Synthese von Arylamin-modifizierten 2`-dG
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Synthese von Arylamin-modifizierten 2’-dGPhosphoramiditen und deren Einbau in Oligonucleotide Dissertation Zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades von Nicolas Böge aus Hamburg vorgelegt dem Department Chemie der Universität Hamburg Hamburg, im Januar 2008 1. Gutachter: Prof. Dr. C. Meier 2. Gutachter: Prof. Dr. J. Thiem Datum der Disputation: 14.3.2008 Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde im Arbeitskreis von Prof. Dr. Chris Meier am Institut für Organische Chemie der Universität Hamburg in der Zeit von April 2005 bis Januar 2008 angefertigt. Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. C. Meier für die Überlassung des interessanten Themas, sowie für die Freiheiten bei der Bearbeitung. Ferner danke ich ihm für die gute Betreuung während der Arbeit, für zahlreiche Diskussionen, Anregungen und Hilfestellungen. Allen ehemaligen und aktiven Mitgliedern des Arbeitskreises gilt mein Dank für ihre Hilfsbereitschaft. Einen ganz besonderen Dank möchte ich Herrn Dipl.-Chem. Nicolas Gisch für die gemeinsamen Jahre im Labor 518, die hervorragende Zusammenarbeit, das exzellente Arbeitsklima und die stete Hilfsbereitschaft in allen Lagen aussprechen. Für die thematische Zusammenarbeit danke ich weiterhin Frau Dipl.-Chem. Maike Jacobsen, Frau Dipl.-Chem. Zita Szombati und Frau Sarah Krüger. Einen besonderen Dank gilt den zahlreichen Praktikantinnen und Praktikanten, welche im Rahmen ihres Studiums experimentelle Arbeiten für mich durchführten. Hervorzuheben sind dabei meine ehemaligen Schwerpunktpraktikanten, Frau Dipl.Chem. Zita Szombati, Frau Sarah Krüger, Frau Saskia Wolf, Frau Nathalie Lunau und Herr Marcus Schröder. Herrn Dr. V. Sinnwell, Herrn Dr. E.T.K. Haupt und ihren Mitarbeitern möchte ich für die Messung zahlreicher NMR-Spektren danken. Frau A. Meiners, Frau C. Christ und Herrn M. Preuße spreche ich meinen Dank für die zahlreichen Messungen der FAB-, ESI- und EI-Massenspektren aus. Herrn Prof. Andreas Marx und Frau Dipl.-Chem. Francesca di Pasquale, Universität Konstanz danke ich für die Durchführung der Primer-Verlängerungs-Tests, sowie für die Aufnahme von ESI-Massenspektren. Einen weiteren Dank gilt meinen Kooperationspartnern am DESY, Hamburg. Allen voran Herrn Dr. Markus Perbandt für die Unterstützung bei den Kristallisationsversuchen der Oligonucleotide. Herrn Dipl.-Chem. Nicolas Gisch und Herrn Dipl.-Chem. Bastian Reichardt danke ich weiterhin für die kritische Durchsicht dieser Arbeit. Meiner Mutter möchte ich für die finanzielle Unterstützung während meines Studiums danken. Ebenso möchte ich ihr wie auch meinen Freunden, besonders Jenny Matthiesen, für die moralische Unterstützung während der gesamten Zeit danken. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1 2. Kenntnisstand 5 2.1 Metabolismus der aromatischen Amine 5 2.1.1 Phase I 5 2.1.2 Phase II (Bildung der ultimalen Carcinogene) 6 2.2 Reaktion ultimaler Carcinogene mit der DNA 8 2.3 Mechanismus der Adduktbildung in vivo 10 2.4 Nachweis der Carcinogenität 11 2.4.1 Ames-Test 11 2.4.2 32 12 2.5 Darstellung von Arylamin-Addukten am 2‘-Desoxyguanosin 13 2.5.1 Darstellung von C8-Arylamin-Addukten 13 P-Postlabeling-Methode 2 2.5.2 Darstellung von N -Arylamin-Addukten 17 2.5.3 Darstellung von O6-Arylamin-Addukten 19 2.5.4 Darstellung von C8-N-Acetyl-Arylamin-Addukten 20 2.6 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide und deren Eigenschaften 21 2.7 Reparatur und Struktur C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 22 3. Aufgabenstellung 24 4. Resultate und Diskussion 26 4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter OligonucleotidBausteine 4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter OligonucleotidBausteine 4.2.1 26 41 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Azokupplung 42 4.2.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Substitution 45 4.2.3 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Palladium-katalysierter Kreuzkupplung 50 Inhaltsverzeichnis 4.3 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter OligonucleotidBausteine 4.3.1 72 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter OligonucleotidBausteine mittels Mitsunobu-Reaktion 4.3.2 73 6 Versuche zur Synthese O -Arylamin-modifizierter OligonucleotidBausteine mittels einer Substitutions-Reaktion 78 4.4 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 94 4.4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 100 4.4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 104 4.5 Messung der Schmelztemperaturen (Tm-Werte) 109 4.6 Messung des circularen Dichroismus 116 4.7 Restriktionsabbau mittels EcoRI 121 4.8 Primer-Verlängerungs-Untersuchungen 127 4.9 Erste Versuche zur Kristallisation von Oligonucleotiden 136 5. Zusammenfassung 141 6. Summary 146 7. Ausblick 149 8. Experimentalteil 152 8.1 Allgemeines 152 8.1.1 Lösungsmittel und Reagenzien 152 8.1.2 Chromatographie und Geräte 154 8.1.2.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 154 8.1.2.2 Präparative Säulenchromatographie 154 8.1.2.3 Zirkulare präparative Dünnschichtchromatographie 155 8.1.2.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 155 8.1.2.5 Kernresonanzspektroskopie (NMR) 156 8.1.2.6 Massenspektrometrie (MS) 156 8.1.2.7 Schmelzpunktbestimmung 157 8.1.2.8 Infrarot-Spektrometer 157 8.1.2.9 Polarimeter 157 8.1.2.10 Zentrifuge 157 8.1.2.11 UV-Spektrometer 157 8.1.2.12 Thermomixer 157 8.1.2.13 Speed-Vac-Probenkonzentrator 157 Inhaltsverzeichnis 8.1.2.14 DNA-Synthesizer 158 8.1.2.15 CD-Spektrometer 158 8.2 Oligonucleotide 158 8.2.1 Synthese von Oligonucleotiden 158 8.2.2 Entschützung und Trägerabspaltung 158 8.2.3 Reinigung der Oligonucleotide 159 8.3 Analytik der Oligonucleotide 159 8.3.1 Bestimmung der Optischen Dichte (OD260) 159 8.3.2 Präparation der Oligonucleotide für das ESI-MS 160 8.3.3 Bestimmung der Schmelztemperatur (Tm-Wert) 160 8.3.4 Messung des circularen Dichroismus 160 8.3.5 Enzymatischer Abbau der Oligonucleotide mittels des EcoRI Restriktionsenzym 160 8.4. Allgemeine Arbeitsvorschriften 161 8.5 Synthesen 167 8.6 Oligonucleotide 273 9. Gefahrstoffe 281 10. Literatur 286 11. Anhang 301 12. Persönliches 312 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen und Symbole AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift Abb. Abbildung Ac Acetyl AG Abgangsgruppe Äq. Äquivalente ber. berechnet BINAP 2,2´-Bis(diphenylphosphino)-1,1´-binaphthyl Bn Benzyl BOP Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat Bz Benzoyl CD circularer Dichroismus cod cyclooctadienyl CPE Cyanophenylethyl CPG controlled pore glass δ chemische Verschiebung d Dublett dA 2’-Desoxyadenosin dba dibenzylidenaceton DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en DC Dünnschichtchromatographie DCM Dichlormethan dC 2’-Desoxycytosin DCI 4,5-Dicyanoimidazol dG 2’-Desoxyguanosin DIAD Diisopropylazodicarboxylat DIPEA Diisopropylethylamin (Hünigs Base) DLS Dynamische Lichtstreuung DMAP 4-(Dimethylamino)-pyridin 1,2-DME 1,2-Dimethoxyethan DMF N,N-Dimethylformamid DMSO-d6 Dimethylsulfoxid (sechsfach deuteriert) Abkürzungsverzeichnis DMTr 4,4’-Dimethoxytriphenylmethyl DNA Desoxyribonucleinsäure dT 2’-Desoxythymidin DTE Dithioerithrol DTT Dithiothreithol ε molarer Extinktionskoeffizient EcoRI Escherichia Coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EI Elektronenionisation ESI Elektronensprayionisation FAB fast atom bombardment FG funktionelle Grupppe Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Form Formamidin gef. gefunden h Stunde HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure HPLC High Performance Liquid Chromatographie iBu iso-Butyryl IQ 2-Amino-3-methyl-imidazo[4,5-f]quinolin IR Infrarot J skalare Kern-Kern-Kopplungskonstante λ Wellenlänge K Kelvin Kap. Kapitel LM Lösungsmittel m Multiplett M Molar MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation MHz Megahertz MPD 2-Methyl-2,4-pentanediol MS Massenspektrometrie NBS N-Bromsuccinimid NER nucleotide excision repair Abkürzungsverzeichnis nm Nanometer NMR Nuclear Magnetic Resonance NOE Nuclear Overhauser Effect NOESY Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy p page PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PPh3 Triphenylphosphin ppm parts per million PhthNOH N-Hydroxyphthalimid rac racemisch Rf Retentionsfaktor RP reversed phase Rt Raumtemperatur s Singulett S. Seite s. siehe Sdp Siedepunkt sec Sekunden sept Septett SG Schutzgruppe Smp Schmelzpunkt t Triplett TBAF Tetrabutylammoniumfluorid TBDMS tert-Butyldimethylsilyl TEAA Triethylammoniumacetat Tf Triflat TFA Trifluoressigsäure THF Tetrahydrofuran Tm Schmelzpunkt eines DNA-Duplexes TMSN3 Trimethylsilylazid tR Retentionszeit Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan UV Ultraviolett XANTPHOS 9,9-Dimethyl-4,5-bis(diphenylphosphino)xanthene Abkürzungsverzeichnis z.B. zum Beispiel Einleitung 1. Einleitung Der menschliche Körper besteht aus vielen verschiedenen Zelltypen. Normalerweise wachsen bzw. teilen sich die Zellen, wenn dies für den Körper notwendig ist. Diese Regeneration der Zellen läuft geregelt ab und dient der Gesunderhaltung des Körpers. Erfolgen Zellteilungen, obwohl keine neuen Zellen benötigt werden, kommt es zu einer übermäßigen Gewebeneubildung. Der Überschuss an Gewebe bildet eine Geschwulst, welche man Tumor nennt. Dieser kann gutartig oder bösartig sein. Bösartiges (malignes) Gewebe bezeichnet man als Krebsgewebe. Bei Krebszellen ist das Gleichgewicht von Wachstum, Teilung und Zerstörung (Apoptose) im Zellverband außer Kraft gesetzt. Regulierende Signale werden nicht erkannt oder nicht ausgeführt, da meistens der dafür benötigte genetische Code einer Mutation unterliegt und damit defekt ist. Die Krebszellen teilen sich im Vergleich zu gesunden Zellen unkontrolliert. Sie können in das benachbarte gesunde Gewebe eindringen (infiltrierendes Wachstum) oder es zerstören (destruierendes Wachstum). Als krebserregend werden daher vor allem Einflüsse bezeichnet, die das Erbgut verändern. Die Nomenklatur der malignen Tumore unterscheidet zum Einen nach dem Ursprungsgewebe und zum Anderen nach dem Tumortyp. Hier werden epitheliale Tumore, die sich aus Ektoderm- und Entodermgewebe gebildet haben, als Karzinome bezeichnet, während mesenchymale Tumore, die aus dem Mesoderm entstehen, als Sarkome bezeichnet werden.[1] Prinzipiell kann jedes Gewebe einen Tumor entwickeln. Die drei häufigsten Tumorerkrankungen sind jedoch das Prostata-Karzinom, das Mamma-Karzinom, sowie das Bronchial-Karzinom. Das Bronchial-Karzinom weist zudem die höchste Todesrate aller Tumorerkrankungen auf. Dies begründet sich vor allem in der Tatsache, dass das Karzinom relativ spät diagnostiziert wird, so dass ein Großteil des umgebenden Gewebes schon geschädigt ist und sich meist schon Metastasen gebildet haben.[2] Metastasen entstehen, wenn sich Tumorzellen aus dem Tumor lösen und sich über das Lymphsystem und den Blutstrom verbreiten. Binden sie schließlich an Endothelzellen, so kann die Zelle von dort in das umliegende Gewebe eindringen und einen Tochtertumor bilden (s. Abb. 1, S. 2). 1 Einleitung Abb. 1 Skizze des Mechanismus der Metastasierung[3] Die direkte Folgeerscheinung des Tumorwachstums ist der Verlust von spezifischen Zell- und Gewebefunktionen, die daraus resultiert, dass der Tumor in das gesunde Gewebe hineinwächst und so die ihn umgebenden Zellstrukturen schädigt. Zudem gibt es eine weitere Folgeerscheinung, die sogenannte Tumoranämie, bei der unter anderem die Anzahl und die Lebensdauer der Erythrozyten herabgesenkt sind. Zusätzlich kommt es zu Schädigungen der Blutgefäße und damit verbunden zu Blutungen, wodurch die Erythrozytenkonzentration weiter sinkt. Eine direkte Konsequenz der Anämie ist somit eine Schwächung des Patienten, wodurch die Überlebenschance weiter abnimmt.[1, 4-6] In den meisten Ländern der Welt ist Krebs Kreislauferkrankungen die zweithäufigste Todesursache. heute [7] nach Herz- und So stieg die Anzahl der durch Krebs ausgelösten Todesfälle in den letzten Jahren auf ein Viertel. Nach Schätzungen der American Cancer Society lag die Zahl der Krebs-Neuerkrankungen beispielsweise innerhalb der USA im Jahre 2007 bei 1.44 Millionen Patienten. Im gleichen Jahr sind schätzungsweise 560.000 Personen an den Folgen von Krebs gestorben. Dabei handelt es sich um 23.1% der in den USA registrierten Todesfälle.[2] Diese Daten lassen sich auf nahezu jedes andere westliche Industrieland übertragen. Neben der Neigung an Krebs zu erkranken, welche bekanntermaßen u.a. bei Brustund Darmkrebs vererbt werden kann, können Neuerkrankungen von ionisierender Strahlung (so starb Marie Curie 1934 an durch radioaktiver Strahlung verursachter Leukämie), infektiösem biologischem Material und genetischen Determinanten herrühren. Als Hauptursache bei der Induktion von Krebs scheinen jedoch Chemikalien zu fungieren.[8] 2 Einleitung Die ersten Befunde über den Zusammenhang zwischen bestimmten Chemikalien und Krebs stammen aus dem Jahr 1761.[9] So berichtete J. Hill von einem erhöhten Auftreten von Krebs in Nasenschleimhäuten nach langjährigem Gebrauch von Schnupftabak. Berichte über aromatische Amine, die Gegenstand dieser Arbeit sind, als krebsauslösende Substanzen, wurden von L. Rehn im Jahr 1895 veröffentlicht.[10] Er beobachtete eine Zunahme von Harnblasenkarzinomen bei Arbeitern, die in der Produktion von Magenta (Fuchsin) beschäftigt waren. Rehn prägte daraufhin den Begriff „Anilin-Krebs“, da Anilin 1 (s. Abb. 2) die Ausgangsverbindung der Synthese darstellt. Diese Bezeichnung stellte sich jedoch später als falsch heraus. Vielmehr waren es die Nebenprodukte der Anilinherstellung, wie z. B. 4-Aminobiphenyl 2, die krebserzeugend waren (s. Abb. 3, S. 4). NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 O 1 2 3 4 5 6 7 Abb. 2 carcinogene aromatische Amine Außer polycyclischen Aminen wie z.B. 2-Aminofluoren 3 oder 2-Naphthylamin 4 sind für die Carcinogenese auch die monocyclischen Amine von Bedeutung, wenngleich sie im Allgemeinen eine geringere Carcinogenität aufweisen. Verbindungen dieser Art, wie z. B. Anilin 1, 4-Toluidin 5, 4-Anisidin 6 oder 4-Ethylanilin 7, werden daher als Grenzcarcinogene bezeichnet. Bei Substanzen dieser Klasse kommt die Fähigkeit der Tumorindikation nur dann zum Ausdruck, wenn eine hohe Dosierung vorliegt, die Substanz über einen langen Zeitraum verabreicht oder aber ein Comutagen zugegeben wird. 3 Einleitung Aromatische Amine sind in den Industrieländern ubiquitäre Umweltgifte. Sie werden seit Beginn des 19. Jahrhunderts vor allem zur Synthese von Azo-Farbstoffen, Pharmaka, Pestiziden oder auch Polyurethanen benötigt. Auch waren aromatische Amine bis ins 20. Jahrhundert aufgrund mangelndem Risikobewusstseins im Straßenteer enthalten. Monocyclische, aromatische Amine wurden unter anderem im Tabakrauch nachgewiesen, vor allem das 4-Aminobiphenyl 2 und zahlreiche Methyl-, Dimethyl-, und Ethylderivate des Anilin 1. Weiterhin können sie jedoch auch als Abbauprodukte, z. B. durch Reduktion von polycyclischen Nitroaromaten aus Dieselgasen und synthetischen Treibstoffen entstehen. Ebenso konnten verschiedene heterocyclische, aromatische Amine, wie z.B. 2-Amino-3-methyl-imidazo[4,5-f]quinolin (IQ) 33 (s. S. 15), in gekochtem Fisch oder Fleisch nachgewiesen werden, wo sie durch Pyrolyse von Aminosäuren wie Tryptophan entstehen können. [11,12] 4 Kenntnisstand 2. Kenntnisstand 2.1 Metabolismus der aromatischen Amine Obwohl das carcinogene Potential bei den genannten Verbindungen bisweilen sehr unterschiedlich ist, bleibt deren Wirkungsweise immer gleich. Gelangen aromatische Amine in den Körper, so setzt ein Detoxifizierungsprozess ein, der die Wasserlöslichkeit körperfremder Stoffe zum Ziel hat, um diese ausscheiden zu können. Allerdings können die aromatischen Amine auch durch enzymatische Reaktionen zu elektrophilen Aminierungsreagenzien (sogenannte ultimale Carcinogene) umgewandelt werden (s. Abb. 4, S. 7). Bei diesen Prozessen unterscheidet man zwei Phasen. In Phase I findet eine Oxidation statt, während es sich bei der Reaktion in Phase II meistens um eine Veresterung handelt. 2.1.1 Phase I Aus Arbeiten von J. W. Cramer, J. A. Miller und E. C. Miller wurde bekannt, dass diesem ersten Schritt, der Oxidation aromatischer Amine, eine Schlüsselrolle für deren Carcinogenität zukommt.[13] Das aromatische Amin 8 (bzw. die N-acetylierte Form) kann relativ unspezifisch durch verschiedene Enzymsysteme am Ring oder am Stickstoff oxidiert werden. So kann es einerseits durch eine Cytochrom-P450-vermittelte Aktivierung in der Leber zum Hydroxylamin 9 oxidiert werden. Quantenmechanische Rechnungen legen dabei einen Ein-Elektronen-Mechanismus für diesen initialisierenden Schritt des Metabolismus aromatischer Amine nahe. Dabei kann der Mechanismus sowohl über das Aminium-Kation 10 als auch über das Aminyl-Radikal 11 laufen (s. Abb. 3, S. 6).[14] 5 Kenntnisstand NH R 10 -e H N R NH R -H 8 -H R = H, Ac N R 11 N R Enz-OH 9 OH N R Abb. 3 Postulierter Ein-Elektronen-Mechanismus der N-Oxidation aromatischer Amine Andererseits kann das Arylamin 8 durch die cytosolische N-Acetyltransferase in das ausscheidbare Acetanilid 12 überführt werden.[15] Nach neueren Erkenntnissen wird auch die N-Glucuronidierung als Entgiftungsreaktion genutzt, wobei der Glucuronsäureester 13 gebildet wird, der aufgrund seiner Stabilität als Transportform gilt und ausgeschieden werden kann. Das Hydroxylamin 9 kann über das Blut in die Nieren transportiert und über den Urin ausgeschieden werden. Im Blut allerdings kann das Hydroxylamin 9 teilweise durch Hämoglobin, unter Methämoglobinbildung, zum Nitrosoderivat 14 oxidiert werden und spontan mit Glutathion (GSH) oder SH-Gruppen des Hämoglobins abreagieren.[9] 2.1.2 Phase II (Bildung der ultimalen Carcinogene) In der Harnblase kann es allerdings zu weiteren Reaktionen kommen. Das Hydroxylamin 9 kann hier wegen des geringen pH-Wertes protoniert werden und liefert unter Wasserabspaltung das hochreaktive Nitreniumion 15, welches kovalent an DNA oder andere Biomoleküle binden kann. Neben diesem nicht-enzymatischen Aktivierungsschritt gibt es je nach Spezies und Organ eine Reihe von enzymatisch katalysierten Wegen. So kann das Hydroxylamin 9 beispielsweise durch die Sulfotransferase in den Sulfatester 16 (ein ultimales Carcinogen) überführt werden, welcher dann durch Abspaltung der Sulfatgruppe ebenfalls das Nitreniumion 15 bildet.[16,17] Ein weiterer Weg, der das Nitreniumion 15 liefert, erfolgt durch Acetylierung des Hydroxylamins 9 durch die N-Acetyltransferase in der Harnblase. Hierbei entsteht 6 Kenntnisstand zunächst das N-Acyloxyarylamin 17 (ultimales Carcinogen), das dann ebenfalls nichtenzymatisch unter Acetatabspaltung zerfällt und das Nitreniumion 15 bildet.[18,19] O R N-Acetyltransferase N H N H 8 Leber 12 P450 R N N 9 OH Gluc 13 HbFe Blut N O GSH Hämoglobin 14 R Harnblase N 11 N R OH Sulfotransferase nichtenzymatisch OAc N R Ausscheidung N-Acetyltransferase OSO3 N 16 Gluc N R 15 17 R = H, Ac R DNA-Addukt Abb. 4 Metabolismus aromatischer Amine in der Entstehung von Harnblasenkrebs (Giftungsreaktionen sind rot, Entgiftungsreaktionen schwarz dargestellt) 7 Kenntnisstand 2.2 Reaktion ultimaler Carcinogene mit der DNA Das durch Metabolisierung erhaltene elektrophile Nitreniumion 15 ist in der Lage sich an die nucleophilen Stellen der DNA anzulagern und sogenannte DNA-Addukte zu bilden. Chemisch betrachtet ist der Begriff des „DNA-Addukts“ missverständlich, da es sich bei der Reaktion zwischen Carcinogen und Nucleobase nicht um eine Additionsreaktion, sondern um eine Substitutionsreaktion handelt. Da der Begriff in der biochemischen Terminologie jedoch gebräuchlich ist und auch in der Literatur Verwendung findet, soll er auch hier angewandt werden. Viele Untersuchungen in den letzten Jahren haben sich mit der Identifizierung dieser „Addukte“ beschäftigt. Dabei hat sich gezeigt, dass sowohl in vitro, als auch in vivo die Anzahl, als auch die Menge der mit den DNA-Basen gebildeten Produkte je nach Carcinogen verschieden sein können. Neben der Bildung von Addukten an der N4-Position des 2’-Desoxycytosin, an der C8- sowie N6-Position des 2’-Desoxyadenosin wurden eine Reihe von Addukten am 2’-Desoxyguanosin gefunden, welche Thema dieser Arbeit sind (s. Abb. 5, S. 9).[20] Neben den Addukten in C8-Position 18 (ca. 80% aller gefundenen Addukte) wurden von Hatcher und Swaminathan, sowie von Kadlubar die in geringerem Maße vorkommenden Addukte in N2- und in O6-Position nachgewiesen und identifiziert. Diese Nachweise wurden dabei mit Hilfe der massenspektrometrischen und 32 P-Postlabeling-Methode, sowie NMR-spektroskopischen Untersuchungen mit [21-26] 4-Aminobiphenyl 2 bzw. 2-Naphthylamin 4 durchgeführt. Eine Quantifizierung gelang dabei für das C8-Addukt des 4-Aminobiphenyl in humanen Pankreaszellen durch Vouros im Jahre 2005. Er konnte dabei die durchschnittliche Anzahl an gebildeten Addukten (60 pro 108 Nucleobasen) bei starken Rauchern mittels Kapillar-Flüssigchromatographie-Mikroelektronenspray Massenspektrometrie bestimmen.[27] Aussagen über die Quantifizierung in anderen Organen oder Zelltypen sind bislang nicht bekannt. 8 Kenntnisstand O N Aryl N H O N NH N NH2 N HO N HO N NH N O O O N NH HN Aryl HO N N N2-dG < 5 % 20 19 18 Aryl NH2 HN O N N HO O O N N N NH2 Aryl OH N2-dG ~ 5 % C8-dG ~ 80 % N O OH OH NH N HO N N H O O N NH N NH2 OH OH 6 N NH2 O OH O6-dG < 0.1 % 2 O -dG ~1 % HO N N -dG < 1 % 23 22 21 Abb. 5 Addukte des 2’-Desoxyguanosin und deren relative Häufigkeit Durch diese Addukte kann die Struktur der DNA soweit verändert werden, dass es bei der Transkription zu Mutationen und in Folge dessen zu Zellen kommt. Dies kann zum Absterben der Zelle (Apoptose) oder im ungünstigsten Fall zur Entwicklung einer Tumorzelle führen.[9] Allerdings führen diese DNA-Modifikationen nur dann zu Replikationsfehlern, sollten die zelleigenen Reparaturmechanismen die Veränderung nicht rechtzeitig erkennen und beheben, sowie die Zelle nicht mehr in der Lage sein ein Signal zu ihrer eigenen Zerstörung abzugeben. In Tierversuchen konnte unter Zuhilfenahme von 32 P-Postlabeling-Experimenten gezeigt werden, dass die unterschiedlichen DNA-Addukte der verschiedenen aromatischen Amine unterschiedlich schnell repariert werden.[28] So sind zum Beispiel N2-Addukte in vivo persistenter verglichen mit den entsprechenden C8-Addukten. Grund hierfür ist die unterschiedliche Konformation der DNA, die durch die verschiedenen Addukte entstehen kann. Welche Konformation vorliegt und damit maßgeblich die Struktur beeinflusst, hängt vom aromatischen System des Addukts ab. Während einige Aromaten sich in die Helix der DNA einfügen und keine merkliche konformative Änderung hervorrufen, begünstigen andere in unterschiedlichem Maße die Umwandlung von der 9 Kenntnisstand B-Konformation zur „stacked“ S-Konformation (z. B. C8-modifizierte Oligonucleotide des 2-Aminofluoren 6), welches eine Denaturierung der DNA zur Folge hat.[29] 2.3 Mechanismus der Adduktbildung in vivo Der Mechanismus der am häufigsten auftretenden DNA-Addukt-Gruppe, dem dG-C8Addukten, ist bislang noch nicht vollständig geklärt. Allerdings gilt es als erwiesen, dass intermediär ein Arylnitreniumion 15 gebildet wird. Die Beobachtung, dass die Reaktion vorwiegend am Guanin stattfindet, kann mit Hilfe des Redoxpotentials der Base erklärt werden, da dieses deutlich kleiner als das der anderen DNAHeterocyclen ist und somit die notwendige Elektronenabgabe erst möglich macht. Aufgrund der Tatsache, dass die C8-Position nicht die nukleophilste Stelle der Base ist und mit Alkylierungsreagenzien (z.B. Methyliodid) eine bevorzugte Reaktion an der N7-Position nachgewiesen werden konnte, schlugen F. P. Guengerich et al. einen Mechanismus vor, der diesen Umstand mit einbezieht.[30,31] Zu ähnlichen Ergebnissen kamen drei Jahre später auch M. Novak und S. A. Kennedy.[32] Die durch den elektrophilen Angriff des Arylnitreniumion 15 erzeugte positive Ladung ist demnach über die N7-, C8- und N9-Positionen delokalisiert. Nach Deprotonierung an der C8-Position liegt dann ein Ylid vor, welches in einer der Stevens-Umlagerung ähnlichen Reaktion das in vivo beobachtete C8-Addukt liefert, wobei seine Aromatizität zurückgebildet wird (s. Abb. 6). Aryl O N HN H 2N N H H N R N Aryl N 15 HO Aryl N H H N R H N H N N N R N R H N Aryl O R= OH Abb. 6 Postulierter Mechanismus der C8-Adduktbildung 10 Kenntnisstand 2.4 Nachweis der Carcinogenität Der Nachweis, ob eine Substanz carcinogen oder mutagen ist, lässt sich am zuverlässigsten in Tierversuchen an Säugetieren klären. Da diese jedoch nicht nur sehr umstritten, sondern auch teuer sind, existieren auch mehrere alternative Methoden, von denen zwei an dieser Stelle kurz erläutert werden sollen. 2.4.1 Ames-Test Der gegenwärtig wichtigste Test zur Untersuchung von Mutagenität einer Verbindung ist der nach seinem Entwickler B. N. Ames benannte Ames-Test.[33,34] Als Testobjekte werden hier mutierte Bakterienstämme von Salmonella typhimurium verwendet. Diese Stämme besitzen das Merkmal der Histidinauxotrophie; eine Mutation in den Genen für die Enzyme der Histidinbiosynthese, welche dafür sorgt, dass diese Bakterien, im Gegensatz zum Wildtyp, nicht zur Synthese des Histidin befähigt sind und deshalb in histidinfreien Kulturen nicht wachsen können. Diese Mutation kann allerdings durch eine weitere Mutation (z. B. durch chemische Substanzen) rückgängig gemacht werden. Durch diese Reversion entsteht eine Zelle, die nun wiederum eine funktionelle Basensequenz besitzt und in der Lage ist, Histidin zu synthetisieren. Es ist möglich, eine Selektion dieser Revertanten vorzunehmen, ihre quantitative Häufigkeit zu bestimmen und mit der Mutagenität der chemischen Substanz in Korrelation zu setzen. In Tabelle 1, S. 12 sind die ermittelten Werte für die in dieser Arbeit verwendeten Arylamine dargestellt. Hierbei scheint in den verwendeten Zellsystemen (TA 100; aus Salmonella typhimurium) ein Zusammenhang zwischen der Mutagenität (log Rev; je größer der Wert, desto mutagener die Substanz) und der Polarität der aromatischen Amine (log P; je größer der Wert, desto lipophiler bzw. unpolarer die Substanz) zu bestehen.[35] 11 Kenntnisstand Arylamin log Rev/nmol log P Anilin 1 4-Methoxyanilin 6 4-Methylanilin 5 3,5-Dimethylanilin 24 4-Aminobiphenyl 2 2-Aminofluoren 3 - 2.61 - 1.95 - 1.77 - 1.31 0.29 0.91 0.90 0.95 1.39 1.91 2.86 3.14 [35] Tabelle 1 Korrelation von Polarität und Mutagenität der verwendeten Arylamine Routinemäßig werden heute fünf verschiedene Bakterienstämme eingesetzt. Da diese Stämme zum Teil verschiedene Arten von Mutationen (z. B. Leseraster- oder Basenpaarmutationen) besitzen, kann mit ihrer Hilfe nicht nur das mutagene Potential einer Substanz, sondern auch Anhaltspunkte für eine Klassifizierung des Wirkmechanismus erfolgen. So gibt es erste Anzeichen für eine Basendeletion welche durch die Modifikationen aromatischer Amine ausgelöst werden könnten. Da die meisten genotoxischen Stoffe (wie z. B. die aromatischen Amine) allerdings nicht direkt, sondern erst nach Aktivierung zu reaktiven Metaboliten mit der DNA reagieren, muss diese im Säugetierorganismus stattfindende Metabolisierung im Ames-Test simuliert werden. Hierzu kann ein aus Säugetierleber gewonnenes Aktivierungssystem (S9-Mix) verwendet werden.[36] 2.4.2 32 P-Postlabeling-Methode Eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von DNA-Addukten ist das 32 P- Postlabeling. Bei dem von K. Randerath et al.[37] eingeführten Verfahren wird zunächst DNA mit der zu testenden Substanz inkubiert, wobei ebenfalls ein Aktivierungssystem hinzugegeben werden kann. Nach Aufarbeitung wird die DNA enzymatisch zu 3’-Nucleosidmonophosphaten abgebaut. Diese werden dann durch Reaktion mit γ-[32P]-Adenosintriphosphaten am C5’ phosphoryliert. Durch mehrdimensionale Dünnschichtchromatographie können die Addukte von den unveränderten 3’,5’-Nucleosiddiphosphaten abgetrennt und radiographisch untersucht werden. Voraussetzung ist jedoch das die Addukte bekannt und strukturell charakterisiert sind, um eine eindeutige Zuordnung vornehmen zu können. 12 Kenntnisstand 2.5 2.5.1 Darstellung von Arylamin-Addukten am 2’-Desoxyguanosin Darstellung von C8-Arylamin-Addukten Bei der Synthese der modifizierten C8-Addukte können grundsätzlich drei Methoden angewendet werden. Bei der 1989 von der Arbeitsgruppe Boche erstmals durchgeführten elektrophilen Arylaminierung werden zunächst Hydroxylamine gebildet, welche dann in das elektrophile Nitreniumion umgewandelt werden können. Der Nachteil dieser Methode sind jedoch die sehr geringen Ausbeuten, wie z.B. bei der Reaktion des Arylhydroxylaminesters 25 mit 2’-Desoxyguanosin zum entsprechenden C8-Addukt 26 mit 2.5% (Abb. 7).[38] O H N N O O R CHCl3/EtOH/H2O (3 : 7 : 4) dG, Et3N, 24 h, 37 °C N H N HO NH N NH2 O 2.5% OH 25 26 Abb. 7 Beispielreaktion zur elektrophilen Arylaminierung nach Boche et al 38] Durch die von E. Kriek und E. Müller bereits 1967 durchgeführte Synthese eines C8-Adduktes mittels nukleophiler Arylaminierung des geschützten Ribosederivates 27 wurde jedoch mit 23% eine bessere Ausbeute erzielt, als es über die elektrophile Arylaminierung bisher möglich war (Abb. 8).[39] O O N N NH Br N N AcO N H NH2 NH2 O 20 h, 150 °C 23% OAc OAc 27 iPrOH 3 N AcO NH N NH2 O OAc OAc 28 Abb. 8 Beispielreaktion zur nukleophilen Arylaminierung nach Kriek und Müller 13 Kenntnisstand Diese Methode ist jedoch nur auf Ribosen anwendbar, da die harschen Reaktionsbedingungen (150 °C) eine Depurinierung des 2’-Desoxynucleotids zur Folge hatten. Die Strategie der Palladium-katalysierten C-N-Bindungskupplung wurde erstmals von T. Migita et al. im Jahre 1983 veröffentlicht.[40] Diese Reaktion wurde von S. L. Buchwald et al. und J. F. Hartwig et al. weiterentwickelt und beide veröffentlichten schließlich 1995 die nach ihnen benannte Buchwald-Hartwig-Kupplung (s. Abb. 9).[41,42] R Br HNR1R2 PdCl2[P(o-Tol)3] tBuONa, Toluol, 100 °C 29 R NR1R2 30 Abb. 9 Buchwald-Hartwig-Kupplung Die ersten Reaktionen dieser Art mit Nucleosiden wurden von M. K. Lakshman et al. durchgeführt. Ihm gelang es u. a. die N6-Aryl-Addukte des 2’-Desoxyadenosin zu synthetisieren.[43] Eine Anwendung der Buchwald-Hartwig-Kupplung zur Darstellung C8-Arylamin modifizierter 2’-Desoxyguanosin-Derivate und deren anschließende Überführung in die entsprechenden Phosphoramidite gelang S. Gräsl in ihrer Dissertation im Arbeitskreis von C. Meier.[44] Ihr gelang es unter Verwendung von Silylethern als Schutzgruppe der beiden Hydroxyfunktionen, sowie der Verwendung der IsobutyrylSchutzgruppe, einer Standardschutzgruppe für die Oligonucleotidsynthese für die exocyclische Aminofunktion, mehrere dG-C8-Addukte (mit Ausbeuten von 65-75%) darzustellen und diese dann in die entsprechenden Phosphoramidite zu überführen. Bei der angewandten Buchwald-Hartwig-Kupplung war eine Schützung der O6– Funktion der Base elementar für eine erfolgreiche Einführung der ArylaminModifikation. Als Schutzgruppe etablierte S. Gräsl die Benzylschutzgruppe, da sie nach der Kupplungsreaktion unter milden Bedingungen wieder abgespalten werden konnte (s. Abb. 10, S. 15). 14 Kenntnisstand 5 NH2 O N N Br N O N H N TBDMSO O K3PO4, rac-BINAP, Pd2(dba)3, 1,2-Dimethoxyethan N N H N N TBDMSO 50 h, 80 °C O N O N H O 75% OTBDMS OTBDMS 31 32 Abb. 10 Synthese des dG-C8-Adduktes des 4-Toluidin 5 Nachteil der verwendeten iso-Butyryl-Schutzgruppe ist jedoch die langwierige, vollständige Abspaltung, die in konzentrierter Ammoniaklösung bei 55 °C erst nach mindestens 8 Stunden zu beobachten war. Des Weiteren war die Synthesesequenz nicht universell anwendbar, so scheiterte z.B. die Überführung des C8-2Aminofluorenyl-modifizierten 2’-Desoxyguanosin-Derivates in das entsprechende Phosphoramidit. Dennoch konnte S. Gräsl den Einbau der modifizierten Phosphoramidite in Oligonucleotide in ihrer Dissertation zeigen. Während der Durchführung der vorliegenden Arbeit veröffentlichten Rizzo et al. eine Modifizierung der Syntheseroute zur Herstellung der C8-Addukte von heteroaromatischen Aminen, wie 2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinolin (IQ) 33.[45] Hierbei gelang es ihnen nach kompletter Entschützung des Adduktes mit Formamidin als Schutzgruppe für die exocyclische Aminofunktion eine sehr labile Gruppe einzuführen (s. Abb. 11). NH2 N N OBn N N Br N N O Si NH2 N N 33 1.) Pd2(dba)3, BINAP 2.) H2, Pd/C 3.) TBAF 4.) Me2NCH(OMe)2 N N HN N 5.) DMTr-Cl 6.) NC(CH2)2OP[N(iPr)2]2 O OBn N N DMTrO N N NMe2 O O Si O O 34 NC O P N(iPr)2 35 Abb. 11 Synthesesequenz zur Herstellung des C8-modifizierten Phosphoramidits 35 des IQ 33 nach Rizzo [45] 15 Kenntnisstand Probleme traten jedoch im Weiteren auf, da die entsprechenden Phosphoramidite, welche als Grundbaustein zur Oligonucleotidsynthese dienen, in den standardmäßig verwendeten Lösungsmitteln nicht löslich waren und deshalb eine präparativ schwierige Oligonucleotidsynthese zur Folge hatten. Ebenfalls konnte nicht gezeigt werden, ob diese Syntheseroute auch auf einfache aromatische Amine anwendbar ist. Einen anderen Weg zur Darstellung C8-Arylamin-modifizierter 2’-DesoxyguanosinDerivate mittels der Buchwald-Hartwig-Kupplung beschritt Takamura-Enya. Nach der Überführung von geschütztem 2’-Desoxyguanosin 36 in das entsprechende C8Amino-Derivat 37 folgte eine Buchwald-Hartwig-Reaktion mit polycyclischen Arylbromiden (s. Abb. 12).[46,47] OBn OBn N N Br N AcO N DMTr N H 1) TMSN3, TBAF, CH3CN 2) NaBH4, MeOH/THF 3) NaOMe 4) TBDMSCl, Imidazol, DMF O N N H2N N N TBDMSO N H DMTr O OTBDMS OAc 36 37 OBn N Br N HN 38 N TBDMSO Pd2(dba)3, XANTPHOS, KO-t-Bu Ausbeute: 75% N N H DMTr O OTBDMS 39 Abb.12 Synthesesequenz nach Takamura-Enya[46,47] Zwar gelang bei diesem Syntheseweg auch die Kupplung mit polycyclischen Arylaminen, jedoch konnte keine Verkürzung der Syntheseschritte oder eine deutliche Steigerung der Syntheseausbeuten erreicht werden. 16 Kenntnisstand 2.5.2 Darstellung von N2-Arylamin-Addukten F. De Riccardis, R. R. Bonala und F. Johnson widmeten sich der Synthese von N2Alkyl-substituierten-2’-dG-Derivaten. Der Schlüssel für diese erfolgreiche Synthese war auch hier die Palladium-katalysierte Buchwald-Hartwig-Kupplung zwischen einem TBDMS-geschützten 2´-dG 40 und einem o-Nitroaryltriflat oder –bromid 41 in Anwesenheit von racemischem BINAP und einer stöchiometrischen Menge einer milden Base, z.B. Cäsiumcarbonat (s. Abb. 13).[48] O N O O2N N N N TBDMSO O2N N N + NH2 N R O N H N TBDMSO O 41 OTBDMS OTBDMS R= OTf, Br 42 40 O O H2N N N N N TBDMSO O N H N N TBDMSO N N Ac HN N H O OTBDMS OTBDMS 43 44 Abb. 13 Synthese der N2-Aryl-2´-dG-Derivate[48] Bei der Umsetzung mit dem geschützten 2´-dG-Derivat 40 konnte unabhängig von den verwendeten aromatischen Donoren stets eine Ausbeute von > 86% beobachtet werden. Die Produkte 42 konnten jeweils durch Flash-Chromatographie leicht gereinigt werden. Eine anschließende Reduktion der Nitro-Funktion lieferte die N2-Alkyl-substituierten-2’-dG-Addukte 43, welche auch in die entsprechenden N-acetylierten Formen 44 überführt werden konnten. Die anschließende Entfernung der TBDMS-Schutzgruppen erfolgte mit TBAF in THF, jedoch wurde von keiner 17 Kenntnisstand Überführung in die entsprechenden Phosphoramidite und deren Einbau in Oligonucleotide berichtet. Neuere Versuche von G. Boche et al. zeigten die Darstellung von N-2´-dG-4aminobiphenyl-3´-phosphaten, welche synthetisiert und vollständig durch 1H-NMR und Massenspektrometrie charakterisiert wurden, um als Standard für die 32 P-Postlabeling-Methode zu dienen. Allerdings erfolgte auch hier keine Synthese der entsprechenden Phosphoramidite (s. Abb. 14).[49] O N N TBDMSO O N NH N N NH2 O TBDMSO N O 1. DEAD, PPh3, Allylalkohol, THF, Rt, 1 h 2. tBuONO, Rt, 5 min 3. Tf2O, Et3N, DMAP, Rt, 0.5 h O O P O O N O O O S CF3 O O P O O 10% 46 45 H N NH2 47 1. DMF, Rt, 3 h 2. (Et2NH2)2CO3, Pd(PPh3)4, CHCl3, Rt, 0.5 h 3. TBAF, THF, Rt, 1 h 4. Pd/C, H2, MeOH, Rt, 1 h O N N HO NH N N H H N O 9% O O P O O 48 Abb. 14 Synthese von N-2´-dG-4-aminobiphenyl-3´-phosphat 47 nach der Vorschrift von G. Boche [49] Ausgehend von einem bereits 5´-TBDMS-geschützten 2´-dG-phosphat 45 erfolgte zuerst mit Hilfe einer Mitsunobu-artigen Reaktion die Allylschützung in O6-Position und die anschließende Umsetzung zum Triflat-Derivat 46. An dieser Stelle erfolgte die Umsetzung mit 4-Hydrazinobiphenyl. Nach Entschützung der Phosphatgruppe, Entfernung der TBDMS-Gruppen mit Hilfe von TBAF und der Entschützung der O6-Position mittels Hydrogenolyse konnte das N-2´-dG-4-aminobiphenyl-3´-phosphat 48 erhalten werden. Auch hier wurde wiederum nicht über die Überführung in die entsprechenden Phosphoramidite 18 Kenntnisstand berichtet, so dass bislang keine Methode zur Darstellung von N2-Addukten und deren Phosphoramidite bekannt ist. Darstellung von O6-Arylamin-Addukten 2.5.3 Im Jahr 1978 gelangen F. F. Kadlubar, J. A. Miller und E. C. Miller neben dem Nachweis auch erste Erfolge in der Synthese von O6-Arylamin-Addukten.[22] Damals fanden sie heraus, dass N-Hydroxy-1-naphthylamin 49 mit Nucleinsäuren bei einem pH-Wert von 5 unter Bildung von kovalent gebundenen Derivaten reagierte. Es konnten dabei jedoch keine Aussagen über die Art der Bindung noch die Ausbeute gemacht werden. Erst die nach Zugabe des Hydroxylamin 49 durchgeführte enzymatische Hydrolyse der DNA führte unter sauren Bedingungen zu zwei O6-Arylamin-Addukten (neben den bereist zuvor identifizierten C8 und N2Addukten), dem N-dG-O6-1-naphthylamin 50 als Hauptprodukt (s. Abb. 15) und dem 2-dG-O6-1-naphthylamin 51. Beide Produkte konnten mittels HPLC getrennt und mittels NMR-Spektroskopie eindeutig charakterisiert werden.[22] HN OH O 1) DNA 2) DNase, Phosphatase, Phosphodiesterase pH 5, 37 °C, 6 h N N HO NH2 NH O N N N NH2 N HO O 49 OH N N NH2 O 50 OH 51 Abb. 15 Reaktion von N-Hydroxyl-1-naphtylamin mit DNA[22] In Anbetracht der Selektivität des Hydroxylamins gegenüber Makromolekülen und der Tatsache, dass die Geschwindigkeit dieser Reaktion von der Konzentration der DNA und des N-Hydoxylarylamins abhängig ist, konnte ein Reaktionsmechanismus postuliert werden, welcher die Bildung eines 1-Naphthyl-Nitrenium-Ions als Schlüsselschritt der Reaktion beinhaltet und welcher durch Solvolyse-Reaktionen mit H218O bestätigt werden konnte. Diese Erkenntnisse wurden in der Folgezeit 19 Kenntnisstand allerdings nicht weiter verfolgt, um zu einer geeigneten Syntheseroute zur Darstellung O6-Arylamin-modifizierten 2’dG-Phosphoramiditen zu gelangen. 