Butyrat, Lactat sowie Ethanol, Acetoin, H2 und CO2 gebildet (Acidogenese). Im Übergang zur stationären Phase werden die zuvor gebildeten Säuren zum Teil wieder aufgenommen und es beginnt die Synthese von Aceton und 1-Butanol (Solventogenese). Die zur ABEFermentation nötigen Gene sind sowohl auf dem Bakterienchromosom (3,94 MBp) als auch auf dem Megaplasmid pSOL1 (192 kBp) lokalisiert und wurden bezüglich der Regulation untersucht (Girbal et al., 1998). Abbildung 3: Elektronenmikroskopische Aufnahme von C. acetobutylicum (http://blogs.princeton.edu/chm333/f2006/ biomass/ethanol%20bacteria.jpg) 1. Einleitung 4 Die am Stoffwechsel beteiligten Enzyme wurden biochemisch charakterisiert (Dürre, 1998) und das gesamte Genom wurde sequenziert (Nölling et al., 2001). Während der Fermentation werden die Lösungsmittel Aceton, Butanol und Ethanol in einem Verhältnis von 3:6:1 gebildet. Die Synthese von Butanol stellt den volumenmäßig größten biotechnologischen Prozess nach der Ethanol-Fermentation dar. Die erste industrielle Anwendung erfolgte bereits 1913 durch das britische Unternehmen Strange & Graham, Ltd. Die Geschichte der biologischen Butanol-Produktion reicht allerdings bis ins Jahr 1862 zurück. Der französische Forscher Louis Pasteur beschrieb bereits damals die Synthese von Butanol durch Vibrion butyrique (Pasteur, 1862). Allerdings handelte es sich hierbei vermutlich um ein Gemisch verschiedener Clostridien. Weitere Studien bezüglich Butanol-produzierender Organismen wurden von Albert Fitz durchgeführt, der schließlich die Isolierung des Bakteriums Bacillus butylicus beschrieb (Fitz, 1876; 1877; 1878; 1882). Andere Lösungsmittel-bildende Organismen wie Granulobacter saccharobutyricum, Amylobacter butylicus und Bacillus orthobutylicus wurden zu Beginn des 20. Jahrhunderts von Martinus Beijerinck und Sergei Winogradski isoliert (Dürre und Bahl, 1996). Vermutlich gehören all diese beschriebenen Organismen zur Gattung der Clostridien. 1910 beauftragte das britische Unternehmen Strange & Graham, Ltd Auguste Fernbach und Moïse Schoen vom Institut Pasteur in Paris sowie William Perkins und Charles Weizmann von der Universität Manchester, einen Butanol-produzierenden Organismus zu isolieren. Während es Fernbach bereits 1911 gelang, einen Stamm zu isolieren, der aus Kartoffeln neben Butanol auch Aceton produzierte und entsprechende Patente angemeldet wurden (Fernbach und Strange 1911ab; 1912), beendete Weizmann die Zusammenarbeit im Jahr 1912. Allerdings führte er seine Versuche an der Universität Manchester fort und untersuchte zwischen 1912 und 1914 zahlreiche Isolate. Es gelang ihm schließlich, einen Organismus zu isolieren, der aus stärkehaltigen Substanzen größere Mengen an Butanol und Aceton produzieren konnte und später in Clostridium acetobutylicum umbenannt wurde (McCoy et al., 1926). Im Jahr 1915 meldete Weizmann ebenfalls ein entsprechendes Patent an (Weizmann, 1915). Im August 1914 brach der Erste Weltkrieg aus und die Nachfrage an Aceton, dem eigentlichen Nebenprodukt der ABE-Fermentation, stieg, da dieses zur Produktion von Kordit (rauchschwaches Schießpulver) benötigt wurde. 1. Einleitung 5 Vor dem Krieg wurde Aceton aus Calciumacetat hergestellt, welches aus Deutschland, Österreich und den Vereinigten Staaten bezogen wurde. Da der Import nun nicht mehr möglich war und die verfügbaren Mengen durch die Vereinigten Staaten bei weitem nicht ausreichten, wurden Strange & Graham damit beauftragt, Aceton zu produzieren. Pro Woche konnten allerdings nur 440 kg Aceton hergestellt werden, was der britischen Regierung nicht ausreichte. Deshalb ging 1916 die Fabrik in deren Besitz über und nach Umstellung der Produktion auf den Weizmann-Prozess konnte die Produktion auf 1000 kg Aceton pro Woche gesteigert werden. Später wurden auch in anderen Ländern wie Kanada, USA und Frankreich neue Produktionsanlagen errichtet (Gabriel, 1928). Sicherlich führte der ständige Nachschub von Aceton mit zum Sieg der Alliierten im Ersten Weltkrieg. Weizmann lehnte allerdings alle Belohnungen und Auszeichnungen der britischen Regierung ab, äußerte aber als Mitglied der Zionisten seinen Wunsch, dass eine neue Heimat für das jüdische Volk in Palästina geschaffen werde. Es besteht kein Zweifel darin, dass dies 1917 Einfluss auf die BalfourDeklaration nahm und zur Gründung Israels führte. Weizmann, der seinen Vornamen mittlerweile von Charles in Chaim geändert hatte, wurde schließlich Präsident von Israel (Jones und Woods, 1986; Dürre, 2007; Noack et al., 2009). Die Nachfrage an Aceton während des Krieges führte dazu, dass auch Butanol in großen Mengen hergestellt wurde. Verwendung fand Butanol in der Automobilindustrie, wo es zu Butylacetat umgesetzt wurde. Dies diente als Lösungsmittel zur Herstellung von schnell trocknenden Nitrocelluloselacken (Killeffer, 1927; Gabriel, 1928). Schließlich wurde die Commercial Solvents Corporation (CSC) gegründet, welche 1919 die Patentrechte des Weizmann-Prozesses und eine der Fabriken in Terre Haute übernahm und 1920 mit der Butanol-Produktion begann (Gabriel, 1928). 1923 erhielten Strange und Graham ihre Firma zurück und nahmen ebenfalls die AcetonButanol-Fermentation wieder auf. Allerdings gingen sie kurz darauf nach einem verlorenen Rechtsstreit mit CSC in Konkurs (Ross, 1961). 1936 lief das Patent für den Weizmann-Prozess aus, woraufhin etliche neue Stämme isoliert und patentiert sowie Anlagen in den USA, Großbritannien, Puerto Rico, Südafrika, Australien, der früheren Sowjetunion, Indien, China und der ehemaligen japanischen Kolonie Formosa (dem heutigen Taiwan) errichtet wurden (McCutchan und Hickey, 1954; Jones und Woods, 1986). Bis 1950 wurden etwa 66 % des produzierten Butanols biotechnologisch hergestellt (Rose, 1961) und während des Zweiten Weltkriegs stieg auch wieder das Interesse an der Aceton-Produktion. 1. Einleitung 6 Damals wurden Aceton und Butanol großindustriell z. B. aus Melasse, Kartoffeln, Getreide und Mais produziert. Allerdings wurden ein paar Jahre danach in den meisten westlichen Ländern die Fabriken aufgrund der steigenden Substratpreise und des preiswerten Öls (Abb. 1) aus dem mittleren Osten geschlossen. Somit wurde die ABE-Fermentation, die nur noch in politisch isolierten Staaten wie der ehemaligen Sowjetunion (Zverlov et al., 2006), der Volksrepublik China (Chiao und Sun, 2007), Ägypten oder dem von einem Apartheid-Regime geführten Südafrika (Jones, 2001) aufrechterhalten wurde, durch die petrochemische Produktion (Abb. 4) ersetzt. Erst durch die Ölkrisen 1973/74 und 1979/80 stieg das Interesse an biotechnologisch produzierten Treibstoffen wieder. Aufgrund der heutigen Situation, den steigenden Ölpreisen (Abb. 1) und der Limitierung von Erdölreserven, wurden in China die Fermentationsanlagen wieder geöffnet (Chiao und Sun, 2007). Auch andere Länder wie Brasilien (Afschar et al., 1990), Frankreich (Nativel et al., 1992; Nimcevic und Gapes, 2000), Österreich (Gapes, 2000; Nimcevic und Gapes, 2000) und Großbritannien (http://www2.dupont.com/EMEA_Media/en_GB/newsreleases/article 20070626.html) haben neue Anlagen zur ABE-Fermentation errichtet. Die chemische Butanol-Synthese kann auf unterschiedliche Weise erfolgen (Abb. 4). Anwendung findet derzeit fast ausschließlich die 1938 von Otto Roelen entdeckte Oxosynthese, auch Hydroformylierung genannt. Als Oxosynthese wird die chemische Reaktion von Alkenen mit Wasserstoff und Kohlenmonoxid unter Bildung von Aldehyden bezeichnet. Bei diesem Zwei-Schritt-Prozess wird zuerst Propen mit Synthesegas (einem Gemisch aus CO und H2) und mittels eines Katalysators (Kobalt oder Rhodium), Hitze und Druck zu einem Aldehydgemisch umgewandelt, welches je nach Prozess-Bedingungen aus ca. 65-75 % Butyraldehyd besteht. Anschließend erfolgt die Hydrierung mit einem Nickel- oder Kupfer-Katalysator zu Butanol (Abb. 4a; Weißermel und Arpe, 2003; Bahrmann und Bach, 2005). In Abb. 4b ist die direkte Umsetzung von Propen zu Butanol durch einen Eisenpentacarbonyl-Katalysator dargestellt. Bei diesem 1942 von Walter Reppe für BASF entwickelten Vorgang entstehen je nach Bedingungen ca. 85 % Butanol und 15 % Isobutanol. Seit 1984 wird diese Methode allerdings aufgrund zu hoher Kosten nicht mehr angewendet (von Kutepow und Kindler, 1960; Weißermel und Arpe, 2003). Zudem wird der Ausgangsstoff Propen durch "cracken" von Erdöl hergestellt. Aufgrund der steigenden Ölpreise und der Verknappung von Ölreserven ist die Nutzung von Propen zur Butanol-Synthese nicht wirtschaftlich (Abb. 1). Eine Alternative bietet die Synthese ausgehend von Acetaldehyd (Abb. 4c). 1. Einleitung 7 Allerdings ist diese Methode aufwendig und es entstehen erhebliche Mengen an giftigem Abwasser. Daher findet dieser Prozess nur in Ländern wie Brasilien statt, die über große Mengen Ethanol und somit auch Acetaldehyd verfügen (Weißermel und Arpe, 2003). Weltweit werden derzeit etwa 4,5-5,5 Millionen Tonnen Butanol pro Jahr auf chemischem Wege synthetisiert (Donaldson et al., 2007). Abbildung 4: Chemische Herstellung von 1-Butanol: a) Oxosynthese (Hydroformylierung), b) Reppe-Prozess, c) Acetaldol-Kondensation mit anschließender Crotonaldehyd-Hydrierung (Köpke, 2009) Butanol (IUPAC Nomenklatur 1-Butanol) ist ein primärer Alkohol, welcher aus vier Kohlenstoffatomen besteht (Abb. 5). Diese farblose, brennbare und klare Flüssigkeit zeichnet sich durch einen charakteristischen Bananen-ähnlichen Geruch aus. Zudem ist Butanol mit allen organischen Lösungsmitteln beliebig mischbar, in Wasser allerdings nur begrenzt löslich. In Tabelle 1 sind die wichtigsten Eigenschaften von 1-Butanol dargestellt. 1. Einleitung 8 Tabelle 1: Eigenschaften von 1-Butanol Molekulare Masse: 0,81 g/cm3 90 g/l Schmelzpunkt: Siedepunkt: -89 °C 118 °C Flammpunkt: Zündpunkt: 35 °C 340 °C Dichte : Löslichkeit in Wasser1): 1) 74,12 g/mol 1) bei 20 °C Abbildung 5: Struktur von 1-Butanol (http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/thumb/c/ca/KalottenMd_1Butanol.png/150pxKalottenMd_1Butanol.png) Eine bedeutende Rolle spielt Butanol in der industriellen Anwendung. Beinahe die Hälfte der weltweiten Produktion wird in Butylacrylat und Butylmethacrylatester umgewandelt. Weitere wichtige Derivate sind Butylglykol und Butylacetat. Butylacrylat und Butylmethacrylatester werden hauptsächlich als Polymere für die Produktion von z. B. Oberflächenbeschichtungen, Lacken, Textilien, Kleb- und Kunststoffen verwendet. Etwa ein Viertel wird zu Butylglycol umgesetzt. Als Lösungsmittel wird es für Industrie-Beschichtungen und Putzmittel verwendet. Aber auch in der Elektronik kommt Butylglycol zur Anwendung. Butylacetat wird in Farben, Drucken und Tinte genutzt sowie als synthetischer Aromastoff in Eiscreme, Käse und Backwaren eingesetzt. Butanol findet zudem sowohl direkt als Lösungsmittel Anwendung, als auch in Hydraulik- und Bremsflüssigkeiten, als Extraktionsmittel bei der Produktion von Medikamenten, Alkaloiden, Antibiotika, Hormonen und Vitaminen sowie bei Kosmetika (Dürre, 2005; 2008). 1. Einleitung 9 Zunehmend an Bedeutung gewinnt der Einsatz von fermentativ aus erneuerbaren Ressourcen hergestelltem Butanol, so genanntem Biobutanol als Biotreibstoff. Durch Nutzung von Biobutanol könnte der Ausstoß Klima-schädigender Gase minimiert werden und die Industrieländer unabhängiger von dem immer teurer werdenden Erdöl machen. Zudem weist Biobutanol im Vergleich zu Bioethanol, welches schon seit Jahrzehnten als Biokraftstoff eingesetzt wird, einige Vorteile auf. Biobutanol kann in reiner Form oder als Zusatz in jeder beliebigen Konzentration mit normalem Benzin in herkömmlichen Motoren eingesetzt werden (www.butanol.com), da es sehr ähnliche Eigenschaften zu normalem Benzin aufweist. Ethanol kann hingegen nur bis zu einem Mischungsverhältnis von maximal 85 % zugegeben werden. (Tab. 2; Dürre 2007; Noack et al., 2009). Außerdem zeichnet sich Biobutanol durch einen geringeren Dampfdruck aus, was die Handhabung einfacher macht. Ein Nachteil von Ethanol ist die doppelt so hohe Verdampfungsenergie, die zu einer unvollständigen Verbrennung im Motor und somit zu Problemen bei Kaltstarts führt. Des Weiteren ist Biobutanol nicht korrosiv und absorbiert kein Wasser, was folglich die Phasentrennung des Butanol/Benzin-Gemisches verhindert. Somit kann es sofort beigemischt, durch Pipelines transportiert und an Tankstellen gelagert werden. Ethanol hingegen kann erst kurz vor Gebrauch zugegeben werden. Ein weiterer Vorteil von Biobutanol ist, dass es sich durch eine höhere Energiedichte auszeichnet, was zu einer höheren Laufleistung führt, welche mit Benzin vergleichbar ist. Außerdem weist Butanol ein höheres Luft-Treibstoff-Verhältnis auf. Dies bedeutet, dass Ethanol in reicheren Gemischen gefahren werden muss, um dieselbe Motorkraft zu erreichen (Dürre, 2007; Noack et al., 2009). In Tabelle 2 werden die wichtigsten Eigenschaften von Benzin, Butanol und Ethanol miteinander verglichen. Tabelle 2: Vergleich von Benzin mit Biotreibstoffen Eigenschaften Benzin Butanol Ethanol 32-35 29,2 19,6 Laufleistung [%] 100 83-91 61-66 Luft-Treibstoff-Verhältnis 14,6 11,2 9,0 Research-Oktanzahl (ROZ) 91-99 96 129 Motor-Oktanzahl (MOZ) 81-89 78 102 0,36 0,43 0,92 Energiedichte [MJ/l] Verdampfungsenergie [MJ/kg] 1. Einleitung 10 Zwar gelten Biokraftstoffe aus nachwachsenden Rohstoffen als umweltfreundlich, jedoch werden diese aus Nutzpflanzen hergestellt. Als Substrate zur fermentativen Biokraftstoff-Herstellung dienen Zucker oder Stärke aus Melassen, Weizen, Kartoffeln und Mais. In Brasilien werden jährlich etwa 15 Milliarden Liter Ethanol aus Zuckerrohr produziert, wobei riesige Anbauflächen für Zuckerrohr bis zu fünfmal im Jahr abgeerntet werden (http://www.spiegel.de/wissenschaft/natur/0,1518,406148,00.html). Die steigende Nachfrage an Zuckerrohr und Getreide stürzt die Lebensmittelbranche allerdings in eine globale Lebensmittelkrise. So stieg der Preis für entsprechende Nahrungsmittel, der jahrelang relativ stabil geblieben ist, in den letzten drei Jahren enorm an (Abb. 6). Zudem führt die steigende Nachfrage an Biokraftstoffen dazu, dass weltweit ein höherer Anteil an Ackerflächen für den Anbau der entsprechenden Pflanzen bereitgestellt wird. In den USA wird mittlerweile etwa ein Drittel der Getreideproduktion zur Ethanolherstellung verwendet und in Europa ist ca. die Hälfte des Pflanzenöls für die Biodieselproduktion reserviert (http://www.spiegel.de/wirtschaft/0,1518,563817,00.html). Doch führt der zunehmende Absatz für Biokraftstoffe nicht nur zu steigenden Preisen für Nahrungsmittel, sondern auch zur Verteuerung der Biokraftstoff-Produktion und zu Hunger in ärmeren Ländern. Die negativen Folgen wurden bereits 2007 in Mexiko spürbar, wo die steigenden Nahrungsmittelpreise für Proteste und Unruhen sorgten, da die Maisreserven geringer wurden und folglich der Preis für Maismehl stieg, welches zur Herstellung von Tortilla-Fladen verwendet wird, dem Grundnahrungsmittel der Mexikaner. So verdoppelte sich in Mexiko-Stadt der Kilopreis für Tortilla innerhalb weniger Wochen von umgerechnet 40 auf 75 Euro-Cent. Auch in anderen ärmeren Ländern wie Haiti, sorgen die steigenden Lebensmittelpreise dafür, dass Grundnahrungsmittel wie Getreide oder Reis für viele Menschen unbezahlbar werden. Aufgrund des bestehenden Ernährungsproblems steht die Produktion von Biokraftstoffen aus Nutzpflanzen in der Kritik, da sich hierbei eine Konkurrenz zum Lebensmittelmarkt ergibt (Abb. 6). 1. Einleitung 11 Abbildung 6: Entwicklung der Getreidepreise am Beispiel von Reis, Weizen, Mais und Hirse im Zeitraum von 2003 bis 2008 (http://www.welthungerhilfe.de/fileadmin/media/bilder/Infografik/getreidepreise_gr.jpg) Alternativen würden sich einerseits durch die Nutzung von pflanzlichen Reststoffen wie Stroh oder Holz ergeben oder durch den Anbau von Energiepflanzen, die keine landwirtschaftliche Bewirtschaftung benötigen sowie auf minderwertigen Böden wachsen. Pflanzenreste oder Holz enthalten nur wenig Stärke oder Saccharose, dafür aber Lignocellulose, welches in den Zellwänden eingelagert ist. Lignocellulose besteht aus 40-50 % Cellulose, 25-35 % Hemicellulose und 15-20 % Lignin. Um aus Lignocellulose Bioethanol herstellen zu können, bedarf es allerdings einer Vorbehandlung und einer enzymatischen Hydrolyse der Lignocellulose in fermentierbare Zucker, was teuer und zeitaufwendig ist (Schubert, 2006; Gray und Zhao, 2006). Andererseits gibt es eine Gruppe von Mikroorganismen, die in der Lage sind, sehr einfache Substrate zu nutzen. Die so genannten acetogenen Organismen (Drake, 1994; Drake et al., 2006) können autotroph auf im Überfluss vorhandenen gasförmigen Substraten wie CO2 + H2 oder auch auf CO wachsen (Wood, 1991). CO bildet hierbei den Hauptanteil an Synthesegas, welches preiswert und relativ einfach herzustellen ist (Weißermel und Arpe, 2003). 1. Einleitung 12 Zudem sind acetogene Bakterien gegenüber den im Synthesegas enthaltenen Schwefelgasen (Schwefelwasserstoff und Carbonylsulfid), CO2 und Teer (Weißermel und Arpe, 2003) sehr tolerant (Vega et al., 1990; Bredwell et al., 1999; Ragauskas et al., 2006). Auch einige Clostridien gehören dieser Gruppe an (Drake und Küsel, 2005). Folglich ist es aufgrund der nahen Verwandtschaft möglich, die bereits identifizierten Butanol-Synthese-Gene aus C. acetobutylicum (Dürre, 2005) in acetogenen Clostridien, wie z. B. C. ljungdahlii zu exprimieren. Die Butanol-Synthese erfolgt hierbei aus Synthesegas über Acetyl-CoA, welches sowohl das Hauptintermediat des acetogenen Stoffwechsels als auch das Ausgangsintermediat für die Butanol-Bildung in C. acetobutylicum darstellt (Köpke, 2009). In der vorliegenden Arbeit sollten die Gene für die Butanol-Produktion aus C. acetobutylicum und C. beijerinckii vorerst in den Zwischenwirt E. coli eingebracht und dort exprimiert werden. E. coli, welches kein 1-Butanol als Fermentationsprodukt synthetisiert, ist ein geeigneter Wirt zur Produktion wichtiger Metabolite. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollten neue Erkenntnisse über die Funktion einer Cytochrom-P450-Monooxygenase in C. acetobutylicum gewonnen werden, da durch Genomsequenz-Analysen in diesem Organismus ein für dieses Enzym kodierendes Gen identifiziert werden konnte (Nölling et al., 2001). Hierbei handelt es sich um Hämb-enthaltende Proteine mit enzymatischer Aktivität, die beim Abbau zahlreicher körpereigener und körperfremder Stoffe eine wichtige Rolle spielen. Da für die Funktion von Cytochrom-P450-Monooxygenasen normalerweise Sauerstoff benötigt wird, würde man das Vorkommen eines solchen Enzyms nicht in anaeroben Organismen vermuten. Um die Funktion dieses Enzyms in C. acetobutylicum zu untersuchen, erfolgte die Klonierung und Expression des für die Cytochrom-P450Monooxygenase kodierenden Gens in E. coli. Anschließend wurden biochemische Analysen zur genaueren Charakterisierung des Enzyms durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass das Enzym die Hydroxylierung zahlreicher Fettsäuren katalysiert und für diese Reaktion Wasserstoffperoxid nutzt (Girhard et al., 2007). Um im Rahmen dieser Arbeit die Funktion der Cytochrom-P450-Monooxygenase in C. acetobutylicum genauer zu analysieren, sollte mit Hilfe des speziell für Clostridien entwickelten "ClosTron® Gene Knockout Systems" das entsprechende Gen spezifisch und dauerhaft ausgeschaltet und in weiterführenden Studien die Folgen der Geninaktivierung untersucht werden. 2. Material und Methoden 13 2. Material und Methoden 2.1. Bakterienstämme Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Bakterienstämme Relevanter Geno- oder Phänotyp1) Herkunft/Referenz Clostridium acetobutylicum (DSM 792 = ATCC 824) Typstamm DSMZ, Braunschweig Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 Typstamm NCIMB Ltd, Aberdeen (Schottland) E. coli B F- dcm ompT hsdS (rB- mB-) gal λ (DE3) Stratagene, La Jolla, CA (USA) DH5α F- φ80dlacIqZΔM15 Δ(lacZYAargF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rK-, mK+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 Hanahan, 1983 ER2275 trp-31 his-1 tonA2 rpsL104 supE44 xyl-7 mtl-2 metB1 e14Δ(lac)U169 endA1 recA1 R(zbgZ10::Tn10) Tcs Δ(mcrhsd-mrr)114::1510 [F’proAB traD36 laq1q ΔM15 zzf::mini Tn10 (Kmr)] Mermelstein und Papoutsakis, 1993 HB101 F– thi-1 hsdS20 (rB-, mB-) supE44 recA13 ara-14 leuB6 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 (Strr) xyl-5 mtl-1 Boyer und RoullandDussoix, 1969 Stamm Escherichia coli BL21 (DE3) 2. Material und Methoden Stamm 14 Relevanter Geno- oder Phänotyp1) Herkunft/Referenz Escherichia coli JM109 Δ(lac-proAB) glnV44 e14gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi hsdR17 [F’ traD36 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15] Yanisch-Perron et al., 1985 SURE® e14– (McrA–) Δ(mcrCBhsdSMR-mrr)171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kmr) uvrC [F’proAB lacIqZ ΔM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene, La Jolla, CA (USA) adhC81 fadR adhE [F+ mel supF] Lorowitz und Clark, 1982 XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene, La Jolla, CA (USA) XL1-Blue MRF′ Δ(mcrA)183 Δ(mcrCBhsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F’proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene, La Jolla, CA (USA) XL2-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr] Stratagene, La Jolla, CA (USA) WL3 1) Für die Genotyp Abkürzungen siehe: Bachmann, 1990; Berlyn et al., 1996. 2. Material und Methoden 15 2.2. Plasmide Die in dieser Arbeit eingesetzten sowie neu hergestellten Plasmide sind in Tabelle 4 aufgelistet. Tabelle 4: Verwendete bzw. neu konstruierte Plasmide Vektor pDrive Größe [Bp] 3851 Eigenschaften linearisierter Vektor zur direkten TA-Klonierung von PCRProdukten Replikation: pMB1/ColE1 ori (rep), f1 ori Resistenz: Apr (bla), Kmr (aph) Sonstiges: Blau-Weiß-Selektion Herkunft/Referenz QIAGEN GmbH, Hilden möglich (lacPOZ’) pUC18 2686 Klonierungsvektor Replikation: pMB1/ColE1 ori (rep) Resistenz: Apr (bla) Sonstiges: Blau-Weiß-Selektion Vieira und Messing, 1982 möglich (lacPOZ’) pUC19 2686 Klonierungsvektor Replikation: pMB1/ColE1 ori (rep) Resistenz: Apr (bla) Sonstiges: Blau-Weiß-Selektion Vieira und Messing, 1982 möglich (lacPOZ’) pIMP1 4695 E. coli/ClostridienSchaukelvektor Replikation: pMB1/ColE1 ori (rep), pIM13 ori (repL) Resistenz: Apr (bla), Emr (ermC’) Mermelstein et al., 1992 2. Material und Methoden Vektor pAN1 Größe [Bp] ca. 70001) 16 Eigenschaften Methylierungsplasmid Replikation: pACYC184/p15A ori (rep) Resistenz: Cmr (cat) Sonstiges: Methyltransferase-Gen Herkunft/Referenz Mermelstein und Papoutsakis, 1993 des Phagen Φ3T I pANS1 ca. 62001) Methylierungsplasmid Replikation: pACYC184/p15A ori (rep) Resistenz: Spr (spcE) Sonstiges: Methyltransferase-Gen Böhringer, 2002 des Phagen Φ3T I E. coli/ClostridienSchaukelvektor Replikation: pMB1/ColE1 ori (rep), pMTL007 11845 pCB102 ori (orfH), oriT (traJ) Resistenz: Cmr (catP) Sonstiges: lac-Repressor (lacI), Heap et al., 2007 fac-Promoter, Gruppe-II-Intron (ltrAB) pSB3C5 3828 Klonierungsvektor Replikation: pSB3/p15A ori (rep) Resistenz: Cmr (cat) Sonstiges: ccdB (Genprodukt ATG:biosynthetics GmbH, Freiburg hemmt DNA-Topoisomerase IIKomplexe) Klonierungsvektor pGS20 pSB3C5_UUMKS 1 2781 12646 Replikation: pSB3/p15A ori (rep) Resistenz: Cmr (cat) Synthetisch hergestelltes Butanol-Synthese-Operon Vektor: pSB3C5 Insert: Pptb, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, Pptb, thlA, catP, Pptb, ald, bdhB ATG:biosynthetics GmbH, Freiburg ATG:biosynthetics GmbH, Freiburg 2. Material und Methoden Vektor pSB3C5_UUMKS 2 Größe [Bp] 12521 17 Eigenschaften Synthetisch hergestelltes Butanol-Synthese-Operon Vektor: pSB3C5 Insert: Pptb, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, Herkunft/Referenz ATG:biosynthetics GmbH, Freiburg Pptb, thlA, catP, Pptb, adhE pSB3C5_UUMKS 3 12515 Synthetisch hergestelltes Butanol-Synthese-Operon Vektor: pSB3C5 Insert: Pptb, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, ATG:biosynthetics GmbH, Freiburg Pptb, thlA, catP, Pptb, adhE2 pIMP1_UUMKS 1 14619 Butanol-Synthese-Operon Vektor: pIMP Insert: Pptb, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, diese Arbeit Pptb, thlA, catP, Pptb, ald, bdhB (pSB3C5) über PstI/EcoRI pIMP1_UUMKS 2 14494 Butanol-Synthese-Operon Vektor: pIMP Insert: Pptb, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, diese Arbeit Pptb, thlA, catP, Pptb, adhE (pSB3C5) über PstI/EcoRI pIMP1_UUMKS 3 14488 Butanol-SyntheseOperon Vektor: pIMP Insert: Pptb, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, diese Arbeit Pptb, thlA, catP, Pptb, adhE2 (pSB3C5) über PstI/EcoRI pDrive_Pptb 18 4015 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt Pptb diese Arbeit (aus C. acetobutylicum DSM 792) pDrive_crt_bcd 5866 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt crt und bcd diese Arbeit (aus C. acetobutylicum DSM 792) pDrive_etfB_etfA_ hbd 6731 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt etfB, etfA und hbd (aus C. acetobutylicum DSM 792) diese Arbeit 2. Material und Methoden Vektor pDrive_Pptb 19 Größe [Bp] 4026 18 Eigenschaften Herkunft/Referenz Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt Pptb diese Arbeit (aus C. acetobutylicum DSM 792) pDrive_thlA 5054 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt thlA diese Arbeit (aus C. acetobutylicum ATCC 824) pDrive_bdhB 5094 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt bdhB diese Arbeit (aus C. acetobutylicum DSM 792) pDrive_ald 5338 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt ald diese Arbeit (aus C. beijerinckii NCIMB 8052) pDrive_Tadc 4028 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt Tadc diese Arbeit (aus C. acetobutylicum DSM 792) pDrive_catP 4767 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt catP diese Arbeit (aus C. acetobutylicum DSM 792) pUC18_Pptb 2828 Vektor: pUC18 Insert: Pptb (pDrive) über PstI/SalI diese Arbeit pUC19_Pptb 2837 Vektor: pUC19 Insert: Pptb (pDrive) über XbaI/SalI diese Arbeit pUC19_Pptb_thlA 4018 Vektor: pUC19 Insert: Pptb (pDrive) über XbaI/SalI diese Arbeit und thlA (pDrive) über NotI/SalI pUC19_Pptb_thlA_ bdhB pUC19_Pptb_thlA_ bdhB_ald 5242 Vektor: pUC19 Insert: Pptb (pDrive) über XbaI/SalI, thlA (pDrive) über NotI/SalI und bdhB (pDrive) über SalI/PstI diese Arbeit Vektor: pUC19 Insert: Pptb (pDrive) über XbaI/SalI, 6703 thlA (pDrive) über NotI/SalI, bdhB (pDrive) über SalI/PstI und ald (pDrive) über XhoI/PstI diese Arbeit 2. Material und Methoden Vektor pDrive_P450 Größe [Bp] 5206 19 Eigenschaften Herkunft/Referenz Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt CAC3330 diese Arbeit (aus C. acetobutylicum DSM 792) pUC18_P450 4023 Vektor: pUC18 Insert: CAC3330 (pDrive) über diese Arbeit PstI/SalI Vektor: pMTL007 Insert: 350-Bp-Integron über pMTL007::CAC3330 _400/401 pDrive_CAC0587 11845 HindIII/BsrGI in pMTL007, spezifisch für die Insertion in das diese Arbeit Gen CAC3330 aus C. acetobutylicum ATCC 824 zwischen Position 400 und 401 4344 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt CAC0587 diese Arbeit (aus C. acetobutylicum ATCC 824) pDrive_CAC3417 4417 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt CAC3417 diese Arbeit (aus C. acetobutylicum ATCC 824) pDrive_CAC2452 4341 Vektor: pDrive Insert: PCR-Produkt CAC2452 diese Arbeit (aus C. acetobutylicum ATCC 824) Vektor: pDrive pDrive_CAC0196 5028 Insert: PCR-Produkt CAC0196 (aus C. acetobutylicum ATCC 824) 1) Teile der Sequenz sind nicht bekannt. diese Arbeit 2. Material und Methoden 20 2.3. Oligodesoxynukleotide Die zur Amplifikation von DNA-Fragmenten oder zur Sequenzierung verwendeten Oligodesoxynukleotide sind in Tabelle 5 aufgeführt. Die eingesetzten Oligodesoxynukleotide wurden von der biomers.net GmbH, Ulm bezogen und jeweils mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 100 pmol/µl eingestellt und anschließend bei -20 °C gelagert. Eingefügte Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme sind rot markiert und dazugehörige Restriktionsenzyme aufgeführt. Tabelle 5: Verwendete Oligodesoxynukleotide Bezeichnung Buptbf ptbrNotSal BuptbfXbaIBcuI Sequenz (5′ 3′) AACTGCAGCAGAAAGTATAATGAG TGGCCGACGTCGACATGCGGCCGCCACTCCCTTT TACTATTTAATTATC GTGGTCTAGATTAACTAGTCAGAAAGTATAATGAG Restriktionsenzym PstI SalI, NotI XbaI, BcuI crt-hbd-F-NotI crt-bcd-R-Eco81IXbaI TGTAACAGCGGCCGCATATTTTAGGAGGATTAGTC TGTTCTAGAACACCTAAGGTCATCCTCTTAACCTC NotI XbaI, Eco81I x etfB-hbd-FEco81I crt-hbd-R-BcuIBamHI TGATTTCAGGAACCTAAGGTAGATAATTTAAGGAG x GATGGATCCCCCACTAGTTAAAATTATATTATATAT AA Eco81I x BamHI, BcuI x thlANotIf thlASalIrev ATAAGCGGCCGCATGAAAGAAGTTGTAATAGC TGGTCGACCTTTCTAGCACTTTTCTAGC bdhBSalIf bdhBXhoIPstIr x ACGCGTCGACCTAAACAGGAGGGGTTAAAGTGG ATACTGCAGAACTCGAGGGCTACGCCCAAACCCC GGTAGG SalI PstI, XhoI x ald-F-XhoI ald-R-Eco32I-PstI x TGAATGTCTCGAGATTTTTAAATCACAAGGAGG TGAAACTGCAGTGGATATCTGTATAAATTTAGCAA GAAG XhoI PstI, Eco32I x Butermf Butermr AATAGATATCGAACTTAGACCCATGGCTG AATAGATATCCTAGCTCTCACATTCTTGC NotI SalI Eco32I Eco32I 2. Material und Methoden 21 Sequenz (5′ 3′) Restriktionsenzym catpPstIf catp-R-BamHIPaeI AAAACTGCAGCGAGTGAAAAAGTGTCCCTAGCG TGATGCATGCCGGGATCCGTTACAGACAAACCTG AAGTTAA PstI PaeI, BamHI x CAC3330-for-PstI x CAC3330-revSalI GGGCTGCAGTTGGAAAAATAAAATATTTAATATATA AGAAAGGAGG TTTGTCGACTATGATTAATGTAATGAATGTAAATTA ATTCC PstI x SalI x 122|123a-IBS x 122|123a-EBS1d x 122|123a-EBS2 x 400|401s-IBS AAAAAAGCTTATAATTATCCTTACTTCTCCAGCCCG TGCGCCCAGATAGGGTG CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCC AGCCCTTTAACTTACCTTTCTTTGT TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTAGAAGTCGAT AGAGGAAAGTGTCT AAAAAAGCTTATAATTATCCTTAAGGGTCCGAAAA x 400|401s-EBS1d x 400|401s-EBS2 x EBS Universal x GTGCGCCCAGATAGGGTG CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCC GAAAAGATAACTTACCTTTCTTTGT TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGATTACCCTTCGATA GAGGAAAGTGTCT CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAA AC Primer fw 122 Primer fw 400 Primer rev universal AGTTGGTCCTCGTCATTGG GCTGAAATGGCTGCCATAG CTGCCATATGCGTGAATCG x CAC0587PstIfw CAC0587SalIrev GGGCTGCAGTTAAATATGTAGGAGGAG GGCGTCGACTTCCATCCTCTATCTCTC PstI SalI CAC3417PstIfw CAC3417SalIrev GGGCTGCAGAGTTAAATAAGGAGTAAG GGCGTCGACCACTGCGCACAATGTATG PstI SalI CAC2452PstIfw CAC2452SalIrev GGGCTGCAGTAATTATTGTCGAGGAGG GGCGTCGACTAGCAAATCCATGTACTC PstI SalI CAC0196PstIfw CAC0196SalIrev GGGCTGCAGATATAATAATAACATACC GGCGTCGACCACAGCACTACTAGCTTC PstI SalI Bezeichnung 2. Material und Methoden Bezeichnung 22 Sequenz (5′ 3′) M13 rev (-29) M13 rev (-49) CAGGAAACAGCTATGACC GAGCGGATAACAATTTCACACAGG M13 uni (-21) M13 uni (-43) GTAAAACGACGGCCAGT AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTT SP1 pUC18 SP2 pUC18 SP3 pUC18 SP4 pUC18 SP5 pUC18 SP6 pUC18 SP7 pUC18 SP8 pUC18 SP9 pUC18 CTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGG CATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGG TAGAGGAATGCAGTGTGATATTGA GTAAGACAGATGGTTAGAGAATTT GCAGGACTTCCATACACAGTTGAT TTCGGAGCATTTGATAAAGAAGTA AGGTATTAGTTGCTGGTGGTAGAG TATTCGGAGCATTTGATAAAGAAG GCAGATATCGGAGAAGCTAAGGTA SPetfBrev TCCTCTTAACCTCCTTAAATTATC SPetfAfw GCAGATTACAAGGGCGTATGGGTG SPhbdrev CCTGAGCAATTCCTGAACCCATAG etfB-SP-fw GGACAGGGAGAAGTTATTGATAAG etfB-SP-rev CTCTTCCTATGAAAGTAGCTCCTATG SP1 pUC19 SP2 pUC19 SP3 pUC19 GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGG CTAGTGCAGTAAGAACAGCGATTG TCTTCCAAGTACATTTATCTTATC bdhB-SP-fw bdhB-SP-rev SPcatP24fw SPcatP24rev TATAGGTGGCGGACAAGGAACAGC ACTCCGAAACATGAAGAATTATCC TCAACCTTCGATGGCTTTAATCTG CGACTGCACTCCCGACTTAATAAC Restriktionsenzym 2. Material und Methoden 23 2.4. Materialien 2.4.1. Gase Die in dieser Arbeit verwendeten Gase und Gasgemische für anaerobe Arbeiten und Analysen wurden von der Firma MTI Industriegase AG, Neu-Ulm bezogen und sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6: Verwendete Gase und Gasgemische Gas(gemisch) Zusammensetzung Formiergas 95 % Stickstoff (N2) 5 % Wasserstoff (H2) Stickstoff (N2) Synthetische Luft 79 % Stickstoff (N2) 21 % Sauerstoff (O2) Wasserstoff (H2) Reinheit Verwendung k. A. k. A. Anaerobenkammer 5.0 Anaerobes Arbeiten, Trägergas Gaschromatograph k. A. k. A. FID Gaschromatograph 5.0 FID Gaschromatograph k. A. = Keine Angabe des Herstellers. 2.4.2. Chemikalien Die im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten Chemikalien mit p.a.