Tierärztliche Hochschule Hannover
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Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen zu 3g-Nanotechnologien als Basis für ein gezieltes Drug-Delivery-System am Modell des Meerschweinchen-Innenohres INAUGURAL–DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von Melanie Wolf Berlin Hannover 2009 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Manfred Kietzmann Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Prof. Dr. Timo Stöver Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover 1. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann Prof. Dr. Timo Stöver 2. Gutachter: Prof. Dr. Andrea Meyer-Lindenberg Tag der mündlichen Prüfung: 11. November 2009 Gefördert durch die Europäische Union im Rahmen des „Nanotechnology-based targeted drug-delivery“ – Projektes „NanoEar“ (Projektnummer NMP4-CT-2006-026556). Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Verzeichnis eigener Vorträge, Poster und publizierter Vortragskurzfassungen Verzeichnis der im Text verwendeten wichtigsten Abkürzungen 1 EINLEITUNG............................................................................................... 1 2 ZIELSETZUNG ........................................................................................... 5 3 LITERATURÜBERSICHT......................................................................... 6 3.1 Das auditorische System der Säugetiere..................................................................... 6 3.1.1 Topographische Anatomie des Hörorganes ........................................................ 7 3.1.2 Physiologie des Hörvorganges ........................................................................... 9 3.1.3 Audiometrische Untersuchungsmethoden ........................................................ 12 3.2 3.1.3.1 Allgemeines zu unterschiedlichen Hörprüfmethoden ....................... 12 3.1.3.2 Akustisch evozierte auditorische Hirnstammpotenziale ................... 13 Pathophysiologie von Hörminderung und Ertaubung............................................ 15 3.2.1 Allgemeines zur Einteilung von Hörschädigungen .......................................... 15 3.2.2 Pathophysiologie sensorineuralen Hörverlustes ............................................... 16 3.2.3 Das Cochlea-Implantat als Therapieoption bei sensorischer Hörstörung......... 18 3.3 Drug-Delivery-Systeme .............................................................................................. 20 3.3.1 Überblick über Substanzen zur Verbesserung der Nerven-ElektrodenInteraktion ......................................................................................................... 20 3.3.2 Vergleich verschiedener Drug-Delivery-Systeme im Innenohr ....................... 21 3.3.3 Nanobiotechnologie .......................................................................................... 23 3.4 3.3.3.1 Allgemeines, Eigenschaften, Anwendungen in der Industrie ........... 23 3.3.3.2 Einsatz in der Biomedizintechnik ..................................................... 24 3.3.3.3 Einsatz speziell in der Otologie ......................................................... 28 Konfokale Lasermikroskopie, Prinzip und Durchführung ...................................... 30 4 4.1 MATERIAL UND METHODEN ............................................................. 33 Material ...................................................................................................................... 33 4.1.1 Hyperverzweigte Polylysine ............................................................................. 33 4.1.2 Lipidnanokapseln.............................................................................................. 34 4.1.3 Zelllinien ........................................................................................................... 35 4.1.4 Versuchstiere .................................................................................................... 36 4.1.5 Tierhaltung........................................................................................................ 36 4.1.6 Versuchsgruppen .............................................................................................. 37 4.2 Methoden ..................................................................................................................... 38 4.2.1 Überblick über die In-vitro-Versuche ............................................................... 38 4.2.2 Zellkultivierung von L929-Mausfibroblasten................................................... 38 4.2.3 Untersuchung zur Nanopartikelaufnahme in Zellen......................................... 40 4.2.3.1 Zelleinsaat und Inkubation ................................................................ 40 4.2.3.2 Fixierung und Phalloidinfärbung ...................................................... 40 4.2.3.3 Auswertung mittels Konfokaler Lasermikroskopie .......................... 41 4.2.4 Quantifizierung der Nanopartikelaufnahme ..................................................... 42 4.2.4.1 Zelleinsaat und Inkubation ................................................................ 42 4.2.4.2 Fluoreszenzmessung.......................................................................... 43 4.2.5 Untersuchung auf Zytotoxizität der Nanopartikel ............................................ 44 4.2.5.1 Zelleinsaat und Inkubation ................................................................ 44 4.2.5.2 Neutralrotfärbung und photometrische Messung .............................. 45 4.2.6 Überblick über die In-vivo-Versuche................................................................ 45 4.2.7 Narkose, Vor- und Nachsorge der Tiere ........................................................... 46 4.2.8 Messung akustisch-evozierter Hirnstammpotenziale ....................................... 47 4.2.9 Flüssigkeitsapplikation ins Innenohr via Cochleostomie ................................. 51 4.2.10 Gewinnung und Aufarbeitung der Cochleae .................................................... 53 4.2.10.1 Transkardiale Perfusion..................................................................... 54 4.2.10.2 Felsenbeinentnahme und Gewinnung der Cochleae ......................... 54 4.2.10.3 Phalloidinfärbung .............................................................................. 55 4.2.10.4 Präparation der Stria vascularis und Basilarmembran ...................... 55 4.2.11 Untersuchung der Nanopartikelaufnahme mittels Konfokaler Mikroskopie.... 57 4.2.12 Erstellung eines Zytocochleogramms ............................................................... 57 5 5.1 ERGEBNISSE............................................................................................. 60 Ergebnisse der In-vitro-Versuche .............................................................................. 60 5.1.1 Konfokalmikroskopische Auswertung der Nanopartikelaufnahme.................. 60 5.1.2 Quantitative Bestimmung der Nanopartikelaufnahme ..................................... 62 5.1.3 Ergebnisse der Vitalitätstests mit Neutralrot .................................................... 65 5.2 Ergebnisse der In-vivo-Versuche............................................................................... 68 5.2.1 Allgemeines ...................................................................................................... 68 5.2.2 Konfokalmikroskopische Auswertung der Nanopartikelaufnahme.................. 69 5.2.3 Auswertung der AABR-Messungen ................................................................. 71 5.2.4 Auswertung der Zytocochleogramme .............................................................. 79 6 DISKUSSION ............................................................................................. 81 6.1 Auswahlkriterien der Nanopartikeltypen für diese Studie .................................... 82 6.2 Diskussion der in vitro angewendeten Methoden .................................................... 84 6.3 Qualitative Bewertung der Nanopartikelaufnahme auf Zellebene ........................ 86 6.4 Quantitative Aussagen zur Nanopartikelaufnahme in Zellkultur ......................... 89 6.5 Auswirkungen der Nanopartikel auf die Zellviabilität auf Grundlage des Neutralrottests ............................................................................................................ 91 6.6 Diskussion der in vivo angewendeten Methoden ..................................................... 93 6.7 Beurteilung der Vektorendetektion im Innenohr .................................................... 94 6.8 Morphologische und funktionelle Effekte der Nanopartikelapplikation in der Cochlea ........................................................................................................................ 96 6.9 Bewertung der eigenen Studien und hieraus resultierende .................................... 99 Zukunftsperspektiven ................................................................................................ 99 6.10 Mögliche veterinärmedizinische Anwendungsgebiete ........................................... 102 7 ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................... 104 8 SUMMARY ............................................................................................... 106 9 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................ 108 10 ANHANG .................................................................................................. 132 10.1 Herstellung von Lösungen und Medien.................................................................. 132 10.2 Lösungen, Reagenzien und Chemikalien ............................................................... 134 10.2.1 Lösungen und Reagenzien für die In-vitro-Versuche..................................... 134 10.2.2 Lösungen, Reagenzien und Chemikalien für die In-vivo-Versuche ............... 135 10.3 Pharmaka .................................................................................................................. 136 10.4 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien.............................................................. 137 10.4.1 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien für die In-vitro-Versuche ............... 137 10.4.2 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien für die In-vivo-Versuche ................ 138 10.5 Geräte ........................................................................................................................ 140 10.5.1 Geräte für die In-vitro-Versuche .................................................................... 140 10.5.2 Geräte für die AABR-Messungen .................................................................. 141 10.5.3 Operationsbesteck und Geräte für die Durchführung der Operation .............. 142 10.2.4 Geräte für die Aufarbeitung der Cochleae und Auswertung .......................... 143 DANKSAGUNG .............................................................................................. 145 Verzeichnis eigener Vorträge, Poster und publizierter Vortragskurzfassungen Teile der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden bereits als Vorträge, Poster und publizierte Vortragskurzfassungen (Abstracts) auf Kongressen vorgestellt oder sind als Vortrag akzeptiert: WOLF, M., SCHEPER, V., STÖVER, T., SCHOLL, M., KADLECOVA, Z., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., PERRIER, T., LENARZ, T. Hyperverzweigte Polylysin-Nanopartikel und Lipidnanokapseln als neuartige drug-delivery Systeme sind im Innenohr nachweisbar In: 79. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Kopfund Hals-Chirurgie e.V., Bonn, 2008 (Poster) WOLF, M., SCHEPER, V., KADLECOVA, Z., PERRIER, T., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T. Uptake and toxicity of Hyperbranched Polylysines and Lipid Nanocapsules as novel drug carriers in mouse fibroblasts In: Leopoldina Symposium “Molecular Medicine of Sensory Systems”, Tübingen, 2008 (Poster) WOLF, M., SCHEPER, V., KADLECOVA, Z., PERRIER, T., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T. Examination of Hyperbranched Polylysines and Lipid Nanocapsules as novel drug-delivery vehicles for inner ear treatment In: European Conference for Clinical Nanomedicine, Basel, Schweiz, 2008 (Poster) WOLF, M., SCHEPER, V., KADLECOVA, Z., PERRIER, T., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T. Nanosized drug carriers: Uptake and toxicity of Hyperbranched Polylysines and Lipid Nanocapsules in mouse fibroblasts In: 45th Inner Ear Biology Workshop, Ferrara, Italien, 2008 (Poster) WOLF, M., SCHEPER, V., DALTON, P., JOHNSTON, A., NEWMAN, T., LENARZ, T., STÖVER, T. In vitro and in vivo toxicity studies on Block Copolymer Micelles: a novel nonviral vector for inner ear treatment In: 32nd MidWinter Meeting of Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, Maryland, USA, 2009 (Poster) WOLF, M., SCHEPER, V., JOHNSTON, A., NEWMAN, T., PERRY, H., LENARZ, T., STÖVER, T. Untersuchungen zur Toxizität von Nanopartikeln (Block Copolymer Micellen) als nonvirale Vektoren ins Innenohr In: 80. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Kopfund Hals-Chirurgie e.V., Rostock, 2009 (Poster, Broicher-Preis 1. Platz) WOLF, M., SCHEPER, V., JOHNSTON, A., NEWMAN, T., PERRY, H., LENARZ, T., STÖVER, T. Toxicity evaluation of nanoparticles (Block Copolymer Micelles) as novel nonviral vectors for inner ear treatment In: European Conference for Clinical Nanomedicine, Basel, Schweiz, 2009 (Poster) SCHEPER, V.1, WOLF, M.1, SCHOLL, M., KADLECOVA, Z., PERRIER, T., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T. 1 these authors contributed equally to this work Potential novel drug carriers for inner ear treatment: Primary research into Hyperbranched Polylysine and Lipid Nanocapsules In: Nanomedicine (4) 2009, 623-635 Für die vorliegende Arbeit wurden die in den Vorträgen und Postern dargestellten Ergebnisse in einen Kontext gesetzt, ausführlicher beschrieben sowie durch weitere Ergebnisse ergänzt. Verzeichnis der im Text verwendeten wichtigsten Abkürzungen AABR akustisch evozierte auditorische Hirnstamm-Potenziale, acoustically evoked auditory brainstem response Abb. Abbildung ABR auditorische Hirnstammpotenziale, auditory brainstem response AEP akustisch evozierte Potenziale, auditory evoked potentials Ak Antikörper ATP Adenosintriphosphat BDNF Brain-derived neurotrophic factor bzw. beziehungsweise ca. zirka °C Grad Celsius Ch channel, Kanal CI Cochlea-Implantat CLSM konfokale Laserrastermikroskopie (confocal laser scanning microscopy) cm Zentimeter CM cochleäres Mikrophonpotenzial DAPI 4’,6-Diamidino-2-phenylindol d Tag (day) dB Dezibel DMEM Zellkulturmedium (Dulbecco´s modified eagle medium) DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) ECochG Elektrocochleographie EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat EEG Elektroenzephalogramm ERA Elektrische Reaktionsaudiometrie (electric response audiometry) et al. et alii (und andere) etc. et cetera, und so weiter EU Europäische Union EWG Europäische Wirtschaftsgemeinschaft FAEP Frühe akustisch evozierte Potenziale FBS Fetal Bovine Serum FGF Fibroblast Growth Factor FITC Fluoreszeinisothiocyanat G Gauge g Gramm GDNF Glial cell line-derived neurotrophic factor GFP grün fluoreszierendes Protein, green-fluorescent protein HBSS Hanks balanced salt solution HP Hyperverzweigte Polylysine Hz Hertz i.m. intramuskulär IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry kg Kilogramm KGW Körpergewicht kHz Kiloherz l Liter LAVES Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit LNK Lipidnanokapseln μ mikro (x 10-6) μl Mikroliter μV Mikrovolt m milli (x 10-3) M Molekulargewicht MAEP Mittlere akustisch evozierte Potenziale MFH Magnetflüssigkeitshyperthermie mg Milligramm Min. Minuten ml Milliliter mm Millimeter mmol Millimol mol Stoffmenge = 6,022137 × 1023 Teilchen Mrd. Milliarde MRT Magnetresonanztomographie ms Millisekunde mV Millivolt n nano (x 10-9) NGF Nerve Growth Factor nm Nanometer NT-3 Neurotrophin-3 p Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen) P Druck Pa Pascal PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PEG Polyethylenglykol PFA Paraformaldehyd pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration p.o. per os RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute) s Sekunde SAEP Späte akustisch evozierte Potenziale SAP Summenaktionspotenzial s.c. subkutan SFAEP Sehr frühe akustisch evozierte Potenziale siRNA kleine inhibitorische Ribonukleinsäure, small interfering ribonucleic acid SP Schalldruck (sound pressure) SPL Schalldruckpegel (sound pressure level) SSAEP Sehr späte akustisch evozierte Potenziale St Stimulation Tab. Tabelle TRITC Tetramethylrhodaminisiothiocyanat Trk-B Tyrosinkinase-Rezeptor B u. a. unter anderem UV ultraviolett V Volt v. a. vor allem z. B. zum Beispiel ZNS Zentrales Nervensystem 1 1 Einleitung In Deutschland und Europa stellt Schwerhörigkeit bis hin zur Ertaubung einen weit verbreiteten Krankheitskomplex dar. Im Juni 2005 wurde eine Umfrage zum Thema Hörprobleme auf Initiative des Forums „Besser Hören“ in Zusammenarbeit mit dem Forschungsinstitut TNS-Emnid durchgeführt. Bezogen auf die gesamte Einwohnerzahl der Bundesrepublik Deutschland kann man demnach von 17 bis 20 Millionen Menschen mit Hörproblemen ausgehen. Nach einer Studie (Befragung und Hörtest) des Deutschen Grünen Kreuzes e.V. leiden rund 15 Millionen Menschen davon unter einer deutlichen behandlungswürdigen Hörminderung. Auf Europa bezogen spricht die Universität Maastricht von 60 Millionen hörgeschädigten Menschen, während das britische Institute of Hearing Research sogar von 80 Millionen Betroffenen ausgeht. Den größten Teil der Hörschädigungen stellt der sensorineurale Hörverlust dar, der neben den erworbenen Ursachen, z. B. durch Infektionskrankheiten, Alkohol, Nikotin, ototoxische Medikamente oder durch Lärm, oft in einer angeborenen Genese begründet ist. Nach Angaben des Deutschen Zentralregisters für kindliche Hörstörungen in Berlin ist das Hörvermögen von rund 80.000 Kindern so hochgradig gestört, dass sie spezielle Sonderschulen besuchen müssen. Eine systemische Behandlung von Innenohrschwerhörigkeiten gestaltet sich sehr schwierig, da aufgrund der Blut-Cochlea-Barriere sehr hohe Medikamentendosen systemisch appliziert werden müssen, um nachweisbare Konzentrationsspiegel in der Perilymphe zu erzielen. Diese Therapieform ist nicht sehr effektiv und geht oft mit Nebenwirkungen und Belastungen des gesamten Organismus einher, so dass eine Durchführung nicht möglich oder effektiv ist. Statt einer medikamentösen Behandlung der Hörstörung kommen bei gering- bis mittelgradigen Formen Hörgeräte zum Einsatz, die das Resthörvermögen optimal nutzen. Bei hochgradig schwerhörigen oder ertaubten Patienten stellt die Cochlea-Implantation inzwischen den Goldstandard dar, wobei diese elektronische Innenohrprothese beim sensorischen Hörverlust die mechano-elektrische Transduktion der Haarzellen übernimmt. Hierbei wird eine Mehrkanalelektrode in das Innenohr eingeführt, um den Hörnerven elektrisch zu stimulieren. Voraussetzungen für eine erfolgreiche Implantation und anschließendes Sprachverständnis sind eine intakte zentrale Hörbahn und eine ausreichende Anzahl der für eine elektrische Stimulation zur Verfügung stehenden Spiralganglienzellen. 2 Eine primäre Schädigung der sensorischen Haarzellen geht allerdings aufgrund fehlender neurotropher und elektrischer Stimulation sekundär oft mit einer Spiralganglienzelldegeneration einher (INCESULU u. NADOL 1998; ALTSCHULER et al. 1999). Neben dem Verlust elektrisch stimulierbarer Neuronen haben auch implantationsabhängige Inflammationsprozesse und Bindegewebsproliferation einen negativen Einfluss auf die Nerven-Elektroden-Interaktion und damit auf den späteren Höreindruck. Zur Unterdrückung der Entzündungsprozesse und Bindegewebsbildung in der Cochlea haben sich Glukokortikoide als therapeutisch wirksam herausgestellt (HIMENO et al. 2002; TAKEMURA et al. 2004). Als Substanzen mit einem protektiven und teils sogar regenerativen Effekt auf Spiralganglienzellen wurden verschiedene neurotrophe Faktoren identifiziert, zu denen beispielsweise BDNF, GDNF, FGF oder NT-3 gehören (STAECKER et al. 1998; MARUYAMA et al. 2008). Aber auch die dem Cochlea-Implantat nachempfundene elektrische Stimulation selbst scheint einen protektiven Effekt auf die Spiralganglienzellen auszuüben und zum Aussprossen von Neuriten zu führen (LOUSTEAU 1987; HARTSHORN et al. 1991). Neben der getrennten Applikation scheint eine Kombination der protektiven Einzelfaktoren sogar eine kumulative Wirkungsweise zur Folge zu haben (HEGARTY et al. 1997; SCHEPER et al. 2009). Leider führt diese Lokaltherapie aber nicht zu einem Langzeiteffekt. GILLESPIE et al. (2003) konnten in einer Studie zeigen, dass nach Einstellen der BDNF-Gabe nicht nur die Zahl der überlebenden Neuronen wieder sinkt, sondern dass die Rate der neuronalen Degeneration im Verhältnis zum ertaubten, unbehandelten Ohr sogar signifikant zunimmt, was eine dauerhafte Therapie zwingend erforderlich macht. Ein Teil der Forschung auf diesem Gebiet beschäftigt sich mit der Gentherapie, wobei Gene neurotropher Faktoren (YAGI et al. 2000; REJALI et al. 2007) oder Transkriptionsfaktoren (KAWAMOTO et al. 2003; IZUMIKAWA et al. 2005) in die betroffenen Zellen eingeschleust zu einer dauerhaften Protektion der Spiralganglienzellen bzw. über die Transdifferenzierung von Unterstützungszellen zu einer Haarzellregeneration führen können. Untersucht wurde bereits die Möglichkeit des Gentransfers ins Innenohr über verschiedenste virale Vektoren (HAN et al. 1999; SUZUKI et al. 2003). Einerseits konnte eine protektive Wirkung auf Spiralganglienzellen nachgewiesen werden, andererseits ist der Gentransfer sehr unspezifisch, die Expression oft nur transient oder die Transfektionsrate zu gering. 3 Des Weiteren konnte eine Migration der viralen Vektoren zur Gegenseite beobachtet werden und sie können entzündliche und immunologische Reaktionen hervorrufen (KHO et al. 2000; STOVER et al. 2000). Ein wesentlicher Nachteil viraler Vektoren ist nach wie vor die potenzielle Infektiosität und die daraus resultierenden ethischen Bedenken, die eine Virusverabreichung beim Menschen als Herausforderung erscheinen lassen. Auf dem Gebiet der Drug-Delivery-Systeme zählen einfache Mikrokatheter, osmotische Pumpen oder Kombinationen mit der CI-Elektrode zu den technisch umsetzbaren Möglichkeiten, die allerdings immer noch zeitlich begrenzt und nicht zielgerichtet applizieren und das Risiko der Entzündung und reaktiver Bindegewebsbildung tragen (CARVALHO u. LALWANI 1999; PAASCHE et al. 2003). Die zellbasierte Therapie auf Grundlage von Fibroblasten oder mesenchymalen Stammzellen stellt ein weiteres Entwicklungsfeld für den Wirkstofftransport dar (LI et al. 2004; NAKAGAWA u. ITO 2005). Abgeschlossene Studien über die Dauer der Produktion von neurotrophen Faktoren, mögliche Migration oder Proliferation der Zellen und immunologische Reaktionen stehen aber noch aus. Eine interessante Alternative zum viralen Wirkstofftransport stellen nonvirale Vektoren dar, wobei vor allem Liposomen im Zentrum der Untersuchungen standen. Für Liposomen als Drug-Delivery-System spricht sicher ihre gute Biokompatibilität, allerdings ist der Wirkstofftransport nicht zielgerichtet und die Effizienz des Transfers ist unzureichend (WAREING et al. 1999; STAECKER et al. 2001). Aktuelle Entwicklungen basieren nun darauf, nonvirale Vektoren im nanoskaligen Maßstab zu entwickeln, die chemisch synthetisiert werden und unterschiedlichste Grundgerüste aufweisen können. Nanopartikel dieser Art sind im Gegensatz zu viralen Vektoren nicht infektiös, sicher und kostengünstig in großen Mengen herstellbar. Grundstruktur dieser Partikel der ersten Generation (1g) ist eine biokompatible Matrix, die durch diverse Oberflächenmodifikationen weiterentwickelt werden kann. Die angepasste Morphologie des Partikels und die Addition spezifischer Oberflächenrezeptoren ermöglichen eine zielgerichtete Infiltration bestimmter Zelltypen, die Permeation durch die geschlossene Rundfenstermembran oder sogar die Penetration des Zellnucleus, so dass eine zweite Generation (2g) entsteht. Zusätzliche Fluoreszenzmarkierung macht die Vehikel im Gewebe verfolgbar, wo sie biogene Arzneistoffe (z. B. neurotrophe Faktoren, Plasmide, Gene) gezielt transportieren und zeitlich kontrolliert und biologisch 4 effektiv freisetzen. Dieses Endprodukt stellt letztendlich einen Nanopartikel der dritten Generation dar (3g), der alle Anforderungen auf sich vereint. Vor diesem hochkomplizierten Prozess des Drug-Delivery stehen allerdings Grundlagenstudien zur Biokompatibilität, Verfolgbarkeit und Infiltrationsvermögen der Partikel im Vordergrund. Auch wenn verschiedene Nanopartikel bereits in anderen Organsystemen getestet wurden und einige auch in der Cochlea visualisiert (BALA et al. 2004; TAMURA et al. 2005) und sogar protektive Effekte nachgewiesen werden konnten (ZHU et al. 2005; JIANG et al. 2007), so fehlt doch die Basisuntersuchung zu Eigenschaften der Grundstruktur, bevor eine Oberflächenmodifikation und Wirkstofftransport erfolgen kann. Die hier durchgeführten Untersuchungen stellen die Grundlagenstudie für zwei unterschiedliche Nanopartikeltypen, Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln, dar, wobei in vitro und in vivo die Bioverträglichkeit, Verfolgbarkeit und die Fähigkeit der Partikel getestet wurden, unterschiedliche Zelltypen zu infiltrieren. Erst wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, sind weitergehende Studien zur Oberflächenmodifikation, zum Wirkstofftransport, -freisetzung und zum biologischen Effekt sinnvoll. Letztendlich würde die Fähigkeit der Partikel, mit gebundenen Substanzen die intakte Rundfenstermembran zu durchdringen, eine völlig neuartige und risikoärmere Behandlungsstrategie für gering- bis mittelgradig hörgeschädigte Patienten darstellen. Andererseits kann die Kombination eines Cochlea-Implantats mit einem Nanopartikelreservoir die Möglichkeit eröffnen, dauerhaft protektiv oder regenerativ auf die verschiedenen cochleären Zelltypen einzuwirken. Die auf diese Weise verbesserte Nerven-Elektroden-Interaktion bringt eine deutlich gesteigerte Funktionalität des Cochlea-Implantats mit sich, was für den Patienten ein besseres Sprachverständnis und damit eine gesteigerte Lebensqualität bedeuten würde. 5 2 Zielsetzung Sollen multikfunktionale Nanopartikel, in diesem Falle Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln, Wirkstoffe gezielt zu spezifischen Zelltypen im Innenohr transportieren und dort zeitlich kontrolliert freisetzen, so ist zunächst eine genaue toxikologische Untersuchung der nicht modifizierten Grundstrukturen nötig. Dies erfolgt zunächst über In-vitro-Studien: Untersuchung der Visualisierungsmöglichkeiten fluoreszenzmarkierter Nanopartikel in Zellkultur über Konfokalmikroskopische Untersuchung Quantifizierung der Nanopartikelaufnahme in die Zellen über zuvor kalibrierte Fluoreszenzmessungen Evaluierung möglicher Toxizität der untersuchten Nanopartkel auf die Fibroblasten über Vitalitätstest mit Neutralrot Im Falle positiver In-vitro-Ergebnisse, werden die beiden nanoskaligen Strukturen in vivo am Modell des Meerschweincheninnenohres auf morphologische oder funktionelle Effekte über verschiedene Zeiträume untersucht: Konfokalmikroskopische Untersuchung der Nanopartikelverteilung im Innenohr und Aufnahme in die unterschiedlichen Zelltypen Elektrophysiologische Untersuchung möglicher funktioneller Beeinträchtigungen in Form von Hörverlust durch die Nanopartikelapplikation ins Innenohr Untersuchung des Einflusses der Nanopartikel auf die Haarzellen des Innenohres über die Erstellung von Zytocochleogrammen Die Ergebnisse dieser Arbeit über die Biokompatibilität der untersuchten Nanopartikeltypen stellen die Grundlage für die Entwicklung nonviraler Vektoren der dritten Generation (3g) dar, die durch Assoziation mit Wirkstoffen und den gezielten Zelltransport nach zusätzlicher Oberflächenmodifizierung entstehen. 