Synthesetrigger von aktiven Exportproteinen Männer bringen die

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ÿ Synthesetrigger von aktiven Exportproteinen
ÿ Männer bringen die Evolution voran
ÿ Phototrophe Gemmatimonadetes
ÿ Stoffwechsel auch ohne Zelle?
Lothar Jaenicke
Jochen Graw
Johannes Sander
© Springer-Verlag 2014
Synthesetrigger von aktiven Exportproteinen
Die aktive tertiäre Faltform eines Wirkproteins entsteht im Endoplasmatischen
Retikulum durch einen sekundären Suchvorgang unter den primär im Ribosom
synthetisierten Polypeptidketten und
wird dann ins Zytosol zum Weitertransport entlassen. Molekulare ChaperonKompartimente helfen, die Konformationsausbeute zu verbessern, indem sie
intra- und intercatenare Fehlaggregationen verhindern oder auflösen. Aber sie
helfen nicht nur, sondern suchen aktiv
nach Falschfaltungen mithilfe eines lange
vermuteten allgemeinen Chaperon-„Triggerfaktors“ (TF), der mit wachsenden und
mit in das Zytosol freiwerdenden Polypeptidketten wechselwirkt und sie
(aus)sortiert.
ó Er wurde nun von A. Mashaghi et al. (Nature
(2013) 500:98–101) bei Escherichia coli mit
konzeptuell intelligenter und technisch eleganter, optischer Pinzettenmethodik am Maltoseparadigma verifiziert.
Ein Maltose-Bindeprotein(MBP)-Molekül
wurde zwischen zwei Halterungen in einen Laser-Lichtstrahl positioniert. N-seits ist es über
eine Streptavidin/Biotin-Lasche mit einem
920 nm-langen DNA-Binder fixiert; am C-Ende
über einen Digoxygenin(D)/(D)-Antikörpermyc-tag-Aggregationskomplex an einer senkrecht zum Lichtstrahl bewegbaren Pipette um
bis zu 1 μM Länge (= x) dehnbar (Kraft in pN =
y) gehalten. Aufgezeichnet wird das x/y-Diagramm. Man beobachtet ohne TF zwischen voll
gefaltetem (N)- und voll gestrecktem (U)-Zustand reproduzierbare Stufungen in der
Längenverteilung nach dem Kette/Wurm-Modell von C. F. Marko und D. Siggia (Macromolecules (1995) 28:8759–8770). Im Dehnungs/Relaxations-Experiment mit TF werden
diese in charakteristischer Weise verschoben
und zu nahezu inverser neuer Ordnung vermehrt. TF bindet nachweislich an MBP-Bruchstücke, erhöht ihre Denaturierungstemperatur
und verzögert die Faltung der naszierenden
Polypeptidketten weit über die Zeit der Domänenbildung hinaus. Die native Konformation
einer im Entstehen begriffenen Polypeptidkette wird also direkt während der Synthese durch
Abschreiten der Energiefläche ausgekundschaftet.
Y Diese hier nachgewiesenen Wechselwirkungen in der enzymatischen Maltose-Synthese lassen extrapolieren, dass Chaperone und
Proteine allgemein ein positiv gekoppeltes Kontrollsystem zur Lieferung einwandfreier Produkte bilden.
Lothar Jaenicke ó
Männer bringen die Evolution voran
Mutationen in der Keimbahn bestimmen
das Tempo der molekularen Evolution, die
genetische Vielfalt und die genetische
Fitness. Die durchschnittliche Rate von
Punktmutationen beträgt bei Menschen
etwa 1,2 × 10–8 pro Basenpaar und Generation; daran sind Männer etwa 3–4 mal
häufiger beteiligt als Frauen – und mit
jedem zusätzlichen Jahr des Vaters (bei
der Konzeption) kommen genomweit
1–2 Mutationen hinzu.
ó Oliver Venn und seine Kolleginnen und Kollegen aus Oxford, UK, und Rijswijk, Niederlande, haben die Mutationsrate in unseren
nächsten Verwandten, den Schimpansen, bestimmt (Venn O et al., Science (2014)
344:1272–1275). Die Autoren haben dazu das
Genom von neun Schimpansen (Pan troglodytes verus) aus drei Generationen vollständig sequenziert. Innerhalb des ganzen Stamm-
baums gab es 375 autosomale Crossingovers;
58 Prozent davon stammten aus der männlichen Keimbahn. Ingesamt beobachteten die
Autoren 204 de novo-Punktmutationen; davon
sind die meisten C→T-Transitionen an CpGStellen. Die Mutationen kommen häufig in
Gruppen vor, d. h. bei 17 Prozent aller Punktmutationen befindet sich innerhalb 1 Mb eine
andere Mutation. Die Häufigkeit der Mutationen nimmt mit dem Alter des Vaters zu (3 Mutationen pro Jahr), aber nicht mit dem der
Mutter (6,7 de novo-Mutationen). Die Geschlechtsreife der männlichen Affen beginnt
mit ca. 8 Jahren; das Durchschnittsalter der
Väter in der Kohorte lag bei ca. 19 Jahren (in
der freien Wildbahn sind es ca. 24 Jahre). Die
Autoren berechnen für Schimpansen in der
freien Wildbahn ein Verhältnis der Mutationen
in der männlichen zur weiblichen Keimbahn
von 7,8.