-Qualität sind der Tabelle 7 zu entnehmen. Tabelle 7: Verwendete Chemikalien Chemikalie Lieferant Adenosin-5′-triphosphat krist. Dinatriumsalz (ATP) Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim x Agarose Aluminiumsulfat Dodecahydrat SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg Merck KGaA, Darmstadt Ammoniaklösung (32 % (v/v)) Ammoniumchlorid Ammoniumeisen(III)-citrat Ammoniumsulfat Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf 2. Material und Methoden 24 Chemikalie Lieferant Ampicillin Natriumsalz Roche Diagnotics GmbH, Mannheim L-Asparagin Monohydrat Merck KGaA, Darmstadt ® Otto Nordwald GmbH, Hamburg ® "Bacto " Hefeextrakt (Becton Dickinson) "Bacto®" Trypton (Becton Dickinson) Borsäure 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-galactosid (X-Gal) Bromphenolblau 1-Butanol Butyrat Otto Nordwald GmbH, Hamburg Otto Nordwald GmbH, Hamburg Mallinckrodt Baker, Griesheim GERBU Biochemicals GmbH, Gaiberg Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Calciumchlorid Dihydrat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Chloramphenicol Citronensäure Monohydrat Clarithromycin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Merck KGaA, Darmstadt Abbott GmbH & Co. KG, Wiesbaden Eisen(II)-sulfat Heptahydrat Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Apotheke des Universitätsklinikums Ulm "Bacto " Agar (Becton Dickinson) Erythromycin Essigsäure (100 % (v/v); Eisessig) Ethanol (absolut) Ethanol (99,8 % (v/v)) vergällt Ethidiumbromidlösung (1 % (w/v)) Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäureDinatriumsalz Dihydrat (EDTA) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe AppliChem GmbH, Darmstadt Formaldehyd (37 % (v/v)) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf D-(+)-Glucose Monohydrat Merck KGaA, Darmstadt D-(+)-Glucose (wasserfrei) Glycerin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Isobutanol Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Isopropanol Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Kaliumchlorid Kaliumdihydrogenphosphat di-Kaliumhydrogenphosphat Kaliumhydroxid Kaliumsulfat Kobaltchlorid Hexahydrat Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Kupfer(II)-chlorid Dihydrat Merck KGaA, Darmstadt Kupfer(II)-sulfat Pentahydrat Merck KGaA, Darmstadt Magnesiumchlorid Hexahydrat Merck KGaA, Darmstadt 2. Material und Methoden 25 Chemikalie Lieferant Magnesiumsulfat Heptahydrat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Manganchlorid Tetrahydrat Mangansulfat Monohydrat Methanol di-Methylsulfoxid (DMSO) Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Natriumacetat Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Merck KGaA, Darmstadt Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt AppliChem GmbH, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf GERBU Biotechnik GmbH, Gaiberg Natriumcarbonat Natriumchlorid Natriumdodecylsulfat (SDS) Natriumhydrogencarbonat Natriumdihydrogenphosphat Monohydrat di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat Natriumhydroxid (Natronlauge) Natriumhydroxidplätzchen di-Natriummolybdat Dihydrat Natriumperchlorat Monohydrat β-Nicotinamidadenindinukleotid-2′-phosphat (NADP+) Piperazin-N,N`-bis-[2-Ethan-Sulfonsäure] Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf (PIPES) 1-Propanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf "Reinforced Clostridial Medium" (Difco™) Otto Nordwald GmbH, Hamburg Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Resazurin "Roti®-C/I" (24:1) "Roti®- P/C/I" (25:24:1) "Roti®-Phenol" D-(+)-Saccharose Salzsäure (32 % (v/v)) Spectinomycin Thiamin-HCl (Vitamin B1) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Thiamphenicol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Xylencyanol FF Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Zinksulfat Heptahydrat Merck KGaA, Darmstadt 2. Material und Methoden 26 2.4.3. Enzyme Die in dieser Arbeit verwendeten Enzyme sind in Tabelle 8 aufgelistet. Eingesetzte Restriktionsendonukleasen (2.6.9.1.) stammten von der Fermentas GmbH, St. LeonRot. Tabelle 8: Verwendete Enzyme und deren Verwendungszweck Enzym Lieferant Verwendungszweck Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf Zelllyse Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Verdau von Proteinen RNase A (5 U/µl) Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Verdau von RNA "FailsafeTM PCR System" Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Lysozym aus Henneneiweiß (84468 U/mg) Proteinase K (2,5 U/mg) "High Fidelity PCR Enzyme Mix" (5 U/µl) "illustraTM PuReTaq ReadyTo-GoTM PCR Beads" "PowerScript DNA Polymerase Short" (4 U/µl) Taq-DNA-Polymerase (rekombinant; 5 U/µl) GE Healthcare Europe GmbH, München PAN-Biotech GmbH, Aidenbach "Antarctic Phosphatase" (5 U/µl) "Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIAP)" (1U/µl) "Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)" (1 U/µl) New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main Fermentas GmbH. St. Leon-Rot T4-DNA-Ligase (1 U/µl) Fermentas GmbH. St. Leon-Rot T4-DNA-Ligase (1 U/µl) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Invitrogen GmbH, Karlsruhe T4-DNA-Ligase (5 U/µl) Hexokinase/Glucose-6Phosphat-Dehydrogenase (340 U HK/ml und 170 U G6P-DH/ml) PCR (2.6.10.2.) Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Dephosphorylierung (2.6.9.2.) Fermentas GmbH. St. Leon-Rot Roche Diagnostics GmbH, Mannheim DNA-Ligation (2.6.9.3.) Glucose-Bestimmung (2.5.5.3.) 2. Material und Methoden 27 2.4.4. Verwendete "Kits" Verschiedene "Kits" wurden im Rahmen dieser Arbeit als molekularbiologische Hilfsmittel verwendet. Die eingesetzten "Kits" sind der Tabelle 9 zu entnehmen. Tabelle 9: Verwendete "Kits" "Kit" Lieferant/Hersteller Verwendungszweck "peqGOLD Plasmid Miniprep Kit I" "ZyppyTM Plasmid Miniprep Kit" PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen HiSS Diagnostics GmbH, Freiburg Isolation von Plasmid-DNA (2.6.3.3. und 2.6.3.4.) "DNA Clean & ConcentratorTM-5 Kit" HiSS Diagnostics GmbH, Freiburg "ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit" HiSS Diagnostics GmbH, Freiburg "UltraCleanTM15 DNA Purification Kit" "QIAGEN PCR Cloning Kit" Reinigung von DNA (2.6.4.5. und 2.6.4.6) MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, California, (USA) QIAGEN GmbH, Hilden TA-Klonierung von PCR-Fragmenten (2.6.10.4.) 2.4.5. Geräte Die nachfolgend aufgelisteten Geräte (Tab. 10) wurden für die Durchführung der Arbeit verwendet. Tabelle 10: Verwendete Geräte Gerät Hersteller Agarose-Gelelektrophorese-Kammer Anaerobenkammer Technische Werkstatt der Universität Ulm Technische Werkstatt der Universität Ulm Brutschrank Heraeus Holding GmbH, Hanau Eismaschine “Scotsman AF 200“ William Wurzach Co., North Highlands, CA (USA) Bio-Rad Laboratories GmbH, München x Elektroporationsgerät "Gene-Pulser® II mit Pulse Controler Plus" 2. Material und Methoden Gerät 28 Hersteller Elektroporationsgerät Bio-Rad Laboratories GmbH, München ™ "Gene-Pulser Xcell mit CE und PC Modul" Feinwaage "AE 16S" Fotodokumentationsanlage "Gelprint 2000i" "FRENCH® Pressure Cell Press" Gaschromatograph "CP 9001" Gene Power Supply "GPS 200/400" Heizblock (Thermoblock 1.0) Heizpliz (2 l) Heizpliz (4 l) Inkubationsschüttler "HT" Inkubationsschüttler für Reagenzgläser "G24 Environmental Incubation Shaker" Kühlregal Kühlschränke Kühlzentrifuge "3K30" Kühlzentrifuge "5402" Kühlzentrifuge "5804 R" Kühlzentrifuge "Universal 320R" x Magnetrührer IKAMAG® REO Mettler-Toledo GmbH, Giessen MWG Biotech AG, Ebersberg SelectScience Ltd., Bath (Großbritannien) Chrompack GmbH, Berlin GE Healthcare Europe GmbH, München Störk GmbH & CoKG, Stuttgart Tyco Thermal Controls GmbH, Heidelberg Heraeus Holding GmbH, Hanau Infors GmbH, Einsbach New Brunswick Scientific GmbH, Nürtingen SÜMAK Kältetechnik GmbH, Leonberg Liebherr-Holding GmbH, Biberach a. d. Riß Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen Mikroskop "Axioskop" Mikrowellengerät Moulinex "OPTIQUICK" IKA® Werke GmbH & Co.KG, Staufen Carl Zeiss AG, Oberkochen SAMOU GmbH, Eigeltingen PCR Maschine Biozym Scientific GmbH, Oldendorf pH-Messgerät "WTW pH 521" x Pipette (10 µl) Pipetten (20 µl, 100 µl, 200 µl) Pipette (1000 µl) WTW Wissenschaftlich-Technische Werkstätten GmbH, Weilheim Eppendorf AG, Hamburg ABIMED GmbH, Langenfeld Gilson International B. V. Deutschland, Limburg-Offheim Reagenzglasschüttler "REAX 2000" x Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach Reinstwasseranlage "ELGASTAT Maxima" Reinstwasseranlage "PURELAB Classic" ELGA LabWater, Celle ELGA LabWater, Celle 2. Material und Methoden 29 Gerät Hersteller Spektralphotometer "Ultrospec® 3000" ® Spektralphotometer "Ultrospec 3100 pro" Tiefkühlschränke (-20 °C) Tiefkühlschränk (-85 °C) Tischautoklav "Systek 2540 EL" x Tischzentrifuge "Mini Spin®" Tischzentrifuge "Biofuge pico" x Tischzentrifuge "Heraeus PICO 17" x Ultraschallbad x Vakuumzentrifuge "Speed Vac Concentrator" Vortexer Waage "BP 2100 S" Waage "BP 8100" Wandautoklav Wasserbad x Wasserbad Zentrifuge für Hungate-Röhrchen "EBA 20" x Zentrifuge für Hungate-Röhrchen "EBA 3S" x GE Healthcare Europe GmbH, München GE Healthcare Europe GmbH, München Liebherr Holding GmbH, Biberach a. d. Riß Heraeus Holding GmbH, Hanau Tuttnauer Europe B. V., Breda (Niederlande) Eppendorf AG, Hamburg Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold Thermo Electron Corporation, Langenselbold Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Berlin Bachofer GmbH, Reutlingen Heidolph Instruments GmbH, Schwabach Sartorius AG, Göttingen Sartorius AG, Göttingen Münchner Medizin Mechanik GmbH, Planegg GFL Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel Memmert GmbH & Co. Kg, Schwabach Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen 2.5. Zellanzucht 2.5.1. Nährmedien Zur Herstellung von Flüssigmedien wurden die Substanzen nach Einwaage in Wasser aus der Reinstwasseranlage gelöst und anschließend wurden der pH-Wert und das Endvolumen eingestellt. 2. Material und Methoden 30 Alle Medien wurden bei 121 °C und 1,2 bar für mindestens 15 min autoklaviert. Hitzelabile Komponenten wurden separat gelöst, sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren dem abgekühlten Medium zugegeben. Bestimmte Medienbestandteile mussten separat autoklaviert werden, um chemische Reaktionen einzelner Komponenten zu verhindern. In diesen Fällen wurde das Medium erst vor Gebrauch komplementiert. Zur Herstellung fester Medien (Agarplatten) wurde den eingewogenen Nährlösungen vor dem Autoklavieren 1,5 % (w/v) "Bacto®" Agar zugegeben. Nach dem Autoklavieren wurden die Nährmedien in Petrischalen gegossen. Zur Anfertigung anaerober Flüssigmedien, bei denen der pH-Wert eingestellt werden musste, wurden die einzelnen Substanzen abgewogen, in Wasser gelöst und anschließend wurde der pH-Wert eingestellt. Um das Redoxpotential und somit den Sauerstoffgehalt anhand eines Farbumschlags kontrollieren zu können, wurde anaeroben Medien zusätzlich der für Bakterien nicht-toxische pH- und Redox-Indikator Resazurin (1 mg/ml) zugegeben. Vor dem Autoklavieren wurde das Medium im Heizpilz nach der Methode von Breznak und Costilow (1994) aufgekocht. Während des Abkühlens auf Eis wurde das Medium mit Stickstoff begast, um gelösten Sauerstoff zu entfernen. Bei der Reduktion wird der wasserlösliche blaue RedoxFarbstoff Resazurin irreversibel zu Resorufin umgesetzt, welches wiederum reversibel zu di-Hydroresurufin reduziert werden kann. Bei einem Redoxpotential unter -110 mV ist dieses Redoxpaar farblos und schlägt ab einem Redoxpotential von über -51 mV nach pink (bei saurem pH), violett (bei neutralem pH) bzw. blau (bei alkalischem pH) um (www.dsmz.de/microorganisms/files/Cultivation_of_ Anaerobes.pdf). Das Medium wurde luftdicht verschlossen, in die Anaerobenkammer eingeschleust und in entsprechende luftdichte Gefäße abgefüllt. Für die Herstellung anaerober Flüssigmedien, bei denen der pH-Wert nicht eingestellt werden musste, wurden die eingewogenen Substanzen mit anaerobem Wasser in der Anaerobenkammer gelöst, in entsprechende Gefäße abgefüllt und luftdicht verschlossen. Bei der Anfertigung fester, anaerober Nährmedien wurden die Substanzen abgewogen, in die Anaerobenkammer eingeschleust und mit anaerobem Wasser gelöst. Nach dem Autoklavieren konnten die Agarplatten in der Anaerobenkammer gegossen werden. 2. Material und Methoden 31 Verwendete Antibiotika wurden den festen Nährmedien steril nach dem Autoklavieren zugegeben, wenn die Nährlösung auf ca. 50 °C abgekühlt war. Alle Agarplatten wurden nach dem Gießen einige Tage getrocknet und konnten bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden. Die Zusammensetzung der für die Versuche mit E. coli und C. acetobutylicum verwendeten Medien sowie Medienkomponenten ist in den Tabellen 11-20 dargestellt. 2.5.1.1. CGM ("Clostridial Growth Medium", mod.) (Wiesenborn et al., 1988) Tabelle 11: Zusammensetzung des CGM Zusammensetzung Menge D-(+)-Glucose Monohydrat Kaliumdihydrogenphosphat 50 g 0,75 g di-Kaliumhydrogenphosphat Ammoniumsulfat Magnesiumsulfat Heptahydrat Mangansulfat Monohydrat Eisen(II)-sulfat Heptahydrat Natriumchlorid L-Asparagin Monohydrat "Bacto®" Hefeextrakt H2O pH 6,9 (mit HCl eingestellt) Konzentration 252,5 mM 5,5 mM 0,75 g 2g 0,71 g 0,01 g 0,01 g 1g 2g 5g ad 1000 ml 4,3 mM 15,1 mM 2,9 mM 0,06 mM 0,04 mM 17,1 mM 15,1 mM 0,5 % (w/v) Die Glucose wurde getrennt autoklaviert und kurz vor Gebrauch zugegeben. 2.5.1.2. LB (Luria-Bertani)-Medium (Sambrook und Russell, 2001) Tabelle 12: Zusammensetzung des LB-Mediums Zusammensetzung "Bacto®" Trypton ® "Bacto " Hefeextrakt Natriumchlorid H2O pH 7,0 Menge 10 g 5g 10 g ad 1000 ml Konzentration 1 % (w/v) 0,5 % (w/v) 171 mM 2. Material und Methoden 32 2.5.1.3. RCM ("Reinforced Clostridial Medium") (Hirsch und Grinstead, 1954) Tabelle 13: Zusammensetzung des RCM Zusammensetzung "Reinforced Clostridial Medium" H2O pH 6,8 Menge 38 g ad 1000 ml Konzentration 3,8 % (w/v) 2.5.1.4. SD-8-Medium (Luli und Strohl, 1990) Tabelle 14: Zusammensetzung des SD-8-Mediums Zusammensetzung Ammoniumchlorid Kaliumdihydrogenphosphat di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat Kaliumsulfat Magnesiumsulfat Heptahydrat Spurenelementlösung (Tab. 15) "Bacto®" Hefeextrakt D-(+)-Glucose Monohydrat H2O pH 7 (mit 5 M Ammoniumhydroxid eingestellt) Menge Konzentration 7g 7,5 g 7,5 g 0,85 g 0,17 g 0,8 ml 10 g 20 g ad 1000 ml 131,6 mM 55,2 mM 42,2 mM 4,9 mM 0,7 mM 0,08 % (v/v) 1 % (w/v) 111 mM Von der Glucose wurde eine 50 %-ige Stammlösung erstellt, welche getrennt autoklaviert und kurz vor Gebrauch zugegeben wurde. Tabelle 15: Zusammensetzung der Spurenelementlösung für das SD-8-Medium Zusammensetzung Eisen(II)-sulfat Heptahydrat Mangansulfat Monohydrat Aluminiumsulfat Dodecahydrat Kobaltchlorid Hexahydrat Zinksulfat Heptahydrat di-Natriummolybdat Dihydrat Kupfer(II)-chlorid Dihydrat Borsäure 5 M HCl Menge 4g 1g 5,5 g 0,4 g 0,2 g 0,2 g 0,1 g 0,05 g ad 100 ml Konzentration 14,4 mM 5,9 mM 8,3 mM 1,7 mM 0,7 mM 0,8 mM 0,6 mM 0,8 mM 2. Material und Methoden 33 2.5.1.5. SOB-Medium (Sambrook und Russell, 2001) Tabelle 16: Zusammensetzung des SOB-Mediums Zusammensetzung "Bacto®" Trypton "Bacto®" Hefeextrakt Natriumchlorid Kaliumchlorid Magnesiumchlorid Hexahydrat Magnesiumsulfat Heptahydrat H2O pH 7,0 Menge Konzentration 20 g 5g 0,59 g 0,19 g 2,03 g 2,46 g ad 1000 ml 2 % (w/v) 0,5 % (w/v) 10 mM 2,5 mM 10 mM 10 mM Die Magnesium-Salze wurden getrennt hergestellt und autoklaviert. Die Zugabe zum Medium erfolgte kurz vor Gebrauch. 2.5.1.6. SOC (Sambrook und Russell, 2001) Tabelle 17: Zusammensetzung des SOC-Mediums Zusammensetzung "Bacto®" Trypton "Bacto®" Hefeextrakt Natriumchlorid Kaliumchlorid Magnesiumchlorid Hexahydrat Magnesiumsulfat Heptahydrat D-(+)-Glucose Monohydrat H2O pH 7,0 Menge Konzentration 20 g 5g 0,59 g 0,19 g 2,03 g 2,46 g 3,96 g ad 1000 ml 2 % (w/v) 0,5 % (w/v) 10 mM 2,5 mM 10 mM 10 mM 20 mM Die Magnesium-Salze wurden getrennt hergestellt und autoklaviert. Die Zugabe zum Medium erfolgte kurz vor Gebrauch. 2. Material und Methoden 34 2.5.1.7. TM3a/Glucose-Medium (Donaldson et al., 2007) Tabelle 18: Zusammensetzung des TM3a/Glucose-Mediums Zusammensetzung D-(+)-Glucose (wasserfrei) Kaliumdihydrogenphosphat Citronensäure Monohydrat Ammoniumsulfat Magnesiumsulfat Heptahydrat Calciumchlorid Dihydrat Ammoniumeisen(III)-citrat Thiamin-HCl (Vitamin B1) "Bacto®" Hefeextrakt Spurenelementlösung (Tab. 19) H2O pH 6,8 (mit Ammoniaklösung eingestellt) Menge 10 g 13,6 g 2g 3g 2g 0,2 g 0,33 g 1 mg 0,5 g 10 ml ad 1000 ml Konzentration 55,5 mM 100 mM 9,5 mM 22,7 mM 8,1 mM 1,8 mM 1,3 mM 3 μM 0,05 % (w/v) 1 % (v/v) Die Glucose wurde getrennt autoklaviert und kurz vor Gebrauch zugegeben. Tabelle 19: Zusammensetzung der Spurenelementlösung für das TM3a/GlucoseMedium Zusammensetzung Citronensäure Monohydrat Mangansulfat Monohydrat Natriumchlorid Eisen(II)-sulfat Heptahydrat Kobaltchlorid Hexahydrat Zinksulfat Heptahydrat Kupfer(II)-sulfat Pentahydrat Borsäure di-Natriummolybdat Dihydrat H2O pH 2,7 Menge 4g 3g 1g 0,1 g 0,1 g 0,1 g 10 mg 10 mg 10 mg ad 1000 ml Konzentration 19 mM 17,7 mM 17,1 mM 0,36 mM 0,42 mM 0,35 mM 40 μM 0,16 mM 41 μM Für die Herstellung der Spurenelementlösung wurden zuerst die Citronensäure und dann die restlichen Substanzen zugegeben. Die Lagerung erfolgte bei 4 °C. 2. Material und Methoden 35 2.5.1.8. TY-Medium (Sambrook und Russell, 2001) Tabelle 20: Zusammensetzung des TY-Mediums Zusammensetzung Menge "Bacto®" Trypton "Bacto®" Hefeextrakt Natriumchlorid H2O 16 g 10 g 5g ad 1000 ml Konzentration 1,6 % (w/v) 1 % (w/v) 86 mM 2.5.2. Medienzusätze 2.5.2.1. Antibiotika In Tabelle 21 sind die in dieser Arbeit verwendeten und für die Selektion von E. coli und C. acetobutylicum nötigen Antibiotika und deren Wirkkonzentration aufgeführt. Die benötigten Antibiotika wurden als 1000-fach konzentrierte Stammlösungen in ihrem jeweiligen Lösungsmittel angesetzt. Alle Lösungen wurden sterilfiltriert, aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Bei Flüssigmedien erfolgte die Zugabe kurz vor Gebrauch, bei Medien für Agarplatten nach Abkühlung auf ca. 50 °C. Tabelle 21: Antibiotika zur Kultivierung rekombinanter E. coli- und C. acetobutylicumStämme. Antibiotikum Ampicillin Stammlösung [mg/ml] Arbeitskonzentration [µg/ml] 100 (in H2O) 100 Chloramphenicol 30 (in 96 % (v/v) Ethanol) 30 Spectinomycin 50 (in H2O) 40 Clarithromycin 5 (in H2O) 1) 5 Thiamphenicol 20 (in DMF) 2) 20 Verwendung E. coli C. acetobutylicum 1) Bei der Herstellung wurde Clarithromycin in mit HCl angesäuertem Wasser (pH 2) gelöst und anschließend mit NaOH neutralisiert (auf etwa pH 6,5; ein zu alkalischer pH-Wert führt zum Ausfallen). 2) Lösung ist lichtempfindlich. Zur Kultivierung rekombinanter C. acetobutylicum-Stämme wurde Clarithromycin anstelle von Erythromycin verwendet, da Erythromycin nicht säurestabil ist. 2. Material und Methoden 36 Außerdem wurde für Clostridien Thiamphenicol anstatt Chloramphenicol verwendet, da bekannt ist, dass wachsende C. acetobutylicum-Kulturen dazu fähig sind, die ArylNitrogruppe von Chloramphenicol zu reduzieren, wodurch dessen Wirkung verloren geht (O’Brien und Morris, 1971). 2.5.2.2. Sonstige Medienzusätze (Induktion der Blau-Weiß-Selektion) Zur erfolgreichen Blau-Weiß-Selektion (2.7.1.3.) wurden den Agarplatten vor dem Ausplattieren der Kulturen 40 μl einer X-Gal- und 20 μl einer IPTG-Stammlösung zugegeben (Tab. 22). Anschließend wurden die Agarplatten für ca. 30 min bei 37 °C inkubiert, damit die Lösungsmittel verdampfen konnten. Lichtempfindliche Lösungen (X-Gal) oder Agarplatten wurden dunkel gelagert. Tabelle 22. Weitere verwendete Medienzusätze Zusatz 1) Stammlösung [mg/ml] Arbeitskonzentration [µg/ml] IPTG 24 (in 96 % (v/v) Ethanol) 24 X-Gal 20 (in DMF)1) 40 Lösung ist lichtempfindlich. 2.5.3. Anzuchtbedingungen Unter aeroben Wachstumsbedingungen erfolgte die Anzucht von E. coli bis zu einem Volumen von 5 ml in Reagenzgläsern. Bei größeren Volumina wurden Erlenmeyerkolben mit Schikanen verwendet. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C auf einem Rundschüttler bei 120-200 Upm. Agarplatten wurden in einem Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Unter anaeroben Wachstumsbedingungen erfolgte die Kultivierung bis zu einem Volumen von 5 ml in Hungate-Röhrchen (Bellco Glass Inc.; Vineland, NJ (USA); importiert durch: Dunn Labortechnik GmbH, Asbach) mit Butyl-Gummistopfen (Ochs GmbH, Bovenden) und Schraubdeckeln. Bei größeren Volumina wurden Kulturflaschen (Müller+Krempel AG, Bülach (Schweiz)) mit Naturgummistopfen (Maag Technic GmbH, Göppingen) und Edelstahldeckeln eingesetzt. Die Anzucht erfolgte bei 37 °C im Brutschrank und Agarplatten wurden im Brutschrank in der Anaerobenkammer oder unter Stickstoffatmosphäre im Anaerobentopf inkubiert. 2. Material und Methoden 37 2.5.4. Stammhaltung Zur Herstellung von E. coli-Stammkulturen wurden Glycerinkulturen nach der von Gherna (1994) beschriebenen Methode angelegt. Hierzu wurden 300 µl einer in LBMedium (2.5.1.2.) logarithmisch, gegebenenfalls unter selektiven Bedingungen, wachsenden Kultur mit 700 µl sterilem 50 %-igem (v/v) Glycerin (Endkonzentration: 35 % (v/v)) versetzt und in einem 2-ml-Schraubdeckelröhrchen suspendiert. Die Lagerung erfolgte bei -85 °C. Glycerin wird bei der Stammhaltung als Gefrierschutzmittel eingesetzt, da es nach dem Passieren der Zellwand in der Zelle den osmotischen Druck und die Bildung von Eiskristallen reduziert und auch in hohen Konzentrationen nicht toxisch wirkt (Meryman, 1971). Für die Herstellung von C. acetobutylicum-Stammkulturen wurde die Sporenbildung des Organismus ausgenutzt. Zur Herstellung einer Sporensuspension wurden 900 μl CGM (2.5.1.1.) mit 100 μl einer in CGM, gegebenenfalls unter selektiven Bedingungen, wachsenden Übernachtkultur angeimpft und für 6-8 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden verschiedene, mit frischem CGM hergestellte Verdünnungen dieser Kultur anaerob auf CGM-Agarplatten ausplattiert. Verwendet wurden jeweils 100 μl der 10-4- bis 10-6-Verdünnung. Die Agarplatten wurden mit Parafilm verschlossen und ca. 5-7 Tage bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Anschließend wurden die gewachsenen Kolonien mit 5 ml frischem CGM mit einer Einwegimpföse von den Agarplatten abgeschwemmt, aliquotiert und in 2-mlSchraubdeckelröhrchen bei -20 °C aerob gelagert. Die Sporenpräparationen wurden mikroskopisch kontrolliert. Für die Anzucht von C. acetobutylicum aus einer Sporenpräparation wurden ca. 100 µl dieser Suspension 10 min bei 80 °C pasteurisiert und anschließend mit einer Spritze in 5 ml CGM injiziert. 2. Material und Methoden 38 2.5.5. Bestimmung von Wachstums- und Stoffwechselparametern 2.5.5.1. Trübungsmessung Der Wachstumsverlauf einer Bakterienkultur wurde anhand der Zunahme der Optischen Dichte mit Hilfe eines Spektralphotometers bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600nm) verfolgt. Die Messung erfolgte in einer Einmalküvette ("1/2 Mikro", 1,6 ml Volumen, 1 cm Schichtdicke, VWR International GmbH, Darmstadt), wobei das entsprechende Medium als Leerwert genutzt wurde. Um eine Linearität zwischen Extinktion und Zellzahl zu gewährleisten, wurden die Proben ab einer Optischen Dichte von 0,3 mit Medium verdünnt. 2.5.5.2. Messung des externen pH-Wertes Zur Bestimmung des pH-Wertes von Kulturüberständen wurde ein Präzisions-pHMeter verwendet. Zuerst wurde die Kultur 10 Minuten bei 10000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend wurde der Kulturüberstand in ein Reagenzglas überführt, um eine Verunreinigung der Messelektrode zu vermeiden. 2.5.5.3. Glucose-Bestimmung Die Bestimmung der Glucose-Konzentration erfolgte durch einen gekoppelten enzymatischen Test mit Hexokinase und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (Bergmeyer, 1974, mod.). Die Reaktionen verlaufen nach folgender Gleichung: Glucose + ATP Hexokinase Glucose-6-PhosphatDehydrogenase Glucose-6-Phosphat + NADP+ Glucose-6-Phosphat + ADP 6-Phosphogluconolacton + NADPH + H+ Da das Enzym Hexokinase neben Glucose auch andere Hexosen umsetzt, verläuft die erste Reaktion unspezifisch. Die zweite Reaktion mit Glucose-6-PhosphatDehydrogenase ist jedoch spezifisch, so dass Glucose auch in Zuckermischungen spezifisch quantifiziert werden kann. Die Bildung des reduzierten Nukleotids (NADPH + H+) ist der in der Probe enthaltenen D-Glucose äquivalent und kann bei 365 nm im Photometer bestimmt werden. 2. Material und Methoden 39 Im Folgenden ist die Zusammensetzung eines Testansatzes zur Glucose-Bestimmung gezeigt: 0,4 M Tris + 4 µM Magnesiumsulfat, pH 7,6 (mit HCl eingestellt) 500 µl NADP (Stammlösung: 44 mg/ml, 1:10 verdünnt) 100 µl ATP (Stammlösung: 96 mg/ml, 1:10 verdünnt) 100 µl Probe 100 µl H2O + ad 1000 µl Es wurde jeweils 1 ml Probe entnommen und 10 min bei 13000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Der klare Kulturüberstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, entsprechend verdünnt und schließlich zum Testansatz gegeben. Nach dem Start der Reaktion durch Zugabe von 10 µl Hexokinase/Glucose6-Phosphat-Dehydrogenase (3 mg/ml) und gutem Mischen erfolgte eine Inkubation des Testansatzes für 10-15 min bei Raumtemperatur. Die Bildung des reduzierten Nukleotids wurde photometrisch bei 365 nm bestimmt (E2). Als Leerwert wurde der entsprechende Testansatz genutzt. Allerdings enthielt dieser anstelle der Probe nur Wasser (E1). Folgende Formel dient der Berechnung der Glucose-Konzentration (in mM): cGlucose = Vgesamt * ΔE ε * d * VProbe * VF wobei: ΔE = E2 – E1 d = 1 cm ε 365 nm = 3,4 / (mmol * cm)-1 2.5.5.4. Gaschromatographische Analytik des Produktspektrums Um das Produktspektrum einer Bakterienkultur quantitativ analysieren zu können wurden jeweils 2 ml Probe entnommen und anschließend zentrifugiert (10000 x g, 10 min, RT), um eine Verschmutzung der gepackten Säule zu vermeiden. Eine Lagerung der Proben bei -20 °C war möglich, falls eine Messung nicht sofort stattfand. 2. Material und Methoden 40 1 ml des Kulturüberstandes wurde in ein Rollrandgefäß ("R1", Chromatographie Service GmbH, Langerwehe) überführt, mit 100 µl interner Standardlösung versetzt und mit einer Bördelkappe ("R11-1.0", Chromatographie Service GmbH, Langerwehe) gasdicht verschlossen. Als interner Standard wurde 110 mM Isobutanol, gelöst in 2 N Salzsäure, verwendet. Anschließend konnten die Proben im Gaschromatographen unter folgenden Bedingungen analysiert werden, wobei der Auftrag auf die Säule von einem automatischen Probengeber (Varian Deutschland GmbH, Darmstadt) übernommen wurde. Probenvolumen Injektionstemperatur 1 µl 195 °C Säule Innendurchmesser Länge Material Trägergas Glas, gepackt 2 mm 2m "Chromosorb 101" (80 bis 100 mesh) Stickstoff (15 ml/min) Temperaturprofil 130 °C für 1 min 130 °C bis 200 °C mit 4 °C/min 200 °C für 3 min Detektor Temperatur FID "Mikro-TCD" 230 °C Wasserstoff (30 ml/min) Synthetische Luft (25 ml/min) FID-Gase Die Auswertung erfolgte am PC mittels des Analyseprogramms "Maestro Sampler II, Version 2.5" (Chrompack GmbH, Frankfurt). Um eine Quantifizierung der Proben zu ermöglichen, wurden Kalibrierläufe mit bekannten Konzentrationen (5 mM) an Ethanol, Aceton, Acetat, 1-Butanol, Acetoin und Butyrat durchgeführt. Für eine aussagekräftige Auswertung durfte also auch die Konzentration der einzelnen Substanzen in den Kulturüberständen 5 mM nicht übersteigen. Die Kulturüberstände wurden deshalb bei Bedarf mit Wasser entsprechend verdünnt. Die automatische Auswertung beruhte auf der vergleichenden Signalflächenberechnung der Kalibrierung und des internen Standards. 2. Material und Methoden 41 2.6. Arbeiten mit Nukleinsäuren 2.6.1. Behandlung von Lösungen und Geräten Alle hitzestabilen Geräte und Lösungen wurden für 20 min bei 121 °C und 1,2 bar autoklaviert, um Nukleasen zu inaktivieren und Kontaminationen zu verhindern. Hitzeempfindliche Geräte wurden mit 70 % (v/v) Ethanol ausgespült oder abgewischt. Hitzelabile Lösungen wurden sterilfiltriert und Kleingeräte aus Metall und Gegenstände wie z. B. der Drigalski-Spatel wurden vor Gebrauch abgeflammt. 2.6.2. Lösungen, Puffer, Wasser Sämtliche in dieser Arbeit verwendeten Lösungen und Puffer wurden mit demineralisiertem Wasser aus einer Reinstwasseranlage hergestellt. Diese dient als Ionenaustauscher und bestrahlt das Wasser zusätzlich mit UV-Licht. Im Folgenden wird dieses meist nur mit H2O oder Wasser bezeichnet. Die für die Durchführung dieser Arbeit nötigen Puffer und Lösungen sind jeweils im Kapitel der entsprechenden Methodik angegeben. 2.6.3. Isolierung von Nukleinsäuren aus Bakterien 2.6.3.1. Isolierung von Gesamt-DNA aus Clostridien Um Gesamt-DNA aus C. acetobutylicum zu isolieren, wurde nach einem Protokoll von Bertram und Dürre (1989) in modifizierter Form vorgegangen. Hierfür wurden die Zellen aus 5 ml einer CGM-Übernachtkultur durch Zentrifugation (6000 x g, 15 min, 4 °C) geerntet. Das Zellsediment wurde in 1 ml Kaliumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) gewaschen (6000 x g, 15 min, 4 °C). Anschließend wurde das Sediment in 500 μl Kaliumphosphatpuffer-Puffer (10 mM, pH 7,5) aufgenommen. Der Aufschluss der Zellen geschah durch Zugabe von 50 µl Lysozym (200 mg/ml). Zusätzlich erfolgte eine RNase-Behandlung durch Zugabe von 5 μl einer RNase A-Lösung (10 mg/ml, gebrauchsfertig von Fermentas GmbH, St. Leon-Rot), um unerwünschte RNA zu verdauen (2.6.3.2.). 2. Material und Methoden 42 Nach einer Inkubationszeit von 1 h bei 37 °C wurden dem Ansatz 50 μl einer 10 %-igen (w/v) SDS-Lösung und 30 μl einer Proteinase K-Lösung (2,5 mg/ml) zur Proteolyse zugegeben. Anschließend erfolgte eine einstündige Inkubation bei 55 °C im Wasserbad. Danach wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion (2.6.4.1.) durchgeführt, um die DNA von Proteinen abzutrennen, und schließlich mit Ethanol (2.6.4.2.) oder Isopropanol (2.6.4.3.) gefällt. Die getrocknete DNA wurde in 50-200 μl H2O aufgenommen und bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Zudem wurde die Konzentration bestimmt (2.6.8.1.) und die Qualität der isolierten DNA im nicht-denaturierenden Agarose-Gel (2.6.5.1.) kontrolliert. 2.6.3.2. RNase-Behandlung von wässrigen DNA-Lösungen Um noch vorhandene RNA zu entfernen, wurde nach Isolierung chromosomaler DNA eine RNase-Behandlung durchgeführt. Dabei wurde 1 ml DNA-Lösung mit 5 μl RNaseA-Lösung (10 mg/ml, gebrauchsfertig von Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) versetzt und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss daran erfolgte eine PhenolChloroform-Extraktion (2.6.4.1.) und eine Fällung mit Ethanol (2.6.4.2.). 2.6.3.3. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli wurde nach einem modifizierten Protokoll von Birnboim und Doly (1979) durchgeführt und erfolgte mittels alkalischer Zellhydrolyse. Es wurden 2-4 ml einer Übernachtkultur zentrifugiert (12000 x g, 30 s, RT). Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellsediment in 300 μl Puffer P1 (Tab. 23) vollständig suspendiert. Nach Zugabe von 300 μl Puffer P2 (Tab. 24) wurde der Versuchsansatz für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und durch Umdrehen des Reaktionsgefäßes vorsichtig gemischt, so dass eine alkalische Lyse erfolgte und lineare DNA denaturiert wurde. Nach dem Zellaufschluss wurden dem Ansatz 300 μl Puffer P3 (Tab. 25) zugegeben und der Ansatz durch erneutes Invertieren des Reaktionsgefäßes gemischt. 2. Material und Methoden 43 Durch Zentrifugation (1200 x g, 10 min, RT) wurden die bei der Lyse angefallenen Zellwandfragmente, ausgefallenen Proteine und chromosomale DNA sedimentiert. Der klare Überstand enthielt die Plasmid-DNA und wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nach Fällung der DNA mit Isopropanol (2.6.4.3.) wurde diese getrocknet und in 30-50 μl H2O aufgenommen und bei -20 °C gelagert. Tabelle 23: Puffer P1 Zusammensetzung Tris-HCl (1 M; pH 8) EDTA RNase A H2O pH 7,8 Menge 5 ml 0,19 g 1 ml ad 100 ml Konzentration 50 mM 5 mM 1 % (v/v) Puffer P1 wurde bei 4 °C gelagert. Tabelle 24: Puffer P2 Zusammensetzung SDS (10 % (w/v)) NaOH (10 M) H2O pH 13,15 Menge 10 ml 2 ml ad 100 ml Konzentration 40 mM 200 mM Puffer P2 war etwa eine Woche bei RT haltbar. Tabelle 25: Puffer P3 Zusammensetzung Natriumacetat H2O pH 4,8 (mit Eisessig eingestellt) Menge Konzentration 24,6 g ad 100 ml 3M Puffer P3 wurde bei RT gelagert. 2.6.3.4. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli mittels "peqGOLD Plasmid Miniprep Kit I" und "Zyppy™ Plasmid Miniprep Kit" Durch die Verwendung von molekularbiologischen "Kits" konnte Plasmid-DNA aus E. coli in kurzer Zeit isoliert werden. In dieser Arbeit wurde sowohl der "peqGOLD Plasmid Miniprep Kit I" als auch der "Zyppy™ Plasmid Miniprep Kit" verwendet. 2. Material und Methoden 44 Der Zellaufschluss basiert auf einer alkalischen Lyse und die Reinigung der PlasmidDNA erfolgt über eine reversible Bindung an einer Silica-Matrix. Zur Plasmidisolierung wurden jeweils 2-4 ml Kulturvolumen eingesetzt und die genaue Durchführung der einzelnen Arbeitsschritte erfolgte entsprechend den Angaben des Herstellers, wobei die optional angegebenen Waschschritte immer ausgeführt wurden. Isolierte Plasmid-DNA wurde in 30-50 μl H2O oder TE-Puffer (Tab. 26) aufgenommen, in ein neues Reaktionsgefäß eluiert und bei -20 °C gelagert. Außerdem konnte die Konzentration der Plasmid-DNA bestimmt (2.6.8.1.), ein Restriktionsverdau (2.6.9.1.) und ein nicht-denaturierendes Agarose-Gel (2.6.5.1.) zur Kontrolle durchgeführt werden. Tabelle 26: TE-Puffer Zusammensetzung Menge Konzentration Tris-HCl (1 M; pH 8) 1 ml 10 mM EDTA H2O pH 7,8 38 mg ad 100 ml 1 mM 2.6.4. Reinigung und Konzentrierung von Nukleinsäuren 2.6.4.1. Phenol-Chloroform-Extraktion Zur Abtrennung von Proteinen aus DNA-Lösungen wurde eine Phenol-ChloroformExtraktion nach Sambrook und Russell (2001) in modifizierter Form durchgeführt. Um eine bessere Denaturierung von Proteinen zu erzielen, wurde vor der PhenolChloroform-Extraktion die Ionenkonzentration durch Zugabe von 10 % (v/v) einer 3 M Natriumacetatlösung (pH 5,2; mit 3 M Essigsäure eingestellt, Tab. 27) erhöht (Wallace, 1987). Die Extraktion erfolgte mit 1 Vol. einer Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung mit dem Mischungsverhältnis 25:24:1 (v/v/v), wobei eine "Roti®- P/C/I-Lösung" für die Extraktion von DNA verwendet wurde. Anschließend wurden die Ansätze gut gemischt und zur Phasentrennung zentrifugiert (9000 x g, 15 min, RT). Die obere wässrige Phase wurde abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. 2. Material und Methoden 45 Dieser Vorgang musste so oft wiederholt werden, bis nach Zentrifugation keine Proteininterphase mehr sichtbar war. Durch Zugabe von 1 Vol. eines "Roti®-C/I"Gemisches (24:1 (v/v)) und erneute Zentrifugation konnte das Phenol entfernt werden. Dieser Schritt konnte optional wiederholt werden. Anschließend wurde die im Überstand vorliegende wässrige DNA-Lösung einer Ethanol- (2.6.4.2.) oder Isopropanolfällung (2.6.4.3.) unterzogen. Tabelle 27: 3 M Essigsäure Zusammensetzung Eisessig H2O Menge 17 ml ad 100 ml Konzentration 3M 2.6.4.2. Ethanolfällung Da Nukleinsäuren in Gegenwart hoher Konzentrationen von monovalenten Kationen im Alkoholmilieu einen unlöslichen Niederschlag bilden, wurde diesen in wässriger Lösung eine 3 M Natriumacetatlösung (pH 5,2, eingestellt mit 3 M Essigsäure) bis zu einer Endkonzentration von 0,2-0,3 M zugegeben und gemischt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 2,5 Vol. eiskaltem Ethanol (absolut) und der Ansatz wurde erneut gemischt. Nach einer Inkubation von 2 h bei -20 °C (wahlweise über Nacht) wurde die präzipitierte DNA durch Zentrifugation (16000 x g, 30 min, 4 °C) sedimentiert. Das Sediment wurde mit eiskaltem 70 %-igem (v/v) Ethanol gewaschen und zentrifugiert (16000 x g, 15 min, 4 °C). Anschließend wurde das Sediment in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in H2O oder TE-Puffer (Tab. 26) aufgenommen. 