6 3 Literaturübersicht 3.1 Das auditorische System der Säugetiere Das Ohr (Auris, Organum vestibulocochleare) ist ein Doppelsinnesorgan und dient als Hörorgan der Wahrnehmung von Schall und als Gleichgewichtsorgan dem Dreh- und Lagesinn. Anatomisch und funktionell lässt sich das Ohr bei Säugetieren in drei Abschnitte untergliedern: das äußere Ohr (Auris externa), das Mittelohr (Auris media) und das Innenohr (Auris interna). Während das Gleichgewichtsorgan allein im Innenohr liegt, sind die dem Hören dienenden Strukuren in allen Abschnitten des Ohres zu finden (NICKEL et al. 2003). Im Folgenden soll das Hörorgan (Abb. 1) näher erläutert werden. Abb. 1: Übersicht über das Hör- und Gleichgewichtsorgan des Menschen (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007) 7 3.1.1 Topographische Anatomie des Hörorganes Das äußere Ohr besitzt bei landlebenden Säugetieren eine Ohrmuschel (Auricula), deren Grundlage von einem elastischen Muschelknorpel (Cartilago auriculae) gebildet wird. An ihrer Basis geht die Ohrmuschel in den äußeren Gehörgang (Meatus acusticus externus) mit seinem zuerst knorpeligen und nach medial knöchernen Anteil über, der am spangenförmigen Paukenring (Anulus tympanicus) endet, in den das Trommelfell (Membrana tympani) eingespannt ist (SEIFERLE 1992). An das Trommelfell schließt sich die knöcherne, luftgefüllte Paukenhöhle (Cavum tympani) des Mittelohres an, in der sich die der Schallleitung dienende Gehörknöchelchenkette (Ossicula auditus) befindet. Die Ossikelkette, bestehend aus Hammer (Malleus), Amboss (Incus) und Steigbügel (Stapes) und stellt eine bewegliche Verbindung zwischen dem Trommelfell und dem Ovalen Fenster (Fenestra vestibuli) dar, wobei der Hammerschaft (Manubrium mallei) am Umbo membranae tympani mit dem Trommelfell fest verwachsen ist und der Steigbügel mit seiner Fußplatte (Basis stapedis) an das Ovale Fenster grenzt. Die Ohrtrompete (Tuba auditiva, Eustachische Röhre) stellt eine Verbindung zum Rachenraum her und dient dem Druckausgleich und Sekretabfluss. Das Innenohr selbst als statoakustisches Doppelsinnesorgan besteht aus einem knöchernen Labyrinth (Labyrinthus osseus), in welches das häutige Labyrinth (Labyrinthus membranaceus) eingelassen ist. Das häutige Labyrinth besteht aus zwei miteinander in Verbindung stehenden funktionellen Teilen. Es enthält die Sinnesrezeptoren des Gleichgewichtsorgans (Vestibularapparat) in Vorhof (Vestibulum) und Bogengängen (Canales semicirculares ossei) sowie die des Gehörorgans in der sich rostroventral anschließenden Hörschnecke (Cochlea). Zwischen knöchernem und häutigem Labyrinth befindet sich ein perilymphatischer Raum (Spatium perilymphaticum), der sowohl über den Aquaeductus vestibuli als auch über den Aquaeductus cochleae (Ductus perilymphaticus) mit dem Cavum leptomeningicum der Schädelhöhle in Verbindung steht und so einen Flüssigkeitsaustausch mit dem Liquor cerebrospinalis ermöglicht. Das häutige Labyrinth selbst ist mit visköser Endolymphe gefüllt. Die Hörschnecke (Cochlea) windet sich um die konusförmige Schneckenspindel (Modiolus) und weist beim Menschen ungefähr 2,75 und beim Meerschweinchen 3,5 bis nahezu 4 sich verjüngende Windungen auf (NADOL 1988). Im Gegensatz zur anatomischen Beschaffenheit 8 des Menschen liegt die Cochlea des Meerschweinchens fast frei im Mittelohr vor und wird durch eine dünne Knochenwandung von diesem abgegrenzt. Vom Modiolus springt eine ebenfalls spiralförmig verlaufende, dünne Knochenlamelle (Lamina spiralis ossea) in den Schneckengang vor und teilt den Schneckenkanal (Canalis spiralis) in die oberhalb gelegene Vorhoftreppe (Scala vestibuli) und die unterhalb gelegene Paukentreppe (Scala tympani). Die Scala vestibuli entspringt am Ovalen Fenster und geht an der Schneckenspitze (Cupula cochleae) im Schneckenloch (Helicotrema) in die Scala tympani über, die schließlich am Runden Fenster (Fenestra cochleae) endet, das beim Meerschweinchen eine ungefähr 1,18 mm2 große Membran darstellt (GHIZ et al. 2001). Diese kommunizierenden Scalen sind perilymphatisch gefüllt, wobei das Gesamtvolumen etwa 15,94 µl (SHINOMORI et al. 2001) beträgt. Der zwischen den beiden Räumen liegende Schlauch des häutigen Labyrinthes (Ductus cochlearis, Scala media) wird durch die Reißnersche Membran (Membrana vestibularis) von der Scala vestibuli und durch die Basilarmembran (Lamina basilaris) von der Scala tympani getrennt (Abb. 2). Die Basilarmembran als Sitz des Cortischen Organs weist beim Menschen eine Länge von durchschnittlich 35 mm und beim Meerschweinchen eine Länge von 16,4 ± 1,4 mm (V. LINSS et al. 2007) auf. Nach lateral wird die Scala media von der Stria vascularis begrenzt, einem vielschichtigen, gut vaskularisierten Epithel, welches der Versorgung der Strukturen mit kaliumreicher Endolymphe dient, wobei das Volumen dieses Raumes etwa 4,69 µl beträgt (SHINOMORI et al. 2001). Das Cortische Organ (Organum spirale), welches das akustische Rezeptorenfeld aus Haarsinneszellen und die sie in ihrer Lage haltenden Stützzellen beinhaltet, befindet sich auf der Basilarmembran (Lamina basilaris), die zwischen einer knöchernen Leiste am Modiolus (Lamina spiralis ossea) und dem Ligamentum spirale lokalisiert ist (Abb. 2). Zu Pfeilerzellen umgewandelte Stützzellen bilden den Cortischen Tunnel, auf dessen axialer Seite sich eine Reihe innerer Haarzellen befindet, während peripher drei bis maximal fünf Reihen äußere Haarzellen vorhanden sind. Jede Haarzelle besitzt an ihrem apikalen Ende Sinneshärchen (Stereovilli), die in die Scala media hineinragen und im Fall der äußeren Haarzellen festen Kontakt mit der sie bedeckenden Tektorialmembran (Membrana tectoria) haben, während die der inneren Haarzellen frei in die Endolymphe ragen (HOTH u. LENARZ 1997). Die Ansatzstelle für die Tektorialmembran stellt der obere Rand (Labium limbi vestibulare) des Limbus spiralis osseae dar, der das Cortische Organ modiolusseitig begrenzt. Im Gegensatz 9 zu den inneren Haarzellen, die nur passiv auf Schalldruckwellen reagieren, sind äußere Haarzellen durch ihr Aktomyosinskelett aktiv zur Kontraktion befähigt (ZENNER 1986). Abb. 2: Bau des Cortischen Organs als akustisches Rezeptorenfeld im Innenohr (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007) 3.1.2 Physiologie des Hörvorganges Das Hörorgan reagiert auf adäquate akustische Reize in Form von Schallwellen, die sich von einem schwingenden Körper (Schallquelle) ausgehend als Druck- bzw. Dichteschwankungen in elastischen Medien (Gase, Flüssigkeiten, Festkörper) ausbreiten. Physikalisch werden Schallwellen sowohl durch die Amplitude (Schalldruck = Lautstärke) als auch durch die Frequenz (= Tonhöhe) der Druckschwankungen näher definiert (ENGELHARDT u. BREVES 2000). Zur besseren Handhabung verwendet man daher den Schalldruckpegel (sound pressure level = SPL), der in Dezibel (dB) angegeben wird und bei dem der Schalldruck Px in einer logarithmischen Beziehung zu einem festgelegten Bezugsschalldruck P0 angegeben wird (ENGELHARDT u. BREVES 2000). Damit ergibt sich für das menschliche Ohr eine verarbeitungsfähige Schallintensität, von 0 bis 120 dB SPL. Wirbeltiere zeigen artspezifisch sehr unterschiedliche frequenzbezogene Hörbereiche, wobei die für den Menschen wahrnehmbaren Töne ein Spektrum von 20 bis 20.000 Hz umfassen 10 (LEHNHARDT u. LASZIG 2001). Bei den ursprünglich nachtjagenden Carnivoren ist die Hörfähigkeit besser ausgeprägt, was nicht nur das in den Ultraschallbereich reichende Frequenzmaximum (bis 60 kHz) betrifft, sondern auch die Sensitivität des Hörvermögens, so dass die Hörschwellenkurve der Katze zwischen 1 und 10 kHz fast 20 dB niedriger ist als beim Menschen. Spitzenreiter in der Ultraschallwahrnehmung sind Fledermäuse und Delphine, die Frequenzen bis zu 200 kHz wahrnehmen (PENZLIN 1991). Dahingegen sind einige Vögel (z. B. Tauben) auch in der Lage, Infraschall von weniger als 1 Hz wahrzunehmen (SCHMIDT-NIELSEN 1999). Meerschweinchen hören in einem Frequenzbereich von 50 Hz bis 50 kHz (FAY 1988). Der Hörvorgang kann als Ablauf dreier aufeinander folgender Ereignisse beschrieben werden: Schallantransport (Konduktion) durch Luft oder Flüssigkeiten Transformation (Transduktion) der mechanischen Schallenergie in neurale Aktivität Reizfortleitung (Transmission) entlang der zentralen Hörbahn zur Verarbeitung und Wahrnehmung von Qualität und Intensität des Schalls Der Luftschall wird von der Ohrmuschel aufgefangen und durch den äußeren Gehörgang zum Trommelfell geleitet, das von den Schallwellen in Schwingung versetzt wird (1. Impedanzwandlung). Der Hammer ist in das Trommelfell eingelassen und überträgt dessen Schwingungen über den Amboss und den Steigbügel, der mit seiner Fußplatte am Ovalen Fenster befestigt ist, auf das flüssigkeitsgefüllte Innenohr (2. Impedanzwandlung). Aufgrund der unterschiedlichen Impedanzen von Luft und Flüssigkeit würden etwa 98% der akustischen Schallenergie beim Aufprall von Luftschwingungen auf die Innenohrflüssigkeit durch Reflexion verloren gehen, was allerdings durch das Schalldruckverstärkersystem des Mittelohres weitgehend Gehörknöchelchen und ausgeglichen das wird. Unterschiedliche Oberflächenverhältnis zwischen Hebelarmlängen der Trommelfell und Steigbügelplatte definieren die artspezifischen Übertragungseigenschaften (PLATH 1981). Die Auslenkung des Ovalen Fensters durch die Steigbügelplatte bewirkt eine Volumenverschiebung der nicht kompressiblen Perilymphe, so dass eine frequenz- und intensitätsabhängige Wanderwelle entsteht, die in der Scala vestibuli entlang der Windungen der Cochlea über das Helicotrema und in der Scala tympani zurück zum runden Fenster läuft. Folgende Eigenschaften bewirken dabei eine Frequenzdispersion oder auch Ortstonotopie 11 (LEONHARDT 1990): Zum Einen nimmt der Durchmesser des knöchernen Kanals zum Apex hin ab, während die Basilarmembran an der Basis um mehr als das tausendfache steifer ist als apikal. Zum Anderen nimmt die Breite der Basilarmembran von ca. 0,04 mm an der Basis auf 0,5 mm an der Schneckenspitze zu, so dass die Amplitude der Wanderwelle bis zu einer Stelle maximaler Auslenkung anwächst und dann rasch zusammenbricht. Dabei haben Schwingungen hoher Frequenz ihr Amplitudenmaximum in Steigbügelnähe, wohingegen niederfrequente Töne in der Nähe des Helicotremas abgeleitet werden (ALLEN 1980). Durch die Auslenkung der Basilarmembran und der Verschiebung der Tektorialmembran bzw. der Endolymphe kommen Scherkräfte zur Wirkung, die die Stereovilli tangential verschieben und den adäquaten Reiz für die Haarzellen darstellen. Zur Schalltransformation im Bereich des Amplitudenmaximums kommt es anschließend im Bereich des Cortischen Organs, wo mechanische in elektrische Energie umgewandelt wird (PICKLES u. COREY 1992). Durch Ablenkung der Stereovilli der Haarzellen und Dehnung der feinen Spitzenfäden (Tip-Links), werden Ionenkanäle der apikalen Haarzellmembran geöffnet. Es kommt zu einem Einstrom von K+-Ionen aus der Endolymphe und damit zu einer Depolarisation der Zelle, was weiterhin den Einstrom von Ca2+-Ionen aus der Perilymphe bewirkt. Schließlich werden an der Haarzellbasis exzitatorische Neurotransmitter in den synaptischen Spalt freigesetzt, was zum Aufbau eines postsynaptischen Generatorpotenzials führt (ABBAS 1988). Für die Übermittlung der Sinnesinformationen sind der Innervation entsprechend überwiegend die inneren Haarzellen zuständig. Die äußeren Haarzellen besitzen neben der Fähigkeit zur mechano-elektrischen Transduktion auch motorische Eigenschaften durch ihr Aktinfilamentskelett. Auf Beschallung reagieren sie mit einer Kontraktion (elektromechanische Transduktion), die den Abstand zwischen Basilar- und Tektorialmembran verkürzt, was wiederum die Amplitude der Welle verstärkt und benachbarte Basilarmembranabschnitte dämpft. Als cochleäre Vorverstärker ermöglichen sie so den inneren Haarzellen auch bei sehr schwachen akustischen Reizen sensorisch wirksam zu werden und steigern somit erheblich das Frequenzauflösungsvermögen und die Empfindlichkeit des Gehörs. Die Aktionspotenziale der afferenten Fasern der Spiralganglienzellen werden über den Hörnerven weitergeleitet und erreichen letztendlich über die Anteile der zentralen Hörbahn die Hörrinde (ENGELHARDT u. BREVES 2000). 12 3.1.3 Audiometrische Untersuchungsmethoden 3.1.3.1 Allgemeines zu unterschiedlichen Hörprüfmethoden Im Falle einer Hörstörung dienen audiometrische Untersuchungen der Überprüfung des Hörvermögens und der Ermittlung von Art, Ort und Ausmaß der Schädigung. Dabei kommen subjektive Tests zur Anwendung, die eine Befragung der Patienten nach der subjektiven Einschätzung der bewussten auditorischen Wahrnehmung beinhalten. Im Gegensatz zu diesen psychoakustischen Verfahren ermöglichen objektive Hörprüfmethoden eine Beurteilung des Hörvermögens durch Registrierung auditorisch korrelierter physikalisch messbarer Parameter. Diese objektiven Testmethoden kommen bei nicht kooperativen Patienten (Kleinkinder, Menschen mit geistiger Behinderung oder psychogener Hörstörung) und bei Tieren zum Einsatz. Neben der Reflexaudiometrie, den otoakustischen Emissionen und der Impedanzaudiometrie hat sich die elektrische Reaktionsaudiometrie (= electric response audiometry, ERA) zum wichtigsten Verfahren entwickelt und soll hier als angewandte objektive Testmethode näher erläutert werden (HOTH u. LENARZ 1994). Aufgrund einer nicht einheitlichen Nomenklatur in diesem Bereich, wird die Bezeichnung „auditory brainstem response (ABR)“ häufig synonym verwendet (LEHNHARDT u. LASZIG 2001). Die ERA als nichtinvasive Untersuchungsmethode dient der Diagnostik von Schädigungen der gesamten Hörbahn von der Cochlea bis hin zum auditorischen Cortex. Die durch akustische Reize entlang der Hörbahn auftretenden Aktionspotenziale werden als akustisch evozierte Potenziale (AEP) abgeleitet und erlauben neben einer Aussage über Art und Ausmaß der Hörschädigung in Kombination mit der Impedanzaudiometrie auch eine genaue Lokalisation der Störung vom peripheren Hörorgan bis zur neuralen Verarbeitung. Über Elektroden lassen sich durch akustische Reize hervorgerufene elektrische Potenziale von allen Stufen der Hörbahn ableiten. Dabei wird die gesamte elektrische Aktivität des Gehirns registriert, die auf periphere Stimulation, afferente Erregungsleitung und zentrale neuronale Verschaltung basiert. Die unter periodischer akustischer Reizeinwirkung entstehenden elektrischen Potenzialschwankungen der Hörbahn lassen sich durch computergestützte Mittelungstechnik (Averaging) von der überlagerten reizunabhängigen spontanen EEGAktivität trennen. So heben sich akustisch evozierte Potenziale (AEP) ab und können als Wellenverlauf im Spannungsdiagramm in Relation zur Zeit dargestellt werden. Da die AEP in örtlich-zeitlicher Reihenfolge entlang der Hörbahn von den Haarzellen in der Cochlea bis zur 13 Hörrinde entstehen, spiegeln einzelne Wellen Teilfunktionen des Hörvorgangs wieder und können bestimmten anatomischen Strukturen topologisch zugeordnet werden. Bezug nehmend auf ihre Latenzzeit, was dem zeitlichen Auftreten im Abstand zum auslösenden Reiz entspricht, werden die AEP in sehr frühe (SFAEP), frühe (FAEP), mittlere (MAEP), späte (SAEP) und sehr späte Potenziale (SSAEP) eingeteilt. Die Wellen lassen sich zusätzlich spezifischen Regionen der Hörbahn als neuronalen Generatoren zuordnen, wobei die Ursprungsgebiete der Generatoren bei Tieren mit denen des Menschen übereinstimmen. Wellen, die innerhalb der ersten 10 ms nach akustischer Stimulation auftreten, werden als FAEP oder Hirnstammpotenziale bezeichnet. Sie entstammen der Cochlea, dem Hörnerv und dem Hirnstamm und dienen der Differenzierung von Hörstörungen des Mittelohres, des Innenohres und der neuralen Hörbahn. Da die erfassten Reaktionen von Pharmaka und Bewusstsein nahezu unbeeinflusst sind, ermöglichen sie ein Hörschwellenscreening bei Neugeborenen, Kleinkindern oder auch Tieren im Schlaf, in Sedierung oder im narkotisierten Zustand. Als Methode der objektiven Hörschwellenmessung wurde für diese Arbeit die Ableitung der akustisch evozierten auditorischen Hirnstammpotenziale (acoustically evoked auditory brainstem response, AABR) angewendet und im weiteren Verlauf auch näher erläutert. 3.1.3.2 Akustisch evozierte auditorische Hirnstammpotenziale Die objektive Beurteilung der Hörschwelle erfolgt in der Hirnstammaudiometrie mit der Erfassung der FAEPs, die sich als ein Komplex von 5 bis 7 Wellen darstellen (JEWETT 1970). Jewett beschrieb erstmals die Möglichkeit, über Kopfelektroden die Reaktionen des Gehirns auf einen Reiz im auditorischen System zu registrieren. Auf ihn geht auch die Bezeichnung der einzelnen Wellen zurück (I-V), deren topologische Zuordnung aufgrund zahlreicher tierexperimenteller Untersuchungen sehr gut möglich ist und mit denen des Menschen weitestgehend übereinstimmt. Da es sich bei den FAEPs um überlagerte Summenaktionspotenziale verschiedener Kerngebiete handelt, kann eine getrennte Zuordnung zu einzelnen Potenzialgeneratoren der Hörbahn nicht eindeutig getroffen werden. STÖHR et al. (1989) aber auch HOTH und LENARZ (1994) ordnen die Welle I den cochleären Strukturen wie dem Spiralganglion und dem N. cochlearis zu. Mit der Welle II tritt der Hörnerv aus dem inneren Gehörgang aus und in den Hirnstamm ein, während die 14 Welle III den Nucleus cochlearis repräsentiert. Die Welle IV wird von der ipsilateralen oberen Olive und dem Lemniscus lateralis generiert, wohingegen die Welle V von der kontralateralen oberen Olive und Lemniscus lateralis stammt. Die späten Wellen VI und VII sind nur inkonstant nachweisbar, besitzen ihren Ursprung aber der Hörbahn entsprechend zwischen Zwischenhirn und primärem auditorischen Cortex. Zur Bestimmung der akustischen Hörschwelle beim Meerschweinchen wird die Welle III herangezogen. Von diagnostischer Bedeutung innerhalb der FAEPs sind die Latenzen der einzelnen Wellen, die eng mit den Stimulusintensitäten korreliert sind und sich umgekehrt proportional zu ihnen verhalten. Hohe Reizpegel führen zu kurzen Latenzen und umgekehrt. Für die Interpretation der abgeleiteten Potenziale ist es außerdem wichtig, den verwendeten Stimulus anhand einzelner Reizparameter wie Reizstärke, Polarität und Frequenz näher zu beschreiben. Die Reizstärke wird wie bereits beschrieben (siehe 2.1.2) in dB SPL angegeben und hat den größten Einfluss auf die FAEPs. Wie in Abb. 3 ersichtlich, nehmen die Amplituden mit zunehmender Reizstärke zu, während sich die Latenzen verkürzen. Abb. 3: Beispiel für eine frequenzspezifische AABR-Messung (1, 4, 8, 16, 32 und 40 kHz) am Tag 0 am linken Ohr eines normal hörenden Meerschweinchens. Mit zunehmender Reizstärke nehmen die Amplituden zu, während die Latenzen sich verkürzen (Ch1 = linkes Ohr, St = stimulierte Frequenz) (Quelle: Gemittelter Graph aus dem Software-Programm HughPhonics) 15 3.2 Pathophysiologie von Hörminderung und Ertaubung 3.2.1 Allgemeines zur Einteilung von Hörschädigungen Der Krankheitskomplex der Hörminderung und Taubheit gewinnt in Deutschland zunehmend an Bedeutung. Wie in Abbildung 4 dargestellt, lassen sich dabei Schallleitungs- und Schallempfindungsschwerhörigkeiten in Abhängigkeit von der Lokalisation der Störung unterscheiden. Im Falle der Schallleitungsschwerhörigkeit handelt es sich um eine konduktive Hörstörung, deren Ursache im Außen- oder Mittelohr zu finden ist. Die Ursache der Schallempfindungsschwerhörigkeit (sensorineuraler Hörverlust) ist dahingegen cochleär oder retrocochleär bedingt, wobei die Sinneszellen selbst (sensorisch), der Hörnerv (neural) oder das Zentrale Nervensystem (zentral) betroffen sein können (HOTH u. LENARZ 1994). Schallleitungsschwerhörigkeit Schallempfindungsschwerhörigkeit cochleär Äußeres Ohr Mittelohr konduktiv Innenohr sensorisch retrocochleär Hörnerv neural Hirnstamm, Cortex zentral Abb. 4: Übersicht über die Klassifizierung von Hörminderungen Bei einer konduktiven Hörstörung wird weniger Schallenergie über die Gehörknöchelchenkette auf die Cochlea mit ihren Sinneszellen übertragen. Es kommt zu einer Dämpfung des wirksamen Schalldrucks und damit zu einer Verschlechterung des Hörvermögens bei intaktem Innenohr. Ursächlich kommt für die Schallleitungsschwerhörigkeit eine Versteifung, Dämpfung oder Blockierung des konduktiven Systems in Frage, so dass beispielsweise eine übermäßige Ansammlung von Cerumen, Fremdkörper oder Gewebsproliferationen im äußeren Gehörgang die Schallwellen daran hindern können, das Trommelfell zu erreichen. Trommelfellrupturen, Mittelohrentzündungen, Tumoren, Otosklerose oder bei der Katze besonders häufig auftretende Mittelohrpolypen können ebenfalls zu einem konduktiven Hörverlust führen (VENKER-VAN HAAGEN 2006). 16 Desweiteren soll auf den sensorineuralen Hörverlust genauer eingegangen werden, da sich die vorliegende Arbeit mit Nanopartikeln als Drug-Delivery-System ins Innenohr beschäftigt, was einen therapeutischen Einsatz bei Schallempfindungsschwerhörigkeit ermöglichen könnte. 3.2.2 Pathophysiologie sensorineuralen Hörverlustes Bei den retrocochleären Schallempfindungsschwerhörigkeiten können sowohl Schädigungen am Hörnerven als auch des Zentralen Nervensystems zu Hörminderung und Taubheit führen. Ursächlich kommen hier vor allem Tumoren in diesem Bereich wie Akustikusneurinome in Betracht, aber auch Traumata, entzündliche Veränderungen (Meningitis) oder Hydrocephalus, wie es auch für Hunde und Katzen mehrfach nachgewiesen wurde (STEISS et al. 1994). Die häufigste Form der Schwerhörigkeit beim Menschen stellt jedoch die Innenohrschwerhörigkeit, also der sensorische Hörverlust dar, der durch eine irreversible Schädigung der Haarzellen im Cortischen Organ gekennzeichnet ist. Die Informationsübertragung von der Cochlea zum Gehirn ist nicht mehr gegeben, wenn die mechano-elektrische Transduktion unterbleibt. Innenohrschäden können zum einen kongenital (angeboren) auftreten, wobei man zwischen hereditären (genetisch bedingt), pränatalen (vor der Geburt erworben) und perinatalen Störungen (während der Geburt erworben) unterscheidet, und zum anderen postnatal erworben sein (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007). Ursachen pränatal erworbener Hörstörungen können Infektionen der Mutter während der Schwangerschaft (z. B. Röteln, Toxoplasmose), Stoffwechselerkrankungen (z. B. Diabetes mellitus, Hypothyreose), Medikamenteneinnahme (z. B. Contergan) oder Alkoholabusus sein. Perinatal sind vor allem Geburtstraumen, die mit Hypoxie einhergehen, mögliche Ursachen einer Hörstörung. Bei den hereditären Hörschädigungen unterscheidet man syndromale und nicht-syndromale Ausprägungen, die sowohl rezessiv als auch dominant vererbt werden können. Syndromale Erkrankungen können mit Augensymptomen (z. B. Cogan-Syndrom, Waardenberg-Klein-Syndrom), mit Nierenerkrankungen (z. B. Alport-Syndrom) oder mit Schilddrüsensymptomen (z. B. Pendred-Syndrom) vergesellschaftet sein. Bei den nichtsyndromalen Taubheitsursachen stellt die Mutation der gap-junction-Proteine Connexin 26 und 31 (LEFEBVRE u. VAN DE WATER 2000; X. Z. LIU et al. 2009) eine zentrale Gruppe beim Menschen dar. Auch bei Hunden und Katzen, die taub geboren werden und erst ab dem 17 5. bis 7. Tag nach der Geburt akustische Reize aufnehmen können, wurden hereditäre Innenohrdefekte untersucht und zum Teil als Tiermodell für das Waardenburg-Syndrom des Menschen genutzt, das durch angeborene Taubheit in Assoziation mit Pigmentierungsstörungen von Haut, Haar und Iris gekennzeichnet ist (WAARDENBURG 1951). Bei Hunden ist angeborene Taubheit bei Dalmatinern sehr gut untersucht (MAIR 1976; HOLLIDAY et al. 1992), aber auch die Merle-Pigmentierung (z. B. Merle-Sheltie, Blue-Merle-Collie, Tigerdogge) und Träger des Piebald-Gens (z. B. Bullterrier, Samoyede, Greyhound) sind mit Taubheit assoziiert. Auch die Taubheit weißer Katzen ist eingehend studiert worden (MAIR 1973), wobei die primäre Degeneration der epithelialen und sensorischen Elemente in der ersten Woche nach der Geburt auftritt und sich die sekundäre Degeneration der neuronalen Strukturen danach entwickelt (BOSHER u. HALLPIKE 1965; PUJOL et al. 1977). Postnatal erworbener sensorischer Hörverlust geht mit einer Zerstörung zuvor intakter Haarzellen einher. Eine mechanische Schädigung kann dabei durch ein akutes oder chronisches akustisches Trauma (PLINKERT u. DE MADDALENA 1996) oder ein stumpfes Schädeltrauma entstehen, während mit zunehmendem Alter degenerative Prozesse zu Altersschwerhörigkeit (Presbyakusis) führen können. Einen wesentlichen Anteil an erworbenen Hörschädigungen besitzen Ototoxine, die unterschiedlichen Ursprungs sein können. Infektionskrankheiten (z. B. Mumps, Fleckfieber, Borreliose) können ototoxisches Potenzial besitzen, bzw. Exotoxine verschiedenster Bakteriengattungen, die an Mittelohrentzündungen beteiligt sind. Auch Stoffwechselprodukte, die bei Schilddrüsen-, Leber- oder Nierenfunktionsstörungen auftreten, können potenziell ototoxisch wirken. Exogene Noxen, die neben der Lärmexposition auch in experimentellen Studien Anwendung finden (WEST et al. 1973), stellen ototoxische Medikamente wie beispielsweise Aminoglykosidantibiotika (z. B. Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, Gentamicin), Diuretika (z. B. Furosemid, Etacrynsäure) und Zytostatika (z. B. Cisplatin, Carboplatin) dar. Dabei ist nicht nur eine lokale Applikation der Substanzen toxisch, wenn diese beispielsweise bei Perforation des Trommelfells die semipermeable Membran des Runden Fensters durchdringen, sondern auch die systemische Verabreichung der Medikamente. Es kommt zu einer Haarzellschädigung mit anschließender -apoptose beginnend an der Basis der Cochlea 18 mit fortschreitendem Haarzellverlust nach apikal in Abhängigkeit von Dosis und Dauer der Applikation. Nach initialer Schädigung der Haarsinneszellen kommt es sekundär zu einer Degeneration der nachgeschalteten Spiralganglienzellen (OTTE et al. 1978; SPOENDLIN 1984), wobei eine Apoptose großer Teile der Spiralganglienzellpopulation bereits innerhalb weniger Stunden nach intracochleärer Aminoglykosidinjektion nachzuweisen ist. Mit dem Verlust der Haarzellen fehlt zum einen die afferente Innervation der Spiralganglienzellen durch ankommende Aktionspotenziale und freigesetzte Neurotransmitter, zum anderen fehlt die Bildung neurotropher Faktoren durch die Sinneszellen, so dass dieser trophische Effekt auf die Spiralganglienzellen unterbleibt. Mit Verlust der elektrischen und neurotrophen Stimulation in Folge des Haarzelluntergangs zeigt sich so sekundär immer eine Spiralganglienzelldegeneration. 3.2.3 Das Cochlea-Implantat als Therapieoption bei sensorischer Hörstörung Ist die Hörminderung bei einem Patienten so weit fortgeschritten, dass das Resthörvermögen für die Verwendung eines Hörgerätes nicht mehr nutzbar ist, so kann mit Hilfe einer elektronischen Innenohrprothese (Cochlea-Implantat, CI) die Wiedererlangung des Sprachverständnisses und damit eine erhebliche Steigerung der Lebensqualität ermöglicht werden (CLARK et al. 1987; MATSCHKE u. PLATH 1988). Grundvoraussetzung für die Implantation solch einer Prothese ist eine rein sensorisch bedingte cochleäre Taubheit mit erhaltener Leitfähigkeit des Hörnerven und intakter zentraler Hörbahn, so dass das Implantat durch direkte elektrische Reizung der Spiralganglienzellen die Funktion der Haarzellen übernehmen und einen Höreindruck vermitteln kann (LENARZ 1998). Das CI setzt sich aus mehreren Einzelkomponenten zusammen: der eigentlichen Cochlea-Implantat-Elektrode, einer Sende- und Empfangsspule, einem Sprachprozessor und dem Mikrophon. Akustische Informationen werden über das Mikrophon aufgenommen und dem Sprachprozessor zugeleitet, der sie nach Filterung, Komprimierung und Entrauschung in elektrisch kodierte Impulse umwandelt. Dieses generierte Signalmuster in Form von elektromagnetischer Induktion wird von der Sendespule transkutan auf die subkutan retroauriculär implantierte Empfängerspule übertragen (LEHNHARDT et al. 1986). 