2.5.4 Darstellung von C8-N-Acetyl-Arylamin-Addukten Neben den Arylaminen haben auch die entsprechenden N-Acetyl-Derivate eine große Bedeutung für die chemische Carcinogenese. Die ersten erfolgreichen Synthesen dieser Addukte wurden von Zhou und Romano beschrieben. Mittels elektrophiler Arylaminierung konnten sie das C8-Addukt des N-Acetyl-2- aminofluorens darstellen. Problematisch war jedoch die geringe Ausbeute der Kupplung (ca. 2.5 %). [50,51] Die bislang einzige effektive Synthese solcher Addukte wurde 2002 von Schärer beschrieben (s. Abb. 16).[52,53] OBn O N N NH N N HO N Br 4 Stufen N NH2 N H N TBDMSO DMTr O O OTBDMS OH 52 53 O OBn Kreuzkupplung Aryl HN N N TBDMSO N N Aryl N 7 Stufen N H DMTr NH N O DMTrO N N NHiPr-PAc O O OTBDMS NC 54 O O P N 55 Gesamtausbeute: 6% Abb. 16 Darstellung C8-N-Acetyl-Arylamin-modifizierter 2’-dG-Phosphoramidite nach Schärer[52,53] Ausgehend vom 2’-Desoxyguanosin 52 wurde zunächst in vier Stufen ein geschützter, bromierter Baustein 53 synthetisiert, welcher anschließend mit dem Arylamin mittels der schon beschriebenen Buchwald-Hartwig-Reaktion zum 20 Kenntnisstand entsprechenden Addukt 54 gekuppelt werden konnte. Nach anschließender Acetylierung und Abspaltung der Schutzgruppen (O6-Benzyl, NH2-DMTr und OHTBDMS) konnte das geschützte Phosphoramidit 55 über insgesamt 12 Stufen mit einer Gesamtausbeute von 6% hergestellt werden. Die Synthese solcher N-acetylierten C8-Addukte ohne die Verwendung einer Kreuzkupplungsreaktion und der damit verbundenen aufwändigen Schutzgruppenstrategie bzw. die direkte Kupplung von Acetaniliden sind bislang nicht bekannt. 2.6 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide und deren Eigenschaften Die ersten synthetisierten C8-modifizierten Oligonucleotidbausteine und deren Einbau wurden von Zhou und Romano beschrieben. Ihnen gelang es, mittels elektrophiler Arylaminierung 2-Aminofluorens einzubauen. [50,51] 3 und die Phosphoramidite des der N-Acetyl-2-aminofluorens dG-C8-Addukte darzustellen des und Probleme waren neben der geringen Ausbeute der Kupplung, die Verwendung der Fmoc-Funktion (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) als Schutzgruppe für die exocyclische Aminofunktion, da die entsprechenden unmodifizierten Phosphoramidite nicht kommerziell erhältlich sind. Nach der erfolgreichen Synthese C8-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite konnte S. Gräsl in ihren Arbeiten auch deren Einbau in verschiedene Oligonucleotide zeigen. Ihr gelang es, neben drei Grenzcarcinogen-C8-modifizierten 2’-dGPhosphoramiditen, auch das C8-Biphenyl-modifizierte 2’-dG-Phosphoramidit einzubauen. Nach anschließender Reinigung mittels HPLC konnte sie erste Untersuchungen hinsichtlich der Eigenschaften solcher modifizierten Oligonucleotide durchführen. Es konnte beobachtet werden, dass die Modifikation eine Verringerung des Schmelzpunktes (Tm-Wert) zur Folge hatte, jedoch keinerlei Einfluss auf die Konformation des Doppelstranges zu haben schien. Auch in ersten biologischen Untersuchen, Primer-Verlängerungs-Untersuchungen, konnte kein Unterschied in den Eigenschaften zwischen den Grenzcarcinogen- und dem Biphenyl-modifizierten Oligonucleotiden festgestellt werden.[44] Während der Durchführung dieser Arbeit gelang Rizzo der Einbau des C8-IQmodifizierten 2’-dG-Phosphoramidits. Er untersuchte die Eigenschaften eines 21 Kenntnisstand solchen modifizierten Oligonucleotids im Vergleich zu einem 2’-dG-C8-N-Acetyl-2aminofluorenyl-modifizierten Oligonucleotids (Sequenz: 5'-d(CTCGGCGCCATC) 56) und konnte zeigen, dass der Einfluss auf den Tm-Wert im Fall des 2’-dG-C8-IQmodifizierten Doppelstranges geringer ist. Jedoch konnte er keine konformativen Unterschiede beider modifizierter Oligonucleotide feststellen.[45] In Folgearbeiten berichtet Rizzo von dem Einbau eines N2-IQ-2’-dG-modifizierten Phosphoramidites des Typs 22 (s. Abb. 6, S. 9). Vergleichende Polymerase-Experimente zu dem 2’-dGC8-IQ-modifizierten Oligonucleotiden wurden beschrieben und legten nahe, dass der Effekt bei der Replikation IQ-modifizierter Oligonucleotide (abhängig von der Sequenz) sowie von der Art (C8 oder N2) der Modifikation sei.[54,55] Hierbei scheinen die C8-Addukte zu einer Basendeletion zu führen, während die N2-Addukte zu einem Abbruch der Replikation führen. Ähnliche Untersuchungen, allerdings nur mit 2’-dGC8-N-Acetyl-2-aminofluorenyl-modifizierten Oligonucleotiden, wurden 2005 von Romano durchgeführt.[56] Auch hier war eine Zwei-Basen-Deletion zu beobachten. Da weitere Untersuchungen, insbesondere im Hinblick auf die Ursachen der unterschiedlichen Carcinogenität mono- und polycyclischer aromatischen Amine nicht bekannt sind, ist es das Bestreben dieser Arbeit, zu weiteren Erkenntnissen auf diesem Gebiet zu gelangen. 2.7 Reparatur und Struktur C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide Die bisherigen Untersuchungen zur Reparatur der DNA-Schäden, welche durch aromatische Amine verursacht werden, legen nahe, dass die Struktur eine entscheidende Rolle spielt. So scheinen Addukte aromatischer Amine schlechte Substrate für die NER (nucleotide excision repair) zu sein, die eine Struktur aufweisen, in der der aromatische Ring in der major oder minor groove liegt (z.B. bei 2-Aminofluoren 6). Andererseits sind Addukte, bei denen das aromatische System innerhalb der DNA liegt, gute Substrate.[57] Detaillierte Versuche zur Reparatur von Benzo[α]pyren- und Benzo[α]phenanthren-Addukten ließen erkennen, dass bei der Reparatur verschiedene Parameter wie z.B. die Störung der Basenpaarung, die Entwindung, die Krümmung und die Flexibilität der DNA eine Rolle zu spielen scheinen.[58-60] Experimentelle Untersuchungen zur Reparatur von Addukten, welche durch aromatische Amine gebildet werden, sind bislang nur für polycyclische 22 Kenntnisstand Arylamine wie 4-Aminobiphenyl 5 und 2-Aminofluoren 6, sowie deren N-acetylierte Formen bekannt. Diese legen nahe, dass eine mögliche syn-Konformation der modifizierten Guanin-Base (Drehung der glycosidischen Bindung um 180°) die Fähigkeit der DNA-Polymerase über das Addukt hinweg zu transkribieren verringern oder gar ganz verhindern könnte. Weiterhin sei die Art (die Struktur) des aromatischen Systems verantwortlich für die Stabilität der Addukte gegenüber Reparaturmechanismen. So scheint eine planare aromatische Struktur (wie beim 2Aminofluoren 6) persistenter in den untersuchten Zelllinien zu sein.[61-63] Um genauere Aussagen über den räumlichen Einfluss der Modifikation machen zu können wurden bislang jedoch nur wenige Strukturuntersuchungen vorgenommen. 1998 veröffentlichten Broyde et al. computergestützte Rechnungen (minimized potential energy calculations), in denen sie zeigen konnten, dass für ein C8-Anilin modifiziertes Oligonucleotid die B-Konformation mit dem Amin in der major groove begünstigt zu sein scheint. Im Gegensatz dazu seien beim C8-2-Aminofluoren modifizierten Oligonucleotid auch anderen Konformationen (z.B. die syn- Konformation) möglich.[64] Ein Beweis für die Existenz einer solchen syn-Konformation bei C8-2-Aminofluorenmodifizierten Oligonucleotiden lieferte Beland et al. Sie konnten mittels NMRSpektroskopie zwei Konformationen nachweisen. Zum Einen eine Konformation, in der der 2-Aminofluorenyl-Rest in der major groove (anti-Konformation des Nucleosids) und zum Anderen in den DNA-Dublex interkalierend.[65] Im Falle des 4-Aminobiphenyl konnten sie zeigen, dass eine solche zweite Konformation immerhin zu 5-10% vorhanden ist.[66] Weitere Strukturaufklärungen, auch mit monocyclischen Arylamin-Addukten, sowie kristallographische Untersuchungen sind bislang nicht bekannt. Da hierüber jedoch möglicherweise eine Differenzierung von poly- und monocyclischen Arylaminen im Hinblick auf ihren Einfluss auf die Struktur von Oligonucleotid-Duplexen erfolgen könnte, ist dieses ein Fernziel, für welches im Rahmen dieser Arbeit erste Grundlagen geschaffen werden sollen. 23 Aufgabenstellung 3. Aufgabenstellung Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Unterschied in der Mutagenität/Carcinogenität von mono- bzw. polycyclischen aromatischen Aminen untersucht werden. Die Bearbeitung dieses Gebietes gestaltete sich dabei in drei Themenkomplexen: Zum Einen sollte zunächst die von S. Gräsl entwickelte Syntheseroute für die C8Arylamin-modifizierten-2’-dG Phosphoramidite optimiert werden. Hauptaugenmerk lag dabei auf der Einführung einer labilen Schutzgruppe für die exocyclische Aminofunktion, um eine Abspaltung nach der Oligonucleotidsynthese unter basischen Bedingungen zu verkürzen und damit die Ausbeute an modifiziertem Oligonucleotid zu steigern. Außerdem sollte die Syntheseroute eine Allgemeingültigkeit besitzen und auch auf aromatische Amine wie 2-Aminofluoren 3 anwendbar sein. Dies war bislang nicht möglich. Ein zweites Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von geeigneten Syntheserouten zur Darstellung weiterer in vivo gefundener Adduktformen am 2’-Desoxyguanosin. Dabei sollte neben der Synthese der O6-Addukte des Typs 21 (s. S. 9) vor allem die Synthese der beiden bislang noch nicht chemisch dargestellten N2-Addukte 19 und 20 (s. S. 9) im Vordergrund stehen. Nach erfolgreicher Darstellung der Addukte sollten diese mit einer geeigneten Schutzgruppenstrategie in die entsprechenden modifizierten Phosphoramidite überführt werden und neben den C8-Arylaminmodifizierten-2’-dG Phosphoramiditen als Bausteine für die Oligonucleotidsynthese zur Verfügung stehen. Die Phosphoramidite sollten dann in Oligonucleotide gezielt eingebaut werden. Hierbei sollten drei verschiedene Sequenzen einen Einblick in die Eigenschaften solcher modifizierten Oligonucleotide geben (s. Abb. 17). 5'-d(CTCGGCGCCATC) 5'-d(GTAGAATTCTAC) 56 57 5'-d(AAATGAACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 58 Abb. 17 Im Rahmen dieser Arbeit synthetisierte Oligonucleotid-Sequenzen Für alle Sequenzen sollten Untersuchungen hinsichtlich der thermischen Stabilität (Tm-Wert) und der Konformation des Doppelstranges (Circular Dichroismus) 24 Aufgabenstellung vorgenommen werden. Außerdem sollte für die selbstkomplementäre Sequenz 57 ein Restriktionsverdau mittels EcoRI etabliert werden und den Einfluss der Modifikation auf die Halbwertszeit untersucht werden. Um eine mögliche Erklärung der unterschiedlichen Mutagenität/Cancerogenität von mono- bzw. polycyclischen aromatischen Aminen geben zu können sollten weitere biochemische Untersuchungen mit der Sequenz 58 durchgeführt werden. So sollte der Einfluss der verschiedenen Arylamin-Modifikationen bei der Replikation mittels Primer-Verlängerungs-Experimenten in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. A. Marx, Universität Konstanz untersucht werden. Abschließend sollten, um Aussagen über den Einfluss der Modifikation auf die Struktur des DNADoppelstranges machen zu können, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. C. Betzel, Universität Hamburg und dem in Hamburg ansässigen DESY erste Versuche zur Kristallisation solcher modifizierten Oligonucleotide durchgeführt werden. 25 Resultate und Diskussion 4. 4.1 Die Resultate und Diskussion Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine Darstellung der C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotidbausteine sollte ausgehend vom 2’-Desoxyguanosin 52 erfolgen. O Aryl HN N O Aryl HN NH N N N DMTrO N(Me)2 O O P NH N N HO O NC N N N(Me)2 O OH 59 60 N(iPr)2 OBn Aryl HN N N TBDMSO O Aryl HN N NH2 N N NH N N HO O NH2 O OTBDMS OH 62 61 OBn N N N N Br TBDMSO O N O NH2 NH N N HO NH2 O OTBDMS OH 63 52 Abb. 18 Retrosynthese der Darstellung C8-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite 59 26 Resultate und Diskussion Der entscheidende Schritt bei der gewählten Syntheseroute ist dabei die Einführung der Modifikation in die C8-Position des Guanosins 63 (s. Abb. 18, S. 26). Diese C-N-Bindungsknüpfung sollte mittels einer Buchwald-Hartwig-Kupplung erfolgen. Die für diese Kupplung notwendigen Schutzgruppen sollten dafür zunächst eingeführt werden. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass eine Schützung der exocyclischen Aminofunktion bei der Kreuzkupplung nicht notwendig ist.[67] Nach der C8-Modifizierung sollten dann die Schutzgruppen abgespalten, die Einführung der basenlabilen NH2-Schutzgruppe (Formamidin), sowie die für die Oligonucleotid-Festphasensynthese notwendige 5‘-OH-Schutzgruppe (DMTr), erfolgen und abschließend die Phosphoramiditfunktion 59 generiert werden. Zur Anwendung der Buchwald-Hartwig-Reaktion war die Synthese eines allgemeinen Bausteins 63 notwendig. Hierbei war besonders wichtig, dass die verwendeten Schutzgruppen nicht nur den Bedingungen der Kupplungsreaktion standhalten (80 °C und schwach basische Reaktionsbedingungen), sondern auch unter möglichst milden Bedingungen nach der Kupplung abzuspalten waren. Aufgrund dieser Voraussetzungen und bereits von S. Gräsl in vergangenen Arbeiten durchgeführten Synthesen kamen für die beiden Hydroxylgruppen eine Schützung mit tertButyldimethylsilylchlorid als entsprechende Silylether in Frage.[44] Für die zwingend notwendige Schützung des Amids des Guanosins als Azaenolether sollte die Benzylgruppe dienen, da diese sich mittels Hydrogenolyse mild abspalten lässt. Zunächst musste 2’-Desoxyguanosin 52 an der C8-Position bromiert werden. Die Reaktion wurde nach P. M. Gannet und T. P. Sura durchgeführt (s. Abb. 19).[68] O O N N HO N NH2 52 NH Br NBS, H2O Rt, 15 min. O OH N NH 79% N HO N NH2 O OH 64 Abb. 19 Synthese von 8-Brom-2’-desoxyguanosin (8-Br-dG) 64 27 Resultate und Diskussion Hierbei wurden feingepulvertes 2’-Desoxyguanosin 52 und N-Bromsuccinimid vorgelegt, mit Wasser versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt konnte nach anschließender Filtration ohne Reinigung in einer Ausbeute von 79% isoliert werden. Allerdings war diese Reaktion nicht auf Mengen über 500 mg 2’-Desoxyguanosin 52 übertragbar, da es dabei zu einer Spaltung der glycosidischen Bindung kam. Größere Mengen 8-Br-dG 64 waren nur durch Parallelansätze zugänglich, die dann vereinigt werden konnten. Der nächste Syntheseschritt bestand darin, die tert-Butyldimethylsilylgruppen an der 3‘- und 5‘-Hydroxylfunktion einzuführen (s. Abb. 20). O O N NH Br N NH2 N HO O N TBDMSCl, Imidazol, Pyridin N 64 NH2 N TBDMSO O Rt, 1 h OH NH Br OTBDMS 74% 65 Abb. 20 Synthese von 8-Brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 65 Die Synthese wurde analog zu P. B. Hopkins et al. durchgeführt.[69] Zunächst wurden Imidazol und tert-Butyldimethylsilylchlorid in Pyridin gelöst vorgelegt und anschließend mit 8-Br-dG 64 versetzt. Nach Aufarbeitung und Reinigung wurde das Produkt in 74% Ausbeute erhalten. Anschließend erfolgte die Überführung der Amidfunktion in einen Azaenolether ebenfalls analog zu Hopkins et al., wobei die Benzylgruppe mittels einer Mitsunobuartigen Reaktion mit Benzylalkohol eingeführt werden konnte (s. Abb. 21).[70] O N NH Br N TBDMSO N O OTBDMS OBn NH2 Benzylalkohol, PPh3, DIAD, 1,4-Dioxan 0 °C -> Rt, 1 h 65 57% N N Br N TBDMSO N NH2 O OTBDMS 63 Abb. 21 Synthese von O6-Benzyl-8-brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63 28 Resultate und Diskussion Bei der Reaktion wurden 8-Brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 65 und Triphenylphosphin in 1,4-Dioxan mit Benzylalkohol und Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur und abschließender Aufarbeitung konnte das Produkt und damit der Ausgangsstoff für die Buchwald-Hartwig-Kupplung mit einer Ausbeute von 57% isoliert werden. Mit dieser Ausgangsverbindung 63 konnte nun die Buchwald-Hartwig-Reaktion durchgeführt werden (s. Abb. 22). OBn N N Br N N TBDMSO NH2 O OTBDMS OBn Pd2(dba)3, rac-BINAP, K3PO4, Aryl-NH2, 1,2-DME 80 °C, 55-84 h 63 Aryl HN N N TBDMSO N N NH2 O 55-91% OTBDMS 66-72 Abb. 22 Einführung der C8-Arylamin-Modifikationen zu den Produkten 66-72 Der Palladium-Katalysator, rac-BINAP und Kaliumphosphat wurden unter Stickstoff eingewogen und anschließend mit O6-Benzyl-8-brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)2’-desoxyguanosin 63, absolutem 1,2-Dimethoxyethan (1,2-DME) und dem entsprechenden Arylamin versetzt. Die Reaktionsmischungen wurden für 55-84 h bei 80 °C gerührt. Die Produkte 66-72 konnten nach Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung in einer Ausbeute von 55-91% isoliert werden (s. Tab. 2). Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute 66 Phenyl 70 h 64% 67 4-Methoxyphenyl 70 h 62% 68 4-Methylphenyl 70 h 75% 69 4-Cyanophenyl 84 h 55% 70 3,5-Dimethylphenyl 72 h 66% 71 4-Biphenyl 55 h 65% 72 2-Fluorenyl 78 h 91% Tab. 2 Zusammenfassung aller Adduktsynthesen zu den Produkten 66-72 29 Resultate und Diskussion Eine Ausbeutesteigerung durch eine Vorreaktion des Katalysators mit dem Liganden konnte nicht beobachtet werden. Der Mechanismus dieser Kupplungsreaktion ist noch nicht vollständig geklärt, wurde aber von S. L. Buchwald et al. postuliert und konnte auf die hier durchgeführte Arylaminierung der C8-Position übertragen werden (s. Abb. 23).[71] Pd2(dba)3 + BINAP OBn Ar N N HN N N NH2 TBDMSO O V OTBDMS (BINAP)Pd(dba) OBn N N Br N N NH2 TBDMSO O (BINAP)Pd(0) OTBDMS Ar OBn NH N (+II) N P Pd N N NH2 P TBDMSO O (+II)Br P Pd P TBDMSO OBn N N N N NH2 O OTBDMS IV OTBDMS K2HPO4 + KBr II Ar-NH2 Ar K3PO4 I + OBn NH2 - N N Pd N N NH2 P Br TBDMSO O P OTBDMS III Abb. 23 Postulierter Mechanismus der Buchwald-Hartwig-Reaktion Die Pd-katalysierte Arylaminierung verläuft wahrscheinlich über die oxidative Addition des Arylbromids I an die Pd0-Spezies (BINAP)Pd0, welches sich aus Pd2(dba)3 (TrisDibenzylidenacetondipalladium) und rac-BINAP bildet. Das entstehende Pd2+Intermediat II bildet durch die Koordination des verwendeten Arylamin die trigonalbipyramidale Verbindung III. Durch Deprotonierung mit der zugesetzten Base 30 Resultate und Diskussion entsteht die Verbindung IV, die durch reduktive Eliminierung neben dem gewünschten Arylaminaddukt V den Pd0-Katalysator zurückbildet. Um nun, ausgehend von den vollgeschützten Addukten 66-72, die Synthese der Oligonucleotidbausteine vorzunehmen, mussten zunächst die Benzylgruppe sowie die Hydroxylschutzgruppen abgespalten, die exocyclische Aminofunktion mit einer basenlabilen Schutzgruppe, sowie die 5’-O-Position mit der Dimethoxytritylfunktion (DMTr) geschützt und abschließend die Reaktion zu den entsprechenden Phosphoramiditen durchgeführt werden. Die zunächst durchgeführte Debenzylierung wurde durch Lösen des entsprechenden C8-Adduktes in Methanol und Zugabe von Palladium auf Aktivkohle bei anschließendem Rühren unter einer Wasserstoff-Atmosphäre erreicht (s. Abb. 24). OBn N Aryl HN O Aryl HN N N N TBDMSO NH2 Pd/C, H2, MeOH Rt, 4-48 h O OTBDMS 66-72 N N TBDMSO NH N NH2 O OTBDMS 78-96% 73-79 Abb. 24 Debenzylierung der C8-Arylamin-Addukte 66-72 Die entsprechenden Produkte 73-79 konnten dabei nach Reaktionszeiten von 4-48 h in zufriedenstellenden Ausbeuten von 78-96% durch mehrmaliges Zentrifugieren und Waschen des Katalysators mit Methanol ohne weitere Aufarbeitung in reiner Form erhalten werden (s. Tab. 3). Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute 73 Phenyl 24 h 90% 74 4-Methoxyphenyl 4h 96% 75 4-Methylphenyl 4h 85% 76 4-Cyanophenyl 16 h 95% 77 3,5-Dimethylphenyl 12 h 78% 78 4-Biphenyl 16 h 93% 79 2-Fluorenyl 48 h 84% Tab. 3 Zusammenfassung aller durchgeführten Debenzylierungen 31 Resultate und Diskussion Der nächste Syntheseschritt bestand in der Deblockierung der beiden Hydroxylgruppen. Hierbei konnte ich in vorangegangenen Arbeiten während meiner Diplomarbeit zeigen, dass die Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid zu einer Dearylierung führt. Eine milde Abspaltung konnte jedoch durch die Verwendung von Triethylamin-Trihydrofluorid in Gegenwart von Triethylamin erreicht werden (s. Abb. 25).[67] O N Aryl HN O NH N N TBDMSO NH2 Et3N*3HF, Et3N, DCM, THF Rt, 2-12 h O 73-79 OTBDMS Aryl HN N NH N N HO NH2 O 61-96% 80-86 OH Abb. 25 Desilylierung der C8-Addukte 73-79 Hierzu wurden die entsprechenden Addukte 73-79 in THF/DCM (1:1 v/v) gelöst, bei Raumtemperatur mit 10 Triethylamin-Trihydrofluorid Äquivalenten versetzt und Triethylamin für 2-12 und 12.5 Stunden Äquivalenten gerührt. Die entsprechenden Produkte 80-86 konnten nach chromatographischer Reinigung (zur Abtrennung gebildeter Triethylammonium-Salze waren bis zu 3 Trennungen erforderlich) mit Ausbeuten von 61-96% erhalten werden (s. Tab. 4). Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute 80 Phenyl 3h 78% 81 4-Methoxyphenyl 2h 96% 82 4-Methylphenyl 4h 89% 83 4-Cyanophenyl 3h 88% 84 3,5-Dimethylphenyl 12 h 79% 85 4-Biphenyl 3h 94% 86 2-Fluorenyl 5h 61% Tab. 4 Zusammenfassung aller durchgeführten Desilylierungen zu den entschützten Addukten 80-86 32 Resultate und Diskussion Die geringere Ausbeute bei der Darstellung der komplett entschützten Addukte 80, 84 und 86 ist möglicherweise auf die niedrige Stabilität dieser Verbindungen gegenüber den anderen Addukten zurückzuführen. So konnte eine deutliche Verfärbung der erhaltenen Feststoffe innerhalb von wenigen Minuten an der Luft beobachtet werden. Die mehrmalige säulenchromatographische Reinigung kann somit mögliche Ausbeuteverluste erklären. Eine direkte Umsetzung (ohne säulenchromatographische Abtrennung der Salze) der entschützten Addukte 80-86, in der folgenden Schützung der exocyclischen Aminofunktion mit Formamidin, könnte diese Verluste verhindern. Für die Schützung der NH2-Gruppe wurden in vorangegangenen Arbeiten Versuche unternommen die Phenoxyacetyl-Funktion einzuführen.[67] Da diese Versuche nicht erfolgreich verliefen, wurde auf die bereits von Rizzo verwendete Formamidin-Gruppe zurückgegriffen.[45] Diese ist unter basischen Bedingungen (konz. Ammoniak) innerhalb von 2 h bei 45 °C abspaltbar und sollte eine schnellere Entschützung nach der Oligonucleotid-Synthese und damit eine Steigerung der Ausbeute der modifizierten Oligonucleotide im Vergleich zu der bislang verwendeten isoButyryl-Strategie ermöglichen. Die selektive Schützung der exocyclischen Aminofunktion der entschützten Addukte 80-86 konnte durch die Reaktion mit Dimethylformamiddiethylacetal in Pyridin bei Raumtemperatur innerhalb von 24-72 h erreicht werden (s. Abb. 26). O Aryl HN N N HO O NH N NH2 O OH Dimethylformamiddiethylacetal, Pyridin Rt, 24-72 h 80-86 47-94% Aryl HN N N HO NH N N N(Me)2 O OH 87-93 Abb. 26 Formamidin-Schützung der C8-Addukte 80-86 Die entsprechenden geschützten Addukte 87-93 konnten dabei in Ausbeuten von 4794% isoliert werden (s. Tab. 5, S. 34). 33 Resultate und Diskussion Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute 87 Phenyl 24 h 67% 88 4-Methoxyphenyl 24 h 81% 89 4-Methylphenyl 24 h 68% 90 4-Cyanophenyl 24 h 91% 91 3,5-Dimethylphenyl 72 h 47% 92 4-Biphenyl 24 h 94% 93 2-Fluorenyl 24 h 60% Tab. 5 Zusammenfassung aller durchgeführten Formamidin-Schützungen Auch hier ist die vermeintliche Instabilität der Edukte eine Erklärung für die teilweise nicht zufriedenstellenden Ausbeuten. Eine alternative, schnellere Umsetzung der Addukte zu den geschützten Produkten 87-93 in Methanol unter Refluxbedingungen für eine Stunde führte nicht zum Erfolg, vielmehr war eine Zersetzung der Edukte 8086 zu beobachten. Um erste Informationen über den Einfluss der Modifikation auf die Struktur zu erhalten, konnte mit den stabilen Produkten 87-93 eine Konformationsanalyse mittels NOESY-Spektroskopie durchgeführt werden. Mit Hilfe der beobachteten NOE-Effekte ist es möglich die Stellung der modifizierten Guanosin-Basen zu bestimmen. Sollte die anti-Stellung auch bei den Addukten vorliegen, so würde man einen NOE-Effekt zwischen der 5‘-Hydroxygruppe und dem NH-Proton des jeweiligen Arylamin erwarten. Dieses lässt sich anhand der aufgenommenen Spektren bestätigen. In Abbildung 27, S. 35 sind exemplarisch die relevanten Kopplungen der NOESYSpektren des Anilin-modifizierten Adduktes 87 und des 4-Aminobiphenyl- modifizierten Adduktes 92 dargestellt. Diese bestätigen das Vorliegen einer antiStellung. Bei einer durch die Modifikation verursachte syn-Stellung würde ein solcher NOE-Effekt zwischen dem NH-Proton und der 5‘-OH-Gruppe nicht zu beobachten sein, vielmehr müsste eine Kopplung des α-Protons der Formamidin-Schutzgruppe zu eben dieser 5‘-OH-Gruppe gemessen werden können, was jedoch in keinem Fall zu beobachten war. 34 Resultate und Diskussion O N O NH HN N N N HO N α NH HN N N(Me)2 HO O N α N N(Me)2 O 87 OH 92 OH H-α NH-Anilin H-α NH-4-Aminobiphenyl 5.850 5.800 5'-OH 5.850 5.900 5'-OH 5.950 5.900 6.000 5.950 6.050 ppm (t1 ppm (t1 8.750 ppm (t2) 8.700 8.650 8.600 8.550 8.500 8.90 8.80 8.70 8.60 8.50 ppm (t2) Abb. 26 relevante Kopplungen der NOESY-Spektren des Anilin-modifizierten Addukt 87 und des 4Aminobiphenyl-modifizierten Addukt 92 Da aus den gemessenen Spektren, wie zu erwarten war, eine räumliche Nähe des Arylamin-NH der modifizierten Nucleobase zu der 5‘-Hydroxyfunktion zu erkennen ist, sollte im Folgenden der Einfluss einer Phosphatgruppe an der 5‘-Position auf die Stellung der Base untersucht werden. Die hierüber erhaltenen Daten könnten dabei Aufschluss geben, ob bei den dargestellten Addukten eine Umwandlung in eine synKonformation innerhalb eines Oligonucleotidstranges vorliegen könnte. Die Synthese der C8-Arylamin-modifizierten 5‘-Monophosphate sollte zunächst analog zu der von Moffat etablierten Methode erfolgen (s. Abb. 27).[72] O N N N O OH POCl3, Pyridin, H2O, MeCN NH HN HO O 87 N N(Me)2 0 °C -> Rt, 4- 24 h N O O P O O NH HN N N N N(Me)2 O OH 94 Abb. 27 Versuch der C8-Anilin-modifizierten 5‘-Monophosphat-Synthese nach Moffat 35 Resultate und Diskussion Nach der Herstellung des Phosphatylierungsreagenz aus Phosphorylchlorid, Wasser und Pyridin bei 0 °C wurde das entschützte Anilin-modifizierte C8-Addukt 87 in situ zu der Reaktionslösung gegeben und die Lösung bei Raumtemperatur gerührt. Nach der für solche Umsetzungen typischen Reaktionszeit von 4 Stunden konnte jedoch keine Umsetzung beobachtet werden und das Edukt nach Aufarbeitung und Reinigung wieder reisoliert werden. Bei einem analog durchgeführten Versuch mit einer Reaktionszeit von 24 Stunden konnte dünnschichtchromatographisch kein Edukt mehr detektiert werden. Nach anschließender hydrolytischer Aufarbeitung, Neutralisation mit Ammoniumhydrogencarbonat und RP-Säulenchromatographie konnten jedoch nur nicht identifizierbare Zersetzungsprodukte isoliert werden. Eine weitere Möglichkeit, Zugang zu modifizierten 5‘-Monophosphaten zu erlangen, ist die selektive Hydrolyse von cycloSal-Phosphattriestern. Zur Darstellung dieser Verbindungen sind zwei Synthesewege denkbar. Zum Einen die Kupplung eines cycloSaligenylchlorphosphits mit dem modifizierten Nucleosid und anschließender Oxidation zum entsprechenden cycloSal-Phosphattriester. Zum Anderen ist die Darstellung eines cycloSaligenylchlorophosphidates möglich, welches analog zu der von O. Ludek entwickelten Methode ohne einen folgenden Oxidationsschritt direkt zum entsprechenden cycloSal-Phosphattriester mit dem Nucleosid gekuppelt werden kann.[73] Bereits 1990 publizierten Johnson et al. die starke Oxidationsempfindlichkeit solcher C8-Arylamin-modifizierten 2‘-dG Addukte.[74,75] Aus diesem Grund wurde hier die gewünschte Darstellung C8-Arylamin-modifizierter cycloSal-Phosphattriester mittels der zweiten Route versucht, um den Oxidationsschritt mit tert-Butylhydroperoxid oder Oxon und die mögliche oxidative Spaltung zu vermeiden. Die Kupplungsreaktion sollte ausgehend vom Addukt 88 durch langsame Zugabe bei -40 °C eines von S. Warnecke im Rahmen ihrer Dissertation synthetisierten cycloSaligenylchlorophosphidates 95 erfolgen (s. Abb. 28, S. 37).[76] 36 Resultate und Diskussion O O N NH HN N HO N N Cl O O P O Cl N(Me)2 O OH 95 88 O O Pyridin, Toluol - 40 °C, 5 h N Cl O OO P O NH HN N N N N(Me)2 O OH 96 Abb. 28 Versuch der Darstellung des C8-4-Methoxyanilin-modifizierten cycloSal-Phosphattriesters 96 Nach einer Reaktionszeit von 5 Stunden bei -40 °C konnte jedoch dünnschichtchromatographisch kein Umsatz beobachtet werden. Ein anschließendes Erwärmen auf Raumtemperatur führte zu einer Zersetzung des Eduktes 95. Da es auf den durchgeführten Wegen nicht möglich war, die 5‘-Phosphatfunktion nach der Einführung der C8-Arylaminmodifikation zu generieren, scheint der einzige Zugang zu solchen Monophosphaten eine Kreuzkupplungsreaktion mit einem geschützten, an 5‘-Position bereits phosphoryliertem, Nucleosid zu sein. Allerdings müsste eine geeignete Schutzgruppenstrategie für die Phosphatgruppe für eine durchzuführende Kreuzkupplung etabliert werden. Diese Versuche wurden nicht mehr im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Die erhaltenen entschützten Addukte 87-93 wurden im Folgenden zu den geschützten Bausteinen für die Oligonucleotidsynthese umgesetzt. Zunächst musste die 4,4’-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe (DMTr) an der primären Hydroxylgruppe eingeführt werden (s. Abb. 29, S. 38). 37 Resultate und Diskussion O N Aryl HN N HO O NH N N N(Me)2 N N DMTrO Rt, 3.5-12 h O 87-93 OH Aryl HN DMTrCl, Pyridin NH N N N(Me)2 O OH 45-84% 97-103 Abb. 29 DMTr-Schützung der C8-Addukte 87-93 Die Edukte 87-93 wurden jeweils in absolutem Pyridin gelöst und mit zwei Äquivalenten 4,4’-Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung sowie chromatographischer Reinigung konnten die entsprechenden Produkte 97-103 in Ausbeuten von 45-84% isoliert werden (s. Tab. 6). Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute 97 Phenyl 3.5 h 79% 98 4-Methoxyphenyl 3.5 h 79% 99 4-Methylphenyl 5h 81% 100 4-Cyanophenyl 3.5 h 45% 101 3,5-Dimethylphenyl 12 h 82% 102 4-Biphenyl 3.5 h 84% 103 2-Fluorenyl 3.5 h 78% Tab. 6 Zusammenfassung aller durchgeführten DMTr-Schützungen An die Dimethoxytritylierung schloss sich die Überführung in das entsprechende Phosphoramidit an. Das benötigte Phosphitylierungsreagenz, Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)phosphit 107, wurde zunächst in zwei Schritten aus Phosphortrichlorid 104, 3Hydroxypropionsäurenitril 105 und N,N’-Diisopropylamin dargestellt (s. Abb. 30, S. 39).[77] 38 Resultate und Diskussion PCl3 CN HO 104 Pyridin, Diethylether - 78 °C -> Rt, 12 h 105 Cl P O CN Cl Diisopropylamin, Diethylether N N - 10 °C -> Rt, 12 h 106 CN P O 107 41% Abb. 30 Synthese von Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 Phosphortrichlorid 104 wurde hierbei zunächst in einem Lösungsmittelgemisch aus absolutem Pyridin und absolutem Diethylether gelöst, bei – 78 °C tropfenweise mit 3-Hydroxypropionsäurenitril 105 versetzt und für 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das nach Filtration erhaltene Rohprodukt 106 wurde direkt in absolutem Diethylether aufgenommen und bei – 10 °C mit N,N’-Diisopropylamin versetzt. Nach Aufarbeitung und anschließender Destillation konnte das Produkt 107 in einer Ausbeute von 41% über beide Stufen erhalten werden. Das so erhaltene Phosphitylierungsreagenz 107 konnte nun zur Umsetzung mit den DMTr-geschützten Addukten 97-103 eingesetzt werden (s. Abb. 31). O Aryl HN N O Aryl HN NH N N DMTrO N N(Me)2 O 107, DCI, DCM, MeCN N N N N(Me)2 O 97-103 47-100% NH DMTrO Rt, 1 h OH N NC O O P 108-114 N(iPr)2 Abb. 31 Synthese der Arylamin-modifizierten Phosphoramidite 108-114 Die DMTr-geschützten coevaporiert, in Addukte 97-103 Dichlormethan/Acetonitril wurden gelöst jeweils und mit Dichlormethan zunächst mit 4,5- Dicyanoimidazol (DCI) und anschließend tropfenweise mit 1.5 Äq. Bis-N,N’Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung und chromatographischer Reinigung mit Dichlormethan/Methanol (0-2%) über Aluminiumoxid (Neutral, Aktivitätsstufe 3) 39 Resultate und Diskussion wurden die entsprechenden Phosphoramidite von den ebenfalls entstehenden HPhosphonaten mit Ausbeuten von 47-100% abgetrennt (s. Tab. 7, S. 40). Produkt Aryl Ausbeute 108 Phenyl 61% 109 4-Methoxyphenyl 61% 110 4-Methylphenyl 68% 111 4-Cyanophenyl 47% 112 3,5-Dimethylphenyl 97% 113 4-Biphenyl 60% 114 2-Fluorenyl 100% Tab. 7 Zusammenfassung aller durchgeführten C8-Arylamin-modifizierten Phosphoramiditsynthesen Die Phosphoramidite wurden anschließend jeweils nach Abkondensierung aus 148. 9300 148. 8690 Benzol als farblose Schäume erhalten. 220 180 140 100 60 ( p p m) 20 - 20 - 60 - 100 - 140 Abb. 32 exemplarisch abgebildetes 31P-NMR des C8-Arylamin-modifizierten Phosphoramidites 110 Aus dem erkennen, 31 P-NMR des Phosphoramidites 110 (s. Abb. 32) ist die Reinheit zu da außer den beiden Diastereomeren weder das 40 Resultate und Diskussion Phosphitylierungsreagenz 107 (bei einer chemischen Verschiebung von 123.34 ppm) noch die entsprechenden H-Phosphonate (bei -5 – 20 ppm) zu erkennen sind. Die Phosphoramidite sind an der Luft einige Tage stabil und können unter Stickstoff im Tiefkühlschrank mehrere Monate gelagert werden. Diese, im Gegensatz zu den von Rizzo et al. synthetisierten C8-IQ-modifizierten Phosphoramiditen in Acetonitril ausgezeichnet löslichen modifizierten Phosphoramidite, lagen nun als Bausteine für die Festphasensynthese modifizierter Oligonucleotide vor. Neben den hier synthetisierten Arylamin-modifizierten C8-Addukten des 2‘Desoxyguanosins kommen weiteren Addukten eine Bedeutung in der chemischen Carcinogenese zu (s. Abb. 5, S. 9). Diese an der N2- sowie O6-Position gebildeten Addukte und deren Phosphoramidite sind bislang chemisch noch nicht zugänglich gewesen, so dass ein gezielter Einbau in Oligonucleotide und damit eine gezielte Untersuchung der Auswirkungen solcher Modifikationen auf die Eigenschaften des DNA-Duplex noch nicht möglich waren. Im Folgenden sollen die Syntheseversuche zur Darstellung dieser Adduktformen und die Überführung in die entsprechenden Phosphoramidite beschrieben werden. 4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine Die Darstellung der N2-Arylamin-modifizierten Phosphoramidite 115 sollte ausgehend vom 2‘-Desoxyguanosin 52 erfolgen. Es sollte zunächst eine Überführung wiederum in einen an der O6-Position sowie den beiden Hydroxyfunktionen geschützten Baustein 117 erfolgen. Dieser sollte an der 2-Position eine funktionelle Gruppierung besitzen, die es ermöglichen sollte, die gewünschte Modifikation einzuführen und das Addukt 116 darzustellen (s. Abb. 33, S. 42). Die im Einzelnen gewählten funktionellen Gruppen und die damit verbundenen Synthesewege sollen im Folgenden diskutiert werden. 41 Resultate und Diskussion OBn N N TBDMSO O N N N H H N O N Aryl NH N N DMTrO N H H N Aryl O OTBDMS 116 NC O O P 115 N(iPr)2 O OBn N N TBDMSO N N N FG N N HO NH2 O O OH OTBDMS FG: NH2, OTf, Br NH 117 52 Abb. 33 allgemeines Retrosynthesschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite 4.2.1 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Azokupplung Bei dem zunächst gewählten Syntheseweg sollte das N2-Arylamin-modifizierte Addukt 118 ausgehend vom Bis-TBDMS-geschützten 2‘-Desoxyguanosin 121 dargestellt werden (s. Abb. 34, S. 43). Nach erfolgreicher Schützung sollte die Modifikation durch eine Kupplung mit der entsprechend hergestellten NitrosoarylVerbindung 120 eingeführt werden. Das entstehende Addukt 119, mit einer N-NDoppelbindung, könnte anschließend selektiv zum Produkt 118 reduziert (analog zu einer an Azobenzen bekannten Reduktion) werden. Vorteil dieser Synthese wäre die einfache Zugänglichkeit des Nucleosidbausteins 121, die kurze Synthesesequenz und das Vorliegen eines zweiten, in der Carcinogenese eine Rolle spielenden, N2Adduktes 119. Dieses könnte ebenfalls in das entsprechende Phosphoramidit überführt und als Baustein für die Oligonucleotidsynthese verwendet werden. 42 Resultate und Diskussion O N N TBDMSO O N NH N N H H N N TBDMSO O NH N N N O OTBDMS OTBDMS 118 119 O N NH NO N TBDMSO N NH2 O 120 OTBDMS 121 Abb. 34 Retrosynthesschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Azokupplung Die für die Azokupplung benötigten beiden Edukte 120 und 121 mussten zunächst hergestellt werden. Die Darstellung von Nitrosobenzol 120 sollte dabei ausgehend vom Anilin 1 durch selektive Oxidation erfolgen (s. Abb. 35). NH2 H2O2, H2O MoO3, KOH NO Rt, 24 h 1 120 13% Abb. 35 Darstellung von Nitrosobenzol 120 Die Reaktion wurde analog zu der von Defoin beschriebenen Methode durchgeführt.[78] Hierfür wurde die Ausgangssubstanz Anilin 1 mit 30%igem H2O2 und H2O, anschließend mit MoO3 in einer KOH-Lösung versetzt und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach erfolgter Aufarbeitung wurden braune Kristalle mit einer Ausbeute von 13% erhalten. Die Ausbeute liegt im Vergleich zu den von Defoin beschriebenen (53-80%) deutlich niedriger, da als Hauptprodukt die Entstehung von Nitrobenzol beobachtet werden konnte. 43 Resultate und Diskussion Neben dem Nitrosobenzol 120 sollte als zweites Edukt das 3´,5´-Bis(tertbutyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 121 dargestellt werden (s. Abb. 36). O N O TBDMSCl, Imidazol, Pyridin NH N N HO NH2 Rt, 14 h O N N N TBDMSO NH2 O 98% OH NH OTBDMS 52 121 Abb. 36 Darstellung von 3´,5´-Bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 121 Dabei wurde 2´-Desoxyguanosin-Monohydrat als Ausgangssubstanz verwendet, mit Imidazol in Pyridin suspendiert und anschließend mit TBDMS-Cl versetzt. Die Reaktion lief innerhalb von 14 h bei Raumtemperatur ab. Nach chromatographischer Reinigung konnte das Produkt in 98% Ausbeute erhalten werden. Nach der erfolgreichen Synthese der beiden Kupplungsedukte sollte anschließend die Umsetzung zu dem gewünschten Produkt 119 erfolgen (s. Abb. 37). O O N N TBDMSO NH N N NO NH N NH2 N TBDMSO N N O O OTBDMS OTBDMS 119 120 121 Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute EtOH, Essigsäure Rt 26 h Kein Umsatz EtOH, Essigsäure 40 °C 26 h Zersetzung Chloroform Rt 24 h Kein Umsatz Abb. 37 Versuche zur Darstellung des N2-Adduktes 119 Die Syntheseversuche erfolgten dabei analog zu denen in der Literatur beschriebenen Kupplungen zu verschieden substituierten Azobenzenen.[79-82] 44 Resultate und Diskussion Bei den durchgeführten Reaktionen konnte jedoch in keinem der Fälle das gewünschte Produkt isoliert werden. Bei der Umsetzung der Edukte 120 und 121 in Ethanol unter Zugabe von Essigsäure bei Raumtemperatur konnte dünnschichtchromatographisch keine Umsetzung detektiert werden. Bei einer Durchführung der Reaktion bei 40 °C wurde eine Spaltung der glycosidischen Bindung beobachtet und es konnten lediglich Zersetzungsprodukte isoliert werden. Ebenfalls keine Umsetzung konnte bei der analog zu der von Yunes et al. durchgeführten Azokupplung in Chloroform bei Raumtemperatur beobachtet werden.