2.6.4.3. Isopropanolfällung Bei der Durchführung der Isopropanolfällung wurde der Nukleinsäurelösung 0,7-1 Vol. Isopropanol (2-Propanol) zugegeben und gemischt. Da Isopropanol in stärkerem Maße als Ethanol zu Kopräzipitation von Salzen führt, erfolgte in diesem Fall keine Zugabe von Natriumacetat. Die ausgefallenen Nukleinsäuren konnten entweder mit einer Pasteurpipette, die in der Bunsenbrennerflamme geschmolzen und zu einem Häckchen geformt wurde, geangelt oder durch Zentrifugation (12000 x g, 10 min) sedimentiert werden. Nach dem Lufttrocknen der Nukleinsäuren wurden diese in H2O oder TE-Puffer (Tab. 26) gelöst. 2. Material und Methoden 46 2.6.4.4. Dialyse von DNA-Lösungen Um Plasmid-DNA-Lösungen mit hohen Salzkonzentrationen für eine Transformation durch Elektroporation (2.7.1.2.) verwenden zu können, wurden diese mittels der Dialyse entsalzt. Hierzu wurde pro Ansatz eine Petrischale mit sterilem Wasser gefüllt und ein Nitrocellulose-Filterplättchen auf die Wasseroberfläche gelegt. Darauf wurde die DNA-Lösung vorsichtig pipettiert und für ca. 30 min bei RT inkubiert. Anschließend konnte die DNA-Lösung wieder vom Filter abgenommen werden und in die Transformation eingesetzt werden. Hohe Salzkonzentrationen führen zu einer erhöhten Leitfähigkeit und somit während der Elektroporation zu einer höheren Stromdichte. Dies hat zur Folge, dass die Transformation misslingen und es sogar zu einem Funkenschlag kommen kann. 2.6.4.5. Reinigung und Konzentrierung von DNA aus Lösungen mittels "UltraCleanTM15 DNA Purification Kit" und "DNA Clean & ConcentratorTM-5 Kit" Um PCR-Produkte (2.6.10.2.), Restriktionsverdaue (2.6.9.1.) oder Ligationen (2.6.9.3.) zu reinigen, wurde der "UltraCleanTM15 DNA Purification Kit" oder der "DNA Clean & ConcentratorTM-5 Kit" verwendet. Auch zur Konzentrierung, zum Entsalzen oder zum Pufferaustausch von DNA-Lösungen wurden diese "Kits" benutzt. Die Reinigung beruht auf der reversiblen Bindung von DNA an eine Silica-Matrix, wobei die Reinigung strikt nach Herstellerangaben durchgeführt wurde. Bei Verwendung des "UltraCleanTM15 DNA Purification Kit" waren allerdings folgende Ausnahmen zu beachten: 7 μl der beigefügten Silica-Matrix-Lösung (Glasmilch) pro Ansatz waren ausreichend. Die Elution der DNA wurde mit ca. 50 % des eingesetzten Volumens, aber mit mind. 15 μl H2O durchgeführt, um Verunreinigungen durch die Glasmilch zu verringern. 2. Material und Methoden 47 2.6.4.6. Reinigung von DNA aus Agarose-Gelen mittels "UltraCleanTM15 DNA Purification Kit" und "ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit" Für die Reinigung von DNA aus Agarose-Gelen wurde der "UltraCleanTM15 DNA Purification Kit" und "ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit" verwendet. Hierzu wurden DNA-Lösungen zur Auftrennung einer nicht-denaturierenden Gelelektrophorese (2.6.5.1.) unterzogen. Anschließend konnte daraus ein spezifisches DNA-Fragment aus einer Lösung mit mehreren verschiedenen DNA-Fragmenten gereinigt werden. Auf diese Weise konnten PCR-Produkte (2.6.10.2.) oder mit Restriktionsendonukleasen (2.6.9.1.) behandelte DNA gereinigt werden. Nach dem Auftragen der DNA-Lösung auf ein nicht-denaturierendes 0,8 oder 2 %-iges Agarosegel (2.6.5.1.) zusammen mit einem Größenstandard und Anfärben mittles Ethidiumbromid (2.6.6.) wurde die DNA auf einem UV-Transilluminator mit einer Wellenlänge von 365 nm sichtbar gemacht. Bei dieser verwendeten Wellenlänge wird die DNA am wenigsten beschädigt (Hauptabsorptionsmaximum bei 260 nm). Anschließend konnte das gewünschte Fragment mit einem Skalpell ausgeschnitten und mit Hilfe der molekularbiologischen "Kits" gereinigt werden. Nach dem Aufschmelzen der Agarose und der Freisetzung der DNA erfolgte die Reinigung über eine reversible Bindung der DNA an eine Silica-Matrix entsprechend den Angaben des Herstellers. 2.6.5. Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäurefragmenten 2.6.5.1. Nicht-denaturierende Agarose-Gelelektrophorese Die Agarose-Gelelektrophorese dient der Größenbestimmung und Mengenabschätzung von DNA-, aber auch der Qualitätsüberprüfung von RNAFragmenten sowie der Überprüfung von Restriktionsansätzen und PCR-Produkten. Hierbei werden DNA- oder RNA-Fragmente in einem elektrischen Feld ihrer Größe nach aufgetrennt. Bei den während der Elektrophorese vorherrschenden pH-Werten sind die Phosphatgruppen der Nukleinsäure-Moleküle negativ geladen, wodurch diese zur Anode wandern. 2. Material und Methoden 48 Die elektrisch neutrale Agarose dient hierbei als Gelmatrix, die als eine Art Sieb fungiert, durch die kleine Fragmente schneller wandern können als große (Sambrook und Russell, 2001). Aber auch die Konformation des Nukleinsäure-Moleküls, die angelegte Spannung sowie die Agarosekonzentration beeinflussen die Geschwindigkeit der wandernden Fragmente. Für Fragmente größer als 1000 Bp wurde eine Agarosekonzentration von 0,8 % (w/v), für Fragmente kleiner als 1000 Bp wurde hingegen eine Agarosekonzentration von 2 % (w/v) verwendet. Die Agarose wurde zunächst in 1 x TAE-Puffer (Tab. 28) durch Aufkochen gelöst und anschließend in horizontale Gelkammern eigener Bauart (100 x 70 x 3 mm) gegossen. Die späteren Ladetaschen wurden dabei durch einen ins Gel eingebrachten Kamm ausgespart. Nach Polymerisation des Gels wurde dieses mit 1 x TAE-Puffer, welcher als Laufpuffer diente, überschichtet. Danach wurden die Ladetaschen mit den Proben, welche mit 0,2 Vol. Ladepuffer versetzt wurden, geladen. Der Ladepuffer diente dazu, die Proben zu beschweren (aufgrund des darin enthaltenen Glycerins) und die Lauffront zu markieren. Somit konnte der Fortschritt der Auftrennung über die dem Laufpuffer zugesetzten Farbstoffe beobachtet werden. In einem 0,8 bis 2 %-igem Gel läuft Bromphenolblau auf einer Höhe von ca. 300 Bp und Xylencyanol FF auf einer Höhe von ca. 4000 Bp. Der Ladepuffer wurde entweder von der Fermentas GmbH, St. LeonRot ("6 x DNA Loading Dye") bezogen oder selbst hergestellt (Tab. 29). Nach Anlegen einer konstanten Spannung von 60-135 V erfolgte die Elektrophorese für ca. 30 bis 60 min bei Raumtemperatur. Abschließend wurde das Gel in einer Ethidiumbromidlösung gefärbt (2.6.6.). Tabelle 28: 50 x TAE-Stammlösung (Sambrook und Russell, 2001) Zusammensetzung Tris Eisessig EDTA H2O pH 7,5 Menge 242 g 57 ml 18,7 g ad 1000 ml Konzentration 2M 1M 50 mM 2. Material und Methoden 49 Tabelle 29: 6 x Ladepuffer Zusammensetzung Tris Glycerin EDTA Bromphenolblau Xylencyanol FF H2O pH 7,6 (mit HCl eingestellt) Menge 0,12 g 60 ml 2,28 g 30 mg 30 mg ad 100 ml Konzentration 10 mM 8,2 M 60 mM 0,45 mM 0,55 mM 2.6.6. Färbung von Nukleinsäuren in Agarose-Gelen Agarose-Gele wurden zur Anfärbung 5-10 min in einer Ethidiumbromidlösung (15 µl einer 1 %-igen (w/v) Ethidiumbromidlösung in 200 ml 1 x TAE-Puffer (Tab. 28)) inkubiert. Ethidiumbromid wurde zur Färbung genutzt, da dieses in Nukleinsäuren interkalieren und dann zu Fluoreszenz im sichtbaren Bereich angeregt werden kann. Nach Abwaschen des überflüssigen Ethidiumbromids konnten die Nukleinsäuren im Agarose-Gel auf einem UV-Transilluminator mit einer Wellenlänge von 265 nm sichtbar gemacht werden. Das Bandenmuster des Gels wurde mit Hilfe der Fotodokumentationsanlage fotografiert. 2.6.7. Größenbestimmung von Nukleinsäuren Zur Bestimmung von DNA-Fragmentgrößen im Agarose-Gel wurden DNAGrößenstandards (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) verwendet, die neben den Proben in einer separaten Ladetasche mit auf das Gel aufgetragen wurden. Je nach Fragmentgröße wurde für DNA entweder der "GeneRuler™ DNA Ladder Mix" (Abb. 7a) oder der "GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder" (Abb. 7b) benutzt. 2. Material und Methoden 50 Abbildung 7: Nukleinsäuren-Größenstandards (www.fermentas.com/): a) "GeneRuler™ DNA Ladder Mix" (0,5 μl in einem 1 %-igem (w/v) Agarosegel, 10010000 Bp) b) "GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder" (0,5 μl in einem 1 %-igem (w/v) Agarosegel, 1001000 Bp) 2.6.8. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 2.6.8.1. Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die Konzentration von Nukleinsäuren in wässriger Lösung wurde im Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Gemessen wurde in einer 100-µl-Quarzküvette mit einer Schichtdicke von 1 cm und einer Verdünnung von 1:50 oder 1:25. Unter Berücksichtigung des verwendeten Verdünnungsfaktors entspricht eine Extinktion von 1 bei doppelsträngiger DNA einer Konzentration von 50 µg/ml und bei RNA einer Konzentration von 40 µg/ml. Der Reinheitsgrad der Nukleinsäurelösung konnte über den Quotienten der Absorption bei 260 nm und 280 nm abgeschätzt werden. Für reine Nukleinsäurelösungen liegt der Quotient für DNA zwischen 1,8 und 2 und für RNA zwischen 2 und 2,2 (Sambrook und Russell, 2001). 2. Material und Methoden 51 2.6.8.2. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren im Agarose-Gel Die Abschätzung der Nukleinsäurekonzentration in einem ethidiumbromidgefärbten Agarose-Gel (2.6.5.1.) wurde durch den verwendeten Größenstandard (2.6.7.) ermöglicht. Dies erfolgte durch den Vergleich der Bandenintensität des Größenstandards und der zu untersuchenden Probe (Abb. 7). 2.6.9. Enzymatische Modifikation von DNA 2.6.9.1. Restriktionsspaltung von DNA Die sequenzspezifische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen zu präparativen und analytischen Zwecken erfolgte nach Angaben des Herstellers im empfohlenen Reaktionspuffer, um eine möglichst optimale Aktivität des Enzyms gewährleisten zu können. Bei Restriktionsansätzen mit mehreren Enzymen wurde ein Puffer gewählt, in dem alle Enzyme mindestens eine Aktivität von 50-100 % aufwiesen. Stand ein solches Puffersystem nicht zur Verfügung, so wurde die Reaktion zuerst mit dem Enzym mit Aktivität im Puffer geringerer Salzkonzentration durchgeführt. Danach wurde die Salzkonzentration erhöht und die einfach geschnittene DNA wurde für eine zweite Restriktion mit dem entsprechenden Enzym im Puffer mit höherer Salzkonzentration inkubiert. Eine weitere Möglichkeit bestand darin, einzelne Restriktionsverdaue durchzuführen. Hierbei wurde die einfach geschnittene DNA dazwischen gereinigt (2.6.4.5.). Falls die Restriktionsenzyme unterschiedliche Inkubationstemperaturen für deren Aktivität benötigten oder die Restriktionsschnittstellen für einen Doppelverdau zu nah zusammen lagen (www.fermentas.com/techinfo/re/ddpuc19mcs.htm), so wurde auf diese Methode zurückgegriffen. Denn Enzyme benötigen, um effizient schneiden zu können, jeweils einen entsprechenden Nukleotidüberhang. Bei dem analytischen Restriktionsverdau von PCR-Fragmenten war zu beachten, dass Enzyme meist einen 5-8 Bp-Nukleotidüberhang benötigen, um die DNA korrekt und effizient schneiden zu können. Bei der Herstellung dieser PCR-Fragmente wurde deshalb ein solcher Überhang generiert und das Einbringen von Restriktionsschnittstellen ganz am Ende des Fragments möglichst vermieden (2.6.10.3.). 2. Material und Methoden 52 Die Internetseite des Herstellers bietet einen Überblick über die optimalen Bedingungen und Puffer für Restriktionsverdaue mit zwei Enzymen (www.fermentas.com/doubledigest/ index.html). Glycerinkonzentrationen von über 5 % (v/v) konnten bei einigen Restriktionsendonukleasen zur so genannten Stern-Aktivität ("Star Activity") führen. Dadurch konnten auch ähnliche Erkennungssequenzen geschnitten werden, was wiederum zu einer unspezifischen Reaktion der DNA führt (Nasri und Thomas, 1986). Da die Lagerungspuffer der Enzyme etwa 50 % (v/v) Glycerin enthalten, wurde den Ansätzen nie mehr als 0,1 Vol. Enzym zugesetzt. Der Restriktionsverdau erfolgte in einem Volumen von 20-50 µl für mindestens 1 h, wobei pro μg DNA maximal 10 U des Enzyms eingesetzt wurden. Analytische Restriktionsansätze wurden soweit nicht anders angegeben bei 37 °C inkubiert. Der Reaktionsverdau wurde durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion (2.6.4.1.), eine Reinigung mit molekularbiologischen "Kits" (2.6.4.5.) oder durch Hitzeinaktivierung, welche enzymabhängig war (nach Angaben des Herstellers), gestoppt. Der Restriktionsverdau konnte mit Hilfe einer nicht-denaturierenden AgaroseGelelektrophorese (2.6.5.1.) kontrolliert und bei Bedarf bei -20 °C gelagert werden. 2.6.9.2 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten Um das Religieren der Vektor-DNA bei einer Ligation (2.6.9.3.) zu verhindern, wurden nach einem Restriktionsverdau (2.6.9.1.) die Phosphatreste an den 5'-Enden hydrolysiert. Bei Verwendung der "Antarctic Phosphatase" musste der Restriktionsansatz gereinigt werden (2.6.4.5.). Die "Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIAP)" und die "Shrimp Alkaline Phosphatase" hingegen waren in denselben Puffern aktiv, in denen auch die Restriktionsendonukleasen Aktivität aufwiesen. Die Dephosphorylierung wurde nach Angaben des Herstellers in einem Volumen von 30-50 µl durchgeführt. Die dephosphorylierte Vektor-DNA konnte entweder sofort weiter verwendet werden oder bei Bedarf bei -20 °C gelagert werden. 2. Material und Methoden 53 Bei der Ligation (2.6.9.3.) wurde ein Ansatz erstellt, in welchem sich keine Insert-DNA befand, um so den Erfolg der Dephosphorylierung zu kontrollieren. Durch die anschließende Transformation (2.7.) konnte dann die Anzahl der Religanten bestimmt werden. 2.6.9.3. Ligation von DNA-Fragmenten Ligationen von DNA-Fragmenten erfolgten mit einer T4-DNA-Ligase, welche ATPabhängig doppelsträngige DNA-Moleküle durch die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen freien 3′-Hydroxyl- und freien 5′-PhosphatGruppen verknüpft (Weiß et al., 1968). Ligationen wurden in 20-µl-Ansätzen durchgeführt, wobei Vektor- und Insert-DNA in einem variablen Mengenverhältnis eingesetzt wurden. Allerdings wurde immer ein deutlicher Überschuss an Insert-DNA zugegeben. Der Ligationsansatz wurde für mindestens 1 h inkubiert, wobei die Temperatur je nach verwendetem Enzym variierte (nach Angaben des Herstellers). Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene T4DNA-Ligasen verwendet (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Invitrogen GmbH, Karlsruhe; Tab. 8). Anschließend wurde das Enzym durch eine Inkubation bei 65 °C für 15 min inaktiviert. Dadurch konnte die Effizienz der nachfolgenden Transformation (2.7.) deutlich erhöht werden (Michelsen, 1995). 2.6.10. Amplifikation von DNA durch Polymerase-Kettenreaktion 2.6.10.1. Herstellung synthetischer Oligodesoxynukleotide Zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) waren spezifische Oligodesoxynukleotide ("Primer") nötig (Tab. 5), die von der Firma biomers.net GmbH, Ulm synthetisiert und bezogen wurden. Zur Gewährleistung einer erfolgreichen PCR und einer optimalen Hybridisierung an die Ziel-DNA sollte der G+C-Gehalt der Oligodesoxynukleotide ca. 40-60 % betragen. Die sich daraus ergebende Schmelztemperatur (Tm) lag bei etwa 50-60 °C. Die Länge der Oligodesoxynukleotide lag idealerweise bei 18-22 Nukleotiden. Zudem wurde darauf geachtet, dass das 3′-Ende der Oligodesoxynukleotide mindestens durch 1-2 Guanin- oder Cytosin-Basen gekennzeichnet war. 2. Material und Methoden 54 Hierbei handelt es sich um eine sogenannte GC-Klammer ("GC-Clamp"), die eine verbesserte Bindung an die Ziel-DNA ermöglicht. Weiter sollten die Oligodesoxynukleotid-Sequenzen möglichst wenige Wiederholungen gleicher Basen aufweisen, um keine internen Sekundärstrukturen oder Dimere bilden zu können. Um die Wahrscheinlichkeit falscher Bindungen zu minimieren, sollte zudem die Stabilität des 5′-Endes höher als die des 3′-Endes sein. Die Oligodesoxynukleotid-Auswahl sowie die Analyse der angesprochenen Parameter erfolgten mit dem Programm "Clone Manager 7.11" (Scientific & Educational Software, Cary, NJ (USA)). 2.6.10.2. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die von Kary B. Mullis entwickelte Polymerase-Kettenreaktion (PCR; "Polymerase Chain Reaction") wurde zur Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente genutzt (Saiki et al., 1985). Diese Methode diente der Herstellung von DNA-Fragmenten für Klonierungen sowie dem Nachweis von Genen und Plasmiden in Klonen von E. coli bzw. C. acetobutylicum. Je nach Anwendung wurden verschiedene Polymerasen eingesetzt. Für analytische Zwecke wurde die "Taq-DNA-Polymerase" verwendet, während für präparative Zwecke die "PowerScript DNA Polymerase Short", ein "High Fidelity PCR Enzyme Mix" oder das "Failsafe™ PCR System" genutzt wurde. Diese zeichnen sich im Gegensatz zur "Taq-DNA-Polymerase" durch eine 3′-5′-Exonukleasefunktion ("ProofReading") aus, was zu einer geringeren Fehlerrate (1 x 10-5 gegenüber 1 x 10-4) führt. Ebenfalls Verwendung fanden die "illustra™ PuReTaq Ready-To-Go™ PCR Beads". Hier liegen Magnesiumchlorid, dNTPs sowie die Taq-Polymerase als lyophylisiertes Kügelchen in einem Reaktionsgefäß vor. Zu diesem Reaktionsansatz muss nur noch die Matrizen-DNA, das entsprechende Oligodesoxynukleotid-Paar und H2O zugegeben und das Kügelchen vollständig gelöst werden. Ein typisches PCR-Programm besteht aus einem Denaturierungs-, einem Anlagerungs- und einem Elongationsschritt. Zuerst wird der DNA-Doppelstrang der Matrize ("Template") und der Oligodesoxynukleotide ("Primer") durch Hitze denaturiert (Abb. 8). Die Denaturierung erfolgt bei 95 °C. Anschließend können dann spezifische Oligodesoxynukleotide (Tab. 5) an die entstandenen Einzelstränge bei einer definierten Anlagerungstemperatur ("Annealingtemperatur") binden (Abb. 8). 2. Material und Methoden 55 Ausgehend vom 5′-Ende dieser kurzen doppelsträngigen Abschnitte kann die DNAPolymerase ansetzen und die fehlenden Stränge mit dNTPs in 3′-Richtung auffüllen (Elongationsschritt) (Abb. 8). Anschließend wird erneut denaturiert und der Zyklus wird wiederholt, wobei die Anzahl der Zyklen n die Anzahl der Kopien (2n) der zu amplifizierenden Sequenz bestimmt. Matrizen-DNA 1) Denaturierung Primer A und B Polymerase 2) Anlagerung Nukleotide 3) Elongation 4) Denaturierung Abbildung 8: Schematische Darstellung eines PCR-Zyklus (http://universe-review.ca/I11-50-PCR.jpg; modifiziert) Die Amplifikation erfolgte hierbei in Versuchsansätzen von 25-50 µl in Reaktionsgefäßen von 0,2 oder 0,5 ml Volumen, wobei als Matrize entweder isolierte Plasmid-DNA (2.6.3.3. und 2.6.3.4.) oder Gesamt-DNA (2.6.3.1.) eingesetzt wurde. Wurde bei einer PCR kein Produkt amplifiziert oder wurden unspezifische Nebenprodukte erhalten, so konnte die Hybridisierungstemperatur oder die Magnesiumionen-Konzentration variiert werden. 2. Material und Methoden 56 Im Folgenden sind die Zusammensetzung eines typischen PCR-Ansatzes und ein für die Amplifikation typisches PCR-Programm gezeigt (Tab. 30 und 31). Tabelle 30: Zusammensetzung einer Standard-PCR Zusammensetzung Konzentration Matrizen-DNA ("Template") Oligodesoxynukleotide ("Primer") A (100 pM) Oligodesoxynukleotide ("Primer") B (100 pM) dNTP-Gemisch (10 mM) Magnesiumchlorid (25 mM) Polymerase Reaktionspuffer H2O 0,1-1 µg 2 pM 2 pM 0,2 mM 1,5 mM 1-2 U Tabelle 31: Standard-PCR-Programm Schritt Initiale Denaturierung Temperatur Zeit 95 °C 5 min 95 °C variabel1) 72 °C 45 s 45 s variabel2) Finale Elongation 72 °C 5 min Kühlung 12 °C Denaturierung Hybridisierung ("Annealing") Elongation 32 Zyklen ∞ 1) Die Hybridisierungstemperatur richtete sich nach der berechneten Schmelztemperatur (Tm) der Oligodesoxynukleotide (Tab. 5). Die Hybridisierung erfolgte 5-10 °C unter der Schmelztemperatur. 2) Die Elongationszeit richtete sich nach der Länge des zu amplifiziernden Fragmentes. Je 1000 Bp erfolgte eine einminütige Elongationszeit. 2.6.10.3. Einfügen von Restriktionsschnittstellen Zur Klonierung von amplifizierten PCR-Fragmenten wurden diesen bei der Amplifikation oft über spezielle Oligodesoxynukleotide (Tab. 5) Erkennungssequenzen für ausgewählte Restriktionsenzyme eingefügt. Die verwendeten Oligodesoxynukleotide waren an den 3′-Enden komplementär zur Matrizen-DNA. Im 5′-Bereich wurden allerdings einige Basen so verändert, dass diese von spezifischen Restriktionsendonukleasen erkannt werden konnten. Die Amplifikation erfolgte analog der Standard-PCR (2.6.10.2.), allerdings wurde die Hybridisierungstemperatur aufgrund der nicht paarenden Sequenzbereiche etwas erniedrigt. 2. Material und Methoden 57 2.6.10.4. TA-Klonierung von PCR-Produkten Diese Methode eignet sich bei schwierigen Klonierungen oder bei geringer PCREffizienz, da das gereinigte PCR-Produkt (2.6.4.5.) ohne Restriktionsverdau direkt kloniert werden kann. Die Klonierung erfolgte hierbei mit dem "QUIAGEN PCR Cloning Kit", wobei der linearisierte Vektor pDrive Anwendung fand, welcher an den 3′-Enden ungepaarte Thymidinbasen besitzt. Die in dieser Arbeit zur TA-Klonierung verwendeten DNA-Polymerasen erzeugen an den 5′-Enden überhängende Adeninbasen, welche dann direkt mit dem pDrive-Vektor ligiert werden können. Zusätzlich kann der Erfolg der Ligation über eine Blau-Weiß-Selektion (2.7.1.3.) kontrolliert werden. Die Ligation erfolgte nach Angaben des Herstellers mit ca. 100 ng gereinigtem PCRProdukt. Zur Transformation dieses Reaktionsansatzes wurden chemisch kompetente E. coli-Zellen (2.7.1.1.) verwendet. 2.6.11. Sequenzierung von DNA Um die selbst hergestellten bzw. klonierten Konstrukte auf Mutationen zu überprüfen, erfolgte die Sequenzierung der entsprechenden Plasmid-DNA. Auf diese Weise konnte nachgewiesen werden, ob es bei der Amplifikation eines anschließend klonierten DNA-Bereichs zu Mutationen gekommen war. Sämtliche Sequenzierungen wurden von der Firma Eurofins MWG Operon, Ebersberg, durchgeführt. Für die Sequenzierung musste ein passendes Oligodesoxynukleotid (Tab. 5) ausgewählt werden, von dem ausgehend die Sequenzierung starten konnte. Die erhaltene Sequenz war normalerweise ca. 1000 Bp lang. Die Analyse der Sequenzdaten erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms "Clone Manager 7.11" (Scientific & Educational Software, Cary, NJ (USA)) oder konnte mit der Datenbank "Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLASTN)" (www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE0Nucleotides&PROGRAM0blastn; Altschul et al., 1990; McGinnis und Madden, 2004) verglichen werden. 2. Material und Methoden 58 2.7. DNA-Transfer in Bakterien 2.7.1. Transformation von E. coli 2.7.1.1. Transformation durch chemisch kompetente Zellen Die Herstellung erfolgte nach Inoue et al. (1990) in modifizierter Form, wobei 250 ml SOB-Medium (2.5.1.5.) mit dem jeweiligen E. coli-Stamm beimpft und unter leichtem Schütteln bis zu einer OD600nm von 0,6-0,8 bei 18 °C inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen für 10 min auf Eis abgekühlt und zentrifugiert (3000 x g, 10 min, 4 °C). Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellsediment in 80 ml eiskaltem PIPES-Puffer (Tab. 32) suspendiert und nochmals 10 min auf Eis inkubiert. Nach einer weiteren Zentrifugation (3000 x g, 10 min, 4 °C), erfolgte die Aufnahme des Sediments in 20 ml eiskaltem PIPES-Puffer. Danach wurde tropfenweise 1,5 ml DMSO (Endkonzentration: 7 % (v/v)) zugegeben. Nach einer erneuten Inkubation für 10 min auf Eis waren die Zellen kompetent. Sie wurden in je 200-μl-Aliquots aufgeteilt und konnten entweder sofort verwendet oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -85 °C gelagert werden. Für die Transformation wurden sie dann wieder auf Eis aufgetaut. Wurden nur einmalig kompetente Zellen von einem bestimmten E. coli-Stamm benötigt, so konnte auf eine simplere Herstellungsmethode zurückgegriffen werden. In diesem Fall mussten die kompetenten Zellen allerdings innerhalb weniger Stunden verwendet werden, da sie nicht gelagert werden konnten. 25 ml vorgewärmtes LB-Medium (2.5.1.2.) wurden hierzu mit 5 ml einer ÜbernachtKultur des entsprechenden E. coli-Stammes beimpft und bei 37 °C bis zu einer OD600nm von 0,6-0,8 inkubiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurden die Zellen durch Zentrifugation (3000 x g, 10 min, 4 °C) sedimentiert. Das Sediment wurde nach Verwerfen des Überstandes in 20 ml eiskalter, 0,1 M Magnesiumchloridlösung suspendiert. Anschließend wurde erneut zentrifugiert und die Zellen wurden in 10 ml eiskalter 0,1 M Calciumchloridlösung aufgenommen. Nach einer 20-minütigen Inkubation auf Eis erfolgte eine weitere Zentrifugation. Danach wurde das Sediment in 1 ml eiskalter 0,1 M Calciumchloridlösung suspendiert. Die kompetenten Zellen wurden schließlich in 50-µl-Aliquots aufgeteilt. 2. Material und Methoden 59 Zur Transformation wurde je ein Aliquot der kompetenten Zellen mit 20 µl des Ligationsansatzes bzw. mit 100-400 ng des zu transformierenden Plasmids versetzt. Nach einer Inkubation von 30 min auf Eis erfolgte ein Hitzeschock für eine Minute bei 42 °C. Dann wurden die Zellen für 5-10 min auf Eis abgekühlt. Die so transformierten Zellen konnten sich nach Zugabe von 800 µl vorgewärmtem (42 °C) SOC-Medium (2.5.1.6.) für 45 min bei 37 °C regenerieren. Anschließend wurden die Zellen sedimentiert (6000 x g, 1 min, RT) und 600 µl des Überstands verworfen. Die Zellen wurden im restlichen Medium resuspendiert und auf Selektivmedium ausplattiert. Chemisch kompetente E. coli-Zellen weisen eine hohe Transformationseffizienz (1-3 x 109 Transformanten/µg pBR322 Plasmid-DNA; Inoue et al., 1990) auf. Eine Transformation konnte selbst bei hohen Salzkonzentrationen oder Verunreinigung der Plasmid-DNA noch erfolgreich durchgeführt werden. Tabelle 32: PIPES-Puffer Zusammensetzung PIPES Calciumchlorid Dihydrat Kaliumchlorid Manganchlorid Tetrahydrat H2O pH 6,7 Menge 3,03 g 1,68 g 18,64 g 6,88 g Konzentration 10 mM 15 mM 250 mM 55 mM ad 500 ml PIPES und Calciumchlorid wurden getrennt von Kaliumchlorid und Manganchlorid autoklaviert und vor Gebrauch zusammengegeben. 2.7.1.2. Transformation durch Elektroporation Die Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen erfolgte nach einer Methode von Dower et al. (1988) in modifizierter Form. Der entsprechende E. coli-Stamm wurde hierzu in 250 ml LB-Medium (2.5.1.2.) bei 37 °C bis zu einer OD600nm von 0,5-0,8 inkubiert und anschließend für 20 min auf Eis abgekühlt. Durch Zentrifugation (6000 x g, 10 min, 4 °C) wurden die Zellen geerntet. Das Sediment wurde zweimal mit 250 ml eiskaltem H2O gewaschen. Anschließend folgten zwei weitere Waschschritte mit 50 ml eiskaltem 10 %-igem Glycerin (v/v) (Zentrifugation bei 8000 x g, 10 min, 4 °C) und 30 ml eiskaltem 10 %-igem Glycerin (v/v) (Zentrifugation bei 9000 x g, 10 min, 4 °C). 2. Material und Methoden 60 Das Sediment wurde schließlich in 1 ml 10 %-igem Glycerin (v/v) aufgenommen und die Zellsuspension in 50-µl-Aliquots in Reaktionsgefäße überführt und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die elektrokompetenten Zellen konnten bei -85 °C für mehrere Monate aufbewahrt werden. Zur Transformation wurde ein 50-µl-Aliquot elektrokompetenter Zellen auf Eis aufgetaut, in eine auf Eis vorgekühlte Elektroporationsküvette (Elektrodenabstand 2 mm, Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) überführt und mit 100-400 ng der Plasmid-DNA bzw. dem dialysierten Ligationsansatz (2.6.4.4.) versetzt. Die Elektroporation wurde bei einer Spannung von 2,5 kV, einem Widerstand von 200 Ω und einer Kapazität von 25 μF durchgeführt. Die daraus resultierende Feldstärke lag bei 12,5 kV/cm und die Zeitkonstante bei maximal 5,0 ms. Direkt nach dem Stromimpuls wurden die Zellen in 800 µl SOC-Medium (2.5.1.6.) aufgenommen und für 45 min bis 60 min bei 37 °C auf einem Schüttler regeneriert. Anschließend wurden die Zellen sedimentiert (6000 x g, 1 min, RT) und 600 µl des Überstands abgenommen. Die Zellen wurden im restlichen Medium resuspendiert und auf Selektivmedium ausplattiert. Die Transformation von E. coli durch Elektroporation ist ebenfalls eine sehr effiziente Methode (109-1010 Transformanten/µg pUC18 oder pBR322 Plasmid-DNA; Dower et al., 1988). Allerdings ist eine Transformation bei hohen Salzkonzentrationen oder Verunreinigungen der Plasmid-DNA nicht möglich. Daher wurde eine Dialyse (2.6.4.4.) durchgeführt, falls Ligationsansätze in elektrokompetente Zellen transformiert werden sollten. 2.7.1.3. Blau-Weiß-Selektion rekombinanter E. coli-Klone Durch Blau-Weiß-Selektion können rekombinante E. coli-Klone auf Insertionen in die multiple Klonierungsstelle des transformierten Vektors überprüft werden. Hierfür waren die E. coli-Stämme DH5α, JM109, SURE®, XL1-Blue, XL1-Blue MRF’ und XL2-Blue und die Vektoren pDrive, pUC18 und pUC19 geeignet. Die verwendeten E. coli-Stämme sind aufgrund der chromosomal lokalisierten Deletion lacIqZΔM15 nicht in der Lage, eine funktionsfähige ß-Galactosidase zu bilden. Dieser Defekt kann durch einen plasmidkodierten Genort (lacPOZ’) ausgeglichen werden (Vieira und Messing, 1982). 2. Material und Methoden 61 War dieser Genort in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors lokalisiert, so konnte ein inserierendes Fragment dieses Gen inaktivieren, so dass keine funktionsfähige ß-Galactosidase mehr entstand. Durch die Zugabe des Substratanalogons X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactosid) konnte dies überprüft werden. Wird X-Gal zu Galactose und 5-Brom-4-Chlor-Indoxyl hydrolisiert, welches wiederum vom Luftsauerstoff zu einem blauen Farbstoff oxidiert wird, der die Kolonien anfärbt, so ist eine aktive ß-Galactosidase vorhanden. Kolonien, die weiß blieben, konnten hingegen als diejenigen charakterisiert werden, die keine funktionsfähige ß-Galactosidase mehr hatten und folglich Plasmide besaßen, die ein inseriertes Fragment trugen. Zur Durchführung des Tests wurden Selektiv-Agarplatten, wie in 2.5.1. beschrieben, vorbereitet. 2.7.2. Transformation von Clostridien 2.7.2.1. Methylierung von Plasmid-DNA Die in Clostridien vorhandenen sequenzspezifischen Restriktionssysteme durch Endonukleasen führen zur Degradierung fremder DNA. Somit würde ungeschützte Plasmid-DNA unmittelbar nach Transformation wieder abgebaut werden, was eine Etablierung von aus E. coli präparierten Vektoren unmöglich machen würde. Um die Plasmid-DNA zu schützen, wurde eine Methyltransferase aus dem Bacillus subtilis-Phagen Φ3T I (Noyer-Weidner et al., 1983; Noyer-Weidner et al., 1985; TranBetcke et al., 1986) verwendet. Die Methylierung des innengelegenen Cytosins der Basenfolge 5'-GGCC-3' und 5'-GCNGC-3' durch die Methyltransferase (Balganesh et al., 1987) führt dazu, dass clostridielle Restriktionsendonukleasen, die genau diese Sequenz erkennen (Mermelstein und Papoutsakis, 1993), nicht mehr schneiden. Diese Sequenzen kommen häufig in Plasmiden vor, die für E. coli verwendet werden, wohingegen sie in clostridieller DNA nur selten zu finden sind (Mermelstein und Papoutsakis, 1993). Die zur Elektroporation eingesetzten Vektoren wurden in vivo in E. coli methyliert. Hierzu wurden die E. coli-Stämme ER2275, XL1-Blue MRF’ oder SURE® verwendet, da diese die Restriktionssysteme McrA, McrBC und Mrr nicht besitzen. 2. Material und Methoden 62 Diese schneiden DNA, bei der das Cytosin der Sequenz 5'-CG-3' methyliert ist (Kelleher und Raleigh, 1991). Die Methyltransferase war auf einem zusätzlichen Plasmid mit einem alternativen Replikationsursprung (pACYC184/p15A ori) kodiert. Verwendet wurden die Plasmide pAN1 (Cmr) und pANS1 (Spr), die sich durch ihre Resistenzgene unterschieden. Die Plasmide pAN1 bzw. pANS1 wurden zunächst in den verwendeten E. coliStämmen etabliert und diese wurden anschließend mit dem zu methylierenden Plasmid transformiert. Die so modifizierte Plasmid-DNA wurde aus den E. coli-Stämmen mittels Minipräparation (2.6.3.3. oder 2.6.3.4.) isoliert. Die Plasmide pAN1 und pANS1 mussten hierbei nicht extra aus den Plasmid-Präparationen entfernt werden, da sie nicht in Clostridien replizieren. Eine erfolgreiche Methylierung konnte durch einen Restriktionsverdau (2.6.9.1.) mit den Enzymen BsuRI (Erkennungssequenz: 5'-GG*CC-3') oder SatI (Erkennungssequenz: 5'-GC*NGC-3') überprüft werden. 2.7.2.2. Transformation durch Elektroporation 5 ml CGM (2.5.1.1.) wurden mit einer vorher pasteurisierten Sporensuspension des Wildtyps von C. acetobutylicum angeimpft (2.5.4.) und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen sedimentiert (3000 x g, 10 min, 4 °C). Mit einer sterilen Spritze wurden 4 ml des Überstandes abgenommen und das Zellsediment wurde im restlichen Medium gelöst. 50 ml vorgewärmtes CGM wurde dann mit dieser Zellsuspension beimpft, ca. 3-4 Stunden bei 37 °C inkubiert und bis zu einer OD600nm von 0,6-0,8 angezogen, da sich die Kultur in der exponentiellen Wachstumsphase befinden sollte. Die Herstellung der kompetenten Zellen erfolgte in der Anaerobenkammer. Hierzu wurde die Kulturflasche mit einer sterilen Kanüle entgast und zusammen mit allen zur Transformation nötigen Utensilien in die Anaerobenkammer eingeschleust. Die Kultur wurde zentrifugiert (2200 x g, 10 min, 4 °C) und einmal mit 1 Vol. eiskaltem ETM-Puffer (Tab. 33) gewaschen (2200 x g, 10 min, 4 °C). Der Überstand wurde vollständig entfernt. Das Sediment wurde in 3 ml eiskaltem ET-Puffer aufgenommen und bis zur anschließenden Transformation auf Eis gelagert. Die auf diese Weise hergestellten kompetenten Zellen waren für 5 Transformationsansätze ausreichend. 2. Material und Methoden 63 Tabelle 33: ETM-Puffer Zusammensetzung Menge Konzentration Saccharose 92,3 g 270 mM di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat 106,7 mg 0,6 mM Natriumdihydrogenphosphat Monohydrat 600 mg 5 mM Magnesiumchlorid Hexahydrat 42,7 g H2O 210 mM ad 1000 ml pH 6 Der ET-Puffer entspricht dem ETM-Puffer, nur enthält dieser kein Magnesiumchlorid. Für die Elektroporation wurden 600 µl kompetente Zellen in eine gekühlte Elektroporationsküvette mit einem Elektrodenabstand von 4 mm (Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) überführt und mit 2 µg methylierter Plasmid-DNA (2.7.2.1.) gemischt. Die Transformation erfolgte bei einer Spannung von 1,8 kV, einem Widerstand von 600 Ω und einer Kapazität von 50 μF. Die daraus resultierende Zeitkonstante betrug ca. 12 ms. Sofort nach dem Impuls wurden die Zellen in 1,4 ml vorgekühltes (4 °C) CGM überführt und 4 Stunden bei 37 °C regeneriert. 