Y Die Autoren diskutieren Unterschiede im
Sexualverhalten als Ursache für den Unterschied der männlichen Mutationsraten bei Menschen und Schimpansen: Menschen leben heute
überwiegend monogam, Schimpansen aber in
Gruppen mit vielen männlichen und weiblichen
Tieren. Daraus wird ein unterschiedlicher
Selektionsdruck auf die Keimzellen abgeleitet:
wenn ein Schimpansen-Weibchen sich mit mehreren männlichen Tieren paart, bedeutet das
einen höheren Selektionsdruck auf die Spermien der Schimpansen. Um die Hypothese zu
testen, wollen die Autoren die Mutationsrate
bei Gorillas bestimmen: Gorillas leben in Gruppen mit einem dominierenden männlichen Tier
und vielen weiblichen Tieren – so sollte die
Mutationsrate bei männlichen Gorillas niedriger sein als bei Menschen.
Jochen Graw ó
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Wolfgang Buckel
Thorsten M.
Hoffmann
Tobias Madl
Cornelia Welte
Volkmar Braun
Daniel-Christoph
Wagner
Phototrophe Gemmatimonadetes
Außer Pflanzen betreiben auch Vertreter
von sechs Bakterienphyla eine (Bacterio-)
Chlorophyll-basierte Photosynthese:
Cyanobakterien, Proteobakterien, Chlorobien, Chloroflexi, Firmicutes und Acidobacterien. Jetzt kann diese Liste durch
einen Vertreter aus dem seltenen und bislang kaum untersuchten Phylum Gemmatimonadetes erweitert werden.
ó Yonghui Zeng et al. (Proc Nat Acad Sci USA
(2014) 111:7795–7800) fanden unter zahlreichen aus einem Süßwassersee in der Wüste
Gobi isolierten, phototrophen Proteobakterien
auch ein bevorzugt semiaerob wachsendes
Bakterium (Isolat AP64), dessen 16S-rRNA zu
96 Prozent mit der 16-sRNA von Gemmatimonas aurantiaca T-27T – dem Typstamm der
Gemmatimonadetes - übereinstimmt. Die Gesamtgenomsequenz des Bakteriums offenbarte ein vollständiges Photosynthesegencluster (PGC) sowie Gene für die Glykolyse und
den Citratzyklus, während kein Stoffwechselweg zur Fixierung von anorganischem Kohlenstoff gefunden werden konnte. Das PGC
wird exprimiert und liefert einen funktionierenden Photosyntheseapparat mit Typ-II-Reaktionszentrum (Chinontyp). AP64 lebt somit
wahrscheinlich fakultativ photoheterotroph
und nutzt die Lichtenergie wie andere aerobe
und anoxygen-phototrophe Bakterien mit Bacteriochlorophyll (ABC-Bakterien) nur als Zubrot
zu seiner ansonsten chemotrophen Lebensweise. Hinweise auf entsprechende Stämme
wurden auch im Yellowstone Lake und in dänischem Abwasser gefunden
Y Wahrscheinlich haben die heute phototrophen Vertreter der Gemmatimonadetes ihren
Photosyntheseapparat (der Zusatz „-synthese“
ist hier eigentlich unangebracht, da keine CO2Fixierung stattfindet) wahrscheinlich einst
durch horizontalen Gentransfer von einem Purpurbakterium erhalten. PGCs können nachweislich durch Phagen, Gentransfergen(GTA)Partikel oder Plasmide übertragen werden.
Ungewöhnlich ist jedoch die große phylogenetische Distanz zwischen Spender und Empfänger.
Johannes Sander ó
Jochen Schmid
Martin Daus
Kurz gefasst
Stoffwechsel auch ohne Zelle?
ó Neues Nukleotidylzyklasetoxin
entdeckt
Der Erreger des Keuchhustens, Bordetella pertussis, und der des Milzbrands, Bacillus anthracis, produzieren Calmodulin-stimulierte Adenylylzyklase(AC)-Toxine, die in Zellen des
Immunsystems die Konzentration von cAMP
massiv erhöhen und dadurch die Infektabwehr
paralysieren. Das Typ-III-Sekretionsprotein
ExoY von Pseudomonas aeruginosa ist eine
Nukelotidylzyklase (NC), die vor allem die
cGMP und cUMP produziert und Zelltod induziert (Beckert U et al., Biochem Biophys Res
Commun (2014) 450:870–874). Vibrio vulnificus kann schwere Infektionen beim Menschen
hervorrufen und produziert ein Biotyp-3MARTX-Toxin, das strukturelle Ähnlichkeit mit
ExoY besitzt (Ziolo KJ et al., Infection Immunity (2014) 82:2148–2157). Das Toxin besitzt ACAktivität, die aber noch niedriger ist als die
entsprechende niedrige AC-Aktivität von ExoY.