19 Schließlich wird die Information an die intracochleär implantierte Mehrkanalelektrode weitergeleitet, die schließlich indirekten Kontakt mit dem Spiralganglion hat. Die Reizelektrode wird über das Runde Fenster oder per Cochleostomie in die Scala tympani eingeführt, wobei eine möglichst modiolusnahe Insertion einen engen Nerven-ElektrodenKontakt sicherstellen soll (SHEPHERD et al. 1993). Die je nach Hersteller bis zu 22 Elektrodenkontakte sind schließlich unterschiedlich tief in der Cochlea positioniert und können so verschiedene Abschnitte der Basilarmembran getrennt voneinander tonotop reizen. Die selektive Stimulation der einzelnen Fasern des Hörnervs wird schließlich analog zum physiologischen Hörvorgang über die zentrale Hörbahn zum auditorischen Cortex geleitet, wo der Höreindruck erzeugt wird (LENARZ 1997). Da das CI also die mechano-elektrische Transduktion der Haarzellen übernimmt, ist der Erfolg der Implantation im Wesentlichen von einer guten Nerven-Elektroden-Interaktion abhängig. Neben einer möglichst modiolusnahen Insertion der Elektrode wird auch eine weitgehende Unterdrückung der Bindegewebsproliferation angestrebt, die durch postoperativ eintretende Entzündungsvorgänge hervorgerufen werden kann. Zusätzlich beeinflusst die Anzahl funktionsfähiger Spiralganglienzellen den späteren Höreindruck und das Sprachverständnis (SUTTON 1983). Die therapeutischen Maßnahmen beinhalten also die Applikation entzündungshemmender Glukokortikoide zur Reduktion des Bindegewebes, aber auch die Intervention mit neurotrophen Faktoren, Genen oder auch elektrischer Stimulation, um eine fortschreitende Spiralganglienzelldegeneration aufzuhalten (WEFSTAEDT et al. 2006). Doch um wirklich gezielt an bestimmten Zelltypen angreifen und auch einen Langzeiteffekt erzielen zu können, ist es nötig neue Drug-Delivery-Systeme zu entwickeln, die mit dem CI kombinierbar sind. 20 3.3 Drug-Delivery-Systeme 3.3.1 Überblick über Substanzen zur Verbesserung der Nerven-Elektroden- Interaktion In vielen vorangegangenen Studien wurden bereits Möglichkeiten untersucht, die Spiralganglienzelldegeneration nach Ertaubung aufzuhalten bzw. diese sogar zu regenerieren, das Bindegewebe zurückzudrängen oder auch Einfluss auf geschädigte Haarzellen zu nehmen. Im Falle der Entzündungshemmung und Verringerung der Bindegewebsbildung haben sich Glukokortikoide als sehr wirksam erwiesen (DE CEULAER et al. 2003; STOVER et al. 2006). Ein protektiver Effekt auf Spiralganglienzellen konnte für verschiedene neurotrophe Faktoren wie beispielsweise BDNF, GDNF, FGF und NT-3 (ERNFORS et al. 1996; STAECKER et al. 1998; YAGI et al. 2000; MCGUINNESS u. SHEPHERD 2005; MARUYAMA et al. 2008) im Innenohr nachgewiesen werden, wobei sowohl einzelne Faktoren, als auch Kombinationen untereinander oder mit elektrischer Stimulation (KANZAKI et al. 2002; SHEPHERD et al. 2005; SHEPHERD et al. 2008) zu höherer Spiralganglienzellzahl führten. Sogar bei einer verzögerten Gabe nach Ertaubung waren die Ergebnisse vielversprechend (GILLESPIE et al. 2004; YAMAGATA et al. 2004; MILLER et al. 2007). Leider handelt sich dabei nicht um einen Langzeiteffekt, sondern unmittelbar nach dem Einstellen der BDNF-Behandlung sinkt die Anzahl der überlebenden Neuronen, die sich dann nicht mehr von der unbehandelten Seite unterscheidet (GILLESPIE et al. 2003). Die Rate der neuronalen Degeneration nimmt im Verhältnis zu ertaubten, unbehandelten Cochleae sogar signifikant zu, so dass eine dauerhafte Therapie angestrebt werden muss. Eine Möglichkeit stellt die noch an ethische und technische Grenzen stoßende Gentherapie dar, bei der Segmente genetischen Materials in die Zellen eingeschleust werden, so dass sie transgene Proteine exprimieren und Funktion und Verhalten der Zellen ändern können (STAECKER et al. 2004). Dabei kommen drei verschiedene Ansatzpunkte in Betracht: erstens können Gene neurotropher Faktoren in die Zellen eingeschleust werden, um Spiralganglien- oder Haarzellen zu protektieren und zu regenerieren, wie es mit GDNF, BDNF und NT-3 allein oder in Kombination mit elektrischer Stimulation bereits geschehen ist (LALWANI et al. 1996; YAGI et al. 2000; REJALI et al. 2007). Als zweite Möglichkeit könnten funktionelle Haarzellen regeneriert werden, indem sie aus Unterstützungszellen 21 transdifferenziert werden, wie es für Math1 bzw. Atoh1 gezeigt werden konnte, einem Gen, das in der embryonalen Entwicklung des Corti-Organs eine wesentliche Rolle spielt (KAWAMOTO et al. 2003; IZUMIKAWA et al. 2005). In einer Meerschweinchenstudie konnte nachgewiesen werden, dass höhere Haarzellzahlen und niedrigere Hörschwellen im Vergleich zur ertaubten unbehandelten Kontrolle auf eine Umwandlung von Stützzellen in Haarzellen schließen lassen. Drittens könnten Gene, deren Dysfunktion oder Mutation mit Hörverlust assoziiert ist, als Ziel für die Gentherapie im Mittelpunkt stehen (LEFEBVRE u. VAN DE WATER 2000; X. Z. LIU et al. 2009). Als Beispiel sei das GJB2-Gen genannt, welches das gap-junction Protein Connexin 26 codiert und dessen Mutation zum angeborenen sensorineuralen Hörverlust führt und damit auch einen Angriffspunkt für eine mögliche Gentherapie darstellt (KUDO et al. 2003; VAN EYKEN et al. 2007). 3.3.2 Vergleich verschiedener Drug-Delivery-Systeme im Innenohr Die Blut-Cochlea-Barriere verhindert in vielen Fällen eine systemische Behandlung des Innenohres. Dies bedeutet, dass eine lokale Therapie mit Pharmaka oft die einzige Interventionsmöglichkeit darstellt. Dabei können die verschiedenen Methoden der Wirkstoffapplikation danach unterschieden werden, ob sie intratympanal, also in das Mittelohr, oder intracochleär erfolgen. Bei der intratympanalen Verabreichung müssen die Wirkstoffe durch die Rundfenstermembran diffundieren, um sich danach in der Scala tympani ausbreiten zu können, was zu einem großen Konzentrationsgradienten zwischen Basis und Apex führen kann. Die Rundfenstermembran stellt auch eine physikalische Barriere dar, die in ihrer Dicke und Durchlässigkeit große individuelle Unterschiede aufweisen kann (BANERJEE u. PARNES 2004), was eine kontrollierte Dosierung für den einzelnen Patienten deutlich erschwert. Außerdem können Wirkstoffe über die Eustachische Röhre verloren gehen. Andererseits ist das Mittelohr leicht zugänglich und das chirurgische Trauma verhältnismäßig gering. Die intracochleäre Applikation hat den Vorteil, dass man direkten Zugang zu den sensorischen und neuronalen Zellen hat und die Wirkstoffverteilung zu apikalen Regionen besser erfolgen kann. Die Auswahl der Moleküle ist nicht mehr von der Rundfenstermembranpassage abhängig und es kann wesentlich präziser dosiert werden. Andererseits ist 22 aber die Möglichkeit des chirurgischen Traumas größer und in das Innenohr verbrachte Langzeitkatheter bergen das Risiko von reaktiver Bindegewebsproliferation. Technisch lässt sich eine intracochleäre Dauerapplikation über verschiedene Methoden lösen: die einfachste Möglichkeit direkt eine Substanz in das Innenohr zu verbringen, ist eine Bolusapplikation unter Verwendung einer Mikroliterspritze. So kann beispielsweise mit der Cochlea-Implantation einmalig eine Glukokortikoidapplikation erfolgen, was nachweislich die reaktive Fibrosierung minimiert und damit zu geringeren Impedanzen führt (DE CEULAER et al. 2003; PAASCHE et al. 2006a). Wirkstoffe können auch über Mikrokatheter oder osmotische Pumpen verabreicht werden. Dieser Ansatz ist aber nur zeitlich befristet umsetzbar, da das Risiko der Fibrosierung der Hörschnecke besteht (BROWN et al. 1993; CARVALHO u. LALWANI 1999). Die Kombination der Elektrode mit einem Injektionskatheter zur Medikamentenapplikation stellt dennoch einen interessanten Ansatz zur Lokaltherapie des Innenohres dar (PAASCHE et al. 2003; HOCHMAIR et al. 2006; PAASCHE et al. 2006b). Eine weitere innovative Möglichkeit, neurotrophe Faktoren über einen längeren Zeitraum im Innenohr freizusetzen, besteht in der zellbasierten Therapie (NAKAGAWA u. ITO 2004, 2005). So wurden transgene Fibroblasten, die BDNF produzieren, in eine Agarosematrix eingekapselt und über eine modifizierte Elektrode ins Innenohr verbracht, was zu einer verbesserten Spiralganglienzellprotektion führte, die allerdings nach apikal abnahm (REJALI et al. 2007). Es existieren auch noch keine verlässlichen Daten darüber, wie lange die BDNFProduktion anhält und ob diese Bindegewebsvorläuferzellen nicht wandern, proliferieren und damit letztendlich zu einer Obliteration der Cochlea durch Fibrosierung führen bzw. eine immunologische Reaktionen hervorrufen. Eine für die Zukunft sehr vielversprechende zellbasierte Therapieoption stellen die mesenchymalen Stammzellen dar, die als pluripotente xenogene oder autologe Transplantate in die Cochlea verbracht werden können (LI et al. 2004; NAITO et al. 2004; MATSUOKA et al. 2007). Für die Regeneration der sensorischen Zellen ist es in diesem Fall nicht nur von Bedeutung, die Zellen gezielt an den gewünschten Wirkort zu bringen, sondern sie müssen auch zum korrekten Phänotyp ausdifferenzieren und die passende dreidimensionale Gewebestruktur annehmen, um eine funktionelle Einheit zu bilden. Dieses Entwicklungsfeld ist noch sehr jung, so dass die für die richtige Differenzierung der Stammzellen benötigten Umweltbedingungen noch zu untersuchen sind. 23 Eine bereits eingehend untersuchte Möglichkeit des Gentransfers ins Innenohr besteht über virale Vektoren, wobei insbesondere Adeno- (RAPHAEL et al. 1996), Lenti- (HAN et al. 1999), Herpes- und Vacciniaviren (DERBY et al. 1999) auf ihre Transfektionsraten und Expressionseigenschaften hin studiert wurden. Auf diese Weise konnten protektive Wirkungen auf Innenohrzellen nachgewiesen werden (DUAN et al. 2004), wobei festzuhalten ist, dass eine Applikation der Viren über Cochleostomie zu einer besseren Verteilung im Innenohr und zu höheren Transfektionsraten führt, als die Rundfensterapplikation (STOVER et al. 1999). Als Nachteile der viralen Vektoren ist deren Unspezifität gegenüber verschiedenen Zelltypen zu nennen und die mögliche Migration und Transfektion der Gegenseite oder anderer Gewebe und Organe. Des Weiteren sind die Transfektionsraten meist sehr niedrig und die Genexpression zeitlich oft nur begrenzt. Hinzu kommt deren Potenzial entzündliche oder immunologische Reaktionen hervorzurufen (KHO et al. 2000; STOVER et al. 2000) und ihre mögliche Infektiosität, was den Hauptgrund für ethische Bedenken darstellt und damit den Einsatz viraler Vektoren am Menschen grundsätzlich in Frage stellt. Aus diesem Grund ist es notwendig nonvirale Vektoren zu entwickeln, die möglichst spezifisch für bestimmte Zelltypen sind, einen Langzeiteffekt erzielen können und dabei biokompatibel sind, wie man es sich für Nanopartikel im Innenohr verspricht (PANYAM u. LABHASETWAR 2003; PARKER et al. 2003). Als erste nonvirale Vektoren wurden Liposomen untersucht, die sich durch einfache Produktion, geringe Toxizität und fehlende immunologische Effekte auszeichneten. Leider war der Wirkstofftransport nicht zielgerichtet und die Effizienz des Gentransfers nur sehr unzureichend (WAREING et al. 1999; STAECKER et al. 2001), so dass aktuelle Studien diese Eigenschaften in Nanopartikeln zu vereinen suchen. 3.3.3 Nanobiotechnologie 3.3.3.1 Allgemeines, Eigenschaften, Anwendungen in der Industrie Als Nanopartikel bezeichnet man einen Verbund von wenigen bis einigen tausend Atomen oder Molekülen, die gemeinsam einen Durchmesser von 10 bis 500 nm besitzen. Diese winzigen Partikel werden gezielt nach gewünschten Eigenschaften und Anwendungsgebieten synthetisch hergestellt und können die unterschiedlichsten Grundgerüste aufweisen (Abb. 5). Sie weisen sich durch einige Besonderheiten aus, die einen Übergang von atomaren zu 24 typischen Festkörpereigenschaften darstellen. Dies betrifft die Leitfähigkeit, optische Eigenschaften aber auch die chemische Reaktivität, die aufgrund der extrem großen Teilchenoberfläche in Relation zum kleinen Volumen zu beschleunigten chemischen Reaktionen und damit zum Einsatz als Katalysatoren führt. So können neue Materialeigenschaften durch die Nanopartikel allein oder in Kombination mit konventionellen Materialien entwickelt und verbessert werden, so dass Nanopartikel, nanostrukturierte Oberflächen oder molekulare Nanostrukturen interdisziplinär in Medizin, Elektronik (Leseköpfe für Festplatten, Materialwissenschaften Mikrochips), Optik (Oberflächenbeschichtungen (optische mit Leuchtdioden) Lotus-Effekt, und Titandioxid- Nanopartikel als UV-Filter) untersucht und genutzt werden. Abb. 5: Diese Schemata demonstrieren Nanopartikel, denen unterschiedliche Gerüststrukturen zugrunde liegen, so dass sich verschiedene Eigenschaften und Anwendungsgebiete für die synthetisch hergestellten Stoffe ergeben (Quelle: EU-Vertrag NMP4-CT-2006-026556). 3.3.3.2 Einsatz in der Biomedizintechnik Nanotechnologie wird in der Medizin für Diagnose, Monitoring und Behandlung von Krankheiten eingesetzt (JAIN 2008) und ist dabei eng mit der Genomik und Proteomik verknüpft (WAGNER u. ZWECK 2006). Sie ermöglicht einen Einblick in die molekularen Ursachen von Krankheiten, die Funktionen von Genen und Proteinen und bildet damit neue Ansätze für die Diagnose und Therapie (Gen-, Proteintherapie, Antikörper). Zusätzlich können nanoskalige oder -strukturierte Biomaterialien die Eigenschaften von Implantaten verbessern. 25 Die Hauptanwendungsfelder der Nanotechnologie in der Medizin werden in Abbildung 6 zusammengefasst: In vitro Diagnostik 17% Wirkstoffe und In vivo Therapien Diagnostik 3% 7% Implantate 19% Wirkstofftransport 54% Abb. 6: Hauptanwendungsfelder der Nanotechnologie in der Medizin (WAGNER u. WECHSLER 2004) Neuartige Wirkstoffe (3%) Als neuartige nanoskalare Moleküle, die direkt zur Therapie von Krankheiten eingesetzt werden können, kommen Dendrimere in Betracht. Diese baumartig verzweigten Makromoleküle in Proteingröße sind mit funktionellen Gruppen an der Oberfläche ausgestattet, die eine direkte Wechselwirkung mit Zellen oder Viren ermöglichen. Auf diese Weise können sie beispielsweise die Oberflächenproteine des HI-Virus besetzen, die Zellaufnahme stören und damit die Infektionskette unterbrechen (RUPP et al. 2007). In-vivo-Diagnostik (7%) Bei der In-vivo-Diagnostik werden Nanopartikel vor allem für die molekulare Bildgebung genutzt. Resovist® der Firma Schering beispielsweise enthält Eisenoxid-Nanopartikel, die sich selektiv in der Leber anreichern und in der Magnetresonanztomographie einen starken Kontrast erzeugen (IGARTUA et al. 2002). 26 Die Zukunft der molekularen Bildgebung liegt darin, Proteine oder Gene von Krankheiten (z. B. Tumoren) und deren Ausprägung bereits vor Krankheitsausbruch bzw. klinischer Symptomatik nachzuweisen und den Therapieerfolg zu überprüfen. Solch ein nanoskaliges Kontrastmittel sollte im Idealfall für eine gezielte Anreicherung ein spezifisches Zielfindungsmolekül in Form eines Antikörpers oder Peptids an der Oberfläche tragen und eine bildgebende Komponente wie Gadolinium besitzen (MULDOON et al. 2006; SUMER u. GAO 2008). In-vitro-Diagnostik (17%) Der Fokus in der In-vitro-Diagnostik liegt ebenfalls in der Frühdiagnose von Krankheiten über die Detektion von spezifischen Genen, Proteinen oder Nukleinsäuren. Auf der einen Seite werden Biochips mit nanostrukturierten Elektroden in diagnostischen Apparaten angewendet, mit deren Hilfe Biomoleküle elektrochemisch nachgewiesen werden können. Auf der anderen Seite werden Nanopartikel auch als Marker für Moleküle eingesetzt, wie beispielsweise Gold-Nanopartikel, die mit DNA konjugiert werden und damit als superspezifisches Suchinstrument für Tumoren, Alzheimer oder Mukoviszidose eingesetzt werden sollen. Durch Implantate und Biomaterialien (19%) Nanostrukturierungen sollen Implantateigenschaften wie Gleiteigenschaften, Einwachsverhalten und Proteinanlagerung verbessert werden, die Lebensdauer verlängert und die Revisionsrate verringert werden (H. LIU u. WEBSTER 2006). Durch nanokristalline Diamantbeschichtungen soll beispielsweise bei Gelenkimplantaten Langzeitstabilität erreicht werden, wohingegen metallische Silbernanopartikel als entzündungs- und infektionshemmende Agenzien für antimikrobielle Oberflächenbeschichtungen genutzt werden können (SCHIERHOLZ et al. 1998). Am Beispiel von Hüftendoprothesen konnte gezeigt werden, dass verringerte Infektionsraten, bessere Biokompatibilität und verbesserte osseointegrative Eigenschaften der Implantate zu Langzeitstabilität, erhöhter Lebensdauer und damit verringerten Revisionsraten führen (NAIR u. LAURENCIN 2008). Als Biomaterialien kommen Nanopartikel beispielsweise in Knochenersatzmaterialien zur Implantatverankerung und zum Auffüllen von Zysten vor. Diese enthalten nanokristallines 27 Hydroxylapatit mit sehr großer spezifischer Oberfläche, so dass Knochenzellen einwandern und die Ersatzmasse durch natürlichen Knochen ersetzen können. Wirkstofftransport (54%) Das mit Abstand größte Anwendungsfeld für Nanopartikel in der Medizin stellt der Wirkstofftransport, also die Entwicklung wirkungsvoller Drug-Delivery-Systeme für biogene Arzneistoffe wie Peptide, Proteine, Plasmide, Gene usw. dar (PANYAM u. LABHASETWAR 2003; VENUGOPAL et al. 2008). Die biokompatiblen Vehikel sollen die Wirkstoffe gegenüber metobolischen Einflüssen des Körpers abschirmen und sie zeitlich kontrolliert freisetzen, um so auch geringere Nebenwirkungen zu verursachen. Zusätzliche Oberflächenmodifizierungen mit Lektinen, Antikörpern oder Peptiden sollen einen gezielten Zellantransport, eine bessere Adhäsion im Zielgewebe und eine Interaktion mit biologischen Barrieren (z. B. Blut-Hirn-Schranke (OLIVIER 2005; SINGH et al. 2007)) ermöglichen und so auch neue angenehmere Applikationsformen wie oral, nasal oder inhalativ eröffnen. Als erstes liposomales Tumortherapeutikum kam Mitte der 90er Jahre Doxil® auf den Markt, welches des Zytostatikum Doxorubicin im Inneren einschloss und so weniger vor allem kardiale Nebenwirkungen verursachte (MASSING u. FUXIUS 2000). Es sei noch die Anwendung von Nanopartikeln in der Magnetflüssigkeitshyperthermie (MFH) genannt, bei der Eisenoxid-Nanopartikel lokal in einen Tumor injiziert und dann durch ein externes magnetisches Wechselfeld in Schwingung versetzt werden. Dadurch wird das Tumorgewebe über 45 °C erwärmt und direkt zerstört bzw. die Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika und Strahlung erhöht. Mit Hilfe eines Target-Moleküls an der Oberfläche ist auch die systemische Applikation bei metastasierenden oder multifokal ausgedehnten Tumoren möglich (JORDAN et al. 2001; JOHANNSEN et al. 2004). Ein zusätzliches Coating mit Zytostatika oder radioaktiven Isotopen kann sogar zu einer kombinierten hyperthermen Radio- oder Radiochemotherapie führen. 28 3.3.3.3 Einsatz speziell in der Otologie Die Miniaturisierung von Pharmakaträgern in den nanoskaligen Bereich hat zur Erarbeitung von Strategien geführt, die mit Hilfe von Nanopartikeln eine Cochlea-Implantat-basierte Freisetzung ermöglichen wollen, um eine Lokaltherapie des Innenohrs zu erlauben. Dabei sollen multifunktionale Nanopartikel als nonvirale Vektoren biogene Arzneistoffe (z. B. Gene, neurotrophe Faktoren) möglichst durch Permeation durch die geschlossene Rundfenstermembran zielgerichtet zum gewünschten cochleären Zelltyp transportieren und zeitlich kontrolliert freisetzen (Abb. 7). Abb. 7: Darstellung eines multifunktionalen Nanopartikels mit biokompatibler Matrix und funktionalisierter Oberfläche, die sowohl Pharmaka, als auch selektive Rezeptoren und bildgebende Komponenten enthält (Quelle: EU-Vertrag NMP4-CT-2006-026556). Durch das Aufbringen biologisch aktiver Nanopartikel auf die geschlossene Rundfenstermembran werden so risikoärmere Möglichkeiten erschlossen, gering- bis mittelgradig hörgeschädigte Patienten zu behandeln. Die Integration eines nanoskalaren Wirkstoffdepots in ein Cochlea-Implantat verbessert über gezielte Gentherapie oder kontrollierte Freisetzung neurotropher Faktoren den Nerven-Elektroden-Kontakt und damit die Effektivität des Implantats. Als einer der ersten Nanopartikel wurde Polylactoglykolsäure (BALA et al. 2004; GE et al. 2007) sowohl systemisch intravenös als auch lokal auf die Rundfenstermembran von Meerschweinchen appliziert, woraufhin die Rhodamin-markierten 29 Vehikel in der Cochlea sichtbar waren (TAMURA et al. 2005). Ebenfalls fluoreszenzmarkierte Silica-Nanopartikel, die auf die Rundfenstermembran aufgebracht wurden (PRAETORIUS et al. 2007), konnten in den inneren Haarzellen und Spiralganglienzellen lokalisiert werden ohne einen zytotoxischen Effekt hervorgerufen zu haben, wobei ein retrograder axonaler Transport angenommen wurde. In weiteren Studien konnte sogar ein protektiver Effekt auf Spiralganglienzellen ertaubter Meerschweinchen (ZHU et al. 2005; JIANG et al. 2007) nachgewiesen werden, denen eine Woche nach Ertaubung HydroxyapatitNanopartikel mit einem rekombinanten GFP (green-fluorescent protein) + NT-3 (Neurotrophin-3)-Plasmid in die Cochlea injiziert wurden. Nach einer Woche konnte die NT3-Expression immunhistochemisch in Spiralganglienzellen nachgewiesen werden. Ein protektiver Effekt ließ sich nach vier Wochen über funktionelle AABR-Messungen und die Histologie zeigen. Die Einsetzbarkeit von Nanopartikeln im Innenohr wurde durch diese und andere Studien bereits belegt, so dass hier in der Kombination von flüssigkeitsbasierter Substanzapplikation und Nanopartikel-Technologie ein neues Feld für die Innenohrintervention durch modifizierte Biomaterialien im Cochlea-Implantat-Bereich eröffnet wird. 30 3.4 Konfokale Lasermikroskopie, Prinzip und Durchführung Die konfokale Laserrastermikroskopie (confocal laser scanning microscope = CLSM) hat sich in den vergangenen zehn Jahren zu einer in der Praxis häufig eingesetzten Technik entwickelt. Heute kommt sie in der biologischen Forschung, chemischen Analyse und Materialprüfung bevorzugt zum Einsatz. In der konfokalen Mikroskopie (Abb. 8) werden Strukturen erkannt, indem das von einer speziell markierten Probe emittierte oder reflektierte Licht aus einer einzigen Fokalebene gebündelt und sämtliches Licht, das nicht aus dieser Ebene stammt, unterdrückt wird (FLOCK et al. 1998). Abb. 8: Die Abbildung (Quelle: Benutzerhandbuch Leica TCS SP2) zeigt eine schematische Übersicht der Funktionsweise eines konfokalen Laserrastermikroskops. Bei einem konfokalen Punktscanner fokussieren die Linsen des Mikroskops das Laserlicht auf einen einzelnen Punkt der Probe (der Fokalpunkt). Laser eignen sich in der konfokalen Mikroskopie hervorragend als Lichtquellen, da sie sehr helles Licht abgeben und der Strahl nur eine geringe Abweichung aufweist. Darüber hinaus sind sie sehr einfach zu fokussieren 31 und stabil in der Intensität. Gerade diese Stabilität ist bei quantitativen Messungen von Bedeutung. Der Laser tastet die Probe nun Punkt für Punkt ab und erzeugt so das gescannte Bild. Fluoreszenzlicht und Reflexionslicht der Probe werden durch das Objektiv zurückgeleitet. Das Mikroskop und das optische System des Scan-Moduls fokussieren das vom Fokalpunkt emittierte Licht auf einen zweiten Punkt, den Konfokalpunkt. Durch die am Konfokalpunkt befindliche winzige Öffnung (sog. Pinhole), kann das Licht vom Fokalpunkt in den Detektor gelangen. Außerfokales Licht gelangt nicht durch die Öffnung (LEICAMICROSYSTEMS 2002). Wie bei konventionellen Epifluoreszenzmikroskopen wird eine Linse ebenso als Kondensor wie auch als Objektiv verwendet. Der große Vorteil ist, dass die Notwendigkeit, zwei Linsen exakt miteinander abzugleichen und gemeinsam auszurichten, entfällt. Ein kollimierter und polarisierter, durch eine Apertur geleiteter Laserstrahl wird von einem Strahlenteiler (einem dichroitischen Spiegel) in den hinteren Teil der Objektivlinse reflektiert und auf die Probe fokussiert. Das von der Probe reflektierte Licht wird durch dieselbe Linse zurückgeleitet. Der Lichtstrahl wird durch das Pinhole (d.h. die Konfokalöffnung) fokussiert, um auf diese Weise alles außerfokale Licht, das heißt Licht, das von anderen Bereichen der Probe unterhalb oder oberhalb der Fokalebene abgegeben wird, zu unterdrücken. Das Volumen der optischen Schnitte hängt von verschiedenen Parametern wie dem (variablen) Durchmesser der Öffnung und der Wellenlänge ab. Die innerfokalen Daten jedes Punktes auf der Probe werden von einem lichtempfindlichen Detektor (z. B. einer Photodiode), der hinter der Konfokalöffnung angeordnet ist, aufgezeichnet. Aufgrund ihres sehr hohen Signal-zu-Rauschverhältnisses werden heute Photomultiplier als Detektoren eingesetzt. Das analoge Ausgangssignal wird digitalisiert und an einen Computer weitergeleitet. Bei dem Detektor handelt es sich um einen Punktdetektor, der nur das Licht von einem Punkt der Probe empfängt. Daher kann mit dem konfokalen Mikroskop - im Gegensatz zum konventionellen Mikroskop, bei dem ein größerer Bereich der Probe zu sehen ist - zu einem Zeitpunkt immer nur ein Punkt der Probe beobachtet werden. Ein Gesamtbild der Probe ergibt sich daher erst durch das punktweise Abtasten der Probe, wobei entweder der Lichtpunkt oder die Probe verschoben wird. Diese beiden Möglichkeiten haben zu der Entwicklung von zwei unterschiedlichen Typen von konfokalen Mikroskopen geführt: Mikroskope mit beweglichem Objekttisch (Stage-scanning) und Mikroskope mit Strahlen- oder Spiegeltechnik, bei der der 32 Lichtpunkt über die feststehende Probe wandert und sie mit Hilfe von kleinen, schnellen, mit Galvanometern betriebenen Spiegeln Punkt für Punkt abtastet. Wird eine Abfolge von optischen Schnitten durch die Probe zu einem Bildstapel zusammengesetzt und anschließend digital verarbeitet, hat das den Vorteil, dass aus diesem mehrdimensionalen Datensatz entweder ein berechnetes zweidimensionales Bild (Projektion) erstellt oder eine verkleinerte 3D-Darstellung der Probe auf einem geeigneten Computer erzeugt werden kann (MACDONALD u. RUBEL 2008). Dadurch besteht nun die Möglichkeit, das angezeigte Bild auf vielfache Weise zu verändern: Verstärken der Kontraste durch Schwellwerte, lineare Kontraststreckung und Gammakorrektur Doppelbelichtung von Bildern in Experimenten. Digitales Filtern zum Vergrößern von Kanten, zum Glätten, Entstören etc. Rekonstruktion von 3D-Ansichten mit Hilfe von zu Bildstapeln zusammengesetzten optischen Schnitten. Zusammenstellung von digitalen Filmen anhand von mit dem Mikroskop aufgenommenen Zeitserien. Quantisierung und Messungen Diese Art der Bildbearbeitung erhöht nicht die Qualität der gesammelten Daten; sie dient jedoch dazu, die Sicht zu verbessern und die qualitative Interpretation der Daten zu erleichtern. 33 4 Material und Methoden 4.1 Material Ein Verzeichnis der verwendeten Lösungen, Reagenzien und Chemikalien (10.2), der Pharmaka (10.3), Geräte (10.5) sowie des verwendeten Laborbedarfs inklusive Verbrauchsmaterialien (10.4) findet sich in Tabellenform im Anhang. Auch die Herstellung einzelner Lösungen und Medien (10.1) ist in Abschnitt 10 (Anhang) genauer erläutert. 4.1.1 Hyperverzweigte Polylysine Die Herstellung der Hyperverzweigten Polylysine (Abb. 9) erfolgte im Laboratoire des Polymères an der Schweizer Partneruniversität École Polytechnique Fédérale in Lausanne nach dem Prinzip der thermischen Polymerisation von L-Lysinhydrochlorid (SCHOLL et al. 2007a). M Catalyst = Li, Na, K, Cs = Zr(OnBu)4, Ti(OnBu)4, Sb(OEt)3 or PyBoA in 3 mol% Abb. 9: Diese Abbildung illustriert die katalysierte thermische Polymerisation von L-Lysinhydrochlorid (links) bei 150 °C mit Hilfe einer metallischen Base MOH zu Hyperverzweigtem Polylysin (rechts) (Quelle: bereitgestellt durch die „École Polytechnique Fédérale in Lausanne). Zu Beginn wurde L-Lysinhydrochlorid zur Neutralisation mit einer metallischen Base auf 150 °C erhitzt, bis es vollständig geschmolzen war und die entsprechende Aminosäure L-Lysin frei vorlag. In vorangegangenen Experimenten wurden die Hydroxide von Na, Li, K und Cs für die Herstellung untersucht und verglichen, wobei die Verwendung von Kaliumhydroxid zu einem Produkt mit dem höchsten Molekulargewicht führte. 34 In Relation zum L-Lysin-Monomer wurden nun 3 mol% eines Katalysators addiert, während das bei der Polymerisation entstandene Wasser permanent aus dem offenen Reaktor entweichen konnte. Um die Biokompatibilität der Hyperverzweigten Polylysine weiter zu steigern und die Oberflächenladung besser kontrollieren zu können, wurde eine Insertion von Polyethylenglykol (PEG) an der Moleküloberfläche nötig. Zusätzlich zur PEGierung wurden die von uns genutzten Hyperverzweigten Polylysine an der Oberfläche mit einem Fluorophor gekoppelt, um sie bei der Internalisierung in den verschiedensten Kompartimenten sichtbar machen zu können. Die Modifizierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein-5-Isothiocyanat (FITC, Firma Pierce) geschah nach Empfehlung der Hersteller. Da für die Durchführung der Experimente Lösungen bevorzugt wurden, wurde jeweils 1 mg Pulver frisch vor dem Einsatz in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst, was bei einem Molekulargewicht von 24.600 g/mol zu einer molekularen Konzentration von 4,1 x 10-5 mol/l führte. Aufgrund der Polydispersität von 11,8 bei einem durchschnittlichen Durchmesser von 20 nm und einem Polymerisationsgrad von 185 kann hier die Nanopartikelmenge nicht in absoluten Werten angegeben werden, sondern lediglich als mol-Fraktion, was bei allen Mengenangaben in dieser Studie berücksichtigt wurde. 