300 µl der Kultur wurden jeweils auf Agarplatten mit Selektivmedium ausplattiert, mit Parafilm verschlossen und ca. 3-5 Tage bei 37 °C in der Anaerobenkammer inkubiert. Schließlich konnte eine Sporenpräparation (2.5.4.) durchgeführt werden. Für das Arbeiten in der Anaerobenkammer wurden nur sterile, gestopfte Spitzen verwendet. Zentrifugenröhrchen und Elektroporationsküvetten wurden in speziell angefertigten Kühlblöcken aus Metall gekühlt. Die Zentrifugenröhrchen und Elektroporationsküvetten (in der gasdurchlässigen Verpackung) wurden schon vorher in die Kammer eingeschleust, um einen Gasaustausch zu ermöglichen. Die Plasmid-DNA-Lösungen sollten außerdem keine hohen Salzkonzentrationen aufweisen und wenn nötig vorher dialysiert werden (2.6.4.4.). Der Widerstand der Lösung konnte allerdings vor der Elektroporation mit Hilfe des Elektroporationsgerätes gemessen werden, um dies zu überprüfen. 2. Material und Methoden 64 2.8. "ClosTron® Gene Knockout System" Das auf dem "TargeTron™ Gene Knockout System" der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf basierende "ClosTron® Gene Knockout System" bietet die Möglichkeit, Gene schnell, effizient und spezifisch durch eine Integration von sog. Gruppe-II-Introns zu inaktivieren (Frazier et al., 2003). Allerdings sind weder der Promoter, der Integrationsmarker noch das Replikon des originalen TargeTron™Plasmids pACD4K-C in Clostridien funktional. Daher wurde der speziell für Clostridien entwickelte Vektor pMTL007 verwendet. Dieses Plasmid verfügt u. a. über einen IPTG-induzierbaren fac-Promoter, eine modifizierte ermB-Resistenzkassette und ein pCB102-basierendes Replikon (Heap et al., 2007). Dabei erkennt ein induzierbares plasmidkodiertes Gruppe-II-Intron eine spezifische chromosomale Sequenz und inseriert dort autokatalytisch (Zhong et al., 2003). Dies bedeutet, dass nach Induktion des fac-Promoters mit IPTG die Transkription des Gruppe-II-Introns erfolgt. Das ebenfalls synthetisierte LtrA-Protein bildet zusammen mit der RNA des Gruppe-II-Introns einen so genannten RNP-Komplex (RNA-ProteinKomplex). Dieser Komplex bindet dann an die Zielsequenz, das LtrA-Protein schneidet an definierter Insertionsstelle und die mRNA wird eingebaut. Daraufhin erfolgt die cDNA- und Doppelstrangsynthese durch das LtrA-Protein anhand der RNA-Matrize und anschließend der mRNA-Abbau. Der komplementäre DNA-Strang wird dann von Wirts-Polymerasen synthetisiert. Eine erst nach einer erfolgreichen Integration aktive Antibiotika-Resistenz erlaubt zusätzlich eine effiziente Selektion der Integrationsmutanten. Die Erkennungssequenz des Introns kann durch eine Ein-Schritt-SOE-PCR (2.8.1.) an das Zielgen angepasst werden. Die Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH bietet dafür eine über eine Internetseite (http://www.sigma-genosys.com/targetron/) erreichbare Suchfunktion und automatische "Primer"-Generierung an. Hierbei ist zu erwarten, dass eine Sequenz von 1000 Bp ca. 5-11 Insertionsstellen aufweist. 2. Material und Methoden 65 2.8.1. Ein-Schritt-SOE-PCR Das Prinzip der "Splicing by Overlap Extension"-PCR ermöglicht es, die Erkennungssequenz des Introns dahingehend zu mutieren, dass es in ein gewünschtes Zielgen inseriert (Ho et al., 1989). In der Ein-Schritt-SOE-PCR wurden die normalerweise 3 Reaktionsschritte zu einem einzigen Schritt vereint. Zuerst wurde die Sequenz des Zielgens mit Hilfe eines computergestützten Algorithmus′ der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf auf mögliche Insertionsstellen hin durchsucht und für jede ausgewählte Insertionsstelle die "Primer" IBS, EBS2 sowie EBS1d für die Mutation der Erkennungssequenz des Introns generiert. Die erforderlichen "Primer" wurden von der Firma biomers.net GmbH, Ulm synthetisiert. Nach Erhalt wurden die "Primer" IBS und EBS1d auf 100 μM und der "Primer" EBS2 auf 20 μM mit H2O verdünnt. Die SOE-PCR wurde nach Anleitung des Handbuchs des Herstellers unter Verwendung des "Failsafe™ PCR Systems" nach folgendem Protokoll durchgeführt (Tab. 34 und 35): Tabelle 34: Herstellung des "4-Primer"-Mixes Zusammensetzung Menge Konzentration 1 μl 1 μl 1 μl 10 μM 10 μM 2 μM 1 μl ad 10 μl 2 μM IBS (100 μM) EBS1d (100 μM) EBS2 (20 μM) EBS Universal (20 μM)1) H2O 1) ® Der "Primer" EBS Universal war im "ClosTron Gene Knockout System" enthalten. Der Reaktionsansatz war wie folgt zusammengesetzt: 1) "Primer"-Mix Intron-Matrize1) (zuvor 1:10 verdünnt) Failsafe™ Premix E Failsafe™ Polymerase H2O ® 1 μl 1 μl 25 μl 0,5 μl ad 50 μl Die Intron-Matrize war im im "ClosTron Gene Knockout System" enthalten. 2. Material und Methoden 66 Im Folgenden ist das verwendete PCR-Programm dargestellt (Tab. 35): Tabelle 35: Verwendetes PCR-Programm Schritt Temperatur Zeit Initiale Denaturierung 95 °C 30 s Denaturierung Hybridisierung ("Annealing") Elongation 95 °C 55 °C 72 °C 15 s 30 s 30 s Finale Elongation 72 °C 2 min Kühlung 12 °C ∞ 30 Zyklen Der Erfolg der SOE-PCR wurde durch eine Agarose-Gelelektrophorese (2.6.5.1.) kontrolliert, wobei eine deutliche Bande mit einer Größe von 350 Bp zu sehen sein sollte. Das PCR-Produkt wurde anschließend gereinigt (2.6.4.5.). 2.8.2. Restriktionsspaltung von DNA-Fragment und Vektor pMTL007 Sowohl das erhaltene DNA-Fragment (2.8.1.) als auch der Vektor pMTL007 wurden einer doppelten Restriktionsspaltung (2.6.9.1.) unterzogen, um für die folgende Ligation kompatible DNA-Enden zu generieren. In einem 20-μl-Ansatz wurden 200 ng gereinigtes PCR-Produkt bzw. 2 μg Vektor zusammen mit jeweils 20 U der Restriktionsendonukleasen HindIII und BsrGI (Bsp1407I) und dem entsprechenden Reaktionspuffer gemischt. Die Inkubation erfolgte 1 h bei 37 °C und 10 min bei 80 °C. Das verdaute DNA-Fragment wurde gereinigt (2.6.4.5.) und konnte für die Ligation verwendet werden. Die Vektor-DNA wurde zuerst dephosphoryliert (2.6.9.2). Da der hier verwendete Vektor bereits ein inseriertes DNA-Fragment trug, musste dieses durch eine nicht-denaturierende Agarose-Gelelektrophorese (2.6.5.1.) abgetrennt und der linearisierte, ca. 11,5 kBp große Vektor aus dem Gel gereinigt (2.6.4.6.) werden. 2. Material und Methoden 67 2.8.3. Ligation von DNA-Fragment und Vektor pMTL007 Nach vorheriger Konzentrationsbestimmung (2.6.8.1.) wurden in den 20-µlLigationsansatz 100 ng Vektor-DNA und 15 ng DNA-Fragment (entspricht einem molaren Verhältnis von 1:5) zusammen mit 10 U T4-DNA-Ligase (Tab. 8) und dem entsprechenden Puffersystem eingesetzt. Nach Inkubation für 1 h bei 22 °C und der Inaktivierung der Ligase für 10 min bei 65 °C wurde der komplette Ansatz in chemisch kompetente E. coli XL1-Blue-Zellen transformiert, auf Chloramphenicol-haltiges Selektivmedium (25 µg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Einzelne Kolonien konnten am drauffolgenden Tag von diesen Agarplatten in selektives Flüssigmedium überführt und angezogen werden. Anschließend erfolgte eine Plasmidisolierung (2.6.3.3. und 2.6.3.4.), wobei die präparierten Plasmide durch Restriktionsspaltung (2.6.9.1.) und Sequenzierung (2.6.11.) kontrolliert wurden. Stämme mit richtigen bzw. mutationsfreien Plasmiden wurden in die Stammhaltung (2.5.4.) aufgenommen. 2.8.4. Transformation von pMTL007 in C. acetobutylicum Die Vektoren pMTL007 mit den nach Wunsch modifizierten Intronsequenzen wurden zuerst in E. coli XL1-Blue MRF' (pANS1) und in E. coli ER2275 (pANS1) in vivo methyliert (2.7.2.1.). Nach erfolgreicher Plasmidpräparation (2.6.3.3. und 2.6.3.4.) und Konzentrationsbestimmung (2.6.8.1.) erfolgte die Transformation in C. acetobutylicum (2.7.2.2.). Nach einer Regeneration von 4 h bei 37 °C wurde der Transformationsansatz auf CGM-Agarplatten mit 7,5 μg/ml Thiamphenicol ausplattiert. Nach Herstellung einer Sporensuspension (2.5.4.) wurde diese in die Stammhaltung aufgenommen. 2.8.5. Induktion der Integration in C. acetobutylicum 100 μl einer Übernacht-Kultur der Transformanten aus 2.8.4. wurden in 900 μl CGM mit 7,5 μg/ml Thiamphenicol in 2-ml-Schraubdeckelreaktionsgefäßen überimpft und unter anaeroben Bedingungen für ca. 3-4 h bei 37 °C inkubiert. War nach dieser Zeit Wachstum zu erkennen, wurde die Kultur mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM induziert und für eine weitere Stunde bei 37 °C inkubiert. 2. Material und Methoden 68 Nach Zentrifugation der Zellen (6000 x g, 1 min, RT) wurden diese mit 0,5 ml anaeroben PBS (Tab. 36) gewaschen, das Sediment in 1 ml CGM suspendiert und für weitere 3-4 h bei 37 °C regeneriert. Anschließend wurden 20, 100 und 200 μl der Kultur auf je eine CGM-Agarplatte mit 2,5 μg/ml Clarithromycin ausplattiert, mit Parafilm versiegelt und für einige Tage bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Herstellung einer Sporensuspension (2.5.4.), welche, falls es die Inaktivierung des entsprechenden Gens zuließ, in die Stammhaltung aufgenommen wurde. Tabelle 36: PBS-Puffer (1 x) Zusammensetzung Natriumdihydrogenphosphat Monohydrat di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat Natriumchlorid H2O pH 7,4 Menge 1,44 g 15,66 g 5,84 g ad 1000 ml Konzentration 12 mM 88 mM 100 mM 2.8.6. Kontrolle der Integration mittels PCR Zuerst wurde aus den Integrationsmutanten die Gesamt-DNA präpariert (2.6.3.1.). Diese DNA wurde als Matrize in eine Standard-PCR (2.6.10.2.) eingesetzt. Bei Verwendung eines Oligodesoxynukleotides, welches vor der Insertionsstelle bindet, und des EBS1d-Oligodesoxynukleotides (bindet stromabwärts im Gen) bzw. bei Verwendung des EBS2-Oligodesoxynukleotides (bindet stromaufwärts im Gen) und eines Oligodesoxynukleotides, welches hinter der Insertionsstelle bindet, zeigte ein spezifisches PCR-Produkt zusätzlich zur vermittelten Resistenz eine positive Integration in dem gewünschten Bestimmungsort auf. 3. Ergebnisse 69 3. Ergebnisse 3.1. Konstruktion eines Butanol-Synthese-Operons Um die Synthese von 1-Butanol mit clostridiellen Genen im Zwischenwirt E. coli zu untersuchen, sollte ein Butanol-Synthese-Operon konstruiert werden. Dieses sollte die Gene der Crotonase (crt), Butyryl-CoA-Dehydrogenase (bcd), ElektronentransferFlavoproteine (etfB, etfA), 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (hbd), Thiolase (thlA), Butanol-Dehydrogenase (bdhB) und Butyraldehyd-Dehydrogenase (ald) beinhalten. Für die Konstruktion des Butanol-Synthese-Operons unter Kontrolle des Promoters Pptb des Phosphotransbutyrylase/Butyrat-Kinase-Operons von C. acetobutylicum wurden die Gene, die für die Enzyme des Butanol-Stoffwechsels kodieren, von der chromosomalen DNA aus C. acetobutylicum DSM 792 (ATCC 824) und C. beijerinckii NCIMB 8052 amplifiziert. Die Termination erfolgt durch den bidirektionalen Terminator Tadc der Acetacetat-Decarboxylase von C. acetobutylicum. Das Einfügen der catP-Resistenzkassette ermöglicht die Selektion auf Chloramphenicol. Ein von Sandra Hujer (unveröffentlicht) konstruiertes Butanol-Synthese-Operon zur Herstellung von 1-Butanol mit C. ljungdahlii aus Synthesegas wurde bereits auf Synthese von 1-Butanol in E. coli als Zwischenwirt getestet (Köpke, 2009). Zur Konstruktion dieses Operons wurden die Gene der Thiolase (thlA), 3-HydroxybutyrylCoA-Dehydrogenase (hbd), Crotonase (crt), Butyryl-CoA-Dehydrogenase (bcd), Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase (adhE) und Butanol-Dehydrogenase (bdhA) von chromosomaler DNA aus C. acetobutylicum DSM 792 (ATCC 824) amplifiziert, in E. coli in den Vektoren pUC18 und pUC19 sukzessive zusammengefügt und dann in den E. coli/Clostridien-Schaukelvektor pIMP1 kloniert. Die sequenzierten und mutationsfreien Butanol-Synthese-Plasmide (plasmid Synthesis Of Butanol) pSOBPptb und pSOBPbdhA stehen dabei unter Kontrolle des Promoters Pptb des Phosphotransbutyrylase/Butyrat-Kinase-Operons bzw. unter Kontrolle des ButanolDehydrogenase A-Promoters PbdhA von C. acetobutylicum. Zur Termination dient in beiden Fällen der bidirektionale Terminator Tadc der Acetacetat-Decarboxylase von C. acetobutylicum (Hujer, unveröffentlicht). 3. Ergebnisse 70 Nach Transformation der Plasmide pSOBPptb und pSOBPbdhA in verschiedene E. coliStämme und anschließenden Wachstumsversuchen mit dem chemisch definierten TM3a/Glucose-Medium (2.5.1.7.) war gaschromatographisch kein 1-Butanol detektierbar (Köpke, 2009). Es ist zu vermuten, dass dies auf das Fehlen der Elektronentransfer-Flavoproteine EtfA/B aus C. acetobutylicum zurückzuführen ist, ohne die die Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd in E. coli nicht aktiv ist (Inui et al., 2007). Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher sowohl die Gene der ElektronentransferFlavoproteine etfB/etfA von chromosomaler DNA aus C. acetobutylicum amplifiziert, als auch das Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase-Gen (adhE) aus C. acetobutylicum DSM 792 (ATCC 824) gegen das Butyraldehyd-DehydrogenaseGen (ald) aus C. beijerinckii NCIMB 8052 ausgetauscht. Die ButyraldehydDehydrogenase Ald katalysiert die Reduktion von Butyryl-CoA zu Buryraldehyd, welches dann durch die Butanol-Dehydrogenase zu 1-Butanol reduziert wird. Zudem wurde das Butanol-Dehydrogenase-Gen bdhA gegen bdhB ausgetauscht, da dessen Genprodukt BdhB (bzw. BdhII) eine höhere Aktivität und Spezifität mit Butyraldehyd aufweist als BdhA (bzw. BdhI) (Welch et al., 1989; Petersen et al., 1991; Walter et al., 1992). In Abbildung 9 ist das Schema der Butanol-Synthese mit den dazu nötigen Genen aus C. acetobutylicum sowie C. beijerinckii dargestellt. Abbildung 9: Schema der Butanol-Synthese mit den Genen aus C. acetobutylicum und C. beijerinckii 3. Ergebnisse 71 Nach Amplifikation der entsprechenden Gene bzw. Genbereiche wurden diese jeweils in den zur TA-Klonierung (2.6.10.4.) geeigneten Vektor pDrive kloniert. Folgende pDrive-Plasmidkonstrukte wurden sequenziert und liegen mutationsfrei in E. coli XL2Blue und E. coli HB101 vor (Tab. 37): Tabelle 37: pDrive-Plasmidkonstrukte Vektor-Bezeichnung Herkunft der eingebrachten Gene/Genbereiche pDrive_Pptb 18 C. acetobutylicum pDrive_crt_bcd C. acetobutylicum pDrive_etfB_etfA_hbd C. acetobutylicum pDrive_Pptb 19 C. acetobutylicum pDrive_thlA C. acetobutylicum pDrive_bdhB C. acetobutylicum pDrive_ald C. beijerinckii pDrive_Tadc C. acetobutylicum pDrive_catP C. acetobutylicum Die Gene wurden über die eingefügten Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme am 5′-Ende der zur Amplifikation verwendeten Oligodesoxynukleotide (Tab. 5) aus dem Vektor pDrive ausgeschnitten. Die Fragmente sollten für die Konstruktion des Butanol-Synthese-Operons in E. coli XL2-Blue in den Vektoren pUC18 und pUC19 sukzessive zusammengefügt werden (Abb. 10). Tabelle 38: Verwendete Schnittstellen für die Klonierung der Butanol-Synthese-Gene in die Vektoren pUC18 und pUC19 Gen(-bereich) verwendete Schnittstellen Pptb 18 PstI und SalI crt_bcd NotI und XbaI etfB_etfA_hbd Eco81I und BamHI Pptb 19 XbaI und SalI thlA NotI und SalI bdhB SalI und PstI ald XhoI und PstI Tadc Eco32I catP PstI und PaeI 3. Ergebnisse 72 a) b) Pptb bla bla Pptb crt thlA pMB1/ColE1 ori pMB1/ColE1 ori pUC18_Pptb_crt_bcd_etfB_etfA_hbd 7653 Bp pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald_Tadc_catP 7762 Bp bcd bdhB catP hbd etfB Tadc etfA ald Abbildung 10: Plasmidkarte von a) pUC18_Pptb_crt_bcd_etfB_etfA_hbd und b) pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald_Tadc_catP Nach dem sukzessiven Zusammenfügen der Butanol-Synthese-Gene in den Vektoren pUC18 und pUC19 in E. coli sollten diese in die E. coli/Clostridien-Schaukelvektoren pIMP1 und pIMP1oriTori2 kloniert und zur Transformation bzw. Konjugation in C. ljungdahlii eingesetzt werden. In Abbildung 11 ist das Klonierungsschema für die Butanol-Synthese-Gene von C. acetobutylicum und C. beijerinckii in den E. coli/Clostridien-Schaukelvektor pIMP1 dargestellt. Auf dieselbe Weise sollte die Klonierung der zur Butanol-Synthese nötigen Gene in den E. coli/ClostridienSchaukelvektor pIMP1oriTori2 erfolgen. 3. Ergebnisse Abbildung 11: Klonierungsschema für das Butanol-Synthese-Operon 73 3. Ergebnisse 74 Nach Klonierung der Butanol-Synthese-Gene in die Vektoren pUC18 und pUC19 wurden die konstruierten Plasmide sequenziert. Das Ergebnis der Sequenzierung ergab, dass die Plasmide nicht mutationsfrei in E. coli XL2-Blue vorliegen. Da dies eventuell auf ein stammspezifisches Problem zurückzuführen ist oder auf der Toxizität von 1-Butanol sowie einiger Intermediate des Butanol-Synthese-Weges für E. coli beruht, wurden die vorhandenen fehlerfreien pDrive-Plasmidkonstrukte jeweils in die E. coli-Stämme HB101, ER2275, DH5α und SURE® transformiert, um den effizientesten Stamm für weitere Klonierungen zu ermitteln. Die erneute Sequenzierung dieser Konstrukte ergab, dass sämtliche pDrive-Konstrukte in E. coli HB101 mutationsfrei vorliegen. Aufgrund dessen wurden alle weiteren Klonierungsschritte in diesem Stamm durchgeführt. Zusätzlich wurde der Vektor pDrive, nach dem Herausschneiden der Fragmente, durch das Restriktionsenzym Alw44I zerstört, bevor die Klonierung der Gene in die Vektoren pUC18 und pUC19 stattfand. Allerdings konnte nur der Promoter Pptb des Phosphotransbutyrylase/Butyrat-Kinase-Operons fehlerfrei in den Vektor pUC18 kloniert werden. Eine schrittweise Klonierung in den Vektor pUC19 war für den Pptb Promoter und die Gene der Thiolase (thlA), Butanol-Dehydrogenase (bdhB) und Butyraldehyd-Dehydrogenase (ald) erfolgreich. Das Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald wurde anschließend auf Funktionalität im Zwischenwirt E. coli getestet. 3.2 . Synthese von 1-Butanol in E. coli 3.2.1. Wachstumsversuche pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald von E. coli mit dem Plasmid Um die Funktionalität des Konstruktes pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald zu überprüfen, wurde die Butanol-Synthese ausgehend von Butyrat im Zwischenwirt E. coli untersucht. Hierzu wurden sowohl das Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald als auch das Kontrollplasmid pUC19 in E. coli HB101 und E. coli WL3 transformiert. Letzterer zeichnet sich durch eine mutierte und somit inaktive Alkohol-Dehydrogenase AdhE aus (Lorowitz und Clark, 1982). 3. Ergebnisse 75 Anschließend wurden Wachstumsversuche unter aeroben, semianaeroben und anaeroben Bedingungen in jeweils 100 ml des chemisch definierten TM3a/GlucoseMediums (2.5.1.7.) durchgeführt. Während der exponentiellen Wachstumsphase wurden 10 bzw. 20 mM Butyrat zugegeben. Sowohl während des exponentiellen als auch während des stationären Wachstums wurden Proben genommen, die gaschromatographisch analysiert wurden. 3.2.1.1. Synthese von 1-Butanol aus Butyrat Abbildung 12 zeigt den Verlauf des Wachstums und die gemessenen ButanolKonzentrationen von E. coli HB101 und WL3 mit dem Kontrollplasmid pUC19 unter semianaeroben (Abb. 12a) und anaeroben (Abb. 12b) Bedingungen mit 10 bzw. 20 mM Butyrat. a) b) 2 2 1,3 1,3 1,2 1,2 1 1 0,6 0,1 0,8 0,6 0,4 Butanol [mM] OD600nm 0,8 1,0 Butanol [mM] OD600nm 1,0 0,4 0,1 0,2 0,2 0,0 0 10 20 30 40 50 0,0 0 5 10 15 20 25 Zeit [h] Zeit [h] [OD600nm] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [OD600nm] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [OD600nm] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [OD600nm] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [OD600nm] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [OD600nm] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [OD600nm] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] [OD600nm] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] [Butanol] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butanol] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Butanol] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butanol] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Butanol] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butanol] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] [Butanol] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butanol] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 30 Abbildung 12: Wachstum von E. coli HB101 und WL3 mit pUC19. a) semianaerobe und b) anaerobe Bedingungen in 100 ml TM3a/Glucose-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 10 bzw. 20 mM Butyrat 3. Ergebnisse 76 In den Abbildungen 13 und 14 ist der Verlauf des Wachstums, sowie die Konzentrationen an gebildeten Produkten von E. coli HB101 (Abb. 13) und E. coli WL3 (Abb. 14) mit dem Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald unter semianaeroben (Abb. 13a und 14a) und anaeroben Bedingungen (Abb. 13b und 14b) mit 10 bzw. 20 mM Butyrat dargestellt. a) 1,3 2 50 [OD600nm] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [OD600nm] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] 1,2 40 0,8 0,6 0,1 0,4 Butanol, Aceton [mM] OD600nm 1,0 30 20 10 Ethanol, Acetat, Butyrat [mM] 1 0,2 0 10 20 30 40 0,0 0 1,3 50 [Butanol] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butanol] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Aceton] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Aceton] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Ethanol] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Ethanol] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Acetat] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Acetat] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Butyrat] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butyrat] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] 50 Zeit [h] b) 2 [OD600nm] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] 1,2 [OD600nm] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] 40 OD600nm 0,8 0,6 0,1 0,4 Butanol, Aceton [mM] 1,0 30 20 10 0,2 0,0 0 5 10 15 20 25 0 Ethanol, Acetat, Butyrat [mM] 1 [Butanol] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butanol] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Aceton] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Aceton] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Ethanol] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Ethanol] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Acetat] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Acetat] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] [Butyrat] E. coli HB101 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butyrat] E. coli HB101 Kultur B [20 mM Butyrat] 30 Zeit [h] Abbildung 13: Wachstum von E. coli HB101 mit pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald. a) semianaerobe und b) anaerobe Bedingungen in 100 ml TM3a/Glucose-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 10 bzw. 20 mM Butyrat 3. Ergebnisse 77 a) 1,3 2 100 [OD600nm] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] 1,2 OD600nm 0,8 0,6 0,4 0,1 80 60 40 Acetat, Butyrat [mM] 1,0 Butanol, Aceton, Ethanol [mM] [OD600nm] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 1 0,0 10 20 30 40 [Aceton] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Aceton] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] [Ethanol] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Ethanol] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 20 [Acetat] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Acetat] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 0 [Butyrat] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butyrat] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 0,2 0 [Butanol] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butanol] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 50 Zeit [h] b) 2 1,3 50 [OD600nm] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [OD600nm] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 1,0 OD600nm 0,8 0,6 0,4 40 30 20 5 10 15 20 25 [Aceton] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Aceton] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] [Ethanol] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Ethanol] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] [Acetat] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Acetat] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 0 [Butyrat] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butyrat] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 0,1 0 [Butanol] E. coli WL3 Kultur A [10 mM Butyrat] [Butanol] E. coli WL3 Kultur B [20 mM Butyrat] 10 0,2 0,0 Acetat, Butyrat [mM] 1 Butanol, Aceton, Ethanol [mM] 1,2 30 Zeit [h] Abbildung 14: Wachstum von E. coli WL3 mit pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald. a) semianaerobe und b) anaerobe Bedingungen in 100 ml TM3a/Glucose-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 10 bzw. 20 mM Butyrat In Tabelle 39 sind die maximalen Butanol-Konzentrationen, die während des Wachstums von E. coli HB101 unter semianaeroben und anaeroben Bedingungen detektiert wurden, dargestellt. Während bei E. coli HB101 mit dem Kontrollplasmid pUC19 nur sehr geringe Mengen 1-Butanol gemessen wurden (Abb. 12), kommt es in der mittleren und in der späten stationären Phase des Wachstums von E. coli HB101 mit dem Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald unter semianaeroben Bedingungen mit 10 bzw. 20 mM Butyrat zur Bildung von 0,94 und 0,87 mM 1-Butanol (Abb. 13a). 3. Ergebnisse 78 Unter anaeroben Bedingungen konnten am Ende der stationären Wachstumsphase von E. coli HB101 mit dem Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald und nach Zugabe von 10 bzw. 20 mM Butyrat maximal 0,65 und 0,60 mM Butanol detektiert werden (Abb. 13b). Tabelle 39: Maximale Butanol-Konzentration während des Wachstums von E. coli HB101 unter semianaeroben und anaeroben Bedingungen E. coli HB101- Stamm Butanol [mM] semianaerob Butanol [mM] anaerob E. coli HB101 + pUC19 [10 mM Butyrat] 0,03 0,03 E. coli HB101 + pUC19 [20 mM Butyrat] 0,04 0,03 E. coli HB101 + pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald [10 mM Butyrat] 0,94 0,65 E. coli HB101 + pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald [20 mM Butyrat] 0,87 0,60 Bei E. coli WL3 mit dem Kontrollplasmid pUC19 konnten über den Verlauf des gesamten Wachstums unter semianaeroben Bedingungen nur sehr geringe Mengen und unter anaeroben Bedingungen kein 1-Butanol detektiert werden (Abb. 12, Tab. 40). Dagegen produzierte E. coli WL3 mit dem Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald in der mittleren und späten Phase des Wachstums unter semianaeroben Bedingungen mit 10 bzw. 20 mM Butyrat 0,11 und 0,71 mM 1-Butanol (Abb. 14a, Tab. 40). Unter anaeroben Bedingungen, nach Zugabe von 10 mM Butyrat, kommt es bei E. coli WL3 mit dem Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald während der frühen stationären Phase zur Bildung von 0,41 mM 1-Butanol (Abb. 14b, Tab. 40). In den Proben des semianaeroben und anaeroben Wachstums von E. coli WL3 mit dem Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald konnten höhere Konzentrationen von Ethanol (ca. 0,91,3 mM) nachgewiesen werden als in den Proben von E. coli WL3 mit dem Kontrollplasmid pUC19 (0,2-0,6 mM). E. coli WL3 zeichnet sich durch eine mutierte und folglich inaktive Alkohol-Dehydrogenase AdhE aus (Lorowitz und Clark, 1982). Die Butyraldehyd-Dehydrogenase Ald von C. beijerinckii, deren Gen sich auf dem Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald befindet, katalysiert jedoch die Reduktion von AcetylCoA und Butyryl-CoA zu den entsprechenden Aldehyden (Yan und Chen, 1990; Toth et al., 1999). 3. Ergebnisse 79 Zusätzlich besitzt dieses Plasmid die Butanol-Dehydrogenase BdhB (BdhII) von C. acetobutylicum, welche neben Butyraldehyd auch Acetaldehyd umsetzen kann. Jedoch weist BdhB eine 46-fach höhere Aktivität mit Butyraldehyd als mit Acetaldehyd auf (Walter et al., 1992). Tabelle 40: Maximale Butanol-Konzentration während des Wachstums von E. coli WL3 unter semianaeroben und anaeroben Bedingungen E. coli WL3- Stamm Butanol [mM] semianaerob Butanol [mM] anaerob E. coli WL3 + pUC19 [10 mM Butyrat] 0,03 --- E. coli WL3 + pUC19 [20 mM Butyrat] 0,01 --- E. coli WL3 + pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald [10 mM Butyrat] 0,11 0,41 E. coli WL3 + pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald [20 mM Butyrat] 0,71 --- Bei Wachstumsversuchen unter aeroben Bedingungen konnten weder E. coli HB101 noch E. coli WL3 mit dem Plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald 1-Butanol produzieren. 3.3. Synthese von 1-Butanol in E. coli mit artifiziellen Butanol-Synthese-Operons 3.3.1. Klonierung der artifiziellen Butanol-Synthese-Gene in den single-copy-Vektor pSB3C5 und Transformation in E. coli Zur weiteren Untersuchung der Butanol-Produktion wurden drei Fragmente mit den zur Butanol-Synthese nötigen Genen synthetisch erstellt, die von der Firma ATG:biosynthetics GmbH, Freiburg bezogen wurden. Diese Gene werden durch den Promoter Pptb des Phosphotransbutyrylase/Butyrat-Kinase-Operons kontrolliert. Für die Konstruktion der artifiziellen Butanol-Synthese-Plasmide erfolgte die Ligation der jeweiligen Fragmente in den single-copy-Vektor pSB3C5 und die Transformation in die E. coli-Stämme BL21 (DE3), DH5α, HB101, JM109, SURE®, WL3 und XL1-Blue. 3. Ergebnisse 80 Die Transformation in verschiedene E. coli-Stämme wurde durchgeführt, da sich bei der Synthese von Aceton in E. coli mit Enzymen aus C. acetobutylicum zeigte, dass die Produktion in unterschiedlichen E. coli-Stämmen deutlich variiert (Bermejo et al., 1998). In Abbildung 15 sind die fertigen Butanol-Synthese-Plasmide pSB3C5_UUMKS 1 (Abb. 15a), pSB3C5_UUMKS 2 (Abb. 15b) und pSB3C5_UUMKS 3 (Abb. 15c) dargestellt. Alle drei Plasmide beinhalten die Gene der Crotonase (crt), Butyryl-CoADehydrogenase (bcd), Elektronentransfer-Flavoproteine (etfB/A), 3-HydroxybutyrylCoA-Dehydrogenase (hbd), Thiolase (thlA) und Chloramphenicol-Resistenzkassette (catP). Während das Plasmid pSB3C5_UUMKS 1 die Gene der ButyraldehydDehydrogenase (ald) und Butanol-Dehydrogenase (bdhB) trägt, befindet sich auf dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 2 das Gen der Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase (adhE). Das dritte Plasmid pSB3C5_UUMKS 3 besitzt hingegen das Gen der zweiten bifunktionellen Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase (adhE2). a) b) EcoRI Sma I EcoRI Sma I bdhB adhE Pst I SalI ald Pptb Pst I Sal I Pptb Pptb pSB3C5_UUMKS 1 crt crt 12646 Bp Pptb pSB3C5_UUMKS 2 12521 Bp catP catP bcd bcd thlA thlA Pptb etfB etfA hbd Pptb etfB etfA hbd 3. Ergebnisse 81 c) EcoRI Sma I adhE2 PstI Sal I Pptb Pptb pSB3C5_UUMKS 3 12515 Bp crt catP bcd thlA Pptb etfB etfA hbd Abbildung 15: Plasmidkarten a) pSB3C5_UUMKS 1, b) pSB3C5_UUMKS 2 und c) pSB3C5_UUMKS 3 3.3.2. Wachstumsversuche von E. coli mit den artifiziellen ButanolSynthese-Operons Nachdem die Butanol-Synthese-Plasmide pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 sowie das Kontrollplasmid pGS20 in E. coli BL21 (DE3), DH5α, HB101, JM109, SURE®, WL3 und XL1-Blue transformiert waren, wurden Wachstumsversuche unter aeroben, semianaeroben und anaeroben Bedingungen durchgeführt. Das Einbringen des Kontrollplasmids pSB3C5 in E. coli war nicht möglich, da dieses Plasmid das Gen ccdB beinhaltet, dessen Genprodukt DNATopoisomerase II-Komplexe hemmt. Daher wurde das Plasmid pGS20 als Kontrolle mitgeführt, bei welchem das ccdB-Gen entfernt wurde. Die Kulturen wurden bei 37 °C in jeweils 100 ml TY-Medium (2.5.1.8.), TY-Medium mit 2 % Glucose und SD-8-Medium (2.5.1.4.) mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol gezüchtet. Die Zugabe von 2 % Glucose entspricht jeweils einer Konzentration von 111 mM. Für die Wachstumsversuche unter aeroben und semianaeroben Bedingungen wurden 500-ml-Erlenmeyerkolben, für Wachstumsversuche unter anaeroben Bedingungen wurden 500-ml-Kulturflaschen verwendet. Während des Wachstums wurde die optische Dichte (OD600nm) der Kulturen, der Glucose-Verbrauch und mitunter der pHWert der Medien bestimmt. Zudem wurden über den Verlauf des gesamten Wachstums Proben genommen und diese anschließend gaschromatographisch analysiert. 3. Ergebnisse 82 Nach gaschromatographischer Analyse konnten Butanol-Konzentrationen nicht nur in den E. coli-Stämmen, welche die Butanol-Synthese-Plasmide pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 trugen detektiert werden, sondern auch in den Stämmen, welche das Kontrollplasmid pGS20 oder kein Plasmid enthielten. Allerdings kann E. coli 1-Butanol weder als Metabolit noch als Endprodukt bilden. Jedoch konnte nachgewiesen werden (Kalscheuer et al., 2006), dass in "Bacto®" Trypton 1-Butanol enthalten sein kann, da dieses während der Herstellung als Extraktionsmittel verwendet wird. Bei gaschromatographischen Untersuchungen des TY-Mediums (2.5.1.8.) konnte daher ebenfalls 1-Butanol detektiert werden, da in diesem Medium große Mengen an "Bacto®" Trypton (16 g/l) enthalten sind. Daher wurde bei allen Analysen das Medium selbst (ohne Kultur von E. coli) als Leerwert mitgeführt, dessen Butanol-Konzentration bestimmt und schließlich von den detektierten Butanol-Konzentrationen mit den Butanol-Synthese-Plasmiden subtrahiert. 