Eine potenzielle NC-Aktivität des MARTX-Toxins
ist bislang noch nicht untersucht worden, aber
es ist wahrscheinlich, dass das Toxin auch
cGMP, cUMP und cCMP produziert. In Anbetracht der immer größer werdenden Problematik der Antibiotika-Resistenz stellen bakterielle NC-Toxine eine hochinteressante Zielstruktur für neue Antibiotika dar.
Roland Seifert
Markus A. Keller et al. (Mol Syst Biol
(2014) 10:725) fanden, dass das Erhitzen
von Fruktose-1,6-bisphosphat oder
6-Phosphoglukonat in reinem Wasser
(70 °C, 5 h) zu Intermediaten der Glykolyse und des Pentosephosphatzylus führt.
Zugabe von Fe(II) beschleunigt diese
Reaktionen und vermehrt die Anzahl der
Intermediate. Diese Experimente weisen
darauf hin, dass unter den vermuteten
Bedingungen des Urozeans wichtige
Stoffwechselwege schon vor dem Entstehen der Enzyme abgelaufen sein könnten.
ó Enzyme haben also keine neuen Stoffwechselwege geschaffen, sondern bereits existierende gefördert und in geordnete Bahnen
gelenkt. Diese Ergebnisse haben bei manchen
Lesern den Eindruck hinterlassen, dass diese
Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Entstehung des Lebens liefere
(www.scinexx.de/wissen-aktuell-17503-201404-29.html). Doch im Urozean gab es sicher
weder Fruktose-1,6-bisphosphat noch 6-Phos-
ó Bakterielle Tyrosin-Phosphatase
kontrolliert pflanzliche Immunantwort
Das Molekül-Wechselspiel bei der Wurzelknöllchenbildung der Leguminosen nach NodBindung bewirkt an die Plasmamembran eine
Konformationsänderung durch die HMGCoAReduktase, durch die die Gen-Kette für die
Knöllchen-Morphogenese in Gang kommt
(Charpentier M et al., Plant Cell (2008)
20:3467–3479). Auch die konstitutive Immunität der Pflanzen beruht auf der Erkennung
von Molekülmustern der Pathogene (PAMP)
durch passende Rezeptoren (PRR) auf der passiven Wirtszell-Oberfläche. Viele von ihnen sind
Kinasen; so auch die EFR-Rezeptorkinase von
Arabidopsis thaliana (at). Sie erkennt EF-TU
(elongation factor thermo unstable) abgeleitete elf18-Peptide des pathogenen Pseudomonas syringae (ps) an mehreren Resten und
phosphoryliert diese. Das ausschlaggebende
Signal für die Aktivierung ist die Markierung
von Tyr1836. Sie wird im dynamischen
Wirt/Gast-Konkurrenzsystem durch ps-TyrPhosphatase HopAO1 spezifisch gespalten und
kontrolliert dadurch die Immunantwort (Macho
AP et al., Science (2014) 343:1509–1512).
Lothar Jaenicke
BIOspektrum | 06.14 | 20. Jahrgang
phoglukonat. Diese Verbindungen mussten
erst aus CO2 und Wasserstoff über Essigsäure und Brenztraubensäure synthetisiert werden. Da die Reduktionskraft des Wasserstoffs
nicht ausreicht, um CO2 über CO zu Essigsäure zu reduzieren, wird ein bifurkierendes System benötigt, dass ein stärker reduzierendes
Agens wie das heutige Ferredoxin bereitstellt
(Buckel W et al, Biochim Biophys Acta (2013)
1827:94–113). Außerdem musste eine Kompartimentierung durch eine Protozelle stattfinden, damit die Syntheseprodukte nicht sofort vom Ozean ausverdünnt werden.
Y In der Protozelle könnte ein elektrochemischer Na+-Gradient aufgebaut werden, der ATPSynthese ermöglicht (Martin WF et al., Science
(2014) 344:1092–1093). Ohne ATP gibt es kein
Fruktose-1,6-bisphosphat oder 6-Phosphogluconat, die – wie von Keller et al. gefunden –
ohne Enzyme zu Ribose-5-phosphat, einem Baustein der RNA und einer Vorstufe der DNA,
umgesetzt werden könnten.
Wolfgang Buckel ó
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ÿ Wirkung von Leucin auf den mTORC1-Signalweg
ÿ Verschränkung der Hippo- und Wnt-Signalwege
ÿ Darm-Mikrobiota staatenbildender Bienen und Hummeln
ÿ Murein-Flippase: MurJ oder FtsW?
Wirkung von Leucin auf den mTORC1-Signalweg
Die Proteinbiosynthese wird in Gegenwart von Wachstumsfaktoren und Aminosäuren durch den Proteinkomplex
mTORC1 aktiviert. Nach allen bisherigen
Modellen ist für die Aminosäuren-induzierte Aktivierung von mTORC1 dessen
Rekrutierung an die lysosomale Membran
essenziell. J. Averous et al. (Cell Signal
(2014) 26:1918–1927) zeigten, dass dies
bei Leucin nicht zutrifft.