4.1.2 Lipidnanokapseln Die in dieser Studie verwendeten Lipidnanokapseln wurden in den „Laboratoires Annuaires Ingénierie de la Vectorisation Particulaire“ an der Universität von Angers in Frankreich als einer der Partner des EU-Konsortiums hergestellt. Für die Herstellung der Partikel, die sich aus einem flüssigen Kern umgeben von einer zusammenhängenden Phasengrenzschicht zusammensetzten und feinst verteilt in wässrigem Medium vorlagen (Abb. 10), kam eine neuartige phaseninversionsbasierte Methode zum Einsatz (HEURTAULT et al. 2002; BEDUNEAU et al. 2006). Dabei setzte sich die ölige Phase aus der lipophilen Einheit zusammen, während die wässrige Phase lediglich Natriumchlorid und Wasser beinhaltete. Zusätzlich wurden Moleküle benötigt, die Einfluss auf die Oberflächenspannung der Grenzschicht nehmen können. Um zunächst eine Öl-inWasser Emulsion zu erhalten wurden alle Komponenten im Magnetrührer vermengt und 35 progressiv erhitzt. Nach einem kurzen Intervall der Transparenz konnte bei etwa 85 °C eine Phasenumkehr beobachtet werden, so dass nun Wassertropfen in öliger Phase vorlagen. Der Temperaturzyklus zwischen 60 und 85 °C um die Zone der Phaseninversion wurde mindestens drei Mal durchlaufen, um eine möglichst stabile Wasser-in-Öl Emulsion zu erhalten und Lipidnanokapseln in der gewünschten Größe zu formieren. Um die produzierten Nanopartikel gegen den Körpermetabolismus abzuschirmen, war eine hohe Dichte von PEG an deren Oberfläche nötig. Im Anschluss an diesen PEGInsertionsprozess mussten die Nanopartikel noch zusätzlich mit dem Fluorophor Fluorescein5-isothiocyanat (FITC) markiert werden, um sie anschließend in Zellen und Geweben lokalisieren zu können (HEURTAULT et al. 2003). Auf diese Weise ist es im Gegensatz zu den Hyperverzweigten Polylysinen möglich, die Anzahl der Lipidnanokapseln in absoluten Werten anzugeben. Für die in dieser Studie durchgeführten Untersuchungen betrug die Konzentration der verwendeten Lösung 9,5 x 1014 Lipidnanokapseln pro ml bzw. 11 mg/ml bei einem Durchmesser der Lipidnanokapseln von 56,2 nm und einer Oberfläche von 9923 nm2. Abb. 10: Diese schematische Zeichnung zeigt die Zusammensetzung von Lipidnanokapseln. (Quelle: bereitgestellt durch die Universität von Angers) 4.1.3 Zelllinien Die Zytokompatibilitätsprüfung wird immer notwendiger für die Qualitätssicherung von Herstellungschargen und Neuprodukten, in diesem Fall multifunktionalen Nanopartikeln zum Wirkstofftransport (DIN EN ISO 10993). Dabei kann die In-vitro-Testung mittels 36 Zellkulturen Tierversuche zwar nicht ersetzen, jedoch toxische Materialien selektieren und somit die Zahl der Tierversuche auf ein unumgängliches Maß reduzieren. Für routinemäßige Toxizitätstests wurde die permanente Zelllinie L929 (Mausfibroblasten, CCL-1TM, ATCC, Manassas, VA, USA) eingesetzt. Dabei handelt es sich um adhärent wachsende Fibroblasten, die aus subkutanem areolarem und adipotischem Gewebe einer männlichen C3H/An Maus stammen. 4.1.4 Versuchstiere Für die vorliegende Arbeit wurden 36 pigmentierte Meerschweinchen des BFA-Stammes beiderlei Geschlechts mit einem Ausgangsgewicht von 250 bis 450 g verwendet. Die Tiere stammen aus der Zucht der Firma Charles River WIGA GmbH, Sulzfeld. Das Tierversuchsvorhaben wurde gemäß § 8 des Deutschen Tierschutzgesetzes durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES, Oldenburg) unter der Antragsnummer 33.9-42502-04-07/1266 genehmigt. Somit erfolgte die Durchführung der Studie in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz und mit der EU-Richtlinie 86/609/EWG zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere. Vor Versuchsbeginn Hirnstammpotenziale wurde der durch Hörstatus Ableitung der Tiere akustisch-evozierter überprüft. Nur auditorischer normal hörende Meerschweinchen wurden in das Projekt integriert. Alle Versuche wurden in den Operationsräumen des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. 4.1.5 Tierhaltung Die Haltung der Meerschweinchen entsprach der EU-Richtlinie 86/609/EWG und erfolgte in den Räumlichkeiten des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover unter identischen Bedingungen für alle Tiere. Die Unterbringung erfolgte in Gruppen von drei Tieren in Typ 4 Makrolon-Käfigen (Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Niederlande) bei 20 °C bis 24 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 bis 60%. Der Tagesrhythmus der Tiere wurde über einen elektronisch gesteuerten Hell-Dunkel-Zyklus im 12-stündigen Wechsel beginnend mit einer Hellphase um 7:00 Uhr sichergestellt. Als Einstreu wurde 37 entkeimte Weichholzfaser verwendet, während sich das Futterangebot aus Trockenpelletfutter (Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest) und Heu zusammensetzte und Trinkwasser den Meerschweinchen ad libitum zur Verfügung stand. 4.1.6 Versuchsgruppen Die insgesamt 36 Meerschweinchen umfassende Tiergruppe wurde geteilt, so dass 18 Tiere für die Untersuchung der Lipidnanokapseln (LNK) und 18 Tiere für die Hyperverzweigten Polylysine (HP) eingesetzt wurden. In den Gruppen HP-2, HP-14 und HP-28, sowie LNK-2, LNK-14 und LNK-28 wurden die entsprechenden Nanopartikel via Cochleostomie in die Scala tympani injiziert, wobei jeweils 6 Tiere nach 2 Tagen, 14 Tagen und 28 Tagen getötet wurden (Tabelle 1). Tab. 1: Übersicht über die Versuchsgruppen und ihre Benennung in dieser Dissertation, die Tierzahlen, die injizierten Nanopartikel und den zeitlichen Verlauf der Untersuchungen bis zur Tötung Zeitlicher Verlauf Tiergruppe/ Nano- Tierzahl partikel Tag 0 Tag 2 HP-2, n=6 HP AABR AABR Cochleostomie Tötung AABR AABR HP-14, n=6 HP Cochleostomie HP-28, n=6 HP AABR Tag 14 AABR Tötung AABR AABR Cochleostomie LNK-2, n=6 LNK-14, n=6 LNK LNK Tötung AABR AABR Cochleostomie Tötung AABR AABR Cochleostomie LNK-28, n=6 LNK AABR Cochleostomie Tag 28 AABR Tötung AABR AABR Tötung 38 4.2 Methoden 4.2.1 Überblick über die In-vitro-Versuche Bevor die beiden Nanopartikeltypen, Hyperverzweigte Polylysine (HP) und Lipidnanokapseln (LNK), am Tiermodell getestet wurden, war es nötig, erste Toxizitätstests in vitro mittels Neutralrotfärbung durchzuführen, wofür die L929-Zelllinie routinemäßig eingesetzt wurde. Darüber hinaus wurde die Detektion der Partikel mit Hilfe der Konfokalen Laser Scanning Mikroskopie an der Zellkultur überprüft und standardisiert, sowie eine quantitative Ermittlung der Nanopartikelaufnahme in die Zellen über Fluoreszenzmessungen durchgeführt. Erst dieses Screening (Abb. 11) gewährleistete ein Mindestmaß an Sicherheit für die folgenden In-vivoVersuche und erste Erkenntnisse im allgemeinen Umgang mit den zu untersuchenden Nanopartikeln. Hyperverzweigte Polylysine CLSM Fluoreszenzmessung Neutralrot-Test Lipidnanokapseln Abb. 11: Übersicht über die Durchführung der einzelnen In-vitro-Methoden 4.2.2 Zellkultivierung von L929-Mausfibroblasten Transport und Aufbewahrung der L929-Zellkultur (siehe Abschnitt 4.1.1) über einen längeren Zeitraum geschah in 1,8 ml Einfrierröhrchen im Stickstofftank bei -196 °C. Zum Auftauen der Fibroblasten zur Durchführung von Experimenten wurden die Gefrierröhrchen dem Stickstofftank entnommen und im 37 °C-Wasserbad unter Schwenken so schnell wie möglich aufgetaut. Der Inhalt eines Einfrierröhrchens wurde in ein spitzes Zentrifugenröhrchen zu 7 ml auf 37 °C vorgewärmtes komplementiertes DMEM gegeben und bei Raumtemperatur für 39 4 Minuten bei 800 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgezogen und die Zellen in 5 ml frischem Medium resuspendiert und komplett in eine kleine Zellkulturflasche überführt. Die anschließende Kultivierung der L929-Zellen erfolgte unter Standardbrutbedingungen im Inkubator bei 37 °C in 5%-iger CO2-Atmosphäre und 95% Luftfeuchtigkeit, wobei ca. alle drei Tage das Medium erneuert wurde. Sobald die Zellen nahezu konfluentes Wachstum zeigten, bzw. mindestens 70% der Fläche bedeckten, erfolgte eine Passage der Zellkultur. Dazu wurde das Medium aus den Flaschen abgesaugt und einmal mit 5 ml Hanks-Lösung gespült. Zum Lösen und Vereinzeln der adhärent wachsenden Zellen wurde 1 ml Trypsin-/ EDTA-Lösung dazugegeben und 4 min bei 37 °C inkubiert, bis die Zellen bei mikroskopischer Kontrolle einzeln, abgekugelt und frei beweglich erschienen. Daraufhin wurde die Reaktion durch Zugabe von 4 ml Nährmedium gestoppt. Es erfolgte eine gründliche Suspension der gelösten Zellen im Medium, bevor 3 bis 5 Tropfen zum Animpfen der Folgekultur in eine neue Zellkulturflasche überführt wurden. Abschließend wurden 5 ml komplementiertes DMEM zugefügt und die Kultur im Brutschrank bis zur nächsten Passage oder Einsaat inkubiert. Zum Erhalt der Zelllinie und dauerhaften Lagerung wurden die Zellen möglichst in ihrer logarithmischen Wachstumsphase eingefroren. Dazu wurde zunächst eine Trypsinierung wie oben beschrieben durchgeführt, um die Zellen zu lösen, zu vereinzeln und schließlich in frischem Medium zu suspendieren. Vor der Überführung ins Gefriermedium war eine Bestimmung der Anzahl vitaler Zellen erforderlich. Dies geschah, indem 10 µl Zellsuspension mit 10 µl Trypanblau vermischt wurden und eine Neubauer-Zählkammer (0,1 mm Tiefe, 0,0025 mm2 Fläche) mit dieser Mischung beschickt wurde. Anschließend wurden die Zellen unter dem Lichtmikroskop ausgezählt, wobei die vitalen, hellen und ungefärbten Zellen deutlich von den toten, blau gefärbten Zellen zu differenzieren waren. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurde die Zellsuspension 4 min bei 800 rpm zentrifugiert und das Nährmedium abgesogen. Es erfolgte eine Zugabe von Gefriermedium, so dass sich eine Zelldichte von 4 bis 5 x 106 Zellen/ml ergab. Diese Gefrierlösung wurde in die Kryoröhrchen gefüllt und langsam heruntergekühlt: 2 Stunden in 4 °C, 12 Stunden in -20 °C, 12 Stunden in -80 °C und schließlich dauerhaft in -196 °C im Stickstofftank. Eine Auflistung der genutzten Chemikalien, Geräte und Verbrauchsmaterialien findet sich im Abschnitt 10 (Anhang). 40 4.2.3 Untersuchung zur Nanopartikelaufnahme in Zellen 4.2.3.1 Zelleinsaat und Inkubation Um in Zellen inkorporierte Nanopartikel zu visualisieren, wurde die Konfokale Laser Scanning Mikroskopie genutzt. Vor der Anwendung dieser Methode an Geweben aus Tierversuchen wurde die Detektion an Zellkulturen standardisiert. Dazu wurden L929-Zellen wie bereits beschrieben trypsiniert und die Zellzahl bestimmt. Anschließend wurden die Zellen in einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Well in 300 µl komplementiertem DMEM in 48er Zellkulturplatten eingesät. Dabei sollten die Zellen auf kleinen herausnehmbaren Glasplättchen in Deckgläschendicke von 0,13 mm wachsen, die zuvor zurechtgeschnitten und in die einzelnen Vertiefungen gelegt wurden. Die Ursprungslösung der Nanopartikel wurde mit Hilfe des Mediums 1:100 verdünnt, so dass sich letztendlich 1,23 x 10-7 mmol Hyperverzweigte Polylysine bzw. 2,85 x 1012 Lipidnanokapseln in jedem Well befanden, was insgesamt sechs Mal pro Nanopartikel wiederholt wurde. Danach erfolgte eine 24-stündige Inkubation im Brutschrank bei 37 °C, 5%-iger CO2Atmosphäre und 95% Luftfeuchte. 4.2.3.2 Fixierung und Phalloidinfärbung Nach erfolgter Inkubation wurde das Medium aus den Wells abgezogen und es wurde zwei Mal mit 300 µl PBS pro Well gespült, um alle Reste zu entfernen. Es folgte eine 10-minütige Fixierung der Zellen mit 4%-igem PFA bei Raumtemperatur, bevor auch dieses durch dreimaliges Spülen mit PBS gründlich entfernt wurde. Mit Hilfe von Triton X-100 0,1% wurden die Zellmembranen 5 Minuten permeabilisiert, bevor eine Färbung der Aktinfilamente durchgeführt wurde, indem 200 µl PBS und 5 µl Rhodamin Phalloidin pro Well hinzugefügt wurden. Nach 20- bis 30-minütiger lichtgeschützter Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Wells ein letztes Mal mit PBS gespült, bevor die Glasplättchen mit feinen Pinzetten aus den Wells entnommen und mit ProLong Gold antifade reagent mit DAPI auf Objektträgern eingedeckelt wurden. Nach einer Trocknungszeit von 24 Stunden wurden die Deckgläschen durch Nagellack auf den Objektträgern fixiert und konnten so lichtgeschützt bis zur mikroskopischen Auswertung gelagert werden. 41 4.2.3.3 Auswertung mittels Konfokaler Lasermikroskopie Die getrockneten und fixierten Objektträger wurden mit dem True Confocal Scanner SP2 und der entsprechenden Leica Confocal Software untersucht (Abb. 12). Abb. 12: Fotographische Aufnahme des Arbeitsplatzes mit Konfikalmikroskop TCS SP2 und angeschlossenem PC mit Auswertungssoftware. Zunächst wurde der gewünschte Bildausschnitt lichtmikroskopisch mit dem 63er Ölimmersionsobjektiv eingestellt, bevor die Laser zum Einsatz kamen. Um ein Überlappen der Exzitations- und Emissionsspektren der drei Farbstoffe zu verhindern, war für die Visualisierung der Nanopartikel in den Zellen eine sequenzielle Analyse erforderlich, wobei folgende Filter zur Anwendung kamen (Tabelle 2): Tab. 2: Übersicht über die zur Anwendung gekommenen Fluoreszenzfarbstoffe, die markierten Komponenten und die notwendigen Wellenlängen der eingesetzten Laser. Fluoreszenzfarbstoff Markiertes Kompartment Exzitation Emission Farbe im CLSM DAPI Zellkern 405 nm 430 – 470 nm blau FITC Nanopartikel 488 nm 500 – 530 nm grün TRITC Aktinfilamente 543 nm 570 – 610 nm rot Im Echtzeit-Aufnahmemodus wurde die Bildqualität über veränderte Laserleistung, elektronische Nachverstärkung am Detektor oder verbesserte Tiefendiskriminierung durch 42 Ausblenden außerfokaler Ebenen optimiert. Mit einer Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln und 8-facher Mittelung der Werte wurde schließlich das endgültige Bild für jeden Kanal aufgenommen. Die daraus resultierenden Einzelbilder wurden anschließend übereinander gelegt, um die Nanopartikel in den Zellen exakt lokalisieren zu können. 4.2.4 Quantifizierung der Nanopartikelaufnahme Um die Aufnahme von markierten Nanopartikeln in die zwei Zelltypen zu quantifizieren, sind konzentrationsabhängige Fluoreszenzmessungen durchgeführt worden. In einem ersten Schritt wurde eine Konzentrationsreihe der bekannten Stammlösung gemessen und die ermittelten Werte als Kalibrationskurve genutzt. Im zweiten Schritt wurden die Zellen mit unterschiedlichen Nanopartikelkonzentrationen inkubiert, die Fluoreszenz gemessen und schließlich mit Hilfe der Kalibrationskurve die Nanopartikelanzahl pro Well bestimmt. 4.2.4.1 Zelleinsaat und Inkubation Für diesen Ansatz wurden 1 x 104 Zellen pro Well in schwarze 96er-Zellkulturplatten eingesät, um Streulicht bei der Fluoreszenzmessung zu verhindern, und 24 Stunden in 100 µl komplementiertem DMEM inkubiert. Ausgehend von einer Initialkonzentration von 6,8 x 10-8 mol Hyperverzweigte Polylysine pro ml und 9,5 x 1014 Lipidnanokapseln pro ml wurden fünf verschiedene Nanopartikelkonzentrationen den Zellen beigefügt: 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 und 1:1000 jeweils im Nährmedium verdünnt. Pro Platte wiederholte sich jede Verdünnungsstufe sechs Mal, so dass sich bei vier Platten pro Nanopartikel und Zelllinie insgesamt 24 Wiederholungen für jeden Konzentrationsschritt ergaben. Nach 24-stündiger Inkubation im Brutschrank wurde das Medium entfernt und drei Mal mit PBS gespült, um möglichst alle nicht in die Zellen inkorporierten Nanopartikel zu eliminieren. Für die Messung wurden die Zellen mit 100 µl PBS überschichtet. Außerdem wurde eine Konzentrationsreihe der Nanopartikelstammlösungen von 1:10 bis 1:100.000 in PBS hergestellt, wovon ebenfalls jeweils 100 µl in ein Well pipettiert wurden, um daraus später die Kalibrationskurve zu erstellen. 43 4.2.4.2 Fluoreszenzmessung Die konzentrationsabhängigen Fluoreszenzmessungen wurden mit dem MikroplattenFluorometer FluoroSkan Ascent und der entsprechenden Ascent Software durchgeführt. Da in diesem Fall nur FITC-markierte Nanopartikel zum Einsatz kamen, wurde der Exzitationsfilter mit 480 nm und der Emissionsfilter mit 520 nm für die Messungen gewählt. Zunächst wurden die Konzentrationsreihen der bekannten Stammlösungen vermessen und die ermittelten Emissionswerte gegen die eingesetzte Nanopartikelanzahl ins Verhältnis gesetzt. Die daraus errechnete Funktion verdeutlichte die lineare Abhängigkeit der Werte und wurde im weiteren Verlauf für die Berechnung der Nanopartikelzahl in den einzelnen Wells genutzt (Abb. 13). Schließlich wurden die Emissionen der Wells gemessen, in denen die Zellen mit den Nanopartikeln inkubiert wurden. Die zuvor generierte lineare Funktion ermöglichte es, die gemessenen Emissionen für jedes Well in Nanopartikelanzahl umzurechnen. Die Resultate wurden sowohl als absolute Zahlen wiedergegeben, als auch prozentual zur Nanopartikelkonzentration, die sich im Nährmedium befunden hat, um zu verdeutlichen, wie groß der Anteil der Nanopartikel im Medium war, der tatsächlich von den Zellen aufgenommen wurde. Für jede Konzentration wurden die Werte gemittelt und die Standardabweichung bestimmt, sowie ein zweiseitiger t-Test für abhängige Stichproben durchgeführt. 44 Kalibrationsreihe Lipidnanokapseln 40 Gemessene Fluoreszenz y = 8E-12x 30 NP verdünnt in PBS 20 Trendlinie 10 0 0 1E+12 2E+12 3E+12 4E+12 5E+12 Anzahl der Nanopartikel Abb. 13: Darstellung einer Kalibrationskurve – die Nanopartikelverdünnungsreihe wurde mit dem FluoroSkan Ascent vermessen und die Resultate gegen die Nanopartikelanzahl ins Verhältnis gesetzt. Die Funktion der ermittelten Trendlinie diente im weiteren Verlauf der Berechnung der Nanopartikelanzahl aus der gemessenen Emission. 4.2.5 Untersuchung auf Zytotoxizität der Nanopartikel Für Zytotoxizitätsbestimmungen kam der Neutralrottest zur Anwendung, welcher von den Lysosomen vitaler Zellen aufgenommenes Neutralrot photometrisch quantifiziert und zu einer Kontrollgruppe ins Verhältnis setzt (BORENFREUND u. PUERNER 1985). 4.2.5.1 Zelleinsaat und Inkubation Analog zum Ansatz für die Fluoreszenzmessungen wurden auch hier 1 x 104 Zellen pro Well in 100 µl Kulturmedium in 96er-Multiplatten eingesät und Nanopartikel in den Verdünnungsstufen 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 und 1:1000 hinzugefügt. Zusätzlich wurde eine Kontrollgruppe addiert, bei der die Zellen ohne Nanopartikelzugabe kultiviert wurden, wobei 45 auch hier sechs Wiederholungen pro Platte und vier Platten pro Nanopartikeltyp eingesät wurden. Die Kultivierung erfolgte 24 Stunden bei 37 °C im Brutschrank. 4.2.5.2 Neutralrotfärbung und photometrische Messung Im Anschluss an die Kultivierung wurde das Nährmedium entfernt und durch 100 µl der präparierten Neutralrotlösung ersetzt, die einer Inkubation von drei Stunden bei 37 °C bedurfte. Daraufhin wurden die Kulturplatten für 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert, bevor die Farblösung ausgeschlagen wurde und die Zellen mit 100 µl der Lösung I fixiert wurden. Es folgte eine erneute Zentrifugation der Platten für 5 min bei 1000 rpm, bevor Lösung I durch Lösung II zur Extraktion ersetzt werden konnte. Eine gute Dispersion konnte erreicht werden, indem die Platten ca. 30 s bei 500 rpm geschüttelt wurden, bevor sie 10 Minuten im Kühlschrank bei 6 °C ein letztes Mal inkubierten. Die photometrischen Messungen wurden schließlich mit dem MultiSkan Ascent und der entsprechenden Ascent Software bei einer Wellenlänge von 570 nm durchgeführt. Die Werte der Kontrollgruppe, die ohne Nanopartikel inkubiert wurde, wurden auf eine Vitalität von 100% festgesetzt, so dass alle anderen Werte dazu ins Verhältnis gesetzt werden konnten. Damit gibt der Quotient aus Probenwert und Kontrollwert den prozentualen Anteil der vitalen Zellen pro Well an. Für die Bestimmung einer statistischen Signifikanz wurden die insgesamt 24 Werte pro Ansatz gemittelt, der Kontrollgruppe gegenübergestellt und ein zweiseitiger t-Test für abhängige Werte durchgeführt. 4.2.6 Überblick über die In-vivo-Versuche Nachdem sich die Nanopartikel in den In-vitro-Versuchen als nicht-toxisch erwiesen haben und es möglich war, sie in den verschiedenen Zelllinien zu visualisieren, wurde auch eine Invivo-Studie begonnen. Dabei wurden die Nanopartikel in den Tiergruppen HP-2, -14 und -28 für die Hyperverzweigten Polylysine sowie LNK-2, -14 und -28 für die Lipidnanokapseln via Cochleostomie in die Scala tympani von Meerschweinchen injiziert und über 2, 14 und 28 Tage beobachtet. Zum einen wurde mit Hilfe der Konfokalmikroskopie die Fähigkeit der Vehikel untersucht, verschiedene Zellgewebe zu infiltrieren. Zum anderen wurde die mögliche Toxizität evaluiert, indem sowohl die Haarzellen gezählt und ein 46 Zytocochleogramm erstellt wurde als auch durch funktionelle elektrophysiologische Messungen und Bestimmung der frequenzspezifischen Hörschwelle an Tag 0, 2, 14 und 28 (Abb. 14). d0 d2 HP-/ LNK-28 HP-/ LNK-14 HP-/ LNK-2 AABR und Cochleostomie d14 d28 AABR, Tötung AABR, Tötung AABR, Tötung CLSM und Zytocochleogramm Abb. 14: Übersicht über die angewendeten Methoden in der In-vivo-Studie den einzelnen Tiergruppen zugeordnet 4.2.7 Narkose, Vor- und Nachsorge der Tiere Alle Manipulationen an den Meerschweinchen, chirurgische Eingriffe und elektrophysiologische Messungen wurden unter Allgemeinanästhesie durchgeführt. Nach genauer Gewichtsermittlung erhielten die Tiere initial 40 mg Ketamin/kg Körpergewicht (KGW) in Kombination mit 10 mg Xylazin/kg KGW intramuskulär verabreicht, wobei je nach Narkosedauer und –tiefe zur Erhaltung die halbe Ursprungsdosis nachgegeben wurde. Parasympatische Effekte wurden durch das Anticholinergikum Glycopyrroniumbromid in einer Dosierung von 0,05 mg/kg KGW subkutan (s.c.) gemildert. Zur Analgesie wurde den Tieren zum einen 5 mg/kg KGW des nicht-steroidalen Entzündungshemmers Carprofen subkutan appliziert, zum anderen wurde eine Lokalanästhesie mit ca. 0,5 ml Prilocain an der Schnittstelle vorgenommen. Zur Erhaltung des Flüssigkeitshaushaltes wurden den Meerschweinchen 15 ml/kg KGW Ringer-Acetat-Lösung subkutan appliziert, während dexpanthenolhaltige Augensalbe die Hornhaut bei fehlendem Lidreflex schützen sollte. Eine antibiotische Abdeckung erfolgte mit einem Kombinationspräparat aus Trimethoprim und Sulfamethoxazol, das von einem Tag vor dem chirurgischen Eingriff bis 5 Tage post operationem über das Trinkwasser verabreicht wurde (1,875 ml Cotrim K/500 ml Wasser). Um gastrointestinalen Komplikationen wie Tympanien vorzubeugen, wurde den 47 Meerschweinchen am Tag der Operation, sowie einen Tag davor und danach je 0,5 g Bird Bene Bac® zur Stabilisierung der Darmflora oral eingegeben. Für die gesamte Narkosedauer wurden die Tiere auf einem Wärmebett oder einer Wärmematte platziert, um die Körpertemperatur konstant zu halten. Für die Cochleostomie erfolgte eine chirurgische Vorbereitung des Operationsgebietes: Der postaurikuläre Bereich wurde mit der Haarschneidemaschine so kurz wie möglich geschoren und mit Braunoderm gründlich desinfiziert, um das Infektionsrisiko so gering wie möglich zu halten. 4.2.8 Messung akustisch-evozierter Hirnstammpotenziale Vor der intracochleären Applikation der Nanopartikel am Tag 0, zwei Tage nach dem Eingriff und der jeweiligen Gruppe zugeordnet am Tag 14 bzw. 28 wurde über die AABR-Messung die frequenzspezifische Hörschwelle der Tiere bestimmt und verglichen. Für die Ableitung der akustisch-evozierten auditorischen Hirnstammpotenziale kam das System der Tucker-Davis Technologies zum Einsatz, dessen Herzstück aus der Basisstation, dem Multifunktionsprozessor und dem Mikrostimulator besteht. Für die Durchführung der Messung wurden die anästhesierten Meerschweinchen (siehe Abschnitt 4.2.7) auf einer Wärmematte in einem schalldichten Raum platziert. Die akustischen Stimuli wurden über elektrostatische Lautsprecher und als Ohrhörer umfunktionierte und in der Größe angepasste 200 µl Pipettenspitzen den Tieren präsentiert. Diese Lautsprecher-Spitzen-Kombination wurde zuvor mittels eines 0,25 Inch-Druckfeld-empfängers für diesen Zweck kalibriert und dann in den äußeren Gehörgang der Tiere eingeführt. Die Ableitung der elektrophysiologischen Potenziale geschah über subdermale Nadelelektroden, die so angebracht wurden, dass sich der positive Pol am Vertex, der negative Pol am linken und rechten Mastoid und die Erdungselektrode im Nacken der Meerschweinchen befanden. Über einen 1,5 mm Sicherheitsverbindungsstecker wurden die Ableitelektroden mit dem NiedrigImpedanz-Headstage verbunden, der die Signale weiter über einen Vorverstärker und ein Glasfaser-Optikkabel zur Basisstation leitete. Die verschiedenen Hardware-Komponenten der Messeinheit wurden über einen angeschlossenen Computer gesteuert, was über TDT-Software geschah, aber auch über die anwendungsspezifische Software HughPhonics (LIM u. ANDERSON 2006). Dabei handelt es sich um eine in MATLAB Schreibweise erstellte, maßgeschneiderte Software zur AABR-Messung und Auswertung der Daten (Abb. 15). 48 A GlasfaserOptikkabel Vorverstärker Headstage Verbindungsstecker Nadelelektroden B C Abb. 15: Die Abbildung demonstriert den Aufbau der AABR-Messeinheit von Tucker-Davis Technologies. Unter A ist die computergesteuerte Basisstation mit Mikrostimulator und Multifunktionsprozessor abgebildet. B zeigt die Ableitung der evozierten Potenziale von den Nadelelektroden bis zum Glasfaser-Optikkabel, welches dann mit der Basisstation verbunden ist. Unter C ist ein anästhesiertes Meerschweinchen abgebildet, dem über die kalibrierte Lautsprecher-Spitzen-Kombination akustische Stimuli präsentiert werden, so dass evozierte Potenziale über subdermale Nadelelektroden abgeleitet werden können. 49 Bevor mit der eigentlichen Messung begonnen wurde, war es nötig über einen Vortest mittels Breitbandrauschen folgende Messparameter festzulegen: Dieser Vortest erlaubte die Festlegung des Grades der Artefaktunterdrückung, der in Abhängigkeit von den umgebenden Störsignalen zwischen 100 und 500 µV lag. Je nach Hörvermögen des Tieres wurde der Lautstärkebereich festgelegt, in dem in 10 dB Schritten die AABR gemessen wurde, wobei folgende Frequenzen standardisiert eingehalten wurden: 1 kHz, 4 kHz, 8 kHz, 16 kHz, 32 kHz und 40 kHz. Die Festlegung der Grenzfrequenzen des Bandpassfilters geschah einheitlich mit einem Hochpass von 300 Hz und einem Tiefpass von 3000 Hz, um die Aufnahme von Hintergrundfrequenzen zu unterdrücken. Im Anschluss an diese Vorabkonfiguration wurde ein Kanal zur Stimulation eines Ohres gewählt und randomisiert die verschiedenen Frequenzen und Lautstärken dem Tier präsentiert. Die dabei generierten Töne hatten eine Dauer von 10 ms mit einer eckigen kosinusförmigen An- und Abstiegszeit von jeweils 1 ms, wobei der Digital-Analog (D/A)-Umsetzer nach dem Sigma-Delta-Verfahren eine Umsatzrate von 200 kHz bzw. 24-bit hatte. Die erfassten neurologischen Signale vom Tier wurden schließlich mit einer A/D-Umsatzrate von 25 kHz (16-bit) digitalisiert und 200 bis 250 Durchläufe pro Stimulation gemittelt. Die über die TDT- und HughPhonics Software entstandenen Rohdaten wurden zunächst in ein anderes Format konvertiert, bevor die Auswertung über MATLAB Software erfolgte. Um eine möglichst objektive Interpretation der Daten zu ermöglichen, ermittelte das Programm aus den Signalen, die ohne akustische Stimulation abgeleitet wurden, den Mittelwert und die Standardabweichung. Als Hörschwelle für eine bestimmte Frequenz wurde die Lautstärke definiert, bei der der dritte Peak der AABR die doppelte Standardabweichung des Hintergrundrauschens noch überschreitet (Abb. 16). Diese Werte wurden für alle Frequenzen für jedes Tier erhoben und dann innerhalb einer Tiergruppe für jeden Messtag gemittelt und die Standardabweichung bestimmt. Aufgrund der relativ geringen Tierzahl pro Gruppe und der Messung in 10 dB-Schritten wurde für die statistische Auswertung der Wilcoxon-Rangsummentest genutzt. Dabei wurde für jede Frequenz und jedes Ohr der Anstieg der Hörschwelle an Tag 2, 14 bzw. 28 gegenüber Tag 0 verglichen, aber auch die Differenzen zwischen dem linken und rechten Ohr der jeweiligen Gruppe. 