[82] Da durch die beschriebenen Versuche gezeigt werden konnte, dass die gewünschten N2-Addukte mittels Azokupplung nicht zugänglich sind, wurde im Folgenden ein alternativer Syntheseweg durchgeführt, bei dem die Einführung der Arylaminmodifikation mittels Substitution erfolgen sollte. 4.2.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Substitution Bei diesem Syntheseweg sollte die Einführung der Arylaminmodifikation an der N2Position analog zu der von Boche für modifizierte 3‘-Monophosphate durchgeführten Substitution eines Triflat-Intermediats 123 mit einem Arylhydrazin erfolgen (s. Abb. 38, S. 46).[49] Das Intermediat 123 musste dafür zunächst aus dem geschützten Xanthosin-Derivat 124 hergestellt werden, welches aus dem entsprechenden geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40 generiert werden sollte. Als Schutzgruppen sollten dabei die schon bei den C8-Addukten erfolgreich etablierten TBDMS-Gruppen (für die Hydroxyfunktionen) und die Benzylgruppe für die O6Position dienen, welche zunächst ausgehend vom 2‘-Desoxyguanosin eingeführt werden sollten. 45 Resultate und Diskussion OBn N N TBDMSO OBn N N N OTf N N O N H N TBDMSO H N O OTBDMS OTBDMS 123 122 OBn OBn N N TBDMSO N N N H N N O N TBDMSO O NH2 O OTBDMS OTBDMS 124 40 Abb. 38 Retrosyntheseschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Substitution Die Darstellung des 3´,5´-Bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 121 erfolgte wie in Abb. 36, S. 44 gezeigt. Anschließend erfolgte die Schützung der O6-Position mittels der Benzylschutzgruppe zum Produkt 40 (s. Abb. 39). O N N TBDMSO OBn NH N NH2 Benzylalkohol, PPh3, DIAD, 1,4-Dioxan Rt, 1 h O N N TBDMSO 68% OTBDMS N N NH2 O OTBDMS 121 40 Abb. 39 Darstellung des geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivates 40 Die Reaktion wurde analog zu der Benzylschützung des C8-bromierten 2‘Desoxyguanosin-Derivates 65 durchgeführt. Dabei konnte nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur und anschließender 46 Resultate und Diskussion säulenchromatographischer Reinigung das Produkt 40 mit einer Ausbeute von 68% (10% höher als bei der bromierten Verbindung 63) erhalten werden. Anschließend sollte die Überführung in das entsprechende Xanthosin-Derivat 124 erfolgen. Für diesen Syntheseschritt erfolgten drei alternative Umsetzungen, um eine möglichst effektive Methode zur Darstellung der gewünschten Verbindung zu erhalten (s. Abb. 40). OBn N N TBDMSO OBn N N N N NH2 TBDMSO O N N H O O OTBDMS OTBDMS 40 124 Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute tertButylnitrit 0 °C 5 min. 9% Na2Fe(CN)5NO*2H2O, NaOH 70 °C 4h --- Aceton, H2O, HClO4, NaNO2, DCM 10 °C 1h 6% Abb. 40 Zusammenfassung der Darstellungen des Xanthosin-Derivates 124 Die Synthese wurde zunächst analog zu der von Boche für das geschützte Monophosphat 45 beschriebenen Methode durchgeführt. Hierbei wurde das Produkt 124 durch Reaktion der Ausgangssubstanz 40 mit tertButylnitrit innerhalb von 5 Minuten bei 0 °C erhalten.[49] Das Produkt konnte nach Aufarbeitung und Reinigung jedoch nur, im Gegensatz zu den 25% von Boche, mit einer Ausbeute von 9% isoliert werden. Eine alternative Umwandlung aus dem geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40 in das Produkt 124 unter der Verwendung von Dinatriumpentacyanonitrosoferrat(II)dihydrat unter alkalischen Bedingungen bei 70 °C, wie von Keefer et al. für 2’-dG 52 beschrieben, führte zu keiner Umsetzung des Eduktes.[83] Eine weitere Möglichkeit zur Darstellung des gewünschten Produktes 124 schien die Umsetzung nach Pfleiderer et al..[84] Hierzu wurde das Edukt O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 in Aceton und Wasser gelöst und mit 70%iger HClO4 und NaNO2 47 Resultate und Diskussion bei 10 °C versetzt und 1 h gerührt. Nach anschließender Aufarbeitung wurde das Produkt mit einer Ausbeute von 6% erhalten. Insgesamt ließ sich in keiner der durchgeführten Synthesemethoden eine zufriedenstellende Ausbeute erreichen, was somit eine Schwierigkeit zur Darstellung größerer Mengen des Produktes 124 darstellt. Die aus den verschiedenen Synthesen vereinigten Produktmengen des geschützten Xanthosin-Derivates 124 wurden anschließend zum Triflat-Intermediat 123 umgesetzt (s. Abb. 41). Dabei wurde ebenfalls auf die von Boche beschriebene Methode zurückgegriffen.[49] OBn N OBn N N N N H TBDMSO O O Et3N, DMAP, DCM, Tf2O N TBDMSO 124 N OTf O 0 °C, 30 min. OTBDMS N OTBDMS 37% 123 Abb. 41 Darstellung des Triflat-Intermediats 123 Es wurde dabei das Edukt 124 mit Triethylamin und einer katalytischen Menge 4(Dimethylamino)-pyridin (DMAP) in Dichlormethan versetzt und auf 0 °C gekühlt. Anschließend erfolgten die Zugabe von Trifluormethansulfonsäureanhydrid und das Rühren für 0.5 h bei dieser Temperatur. Nach der folgenden Reinigung wurde das Produkt in 37% Ausbeute erhalten und stand somit für die Umsetzung mit entsprechenden Arylhydrazinen zur Verfügung. Die für eine solche Substitution benötigten monocyclischen Arylhydrazine sind als entsprechende Hydrochloride kommerziell erhältlich. Da die Darstellung polycyclischer Arylaminmodifikationen an der N2-Position ebenfalls ein Ziel war, mussten die entsprechenden Arylhydrazine zunächst dargestellt werden (s. Abb. 42). NH2 1) NaNO2, HCl, H2O, SnCl2 2) konz. NH3 H N NH2 -10 °C, 4 h 2 80% 125 Abb. 42 Darstellung von 4-Hydrazinobiphenyl 125 48 Resultate und Diskussion Die Synthese von 4-Hydrazinobiphenyl erfolgte analog zu der von Müller beschriebenen Methode.[85] Dabei wurde 4-Aminobiphenyl 2 zunächst in Wasser und konz. Salzsäure suspendiert und bei –10 °C mit Natriumnitrit versetzt. Nach anschließender Reduktion des entstehenden Diazoniumsalzes mittels Zinn(II)chlorid konnte das Produkt als Hydrochlorid isoliert werden. Zur Darstellung des instabilen freien Hydrazins 125 wurde das Hydrochlorid basisch mit Diethylether extrahiert und nach dem Einengen in reiner Form mit einer Ausbeute von 80% erhalten. Mittels dieser Methode konnte ebenfalls das entsprechende Fluorenyl-Derivat dargestellt werden (s. S. 223). Für die Umsetzung zu dem gewünschten N2-Addukt, ausgehend vom TriflatIntermediat 123, wurde zunächst das kommerziell erworbene Phenylhydrazin nach der von Boche beschriebenen Methode verwendet (s. Abb. 43).[49] OBn OBn N N TBDMSO N N OTf N O Phenylhydrazin, DMF N TBDMSO N N H H N O Rt, 10 d OTBDMS N OTBDMS (53%) 122 123 2 Abb. 43 Erste Darstellung des N -Arylhydrazino-Adduktes 122 Hierbei wurde das Triflat-Intermediat 123 mit Phenylhydrazin in DMF versetzt und 10 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach der entsprechenden Aufarbeitung konnte mit einer Ausbeute von 53% ein Produktgemisch erhalten werden. Zwar zeigten die NMR-Messungen das gewünschte Produkt, jedoch lag dieses in einer nicht trennbaren Mischung verschiedener nicht identifizierbarer Produkte nur zu ca. 10% vor, weshalb eine genaue Ausbeutebestimmung für die durchgeführte Substitutionsreaktion nicht möglich ist. Mittels dieser Substitution ist es möglich, die gewünschte N2-Modifikation am 2‘-Desoxyguanosin einzuführen, jedoch ist es aufgrund der geringen Ausbeuten nicht durchführbar größere Mengen der Addukte herzustellen, welche für eine weitere Umsetzung zu den entsprechenden Phosphoramiditen nötig wäre. Eine alternative Darstellung zur Einführung der Arylaminmodifikation sollte analog zu den synthetisierten C8-Addukten mittels einer Palladium-katalysierten 49 Resultate und Diskussion Kreuzkupplungsreaktion erfolgen. Die entsprechenden Ergebnisse sollen im Folgenden aufgezeigt und diskutiert werden. 4.2.3 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Palladium-katalysierter Kreuzkupplung Bei diesem Syntheseweg sollte die Einführung der Arylaminmodifikation an der N2Position analog Kreuzkupplung zu an den C8-Addukten einem an der mittels einer 2-Position Palladium-katalysierten bromierten, geschützten 2‘-Desoxyguansoin-Derivat 126 mit einem Arylhydrazin erfolgen (s. Abb. 44). OBn N N TBDMSO N N N H H N O OTBDMS 122 OBn N N TBDMSO OBn N N N O Br N TBDMSO N N NH2 O OTBDMS OTBDMS 126 40 Abb. 44 Retrosynthesschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Kreuzkupplung Der Baustein 126 sollte dabei direkt aus dem entsprechenden geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40, welches aus den vorangegangenen Versuchen bereits vorlag, generiert werden. Anschließend sollte eine Buchwald-Hartwig- 50 Resultate und Diskussion ähnliche Kreuzkupplungsreaktion mit den Arylhydrazinen die Einführung der N2Arylamin-Modifikation ermöglichen und das gewünschte Produkt 122 liefern. Nach der bereits beschriebenen Schützung der beiden Hydroxylgruppen mit TBDMS sowie der Blockierung der O6-Position mit der Benzylgruppe, sollte eine Methode zur selektiven Bromierung der 2-Position gefunden werden. Hierfür wurden drei unterschiedliche Methoden angewendet, um eine möglichst effiziente Synthese zu entwickeln (s. Abb. 45). OBn N N TBDMSO OBn N N N N N NH2 O Br N TBDMSO O OTBDMS OTBDMS 40 126 Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute tert-Butylnitrit, CHBr3 90 °C 30 min. --- NaNO2, TMSBr, BnBu3NCl, CCl4 0 °C 1.5 h --- tert-Butylnitrit, CH2Br2, Sb(III)Br3 - 10 °C 1h 40% Abb. 45 Zusammenfassung der Bromierungsversuche zur Darstellung des Produktes 126 Die Synthese wurde zunächst analog zu der von Nair beschriebenen Methode durchgeführt.[86] Hierbei sollte das Edukt 40 durch Reaktion mit tertButylnitrit innerhalb von 30 Minuten bei 90 °C in die Diazonium-Verbindung überführt werden und anschließend mit einem Bromid des Lösungsmittels Bromoform zum Produkt 126 reagieren. Nach Reinigung des Reaktionsgemisches konnte das Produkt jedoch nicht isoliert werden. Vielmehr trat hierbei eine Vielzahl nicht identifizierbarer Produkte auf. Auch die Umwandlung aus dem geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40 in das Produkt 126 unter der Verwendung von Trimethylsilylbromid als Bromid-Donor in Gegenwart von Benzyltributylammoniumchlorid bei einer Temperatur von 0 °C, wie von Lee et al. beschrieben, führte zu keiner Umsetzung des Eduktes.[87] 51 Resultate und Diskussion Die Synthese des gewünschten Produktes 126 gelang schließlich durch die Umsetzung nach Harwood et al..[88] Hierzu wurde das Edukt O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 in Dibrommethan bei -10 °C gelöst, mit Antimon(III)-bromid und tertButylnitrit versetzt und eine Stunde gerührt. Nach anschließender Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung wurde das Produkt mit einer Ausbeute von 40% erhalten. Ausgehend von dem dargestellten Baustein 126 sollte nun die Einführung der Arylaminmodifikation erfolgen. Für die notwendige Kreuzkupplungsreaktion wurde auf die Bedingungen der C8-Kreuzkupplung zurückgegriffen. Um für diese Anwendung die optimalen Reaktionsbedingungen zu finden, wurden die Komponenten Lösungsmittel, Base und Salzzusatz variiert (s. Abb. 46). OBn N Pd2(dba)3, rac-BINAP, Phenylhydrazin, Base, LM N N N TBDMSO OBn N N Br TBDMSO O N N N H H N O OTBDMS OTBDMS 126 122 Lösungsmittel Base Zusatz (0.2 Äq.) Zeit Ausbeute Toluol KtOBu --- 24 h --- 1,2-DME K3PO4 --- 48 h (14) 1,2-DME K3PO4 Et3NHCl 24 h (100) 1,2-DME K3PO4 LiCl 24 h (52) 1,2-DME K3PO4 Bu4NCl 24 h (45) 1,2-DME Cs2CO3 Et3NHCl 24 h (56) Abb. 46 Zusammenfassung der Kreuzkupplungen zum Produkt 122 Zunächst wurde die Reaktion in Toluol mit Kaliumtertbutanolat als Base durchgeführt. Der Palladiumkatalysator wurde dabei mit rac-BINAP und dem Kupplungsedukt 126 in abs. Toluol gelöst. Anschließend erfolgte die Zugabe von Phenylhydrazin und der Base. Die Reaktionsmischung wurde 24 h bei 80 °C gerührt, wobei eine Zersetzung des Eduktes dünnschichtchromatographisch beobachtet werden konnte. Da diese 52 Resultate und Diskussion Beobachtung bereits bei der Verwendung von Kaliumtertbutanolat als Base bei der durchgeführten C8-Addukt-Synthese gemacht wurde, wurden für die folgenden Synthesen schwächere Basen, wie Kaliumphosphat und Cäsiumcarbonat gewählt. Bei der Verwendung von Kaliumphosphat als Base (analoge Bedingungen der C8Kreuzkupplung) konnte die Bildung des Produktes dünnschichtchromatographisch detektiert werden. Nach erfolgter Aufarbeitung und Reinigung konnten allerdings nur 14% eines Produktgemisches erhalten werden. Bei diesem nicht trennbaren Gemisch handelt es sich um das Produkt 122 und einem Nebenprodukt, welches aus dem Liganden rac-BINAP entstanden sein könnte, im Verhältnis 2:1. Das Nebenprodukt wurde jedoch nicht weiter charakterisiert. Im Jahr 2005 publizierten Cacchi et al. eine Kreuzkupplungsreaktion von Hydrazinen mit Arylbromiden. Ihnen gelang es durch Addition von Lithiumchlorid als ChloridDonor eine deutliche Steigerung der Ausbeute zu erzielen.[89] Auch für die hier durchgeführte Kreuzkupplung ließ sich durch Addition von 0.2 Äquivalenten Lithiumchlorid eine Ausbeutesteigerung auf 52% erzielen, wobei ebenfalls das zuvor beobachtete Produktgemisch im gleichen Verhältnis vorlag. Neben Lithiumchlorid wurden unter gleichen Bedingungen weitere Zusätze getestet, welche ebenfalls als Chlorid-Donatoren dienen sollten. Bei der Verwendung von Tetrabutylammoniumchlorid konnte dabei eine Ausbeute von 45% erzielt werden. Eine deutliche Steigerung konnte bei der Verwendung von Triethylammoniumchlorid als Salzzusatz erreicht werden.[90] Nach erfolgter Reinigung konnten 100% des Produktgemisches erhalten werden. Auch in diesem Fall lag das Produkt 122 und das Nebenprodukt im zuvor beschriebenen Verhältnis vor. Die deutliche Ausbeutesteigerung durch die Addition von Chlorid-Ionen kann durch einen von Amatore postulierten Mechanismus erklärt werden (s. Abb. 46, S. 54).[90] Beim diesem postulierten Mechanismus geht man von dem bereits in Abb. 23, S. 29 beschriebenen Mechanismus aus. Hier wird zusätzlich ein zweifach negativ geladener Komplex, welcher durch den Zusatz von Chlorid-Ionen hervorgerufen wird, angenommen. Durch die Koordination der Chlor-Atome an den 0-wertigen PdKatalysator werden ein Zwei-Zentren-Drei-Elektronen-Übergangszustand und eine Stabilisierung im jeweiligen Lösungsmittel erreicht. Dieser wird erst durch die Reaktion mit dem Edukt I aufgelöst. Durch diese Stabilisierung wird möglicherweise 53 Resultate und Diskussion ein anderer Reaktionsweg eingeschlagen, wodurch die Ausbeute des Produktes gesteigert werden kann. Pd2(dba)3 + BINAP TBDMSO V O OBn N N N N NH-NH-Ar (BINAP)Pd(dba) OTBDMS TBDMSO O (Et)3N Cl (BINAP)Pd(0) -2 Cl OBn N N NH-NH-Ar N N Pd P (+II) P P 0 0 Pd P Pd P P Cl OTBDMS IV TBDMSO K2HPO4 + KBr O OBn N N N N Br OTBDMS I K3PO4 TBDMSO OBn + N N NH2-NH-Ar N N Pd- P Br P TBDMSO O OBn N N Br N N Pd P (+II) P O OTBDMS II OTBDMS III Ar-NH-NH2 Abb. 46 Postulierter Mechanismus der Buchwald-Hartwig-Reaktion mit Zusatz von (Et)3N+Cl- nach C. Amatore 54 Resultate und Diskussion Eine weitere Optimierung der Salzzusatzkonzentration (0.1, 0.5, 1, 2 Äquivalente) brachte keine Steigerung der Ausbeute bzw. eine Verschiebung des Verhältnisses im Produktgemisch. Auch die unter optimierten Bedingungen durchgeführte Verwendung von Cäsiumcarbonat als Base führte zu keiner weiteren Verbesserung (56% Ausbeute des beschriebenen Produktgemisches). Nach erfolgter Kupplung, sollte nun die Umsetzung des Produktgemisches zum entsprechenden Phosphoramidit erfolgen. Diese Umsetzung sollte analog zu den bereits durchgeführten Synthesen zu den C8-Arylamin-modifizierten Phosphoramiditen 108-114 erfolgen. Zunächst erfolgte die Debenzylierung in O6-Position mit Hilfe von Pd/C unter einer H2-Atmosphäre (s. Abb. 47). O OBn N N TBDMSO N N N N H H N Pd/C, H2, MeOH TBDMSO Rt, 5 h O OTBDMS N N H H N O OTBDMS 40% (über 2 Stufen) 122 N NH 118 Abb. 47 Debenzylierung zum Produkt 118 Hierfür wurde O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 122 mit einer katalytischen Menge Pd/C in Methanol versetzt und unter H2-Atmosphäre 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der entsprechenden Aufarbeitung konnte das Produkt 118 über beide Syntheseschritte, Kupplung und Debenzylierung, mit einer Ausbeute von 40% in reiner Form erhalten werden. Der nächste Syntheseschritt bestand in der Entfernung der TBDMS-Schutzgruppen. Nach einer Vorschrift von De Riccardis wurde die Entschützung mit Tetrabutylammoniumfluorid in THF vorgenommen (s. Abb. 48, S. 56).[48] Die Reaktion führte nicht zu dem gewünschten Produkt 127, vielmehr konnte eine Dearylierung beobachtet werden. 55 Resultate und Diskussion O O N N TBDMSO N NH N N H H N N TBAF, THF O HO NH N H N H N O Rt, 3 h OH OTBDMS 127 118 Abb. 48 Versuch der Desilylierung mittels Tetrabutylammoniumfluorid zum Produkt 127 Als Alternative erfolgte die Entschützung mit Triethylamin-Trihydrofluorid unter Zusatz von Triethylamin in Dichlormethan/THF (s. Abb. 49). O O N N TBDMSO NH N O N H H N Et3N*3HF, Et3N, DCM, THF N N HO 68% N N H H N O Rt, 24 h OTBDMS NH OH 118 127 Abb. 49 Desilylierung zum Produkt 127 Das Produkt 127 konnte dabei nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden und entsprechender Reinigung mit einer Ausbeute von 68% erhalten werden. Mittels dieser schonenden Methode war es erstmals möglich, das vollständig entschützte N2-Phenylhydrazino-2‘-desoxyguanosin 127 darzustellen. Verbindungen dieser Art könnten in zukünftigen Untersuchungen als Referenz zur weiteren Identifizierung solcher Addukte dienen und damit eine Quantifizierung solcher Addukte auch für weitere aromatische Amine möglich machen. Das erhaltene entschützte N2-Addukt 127 sollte im Folgenden zum geschützten Baustein für die Oligonucleotidsynthese umgesetzt werden. Zunächst musste die 4,4’-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe (DMTr) an der primären Hydroxylgruppe eingeführt werden (s. Abb. 50, S. 57). 56 Resultate und Diskussion O N O NH N N H N HO N DMTrCl, Pyridin H N Rt, 20 h O N H N N H N DMTrO O 10% OH NH OH 127 128 Abb. 50 DMTr-Schützung des N2-Addukt 127 Das Edukt 127 wurden in absolutem Pyridin gelöst und mit zwei Äquivalenten 4,4’Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung, sowie chromatographischer Reinigung konnte das entsprechende Produkt 128 in einer Ausbeute von 10% isoliert werden. Diese für eine solche Reaktion unbefriedigende Ausbeute ließ sich aber auch durch eine Wiederholung der Synthese nicht steigern. Im Anschluss an die Dimethoxytritylierung sollte sich die Überführung in das entsprechende Phosphoramidit 129 anschließen (s. Abb. 51). O O N N DMTrO NH N H N O H N N 107, DCI, DCM, MeCN Rt, 1 h N DMTrO N N H H N O OH 128 NH NC O O P N(iPr)2 129 Abb. 51 Versuch der Synthese des Phosphoramidit 129 Das DMTr-geschützte Addukt 128 wurde mit Dichlormethan coevaporiert, in Dichlormethan/Acetonitril gelöst und zunächst mit 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) und anschließend tropfenweise mit Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung und chromatographischer Reinigung mit Dichlormethan/Methanol (0-2%) über Aluminiumoxid (Neutral, Aktivitätsstufe 3) konnte jedoch kein Produkt 129 isoliert. Vielmehr war bereits während der Reaktion eine, auf eine Zersetzung hindeutende, starke Verfärbung der Reaktionslösung zu beobachten, welche während der 57 Resultate und Diskussion Aufarbeitung und Reinigung noch deutlich stärker wurde. Zwar konnte die Entstehung des Produktes massenspektrometrisch aus der Reaktionslösung nachgewiesen werden, jedoch machten es auch eine kürzere Reaktionszeit sowie eine Aufarbeitung und Reinigung unter Schlenk-Bedingungen nicht möglich, das gewünschte Produkt 129 zu isolieren. Bei Produkten der Art 129 scheint es sich also um an Luft instabile Verbindungen zu handeln, welche es nicht ermöglichen, eine Darstellung, Isolierung oder gar Lagerung durchzuführen. Diese Instabilität könnte bereits die Ursache für die niedrige Ausbeute bei der DMTr-Schützung gewesen sein und deshalb auch die Darstellung einer solchen Verbindung erschweren. Die Isolierung der angestrebten N2-Arylamin-modifizierten Phosphoramidite kann aus den erhaltenen Ergebnissen nur durch eine Stabilisierung des Systems geschehen. Diese Stabilisierung müsste durch eine funktionelle Gruppe geschehen, welche erst nach dem erfolgreichen Einbau in Oligonucleotide abgespalten werden kann. Über solche Schutzgruppen berichteten Pfleiderer et al. im Jahre 1981.[91] Die für die Blockierung der O6-Position eingesetzten p-subsituierten (p-Nitro bzw. p-Cyano) 2-Phenylethyl-Gruppen erfüllen diese Anforderungen. Da bereits aus vorangegangen Arbeiten hervorging, dass eine Schützung mit einer p-Nitro-2-phenylethyl-Gruppe an der O6-Position des 2‘-Desoxyguanosin eine Kreuzkupplungsreaktion nicht möglich macht, sollte für die Stabilisierung die p-Cyano-2-phenylethyl-Gruppe (CPE-Gruppe) angewendet werden (s. Abb. 52, S. 59). Die Synthese eines CPE-geschützten bromierten Bausteins 132 sollte ausgehend vom bereits 3‘,5‘-BisTBDMS-2´-desoxyguanosin 121 geschehen. Anschließend sollte die CPE-Schutzgruppe in die O6-Position eingeführt werden und die Bromierung der N2-Position erfolgen. Ausgehend von diesem bromierten Baustein 132 sollte die Einführung der Modifikation in die N2-Position des Guanins wiederum durch die entwickelte Buchwald-Hartwig-Kupplung vorgenommen werden. Nach erfolgter Kupplung sollten die 3´- und 5´-Position wieder entschützt und nach der Einführung der 5‘-DMTr-Schutzgruppe das Phosphoramidit 130 generiert werden. 58 Resultate und Diskussion OCPE OCPE N N N N H N TBDMSO N H N N N OTBDMS NC 131 O O P N(iPr)2 OCPE N TBDMSO 130 O N N N Br N Aryl O O N N H N DMTrO Aryl H N TBDMSO O NH N NH2 O OTBDMS OTBDMS 132 121 Abb. 52 Retrosyntheseschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte unter Verwendung der O6CPE-Schutzgruppe Für die angedachte Einführung der CPE-Schutzgruppe musste zunächst der entsprechende Alkohol, 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134, analog zu Pfleiderer hergestellt werden (s. Abb. 53).[91] NH2 1) NaNO2, HCl, H2O 2) CuCN, Toluol, Benzol CN 0 °C -> 50 °C, 3.5 h OH OH 133 44% 134 Abb. 53 Darstellung von 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134 In dieser Sandmeyer-Reaktion wurde zunächst der 2-(p-Aminophenyl)ethanol 133 in einem Wasser/Salzsäure-Gemisch suspendiert und bei einer Temperatur von 0 °C 59 Resultate und Diskussion mit Natriumnitrit diazotiert. Anschließend konnte die Reaktion mit frisch hergestelltem Kupfer(I)cyanid erfolgen. Das Produkt 134 konnte nach Aufarbeitung und Reinigung mit einer Ausbeute von 44% erhalten werden. Die Einführung der CPE-Schutzgruppe geschah analog zu der Einführung der Benzylschutzgruppe mittels einer Mitsunobu-Reaktion (s. Abb. 54). O N N TBDMSO OCPE N NH NH2 N O 134, PPh3, DIAD, 1,4-Dioxan N O OTBDMS 92% 121 NH2 N TBDMSO 0 °C -> Rt, 14 h OTBDMS N 135 Abb. 54 Darstellung der O6-CPE-geschützten Verbindung 135 Bei der Reaktion wurden zunächst 3’,5’-Bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin 121 und Triphenylphosphin in 1,4-Dioxan mit 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134 vorgelegt und mit Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur und abschließender Aufarbeitung konnte das Produkt mit einer Ausbeute von 92% isoliert werden. Die anschließende Bromierung in 2-Position erfolgte ebenfalls analog zu der bereits durchgeführten Synthese des Benzyl-geschützten Derivates 126 (s. Abb. 55). OCPE OCPE N N TBDMSO N N N NH2 tert-Butylnitrit, Sb(III)Br3, CH2Br2 - 10 °C, 1 h O 50% OTBDMS N TBDMSO N N Br O OTBDMS 132 135 6 Abb. 55 Darstellung von O -CPE-3´,5´-bis-(TBDMS)-2-brom-2´-desoxyguanosin 132 Das Produkt 132, und damit der Ausgangsbaustein für die Buchwald-HartwigKupplung, konnte nach analoger Durchführung und Reinigung mit einer Ausbeute von 50% isoliert werden. Bereits bei den ersten Schritten scheint der Einfluss der 60 Resultate und Diskussion CPE-Schutzgruppe erkennbar zu sein, denn sowohl die Einführung der O6Schutzgruppe, als auch die anschließende Bromierung gelangen mit höheren Ausbeuten, als dieses bei den entsprechenden Benzyl-geschützten Derivaten 40 und 126 möglich war. Anschließend konnte die Kupplungsreaktion mit den entsprechenden Arylhydrazinen zu den Kupplungsprodukten 136-139 durchgeführt werden (s. Abb. 56). OCPE N N TBDMSO N N O Br Pd2(dba)3, rac-BINAP, K3PO4, Et3NHCl, Arylhydrazin 1,2-DME OCPE N N TBDMSO 80 °C, 24 h OTBDMS N N N H H N Aryl O OTBDMS 132 136-139 2 Abb. 56 Einführung der N -Arylamin-Modifikationen zu den Produkten 136-139 Die Reaktionen wurden dabei unter den für die Darstellung des Benzyl-geschützten Produktes 122 optimierten Bedingungen durchgeführt. Die Produkte 136-139 konnten nach Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung in einer Ausbeute von 52-80% in reiner Form isoliert werden (s. Tab. 8). Produkt Aryl Ausbeute 136 Phenyl 80% 137 4-Biphenyl 50% 138 4-Methylphenyl 75% 139 3,5-Dimethylphenyl 52% Tab. 8 Zusammenfassung aller Adduktsynthesen zu den Produkten 136-139 Eine Ausbeutesteigerung durch eine Vorreaktion des Katalysators mit dem Liganden konnte wiederum nicht beobachtet werden. Anschließend sollten unter den ebenfalls erprobten Bedingungen die TBDMSGruppen exemplarisch für die Verbindungen 136-137 abgespalten werden (s. Abb. 57, S. 62). 61 Resultate und Diskussion OCPE N N HO OCPE N N N N H N TBDMSO H N Aryl N H N N H Aryl O Et3N*3HF, Et3N, DCM, THF 140-141 OH OCPE Rt, 2-12 h O N N OTBDMS N 136-137 HO N N N N Aryl O 142-143 OH Abb. 57 TBDMS-Entschützung der N2-Arylamin-Addukte 136-137 Hierzu wurden die entsprechenden Addukte 136-137 in THF/DCM (1:1 v/v) gelöst, bei Raumtemperatur mit 10 Äquivalenten Triethylamin und 12.5 Äquivalenten Triethylamin-Trihydrofluorid versetzt und bei Raumtemperatur für 2-12 Stunden gerührt. Nach anschließender chromatographischer Reinigung konnten jedoch nur jeweils Produktgemische aus den gewünschten entschützten N2-Addukten 140-141 (im Folgenden als Hydrazinoaryl-Addukt bezeichnet), sowie deren Oxidationsprodukten 142-143 (im Folgenden als Azoaryl-Addukt bezeichnet) erhalten werden. Die unerwartete Entstehung der Oxidationsprodukte 142-143 konnte bisher nicht mit Sicherheit aufgeklärt werden. Eine dünnschichtchromatographische Reaktionsverfolgung sowie eine NMR-spektroskopische Analyse des Reaktionsgemisches zeigen, dass die Bildung dieser Produkte nicht während der Reaktion zu beobachten ist. Ebenfalls kann eine Oxidation während der wässrigen Aufarbeitung ausgeschlossen werden. Somit müsste die Oxidation während der Säulenchromatographie über Silica-Gel stattfinden. In Abbildung 58, S. 63 sind exemplarisch die NMR-Spektren vor und nach säulenchromatographischer Reinigung über Silica-Kieselgel abgebildet. Es ist deutlich zu erkennen, dass ausgehend von einem nucleosidischen Produkt nach der Trennung eine Verdopplung der Signale vorliegt. Dieses weist auf das Entstehen der oxidierten Form während der Säulenchromatographie hin. 62 Resultate und Diskussion H-8 8. 5 8. 0 7. 5 7. 0 2 x H-8 6. 5 6. 0 5. 5 5. 0 ( p p m) 4. 5 4. 0 3. 5 3. 0 2. 5 8. 0 2. 0 7. 6 7. 2 6. 8 6. 4 6. 0 5. 6 5. 2 ( p p m) 4. 8 4. 4 4. 0 3. 6 3. 2 2. 8 2. 4 Abb. 58 1H-NMR-Spektren vor (links) und nach (rechts) einer durchgeführten Kieselgeltrennung bei der 2 Entschützung des N -Adduktes 136 Durch die Verwendung von Aluminiumoxid könnte eine solche Reaktion unterbunden werden. Da beide Adduktformen jedoch in der chemischen Carcinogenese eine Rolle spielen, sollte sich diese partielle Oxidation zu Nutze gemacht und eine Möglichkeit gefunden werden, die jeweiligen Addukte quantitativ darzustellen und separat in die entsprechenden Phosphoramidite zu überführen. Da eine säulenchromatographische Trennung ausgeschlossen werden konnte, wurde zunächst einmal untersucht, ob eine chemische, quantitative Überführung des Reaktionsgemisches 140/142 in die reduzierte Form 140 möglich ist (s. Abb. 59, S. 64). Zunächst wurde das Produktgemisch 140/142 in Methanol gelöst und mit Magnesium und Ammoniumchlorid versetzt und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.[92] Nach dieser Zeit konnte mittels 1H-NMR-Spektroskopie der Reaktionslösung keine merkliche Verschiebung des Produktverhältnisses 140/142 beobachtet werden. Eine weitere entsprechenden Möglichkeit zur Reduktion Hydrazinoverbindungen von besteht Azoverbindungen durch die zu den Reaktion mit Natriumhydrogencarbonat, Hydrazin-Hydrat und Zirkoniumdioxid als Katalysator in Ethanol.[93] Auch bei dieser durchgeführten Reaktion konnte jedoch keine quantitative Reduktion erreicht werden. Gleiches gilt für den Reduktionsversuch mit Natriumborhydrid und Iod, welches in Tetrahydrofuran gelöst wurde.[94] Diese Reaktionen fanden alle bei Raumtemperatur für 24 Stunden statt, lieferten allerdings ebenso keine quantitative Umsetzung wie die Reaktion mit Iod, Magnesiumiodid und Magnesium. Als Lösungsmittel wurde bei dieser Reaktion ein 63 Resultate und Diskussion Ether/Benzol-Gemisch verwendet. Die Reaktion fand bei Raumtemperatur für 72 Stunden statt.[95] OCPE N N HO N N H N H N O OCPE N OH 140 N N N HO O OCPE N N HO N N N H H N OH N 140 N O OH 142 Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute* MeOH, Mg, Ammoniumchlorid Rt 24 h --- NaHCO3, EtOH, Hydrazinhydrat, ZrO2 Rt 24 h --- Iod, Magnesiumiodid, Diethylether, Benzol, Mg Rt 72 h --- NaBH4, Iod, THF Rt 24 h --- Hydrazinhydrat, Pd/C, MeOH Rt 14 h --- Hydrazinhydrat, Pd/C, MeOH (Ultraschall-Bad) Rt 14 h --- Hydrazinhydrat, Pd/C, MeOH 60 °C 14 h --- Hydrazinhydrat, Pd/C, EtOH 60 °C 14 h --- *Ausbeute bezieht sich auf eine quantitative Reduktion zum Produkt 140 Abb. 59 Zusammenfassung aller Versuche zur quantitativen Darstellung von 140 In weiteren Versuchen wurden die Reaktionsbedingungen für die Reaktion mit Hydrazin-Hydrat und Palladium auf Aktivkohle als Katalysator in Methanol variiert.[96] Im Allgemeinen wurde Methanol als Lösungsmittel verwendet und die Zeit des Ultraschallbades zum Aktivieren des Katalysators variiert. Dieses lieferte allerdings keine quantitative Umsetzung zum Hydrazino-Produkt 140, ebenso wie bei einem Erhitzen der Reaktionslösung auf 50 °C. Es wurde zwar eine Verschiebung der 64 Resultate und Diskussion Verhältnisse beobachtet, aber es erfolgte keine quantitative Umsetzung. Letztlich wurde versucht, die Reaktion ohne Katalysator stattfinden zu lassen. Auch hierbei konnte sowohl in Methanol, als auch in Ethanol kein reines Hydrazino-Produkt 140 erhalten werden. Es scheint somit nicht möglich zu sein eine quantitative Reduktion des Produktgemisch 140/142 zur reinen Hydrazinoform 140 chemisch zu erreichen. Neben der reduzierten Form 140 spielt die oxidierte Form 142 eine wichtige Rolle in der chemischen Carcinogenese, weshalb im Folgenden versucht wurde, das Produktgemisch 140/142 zur reinen Azoform 142 zu oxidieren (s. Abb. 60). OCPE N N HO N N H N H N O OCPE N OH 140 N HO N HO N N N N N O OCPE N N OH N 142 N O OH 142 Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute* KO2, Toluol Rt 48 h --- NBS, Pyridin, DCM Rt 1.5 h --- *Ausbeute bezieht sich auf eine quantitative Oxidation zum Produkt 142 Abb. 60 Zusammenfassung aller Versuche zur quantitativen Darstellung von 142 65 Resultate und Diskussion Die Oxidation zum Azo-Produkt 142 sollte zum Einen mit Hilfe von Kaliumsuperoxid in Toluol bei Raumtemperatur erfolgen.[97] Hierbei verschoben sich laut NMR zwar nach einer Reaktionszeit von 48 Stunden die Verhältnisse zu Gunsten der AzoKomponente, jedoch war keine quantitative Reaktion zu beobachten. Zum Anderen wurde das Produktgemisch 140/142 in Dichlormethan gelöst, mit Pyridin und NBS versetzt und anschließend bei Raumtemperatur gerührt.[98] Auch hier erfolgte allerdings keine reproduzierbare quantitative Umsetzung zum AzoProdukt 142. Mit dem bei der DNA-Synthese verwendeten Oxidationsreagenz (THF, Pyridin, Iod) konnte ebenfalls keine Verschiebung des Hydrazino / Azo – Gleichgewichtes gefunden werden. Da auch in diesem Fall keine quantitative Überführung des Produktgemisches möglich war, wurde nach einer geeigneten Trennmethode der beiden Komponenten 140/142 gesucht. Eine Trennung über Aluminiumoxid verlief dabei allerdings aufgrund des geringen Polaritätsunterschiedes der beiden Verbindungen erfolglos. Letztendlich konnte eine Trennung des Produktgemisches 140/142 mittels Reversed Phase-Säulenchromatographie erreicht werden. Für die Trennung des Produktgemisches mittels RP-Säule wurde Wasser mit einem Acetonitril-Gradienten (20-40%) als Laufmittel verwendet. Hiermit gelang es die Produkte 140 und 142 getrennt in reiner Form zu isolieren. Die 1H-NMR-Spektren der isolierten Produkte sind in Abb. 61, S. 66 dargestellt. Die erfolgreiche Trennung wurde durch die Ergebnisse der MS-Spektren bestätigt. Auch ließ sich die Trennung des Produktgemisches 141/143 mit dieser Methode durchführen. In Tab. 9 sind die isolierten Ausbeuten der Produkte 140-143 aus der TBDMS-Entschützung zusammengefasst. Produkt Aryl Ausbeute 140 Phenyl 48% 141 4-Biphenyl 31% 142 Phenyl 27% 143 4-Biphenyl 25% Tab. 9 Zusammenfassung der Ausbeuten aus den TBDMS-Entschützungen der Addukte 136-137 66 9. 0 8. 5 8. 0 7. 5 7. 0 6. 5 6. 0 5. 5 ( p p m) 5. 0 4. 5 4. 0 1. 0 3. 5 3. 0 1. 1723 2. 0 1. 1930 3. 0 1. 0246 1. 3065 4. 0 1. 1891 5. 0 ( p p m) 1. 2923 9069 8904 8739 4499 4417 4347 9014 8938 6605 6491 6307 6192 5658 5544 5360 7765 7612 7434 3894 3811 3748 3653 3316 3265 6. 0 4. 4. 4. 4. 4. 4. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 6. 4806 7. 0 2. 2135 1. 0000 9989 9951 9875 8000 7797 7593 6805 6761 6710 6678 6621 6074 5865 8. 0 0. 9668 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 9. 0 2. 2065 1. 8318 2. 4204 1. 5463 1. 0535 I nt e gr al 3089 2982 1862 1094 1008 1. 0318 1. 1522 2. 0596 2. 2238 1. 0880 2. 1853 1. 0779 1. 0660 1. 9682 1. 0000 2. 2. 2. 2. 1. 1. 0241 I nt e gr al 6475 6449 6398 6259 6233 4231 4021 3373 3189 3024 2973 1053 0869 0685 3236 3077 3045 2886 3143 2927 8916 6374 6203 6031 3737 3667 8480 8360 8290 8239 8169 5417 1413 1241 1070 7708 7561 7517 7377 7231 7186 7040 2661 2585 2509 2432 2331 2254 2178 2102 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 7. 6. 6. 6. 6. 5. 5. 4. 4. 4. 4. 4. 4. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. Resultate und Diskussion 0. 0 2. 5 Abb. 61 1H-NMR-Spektren des entschützten N2-Phenylhydrazino-modifizierten Adduktes 140 (oben) und des N2- Azophenyl-modifizierten Adduktes 142 (unten) 67 Resultate und Diskussion Die erhaltenen entschützten N2-Hydrazinoaryl-Addukte 140,141, sowie die entschützten N2-Azoaryl-Addukte 142,143 sollte im Folgenden zu geschützten Bausteinen für die Oligonucleotidsynthese umgesetzt werden. Zunächst musste die 4,4’-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe (DMTr) an der primären Hydroxylgruppe der N2-Hydrazino-Addukte 140,141 eingeführt werden (s. Abb. 62). OCPE N N HO N N N H OCPE H N O Aryl N DMTrCl, Pyridin Rt, 12 h N DMTrO OH N N N H H N Aryl O OH 140,141 144,145 Produkt Aryl Ausbeute 144 Phenyl 69% 145 4-Biphenyl 62% Abb. 62 DMTr-Schützung der N2-Addukte 140,141 Die Edukte 140,141 wurden in absolutem Pyridin gelöst und mit zwei Äquivalenten 4,4’-Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach Aufarbeitung sowie chromatographischer Reinigung über Aluminiumoxid (zur Vermeidung einer weiteren Oxidation) konnten die entsprechenden Produkte 144,145 in einer Ausbeute von 62-69% isoliert werden. Analog konnte die Schützung der entschützten N2-Azoaryl-Addukte 142,143 erfolgen (s. Abb. 63, S. 69). Hierbei konnte auf die Verwendung von Aluminiumoxid verzichtet werden und die Trennung mittels Silica-Kieselgel erfolgen. Die Produkte konnten mit Ausbeuten von 68-76% isoliert werden. 68 Resultate und Diskussion OCPE N OCPE N N N HO N N Aryl N DMTrCl, Pyridin N N DMTrO Rt, 12 h O N N N Aryl O OH OH 142,143 146,147 Produkt Aryl Ausbeute 146 Phenyl 68% 147 4-Biphenyl 76% 2 Abb. 63 DMTr-Schützung der N -Addukte 142,143 An die Dimethoxytritylierung sollte sich die Überführung in die entsprechenden Phosphoramidite anschließen. Zunächst wurden wiederum die N2-HydrazinoarylAddukte 144,145 umgesetzt (s. Abb. 64). OCPE OCPE N N N DMTrO N N H N H N 107, DCI, DCM, MeCN Aryl Rt, 12 h N DMTrO NC 144,145 N N H H N Aryl O O OH N O O P N(iPr)2 Produkt Aryl Ausbeute 148 Phenyl 75% 149 4-Biphenyl 90% 148,149 Abb. 64 Synthese des Phosphoramidite 148,149 Die DMTr-geschützten Addukte 144,145 wurde mit Dichlormethan coevaporiert, in Dichlormethan/Acetonitril gelöst und zunächst mit 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) und anschließend tropfenweise mit Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung und chromatographischer Reinigung über Aluminiumoxid (Neutral, Aktivitätsstufe 3) 69 Resultate und Diskussion konnten die Produkte 148,149 in reiner Form mit Ausbeuten von 75-90% isoliert 7. 0 6. 0 5. 5 5. 0 4. 5 ( p p m) 4. 0 3. 0 2. 5 2. 0 18. 445 3. 5 2. 0588 1. 9887 0. 9847 1. 0000 6. 5 2. 5383 0. 2242 7. 5 0. 6796 8. 0 4. 2297 8. 6956 8. 5 1. 5 1. 0 0. 5 149. 1309 148. 3532 9. 0 0. 6939 1. 3446 12. 445 0. 9561 5. 2833 4. 3215 2. 6146 2. 0683 I nt e gr al 6. 6. 6. 6. 6. 6. 6. 6. 6. 6. 6. 6. 6. 6. 4. 4. 4. 4. 4. 4. 4. 4. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 8553 8522 8433 8232 7771 7715 7595 7538 6845 6738 6687 6580 3668 3535 5343 5280 5198 5097 2160 2090 2027 1895 6625 6486 6354 6285 6222 6152 6014 5793 5711 5535 5497 5446 5390 5345 5301 5182 5150 5119 5100 5043 5018 4986 4904 4885 4835 4784 4721 4671 4652 4589 4526 4387 3978 werden. Abbildung 65 zeigt exemplarisch die NMR-Spektren der Verbindung 149. 210 190 170 150 130 110 90 70 ( p p m) 50 30 10 - 10 - 30 - 50 - 70 Abb. 65 1H-NMR- (oben) und 31P-NMR- (unten) 2 Spektren des N -Biphenylhydrazino-modifizierten Phosphoramidites 149 Die Phosphoramidite wurden abschließend jeweils als farblose Schäume nach Abkondensierung aus Benzol erhalten. Analog konnte die Überführung der N2-Azoaryl-Addukte 146,147 erfolgen (s. Abb. 66, S. 71). 