ó Mittels Immunfärbung konnte gezeigt werden, dass bei Kultivierung von HEK293-Zellen
in Aminosäure-haltigem Medium mTORC1 an
die lysosomale Membran lokalisiert und aktiv
ist, was sich in der Phosphorylierung der
mTORC1-Substrate p70S6K und 4E-BP1 äußert. Bei Zellen, die in Aminosäure-freies Medium überführt werden, zeigt sich schon nach
kurzer Zeit eine diffuse Verteilung von
mTORC1 über die Zelle und eine Inaktivierung
der mTORC1-Kinaseaktivität. Wird den Zellen
statt allen Aminosäuren nur Leucin entzogen,
findet ebenso keine Phosphorylierung der
mTORC1-Substrate statt. Interessanterweise
bleibt jedoch der mTORC1-Komplex am Lysosom lokalisiert.
Die Aktivierung von mTORC1 kann in Zellen,
die in Aminosäure-freiem Medium „ausgehungert“ wurden, wiederhergestellt werden, indem
alle Aminosäuren oder lediglich Leucin in das
Medium gegeben wird. Im ersten Fall wird
mTORC1 zum Lysosom rekrutiert, im zweiten
Fall nicht. Werden alle Aminosäuren außer Leucin zugegeben, lokalisiert mTORC1 zwar am
Lysosom, die mTORC1-Substrate p70S6K und
4E-BP1 werden allerdings nicht phosphoryliert.
Leucin ist somit zur Aktivierung von
mTORC1 notwendig und ausreichend – die Lokalisierung von mTORC1 an die lysosomale
Membran ist dabei nicht essenziell und wird
wahrscheinlich durch andere Aminosäuren
initiiert.
Die Rekrutierung von mTORC1 an die lysosomale Membran wird durch die Rag-GTPasen
vermittelt. Bei einem Knock-down von Rag C
und D ist zwar die Lokalisierung von mTORC1
an das Lysosom gestört, dennoch findet keine
Abnahme der p70S6K- und 4E-BP1-Phosphorylierung statt. Auch dies zeigt, dass die Lokalisierung von mTORC1 an die lysosomale
Membran nicht obligatorisch für dessen Aktivität ist.
Y Die Regulation des mTORC1-Signalweges
ist ein äußerst komplexes Themengebiet, das
durch die Arbeit von Averous et al. um wichtige Punkte erweitert wurde. Dabei muss in allen
bisherigen Modellen nicht nur die Rolle des
Lysosoms, sondern auch die der Rags bei der
mTORC1-Aktivierung detaillierter bestimmt werden. Beides ist komplexer, als bisher angenommen.
Thorsten M. Hoffmann ó
Verschränkung der Hippo- und Wnt-Signalwege
Die Hippo- und Wnt-Signalübertragungswege treten in allen Stämmen des Tierreichs auf und sind von entscheidender
Bedeutung in einer Vielzahl von Entwicklungsprozessen wie Zellwachstum, Differenzierung und Homöostase. Um ein ausgewogenes Wachstum und die Reparatur
von Gewebe zu gewährleisten, müssen
diese Signalwege in Abstimmung handeln. In einer herausragenden Publikation
berichtet die Gruppe von Stefano Piccolo
wie diese Signalwege miteinander verschränkt sein könnten (Cell (2014)
158:1–14).
ó In vielen Krebsarten findet man eine Aktivierung des Wnt- in Kombination mit einer Deaktivierung des Hippo-Signalwegs. Diese
gegenläufigen Effekte auf das Wachstum üben
die Synthesewege über ähnliche Steuerungsmechanismen unter Verwendung sekundärer
Botenstoffproteine aus. Aktivierung des WntSignalwegs führt zur Stabilisierung des Botenstoffs β-Catenin. Dadurch kann β-Catenin
in den Zellkern gelangen, wo es die Expression
von Wnt-Zielgenen induziert. Aktivierung des
Hippo-Signalwegs führt zum Gegenteil – die
Botenstoffe YAP/TAZ werden aus dem Zellkern
in das Zytoplasma transportiert, und die Genexpression unterdrückt. Sowohl β-Catenin, als
auch YAP1/TAZ werden im Zytoplasma phosphoryliert, ubiquitiniert, und abgebaut. Und sie
binden aneinander – YAP1 und TAZ bilden
Homo- und Heterodimere, und jedes der beiden Proteine kann an β-Catenin binden.
In einer kürzlich erschienenen Arbeit wurden nun erstmals experimentelle Beweise dafür geliefert dass YAP und TAZ integrale Bestandteile des β-catenin destruction complex
sind (Bernier R et al., Cell (2014) 158:1–14).