50 Abb. 16: Dieser Graph veranschaulicht die Auswertung der konvertierten Messdaten mit MATLAB Software. In 10 dB Schritten wurden die auditorischen Hirnstammpotenziale zwischen 0 und 70 dB SPL bei 8000 Hz Stimulation abgeleitet, bei 206 bis 215 Mittelungen pro Durchlauf (Schwankungen wegen randomisierter Stimulation). Waagerecht ist die einfache und doppelte Standardabweichung sichtbar, die bis 30 dB SPL vom dritten Peak noch überschritten wird, so dass dort die frequenzspezifische Hörschwelle festgesetzt werden kann. 51 4.2.9 Flüssigkeitsapplikation ins Innenohr via Cochleostomie Für die Injektion von Lösungen in die Scala tympani via Cochleostomie wurde ein sehr kleiner Katheter benötigt, der auf eine Hamiltonspritze aufgesetzt werden konnte. Dazu wurde ein Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,3 mm und einem Außendurchmesser von 0,7 mm auf ca. 20 cm Länge zurechtgeschnitten und bis zum Konus über das stumpfe Ende einer 27G-Präzisionskanüle geschoben. In das andere Ende des Silikonschlauches wurde ein ca. 3 cm langer Polyimidschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,12 mm zur Hälfte hineingeschoben. Beide Enden wurden abschließend mit dem Sofortklebstoff Loctite 4061 dicht verschlossen, so dass nach erfolgter Aushärtung eine Sterilisation mit Gas durchgeführt werden konnte (Abb. 17). Polyimidschlauch 27G Kanüle Silikonschlauch Hamiltonspritze 10µl Abb. 17: Diese Abbildung veranschaulicht den Aufbau des Injektionskatheters: An dem Silikonschlauch wurde auf einer Seite eine stumpfe Kanüle für den Aufsatz der Hamiltonspritze befestigt, während ein eingeschobener Polyimidschlauch am anderen Ende die nötige Größe für die Insertion in die Cochleostomie ermöglicht. 52 Für die Injektion in die Scala tympani der Meerschweinchen wurde die Stammlösung zunächst 1:100 mit PBS verdünnt und dann steril filtriert. Am Tag 0 wurde die Ausgangshörschwelle der Tiere bestimmt. Anschließend wurde die verdünnte Nanopartikellösung in die linke Cochlea injiziert, während in die rechte Cochlea zur Kontrolle die Injektion mit PBS-Lösung erfolgte. Durch eine postaurikuläre Inzision wurden dazu Haut und Platysma durchtrennt. Die Muskulatur wurde stumpf präpariert und nach kaudal verlagert, sowie der mastoidale Anteil des Musculus sternocleidomastoideus von seinem Ansatz mobilisiert, bis die Bulla tympanica freigelegt war. Das Periost wurde entfernt und mit Hilfe einer 11er Skalpellklinge das Mittelohr eröffnet, so dass die Cochlea unter dem Stativmikroskop dargestellt werden konnte. Mit einer kleinen spitzen Sonde wurde dann in der basalen Windung nahe der Rundfenstermembran eine Cochleostomie angelegt, so dass man einen Zugang zum perilymphatischen Raum der Scala tympani erhielt. Dort wurde das Polyimid-Ende des zuvor präparierten und gefüllten Injektionsschlauches mit aufgesetzter Hamiltonspritze unter mikroskopischer Kontrolle vorsichtig inseriert und 5 µl der Flüssigkeit über fünf Minuten bis zehn Minuten injiziert (Abb. 18). Auf diese Weise wurden je nach Tiergruppe 3,4 x 10-12 mol Hyperverzweigte Polylysine bzw. 4,7 x 1010 Lipidnanokapseln in die linke Cochlea appliziert, während rechts PBS injiziert wurde. Sowohl die Cochleostomie als auch der Bulladefekt wurden anschließend mit Karboxylatzement verschlossen. Die Wunde wurde in zwei Schichten mit Einzelnähten adaptiert, wobei für die Muskulatur eine absorbierbare NadelFaden-Kombination verwendet wurde, während die Haut mit nicht-resorbierbarem NylonNahtmaterial verschlossen wurde. 53 A B Tympanotomie Rundes Fenster C D Cochleostomie Injektionskatheter Abb. 18: Diese Fotoserie illustriert die Flüssigkeitsapplikationapplikation via Cochleostomie in die Scala tympani eines Meerschweinchens. A: Freilegung der Bulla tympanica und Tympanotomie; B: Orientierung in der Mittelohrkavität und Ausrichtung der Cochlea anhand des Runden Fensters. C: Cochleostomie in der basalen Windung nahe des Runden Fensters; D: Insertion des präparierten Injektionskatheters in die Scala tympani 4.2.10 Gewinnung und Aufarbeitung der Cochleae Je nach Tiergruppe wurde nach 2, 14 oder 28 Tagen abschließend noch einmal die Hörschwelle der Meerschweinchen bestimmt, bevor das Gewebe für konfokalmikroskopische Untersuchungen und die Erstellung eines Zytocochleogramms gewonnen und aufgearbeitet wurde. 54 4.2.10.1 Transkardiale Perfusion Im Anschluss an die elektrophysiologischen Messungen erhielten die Tiere zur Sicherstellung einer ausreichenden Narkosetiefe die Hälfte der Initialdosis zusätzlich i.m. verabreicht. Bevor die Meerschweinchen transkardial perfundiert wurden, wurde zusätzlich eine Lokalanästhesie mit 5 ml Prilocain s.c. entlang der Schnittlinie durchgeführt. Nach entsprechender Wirkzeit wurde zunächst eine Thorakotomie durchgeführt, das Herz freigelegt und der Herzbeutel eröffnet. Ein Schnitt in den rechten Vorhof ermöglichte den Abfluss von Blut und Perfusionslösung aus dem Körperkreislauf. In den linken Ventrikel wurde eine Kanüle eingeführt, welche über ein angeschlossenes Infusionsbesteck dem Herzen zunächst 200 ml PBS zum Ausspülen des Blutes zuführte. Daraufhin erfolgte eine Fixierung des Tierkörpers durch die Zufuhr von 200 ml 4%-igem Paraformaldehyd unter dem Abzug. 4.2.10.2 Felsenbeinentnahme und Gewinnung der Cochleae Nach der Fixierung folgte die Dekapitation des Tieres mit anschließender Abpräparation der Schädelhaut. Die Schädeldecke wurde durch zwei Scherenschläge vom Hinterhauptsloch in Richtung temporaler Augenwinkel durchtrennt, nach rostral umgeklappt und schließlich entfernt. Nachdem das Gehirn entfernt wurde, konnten die Felsenbeine manuell aus dem Schädel herausgebrochen und nach Entfernung anhaftender Muskel- und Sehnenanteile in PBS überführt werden. Des Weiteren wurden die Felsenbeine mit der Spitze einer Pinzette eröffnet und die Bullawand mit Hilfe einer Zange großflächig entfernt, so dass die weitere Dissektion in einer PBS-gefüllten Petrischale unter dem Auflichtmikroskop mittels feiner Präzisionspinzetten erfolgen konnte. Dabei wurden sowohl das Runde als auch das Ovale Fenster eröffnet und eine Öffnung in den knöchernen Apex der Cochlea gebohrt. Von dieser Öffnung ausgehend wurde die knöcherne Cochleawand mit einer Dumont Pinzette Nr. 3 von den zwei apikalen Windungen vorsichtig entfernt, um einerseits eine möglichst gleichmäßige Fixierung und Färbung des Gewebes zu ermöglichen, aber andererseits noch ein Minimum an Stabilität für die folgenden Manipulationen zu gewährleisten. 55 4.2.10.3 Phalloidinfärbung Die folgenden Inkubationsschritte wurden bei Raumtemperatur auf dem Schwingtisch unter Lichtabschluss durchgeführt, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösungen in den Innenohrkompartimenten sicherzustellen und ein Ausbleichen der fluoreszenzmarkierten Nanopartikel zu verhindern. Die frisch präparierten Cochleae wurden zunächst für 30 Minuten in 4%-igem PFA fixiert, bevor das Gewebe durch eine 10-minütige Verweildauer in 0,1%-igem Triton X-100 permeabilisiert wurde. Erst nach dreimaligem Spülen in PBS erfolgte schließlich die Aktinfilament-Färbung mittels Rhodamin Phalloidin, das 1:200 mit PBS verdünnt für eine Stunde auf die Cochleae einwirkte. Nach erneuter PBS-Spülung wurden die Objekte schließlich bis zur endgültigen Dissektion in 4%-igem PFA im Kühlschrank lichtgeschützt gelagert. 4.2.10.4 Präparation der Stria vascularis und Basilarmembran Die abschließende Dissektion der Cochleae wurde unter dem Auflichtmikroskop mit feinsten Präzisionspinzetten durchgeführt (Abb. 19). Die knöcherne Wand der Hörschnecke wurde bereits vor der Färbung von den apikalen Windungen entfernt, so dass hier sofort die Stria vascularis mit dem dazugehörigen Spiralligament vorsichtig abgezogen und auf einen Objektträger überführt werden konnte. Bei den basalen Windungen musste dies noch geschehen, was aufgrund der zunehmenden Festigkeit der Cochleawand durchaus zu Brüchen an der Hörschnecke führen konnte. Anschließend wurde die knöcherne Verbindung zwischen der Basilarmembran mit aufsitzendem Corti-Organ und dem Modiolus getrennt und für die weitere Bearbeitung und Auswertung die separierten Membranen in Teilstücke vereinzelt, die ungefähr eine halbe Windung beinhalteten. Von diesen separierten Teilstücken wurden überschüssiger Knochen, sowie Reißner- und Tektorialmembran entfernt, bevor auch diese in entsprechender Reihenfolge von apikal nach basal auf Objektträger überführt und für die Kernfärbung und gegen Ausbleichen mit ProLong® Gold antifade reagent mit DAPI eingedeckelt wurden. Nach einer 24-stündigen Trocknungsdauer wurden die Deckgläschen mit Nagellack auf den Objektträgern fixiert und bis zur Auswertung dunkel gelagert. 56 B A Stria vascularis Steigbügel Rundes Fenster D C Basilarmembran Modiolus Abb. 19: Die Bildserie veranschaulicht die Präparation der Basilarmembran für Konfokalmikroskopie und Zytocochleogramm. A: Die Bullawand wurde großflächig entfernt und die knöcherne Cochlea freigelegt. B: Die knöcherne Cochleawand wurde vorsichtig entfernt. C: Das Spiralligament mit der Stria vascularis wurde abgezogen, so dass die Basilarmembran frei zugänglich ist. D: Die Basilarmembran wurde windungsweise vom Modiolus abpräpariert (hier apikale Windung sichtbar). 57 4.2.11 Untersuchung der Nanopartikelaufnahme mittels Konfokaler Mikroskopie Die konfokalmikroskopische Auswertung von Stria vascularis und Basilarmembran geschah analog zur Auswertung der Zellkulturen: Die getrockneten und fixierten Objektträger wurden mit dem TCS SP2 der Firma Leica und der entsprechenden Leica Confocal Software untersucht, wobei zunächst der gewünschte Bildausschnitt lichtmikroskopisch mit dem 40er Ölimmersionsobjektiv eingestellt wurde. Da die Färbung des Gewebes ebenfalls mit der Zellkultur übereinstimmt, konnten für die sequenzielle Anregung dieselben Filter verwendet werden (Tabelle 3): Tab. 3: Übersicht über die zur Anwendung gekommenen Fluoreszenzfarbstoffe, die markierten Komponenten und die notwendigen Wellenlängen der eingesetzten Laser. Fluoreszenzfarbstoff Markiertes Kompartment Exzitation Emission Farbe im CLSM DAPI Zellkern 405 nm 430 – 470 nm blau FITC Nanopartikel 488 nm 500 – 540 nm grün TRITC Aktinfilamente - Haarzellen 543 nm 570 – 610 nm rot Im Echtzeit-Aufnahmemodus wurde zunächst nur TRITC angeregt, um anhand der Haarzellen die richtige Fokusebene zu finden. Erst dann wurden die anderen Laser dazugeschaltet und die Bildqualität über Laserleistung, Nachverstärkung oder verbesserte Tiefendiskriminierung wie bereits beschrieben optimiert. Auch die Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln und die 8-fache Mittelung der Werte für jeden Kanal mit anschließender Überlagerung wurden für die Bildaufnahme übernommen, um so vergleichbare Aufnahmen zu gewährleisten. 4.2.12 Erstellung eines Zytocochleogramms Auf die qualitative Untersuchung der Basilarmembran folgte eine quantitative Analyse der Haarzellen, um die funktionellen Ergebnisse der elektrophysiologischen Messungen durch histologische Untersuchungen unterstützen zu können. Die Auswertung erfolgte unter Verwendung des inversen Fluoreszenzmikroskops Olympus IX 81, welches mit einem motorisierten Objekttisch ausgestattet und direkt mit dem rechnergestützten Bildbearbeitungsprogramm analysis® verbunden war. Die einzelnen 58 Basilarmembranteilstücke wurden von apikal nach basal mit dem TRITC-Filter und 10er Objektiv aufgenommen, wobei der softwaregesteuerte motorisierte Objekttisch die unterbrechungsfreie Aneinanderreihung der Einzelbilder zu einer einzigen Panoramaaufnahme pro halber Windung ermöglichte. Anhand dieser digitalen Aufnahmen erfolgte schließlich die Erstellung des Zytocochleogramms, indem für jede Haarzellreihe fehlende Haarzellen in Abhängigkeit von der Distanz zum Apex registriert wurden (Abb. 20). Die Erfassung der Abwesenheit der Haarzellen begann jedoch erst 1 bis 2 mm vom Apex entfernt, wo sich die typisch regelmäßige Organisation der sensorischen Zellen zeigte (W. LINSS et al. 2000). Da die durchschnittliche Länge einer Meerschweinchencochlea 16,4 ± 1,4 mm beträgt, wobei die durchschnittliche Haarzelldichte 0,389 äußere Haarzellen / µm und 0,101 innere Haarzellen / µm bemisst (V. LINSS et al. 2007), konnte basierend auf diesen Daten der prozentuale Anteil fehlender Haarzellen in Abhängigkeit zur Distanz vom Apex bestimmt und graphisch dargestellt werden. Um Speziesunterschiede herausstellen zu können, könnte die Distanz zum Apex ebenfalls in Prozent angegeben werden (YANG et al. 2004) oder der Ort auf der Basilarmembran aufgrund der Tonotopie mit einer spezifischen Frequenz gleichgesetzt werden (VIBERG u. CANLON 2004). Da in dieser Studie aber nur Meerschweinchen untersucht und durch die AABR-Messungen bereits frequenzspezifische Analysen durchgeführt wurden, wurde die gewählte Darstellungsmethode in der Form „Prozent fehlender Haarzellen in Abhängigkeit von der Distanz zum Apex in mm“ als am besten nachvollziehbar beurteilt. 59 A 2543 µm B Abb. 20: Mit Hilfe des softwaregesteuerten motorisierten Objekttisches des Fluoreszenzmikroskops lassen sich die einzeln aufgenommenen Bilder zu einer Panoramaübersicht jeder präparierten halben Windung zusammenfassen. Anhand dieser Übersichtsaufnahme (A) kann die Länge der Basilarmembran ausgemessen werden (rote Linie). In der Vergrößerungsansicht der einzelnen Abschnitte (B als Ausschnitt aus A, blaues Rechteck) können die fehlenden Haarzellen gezählt und im Verhältnis zum Abstand zum Apex registriert werden. In diesem Fall ist die mittlere Windung einer Cochlea 28 Tage nach Injektion Hyperverzweigter Polylysine dargestellt, die keinerlei Haarzellverlust aufweist. 60 5 Ergebnisse 5.1 Ergebnisse der In-vitro-Versuche Hyperverzweigte Polylysine (HP) und Lipidnanokapseln (LNK) wurden vor der In-vivoApplikation zunächst in einer Fibroblastenkultur auf ihre Fähigkeit zur Penetration der Zellmembranen, ihre Verfolgbarkeit mittels Konfokaler Laserrastermikroskopie und ihre grundlegende Biokompatibilität getestet. 5.1.1 Konfokalmikroskopische Auswertung der Nanopartikelaufnahme Nach 24-stündiger Inkubation der L929-Zellen mit den verschiedenen Nanopartikeltypen und anschließender Färbung mit DAPI und Rhodamin Phalloidin wurden die zu untersuchenden Proben unter dem Konfokalmikroskop sequenziell angeregt und die einzelnen Kanäle anschließend übereinandergelagert und ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass sowohl Hyperverzweigte Polylysine als auch Lipidnanokapseln die Zellmembranen der L929-Mausfibroblasten penetriert hatten und sich im Zytoplasma der Zellen befanden (Abb. 21). Es konnte eine gleichmäßige Verteilung der Partikel über alle Zellen der Kultur nachgewiesen werden, unabhängig davon, in welcher Phase des Zellzyklus sie sich gerade befanden. Beide Nanopartikeltypen schienen sich zu Clustern zusammengelagert zu haben und waren vor allem in Kernnähe zu finden, ohne aber in diesen einzudringen. Dies wurde durch Aufnahmen nach Verschiebung der z-Achse apparent, die verdeutlichte, dass einzelne grüne Fluoreszenzen, die sich im Feld der Kerne befanden, in der Ebene über oder unter den Nuclei einzusortieren waren, nicht aber in deren Inneren. Wesentlich ist auch, dass die Zellen keine morphologischen Hinweise auf Apoptose oder Nekrose aufwiesen. Weder die Zellgröße und -form war verändert, keine Granulation des Zytoplasmas erkennbar, und die Kerne zeigten sich stoffwechselaktiv ohne Hinweise auf Pyknose oder Karyorhexis, wobei die Inkubation allerdings mit 1:100 verdünnter Nanopartikellösung durchgeführt wurde. 61 10 µm 10 µm Abb. 21: Bei den abgebildeten Aufnahmen handelt es sich um die bereits übereinander gelagerten Bilder mit Nanopartikeln inkubierter L929-Fibroblasten, die mit dem Konfokalmikroskop in 3 Kanälen aufgezeichnet wurden: Blau sind die mit DAPI gefärbten Zellkerne erkennbar, die mit 405 nm angeregt wurden, während das Emissionsspektrum bei 430 bis 470 nm liegt. Rot stellen sich die mit Rhodamin Phalloidin gefärbten Aktinfilamente dar, deren Exzitation mit 543 nm vorgenommen wurde bei einer Emission von 570 bis 610 nm. Im Zytoplasma der Zellen grün dargestellt sind die mit FITC markierten Nanopartikel sichtbar, die mit 488 nm angeregt wurden und dann zwischen 500 und 540 nm emittieren. In der linken Abbildung handelt es sich um Hyperverzweigte Polylysine, wohingegen die rechte Lipidnanokapseln illustriert, die allerdings beide von der Verteilung gleich im Zytoplasma um den Kern herum liegen, ohne diesen zu internalisieren. 62 5.1.2 Quantitative Bestimmung der Nanopartikelaufnahme Nachdem die Fibroblastenkultur unterschiedlicher Konzentrationen 24 Stunden inkubiert mit wurde, nanopartikelhaltigem konnte nach Medium Entfernen des Inkubationsmediums und gründlicher Spülung mit PBS die verbleibende Fluoreszenz in den Zellen mit Hilfe des Fluorometers gemessen werden. Mit Hilfe der Kalibrationskurve, die auf Grundlage einer Verdünnungsreihe der Ursprungsnanopartikellösungen erstellt wurde, war es möglich, die quantitativ ermittelten Emissionen in Nanopartikelmenge umzurechnen. Es konnten sowohl die absoluten Werte der aufgenommenen Vektoren benannt werden als auch der prozentuale Anteil bezüglich der Nanopartikelkonzentration im Inkubationsmedium. Aufnahme Hyperverzweigter Polylysine in L929 HP in den Zellen HP im Medium 20% 15% 10% 5% 0% HP 1:10 HP 1:30 HP 1:100 HP 1:300 HP 1:1000 HP-Verdünnung im Medium Abb. 22: In diesem Diagramm wird der Anteil der Hyperverzweigten Polylysine dargestellt, der von dem Inkubationsmedium in die L929-Zellen gelangte. Zur deutlicheren Darstellung wurde hier das Maximum der y-Achse auf 20% gesetzt, da der Anteil der internalisierten Hyperverzweigten Polylysine zwischen 6,6% und 11,9% schwankte, ohne aber statistisch signifikante Unterschiede aufzuweisen. Für Hyperverzweigte Polylysine ergaben sich so folgende Absolutwerte: Bei einer Verdünnung von 1:10, was einer Nanopartikelmenge von 4,1 x 10-10 mol Hyperverzweigte 63 Polylysine pro Well entspricht, waren nach 24 Stunden noch 2,7 x 10-11 mol Hyperverzweigte Polylysine in den Zellen nachweisbar. Um diese Werte besser miteinander vergleichen zu können, wurden sie jeweils zueinander ins Verhältnis gesetzt, so dass pro Verdünnungsstufe schließlich folgender prozentuale Anteil Hyperverzweigter Polylysine die L929 infiltriert hatte: 6,6% bei einer Verdünnung von 1:10, 11,4% bei der 1:30-Verdünnung und die folgenden Verdünnungsstufen resultierten der Reihe nach in 11,9%, 10,3% und 9,9% aufgenommenen Hyperverzweigten Polylysinen (Abb. 22). Nach statistischer Evaluierung dieser Werte, lässt sich für die verschiedenen Verdünnungsstufen kein signifikanter Unterschied in der Aufnahme Hyperverzweigter Polylysine registrieren. Das heißt zusammenfassend für die Hyperverzweigten Polylysine, dass unabhängig von der Grundkonzentration im Inkubationsmedium derselbe prozentuale Anteil in die Zellen gelangt. Aufnahme der Lipidnanokapseln in L929 LNK in den Zellen LNK im Medium 20% 15% 10% 5% 0% LNK 1:10 LNK 1:30 LNK 1:100 LNK 1:300 LNK 1:1000 LNK-Verdünnung im Medium Abb. 23: Der prozentuale Anteil der Lipidnanokapseln, der vom Inkubationsmedium in die L929-Zellen penetriert, wird in diesem Diagramm dargestellt. Die Aufnahme der Lipidnanokapseln in die Zellen liegt zwischen 1,4% und 2,8%, so dass eine Begrenzung der y-Achse auf ein Maximum von 20% gewählt wurde. Von einer Verdünnungsstufe zur nächsten sind keine signifikanten Unterschiede vorhanden, aber die Aufnahme bei einer Verdünnung von 1:1000 ist signifikant größer als bei einer Verdünnung von 1:10 (* = p < 0,001). 64 Im Falle der Lipidnanokapseln sieht der Verlauf der Werte zunächst ähnlich aus wie bei den Hyperverzweigten Polylysinen. Bei der ersten Verdünnungsstufe von 1:10 werden von den 9,5 x 1012 Lipidnanokapseln, die sich im Well befinden, nur 1,3 x 1011 Lipidnanokapseln internalisiert. Setzt man diese Werte nun wieder in Relation zur Ausgangskonzentration im Inkubationsmedium, so lassen sich die prozentualen Anteile der Lipidnanokapseln berechnen, die nach 24 Stunden aus dem Medium die Zellen infiltriert haben. Die geringste Verdünnungsstufe 1:10 führt zu einer Zellaufnahme von 1,4% der Lipidnanokapseln aus dem Medium. Die darauffolgenden Werte steigern sich allmählich von 1,5% bei 1:30, 1,8% bei 1:100, 2,0% bei 1:300 und 2,8% bei 1:1000 (Abb. 23). Damit ist der Anteil der Lipidnanokapseln in den L929-Zellen zwar geringer als der der Hyperverzweigten Polylysine, allerdings lässt sich ein Trend beobachten, wonach mit zunehmender Verdünnung die relative Aufnahme der Lipidnanokapseln ansteigt. Zwischen den einzelnen benachbarten Verdünnungsstufen lassen sich dabei keine signifikanten Unterschiede nachweisen. Daraufhin wurden alle Verdünnungsstufen untereinander mittels t-Test verglichen, wobei ein signifikanter Anstieg der Nanopartikelaufnahme bei der 1:1000 Verdünnung im Verhältnis zur 1:10 Verdünnung festgestellt werden konnte (p < 0,001). Mit einem signifikanten Anstieg der internalisierten Nanopartikel von 1,4% bei 1:10 auf 2,8% bei 1:1000 ist dieser Trend nachvollziehbar und lässt auf einen Sättigungseffekt schließen. 65 5.1.3 Ergebnisse der Vitalitätstests mit Neutralrot Zur Quantifizierung der zytotoxischen Effekte, die nanopartikelhaltiges Medium auf eine Fibroblastenkultur ausüben könnte, wurden nach 24-stündiger Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen von Hyperverzweigten Polylysinen und Lipidnanokapseln Vitalitätstests mit Neutralrot durchgeführt. Die ermittelten Werte wurden mit denen einer Kontrollgruppe, welche ohne Nanopartikelzusatz inkubiert wurde, ins Verhältnis gesetzt. Die Vitalitätsfärbungen mit Neutralrot zeigten für beide Nanopartikeltypen, Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln gleichermaßen, bei hohen Konzentrationen einen zytotoxischen Effekt auf die Fibroblastenkultur, während niedrigere Konzentrationen im Inkubationsmedium keinen negativen Einfluss auf die Viabilität zu haben schienen. Zellvitalität nach Inkubation mit HP 120 Vitalität % 100 80 60 40 20 0 Kontrolle HP 1:10 HP 1:30 HP 1:100 HP 1:300 HP 1:1000 Nanopartikelverdünnung im Medium Abb. 24: Dieses Diagramm veranschaulicht den Einfluss der Konzentration von Hyperverzweigten Polylysinen (HP) im Inkubationsmedium auf die Vitalität der Fibroblasten im Verhältnis zur Kontrollgruppe ohne Nanopartikelzugabe. Dabei ist ersichtlich, dass hohe Konzentrationen (Verdünnung 1:10, 1:30 und 1:100) zu einer signifikanten Reduktion der Zellvitalität führen (* = p < 0,001), während Verdünnungen von 1:300 und 1:1000 keine zytotoxischen Auswirkungen auf die Kultur haben. 66 Wurden die L929-Zellen mit 4,1 x 10-10 mol Hyperverzweigter Polylysine, was einer Verdünnung von 1:10 entsprach, 24 Stunden inkubiert, so war eine signifikante Reduktion der Vitalität auf 33% (p < 0,001) bezüglich der Kontrollgruppe feststellbar. Die Verdünnung der Ursprungssubstanz auf 1:30 führte zu 53% vitalen Zellen, eine Verdünnung von 1:100 zu 72% vitalen Fibroblasten, was immer noch eine signifikante Reduktion der Zellvitalität darstellt (p < 0,001). Erst die folgenden Verdünnungsstufen 1:300 und 1:1000 zeigten mit 102% und 104% Vitalität keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die nanopartikelfreie Kontrollgruppe (Abb. 24). Zellvitalität nach Inkubation mit LNK 120 Vitalität % 100 80 60 40 20 0 Kontrolle LNK 1:10 LNK 1:30 LNK 1:100 LNK 1:300 LNK 1:1000 Nanopartikelverdünnung im Medium Abb. 25: Dieser Graph veranschaulicht, dass ähnlich wie Hyperverzweigte Polylysine auch die Lipidnanokapseln (LNK) in hohen Konzentrationen einen zytotoxischen Effekt auf die L929-Kultur haben. Bei einer Verdünnung von 1:10, 1:30 (* = p < 0,001) und 1:100 (** = p < 0,01) ist die Zellvitalität signifikant erniedrigt, bei der Verdünnungsstufe 1:300 und 1:1000 gleich der Kontrollgruppe ohne signifikanten Unterschied. 67 Bei der Inkubation mit Lipidnanokapseln fielen die Ergebnisse ähnlich aus: Eine Verdünnung der Lipidnanokapsel-Lösung um 1:10, was einer Menge von 9,51 x 1012 Lipidnanokapseln pro Well entsprach, führte zu einer signifikanten Reduktion der Vitalität der Zellen auf 39% (p < 0,001). Eine 1:30 Verdünnung verursachte mit 79% Restvitalität ebenfalls eine signifikante Reduktion (p < 0,001), ebenso wie die 1:100 Verdünnungsstufe, die mit 89% zwar bereits überwiegend vitale Zellen enthielt, was aber immer noch signifikant verringert im Verhältnis zur Kontrollgruppe (p < 0,01) war. Eine weitere Verdünnung der Hyperverzweigten Polylysine auf 1:300 und anschließend 1:1000 war dann nicht mehr mit Vitalitätseinbußen der Fibroblasten verbunden. Mit 100% und 109% Vitalität ist kein signifikanter Unterschied zur vektorfreien Kultur nachweisbar (Abb. 25). Zusätzlich zu diesen quantitativen Bestimmungen zur Zytotoxizität waren bei den hohen Nanopartikelkonzentrationen lichtmikroskopisch ebenfalls morphologische Veränderungen sichtbar. So erschien ein Teil der Fibroblasten in der Kultur kleiner, abgerundet ohne Zellausläufer und mit zum Teil granuliertem Zytoplasma, was auf den toxischen Effekt der Nanopartikel zurückzuführen ist und erste Anzeichen des Zelluntergangs darstellt. Die Kerne schienen jedoch noch unverändert intakt und auch die Zellzahl war im Gegensatz zur Kontrollgruppe nicht merklich verringert. Als wesentliche Schlussfolgerung aus diesen Ergebnissen musste die Nanopartikelkonzentration, die den Meerschweinchen intracochleär verabreicht werden sollte, soweit reduziert werden, dass keine zytotoxischen Erscheinungen zu erwarten waren, aber andererseits noch eine gute Visualisierung der Vektoren mittels Konfokalmikroskopie möglich war. Aus diesem Grund erhielten die Tiere 5 µl in PBS verdünnter Nanopartikellösung, die in die Scala tympani injiziert wurde, mit folgenden Nanopartikelmengen: 3,4 x 10-12 mol Hyperverzweigte Polylysine bzw. 4,7 x 1010 Lipidnanokapseln. 68 5.2 Ergebnisse der In-vivo-Versuche Durch die In-vitro-Studie konnte demonstriert werden, dass Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln in Zellen eindringen und über die Konfokalmikroskopie dort lokalisiert werden können. Durch den Neutralrottest wurde gezeigt, welche Konzentrationen biokompatibel sind, so dass die etablierten Methoden nun in der In-vivo-Studie Anwendung fanden. Insgesamt 36 Meerschweinchen wurden zur Hälfte mit Hyperverzweigten Polylysinen und Lipidnanokapseln behandelt, wobei jeweils in das linke Ohr die Nanopartikellösung und in das rechte Ohr zur Kontrolle PBS injiziert wurde. Über Konfokalmikroskopie wurde die Verteilung im Innenohr und in den unterschiedlichen Zelltypen untersucht, AABRMessungen gaben Aufschluss über funktionelle Effekte in Form von Hörverlust und Zytocochleogramme dokumentierten möglichen Haarzellverlust. 5.2.1 Allgemeines Keines der 36 Tiere ist während des Experimentes verstorben oder musste frühzeitig vor der Abschlussmessung aus der Studie ausscheiden. Alle Meerschweinchen befanden sich über die gruppenspezifische Versuchszeit bei gutem Allgemeinbefinden, zeigten gutes Futteraufnahmeverhalten mit entsprechenden Tageszunahmen und artspezifisches Komfortverhalten. Dennoch zeigte sich bei der Gewebepräparation im Anschluss, dass bei sechs Tieren beidseits Mittelohrentzündungen aufgetreten waren, die zu entsprechender Gewebezerstörung und veränderten Messdaten geführt haben, so dass eine AABR-Auswertung und Haarzellzählung, sowie konfokalmikroskopische Auswertung bei diesen Tieren nicht mehr möglich war. Da die Veränderungen bei allen diesen Tieren beidseits zu finden waren, kann nicht davon ausgegangen werden, dass es sich dabei um toxische Reaktionen auf die Nanopartikel handelt, zumal die Injektion direkt in die Scala tympani und nicht in die Mittelohrhöhle erfolgte. Diese sechs Tiere waren je einer der sechs Gruppen zuzuordnen. Es waren also Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln gleichermaßen betroffen, wie auch alle Zeitgruppen. Aufgrund dieser gleichmäßigen Verteilung der Infektionen wurde die Entscheidung getroffen, die entsprechenden Daten der Tiere nicht zu verwenden, um eine Verfälschung der Messwerte zu vermeiden. Abschließend wurden also fünf Tiere pro Gruppe (HP-2, -14, -28; LNK-2, -14, -28) in die Datenauswertung miteinbezogen, was zu einer Gesamttierzahl von 30 führte. 