3.3.2.1. Wachstumsversuche von E. coli mit dem Kontrollplasmid pGS20 Nach Transformation des Kontrollplasmids pGS20 in die oben genannten E. coliStämme wurden Wachstumsversuche in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol unter aeroben, semianaeroben und anaeroben Bedingungen durchgeführt. In Tabelle 41 sind die während des Wachstumsverlaufs maximal detektierten Butanol-Konzentrationen zusammengefasst. Tabelle 41: Maximale Butanol-Konzentration [mM] von E. coli mit dem Kontrollplasmid pGS20 bei Wachstum in TY-Medium mit 2 % Glucose Plasmid pGS20 (aerob) pGS20 (semianaerob) pGS20 (anaerob) BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue 0,05 --- --- --- 0,04 0,03 0,03 --- 0,04 0,03 0,03 0,03 --- --- 0,04 0,03 0,05 0,02 0,02 0,02 --- 3. Ergebnisse 83 3.3.2.2. Synthese von 1-Butanol in TY-Medium Nach Transformation der artifiziellen Butanol-Synthese-Plasmide in die jeweiligen E. coli-Stämme wurden Wachstumsversuche in TY-Medium (2.5.1.8.) mit 15 µg/ml Chloramphenicol unter aeroben, semianaeroben und anaeroben Bedingungen durchgeführt. Abbildung 16 zeigt exemplarisch den Verlauf des Wachstums sowie die Konzentration an gebildetem 1-Butanol von E. coli BL21, DH5α, HB101, JM109, SURE®, WL3 und XL1-Blue mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 1 (Abb. 16a), pSB3C5_UUMKS 2 (Abb. 16b) bzw. mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 3 (Abb. 16c) in TY-Medium unter aeroben Bedingungen. Die unter semianaeroben und anaeroben Bedingungen erhaltenen Ergebnisse sind im Anhang dargestellt. a) OD600nm 10 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue 1 0,1 0 10 20 30 40 50 Zeit [h] 8 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 7 Butanol [mM] 6 5 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 4 3 2 1 0 0 10 20 30 Zeit [h] 40 50 3. Ergebnisse 84 b) OD600nm 10 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue 1 0,1 0 10 20 30 40 50 Zeit [h] 8 [Butanol] [Butanol] [Butanol] [Butanol] BL21 DH5 HB101 JM109 [Butanol] E. coli SURE® [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 7 Butanol [mM] 6 5 4 E. coli E. coli E. coli E. coli 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 Zeit [h] c) OD600nm 10 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue 1 0,1 0 10 20 30 Zeit [h] 40 50 3. Ergebnisse 85 7 [Butanol] [Butanol] [Butanol] [Butanol] BL21 DH5 HB101 JM109 [Butanol] E. coli SURE® [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue Butanol [mM] 6 5 4 3 E. coli E. coli E. coli E. coli 2 1 0 0 10 20 30 40 50 Zeit [h] Abbildung 16: Wachstum und Butanol-Konzentrationen von E. coli. a) pSB3C5_UUMKS 1, b) pSB3C5_UUMKS 2 und c) pSB3C5_UUMKS 3 in 100 ml TYMedium und 15 µg/ml Chloramphenicol unter aeroben Bedingungen In Abbildung 17 und Tabelle 42 sind die unter aeroben Bedingungen maximal detektierten Konzentrationen an gebildetem 1-Butanol von E. coli mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 sowie pSB3C5_UUMKS 3 in TY-Medium dargestellt. 8 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue Abbildung 17: Maximale Butanol-Konzentrationen von E. coli mit den ButanolSynthese-Operons bei Wachstum in TY-Medium unter aeroben Bedingungen 3. Ergebnisse 86 Tabelle 42: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 6,77 6,04 3,45 3,51 3,07 3,26 6,36 pSB3C5_UUMKS 2 4,58 6,02 4,76 3,49 2,85 7,19 3,34 pSB3C5_UUMKS 3 4,06 5,35 3,13 3,88 3,18 6,29 3,06 Unter aeroben Bedingungen wurden während der späten exponentiellen Phase des Wachstums von E. coli BL21 mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 1 maximal 6,77 mM 1-Butanol produziert. Bei E. coli WL3, welches das Plasmid pSB3C5-UUMKS 2 trägt, kam es während der frühen stationären Wachstumsphase zur Bildung von 7,19 mM 1-Butanol. 6,29 mM 1-Butanol konnten bei E. coli WL3 mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 3 während der mittleren stationären Wachstumsphase gemessen werden (Abb. 16, 17). In weiteren Versuchen konnten in TY-Medium unter aeroben Bedingungen maximal zwischen 2,85 und 7,19 mM 1-Butanol detektiert werden. 3.3.2.3. Synthese von 1-Butanol in TY-Medium mit 2 % Glucose Weitere Wachstumsversuche von E. coli mit den Butanol-Synthese-Operons erfolgten in TY-Medium mit 2 % Glucose als zusätzliche Energie- und Kohlenstoffquelle. In Abbildung 18 ist beispielhaft der Verlauf des Wachstums sowie die Konzentration an gebildetem 1-Butanol unter aeroben Bedingungen von E. coli BL21, DH5α, HB101, JM109, SURE®, WL3 und XL1-Blue mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 1 (Abb. 18a), pSB3C5_UUMKS 2 (Abb. 18b) sowie mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 3 (Abb. 18c) dargestellt. Der Wachstumsverlauf und die detektierten Butanol-Konzentrationen unter semianaeroben und anaeroben Bedingungen sind dem Anhang zu entnehmen. 3. Ergebnisse 87 a) 250 20 10 150 1 100 Glucose [mM] OD600nm 200 [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® 50 0,1 0 0 10 20 30 40 50 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue 60 Zeit [h] [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 6 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® Butanol [mM] 5 4 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [h] b) 20 200 10 180 140 120 1 100 80 60 40 0,1 20 0 10 20 30 Zeit [h] 8 40 50 60 Glucose [mM] OD600nm 160 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 3. Ergebnisse 88 8 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 7 Butanol [mM] 6 5 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [h] c) 220 20 200 10 180 140 120 1 100 80 Glucose [mM] OD600nm 160 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue 60 40 20 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [h] [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 8 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 7 Butanol [mM] 6 5 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [h] Abbildung 18: Wachstum und Butanol-Konzentrationen von E. coli. a) pSB3C5_UUMKS 1, b) pSB3C5_UUMKS 2 und c) pSB3C5_UUMKS 3 in 100 ml TYMedium mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol unter aeroben Bedingungen 3. Ergebnisse 89 Abbildung 19 und Tabelle 43 zeigen die unter aeroben Bedingungen maximal nachgewiesenen Konzentrationen an gebildetem 1-Butanol von E. coli mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 sowie pSB3C5_UUMKS 3 in TYMedium mit 2 % Glucose. 8 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE ® WL3 XL1-Blue Abbildung 19: Maximale Butanol-Konzentrationen von E. coli mit den ButanolSynthese-Operons bei Wachstum in TY-Medium mit 2 % Glucose unter aeroben Bedingungen Tabelle 43: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 3,83 4,95 4,54 4,93 5,27 4,67 5,13 pSB3C5_UUMKS 2 3,72 4,71 7,36 5,51 4,34 4,86 4,42 pSB3C5_UUMKS 3 3,93 4,69 5,23 5,51 4,89 6,80 4,88 E. coli SURE® produzierte mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 1 in TY-Medium mit 2 % Glucose unter aeroben Bedingungen maximal 5,27 mM 1-Butanol. Bei E. coli HB101 mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 2 konnten maximal 7,36 mM 1-Butanol detektiert werden. Zur Bildung von 6,80 mM 1-Butanol kam es bei E. coli WL3, welches das Plasmid pSB3C5-UUMKS 3 trägt (Abb. 18,19). Diese Konzentrationen von gebildetem 1-Butanol wurden während der mittleren stationären Phase des Wachstums von E. coli nachgewiesen. In weiteren Versuchen wurden maximal zwischen 3,72 und 7,36 mM 1-Butanol gebildet. 3. Ergebnisse 90 3.3.2.4. Synthese von 1-Butanol in TY-Medium mit 2 % Glucose (erneute Glucose-Zugabe beim Erreichen der stationären Phase) Um eventuell die Konzentration von gebildetem 1-Butanol zu steigern, wurden weitere Wachstumsversuche von E. coli mit den Butanol-Synthese-Operons in TY-Medium mit 2 % Glucose durchgeführt. Dabei wurde beim Erreichen der stationären Wachstumsphase nochmals Glucose zugegeben. Abbildung 20 zeigt den Verlauf des Wachstums sowie die gemessenen Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coliStämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1 (Abb. 20a), pSB3C5_UUMKS 2 (Abb. 20b) sowie mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 3 (Abb. 20c) unter anaeroben Wachstumsbedingungen. Die Ergebnisse der Wachstumsversuche von E. coli unter aeroben sowie semianaeroben Bedingungen sind im Anhang dargestellt. a) 2 240 220 1 OD600nm 180 160 140 120 100 80 0,1 60 0 20 40 60 80 Zeit [h] Glucose [mM] 200 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 14 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 12 Butanol [mM] 10 8 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 Zeit [h] 120 140 160 180 3. Ergebnisse 91 b) 2 260 240 OD600nm 200 180 160 140 120 Glucose [mM] 220 1 [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® 100 80 0,1 60 0 20 40 60 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue 80 Zeit [h] [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 14 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 12 Butanol [mM] 10 8 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Zeit [h] c) 2 260 240 OD600nm 200 180 160 140 120 100 80 0,1 60 0 20 40 Zeit [h] 14 60 80 Glucose [mM] 220 1 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 3. Ergebnisse 92 14 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 12 Butanol [mM] 10 8 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Zeit [h] Abbildung 20: Wachstum und Butanol-Konzentrationen von E. coli. a) pSB3C5_UUMKS 1, b) pSB3C5_UUMKS 2 und c) pSB3C5_UUMKS 3 in 100 ml TYMedium mit 2 % Glucose (sowie erneuter Glucose-Zugabe) und 15 µg/ml Chloramphenicol unter anaeroben Bedingungen Die während des anaeroben Wachstums von E. coli mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 maximal produzierten Butanol-Konzentrationen in TY-Medium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zufuhr) sind der Abbildung 21 bzw. der Tabelle 44 zu entnehmen. 14 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 12 10 8 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue Abbildung 21: Maximale Butanol-Konzentrationen von E. coli mit den ButanolSynthese-Operons bei Wachstum in TY-Medium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zugabe) unter anaeroben Bedingungen 3. Ergebnisse 93 Tabelle 44: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 10,03 8,52 9,40 8,83 9,73 10,46 8,84 pSB3C5_UUMKS 2 8,75 11,57 10,00 10,51 9,92 12,45 10,11 pSB3C5_UUMKS 3 7,92 12,90 11,00 8,38 9,04 11,55 10,05 Unter anaeroben Bedingungen produzierte E. coli WL3 mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 1 während der mittleren stationären Phase des Wachstums maximal 10,46 mM 1-Butanol. Bei E. coli WL3 mit dem Plasmid pSB3C5-UUMKS 2 kam es während der frühen stationären Wachstumsphase zur Bildung von 12,45 mM 1-Butanol. 12,90 mM 1-Butanol konnten bei E. coli DH5α mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 3 am Ende der stationären Wachstumsphase detektiert werden (Abb. 20, 21). In weiteren Versuchen wurden unter anaeroben Bedingungen maximal zwischen 7,92 und 12, 90 mM 1-Btanol gemessen. 3.3.2.5. Synthese von 1-Butanol in SD-8-Medium mit 2 % Glucose (erneute Glucose-Zugabe beim Erreichen der stationären Phase) Bei Wachstumsversuchen von verschiedenen E. coli-Stämmen mit den artifiziellen Butanol-Synthese-Operons in SD-8-Medium mit 2 % Glucose wurde beim Erreichen der stationären Wachstumsphase erneut Glucose zugegeben. In Abbildung 22 ist der Wachstumsverlauf sowie die Konzentration an gebildetem 1-Butanol der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1 (Abb. 22a), pSB3C5_ UUMKS 2 (Abb. 22b) und pSB3C5_UUMKS 3 (Abb. 22c) unter semianaeroben Bedingungen dargestellt. Weitere Wachstumsversuche wurden unter aeroben und anaeroben Bedingungen durchgeführt, wobei die Ergebnisse dem Anhang zu entnehmen sind. 3. Ergebnisse 94 a) 5 260 240 200 1 180 160 140 Glucose [mM] OD600nm 220 120 [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® 100 0,1 80 0 10 20 30 40 50 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue 60 Zeit [h] [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue Butanol [mM] 8 6 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 4 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Zeit [h] b) 5 400 OD600nm 300 1 250 200 Glucose [mM] 350 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue 150 100 0,1 50 0 10 20 30 Zeit [h] 40 50 60 [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 3. Ergebnisse 95 Butanol [mM] 8 6 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 4 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Zeit [h] c) 5 280 260 240 200 1 180 160 140 Glucose [mM] OD600nm 220 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue 120 100 80 0,1 60 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [h] [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue Butanol [mM] 8 6 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 4 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Zeit [h] Abbildung 22: Wachstum und Butanol-Konzentrationen von E. coli. a) pSB3C5_UUMKS 1, b) pSB3C5_UUMKS 2 und c) pSB3C5_UUMKS 3 in 100 ml SD-8Medium mit 2 % Glucose (sowie erneuter Glucose-Zugabe) und 15 µg/ml Chloramphenicol unter semianaeroben Bedingungen 3. Ergebnisse 96 Abbildung 23 und Tabelle 45 zeigen die unter semianaeroben Bedingungen maximal detektierten Konzentrationen an gebildetem 1-Butanol von E. coli mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 sowie pSB3C5_UUMKS 3 in SD-8-Medium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zufuhr beim Erreichen der stationären Phase). 8 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE ® WL3 XL1-Blue Abbildung 23: Maximale Butanol-Konzentrationen von E. coli mit den ButanolSynthese-Operons bei Wachstum in SD-8-Medium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zugabe) unter semianaeroben Bedingungen Tabelle 45: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 1,73 5,54 5,45 1,63 6,97 2,00 1,23 pSB3C5_UUMKS 2 2,03 5,74 7,22 7,27 6,52 2,81 1,72 pSB3C5_UUMKS 3 1,71 6,84 1,43 6,81 6,67 2,38 1,15 Unter semianaeroben Bedingungen produzierte E. coli SURE® mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 1 maximal 6,97 mM 1-Butanol. Während des Wachstums von E. coli JM109 mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 2 konnten maximal 7,27 mM 1-Butanol gemessen werden, wobei die Butanol-Produktion von E. coli DH5α mit dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 3 bei 6,84 mM lag (Abb. 22, 23). Die höchsten ButanolKonzentrationen von E. coli in SD-8-Medium mit 2 % Glucose konnten während der späten stationären Phase des Wachstums nachgewiesen werden. In weiteren Versuchen konnten unter semianaeroben Bedingungen maximal zwischen 1,15 und 7,27 mM 1-Butanol detektiert werden. 3. Ergebnisse 97 3.3.3. Klonierung der artifiziellen Butanol-Synthese-Gene in den E. coli/Clostridien-Schaukelvektor pIMP1 Um die Butanol-Produktion mit acetogenen Organsimen wie C. ljungdahlii zu untersuchen und das Einbringen der Butanol-Synthese-Plasmide in diesen Stamm zu ermöglichen, erfolgte eine Umklonierung der Butanol-Synthese-Gene aus dem Vektor pSB3C5 in den E. coli/Clostridien-Schaukelvektor pIMP1. Hierzu wurden die jeweiligen Insertionen (UUMKS 1, UUMKS 2 und UUMKS 3) über die eingebrachten Schnittstellen PstI und EcoRI aus dem single-copy-Vektor pSB3C5 herausgeschnitten, gereinigt und jeweils in den entsprechend geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pIMP1 ligiert. Vorerst erfolgte die Transformation der Butanol-SynthesePlasmide in die E. coli-Stämme BL21 (DE3), DH5α, HB101, JM109, SURE®, WL3 und XL1-Blue, um deren Funktionalität im Zwischenwirt E. coli zu testen. Der Nachweis der Plasmide erfolgte über Restriktionsverdaue mit dem Restriktionsenzym PvuI. 3.3.4. Wachstumsversuche von E. coli mit den artifiziellen ButanolSynthese-Operons Nach Transformation der Butanol-Synthese-Plasmide pIMP1_UUMKS 1, pIMP1_UUMKS 2 und pIMP1_UUMKS 3 sowie des Kontrollplasmids pIMP1 in die oben genannten E. coli-Stämme wurden Wachstumsversuche in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose als Energie- und Kohlenstoffquelle und mit 15 µg/ml Chloramphenicol in 500-ml-Erlenmeyerkolben bzw. 500-ml-Kulturflaschen durchgeführt. Die ButanolSynthese der jeweiligen E. coli-Stämme wurde unter aeroben, semianaeroben und anaeroben Bedingungen getestet. Über den Verlauf des gesamten Wachstums wurden Proben für gaschromatographische Analysen genommen sowie die optische Dichte (OD600nm) der Kulturen, der Glucose-Verbrauch und der pH-Wert der Medien bestimmt. 3.3.4.1. Wachstumsversuche von E. coli mit dem Kontrollplasmid pIMP1 Tabelle 46 zeigt die während des Wachstums von E. coli mit dem Kontrollplasmid pIMP1 maximal detektierten Butanol-Konzentrationen in TY-Medium mit 2 % Glucose unter aeroben, semianaeroben und anaeroben Bedingungen. 3. Ergebnisse 98 Tabelle 46: Maximale Butanol-Konzentration [mM] von E. coli mit dem Kontrollplasmid pIMP1 bei Wachstum in TY-Medium mit 2 % Glucose BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pIMP1 (aerob) 0,03 0,04 --- 0,04 0,04 --- 0,05 pIMP1 (semianaerob) 0,01 0,03 0,02 --- 0,02 0,04 0,04 --- 0,03 0,03 0,05 0,04 0,02 --- Plasmid pIMP1 (anaerob) 3.3.4.2. Synthese von 1-Butanol in TY-Medium mit 2 % Glucose Die Wachstumsversuche von E. coli mit den Butanol-Synthese-Operons wurden in TYMedium mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol unter aeroben, semianaeroben und anaeroben Bedingungen durchgeführt, um die Butanol-Produktion zu untersuchen. Abbildung 24 zeigt stellvertretend den Wachstumsverlauf sowie die Konzentration an gebildetem 1-Butanol von E. coli BL21, DH5α, HB101, JM109, SURE®, WL3 und XL1-Blue mit den Plasmiden pIMP1_UUMKS 1 (Abb. 24a), pIMP1_UUMKS 2 (Abb. 24b) und pIMP1_UUMKS 3 (Abb. 24c) unter semianaeroben Bedingungen. Die unter aeroben und anaeroben Bedingungen erhaltenen Ergebnisse sind dem Anhang zu entnehmen. a) 5 130 120 100 1 90 80 70 60 0,1 50 0 20 40 60 80 Zeit [h] 7 100 120 140 160 Glucose [mM] OD600nm 110 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 3. Ergebnisse 99 7 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 6 Butanol [mM] 5 4 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Zeit [h] b) 5 140 130 110 1 100 90 80 70 0,1 0 20 40 60 80 100 120 140 60 160 Zeit [h] Glucose [mM] OD600nm 120 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 7 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 6 Butanol [mM] 5 4 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 3 2 1 0 0 20 40 60 80 Zeit [h] 100 120 140 160 3. Ergebnisse 100 c) 140 5 130 110 1 100 90 80 70 0,1 0 20 40 60 80 100 120 140 60 160 Zeit [h] Glucose [mM] OD600nm 120 [OD600nm] E. coli BL21 [OD600nm] E. coli DH5 [OD600nm] E. coli HB101 [OD600nm] E. coli JM109 [OD600nm] E. coli SURE® [OD600nm] E. coli WL3 [OD600nm] E. coli XL1-Blue [Glucose] E. coli BL21 [Glucose] E. coli DH5 [Glucose] E. coli HB101 [Glucose] E. coli JM109 [Glucose] E. coli SURE® [Glucose] E. coli WL3 [Glucose] E. coli XL1-Blue 7 [Butanol] E. coli BL21 [Butanol] E. coli DH5 [Butanol] E. coli HB101 [Butanol] E. coli JM109 [Butanol] E. coli SURE® 6 Butanol [mM] 5 4 [Butanol] E. coli WL3 [Butanol] E. coli XL1-Blue 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Zeit [h] Abbildung 24: Wachstum und Butanol-Konzentrationen von E. coli. a) pIMP1_UUMKS 1, b) pIMP1_UUMKS 2 und c) pIMP1_UUMKS 3 in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol unter semianaeroben Bedingungen In Abbildung 25 und Tabelle 47 sind die unter semianaeroben Bedingungen maximal detektierten Butanol-Konzentrationen von E. coli mit den Plasmiden pIMP1_UUMKS 1, pIMP1_UUMKS 2 sowie pIMP1_UUMKS 3 in TY-Medium mit 2 % Glucose dargestellt. 3. Ergebnisse 101 7 pIMP1_UUMKS 1 pIMP1_UUMKS 2 pIMP1_UUMKS 3 6 Butanol [mM] 5 4 3 2 1 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue Abbildung 25: Maximale Butanol-Konzentrationen von E. coli mit den ButanolSynthese-Operons bei Wachstum in TY-Medium mit 2 % Glucose unter semianaeroben Bedingungen Tabelle 47: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pIMP1_UUMKS 1 6,34 4,39 5,36 4,27 4,59 5,81 4,95 pIMP1_UUMKS 2 4,76 5,74 3,79 4,58 4,69 5,56 5,35 pIMP1_UUMKS 3 4,25 3,62 6,40 4,82 5,18 6,19 5,27 Während des Wachstums von E. coli BL21 mit dem Plasmid pIMP1_UUMKS 1 konnten unter semianaeroben Bedingungen maximal 6,34 mM 1-Butanol gemessen werden. Bei E. coli DH5α mit dem Plasmid pIMP1_UUMKS 2 betrug die maximal detektierte Konzentration an 1-Butanol 5,74 mM. E. coli HB101, welches das Plasmid pIMP1_UUMKS 3 enthält, konnte 6,40 mM 1-Butanol produzieren (Abb. 24, 25). Die höchste Butanol-Konzentration konnte jeweils während der frühen stationären Phase des Wachstums nachgewiesen werden. In weiteren Versuchen konnten unter semianaeroben Bedingungen maximal zwischen 3,62 und 6,40 mM 1-Butanol detektiert werden. 3. Ergebnisse 102 3.4. Verstoffwechselung von 1-Butanol durch E. coli Wachstumsversuche von E. coli mit den Butanol-Synthese-Plasmiden lassen vermuten, dass der Organismus das synthetisierte 1-Butanol wieder aufnimmt und es anschließend verstoffwechselt. Um dies zu überprüfen, wurden Wachstumsversuche von E. coli HB101 in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose als zusätzliche Energie- und Kohlenstoffquelle unter aeroben Bedingungen bei 37 °C durchgeführt. Hierbei wurden der E. coli-Kultur verschiedene 1-Butanol Konzentrationen (10, 50, 100 und 200 mM) zugegeben. Der Wachstumsverlauf wurde verfolgt und anschließend die ButanolKonzentration im Medium gaschromatographisch bestimmt. Die Konzentration an 1-Butanol ist im folgenden Diagramm in [%] angegeben, wobei die zugegebenen Butanol-Konzentrationen zu Beginn als 100 % gewertet wurden. 20 [OD600nm] E. coli HB101 + 0 mM Butanol [OD600nm] E. coli HB101 + 10 mM Butanol 100 10 [OD600nm] E. coli HB101 + 50 mM Butanol [OD600nm] E. coli HB101 + 100 mM Butanol 60 1 40 Butanol [%] OD600nm 80 [OD600nm] E. coli HB101 + 200 mM Butanol [Butanol] E. coli HB101 + 10 mM Butanol [Butanol] E. coli HB101 + 50 mM Butanol [Butanol] E. coli HB101 + 100 mM Butanol [Butanol] E. coli HB101 + 200 mM Butanol 20 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [h] Abbildung 26: Wachstum von E. coli HB101 in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose und 10, 50, 100 und 200 mM 1-Butanol In Abbildung 26 ist zu erkennen, dass jeweils die Konzentration des zugegebenen 1-Butanols über den Verlauf des Wachstums von E. coli HB101 abnimmt. Zur Kontrolle, ob E. coli tatsächlich in der Lage ist, 1-Butanol aufzunehmen und um auszuschließen, dass das zugegebene 1-Butanol nicht verdunstet, wurden dieselben Konzentrationen an 1-Butanol nur in Medium unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Hier kam es nicht zur Abnahme der Butanol-Konzentration, sondern zu einem Anstieg der Konzentration im Medium. Die Zunahme an 1-Butanol während der Inkubationsdauer ist darauf zurückzuführen, dass zuerst das Wasser und nicht das zugegebene 1-Butanol verdunstet, was folglich die Butanol-Konzentration im Medium erhöht. E. coli ist folglich in der Lage, 1-Butanol zu verstoffwechseln. 3. Ergebnisse 103 3.5. Wachstum von E. coli in Gegenwart von 1-Butanol Um die Butanol-Toleranz von E. coli zu testen, wurden verschiedene ButanolKonzentrationen (10, 50, 100 und 200 mM) einer wachsenden E. coli HB101-Kultur während der frühen logarithmischen Wachstumsphase zugegeben. Die Wachstumsversuche wurden in TY-Medium mit 2 % Glucose als zusätzliche Energieund Kohlenstoffquelle durchgeführt. Über den Verlauf des gesamten Wachstums wurde die optische Dichte (OD600nm) bestimmt und das Wachstum mit einer Kultur verglichen, welcher kein Butanol zugegeben wurde. 20 [OD600nm] E. coli HB101 + 0 mM Butanol 10 [OD600nm] E. coli HB101 + 10 mM Butanol [OD600nm] E. coli HB101 + 50 mM Butanol [OD600nm] E. coli HB101 + 100 mM Butanol OD600nm [OD600nm] E. coli HB101 + 200 mM Butanol Zugabe von Butanol 1 0,1 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [h] Abbildung 27: Wachstum von E. coli HB101 in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose sowie verschiedenen Butanol-Konzentrationen Während bei Zugabe von 10 und 50 mM 1-Butanol nur ein geringer Effekt zu erkennen war und ungefähr dieselben Zelldichten erreicht wurden wie bei der Kultur ohne Butanol, war bei Zugabe von 100 und 200 mM 1-Butanol die Wachstumsrate um ca. 25 bzw. 50 % erniedrigt. 3. Ergebnisse 104 3.6. Klonierung und Expression der Cytochrom-P450Monooxygenase (CYP152A2) von C. acetobutylicum Da normalerweise molekularer Sauerstoff für die Funktion von Cytochrom-P450Monooxygenasen benötigt wird, sind diese Enzyme ausschließlich in aeroben Organismen zu vermuten. Durch Sequenzanalysen wurde aber ein Gen (CAC3330) in C. acetobutylicum DSM 792 (ATCC 824) gefunden, welches für eine P450Monooxygenase (CYP152A2) kodiert und im Folgenden als P450CLA bezeichnet wird (Nölling et al., 2001). P450CLA von C. acetobutylicum weist eine 57 %-ige Identität mit dem P450-Enzym (P450Bsß) von Bacillus subtilis (CYP152A1) auf. Hierbei handelt es sich um eine Wasserstoffperoxid-abhängige Fettsäure-Hydroxylase (Matsunaga et al., 1999; Lee et al., 2003). Da eine Sauerstoff- oder Wasserstoffperoxid-abhängige P450Monooxygenase auch im Metabolismus von C. acetobutylicum eine Rolle spielen könnte, sollten genauere Analysen Aufschluss über die Funktion dieses Enzyms bringen. Diese Arbeiten erfolgten in Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. V. B. Urlacher (Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf). Zur biochemischen Charakterisierung der Cytochrom-P450-Monooxygense von C. acetobutylicum DSM 792 erfolgte die Klonierung und Expression des für dieses Enzym kodierenden Gens in E. coli (Girhard et al., 2007). Über eine PCR mit den Oligodesoxynukleotiden "CAC3330-for-PstI" und "CAC3330-rev-SalI" (Tab. 5) wurde das für die Cytochrom-P450-Monooxygenase kodierende Gen CAC3330 von chromosomaler DNA aus C. acetobutylicum DSM 792 amplifiziert und anschließend in die Vektoren pDrive und pUC18 kloniert. Die fertigen Plasmide pDrive_P450 und pUC18_P450 wurden sequenziert und liegen fehlerfrei in E. coli XL2-Blue vor. Für weitere Analysen wurde das Gen CAC3330 über eine PCR mit den Oligodesoxynukleotiden 5′-GCTAGCTAGCATGTTACTAAAAGAAAATAC-3′ und 5′-CCGCTCGAGTTAAAGCTTTAGATTAATATTATC-3′ erneut amplifiziert, um neue Schnittstellen zu generieren, wobei das Plasmid pUC18_P450 als Matrize verwendet wurde. Anschließend wurde das PCR-Produkt in den Expressions-Vektor pET28a(+) kloniert und in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Das Gen CAC3330 wird hierbei durch den T7-Promoter kontrolliert (Girhard et al., 2007). Nach Überproduktion und Reinigung der P450-Monoxygenase wurde das Substratspektrum sowie die Produktbildung von P450CLA bestimmt. P450CLA bindet zahlreiche gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C8 bis C18, einige Fettsäureester sowie heteroaromatische und polyzyklische aromatische Verbindungen. 3. Ergebnisse 105 Zudem konnte gezeigt werden, dass das Enzym die Hydroxylierung von Fettsäuren (z. B. Laurin-, Myristin- und Palmitinsäure) katalysiert und hierbei Wasserstoffperoxid nutzt, um hydroxylierte (-OH) Fettsäuren zu produzieren. Da die Hydroxylierung bevorzugt an der α-Position erfolgt, kann das P450CLA-Enzym als Fettsäure-α-Hydroxylase bezeichnet werden. Jedoch war die Produktbildung nur in den ersten Minuten der Reaktion zu beobachten. Vermutlich führt die hohe Konzentration an H2O2 zu einer schnellen Inaktivierung des Enzyms, was zu einem Verlust der Aktivität führt (Girhard et al., 2007). In einem weiteren Versuch, welcher auf einem NADPH-basierenden Reaktionssystem beruht konnte gezeigt werden, dass es möglich ist H2O2 als Elektronendonor zu ersetzen und P450CLA Sauerstoff akzeptiert (Girhard et al., 2007). In diesem Fall wären Redoxpartner nötig, die die Elektronen für die Reaktion bereitstellen. In Frage kämen verschiedene Flavodoxine und eine Flavodoxin-Oxidoreduktase. Zur Identifizierung von möglichen Elektronentransfer-Partnern wurden die FlavodoxinGene CacFld1 (CAC0587) und CacFld2 (CAC3417) sowie das FlavodoxinOxidoreduktase-Gen CacFdR (CAC0196) über eine PCR mit den in Tabelle 5 aufgelisteten Oligodesoxynukleotiden von der chromosomalen DNA aus C. acetobutylicum ATCC 824 amplifiziert und jeweils in den Vektor pDrive kloniert. Die fertigen Plasmide pDrive_CAC0587, pDrive_CAC3417 und pDrive_CAC0196 wurden sequenziert und liegen fehlerfrei in E. coli HB101 vor. Anschließend wurden die Flavodoxin-Gene CAC0587 und CAC3417 über eine PCR mit den Oligodesoxynukleotiden 5′-GGATCCATGGTGAAAATAAACATAATTTATTGC3′ und 5′-GATCCTCGAGGCTATTTATAAGAGCCTT-3′ bzw. mit den Oligodesoxynukleotiden 5′-GGTCCATGGGCATGAAAAGTTTAATAG-3′ und 5′-GGCGCTCGAGTTTTTCTAAATACTTTGTTA-3′ erneut amplifiziert und schließlich zur Expression in E. coli BL21 (DE3) in den Vektor pET28a(+) kloniert. Das Flavodoxin-Oxidoreduktase-Gen CAC0196 wurde über eine PCR mit den Oligodesoxynukleotiden 5′-GGTCCCATGGGCATGAAAAGTTTAATAG-3′ und 5′-GATCGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGGGCATTATTTCT-3′ amplifiziert, in den Vektor pET16b kloniert und anschließend in E. coli BL21 (DE3) exprimiert (Malca et al., 2010). Nach Überproduktion und Reinigung der Flavodoxine CacFld1 (CAC0587) und CacFLd2 (CAC3417) erfolgte die Charakterisierung dieser Enzyme, um zu untersuchen, ob es sich hierbei um mögliche Elektronentransfer-Partner für die Cytochrom-P450-Monooxygenase von C. acetobutylicum handelt. 3. Ergebnisse 106 Die Flavodoxin-Reduktase (FdR) aus E. coli wurde als Redoxpartner verwendet, da die Flavodoxin-Oxidoreduktase CacFdR (CAC0196) von C. acetobutylicum nicht in funktioneller Form gereinigt werden konnte. Anhand verschiedener Experimente geht hervor, dass ein Elektronentransfer von NADPH zur P450-Monooxygenase über FdR und CacFld1 erfolgt. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Hydroxylase-Aktivität der Cytochrom-P450-Monooxygenase für Myristinsäure mit CacFld1 um das 17-fache stieg. Diese Ergebnisse konnten somit FdR und CacFld1 als ElektronentransferPartner für die P450-Monooxygenase identifizieren. Jedoch konnte der Elektronentransfer von reduziertem FdR nur für CacFld1 nachgewiesen werden. Auch wenn kein Elektronentransfer von NADPH-reduziertem FdR auf das Flavodoxin CacFld2 nachgewiesen werden konnte, kann dieses trotzdem nicht als Redoxpartner für P450CLA ausgeschlossen werden (Malca et al., 2010). 3.7. Verwendung des "ClosTron® Gene Knockout Systems" zur Inaktivierung von CAC3330 in C. acetobutylicum Zur Herstellung von "Knockout"-Mutanten fand das "ClosTron® Gene Knockout System" Anwendung. Durch gezieltes Ausschalten des für die Cytochrom-P450Monooxygenase kodierenden Gens CAC3330 und sich daran anschließenden Wachstumsstudien sollten weitere Erkenntnisse über die Funktion der CytochromP450-Monooxygenase in C. acetobutylicum ATCC 824 gewonnen werden. Das "ClosTron® Gene Knockout System" (2.8.) bietet die Möglichkeit, clostridielle Gene hoch effizient, gezielt und dauerhaft auszuschalten (Frazier et al., 2003). Die Funktionsweise basiert auf demselben Prinzip wie das für E. coli konzipierte "TargeTron™ Gene Knockout System". Allerdings wurde das "ClosTron® Gene Knockout System" speziell für die Anwendung in Clostridien angepasst und funktioniert im Gegensatz zur konventionellen DNA-Transposon-Mutagenese sequenzspezifisch und nicht zufällig. Hierbei ist das sog. mobile Gruppe-II-Intron aus Lactococcus lactis von essentieller Bedeutung. Gruppe-II-Introns sind RNAs mit autokatalytischer Funktion (Ribozyme) und mobile Retroelemente, die spezifisch in Ziel-DNA-Sequenzen integrieren können. Das Gruppe-II-Intron kann mit Hilfe des LtrA-Proteins in das Zielgen über einen "Retrohoming"-Prozess integrieren, was zu einem gezielten Ausschalten von Genen führt (Zhong et al., 2003). Zur Herstellung sog. "Knockout"-Mutanten mittels des "ClosTron® Gene Knockout Systems" findet der speziell für Clostridien angepasste Vektor pMTL007 (Abb. 28) Anwendung. 3. Ergebnisse 107 Abbildung 28: Plasmid pMTL007 Bestandteil des "ClosTron® Gene Knockout Systems", das mittels Gruppe-II-Introns zum spezifischen und permanenten Ausschalten clostridieller Gene verwendet wird. Für die spezifische Integration eines Gruppe-II-Introns in ein bestimmtes Zielgen werden die Sequenzbereiche IBS, EBS2 und EBS1d der Gruppe-II-Intron-DNA mit Hilfe spezifischer Oligodesoxynukleotide und einer Ein-Schritt-SOE-PCR der Zielsequenz angepasst. Über die Schnittstellen HindIII und BsrGI wird der ca. 350-Bp-große und dem Zielgen angepasste Sequenzabschnitt in den Vektor pMTL007 kloniert, der den restlichen Teil des Gruppe-IIIntrons beinhaltet. Pfac: mit IPTG induzierbarer fac-Promoter; ErmRam: modifizierte ermB-Resistenzkassette; td: Gruppe-I-Intron zur Zerstörung des Erythromycin-Resistenzgens; ltrA: Gen für das LtrAProtein; pCB102: Replikon aus C. beijerinckii; catP: Gen für die ChloramphenicolAcetyltransferase; ColE1: Replikationsursprung des Plasmids in E. coli; lacI: Gen für Lac-Repressor; oriT: "origin of transfer", wichtig für den Transfer des Plasmids durch Konjugation von pMTL007 in den Zielorganismus. Weitere Erläuterungen sind dem Text zu entnehmen. Die Expression des auf dem Plasmid pMTL007 kodierten Gruppe-II-Introns kann von einem fac-Promoter aus mit IPTG induziert werden. Dessen Sequenz stammt aus dem Operator des E. coli lacZ-Operons und der Promotersequenz der Ferredoxin-Gene aus C. pasteurianum. Ebenso steht das ltrA-Gen unter Kontrolle dieses Promoters, welches für das IEP (Intron Encoded Protein) oder auch LtrA-Protein genannt, kodiert. 3. Ergebnisse 108 Im Gegensatz zum "TargeTron® Gene Knockout System" befindet sich das Gen für das LtrA-Protein im Vektor pMTL007 außerhalb des Gruppe-II-Introns (liegt stromabwärts des Gruppe-II-Introns). Dadurch wird verhindert, dass nach erfolgreicher Integration des Gruppe-II-Introns ins Zielgen das Intron wieder herausgeschnitten wird. An dessen Stelle im Gruppe-II-Intron befindet sich eine ErmRAM-Kassette, die eine Selektion positiver Integrationsmutanten über eine Erythromycin-Resistenz ermöglicht. Der Vektor pMTL007 beinhaltet neben dem bereits erwähnten IPTGinduzierbaren fac-Promoter und der modifizierten ermB_Resistenzkassette ein pCB102-basierendes Replikon für die Replikation des Plasmids in C. acetobutylicum (Heap et al., 2007). Der Integrationsvorgang beginnt, nach Induktion des fac-Promoters mit IPTG, mit der Transkription des Gruppe-II-Introns in eine Vorläufer-RNA sowie mit der Transkription und Bildung des LtrA-Proteins. Das synthetisierte LtrA-Protein bindet die VorläuferRNA und unterstützt deren Faltung in eine katalytisch aktive Form. Nach der autokatalytischen Spleißreaktion entsteht eine lassoartige Struktur der RNA. Das LtrAProtein und die speziell gespleißte Intron-RNA bilden einen so genannten RNPKomplex (RNA-Protein-Komplex), der bestimmte chromosomale Sequenzelemente erkennt und nun in die Ziel-DNA des Wirts integrieren kann. Dabei bindet das LtrAProtein zuerst vier unveränderliche Nukleotide der chromosomalen DNA (Abb. 29). Durch die Gyrase-Aktivität des LtrA-Proteins wird die doppelsträngige DNA lokal entwunden und die Intron-RNA kann mit drei kurzen, spezifischen Regionen (insgesamt 15 Nukleotide) der genomischen DNA paaren. Diese drei kurzen Sequenzelemente der DNA-Zielsequenz ("Intron Binding Sites" 1 und 2 (IBS1 und IBS2) und δ′) werden hierbei von den komplementären Sequenzelementen in der Intron-RNA (("Exon Binding Sites" 1 und 2 (EBS1 und EBS2) und δ) erkannt (Mohr et al., 2000). Die Intron-RNA integriert daraufhin über eine reverse Spleißreaktion in die Ziel-DNA, in den oberen Strang und an definierter Stelle. Durch die EndonukleaseAktivität des LtrA-Proteins wird der gegenüberliegende Strang gespalten. An dessen 3'-Ende synthetisiert das LtrA-Protein durch die Reverse-Transkriptase-Aktivität die zur Intron-RNA komplementäre cDNA. Durch wirtseigene Reparatursysteme wird die cDNA vollständig in das Wirtsgenom integriert, was den Integrationsprozess abschließt (Lambowitz und Zimmerly, 2004). Durch Insertion des Fragmentes in die Zielsequenz wird mit hoher Wahrscheinlichkeit die Funktion des Zielgens zerstört. 