Dieser große Multi-Protein-Komplex dient dem
Wnt-Signalweg zur strengen Regulierung freier
β-Catenin-Mengen. YAP/TAZ wird ebenso wie
β-Catenin in den destruction complex eingebaut, was zu einer Deaktivierung der Expression von Hippo-Zielgenen führt. Die
Gegenwart von YAP/TAZ verstärkt den Abbau
von β-Catenin durch Rekrutierung der E3-Ubiquitinligase β-TrCP. Dies stellt den bislang
angenommenen Abbaumechanismus von
β-Catenin in Frage.
Außerdem wird YAP/TAZ nach Aktivierung
des Wnt-Signalwegs aus dem destruction complex entfernt, lokalisiert im Zellkern und aktiviert die Expression von YAP/TAZ-Zielgenen.
Dies hat wichtige Auswirkungen im Bereich von
Wnt-assoziierten Krebserkrankungen; oft
kommt es in diesem Zusammenhang zu einer
Aktivierung von YAP/TAZ. Deaktivierung von
YAP/TAZ wirkt der Proliferation und Selbsterneuerung von Krebszellen entgegen und könnte einen neuen Behandlungsansatz darstellen.
Y Diese Arbeit zeigt erstmals die molekularen Mechanismen der Verschränkung der Hippo- und Wnt-Signalwege auf. Dieser Schritt ist
essenziell um die Grundlagen der Gewebeentwicklung, deren Regeneration sowie Störungen
darin in Krebserkrankungen zu verstehen.
Tobias Madl ó
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Darm-Mikrobiota staatenbildender Bienen und Hummeln
Die Darm-Mikrobiota von Tieren rückt
immer näher in den Fokus der Wissenschaft, da klar wird, wie wichtig diese
Tier-assoziierten Mikroorganismen für
das Wohlergehen ihres Wirts sind. Eusoziale Bienen sind hierfür ein interessantes
Modellsystem, da sie eine relativ einfache
Mikrobiota besitzen. W. K. Kwong et al.
erklären in ihrer Studie (Proc Nat Acad
Sci USA (2014), doi: 10.1073/pnas.
1405838111), wie sich zwei Bakterienarten an ihren Bienen- und Hummelwirt
angepasst haben.
ó Bienen (Apis spp.) und Hummeln (Bombus
spp.) sind staatenbildende Insekten, die eine
einfache Darm-Mikrobiota besitzen. Acht Bakterienarten bilden etwa 95 Prozent der ge samten Mikrobiota, wobei Snodgrassella alvi
(Familie Neisseriaceae) und Gilliamella apicola (Familie Orbaceae) am häufigsten vorkommen. Die amerikanischen Wissenschaftler sequenzierten Stämme beider Bakterienarten
aus Hummeln und Bienen und verglichen die
Genome. Es zeigte sich, dass G. apicola aus
Bienen ein um etwa 800 kb größeres Genom
besitzt, das vermehrt Kohlenhydrat-abbauende Enzyme codiert. Die Autoren vermuten,
dass diese über horizontalen Gentransfer von
den Firmicutes stammen und G. apicola somit über ein großes Pan-Genom, vor allem bei
den Bienen, verfügt. Die Genome von S. alviIsolaten aus Hummeln und Bienen ähnelten
sich und enthielten darüber hinaus viele Gene,
die für Oberflächenproteine codieren, die direkt an das Darmepithelium der Tiere binden
– Indizien dafür, dass S. alvi eng mit seinem
Wirt assoziiert ist. Beim Vergleich von S. alviund G. apicola-Genome fiel auf, dass sich zentrale Stoffwechselwege in den zwei Bakterienarten ergänzen: G. apicola verstoffwechselt Kohlenhydrate zu Pyruvat, kann dieses
aber nicht weiter im Citratzyklus verwerten; es
wird Laktat abgegeben. S. alvi fehlen Schlüsselenzyme der Glykolyse, jedoch kann Laktat
aufgenommen und über Pyruvat in den Citratzyklus eingeschleust werden. Neben diesen
gibt es noch weitere sich gegenseitig ergänzende Eigenschaften der beiden Bakterienarten. Ausserdem konnten die Autoren zeigen,
dass die Bakterien der einzelnen Darm-Mikrobioten einen hohen Grad an horizontalem Gentransfer innerhalb einer Insektenart aufweisen,
nicht aber zwischen Hummeln und Bienen.
Y Bienen und Hummeln besitzen eine einfache Darm-Mikrobiota und geben diese durch
die Staatenbildung auch an Nachkommen weiter. Viele Aspekte wie horizontaler Gentransfer, Genom-Evolution, Pan-Genome und WirtMikrobe-Interaktionen können an diesem Insekten-Modellsystem sehr gut untersucht werden
und führen zu wertvollen Erkenntnissen, die
auch für das Verstehen der Säugetier-Mikrobiota genutzt werden können.
Cornelia Welte ó
Murein-Flippase: MurJ oder FtsW?