69 5.2.2 Konfokalmikroskopische Auswertung der Nanopartikelaufnahme Da die Hyperverzweigten Polylysine und Lipidnanokapseln an der Oberfläche kovalent mit dem Fluorophor FITC markiert waren, wurde wie bereits in der In-vitro-Studie standardisiert, die Konfokalmikroskopie genutzt, um die Verteilung der Partikel in der Cochlea und ihre Aufnahme in die unterschiedlichen Gewebe zu untersuchen. Nach der Tötung und Perfusion der Tiere erfolgte eine DAPI- und Phalloidinfärbung zur Visualisierung der Zellkerne und Aktinfilamente, die insbesondere in den Haarzellen typische Muster bilden. Daraufhin wurden die einzelnen Striae vasculares und Basilarmembranen der Tiere windungsweise präpariert, unter dem Konfokalmikroskop untersucht und durch Überlagerung der sequenziell aufgenommenen Fluoreszenzkanäle die Lokalisation der Vehikel im Gewebe bestimmt. Die Hyperverzweigten Polylysine einerseits und auch die Lipidnanokapseln andererseits waren im Innenohrgewebe visualisierbar, wobei die Fluoreszenz in der gesamten Cochlea von basal bis apikal nachzuweisen war (Abb. 26). Dabei hatten die Vektoren sensorische Haarzellen und Unterstützungszellen der Basilarmembranen gleichermaßen penetriert und waren auch in allen Zelltypen der Stria vascularis lokalisierbar. Die Verteilung von Hyperverzweigten Polylysinen und Lipidnanokapseln in der Cochlea war identisch und es konnten auch keine zeitlich bedingten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Auch wenn es technisch nicht möglich war, die Fluoreszenzen zu quantifizieren, so konnte man doch auf Grundlage der wiederholten qualitativen Bildaufnahmen zumindest semiquantitativ festhalten, dass die Nanopartikelaufnahme in die inneren Haarzellen am höchsten zu sein schien und von dort zentrifugal die Internalisierung in die äußeren Haarzellreihen abnahm. Unabhängig vom Zelltyp konnten sowohl Hyperverzweigte Polylysine als auch Lipidnanokapseln äquivalent zu den Ergebnissen in der Zellkulturstudie nur im Zytoplasma in Kernnähe, nicht aber innerhalb des Nucleus nachgewiesen werden. Auch in vivo zeigten sie eine Akkumulation zu Clustern, ohne dabei einen negativen Einfluss auf den Zellstoffwechsel auszuüben. Die Anordnung der einzelnen Zellen im Gewebeverband schien unverändert, weder Zellverlust, noch veränderte Morphologie der Zellen oder ihrer Kerne war konfokalmikroskopisch zu beobachten, was durch die anschließende Haarzellzählung quantifiziert werden konnte. Damit bestätigten die histologischen Ergebnisse die durch die AABR-Messung bereits ermittelten elektrophysiologischen Resultate (siehe 5.2.3). 70 Abb. 26: Die konfokalmikroskopische Auswertung der Gewebe zeigt, dass sowohl in der Stria vascularis (A, B) als auch in der Basilarmembran (C, D) Nanopartikel zu finden sind. Diese stellen sich durch die FITC-Markierung grün dar, während die Nuclei blau mit DAPI gefärbt sind und die Haarzellen rot mit Rhodamin-Phalloidin. Zwischen der Verteilung der Hyperverzweigten Polylysine (A, C) und der Lipidnanokapseln (B, D) im Innenohr besteht kein Unterschied: beide Vehikel penetrieren alle cochleären Zelltypen von basal bis apikal, lagern sich im Zytoplasma zu Clustern zusammen und internalisieren nicht den Nucleus. Zwischen den einzelnen Zeitgruppen waren ebenfalls keine Differenzen erkennbar. 71 5.2.3 Auswertung der AABR-Messungen Elektrophysiologische Messungen wurden durchgeführt, um funktionell toxische Effekte der Nanopartikel auf die Hörschwellen der Tiere analysieren zu können. Um sicher zu gehen, dass die ausgewählten Meerschweinchen vor der Manipulation normalhörend waren und um eine Datengrundlage für die Quantifizierung der Veränderungen im Hörspektrum der Tiere zu erhalten, wurde vor der Manipulation der Innenohren eine frequenzspezifische AABRMessung durchgeführt. Anschließend wurden die 60 Ergebnisse beider Ohren aller 30 Meerschweinchen gemittelt, woraus folgende Hörschwellen resultierten (Tabelle 4): Tab. 4: Übersicht über die Mittelwerte der frequenzspezifischen Hörschwellen beider Ohren aller Tiere an Tag 0 vor jeder Manipulation (Gruppen HP-2, -14, -28, LNK-2, -14, -28). Tag 0 1 kHz 4 kHz alle Ohren (dB SPL) 59 51 8 kHz 16 kHz 32 kHz 40 kHz 34 35 42 54 Die Werte vom linken und rechten Ohr divergierten dabei um durchschnittlich 3,7 dB SPL. Zwei Tage nach der Applikation der Hyperverzweigten Polylysine in die Scala tympani wurden bei allen Tieren, unabhängig davon, ob sie anschließend getötet wurden oder nicht (Gruppen HP-2, -14, -28), erneut elektrophysiologische Messungen durchgeführt, die zu folgenden frequenzspezifischen Mittelwerten führten (Tabelle 5): Tab. 5: Darstellung der frequenzspezifischen Hörschwellen der Tiere an Tag 2 nach der Injektion mit Hyperverzweigten Polylysinen in das linke Ohr und PBS-Injektion in das rechte Ohr. Tag 2 1 kHz 4 kHz 8 kHz 16 kHz 32 kHz 40 kHz linkes Ohr (dB SPL) 61 56 42 53 67 75 rechtes Ohr (dB SPL) 67 56 36 36 51 71 Aus diesen Werten lässt sich ein durchschnittlicher frequenzübergreifender Anstieg der Hörschwelle um 13,7 dB SPL für die linken Ohren und 7,2 dB SPL für die rechten Ohren in Relation zum Tag 0 ermitteln. Dabei ist festzuhalten, dass die Hörschwellen in den hohen Frequenzen deutlich stärker ansteigen (maximaler Anstieg um 25 dB SPL bei 32 kHz am 72 linken Ohr) als in den niederen Frequenzen (minimaler Anstieg um 2 dB SPL bei 1 kHz am linken Ohr). Der Wilcoxon-Rangsummentest ergab bei den linken Ohren einen signifikanten Anstieg der Hörschwelle gegenüber Tag 0 bei 8, 16, 32 und 40 kHz (p < 0,05), nicht aber bei 1 und 4 kHz. Bei den rechten Kontrollohren war ebenfalls ein signifikanter Hörschwellenanstieg bei 32 und 40 kHz festzustellen (p < 0,05). Ein frequenzspezifischer Vergleich der naopartikelbehandelten linken Seite mit der rechten Kontrollseite ergab allerdings keinen signifikanten Unterschied (Abb. 27). Bei allen Frequenzen war der Hörschwellenanstieg links und rechts vergleichbar. AABR-Messung am Tag 2 - HP und PBS vergleichend Hörschwelle (dB SPL) 100 75 Tag 0 50 Tag 2 linkes Ohr Tag 2 rechtes Ohr 25 0 1 4 8 16 32 40 Frequenz (kHz) Abb. 27: Dieser Graph setzt die Hörschwellen der Tiere 2 Tage nach der Injektion der Hyperverzweigten Polylysine ins linke Innenohr und PBS in das rechte Innenohr mit dem Zustand vor der Cochleostomie am Tag 0 ins Verhältnis. Der Anstieg der Hörschwellen ist in den höheren Frequenzen deutlicher ausgeprägt als in den tiefen Frequenzen und auch signifikant (p < 0,05), was allerdings sowohl die linke HP- als auch die rechte Kontrollseite betrifft. Der Unterschied zwischen dem linken und rechten Ohr ist nicht signifikant. 73 14 bzw. 28 Tage nach der Applikation von Hyperverzweigten Polylysinen wurden die Tiere der entsprechenden Gruppe vor der Tötung erneut einer audiologischen Messung unterzogen, wobei folgende frequenzspezifische Hörschwellen ermittelt wurden (Tabelle 6, Abb. 28/29): Tab. 6: Übersicht über die Hörschwellen der je 5 Tiere der Gruppen HP-14 und HP-28 Tag 14 1 kHz 4 kHz 8 kHz 16 kHz 32 kHz 40 kHz linkes Ohr (dB SPL) 62 64 40 58 64 70 rechtes Ohr (dB SPL) 68 66 44 46 50 72 Tag 28 1 kHz 4 kHz linkes Ohr (dB SPL) 58 58 40 54 56 66 rechtes Ohr (dB SPL) 66 60 42 42 50 68 8 kHz 16 kHz 32 kHz 40 kHz AABR-Messung am Tag 14 - HP und PBS vergleichend Hörschwelle (dB SPL) 100 75 Tag 0 50 Tag 14 linkes Ohr Tag 14 rechtes Ohr 25 0 1 4 8 16 32 40 Frequenz (kHz) Abb. 28: Dieser Graph setzt die Hörschwellen der Tiere 14 Tage nach der Injektion mit Hyperverzweigten Polylysinen in die linke Cochlea mit der PBS-Injektion in die rechte Cochlea und den Zustand vor der Cochleostomie am Tag 0 ins Verhältnis. Der Anstieg der Hörschwellen ist weder in Relation zum Tag 0 signifikant, noch im Verhältnis zur PBS-behandelten rechten Seite. 74 Die durchschnittliche Steigerung der Hörschwelle gegenüber Tag 0 lag nach 14 Tagen links bei 14,1 dB SPL und rechts bei 12,1 dB SPL bzw. nach 28 Tagen links bei 9,8 dB SPL und rechts bei 9,1 dB SPL. Auch hier waren frequenzspezifische Unterschiede feststellbar, so dass der maximale Anstieg mit 23 dB SPL bei 16 kHz links am Tag 14 zu finden war, während am Tag 28 bei 1 kHz am linken Ohr sogar eine geringfügige Senkung der Hörschwelle um 1 dB SPL ermittelt wurde. Im Gegensatz zu den Ergebnissen am Tag 2 konnten aber am Tag 14 und 28 weder auf dem linken Ohr noch auf dem rechten Ohr signifikante Veränderungen der Hörschwelle einzelner Frequenzen in Relation zum Tag 0 ermittelt werden. Auch der Vergleich der Nanopartikelseite mit der Kontrollseite ergab keinen signifikanten Unterschied der Hörschwellen. AABR-Messung am Tag 28 - HP und PBS vergleichend Hörschwelle (dB SPL) 100 75 Tag 0 50 Tag 28 linkes Ohr Tag 28 rechtes Ohr 25 0 1 4 8 16 32 40 Frequenz (kHz) Abb. 29: Dieser Graph setzt die Hörschwellen der Tiere 28 Tage nach der Injektion ins Innenohr mit dem Zustand vor der Cochleostomie am Tag 0 ins Verhältnis. Der Anstieg der Hörschwellen auf der HP-behandelten Seite ist weder in Relation zum Tag 0 signifikant, noch im Verhältnis zur PBS-behandelten Seite. 75 Die Injektion von Lipidnanokapseln über eine Cochleostomie in die Innenohren der Tiere hatte ebenfalls Änderungen der frequenzspezifischen Hörschwellen zur Folge. Nach 2 Tagen wurden die Tiere aller Gruppen (LNK-2, -14, -28) noch einmal elektrophysiologisch getestet, was folgende Hörschwellen hervorbrachte (Tabelle 7, Abb. 30): Tab. 7: Darstellung der frequenzspezifischen Hörschwellen der Tiere an Tag 2 nach der Injektion mit Lipidnanokapseln in das linke Ohr und PBS-Injektion in das rechte Ohr. Tag 2 1 kHz 4 kHz 8 kHz 16 kHz 32 kHz 40 kHz linkes Ohr (dB SPL) 62 54 41 49 61 73 rechtes Ohr (dB SPL) 66 58 40 47 58 71 AABR-Messung am Tag 2 - LNK und PBS vergleichend Hörschwelle (dB SPL) 100 75 Tag 0 50 Tag 2 linkes Ohr Tag 2 rechtes Ohr 25 0 1 4 8 16 32 40 Frequenz (kHz) Abb. 30: Das Diagramm veranschaulicht die Entwicklung der frequenzspezifischen Hörschwellen der Meerschweinchen 2 Tage nach der Injektion im Vergleich zu Tag 0 vor der Manipulation. Dabei ist ersichtlich, dass die Hörschwellen im linken und rechten Ohr gleichermaßen ansteigen und in den hohen Frequenzen auch zu signifikanten Differenzen im Verhältnis zu Tag 0 führen (bei 16, 32 und 40 kHz, p < 0,05). Die Unterschiede zwischen der LNK-behandelten linken Cochlea und der PBSbehandelten rechten Cochlea sind aber nicht signifikant. 76 Diese Werte entsprechen einer gemittelten Steigung der Hörschwelle von 11,3 dB SPL links und 11,0 dB SPL rechts, wobei auch bei diesem Nanopartikeltyp bei den hohen Frequenzen eine stärkere Erhöhung (maximaler Anstieg um 19 dB SPL bei 40 kHz am linken Ohr) als bei den niederen Frequenzen festzustellen ist (minimaler Anstieg um 3 dB SPL bei 1 kHz am linken Ohr). Ein Vergleich über den Wilcoxon-Test ergab dabei signifikante Erhöhungen der Hörschwellen gegenüber Tag 0 bei 16, 32 und 40 kHz sowohl für die linken mit Lipidnanokapseln behandelten Ohren als auch für die rechten PBS-behandelten Kontrollohren (p < 0,05). Bei 1, 4 und 8 kHz wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Wurden die unterschiedlich behandelten Ohren zueinander ins Verhältnis gesetzt, so konnte bei keiner der gemessenen Frequenzen ein signifikanter Unterschied ermittelt werden. Im Abstand von 14 bzw. 28 Tagen nach der Applikation von Lipidnanokapseln wurden die verbleibenden Tiere den entsprechenden Gruppen zugeordnet vor der Tötung und Gewebepräparation ebenfalls einer AABR-Messung unterzogen. Folgende frequenzspezifische Hörschwellen wurden dabei ermittelt (Tabelle 8, Abb. 31, 32): Tab. 8: Übersicht über die Hörschwellen der je 5 Tiere der Gruppen LNK-14 und LNK-28 Tag 14 1 kHz 4 kHz 8 kHz 16 kHz 32 kHz 40 kHz linkes Ohr (dB SPL) 66 64 60 62 70 78 rechtes Ohr (dB SPL) 72 70 60 62 76 84 Tag 28 1 kHz 4 kHz 8 kHz linkes Ohr (dB SPL) 58 54 34 40 46 52 rechtes Ohr (dB SPL) 60 52 30 30 40 58 16 kHz 32 kHz 40 kHz Nach 14 Tagen konnte demnach eine durchschnittliche Steigerung der Hörschwelle gegenüber Tag 0 um 21,1 dB SPL links und 25,1 dB SPL rechts verzeichnet werden, während nach 28 Tagen die Differenz links nur noch bei 1,8 dB SPL und rechts bei -0,6 dB SPL lag. Bei der frequenzspezifischen Analyse der Daten war ebenfalls ein stärkerer Anstieg bei den hohen Frequenzen zu verzeichnen (maximaler Anstieg um 32 dB SPL bei 32 kHz rechts am 77 Tag 14). Nach 28 Tagen hatten sich die Hörschwellen allerdings wieder so weit genähert, dass der Unterschied nicht mehr so deutlich hervortrat und so bei 16 kHz am rechten Ohr sogar eine Verminderung der Hörschwelle um 5 dB SPL ermittelt werden konnte. Die statistische Auswertung konnte aber zu keiner der veränderten frequenzabhängigen Hörschwellen am Tag 14 und 28 eine Signifikanz ermitteln, weder für die linken Ohren nach der Injektion der Lipidnanokapseln, noch für die rechten PBS-injizierten Ohren. Damit waren auch die Unterschiede zwischen den beiden unterschiedlich behandelten Seiten nicht signifikant. AABR-Messung am Tag 14 - LNK und PBS vergleichend Hörschwelle (dB SPL) 100 75 Tag 0 50 Tag 14 linkes Ohr Tag 14 rechtes Ohr 25 0 1 4 8 16 32 40 Frequenz (kHz) Abb. 31: Dieser Graph setzt die Hörschwellen der Tiere 14 Tage nach der LNK-Injektion in die linke Cochlea und PBS-Injektion in die rechte Cochlea mit dem Zustand vor der Cochleostomie am Tag 0 ins Verhältnis. Der Anstieg der Hörschwellen ist weder in Relation zum Tag 0 signifikant, noch im Verhältnis zur unbehandelten Seite. 78 AABR-Messung am Tag 28 - LNK und PBS vergleichend Hörschwelle (dB SPL) 100 75 Tag 0 50 Tag 28 linkes Ohr Tag 28 rechtes Ohr 25 0 1 4 8 16 32 40 Frequenz (kHz) Abb. 32: Die Hörschwellen der Tiere 28 Tage nach der LNK-Injektion in die linke Cochlea und PBSInjektion in die rechte Cochlea werden in diesem Graphen mit dem Zustand vor der Cochleostomie am Tag 0 ins Verhältnis. Der Anstieg der Hörschwellen ist weder in Relation zum Tag 0 signifikant, noch im Verhältnis zur unbehandelten Seite. 79 5.2.4 Nach Auswertung der Zytocochleogramme Phalloidinfärbung und anschließender windungsweiser Präparation der Basilarmembranen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop die Haarzellen ausgezählt und fehlende Zellen in Abhängigkeit zum Abstand vom Apex ortsspezifisch registriert. Die Aufstellung solch eines Zytocochleogramms ermöglichte genaue Aussagen über den Haarzellverlust, der durch die Nanopartikelapplikation hervorgerufen wurde. Mit Hilfe der Haarzellzählung wurde für die Cochleae, die mit Hyperverzweigten Polylysinen behandelt wurden, ein durchschnittlicher Verlust der sensorischen Zellen von 0,003% nach zwei Tagen festgestellt. Zwei Wochen nach der Vektorenapplikation waren noch 100% der Haarzellen vorhanden, während nach 28 Tagen ca. 0,1% der Haarzellen verloren gegangen waren. In Abhängigkeit zur Distanz zum Apex liegen die Verlustzahlen bei den Hyperverzweigten Polylysinen zwischen 0% (am Tag 28, 16 mm vom Apex entfernt) und 0,36% (am Tag 28, 4 mm vom Apex entfernt), was innerhalb der physiologischen Schwankungsbreite liegt (Abb. 33). Zytocochleogramm nach HP-Injektion Haarzellverlust % 10 8 Tag 2 6 Tag 14 4 Tag 28 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Basilarmembran vom Apex (0) bis Basis in mm Abb. 33: Diese Graphik veranschaulicht den ortsspezifischen Haarzellverlust nach Applikation von Hyperverzweigten Polylysinen (HP) in die linke Scala tympani nach 2, 14 und 28 Tagen. 80 Das Zytocochleogramm für die Lipidnanokapseln ergab ähnliche Resultate: nach 2 Tagen zeigte sich ein Verlust der inneren und äußeren Haarzellen von durchschnittlich 0,018%, nach 14 Tagen von 0,024% und nach 28 Tagen von 0,021% (Abb. 34). Der Haarzellverlust in den einzelnen Gruppen liegt damit innerhalb des physiologischen Bereichs normal hörender Tiere. Es wurde auch kein verstärkter Verlust in einem bestimmten Bereich der Basilarmembran festgestellt. Die Werte bewegten sich zwischen 0% (16 mm vom Apex entfernt am Tag 2) und maximal 0,09% (4 mm vom Apex entfernt am Tag 2), wobei zwischen den unterschiedlichen Zeitgruppen und Distanzen zum Apex keine Unterschiede ermittelt werden konnten. Zytocochleogramm nach LNK-Injektion Haarzellverlust % 10 8 Tag 2 6 Tag 14 4 Tag 28 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Basilarmembran vom Apex (0) bis Basis in mm Abb. 34: In diesem Diagramm wird der prozentuale Anteil der fehlenden Haarzellen nach Injektion von Lipidnanokapseln in die linke Cochlea in Abhängigkeit von der Entfernung zum Apex dargestellt. Die tonotopen Werte schwanken zwischen 0% und 0,09%, was zum physiologischen Bereich normal hörender Meerschweinchen gehört. Zur besseren Darstellung wurde die y-Achse auf 10% begrenzt. Zusammenfassend kann man feststellen, dass die Injektion der hier untersuchten Nanopartikel in die Scala tympani von Meerschweinchen morphologisch keinen Effekt auf die Haarzellen ausübt, unabhängig von der Art des Nanopartikels und der untersuchten Zeitspanne. 81 6 Diskussion Die hier vorgestellte Arbeit hatte zum Ziel, zwei potenzielle Kandidaten für ein nonvirales Drug-Delivery-System zur Anwendung im Innenohr auf seine grundlegenden Eigenschaften zu untersuchen. Bei diesen Vektoren handelt es sich um zwei Nanopartikel in Form von Hyperverzweigten Polylysinen (HP) und Lipidnanokapseln (LNK), die hier zunächst als nicht weiter modifizierte Grundstrukturen vorlagen. Diese beiden Partikeltypen wurden zunächst in vitro auf ihre Biokompatibilität und das Zellaufnahmeverhalten getestet, wobei dieser Ansatz auch dazu diente, die Visualisierung der fluoreszenzmarkierten Partikel mittels Konfokaler Lasermikroskopie für spätere In-vivo-Anwendungen zu standardisieren. In der folgenden In-vivo-Studie wurden verdünnte Nanopartikellösungen, die zuvor in der Zellkultur als nicht zytotoxisch eingestuft werden konnten, über eine Cochleostomie in die linke Scala tympani von Meerschweinchen appliziert. Die rechten Ohren der Tiere dienten der Kontrolle und wurden ebenfalls nach derselben Methode operiert und mit PBS behandelt. Elektrophysiologische Messungen vor und nach dem Eingriff erfassten den funktionellen Einfluss auf das Hörvermögen der Tiere, während Haarzellzählungen histologische Effekte der Nanopartikelapplikation ins Innenohr dokumentierten. Über die Konfokalmikroskopie wurde die Verteilung der Nanopartikel im Innenohr und in den verschiedenen cochleären Zelltypen evaluiert. Erst nach diesen grundlegenden Studien soll eine Modifikation der Nanopartikel erfolgen, was zu einem gezielten Wirkstofftransport und einer zeitlich kontrollierten Freisetzung eines geeigneten biogenen Wirkstoffes führen soll. 82 6.1 Auswahlkriterien der Nanopartikeltypen für diese Studie Makromoleküle, die aus L-Lysin als Grundgerüst bestehen, wurden bereits in der Vergangenheit als nonvirale Vektoren untersucht und getestet. Dabei wurden mit Hilfe dieser Aminosäure Dendrimere hergestellt, die als monodisperse Makromoleküle eine sehr regelmäßige, hoch verzweigte dreidimensionale Architektur aufwiesen und frei von strukturellen Defekten waren (BOSMAN et al. 1999). Der Einsatz von L-Lysin-Dendrimeren zum Gentransfer, als Wirkstofftransporter, Agenzien zur Bildgebung bei der Magnetresonanztomographie oder bei der Entwicklung multipler Antigen-Peptid-Systeme wurde bereits getestet und zeigt die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten dieser Substanzen. Nachteilig ist allerdings der Herstellungsprozess, der sehr mühsam, zeitaufwändig und in mehreren Schritten durchgeführt werden muss. Als attraktive Alternative könnten Hyperverzweigte Polylysine (HP) einen Großteil der Anwendungen der Dendrimere übernehmen, wobei eine direkte Ein-Schritt-Synthese die Produktion wesentlich erleichtert. Im Gegensatz zu den Dendrimeren sind Hyperverzweigte Polylysine zwar weder perfekt monodispers noch frei von strukturellen Defekten, doch inwieweit sich das negativ auf ihre Eigenschaften als Vehikel auswirkt, muss noch untersucht werden (SCHOLL et al. 2007b). Lipidnanokapseln (LNK) wurden bereits bezüglich ihrer Biokompatibilität anhand von Komplementaktivierung und Aufnahme durch Makrophagen untersucht (VONARBOURG et al. 2006b). In diesen Vorstudien zeigten sich diese Partikel nach intravenöser und intraperitonealer Applikation als sehr gut bioverträglich und aufgrund ihrer monodispersen und nanoskalaren Größe als sehr attraktiv für den Wirkstofftransport im Körper (VONARBOURG et al. 2006a). Eine sehr geringe Komplementaktivierung und Makrophageninternalisierung kombiniert mit einer hohen Beladungsrate und verzögerter Wirkstoffabgabe über eine signifikante Zeitspanne im Falle des Amiodarone (LAMPRECHT et al. 2002) führte schließlich zu der Überlegung, Lipidnanokapseln auch im Innenohr als Vehikel einzusetzen. Zou et al. (ZOU et al. 2008) waren bereits in der Lage Lipidnanokapseln nach Rundfensterpermeation im Cochleagewebe sichtbar zu machen, wobei sie einen parazellulären Weg der Partikel annahmen. Genauere Untersuchungen zur Toxizität der Grundstruktur sollten nun folgen, bevor ein zellspezifischer Wirkstofftransport evaluiert werden kann. 83 Welche biogenen Arzneistoffe von den als nonvirale Vektoren dienenden Nanopartikeltypen in die Cochlea transportiert werden können, hängt im Wesentlichen von der Morphologie und den Eigenschaften der Partikel ab. Hyperverzweigte Polylysine besitzen einen mittleren Radius von 10 nm und bieten sich damit für einen Gentransfer an. Lipidnanokapseln können unterschiedlichste Wirkstoffe transportieren, da sie aufgrund ihres komplexen Aufbaus Substanzen in ihren lipophilen Kern einschließen können, andere Substanzen in die hydrophile Hülle aufnehmen können oder auch auf der Oberfläche Substanzen binden können. Mit einem mittleren Durchmesser von 53 nm eignen sie sich im Gegensatz zu Hyperverzweigten Polylysinen auch für den Wirkstofftransport größerer Moleküle, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren. 84 6.2 Diskussion der in vitro angewendeten Methoden Für die Toxizitätstests wurde die permanente Zelllinie L929 eingesetzt, einer aus adhärent wachsenden Fibroblasten bestehenden Kultur, die aus subkutanem areolarem und adipotischem Gewebe einer männlichen C3H/An Maus stammt. Die Zelllinie ist seit Jahrzehnten etabliert, wobei die Normalparameter wie z. B. Morphologie und Mitoseaktivität bekannt sind. L929-Zellen sind einfach zu kultivieren, zeichnen sich durch reproduzierbare Ergebnisse aus und sind somit als sensibles Testsystem für die Bioverträglichkeitsprüfung von Biomaterialien und Wirkstoffen prädestiniert, so dass sie für diesen Zweck durch die DIN EN ISO 10993 empfohlen werden und auch bereits für die Evaluierung anderer Nanopartikeltypen eingesetzt wurden (JIN et al. 2008). Um die mit dem Fluorophor FITC markierten Nanopartikel in den Zellen verfolgen, das Aufnahmeverhalten und die Verteilung beurteilen zu können, bediente man sich der Konfokalen Laserrastermikroskopie. Bei einem üblichen Epifluoreszenzmikroskop entsteht ein Bild aus der Überlagerung einer scharfen Abbildung der Punkte innerhalb der Fokalebene und einer unscharfen Abbildung der Punkte außerhalb dieser Ebene. Doch gerade für die Visualisierung winzigster Nanopartikel führt diese Unschärfe zu großen Schwierigkeiten, die Vehikel überhaupt zu detektieren bzw. bestimmten Gewebekompartimenten zuzuordnen (ROY et al. 2005). Der Versuch, Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln mit einem üblichen Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen, schlug fehl. Die Konfokalmikroskopie ermöglicht es, virtuelle optische Schnitte durch ein Objekt zu erzeugen und die entstehenden Schnittbilder anschließend durch geeignete Software zu einer räumlichen Darstellung zusammenzusetzen (MACDONALD u. RUBEL 2008). Das Auflösungsvermögen ist wesentlich höher, so dass selbst Nanopartikel im Gewebe verfolgt werden können. Dazu muss das umliegende Gewebe allerdings gegengefärbt werden, was in dieser Studie sowohl in vitro als auch in vivo mit Hilfe von Rhodamin-Phalloidin und DAPI erfolgte. Bei Phalloidin handelt es sich um ein für F-Aktin hochaffines Phallotoxin des Grünen Knollenblätterpilzes, das mit dem Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamine konjugiert ist. Auf diese Weise können nanomolare Konzentrationen dieser Verbindung genutzt werden, um entsprechende Teile des Zytoskeletts sichtbar zu machen und zu quantifizieren (SMALL et al. 85 1999). Die Konjugation mit dem Fluorophor Rhodamin verhindert auch ein Überlappen der Wellenlängen mit dem FITC der Nanopartikel. DAPI (IUPAC-Bezeichnung: 4’,6-Diamidino-2-phenylindol) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der in vielen Bereichen zur Kernfärbung eingesetzt wird (KRISHAN u. DANDEKAR 2005), wobei er sich bevorzugt an AT-reiche Regionen in den kleinen Furchen der DNA anlagert. Obwohl DAPI sowohl an DNA als auch an RNA bindet, kann es aufgrund unterschiedlicher Emissionsmaxima als DNA-spezifisch bezeichnet werden (TANIOUS et al. 1992). Auch die Wellenlängen des DAPI überschneiden sich nicht, was für die konfokalmikroskopischen Aufnahmen von großer Wichtigkeit ist. Für die Zytotoxizitätsbestimmungen der Nanopartikel in vitro kam der Viabilitätstest mit Neutralrot (10.2.1) zur Anwendung. Dieser rote Farbstoff wird von den Lysosomen vitaler Zellen aufgenommen, kann photometrisch quantifiziert werden und dann zu einer Kontrollgruppe ins Verhältnis gesetzt werden kann (BORENFREUND u. PUERNER 1985). Dieser Test wird standardmäßig für die Einschätzung zytotoxischer Effekte verschiedenster Stoffe auf Zellkulturen eingesetzt, da er einfach in der Durchführung ist und sichere, reproduzierbare Ergebnisse liefert. 