70 Resultate und Diskussion OCPE OCPE N N N DMTrO N N N N 107, DCI, DCM, MeCN Aryl N N DMTrO Rt, 12 h N N N Aryl O O OH NC 146,147 O O P 150,151 N(iPr)2 Produkt Aryl Ausbeute 150 Phenyl 51% 151 4-Biphenyl 35% Abb. 66 Synthese des Phosphoramidite 150,151 Hierbei konnte erneut auf die Verwendung von Aluminiumoxid verzichtet werden und die Trennung mittels Silica-Kieselgel erfolgen. Auch hier war es möglich die Produkte 150,151 in reiner Form mit Ausbeuten von 35-51% zu isolieren. Die Phosphoramidite wurden abschließend jeweils als orangefarbene Schäume nach Abkondensierung aus Benzol erhalten und konnten ebenfalls mittels ESI-MS eindeutig charakterisiert werden. Mittels der hier beschriebenen Methode ist es somit erstmals möglich N2-Arylaminmodifizierte 2‘-Desoxyguanosinaddukte herzustellen und diese in die entsprechenden Phosphoramidite zu überführen. Diese entwickelte Syntheseroute liefert neben den N2-Hydrazinoaryl-Addukten zusätzlich noch die ebenfalls in der chemischen Carcinogenese eine Rolle spielenden N2-Azoaryl-Addukte. Diese konnten in sehr guten Ausbeuten isoliert und ebenfalls in die entsprechenden Phosphoramidite überführt werden, wodurch auch diese als Bausteine für die Oligonucleotidsynthese zum gezielten Einbau in DNA und damit zur gezielten Untersuchung solcher Modifikationen auf die Eigenschaften eines DNA-Dublex zur Verfügung stehen. Die für die Synthese eines weiteren Typs von aromatischen Aminen gebildeten Addukten, den O6-2‘-dG-Addukten, unternommenen Versuche sollen im Folgenden diskutiert werden. 71 Resultate und Diskussion 4.3 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine Die Darstellung der Arylamin-modifizierten Oligonucleotidbausteine sollte ausgehend vom 2’-Desoxyguanosin 52 erfolgen. Bei der gewählten Syntheseroute stellt die Einführung der Modifikation in die O6-Position des Guanins den bedeutendsten Schritt dar. Dabei sollte die C-O-N-Bindung des Adduktes 153 generiert und dieses anschließend in das Phosphoramidit 152 überführt werden (s. Abb. 67). Aryl HN O N N N N DMTrO N N(Me)2 O NC O O P 152 N(iPr)2 HN O N N HO Aryl O N N N NH2 O NH N N HO NH2 O OH OH 153 52 Abb. 67 Retrosynthese der Darstellung O6-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite Die Einführung einer solchen Modifikation ist prinzipiell auf mehreren Wegen denkbar. In den durchgeführten Fällen wurde von einer bereits bestehenden C-O-NBindung an einem Hydroxylamin ausgegangen und versucht, diese zunächst mittels Mitsunobu-Reaktion oder durch Substitution einzuführen. Die Versuche hierzu sollen im Folgenden aufgezeigt werden. 72 Resultate und Diskussion 4.3.1 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine mittels Mitsunobu-Reaktion Bei diesem Syntheseweg sollte die Einführung der Arylaminmodifikation an der O6Position mittels einer Mitsunobu-artigen Reaktion am bereits synthetisierten TBDMSgeschützten 2‘-dG 121 mit einem Arylhydroxylamin 155 erfolgen (s. Abb. 68). HN O N N N TBDMSO N NH2 O OTBDMS 154 O N N TBDMSO HO NH N NH NO2 NH2 O OTBDMS 155 121 156 6 Abb. 68 Retrosyntheseschema zur Darstellung O -modifizierter Addukte mittels Mitsunobu-Reaktion Das für die Mitsunobu-Reaktion benötigte Hydroxylamin 155 sollte dabei aus der entsprechenden Nitroarylverbindung 156 zugänglich sein. Die Synthese hierfür wurde analog zu Brink et al. durchgeführt (s. Abb. 69, S. 74).[99] 73 Resultate und Diskussion HO NO2 NH4Cl, Zn, H2O NH 60 °C, 20 min. 43% 156 155 Abb. 69 Darstellung des N-Phenylhydroxylamin 155 Bei dieser Reaktion wurde zunächst eine Lösung aus Nitrobenzol und einer wässrigen Ammoniumchlorid-Lösung auf 60 °C erhitzt und dann in einem Zeitraum von ca. 20 Minuten mit der entsprechenden Menge Zink versetzt. Nach anschließender Aufarbeitung konnte das Produkt mit einer Ausbeute von 43% erhalten werden. Die Einführung der O6-Arylamin-Modifikation sollte nun an dem bereits synthetisierten 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG 121 mittels einer Mitsunobu-Reaktion erfolgen (s. Abb. 70). HN O O N NH N TBDMSO N HO NH NH2 N PPh3, DIAD, 1,4-Dioxan 0 °C -> Rt, 14 h O N TBDMSO N NH2 O OTBDMS OTBDMS 121 N 154 155 6 Abb. 70 Versuch der Darstellung des O -Adduktes 154 Hierzu wurden die bereits für die Benzylierung der C8-Addukte und für die CPESchützung der N2-Addukte etablierten Synthesebedingungen angewandt. Die Edukte 121 und 155 wurden dabei mit Triphenylphosphin vorgelegt, in 1,4-Dioxan gelöst und bei 0 °C mit DIAD versetzt. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur und einer Reaktionszeit von 14 Stunden konnte jedoch kein Umsatz des geschützten 2‘-dG 121 beobachtet werden. Vielmehr war eine unerwünschte Reaktion an der NH- 74 Resultate und Diskussion Gruppierung des Hydroxylamins 155 zu beobachten, welches die Bildung des gewünschten Produktes unmöglich machte. Um das Problem der höheren Reaktivität der NH-Funktion des Hydroxylamin 155 im Vergleich zu der Hydroxyl-Gruppe zu umgehen, sollte eine selektive Schützung der NH-Funktion erfolgen. Als Schutzgruppen sollten dabei basenlabile Gruppen (um eine Abspaltung nach der Oligonucleotidsynthese mit Ammoniak zu garantieren) wie Acetyl und Benzoyl eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit sollte die hydrogenolytisch abspaltbare Benzylgruppe sein. Zunächst erfolgte die Acetyl-Schützung zur N-Acetyl-N-phenylhydroxamsäure 157 analog zu Trager et al. (s. Abb. 71).[100] HO NH HO Et2O, NaHCO3, AcCl NAc Rt, 16 h 155 49% 157 Abb. 71 Acetyl-Schützung des Hydroxylamins 155 Die Umsetzung des Hydroxylamin 155, welches in Diethylether gelöst wurde, erfolgte mit Natriumhydrogencarbonat und Acetylchlorid bei einer Temperatur von 0 °C und anschließendem 16-stündigen Rühren und Aufarbeitung mit einer Ausbeute von 49%. Eine Benzyl-NH-Schützung konnte analog zu Utzinger erreicht werden (s. Abb. 72).[101] HO NH HO Pyridin, H2O BnCl NBn Rt, 16 h 155 46% 158 Abb. 72 Benzyl-Schützung des Hydroxylamins 155 Die Einführung der Benzyl-Gruppe an das Hydroxylamin 155 erfolgte durch Reaktion unter Lichtausschluss mit Benzylchlorid in Pyridin und einigen Tropfen Wasser. Nach 75 Resultate und Diskussion 16-stündigen Rühren und Aufarbeitung wurde das Produkt mit einer Ausbeute von 46% erhalten. Als drittes konnte die Schützung mit der Benzoyl-Gruppe analog zu Nikrad erreicht werden (s. Abb. 73).[102] HO HO NH Et2O, NaHCO3, BzCl NBz 0 °C , 3 h 68% 155 159 Abb. 73 Benzoyl-Schützung des Hydroxylamins 155 Die Reaktion erfolgte durch Zugabe von Benzoylchlorid zu bereits gelöstem Hydroxylamin 155 in Diethylether in Gegenwart von Natriumhydrogencarbonat bei einer Temperatur von 0 °C. Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden konnte das Produkt in reiner Form durch Filtration mit einer Ausbeute von 68% erhalten werden. Die folgenden Reaktionen, die Umsetzung des 3´,5´-Bis-(TBDMS)-2´-dG-Derivates 121 mit der N-Acetyl-N-phenylhydroxamsäure 157 bzw. dem N-Benzyl-N- phenylhydroxylamin 158 erfolgten unter unterschiedlichen Synthesebedingungen (s. Abb. 74, S. 77). Dabei erfolgte stets zunächst die Zugabe von Triphenylphosphin und DIAD, welche zur Bildung eines Betains führen, das wiederum durch das geschützte Hydroxylamin protoniert werden sollte. Das auf diese Weise aktivierte Triphenylphosphin sollte unter Addition mit dem O6-Atom des 2´-dG reagieren. Triphenylphosphinoxid stellt eine gute Abgangsgruppe dar und könnte durch die geschützten Hydroxylamine in einer SN2-Reaktion angegriffen werden.[103-104] Bei den Durchführungen der in der Abbildung 74, S. 76 aufgeführten Reaktionen fanden vor allem Variationen in Bezug auf die Lösungsmittel statt. Hier wurden Acetonitril, 1,4-Dioxan, Dichlormethan sowie THF verwendet. Außerdem wurden die Reaktionen unter Zugabe von Imidazol durchgeführt, welches als Deprotonierungsreagenz für das jeweils eingesetzte N-geschütze Hydroxylamin dienen sollte.[105] 76 Resultate und Diskussion SGN O O N NH N TBDMSO N NH2 N PPh3, DIAD, LM, Zusatz N TBDMSO N NH2 O O OTBDMS OTBDMS 154 121 geschütztes N SG: Ac, Bn, Bz Lösungsmittel Base Temp. Zeit Ausbeute 157 THF --- Rt 16 h --- 157 THF Imidazol Rt 16 h --- 157 MeCN --- 20 h --- 157 DCM Imidazol Rt 20 h --- 157 Dioxan --- Rt 16 h --- 158 THF Imidazol Rt 16 h --- Hydroxylamin -40 °C -> Rt 6 Abb. 74 Versuche zur Darstellung von O -Addukten unter Mitsunobu-Bedingungen Sämtliche Variationen führten jedoch leider nicht zu einer Umsetzung und zu dem gewünschten Produkt 154, wodurch eine Reaktion unter Mitsunobu-Bedingungen als Syntheseweg zum O6-Addukt ausgeschlossen werden kann. Als eine weitere Möglichkeit der Darstellung der O6-Addukte kommt eine Einführung der Modifikation durch eine Substitutionsreaktion mit den bereits dargestellten geschützten Hydroxylaminen 157-159 in Frage. Die entsprechenden Versuche sollen im Folgenden aufgezeigt und diskutiert werden. 77 Resultate und Diskussion 4.3.2 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine mittels einer Substitutions-Reaktion Eine einfache Methode zur Einführung einer Propiohydroxamsäure in die O6-Position von Guanosin unter Abspaltung von Wasser wurde von Shibaeva beschrieben.[106] Diese Methode sollte auf das ungeschützte 2‘-Desoxyguanosin 52 und das geschützte Arylhydroxylamin 159 angewendet werden (s. Abb. 75). BzN O O N N HO HO NH N N NBz LM, H2O NH2 O N N HO Aryl N NH2 O OH OH 159 52 161 Lösungsmittel pH Temp. Zeit Ausbeute MeCN 9 Rt 7d --- MeCN 10 Rt 7d --- Pyridin 10 Rt 7d --- MeOH 10 Rt 7d --- Abb. 75 Versuche zur direkten Einführung der O6-Arylamin-Modifikatinon nach Shibaeva Für die Reaktionen wurde 2‘-dG 52 in einer Mischung aus dem verwendeten Lösungsmittel und einer wässrigen pH-definierten Lösung (pH 9 und 10) gegeben und mit der Benzoyl-geschützten Hydroxamsäure 159 versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 7 Tagen konnte jedoch dünnschichtchromatographisch kein Umsatz detektiert werden. Eine Erhöhung der Temperatur führte ebenfalls nicht zu einer Umsetzung und das Edukt konnte reisoliert werden. Es ist davon auszugehen, dass der Grund für das Misslingen dieser Reaktionen die Eigenschaft des O6Sauerstoffs als schlechte Austrittsgruppe zu fungieren ist. Diese Art von Substitution mit einer Propiohydroxamsäure konnte jedoch von Shibaeva bei Ribonucleosiden beobachtet werden konnte. 78 Resultate und Diskussion Um eine Substitutionsreaktion möglich zu machen, sollten im Folgenden verschiedene Austrittsgruppen an der 6-Position eingeführt werden (s. Abb. 76). HN O N N N HO Aryl N NH2 O OH 162 O AG N N SGO N N N NH2 NH N SGO O O OSG OSG N NH2 164 163 AG: Cl, N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl, benzotriazoyl SG: Ac, TBDMS 6 Abb. 76 Retrosyntheseschema der O -Arylamin-Addukt Darstellung mittels Substitution Ausgehend von an den Hydroxyfunktionen geschützten 2‘-dG-Derivaten 164 sollte im Folgenden eine Austrittsgruppe in der 6-Position eingeführt werden, welche nach Substitution und anschließender Schutzgruppenabspaltung das gewünschte O6Addukt 162 liefern sollte. Als Abgangsgruppen sollte dabei zunächst Chlorid Verwendung finden. Als alternative Gruppen kämen N-Phenyl-2,2,2- trifluoracetimidoyl und Benzotriazoyl in Frage. Die durchgeführten Versuche sollen im Folgenden aufgezeigt werden. Für die Einführung der Chlorid-Funktion in 6-Position mussten zunächst die Hydroxylgruppen des 2‘-Desoxyguanosin 52 durch Acetylgruppen geschützt werden. Die Synthese geschah analog zu Matsuda (s. Abb. 77, S. 80).[107] 79 Resultate und Diskussion O O N NH N HO NH2 N Et3N, DMAP, Ac2O, Pyridin, MeCN NH NH2 N O 98% OH N AcO Rt, 20 h O N OAc 165 52 Abb. 77 Acetylierung von 2‘-Desoxyguanosin 52 Die Darstellung von 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin 165 erfolgte ausgehend von 2’-Desoxyguanosin-Monohydrat 52, welches in Pyridin und Acetonitril suspendiert wurde. Nachdem DMAP, Triethylamin und Essigsäureanhydrid zugegeben wurde, wurde die Lösung für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und nach anschließender Filtration konnte das Produkt in einer sehr guten Ausbeute von 98% erhalten werden. Anschließend erfolgte die Umsetzung zum 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´- desoxyribosylpurin 166 (s. Abb. 78).[108] Cl O N N AcO NH N NH2 Et4NCl, POCl3 N,N-Dimethylanilin, MeCN reflux, 10 min. O 70% OAc N N AcO N N NH2 O OAc 165 166 Abb. 78 Chlorierung des 2‘-Desoxyguanosinderivates 165 Dazu wurde das zuvor dargestellte 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin 165 zusammen mit Tetraethylammoniumchlorid in Acetonitril gelöst und mit N,N-Dimethylanilin und Phosphorylchlorid versetzt. Nach kurzem Erhitzen auf 80 °C und Aufarbeitung mit chromatographischer Reinigung wurde das Produkt in einer Ausbeute von 70% erhalten. Bereits 2003 gelang es Zemlicka et al., an solchen Derivaten eine nucleophile Substitution an der 6-Position, u. a. mit Alkoholen oder Aminen, durchzuführen.[109] Diese Durchführungen sollten sich auf die Substitution mit den geschützten 80 Resultate und Diskussion Hydroxylaminen 157-158 übertragen lassen und eine Darstellung der gewünschten O6-Addukte ermöglichen. Die durchgeführten Synthesen sind in Abb. 79 zusammengefasst. SGN O Cl N N AcO N N N NH2 N AcO O O OAc OAc N N NH2 167 166 SG: Ac, Bn geschütztes Lösungsmittel/Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute 158 EtOH, Et3N, DMAP 80 °C 20 h --- 158 THF, NaH Rt 20 h --- 158 THF, NaH 80 °C 20 h --- 158 EtOH Rt 70 h --- 158 EtOH 80 °C 70 h --- 158 Pyridin Rt 70 h --- 158 Pyridin 80 °C 70 h --- 158 Formamid 100 °C 40 h --- 158 1,2-DME, K2CO3 80 °C 40 h --- 157 EtOH Rt 72 h --- 157 EtOH, Pyridin 80 °C 72 h --- 157 EtOH, DIPEA 80 °C 72 h --- 157 EtOH 80 °C 72 h --- Hydroxylamin Abb. 79 Zusammenfassung der Versuche zur Substitution am 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´desoxyribosylpurin 166 Bei den durchgeführten Testreaktionen wurden dabei jeweils 50-100 mg des 2Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-desoxyribosylpurins 166 mit 2 Äquivalenten des geschützten Hydroxylamins 157, 158 in dem verwendeten Lösungsmittel gelöst und 81 Resultate und Diskussion bei der angegebenen Temperatur (ggf. unter Zugabe der aufgeführten Basen zur Deprotonierung der Hydroxylamine) für 20 – 72 Stunden gerührt. Hierbei wurden Variationen in Bezug auf das Lösungsmittel, die Reaktionstemperatur und die Deprotonierungsreagenzien durchgeführt, wobei SN2-begünstigende protisch polare wie Ethanol und Formamid, aber auch als Deprotonierungsreagenzien wirkende Lösungsmittel wie Pyridin zum Einsatz kamen. Für die mit dem N-Benzyl-N-phenylhydroxylamin 158 durchgeführten Reaktionen führte weder eine Erhöhung der Temperatur noch ein Zusatz von Deprotonierungsreagenzien wie Kaliumcarbonat oder Triethylamin in dieser Reihe zu dem gewünschten O6-Addukt. Dabei konnte durch dünnschichtchromatographische Überprüfung keine Umsetzung der Edukte bei Raumtemperatur beobachtet werden. Bei den bei 80 °C durchgeführten Reaktionen fand eine Zersetzung (Abspaltung der Acetylgruppe) des Zucker-Derivates statt. Bei den Reaktionen mit N-Acetyl-N-phenylhydroxamsäure 157 konnten die zuvor beschriebenen Beobachtungen bestätigt werden und außerdem eine Zersetzung des Eduktes 166 dünnschichtchromatographisch detektiert werden. Auch in dieser Versuchsreihe konnte das gewünschte O6-Addukt nicht isoliert werden. Eine Ausnahme bildet die bei Raumtemperatur in Ethanol durchgeführte Reaktion des 2‘-dG-Derivates 166 mit der Hydroxamsäure 157. Bei dieser Reaktion erfolgte wahrscheinlich die Abspaltung der Acetyl-Schutzgruppe der Hydroxamsäure 157, wodurch die reaktivere NH-Funktion mit dem Desoxyribosylpurin-Derivat unter Wasserabspaltung zu einem Produkt führte, in dem sich das Stickstoff-Atom direkt am C6 befindet. Da bei den durchgeführten Reaktionen mit Hilfe der aufgenommenen NMR-Spektren zum Teil Abspaltungen der Acetyl-Schutzgruppen beobachtet wurden, sollten im Folgenden Versuchsreihen mit TBDMS-Schutzgruppen in 3´- und 5´-Position des Desoxyribosylpurin-Derivates durchgeführt wurden. Da eine analog durchgeführte Chlorierung mit dem bereits Bis-TBDMS-geschützten 2‘-dG-Derivat 121 zu einer Abspaltung der TBDMS-Gruppen und zu unerwünschten Nebenprodukten führte, sollte die Darstellung ausgehend vom 2-Amino-6-chlor-3´,5´O-acetyl-2´-desoxyribosylpurin 166 durch Entschützung und anschließende TBDMSSchützung erfolgen. 82 Resultate und Diskussion Zunächst wurden die Acetyl-Schutzgruppen durch Zugabe eines Gemisches aus Triethylamin, Wasser und Methanol und anschließendem 3-stündigen Rühren bei Raumtemperatur abgespalten. Nach Aufarbeitung konnte das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von 99% erhalten werden (s. Abb. 80). Cl N N N AcO Cl NH2 N Rt, 3 h O N Et3N, H2O, MeOH N HO NH2 N O 99% OAc N OH 166 168 Abb. 80 Entschützung von 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-desoxyribosylpurin 166 Es folgte die TBDMS-Schützung analog zu den bereits durchgeführten Reaktionen, wodurch das 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyribosylpurin 169 mit einer Ausbeute von 90% erhalten wurde (s. Abb. 81). Cl N N N HO Cl N NH2 TBDMSCl, Imidazol, Pyridin Rt, 16 h O N N NH2 O 90% OH N TBDMSO N OTBDMS 168 169 Abb. 81 TBDMS-Schützung von 2-Amino-6-chlor-2´-desoxyribosylpurin 168 Im Folgenden wurden Versuche unternommen die O6-Modifikation durch eine Umsetzung des 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2´- desoxyribosylpurins 169 mit einem geschützten Hydroxylamin zu erreichen. Bei den durchgeführten Testreaktionen wurden dabei jeweils 50-100 mg des 2-Amino-6chlor-3´,5´-O-TBDMS-2´-desoxyribosylpurins 169 mit 2 Äquivalenten des geschützten Hydroxylamins 157, 158 in dem verwendeten Lösungsmittel gelöst und bei 80 °C unter Zugabe der beschriebenen Base gerührt. Abbildung 82, S. 84 fasst die Ergebnisse dieser Versuche zusammen. 83 Resultate und Diskussion SGN O Cl N N TBDMSO N N N NH2 N N TBDMSO N NH2 O O OTBDMS OTBDMS 170 169 SG: Ac, Bn geschütztes Lösungsmittel/Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute 158 EtOH 80 °C 16 h --- 158 EtOH, K2CO3 80 °C 16 h --- 158 EtOH, DIPEA 80 °C 16 h --- 158 DMSO, DIPEA 80 °C 16 h --- 157 EtOH 80 °C 16 h --- 157 EtOH, K2CO3 80 °C 16 h --- 157 DMSO, DIPEA 80 °C 16 h --- 157 EtOH 80 °C 16 h --- Hydroxylamin Abb. 82 Zusammenfassung der Versuche zur Substitution am 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-TBDMS-2´desoxyribosylpurin 169 Auch bei diesen durchgeführten Reaktionen konnte kein Umsatz des Eduktes 169 beobachtet werden. Einzige Ausnahmen bilden die in Ethanol unter Zugabe von Kaliumcarbonat durchgeführten Reaktionen. In diesen Fällen konnte eine Umsetzung beobachtet werden. Nach anschließender Aufarbeitung und Reinigung gelang es nicht, das entstandene Produkt in reiner Form zu isolieren. Aus den NMR-Daten ließ sich jedoch erkennen, dass nicht das gewünschte Produkt 170 entstanden war, vielmehr scheint eine Reaktion am C8-Atom der Nucleobase stattgefunden zu haben. Eine genaue Identifizierung dieses in geringen Mengen gebildeten Produktes war jedoch nicht möglich. Die beschriebenen Versuche zeigen, dass im vorliegenden Fall Chlorid als Abgangsgruppe ungeeignet ist und eine Substitutionsreaktion zu dem gewünschten O6-Addukt auf diesem Wege nicht möglich ist. 84 Resultate und Diskussion Eine Alternative als Abgangsgruppe stellt die von Papot et al. verwendete N-Phenyl2,2,2-trifluoracetimidoyl-Gruppe dar.[110] Ihnen gelang es, an einer glycosidischen Hydroxylgruppe diese Funktion einzuführen und mit einer Hydroxamsäure zu substituieren. Das für die Einführung dieser Abgangsgruppe benötigte Chlorid sollte zunächst aus Anilin und Trifluoressigsäure hergestellt werden (s. Abb. 83). CF3 NH2 PPh3, Et3N, Cl CCl4 O F3C OH reflux, 20 h 22% 171 1 N 172 Abb. 83 Darstellung von N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoylchlorid 172 Dabei wurden Triphenylphosphin, Anilin 1, Triethylamin zunächst in Tetrachlorkohlenstoff suspendiert und unter Reflux mit Trifluoressigsäure versetzt und für 20 Stunden gerührt. Das Produkt konnte nach Aufarbeitung und abschließender Destillation mit 22% Ausbeute erhalten werden. Die Einführung dieser Schutzgruppe geschah anschließend unter den von Papot beschriebenen Bedingungen (s. Abb. 84).[110] N O N O NH N TBDMSO N NH2 N CF3 Cl N O Et3N, DMAP, DCM TBDMSO Rt, 14 h OTBDMS 121 CF3 172 40% N N N NH2 O OTBDMS 173 Abb. 84 N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl-Schützung Dabei wurden die beiden Edukte 121 und 172 zunächst in Dichlormethan gelöst und anschließend mit Triethylamin und DMAP versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 14 85 Resultate und Diskussion Stunden bei Raumtemperatur und anschließender chromatographischer Reinigung konnte das Produkt 173 in 40% Ausbeute erhalten werden. Die abschließende Substitutionsreaktion unter Verwendung von TMSO-Triflat wurde ebenfalls analog zu den von Papot beschriebenen Versuchen durchgeführt (s. Abb. 85).[110] N CF3 AcN O O N N TBDMSO N N N O NH2 157, TMSOTf, DCM - 20 °C -> Rt, 4h OTBDMS 173 N N TBDMSO N NH2 O OTBDMS 170 Abb. 85 Versuch der TMSOTf-katalysierten Substitutionsreaktion nach Papot Hierbei wurde das geschützte 2‘-dG-Derivat 173 in Dichlormethan unter Zugabe von aktiviertem Molekularsieb gelöst und nach der Zugabe von TMSO-Triflat mit dem geschützten Hydroxylamin 157 bei einer Temperatur von – 20 °C versetzt. Nach anschließendem Erwärmen und einer Reaktionszeit von vier Stunden konnte kein Umsatz des Nucleosid 173 dünnschichtchromatographisch detektiert werden. Allerdings konnte eine Zersetzung des geschützten Hydroxylamins 157 beobachtet werden. Auch diese Methode eignet sich damit nicht, um mittels einer Substitutionsreaktion die gewünschten O6-Addukte zu synthetisieren. Als eine letzte Abgangsgruppe sollte die von Lakshman zur Synthese C6modifizierter Inosin-Derivate etablierte Benzotriazoyl-Funktion untersucht werden.[111] Ihm gelang es, nach Addition von Benzotriazol an die O6-Position des Inosins nucleophile Substitutionsreaktionen mit Alkoholen, Aminen, Phenolen und Thiolen durchzuführen. Das hierfür benötigte, geschützte 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 174 musste zunächst hergestellt werden (s. Abb. 86, S. 87). 86 Resultate und Diskussion N N N O O N N TBDMSO N NH N NH2 BOP, DIPEA, DMF N TBDMSO 65% OTBDMS N NH2 O Rt, 72 h O N OTBDMS 174 121 Abb. 86 Benzotriazol-Schützung von 3’,5’-BisTBDMS-2‘-dG 121 Das geschützte Nucleosid 121 wurde dafür in DMF gelöst und anschließend mit BOP (Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat) und Diisopropylethylamin (Hünigs Base) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 72 Stunden konnte das Produkt nach Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung in einer Ausbeute von 65% isoliert werden. Die Substitutionsreaktion sollte zunächst aufgrund möglicher Selektivitäten metallkatalysiert durchgeführt werden. Ähnliche Versuche zur Verwendung von Hydroxylaminen als Sauerstoff-Nucleophile wurden von Takemoto 2005 beschrieben.[112] Die analog durchgeführten Versuche sind in Abb. 87, S. 88 zusammengefasst. Bei den Reaktionen wurde das Benzotriazol-geschützte 2‘-dG-Derivat 174 in dem verwendeten Lösungsmittel vorgelegt und anschließend mit dem Katalysator sowie dem geschützten Hydroxylamin 159 versetzt. Als Katalysator wurden dabei die von Takemoto verwendeten Tetrakis(triphenylphosphino)palladium und das dimere Iridiumcyclooctadienchlorid eingesetzt. Nach Reaktionszeiten von 24 Stunden bei Raumtemperatur konnte jedoch erneut in beiden Fällen kein Umsatz des Eduktes 174 dünnschichtchromatographisch detektiert werden. 87 Resultate und Diskussion N N N O N N N N TBDMSO BzN O N NH2 N TBDMSO N NH2 O O OTBDMS OTBDMS 174 geschütztes N 170 Lösungsmittel/Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute 159 DCM, [IrCl(cod)]2 Rt 24 h --- 159 MeCN, Pd(PPh3)4 Rt 24 h --- Hydroxylamin Abb. 87 Versuche zur metallkatalysierten Substitution an 174 Als letzte Variante sollte eine basen-katalysierte Substitution mit dem Benzotriazolgeschützten 2‘-dG-Derivat 174 durchgeführt werden. Nach der durch die Base erfolgten Deprotonierung sollte die Hydroxamsäure 157 an der C6-Position selektiv angreifen und unter Abspaltung von Hydroxybenzotriazol das gewünschte geschützte O6-Addukt liefern. Als Base sollte neben Cäsiumcarbonat (mit 1,2-DME als Lösungsmittel) auch Pyridin Verwendung finden, welches sowohl als Base als auch als Lösungsmittel dienen sollte. Für die Versuche wurden 174 und 1.5 Äquivalente Hydroxamsäure 157 in dem jeweiligen Lösungsmittel gelöst, ggf. mit der Base versetzt, und bei Raumtemperatur gerührt. Bei den durchgeführten Reaktionen konnte bereits nach kurzer Zeit eine dünnschichtchromatographische Umsetzung zu zwei Produkten beobachtet werden. Diese konnten nach kompletter Umsetzung und anschließender säulenchromatographischer Reinigung sauber erhalten werden. Neben dem erhaltenen 3’,5’-BisTBDMS-2‘-dG 121 konnte auch das zweite Produkt charakterisiert werden. Zwar handelt es sich auch bei diesem nicht um das gewünschte O6-Addukt, vielmehr konnte das unerwartet entstandene C8-N-Acgeschützte Addukt 175 isoliert werden (s. Abb. 88, S. 89). 88 Resultate und Diskussion N N N O N N N N TBDMSO O N NH AcN NH2 N TBDMSO O N NH2 O OTBDMS OTBDMS 174 175 Lösungsmittel/Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute 157, Cs2CO3, 1,2-DME Rt 2h 52% 157, Pyridin Rt 16 h 75% Abb. 88 Zusammenfassung der Versuche zur basenkatalysierten Substitution an 174 Die Umsetzung zum Produkt 175 gelang dabei in 1,2-DME unter Zugabe von Cäsiumcarbonat mit einer Ausbeute von 52% nach zwei Stunden, während die Verwendung von Pyridin als Base und Lösungsmittel nach 16 Stunden gar eine Ausbeute des sauberen Produktes von 75% lieferte. Mittels dieser Methode sind offensichtlich die O6-Addukte nicht zugänglich, jedoch ist hiermit eine neue und erste Methode gefunden worden, die einen schnellen und einfachen Zugang zu den C8-N-Ac-Addukten liefert, welche ebenfalls eine Rolle in der chemischen Carcinogenese spielen. Im Gegensatz zu der bislang einzigen veröffentlichten Syntheseroute solcher Addukte von Schärer et al. (s. Abb. 16, S. 20) ist hier keine komplexe Schutzgruppenstrategie sowie keine metallkatalysierte Kreuzkupplungsreaktion nötig. Allerdings scheint hier eine zunächst durchgeführte Aktivierung der O6-Position mit Benzotriazol elementar. In einer durchgeführten Testsynthese zur direkten Umsetzung von 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG 121 unter Zugabe der Hydroxamsäure 157, BOP und DIPEA in DMF konnte auch nach 96 Stunden keine Umsetzung detektiert werden (s. Abb. 89, S. 90). Auch eine zu erwartende erneute Aktivierung der O6-Position mit Benzotriazol konnte nicht beobachtet werden. 89 Resultate und Diskussion O O N N TBDMSO N NH N O NH2 157, BOP, DIPEA, DMF TBDMSO NH AcN N N NH2 O Rt, 96 h OTBDMS OTBDMS 175 121 Abb. 89 Versuch zur direkten Umsetzung von 121 zu dem C8-N-Ac-Addukt 175 Diese Beobachtungen geben einen ersten Aufschluss über den Mechanismus, welcher zu dem unerwarteten Produkt 175 führen könnte. Da ebenfalls kein an der O6-Position Benzotriazol-geschütztes C8-N-Ac-Addukt erhalten werden konnte, scheint zunächst eine Reaktion der Hydroxamsäure mit der Benzotriazol-Gruppe stattzufinden (s. Abb. 90). O N O N OH N N 157 N O N N N TBDMSO N N N O N O N NH2 O N TBDMSO N N NH2 O OTBDMS OTBDMS 174 O N N N O O N N TBDMSO O NH AcN N NH2 N N N TBDMSO NH N NH2 O O OTBDMS OTBDMS 175 Abb. 90 Postulierter Mechanismus zur Darstellung der C8-N-Ac-Addukte aus 174 90 Resultate und Diskussion Nach einer Addition der Hydroxamsäure 157 an die Benzotriazol-Gruppe könnte sich unter Abspaltung von Hydroxybenzotriazol neben 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG ein hochreaktives Nitreniumion bilden, welches analog zu dem in vivo gefundenen Mechanismus (s. Abb. 6, S. 10) zu dem C8-N-Ac-Addukt 175 reagiert. Durch diesen Mechanismus würde ebenfalls die Entstehung des 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG 121 als Nebenprodukt erklärt werden, da möglicherweise keine quantitative Umsetzung mit dem intermediär gebildeten Nitreniumion erfolgt. Ein solcher Mechanismus wäre insofern bemerkenswert, da hier ein Beispiel für eine elektrophile Arylaminierung vorliegen würde. Diese Methode wurde in vorangegangenen Arbeiten zur Darstellung von C8-Arylamin-Addukten angewendet, lieferte aber mit 2.5% sehr schlechte Ausbeuten (s. Abb. 7, S. 13). Zukünftige Arbeiten sollen Aufschluss über den Mechanismus dieser Reaktion geben. Hierbei könnte ein intermediär entstehendes Nitreniumion abgefangen werden oder eine Reaktionsverfolgung isotopen-markierter Edukte mittels NMR-Spektroskopie erfolgen. Die NMR-Spektren des hier dargestellten C8-N-Ac-Adduktes 175 weisen eine starke Verbreiterung der Signale auf. Diese Beobachtung wurde bereits von Beland et al. gemacht.[113] Diese beschrieben, dass eine solche Verbreiterung möglicherweise durch vorliegende Rotationsisomere verursacht wird. Diese These sollte anhand von NMR-spektroskopischen, temperaturabhängigen Messungen gestützt werden. Diese wurden exemplarisch mit dem Addukt 175 durchgeführt. Dazu wurde die Substanz in DMSO-d6 gelöst und bei verschiedenen Temperaturen spektroskopisch untersucht. Abbildung 91, S. 92 enthält exemplarisch einen Ausschnitt (H1‘, NH2-Funktion, sowie aromatischer Bereich) aus den jeweils durchgeführten Messung aus denen eine für diese Verbindung charakteristische Koaleszenztemperatur (Temperatur, bei der sich beide Signale komplett zu einem überlagern) ermittelt werden kann. Diese liegt über einem Wert von 353 K. 91 Resultate und Diskussion 300 K 323 K 333 K 353 K 8. 8 8. 4 8. 0 7. 6 7. 2 6. 8 6. 4 6. 0 5. 6 5. 2 4. 8 ( p p m) Abb. 91 Koaleszenz im Bereich von 5-8 ppm der Verbindung 175 Um die Zugänglichkeit solcher Addukte für die Oligonucleotidsynthese zu zeigen, sollte das dargestellte Addukt 175 in das entsprechende Phosphoramidit überführt werden. Hierzu wurden bei allen weiteren durchgeführten Reaktionen jeweils die für die C8-Addukte etablierten Bedingungen mit einer Ausgangsmenge von 150 mg angewendet. Zunächst erfolgte die Abspaltung der TBDMS-Gruppen mittels TriethylaminTrihydrofluorid (s. Abb. 92). O N NH AcN N TBDMSO O N O OTBDMS NH2 Et3N*3HF, Et3N, DCM, THF Rt, 3 h 96% N NH AcN N HO N NH2 O OH 175 176 Abb. 92 TBDMS-Entschützung des C8-N-Ac-Adduktes 175 Das komplett entschützte Addukt 176 konnte dabei mit einer sehr gute Ausbeute von 96% isoliert werden. Anschließend erfolgte die Einführung der basenlabilen Schutzgruppe Formamidin an der exocyclischen Aminofunktion (s. Abb. 93, S. 93). 92 Resultate und Diskussion O N NH AcN N HO O N NH2 O N DimethylformamidAcN diethylacetal, Pyridin HO O Rt, 24 h OH 61% 176 NH N N N N(Me)2 OH 177 Abb. 93 Formamidin-Schützung des C8-N-Ac-Adduktes 176 Nach säulenchromatographischer Reinigung konnte dabei das entsprechende Produkt 177 mit einer Ausbeute von 61% isoliert werden. Als weitere Schutzgruppe wurde die DMTr-Funktion an der 5‘-OH-Gruppe eingeführt (s. Abb. 94). O O N NH AcN N HO N O N N(Me)2 N DMTrCl, Pyridin Rt, 3.5 h N DMTrO 56% OH NH AcN N N N(Me)2 O OH 178 177 Abb. 94 DMTr-Schützung des C8-N-Ac-Adduktes 176 Das entsprechend geschützte Produkt konnte dabei nach Aufarbeitung und Reinigung mit einer Ausbeute von 56% erhalten werden. Abschließend sollte die Überführung in das Phosphoramidit 179 erfolgen (s. Abb. 95, S. 94). 93 Resultate und Diskussion O N NH AcN N DMTrO O N N N 107, DCI, DCM, MeCN N(Me)2 O N N N(Me)2 O 68% OH N DMTrO Rt, 1 h NH AcN 178 NC O O P 179 N(iPr)2 Abb. 95 Überführung des C8-N-Ac-Addukt 178 in das entsprechende Phosphoramidit 179 Auch diese Überführung gelang unter den für die C8-Addukte etablierten Reaktionsbedingungen und das Produkt 179 konnte mit einer zufriedenstellenden Ausbeute von 68% erhalten werden. Somit ist es gelungen das C8-N-Ac-Arylamin-modifizierte Addukt darzustellen und in insgesamt sieben Syntheseschritten, ausgehend vom 2‘-dG, in das entsprechende Phosphoramidit 179 mit einer Gesamtausbeute von 20% zu überführen und damit eine höchst effiziente Syntheseroute für die Zugänglichkeit solcher Addukt und deren Einbau in Oligonucleotide zu entwickeln. Die Untersuchungen dieser Addukte und deren gezielter Einbau in Oligonucleotide sind Gegenstand gegenwärtiger Arbeiten in unserem Arbeitskreis und werden von Frau Sarah Krüger durchgeführt. 4.4 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide Die im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten C8- und N2-Arylamin-modifizierten Phosphoramidite sollten nun gezielt in verschiedene Oligonucleotide eingebaut und deren Einfluss auf die Eigenschaften untersucht werden. Oligonucleotide sind Polymere, die durch Polykondensation von Nucleosidphosphaten entstehen. Im Gegensatz zu der auf 5’-Triphosphaten basierenden natürlichen DNA-Synthese verläuft die Oligonucleotidsynthese am DNASynthesizer aufgrund der höheren Reaktivität der 5’-Hydroxygruppe in 3’→5’Richtung. Die unterscheiden Methoden sich im Phosphorsäureesterbindung zur chemischen Wesentlichen erhalten wird. Synthese durch Man von die Oligonucleotiden Art unterscheidet wie die die Triester-, 94 Resultate und Diskussion Phosphit-, Phosphoramidit-, Ausgangsverbindung der bzw. H-Phosphonatmethode Synthese fungiert das (s. Abb. entsprechend 96). Als geschützte Nucleosidderivat 180. Triestermethode: DMTrO O DMTrO O B HO O + O O P O OR2 B Kondensation O O P 2 R O O OR1 O 180 DMTrO O B O HO O O P O H B O + B OR1 H-Phosphonatmethode: DMTrO B O O P O O 1) Kondensation 2) Oxidation OR1 B O B 180 OR1 Phosphit- (X=Cl) bzw. Phosphoramiditmethode (X=N(i-Pr)2): DMTrO O DMTrO B O X HO + O P OR 181 H B= N N N ABz 2) Oxidation O 180 X = Cl, 182 N H N N N CBz OR1 O O N B O O N N O O P 2 RO O 1) Katalyse OR1 2 O B O B O N NH N N Gform N(Me)2 NH DMTr = O N O T Abb. 96 Methoden der Oligonucleotidsynthese 95 Resultate und Diskussion Obgleich viele Schutzgruppen bekannt sind, haben sich aufgrund der Automatisierung der DNA-Synthese einige wenige Schutzgruppen durchgesetzt. Dies sind im Wesentlichen die von Khorana[114] eingeführten Acylgruppen für die exocyclischen Aminofunktionen an Adenin und Cytosin, die Formamidin-Gruppe am Guanin sowie die 4,4’-Dimethoxytriphenylmethylgruppe (DMTr) an der 5’- Hydroxylgruppe der Desoxyribose. Das Startmolekül wird bei der automatisierten Festphasensynthese über die 3’-Hydroxylgruppe und einem Linker an einen sogenannten „controlled pore glass“Träger (CPG-Träger) gebunden. Der Linker zwischen dem festen Trägermaterial und dem Startnucleosid ist im allgemeinen eine Dicarbonsäure (meist Bernsteinsäure), die wiederum an ein langkettiges Alkylamin (Long Chain Amino Alkyl) gebunden ist. Die wegen ihrer sehr guten Ausbeuten standardmäßig angewandte Methode ist die Phosphoramiditmethode. Hier wird ein geschütztes Nucleosidphosphoramidit 181 in Gegenwart eines Aktivators wie Tetrazol oder Dicyanoimidazol mit einem 5’-OHfreien Nucleosid 180 zu einem Phosphittriester umgesetzt. Eine nachfolgende Oxidation führt zum entsprechenden Phosphattriester 182. Durch die höhere Reaktivität der P(III)-Verbindungen im Gegensatz zu den P(V)Verbindungen sind die Phosphoramidite attraktive Edukte, wobei zunächst ihre schlechte Zugänglichkeit und Lagerfähigkeit der monomeren Bausteine im Wege stand. Mit der Einführung der durch milde Säuren aktivierbaren Phosphoramidite durch H. Köster et al.[115] und deren Optimierung durch M. H. Caruthers et al.[116] gelang der Durchbruch, wobei heute die Diisopropylaminoverbindungen in Verbindung mit der 2-Cyanoethylschutzgruppe den besten Kompromiss darstellen. Der Synthesezyklus (s. Abb. 97, S. 97) beginnt mit der Abspaltung der DMTrSchutzgruppe durch Trifluoressigsäure (TFA, 1% in Acetonitril) (Schritt 1). Darauf folgt die Addition des Nucleosidphosphoramidits, das zuvor durch DCI aktiviert wurde (Schritt 2). Man erhält zunächst ein 3’→5’-verknüpftes Dinucleosidphosphit mit einer Ausbeute von über 99% (Schritt 3). Zur Vermeidung von Fehlsequenzen werden daraufhin nicht abreagierte 5’-Hydroxygruppen mit Essigsäureanhydrid und NMethylimidazol als 5’-Acetate blockiert (Schritt 4). Der anschließenden Oxidation des dreiwertigen Phosphits zum fünfwertigen Phosphat mit einer Iodlösung (Schritt 5) 96 Resultate und Diskussion folgen erneut die saure Abspaltung der nächsten DMTr-Gruppe und der Eintritt in den sich wiederholenden Synthesezyklus. Oligonucleotid 6. Schutzgruppen abspaltung B = ABz, GForm, CAc oder T NH4OH TrMDO O NC 5. Oxidation B O O O P O O O O I2/H2O O NC O O P B CPG CPG F3CCOOH B HO O O O O O B CPG 3. Addition 4. Capping AcO O O B 1. Detritylierung O TrMDO TrMDO B CPG H N CN N CN 2. Aktivierung B TrMDO CPG < 1% Kettenabbruch O N O P O B CN Abb. 97 Synthesezyklus der Phosphoramiditmethode Nach Abschluss der Synthese wird unter Standardbedingungen das Oligonucleotid mit konzentrierter, wässriger Ammoniaklösung von der festen Phase abgespalten und die Schutzgruppen der Nucleobasen sowie der Phosphatgruppen im gleichen Medium bei erhöhter Temperatur (45 °C) entfernt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Herstellung verschiedener modifizierter und unmodifizierter Oligonucleotide dreier Sequenzen erfolgen. 97 Resultate und Diskussion Zunächst sollte die bereits von Rizzo für das heterocyclische Amin IQ verwendete NarI-Sequenz 56 verwendet werden. Das als Hotspot für aromatische Amine bekannte 12mer sollte an verschiedenen Positionen C8-modifiziert und der Einfluss der Modifikation auf den Tm-Wert und die Konformation untersucht werden (s. Tab. 10). Oligonucleotid Sequenz 56 5'-d(CTCGGCGCCATC) 183 5'-d(GATGGCGCCGAG) 184 5'-d(CTC[G(Anil)]GCGCCATC) 185 5'-d(CTC[G(4-ABP)]GCGCCATC) 186 5'-d(CTCGGC[G(Anil)]CCATC) 187 5'-d(CTCGGC[G(4-ABP)]CCATC) 188 5'-d(CTCGGCG[(4-Anis)]CCATC) Tab. 10 Zusammenfassung aller synthetisierten Oligonucleotide der NarI-Sequenz Als weitere Sequenz wurde ein selbstkomplementäres 12mer gewählt, welches eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRI besitzt (Sequenz wird im Folgenden als EcoRI-Sequenz bezeichnet). Hier sollten neben den C8-Addukten, welche an verschiedenen Stellen der Sequenz eingebaut wurden, auch die synthetisierten N2-Addukte eingebaut werden (s. Tab. 11, S. 99). Anschließend sollten erneut Untersuchungen bezüglich des Einflusses der Modifikation auf den Tm-Wert und die Konformation, sowie den Restriktionsabbau durch das EcoRI-Enzym durchgeführt werden. Um den Einfluss solcher Modifikationen auf längere Oligonucleotide zu untersuchen, wurden als Weiteres die synthetisierten Phosphoramidite in ein nicht-palindromisches 30mer eingebaut (s. Tab. 12, S. 99). Nach den Standarduntersuchungen bezüglich des Einflusses der Modifikation auf den Tm-Wert und die Konformation, sollten in Kooperation mit Prof. Andreas Marx, Universität Konstanz, Primer- Verlängerungsuntersuchungen mit den dargestellten C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden 203-208 erfolgen. 