Die Zellwand von Bakterien enthält ein
Makromolekül, Murein oder Peptidoglycan, gegen das die Zytoplasmamembran
(ZM) durch den internen osmotischen
Druck gepresst wird. Die Zerstörung des
Mureins durch Penicillin oder Lysozym
führt zur Lyse der Zellen. Die Biosynthesevorstufe Undecaprenyl-PP-MurNAc-(Pentapeptid)-GlcNAc (Lipid II) wird an der
Innenseite der ZM synthetisiert, durch die
ZM transferiert und in das existierende
Murein eingebaut. Die Mureinbiosynthese
ist bekannt, jedoch blieb der Transfer der
amphipathischen Vorstufe durch die
hydrophobe ZM offen.
ó Zum Nachweis des Transmembrantransfers
mussten Methoden entwickelt werden, die zwischen der Bindung der Vorstufe an die zytoplasmatische Innenseite und an die periplasmatische Außenseite der ZM unterscheiden.
L.-T. Sham et al. (Science (2014) 345:220–222)
benutzten hierzu ein Escherichia coli-Proteintoxin, Colicin M, das im Periplasma die Bindung
zwischen dem Undecaprenyl-PP und der Mureinvorstufe spaltet. Freigesetztes PP-MurNAcPentapeptid-GlcNAc wurde über HPLC nachgewiesen. Der schon früher geäußerte Verdacht, dass MurJ als Flippase dient, wurde
durch chemische Inaktivierung von MurJ bestätigt. Da MurJ-Mutanten letal sind, wurden
BIOspektrum | 06.14 | 20. Jahrgang
39 Cysteinreste in MurJ eingeführt und gemessen, welche Mutante durch Umsetzung mit
einem Cystein-spezifischen Reagenz (MTSES)
inaktiviert wird. In der Cysteinmutante setzte
Colicin M ohne MTSES-Behandlung Mureinvorläufer frei, nach MTSE-Behandlung wurde
keine Vorstufenfreisetzung beobachtet. Die
ausgelöste Lyse der MTSES-inaktivierten MurJZellen wurde durch gleichzeitige Präsenz von
Wildtyp-MurJ verhindert. Die Experimente zeigen überzeugend, das MurJ als Flippase der
Mureinvorstufe dient.
In früheren Experimenten wurde das FtsWProtein als Flippase identifiziert (Mohammadi T
et al., EMBO J (2011) 30:1425–1432). FtsW
ist ein für die Zellteilung essenzielles ZM-Protein. Lipd II und Vancomycin wurden unterschiedlich fluoreszenzmarkiert. Bindung von
Vancomycin an Lipid II führt zu einem FRET-Signal. Da Vancomycin nicht die ZM passiert, markiert es Lipid II an der Außenseite der ZM. NBDmarkiertes Lipid II wurde in E. coli-Membranvesikeln synthetisiert. Dazu wurden die Vorstufen NBD-UDP-MurNAc-PP und UDP-GlcNAC
zur Lipid II-Synthese durch eine Gefrier-Tau-Prozedur in das Lumen der Vesikel gebracht. Bei
Zugabe von Vancomycin erhöhte sich das FRETSignal, das durch Überproduktion von FtsW gesteigert, durch Reduktion von FtsW vermindert
wurde. Ferner wurde gereinigtes FtsW zusam-
men mit NBD-Lipid II in unilamminaren Vesikeln
rekonstituiert. FtsW erhöhte Lipid II an der
Außenseite der Vesikel, dessen Fluorezenz
durch Dithionit gelöscht wurde. Lys und Arg in
der Transmembranhelix 4 wurden als notwendig für die Flippaseaktivität identifiziert. In dem
in vivo-Verfahren mit Colicin M wird die Lipid IITranslokation in einer FtsW-Mutante, die durch
einen regluierbaren FtsW-Wildtyp komplementiert wurde, nicht wesentlich beeinträchtigt. Das in vivo-Verfahren ist experimentell
einfacher und weniger störanfällig als das
in vitro-Verfahren. Letzteres zeigt aber eindeutig eine Lipid II-Translokation durch FtsW. Es ist
möglich, dass beide Proteine als Mureinvorstufen-Flippasen aktiv sind und FtsW den
hohen lokalen Bedarf an Vorstufen bei der Septumsbildung mit abdeckt.
Y Die Geschwindigkeit, mit der Flippasen
Lipid II transferieren, beträgt mehrere Millionen
Moleküle pro 30 Minuten Generationszeit. Das
Bakterien-spezifische Murein ist bevorzugter
Wirkort von Antibiotika, insbesondere von BetaLactam-Antibiotika. Die Kenntnis der Flippasen, vor allem der hydrophilen Pore mit geladenen Aminosäuren, sowie das in vivo-Testverfahren eröffnen die gezielte Suche nach wasserlöslichen Bakterien-spezifischen Wirkstoffen, die den Transmembran-Vorstufentransfer
hemmen.
Volkmar Braun ó
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W I S S EN SCH AFT · JOU R NAL CLUB
ÿ Wie unser Mikrobiom die Gesundheit beeinflusst
ÿ Generalisierte Methode der bakteriellen Genommodifikation
ÿ Amyloidogen oder nicht?