3. Ergebnisse 109 Die Integration kann zudem nur erfolgreich sein, wenn die Intron-RNA komplementäre Sequenzelemente zum gewünschten Integrationsort trägt. Mit Hilfe eines ComputerAlgorithmus können die Erkennungssequenzen des LtrA-Proteins und der Intron-RNA im Zielgen gesucht und durch eine einfache Ein-Schritt-SOE-PCR an die Zielsequenz angepasst werden. Für eine effiziente Insertion der Intron-RNA dürfen die Sequenzen nur in geringem Maße variieren (Zhong et al., 2003). Die Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH bietet hierfür eine über eine Internetseite (http://www.sigmagenosys.com/targetron/) erreichbare Suchfunktion und automatische "Primer"Generierung an. Abbildung 29: Schema der Integration des Gruppe-II-Introns in das Chromosom Das LtrA-Protein erkennt spezifische Nukleotide auf dem Chromosom (grau unterlegt). Die komplementären Sequenzen der Intron-RNA (EBS2, EBS1, δ) binden an die DNA. Die IntronRNA inseriert autokatalytisch in den oberen Strang der DNA und an definierter Stelle (Insertion). Das LtrA-Protein spaltet den komplementären DNA-Strang (Spaltung) und beginnt mit der cDNA-Synthese. Der DNA-Doppelstrang wird durch wirtseigene Mechanismen wiederhergestellt. Durch eine modifizierte ermB-Resistenzkassette wird die effiziente Selektion der Integrationsmutanten ermöglicht. Bei der auf dem sog. RAM-("retrotranspositionactivated selectable marker") System basierenden Selektion wurde das für die Erythromycin-Resistenz kodierende Gen mit eigenem Promoter in umgekehrter Orientierung in das Gruppe-II-Intron kloniert. Dieses Resistenzgen wird sehr effizient von dem selbst-spleißenden Gruppe-I-Intron td inaktiviert, das wiederum in der gleichen Orientierung wie das Gruppe-II-Intron in die Resistenzkassette eingefügt wurde. Die Transkription des RAM-Systems durch den Promoter der Resistenzkassette ergibt demnach ein nicht funktionelles Gruppe-I-Intron td, das sich deshalb nicht aus dem Transkript herausschneiden kann. 3. Ergebnisse 110 Das Resistenzgen bleibt folglich inaktiviert. Erst nach Induktion des fac-Promoters und Transkription des Gruppe-II-Introns wird auch das Gruppe-I-Intron td in richtiger Orientierung abgelesen. Dieses schneidet sich daraufhin aus dem Resistenzgen aus und aktiviert die Antibiotikum-Resistenz. Eine dauerhafte Resistenz kann außerdem nur durch die Integration des Gruppe-II-Introns in das Chromosom entstehen. Das "ClosTron® Gene Knockout System" wurde im Rahmen dieser Arbeit dazu verwendet, um das Gen CAC3330, welches für eine Cytochrom-P450Monooxygenase in C. acetobutylicum kodiert, durch Integration eines Gruppe-IIIntrons auszuschalten. Anschließend sollten in weiterführenden Experimenten die Folgen der Integration ins Zielgen untersucht werden, um die Funktion der CytochromP450-Monooxygenase in C. acetobutylicum genauer zu analysieren. Mit Hilfe eines Computer-Algorithmus konnten die Erkennungssequenzen des LtrAProteins und der Intron-DNA im Zielgen gesucht werden. Für das Cytochrom-P450Monooxygenase-Gen wurden zwei mögliche Insertionsstellen ausgewählt. Ein durch das Computerprogramm ermittelter sog. "E-Wert" gab dabei die Wahrscheinlichkeit einer Integration des Gruppe-II-Introns an ausgewählter Stelle an. Nach Herstellerangaben ist eine Integration nur bis zu einem Wert von < 0,5 effizient. Für die Wahl der Integrationsstellen wurden deshalb Insertionsstellen mit den niedrigsten "E-Werten" in einem Bereich von ca. 500 Bp im Gen ausgewählt. Anschließend wurden die EBS/IBS-Sequenzen im Gruppe-II-Intron von pMTL007 auf die gewählten Insertionsstellen in CAC3330 an Position 122/123 und 400/401 angepasst. Allerdings war eine Integration nur für die Insertionsstelle 400/401 erfolgreich. Hier lag der berechnete "E-Wert" bei 0,283 und als Integrationsrichtung des Gruppe-II-Introns wurde "sense" angegeben. Im Folgenden ist der Integrationsort (400/401) im Zielgen angegeben und in Tabelle 5 sind die zur Generierung einer Integartionsmutante in C. acetobutylicum verwendeten Oligodesoxynukleotide aufgelistet. Integrationsort: CAC3330 5′-GCTCCTTTTGTTGGTGCGAGGGTACGAAAA - Intron - GATTTTTTATGGAAT-3′ Durch eine Ein-Schritt-SOE-PCR mit den entsprechenden Oligodesoxynukleotiden IBS, EBS2 und EBS1d (Tab. 5) konnten die Erkennungssequenzen des Introns dem gewünschten Zielgen angepasst werden. Die Ein-Schritt-SOE-PCR wurde hierbei analog zu 2.8.1. durchgeführt. 3. Ergebnisse 111 Da der hier verwendete Vektor pMTL007 bereits ein inseriertes DNA-Fragment trug, musste dieses vor der Ligation mit dem veränderten Intron-Fragment durch einen Restriktionsverdau mit den Enzymen HindIII und BsrGI und einer anschließenden Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt und der linearisierte Vektor aus dem Gel gereinigt werden (2.8.2.). Nach Restriktionsspaltung des nach der Ein-Schritt-SOEPCR erhaltenen DNA-Fragmentes mit HindIII und BsrGI und der Dephosphorylierung des Vektors (2.8.2.) wurde nach vorheriger Konzentrationsbestimmung das ca. 350-Bp-große PCR-Fragment über die genannten Schnittstellen in den Vektor pMTL007 ligiert (2.8.3.). Nach Transformation in kompetente E. coli XL1-Blue-Zellen erfolgte eine Plasmidisolierung (2.6.3.3. und 2.6.3.4.), wobei die präparierten Plasmide durch Restriktionsspaltung (2.6.9.1.) und Sequenzierung (2.6.11.) kontrolliert wurden. Um die als mutationsfrei sequenzierten Plasmide in C. acetobutylicum transformieren zu können, wurde der Vektor pMTL007 mit den nach Wunsch modifizierten Intronsequenzen zuerst in E. coli XL1-Blue MRF′ (pANS1) und E. coli ER2275 (pANS1) in vivo methyliert (2.8.4.). Nach erfolgreicher Transformation der methylierten Plasmide in C. acetobutylicum konnten nach Inkubation einzelne Kolonien gepickt und die Induktion der Integration analog zu 2.8.5. durchgeführt werden. Nach Transformation von C. acetobutylicum mit dem gezielt in der Intron-DNA-Sequenz veränderten Plasmid pMTL007 erfolgte der Nachweis der Integration über eine PCR (2.8.6.). Die Integration des Gruppe-II-Introns in das Zielgen CAC3330 war für die Insertionsstelle 400/401 erfolgreich. In darauf folgenden Wachstumsversuchen sollten die Folgen der Integration des Gruppe-II-Introns ins Zielgen analysiert werden, wodurch evtl. Änderungen in der Membranzusammensetzung hervorgerufen wurden. Es wurde das Wachstum von C. acetobutylicum mit dem der Integrationsmutante, welche das Plasmid pMTL007::CAC3330_400/401 trägt, in Gegenwart von 1-Butanol getestet. Hierbei wurden verschiedene Butanol-Konzentrationen (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4 und 5 % (v/v)) zu einer wachsenden C. acetobutylicum-Kultur während der exponentiellen Wachstumsphase zugegeben. Über den Verlauf des gesamten Wachstums wurde die optische Dichte (OD600nm) bestimmt und das Wachstum der Integrationsmutante mit dem des Wildtyps von C. acetobuytlicum bei verschiedenen Butanol-Konzentrationen miteinander verglichen. 3. Ergebnisse 112 Während bei Zugabe von 0,5 % (v/v) (2,7 mM) und 1 % (v/v) (5,5 mM) 1-Butanol kein Effekt zu erkennen war, waren die Wachstumsraten von C. acetobutylicum Wildtyp und Integrationsmutante bei Butanol-Konzentrationen von 1,5-5 % (v/v) (8,2-27,3 mM) etwas geringer als bei den Kulturen, denen kein 1-Butanol zugegeben wurde. Am Ende des Wachstums erreichte die Integrationsmutante etwas geringere Zelldichten als der Wildtyp von C. acetobuylicum. Abbildung 30 zeigt exemplarisch den Verlauf des Wachstums der beiden Kulturen in CGM mit 5 % (v/v) (27,3 mM) 1-Butanol. 10 [OD600nm] Wildtyp ohne Zugabe von Butanol [OD600nm] Wildtyp + 5 % (v/v) Butanol (27,3 mM) [OD600nm] Mutante ohne Zugabe von Butanol OD600nm [OD600nm] Mutante + 5 % (v/v) Butanol (27,3 mM) Zugabe von Butanol 1 0,1 0 10 20 30 40 50 60 Zeit [h] Abbildung 30: Wachstum von C. acetobutylicum ATCC 824 Wildtyp und Integrationsmutante in 50 ml CGM und 2,5 µg/ml Clarithromycin sowie 5 % (v/v) 1-Butanol (27,3 mM) 4. Diskussion 113 4. Diskussion Der Einsatz von Biokraftstoffen auf der Basis nachwachsender Rohstoffe, welche auf chemischem oder biotechnologischem Wege hergestellt werden können, gewinnt zunehmend an Bedeutung. In Zeiten stetig steigender Rohölpreise (145 US$ pro Barrel im Juli 2008) infolge der Limitierung von Erdölreserven stellen Biokraftstoffe eine Alternative zu fossilen Treibstoffen dar. Zudem führt die Verbrennung fossiler Treibstoffe zu einem Anstieg des Treibhausgases CO2 in der Atmosphäre und folglich zu globaler Erwärmung. Die Nutzung von Biokraftstoffen aus erneuerbarer Biomasse könnte einer weiteren Zunahme Klima-schädigender Gase entgegenwirken und die Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen bzw. Rohölressourcen minimieren. Da der weltweite Energieverbrauch bis zum Jahr 2030 vermutlich um 57 % steigen wird (Noack et al., 2009) und fossile Ressourcen limitiert sind, wächst das Interesse an Biokraftstoffen. Die Biokraftstoffe Bioethanol und Biodiesel werden bereits großindustriell hergestellt. Bioethanol wird hierbei hauptsächlich in Ländern wie den Vereinigten Staaten und Brasilien produziert, während einige europäische Staaten wie Deutschland, Frankreich und Italien auch große Mengen an Biodiesel herstellen. Weltweit wurden im Jahr 2007 insgesamt etwa 50 Milliarden Liter Bioethanol und 7 Milliarden Liter Biodiesel produziert (Tab. 48; Noack et al., 2009). Bioethanol wird vor allem durch Fermentation von Zucker oder Stärke durch Saccharomyces cerevisiae hergestellt. In diesem Fall handelt es sich um den größten biotechnologischen Prozess. Jedoch verursacht die Nutzung von Bioethanol im Vergleich zu Biobutanol in herkömmlichen Motoren einige Schwierigkeiten (siehe unten). Biodiesel wird chemisch aus pflanzlichen Ölen und tierischen Fetten erzeugt (Alkoholyse). Die Fettsäure-Komponenten werden zu Methylester (FAME, Fettsäuremethylester) umgewandelt, wobei Glycerin als Nebenprodukt entsteht. Bioethanol und Biodiesel zählen zu den Biotreibstoffen der ersten Generation. BtL-(Biomass to Liquid)-Kraftstoffe gehören der zweiten Generation an. Hierbei handelt es sich um Treibstoffe, die aus Biomasse hergestellt werden. In einem ersten Verfahrensschritt zur Produktion von BtL-Treibstoffen, wird Synthesegas hergestellt, im zweiten Schritt wird über die so genannte "FischerTropsch-Synthese" der flüssige Kraftstoff erzeugt. 4. Diskussion 114 Table 48: Weltweite Produktion von Biokraftstoffen im Jahr 2007 Bioethanol Land [Milliarden [Milliarden Liter] Gallonen] USA 24548 6485 Brasilien 19000 5019 Deutschland 394 104 China 1772 486 Frankreich 578 153 Kanada 799 211 Spanien 348 92 Italien 60 16 Thailand 300 79 Kolumbien 284 75 Österreich keine Daten verfügbar Polen 155 41 Indien 201 53 Portugal keine Daten verfügbar Großbritannien 20 5 Schweden 70 18 Australien 98 26 Niederlande 14 4 Griechenland keine Daten verfügbar Tschechien 33 9 Dänemark keine Daten verfügbar Slowakei 30 9 Türkei 60 16 Litauen 20 5 Ungarn 30 9 Pakistan 35 9 Finnland 0 0 Rumänien keine Daten verfügbar Peru 30 8 Lettland 18 5 Argentinien 20 5 Paraguay 20 5 Slowenien keine Daten verfügbar Bulgarien keine Daten verfügbar Irland keine Daten verfügbar Andere 587 155 Gesamt 49524 13102 Biodiesel [Milliarden [Milliarden Liter] Gallonen] 1859 491 keine Daten verfügbar 2543 672 keine Daten verfügbar 767 203 keine Daten verfügbar 148 39 319 84 keine Daten verfügbar keine Daten verfügbar 235 62 70 19 keine Daten verfügbar 154 41 132 35 55 15 keine Daten verfügbar 75 20 88 23 54 14 75 20 41 11 keine Daten verfügbar 23 6 6 2 keine Daten verfügbar 34 9 32 8 keine Daten verfügbar 6 2 keine Daten verfügbar keine Daten verfügbar 10 3 8 2 3 1 keine Daten verfügbar 6737 1782 gesamte Produktion [Milliarden Liter] 26407 19000 2937 1772 1345 799 496 379 300 284 235 225 201 154 152 125 98 89 88 87 75 71 60 43 36 35 34 32 30 24 20 20 10 8 3 587 56261 [Milliarden Gallonen] 6976 5019 776 486 356 211 131 100 79 75 62 60 53 41 40 33 26 24 23 23 20 20 16 11 11 9 9 8 8 7 5 5 3 2 1 155 14884 Zunehmend an Bedeutung gewinnt der Einsatz von Butanol als Biokraftstoff, da es im Vergleich zu Bioethanol einige Vorteile aufweist. Biobutanol kann in reiner Form in herkömmlichen Motoren genutzt oder in jeder beliebigen Konzentration mit normalem Benzin gemischt werden (www.butanol.com), da es sehr ähnliche Eigenschaften zu Benzin aufweist. 4. Diskussion 115 Ethanol kann hingegen nur bis zu einem Mischungsverhältnis von maximal 85 % zugegeben werden (Dürre, 2007; Noack et al., 2009). Biobutanol ist nicht korrosiv und absorbiert kein Wasser, wodurch die Phasentrennung des Butanol/Benzin-Gemisches verhindert wird. Zudem zeichnet sich Biobutanol durch einen geringeren Dampfdruck und eine höhere Energiedichte aus, was die Handhabung vereinfacht und zu höherer Laufleistung führt. Die Herstellung von Butanol als Biokraftstoff erfolgt ebenfalls über chemische oder biotechnologische Verfahren. Auf chemischem Wege wird Butanol hauptsächlich über die Hydroformylierung von Propen mit einer daran anschließenden Hydrierung hergestellt. Aufgrund zu hoher Kosten und der Abhängigkeit von Erdölressourcen steigt jedoch das Interesse an der mikrobiellen Produktion von Butanol aus erneuerbarer Biomasse über die ABE-Fermentation. Die Synthese von Butanol stellt den volumenmäßig größten biotechnologischen Prozess nach der EthanolFermentation dar. Bereits im Jahr 1862 beschrieb der französische Forscher Louis Pasteur die mikrobielle Butanol-Produktion durch Vibrion butyrique (Pasteur, 1862), wobei es sich vermutlich um eine Mischkultur handelte. Wenig später gelang es Albert Fitz, einen Butanol-produzierenden Organismus in Reinkultur zu isolieren. Dabei handelte es sich um Bacillus butylicus (Fitz, 1876; 1877; 1878; 1882). Zu Beginn des 20. Jahrhunderts isolierten Martinus Beijerinck und Sergei Winogradski weitere Reinkulturen wie Granulobacter saccharobutyricum, Amylobacter butylicus und Bacillus orthobutylicus (McCutchan und Hickey, 1954; Ross, 1961; Dürre und Bahl, 1996). All diese beschriebenen Organismen gehören vermutlich der Gattung der Clostridien an. Einige Clostridien wie C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharoperbutylacetonicum und C. saccharobutylicum sind in der Lage, 1-Butanol als Fermentationsprodukt zu bilden. Weitere Butanol-Produzenten sind die Organismen Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, welches früher ebenfalls den Clostridien zugeordnet wurde (Collins et al., 1994) und Butyribacterium methylotrophicum. Tabelle 49 gibt einen Überblick über die verschiedenen Mikroorganismen, die fähig sind, 1-Butanol zu produzieren. Es handelt sich in diesem Zusammenhang ausschließlich um anaerobe Organismen, wovon die meisten der Gattung Clostridium angehören (Abb. 31). 4. Diskussion 116 Tabelle 49: Mikrobielle Butanol-Produzenten Genus Species Referenz Butyribacterium methylotrophicum Grethlein et al., 1991 Clostridium acetobutylicum Keis et al., 2001 George et al., 1983 McCoy et al., 1926 aurantibutyricum George et al., 1983 beijerinckii Keis et al., 2001 George et al., 1983 butyricum Zoutberg et al., 1989 cadaveris George et al., 1983 carboxidivorans Liou et al., 2005 chauvoei Cortiñas et al., 1994 Brooks et al., 1976 McClung und McCoy, 1935 felsineum pasteurianum Harris et al., 1986 George et al., 1983 puniceum Holt et al., 1988 roseum McCoy und McClung, 1935 saccharobutylicum Keis et al., 2001 saccharoperbutylacetonicum Keis et al., 2001 septicum Brooks et al., 1976 sporogenes George et al., 1983 tetanomorphum Gottwald et al., 1984 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum Freier-Schröder et al., 1989 4. Diskussion 117 Abbildung 31: Phylogenetische Verwandtschaft zwischen den bekannten mikrobiellen Butanol-Produzenten anhand ihrer 16s rRNA-Gensequenzen. Das Diagramm wurde mit dem "Ribosomal Database Project (RDP)" erstellt. (http://rdp.cme.msu.edu/; Cole et al., 2007) Während der Mechanismus der Butanol-Synthese bei einigen Organismen noch nicht erforscht ist (Grethlein et al., 1991; Brügger et al., 2007), ist dieser bei Clostridien bereits bekannt. Am besten untersucht ist C. acetobutylicum. Das gesamte Genom wurde sequenziert (Nölling et al., 2001) und die am Stoffwechsel beteiligten Enzyme sowie die entsprechenden Gene schon identifiziert und biochemisch charakterisiert (Jones und Woods, 1986; Dürre und Bahl, 1996; Dürre, 2005; 2007; 2008; Noack et al., 2009). In C. acetobutylicum sind die zur Lösungsmittelbildung nötigen Gene sowohl auf dem Bakterienchromosom (3,94 MBp) als auch auf dem Megaplasmid pSOL1 (192 kBp) lokalisiert. C. acetobutylicum zeichnet sich durch einen biphasischen Stoffwechsel aus (Abb. 32; Jones und Woods, 1986; Dürre und Bahl, 1996; Dürre 2005; 2007; 2008; Noack et al., 2009). Bei der Fermentation zucker- oder stärkehaltiger Substrate werden während der exponentiellen Wachstumsphase hauptsächlich die organischen Säuren Acetat und Butyrat sowie CO2 und H2 gebildet. In dieser so genannten acidogenen Wachstumsphase werden zudem geringe Mengen Ethanol, Acetoin und unter spezifischen Wachstumsbedingungen auch Lactat gebildet. Aufgrund der Säurebildung während der Fermentation sinkt der externe pH. Allerdings sind anaerobe Bakterien nicht in der Lage, den internen pH konstant zu halten, was dazu führt, dass dieser parallel zum externen pH abnimmt. 4. Diskussion 118 Hierbei ist der interne pH um etwa eine Einheit höher als der externe pH (Gottwald und Gottschalk, 1985; Huang et al., 1985; Dürre et al., 1988). Ab einem externen pHWert von 4,5 liegen beträchtliche Mengen an undissoziierten Säuren vor, welche über die Zellwand ins Cytoplasma diffundieren können. Dort können sie dann wieder in das entsprechende Salz und Protonen dissoziieren. Dies würde den Zusammenbruch des Protonengradienten bewirken, welcher für Energiekonservierung und Transportvorgänge essentiell ist und somit zum Zelltod führen. C. acetobutylicum ist jedoch in der Lage, den Zusammenbruch des Protonengradienten zu verhindern, indem dieser Organismus die Säureproduktion am Ende der exponentiellen Wachstumsphase reduziert und den Metabolismus auf Lösungsmittelbildung umstellt ("Shift"). Im Übergang zur stationären Phase werden die zuvor gebildeten Säuren zum Teil wieder aufgenommen, und es beginnt die Synthese von Aceton und 1-Butanol (Solventogenese). Infolge der Umwandlung von Säuren in Lösungsmittel steigt der pH wieder an. Diese Lösungsmittel, insbesondere 1-Butanol, sind in höheren Konzentrationen für C. acetobutylicum-Zellen ebenso toxisch und führen dazu, dass die Fluidität der Zellmembran erhöht wird (Ingram, 1976; Vollherbst-Schneck et al., 1984; Baer et al., 1987; 1989) und andere Membranproteine wie Transporter (Moreira et al., 1981; Bowles und Ellefson, 1985; Ounine et al., 1985) oder ATPasen (Terracciano und Kashket, 1986) inhibiert werden. Durch die Umstellung auf die Lösungsmittelproduktion gewinnt die Zelle ausreichend Zeit, um die Endosporenbildung zu starten, wodurch ein langzeitiges Überleben gewährleistet wird. Die wichtigsten Kohlenstoffquellen für C. acetobutylicum sind Stärke und Zucker. Die Verwendung von Stärke als Substrat ist dagegen von Nachteil, da sie beim Hitzesterilisieren geliert und dann beim Erkalten stabile Oligomere bildet, welche den enzymatischen Abbau erschweren (Ezeji et al., 2005a). Bei der Verwertung von Zuckern durch C. acetobutylicum werden diese durch das Phosphoenolpyruvatabhängige Phosphotransferasesystem in die Zelle aufgenommen, wobei Glucose über die Glykolyse (Embden-Meyerhof-Parnas-Weg) zu Pyruvat abgebaut wird. Die Umwandlung von Pyruvat zu Acetyl-CoA wird durch die Pyruvat:FerredoxinOxidoreduktase katalysiert (Meinecke et al., 1989). Acetyl-CoA stellt hierbei das Ausgangsintermediat für die Butanol-Synthese in C. acetobuylicum dar. Zunächst erfolgt die Kondensation von zwei Molekülen Acetyl-CoA an dem Enzym Thiolase ThlA zu Acetacetyl-CoA und dessen Reduktion. Acetacetyl-CoA wird durch die 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase Hbd zu 3-Hydroxybutyryl-CoA reduziert. Davon wird durch die Crotonase Crt Wasser abgespalten und Crotonyl-CoA wird daraufhin durch die Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd zu Butyryl-CoA umgewandelt (Abb. 32). 4. Diskussion 119 Das erste Enzym, welches für die Solventogenese benötigt wird, ist die AcetacetylCoA:Acetat/Butyrat-Coenzym A-Transferase (CoA-Transferase) CtfA/B. Diese wandelt die organischen Säuren Acetat und Butyrat zu Acetyl-CoA und Butyryl-CoA um. Butyryl-CoA wird schließlich durch die bifunktionelle Butyraldehyd-/ButanolDehydrogenase AdhE (bzw. Aad) zu Butyraldehyd und dann zu 1-Butanol reduziert. Alternativ erfolgt die Umwandlung von Butyryl-CoA zu Butyraldehyd über die Butyraldehyd-Dehydrogenase Ald aus C. beijerinckii. Die Reduktion von Butyraldehyd zu 1-Butanol kann auch durch die beiden Butanol-Dehydrogenasen BdhA/B (bzw. BdhI/II) katalysiert werden (Abb. 32). Dabei besitzt das Genprodukt BdhB (bzw. BdhII) eine 46-fach höhere Aktivität und Spezifität mit Butyraldehyd als mit Acetaldehyd. BdhA (bzw. BdhI) hingegen weist nur eine 2-fach höhere Aktivität gegenüber Butyraldehyd auf (Welch et al., 1989; Petersen et al., 1991; Walter et al., 1992). Abbildung 32: Schema des Metabolismus von C. acetobutylicum. Die Reduktion von Butyryl-CoA zu Butyraldehyd kann auch durch die Butyraldehyd-Dehydrogenase Ald aus C. beijerinckii katalysiert werden. 4. Diskussion 120 Die Thiolase ThlA aus C. acetobutylicum (Stim-Herndon et al., 1995) wurde bereits charakterisiert. Bei diesem Enzym handelt es sich um ein Tetramer aus vier identischen Untereinheiten mit einer molekularen Masse von jeweils 44 kDa (Wiesenborn et al., 1988). Die Thiolase ist ein ubiquitär in Pro- und Eukaryoten vorkommendes Enzym, wobei zwischen abbauenden und biosynthetischen Thiolasen unterschieden wird (Meng und Li, 2006). Biosynthetische Thiolasen katalysieren die Umwandlung von zwei Molekülen Acetyl-CoA zu Acetacetyl-CoA (Claisen-Reaktion) und somit den ersten Schritt des Butanol-Synthese-Weges (Abb. 32). In C. acetobutylicum konnte zusätzlich noch eine weitere Thiolase (ThlB) nachgewiesen werden, wobei sich das thlB-Gen auf einem polycistronischen Operon befindet (Winzer et al., 2000). Gene für zwei verschiedene Thiolasen konnten auch in C. kluyveri (Hartmanis und Stadtman, 1982; Hartmanis und Sliwkowski, 1985) und C. pasteurianum (Berndt und Schlegel, 1975; Meng und Li., 2006) nachgewiesen und charakterisiert werden, während über die Thiolase von C. beijerinckii noch wenig bekannt ist. Die Gene für die Crotonase Crt, Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd und die 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase Hbd bilden zusammen mit den Elektronentranfer-Flavoproteinen EtfB und EtfA in C. acetobutylicum eine Transkriptionseinheit ("Cluster") und befinden sich auf dem so genannten bcs-Operon (Butyryl-CoA-Synthese) (Boynton et al., 1996). Diese Enzyme katalysieren in C. acetobutylicum die Bildung von Butyryl-CoA aus Acetacetyl-CoA. Das Gen crt aus C. acetobutylicum, welches für die Crotonase mit einer molekularen Masse von 28,2 kDa kodiert, ist 13 Bp stromaufwärts des bcd-Gens lokalisiert. Für die Aktivität der Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd sind die Elektronentransfer-Flavoproteine EtfB/A essentiell (Inui et al., 2007). etfB kodiert für ein 27,2 kDa-Protein und befindet sich auf dem bcs-Operon 17 Bp stromabwärts von bcd. 37 Bp stromabwärts von etfB wurde das Gen etfA identifiziert, welches für ein Protein mit einer molekularen Masse von 36,1 kDa kodiert. Das Gen für die 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase Hbd, ein 30,5 kDa-Protein, ist 143 Bp stromabwärts von etfA vorzufinden (Boynton et al., 1996). Das adhE-Gen aus C. acetobutylicum, welches für die bifunktionelle Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase kodiert, bildet zusammen mit den Genen der beiden Untereinheiten der Acetacetyl-CoA:Acetat/Butyrat-Coenzym A-Transferase (CoA-Transferase) (ctfA/B) das so genannte sol-Operon (für "solvents") (Fischer et al., 1993). Dieses Operon ist auf dem Megaplasmid pSOL1 lokalisiert (Cornillot et al., 1997). 4. Diskussion 121 Das entsprechende Enzym AdhE (bzw. Aad) zeichnet sich durch zwei funktionelle Bereiche aus, eine N-terminale Aldehyd-Dehydrogenase-Domäne und eine C-terminale Alkohol-Dehydrogenase-Domäne. Das Protein weist eine molekulare Masse von 95,5 kDa auf und besitzt eine hohe Identität von 56 % bzw. Homologie von 75 % zu der multifunktionellen AdhE von E. coli (Fischer et al., 1993). Wie wichtig das Enzym AdhE für die Butanol-Bildung ist, konnte durch einige Experimente gezeigt werden (Sauer und Dürre 1993). Die Inaktivierung des adhE-Gens führte zu einer deutlich geringeren Butanol-Produktion in C. acetobutylicum. Eine Lösungsmittelnegative Mutante war nach Transformation des adhE-Gens wieder in der Lage, Butanol zu produzieren (Nair und Papoutsakis, 1994; Green und Bennett, 1996) Zusätzlich besitzt C. acetobutylicum eine zweite bifunktionelle Butyraldehyd-/ButanolDehydrogenase AdhE2 (Fontaine et al., 2002), welche eine 66 %-ige Identität sowie eine 81 %-ige Homologie zu AdhE aufweist und ebenfalls über eine N-terminale Aldehyd- und eine C-terminale Alkohol-Dehydrogenase-Domäne verfügt. Allerdings wird diese nur in alkohologenen Kulturen von C. acetobutylicum bei Wachstum auf reduzierten Substraten, wie einer Mischung aus Glycerin und Glucose (Fontaine et al., 2002), oder durch Zugabe von Reduktionsmitteln wie Methylviologen (Rao und Mutharasan, 1986; 1987) bei neutralem pH gebildet. Diese Kulturen produzieren jedoch kein Aceton mehr, sondern nur noch Ethanol und 1-Butanol. Bei Überproduktion von AdhE in C. acetobutylicum konnte eine NAD+-abhängige Butyraldehyd- und Acetaldehyd-Dehydrogenase-Aktivität sowie eine NADH-abhängige Butanol- und minimale Ethanol-Dehydrogenase-Aktivität gemessen werden (Nair et al., 1994). Nach Reinigung wies das Enzym eine spezifische ButyraldehydDehydrogenase-Aktivität von 0,06 U/mg auf, jedoch keine Butanol-DehydrogenaseAktivität (Thormann, 2001). Eine heterologe Überproduktion von AdhE in E. coli resultierte in einem nahezu inaktiven Protein (Nair et al., 1994; Lorenz, 1997). Nachdem in E. coli AdhE durch die sekundäre Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase AdhE2 von C. acetobutylicum ersetzt wurde, stieg die Butanol-Produktion deutlich von 4,2 mM auf 16,2 mM (Inui et al., 2007). AdhE2 besitzt eine ähnliche molekulare Masse wie AdhE (94 kDa), ist ebenfalls NAD+- bzw. NADH-abhängig und zeigt auch nach heterologer Überproduktion und Reinigung vollständige Aktivität. Die spezifische Butyraldehyd-Dehydrogenase-Aktivität beträgt 0,74 U/mg Dehydrogenase-Aktivität 0,18 U/mg (Fontaine et al., 2002). und die Butanol- 4. Diskussion 122 Das adhE2-Gen ist in einem monocistronischen Operon etwa 47 kBp entfernt von adhE auf dem Megaplasmid pSOL1 lokalisiert (Fontaine et al., 2002). Die Verwendung von adhE2 anstelle von adhE bei Konstruktion eines Butanol-Synthese-Plasmids könnte eventuell zur Produktionsstamm führen. Steigerung der Butanol-Synthese im jeweiligen Die Gene bdhA und bdhB befinden sich auf dem Genom von C. acetobutylicum direkt nebeneinander, bilden aber jeweils ein monocistronisches Operon. Während bdhA schon in der frühen Wachstumsphase induziert wird, erfolgt die Expression von bdhB erst in der Lösungsmittelphase (Feustel et al., 2004; Alsaker und Papoutsakis, 2005). In Kombination mit der Spezifität der jeweiligen Enzyme (siehe oben) lässt sich darauf schließen, dass BdhA hauptsächlich zur Ethanol-Bildung beiträgt und BdhB an der Butanol-Bildung beteiligt ist. Zudem konnte in der Genomsequenz von C. acetobutylicum noch eine weitere potentielle NADH-abhängige ButanolDehydrogenase CAC3392 gefunden werden (Nölling et al., 2001). Dieses Enzym hat eine Identität von 38 % und eine Homologie von 59 % zu BdhA bzw. BdhB, wurde jedoch noch nicht näher untersucht. BdhA und BdhB (bzw. BdhI und BdhII) weisen zueinander eine Identität von 73 % sowie eine Homologie von 88 % auf. Bei beiden Enzymen handelt es ich um Homodimere aus 42 kDa-Untereinheiten (Walter et al., 1992). In beiden Fällen war die Reinigung bereits erfolgreich, wobei Zink als Co-Faktor benötigt wird. Mit Butyraldehyd als Substrat und NADH + H+ als Co-Substrat weist BdhB eine spezifische Aktivität von 7,1 U/mg sowie ein pH-Optimum zwischen pH 5,56 auf, mit NADPH + H+ hingegen beträgt die Aktivität 2,6 U/mg und das Optimum liegt ca. bei pH 8 (Welch et al., 1989). Die Aktivität der Rückreaktion ist 50-fach niedriger. Der Km-Wert mit Butyraldehyd als Substrat beträgt für BdhA 3,6 mM und für BdhB 1416 mM (Welch et al., 1989; Petersen et al., 1991). In der Genomsequenz von C. beijerinckii konnte ein Gen identifiziert werden, welches ebenfalls die Reduktion von Butyryl-CoA zu Butyraldehyd katalysiert. Das Genprodukt weist eine Identität von 66 % und eine Homologie von 81 bzw. 83 % zu AdhE bzw. AdhE2 von C. acetobutylicum auf und konnte bereits erfolgreich für die ButanolProduktion in Saccharomyces cerevisiae eingesetzt werden (Steen et al., 2008). Das ald-Gen von C. beijerinckii, welches für die Butyraldehyd-Dehydrogenase kodiert, befindet sich anstelle des entsprechenden Gens von C. acetobutylicum im sol-Operon. Zudem ist auch das Gen für die Acetacetat-Decarboxylase Adc Teil des sol-Operons. Dieselbe Anordnung findet sich auch in C. saccharobutylicum und C. saccharoperbutylacetonicum (Toth et al., 1999). 4. Diskussion 123 Das Ald-Enzym wurde bereits aus den C. beijerinckii-Stämmen NRRL B592 (Yan und Chen, 1990) und NRRL B593 (Toth et al., 1999) und aus C. saccharobutylicum NRRL B643 (Palosaari und Rogers, 1988; damals trug dieser Organismus noch die Bezeichnung C. acetobutylicum B643) gereinigt und charakterisiert. Alle drei Enzyme sind Homodimere aus ca. 55 kDA-Untereinheiten und nutzen bevorzugt Butyryl-CoA als Substrat, wobei aber auch Acetyl-CoA umgesetzt werden kann. Keines der Enzyme verfügt über eine Alkohol-Dehydrogenase-Aktivität. Als Co-Substrat kann entweder NADH + H+ oder mit geringerer Aktivität auch NADPH + H+ genutzt werden. Das Ald-Enzym aus C. beijerinckii wurde schon für die Butanol-Produktion in E. coli, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae genutzt (Donaldson et al., 2007). Als Substrate zur fermentativen Biokraftstoff-Herstellung mit C. acetobutylicum oder mit C. beijerinckii, C. saccharobutylicum und C. saccharoperbutylacetonicum (Jones und Keis, 1995; Keis et al., 2001) dienen Melassen aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr und Getreide wie Mais (Ezeji et al., 2005b). Zwar gelten Biokraftstoffe aus nachwachsenden Rohstoffen als umweltfreundlich, jedoch führt die steigende Nachfrage an Biokraftstoffen sowohl zu steigenden Preisen für Nahrungsmittel als auch zur Verteuerung der Biokraftstoff-Produktion. Folglich ergibt sich durch die Verwendung von Nutzpflanzen für die industrielle Fermentation eine Konkurrenz zur Lebensmittelbranche. Dementsprechend stieg in den letzten Jahren der Preis für bestimmte Nahrungsmittel, der jahrelang relativ stabil geblieben ist, enorm an (Abb. 6). So sorgten die steigenden Nahrungsmittelpreise in ärmeren Ländern wie Mexiko und Haiti für Proteste und Unruhen, da Grundnahrungsmittel wie Reis oder Mais für viele Menschen unbezahlbar wurden. Nicht nur aufgrund des bestehenden Ernährungsproblems steht die Produktion von Biokraftstoffen aus Nutzpflanzen in der Kritik. Auch infolge des steigenden Absatzes für Biokraftstoffe wird weltweit ein höherer Anteil an Ackerflächen für den Anbau der entsprechenden Substrate bereitgestellt. Daher wurden bereits Fermentationen mit alternativen Substraten wie Süßkartoffeln, Kartoffeln, Topinambur (Marchal et al., 1985), Molke (Maddox et al., 1993), Apfelester (Voget et al., 1985) und weiteren Substraten durchgeführt (Dürre, 1998; Ezeji et al., 2005b). Eine zusätzliche Alternative bieten Wassermelonen, welche ebenfalls schon erfolgreich als Substrat zur Fermentation eingesetzt wurden (http://www.chemie.de/news/d/105331). Dennoch steht die Verwendung dieser Substrate ebenfalls im direkten oder indirekten Wettbewerb zum Lebensmittelmarkt und die Butanol-Ausbeute ist mit einigen Substraten deutlich geringer. Folglich bieten diese Alternativen keine dauerhafte Lösung. 