98 Resultate und Diskussion Oligonucleotid Sequenz 57 5'-d(GTAGAATTCTAC) 189 5'-d(GTA[G(Anil)]AATTCTAC) 190 5'-d(GTA[G(4-Anis)]AATTCTAC) 191 5'-d(GTA[G(4-Tol)]AATTCTAC) 192 5'-d(GTA[G(4-Cyano)]AATTCTAC) 193 5'-d(GTA[G(3,5-DMA)]AATTCTAC) 194 5'-d(GTA[G(4-ABP)]AATTCTAC) 195 5'-d(GTA[G(2-AF)]AATTCTAC) 196 5'-d([G(Anil)]TAGAATTCTAC) 197 5'-d([G(4-ABP)]TAGAATTCTAC) 198 5'-d(GTA[G(N2-Hydr. Anil)]AATTCTAC) 199 5'-d(GTA[G(N2-Hydr. 4-ABP)]AATTCTAC) 200 5'-d(GTA[G(N2-Azo Anil)]AATTCTAC) 201 5'-d(GTA[G(N2-Azo 4-ABP)]AATTCTAC) Tab. 11 Zusammenfassung aller synthetisierten Oligonucleotide der EcoRI-Sequenz Oligonucleotid Sequenz 58 5'-d(AAATGAACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 202 5‘-d(CGTTGGTCCTGAAGGAGGATAGGTTCATTT) 203 5'-d(AAAT[G(Anil)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 204 5'-d(AAAT[G(4-Anis)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 205 5'-d(AAAT[G(4-Tol)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 206 5'-d(AAAT[G(3,5-DMA)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 207 5'-d(AAAT[G(4-ABP)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 208 5'-d(AAAT[G(2-AF)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 209 5'-d(AAAT[G(N2-Hydr. Anil)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 210 5'-d(AAAT[G(N2-Hydr. 4-ABP)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 211 5'-d(AAAT[G(N2-Azo Anil)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) 212 5'-d(AAAT[G(N2-Azo 4-ABP)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) Tab. 12 Zusammenfassung aller synthetisierten 30mer-Oligonucleotide 99 Resultate und Diskussion Die Synthesen der unmodifizierten Oligonucleotide wurden mittels Festphasensynthese nach der Phosphoramiditmethode auf einem DNA-Synthesizer der Firma Applied Biosystems (Modell 392/394) durchgeführt. Zur Synthese der unmodifizierten Oligonucleotide wurden sowohl die Standard-Chemikalien als auch die Syntheseprotokolle des Herstellers (s. Anhang) verwendet. Als Trägermaterial wurden kommerziell erhältliche Succinyl-CPG-Träger eingesetzt. Die Kupplungsausbeuten lagen bei jedem Schritt bei ca. 98% (ermittelt über einen TritylAssay). Zur Synthese der modifizierten Oligonucleotide wurden die zuvor synthetisierten Oligonucleotidbausteine in ein spezielles (spitz zulaufendes) Synthesizerfläschchen überführt und in absolutem Acetonitril gelöst. Die Konzentration der eingesetzten Phosphoramidite betrug stets 0.1 M. Es wurden die Standard-Chemikalien der Hersteller eingesetzt. Kupplungsprotokoll Beim leicht Einbau verändert des (s. modifizierten Anhang). Amidits Es wurde wurde ein das dritter Kupplungsschritt eingefügt und die Kupplungszeit bei jedem der drei Schritte von 15 auf 500 sec verlängert. Dies konnte die Kupplungsausbeute jedoch nicht über 60% bei den C8-Addukten (NH und N-Ac) bzw. 80% bei den N2-Addukten steigern und liegt damit deutlich unter den Ausbeuten der Standardkupplungen, die auch in diesem Fall ca. 98% betrugen. Alle Synthesen wurden im 1 μM-Maßstab durchgeführt. Nach den Synthesen wurden die Oligonucleotide unter den im Folgenden beschriebenen identischen Bedingungen gereinigt, isoliert und charakterisiert. 4.4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide Die letzte DMTr-Schutzgruppe wurde noch am Synthesizer entfernt. Anschließend wurden die Oligonucleotide β-Mercaptoethanol vom manuell CPG-Träger mit konzentriertem abgespalten. Zur Ammoniak und Abspaltung der Schutzgruppen der einzelnen Basen wurde diese Lösung anschließend für 4 h im Thermomixer bei 45 °C inkubiert und abschließend im Vakuum (Speed-Vac) aufkonzentriert.[117,118] 100 Resultate und Diskussion Die erhaltenen Rohprodukte wurden in Reinstwasser aufgenommen und auf eine RP-18-Säule gegeben und mit einem Triethylammoniumacetat-Puffer (TEAA-Puffer, pH 6.9) und einem Acetonitrilgradienten eluiert. Der Gradient wurde für die Oligonucleotide so gewählt, dass der (n-1) – Peak des um eine Base kürzeren Oligonucleotids eindeutig vom Produktpeak zu unterscheiden war. Die Säulentemperatur betrug 25 °C. Anschließend wurde das Roh-Oligonucleotid mit dem optimierten Gradienten gereinigt. Die Absorption wurde bei 260 nm gemessen. Abbildung 98 zeigt exemplarisch das Roh-Chromatogramm des C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189. Der gewünschte Peak wurde in einzelnen Fraktionen gesammelt und anschließend von jeder Fraktion eine Probe chromatographisch über die HPLC analysiert. Abbildung 99, S. 102 zeigt exemplarisch das Chromatogramm des gereinigten C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189. Gleiche Fraktionen wurden dabei vereinigt und in einem Speed-Vac-Probenkonzentrator bis zur Trockene eingeengt. 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 10 20 30 40 50 60 t [min] Abb. 98 Rohgemisch des Anilin-modifizierten Oligonucleotids d(GTA[G(Anil)]AATTCTAC) 189 101 Resultate und Diskussion 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 10 20 30 40 50 60 t [min] Abb. 99 Isoliertes gereinigtes Anilin-modifiziertes Oligonucleotid d(GTAG(Anil)AATTCTAC) 189 Analoge Trennungen wurden für alle synthetisierten Oligonucleotide durchgeführt. Die gereinigten und getrockneten Oligonucleotide wurden erneut in je 200 μL Reinstwasser aufgenommen. Von 20 μL dieser Oligonucleotidlösung wurde nun die Absorption bei 260 nm (A260) gemessen. Aus dem A260-Wert ließ sich durch Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor die optische Dichte der Gesamtlösung (OD260) und daraus die Menge des in den Fraktionen erhaltenen Oligonucleotids berechnen (s. Abschnitt 8.3.1 S. 159). Die erhaltenen Mengen der modifizierten Oligonucleotide lagen dabei 4-5fach höher als dieses über die isoButyryl-Strategie bislang möglich war. Zur Identifizierung der erhaltenen, sauberen Fraktionen der Oligonucleotide mittels ESI-MS wurde eine Lösung aus 20% Isopropanol und 1% Triethylamin in Wasser hergestellt. Die ESI-MS Messungen wurden von Frau Christine Christ, unter der Anleitung von Dr. Stefan Franke, mit einer Oligonucleotidkonzentration von 5 pM/ μL durchgeführt. Mittels dieses Lösungsmittelgemisches gelang eine erfolgreiche Vermessung und Charakterisierung aller synthetisierten 12mere 56,57 und 183-197. 102 Resultate und Diskussion Abbildung 100 zeigt exemplarisch das aufgenommene ESI-MS-Spektrum des modifizierten Oligonucleotids 189. 465 100 532 95 -8 90 -7 85 80 75 70 65 Relative Abundance 60 55 50 45 40 -6 535 35 30 468 621 25 20 471 15 10 414 406 408 485 492 473 424 5 538 416 425 441 440 476 452 459 500 494 503 624 544 563 554 514 519 527 628 571 573 584 590 598 606 609 617 632 636 642 664 668 671 690 696 0 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 m /z Abb. 100 Spektrum des modifizierten Oligonucleotids 189 Oligonucleotide sind Polyanionen und liegen in größeren Ladungen als -1 vor. Maximale Ladung des Dodecamers ist -11. Bei den ESI-MS-Spektren muss somit die m/z mit der dort vorliegenden Ladung multipliziert werden, um die Masse des Oligonucleotids zu erhalten. Für die synthetisierten 30mere 58 und 202-208 war eine Vermessung in Hamburg und die damit verbundene Charakterisierung nicht möglich. Die Charakterisierung erfolgte mittels ESI-MS-Spektrometrie durch die Arbeitsgruppe von Prof. A. Marx an der Universität Konstanz. 103 700 Resultate und Diskussion 4.4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide Bei den N2-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden war die Entschützung in konz. Ammoniak nicht ausreichend, da die modifizierten Nucleotide an der O6-Position CPE geschützt waren und die Schutzgruppe, obwohl auch sie basenlabil ist, nicht mit Ammoniak abgespalten werden konnte. Stengele et al. 2-(4-Nitrophenyl)ethyl- berichteten (NPE) über und die erfolgreiche Verwendung von 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl- (NPEOC) Schutzgruppen. NPEOC wurde anstelle der Benzoyl- bzw. der iBu-Gruppe zur Blockierung des N6 am dA und des N2 am dG benutzt und die NPE-Schutzgruppe wurde zur Schützung der Amidfunktion des dG verwendet.[119] Die Abspaltung (βEliminierung) wurde mit 0.5 M DBU in Acetonitril innerhalb von 6 h bei Rt erfolgreich durchgeführt. DBU in abs. Pyridin wurde von Uhlmann et al. für die Abspaltung der NPE-Schutzgruppe an Phosphorsäuretriestern verwendet, wobei sie dort als Schutzgruppe am Phosphorzentrum diente.[120] 1995 berichteten Pfister et al. außerdem über die Verwendung von der 2-(4-Nitrophenyl)ethylsulfonyl- (NPES) Schutzgruppe für Schützungen der 2’-Hydroxygruppe an Ribonucleotiden und deren erfolgreiche Abspaltung mit DBU in Acetonitril.[121] Da die CPE-Schutzgruppe eine ähnliche Reaktivität wie die NPE-Schutzgruppe besitzt, sollte sie sich unter gleichen Bedingungen abspalten lassen. Die Verwendung von DBU als sterisch anspruchsvolle, nicht nucleophile, aber trotzdem starke Base bietet noch den weiteren Vorteil, dass das Oligonucleotid nicht von der festen Phase abgespalten wird und somit die DBU-Salze durch Filtration entfernbar sind. Zu Testzwecken wurde das Oligonucleotid 200 hergestellt, um dann die idealen Bedingungen zur CPE-Abspaltung bestimmen zu können. Zuerst wurde Acetonitril als Lösungsmittel benutzt und die DBU Konzentration sowie die Temperatur variiert. Wie in Tab. 13, S. 104 zu erkennen ist, fand nach 24 h Reaktionszeit weder bei 0.1 M noch bei 0.5 M DBU eine Abspaltung der CPE-Gruppe statt. Auch eine Erhöhung der Temperatur von RT auf 45 °C brachte in beiden Fällen keinen Erfolg. Die Verwendung von Pyridin als Alternative zu Acetonitril führte bei 0.1 M DBU ebenfalls 104 Resultate und Diskussion zu keinem erfolgreichen Ergebnis. Jedoch konnte mit 0.5 M DBU in Pyridin bei Rt die CPE-Schutzgruppe ohne störende Nebenreaktionen quantitativ abgespalten werden. Lösungsmittel Temp. Zeit c (DBU) Abspaltung Acetonitril Rt 24 h 0.1M Nein Acetonitril 45 24 h 0.1M Nein Acetonitril Rt 24 h 0.5M Nein Acetonitril 45 24 h 0.5M Nein Pyridin Rt 24 h 0.1M Nein Pyridin 45 24 h 0.1M Nein Pyridin Rt 24 h 0.5M JA Tab. 13 Abspaltungsmethoden der CPE-Gruppe nach der Oligonucleotidsynthese Nach der CPE-Abspaltung fand die vollständige Entschützung und Abspaltung von der festen Phase unter den bekannten Bedingungen mit konz. Ammoniak und βMercaptoethanol (4 h bei 45 °C) statt. Anschließend konnten die Reinigungen mittels HPLC und die anschließende Charakterisierung mittels ESI-MS analog zu den dargestellten C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden erfolgen. Mittels dieser Methoden gelang die Darstellung N2-Azoaryl-modifizierter Oligonucleotide. In den ESI-Spektren der N2-Hydrazinoaryl-modifizierten Oligonucleotide trat bei der Charakterisierung das Problem auf, dass nur die Masse des gewünschten Oligonucleotides plus 40 gefunden wurde. Da eine zusätzliche Acetylgruppe die Gesamtmasse exakt um 40 erhöhen würde, liegt die Vermutung nahe, dass eine Acetylierung des Oligonucleotides durch das verwendete Essigsäureanhydrid im Capping-Schritt bei der chemischen DNA-Synthese stattgefunden hat (vgl. Abb. 97, S. 97). Da außer der Hydrazinofunktion alle anderen funktionellen Gruppen geschützt sind, kann die Acetylierung somit nur dort stattgefunden haben. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurde die geschützte N2-Hydrazinophenyl-modifizierte 105 Resultate und Diskussion Verbindung 136 mit Essigsäureanhydrid unter den am Synthesizer verwendeten Bedingungen umgesetzt (s. Abb. 101). Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden konnte dabei das doppelt acetylierte Produkt 213 erhalten werden. OCPE OCPE N N TBDMSO N N N H N O H N Ac2O, THF Rt, 3 h N TBDMSO N N N Ac O Ac N OTBDMS OTBDMS 213 136 Abb. 101 Acetylierungsreaktion am N2-Addukt 136 Eine anschließende Abspaltung mit Ammoniak unter den Standardbedingungen (4 h, 45 °C) lieferte das erwartete monoacetylierte Produkt 214 (s. Abb. 102). OCPE OCPE N N TBDMSO N N O N Ac Ac N N konz. NH3 45 °C, 4 h N TBDMSO N N O N Ac H N OTBDMS OTBDMS 213 214 Abb. 102 Entschützung des diacetylierten N2-Addukt 213 Die Position der Acetylgruppe konnte dabei mit Hilfe der 2D-NMR-Spektren bestimmt werden. Um die Acetylgruppe wieder abzuspalten wurde zuerst die Dauer der normalen Entschützung mit Ammoniak von 4 auf 24 h verlängert, was jedoch keine Abspaltung bewirkte. Reddy et al. berichteten über die Verwendung von Methylamin/Ammoniak 1:1 zur Entschützung von Oligonucleotiden, wodurch sich die Reaktionszeit von 4 h auf 10 min bei 55 °C verkürzen ließ, was auf die größere Nucleophilie des Methylamins zurückgeführt wurde.[122] Außerdem wurde berichtet, dass mit dieser Methode die Ausbeute bei der Synthese von Oligoribonucleotiden deutlich gesteigert 106 Resultate und Diskussion werden konnte. Bei der Hydrazinoaryl-modifizierten testweise durchgeführten Dodecamere führte Entschützung die der Anwendung N2von Methylamin/Ammoniak 1:1 jedoch wiederum nur zu dem monoacetylierten Produkt und dies in schlechteren Ausbeuten. Bei der Verwendung von stärkeren Basen wie 1 N Natriumhydroxidlösung konnte eine Zersetzung des modifizierten Oligonucleotids beobachtet werden. Somit scheint eine nachträgliche Abspaltung dieser Acetylgruppe nicht durchführbar. Zur Darstellung der gewünschten N2-Hydrazinoaryl-modifizierten Oligonucleotide muss deshalb diese Acetylierung vermieden werden. Im Jahre 2001 berichtete Greenberg von der Verwendung anderen Reagenzien zum „cappen“ der Abbruchstränge wie Trimethylessigsäureanhydrid zur Vermeidung unerwünschter Acetylierungen.[123] Durch dieses Ersetzen des Capping-Reagenzes gelang es nach analogem Entfernen der Schutzgruppen die N2-Hydrazinoarylmodifizierten Oligonucleotide 198, 199 und 209, 210 erfolgreich darzustellen. Eine Reaktion mit dem Trimethylessigsäureanhydrid konnte auch in geringem Maße nicht beobachtet werden. Für die synthetisierten N2-Arylamin-modifizierten Oligonucleotide erfolgte die Charakterisierung mittels ESI-MS-Spektrometrie durch die Arbeitsgruppe von Prof. A. Marx an der Universität Konstanz. Abbildung 103, S. 108 zeigt exemplarisch das aufgenommen ESI-MS-Spektrum des modifizierten Oligonucleotids 209. Eine Alternative zur Verwendung des Trimethylessigsäureanhydrids zur Vermeidung der Acetylierung wäre das Auslassen des Capping-Schrittes bei allen Schritten nach dem erfolgten Einbau der N2-Hydrazinoaryl-Modifikation. Dieses hätte jedoch eine erschwerte Abtrennung der Abbruchstränge zur Folge, weswegen auf die Anwendung diese Methode verzichtet wurde. 107 Resultate und Diskussion -14 Intens. x10 5 - 15 2.0 - 13 716.5 620.7 665.2 -12 - 11 776.3 1.5 847.0 - 16 - 10 581.8 -9 1.0 931.8 1035.5 -8 0.5 489.9 465.9 416.9 1165.2 547.5 1194.5 1313.4 0.0 400 600 800 1000 1200 1400 m/z Abb. 103 ESI-MS-Spektrum des N2-Hydrazinobiphenyl-modifizierten Oligonucleotids 209 Für die Untersuchungen hinsichtlich des Einflusses einer Arylamin-Modifikation lagen nun, neben den synthetisierten C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden, auch die entsprechenden N2-Azo- und N2-Hydrazino-modifizierten Oligonucleotide in reiner Form vor. Zunächst sollte dabei die Messung der Schmelztemperaturen (Tm-Werte) erfolgen, um Aussagen über die thermische Stabilität der modifizierten Oligonucleotide im Vergleich zu den unmodifizierten machen zu können. Ebenfalls sollten hierüber Aussagen über den Einfluss unterschiedlicher Arylamin-Modifikationen und unterschiedlicher Modifikationsarten (C8 und N2) gemacht werden können. 108 Resultate und Diskussion 4.5 Messung der Schmelztemperaturen (Tm-Werte) Bei Oligonucleotiden kann durch Messung der UV-Absorption als Funktion der Temperatur der thermisch induzierte Übergang von einer geordneten, helikalen Struktur in einen ungeordneten Zustand mit statistischer Verteilung der Konformation verfolgt werden. Die elektronische Wechselwirkung der π-Systeme der Basen, die in der helikalen Form in Stapeln senkrecht zur Helixachse angeordnet sind, führt zu einer deutlichen Reduktion der UV-Absorption, dem hypochromen Effekt (Hypochromizität).[124] Beim Erwärmen der Probe sollte der Absorptionswert zunächst langsam, dann sprunghaft und später wieder langsam steigen. Dieser sigmoide Verlauf resultiert aus dem Phänomen, dass von einem Startpunkt aus, meistens den Strangenden, die Denaturierung sehr schnell den Duplex entlang verläuft, da der Zustand eines Nucleotids die Konformation der benachbarten Nucleotide beeinflusst. Der Grad der Hypochromizität ist ein Maß für die Basenpaarung und –stapelung der Sekundärstruktur. Der Wendepunkt der sigmoiden Kurve, bzw. das Maximum der 1. Ableitung, das man durch Auftragung der UV-Absorption gegen die Temperatur erhält, entspricht dem Schmelzpunkt (Tm-Wert) des Duplexes. Die in dieser Arbeit synthetisierten und untersuchten Oligonucleotide wurden in einem 2 μM-Maßstab (2 nmol der komplementären Stränge), in einem 10 mM Phosphat-Puffer mit 140 mM NaCl und 1 mM EDTA, pH 6.8 vermessen. Die Messungen wurden in einem Temperaturbereich von 5 °C bis 80 °C durchgeführt, wobei jeweils dreimal von 5 °C auf 80 °C erhitzt und dreimal von 80 °C auf 5 °C abgekühlt wurde. Die Heiz- bzw. Kühlrate betrug hierbei 0.5 °C/min, wobei alle 0.5 °C ein Datenpunkt aufgenommen wurde. Vor der eigentlichen Messung wurde die Probelösung zweimal schnell von 5 °C auf 80 °C erhitzt und wieder auf 5 °C abgekühlt. Die Heiz- bzw. Kühlrate hierbei lag bei 10 °C/min. Mit dieser „Rampe“ wurde die DNA-Struktur zunächst in Einzelstränge auseinander geschmolzen, damit sie bei der folgenden Abkühlung eine wohldefinierte Struktur ausbilden konnte. Die Absorption der Probelösung wurde bei einer Wellenlänge von 260 nm verfolgt. Von der resultierenden sigmoiden Kurve kann das Maximum der 1. Ableitung zur Bestimmung des Schmelzpunktes berechnet und die einzelnen Werte gemittelt 109 Resultate und Diskussion werden. Der so erhaltene Mittelwert wird als Tm-Wert des Duplexes angegeben. Der Fehler bei dieser Methode beträgt ±1 °C. Eine weitere Möglichkeit den Tm-Wert zu bestimmen, ist die van’t Hoff’sche Kurvenanalyse. Sie lieferte mit einem Fehler von ±0.5 °C die genaueren Ergebnisse und wurde für die hier angegebenen Werte verwendet. Zusätzlich dazu lassen sich mittels dieser Methode thermodynamische Daten (ΔH und ΔS) der Oligonucleotid-Stränge bestimmen. In Tabelle 14 und Tabelle 15, S. 111 sind die ermittelten Werte für die NarI-Sequenz aufgelistet. Oligonucleotid Tm [°C] 56 (unmod.) 58.2/65 ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K] -79.1 -267.7 [125] 184 (Anil) 50.3 -88.5 -303.0 185 (4-ABP) 40.4 -72.9 -254.8 keine Angabe keine Angabe IQ 58 [125] Tab. 14 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 56 und den an G1-modifizierten NarIOligonucleotiden 184, 185 mit 183 als Gegenstrang Die dargestellten Tm-Werte wurden 5'-d(CTCGGCGCCATC), sowie 5'-d(CTCG*GCGCCATC) mit die dem für den unmodifizierten modifizierten Stränge komplementären Strang 184, Strang 56 185 183 5'-d(GATGGCGCCGAG) gemessen. Es ist ein deutlicher Einfluss der beiden Arylamin-Modifikationen auf die thermische Stabilität zu erkennen. So liegt der Wert für das C8-Anilin-modifizierte Oligonucleotid 184 mit 50 °C bereits 8 °C tiefer als der für das unmodifizierte Oligonucleotid 56. Einen noch stärkeren Effekt lässt sich bei dem 4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotid 185 beobachten. Hier reicht eine einzelne Modifikation in dem vorliegenden 12mer aus, um den Tm-Wert um 18 °C auf 40 °C zu senken. Der Grund für diesen signifikanten Unterschied muss das polycyclische aromatische System des 4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotids 185 zu sein, welches eine merkliche Verkrümmung des DNA-Duplexes zur Folge haben könnte. Dieser Einfluss scheint jedoch nicht in dem Maße für polycyclische, heterocyclische Amine zu gelten. Bereits 110 Resultate und Diskussion 2007 publizierten Rizzo et al. für die verwendete Sequenz den Einbau des C8-IQmodifizierten 2‘-Desoxyguanosin.[125] In Tabelle 14, S. 109 ist vergleichend der von gemessene Wert mit aufgenommen. Dieser liegt mit 58 °C höher, als die hier vermessenen modifizierten Oligonucleotide 184, 185. Im Vergleich zu dem hier vermessenen unmodifizierten Strang 56 scheint also kein Effekt beobachtet werden zu können. Bei den von Rizzo durchgeführten Messungen betrug dieser Tm-Wert allerdings 65 °C, so dass also auch dort eine Erniedrigung von 7 °C vorliegt, die dem Einfluss der Anilin-Modifikation entsprechen würde. Der Unterschied in den gemessenen Tm-Werten für den unmodifizierten Strang 56 liegt an der Verwendung eineinhalbfach höherer Salzkonzentrationen von Rizzo et al., welche zu einer zusätzlichen Stabilisierung des Duplexes führen. Um eine eventuelle Abhängigkeit des Tm-Wertes von der Lage der Modifikation innerhalb einer bestimmten Sequenz zu ermitteln, wurden neben der G1-Position ebenfalls analoge Messungen mit den in G3-Position modifizierten Oligonucleotiden 186-188 durchgeführt. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 15, wiederum vergleichend zu dem an dieser Stelle IQ-modifizierten Oligonucleotid, zusammengefasst. Oligonucleotid Tm [°C] 56 (unmod.) 58.2/65 [125] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K] -79.1 -267.7 186 (Anil) 50.3 -47.5 -122.4 187 (4-ABP) 39.2 -47.9 -182.5 188 (4-Anis) 51.4 -65.5 -169.9 IQ 61[125] --- --- Tab. 15 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 56 und den an G3-modifizierten NarIOligonucleotiden 186-188 mit 183 als Gegenstrang Auch aus diesen gemessenen Werten ist der unterschiedliche Einfluss der monobzw. polycyclischen aromatischen Modifikation auf die thermische Stabilität zu erkennen. In diesem Fall haben die monocyclischen Modifikationen der Oligonucleotide 186 (Anilin) und 188 (4-Anisidin) eine Erniedrigung des Tm-Wertes 111 Resultate und Diskussion um 7-8 °C auf 50.3 bzw. 51.4 °C zur Folge. Einen erneut stärkeren Einfluss weist die polycyclische Modifikation 4-Aminobiphenyl im Oligonucleotid 187 auf. Hier ist, wie schon bei der analogen G1-Modifikation 185, eine starke Senkung auf 39 °C zu beobachten. Insgesamt lässt sich allerdings keine Abhängigkeit des Tm-Wertes durch die Position (G1 oder G3) einer Arylamin-Modifikation feststellen. Anders ist die Beobachtung von Rizzo für das an G3 IQ-modifizierte Oligonucleotid. Hier ist, anders als an der G1Position, nur eine halb so große Senkung des Tm-Wertes (-4 °C) zu beobachten, was auf eine Abhängigkeit in der Lage einer solchen Modifikation innerhalb eines Oligonucleotidstranges hindeutet.[125] Um weitere Informationen über den Einfluss der Arylamin-Modifikationen zu erhalten, wurden analoge Messungen auch für die selbstkomplementäre Sequenz 57 5'-d(GTAGAATTCTAC) und den an der G2-Position modifizierten Strängen 189-195 und 198-201 5'-d(GTAG*AATTCTAC) gemacht. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Tabelle 16 dargestellt. Oligonucleotid Tm [°C] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K] 57 (unmod.) 42.1 -74.4 -269.5 189 (Anil) 29.5 -88.9 -323.1 190 (4-Anis) 25.5 -90.7 -276.1 191 (4-Tol) 23.2 -50.2 -142.0 192 (4-Cyano) 23.7 -70.5 -212.4 193 (3,5-DMA) 24.0 -80.7 -243.4 194 (4-ABP) 23.9 -87.5 -267.5 195 (2-AF) 23.3 -56.5 -164 198 (N2-Hydr. Anil) --- --- --- 199 (N2-Hydr. 4-ABP) --- --- --- 200 (N2-Azo Anil) --- --- --- 201 (N2-Azo 4-ABP) --- --- --- Tab. 16 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 57 und den an G2-modifizierten Oligonucleotiden 189-195 und 198-201 112 Resultate und Diskussion Wie schon erwartet, sind auch hier die Tm-Werte für die modifizierten Oligonucleotide niedriger als für den unmodifizierten Referenzstrang 57, der einen Tm-Wert von 42.1 °C aufweist. Dabei lässt sich generell erkennen, dass eine zweite Modifikation nahezu eine Verdopplung des Effektes bewirkt, wie er bei den Strängen mit einer monocyclischen Modifikation zu beobachten war. Der geringste Einfluss ist dabei für das C8-Anilin-modifizierte Oligonucleotid 189 zu erkennen. Hier konnte eine Senkung, verursacht durch die beiden Modifikationen, des Tm-Wertes um 13 °C auf 29.5 °C beobachtet werden. Für alle weiteren C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotide 190-195 ist diese Senkung in stärkerem Maße zu beobachten. Die hierfür gemessenen Tm-Werte liegen im Bereich von 23.2 - 25.5 °C und lassen in diesem Fall keinen Unterschied im Einfluss poly- bzw. monocyclischer Modifikationen erkennen. Einen großen Unterschied machen die N2-modifizierten Oligonucleotide 198-201. In der vorliegenden selbstkomplementären Sequenz konnte in keinem Fall eine Paarung des DNA-Stranges beobachtet werden, was auf eine deutlich größere Destabilisierung dieser Modifikationen gegenüber der analogen Modifikation an der C8-Position hindeutet. Dabei scheint die Art der Modifikation (N2-Hydrazinoaryl oder N2-Azoaryl) keine Rolle zu spielen. Ebenso lässt sich zunächst keine Aussage über einen möglichen unterschiedlichen Einfluss poly- bzw. monocyclischer Modifikationen machen. Neben den Modifikationen an der G2-Position sollte exemplarisch eine poly- bzw. monocyclische Modifikation an der G1-Position eingeführt werden. Die Ergebnisse der Tm-Wert-Messungen sind in Tabelle 17 zusammengefasst. Oligonucleotid Tm [°C] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K] 57 (unmod.) 42.1 -74.4 -269.5 196 (Anil) 35.0 -81.2 -237.1 197 (4-ABP) 30.9 -88.1 -263.1 Tab. 17 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 57 und den an G1-modifizierten Oligonucleotiden 196-197 113 Resultate und Diskussion Auch bei diesen Messungen ist augenscheinlich eine Senkung des Tm-Wertes zu erkennen. Diese ist jedoch im Vergleich zu den Modifikationen in der G2-Position deutlich geringer, was auf die ohnehin schwächere Basenpaarung an den Enden des DNA-Doppelstranges zurückzuführen ist. Für das C8-Anilin-modifizierte Oligonucleotid 196 liegt der gemessene Tm-Wert mit 35 °C lediglich 7.1 °C niedriger als für den unmodifizierten Strang 57. Ein Unterschied im Einfluss auf die thermische Stabilität ist hier für die polycyclische Modifikation zu erkennen. So erfolgt eine deutliche größere Destabilisierung durch die C8-4-Aminobiphenyl-Modifikation auf 30.9 °C. Diese Beobachtung stimmt also mit den für die NarI-Sequenz erhaltenen Ergebnissen überein. Um diese Ergebnisse weiter zu bestätigen und den Einfluss der N2-Modifikation auf die thermische Stabilität zu untersuchen, wurden diese Modifikationen ebenfalls in ein nicht selbstkomplementäres 30mer-Oligonucleotid eingebaut. Die Ergebnisse der Tm-Wert-Messungen sind in Tabelle 18 dargestellt. Oligonucleotid Tm [°C] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K] 58 (unmod.) 62.3 -67.5 -232.9 203 (Anil) 62.2 -131.7 -361.1 204 (4-Anis) 62.3 -120.6 -389.3 205 (4-Tol) 62.6 -72.7 -246.2 206 (3,5-DMA) 59.0 -89.4 -238.5 207 (4-ABP) 58.7 -72.3 -299.6 208 (2-AF) 59.2 -55.3 -197.7 209 (N2-Hydr. Anil) 60.8 -67.5 -173 210 (N2-Hydr. 4-ABP) 59.8 -53.1 -188.1 211 (N2-Azo Anil) 60.5 -71.5 -214 212 (N2-Azo 4-ABP) 59.2 -62.9 -218.2 Tab. 18 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 58 und den modifizierten Oligonucleotiden 203-212 mit 202 als Gegenstrang Aus den Werten lässt sich klar der Unterschied in dem Einfluss der verschiedenen Modifikationen auf die thermische Stabilität erkennen. So liegen die Tm-Werte der 114 Resultate und Diskussion monocyclischen C8-Modifikationen 203-205 exakt in dem Bereich des unmodifizierten Stranges 58, welcher einen Tm-Wert von 62.3 °C aufweist. Ein Einfluss ist lediglich für die Modifikationen mit den starken Carcinogenen, dem 3,5Dimethylanilin und den polycyclischen Arylaminen, erkennbar. Diese Modifikation führen wie erwartet zu einer Senkung des Tm-Wertes, in diesen Fällen um ca. 3 °C auf 58.7 - 59.2 °C. Für beide N2-Anilin-Modifikationen kann eine Reduktion des Tm-Wertes um 2 °C auf 60.5 bzw. 60.8 °C beobachtet werden. Es ist zu erkennen, dass die N2Modifikationen in diesen Fällen einen höheren Effekt haben, als die entsprechende C8-Modifikation (hier war keine Änderung des Tm-Wertes zu erkennen). Dabei scheint es keine Rolle zu spielen, ob eine N2-Hydrazinoaryl- oder N2-AzoarylModifikation vorliegt. Auch für die N2-Modifikation lässt sich beobachten, dass die polycyclische Modifikation, in diesem Fall 4-Aminobiphenyl, einen höheren Einfluss und damit ein stärkeres Absenken des Tm-Wertes im Vergleich zur monocyclischen Modifikation, hier Anilin, ausübt. So ist für beide N2-4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotide 210 und 212 eine Senkung des Tm-Wertes um ca. 3.5 °C zu beobachten. Auch hier ist kein signifikanter Unterschied zwischen der N2-Hydrazino- oder N2-AzoModifikation zu erkennen. Alle durchgeführten Messungen geben erste Hinweise darauf, dass der Einfluss auf die thermische Stabilität durch polycyclische Arylamin-Modifikationen höher ist, als durch monocyclische Modifikationen. Auch scheint der Einfluss abhängig von der Art der Modifikation zu sein, so haben die N2-Modifikationen einen höheren Einfluss als die korrespondierenden C8-Modifikationen. Um Aussagen über den Einfluss der Modifikationen auf die Konformation des DNADuplexes machen zu können, wurden Untersuchungen mittels circularer Dichroismus durchgeführt. Die Ergebnisse sollen im Folgenden gezeigt und diskutiert werden. 115 Resultate und Diskussion 4.6 Messung des circularen Dichroismus Links und rechts zirkular-polarisiertes Licht wird beim Durchtritt durch ein optisch aktives Medium unterschiedlich stark absorbiert - dieser Effekt wird als Zirkularer Dichroismus bezeichnet (CD). Beim CD-Experiment bestimmt man also nicht nur die spezifische Drehung, sondern man misst auch die Intensitätsunterschiede von linksund rechts-linear polarisiertem Licht. Zum CD-Effekt kommt es durch Wechselwirkungen der helikalen Struktur des zirkular-polarisierten Lichtes mit den Gruppen um ein asymmetrisches C-Atom. Ein Maximum im CD-Spektrum ist für das eine Enantiomer positiv, für das andere negativ. Durch die CD-Spektroskopie ist somit eine Bestimmung der absoluten Konfiguration möglich. Außerdem gehört sie zu den wichtigsten Methoden zur Konformationsanalyse von Peptiden und Oligonucleotiden. In Oligonucleotiddoppelsträngen sind die Nucleobasen als Chromophore konformativ fixiert, während in Einzelsträngen eine statistische Verteilung der Basenorientierung vorliegt. Dadurch entsteht eine chirale Doppelhelix. Diese bewirkt im DNADoppelstrang eine Vorzugsrichtung der Nucleobasen gegenüber dem Rückgrat einen Cotton-Effekt.[126] Abb. 104 zeigt die CD-Spektren der verschiedenen DNAKonformationen. Abb. 104 CD-Spektren der verschiedenen DNA-Konformationen 116 Resultate und Diskussion Diese können anhand der charakteristischen Lage der Maxima und Minima zugeordnet werden. Dabei handelt es sich bei der B-DNA um die natürlich vorkommende DNA-Konformation, während die A-DNA-Konformation nur in dehydratisierter DNA und die Z-DNA-Konformation nur in stark salzhaltigen Lösungen und Sequenzen mit alternierenden Pyrimidin- und Purinbasen vorliegen. Die CD-Messungen wurden mit der gleichen Lösung durchgeführt wie die Tm-WertBestimmung. Die Absorption wurde dabei in einem Bereich von 220-350 nm bei einer Temperatur von 10 °C gemessen. Mit Hilfe dieser Spektren kann analysiert werden, welche Konformation der DNA bei allen modifizierten Oligonucleotiden im Vergleich zu dem unmodifizierten Doppelstrang vorliegt. Die gemessenen CD-Spektren der Oligonucleotide der NarI-Sequenz 56 und 184188 mit 183 als Gegenstrang sind in Abb. 105 dargestellt. unmod. 56 Anil G1 184 4-ABP G1 185 Anil G3 186 4-ABP G3 187 4-Anis G3 188 molare Elliptizität 4 2 0 -2 220 240 260 280 300 320 340 Wellenlänge [nm] Abb. 105 CD-Spektren der NarI-Sequenz 56 und 184-188 mit 183 als Gegenstrang Die CD-Spektren der modifizierten Sequenzen 184-188 zeigen, wie auch das unmodifizierte Oligonucleotid 56, im Duplex das typische CD-Spektrum einer B-DNA. Charakteristisch für diese Konformation ist dabei das Maximum bei einer Wellenlänge von ca. 265 nm sowie das Minimum bei einer Wellenlänge von 250 nm. Unterschiede zwischen den verschiedenen Modifikationen, sowohl was die ArylaminModifikation als auch die Position betrifft, sind nicht erkennbar. Die Untersuchungen 117 Resultate und Diskussion (exemplarisch für das C8-Anilin, das C8-4-Aminobiphenyl und das C8-2- Aminofluoren-modifizierte Oligonucleotid) für die an der G2-Position modifizierten selbstkomplementären Oligonucleotide sind im Folgenden dargestellt. 6 unmod. 57 2-AF 195 4-ABP 194 Anil 189 molare Elliptizität 4 2 0 -2 -4 220 240 260 280 300 320 340 Wellenlänge [nm] Abb. 106 CD-Spektren der selbstkomplementären Sequenz 57 und der modifizierten Oligonucleotide 189, 194 und 195 Auch diese CD-Spektren der modifizierten und des unmodifizierten Oligonucleotids zeigen das eindeutige Vorhandensein einer B-DNA-Konformation. Die Verschiebung der lokalen Maxima und Minima für die polycyclisch-modifizierten Oligonucleotide 194 und 195 zu höheren Wellenlängen (bathochromer Effekt) lässt sich durch die Vergrößerung des π-Systems und der damit verbundenen stärkeren Delokalisation erklären. Analoge Beobachtungen können auch bei den CD-Spektren für die an G1Position modifizierten Oligonucleotide der selbstkomplementären Sequenz 57 gemacht werden. Die gemessenen Spektren sind in Abb. 107, S. 119 dargestellt. 118 Resultate und Diskussion 8 unmod. 57 Anil 196 4-ABP 197 molare Elliptizität 6 4 2 0 -2 220 240 260 280 300 320 340 Wellenlänge [nm] Abb. 107 CD-Spektren der selbstkomplementären Sequenz 57 und der modifizierten Oligonucleotide 196, 197 Abschließend sollten diese konformativen Untersuchungen ebenfalls für das synthetisierte 30mer 58 und die entsprechend modifizierten Oligonucleotide 203-212 durchgeführt werden. Abb. 108, S. 120 zeigt die erhaltenen CD-Spektren für die C8modifizierten Oligonucleotide 203-208. In Abb. 109, S. 120 sind die Ergebnisse der CD-Spektren der N2-modifizierten Oligonucleotide 209-212 zusammengefasst. Auch diese CD-Spektren des unmodifizierten und der modifizierten Oligonucleotide zeigen das Vorliegen einer B-DNA-Konformation. Auch in diesen Fällen ist kein Unterschied in der Lage der Maxima bzw. Minima zwischen den Spektren des unmodifizierten und der modifizierten Dublices erkennbar. 119 Resultate und Diskussion unmod. 58 Anil 203 4-Anis 204 4-Tol 205 3,5-DMA 206 4-ABP 207 2-AF 208 10 molare Elliptizität 5 0 -5 -10 220 240 260 280 300 320 340 Wellenlänge [nm] Abb. 108 CD-Spektren der 30mer-Sequenz 58 und der C8-modifizierten Oligonucleotide 203-208 mit 202 als Gegenstrang unmod. 58 2 N Hydr. Anil 209 2 N Hydr. 4-ABP 210 2 N Azo Anil 211 2 N Azo 4-ABP 212 molare Elliptizität 5 0 -5 220 240 260 280 300 320 340 Wellenlänge [nm] Abb. 109 CD-Spektren der 30mer-Sequenz 58 und der N2-modifizierten Oligonucleotide 209-212 mit 202 als Gegenstrang Zusammenfassend kann aus den aufgenommenen CD-Spektren geschlossen werden, dass die hier angewandte CD-Spektroskopie keinen Hinweis auf strukturelle 120 Resultate und Diskussion Veränderungen der DNA durch Modifikation eines 2‘-Desoxyguanosin liefert. So kann kein konformativer Einfluss einer C8- oder einer N2-Modifikation erkannt werden. Die Unterschiede in Veränderungen der oder Carcinogenität auf die sind demnach unterschiedliche auf lokale Interaktion mit strukturelle Enzymen zurückzuführen. Um diese Vermutung zu stützen, sollten erste Informationen über die Interaktion mit Enzymen, am Beispiel des Restriktionsenzyms EcoRI sowie verschiedener Polymerasen, durch verschiedene Assays erhalten werden. Abschließend sollten erste Experimente zur Kristallisation und damit zur Strukturuntersuchung solcher modifizierten Oligonucleotide erfolgen. Die durchgeführten Experimente und die daraus resultierenden Ergebnisse sollen im Folgenden aufgezeigt und diskutiert werden. 4.7 Restriktionsabbau mittels EcoRI Um den Einfluss der Modifikation auf die Restriktion durch das EcoRI-Enzym untersuchen zu können, wurde die von Seela et al. beschriebene Sequenz 57 verwendet.[127] Diese selbstkomplementäre Sequenz beinhaltet die Erkennungssequenz für EcoRI und sollte somit mittels diesem durch Restriktion zu den entsprechenden Tetra- bzw. Octameren abgebaut werden können (s. Abb. 110). 5'-G T A G A A T T C T A C-3' 3'-C A T C T T A A G A T G-5' EcoRI 5'-G T A G-3' 5'-A A T T C T A C-3' 3'-C A T C T T A A-5' 3'-G A T G-5' Rt 5'-GTAG-3' 3'-CATCTTAA-5' Abb. 110 Restriktionsabbau des Oligonucleotids 57 mittels EcoRI Zunächst sollten die experimentellen Bedingungen für diesen Test am Beispiel des unmodifizierten Oligonucleotids 57 etabliert werden. Dabei sollte die Temperatur 20 °C betragen, um auch diesen Test mit den modifizierten Oligonucleotiden 189-197 121 Resultate und Diskussion durchführen zu können. Da diese teilweise einen Tm-Wert von 23 °C besitzen war es wichtig eine geringere Temperatur während des Restiktionsassays einzuhalten, um das Vorliegen der DNA-Doppelstränge zu gewährleisten. Optimiert werden sollten dabei das verwendete Puffersystem, sowie die für den Abbau benötigte Menge (Units) des EcoRI-Enzym. Um festzustellen, ob eine Restriktion unter den gewählten Bedingungen erfolgt, wurden zunächst lediglich qualitative Versuche durchgeführt. Tab. 19 fasst die erhaltenen Ergebnisse zusammen. Puffer (pH 7.5) Units EcoRI Restriktion Tris/HCl 100 nein Tris/HCl 270 nein DTE 100 nein DTE 270 nein DTT 100 nein DTT 270 ja Tab. 19 Zusammenfassung der Reaktionsoptimierung des Restriktionsassay am unmodifizierten Oligonucleotid 57 bei 20 °C Zunächst wurden die von Seela für einen solchen Abbau beschriebenen Bedingungen angewendet.[127] Hierbei konnte auch durch die Verwendung von 270 Units EcoRI Enzym keine Restriktion erreicht werden.[128] Ursache hierfür könnte die Temperatur von 20 °C sein, da Seela seine Experimente bei einer Temperatur von 37 °C durchgeführt hat. Dieses könnte eine Verringerung der Enzymaktivität, bis hin zur vollkommenen Inaktivität zur Folge haben. Da die Enzymaktivität ebenfalls durch die Verwendung anderer Puffersysteme beeinflusst werden kann, wurden ebenfalls DTE- und DTT-Puffersysteme verwendet.