Wie unser Mikrobiom die Gesundheit beeinflusst
Eine aktuelle tierexperimentelle Studie
(Cox LM et al., Cell (2014) 158:705–721)
zeigt, dass eine Antibiotikatherapie direkt
nach der Geburt die sich entwickelnde
Darmflora stört. Dies führt wiederum zu
einer dauerhaften metabolischen Umprogrammierung und zu einem erhöhten
Risiko für Adipositas.
ó Adipositas ist eine komplexe metabolische
Störung, die maßgeblich das Risiko für die großen Volkskrankheiten Herzinfarkt, Schlaganfall und Krebs bestimmt. Neben alimentären und genetischen Ursachen kann Adipositas auch durch Veränderungen der Darmflora
(microbe-induced obesity, MIO) verursacht
werden.
Die Tatsache, dass eine Antibiotikagabe im
frühen Lebensalter zu einer Steigerung des
Körpergewichts führt, ist seit langem bekannt
und wird intensiv in der Tiermast ausgenutzt.
In den letzten Jahren verdichteten sich die Hin-
weise, dass Antibiotika die Symbiose zwischen
Wirt und Mikrobiom stören und so eine MIO
verursachen können.
Dieser Pathomechanismus konnte nun in einer umfangreichen Mausstudie bestätigt werden. Die chronische, niedrigdosierte Gabe von
Penicillin führte zu einer Störung der Darmflora
junger Mäuse; besonders betroffen waren dabei Penicillin-sensible Bakterien wie Candidatus Arthromitus und Allobaculum, die vorübergehend den jungen Darm bevölkern. Gerade diese Bakterien scheinen jedoch für eine gesunde Immunhomöostase der Darmwand
notwendig zu sein. Die Autoren vermuten, dass
eine Störung der lokalen Immunbarriere während eines kritischen Zeitfensters zu einer Programmierung langanhaltender metabolischer
Veränderungen führt. Entsprechende Surrogate wie Adipositas, Leberverfettung, ein veränderter Fettsäurestoffwechsel und eine gestörte Insulinreaktion waren tatsächlich lange
nach Beendigung der Penicillintherapie und
Normalisierung der Darmflora nachweisbar.
Natürlich weisen Menschen ein komplexeres Verhältnis zwischen Wirt und Mikrobiom
auf als Mäuse, die unter standardisierten Haltungs- und Ernährungsbedingungen untersucht werden können. Das Konzept der metabolischen Programmierung durch frühzeitige
Antibiotikagabe muss daher in weiteren Studien auf seine Relevanz im Menschen überprüft werden.
Y Diese Studie weist auf eine bisher unbekannte, unerwünschte Wirkung von Antibiotika im jungen Lebensalter hin. Eine direkte
Behandlung mit Antibiotika oder die indirekte
Aufnahme über die Muttermilch oder über
belastete Lebensmittel könnte das Risiko für
Adipositas und die entsprechenden Folgeerkrankungen langfristig erhöhen.
Daniel-Christoph Wagner ó
Generalisierte Methode der bakteriellen Genommodifikation
Effiziente Methoden zur Genom-Modifikation, anwendbar auf ein breites Spektrum
an Bakterienarten, sind selten und müssen meist mühsam und zeitintensiv an die
jeweiligen Zielorganismen angepasst werden. Die Gruppe um Peter J. Enyeart veröffentlichte eine Modifikationsmethode
basierend auf der Kombination aus Gruppe II-Introns und dem Cre/lox-System,
welche sie als GETR (Genome Editing via
Targetrons and Recombinase) bezeichneten (Molecular Systems Biology (2013)
9:685).
ó Hierbei werden mittels der mobilen Gruppe II-Introns (Retroelemente) lox-Erkennungssequenzen in spezifische genomische Loci eingebracht, wodurch genomweite Modifikationen ermöglicht werden. Die Introns codieren
eine reverse Transkriptase und können mittels
retrohoming gezielt in spezifische DNA-Zielsequenzen eingebracht werden. Das retrohoming wird durch einen Ribonukleoprotein-
Komplex (RNP) ermöglicht, welcher während
RNA-splicing gebildet wird. Dieser Ribonukleoprotein-Komplex besteht aus dem Intron-codierten Protein (IEP) und der ausgeschnittenen
Intron-RNA in Lassoform. Der gesamte RNP initiiert die Mobilität aufgrund der Erkennung einer spezifischen doppelsträngigen DNASequenz durch das IEP und der passenden
Basenpaarung der Intron-RNA. Hierbei entwindet das IEP nach der Erkennung die lokale
DNA-Doppelhelix und ermöglicht so der IntronRNA die exakte Anlagerung an die angrenzenden komplementären 14–16 bp langen
DNA-Sequenz. Die gezielte Einbringung dieser
komplementären Sequenzen in das Intron
mittels PCR erlaubt die spezifische Lokalisierung im Zielgenom. Die Ermittlung dieser passenden Sequenz zur Einbringung in das Intron
erfolgt anhand eines eigens entwickelten
Algorithmus.