4. Diskussion 124 Eine weitere Möglichkeit würde darin bestehen die Butanol-Synthese-Gene aus C. acetobutylicum in einen Organismus einzubringen, der in der Lage ist, sehr einfache und im Überfluss vorhandene Substrate zu verwerten, der leicht zu handhaben ist und keine allzu anspruchsvollen Wachstumsbedingungen hat. Zudem sollten die verwendeten Substrate kostengünstig sein, nicht in Konkurrenz zur Lebensmittelindustrie stehen und nicht auf fossilem Ursprung beruhen. Weiterhin müsste der Organismus auf den jeweiligen Substraten effektiv wachsen können und ausreichende Intermediat- und Produktmengen bilden, welche den Ausgangsstoff für die Butanol-Synthese darstellen. Dies sollte mit einer möglichst geringen Anzahl an eingebrachten Genen bzw. Enzymen von C. acetobutylicum geschehen. Wichtig ist auch, dass der Organismus eine hohe Toleranz gegenüber 1-Butanol aufweist und dieses nicht verstoffwechseln kann. Geeignet wären Organismen, die zu C. acetobutylicum nahe verwandt sind und deren Genomsequenz bereits bekannt ist. Die so genannten acetogenen Organismen (zur Übersicht: Drake, 1994; Drake et al., 2006; Imkamp und Müller, 2007) können autotroph auf im Überfluss vorhandenen gasförmigen Substraten wie CO2 + H2 oder auch auf CO (Wood, 1991) sowie auf Methanol oder Formiat (Diekert und Wolfarth, 1994) wachsen. CO stellt in diesem Fall den Hauptbestandteil von Synthesegas (50-60 % CO, 30-45 % H2, 2-5 % CO2) dar, welches preiswert und relativ einfach auf verschiedene Arten herzustellen ist. Am häufigsten findet die Kohlevergasung Anwendung, bei der Wasserdampf über heiße Kohlen geleitet wird. Es kann aber auch durch chemisches Recycling von Plastik oder durch Verschwelung von Biomasse sowie städtischen Abfällen produziert werden (Weißermel und Arpe, 2003). Jährlich werden etwa 53,3 Millionen m3 Synthesegas in entsprechenden Anlagen hergestellt (Halmann und Steinfeld, 2006). Je nach Herstellungsart enthält Synthesegas allerdings relativ viel CO2, Schwefelgase (Schwefelwasserstoff und Carbonylsulfid) und Teer (Weißermel und Arpe, 2003). Acetogene Bakterien sind dagegen jedoch sehr tolerant (Vega et al., 1990; Bredwell et al., 1999; Ragauskas et al., 2006). Auch einige Clostridien (Drake und Küsel, 2005) gehören zu dieser inhomogenen Gruppe aus 21 Gattungen (Imkamp und Müller, 2007; Drake et al., 2006). Aufgrund der nahen Verwandtschaft (Abb. 33) sollte es daher möglich sein, die bereits identifizierten Butanol-Synthese-Gene aus C. acetobutylicum (Dürre, 2005) in acetogene Organismen wie C. ljungdahlii, C. aceticum oder Acetobacterium woodii einzubringen und zu exprimieren. 4. Diskussion 125 Abbildung 33: Phylogentische Verwandtschaft von C. acetobutylicum zu verschiedenen Acetogenen anhand von 16s rRNA-Gensequenzen. Das Diagramm wurde mit dem "Ribosomal database Project (RDP)" erstellt. (http://rdp.cme.msu.edu/; Cole et al., 2007) 4. Diskussion 126 Die verschiedenen C1-Substrate, wie Kohlenmonoxid (CO), Kohlendioxid plus Wasserstoff (CO2 + H2), Methanol und Formiat werden über den "(Reduktiven) AcetylCoA-Weg" bzw. "Wood-Ljungdahl-Weg" (in Anerkennung an Harland G. Wood und Lars G. Ljungdahl für die Aufklärung der meisten beteiligten Enzyme im Modellorganismus Moorella thermoacetica) (Abb. 34) zu dem zentralen Intermediat Acetyl-CoA umgewandelt. Acetyl-CoA steht dann sowohl für den Anabolismus, also zur Bildung von Zellmasse, als auch für den Katabolismus, folglich zur Energiekonservierung durch Bildung von Acetat und teilweise auch anderen Produkten zur Verfügung. Abbildung 34: "Acetyl-CoA-Weg" bzw. "Wood-Ljungdahl-Weg" (Müller, 2003; mod.) 4. Diskussion 127 Nach dem Einbringen und der Expression der zur Butanol-Synthese nötigen Gene bzw. Enzyme aus C. acetobutylicum in einen acetogenen Organismus sollte es ausgehend von Acetyl-CoA möglich sein, 1-Butanol zu produzieren (Abb. 32). Hierzu wurde bereits ein Butanol-Synthese-Plasmid (pSOBPptb) mit den benötigten Genen wie der Thiolase ThlA, 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase Hbd, Crotonase Crt, Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd, Butyraldehyd-Dehydrogenase AdhE und der Butanol-Dehydrogenase BdhA konstruiert (Hujer, unveröffentlicht). Die Elektronentransfer-Flavoproteine EtfB/A aus C. acetobutylicum sind aber auf diesem Plasmid nicht vorhanden, welche jedoch für die Aktivität der Butyryl-CoADehydrogenase Bcd essentiell sind (Inui et al., 2007). Aufgrund dessen sollte die Transformation des Butanol-Synthese-Plasmids in einen nahen verwandten Organismus von C. acetobutylicum erfolgen, der Elektronentransfer-Flavoproteine mit möglichst hoher Identität zu EtfB/A von C. acetobutylicum aufweist, um die Funktion der fehlenden Elektronentransfer-Flavoroteine zu übernehmen. Zwar sind Elektronentransfer-Flavoproteine weit verbreitet (Tsai und Saier, 1995) und auch in E. coli nachgewiesen worden, allerdings sind deren Homologien zu den Elektronentransfer-Flavoproteinen von C. acetobutylicum nur sehr gering. Folglich konnte nach dem Einbringen des Butanol-Synthese-Plasmides pSOBPptb in E. coli keine Butanol-Produktion festgestellt werden. Dennoch wurden die eingebrachten Butanol-Synthese-Gene vermutlich exprimiert, da in E. coli WL3 geringe Mengen an Ethanol nachgewiesen werden konnten. Dies ist vermutlich auf eine unspezifische Reaktion der plasmidkodierten Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase AdhE und Butanol-Dehydrogenase BdhA zurückzuführen. Elektronentransfer-Flavoproteine mit hoher Identität kommen in einigen Clostridien sowie in Moorella thermoacetica vor. C. ljungdahlii besitzt zudem mehrere Paare an Elektronentransfer-Flavoproteinen, die eine hohe Identität zu EtfB/A von C. acetobutylicum aufweisen und somit die Funktion der fehlenden ElektronentransferFlavoproteine auf dem Butanol-Synthese-Plasmid übernehmen könnten. In vorangegangenen Arbeiten konnte bereits bewiesen werden, dass es nach dem Einbringen des Butanol-Synthese-Plasmids pSOBPptb in C. ljungdahlii möglich war, 1-Butanol zu produzieren. Bei Verwendung von Fructose als Substrat konnten maximal 2 mM Butanol detektiert werden und bei autotrophem Wachstum auf Synthesegas ca. 1 mM Butanol. Anschließend sank die Butanol-Konzentration im Medium wieder stark ab, wobei gezeigt werden konnte, dass der Wildtyp von C. ljungdahlii in Verbindung mit einer anderen Energie- und Kohlenstoffquelle in der Lage ist, 1-Butanol zu Butyrat zu verstoffwechseln (Köpke, 2009). 4. Diskussion 128 Zwar sind die Butanol-Konzentrationen in C. ljungdahlli nach dem Einbringen des Butanol-Synthese-Plasmides pSOBPptb nur gering, dennoch scheint C. ljungdahlli ein geeigneter Produktionsstamm zu sein. Zudem wird dieser Organismus bereits von der BRI Energy, LLC und Bioengineering Resources, Inc. für die industrielle Herstellung von Bioethanol aus Hausmüll verwendet (http://www.brienergy.com; Gaddy, 2000). Wie C. acetobutylicum gehört auch C. ljungdahlii neben C. ragsdalei, C. drakei und C. scatalogenes der Clostridium-Gruppe I an (Collins et al., 1994). Diese Organismen wachsen sehr effektiv auf CO, wobei C. ljungdahlii das beste Wachstum aufweist (tD = 3,8 h; Henstra et al., 2007). Um die Butanol-Produktion in C. ljungdahlii zu steigern, wurde schon mit der Optimierung des Butanol-Synthese-Plasmides pSOBPptb begonnen (Köpke, 2009). Hierzu sollen die entdeckten Haarnadelstrukturen vor bdhA und adhE entfernt werden, da diese die Transkription der Gene signifikant abschwächen. Folglich werden nur geringe Mengen der Butyraldehyd- und Butanol-Dehydrogenase gebildet, welche vermutlich nicht ausreichen, um die vollständige Umwandlung des gebildeten ButyrylCoA zu 1-Butanol zu katalysieren. Stattdessen wird das nicht verbrauchte Butyryl-CoA möglicherweise von C. ljungdahlli zu Butyrat umgewandelt, welches im Laufe der Fermentation mit dem Plasmid pSOBPptb ebenfalls entsteht. Die Entfernung der Haarnadelstrukturen könnte folglich zur Steigerung der Butanol-Produktion führen und eventuell die Bildung des Nebenproduktes Butyrat verhindern. Es wurde bereits mit der Klonierung zur Entfernung der Haarnadelstruktur begonnen, jedoch konnte das Plasmid aufgrund immer wieder auftretender Mutationen nicht fertig gestellt werden (Köpke, 2009). In der vorliegenden Arbeit sollte ein weiteres Butanol-Synthese-Plasmid konstruiert werden und durch Verwendung von alternativen Genen bzw. Enzymen zur Optimierung der Butanol-Produktion beitragen. Auf dem Butanol-Synthese-Plasmid pSOBPptb befinden sich die Gene crt, bcd und hbd. Durch die 3-Hydroxybutyryl-CoADehydrogenase erfolgt die Umwandlung von Acetacetyl-CoA zu 3-Hydroxybutyryl-CoA (Abb. 32) Dieses wird anschließend über eine Crotonase und eine Butyryl-CoADehydrogenase zu Butyryl-CoA umgewandelt. Die jeweiligen Gene sind in C. acetobutylicum in einem Operon lokalisiert (Boynton et al., 1996), wobei sich auf diesem Operon auch die Gene der Elektronentransfer-Flavoproteine befinden, welche aber auf dem Butanol-Synthese-Plasmid pSOBPptb fehlen. 4. Diskussion 129 Da die Elektronentransfer-Flavoproteine allerdings für die Aktivität von Bcd essentiell sind und durch das Einbringen von EtfB/A die Butanol-Ausbeute gesteigert werden könnte, wurden diese von chromosomaler DNA aus C. acetobutylicum amplifiziert und sollten anschließend zusammen mit den Genen crt, bcd und hbd in den Vektor pUC18 eingebracht werden (Abb. 10a). Die Synthese von 1-Butanol erfolgt durch die Umwandlung von Butyryl-CoA über die Butyraldehyd- und Butanol-Dehydrogenase (Abb. 32). Die entsprechenden Gene der bifunktionellen Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase AdhE und der ButanolDehydrogenase BdhA aus C. acetobutylicum befinden sich auf dem ButanolSynthese-Plasmid pSOBPptb. Beim Versuch, ein weiteres Butanol-Synthese-Plasmid zu konstruieren, wurde anstelle des adhE-Gens aus C. acetobutylicum das ald-Gen aus C. beijerinckii, welches für eine Butyraldehyd-Dehydrogenase kodiert und die Umwandlung von Butyryl-CoA zu Butyraldehyd katalysiert, in den Vektor pUC19 eingebracht. Zusätzlich wurde in diesem Plasmid das Gen der ButanolDehydrogenase BdhA gegen BhdB aus C. acetobutylicum ausgetauscht, da es aufgrund des Expressionsverhaltens und der Spezifität der jeweiligen Enzyme dafür spricht, dass BdhA hauptsächlich zur Ethanol-Bildung beiträgt und BdhB für die Butanol-Bildung verantwortlich ist. Des Weiteren trägt der Vektor pUC19 das für die Thiolase A kodierende Gen thlA, welche die Kondensation von zwei Molekülen AcetylCoA zu Acetacetyl-CoA katalysiert (Abb. 10b). Für die Konstruktion des optimierten Butanol-Synthese-Operons wurden die entsprechenden Gene (crt, bcd, etfB/A, hbd, thlA, bdhB, ald) von der chromosomalen DNA aus C. acetobutylicum DSM 792 (ATCC 824) und C. beijerinckii NCIMB 8052 amplifiziert. Die Butanol-Synthese-Gene unter Kontrolle des Promoters Pptb des Phosphotransbutyrylase/Butyrat-Kinase-Operons von C. acetobutylicum sollten anschließend in E. coli in den Vektoren pUC18 und pUC19 sukzessive zusammengefügt und dann in den E. coli/Clostridien-Schaukelvektor pIMP1 bzw. pIMP1oriTori2 kloniert werden. Die vollständige Konstruktion eines optimierten Butanol-Synthese-Operons (Abb. 10a/b, 11) war allerdings nicht möglich, da nach Transformation in E. coli immer wieder Mutationen auftraten, welche die Fertigstellung der Plasmide verhinderten. Eine schrittweise Klonierung in den Vektor pUC19 war für die Gene der Thiolase (thlA), Butanol-Dehydrogenase (bdhB) und ButyraldehydDehydrogenase (ald) erfolgreich, welche durch den Promoter Pptb des Phosphotransbutyrylase/Butyrat-Kinase-Operons von C. acetobutylicum kontrolliert werden. 4. Diskussion 130 Um die Funktionalität des Konstruktes pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald zu überprüfen, wurde die Butanol-Synthese ausgehend von Butyrat im Zwischenwirt E. coli untersucht (3.2.). Weder E. coli HB101 noch E. coli WL3 konnten bei Wachstum auf Glucose unter aeroben Bedingungen 1-Butanol produzieren. Bei E. coli HB101 kam es unter semianaeroben Bedingungen mit 10 bzw. 20 mM Butyrat zur Bildung von 0,94 und 0,87 mM 1-Butanol und unter anaeroben Wachstumsbedingungen konnten bis zu 0,65 mM 1-Butanol detektiert werden. Unter semianaeroben Bedingungen konnten bei E. coli WL3 nach Zugabe von 10 bzw. 20 mM Butyrat zwischen 0,11 und 0,71 mM 1-Butanol gemessen werden, wobei unter anaeroben Bedingungen mit 10 mM Butyrat 0,41 mM 1-Butanol synthetisiert wurden. Folglich wurden die hier eingebrachten Gene exprimiert, da E. coli ausgehend von Butyrat in der Lage war, 1-Butanol zu produzieren. Zwar ist es gelungen, die jeweiligen Butanol-Synthese-Gene einzeln und mutationsfrei in den pDrive-Klonierungsvektor einzubringen, jedoch war eine sukzessive Zusammenführung der Gene in die Vektoren pUC18 und pUC19 nicht möglich. Dies ist auf zahlreich auftretende Probleme während der Klonierungsarbeiten, wie beim Restriktionsverdau oder beim Einbringen der Butanol-Synthese-Gene in entsprechende Vektoren, zurückzuführen. Darüber hinaus war die Transformationseffizienz zum Teil nur sehr gering. Obwohl bei Restriktionsansätzen für Enzymaktivitäten stets ein optimales Puffersystem gewählt wurde (Aktivität von 50100 %) und auf unterschiedliche Inkubationstemperaturen geachtet wurde, war der Restriktionsverdau mitunter nicht effizient genug. Zudem wurde bei der Herstellung von PCR-Fragmenten ein entsprechender Nukleotidüberhang generiert und das Einbringen von Restriktionsschnittstellen am Ende des Fragments vermieden, damit die verwendeten Restriktionsenzyme die DNA korrekt und effizient schneiden können. Vermutlich waren Restriktionsverdaue zum Teil dennoch nicht effizient genug, was möglicherweise auf reduzierte Enzym-Aktivitäten mit dem eingesetzten DNA-Substrat zurückzuführen ist. Glycerinkonzentrationen von über 5 % (v/v) führen bei einigen Restriktionsendonukleasen zur sog. Stern-Aktivität ("Star Activity"). Dadurch können auch ähnliche Erkennungssequenzen geschnitten werden, was wiederum zu einer unspezifischen Reaktion der DNA führt (Nasri und Thomas, 1986). Darüber hinaus tragen zu lange Inkubationszeiten ebenfalls zur Stern-Aktivität bei und erniedrigen somit die Effizienz der Restriktionsspaltung von DNA. Um das Religieren der VektorDNA bei einer Ligation zu verhindern, wurden nach einem Restriktionsverdau die Phosphatreste an den 5'-Enden hydrolysiert. 4. Diskussion 131 Des Weiteren wurden sowohl die Plasmid-DNA als auch das PCR-Produkt nach Restriktionsverdauen stets über eine Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend aus dem Gel gereinigt. Die Gel-Reinigung diente der Entfernung von kleinen DNA-Fragmenten, welche die anschließende Ligation negativ beeinflussen könnten. Jedoch können manche Reinigungsmethoden, bei welchen Glasmilch verwendet wird, die Ligation stören. Die Transformationseffizienz kann durch Hitzeinaktivierung der T4-DNA-Ligase gesteigert werden. Da es sich bei der T4-DNALigase um ein DNA-bindendes Protein handelt, kommt es zur Bildung sog. DNAProtein-Komplexe. E. coli ist nicht in der Lage, diese Komplexe während der Transformation aufzunehmen. Durch Hitzeinaktivierung allerdings wird die Komplexbildung minimiert und folglich die Transformationseffizienz erhöht. Die zahlreichen vorhandenen Mutationen sind vermutlich darauf zurückzuführen, dass sowohl 1-Butanol als auch einige Intermediate des Butanol-Synthese-Weges für E. coli toxisch sind. Zudem wäre es möglich, dass die starke Expression eines Proteins von C. acetobutylicum zu einem Konflikt mit einem der E. coli-Proteine führt bzw. den Stoffwechsel von E. coli negativ beeinflusst. Um dieses Problem zu umgehen, wäre ein Promoter nötig, welcher im Gram-negativen Zwischenwirt E. coli inaktiv ist, im eigentlichen Produktionsstamm (in acetogenen Organismen) jedoch eine dauerhaft hohe Aktivität hat. Ein solcher Promoter ist indessen nicht bekannt. Der hier verwendete Promoter Pptb des Phosphotransbutyrylase/Butyrat-Kinase-Operons aus C. acetobutylicum weist in E. coli ebenfalls Aktivität auf. Aufgrund der auftretenden Problematik wurden drei Fragmente mit den zur ButanolSynthese nötigen Gene synthetisch erstellt, die von der Firma ATG:biosynthetics GmbH, Freiburg bezogen wurden. Für die Konstruktion der artifiziellen ButanolSynthese-Plasmide wurden die jeweiligen Fragmente in den single-copy-Vektor pSB3C5 ligiert. Aber auch in diesem Fall erwies sich das sukzessive Zusammenfügen der Butanol-Synthese-Gene als schwierig. Die notwendigen Butanol-Synthese-Gene konnten schließlich in den single-copy-Vektor pSB3C5 eingebracht werden, während dies bei Verwendung eines Vektors mit hoher Kopienzahl vorerst nicht gelang. Die Plasmide pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 beinhalten die Gene für die Crotonase Crt, Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd, ElektronentransferFlavoproteine EtfB/A, 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase Hbd und Thiolase ThlA. Das Plasmid pSB3C5_UUMKS 1 enthält zusätzlich die Gene für die Butyraldehyd- Ald und Butanol-Dehydrogenase BdhB, während auf den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 die Gene für die bifunktionellen Butyraldehyd-/ButanolDehydrogenasen AdhE bzw. AdhE2 lokalisiert sind. 4. Diskussion 132 Diese Gene werden durch den Promoter Pptb des Phosphotransbutyrylase/ButyratKinase-Operons kontrolliert und das Einfügen der catP-Resistenzkassette ermöglicht die Selektion auf Chloramphenicol (Tab. 50, Abb. 15a/b/c). Tabelle 50: Butanol-Synthese-Plasmide mit den jeweiligen Insertionen Plasmidbezeichnung Insertion Größe [Bp] pSB3C5_UUMKS 1 Pptb, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, Pptb, thlA, catP, Pptb, ald, bdhB 12646 pSB3C5_UUMKS 2 Pptb, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, Pptb, thlA, catP, Pptb, adhE 12521 pSB3C5_UUMKS 3 Pptb, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, Pptb, thlA, catP, Pptb, adhE2 12515 Die Transformation der künstlich synthetisierten Butanol-Synthese-Plasmide erfolgte jeweils in verschiedene E. coli-Stämme (BL21 (DE3), DH5α, HB101, JM109, SURE®, WL3 und XL1-Blue), da sich bei der Synthese von Aceton in E. coli mit Enzymen aus C. acetobutylicum zeigte, dass die Produktion in unterschiedlichen E. coli-Stämmen deutlich variiert (Bermejo et al., 1998). Zusätzlich wurde das Kontrollplasmid pGS20 in die genannten E. coli-Stämme eingebracht. Die Transformation des Kontrollplasmids pSB3C5 in E. coli konnte nicht durchgeführt werden, da dieses Plasmid das Gen ccdB beinhaltet, dessen Genprodukt DNA-Topoisomerase II-Komplexe hemmt. Aufgrund dessen wurde das Plasmid pGS20 als Kontrolle mitgeführt, bei welchem das ccdBGen entfernt wurde. Nach Expression der zur Butanol-Synthese nötigen Gene in den verschiedenen E. coli-Stämmen wurden Wachstumsversuche unter aeroben, semianaeroben und anaeroben Bedingungen in jeweils 100 ml TY-Medium (2.5.1.8.), TY-Medium mit 2 % Glucose und SD-8-Medium (2.5.1.4.) mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol durchgeführt (3.3.2. und 3.3.4.). Während des gesamten Wachstums wurden Proben genommen und danach gaschromatographisch analysiert. Dabei konnten nicht nur Butanol-Konzentrationen in den E. coli-Stämmen, welche die Butanol-Synthese-Plasmide trugen, detektiert werden, sondern auch in den Stämmen, welche das Kontrollplasmid pGS20 oder kein Plasmid enthielten. Allerdings kann E. coli 1-Butanol weder als Metabolit noch als Endprodukt bilden. Es konnte jedoch nachgewiesen werden (Kalscheuer et al., 2006), dass in "Bacto®" Trypton 1-Butanol enthalten sein kann, welches während der Herstellung als Extraktionsmittel verwendet wird. 4. Diskussion 133 Bei Analyse des TY-Mediums im Gaschromatographen konnte ebenfalls 1-Butanol nachgewiesen werden, da in diesem Medium große Mengen an "Bacto®" Trypton (16 g/l) enthalten sind. Daher wurde nach Wachstumsversuchen in TYMedium bei allen gaschromatographischen Analysen das Medium selbst (ohne Kultur von E. coli) als Leerwert mitgeführt, dessen Butanol-Konzentration bestimmt und schließlich von den detektierten Butanol-Konzentrationen mit den Butanol-SynthesePlasmiden subtrahiert. In Wachstumsstudien von E. coli mit den Butanol-Synthese-Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 wurden unter aeroben Bedingungen stets die höchsten Zelldichten erreicht. Jedoch war nicht immer eine Korrelation zwischen Zellzahl und detektierter Butanol-Konzentration zu erkennen. So produzierte E. coli bei Wachstum in TY-Medium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zugabe beim Erreichen der stationären Phase) unter aeroben Bedingungen maximal zwischen 4,93 und 9,40 mM 1-Butanol (maximale OD600nm von ca. 5,8). Während unter semianaeroben Wachstumsbedingungen nur eine OD600nm von ca. 0,3-1,5 erreicht wurde, betrugen die gemessenen Butanol-Konzentrationen 5,32-11,61 mM. Unter anaeroben Bedingungen konnten zwischen 7,92 und 12,90 mM 1-Butanol detektiert werden, wobei am Ende des Wachstums ungefähr dieselbe Zelldichte erreicht wurde wie unter semianaeroben Bedingungen. Darüber hinaus konnte die Butanol-Ausbeute durch Verwendung von alternativen Genen bzw. Enzymen nicht optimiert werden. Die synthetisierten Butanol-Mengen von E. coli mit den Butanol-Synthese-Plasmiden unter den jeweiligen Wachstumsbedingungen waren durchaus vergleichbar. So führte das Einbringen von adhE oder adhE2 anstelle von ald/bdhB nicht zu deutlichen Unterschieden bzw. zur Steigerung hinsichtlich der Butanol-Ausbeute. Auch die Produktion in unterschiedlichen E. coli-Stämmen variierte nicht erheblich, wie dies bei der Synthese von Aceton in E. coli mit Enzymen aus C. acetobutylicum beschrieben ist (Bermejo et al., 1998). Dennoch konnte der Beweis der Durchführbarkeit erbracht werden. Zudem konnte die Konzentration von gebildetem 1-Butanol durch erneute Glucose-Zugabe beim Erreichen der stationären Wachstumsphase gesteigert werden. Bei Wachstumsversuchen von E. coli in TYMedium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zufuhr) konnten im Vergleich zu weiteren verwendeten Medien die höchsten Butanol-Konzentrationen nachgewiesen werden. In diesem Fall konnte unter anaeroben Bedingungen mit E. coli DH5α, welches das Plasmid pSB3C5_UUMKS 3 trägt, eine maximale Butanol-Konzentration von 12,90 mM am Ende des stationären Wachstums detektiert werden. 4. Diskussion 134 Nach Einbringen der Elektronentransfer-Flavoproteine war es nun also möglich, in E. coli 1-Butanol zu produzieren. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die ButyrylCoA-Dehydrogenase Bcd von C. acetobutylicum bei heterologer Expression in E. coli nur dann aktiv ist, wenn die Elektronentransfer-Flavoproteine EtfB/A aus C. acetobuytlicum ebenfalls exprimiert werden. Werden Bcd und EtfB/A getrennt voneinander exprimiert und danach in vitro zusammengegeben, kann hingegen keine Aktivität gemessen werden (Inui et al., 2007). Die Synthese von 1-Butanol beginnt vergleichbar wie in C. acetobutylicum, nämlich überwiegend während der stationären Phase des Wachstums. Die Butanol-Produktion startete zum Teil aber auch schon während der Mitte bzw. zum Ende des logarithmischen Wachstums. Dies entspricht dem Aktivitätsprofil des verwendeten ptbPromoters (Feustel et al., 2004) bzw. Expressionsprofil des ptb-Gens (Alsaker und Papoutsakis, 2005) in C. acetobutylicum. In den jeweiligen Wachstumsversuchen von E. coli mit den Butanol-Synthese-Operons machte es den Anschein, als wäre der Organismus in der Lage, das produzierte 1-Butanol wieder aufzunehmen und anschließend zu verstoffwechseln, da die Butanol-Konzentration im Medium wieder sank. In weiteren Studien konnte gezeigt werden, dass E. coli tatsächlich in der Lage ist, 1-Butanol zu verstoffwechseln und es konnte ausgeschlossen werden, dass das zugegebene 1-Butanol verdunstet (3.4.). Zudem erfolgte die Umklonierung der Butanol-Synthese-Gene über entsprechende Schnittstellen aus dem Vektor pSB3C5 in den E. coli/Clostridien-Schaukelvektor pIMP1, um die Butanol-Produktion mit acetogenen Organsimen wie C. ljungdahlii untersuchen zu können und das Einbringen sowie die Expression der entsprechenden Gene in diesen Stamm zu ermöglichen (3.3.3.). Vorerst wurden die Butanol-SynthesePlasmide in die E. coli-Stämme BL21 (DE3), DH5α, HB101, JM109, SURE®, WL3 und XL1-Blue eingebracht, um die Funktionalität der jeweiligen Plasmide im Zwischenwirt E. coli zu testen. Die maximal gemessenen Butanol-Konzentrationen von E. coli mit den Butanol-Synthese-Plasmiden pIMP1_UUMKS 1, pIMP1_UUMKS 2 und pIMP1_UUMKS 3 unter den jeweiligen Wachstumsbedingungen in TY-Medium mit 2 % Glucose sind mit den unter Verwendung des single-copy-Vektors pSB3C5 erhaltenen Ergebnissen vergleichbar. 4. Diskussion 135 Die produzierten Butanol-Mengen in den verschiedenen E. coli-Stämmen sind nach dem Einbringen der Butanol-Synthese-Plasmide (pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2, pSB3C5_UUMKS 3, pIMP1_UUMKS 1, pIMP1_UUMKS 2 und pIMP1_UUMKS 3) jedoch im Gegensatz zu den Butanol-Konzentrationen von natürlichen Produzenten wie C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum oder C. saccharoperbutylacetonicum nur gering. In entsprechenden MutantenStämmen oder durch Überexpression bzw. Inaktivierung von bestimmten Genen, wie dem Glycosylase/Deglycosylase-Gen (Thormann et al., 2002) orf5 (Harris et al., 2001), den Chaperon-Genen groESL (Tomas et al., 2003) oder dem Butyrat-KinaseGen buk (Harris et al., 2000), können bis zu etwa 250 mM (~ 23 g/l) Butanol produziert werden (Tab. 51). Dennoch sind die erzielten Butanol-Konzentrationen mit den Butanol-Synthese-Plasmiden in den verschiedenen E. coli-Stämmen vergleichbar mit ähnlichen Studien in E. coli (Tab. 51). Wie bereits gezeigt werden konnte, war es nach dem Einbringen der Gene für die Thiolase ThlA, 3-Hydroxybutyryl-CoADehydrogenase Hbd, Crotonase Crt, Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd, Elektronentransfer-Flavoproteine EtfB/A sowie dem Gen für die bifunktionelle Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase AdhE aus C. acetobutylicum möglich, in E. coli 4,2 mM Butanol zu produzieren (Inui et al, 2007). Durch den Austausch von adhE gegen adhE2 konnte die Butanol-Ausbeute sogar auf 16,2 mM gesteigert werden (Inui et al., 2007). In einer anderen Studie wurden aber bei Verwendung derselben Gene nur 1,9 mM Butanol in E. coli detektiert (Atsumi et al., 2008a). Bei Verwendung einer Trans-2-Enoyl-CoA-Reduktase Ter aus dem Augentierchen Euglena gracilis anstelle der Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd sowie einer Butyraldehyd-Dehydrogenase Ald aus C. beijerinckii anstelle von AdhE wurde in E. coli hingegen nur eine ButanolKonzentration von 1,03 mM gemessen. In Bacillus subtilis und in der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurden dagegen nach dem Einbringen derselben Gene nur 0,19 mM bzw. 20 µM 1-Butanol produziert (Donaldson et al., 2007). In einer anderen Arbeit konnten in Saccharomyces cerevisiae nur maximal 27 µM Butanol gemessen werden (Steen et al., 2008). Des Weiteren ist es möglich, in E. coli 1-Butanol nicht-fermentativ aus 2-Ketovalerat, einem Intermediat des NorvalinBiosyntheseweges, über die eingebrachte 2-Ketosäure-Decarboxylase KivD aus Lactococcus lactis sowie die Alkohol-Dehydrogenase Adh2 aus Saccharomyces cerevisiae herzustellen. In diesem Zusammenhang betrug die Butanol-Ausbeute 9 mM (Atsumi et al., 2008b). 4. Diskussion 136 Tabelle 51: Butanol-Konzentrationen in einigen (genetisch modifizierten) Organismen Organismus C. acetobutylicum C. beijerinckii E. coli ButanolAusbeute [mM] Referenz Inaktivierung von orf5 (solR) und Überexpression von adhE 238 Harris et al., 2001 Überexpression von groESL 231 Tomas et al., 2003 Inaktivierung von buk und Überexpression von adhE 226 Harris et al., 2000 Überexpression von adc und ctfAB 177 Wildtyp-Stamm ATCC 824 130-160 Mermelstein et al., 1993 alle oben genannten Mutanten-Stamm BA101 Wildtyp-Stamm NCIMB 8052 229 98 Qureshi und Blaschek, 2001 Einbringen von thlA, hbd, crt, bcd, etfB/A und adhE2 aus C. acetobutylicum 16,2 Inui et al., 2007 Einbringen von kivD aus Lactococcus lactis und adh2 aus Saccharomyces cerevisiae sowie Überexpression von ilvA und leuABCD und Deletion von ilvD 9 Atsumi et al., 2008b Einbringen von thlA, hbd, crt, bcd, etfB/A und adhE aus C. acetobutylicum 4,2 Inui et al., 2007 Einbringen von thlA, hbd, crt, bcd, etfB/A und adhE2 aus C. acetobutylicum 1,9 Atsumi et al., 2008a 1,03 Donaldson et al., 2007 Einbringen von thlA, hbd, crt und bdhB aus C. acetobutylicum, ter aus Euglena gracilis und ald aus C. beijerinckii 0,19 Donaldson et al., 2007 Einbringen von hbd, crt und adhE2 aus C. beijerinckii, ccr aus Streptomyces collinus und Überexpression von erg10 0,03 Steen et al., 2008 Einbringen von thlA, hbd und crt aus C. acetobutylicum, ter aus Euglena gracilis und ald aus C. beijerinckii 0,02 Donaldson et al., 2007 Modifikation Einbringen von thlA, hbd und crt aus C. acetobutylicum, ter aus Euglena gracilis und ald aus C. beijerinckii sowie Überexpression von yqhD Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae 4. Diskussion 137 In weiteren Studien sollen die clostridiellen Butanol-Synthese-Plasmide pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 in acetogene Organismen wie Acetobacterium woodii, C. aceticum und C. ljungdahlii eingebracht werden. Acetobacterium woodii, benannt nach Harland G. Wood, ist ein Grampositiver, stäbchenförmiger und anaerober Organismus mit einem G+C-Gehalt von 35-48 Mol-%. Acetobacterium woodii ist in der Lage, auf CO und CO2 + H2 sowie auf Fructose, Glucose und Lactat zu wachsen und bildet hierbei Acetat (Balch et al., 1977; Schink und Stieb, 1983; Sharak Genthner und Bryant, 1987). Die Anreicherung und Isolierung von C. aceticum aus Klärschlamm wurde erstmals 1936 von Wieringa beschrieben. Dabei handelt es sich um einen Gram-variablen, anaeroben und Sporen-bildenden Organismus mit einem G+C-Gehalt von 33 Mol-%. C. aceticum produziert Acetat und wächst außer auf CO und H2 + CO2 auch auf Fructose, L-Glutamat, L-Malat und Pyruvat (Wieringa, 1936; Adamse, 1980; Braun et al., 1982; Lux und Drake, 1992). C. ljungdahlii (in Anerkennung der Arbeit nach Lars G. Ljungdahl benannt) wurde 1988 von Barik et al. aus Hühnermist isoliert und von Tanner et al. (1993) charakterisiert. Dieser stäbchenförmige, anaerobe, Gram-positive und unregelmäßig sporulierende Organismus bildet sowohl Acetat als auch Ethanol. Außer auf CO und CO2 + H2 kann C. ljungdahlii auch auf Fructose, Pyruvat, Ethanol und nach Adaption auch auf Glucose wachsen, jedoch nicht auf 1-Butanol. Zudem konnte gezeigt werden, dass dieser Organismus eine ähnliche Butanol-Toleranz aufweist wie C. acetobutylicum (Köpke, 2009). Vor kurzem wurde das Genom von C. ljungdahlii am Göttingen Genomics Laboratory (Georg-August-Universität Göttingen) sequenziert. Das 4,63 MBp große Genom stellt eines der größten clostridiellen Genome dar (Brüggemann und Gottschalk, 2008) und hat einen G+C-Gehalt von 31 Mol-% (Tanner et al., 1993). Die Annotation der Genomsequenz dauert noch an. Diese Organismen sind in der Lage, auf CO2 + H2 und insbesondere auf CO, dem Hauptbestandteil von Synthesegas, zu wachsen. Aus den insgesamt ca. 100 verschiedenen acetogenen Spezies (Drake et al., 2006; Imkamp und Müller, 2007) sind nicht alle Acetogenen in der Lage, auf diesen beiden Substraten zu wachsen. Von allen acetogenen Organismen existierte lediglich für Acetobacterium woodii ein Transformationsprotokoll für das Einbringen fremder DNA (Strätz et al., 1994). Nun konnte zusätzlich ein Transformationsprotokoll durch Elektroporation für C. ljungdahlii etabliert werden. 4. Diskussion 138 Zudem wurden neue, grundlegende Methoden zur Stammhaltung entwickelt und das Wachstum dieses Organismus auf Fructose und insbesondere auf CO optimiert (Köpke, 2009). Im Vergleich zu C. ljungdahlii (tD = 3,8 h) wächst Acetobacterium woodii (tD = 13 h) nur langsam auf CO. Das beste Wachstum auf CO zeigen zwei Stämme (U-1 und Marburg) von Blautia producta (Tab. 52; tD = 1,5-3 h). Diese Stämme sind jedoch nur entfernt mit C. acetobutylicum verwandt (Abb. 33) und zeichnen sich durch einen deutlich höheren G+C-Gehalt (45-46 Mol-%) als C. acetobutylicum (31 Mol-%) aus, was zu Problemen bei der Expression der Butanol-Synthese-Gene aus C. acetobutylicum führen könnte. Ungewiss ist auch, ob sich die bekannten Schaukelvektoren in Blautia producta überhaupt replizieren ließen. Ähnliche Schwierigkeiten könnten sich auch bei Acetobacterium woodii ergeben, da dieser Organismus ebenfalls einen höheren G+C-Gehalt (35-48 Mol-%) aufweist als C. acetobutylicum. Die Verdopplungszeit von Moorella thermoacetica ist vergleichbar mit der von M. thermoautotrophica (Tab. 52; tD = 7-9 h). Zudem ist von Moorella thermoacetica bereits die komplette Genomsequenz bekannt (Pierce et al., 2008). Allerdings handelt es sich hierbei um eine thermophile Gattung (G+C-Gehalt = 53-56 Mol-%), was zur Verteuerung des Fermentationsprozesses führen würde. Butyribacterium methylotrophicum (G+C-Gehalt 48-55 Mol-%) wächst nach Adaption (Lynd et al., 1982) nur sehr langsam auf CO (Tab. 52; Verdopplungszeit tD= 13,9 h), kann jedoch über einen noch nicht geklärten Mechanismus geringe Mengen (0,08 g/l bzw. 1,08 mM) an Butanol bilden (Grethlein et al., 1991). C. carboxidivorans zeigt hingegen auf CO besseres Wachstum (Tab. 52; tD = 4,3 h) und produziert aus 600 mmol CO ca. 24 mmol Butanol (Liou et al., 2005), welches dieser Organismus allerdings auch wieder verstoffwechseln kann (Liou et al., 2005). Darüber hinaus ist es in früheren Studien weder gelungen, diesen Organismus auf Synthesegas wachsen zu lassen noch erfolgreich zu transformieren (Köpke, 2009). 