86 6.3 Qualitative Bewertung der Nanopartikelaufnahme auf Zellebene Im ersten Versuchsansatz wurden die Mausfibroblasten mit einem nanopartikelhaltigen Inkubationsmedium kultiviert, anschließend fixiert und mit DAPI und Rhodamin-Phalloidin gegengefärbt. Konfokalmikroskopische Aufnahmen analysierten die Verteilung der Nanopartikel in der Zellkultur und die Aufnahme in die einzelnen Zellkompartimemte. Die Auswertung dieser Aufnahmen ergab bei den mit Hyperverzweigten Polylysinen und Lipidnanokapseln inkubierten Fibroblasten einen deutlichen Nachweis von FITC im Zytoplasma aller Kulturzellen. Die Fluoreszenz konnte gehäuft um den Nucleus visualisiert werden, nicht aber in dessen Inneren, was über die sequenzielle Anregung der einzelnen Kanäle und Verschiebung der z-Achse genau verifiziert werden konnte. Da das Fluorophor bei beiden Vektorentypen über eine Thioamid-Bindung kovalent an die Grundstruktur gebunden ist, kann man die FITC-Detektion mit dem Nanopartikelnachweis gleichsetzen. Der Fluoreszenzfarbstoff ist also nicht nur in der Vektorenstruktur eingekapselt oder auf andere nicht-kovalente Art gebunden, was von entscheidender Bedeutung für das Experiment ist. Denn hier besteht die einzige Möglichkeit der Lokalisation der Vehikel in den Zellen und Geweben in dem Fluoreszenznachweis. Da die kovalente Bindung die stabilste Form darstellt, mit der ein Fluorophor an die Nanopartikel gebunden werden kann (BANKS u. PAQUETTE 1995; SEIB et al. 2007), erlaubt sie eine qualitative Bildgebung und quantitative Messungen über eine gewisse Zeitspanne. Bevor Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln in vitro und in vivo getestet wurden, haben die Nanopartikelhersteller bereits Untersuchungen bezüglich der Stabilität der Partikel durchgeführt, um eine frühzeitige Dissoziation der Fluorophore von der Grundstruktur ausschließen zu können. Hierzu wurden die Partikel in unterschiedlichen Elektrolytlösungen, bei unterschiedlichen Konzentrationen und pH-Werten bis zu drei Monate gelagert und anschließend das zeta-Potenzial und der hydrodynamische Radius bestimmt, sowie spektroskopische Untersuchungen vorgenommen. Die Ergebnisse bewiesen eine gute Stabilität der Verbindungen und auch makroskopisch war keine Trübung, Sedimentierung oder andere Zeichen des Strukturverlusts ersichtlich. Somit kann man also davon ausgehen, dass die Fluoreszenz in den Fibroblasten ausschließlich von den FITC-markierten Nanopartikeln stammt, die sich zu Clustern zusammengelagert um den Kern herum im Zytoplasma detektieren lassen und nicht von dissoziiertem FITC. Als Inkorporationsprozess für nonvirale Partikel in verschiedenste Zelltypen kann Endozytose in 87 Form von Phagozytose oder Pinozytose angenommen werden. Bei der Phagozytose handelt es sich um einen Vorgang, zu dem nur spezialisierte Zellen fähig sind, wie beispielsweise Makrophagen, Lymphozyten oder dendritische Zellen. Diese erkennen Pathogene oder andere fremde Strukturen anhand ihrer Oberfläche oder über spezifische Rezeptoren und Antikörper und schnüren sie dann über Phagosomen in ihr Zellinneres ein. Die Pinozytose verläuft ähnlich, bezieht sich aber auf wesentlich kleinere und flüssige Stoffe, die eingeschnürt werden, und tritt entweder als Clathrin-vermittelte Endozytose auf, als Mikropinozytose, über Caveolae oder als clathrin- und caveolae-unabhängige Endozytose (KHALIL et al. 2006). Dabei ist Clathrin ein Protein, das an der Einstülpung von Zellmembranen und der Bildung von Vesikeln beteiligt ist (v.a. bei der rezeptorabhängigen Endozytose), wobei es nach dem Abschnüren der Stachelsaumbläschen (Clathrin coated vesicles) ATP-abhängig entfernt wird („uncoating“ durch die uncoating-ATPase). Bei Caveolae handelt es sich um 50 - 100 nm große sackförmige Einbuchtungen der Plasmamembran, die man unter dem Elektronenmikroskop auf der Oberfläche von unterschiedlichen Zelltypen erkennen kann, besonders zahlreich zum Beispiel auf Endothelien. Caveolae besitzen eine typische Zusammensetzung an Proteinen und Lipiden, wobei das Protein Caveolin das wichtigste Strukturelement darstellt. Im Gefäßendothel schnüren sich Caveolae ab und dienen vermutlich der Transzytose von Plasmaproteinen (transendothelialer Stoffaustausch), was auch für Nanopartikel eine Internalisierungsmöglichkeit darstellt. Auch nicht-endozytotische Aufnahmewege in die Zelle können eine Rolle spielen. Lipophile und kleine, ungeladene aber polare Moleküle können per Diffusion ihrem Konzentrationsgefälle und dem Membranpotenzial folgend durch die Membran gelangen. Weitere passive Mechanismen stellen diverse Kanäle in der Zellmembran dar, die ligandenoder spannungsgesteuert geöffnet werden können oder verschiedene Carrier, die in Form eines Uniports, Symports oder Antiports Stoffe ins Zellinnere befördern können. Schließlich bestehen auch Möglichkeiten aktiv über ATP-Verbrauch Substanzen einzuschleusen. Bisher wird ein endozytotischer Aufnahmeweg für Nanopartikel angenommen, was aber noch nicht abschließend geklärt werden konnte. Es fehlen noch tiefgreifende Untersuchungen mit speziellen Membranfärbungen und elektro- und rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen, insbesondere für die verschiedenen Nanopartikeltypen, die durchaus unterschiedliche Wege ins Zytoplasma finden können. Doch die Aufklärung dieses Mechanismus ist wichtig in 88 Hinblick auf die Wahl eines passenden Liganden, der mittels nonviraler Vektoren an seinen Bestimmungsort gebracht werden soll. Diese Untersuchungen sind Gegenstand zukünftiger Projekte, die dann bereits auf einen Wirkstofftransport ausgerichtet sind, während in dieser Arbeit zunächst die grundlegende Biokompatibilität und Verfolgbarkeit untersucht wurde. Die verschiedenen potenziell zur Anwendung kommenden Medikamente, Wachstumsfaktoren, Plasmide, Gene oder siRNAs setzen an verschiedenen Punkten des Zellstoffwechsels an und müssen meist zunächst in die Zelle oder sogar in den Nucleus integriert werden, bevor sie die Zellfunktionen kontrollieren oder die Zellen transfizieren und so ihre Wirkung entfalten können. Neurotrophe Faktoren wirken über die Aktivierung spezifischer Rezeptoren an der Oberfläche ihrer Zielzellen (QUN et al. 1999), so wie beispielsweise BDNF an den Rezeptor Trk-B der Spiralganglienzellen bindet, um einen protektiven Effekt auszuüben (WEFSTAEDT et al. 2006). Das bedeutet, dass Vektoren für Wachstumsfaktoren zwar die gewünschten Zielzellen erreichen, aber nicht unbedingt in sie eindringen müssen. Dahingegen ist es bei vielen anderen Medikamenten notwendig, dass sie in das Zytoplasma eindringen und auch siRNAs können nur dort von den Ribosomen zur Proteinsynthese translatiert werden. Wenn allerdings ein komplettes Gen oder eine Gensequenz von der Zielzelle exprimiert werden soll, so muss dieses in den Nucleus eindringen, um in das Ursprungsgenom eingebaut zu werden. Dabei stellt die Kernhülle ein hochgradig spezialisiertes Membransystem dar, welches den Zellkern eukaryontischer Zellen in der Interphase umgibt. Kernporenkomplexe bilden Kanäle durch die Kernhülle und vermitteln den Transport von Molekülen zwischen Zellkerninnerem und Zytoplasma, sowohl in Form von passiver Diffusion als auch als aktiver Transport. Während Partikel mit einem Durchmesser bis zu 10 nm frei durch diese Kanäle diffundieren können, erfolgt für die meisten Makromoleküle ein signalabhängiger Transportmechanismus durch die Kernporen. Insgesamt können aber nur Moleküle bis zu einem maximalen Durchmesser von 30 nm in den Zellkern eindringen (MELCHIOR u. GERACE 1995). Zusammenfassend kann man also sagen, dass der Ligand, der durch die nonviralen Vektoren an seinen Wirkort gebracht werden soll, die zu erreichende Zielzelle, also Zelltyp und Kompartiment der Zelle festlegt. Die Nanopartikelstruktur, Größe, Oberflächenladung und zusätzliche Modifikationen über Rezeptoren oder Antikörper bestimmen schließlich den Weg, den das Vehikel zur finalen Lokalisation nimmt. 89 6.4 Quantitative Aussagen zur Nanopartikelaufnahme in Zellkultur Mit Hilfe der konzentrationsabhängigen Fluoreszenzmessungen konnte die Aufnahme der Hyperverzweigten Polylysine und Lipidnanokapseln in die Fibroblastenkultur genau quantifiziert werden. Dazu wurden die Fibroblasten in unterschiedlichen Nanopartikelkonzentrationen inkubiert und anschließend das nanopartikelhaltige Medium abgesaugt. Anschließend erfolgte die Fluoreszenzmessung mit einem Plattenfluorometer, wobei die Verwendung schwarzer Zellkulturplatten Ungenauigkeiten durch Streulicht aus den anderen Wells verhinderte. Außerdem wurde lichtmikroskopisch kontrolliert, dass die adhärent wachsenden L929-Zellen eine Monolayer-Kultur gebildet haben, so dass bei der Einstellung des Messgerätes auf den Boden der Kulturplatten möglichst alle Zellen miteinbezogen wurden. Mehrmaliges Spülen mit PBS nach Inkubationsende sollte alle nicht internalisierten Partikel restlos von den Zelloberflächen entfernen, so dass wirklich nur die Fluoreszenz der Partikel gemessen wurde, die sich in den Fibroblasten befand. Um die gemessenen Emissionen in Nanopartikelanzahl umrechnen zu können, wurde zuvor eine Verdünnungsreihe der jeweiligen Stammlösung mit bekannter Nanopartikelzahl mit dem Fluorometer vermessen und eine Kalibrationskurve und deren Funktion bestimmt. So wurden die Emissionen in absolute Nanopartikelzahlen umgerechnet und diese schließlich zur Nanopartikelkonzentration im eingesetzten Inkubationsmedium ins Verhältnis gesetzt, so dass sich daraus der prozentuale Anteil ergab, der aus dem Medium in die Zellen aufgenommen wurde. Bei den Hyperverzweigten Polylysinen lag der prozentuale Anteil der Nanopartikel, die aus dem Medium in die Zellen gelangten, konstant zwischen 6,6% und 11,8% ohne einen signifikanten Unterschied zwischen den eingesetzten Konzentrationen, was auf einen konzentrationsunabhängigen Aufnahmevorgang hindeutete. Insgesamt ist die Aufnahme der Hyperverzweigten Polylysine aber eher als gering einzustufen, da vermutlich neben dem Konzentrationsgradienten auch das Membranpotenzial und die Oberflächenladung der Partikel eine Rolle zu spielen schienen, so dass sich das dynamische Gleichgewicht bei eben diesem Zahlenverhältnis einstellte. Für die Lipidnanokapseln lagen die Werte noch unter denen der Zellaufnahme der Hyperverzweigten Polylysine, aber im Gegensatz dazu zeigten die relativen Verhältnisse zwischen eingesetzter Nanopartikelkonzentration im Medium und aufgenommenen Anteil in 90 den Zellen einen Trend zur negativen Korrelation. Die Aufnahme der Lipidnanokapseln lag zwischen 1,4% bei der 1:10-Verdünnung und 2,8% bei der 1:1000-Verdünnung, wobei zwischen diesen beiden Extremwerten ein signifikanter Unterschied bestand. Je höher also die Konzentration der Lipidnanokapseln im Medium war, desto geringer war der Anteil, der davon in die Zellen eindrang. Dies lässt darauf schließen, dass neben dem Konzentrationsgradienten und dem Membranpotenzial hier auch ein Sättigungseffekt auftrat, der einer ungehemmten Steigerung der Nanopartikelaufnahme entgegenwirkte. Um diesen Sättigungseffekt anhand einer Kurve genau bestimmen zu können, müsste die Konzentrationsreihe noch wesentlich erweitert werden. Technisch wird allerdings hierbei die Nachweisgrenze der Nanopartikel erreicht, so dass die Erstellung einer Verdünnungskurve nicht ohne weiteres möglich ist. Dies war jedoch nicht Bestandteil dieser Studie, sondern wird in folgenden Untersuchungen näher beleuchtet. 91 6.5 Auswirkungen der Nanopartikel auf die Zellviabilität auf Grundlage des Neutralrottests Zytotoxische Effekte der Hyperverzweigten Polylysine und Lipidnanokapseln auf L929Zellkulturen wurden nach 24-stündiger Inkubation in unterschiedlichen Nanopartikelkonzentrationen qualitativ lichtmikroskopisch untersucht, wobei auf mögliche morphologische Veränderungen der Zellstrukturen geachtet wurde. Der zytotoxische Einfluss der Hyperverzweigten Polylysine und Lipidnanokapseln konnte allerdings auch quantifiziert werden, indem die Zellvitalität der Kultur bei unterschiedlichen Nanopartikelkonzentrationen des Mediums mit einem Neutralrottest gemessen wurde und zu einer nanopartikelfreien Kultur als Kontrolle ins Verhältnis gesetzt wurde. Hohe Konzentrationen der Hyperverzweigten Polylysine und Lipidnanokapseln führten zu einem veränderten Erscheinungsbild der Fibroblasten, was sich in kleinen, abgerundeten, granulierten Zellen ohne Zellausläufer manifestierte, ohne jedoch das histologische Bild des Nucleus zu verändern. Kernpyknose oder gar Karyorhexis als Apoptosemerkmale wurden nicht beobachtet. Der Anteil dieser pathologisch veränderten Zellen nahm mit steigender Nanopartikelkonzentration im Inkubationsmedium zu. Quantitativ konnte man mittels Vitalfärbung mit Neutralrot eine signifikante Reduktion der Zellviabilität auf 30-40% bei einer 1:10-Nanopartikelverdünnung im Medium unabhängig vom Nanopartikeltyp feststellen. Mit zunehmender Verdünnungsstufe nahmen die zytotoxischen Effekte ab, so dass für beide Vektorentypen ab einer 1:300-Verdünnung keine signifikanten Unterschiede zum partikelfreien Medium mehr auszumachen waren. Diese Auswirkungen der Polylysine auf Zellkulturen wurden in der Vergangenheit bereits bestätigt (SANTINI et al. 1997), wobei die positive Nettoladung und die Ionenumgebung der Zellmembran für diesen Effekt verantwortlich gemacht wurde. Auch wenn es sich in der Studie von Santini et al. nicht um nanoskalige Hyperverzweigte Polylysine handelt, und die Toxizitätsstudien an K562-Zellen durchgeführt wurden, so kann man die Ergebnisse doch durchaus als übertragbar auf L929-Mausfibroblasten ansehen. Bei den durchgeführten Untersuchungen zeigte sich, dass Hyperverzweigte Polylysine die Art, Menge und Verteilung einzelner Zellmembrankomponenten wie Lipide, Proteine und Polysaccharide verändern können und damit einen entscheidenden Einfluss auf die Zellintegrität besitzen. Aktive 92 Ionentransporte werden auf diese Weise ebenso modifiziert, wie verschiedenste rezeptorvermittelte Abläufe an der Zellmembran, Exo- und Endozytosevorgänge oder Zellkontakte und -kommunikation zu Nachbarzellen der Kultur. Die Stoffwechselfunktion der Zellen ist somit eingeschränkt, was sich in einer verringerten Vitalität im Neutralrottest darstellt, allerdings sind die Zellen offensichtlich nicht so stark geschädigt, dass die Mitosefähigkeit herabgesetzt wird. Die Dichte der Zellkultur ist über die untersuchte Zeitspanne mit der nanopartikelfreien Kontrollgruppe gleichzusetzen und auch der Zellkern erscheint morphologisch unverändert. Dies kann damit zusammenhängen, dass die Hyperverzweigten Polylysine nicht in der Lage sind, den Nucleus zu penetrieren und der veränderte Zellmetabolismus selbst für die Auslösung einer Apoptose oder Nekrose nicht ausreicht. Allerdings stehen Untersuchungen über längere Zeiträume und mit noch höheren Konzentrationen der Hyperverzweigten Polylysine noch aus, um eine definitive Aussage darüber treffen zu können. Die Ergebnisse für die Lipidnanokapseln fielen in dieser Studie äquivalent zu den Resultaten für die Hyperverzweigten Polylysine aus, was Morphologie und Neutralrottest betrifft. In vorangegangenen Untersuchungen (VONARBOURG et al. 2006b) besaßen Lipidnanokapseln immer eine sehr gute Biokompatibilität bezogen auf Makrophagen und führten nicht zu einer Komplementaktivierung. Der zum Teil zytotoxische Effekt hoher Konzentrationen von Lipidnanokapseln auf Fibroblastenkulturen ist bisher nicht beschrieben, basiert aber vermutlich auf einem ähnlichen Mechanismus wie bei den Hyperverzweigten Polylysinen. Die phospholipidhaltige Hülle der Lipidnanokapseln kann bei der Invasion in die Zellen über Veränderungen an der Zellmembran zu Störungen der Zellinteraktion führen, was zu einem eingeschränkten Metabolismus aber nicht zu einer geringeren Teilungsrate führt. Auch Lipidnanokapseln finden sich nicht im Kern wieder, sondern reichern sich im Zytoplasma an, wo sie vermutlich den Zellstoffwechsel beeinflussen, ohne einen Zelluntergang zu verursachen. 93 6.6 Diskussion der in vivo angewendeten Methoden Resultierend aus den In-vitro-Versuchen wurde schließlich die Nanopartikelkonzentration ermittelt, die hoch genug war, um ein gutes Signal mit dem Konfokalmikroskop zu erzeugen, so dass die Vektoren gut im Gewebe lokalisiert werden konnten. Die Konzentration war andererseits aber so gering, dass keine zytotoxischen Wirkungen zu erwarten waren. Aus diesem Grund wurden letztendlich 3,4 x 10-12 mol Hyperverzweigte Polylysine bzw. 4,7 x 1010 Lipidnanokapseln gelöst in jeweils 5 µl sterilfiltriertem PBS per Cochleostomie appliziert. Für die tierexperimentellen Arbeiten wurden Meerschweinchen als Versuchstiere gewählt, da sich die anatomischen Dimensionen der Cochlea für otochirurgische Manipulationen als besonders günstig erwiesen haben. Dieses Tiermodell ist in der Arbeitsgruppe bereits etabliert, so dass standardisierte operative Zugänge zum Innenohr bestehen und durch bereits durchgeführte Untersuchungen über AABR Vergleichswerte für die Studien zur Verfügung standen. Vor und nach der Nanopartikelapplikation ins linke Innenohr der Tiere und PBS-Applikation ins rechte Innenohr zur Kontrolle wurden die Hörschwellen der Tiere über AABR-Messungen ermittelt und so funktionelle Effekte festgehalten. Morphologisch konnte der Einfluss der Nanopartikel über Haarzellzählungen auch quantifiziert werden, so dass insgesamt eine Aussage zur Biokompatibilität der zwei Nanopartikeltypen getroffen werden konnte. Die Verteilung der fluoreszenzmarkierten Vektoren im Innenohr und die Aufnahme in die unterschiedlichen cochleären Zelltypen wurde mit Hilfe der Konfokalmikroskopie untersucht, wobei die etablierten Färbemethoden und Aufnahmetechniken aus der zuvor durchgeführten In-vitro-Studie übernommen wurden. 94 6.7 Beurteilung der Vektorendetektion im Innenohr Nach Ablauf der gruppenspezifischen Versuchszeit wurden die Meerschweinchen zunächst einer elektrophysiologischen Abschlussmessung unterzogen, bevor sie getötet wurden und das Gewebe zur weiteren Untersuchung gewonnen wurde. Entsprechend den In-vitro-Methoden wurde das Innenohrgewebe mit Phalloidin und DAPI gegengefärbt, um die fluoreszenzmarkierten Partikel in den Innenohrkompartimenten genau lokalisieren zu können. Nach einer Präparation der einzelnen Windungen von Basilarmembran und Stria vascularis erfolgte dann die Detektion von Hyperverzweigten Polylysinen und Lipidnanokapseln unter dem Konfokalmikroskop. Die Auswertung der konfokalmikroskopischen Aufnahmen ergab eine gleichmäßige Verteilung der Nanopartikel in allen Zelltypen des Innenohres. Sensorische Zellen, Stützzellen und Spiralganglienzellen von basal bis apikal waren gleichermaßen infiltriert, wobei sich auch kein zeitlicher Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen oder den verschiedenen Vektorentypen manifestierte. Die fluoreszenzmarkierten Vehikel waren nur im Zytoplasma und nicht im Kern lokalisierbar, wobei wiederholt eine deutliche Fluoreszenz in den inneren Haarzellen im Gegensatz zu den äußeren Haarzellen festzustellen war. Eine kürzlich veröffentlichte Studie (ZOU et al. 2008) zu den Lipidnanokapseln nahm für die Ausbreitung der Nanopartikel nach Rundfensterapplikation bis zum Cortischen Organ einen neuronen-assoziierten parazellulären Übertragungsweg an. Dabei wurde über kurze Zeitabstände demonstriert, dass die Partikel nach Überwindung der Rundfenstermembran vom perilymphatischen Raum der Scala tympani in den Modiolus und die dort befindlichen Spiralganglienzellen diffundierten. Entlang der Nervenfasern im Rosenthalschen Kanal erreichten sie zentrifugal zuerst die inneren Haarzellen und dort gelegene Stützzellen und letztendlich die äußeren Haarzellen und die Stria vascularis mit dem Spiralligament. Auch in der vorliegenden Studie wurde zum Teil eine stärkere Infiltration der inneren Haarzellen nachgewiesen, was sich allerdings über die beobachteten Zeiträume bis zu vier Wochen nicht änderte. Da die Verteilung der Hyperverzweigten Polylysine mit der der Lipidnanokapseln übereinstimmt, kann für beide Nanopartikeltypen derselbe parazelluläre Ausbreitungsweg angenommen werden. Diese Form der Verteilung führt vermutlich im Gegensatz zu bisher untersuchten viralen Vektoren zu der gleichmäßigen Detektion von basal bis apikal, auch noch nach 28 Tagen. Studien zu viralen Vektoren konnten nach Applikation in die Scala 95 tympani oft nur eine zeitlich begrenzte Genexpression oder geringe Transfektionsraten nachweisen, die nach apikal deutlich abnahmen, insbesondere wenn eine Rundfensterapplikation erfolgte (HAN et al. 1999; STOVER et al. 1999; SUZUKI et al. 2003). Ein weiteres Sicherheitsproblem viraler Vektoren ist die Möglichkeit der Migration auf die Gegenseite, wo sie ebenfalls zu einer Transfektion der Zellen führten. Die hier durchgeführten Untersuchungen zu nonviralen Vektoren gaben dahingegen keinen Hinweis auf eine Verteilung der Nanopartikel in das Gegenohr. Um die bisher unspezifische Verteilung der Nanopartikel im Innenohrgewebe in einen zielgerichteten Transport zu nur einem Zelltyp der Cochlea zu ändern, ist eine Oberflächenmodifizierung der Grundstruktur der Nanopartikel nötig. Die Adhäsion spezifischer Rezeptoren, Antikörper oder Lektine soll schließlich einen gezielten Wirkstofftransport erzeugen. Die Entwicklung solcher multifunktionaler Nanopartikel hat zusammengefasst entscheidende Vorteile gegenüber bisher untersuchten Drug-Delivery-Systemen. Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln sind in dieser Arbeit über Fluoreszenzen im Gewebe bis zu 28 Tage detektierbar, wobei sie eine gleichmäßige Verteilung im Innenohr zeigen. In folgenden Studien sollen sie über spezifische Oberflächenrezeptoren Pharmaka gezielt ins Innenohr transportieren und zeitlich kontrolliert freisetzen und wären damit anderen Vektoren weit überlegen. 96 6.8 Morphologische und funktionelle Effekte der Nanopartikel- applikation in der Cochlea Zur Überprüfung der Biokompatibilität der Hyperverzweigten Polylysine und Lipidnanokapseln in vivo wurde in dieser Arbeit elektrophysiologisch die Hörschwelle der behandelten Tiere bestimmt, um funktionelle Auswirkungen zu analysieren. Haarzellzählungen dienten dazu, eine histologische Quantifizierung eines Haarzellverlusts durch Injektion zu ermöglichen. Der Vorteil der frequenzspezifischen Analyse liegt hierbei in der Ortstonotopie, so dass frequenzspezifischer Hörverlust im Zytocochleogramm mit auftretendem Haarzellverlust und im konfokalmikroskopischen Bild mit der Nanopartikelaufnahme vergleichend beurteilt werden kann. Zwei Tage nach der Nanopartikelapplikation in die Scala tympani war in den Gruppen HP-2, -14 und -28 die Hörschwelle links um durchschnittlich 13,7 dB SPL angestiegen, während rechts ein Anstieg um 7,2 dB SPL zu verzeichnen war. Die Werte in den Gruppen der Lipidnanokapseln ähneln sich dahingegen, dass nach 2 Tagen ein frequenzübergreifender Hörschwellenanstieg von 11,3 dB SPL links und 11,0 dB SPL rechts festzustellen war. Die frequenzspezifische Analyse ergab, dass in den tiefen und mittleren Frequenzen die Erhöhung der Hörschwellen nur moderat und nicht signifikant war, während in den hohen Frequenzen, die im basalen Bereich der Basilarmembran abgeleitet werden, signifikante Anstiege für beide Ohren nachzuweisen waren (5.2.3). Doch ein Vergleich der beiden unterschiedlich behandelten Ohren der Tiere ergab keine signifikanten Unterschiede für die mit Lipidnanokapseln oder Hyperverzweigten Polylysine behandelten linken Cochleae gegenüber den PBS-behandelten rechten Cochleae nach 2 Tagen. Auch wenn in den höheren Frequenzen die Hörschwellen tendenziell mehr anstiegen, so wurde doch über die Konfokalmikroskopie nachgewiesen, dass Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln gleichmäßig von apikal bis basal die unterschiedlichen Zelltypen der Cochlea infiltriert hatten (5.2.2) und nicht gehäuft in der Nähe der Rundfenstermembran zu finden waren. Zusätzlich zeigte die Haarzellzählung für die Hyperverzweigten Polylysine einen maximalen durchschnittlichen Haarzellverlust von 0,1% und für die Lipidnanokapseln 0,024%, wobei keine Häufung in einem bestimmten Bereich der Basilarmembran anzutreffen war. Die Registrierung der 97 fehlenden Haarzellen geschah in Abhängigkeit zur Distanz zum Apex, was ebenfalls nicht dazu führte, dass sich ein erhöhter Haarzellverlust bei den hohen Frequenzen darstellen ließ. Damit beweisen die Ergebnisse der Histologie, dass die Nanopartikel selbst in der verwendeten Konzentration keinen toxischen Effekt auf die Cochlea haben, sondern die angestiegenen Hörschwellen in den hohen Frequenzen anderen Ursachen zuzuordnen sind. Wahrscheinlich ist, dass die Manipulation selbst zu den angestiegenen Hörschwellen in den hohen Frequenzen geführt hat. Die Eröffnung der Mittelohrkavität führt dort zu veränderten Druckverhältnissen und damit zu einer veränderten Schallkonduktion bis zum Ovalen Fenster. Über die Cochleostomie wird anschließend in der basalen Windung der perilymphatische Flüssigkeitsraum der Scala tympani eröffnet und 5 µl einer Lösung langsam injiziert. Damit verändert sich die Zusammensetzung der Perilymphe ebenso wie der Druck in der Scala tympani und damit im gesamten perilymphatischen Raum, was zu einer veränderten Schallausbreitung führen kann. Cochleostomie und Tympanotomie werden zwar im Anschluss mit Karboxylatzement wieder verschlossen, aber eine Wiederherstellung der ursprünglichen Druck- und Flüssigkeitsverhältnisse benötigt eine bestimmte Zeit. Zusammengenommen führt dies zu den ermittelten Hörschwellenanstiegen besonders im Bereich der hohen Frequenzen, basal nahe der Cochleostomie, unabhängig davon, welche Flüssigkeit appliziert wurde. Doch wie die AABR-Daten nach 14 und 28 Tagen zeigten, sind der Hörschwellenanstieg und damit der funktionelle Effekt reversibel. In den Gruppen HP-14, -28, LNK-14 und LNK-28 konnte kein signifikanter Anstieg der Hörschwelle im Verhältnis zu Tag 0 ermittelt werden und auch der Vergleich der linken und rechten Seiten ergab keine signifikanten Differenzen. In diesem Zeitrahmen haben sich die durch den Eingriff veränderten Zustände im Mittel- und Innenohr wieder soweit dem Ausgangszustand angeglichen, dass keine signifikanten funktionellen Verluste zu verzeichnen waren, wie es ebenfalls histologisch belegt wurde. Der Effekt war nur temporär feststellbar und damit mit hoher Wahrscheinlichkeit auf die Operation und nicht auf die Toxizität der Nanopartikel zurückzuführen. Im Gegensatz zu viralen Vektoren, bei denen die Auslösung entzündlicher und immunologischer Reaktion zu funktionellen und morphologischen Veränderungen in vorherigen Studien führte (KHO et al. 2000), konnte hier für die beiden nonviralen Vektoren eine gute Biokompatibilität in vivo nachgewiesen werden. Diese gute Bioverträglichkeit im 98 Zusammenhang mit der Verfolgbarkeit im Gewebe und der Fähigkeit verschiedenste Zelltypen zu infiltrieren, qualifiziert die Hyperverzweigten Polylysine und die Lipidnanokapseln für weitergehende Versuche zum zielgerichteten Transport nach Oberflächenmodifikation, Wirkstofftransport, -freisetzung und Bioeffektivität als DrugDelivery-System der dritten Generation. 99 6.9 Bewertung der eigenen Studien und hieraus resultierende Zukunftsperspektiven Die vorliegende Studie hat sich mit grundlegenden Untersuchungen zu Nanopartikeln als nonvirale Vektoren ins Innenohr befasst. Anhand zweier Beispiele (Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln) konnte in In-vitro-Studien gezeigt werden, dass diese Partikel in der Lage sind, Zellen zu infiltrieren und dabei durch Fluoreszenzmarkierung in der Kultur verfolgbar sind. Auch nach Applikation ins Innenohr konnte eine unspezifische Verteilung im Zytoplasma aller Zelltypen beobachtet werden. Zytotoxische Effekte konnten mittels Neutralrottests nur bei hohen Nanopartikelkonzentrationen festgestellt werden, während im Innenohr weder morphologische Veränderungen (Haarzelluntergang) noch dauerhafte funktionelle Einbußen (AABR-Messung) auf zytotoxische Einflüsse hinwiesen. Biokompatibilität, Verfolgbarkeit im Gewebe und die Fähigkeit unterschiedlichste Zelltypen zu infiltrieren sind die Voraussetzungen, die die untersuchten Grundstrukturen erfüllen müssen, bevor eine weitere Modifikation oder Drug-Delivery erfolgen kann. Damit sind Hyperverzweigten Polylysine und Lipidnanokapseln sehr vielversprechende Kandidaten für den Wirkstofftransport ins Innenohr. Entscheidend dafür, welcher Ligand an das Grundgerüst gebunden werden sollte, ist zunächst die gerichtete Verteilung in der Cochlea und der Aufnahmeweg in spezielle Kompartimente der Zelle. Hier werden aktuell Untersuchungen durchgeführt, die sich mit dem Einfluss der Partikelgröße, Oberflächenladung und spezifischen Oberflächenrezeptoren auf die Zielsicherheit und den Aufnahmemechanismus beschäftigen. Erst eine genaue Kenntnis des Weges der Nanopartikel im Organismus ermöglicht die Wahl einer geeigneten Substanz zum Wirkstofftransport, seien es Gene, Wachstumsfaktoren oder andere Medikamente. Zusätzliche Oberflächenmodifizierungen mit Lektinen, Antikörpern oder Peptiden sollen auch beim Wirkstofftransport zu anderen Organsystemen einen gezielten Zellantransport, eine bessere Adhäsion im Zielgewebe und eine Interaktion mit biologischen Barrieren (z. B. Blut-HirnSchranke (OLIVIER 2005; SINGH et al. 2007)) ermöglichen und so auch neue angenehmere Applikationsformen wie oral, nasal oder inhalativ eröffnen. In einer aktuellen Studie nutzten nun SINGH et al. (2007) das Apolipoprotein E als Targetmolekül an der Nanopartikeloberfläche, um die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden und so die Möglichkeit zu 100 haben, tumoröse und degenerative Erkrankungen des Gehirns zu therapieren. Die inhalative Applikation bei Lungenerkrankungen (PISON et al. 2006) und die Anwendung am Auge (BEJJANI et al. 2005) stehen ebenfalls im Mittelpunkt der Forschung. Ist dieser Ligand für die Anwendung am Innenohr ermittelt, müssen Untersuchungen bezüglich der Freisetzung am Wirkort, Pharmakodynamik und -kinetik anhand von morphologischen und funktionellen Studien durchgeführt werden. Auch die Dauer der Wirksamkeit, Akkumulation im Gewebe und Clearance-Mechanismen müssen ermittelt werden, um eine spätere Anwendungssicherheit garantieren zu können. Dazu sind auch andere Organsysteme des Organismus nach Nanopartikelapplikation zu untersuchen, zumal eine Anwendung zum Wirkstofftransport nicht auf das Innenohr beschränkt bleiben muss. Die Möglichkeit der Variation der Oberflächenmodifikation der Vektoren und damit der angesteuerten Zellarten ist noch nicht absehbar und erscheint im Zusammenhang mit der Vielzahl der zu transportierenden Agenzien (Medikamente, Gene, Plasmide usw.) nahezu vielfältig. Das in dieser Studie entwickelte Drug-Delivery-System könnte durchaus in modifizierter Form auch in anderen Organsystemen zur Anwendung kommen. Die Fähigkeit der hier untersuchten Partikel, gemeinsam mit einem gebundenen Liganden die unversehrte Rundfenstermembran zu passieren, eröffnet die Möglichkeit der Behandlung gering- bis mittelgradig hörgeschädigter Patienten ohne Eröffnung des perilymphatischen Raumes. Die Auftragung eines nanopartikelhaltigen Gels im Mittelohr auf die geschlossene Rundfenstermembran stellt eine innovative Behandlungsstrategie dar. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des Vektorensystems stellt die Kombination mit einem Cochlea-Implantat dar (Abb. 35). Dabei könnte die in die Scala tympani eingeführte Elektrode mit einem Nanopartikelreservoir gekoppelt sein, das protektive Wachstumsfaktoren oder Gene für die gentherapeutische Intervention im Innenohr beherbergt. So könnte dauerhaft ein positiver Einfluss auf die Zellen der Cochlea genommen werden und somit die Nerven-Elektroden-Interaktion verbessert werden, was zu einer deutlich gesteigerten Funktionalität des Implantats und damit letztendlich zu einer gesteigerten Lebensqualität der implantierten Patienten führt. 101 Abb. 35: Die Zeichnungen veranschaulichen mögliche Anwendungsstrategien der Nanopartikel zum Wirkstofftransport in die Cochlea. Das obere Bild verdeutlicht die Möglichkeit der Kombination einer CI-Elektrode mit einem Nanopartikelreservoir, während das untere Bild die Auftragung eines nanopartikelhaltigen Gels auf die geschlossene Rundfenstermembran mit anschließender Diffusion der Partikel in die Scala tympani illustriert (Quelle: Projektantrag NanoEar). 102 6.10 Mögliche veterinärmedizinische Anwendungsgebiete Wie bereits beschrieben (Abschnitt 2.2.2) ist der sensorineurale Hörverlust bei unseren Haustieren ebenfalls ein häufig beschriebener Krankheitskomplex. Neben Altersschwerhörigkeit, Lärm und Ototoxinen stellen die hereditären Ursachen die am weitesten verbreitete Form der Innenohrschwerhörigkeit dar. Vor allem in Verbindung mit Pigmentierungsstörungen wie bei weißen Katzen, Dalmatinern oder anderen Trägern des Merle- oder Albino-Gens treten häufig Cochleadefekte auf (MAIR 1976). In der Veterinärmedizin wird die Ableitung der akustisch evozierten Potenziale neben experimentellen Studien vor allem in der Tierzucht als objektives Testverfahren bei Zuchttieren zum Ausschluss kongenitaler Taubheit wie z. B. beim Dalmatiner (MAIR 1973; HOLLIDAY et al. 1992) oder bei weißen Katzen eingesetzt. Da gerade bei diesen Tieren häufig nur eine einseitige Taubheit besteht, fällt die klinische Diagnose schwer. Für die Ankörung als Zuchttier wird daher in den USA, Großbritannien, Deutschland und der Schweiz ein audiometrisches Zeugnis gefordert, das ein beidseitiges, intaktes Hörvermögen belegt. Auch Gebrauchshunde können mit Hilfe der ERA entsprechend ihrer Hörleistung eingestuft werden. Eine Behandlung der Hörschädigungen ist aus folgenden Gründen bisher unterblieben: Bei einer angeborenen Taubheit ist eine möglichst frühzeitige Intervention vor der abgeschlossenen Ausbildung der Hörbahn im ersten Lebensjahr unerlässlich (KLINKE 2008), damit die Möglichkeit besteht, noch in der Prägungsphase die Kommunikation mit den Artgenossen zu erlernen. Gehör und erlernte Lautäußerungen stehen im engen Zusammenhang und zählen nicht zum instinktiven, sondern zum erlernten Verhalten. Eine spätere Behandlung ermöglicht zwar eine begrenzte Geräuschaufnahme z. B. von Warntönen, Kommunikationsfähigkeit wird allerdings nicht erreicht. Wild lebende und taub geborene Tiere fallen meist der natürlichen Selektion zum Opfer, da sie weder ihre Beute noch Angreifer oder Warnrufe von Artgenossen akustisch wahrnehmen können und eine Kompensation mit den anderen Sinnen kaum möglich ist. Dahingegen kommen Tiere in menschlicher Obhut oft sehr gut mit einem Hörverlust zurecht, da sie einerseits keine natürlichen Feinde besitzen und andererseits nicht selbst für die Nahrungsbeschaffung sorgen müssen. Für die Kommunikation und Orientierung in der 103 Umwelt genügen die Körpersprache und der Ausgleich durch die noch vorhandenen Sinne, so dass eine Behandlung der Hörschädigung nicht zwingend erforderlich ist. Schließlich stellt eine Versorgung hörgeschädigter Tiere mit einem Cochlea-Implantat in keinem adäquaten Kosten-Nutzen-Verhältnis für das Tier und den Besitzer, so dass mit Ausnahme der experimentellen Anwendung diese Therapieoption entfällt. Bestünde allerdings die Möglichkeit mit Hilfe der Nanopartikel eine Innenohrtherapie über das Mittelohr durchzuführen, indem ein Drug-Delivery-System Substanzen durch die geschlossene Rundfenstermembran schleust, so erscheint eine Therapie durchaus denkbar. Der chirurgische und technische Aufwand und das damit verbundene Risiko wären wesentlich geringer und auf diese Weise attraktiver für die Anwendung in der Veterinärmedizin. Des Weiteren könnten die gewonnenen Erkenntnisse zum Wirkstofftransport nicht nur am Innenohr eingesetzt werden, sondern auch beispielhaft auf andere Organsysteme übertragen werden. Die Überwindung biologischer Barrieren wie beispielsweise der Blut-Hirn-Schranke könnte völlig neue Anwendungsstrategien auch in der Veterinärmedizin liefern. Untersuchungen am Beispiel von Prionenkrankheiten (CALVO et al. 2001) demonstrieren die vielfältigen Möglichkeiten des Einsatzes von Nanopartikeln als nonvirale Vektoren zum Wirkstofftransport in sonst schwer pharmakologisch erreichbare Gebiete. 104 7 Zusammenfassung Melanie Wolf (2009): „Untersuchungen zu 3g-Nanotechnologien als Basis für ein gezieltes DrugDelivery-System am Modell des Meerschweinchen-Innenohres“ Ziel dieser Studie ist es, multifunktionale Nanopartikel als nonvirale Vektoren ins Innenohr zu entwickeln, die biodegradierbar und in vivo nachweisbar sind, mit einer Vielzahl therapeutischer Wirkstoffe beladen werden können und diese präzise zu ausgewählten Zellpopulationen in der Cochlea transportieren und zeitlich kontrolliert freisetzen. Einen ersten Schritt zur Entwicklung eines solchen Drug-Delivery-Systems stellt die Untersuchung der Grundstruktur von Hyperverzweigten Polylysinen (HP) und Lipidnanokapseln (LNK) auf Biokompatibilität, Verfolgbarkeit im Gewebe und Infiltrationsvermögen dar. Dazu wurden diese Nanopartikeltypen in einer ersten In-vitro-Studie mit L929Mausfibroblasten kultiviert und anschließend mittels Konfokaler Lasermikroskopie in den Zellen visualisiert. Quantitativ konnte die Nanopartikelaufnahme in die Zellen über Fluoreszenzmessungen ermittelt werden, während ein Vitalitätstest mit Neutralrot Aufschluss über zytotoxische Eigenschaften der Partikel gab. Sowohl Hyperverzweigte Polylysine als auch Lipidnanokapseln penetrierten dabei alle Zellen der Kultur, wobei sie in Kernnähe im Zytoplasma akkumulierten, ohne den Nucleus zu infiltrieren. Verdünnungen der Stammlösung von 1:10 bis 1:100 führten dabei zu einer Reduktion der Zellvitalität, die erst ab einer 1:300-Verdünnung keinen signifikanten Unterschied zur nanopartikelfreien Kontrollgruppe mehr aufwies. Basierend auf diesen In-vitro-Daten wurde anschließend die in vivo zu applizierende Nanopartikelmenge so gewählt, dass keine toxischen Effekte im Innenohr zu erwarten waren. Per Cochleostomie erhielten 18 Meerschweinchen Hyperverzweigte Polylysine und dieselbe Tierzahl Lipidnanokapseln in die linke Scala tympani appliziert, während die jeweilige Gegenseite derselben Tiere zur Kontrolle mit PBS behandelt wurde. Über elektrophysiologische AABR-Messungen wurden die funktionellen Auswirkungen der 105 Nanopartikelinjektion auf die Hörschwellen der Tiere dokumentiert. Mit Hilfe der Konfokalmikroskopie wurden die Verfolgbarkeit und das Infiltrationsvermögen im Innenohrgewebe untersucht, während die Aufstellung von Zytocochleogrammen der histologischen Darstellung möglicher toxischer Effekte auf die Haarzellen diente. Beide Nanopartikel konnten in allen Zelltypen des Innenohres von basal bis apikal nachgewiesen werden, wobei sie die Zellmembran, nicht aber die Kernmembran penetriert hatten. Die Auswertung der AABR-Daten ergab zwar einen signifikanten Anstieg der Hörschwellen nach zwei Tagen bei den hohen Frequenzen für beide Vektorentypen, allerdings konnte kein Unterschied zur PBS-behandelten Kontrollseite nachgewiesen werden. Nach 14 bzw. 28 Tagen sank dieser Hörschwellenanstieg wieder auf nicht signifikant erhöhte Werte bezogen auf Tag 0. Die Analyse der Zytocochleogramme ergab keinen Haarzellverlust, so dass der reversible Hörschwellenanstieg vermutlich auf die Operationsmethode und nicht auf toxische Eigenschaften der Hyperverzweigten Polylysine oder Lipidnanokapseln zurückzuführen war. Die Verteilung der Nanopartikel in der gesamten Cochlea, ihre Fähigkeit, alle Zelltypen zu penetrieren, ohne zu morphologischen oder funktionellen toxischen Erscheinungen zu führen und ihre Verfolgbarkeit im Gewebe über Fluoreszenzmarkierung sind wesentliche Grundanforderungen, die an ein neuartiges Drug-Delivery-System gestellt werden und von Hyperverzweigten Polylysinen und Lipidnanokapseln gleichermaßen erfüllt werden. Weitere Studien zum Aufnahmemechanismus der Nanopartikel in die Zellen und möglichen Oberflächenmodifikationen der Grundstruktur werden folgen, um die bislang unspezifische Verteilung in einen zielsicheren selektiven Wirkstofftransport zu spezifischen Zelltypen zu wandeln. Erst dann kann eine Wahl geeigneter Substanzen (z. B. Gene oder neurotrophe Faktoren) erfolgen, um auch einen biologischen Effekt am Wirkort zu erzielen. Studien zur Pharmakokinetik und Pharmakodynamik werden sich anschließen, so dass ein anwendungssicheres Drug-Delivery-System entwickelt werden kann, bei dem nonvirale Vektoren in Form von Nanopartikeln als innovative therapeutische Strategie für Innenohrkrankheiten genutzt werden. 106 8 Summary Melanie Wolf (2009): “3g-Nanotechnology based targeted drug-delivery using the guinea pig inner ear as a model target organ” The aim of this study was to develop multifunctional nanoparticles as nonviral vectors into the inner ear which are biodegradable, traceable in vivo and can be attached to a variety of therapeutic agents combined with a targeted drug-delivery and controlled drug release to a selective cell population in the cochlea. The first step in developing a novel drug-delivery system included the examination of the basic structures of Hyperbranched Polylysine and Lipid Nanocapsules concerning biocompatibility, traceability in the tissue and the capability to infiltrate different cells. In an initial in-vitro-study, these types of nanoparticles were cultivated with L929-fibroblasts and visualized in these cells via confocal laser scanning microscopy (CLSM). Furthermore the cellular uptake was quantitatively determined by fluorescence measurements whereas vitality tests with neutral red gave information about the cytotoxic properties of these particles. Hyperbranched Polylysine as well as Lipid Nanocapsules penetrated the cultured cells accumulating in the cytoplasm near the nucleus without entering it. Dilutions of the stock solution between 1:10 and 1:100 caused a significant reduction of cell vitality but higher dilution did not result in significant differences to the control group incubated without nanoparticles. Based upon these results the nanoparticle dilution applied in vivo was chosen to be above 1:100, in order to reduce the risk of toxic effects to the inner ear. Two groups each of 18 guinea pigs were treated either with Hyperbranched Polylysine or Lipid Nanocapsules via cochleostomy of the left scala tympani. The contralateral ears served as control and were operated and treated with PBS. Using electrophysiological measurements of the acousticallyevoked auditory brainstem response (AABR), functional effects of nanoparticle-injection on hearing thresholds were determined. CLSM was used to examine cellular infiltration and 107 nanoparticle-traceability in the inner ear tissue. Cytocochleograms documented possible toxic effects on hair cells. Both types of nanoparticles were detected in all cochlear cell types from basal to apical penetrating the cell membranes but not the nuclear membranes. AABR data analysis resulted in significantly increased hearing thresholds after two days in the high frequencies for both vectors but without statistically significant differences to the PBS-treated control ears. After 14 and 28 days the hearing thresholds decreased again to values that were not significantly different compared to day 0. Additionally, the cytocochleograms did not detect any hair cell loss so that the reversible increase of hearing threshold is probably due to the operation procedure and not due to toxic effects of Hyperbranched Polylysine or Lipid Nanocapsules. Hyperbranched Polylysine and Lipid Nanocapsules distribution in the whole cochlea, their ability to penetrate cells without causing morphological or functional toxic effects and their traceability in living tissue via fluorescence labelling comply with the basic requirements for a novel drug-delivery-system. Further research concerning nanoparticle-uptake mechanisms and surface modifications of the basic structures will follow to change unspecific distribution into a targeted selective drugdelivery to specific cell types. After that, suitable agents (genes or neurotrophic factors) can be chosen to cause a biological effect at the target location. Examinations concerning pharmacokinetics and pharmacodynamics will be added to develop a secure drug-deliverysystem using nanoparticles as nonviral vectors and innovative therapeutic strategy for inner ear diseases. 108 9 Literaturverzeichnis ABBAS, P. J. (1988): Electrophysiology of the auditory system. 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J Biomed Mater Res B Appl Biomater 87, 10-18 132 10 Anhang 10.1 Herstellung von Lösungen und Medien Medium für L929-Zellkultur / komplementiertes DMEM o Dulbecco’s modifiziertes Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/l Glukose, 3,7 g/l NaHCO3, Na-Pyruvat und stabilem Glutamin 1,028 g/l (10.2.1) o 10% Fötales Rinderserum (10.2.1) o 1% Penicillin / Streptomycin (10.2.1) Gefriermedium o 95% Fötales Rinderserum (10.2.1) o 5% Dimethylsulfoxid (10.2.1) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Zur Herstellung der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (0,14 M NaCl, 0,010 M PO4-Puffer, 0,0003 M KCl; pH 7,45) wurde auf dem Magnetrührer (10.5.1) eine Tablette PBS (10.2.1) in 500 ml Reinstwasser (10.5.1) gelöst und anschließend steril filtriert (10.1.2). Paraformaldehyd 4% (PFA) Bei der Herstellung von 4%-igem Paraformaldehyd wird ein halber Liter PBS (Herstellung s.o.) mit 20 g PFA (10.2.1) versetzt und auf dem Magnetrührer (10.5.1) auf 60°C erwärmt. Sollte die Flüssigkeit anschließend noch trüb sein, erfolgt eine Klärung mittels 1-molarer Natronlauge (10.2.1). Abschließend wird die Lösung filtriert und kühl gelagert. Triton X-100 0,1% Zur Verdünnung von Triton X-100 (10.2.1) wird 1 ml der viskösen Flüssigkeit in einem Liter PBS gelöst. 133 Neutralrot für die Vitalitätsfärbung Die Stammlösung des Neutralrots (10.2.1) beinhaltet 4 mg/ml gelöst in Reinstwasser und kann so lichtgeschützt und kühl gelagert werden. Für den Zytotoxizitätstest wird diese Stammlösung 1:50 mit dem Medium der entsprechenden Zellkultur verdünnt: in diesem Fall mit komplementiertem DMEM für L929-Zellen. Lösung I für den Neutralrottest o 6,5 ml Formaldehyd (10.2.1) o 50 ml 10% CaCl2 (100 g/l in Reinstwasser, 10.2.1) o 445 ml Reinstwasser (10.5.1) Lösung II für den Neutralrottest o 4,75 ml Essigsäure (10.2.1) o 250 ml Ethanol 95% (10.2.1) o 245 ml Reinstwasser (10.5.1) 134 10.2 Lösungen, Reagenzien und Chemikalien 10.2.1 Lösungen und Reagenzien für die In-vitro-Versuche Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium Invitrogen, GIBCOTM, Karlsruhe (DMEM) Essigsäure Merck, Darmstadt Ethanol für die Molekularbiologie Merck, Darmstadt Ethanol, vergällt 70% zur Desinfektion Medizinische Hochschule, Hannover Fötales Rinderserum (FBS) hitzeinaktiviert Biochrom AG, Berlin Formaldehyd Merck, Darmstadt Hanks' gepufferte Salzlösung (HBSS) ohne Ca2+ und Mg2+ Invitrogen, GIBCOTM, Karlsruhe Hyperverzweigte Polylysine (HP) Universität von Lausanne, Schweiz (2.y) Kalziumchlorid (CaCl2) Merck, Darmstadt Lipidnanokapseln (LNK) Universität von Angers, Frankreich (2.x) Natronlauge 10 mol/l, reinst Merck, Darmstadt Neutralrot Merck, Darmstadt t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100) Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA Paraformaldehyd (PFA) Merck, Darmstadt Penicillin (10.000 IE/ml)/ Streptomycin Biochrom AG, Berlin (10.000 µg/ml) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Tabletten Invitrogen, GIBCOTM, Karlsruhe ProLong® Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregan, USA Rhodamin Phalloidin Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Trypanblau 0,5% Biochrom AG, Berlin 135 Trypsin / EDTA-Lösung (0,05% / 0,02%) Biochrom AG, Berlin 10.2.2 Lösungen, Reagenzien und Chemikalien für die In-vivo-Versuche Hyperverzweigte Polylysine (HP) Universität von Lausanne, Schweiz (2.y) Karboxylatzement Durelon® ESPE Dental AG, Seefeld Lipidnanokapseln (LNK) Universität von Angers, Frankreich (2.x) t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100) Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA Paraformaldehyd (PFA) Merck, Darmstadt Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Tabletten Invitrogen, GIBCOTM, Karlsruhe ProLong® Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregan, USA Rhodamin Phalloidin Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Sofortklebstoff Loctite 4061 Fa. Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf 136 10.3 Pharmaka Carprofen (50 mg/ml), Rimadyl®, 20 ml Pfizer GmbH, Karlsruhe Glycopyrroniumbromid (0,2 mg/ml), Robinul®, 1 ml Riemser Arzneimittel AG, Greifswald Lactobacillen (L. fermentum, L. casei, L. plantarum, L. acidophilus, je 60 mg) und Streptococcus faecium (60 mg), Bird Bene-Bac® A. Albrecht GmbH & Co., Aulendorf Ketamin (100 mg/ml), Ketamin Gräub® A. Albrecht GmbH & Co., Aulendorf 10%, 10 ml Polyvinylpyrrolidoniod (Povidon-Iod), Braunoderm, 500 ml Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen Prilocainhydrochlorid (20 mg/ml), Xylonest® 1%, 10 ml AstraZeneca GmbH, Plankstadt Ringer Acetat Infusionslösung, 1000 ml Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen Sulfamethoxazol (200 mg) und Trimethoprim (40 mg), Cotrim Kratiopharm® Saft, 250 ml ratiopharm GmbH, Ulm Xylazin (20 mg/ml), Rompun® 2%, 20 ml Bayer Vital GmbH, Leverkusen 137 10.4 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien 10.4.1 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien für die In-vitro-Versuche Deckgläser 22 x 22 mm Menzel-Gläser, Braunschweig Gefrierröhrchen "Nalgene", 1,8 ml Nalge Co., Rochester, USA Handschuhe aus Latex SAFESKIN SATIN PLUS Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Laborglaswaren (Erlenmeyerkolben, Flaschen, Bechergläser, etc.) Omnilab, Gehrden / VWR, Darmstadt Multiwell-Zellkulturplatte 96, transparent nunc, Langenselbold Multiwell-Zellkulturplatte 96, schwarz nunc, Langenselbold Multiwell-Zellkulturplatte 48, transparent nunc, Langenselbold Objektträger Superfrost® Plus Menzel-Gläser, Braunschweig Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas Brand, Wertheim Pipetten zum Einmalgebrauch, serologisch, 2 ml, 5 ml, 10 ml Sarstedt, Nürnbrecht Pipettenspitzen, 1-10 µl, 1-200 µl, 1011000 µl TipOne, Starlab, Ahrensburg Reaktionsgefäß "Safe-Lock", 2 ml Omnilab, Gehrden Sterilfilter zum Einmalgebrauch, 0,2 µm Sartorius, Göttingen "Minisart®" Zellkulturflasche, 25 cm2 Biochrom AG, Berlin Zentrifugenröhrchen, 15 ml, konisch Biochrom AG, Berlin Zentrifugenröhrchen, 50 ml, konisch Biochrom AG, Berlin 138 10.4.2 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien für die In-vivo-Versuche Abdecktücher Barrier, 37 cm x 45 cm WDT eG, Garbsen Deckgläser 22 x 22 mm Menzel-Gläser (22x22#1), Braunschweig Einmalkanülen BD MicrolanceTM3, 23G x 11/4´´, 0,6 mm x 30 mm Becton-Dickinson, Fraga (Huesca)/Spanien Einmalkanülen Sterican®, 27G x 11/2´´, Braun, Melsungen 0,4 mm x 12 mm Einmalspritzen Omnifix®-F, Luer, steril, Braun, Melsungen 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml Einweg Skalpellklingen Nr. 11 Aesculap Produkte für die Medizin AG, pfm, Köln Gelfoam® Pfizer Pharma GmbH, Berlin Handschuhe aus Latex, SAFESKIN SATIN PLUS, Gr. M Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien Infusionsgerät “Intrafix® Primeline Comfort“ Braun, Melsungen Laborglaswaren (Erlenmeyerkolben, Bechergläser, Flaschen, etc.) Omnilab, Gehrden/ VWR, Darmstadt Mullkompressen, 5 cm x 5 cm Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG., Rengsdorf Mundschutz zum Binden WDT eG, Garbsen Nahtmaterial nicht resorbierbar, Seralon®, USP 3/0, DSS-15 Serag Wiessner, Naila Nahtmaterial resorbierbar, Vicryl® rapide, USP 3/0, RB-1 Ethicon GmbH, Norderstedt Objektträger Super Frost Plus Omnilab, Gerden ® Operationshandschuhe „sempermed supreme“, Gr. 7 Semperit Technische Produkte, Wien, Österreich Petrischalen, 60 mm x 15 mm Corning Inc., New York, USA Pipettenspitzen, 1-10 µl, 1-200 µl, 101-1000 µl TipOne, Starlab, Ahrensburg 139 Polyimidschlauch, Innendurchmesser 0,12 mm Fa. Microlumen Inc., Tampa, FL, USA Schwesternhaube, grün, mit Gummizug WDT eG, Garbsen Silikonschlauch Fluidflex, Innendurchmesser 0,3 mm, Außendurchmesser 0,7 mm Fa. LIQUID-scan GmbH & Co. KG, Überlingen Sterilfilter zum Einmalgebrauch, 0,2 µm Sartorius, Göttingen „Minisart®“ Wattestäbchen mit Holzstab, 15 cm WDT eG, Garbsen 140 10.5 Geräte 10.5.1 Geräte für die In-vitro-Versuche CO2-Inkubator MCO-20AIC ® Sanyo, Japan FluoroSkan Ascent mit Ascent Software Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen Flüssigstickstoffbehälter "euro-cyl" german-cryo, Jüchen Inkubationsbad 1002 Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel Lichtmikroskop Olympus CKX31 (invers) Olympus, Hamburg Konfokalmikroskop Leica TCS SP2 mit Leica Microsystems GmbH, Heidelberg Leica Confocal Software Kühlgefrierkombination "Typ 56134", 4 °C, -20°C Liebherr, Bieberach Magnetrührer mit Heizplatte "K-RET basic" IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen Multifuge 1s, Hereaus Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen MultiSkan Ascent® mit Ascent Software Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen Neubauer-Zählkammer Omnilab, Bremen Pinzette "Dumont Nr. 5" Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Pipette, einstellbar "pipetman" (1-10 μl, Gilson, Villers Le Bel/Frankreich 20-200 μl, 100-1000μl) Pipettierhelfer "accu-jet® pro" Brand GmbH & Co. KG, Wertheim Präzisionswaage "CP64" Sartorius, Göttingen Reinstwasseraufbereitung: Milli-Q Biocel System Gard 2 Millipore GmbH, Schwalbach Sicherheitswerkbank HeraSafe 343 Heraeus, Kendro Laboratory Products, Hanau Thermomixer compact Eppendorf AG, Hamburg 141 Tiefgefrierschrank VIP series -86°C, MDF-U71V Sanyo, Japan Vakuumpumpe "Laboport" KNF Neuberger GmbH, Freiburg 10.5.2 Geräte für die AABR-Messungen elektrostatischen Lautsprecher ES1 mit Steuereinheit Tucker-Davis Technologies (TDT), Alachua, FL, USA Mikrostimulator Basis Station RX7 Multifunktionsprozessor RX6 Niedrig-Impedanz-Headstage RA16LI, 16 Kanäle Pentusa Basis Station RX5 Sicherheitsverbindungsstecker LICONN, 1,5 mm Sigma-Delta Vorverstärker Medusa PreAmp RA16PA, 16 Kanäle Druckfeldempfängers, 0,25 Inch ACO Pacific Inc., Belmont, CA, USA Nadelelektroden, 12 mm Medtronic Xomed, Jacksonville, FL, USA Schallschutzraum, maßangefertigt Fa. industrial acoustics company GmbH, Niederkrüchten Wärmematte Hico-Aquatherm 660 mit Polyurethan Wassermatte 50 cm x 30 cm Fa. Hirtz, Köln 142 10.5.3 Operationsbesteck und Geräte für die Durchführung der Operation Haarschneidemaschine ECO-black M Tondeo Werk GmbH, Solingen Metzenbaumschere gebogen, 14,5 cm Fine Science Tools, Heidelberg Mikroliterspritze, 10 µl Fa. Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz Nadelhalter Halsey, 13 cm Aesculap, Tuttlingen Pinzette nach Adson, 1 x 2 Zähne, 12cm Fine Science Tools, Heidelberg Pinzette "Dumont Nr. 3", gerade Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Pinzette "Dumont Nr. 5", gerade Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Pinzette "Dumont Nr. 7", gebogen Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Schere chirurgisch, spitz-stumpf, gerade WDT eG, Garbsen Schere chirurgisch, spitz-stumpf, gebogen WDT eG, Garbsen Skalpellgriff Aesculap, klein WDT eG, Garbsen Sonde, gerade, spitz, 15,5 cm Fine Science Tools, Heidelberg Stativmikroskop OPMI-6-M Fa. Carl Zeiss AG, Oberkochen Wärmebett mit Badthermostat C10 Fa. Thermo Haake, Karlsruhe Zentrale Forschungswerkstätten der Medizinischen Hochschule Hannover Wundspreizer modifiziert nach Alm Fine Science Tools, Heidelberg 143 10.2.4 Geräte für die Aufarbeitung der Cochleae und Auswertung Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“ Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel Auflichtstereomikroskop „Leica MZ6“ Leica, Wetzlar Augenpinzette, anatomisch Fine Science Tools, Heidelberg Computereinheit mit folgender Software: Leica Confocal Software Leica Microsystems GmbH, Heidelberg MATLAB Software MathWorks, Natick, MA, USA HughPhonics LIM u. ANDERSON 2006 TDT Software Alachua, FL, USA Analysis® Software Soft Imaging Software GmbH, Münster Microsoft Excel® Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim Inverses Fluoreszenzmikroskop „Olympus IX81" mit motorisiertem Objekttisch und Steuerungseinheit Olympus, Hamburg Konfokalmikroskop „Leica TCS SP2“ Leica Microsystems GmbH, Heidelberg Kreisschüttler „IKA KS 130 basic“ IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen Kühlgefrierkombination „Typ 56134“, 4 °C, -20°C Liebherr, Bieberach Laborwaage „Typ 510-63“ Kern, Albstadt Magnetrührer mit Heizplatte „K-RET basic“ IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen Ohrpolypenzange, Modell Hartmann WDT eG, Garbsen Pinzette "Dumont Nr. 3", gerade Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Pinzette "Dumont Nr. 5", gerade Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Schere chirurgisch, spitz-stumpf, gerade WDT eG, Garbsen Verbandsschere nach Lister, 20 cm WDT eG, Garbsen 144 145 Danksagung Mein ganz besonderer Dank gilt an erster Stelle Herrn Prof. Dr. T. Stöver für die engagierte und freundschaftliche Betreuung meiner Doktorarbeit. Profitiert habe ich nicht nur von seiner wissenschaftlichen Erfahrung und den Herausforderungen, denen er mich manchmal gestellt hat, sondern auch von den neuen Möglichkeiten, die diese Arbeit mir geboten hat. Seine menschliche Art war mir sehr sympathisch und die Zusammenarbeit mit ihm hat mir große Freude bereitet. Herrn Prof. Dr. M. Kietzmann, meinem Doktorvater an der Tierärztlichen Hochschule Hannover, möchte ich ganz herzlich für die Übernahme der Betreuung meiner Doktorarbeit danken. Seine herzliche und unkomplizierte Art waren mir sehr angenehm. Herrn Prof. Dr. T. Lenarz, dem Leiter der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover, gilt mein besonderer Dank für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der Arbeitsmittel. Den Tierpflegern und Tierärzten des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover danke ich für die zuverlässige und liebevolle Betreuung meiner Meerschweinchen und die fachliche Unterstützung. Herrn Dr. R. Bauerfeind möchte ich für große Geduld bei der Einweisung in die Konfokale Lasermikroskopie und die kollegiale Zusammenarbeit danken. Für die freundliche Beratung bei der statistischen Auswertung danke ich Herrn Andreas Hahn aus dem Institut für Biometrie der Medizinischen Hochschule Hannover. Dem gesamten Praxisteam der Tierarztpraxis Dr. S. Drögemüller in Ditterke möchte ich für die tolle Zusammenarbeit danken und für die praktischen Erfahrungen, die ich in der Promotionszeit sammeln durfte. 146 Meinen Kollegen im dritten Stock möchte ich für die hervorragende Arbeitsatmosphäre und die kollegiale und freundschaftliche Zusammenarbeit danken. Verena danke ich für die Betreuung und Unterstützung bei den Versuchen und die angenehme Begleitung auf den zahlreichen Kongressreisen. Roger und Hubert danke ich für die Einführung in die wundersame Welt von TDT, MATLAB und HughPhonics und für die Unterstützung bei der Auswertung der Datenmengen. Henning und Athanasia möchte ich ganz herzlich für die zeitraubende und äußerst kritische Korrektur dieser Arbeit danken. Mein besonderer Dank gilt Susanne, Eve und Anke, die mir nicht nur den Arbeitsalltag versüßt haben, sondern auch nach Feierabend zur manchmal erforderlichen gemeinsamen Frustbewältigung für mich da waren. Markus danke ich von ganzem Herzen für seine Geduld, seine anhaltende Motivation und die Kraft, die er mir in den letzten Monaten gegeben hat. Schließlich danke ich ganz besonders herzlich meinen Eltern, meiner Familie und meinen Freunden, die mich stets unterstützt und motiviert haben und immer für mich da waren.