Y Mit diesem System wurden eindrucksvoll
Insertionen, Deletionen und Inversionen inner-
halb des Genoms von Escherichia coli durchgeführt. Modifikationen wie z. B. die Insertion
des 12 kb-Polyketidsynthase-Operons in das
lacZ-Gen zeigen die Möglichkeiten dieses Ansatzes auf. Zusätzlich wurden mehrere gleichzeitige, sowie aufeinanderfolgende Deletionen von
bis zu 120 kb demonstriert. Das System ermöglicht zudem Inversionen großer DNA Sequenzen
(1,2 Mb) oder die Exzision chromosomaler
Sequenzen (120 kb) und deren gezielten Wiedereinbau an anderer Stelle im Genom (1,5 Mb
Entfernung). Die in den durchgeführten Ansätzen erreichten Effizienzen von bis zu 100 Prozent sind im Vergleich zu anderen Methoden,
wie z. B. die Verwendung von suicide-Vektoren,
sehr hoch. Das System wurde zusätzlich erfolgreich in Bacillus subtilis, Staphylococcus
aureus und Shewanella oneidensis angewandt
und weist somit ein hohes Potenzial als generalisierte Methode der Genommodifikation
auch in Bereich der Synthetischen Biologie auf.
Jochen Schmid ó
BIOspektrum | 06.14 | 20. Jahrgang
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Amyloidogen oder nicht?
Bakterien werden routinemäßig zur
Generierung von heterologen Genprodukten verwendet. Dabei könnte die
Synthese von funktionellen Amyloiden,
d. h. β-Faltblatt-reichen Isoformen von
diversen zellulären Proteinen, einen
Beitrag zum Verständnis des amyloiden Prinzips leisten, das auch neurodegenerativen Erkrankungsformen
zugrunde liegt.
ó Zahlreiche Proteine von Bakterien, Pilzen und Tieren sind in der Lage, amyloide
Aggregate zu bilden, die mit einer biologischen Funktion verbunden und in manchen
Fällen auch pathogen sein können. Beispiele sind fehlgefaltete Proteine neurodegenerativer Erkrankungen beim Menschen,
Amyloide bei Pilzen, welche als epigenetische Faktoren fungieren können oder auch
Amyloide auf Zelloberflächen Biofilm-bildender Bakterien. V. Sivanathan und A.
Hochschild stellen eine zellbasierte Methode zur Generierung amyloider Aggregate in Escherichia coli vor (Nature Protocols
(2013) 8:1381–1390). Das bakterielle Curli-System, welches den Export von Proteinen des Biofilmes in Form von Amyloiden
koordiniert, wird hierfür genutzt. Dabei wird
die N-terminale Signalsequenz der CurliUntereinheit CsgA an ein zu untersuchendes Protein fusioniert, was den Export an
die Zelloberfläche ermöglicht und zur Bildung von Amyloidfibrillen führen kann. Somit stellt diese Methode erstmals ein E. coli-basiertes Expressionssystem zur Generierung amyloider Aggregate dar, das sich
ideal zur Identifikation potenziell amyloidogener Proteinen eignet.
Y Diese Möglichkeit der zellbasierten Amyloidsynthese kann verwendet werden, um
potenziell amyloidogene Proteine aus verschiedenen Reichen des Lebens in E. coli zu
identifizieren. Eine Analyse dieser Amyloide
hinsichtlich einer biologischen Funktion und
Struktur kann einen entscheidenden Beitrag zum Verständnis des amyloiden Prinzips generell leisten.
Martin Daus ó
Prof. Dr. Lothar Jaenicke, Institut f. Biochemie, Universität zu Köln, Zülpicher Straße 47, D-50674 Köln
Prof. Dr. Jochen Graw, Helmholtz Zentrum München – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und
Umwelt GmbH, Ingolstädter Landstraße 1, D-85764 Neuherberg, [email protected]
Dr. Johannes Sander, Falkenstraße 87, D-58553 Halver, [email protected]
Prof. Dr. Wolfgang Buckel, Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie und Fachbereich Biologie,
Universität Marburg, D-35032 Marburg, [email protected]
Dr. Thorsten M. Hoffmann, College of Life Science, University of Dundee, Dow Street, DD15EH Dundee, UK,
[email protected]
Dr. Tobias Madl, Fakultät für Chemie, TU München, Lichtenbergstraße 4, D-85748 Garching, [email protected]
Dr. Cornelia Welte, Radboud University Nijmegen, Heyendaalseweg 135, NL-6525 AJ Nijmegen, Niederlande,
[email protected]
Prof. Dr. Volkmar Braun, Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie, Spemannstraße 35, D-72076 Tübingen,
[email protected]
Dr. Daniel-Christoph Wagner, Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie, Perlickstraße 1,
D-04103 Leipzig, [email protected]
Dr.-Ing. Jochen Schmid, Lehrstuhl für Chemie Biogener Rohstoffe, TU München, Schulgasse 16,
D-94315 Straubing, [email protected]
Dr. Martin L. Daus, Robert Koch-Institut, Nordufer 20, D-13353 Berlin, [email protected]
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