4. Diskussion 139 Tabelle 52: Verdopplungszeit und Wachstumsraten von acetogenen Organismen auf CO Organismus/Stamm Verdopplungszeit tD [h] Wachstumsrate µ [h-1 ] Referenz 1,5 0,46 Lorowitz und Bryant, 1984 3 0,23 Geerlings et al., 1987 3,8 0,18 Henstra et al., 2007 4 0,175 Huhnke et al., 2008 4,3 0,16 Liou et al., 2005 5,8 0,12 Liou et al., 2005 7 0,10 Savage et al., 1987 7,7 0,09 Liou et al., 2005 9 0,08 Daniel et al., 1990 9 0,08 13 0,05 13,9 1) 0,05 13,9 2) --- 16 0,04 Blautia producta U-1 Blautia producta Marburg Clostridium ljungdahlii PETCT Clostridium ragsdalei P11T Clostridium carboxidivorans P7T Clostridium drakei SL1T Moorella thermoautotrophica JW701/3T Clostridium scatologenes DSM 757T Moorella thermoacetica ATCC 39073 Eubacterium limosum RF Acetobacterium woodii WB1T Butyribacterium methylotrophicum Marburg T Oxobacter pfennigii V5-2T Moorella thermoacetica DSM 2955 T 1) 2) Sharak Genthner und Bryant, 1982 Sharak Genthner und Bryant, 1987 Lynd et al., 1982 Krumholz und Bryant, 1985 Kerby und Zeikus, 1983 = Typstamm Das Wachstum auf CO erfolgte erst nach Adaption des Organismus (Lynd et al., 1982). Generationszeit g anstatt Verdopplungszeit tD 4. Diskussion 140 Bei Annotation des Genoms konnte des Weiteren gezeigt werden, dass C. ljungdahlii einen neuen Typ der Energiekonservierung in acetogenen Bakterien darstellt. Acetogene Organismen werden abhängig von der Art der Energiekonservierung in zwei Gruppen eingeteilt (Müller, 2003). Bisher wurde zwischen H+-abhängigen und Na+-abhängigen Organismen unterschieden. In der Genomsequenz von C. ljungdahlii konnten jedoch keine Gene für Cytochrome und Menaquinone identifiziert werden, welche in den H+-abhängigen Acetogenen wie Moorella thermoacetica und M. thermoautotrophica am Aufbau eines Protonengradienten über eine Elektronentransportkette beteiligt sind (Das und Ljungdahl, 2003). Die Energiekonservierung erfolgt dabei über eine H+-abhängige F1FO-ATPase (Ivey und Ljungdahl, 1986; Das et al., 1997). Dennoch wurde eine H+-abhängige anstelle einer Na+-abhängigen ATPase in C. ljungdahlii entdeckt. Im Gegensatz zu den Na+abhängigen Acetogenen benötigt C. ljungdahlii für das autotrophe Wachstum kein Natrium (Köpke, 2009) und die ATPase weist keine Na+-Koordinationsstelle auf (Müller et al., 2001; Meier et al., 2006). Na+-abhängige Acetogene wie Acetobacterium woodii (Heise et al., 1989) und Blautia producta (Geerlings et al., 1989) generieren über einen bisher unbekannten Mechanismus einen Na+-Gradienten. Diese Organismen besitzen Corrinoide (Dangel et al., 1987) und die Energiekonservierung erfolgt über eine Na+-abhängige F1FO-ATPase (Müller et al., 2001). Vermutlich ist bei Acetobacterium woodii ein Rnf-Komplex am Aufbau des Na+-Gradienten beteiligt (Müller et al., 2008). Da in C. ljungdahlii ebenfalls ein solcher membranständiger RnfKomplex bekannt ist, wurde ein hypothetisches Modell der Energiekonservierung in C. ljungdahlii über Elektronentransfer-Flavoproteine und einen Rnf-Komplex aufgestellt (Köpke, 2009). Um die artifiziell hergestellten Butanol-Synthese-Plasmide pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 in Gram-positive acetogene Organismen transformieren zu können, muss der Vektor pSB3C5 entsprechend modifiziert werden. Nach dem Einbringen der Butanol-Synthese-Plasmide in acetogene Organismen wie C. ljungdahlii, C. aceticum und Acetobacterium woodii sollte es ausgehend von AcetylCoA möglich sein, 1-Butanol zu produzieren (Abb. 34; Wood-Weg). Diesbezüglich scheint C. ljungdahlli ein guter Produktionsstamm für die Synthese von 1-Butanol über eingebrachte clostridielle Gene bzw. Enzyme zu sein, da in vorangegangenen Studien schon gezeigt werden konnte, dass es nach dem Einbringen des Butanol-SynthesePlasmids pSOBPptb in C. ljungdahlii möglich war, 1-Butanol zu produzieren (Köpke, 2009). 4. Diskussion 141 Die hier verwendeten Butanol-Synthese-Operons stehen alle unter Kontrolle des Promoters Pptb des Phosphotransbutyrylase/Butyrat-Kinase-Operons aus C. acetobutylicum. In acetogenen Organismen wie C. ljungdahlli zeigt der ptbPromoter ebenfalls Aktivität, vor allem während der logarithmischen Phase. Im Vergleich hierzu weist der Promoter der Acetat-Kinase von C. ljungdahlii eine deutlich höhere Aktivität auf (Köpke, 2009). Durch Einbringen dieses Promoters oder eines anderen starken Promoters aus C. ljungdahlii in die Butanol-Synthese-Plasmide könnte die Butanol-Ausbeute gesteigert werden. Hierzu müsste allerdings zuvor geklärt werden, ob das Acetat-Kinase-Gen ack, wie auch in anderen Bakterien, ein Operon mit dem Phosphotransacetylase-Gen pta bildet sowie der entsprechende Transkriptionsstartpunkt bestimmt werden. Darüber hinaus könnte die ButanolKonzentration durch Verwendung alternativer Gene gesteigert werden. Während einige Gruppen der acetogenen Organismen in der Lage sind, autotroph auf einfachen Substraten wie Kohlenmonoxid (CO) oder Kohlendioxid plus Wasserstoff (CO2 + H2) zu wachsen, benötigen sowohl E. coli, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae als auch die solventogenen Clostridien Zucker bzw. Stärke als Substrat. Es ist jedoch nicht sicher, ob die Butanol-Produktion in diesen Organismen bzw. in den natürlichen Butanol-Produzenten noch signifikant erhöht werden kann, da 1-Butanol in Konzentrationen von 250 mM extrem toxisch für die Zelle ist. Daher wird bereits in einigen Arbeiten versucht, die Substratnutzung, Butanol-Toleranz oder Lösemittelabtrennung zu verbessern und die Nebenprodukte der Fermentation zu eliminieren (Dürre, 2007; 2008; Noack et al., 2009). Zudem ist es fraglich, ob in E. coli, Bacillus subtilis oder Saccharomyces cerevisiae vergleichbar hohe ButanolKonzentrationen wie in Clostridien erreicht werden können. Durch Deletion des Alkohol-Dehydrogenase-Gens adhE, des Lactat-DehydrogenaseGens ldhA, der Fumarat-Reduktase-Gene frdBC, des Phosphotransacetylase-Gens pta und des Pyruvat-Dehydrogenase-Regulator-Gens fnr sollte der E. coliProduktionsstamm von Atsumi et al. (2008a) optimiert werden. Dadurch konnte die Butanol-Konzentration jedoch nur auf 5 mM erhöht werden. Eine Steigerung der Butanol-Ausbeute durch Verwendung alternativer Butyryl-CoA-Dehydrogenase-Gene (bcd und etfB/A aus Megasphaera elsdenii oder ccr aus Streptomyces coelicolor) war hingegen nicht erfolgreich (Atsumi et al., 2008a). 4. Diskussion 142 In Saccharomyces cerevisiae konnten nach dem Einbringen unterschiedlicher Thiolase-Gene (atoB aus E. coli, erg10 aus Saccharomyces cerevisiae oder phaA aus Ralstonia eutropha), 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase-Gene (hbd aus C. beijerinckii oder phaB aus Ralstonia eutropha) und Butyryl-CoA-DehydrogenaseGene (bcd und etfB/A aus C. beijerinckii oder ccr aus Streptomyces collinus) nur maximal 27 µM 1-Butanol detektiert werden. Folglich war eine Optimierung der Butanol-Ausbeute in E. coli, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae durch Verwendung von PhaB aus Ralstonia eutropha anstelle von Hbd und entweder Ccr aus Streptomyces coelicolor bzw. S. collinus, Ter aus Euglena gracilis oder Bcd und EtfB/A aus Megasphaera elsdenii anstatt der clostridiellen Bcd und EtfB/A nicht möglich, da die Butanol-Konzentrationen nur sehr gering waren. Somit stellen diese Enzyme keine geeignete Alternative zu den entsprechenden clostridiellen Enzymen dar (Donaldson et al., 2007; Atsumi et al., 2008; Steen et al., 2008). Um die Butanol-Ausbeute in acetogenen Organismen zu optimieren, eignen sich eventuell die Gene aus C. kluyveri, da es sich hier um einen der am nahesten verwandten Organismen von C. ljungdahlli handelt (Collins et al., 1994). C. kluyveri produziert zwar kein 1-Butanol, ist dafür aber in der Lage, Butyrat zu produzieren. Folglich verfügt dieser Organismus über die Enzyme, die für die Bildung von ButyrylCoA aus Acetyl-CoA nötig sind. Zudem besitzt C. kluyveri wie auch C. beijerinckii homolog zu C. acetobutylicum ein Operon bestehend aus den Genen crt, bcd, etfB, etfA und hbd. Es wird angenommen, dass C. kluyveri über Bcd und EtfA/B mit Hilfe eines Rnf-Komplexes Energie konservieren kann. Da ein solcher Komplex auch in C. ljungdahlii bekannt ist (Köpke, 2009), könnte nach Einbringen von Bcd und EtfA/B aus C. kluyveri anstatt aus C. acetobutylicum bei der Butanol-Produktion zusätzlich Energie konserviert und folglich die Butanol-Ausbeute sowie das Wachstum optimiert werden. 4. Diskussion 143 Im zweiten Teil dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die Funktion einer Cytochrom-P450-Monooxygenase in C. acetobutylicum gewonnen werden. Da für die Funktion von Cytochrom-P450-Monooxygenasen normalerweise molekularer Sauerstoff benötigt wird, würde man diese Enzyme ausschließlich in aeroben Organismen vermuten. Nachdem jedoch durch Genomsequenz-Analysen in C. acetobutylicum ein für dieses Enzym kodierendes Gen (CAC3330) identifiziert werden konnte (Nölling et al., 2001), erfolgte die Klonierung und Expression von CAC3330 in E. coli, um die Funktion des Enzyms näher zu untersuchen. Im Anschluss daran wurden biochemische Analysen zur genaueren Charakterisierung der Cytochrom-P450-Monooxygenase (P450CLA) durchgeführt. P450CLA bindet zahlreiche gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C8 bis C18, einige Fettsäureester sowie heteroaromatische und polyzyklische aromatische Verbindungen. Darüber hinaus katalysiert dieses Enzym die Hydroxylierung von Fettsäuren (z. B. Laurin-, Myristin- und Palmitinsäure), wobei Wasserstoffperoxid genutzt wird, um hydroxylierte (-OH) Fettsäuren zu produzieren. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, H2O2 als Elektronendonor zu ersetzen und dass P450CLA Sauerstoff akzeptiert (Girhard et al., 2007). Die in diesem Fall nötigen Redoxpartner, welche die Elektronen für die Reaktion bereitstellen, konnten ebenfalls identifiziert werden. Zur genaueren Untersuchung von möglichen ElektronentransferPartnern für die Cytochrom-P450-Monooxygenase von C. acetobutylicum wurden die Flavodoxin-Gene CacFld1 (CAC0587) und CacFld2 (CAC3417) sowie das FlavodoxinOxidoreduktase-Gen CacFdR (CAC0196) von der chromosomalen DNA aus C. acetobutylicum ATCC 824 amplifiziert. Während die Überproduktion und Reinigung der Flavodoxine CacFld1 (CAC0587) und CacFld2 (CAC3417) erfolgreich war, konnte die Flavodoxin-Oxidoreduktase CacFdR (CAC0196) von C. acetobutylicum nicht in funktioneller Form gereinigt werden. Deshalb wurde für weitere Studien die Flavodoxin-Reduktase (FdR) aus E. coli als Redoxpartner verwendet. Aufgrund verschiedener Experimente konnten FdR und CacFld1 als Elektronentransfer-Partner für die P450-Monooxygenase identifiziert werden, da ein Elektronentransfer von NADPH zur P450-Monooxygenase über FdR und CacFld1 nachgewiesen werden konnte (Malca et al., 2010). Um im Rahmen dieser Arbeit die Funktion der Cytochrom-P450-Monooxygenase in C. acetobutylicum genauer zu analysieren, wurde das für dieses Enzym kodierende Gen (CAC3330) spezifisch und dauerhaft ausgeschaltet. Zur Inaktivierung von CAC3330 fand das speziell für Clostridien entwickelte "ClosTron® Gene Knockout System" Anwendung. 4. Diskussion 144 Das "ClosTron® Gene Knockout System" (2.8.) bietet die Möglichkeit, clostridielle Gene hoch effizient, gezielt und dauerhaft auszuschalten (Frazier et al., 2003). Diesbezüglich ist das sog. mobile Gruppe-II-Intron aus Lactococcus lactis von essentieller Bedeutung. Gruppe-II-Introns sind mobile DNA-Elemente, die sich mit Hilfe eines speziellen Proteins ("Intron Encoded Protein", IEP oder auch LtrA-Protein genannt) an definierten Stellen in fremde DNA über einen "Retrohoming" genannten Prozess integrieren können (Cousineau et al., 1998). Die Wahrscheinlichkeit der Integration des Gruppe-II-Introns sinkt mit dessen zunehmender Größe. Das längste Gruppe-II-Intron, mit dem bisher eine Integration durchgeführt wurde, besaß eine Länge von ca. 2 kBp (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomicsand-rnai/targetron/faq.html). Der Integrationsort wird über kurze BasenpaarSequenzen festgelegt, die an die komplementären Sequenzelemente im Wirtsgenom binden (Mohr et al., 2000). Zur Herstellung sog. "Knockout"-Mutanten mittels des "ClosTron® Gene Knockout Systems" findet der speziell für Clostridien angepasste Vektor pMTL007 (Abb. 28) Anwendung. Auf diesem Vektor ist sowohl das Gruppe-IIIntron aus L. lactis als auch das IEP kodiert. Zur Selektion positiver Integrationsmutanten über eine Erythromycin-Resistenz enthält das Gruppe-II-Intron an der Stelle, an der sich ursprünglich der orf von ltrA befand, eine ErmRAM-Kassette (Heap et al., 2007). Um das für die Cytochrom-P450-Monooxygenase kodierende Gen CAC3330 gezielt auszuschalten, wurden die für die Integration geeigneten Stellen bestimmt. Hierzu wurden die EBS/IBS-Sequenzen im Gruppe-II-Intron von pMTL007 auf die gewählten Insertionsstellen in CAC3330 an Position 122/123 und 400/401 durch eine SOE-PCR mit den entsprechenden Oligodesoxynukleotiden erfolgreich angepasst, wie die Sequenzierung der konstruierten Plasmide bestätigte Die berechneten "E-Werte" lagen dabei deutlich unter dem Wert von 0,5, was nach Herstellerangaben eine effiziente Integration ermöglicht. Um die als mutationsfrei sequenzierten Plasmide in C. acetobutylicum transformieren zu können, wurde der Vektor pMTL007 mit den nach Wunsch modifizierten Intronsequenzen zuerst in E. coli XL1-Blue MRF′ (pANS1) und E. coli ER2275 (pANS1) in vivo methyliert (2.8.4.). Nach Transformation von C. acetobutylicum mit dem gezielt in der Intron-DNA-Sequenz veränderten Plasmid pMTL007 erfolgte der Nachweis der Integration über eine PCR (2.8.6.). Die Integration des Gruppe-II-Introns in das Zielgen CAC3330 war indes nur für die Insertionsstelle 400/401 erfolgreich. Anschließend sollten in weiterführenden Wachstumsstudien die Folgen der Integration untersucht werden, da aufgrund dessen möglicherweise Änderungen in der Membranzusammensetzung verursacht wurden. 4. Diskussion 145 Es wurde das Wachstum von C. acetobutylicum mit dem der Integrationsmutante, welche das Plasmid pMTL007::CAC3330_400/401 trägt, in Gegenwart von 1-Butanol getestet. Während der exponentiellen Phase des Wachstums wurden verschiedene Butanol-Konzentrationen (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4 und 5 % (v/v)) (2,7-27,3 mM) zu den jeweiligen C. acetobutylicum-Kulturen zugegeben und schließlich das Wachstum der Integrationsmutante mit dem des Wildtyps von C. acetobuytlicum verglichen. Allerdings ergab sich bei der Analyse der Integrationsmutante kein wesentlicher Unterschied zum Wildtyp-Stamm. Vermutlich war die Integration des Gruppe-II-Introns in das Zielgen CAC3330 erfolgreich, da durch die modifizierte ermB-Resistenzkassette die effiziente Selektion von Integrationsmutanten ermöglicht wird. Eine dauerhafte Resistenz kann außerdem nur durch die Integration des Gruppe-II-Introns in das Chromosom entstehen. Das für die Erythromycin-Resistenz kodierende Gen mit eigenem Promoter wurde bei der auf dem sog. RAM- ("retrotransposition-activated selectable marker") System basierenden Selektion in umgekehrter Orientierung in das Gruppe-II-Intron kloniert. Die effiziente Inaktivierung dieses Resistenzgens erfolgt durch das selbst-spleißende Gruppe-I-Intron td, welches wiederum in gleicher Orientierung wie das Gruppe-II-Intron in die Resistenzkassette eingefügt wurde. Die Transkription des RAM-Systems durch den Promoter der Resistenzkassette resultiert folglich in einem nicht funktionellen Gruppe-I-Intron td, das sich deshalb nicht aus dem Transkript herausschneiden kann. Das Resistenzgen bleibt somit inaktiviert. Erst die Induktion des fac-Promoters und die Transkription des Gruppe-II-Introns führen dazu, dass auch das Gruppe-I-Intron td in richtiger Orientierung abgelesen wird. Dieses schneidet sich daraufhin aus dem Resistenzgen aus und aktiviert die AntibiotikumResistenz. Zur Kultivierung rekombinanter C. acetobutylicum-Stämme wurde jedoch Clarithromycin anstelle von Erythromycin verwendet, da Erythromycin nicht säurestabil ist. Zudem konnte bereits nachgewiesen werden, dass der Wildtyp-Stamm im Gegensatz zur Integrationsmutante nicht in der Lage ist, auf Clarithromycin zu wachsen. Dies deutet ebenfalls auf eine positive Integration des Gruppe-II-Introns in das Zielgen CAC3330 an Position 400/401 hin. 5.a. Zusammenfassung 146 5.a. Zusammenfassung 1. Für die Konstruktion eines optimierten Butanol-Synthese-Operons wurden die Gene der Crotonase (crt), Butyryl-CoA-Dehydrogenase (bcd), ElektronentransferFlavoproteine (etfB/A), 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (hbd), Thiolase (thlA), Butanol-Dehydrogenase (bdhB) aus C. acetobutylicum DSM 792 (ATCC 824), sowie das Gen der Butyraldehyd-Dehydrogenase ald aus C. beijerinckii NCIMB 8052 amplifiziert. Es ist gelungen, die jeweiligen ButanolSynthese-Gene einzeln und mutationsfrei in den pDrive-Klonierungsvektor einzubringen. Eine schrittweise Klonierung in den Vektor pUC19 war für die Gene thlA, bdhB und ald unter Kontrolle des Promoters Pptb erfolgreich (3.1.). Nach Einbringen des Konstruktes pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald in E. coli konnte ausgehend von Butyrat 1-Butanol produziert werden (3.2.). 2. Nach Transformation von artifiziellen Butanol-Synthese-Operons in verschiedene E. coli-Stämme war es möglich, 1-Butanol zu produzieren (3.3.1. und 3.3.2.). Die Plasmide pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 beinhalten die zur Butanol-Synthese nötigen Gene der Crotonase (crt), ButyrylCoA-Dehydrogenase (bcd), Elektronentransfer-Flavoproteine (etfB/A), 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (hbd) und Thiolase (thlA). Während das Plasmid pSB3C5_UUMKS 1 zusätzlich die Gene der Butyraldehyd-Dehydrogenase (ald) und Butanol-Dehydrogenase (bdhB) trägt, befindet sich auf dem Plasmid pSB3C5_UUMKS 2 das Gen der Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase (adhE). Das dritte Plasmid pSB3C5_UUMKS 3 besitzt hingegen das Gen der zweiten bifunktionellen Butyraldehyd-/Butanol-Dehydrogenase (adhE2). Es konnte gezeigt werden, dass es nach Einbringen der Elektronentransfer-Flavoproteine gelang, in E. coli 1-Butanol zu synthetisieren. Dadurch konnte der Beweis erbracht werden, dass die Butyryl-CoA-Dehydrogenase Bcd von C. acetobutylicum bei heterologer Expression in E. coli nur dann aktiv ist, wenn die Elektronentransfer-Flavoproteine EtfB/A ebenfalls exprimiert werden. 3. Um die Butanol-Produktion mit acetogenen Organsimen wie C. ljungdahlii zu untersuchen, wurden die Butanol-Synthese-Gene aus dem Vektor pSB3C5 in den E. coli/Clostridien-Schaukelvektor pIMP1 kloniert (3.3.3.). Die funktionelle Expression der Gene konnte nachgewiesen werden, da es möglich war, im Zwischenwirt E. coli aus Glucose 1-Butanol zu synthetisieren (3.3.4.). 5.a. Zusammenfassung 147 4. Durch Sequenzanalysen konnte ein Gen (CAC3330) in C. acetobutylicum DSM 792 (ATCC 824) gefunden werden, welches für eine Cytochrom-P450Monooxygenase (CYP152A2) kodiert. Das für die Monooxygenase kodierende Gen wurde amplifiziert und in E. coli exprimiert (3.6.). Nach Überproduktion und Reinigung von P450CLA wurden das Substratspektrum und die Produktbildung bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass P450CLA die Hydroxylierung von Fettsäuren (z. B. Laurin-, Myristin- und Palmitinsäure) katalysiert und hierbei Wasserstoffperoxid nutzt, um hydroxylierte (-OH) Fettsäuren zu produzieren. Da die Hydroxylierung bevorzugt an der α-Position erfolgt, wurde das P450CLA-Enzym als Fettsäure-α-Hydroxylase bezeichnet (Girhard et al., 2007). 5. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass das Enzym P450CLA Sauerstoff akzeptiert und H2O2 als Elektronendonor ersetzt werden kann. In diesem Fall sind Redoxpartner nötig, die die Elektronen für die Reaktion bereitstellen. Zur Identifizierung von möglichen Elektronentransfer-Partnern für die Cytochrom-P450Monooxygense von C. acetobutylicum wurden die Flavodoxin-Gene CacFld1 (CAC0587) und CacFld2 (CAC3417) sowie das Flavodoxin-Oxidoreduktase-Gen CacFdR (CAC0196) von der chromosomalen DNA aus C. acetobutylicum ATCC 824 amplifiziert (3.6.). Die Gene wurden in E. coli kloniert und exprimiert. Allerdings wurde die Flavodoxin-Reduktase (FdR) aus E. coli als Redoxpartner verwendet, da die Flavodoxin-Oxidoreduktase CacFdR (CAC0196) von C. acetobutylicum nicht in funktioneller Form gereinigt werden konnte. Nach Charakterisierung dieser Enzyme konnten FdR und CacFld1 als Elektronentransfer-Partner für die P450Monooxygenase identifiziert werden, da ein Elektronentransfer von NADPH zur P450-Monooxygenase über FdR und CacFld1 nachgewiesen werden konnte. (Malca et al., 2010). 6. Unter Verwendung des speziell für Clostridien entwickelten "ClosTron® Gene Knockout Systems" wurde das für die Cytochrom-P450-Monooxygenase kodierende Gen (CAC3330) in C. acetobutylicum ATCC 824 spezifisch und dauerhaft ausgeschaltet (3.7.). Ziel war es, eine Insertion in die chromosomale DNA von C. acetobutylicum mit Hilfe des auf dem Vektor pMTL007 kodierten Gruppe-II-Introns zu erhalten. Die Programmierung des Vektors pMTL007 auf die Insertionsstelle 400/401 in das Gen CAC3330 von C. acetobutylicum wurde erfolgreich durchgeführt. In weiterführenden Wachstumsstudien wurden die Folgen der Integration untersucht. Allerdings ergab sich bei der Analyse der Integrationsmutante kein wesentlicher Unterschied zum Wildtyp-Stamm. 5.b. Summary 148 5.b. Summary 1. For the construction of an optimized butanol-synthesis plasmid the C. acetobutylicum DSM 792 (ATCC 824) and C. beijerinckii NCIMB 8052 genes crt, bcd, etfB/A, hbd, thlA, bdhB, and ald coding for crotonase, butyryl-CoA dehydrogenase, electron-transfer-flavoproteins, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, thiolase, butanol dehydrogenase, and butyraldehyde dehydrogenase were amplified. After cloning of these genes into the vector pDrive, the genes thlA, bdhB and ald under the control of the ptb promoter were introduced into the vector pUC19 (3.1.). After transformation of the plasmid pUC19_Pptb_thlA_bdhB_ald E. coli was able to produce 1-butanol from butyrate (3.2.). 2. Different E. coli strains were metabolically engineered to produce 1-butanol by transformation of the artificial butanol-synthesis plasmids pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2, and pSB3C5_UUMKS 3 containing the genes for a crotonase (crt), a butyryl-CoA dehydrogenase (bcd), electron-transfer-flavoproteins (etfB/A), a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (hbd), and a thiolase (thlA) (3.3.1. and 3.3.2.). Additionally, the plasmid pSB3C5_UUMKS 1 possesses the genes for a butyraldehyde dehydrogenase (ald) and a butanol dehydrogenase (bdhB). The plasmids pSB3C5_UUMKS 2 and pSB3C5_UUMKS 3 include the gene for a butyraldehyde/butanol dehydrogenase (adhE) and for a second butyraldehyde/butanol dehydrogenase (adhE2), respectively. After introducing the electron-transfer-flavoproteins 1-butanol was detected in E. coli. Thus, it was demonstrated that etfB/A co-expression is essential for the activity of the butyrylCoA dehydrogenase Bcd from C. acetobutylicum. 3. To investigate the butanol production in acetogenic bacteria such as C. ljungdahlii, the butanol-synthesis genes were cloned into the shuttle vector pIMP1 (3.3.3.). So far, the functional expression of the genes was proven by demonstrating the synthesis of 1-butanol from glucose in E. coli (3.3.4.). 5.b. Summary 149 4. Genome sequence analysis of C. acetobutylicum revealed a gene (CAC3330) encoding a P450 monooxygenase (CYP152A2). The gene coding for P450CLA was amplified and expressed in E. coli (3.6.). After overexpression and purification of P450 monooxygenase, substrate spectra and products were determined. It was demonstrated that P450CLA was able to catalyze the hydroxylation of fatty acids in the presence of hydrogen peroxide. According to a clear preference for hydroxylation at the α-position, the enzyme can be referred to as fatty acid α-hydroxylase (Girhard et al., 2007). 5. It could be shown that P450CLA accepts molecular oxygen as well and the electron donor H2O2 can be replaced. In this case, the use of redox partners is essential, providing electrons for catalysis. To identify potential electron transfer donors for the P450 monooxygenase from C. acetobutylicum, the flavodoxin genes CacFld1 (CAC0587) and CacFld2 (CAC3417) as well as the flavodoxin oxidoreductase gene CacFdR (CAC0196) from C. acetobutylicum ATCC 824 were amplified (3.6.). The genes were cloned and expressed in E. coli. The flavodoxin reductase (FdR) from E. coli was used as a redox partner, since flavodoxin reductase CacFdR (CAC0196) from C. acetobutylicum could not be purified in a functional form. CacFld1 was shown to accept electrons from FdR and transfer them to the P450 monooxygenase, demonstrating that this flavodoxin functions as an electron transfer partner of the P450 monooxygenase (Malca et al., 2010). 6. The "ClosTron® Gene Knockout System" was used for the specific disruption of CAC3330 coding for the P450 monooxygenase from C. acetobutylicum ATCC 824 (3.7.). The site-specific and directed inactivation of CAC3330 (integration site: 400/401) by insertion of group II introns was successful. In growth experiments, the consequences of the inactivation of CAC3330 were determined. However the analysis of the integration mutant showed no significant differences to the wild type strain. 6. Literatur 150 6. Literatur Adamse, A. D. 1980. New isolation of Clostridium aceticum (Wieringa). Ant. v. Leeuwenhoek 46: 523-531. Afschar, A. S., C. E. Vaz Rossell und K. Schaller. 1990. Bacterial conversion of molasses to acetone and butanol. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 168-171. Alsaker, K. V., und E. T. Papoutsakis. 2005. Transcriptional program of early sporulation and stationary-phase events in Clostridium acetobutylicum. J. Bacteriol. 187: 7103-7118. Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. 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Anhang 2,5 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue Abbildung 35: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml TY-Medium und 15 µg/ml Chloramphenicol unter semianaeroben Bedingungen Tabelle 53: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in TY-Medium unter semianaeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 1,46 1,40 1,35 1,46 1,44 1,46 1,33 pSB3C5_UUMKS 2 1,44 1,39 1,43 1,51 1,37 1,95 1,39 pSB3C5_UUMKS 3 1,49 1,49 1,47 1,54 1,26 2,02 1,35 7. Anhang 173 2,5 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue Abbildung 36: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml TY-Medium und 15 µg/ml Chloramphenicol unter anaeroben Bedingungen Tabelle 54: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in TY-Medium unter anaeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 1,45 0,92 0,93 0,82 1,51 2,14 1,85 pSB3C5_UUMKS 2 1,07 0,97 1,02 0,90 1,30 1,51 0,68 pSB3C5_UUMKS 3 1,11 1,04 1,11 1,90 1,42 1,16 0,94 7. Anhang 174 10 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 8 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE ® WL3 XL1-Blue Abbildung 37: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol unter semianaeroben Bedingungen Tabelle 55: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in TY-Medium mit 2 % Glucose unter semianaeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 7,35 7,95 7,24 4,48 3,29 6,26 5,80 pSB3C5_UUMKS 2 6,99 8,71 8,90 3,06 3,44 5,96 6,12 pSB3C5_UUMKS 3 8,36 7,95 7,82 7,15 2,90 6,38 3,77 7. Anhang 175 5 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 4 3 2 1 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue Abbildung 38: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol unter anaeroben Bedingungen Tabelle 56: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in TY-Medium mit 2 % Glucose unter anaeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 3,81 4,07 3,88 3,54 3,89 3,74 3,77 pSB3C5_UUMKS 2 4,11 3,87 3,93 3,30 4,35 3,49 3,37 pSB3C5_UUMKS 3 3,93 3,77 4,06 4,16 4,08 3,57 3,65 7. Anhang 176 10 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 8 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE ® WL3 XL1-Blue Abbildung 39: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose (sowie erneuter Glucose-Zugabe) und 15 µg/ml Chloramphenicol unter aeroben Bedingungen Tabelle 57: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in TY-Medium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zugabe) unter aeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 7,10 5,68 8,83 5,52 9,33 5,51 7,57 pSB3C5_UUMKS 2 7,02 7,46 7,35 5,38 5,50 4,98 5,25 pSB3C5_UUMKS 3 7,64 6,51 6,11 9,40 5,41 4,93 6,28 7. Anhang 177 14 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 12 Butanol [mM] 10 8 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE ® WL3 XL1-Blue Abbildung 40: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose (sowie erneuter Glucose-Zugabe) und 15 µg/ml Chloramphenicol unter semianaeroben Bedingungen Tabelle 58: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in TY-Medium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zugabe) unter semianaeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 6,82 6,65 9,43 5,32 6,40 7,12 7,08 pSB3C5_UUMKS 2 7,67 7,10 6,53 8,10 5,97 7,61 6,98 pSB3C5_UUMKS 3 7,25 7,34 7,44 11,61 6,83 7,26 7,02 7. Anhang 178 8 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue Abbildung 41: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml SD-8-Medium mit 2 % Glucose (sowie erneuter Glucose-Zugabe) und 15 µg/ml Chloramphenicol unter aeroben Bedingungen Tabelle 59: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in SD-8Medium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zugabe) unter aeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 5,30 1,35 2,25 6,69 1,92 1,70 1,28 pSB3C5_UUMKS 2 4,85 1,81 2,16 6,00 1,79 1,70 2,01 pSB3C5_UUMKS 3 1,15 1,12 1,85 1,73 1,30 1,65 1,83 7. Anhang 179 8 pSB3C5_UUMKS 1 pSB3C5_UUMKS 2 pSB3C5_UUMKS 3 Butanol [mM] 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue Abbildung 42: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pSB3C5_UUMKS 1, pSB3C5_UUMKS 2 und pSB3C5_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml SD-8-Medium mit 2 % Glucose (sowie erneuter Glucose-Zugabe) und 15 µg/ml Chloramphenicol unter anaeroben Bedingungen Tabelle 60: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in SD-8Medium mit 2 % Glucose (und erneuter Glucose-Zugabe) unter anaeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pSB3C5_UUMKS 1 1,42 1,11 2,94 2,55 1,86 6,83 1,92 pSB3C5_UUMKS 2 1,53 1,98 2,32 2,22 2,29 3,55 3,40 pSB3C5_UUMKS 3 2,60 1,91 2,34 2,43 2,18 4,39 1,81 7. Anhang 180 12 pIMP1_UUMKS 1 pIMP1_UUMKS 2 pIMP1_UUMKS 3 Butanol [mM] 10 8 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue Abbildung 43: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pIMP1_UUMKS 1, pIMP1_UUMKS 2 und pIMP1_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol unter aeroben Bedingungen Tabelle 61: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in TY-Medium mit 2 % Glucose unter aeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pIMP1_UUMKS 1 6,81 7,96 6,74 6,33 6,74 5,87 6,35 pIMP1_UUMKS 2 6,66 7,11 6,56 6,15 7,59 6,95 7,54 pIMP1_UUMKS 3 8,63 5,98 6,80 7,55 7,23 7,29 10,96 7. Anhang 181 12 pIMP1_UUMKS 1 pIMP1_UUMKS 2 pIMP1_UUMKS 3 Butanol [mM] 10 8 6 4 2 0 BL21 DH5HB101 JM109 SURE ® WL3 XL1-Blue Abbildung 44: Maximale Butanol-Konzentrationen der jeweiligen E. coli-Stämme mit den Plasmiden pIMP1_UUMKS 1, pIMP1_UUMKS 2 und pIMP1_UUMKS 3 bei Wachstum in 100 ml TY-Medium mit 2 % Glucose und 15 µg/ml Chloramphenicol unter anaeroben Bedingungen Tabelle 62: Maximal detektierte Butanol-Konzentrationen [mM] von E. coli in TY-Medium mit 2 % Glucose unter anaeroben Bedingungen Plasmid BL21 DH5α HB101 JM109 SURE® WL3 XL1-Blue pIMP1_UUMKS 1 6,60 7,71 9,50 6,08 6,80 8,12 8,83 pIMP1_UUMKS 2 5,61 6,34 8,21 6,60 9,63 8,21 7,06 pIMP1_UUMKS 3 8,78 6,92 9,15 7,64 5,39 5,95 6,84 Danksagung 182 Danksagung Bedanken möchte ich mich an erster Stelle bei Herrn Prof. Dr. Peter Dürre für die Überlassung des interessanten Themas und die Ermöglichung eines selbständigen wissenschaftlichen Arbeitens. Danke für die aufgebrachte Geduld bei der Durchsicht des Manuskripts und die Vorschläge zur Korrektur. Herzlichsten Dank für eine schöne Zeit am Institut in einer tollen Arbeitsgruppe. Vielen Dank an Herrn Prof. Dr. Bernhard Eikmanns für die Übernahme des Koreferats dieser Arbeit. Herzlichen Dank an alle ehemaligen und jetzigen Kollegen wie Dominik, Tobi, Hatice, Steffi, Thomas, Karin, Thiemo, Mandy, Meli, Iris, José, Sabrina, Fenja, Frank, Bettina, Käthe und Betina für eine einmalige Arbeitsatmosphäre und die schöne Zusammenarbeit. Es hat großen Spaß gemacht, mit Euch zu arbeiten. Bedanken möchte ich mich vor allem bei meinen GC-Mädels Simone und Sonja. Tausend Dank für Eure Hilfe, ich weiß es zu schätzen. Ganz herzlich möchte ich mich bei Michi bedanken, der mir während der gesamten Zeit immer mit unendlicher Geduld sowie mit Rat und Tat zur Seite stand. Ein besonderer Dank an Sandi, die mir eine gute und wichtige Freundin geworden ist und mit der ich einen unvergesslichen Urlaub in New York verbringen durfte. Danke auch für das schnelle Korrekturlesen dieser Arbeit. Ein Dankeschön geht natürlich auch an alle Arbeitskollegen und das gesamte Institut für die Hilfsbereitschaft, ein freundschaftliches Miteinander und einzigartige Stunden in der Kaffee-Ecke. Danke Euch allen. Speziellen Dank an Brigitte Z. und Brigitte E. dafür, dass ihr immer zur Stelle seid. Danke für Eure Hilfe, die vieles vereinfacht hat. Ein großes Dankeschön geht an meinen Bruder, Stiefbruder und alle meine Freunde, die für die erforderliche Abwechslung sorgten und hoffentlich auch sorgen werden. Vielen Dank an die "SATC-Crew" für viele lustige und erlebnisreiche Abende. Nicht zu vergessen mein Cousinchen Sabine, die nun ebenfalls in unseren "Dirndl-Club" eingetreten ist. Danksagung 183 Herzlichen Dank an Claudia und Annika für gemeinsame Unternehmungen, Gespräche und schöne Tage im Aktivurlaub. Schön, dass es Euch gibt. Bedanken möchte ich mich bei meiner Oma, für die leckeren Verköstigungen jeglicher Art und natürlich auch bei den Reinelts für zahlreiche gesellige Sonntagabende. Zu guter Letzt möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, ohne die ein Studium und eine Doktorarbeit niemals möglich gewesen wären. Vielen Dank für die Unterstützung und das entgegengebrachte Vertrauen. Lebenslauf 184 Lebenslauf 04.06.1981 Geburt in Memmingen 09/1987-07/1991 Besuch der Grundschule in Buxheim 09/1991-07/2000 Besuch des Gymnasiums Marianum in Buxheim Abschluß mit Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife 10/2000-10/2002 Grundstudium der Biologie an der Universität Ulm Abschluß mit der Diplomvorprüfung 10/2002-10/2004 Hauptstudium der Biologie an der Universität Ulm Hauptfach: Mikrobiologie Nebenfächer: Molekularbiologie, Pharmakologie und Toxikologie, analytische Chemie 01/2005-09/2005 Experimentelle Diplomarbeit am Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie an der Universität Ulm mit dem Thema "Molekularbiologische und immunologische Untersuchungen von Methyltransferreaktionen in Sporomusa ovata H1" 11/2005 Erlangen des akademischen Grades "Diplom-Biologin" 11/2005 Beginn der Arbeiten zur Dissertation am Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie an der Universität Ulm mit dem Thema "Expression von identifizierten clostridiellen Butanol-SyntheseGenen im Zwischenwirt Escherichia coli" Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet, sowie Zitate kenntlich gemacht habe. Ulm, im April 2010 Stefanie Schuster