[129,130] Auch bei der Verwendung des DTEPuffers konnte weder unter der Zugabe von 100 bzw. 270 Units des EcoRI-Enzyms eine Restriktion beobachtet werden. Erst durch die Verwendung eines DTT-Puffers und der Zugabe von 270 Units Enzym gelang der gewünschte Abbau des Oligonucleotids 57. Für den Abbau wurden zunächst je 0.4 OD des Oligonucleotids in 100 μL eines DTTPuffers (pH 7.5) gelöst und für 2 Minuten auf 70 °C erhitzt. Nach Abkühlen auf 20 °C 122 Resultate und Diskussion folgte die Inkubation mit 270 Units EcoRI. Nach gewählten Reaktionsdauern wurden Aliquote entnommen und mittels der HPLC vermessen. Abb. 111 zeigt die erhaltenen Chromatogramme zu verschiedenen Zeitpunkten bei dem Abbau des Oligonucleotids 57. t=0h t=1h t=2h t=3h t=5h 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 -0,02 10 20 t [min] Abb. 111 Restriktionsabbau des unmodifizierten Oligonucleotids 57 Aus den dargestellten Chromatogrammen ist deutlich die Abnahme des 12merPeaks zu erkennen, welcher bei andauernder Inkubation mit dem Enzym immer mehr abnimmt, während im Gegensatz dazu die Fläche des 4-mers und des 8-mers größer werden. Mittels der erhaltenen Chromatogramme ist es möglich, die Halbwertszeit für den Restriktionsabbau des Oligonucleotids 57 zu berechnen. Mittels der anhängenden Formeln konnte die Menge an abgebautem Oligonucleotid berechnet und anschließend graphisch die Halbwertszeit ermittelt werden(s. Abb. 112, S. 124):[131] μM gespaltenes [Fläche d(GTAG)][ε260[GTAGAATTCTAC]][μM d(GTAGAATTCTAC)orig.] = Oligonucleotid [(Gesamtfläche) * [ε260[d(GTAG)]]] 123 Resultate und Diskussion μM Ausgangsmenge Oligonucleotid - μM gespaltenes Oligonucleotid X= μM Ausgangsmenge Oligonucleotid 2.5 2 y = 2.4572e -0.2825x 1.5 ln [x] 1 0.5 0 0 1 2 3 4 5 6 t [h] Abb. 112 Graph zur Berechnung der Halbwertszeit τ ½ des Oligonucleotids 57 Da es sich hierbei um eine Reaktion erster Ordnung handelt, ist k die negative Hochzahl und es folgt daraus: τ ½ = ln 2 / k = 2.45 h Somit erhält man eine Halbwertszeit von 2.45 h. Analoge Versuche wurden für die an der G2-Position modifizierten Oligonucleotide 189-195 durchgeführt. Diese direkt an der Schnittstelle modifizierten Oligonucleotide werden im Gegensatz zu dem unmodifizierten Oligonucleotid auch nach einer Inkubationszeit von 76 Stunden nicht gespalten. Abb. 113, S. 125 zeigt exemplarisch die Chromatogramme des C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189. 124 Resultate und Diskussion 0,25 t=0h t=1h t=5h t=24h t=76h 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 -0,05 10 20 t [min] Abb. 113 Restriktionsabbau des G2-C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189 Hier wird ein erster immenser Einfluss einer C8-Arylamin modifizierten 2‘Desoxyguanosinbase deutlich. Durch diese Modifikation scheint es dem Restriktionsenzym EcoRI nicht mehr möglich zu sein an den OligonucleotidDoppelstrang zu binden und die enzymatische Spaltung durchzuführen. Diese Beobachtung ist dabei unabhängig von der aromatischen Modifikation. Neben der Modifikation der Guanosinbase an der Schnittstelle des EcoRI-Enzyms sollte untersucht werden, ob auch eine C8-Arylamin-Modifikation außerhalb dieser Schnittstelle einen Einfluss auf die Aktivität des Enzyms hat. Dazu wurden exemplarisch die an G1-modifizierten Oligonucleotide 196 (C8-Anilin-modifiziert) und 197 (C8-4-Aminobiphenyl-modifiziert) untersucht. Bei diesen analog durchgeführten Experimenten konnte auch für diese modifizierten Oligonucleotide eine Spaltung beobachtet werden. Die Chromatogramme des Verdaus des Oligonucleotid 197 sind exemplarisch in Abb. 114, S. 126 dargestellt. 125 Resultate und Diskussion 0h 1h 2h 4h 8h 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 -0,05 10 20 t [min] Abb. 114 Restriktionsabbau des G1-C8-4-Aminobiphenyl modifizierten Oligonucleotids 197 Aus diesen Chromatogrammen ist der Abbau des Oligonucleotids 197 klar zu erkennen. Die Abnahme des durch das 12mer hervorgerufenen Peaks führt in diesem Fall nur zu Entstehung eines weiteren Peaks (nach kompletten Verdau ist nur dieser zu erkennen). Dieser wird nicht nur durch das entstehende Octamer, sondern auch durch das Tetramer welches die Modifikation beinhaltet, verursacht. Analoge Beobachtungen konnten auch bei dem Abbau des Oligonucleotids 196 gemacht werden. In beiden Fällen war eine Berechnung der Halbwertszeit möglich. Tabelle 20 fasst die Ergebnisse im Vergleich zum unmodifizierten Oligonucleotid 57 zusammen. Oligonucleotid t1/2 [h] 57 (unmod.) 2.5 196 (Anil) 6.5 197 (4-ABP) 3.4 Tab. 20 Zusammenfassung der berechneten Halbwertszeiten des EcoRI-Restriktionsverdaus 126 Resultate und Diskussion Aus den erhaltenen Werten ist deutlich der Einfluss der Modifikationen auf die Enzymaktivität zu erkennen. Auch außerhalb der Erkennungssequenz des EcoRIEnzyms ist eine Verminderung der Enzymaktivität zu beobachten. So beträgt die Halbwertszeit für das C8-4-Aminobiphenyl-modifizierte Oligonucleotid 197 mit 3.4 h nahezu das 1.5-fache wie für das unmodifizierte Oligonucleotid 57. Deutlicher ist der hemmende Einfluss für die monocyclische Modifikation des Oligonucleotids 196. Für dieses C8-Anilin-modifzierte Oligonucleotid ist mehr als eine Verdopplung der Halbwertszeit auf 6.5 Stunden zu beobachten. Somit scheint der Effekt einer Grenzcarcinogen-modifizierten Guanosinnucleobase größer zu sein, als das einer in C8-Position mit einem starken Carcinogen modifizierte Guanosinbase. Dieses unerwartete Ergebnis lässt sich bislang nicht erklären, gibt jedoch einen ersten Hinweis darauf, dass der Unterschied in der Carcinogenität mono- und polycyclischer aromatischer Amine durch unterschiedliche Interaktionen mit Enzymen verursacht werden könnte. Um einen weiteren Einblick und eine mögliche Bestätigung dieser Überlegung zu erhalten, wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Andreas Marx, Universität Konstanz, erste Primer-Verlängerungs-Experimente durchgeführt. Die ersten Ergebnisse hierzu sollen im Folgenden aufgezeigt werden. 4.8 Primer-Verlängerungs-Untersuchungen Mit Primer-Verlängerungs-Untersuchungen sollte der Einfluss von C8-ArylaminModifikationen am 2’-Desoxyguanosin in Oligonucleotiden auf die Selektivität verschiedener DNA-Polymerasen untersucht werden. DNA-Polymerasen lassen sich nach Strukturhomologien in mindestens sechs Familien einteilen, darunter Familie B (z.B. Pfu), Familie X (z.B. Pol β) und Familie Y (z.B. Dpo4). Die DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus (Pfu) arbeitet mit einer extrem hohen Genauigkeit. Da sie zusätzlich noch thermostabil ist, wird sie häufig für die PCR verwendet.[132] 127 Resultate und Diskussion Pol β ist eine Polymerase, die durch Basen-Excisions-Reparatur entstandene „Löcher“ in der DNA wieder auffüllt. In vitro macht Pol β jedoch vergleichsweise sehr viele Deletionen und Einbaufehler (ein Fehler pro103 bp).[133] Es wird weiter angenommen, dass Pol β in der Neurogenese eine entscheidende Rolle spielt und auch bei der Meiose beteiligt ist.[134] Dpo4 (Y-Familie) aus Sulfolobus solfataricus wird häufig als strukturelles und funktionelles Modell für eine DNA-Polymerase der Y-Familie verwendet. Sie ist ebenfalls eine thermostabile Polymerase, welche eine Fehlerrate von 8 × 10–3 bis 3 × 10–4 besitzt.[135] Die in dieser Arbeit synthetisierten, modifizierten Oligonucleotide (58 und 203-208) sollten nun mit den DNA-Polymerasen aus den drei verschiedenen Familien (Pfu exo-, Polβ, Dpo4) untersucht werden. Es wurde untersucht, welche Auswirkungen der Einbau einer C8-ArylaminModifikation in den Templatstrang auf die Genauigkeit beim komplementären Nucleotideinbau bzw. beim Einbau des darauffolgenden Nucleotids hat. Für die Versuche zur Einbaugenauigkeit gegenüber dem C8-modifizierten Desoxyguanosin wurden „standing-start“-Reaktionen durchgeführt. Das heißt, die DNA-Polymerase ist noch nicht in Bewegung, wenn sie an die zu untersuchende Stelle kommt. Sie muss dort zuerst an die DNA binden und dann mit der Synthese beginnen. Dafür wurde ein Primer verwendet, der direkt vor dem Desoxyguanosinanalogon endet. Um ein Nucleotid verlängert ist der Primer für die Einbauversuche des darauffolgenden Nucleotids. Diese Experimente werden im weiteren Verlauf der Arbeit als „standing-start +1“-Versuche bezeichnet. Hierbei sollte das Nucleotid des verwendeten Primers, welches sich gegenüber der Modifikation befindet, dem bei den „standing-start“-Reaktionen bevorzugt eingebauten entsprechen. Die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-Bilder (PAGE) wurden folgendermaßen beschriftet: Die Abkürzungen über jeder Bande geben die Art der C8-Modifikation an. Die Buchstaben unter jeder Bande zeigen, mit welchem dNTP das Reaktionsgemisch versetzt wurde: C: dCTP, A: dATP, G: dGTP, T: dTTP, N: alle dNTP 128 Resultate und Diskussion Zunächst wurden die „standing-start“-Reaktionen exemplarisch mit dem 4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotid 207 und dem 4-Anisidin-modifizierten Oligonucleotid 204 im Vergleich zum unmodifizierten Referenzstrang 58 mit den verschiedenen Polymerasen durchgeführt. Zu der Lösung mit dem Reaktionspuffer, Primer und dem jeweiligen Templat wurden die DNA-Polymerase und das entsprechende dNTP gegeben. Abb. 115 zeigt die Polyacrylamid-Gele. Abb. 115 Polyacrylamid-Gele der ersten „standing-start“-Reaktionen Bei den Reaktionen des unmodifizierten Templat 58 ist für alle drei verwendeten Enzyme der kanonische Einbau von dCTP zu erkennen. Neben diesem sind lediglich für die Pfu DNA-Polymerase geringe Fehleinbauten aller drei übrigen Nucleotide zu 129 Resultate und Diskussion sehen. Bei der Zugabe aller vier dNTPs ist für das Templat 58 jeweils unabhängig vom verwendeten Enzym eine vollständige Elongation des Stranges zu beobachten. Bei den Versuchen der modifizierten Template 207 und 204 mit der Pfu DNAPolymerase ergeben sich erste Unterschiede. So ist bei dem 4-Aminobiphenylmodifizierten Templat 207 neben dem kanonischen Einbau von dCTP ebenfalls, wenn auch in geringerer Häufigkeit, der Einbau von dATP zu beobachten. Auffällig ist der Abbruch bei der Zugabe aller dNTPs nach dem Einbau eines Nucleotids. Es erfolgt hier keine vollständige Elongation zum 30mer. Diese Beobachtung tritt ebenfalls beim 4-Anisidin-modifizierten Templat 204 auf. Auch hier erfolgt der Kettenabbruch nach dem Einbau eines Nucleotids. Unterschiedlich, im Vergleich zum Templat 207, ist jedoch die Häufigkeit eines nicht-kanonischen Einbaus. Das 4Ansidin-Addukt bewirkt einen Fehleinbau von dATP und dTTP. Diese haben jeweils die gleiche Häufigkeit wie der Einbau des dCTP. Die monocyclische Modifikation hat also einen größeren Einfluss auf die Genauigkeit der Pfu DNA-Polymerase und führt zu einer höheren Fehlerrate als die verwendete polycyclische Modifikation im Templat 207. Analoge Beobachtungen können auch bei der Verwendung der Dpo4 DNAPolymerase gemacht werden. Auch hier erfolgt keine vollständige Elongation der Template 204 und 207. Erneut kommt es zu dem bereits für die Pfu DNA-Polymerase beobachteten Kettenabbruch. Ebenfalls ist die Häufigkeit eines Fehleinbaus bei dem 4-Anisidin-modifizierten Templat 204 höher als bei dem entsprechend 4-Aminobiphenyl-modifizierten Templat 207. Insgesamt ist jedoch ein geringerer Fehleinbau bei der Dpo4 DNA-Polymerase als bei der Pfu DNA-Polymerase zu erkennen. In gleicher Häufigkeit wie bei der Dpo4 DNA-Polymerase erfolgt auch der fehlerhafte Einbau bei der Verwendung der humanen pol β DNA-Polymerase. Auch hier ist der Anteil des nicht-kanonischen Einbaus von dATP und dTTP bei dem 4-Anisidinmodifizierten Templat 204 größer als beim 4-Aminobiphenyl-modifizierten Templat 207. Einen Unterschied zu den anderen verwendeten Enzymen besteht bei der Zugabe aller vier dNTPs. Hier ist in beiden Fällen neben einer vollständigen Elongation auch das Auftreten eines um ein bzw. zwei Nucleotide verkürzten Stranges zu beobachten. Die Modifikationen könnten also in diesen Fällen zu einer 130 Resultate und Diskussion ein- bzw. zwei-Basendeletion führen, wie sie für heterocyclische Modifikationen bereits von Rizzo beschrieben worden sind.[136] Um genauere Aussagen über die Häufigkeit eines nicht-kanonischen Einbaus machen zu können, wurden weitere „standing-start“-Reaktionen mit den modifizierten Oligonucleotiden 204-208 durchgeführt. In diesen Fällen wurde neben der humanen pol β DNA-Polymerase die Dpo4 DNA-Polymerase verwendet. Abbildung 116 zeigt die erhaltenen PAGE-Gele. Abb. 116 PAGE-Gele der durchgeführten „standing-start“-Reaktion mit den Oligonucleotiden 58 und 204-208 unter der Verwendung der humanen pol β und der Dpo4 DNA-Polymerase Bei diesen durchgeführten Versuchen lassen sich die zuvor erhaltenen Ergebnisse bestätigen. Bei der humanen pol β DNA-Polymerase erfolgt bei dem unmodifizierten 131 Resultate und Diskussion Templat 58 einzig der kanonische Einbau von dCTP. Für alle modifizierten Template 204-208 ist eine deutlich geringere Einbaurate zu erkennen. Dabei kommt es bei den polycyclisch modifizierten Templaten 207 und 208 nur zu einem Einbau von dCTP, während bei den monocyclischen Templaten 204-206 auch der Einbau von dATP und, im Falle des 4-Anisidin Adukktes 204, von dTTP zu beobachten ist. Der höhere Einfluss der monocyclischen Modifikation auf einen nicht-kanonischen Einbau bestätigt sich auch hier und lässt auf eine Allgemeingültigkeit schließen. Auch scheint dieser Trend nicht vom Enzym abhängig zu sein. Bei der Verwendung der Dpo4 DNA-Polymerase bestätigen sich wiederum die Unterschiede in der Häufigkeit der Fehleinbauten. Bei den monocyclischen Modifikationen 204-206 überwiegt erneut der nicht-kanonische Einbau im Unterschied zu den entsprechend polycyclisch modifizierten Templaten 207 und 208, wo ein solcher nur mit geringerer Häufigkeit zu beobachten ist. Allgemein lässt sich erkennen, dass die Dpo4 DNA-Polymerase im Vergleich zur humanen pol β DNA-Polymerase eine deutlich höhere Häufigkeit von nicht-kanonischen Einbauten aufweist, was bereits am unmodifizierten Templat 58 deutlich wird. Auch hier kommt es zum Einbau von dATP, dGTP und dTTP. Um Informationen zu erhalten, welche Effekte solche Modifikationen auf eine weitere Elongation haben, wurden im Folgenden „standing-start +1“-Versuche durchgeführt. Hierzu wurde der in den vorigen Versuchen eingesetzte Primer um ein Nucleotid verlängert. Zum Einen, dem kanonischen Einbau entsprechend, mit dC (F26C) und zum Anderen, einem nicht-kanonischen Einbau entsprechend, mit dA (F26A). Anschließend wurden den „standing-start“-Experimenten analoge Reaktionen mit dem Reaktionspuffer, den beiden Primern, dem jeweiligen Templat und der DNAPolymerase sowie dem entsprechenden dNTP durchgeführt. Für diese Untersuchungen wurden neben der humanen pol β DNA-Polymerase die Dpo4 DNAPolymerase verwendet. In Abb. 117, S. 133 sind die PAGE-Gele der „standing-start +1“-Versuche unter Verwendung der humanen pol β DNA-Polymerase dargestellt. 132 Resultate und Diskussion Abb. 117 „standing-start +1“-Versuche der Template 58 und 203-208 unter Verwendung der humanen pol β DNA-Polymerase Bei der Verwendung des F26A-Primers (exemplarisch für einen nicht-kanonischen Einbau) kann man lediglich bei den polycyclisch modifizierten Templaten 207 und 208 einen weiteren Einbau erkennen. Dieser ist mit dTTP ebenfalls nicht-kanonisch und führt daher erneut zu einer Mutation, möglicherweise durch das Überspringen (1Basendeletion) des im Templat befindlichen T. Für die monocyclisch modifizierten Template 203-206, sowie für den unmodifizierten DNA-Strang 58 erfolgt ein Kettenabbruch. Hier kommt es zu keinem weiteren (fehlerhaften) Einbau. Grund hierfür könnte eine Erkennung des nicht-kanonische Einbaus an der vorherigen Position durch die Polymerase sein. Die polycyclische Modifikation könnte also einen Einfluss auf die Exonuclease-Aktivität der humanen pol β DNA-Polymerase haben. Bei der Verwendung des F26C-Primers (kanonischer Einbau) hingegen kommt es in allen Fällen zu einer weiteren Elongation. Es wird dabei jeweils mit dATP ein korrekter Einbau vorgenommen und kein weiterer Einfluss der Modifikation auf die Polymerase-Aktivität beobachtet. 133 Resultate und Diskussion Für die Dpo4 DNA-Polymerase wurden analoge Experimente durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abb. 118 zusammengefasst. Abb. 118 „standing-start +1“-Versuche der Template 58 und 203-208 unter Verwendung der Dpo4 DNA-Polymerase Bei der Verwendung des F26A-Primers (exemplarisch für einen nicht-kanonischen Einbau) kommt es bei der weiteren Elongation durch die Dpo4 DNA-Polymerase zu einem massiven Fehleinbau. So kann in allen Fällen neben dem kanonischen Einbau von dATP auch der Einbau von dTTP beobachtet werden. Es kommt weiterhin zu keinem Kettenabbruch, sondern zum weiteren Einbau von dTTP. Dieses weist auf eine Ein-Basendeletion hin, welche durch den nicht-kanonischen Einbau des dATP gegenüber der Modifikation hervorgerufen sein könnte. Auch bei der weiteren Elongation des F26C-Primers (kanonischen Einbau) durch die Dpo4 DNAPolymerase ist eine solche Basendeletion zu vermuten, da es hier ebenfalls nicht nur zu dem kanonischen Einbau von dATP kommt. Vielmehr ist hier auch eine weitere Elongation mit dATP zu erkennen. Die höchste Fehlerrate beim Einbau weist dabei das unmodifizierte Templat 58 auf, was ein Hinweis auf die hohe Ungenauigkeit der 134 Resultate und Diskussion verwendeten Dpo4 DNA-Polymerase ist. Die mit der Dpo4 DNA-Polymerase durchgeführten „standing-start +1“-Versuche lassen keinen Unterschied in dem Einfluss mono- bzw. polycyclischer Modifikationen erkennen und geben somit keinen Anhaltspunkt für eine mögliche Erklärung der unterschiedlichen Carcinogenität solcher Verbindungen. Allgemein können jedoch aus den durchgeführten Experimenten erste Schlüsse hinsichtlich der durch die C8-Arylamin-modifizierten dGs verursachten Einflüsse auf die Replikation gezogen werden. Zum Einen sind diese Einflüsse abhängig von der verwendeten Polymerase und zum Anderen vom aromatischen System der Modifikation. So führen Schäden durch monocyclische Arylamine, verglichen mit den polycyclischen, vermehrt zu einem Fehleinbau. Diese Ergebnisse widersprechen somit zunächst den im Ames-Test gefundenen Daten. Allerdings ist auch durch diesen höheren Einfluss die Möglichkeit gegeben, dass diese Art von Modifikationen in vivo schneller durch Enzyme erkannt und repariert werden. Versuche hierzu sind Gegenstand zukünftiger Projekte der Arbeitsgruppe von Prof. C. Meier. Ebenso werden gegenwärtig Versuche mit den N2-modifizierten Oligonucleotiden 209-212 sowie kinetische Messungen der „standing-start“-Versuche durchgeführt, wodurch weitere Information hinsichtlich des Einflusses solcher Modifikationen auf verschiedene Polymerasen erhalten werden können. Sollten sich die hier erhaltenen Ergebnisse bestätigen, so würde der Unterschied in der Carcinogenität durch die verschieden starke Interaktion der Modifikationen mit den Enzymen herrühren. Als Ursache dafür kämen strukturelle Unterschiede in Frage. Da durch die durchgeführten Messungen des Circular Dichroismus keine konformative Veränderung der modifizierten Oligonucleotide gefunden werden konnte, sollte eine Methode zur strukturellen Analyse modifizierter Oligonucleotide etabliert werden, um diese in Zukunft untersuchen zu können. Für solche strukturellen Untersuchungen kommen hauptsächlich drei Methoden in Frage: 1) Molecular Modelling 2) NMR-Strukturanalyse 3) Kristallisation 135 Resultate und Diskussion Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Grundlagen zur Kristallisation und damit zur strukturellen Analyse modifizierter Oligonucleotide geschaffen werden. Diese Methode erscheint für die gewünschten strukturellen Untersuchungen am besten geeignet, da zum Einen vergleichsweise wenig Substanz benötigt wird (im Gegensatz gemessenen zur NMR-Strukturanalyse), Datenpunkten jedoch berechnet eine werden Struktur kann (im aufgrund von Gegensatz zur computergestützten Berechnung mittels molecular modelling). Die ersten Versuche hierzu sollen im Folgenden beschrieben werden. 4.9 Erste Versuche zur Kristallisation von Oligonucleotiden Die Versuche wurden in Kooperation mit Dr. Markus Perbandt, Universität Hamburg und dem in Hamburg ansässigen DESY durchgeführt. Im Gegensatz zu kleinen Molekülen wie Zucker oder Salze, die häufig problemlos auskristallisieren und sehr regelmäßige Kristalle bilden, kristallisieren die oft sehr großen DNA-Moleküle mit ihrer unregelmäßigen dreidimensionalen Struktur nur unter ganz bestimmten Bedingungen, die in Versuchsreihen ermittelt werden müssen. Für diese Versuche wird eine Oligonucleotid-Lösung mit einer Konzentration von 2.5 mg/mL verwendet. Da zunächst optimale Kristallisationsbedingungen gefunden werden sollten, wurde zunächst das selbstkomplementäre unmodifizierte Oligonucleotid 57 für diese Zwecke verwendet. Der erste Schritt ist die Wahl des richtigen Puffersystems. Das gewählte System sollte die DNA-Moleküle mit dem negativ geladenen Phosphatrückgrat stabilisieren, jedoch nicht mit dem Duplex in Wechselwirkung treten oder gar reagieren. Ziel ist es durch die Wahl eines geeigneten Puffers eine monodisperse Lösung zu erhalten. D.h., dass sich in der Lösung nur Teilchen einer Größe befinden, in diesem Fall des DNA-Duplex. Unerwünscht sind Einzelstränge, sowie die Bildung höhere Aggregate, wie z.B. eine Triplehelix oder das Annealing mehrerer DNA-Duplices aneinander. Zur Bestimmung der Monodispersität wird die dynamische Lichtstreuung der Probe vermessen. 136 Resultate und Diskussion Bei der dynamischen Lichtstreuung (DLS) handelt es sich um eine Methode, bei der das Streulicht eines Lasers an einer gelösten Probe analysiert wird. Sie wird am häufigsten bei Polymeren und Biopolymeren wie zum Beispiel Proteinen angewandt, um den hydrodynamischen Radius der Moleküle zu bestimmen. Strahlt man mit einem Laser auf eine gelöste Probe, so wird ca. 1 % des Lichts an den gelösten Molekülen gestreut. Analysiert man die Intensität des Streulichts unter einem bestimmten Winkel, so erhält man eine Messgröße, die eine Aussage über die Molekülmasse der Moleküle erlaubt. Man spricht hierbei zur klaren Unterscheidung von der dynamischen Lichtstreuung auch von 'statischer Lichtstreuung'. Da die Moleküle sich in Lösung aber auch bewegen (Brown‘sche Molekularbewegung), wird die Wellenlänge des gestreuten Lichtes minimal verändert. Dies hat zur Folge, dass die Intensität des Streulichtes kleine Schwankungen aufweist. Misst man nun diese Schwankungen im MillisekundenBereich, so spricht man von 'dynamischer Lichtstreuung'. Aus den Schwankungen kann man die Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle in Lösung bestimmen. Und kann den hydrodynamischen Radius der Moleküle in Lösung bestimmen.[137] Mittels solcher Messungen konnte ein Puffersystem gefunden werden, welches alle genannten Bedingungen erfüllt. Abb.119 zeigt die Ergebnisse der DLS-Messungen unter der Verwendung eines Natriumcacodylat-Puffers.[138] Abb. 119 Ergebnisse der DLS-Messung des Oligonucleotids 57 unter Verwendung des Natriumcacodylat-Puffers; links: zeitabhängige Messung, rechts: berechneter hydrodynamischer Radius 137 Resultate und Diskussion Aus den erhaltenen Daten ist die einheitliche Teilchengröße in der verwendeten Lösung zu erkennen. Der berechnete hydrodynamische Radius beträgt in diesem Fall 2.90 nm. Anschließend erfolgt ein erstes Screening, bei dem eine Reihe von Bedingungen austestet. Hierzu wurden die Bedingungen käuflich erworbener Kristallisations-Kits ausgetestet. Zum Einen wurde der Natrix-Screen (s. Anhang) angewendet. Zum Anderen kam der MPD-Screen (s. Anhang) zum Einsatz. Beide Kits wurden von der Firma Hampton Research erworben. Die in diesem Screening ermittelten Bedingungen (0.01M Magnesiumchlorid, 0.5M HEPES-Puffer pH 7.0, 25% Polyethylenglycolmonomethylether 550), bei denen Kristallisationskeime gebildet werden, wurden anschließend systematisch durch Konzentrationsvariationen mittels der hanging drop-Methode optimiert. Es gibt grundsätzlich zwei verschiedene Methoden zur Kristallisation, die sitting dropund die hanging drop-Methode. Bei der hier angewendeten hanging drop-Methode werden ein paar Mikroliter der Oligonucleotid-Lösung mit einem gleichen Volumen einer Reservoir-Lösung gemischt, die das Präzipitationsmittel enthält. Ein Tropfen dieser Mischung wird auf einen Glasträger gegeben, der das Reservoir bedeckt (s. Abb. 120, S. 139). Da die Lösung im Reservoir eine höhere Konzentration des Präzipitationsmittels enthält als der Tropfen (der ja ein Gemisch mit Oligonucleotid ist), tritt im Laufe der Zeit Wasser von dem Tropfen in das Reservoir über und sowohl die DNAKonzentration als auch die Konzentration des Präzipitationsmittels im Tropfen erhöht sich sukzessive. Dieser Vorgang wird mikroskopisch verfolgt, immer in der Hoffnung, dass sich Kristallisationskeime bilden. Für die Vermessung von Kristallen mittels Synchrotronstrahlung[139] (besondere Form der Bremsstrahlung durch elektromagnetischen Wellen, die tangential zur Bewegungsrichtung von Elektronen austreten, wenn sie durch ein Magnetfeld abgelenkt werden) müssen diese neben einer homogenen, möglichst kubischen Form auch eine Größe von 1 mm pro Seite aufweisen. Abb. 121, S. 140 zeigt einige für das Oligonucleotid 57 erhaltenen Kristalle. 138 Resultate und Diskussion Abb. 120 hanging drop-Methode zur Kristallisation von Oligonucleotiden Zwar wurde mit allen erhaltenen Kristallen eine Vermessung durchgeführt, jedoch konnte in keinem Fall ein verwertbarer Datensatz erhalten werden. Als mögliche Gründe hierfür ist neben der Inhomogenität der Kristalle auch die geringe Größe zu nennen. Zwar konnte anhand der Reflexmuster gezeigt werden, dass es sich um DNA-Kristalle, und nicht um auskristallisierte Salze des verwendeten Puffers, handelt, jedoch konnte keine Kristallstruktur des unmodifizierten selbstkomplementären Oligonucleotids 57 (EcoRI-Sequenz) erhalten werden. 139 Resultate und Diskussion Abb. 121 erhaltene Kristalle des Oligonucleotides 57 Um eine Inhomogenität durch die vorliegende Selbstkomplimentarität der Oligonucleotids 57 auszuschließen, wurde ein entsprechendes Screening mit dem unmodifizierten DNA-Doppelstrang 58/202 durchgeführt. Auch hier konnte das Wachstum von ersten Kristallen beobachtet werden. Gegenwärtig werden die Kristallisationsbedingungen durchgeführt. Diese für ersten diesen vielversprechenden Ansätze zur unmodifizierten Optimierung DNA-Duplex Kristallisationsansätze der 58/202 werden in zukünftigen Arbeiten von Frau Sarah Krüger aus der Arbeitsgruppe von Prof. Meier weiter verfolgt werden. 140 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Das Ziel dieser Arbeit war der Unterschied in der Mutagenität/Carcinogenität von mono- bzw. polycyclischen aromatischen Aminen zu untersuchen. Diese nach Metabolisierung unter Bildung von hochreaktiven Nitreniumionen umgewandelten Verbindungen reagieren mit den Nucleobasen der DNA und führen in unterschiedlichem Maße zur Bildung von Mutationen. Die Bearbeitung dieses Themas unterteilte sich dabei in mehrere Punkte. Um die Auswirkungen solcher Modifikationen in DNA-Doppelsträngen untersuchen zu können, mussten in einem ersten Teil zunächst die Nucleosid-Addukte hergestellt und in die entsprechenden Phosphoramidite überführt werden. Als zweiter wesentlicher Teil dieser Arbeit sollten nach dem erfolgten Einbau in ausgewählte DNA-Sequenzen die Eigenschaften der modifizierten DNA-Duplices bestimmt und möglicherweise erste Informationen für den Carcinogenitätsunterschied mono- bzw. polycyclischen aromatischer Amine erhalten werden. Zunächst wurde eine Optimierung der Synthese von C8-Arylamin-modifizierten 2‘-Desoxyguanosinaddukten und deren anschließende Überführung in die modifizierten Phosphoramidite mit einer möglichst basenlabilen Schutzgruppe der exocyclischen Aminofunktion (zur Verkürzung der Schutzgruppenabspaltung nach der Oligonucleotidsynthese) vorgenommen. Nach der dreistufigen Darstellung des geschützten, bromierten Bausteins 63 gelang die Einführung der C8-ArylaminModifikation mittels einer Palladium-katalysierten Kreuzkupplungsreaktion (Buchwald-Hartwig-Reaktion) in Ausbeuten von 55-91% (s. S. 29). Diese geschützten Addukte 66-72 konnten in zwei Stufen jeweils komplett entschützt und anschließend die exocyclische Aminofunktion mit der Formamidin-Schutzgruppe blockiert werden. Dabei führten diese Addukte 87-93 zu keiner Konformationsänderung und so lag bei allen eine anti-Stellung der Nucleobase vor (s. S. 35). Abschließend gelang es diese Addukte in weiteren zwei Syntheseschritten in die entsprechenden Phosphoramidite 108-114 zu überführen, die Bausteine zur Oligonucleotidsynthese zu generieren und damit die Allgemeingültigkeit dieser Syntheseroute klar zu belegen unter der Verwendung der labilen Schutzgruppe der exocyclischen Aminofunktion. Neben den synthetisierten Arylamin-modifizierten C8-Addukten des 2‘-Desoxyguanosin kommen weiteren Addukten eine Bedeutung in der chemischen 141 Zusammenfassung Carcinogenese zu (s. Abb. 5, S. 9). Die Darstellung der N2-Arylamin-modifizierten Addukte wurde dabei auf drei verschiedenen Syntheserouten untersucht (s. Kap. 4.2, S. 41). Eine zunächst durchgeführte Azokupplung eines Nitrosoaryl mit dem 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 121 zur Darstellung der N2-Addukte scheiterte. Ebenfalls erfolglos verlief die Umsetzung des Triflat-Intermediats 123 mit Phenylhydrazin. Zwar konnte hier das gewünschte Addukt 122 in geringer Ausbeute hergestellt werden, jedoch bleiben als Ergebnis dieser Syntheseroute mehrere Probleme bestehen. Zum Einen erwies sich die Zugänglichkeit des TriflatIntermediats 123 als sehr schwierig und gelang nur in einer Gesamtausbeute von 2%, was eine Darstellung größerer Mengen nicht möglich macht. Zum Anderen ließ sich das N2-Addukt 122 nicht in reiner Form isolieren und lag in einem nicht trennbaren Produktgemisch vor. Erfolgreich, und damit die erstmalige Darstellung in guten Ausbeuten, verlief der Syntheseweg mittels einer Buchwald-Hartwig-Reaktion-ähnlichen Synthese unter der Verwendung des entsprechenden Arylhydrazins und einem an 2-Position bromierten Baustein 126. Die dreistufige Darstellung dieses Bausteins gelang dabei mit einer Gesamtausbeute von 30% und lässt somit auch die Darstellung größerer Mengen zu (s. S. 51). Nach der Optimierung dieser Kreuzkupplungsreaktion und der erfolgreichen Darstellung des N2-Adduktes 122 erfolgte die Umwandlung in die entschützte Form 127. Eine anschließende Schützung mit DMTr verlief in schlechten Ausbeuten und eine Überführung in das entsprechende Phosphoramidit 129 scheiterte an einer vermeintlichen Instabilität dieser Verbindung (s. S. 57). Es gelang im Folgenden eine Stabilisierung des Systems durch die Verwendung einer O6-Schutzgruppe, welche nach der Oligonucleotidsynthese abgespalten werden kann. Hierfür wurde die von Pfleiderer etablierte CPE-Gruppe verwendet (s. S. 59 ff.). Auch hier gelang es den bromierten Baustein 132 in einer guten Gesamtausbeute von 47% herzustellen. Die Arylmodifikationen konnten dann mittels der in dieser Arbeit etablierten Kreuzkupplungsreaktion eingeführt werden und die entsprechenden N2-Addukte 136-139 erstmalig in sehr guten Ausbeuten synthetisiert werden (s. S. 61). Bei der anschließend für die Addukte 136 und 137 durchgeführten TBDMS-Entschützung kam es neben der Bildung der gewünschten Produkte 140, 141 auch zur Entstehung der Azoprodukte 142, 143. Diese spielen ebenfalls eine Rolle in der chemischen Carcinogenese. Das Produktgemisch 140/142 sollten 142 Zusammenfassung zunächst chemisch quantitativ in die jeweiligen reinen Komponenten 140 bzw. 142 überführt werden, welches jedoch in keinem Fall gelang. Eine Trennung und damit die saubere Isolierung beider Adduktformen gelang mittels RP- Säulenchromatographie in guten Ausbeuten (s. S. 66). Anschließend gelang es die jeweiligen N2-Addukte nach einer durchgeführten DMTr-Schützung in die Phosphoramidite 148-151 zu überführen und somit erstmalig die Darstellung solch modifizierter Bausteine für die Oligonucleotidsynthese mittels einer höchst effizienten Syntheseroute zu ermöglichen. Diese neu etablierte Syntheseroute bietet dabei den Vorteil, dass neben den N2-Hydrazinoaryl- auch die N2-Azoaryl-Addukte erstmalig zugänglich sind und die Darstellung der entsprechenden Phosphoramidite auch in größeren Mengen problemlos zu erzielen ist. Zur Darstellung der O6-Arylamin-modifizierten Addukte wurden zwei Synthesewege beschritten. Zunächst sollte die Arylamin-Modifikation mittels einer Mitsunobu-artigen Reaktion unter Verwendung eines geschützten Hydroxylamin eingeführt werden. Da jedoch unter keinen gewählten Bedingungen eine Reaktion zu beobachten war (s. Kap. 4.3.1) wurden Versuche zur Einführung der Modifikation mittels Substitution unternommen (s. Kap. 4.3.2). Die Darstellung von 2‘-Desoxyguanosinderivaten, welche eine gute Abgangsgruppe an der 6-Position besitzen, gelang dabei für die Chloride 166 und 169 sowie das N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl-Derivat 173 in guten Ausbeuten. Jedoch konnte auch hier unter keiner Reaktionsbedingung die Bildung des gewünschten Produktes beobachtet werden. Eine weitere Einführung einer Abgangsgruppe bestand in der Schützung der O6-Position mit Benzotriazol. Die Darstellung des analogen Benzotriazol-geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivates 174 gelang in einer guten Ausbeute von 63%. Bei den durchgeführten Reaktionen konnte eine rasche Umsetzung beobachtet werden. Zwar handelt es sich auch bei diesem Produkt nicht um das gewünschte O6-Addukt, vielmehr konnte das unerwartete C8-N-Ac-geschützte Addukt 175 isoliert werden (s. S. 90). Durch eine Optimierung der Reaktionsbedingungen war es möglich, die Ausbeute auf 75% zu steigern und somit eine neue, einfache und höchst effektive Darstellungsmethode für C8-N-Ac-geschützte Addukte zu entwickeln. In weiteren vier Syntheseschritten war die Überführung in das entsprechende Phosphoramidit 179 mit einer Gesamtausbeute von 45% möglich (s. S. 93). Diese entwickelte Syntheseroute macht es möglich auch diese Adduktform in zukünftigen Arbeiten weiter auf ihren Einfluss auf die Eigenschaften der DNA durch gezielte Synthese und Einbau in 143 Zusammenfassung Oligonucleotide zu untersuchen, was bislang aufgrund einer einfachen fehlenden Syntheseroute nicht möglich war. Mit den C8- und N2-modifizierten Phosphoramiditen 108-114 und 148-151 wurden unter Verwendung eines abgewandelten Standard-Syntheseprotokolls (s. Anhang) verschiedene, modifizierte Oligonucleotide synthetisiert (s. Kap. 4.4, S. 94 ff.). Für die C8-modifizierten Oligonucleotide konnten nach einer durch die verwendete labilere Schutzgruppe verkürzten Abspaltungszeit mit Ammoniak und anschließender Reinigung mittels HPLC die gewünschten Oligonucleotide mit einer 4-5fach höheren Ausbeute erhalten werden, als dieses mit der bislang verwendeten isoButyrylStrategie möglich war (s. Kap. 4.4.1). Für die N2-modifizierten Oligonucleotide wurde zunächst eine geeignete Methode zur Abspaltung der CPE-Schutzgruppe unter Verwendung von DBU etabliert. Nach analog zu den C8-modifizierten Oligonucleotiden erfolgter Abspaltung mit Ammoniak und abschließender Reinigung konnten alle modifizierten Oligonucleotide in reiner Form erhalten werden (s. Kap. 4.4.2). Bei den gewählten Sequenzen handelt es sich zum Einem um die NarI-Sequenz 5'-d(CTCGGCGCCATC), einem Hot Spot für Arylamin-Modifikationen. Hier konnten C8-Arylamin-Modifikationen erfolgreich in Position 4 und 7 eingebaut werden und anhand von Schmelzpunktexperimenten und CD-spektroskopischen Untersuchungen dieser modifizierten Oligonucleotide mit den entsprechenden Antisense-Strängen der Einfluss der Modifikation auf das Hybridisierungsverhalten oder die Konformation der entstehenden DNA-Helix festgestellt werden. Dabei bleibt als Ergebnis festzuhalten, dass die polycyclische C8-Modifikation einen massiven Einfluss auf den Tm-Wert hat und zu einer deutlicheren Senkung dieses führen. Ein Einfluss eines Schadens auf die Konformation konnte in keinem Fall beobachtet werden. Als weitere Sequenz wurde das selbstkomplementäre 12mer 5'-d(GTAGAATTCTAC) gewählt welche eine Erkennungssequenz für das Enzym EcoRI besitzt. Neben den C8-Addukten wurden erstmals die N2-Addukte eingebaut. Es konnte hier außer dem Einfluss auf den Tm-Wert und die Konformation auch die Auswirkungen auf die Aktivität des Restriktionsenzym EcoRI durch einen in dieser Arbeit etablierten Abbau untersucht werden (s. Kap. 4.7). Aus den Untersuchungen ging hervor, dass eine N2-Modifikation im Allgemeinen einen größeren Einfluss auf die Schmelztemperatur hat als die entsprechenden C8-Modifikationen. So war in keinem Fall eine Duplex-Bildung oberhalb von 5 °C zu beobachten (s. S. 112). Ein 144 Zusammenfassung Einfluss auf die Konformation war jedoch erneut nicht zu beobachten. Bei den in Position 1 und 4 C8-modifizierten Oligonucleotiden ergaben sich einige Rückschlüsse auf den Einfluss solcher Modifikationen auf Enzyme durch den durchgeführten Restriktionsabbau. Eine Modifikation direkt an der Schnittstelle führt zu einer kompletten Inaktivität des EcoRI-Enzyms, während eine Modifikation außerhalb der Schnittstelle immerhin noch eine Erniedrigung der Aktivität zur Folge hat. Hierbei ist der Einfluss der polycyclischen Modifikation geringer als der eines monocyclischen Arylamin-Schadens (s. S. 126). Zur Klärung der Auswirkungen von C8-Arylamin-Addukten auf die Wirkungsweise verschiedener DNA-Polymerasen wurden modifizierte 30mer-Oligonucleotide mit der Sequenz 5'-d(AAATG*AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) synthetisiert und als Templat in Primer-Verlängerungs-Untersuchungen mit drei verschiedenen DNAPolymerasen (Pfu, Pol β, Dpo4) eingesetzt (s. Kap. 4.8, S. 127). Als Ergebnis dieser Untersuchungen lässt sich festhalten, dass die C8-DNA-Addukte starker Carcinogene bei Versuchen eine geringere Rate an Fehleinbauten besitzen, als die monocyclischen DNA-Schäden. So findet hier für die monocyclischen Modifikationen neben dem kanonischen Einbau eines dCTPs mit derselben Häufigkeit auch der nicht-kanonischer Einbau eines dTTPs und dATPs statt (s. S. 129). Somit scheinen auch in diesen Fällen die monocyclischen Modifikationen einen höheren Einfluss auf die Enzyme zu haben. Abschließend wurden erste Versuche unternommen strukturelle Informationen mittels Kristallisation zu erhalten. Zwar gelang es das selbstkomplementäre Oligonucleotid 57 zu kristallisieren, jedoch waren diese Kristalle zu inhomogen oder wiesen eine zu kleine Oberfläch auf, um verwertbare Messungen zur Strukturanalyse mittels Synchrotronstrahlung durchführen zu können (s. Kap. 4.9, S. 136 ff.). Weitere vielversprechende Ansätze zur Kristallisation des 30mer-Oligonucleotide laufen zurzeit und waren bei der Beendigung der Arbeit nicht abgeschlossen und werden an einer anderen Stelle publiziert. Insgesamt scheinen im Rahmen dieser Arbeit erste Anhaltspunkte für die Ursache der unterschiedlichen Mutagenität mono- bzw. polycyclischer aromatischer Amine gefunden worden zu sein. So haben die monocyclischen Modifikationen einen stärkeren Einfluss auf enzymatische Aktivitäten, was eventuell zu einer schnelleren Erkennung eines solchen Schadens und damit zu einer schnelleren Reparatur führen könnte, als dieses für die polycyclischen Modifikationen der Fall ist. 145 Summary 6. Summary Polycyclic aromatic amines belong to the class of strong chemical carcinogens, whereas monocyclic aromatic amines are only borderline carcinogens, which act as carcinogens after a longer exposition or at high concentrations. Until now no reason for their different carcinogenic potential was found. Both types form covalently bonded adducts with DNA after metabolic activation. If these damages are not repaired, they can compromise the fidelity of DNA replication and cause mutations and possibly cancer. To properly study the mutagenic effects, structure and repair of these adducts, it was the aim of this thesis, to develop strategies for the site-specific incorporation of these dG-carcinogen-adducts into oligonucleotides. The first section of this thesis deals with the synthesis of the arylamine-modified phosphoramidites. Primary goal was to achieve an optimization of the synthesis of C8-arylamine-adducts using a base labile protecting group for the exocyclic amino function of 2’-dG to shorten the period of time for the alkaline cleavage after oligonucleotide synthesis. The key step for this synthesis was the Pd-catalyzed Buchwald-Hartwig reaction (see p. 29). After the complete deprotection of these adducts 66-72 the formamidine group was introduced to block the exocyclic amino function. After that the compounds 87-93 were converted into the corresponding oligonucleotide building blocks 108-114 by dimethoxytritylation and phosphitylation. In the second part of this thesis a synthetic route to the N2-arylamine-adducts was found. A direct azo-coupling as well as a substitution using a triflated 2’-dG-derivative 123 failed. Again a Pd-catalyzed cross-coupling reaction with the bromide 132 and the corresponding arylhydrazines was used to introduce the N2-modification (see p. 61). During the subsequently performed deprotection a partial oxidation to the corresponding azo-products 142, 143 could be observed. The mixture of the two N2adduct forms (N2-hydrazino and N2-azo) could be separated using RP column chromatography (see p. 66). Afterwards a dimethoxytritylation and phosphitylation led to the desired N2-arylamine modified phosphoramidites 148-151. Therefore a blocking of the O6-position using a protecting group which could be cleaved after oligonucleotide synthesis (Pfleiderers CPE-group) was found to be essential to stabilize the system and for the isolation of these oligonucleotide building blocks. As a third class of adducts the O6-arylamine modified 2’-dG-derivatives were target molecules. Unfortunately, the modifications could be introduced neither by a 146 Summary Mitsunobu-reaction nor by a substitution using different protected hydroxylamines (see chapter 4.3). When using the O6-benzotriazol protected 2’-dG-derivative 174 a quick and highly efficient conversion to the unexpected product 175, the C8-N-Acadduct, was observed. In four additional synthetic steps a conversion into the corresponding phosphoramidite 179 with an overall yield of 20% was achieved and therewith a new and short synthesis for this type of adduct been developed. The C8- and N2-modified phosphoramidites 108-114 and 148-151 were incorporated into three different oligonucleotide sequences. First the NarI-sequence with a modification in position 4 or 7 5'-d(CTCGGCGCCATC), and a self complementary sequence with a recognition site for then EcoRI enzyme 5'-d(GTAGAATTCTAC) were used to investigate the effects of the modification on hybridisation and structure of the resulting DNA-helices. The result of these CD- and Tm-value studies were that no difference in structure was observed, but a higher decrease of the polycyclic modifications of the Tm-value. Also the influence of the N2-modifications compared to the corresponding C8-adducts was bigger and for these modified oligonucleotides a lower Tm-value was measured. Using the oligonucleotides of the EcoRI-sequence a restriction assay was performed. As a result, a total prevention was achieved by modifying the dG-nucleotide at the cleavage site. When the modification was outside the recognition sequence a higher influence, leading to a higher half-live, for the C8-monocyclic-adducted oligonucleotides than for the polycyclic-modified one was observed (see p. 126). To study the influence of C8-arylamine adducts on the effectiveness of DNApolymerases, oligonucleotides of the following sequence were synthesized 5'-d(AAATG*AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) and used as templates in primer-extension experiments. Three different polymerases were used, Pfu, Pol β and Dpo4 (see chapter 4.8, p. 127). The primer-extension experiments with the modified oligonucleotides revealed differences between the three polymerases and between the modifications. The most outstanding result is that there is a much more significant introduction of a wrong base for the monocyclic modifications (dGTP and dATP instead of dCTP) opposite the modified base. This effect was also observed for the strong-carcinogen adducts, but was in comparison only very small (see p. 129). To gain information about the structure of the modified oligonucleotides first experiments for the crystallization of the oligonucleotide 57 were performed. The first 147 Summary obtained crystals were too small or too inhomogeneous. Promising experiments for the crystallization of the 30mer sequence are currently underway in our laboratories and were not terminated when this thesis was finished. 148 Ausblick 7. Ausblick Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Reihe modifizierter Oligonucleotide mit verschiedenen Addukten unterschiedlich starker Carcinogene synthetisiert und sowohl strukturell als auch molekularbiologisch untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse geben erste Hinweise auf die mögliche Ursache der unterschiedlichen Carcinogenitäten mono- bzw. polycyclischer Arylamine durch deren unterschiedliche Interaktion mit verschiedenen Enzymen. Dabei scheinen diese Wechselwirkungen nicht nur abhängig von der Art des aromatischen Systems, sondern auch von der Art der Modifikation zu sein. Um weitere Informationen hierüber zu erhalten ist es nötig, neben zusätzlichen Modifikationen in der N2-Position (z.B. 2-Aminofluoren) auch einen geeigneten Syntheseweg zur Darstellung der O6-Addukte zu finden. Eine Alternative zu den in dieser Arbeit nicht erfolgreichen Syntheserouten wäre die Darstellung dieser Addukte mittels einer Buchwald-Hartwig-Reaktion. In diesem Fall konnte eine Reaktion eines Arylbromids mit einem entsprechenden 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 215 zu dem gewünschten Produkt 216 führen (s. Abb. 122). Aryl NH2 O N Pd2(dba)3, rac-BINAP, K3PO4, Aryl-Br, 1,2-DME N N N TBDMSO NH2 O OTBDMS HN O 80 °C N N TBDMSO N N NH2 O 215 OTBDMS 216 Abb. 122 mögliche Synthesestrategie zur Darstellung der O6-Arylamin-Addukte Für die Darstellung eines solchen Kupplungsbausteins 215 bieten sich mehrere Wege an (s. Abb. 123, S.150). Zum Einen wäre eine Darstellung ausgehend vom TBDMS-geschützten 2‘-dG 121 denkbar. Durch eine Mitsunobu-Reaktion mit N-Hydroxyphthalimid und anschließender Reaktion mit Hydrazinhydrat oder Methylhydrazin könnte das gewünschte Produkt 215 liefern.[140,141] 149 Ausblick Cl N N N NH2 N TBDMSO O O N N TBDMSO 169 OTBDMS NH 1) PhthNOH, Et3N, MeCN 2) H2NNH2 . H2O, EtOH NH2 N O OTBDMS 121 Cl NH2 O 1) PhthNOH, PPh3, DIAD (rt) 2) CH3NHNH2, CH2Cl2 N 1) tBu N-hydroxycarbamat 2) CF3COOH N N TBDMSO N N TBDMSO NH2 OTBDMS OTBDMS N N OTBDMS N N TBDMSO 121 169 Cl NH2 O NH2 1) NH2OH . HCl, Na2CO3, H2O 2) KOH, nBu4NBr 3) HCl NH TBDMSO N 215 O N N O O 1) PhthNOH, PPh3, DIAD (reflux) 2) H2NNH2 . H2O, EtOH N N N NH2 O OTBDMS 169 Abb. 123 mögliche Synthesen zur Darstellung des Hydroxylamin 215 Zum Anderen wäre eine Darstellung ausgehend vom in dieser Arbeit bereits synthetisierten Chlorid 169 auf unterschiedlichen Wegen denkbar.[142-144] Neben der Darstellung der O6-Addukte am 2‘-Desoxyguanosin und den bereits in der Arbeitsgruppe synthetisierten dA-Addukten könnten auch die Synthesen der an den Pyrimidin-Basen gefundenen Addukte von Interesse sein. Hier wurden in Versuchen neben C5-dC-, N4-dC- auch C5-dT-Addukte aromatischer Amine in geringen Mengen nachgewiesen und identifiziert.[145-147] Auch die weitere Darstellung und der gezielte Einbau in Oligonucleotide der Nacetylierten Addukte sollte in zukünftigen Arbeiten eine wichtige Rolle spielen. Dabei könnte mit Paracetamol (4-Hydroxyacetanilin) auch eine in der Medizin wichtige Verbindung verwendet werden und die Darstellung der entsprechenden Addukte wichtige Informationen über die möglichen Nebenwirkungen bei anhaltender Verabreichung geben. 150 Ausblick Außer der Synthese modifizierter Phosphoramidite sollte in Zukunft das Hauptaugenmerk auf den Einbau in Oligonucleotide und die Untersuchungen deren Eigenschaften gelegt werden. Hierbei sollte neben den bereits in dieser Arbeit angewandten Methoden (Tm-Wert, CD, Restriktionsabbau, Polymerase-Experimente) auch die Untersuchung in Repair-Assays möglich gemacht werden, um Aussagen über die Resistenz der unterschiedlichen Modifikationen gegenüber den Reparaturmechanismen der Zelle machen zu können.[148] Die beschriebenen Untersuchungen könnten dabei vergleichend zu einem heterocyclischen DNASchaden, z.B. durch IQ 33, untersucht werden Eine weitere Möglichkeit, Informationen bezüglich des Verhaltens von dG-Addukten in biologischen Systemen zu erhalten, könnte beispielsweise die Einführung von diesen an der Schnittstelle der Topoisomerase 1 (top1) sein (Abb. 124). 5'-AAAAAGACTT-GGAAAAAT TTTT T T T T TCTGAA-CCTTTTTAAAAA-3’ Abb. 124 Topoisomerase 1 Schnittstelle Topoisomerasen sind zusammen mit Helikasen dafür verantwortlich, dass die DNA nach der Verdoppelung wieder funktionsfähig gemacht wird. Wird beispielsweise die Topoisomerase 1 blockiert, so ist eine geordnete Weitergabe genetischer Information für die betroffenen Zellen nicht mehr möglich. Topoisomerase-Hemmer wie z.B. Camptothecin werden in der Krebstherapie verwendet und können DNA-Brüche, und damit verbunden, den programmierten Zelltod (Apoptose) auslösen.[149] Auch die in dieser Arbeit begonnenen Versuche zur Kristallisation und damit zur strukturellen Analyse modifizierter Oligonucleotide sollte in folgenden Arbeiten weitergeführt werden. Als weiteres zukünftiges Projekt wäre eine Anwendung der Synthesen und der durchgeführten Untersuchungen auf RNA-Ebene vorstellbar. Dieses könnte dann im Zusammenhang mit einer möglichen Untersuchung der Einflüsse solcher Modifikationen im Hinblick auf die Translation stehen. 151 Experimentalteil 8. Experimentalteil 8.1 Allgemeines 8.1.1 Lösungsmittel und Reagenzien Acetonitril: C2H3N [41.05]; Sdp.: 81-82 °C; d = 0.78 a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 0.001%; Fluka Nr.0069 b) zur Synthese; Merck Nr. 800015. c) technische Qualität; über Calciumhydrid getrocknet und bei Normaldruck abdestilliert. Dichlormethan: CH2Cl2 [84.93]; Sdp.: 39-40 °C; d = 1.325 a) technische Qualität; über Calciumchlorid getrocknet und bei Normaldruck abdestilliert. b) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 50 ppm; Fluka Nr. 66749 Diethylether: C4H10O [74.12]; Sdp.: 34.5 °C; d = 0.70 a) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normaldruck abdestilliert. 1,2-Dimethoxyethan: C4H10O2 [90.12]; Sdp.: 84-86 °C; d = 0.867 a) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normaldruck abdestilliert. N,N’-Dimethylformamide: C3H7N1O1 [73.09]; Sdp.: 153 °C; d = 0.94 a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 0.001%; Fluka Nr.40248 1,4-Dioxan: C4H8O2 [88.10]; Sdp.: 101.5 °C; d = 1.03 a) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normaldruck abdestilliert. Essigsäureethylester: C4H8O2 [88.11]; Sdp.: 77 °C; d = 0.902 a) technische Qualität; über Calciumchlorid getrocknet und bei Normaldruck abdestilliert. n-Hexan: C6H14 [86.17]; Sdp.: 68.7 °C; d = 0.65 a) technische Qualität; über Normaldruck abdestilliert. Methanol: CH4O [32.04]; Sdp.: 64 °C; d = 0.791 a) technische Qualität; über Normaldruck abdestilliert. b) puriss. Absolut, über Molsieb, Fluka Nr. 65542 152 Experimentalteil Petrolether 50-70: ---; Sdp.: 50-70 °C; --a) technische Qualität; über Normaldruck abdestilliert. Pyridin: C5H5N [79.10]; Sdp.: 115 °C; d = 0.980 a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 50 ppm; Fluka Nr. 82704 b) technische Qualität; über Calciumhydriddispersion getrocknet und bei Normaldruck abdestilliert. Tetrahydrofuran: C4H8O [72.11]; Sdp.: 65-66 °C; d = 0.890 a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 50 ppm; Fluka Nr. 87371 b) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normaldruck abdestilliert. Triethylamin C6H15N [101.19]; Sdp.: 89 °C; d = 0.72 a) technische Qualität; über Natrium getrocknet und bei Normaldruck abdestilliert. racemisches 2,2´-Bis(diphenylphosphino)-1,1´-binaphthyl: C44H32P2 [633.70] luftdicht verpackt unter Argon, STREM Nr. 98327-87-8 I Tris(dibenzylidenaceton)-dipalladium(0): C51H42O3Pd2 [915.70] luftdicht verpackt unter Argon, STREM Nr. 52409-22-0 EcoRI Enzym: aus Escherichia Coli BS5; fermentas ER 0271; 5000 units DTT-Puffer (pH = 7.5) für den EcoRI-Restriktionsabbau Es wurden 190.4 mg Magnesiumchlorid, 1.17 g Natriumchlorid und 1.21 g Tris in ca. 180 mL Reinstwasser gelöst, mit konz. Salzsäure auf einen pH-Wert von 7.5 eingestellt und auf 200 mL aufgefüllt. Anschließend wurden zu 200 mL Puffer noch 15.4 mg DTT hinzugefügt. 153 Experimentalteil Triethylammoniumacetat-Puffer (TEAA-Puffer) pH = 8.0 für die HPLC (EcoRI Abbau) Es wurden 3.00 mL Eisessig und 5.00 mL Triethylamin sowie 50 mL Acetonitril in ca. 900 mL Reinstwasser gelöst und auf einen pH-Wert von 8.0 eingestellt und mit Reinstwasser auf 1000 mL aufgefüllt. Triethylammoniumacetat-Puffer (TEAA-Puffer) pH = 6.9 für die HPLC (Trennung der Oligonucleotide) Es wurden 5.88 mL Eisessig und 10.12 mL Triethylamin in ca. 900 mL Reinstwasser gelöst und auf einen pH-Wert von 6.9 eingestellt und mit Reinstwasser auf 1000 mL aufgefüllt. Natriumcacodylat-Puffer (10 mM; pH = 7.0) Es wurden 214.03 mg Natriumcacodylat in 80 mL Reinstwasser gelöst und auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Danach wurden noch 952.18 mg Magnesiumchlorid hinzugefügt und auf 100 mL aufgefüllt. 8.1.2 Chromatographie und Geräte 8.1.2.1 Dünnschichtchromatographie (DC) Es wurden mit Kieselgel beschichtete Aluminiumfolien mit Fluoreszenzindikator (Merck Nr. 5554; Schichtdicke 0.2 mm) verwendet. Die Platten wurden auf eine Größe von 1-8 x 10 cm zugeschnitten; die Laufstrecke betrug 5-10 cm. Alle Rf-Werte wurden bei Kammersättigung ermittelt. Die Detektion der UV-aktiven Substanzen erfolgte mit einer UV-Lampe bei einer Wellenlänge von 254 nm. 8.1.2.2 Präparative Säulenchromatographie Substanzgemische mit mehr als 4 g Rohausbeute wurden über eine Säule mit leichtem Überdruck aufgereinigt. Als Trennmaterial wurde Kieselgel mit einer Korngröße von 63-200 µm (Baker Nr. 0253) verwendet. 154 Experimentalteil 8.1.2.3 Zirkulare präparative Dünnschichtchromatographie (Chromatotron) Substanzgemische mit weniger als 4 g Rohausbeute wurden über eine Platte mit einer Schichtdicke von 1-4 mm aufgereinigt. Als Trennmaterial wurde Kieselgel Merck Typ 7749 mit Gipszusatz und Fluoreszenzindikator verwendet. 8.1.2.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Die Hochleistungflüssigkeitschromatographie wurde an einer Merck-Hitachi-Anlage durchgeführt. Software: Chromatography Data Station Software HPLC System Manager Version 3.1.1. Interface: Model L-7000 Pumpe: Model L-7100 Automatischer Probenwechsler: Model L-7200 Dioden Array Detektor: Model L-7455 Säule: RP-18 endcapped 5 μm Li Chrosphor 100, EcoCART 125-3 HPLC-Methoden: Methode A: Reinigung (12mere) Acetonitril-Gradient von 0-23% in TEAA-Puffer (pH 6.9) bis 50 Minuten, dann 100% Acetonitril für 5 Minuten und abschließend 100% TEAA-Puffer für 10 Minuten. Methode B: Reinigung (30mere) Acetonitril-Gradient von 0-26% in TEAA-Puffer (pH 6.9) bis 50 Minuten, dann 100% Acetonitril für 5 Minuten und abschließend 100% TEAA-Puffer für 10 Minuten. Methode C: Enzymatischer Abbau durch EcoRI Acetonitril-Gradient von 0-25% in Triethylammoniumacetat-Puffer (pH 8.0) bis 20 Minuten, dann für 5 Minuten 100% Acetonitril und abschließend 100% Triethylammoniumacetat-Puffer für 10 Minuten. 155 Experimentalteil 8.1.2.5 Kernresonanzspektroskopie (NMR) Die NMR-Spektren wurden in der spektroskopischen Abteilung der Universität Hamburg aufgenommen. Es standen folgende Geräte zur Verfügung: 1 H-NMR: Bruker AMX 400 (400 MHz), Bruker DMX 500 (500 MHz), Bruker AV 400 (400MHz) Die Standardisierung erfolgte gegen DMSO-d6 (δ= 2.50 ppm) und C6D6 (δ= 7.26 ppm). Die Aufnahmen erfolgten bei 400 MHz in 5-mm-Röhrchen über einen Messbereich von 0 bis 14 ppm. 13 C-NMR: Bruker AMX 400 (101 MHz), Bruker AV 400 Die Standardisierung erfolgte gegen DMSO-d6 (δ= 39.52 ppm) und C6D6 (δ= 128.0 ppm). Die Aufnahmen erfolgten bei 100.6 MHz in einen Messbereich von 0 bis 220 ppm. 31 P-NMR: Bruker DMX 500 (202 MHz). Die Standardisierung erfolgte gegen einen externen Standard (85% Phosphorsäure). Zur Wiedergabe der Multiplizitäten in den 1H-, 13 C- und 31 P-NMR-Spektren finden folgende Abkürzungen Verwendung: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quadruplett, quin = Quintett, sept = Septett, m = Multiplett. Die Zuordnung der Signale erfolgte durch die Aufnahme zweidimensionaler Spektren (H,H-COSY; HSQC; HMBC; NOESY; TOCSY). 8.1.2.6 Die Massenspektrometrie (MS) FAB-Massenspektren wurden an der Universität Hamburg mit einem doppelfokussierenden Spektrometer VG/70-250 F der Firma VG Analytical gemessen. Als Stoßgas wurde Xenon, als Matrix wurde m-Nitrobenzylalkohol verwendet. Die EI-Massensprektren wurden an der Universität Hamburg mit einem doppelfokussierenden VG Analytical VG/70-250S-Spektrometer aufgenommen. Die ESI-Massenspektren wurden an der Universität Hamburg mit einem ThermoQuest Spektrometer der Marke Finnigan, Modell MAT 95 XL gemessen. 156 Experimentalteil 8.1.2.7 Schmelzpunktbestimmung Die Schmelzpunkte wurden mit einem Schmelzpunkt-Bestimmer apotec der Firma Otto Stein ermittelt. 8.1.2.8 Infrarot-Spektrometer Die IR-Spektren wurden an einem IR-Spektrometer AVATAR 370 FT-IR bei Raumtemperatur in einem Messbereich von 400 - 4000 cm-1 aufgenommen. Die Substanzen wurden als KBr - Presslinge und teils mit Hilfe von NaCl-Platten gemessen. 8.1.2.9 Polarimeter Der Drehwert der chiralen Verbindungen wurde an einem Perkin Elmer Polarimeter 341 mit einer Hg-Lampe (546 nm) bei 20 °C aufgenommen. 8.1.2.10 Zentrifuge Die Entfernung des Palladium-Katalysators erfolgte mit Hilfe einer Biofuge der Firma Heraeus, Modell Pico. 8.1.2.11 UV-Spektrometer Die UV-Spektren wurden an einem UV-Spektralphotometer (CARY 1E) der Firma Varian aufgenommen. 8.1.2.12 Thermomixer Die Abspaltung vom Träger wurde in einem Eppendorf Thermomixer, Modell 5436, bei 45 °C durchgeführt. 8.1.2.13 Speed-Vac-Probenkonzentrator Die Oligonucleotide wurden in einem Speed-Vac-Probenkonzentrator, einer Zentrifuge mit integrierter Membranpumpe, der Firma Eppendorf getrocknet. 8.1.2.14 DNA/RNA-Synthesizer Die modifizierten und unmodifizierten Oligonucleotide wurden in einem DNASynthesizer der Firma Applied Biosystems, Modell 394 DNA/RNA Synthesizer, 157 Experimentalteil synthetisiert. Die Synthesen wurden dabei nach der Phosphoramidit-Methode durchgeführt. 8.1.2.15 circularer Dichroismus Die Messungen des Circular Dichroismus wurden an einem CD Instrument Model 215 der Firma AVIV durchgeführt. 8.2 Synthese von Oligonucleotiden 8.2.1 Synthese Die Synthese der DNA-Oligonucleotide wurde im Maßstab 1.00 μM mit Hilfe der Phosphoramidit-Methode durchgeführt. Für unmodifizierte DNA-Stränge wurde das Standardprotokoll der DNA-Synthese verwendet (s. Anhang). Für die Synthese der modifizierten DNA-Oligonucleotide wurde dieses Protokoll abgewandelt und ein weiterer Kupplungsschritt eingeführt, sowie die Kupplungszeit erhöht (s. Anhang). Phosphoramidite wurde Für als den Einbau der Capping-Reagenz N2-Hydrazinoaryl-modifizierten eine Mischung aus THF/2,6- Lutidin/Trimethylessigsäureanhydrid (8:1:1 v/v) verwendet. 8.2.2 Entschützung und Trägerabspaltung Am Ende der DNA-Synthese wurde von allen Oligonucleotiden die letzte DMTrSchutzgruppe mit dem Synthesemodus „Trityl-off“ entfernt. Die weitere Entschützung und die Abspaltung vom Träger wurden manuell durchgeführt. Für die N2-modifizierten Oligonucleotide wurde zunächst die Abspaltung der CPESchutzgruppe vorgenommen. Dazu wurden die noch festphasengebundenen Oligonucleotide mit 1 mL absolutem Pyridin und 100 μL DBU versetzt und für 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die DBU-Lösung durch Filtration entfernt und die weitere Abspaltung analog zu den C8-modifizierten Oligonucleotiden vorgenommen. Für die Abspaltung von der festen Phase, sowie der Schutzgruppen der Nucleobasen wurden die noch festphasengebundenen Oligonucleotide mit 1 mL konzentriertem Ammoniak und 17.5 μL ß-Mercaptoethanol versetzt und für mindestens 4 Stunden im Thermomixer bei 45 °C geschüttelt. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen, 158 Experimentalteil der Rückstand noch zweimal mit Reinstwasser gewaschen und in einem Speed-VacProbenkonzentrator getrocknet. 8.2.3 Reinigung der Oligonucleotide Das getrocknete Roh-Oligonucleotid wurde in 100 μL Reinstwasser aufgenommen und in zwei Portionen über die Säule an der HPLC gereinigt. Hierbei wurden manuell jeweils 0.5-1.0 mL-Fraktionen in Eppendorf-Caps aufgefangen und anschließend mittels analytischen Läufen die Reinheit der Fraktionen untersucht. Gleiche Fraktionen wurden vereinigt, an einem Speed-Vac-Probenkonzentrator bis zur Trockne eingeengt, und bei Bedarf noch einmal getrennt. 8.3 Analytik der Oligonucleotide 8.3.1 Bestimmung der Optischen Dichte (OD260) Eine OD260-Einheit ist die Menge, die in 1.0 mL Wasser gelöst, im Spektralphotometer (1 cm Küvettendicke) bei 260 nm einen Absorptionswert von 1.0 erzeugt. Um die OD260-Menge zu bestimmen, wurde das gereinigte Oligonucleotid in 200 μL Reinstwasser gelöst und 20 μL davon mit 980 μL Reinstwasser auf 1000 μL Gesamtlösung verdünnt. Diese Lösung wurde in einer Quarzküvette in einem UV/VISSpektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm vermessen. Der Absorptionswert (A260) wurde mit dem Faktor 10 (für zehnfache Verdünnung) multipliziert und ergibt den OD260-Wert. Mittels des Oligo Calculator 3.1 der Firma Northwestern (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html) wurden die Stoffmengen, sowie die Mengen der Oligonucleotide ausgehend vom gemessenen OD260-Wert berechnet. Bei modifizierten Basen wurde dabei der Extinktionskoeffizient der unmodifizierten Base als Näherungswert verwendet. 8.3.2 Präparation der Oligonucleotide für das ESI – MS Verdünnung der Oligonucleotide mit einer Lösung aus 20% Isopropanol in Wasser und 1% Triethylamin, auf eine Konzentration von 5 pmol/ μL. 159 Experimentalteil 8.3.3 Bestimmung der Schmelztemperatur (Tm-Wert) Die Tm-Werte wurden im 1 μM-Maßstab (1 nmol je Strang gelöst in 1 mL Puffer), in einem 10 mM Phosphat-Puffer mit 140 nM NaCl und 1 mM EDTA, pH 6.8 vermessen. Die Messungen wurden in einem Temperaturbereich von 5 °C bis 80 °C durchgeführt. Die Probe wurde jeweils dreimal von 5 °C auf 80 °C erhitzt und dreimal von 80 °C auf 5 °C abgekühlt. Die Heiz- bzw. Kühlrate betrug hierbei 0.5 °C/min., wobei alle 0.5 °C ein Datenpunkt aufgenommen wurde. Die Absorption der Probelösung wurde bei einer Wellenlänge von 260 nm verfolgt. Von der resultierenden sigmoiden Kurve wurde das Maximum der 1. Ableitung zur Bestimmung des Schmelzpunktes berechnet und die einzelnen Werte gemittelt. 8.3.4 Messung des circularen Dichroismus Für die Messung des Circular Dichroismus wurden die verwendeten Lösungen der Schmelzpunktbestimmung auf 3 mL mittels des Phosphatpuffers (pH=6.8) verdünnt und die molare Elliptizität von 350-200 nm gemessen. 8.3.5 Enzymatischer Abbau der Oligonucleotide mittels des EcoRI Restriktionsenzym Es wurden jeweils so viele μL wässrige Oligonucleotid-Lösung eingesetzt, dass mit einem OD von 0.4 gearbeitet werden konnte. Nach der Aufkonzentration wurde das Oligonucleotid in 100 μL DTT-Puffer aufgenommen, für ca. 2 Minuten auf 70 °C erhitzt und durch Eiskühlung wieder abgekühlt. Es folgte die Inkubation mit 27 μL EcoRI (270 Units) bei ca. 20 °C im Thermomixer. Je Probe wurden 20 μL Reaktionslösung und 40 μL Reinstwasser verwendet und sofort an der HPLC vermessen. Für die Bestimmung der Halbwertszeit wurden die Integrale des Oligonucleotids und der beiden Restriktionsprodukte bestimmt und die Menge des geschnittenen Oligonucleotides zu den jeweiligen Zeitpunkten mittels der folgenden Formel bestimmt:[131] μM geschnittenes Oligonucleotid = [Integral d(GTAG)][ε260[GTAGAATTCTAC]][μM d(GTAGAATTCTAC)orig.] [(Summe aller Integrale) * [ε260[d(GTAG)]]] 160 Experimentalteil Nach Auftragung des natürlichen Logarithmus der berechneten Menge gegen die Zeit konnte, unter der Annahme einer Reaktion 1. Ordnung, die Halbwertszeit nach folgender Formel berechnet werden: τ ½ = ln 2 / k (k: ergibt sich aus der Gleichung des Graphen) 8.4 Allgemeine Arbeitsvorschriften Darstellung der C8-Arylamin-Addukte mittels der Buchwald-Hartwig-Reaktion (AAV 1) In einem ausgeheizten Kolben wurden, unter Stickstoffatmosphäre, das Bromid, 1.5 Äquivalente der Base (K3PO4), 10 mol% Tris(dibenzylidenaceton)-dipalladium(0) (Pd2(dba)3), 30 (rac-BINAP) und mol% 2 racemisches Äquivalente Amin 2,2’-Bis(diphenylphosphino)-1,1’-binaphthyl eingewogen und in absolutem 1,2- Dimethoxyethan (1,2-DME) (15 mL pro mmol des Bromid) gelöst. Anschließend wurde die Reaktionsmischung bei 80 °C solange gerührt bis dünnschichtchromatographisch kein Edukt mehr detektiert werden konnte. Nach Abkühlen der Reaktion auf Raumtemperatur wurden 5 mL gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung zugegeben und die Mischung kurz gerührt. Nach Zugabe von 10 mL gesättigter Natriumchloridlösung wurden die Phasen getrennt. Die wässrige Phase wurde dreimal mit je 30 mL Essigsäureethylester extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen anschließend zweimal mit je 10 mL gesättigter Natriumchloridlösung und einmal mit einer Mischung aus 10 mL gesättigter Natriumchloridlösung und 2 mL Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Durch säulenchromatographische Reinigung mit Essigsäureethylester in Petrolether (10-33%) konnten die Arylamin-Addukte erhalten werden. Debenzylierung der 8-N-Arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosinDerivate (AAV 2) 161 Experimentalteil In einem ausgeheizten Kolben wurden, unter Stickstoffatmosphäre, das 8-NArylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-Derivat in absolutem Methanol (20 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit einer Spatelspitze Pd/C versetzt. Nach kurzem Halten ins Ultraschall-Bad wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre für 1-48 h gerührt und anschließend durch mehrmalige Zentrifugation vom Katalysator befreit. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck lieferte das saubere Produkt. Desilylierung der 8-N-Arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin- Derivate (AAV 3) In einem ausgeheizten Kolben wurde, unter Stickstoffatmosphäre, das 8-N-Arylamino3’,5’-bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-Derivat in absolutem Tetrahydrofuran (THF) und absolutem Dichlormethan (DCM) im Verhältnis 1:1 v/v (20 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 10 Äquivalenten Triethylamin und 12.5 Äquivalenten Triethylamintrihydrofluorid versetzt und bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ende der Reaktion wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (10-40%). Formamidin-Schützung der 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 4) In einem ausgeheizten Kolben wurden unter Stickstoffatmosphäre 1 Äquivalent des 2’Desoxyguanosin-Derivats in absolutem Pyridin (25 mL je mmol Edukt) gelöst und mit 2 Äquivalenten N,N-Dimethylformamiddiethylacetal versetzt und bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ende der Reaktion wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (5-25%). 162 Experimentalteil Dimethoxytritylierung der 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 5) Das 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosine-Derivat wurde zweimal mit Pyridin coevaporiert, in absolutem Pyridin (25 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 2 Äquivalenten Dimethoxytritylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre versetzt und bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan wurden die Phasen getrennt, und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient und 0.1% Triethylamin. Phosphitylierung der 8-N-Arylamino-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 6) Das 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosin-Derivat wurde zweimal mit absolutem Acetonitril coevaporiert, unter einer Stickstoffatmosphäre in absolutem Dichlormethan: absolutem Acetonitril (1:1 v/v) (30 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit 1 Äquivalent einer 0.25 M DCI-Aktivator-Lösung in THF versetzt. Unter Rühren wurden dann 1.5 Äquivalente Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 zugetropft und die Reaktionsmischung bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von gesättigter NatriumhydrogencarbonatLösung wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Aluminiumoxid (neutral, Aktivitätsstufe III) gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit 0-2% Methanol. Eine anschließende Gefriertrocknung mit Benzol lieferte das gewünschte Produkt als Feststoff. 163 Experimentalteil Darstellung der N2-Arylamin-Addukte mittels der Buchwald-Hartwig-Reaktion (AAV 7) In einer Stickstoffatmosphäre wurden 1 Äquivalent O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-3’,5’bis(TBDMS)-2-brom-2’-dG mit 30mol% rac-BINAP, 10mol% Pd2(dba)3, 2 Äquivalenten Kaliumphosphat, 0.2 Äquivalenten Triethylammoniumchlorid und 2 Äquivalenten des Arylhydrazin versetzt. Die Reaktanden wurden in abs. 1,2-DME (20 mL pro mmol Edukt) gelöst und 24 h bei 80 °C gerührt. Nach Abkühlen der Reaktionslösung wurden 1 mL gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung und anschließend 10 mL ges. Natriumchloridlösung dazugeben. Nach Trennung der Phasen wurde die wässrige dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung und anschließend mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel entfernt. Die Reinigung erfolgte säulenchromatographisch (PE/EE: 10% -35 %). Desilylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-arylamino-3’,5’-bis(tert- butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 8) In einem ausgeheizten Kolben wurde, unter Stickstoffatmosphäre, das O6-2-(pCyanophenyl)-ethyl-N2-arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosinDerivat in absolutem Tetrahydrofuran (THF) und absolutem Dichlormethan (DCM) im Verhältnis 1:1 v/v (20 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 10 Äquivalenten Triethylamin und 12.5 Äquivalenten Triethylamintrihydrofluorid versetzt und bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ende der Reaktion wurde Natriumhydrogencarbonat-Lösung hinzugegeben und die wässrige Phase dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Nach anschließendem Trocknen über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (10-40%). Die Trennung der Azo- und Hydrazinoform erfolgte mittels RP-18-Chromatographie. Als Eluent diente dabei Wasser:Acetonitril (10-40%). 164 Experimentalteil Dimethoxytritylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-2’-desoxyguanosinDerivate (AAV 9) Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-2’-desoxyguanosin-Derivat wurde zweimal mit Pyridin coevaporiert, in absolutem Pyridin (25 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 2 Äquivalenten Dimethoxytritylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre versetzt und bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan wurden die Phasen getrennt, und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0-20%). Dimethoxytritylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-2’- desoxyguanosin-Derivate (AAV 10) Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-2’-desoxyguanosin-Derivat wurde zweimal mit Pyridin coevaporiert, in absolutem Pyridin (25 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 2 Äquivalenten Dimethoxytritylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre versetzt und bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan wurden die Phasen getrennt, und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Aluminiumoxid (Neutral; Aktivitätsstufe III) gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan. 165 Experimentalteil Phosphitylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-O-5’-dimethoxytrityl-2’desoxyguanosin-Derivate (AAV 11) Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin- Derivat wurde zweimal mit absolutem Acetonitril coevaporiert, unter einer Stickstoffatmosphäre in absolutem Dichlormethan: absolutem Acetonitril (1:1 v/v) (30 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit 1 Äquivalent einer 0.25 M DCI-AktivatorLösung in THF versetzt. Unter Rühren wurden dann 1.5 Äquivalente Bis-N,N’Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 zugetropft und die Reaktionsmischung bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit 0-2% Methanol. Eine anschließende Gefriertrocknung mit Benzol lieferte das gewünschte Produkt als Feststoff. Phosphitylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-O-5’- dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 12) Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxy- guanosin-Derivat wurde zweimal mit absolutem Acetonitril coevaporiert, unter einer Stickstoffatmosphäre in absolutem Dichlormethan: absolutem Acetonitril (1:1 v/v) (30 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit 1 Äquivalent einer 0.25 M DCI-AktivatorLösung in THF versetzt. Unter Rühren wurden dann 1.5 Äquivalente Bis-N,N’Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 zugetropft und die Reaktionsmischung bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde 166 Experimentalteil säulenchromatographisch über Aluminiumoxid (Neutral; Aktivitätsstufe 3) gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan:Ethylacetat 1:2. Eine anschließende Gefriertrocknung mit Benzol lieferte das gewünschte Produkt als Feststoff. 8.5 Synthesen Synthese von 8-Brom-2’-desoxyguanosin (Br-dG) 64 571 mg (2.00 mmol) feingepulvertes 2’-Desoxyguanosin 52 wurden in 20 mL dest. Wasser suspendiert, mit 534 mg (3.00 mmol) N-Bromsuccinimid versetzt, kurz im Ultraschallbad suspendiert und für genau 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließendes Filtrieren vom Lösungsmittel mit Unterdruck liefert das 8-Brom-2’-desoxyguanosin 64. Produkt O 7 Br HO N 5 8 O 4' 3' OH NH 2 9N 5' 61 4 N 3 NH2 1' 2' 64 Ausbeute: 545 mg (1.58 mmol, 79%) eines orangenen Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.03. - Smp.: Zersetzung bei 217 °C. - [α]20546: - 15.4 ° (c = 0.5, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.83 (s, 1H, NH), 6.50 (s, 2H, NH2), 6.14 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 4.39 (ddd, 3JHH = 3.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 2.7 Hz, 1H, H3’), 3.79 (ddd, 3JHH = 5.3 Hz, 3 JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H4’), 3.61 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 5.3 Hz, 1H, H5a’), 3.48 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.13 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3 JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.10 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 2.7 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 166.8 (C6), 163.3 (C2), 145.7 (C8), 139.5 (C4), 135.4 (C5), 88.1 (C4’), 81.8 (C1’), 65.3 (C3’), 63.2 (C5’), 36.8 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3168, 1650, 1460, 1290, 1064, 789, 626. - MS (FAB, m/z): ber.: 345.00, gef.: 346.01 (M+H+). 167 Experimentalteil Synthese von 8-Brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 65 Unter Stickstoffatmosphäre wurden 8.00 g (23.1 mmol) 8-Brom-2’-desoxyguanosin 64, 14.9 g (99.2 mmol) tert-Butyldimethylsilylchlorid und 10.4 g (152 mmol) Imidazol in 60 mL absolutem Pyridin Br TBDMSO 5' 3' gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dabei klar. Rühren, N 9N 4 2' 61 NH 2 N 3 NH2 1' OTBDMS 65 Nach langsamer Zugabe von 4 mL Methanol und fünfminütigem 8 5 O 4' suspendiert und für eine Stunde bei Raumtemperatur anschließendem O 7 wurde das Lösungsmittel im Ölpumpenvakuum in eine Kühlfalle abkondensiert. Der Rückstand wurde zweimal mit je 40 mL Toluol coevaporiert und säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit 5% Methanol. Ausbeute: 9.77 g (17.0 mmol, 74%) eines gelben Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Dichlor- methan/Methanol 9:1 v/v): 0.21. - Smp.: 66 °C. - [α]20546: + 29.5 ° (c = 0.8, CHCl3). 1 H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.81 (s, 1H, NH), 6.41 (s, 2H, NH2), 6.14 (dd, 3 JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 4.58 (ddd, 3JHH = 3.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’), 3.74 (ddd, 3JHH = 7.6 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H4’), 3.63 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H5a’), 3.42 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.16 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.14 (ddd,2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C3’), 0.82 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C5’), 0.10 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), - 0.01 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), - 0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.6 (C6), 153.5 (C2), 152.3 (C8), 120.8 (C4), 117.6 (C5), 87.3 (C4’), 84.9 (C3’), 83.0 (C1’), 72.6 (C5’), 36.2 (C2’), 25.9 (SiC(CH3)3), 25.8 (SiC(CH3)3), 18.1 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.2 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 2928, 1693, 1471, 1082, 836, 777. - MS (FAB, m/z): ber.: 573.18, gef.: 574.18 (M+H+). 168 Experimentalteil Synthese von O6-Benzyl-8-brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63 Ein Kolben mit 5.50 g (9.57 mmol) 8-Br-3’,5’TBDMS-dG 65 Triphenylphosphin und 5.02 (PPh3) g wurde (19.1 10 γ mmol) min. α im Ölpumpenvakuum evakuiert. Dann wurden, unter Stickstoffatmosphäre, 50 mL absolutes 1,4-Dioxan und 2 ml Benzylalkohol über eine Br TBDMSO Spritze (DIAD) zugetropft. N 5 O 3' Reaktionsmischung auf 0 °C abgekühlt und 3.7 mL 8 2' ε 61 N 2 9N 5' 4' zugegeben. Nach zehnminütigem Rühren wurde die Diisopropylazodicarboxylat O 7 δ β 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 63 Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmt und eine Stunde gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand am Chromatotron gereinigt. Als Eluent diente Petrolether mit 10% Essigsäureethylester. Ausbeute: 4.36 g (5.45 mmol, 57%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan): 0.22. - [α]20546: + 12.2 ° (c = 2.80, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 7.49-7.46 (m, 2H, Hγ), 7.41-7.36 (m, 2H, Hδ), 7.30-7.28 (m, 1H, Hε), 6.46 (s, 2H, NH2), 6.18 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H1’), 5.47 (d, 2JHH = 7.2 Hz, 2H, Hα), 4.66 (ddd, 3JHH = 3.0 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’), 3.77 (ddd, 3JHH = 7.6 Hz, 3 JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H4’), 3.63 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H5a’), 3.42 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.21 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3 JHH = 6.9 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, H2a’), 2.18 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C3’), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C5’), 0.12 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.06 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.4 (C6), 159.2 (C2), 154.8 (C8), 136.5 (Cβ), 128.6 (Cγ + Cδ), 128.3 (Cε), 125.9 (C4), 114.6 (C5), 87.4 (C4’), 85.2 (C3’), 82.8 (C1’), 72.4 (Cα), 67.1 (C5’), 35.9 (C2’), 26.5 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.1 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 2954, 2929, 1614, 1585, 1251, 1077, 836, 777. - MS (FAB, m/z): ber.: 665.78, gef.: 666.80 (M+H+). 169 Experimentalteil Synthese von O6-Benzyl-8-N-(phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethyl-silyl)-2’- desoxyguanosin 66 Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt. γ 6 Es wurden 3.00 g (4.51 mmol) O -Benzyl-8-brom- α C B D 3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin A HN 63 eingesetzt. Reaktionszeit: 70 h. - Ausbeute: 1.97 g (2.90 mmol, 64%) eines gelben Feststoffs. - DC: Rf-Wert N 5 8 O 3' 2' ε 61 N 2 9N TBDMSO 5' 4' O 7 δ β 4 N 3 NH2 1' OTBDMS (Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v): 0.48. Smp.: 161.1 °C. - [α]20546: +13.8 (c= 1.64, CHCl3). 1 66 H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.69 (s, 1H, H10), 7.59 (dd, 3JHH= 7.6 Hz, 2H, Hg), 7.49 (dd, 3JHH= 6.7 Hz, 2H, Hd), 7.47 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 2H, Hγ), 7.40-7.38 (m, 4H, He, Hδ + Hε), 7.37-7.33 (m, 2H, Hc), 7.26 (ddd, 3JHH= 7.5 Hz, 3JHH= 7.5 Hz, 2H, Hh), 6.91 (ddd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, Hi), 6.31 (dd, 3JHH= 6.9 Hz, 3JHH= 6.9 Hz, 1H, H1´), 6.05 (s, 2H, H11), 5.48 (s, 2H, Hα), 4.64 (ddd, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 3.1 Hz, 3 JHH= 6.2 Hz, 1H, H3´), 3.88-3.80 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.68 (dd, 3JHH= 4.4 Hz, 2JHH= 10.0 Hz, 1H, H5´b), 3.47-3.40 (m, 1H, H2´a), 2.15-2.10 (m, 1H, H2´b), 0.90 (s, 9H, SiC(CH3)3 an H3´), 0.81 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.12 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.02, -0.03 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.6 (C2), 157.4 (C6), 147.2 (C8), 137.3 (C(A)), 133.9 (Cβ), 128.6 (Cγ + C(C)), 128.5 (Cδ), 128.1 (Cε + C(B)), 127.1 (C(D)), 86.6 (C4´), 82.4 (C3´), 72.1 (C1´), 65.8 (Cα), 62.4 (C5´), 35.8 (C2´), 25.2 (Si(CH3)2), 17.4 (SiC(CH3)3), 17.2 (SiC(CH3)3), -5.2 (SiC(CH3)3), -5.4 (Si(CH3)3), -6.0 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3227, 3034, 1180, 1005, 917, 895, 725, 669, 560, 505. - MS (FAB, m/z): ber.: 678.3745, gef.: 677.3616 [M-H]+ 170 Experimentalteil Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-methoxyphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethyl- silyl)-2’-desoxyguanosin 67 Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt. 6 Es wurden 3.02 g (4.54 mmol) O -Benzyl-8-brom- γ O α C B D 3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin Reaktionszeit: 70 h. - Ausbeute: 2.00 g (2.81 mmol, 62%) eines A HN 63 eingesetzt. gelben Feststoff. -DC: Rf-Wert TBDMSO N 5 8 O 3' 2' ε 61 N 2 9N 5' 4' O 7 δ β 4 N 3 NH2 1' OTBDMS (Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v): 0.38. Smp.: 117-121 °C. - [α]20546: + 15 ° (c = 0.1, CHCl3). 67 - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.47 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.51 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 7.47 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 2H, Hγ), 7.38 (dd, 3JHH = 7.2 Hz, 3H, Hδ + Hε), 6.88 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.29 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1’), 5.97 (s, 2H, NH2), 5.46 (s, 2H, Hα), 4.63 (ddd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’), 3.84-3.81 (m, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 9.6 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.70 (s, 3H, OMe), 3.68 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.43 (ddd, 2JHH = 13.3 Hz, 3 JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.10 (ddd, 2JHH = 13.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, 1H, H2b’), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.81 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.12 (s, 6H, Si(CH3)2 an C3’), -0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13 C- NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.6 (C2), 157.4 (C6), 147.2 (C8), 139.1 (C(D)), 137.3 (C(A)), 133.9 (Cβ), 128.6 (Cγ + C(C)), 128.5 (Cδ), 128.1 (Cε + C(B)), 120.0 (C4), 114.0 (C5), 87.3 (C1’), 83.0 (C4’), 72.9 (C3’), 66.6 (Cα), 63.2 (C5’), 55.3 (O-CH3), 36.6 (C2’), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.0 (SiC(CH3)3), -5.2 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3332, 2952, 2929, 1633, 1605, 1565, 1414, 1256, 835. - MS (FAB, m/z): ber.: 706.3718, gef.: 707.3622 (M+H+). 171 Experimentalteil Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-methylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)2’-desoxyguanosin 68 Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt. γ 6 Es wurden 2.50 g (3.76 mmol) O -Benzyl-8-brom3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin C B D HN 70 h. - Ausbeute: 1.96 g TBDMSO (2.83 mmol, 75%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf- N 5 8 O 3' 2' δ β ε 61 N 2 9N 5' 4' O 7 A 63 eingesetzt. Reaktionszeit: α 4 N 3 NH2 1' Wert (Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v): OTBDMS 0.4. - Smp.: 86 °C. - [α]20546: + 16.9 ° (c = 0.9, 68 CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.56 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 7.477.49 (m, 2H, Hδ), 7.30-7.40 (m, 3H, H(B) + Hε), 7.07 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, Hγ), 6.80 (d, 3JHH = 8.0 Hz, 2H, H(C)), 6.30 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1’), 6.01 (s, 2H, NH2), 5.47 (s, 2H, Hα), 4.62 (ddd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H3’), 3.82-3.79 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.68 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 4.5 Hz, 1H, H5b’), 3.42-3.38 (m, 1H, H2a’), 2.22 (s, 3H, CH3), 2.11 (m, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.11 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.6 (C2), 157.4 (C6), 146.4 (C8), 138.1 (C(D)), 137.0 (C(A)), 129.9 (Cβ), 129.2 (Cγ), 128.4 (Cδ), 128.3 (C(B)), 127.9 (Cε), 123.9 (C4), 117.4 (C(C)), 111.0 (C5), 87.1 (C1’), 83.0 (C4’), 72.7 (C3’), 66.4 (Cα), 63.0 (C5’), 36.5 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 20.3 (CH3Toluidin), 18.0 (SiC(CH3)3), -4.6, -5.2 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3465, 3348, 2953, 1600, 1409, 1257, 1105, 1060, 835, 698. - MS (FAB, m/z): ber.: 690.3745, gef.: 691.3809 (M+H+). 172 Experimentalteil Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’desoxyguanosin 69 Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt. γ 6 Es wurden 2.50 g (3.76 mmol) O -Benzyl-8-brom3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin NC C B D HN Reaktionszeit: 84 h. - Ausbeute: 1.27 g (1.81 TBDMSO mmol, 55%) eines gelben Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Petrolether/Essigsäureethylester 4:1 v/v): 0.36. Smp.: 70 °C. - [α]20546: - 1 H-NMR: + 19 ° (c = 0.28, δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): N 5 8 O 3' 2' δ β ε 61 N 2 9N 5' 4' O 7 A 63 eingesetzt. CHCl3). α 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 69 9.39 (s, 1H, NH-p- Cyanophenylamin), 7.71-7.67 (m, 4H, H(C) + Hγ), 7.50-7.48 (m, 2H, H(B)), 7.28-7.41 (m, 3H, Hδ + Hε), 6.30 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1´), 6.12 (s, 2 H, NH2), 5.50 (s, 2 H, Hα), 4.64-4.60 (m, 1H, H3´), 3.81-3.78 (m, 2H, H4´+ H5a´), 3.65 (dd, 3JHH = 8.2 Hz, 1H, H5b´), 3.52 (dd, 2JHH = 13.2 Hz , 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a´), 2.13 (ddd, 2JHH = 13.2 Hz , 3JHH = 6.7 Hz , 3JHH = 3.2, 1H, H2b´), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3´), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5´), 0.12 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3´), -0.34 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5´), 0.43 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5´). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.0 (C2), 156.6 (C6), 144.6 (C8), 139.9 (C(D)), 136.8 (C(A)), 133.1 (Cβ), 128.4 (C(C) + Cγ), 128.3 (Cδ), 127.9 (C(B) + Cε), 124.3 (C4), 117.2 (C5), 111.1 (CN), 87.3 (C4´), 83.0 (C1´), 72.6 (Cα), 66.4 (C3´), 62.9 (C5´), 36.1 (C2´), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.9, -5.6 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3215, 2953, 2929, 1622, 1595, 1540, 1304, 1176, 950, 697. - MS (FAB, m/z): ber.: 701.3541, gef.: 702.3641 (M+H+). 173 Experimentalteil Synthese von O6-Benzyl-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert- butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 70 Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt. χ 6 Es wurden 2.50 g (3.47 mmol) O -Benzyl-8-brom3´,5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 63 eingesetzt. D C A B N H 5' 8 N 5 9N 4 O 4' 3' - DC: Rf-Wert (Petrolether/Essigsäureethylester 2' δ ε O 7 B C Reaktionszeit: 72 h. - Ausbeute: 1.74 g (2.29 TBDMSO mmol, 66%) eines orangen schmierigen Feststoff. α β 61 N 2 N 3 NH2 1' OTBDMS 70 2:1 v/v): 0.58. – Smp.: 135 °C. - [α]20546: + 15 ° (c = 1.64, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.38 (s, 1H, NH-3,5-Dimethylanilin), 7.46 (d, 3JHH= 7.2 Hz, 2H, H(B)), 7.36 (t, 3JHH= 7.5 Hz, 2H, Hδ), 7.32-7.29 (dd, 3JHH= 7.2 Hz, 3JHH= 8.2 Hz, 2H, Hγ), 7.25 (d, 3JHH= 7.1 Hz, 1H, Hε), 6.55 (s, 1H, H(D)), 6.26 (t, 3JHH= 6.9 Hz, 1H, H1’), 6.02 (s, 2H, NH2), 5.49 (s, 2H, Hα), 4.59 (s, 1H, H3´), 3.85-3.79 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.67 (dd, 3JHH= 4.6 Hz, 3JHH= 5.8 Hz, 1H, H5´b ), 2.20 (s, 6H, Me-aromat.), 2.08 (s, 2H, H2´), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C3´), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C5´)), 0.10 (d, 3JHH= 2.1 Hz, 6H, Si(CH3)2), 0.00 (d, 3JHH= 3.3 Hz, 6H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.8 (Cβ), 154.9 (C6), 154.1 (C2), 149.3 (C8), 141.0 (C4), 137.7 (C5), 128.7 (C(D)), 128.5 (C(B)), 128.4 (Cε), 128.3 (Cδ), 128.0 (Cγ), 120.8 (C(C)), 117.9 (C(A)), 87.2 (C4´), 84.0 (C3´), 72.8 (C1´), 66.6 (Cα), 63.2 (C5´), 36.7 (C2´), 25.9 (Si(CH3)2), 21.4 (Me-aromat.), 17.4 (SiC(CH3)3), 16.7 (SiC(CH3)3), -5.2 (SiC(CH3)3), 5.4 (Si(CH3)3), -6.0 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3377, 3333, 2950, 2857, 1616, 1565, 1464, 1413, 1253, 1108, 833, 783. - MS (FAB, m/z): ber.: 704.902, gef.: 705.3993 (M+H+). 174 Experimentalteil Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’- desoxyguanosin 71 Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt. 6 Es wurden 1.40 g (1.56 mmol) O -Benzyl-8-brom3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin H γ G F E D α C B A 63 eingesetzt. HN Reaktionszeit: 55 h. - Ausbeute: 1.03 g (1.37 mmol, 65%) eines gelben Feststoff. -DC: Rf-Wert N 5 8 O 3' 2' ε 61 N 2 9N TBDMSO 5' 4' O 7 δ β 4 N 3 NH2 1' (Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v): 0.42. - OTBDMS Smp.: 146 °C. - [α]20546: + 16.3° (c = 0.32, CHCl3). 71 - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.05 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 7.52-7.20 (m, 14H, Hγ + Hδ + Hε + H(B) + H(C) + H(F) + H(G) + H(H)), 6.50 (s, 2H, NH2), 6.20 (dd, 3JHH = 6.8 Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H1’), 5.48 (s, 2H, Hα), 4.51 (ddd, 3JHH = 6.7 Hz, 3 JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 1H, H3’), 3.81 (dd, 2JHH = 10.6 Hz, 3JHH = 5.0 Hz, 1H, H5a’), 3.73 (ddd, 3JHH = 5.0 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H4’), 3.69 (dd, 2JHH = 10.6 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.63 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H2a’), 2.26 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.85 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.10 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.09 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.04 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.05 (s, 3H, Si(CH3)2 an C5’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.2 (C2), 159.9 (C6), 154.3 (C(A)), 148.5 (C8), 140.9 (C(D)), 137.8 (C(E)), 136.8 (Cβ), 128.9 (Cγ), 128.6 (Cδ), 128.4 (C(B)), 128.2 (Cε), 127.5 (C4), 127.4 (C(C)), 127.2 (C5), 125.8 (C(F)), 125.5 (C(G)), 114.4 (C(H)), 82.5 (C1’), 72.4 (C4’), 72.3 (C3’), 67.0 (Cα), 62.9 (C5’), 37.2 (C2’), 26.0 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.1 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.2 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 2940, 2908, 2877, 1607, 1559, 1423, 1159, 1005, 938, 785. - MS (FAB, m/z): ber.: 752.3902, gef.: 753.3992 (M+H+). 175 Experimentalteil Synthese O6-Benzyl-8-N-(2-aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’- von desoxyguanosin 72 Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt. 6 Es wurden 1.95 g (2.91 mmol) O -Benzyl-8brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’- mmol, 91%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf2:1 v/v): 0.44. - Smp.: 85 °C. - [α]20546: - 5.2 ° (c = 0.5, CHCl3). - 1 α C M B D A TBDMSO N 5 8 O 3' 2' δ β ε 61 N 2 9N 5' 4' O 7 HN F Reaktionszeit: 78 h. - Ausbeute: 2.05 g (2.68 (Petrolether/Essigsäureethylester L γ G H K E desoxyguanosin 63 eingesetzt. Wert I J 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 72 H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.77 (s, 1H, NH-2- Aminofluoren), 7.88 (m, 1H, H(E)), 7.76 (dt, 3JHH = 7.8 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H(B)), 7.59 (dd, 3 JHH = 8.3 Hz, 4JHH = 1.9 Hz, 1H, H(L)), 7.46-7.52 (m, 3H, H(F) + Hγ), 7.20- 7.42 (m, 5H, H(J) + H(I) + Hδ + Hε), 7.07-7.00 (m, 1H, H(K)), 6.34 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1’), 6.07 (s, 2H, NH2), 5.50 (s, 2H, Hα), 4.63 (ddd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’), 3.92 (s, 2H, CH2-AF), 3.86-3.81 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.69-3.65 (m, 1H, H5b’), 3.43 (ddd, 2JHH = 10.1 Hz, 3JHH = 6.5 Hz, 1H, H2a’), 2.13 (ddd, 2JHH = 10.1 Hz, 3JHH = 7.2 Hz, 3JHH = 3.5 Hz, 1H, H2b’), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.81 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.12 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.00 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.01 (s, 3H, Si(CH3)2 an C5’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.8 (C(A)), 157.6 (C2), 153.9 (C6), 146.1 (C8), 143.8 (C(D)), 142.5 (C(M)), 141.3 (C(H)), 140.1 (C(C)), 137.0 (C(A)), 134.5 (Cβ), 128.4 (Cγ), 128.4 (Cδ), 127.9 (Cε), 126.7 (C(F)), 124.9 (C(B)), 124.3 (C4), 120.1 (C(K)), 119.0 (C(I) + C(J)), 116.8 (C(L)), 114.4 (C(E)), 111.3 (C5), 87.2 (C4’), 83.0 (C1’), 72.7 (Cα), 66.5 (C3’), 63.0 (C5’), 57.9 (C(G)), 36.5 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.7, -5.4 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3495, 3357, 2952, 2927, 1597, 1560, 1456, 1416, 1254, 835, 778. - MS (FAB, m/z): ber.: 764.3902, gef.: 765.3974 (M+H+). 176 Experimentalteil Synthese von 8-N-(Phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 73 Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt. D C B Es wurden 1.90 g (2.80 mmol) O6-Benzyl-8-N- A HN (phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’desoxyguanosin 66 eingesetzt. Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 1.48 g (2.52 mmol, 90%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.9. - Smp.: TBDMSO 8 N 5 O 3' 2' 61 NH 2 9N 5' 4' O 7 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 73 155°C. - [α]20546: - 10.8 ° (c = 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.52 (s, 1H, NH), 8.35 (s, 1H, NH-Anilin), 7.45 (dd, 3JHH= 7.6 Hz, 2H, H(B)), 7.23 (dd, 3 JHH= 8.5 Hz, 2H, H(C)), 6.87 (dd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, H(D)), 6.22 (dd, 3 JHH= 7.1 Hz, 1H, H1´), 6.19 (s, 2H, NH2), 4.53 (ddd, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 6.2 Hz, 1H, H3´), 3.84-3.78 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.71 (ddd, 3JHH= 8.2 Hz, 3JHH= 8.2 Hz, 3 JHH= 8.1 Hz, 1H, H5´b), 3.23-3.16 (m, 1H, H2´a), 2.18-2.14 (m, 1H, H2´b), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.10 (s, 6H, (Si(CH3)2)2), 0.00 (s, 6H, (Si(CH3)2)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.3 (C6), 152.0 (C2), 149.5 (C8), 143.2 (C4), 141.3 (C5), 128.2 (C(D)), 120.0 (C(C)), 116.5 (C(B)), 113.0 (C(A)), 86.8 (C4´), 82.5 (C3´), 72.3 (C1´), 62.7 (C5´), 36.5 (C2´), 25.4 (Si(CH3)2), 25.3 (Si(CH3)2), 17.7 (SiC(CH3)3), 17.4 (SiC(CH3)3), -5.1 (SiC(CH3)3), -5.3 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3353, 1179, 1006, 953, 692, 667, 576, 501. - MS (FAB, m/z): ber.: 586.8736, gef.: 587.8705 (M+H+). 177 Experimentalteil Synthese von 8-N-(4-Methoxyphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’- desoxyguanosin 74 Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt. O Es wurden 1.92 g (2.69 mmol) O6-Benzyl-8-N-(4- D C B A methoxyphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)2’-desoxyguanosin 67 eingesetzt. HN 8 TBDMSO 5' Reaktionszeit: 4 h. - Ausbeute: 1.58 g (2.55 mmol, 96%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert 3' (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.36. - Smp.: N 5 9N 4 O 4' O 7 2' 61 NH 2 N 3 NH2 1' OTBDMS 74 112°C. - [α]20546: - 9.9 ° (c = 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.53 (s, 1H, NH), 8.14 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.42 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 6.84 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.20 (dd, 3JHH = 7.1 Hz, 1H, H1’), 6.15 (s, 2H, NH2), 4.52 (ddd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’), 3.83-3.79 (m, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 9.6 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.70 (s, 3H, OMe), 3.68 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.20 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’), 2.10 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, 1H, H2b’), 0.88 (s, 9H, SiC(CH)3 an C3’), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.10 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.00 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.8 (C2), 153.9 (C6), 152.2 (C8), 150.0 (C(D)), 144.7 (C(A)), 134.8 (C(C)), 128.4 (C(B)), 119.3 (C4), 114.0 (C5), 87.3 (C1’), 83.0 (C4’), 72.9 (C3’), 63.3 (C5’), 55.3 (O-CH3), 37.0 (C2’), 26.0 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.0 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.6 (Si(CH3)2), - 5.2 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 2929, 2856, 1698, 1613, 1513, 1248, 1108, 834, 777. - MS (FAB, m/z): ber.: 616.3222, gef.: 617.3312 (M+H+). 178 Experimentalteil Synthese von 8-N-(4-Methylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’- desoxyguanosin 75 C Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt. B D A Es wurden 1.90 g (2.74 mmol) O6-Benzyl-8-N-(4methylphenylamino)- 3’,5’- bis(tert-butyldimethylsilyl)2’-desoxyguanosin 68 eingesetzt. HN TBDMSO Reaktionszeit: 4 h. - Ausbeute: 1.69 g (2.38 mmol, 85%) eines gelben Feststoff. - DC: N 5 8 O 3' 2' 61 NH 2 9N 5' 4' O 7 4 N 3 NH2 1' OTBDMS Rf-Wert 75 (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.34. - Smp.: 119 °C. - [α]20546: - 7.9 ° (c = 0.47, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.55 (s, 1H, NH), 8.22 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 7.37 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(B)), 7.04 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(C)), 6.20 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 6.17 (s, 2H, NH2), 4.52 (m, 1H, H3’), 3.81-3.76 (m, 3JHH = 8.3 Hz, 3JHH = 9.3 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.70-3.66 (m, 1H, H5b’), 3.18 (ddd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.23 (s, 3H, CH3), 2.06 (ddd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H2b’), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), 0.00 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.7 (C2), 152.3 (C6), 146.0 (C8), 143.9 (C(D)), 139.0 (C(A)), 128.3 (C(B)), 123.9 (C4), 114.5 (C(C)), 111.0 (C5), 87.1 (C1’), 82.9 (C4’), 72.7 (C3’), 63.1 (C5’), 36.9 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 20.1 (CH3-Toluidin), 18.1 (SiC(CH3)3), -4.6, -5.3 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3312, 2918, 1693, 1603, 1517, 1369, 1252, 1083, 837, 776. - MS (FAB, m/z): ber.: 600.3276, gef.: 601.3344 (M+H+). 179 Experimentalteil Synthese von 8-N-(4-Cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 76 Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt. NC Es wurden 1.40 g (1.99 mmol) O6-Benzyl-8-N-(4- C B D A HN cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’desoxyguanosin 69 eingesetzt. TBDMSO Reaktionszeit: 16 h. - Ausbeute: 1.16 g (1.89 mmol, 95%) eines farblosen Feststoff. -DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.49. - Smp.: 8 N 5 O 3' 2' 61 NH 2 9N 5' 4' O 7 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 148 76 °C. -[α] 546: - 8.6 ° (c = 0.5, CHCl3). - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.65 20 1 (s, 1H, NH), 9.14 (s, 1H, NH-p-Cyanophenylamin), 7.67 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, H(C)), 7.53 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 6.24 (s, 2H, NH2), 6.29 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 4.51 (ddd, 3JHH = 5.8 Hz, 3JHH = 2.7 Hz, 1H, H3’), 3.81-3.78 (m, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 8.0 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.64 (dd, 2JHH = 9.7 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, H5b’), 3.43 (ddd, 2JHH = 13.1 Hz, 3JHH = 6.5 Hz, 1H, H2a’), 2.09 (ddd, 2JHH = 13.1 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H2b’), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.82 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.01 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.8 (C2), 152.6 (C6), 150.0 (C8), 146.4 (C(D)), 141.8 (C(A)), 133.2 (C(C)), 116.4 (C(B)), 114.3 (C4), 113.7 (C5), 101.6 (CN), 87.3 (C4’), 82.9 (C1’), 66.6 (C3’), 63.2 (C5’), 36.6 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.7, -5.4 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3499, 3211, 2218, 1634, 1471, 1175, 1031, 777, 544. - MS (FAB, m/z): ber.: 611.3072, gef.: 612.3144 (M+H+). 180 Experimentalteil Synthese von 8-N-(3,5-Dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’- desoxy-guanosin 77 Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt. C B D 6 Es wurden 1.71 g (1.54 mmol) O -Benzyl-8-N-(3,5- A dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)2’-desoxyguanosin 70 eingesetzt. HN O 3' 2' 185°C. - [α] 546: NH 4 N NH2 3 1' OTBDMS (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.46. - Smp.: 20 61 2 9N 4' 78%) eines bräunlichen Feststoff. - DC: Rf-Wert N 5 8 TBDMSO 5' Reaktionszeit: 12 h. - Ausbeute: 1.17 g (1.35 mmol, O 7 77 1 - 43 ° (c = 0.8, CHCl3). - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.57 (s, 1H, NH), 8.04 (s, 1H, NH-3,5-Dimethylanilin), 7.28-7.21 (m, 2H, H(B)), 6.97 (s, 1H, H(D)), 6.51 (s, 2H, NH2), 6.20-6.11 (m, 1H, H1´), 4.49 (t, 3JHH= 2.8 Hz, 1H, H3´), 4.02 (q, 3JHH= 7.1 Hz, 1H, H4´), 3.82-3.75 (m, 2H, H5´), 3.08 (q, 3JHH= 6.8 Hz, 1H, H2´a), 2.19 (s, 1H, H2´b), 0.86 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.7 (s, 6H, (Si(CH3)2)2), 0.00 (s, 6H, (Si(CH3)2)2). – 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.9 (C6), 152.7 (C2), 150.2 (C8), 143.6 (C4), 142.0 (C5), 137.7 (C(C), 119.7 (C(D), 117.8 (C(B)), 112.2 (C(A)), 93.7 (C4´), 87.2 (C3´), 73.0 (C1´), 63.2 (C5´), 37.2 (C2´), 30.5 (Si(CH3)2), 26.0 (Si(CH3)2), 26.0 (Me-aromat.), 21.4 (Me-aromat.), 18.3 (SiC(CH3)3), 17.3 (SiC(CH3)3), -4.7 (SiC(CH3)3), -6.1 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3489, 2928, 2857, 1696, 1596, 1497, 1406, 1285, 1091, 836, 775. - MS (FAB, m/z): ber.: 614.3439, gef.: 615.3510 (M+H+). Synthese von 8-N-(4-Aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy- guanosin 78 Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt. Es wurden 1.00 g (1.32 mmol) O6-Benzyl-8-N-(4- H G F E D C B aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-des- A HN oxyguanosin 71 eingesetzt. Reaktionszeit: 16 h. - Ausbeute: 820 mg (1.23 mmol, 93%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.56. - Smp.: 8 N 5 O 3' 2' 61 NH 2 9N TBDMSO 5' 4' O 7 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 78 181 Experimentalteil Zersetzung bei 200 °C. - [α]20546: - 8 ° (c = 0.3, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.59 (s, 1H, NH), 7.87 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 7.83 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 2H, H(B)), 7.60 (dd, 3 JHH = 8.3 Hz, 4H, H(C) + H(F)), 7.42 (dd,3JHH = 7.6 Hz, 2H, H(G)), 7.29 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H(H)), 6.47 (s, 2H, NH2), 6.10 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3 JHH = 7.6 Hz, 1H, H1’), 4.48 (ddd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 5.3 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 1H, H3’), 3.81 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, H5a’), 3.73 (ddd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 1H, H4’), 3.69 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H5b’), 3.63 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H2a’), 2.22 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3 JHH = 7.6 Hz, 1H, H2b’), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.86 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.08 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.04 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.4 (C2), 159.9 (C6), 154.5 (C(A)), 148.6 (C8), 140.9 (C(D)), 139.8 (C(E)), 128.9 (C(B)), 127.6 (C4), 127.3 (C(C)), 127.2 (C5), 125.8 (C(F)), 125.5 (C(G)), 114.4 (C(H)), 82.3 (C1’), 72.4 (C4’), 72.3 (C3’), 62.9 (C5’), 37.2 (C2’), 26.0 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.1 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.2 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3346, 3173, 2954, 2928, 1647, 1603, 1537, 1486, 1383, 1169, 1075, 776. - MS (FAB, m/z): ber.: 662.3432, gef.: 663.3496 (M+H+). Synthese von 8-N-(2-Aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy- guanosin 79 Die Reaktion wurde nach AAV 2 durchgeführt. Es wurden 1.95 g (2.55 mmol) O -Benzyl-8-N-(2aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)- 2’ desoxyguanosin 72 eingesetzt. I J 6 G H K L C M B D E Reaktionszeit: 48 h. - Ausbeute: 1.45 g (2.14 mmol, 84%) eines beigen Feststoff. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.56. - Smp.: 169 °C. - [α]20546: - 21 ° (c = 0.34, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.61 (s, 1H, NH), HN F TBDMSO 5' N 5 9N 4 8 O 4' 3' O 7 A 2' 61 NH 2 N 3 NH2 1' OTBDMS 79 8.50 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 7.80-7.75 (m, 1H, H(E)), 7.75 (dt, 3JHH = 7.9 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H(B)), 7.63 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4JHH = 1.9 Hz, 1H, H(L)), 7.50-7.46 (m, 182 Experimentalteil 1H, H(F)), 7.41 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4JHH = 2.0 Hz, 1H, H(I)), 7.32 (dt, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H(J)), 7.06-7.01 (m, 1H, H(K)), 6.55 (dd, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H1’), 6.21 (s, 2H, NH2), 4.53-4.49 (m, 1H, H3’), 3.99 (s, 2H, CH2-AF), 3.65-3.92 (m, 3H, H5a’, H5b’, H4’), 3.21 (dd, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H2a’), 2.09-2.01 (m, 1H, H2b’), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.84 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.08 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), 0.01 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.3 (C(A)), 157.3 (C2), 152.3 (C6), 149.8 (C8), 143.9 (C(D)), 143.5 (C(M)), 140.9 (C(H)), 140.1 (C(C)), 137.0 (C(A)), 126.9 (C(F)), 125.4 (C(B)), 124.8 (C4), 120.1 (C(K)), 118.9 (C(I) + C(J)), 115.9 (C(L)), 113.4 (C(E)), 110.3 (C5), 87.2 (C4’), 83.0 (C1’), 72.6 (C3’), 63.1 (C5’), 57.9 (C(G)), 36.9 (C2’), 25.8 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.7, -5.4 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3357, 2952, 2928, 1684, 1591, 1562, 1456, 1359, 1256, 836. - MS (FAB, m/z): ber.: 674.3432, gef.: 675.3483 (M+H+). Synthese von 8-N-(Phenylamino)-2’-desoxyguanosin 80 C D Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt. B Es wurden 1.41 g (2.40 mmol) 8-N-(Phenylamino)-3’,5’bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 73 8 HN Reaktionszeit: 3 h. - Ausbeute: 820 mg (2.05 mmol, 78%) farblosen Feststoff. - DC: N 5 O 4' 3' Rf-Wert 2' 61 NH 2 9N HO 5' setzt. eines A einge- O 7 4 N 3 NH2 1' OH 80 (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.02. - Smp.: 103 °C. - [α] 546: - 3.4 ° (c = 1.0, 20 CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.52 (s, 1H, NH), 8.62 (s, 1H, NH-Anilin), 7.72 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 2H, H(B)), 7.25 (ddd, 3JHH= 7.4 Hz, 3JHH= 7.4 Hz, 2H, H(C)), 6.89 (dd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, H(D)), 6.38 (s, 2H, NH2), 6.32 (dd, 3JHH= 5.6 Hz, 3JHH= 9.7 Hz, 1H, H1´), 5.92 (dd, 3JHH= 4.7 Hz, 3 JHH= 4.7 Hz, 1H, 5´-OH), 5.34 (d, 3JHH= 3.5 Hz, 1H, 3´-OH), 4.42-4.41 (m, 1H, H3´), 3.92-3.88 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.75-3.74 (m, 1H, H5´b), 3.35 (dd, 1H, H2´a), 2.03-2.00 (m, 1H, H2´b). 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.1 (C6), 152.3 (C2), 148.9 (C8), 142.7 (C4), 140.3 (C5), 128.0 (C(D)), 120.0 (C(C)), 116.8 (C(B)), 112.7 (C(A)), 86.6 (C4´), 82.3 (C3´), 70.7 (C1´), 60.7 (C5´), 45.1 (C2´). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3423, 183 Experimentalteil 2982, 1638, 1476, 1037. - UV: λMax [nm] MeCN: 285. - MS (FAB,m/z): ber.: 358.1390, gef.: 359.1402 (M+H+). Synthese von 8-N-(4-Methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 81 Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt. Es wurden 1.80 g (2.92 mmol) 8-N-(4-Methoxy- phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy- O D C B A guanosin 74 eingesetzt. Reaktionszeit: 2 h. - Ausbeute: 780 mg (2.89 mmol, 96%) eines farblosen Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.48. - [α]20546: - 0.9 ° (c = 1.0, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, HN HO 8 5' N 5 9N 4 O 4' 3' O 7 2' 61 NH 2 N 3 NH2 1' OH 81 DMSO-d6): 10.73 (s, 1H, NH), 8.47 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.64 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 6.83 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.62 (s, 2H, NH2), 6.31 (dd, 3JHH = 9.7 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H1’), 5.90 (s, 1H, 5’-OH), 5.34 (s, 1H, 3’-OH), 4.42 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H3’), 3.91 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 2H, H5a’, H4), 3.74 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.71 (s, 3H, OMe), 3.40 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’), 1.99 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.1 (C2), 153.8 (C6), 153.3 (C8), 149.9 (C(D)), 144.1 (C(A)), 134.5 (C(C)), 128.4 (C(B)), 119.3 (C4), 112.0 (C5), 87.5 (C1’), 83.0 (C4’), 71.7 (C3’), 61.7 (C5’), 55.5 (O-CH3), 38.5 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 3423, 2982, 1638, 1476, 1037. - UV: λMax [nm] MeCN: 294, 255. - MS (FAB,m/z): ber.: 388.1495, gef.: 389.1501 (M+H+). 184 Experimentalteil Synthese von 8-N-(4-Methylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 82 Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt. C Es wurden 1.30 g (2.16 mmol) 8-N-(4-Methylphenylamino)- B D HN 3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 75 einHO gesetzt. 9N 4 O 3' eines weißen klebrigen hochviskosen Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.65. - [α]20546: N 5 8 5' 4' Reaktionszeit: 4 h. - Ausbeute: 720 mg (1.93 mmol, 89%) O 7 A 2' 61 NH 2 NH2 N 3 1' OH - 1.8 ° 82 1 (c = 0.94, CH2Cl2/MeOH). - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.92 (s, 1H, NH), 8.53 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 7.62 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 7.04 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(C)), 6.56 (s, 2H, NH2), 6.31 (dd, 3JHH = 9.7 Hz, 3JHH = 5.6 Hz, 1H, H1’), 5.75 (s, 1H, 5’-OH), 5.32 (s, 1H, 3’-OH), 4.42-4.38 (m, 1H, H3’), 3.91-3.88 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.74-3.69 (m, 1H, H5b’), 3.16-3.10 (m, 1H, H2a’), 2.23 (s, 3H, CH3), 1.99 (dd, 2JHH = 12.9 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.7 (C2), 153.0 (C6), 149.5 (C8), 143.4 (C(D)), 138.4 (C(A)), 129.2 (C4), 128.6 (C(B)), 117.4 (C(C)), 111.8 (C5), 87.1 (C1’), 82.7 (C4’), 71.3 (C3’), 61.3 (C5’), 38.3 (C2’), 20.3 (CH3-Toluidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 3468, 3095, 2938, 1676, 1647, 1561, 1474, 1361, 736. - UV: λMax [nm] MeCN: 312, 255, 213. - MS (FAB, m/z): ber.: 372.1546, gef.: 373.1611 (M+H+). Synthese von 8-N-(4-Cyanophenylamino)-2’-desoxyguanosin 83 Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt. Es wurden 900 mg (1.47 mmol) NC 8-N-(4- C B D A HN Cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl) - 2’ - HO 5' desoxyguanosin 76 eingesetzt. Reaktionszeit: 3 h. - Ausbeute: 500 mg (1.30 mmol, 88%) eines farblosen Öl. - DC: Rf-Wert 8 N 5 9N 4 O 4' 3' O 7 2' 61 NH 2 N 3 NH2 1' OH (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.06. - [α]20546: + 14 ° (c 83 = 1.3, CH2Cl2/MeOH). - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.33 (s, 1H, NH), 1 9.25 (s, 1H, NH-p-Cyanophenylamin), 7.91 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, H(C)), 7.68 (d, 3JHH = 8.9 Hz, 2H, H(B)), 6.98 (s, 2H, NH2), 6.33 (dd, 3JHH = 9.5 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H1’), 185 Experimentalteil 5.75 (s, 1H, 5’-OH), 4.82 (s, 1H, 3’-OH), 4.42 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H3’), 3.92-3.88 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.74-3.66 (m, 1H, H5b’), 3.16-3.09 (m, 1H, H2a’), 2.06 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 154.1 (C2), 153.3 (C6), 149.6 (C8), 144.9 (C(D)), 141.7 (C(A)), 133.1 (C(C)), 119.7 (C4), 117.1 (C(B)), 113.7 (C5), 101.6 (CN), 87.3 (C4’), 83.0 (C1’), 71.3 (C3’), 61.3 (C5’), 38.6 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3422, 2974, 2937, 2676, 1685, 1647, 1170, 1027, 736, 418. - UV: λMax [nm] MeCN: 335, 212. - MS (FAB, m/z): ber.: 383,1342, gef.: 384.2351 (M+H+). Synthese von 8-N-(3,5-Dimethylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 84 Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt. Es wurden 1.17 g (1.75 mmol) C 8-N-(3,5- B D A dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’desoxyguanosin 77 eingesetzt. HO Reaktionszeit: 12 h. - Ausbeute: 520 mg (1.35 mmol, 79%) eines braunen Öls. HN - DC: Rf-Wert 8 N 5 O 3' 2' 61 NH 2 9N 5' 4' O 7 4 N 3 NH2 1' OH (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.85. - [α]20546: - 17 ° (c 84 = 1.0, CH2Cl2/MeOH). - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.53 (s, 1H, NH), 1 8.41 (s, 1H, NH-3,5-Dimethylanilin), 7.30 (s, 2H, H(B)), 6.52 (s, 1H, H(D)), 6.45 (s, 2H, NH2), 6.29 (dd, , 3JHH= 5.7 Hz, , 3JHH= 3.9 Hz, 1H, H´1), 5.86 (s, 1H, 5´-OH), 5.03 (s, 1H, 3´-OH), 4.40 (d, 3JHH= 5.2 Hz, 1H, H3´), 3.89 (d, 3JHH= 1.9 Hz, 1H, H4´), 3.70-3.65 (m, 2H, H5´), 2.21 (s, 6H, Me-aromat.), 1.98-1.91 (m, 2H, H2´). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.6 (C6), 154.4 (C2), 150.7 (C8), 147.9 (C4), 137.5 (C5), 133.6 (C(D)), 130.9 (C(B)), 130.8 (C(B)), 127.5 (C(C)), 127.0 (C(C)), 115.2 (C(A)), 95.4 (C4´), 90.4 (C3´), 71.3 (C1´), 58.7 (C5´), 45.8 (C2´), 21.4 (Me-aromt.). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3438, 2941, 2677, 1684, 1476, 1397, 1069, 736, 519. - UV: λMax [nm] MeCN: 335, 212. - MS (FAB, m/z): ber.: 386.1703, gef.: 387.1751 (M+H+). 186 Experimentalteil Synthese von 8-N-(4-Aminobiphenyl)-2’-desoxyguanosin 85 Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt. Es wurden 600 mg (0.90 H mmol) G E F 8-N-(4-Aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethyl- C D B silyl)-2’-desoxyguanosin 78 eingesetzt. HO 94%) eines farblosen Feststoff. -DC: Rf-Wert 5' 20 197 °C. - [α] 1 546: 9N 4 O 4' 3' (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.83. - Smp.: N 5 8 HN Reaktionszeit: 3 h. - Ausbeute: 370 mg (0.85 mmol, O 7 A 2' 61 NH 2 N NH2 3 1' OH + 3.8 ° (c = 0.5, CH2Cl2/MeOH). - 85 H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.92 (s, 1H, NH), 8.77 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 7.83 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 2H, H(B)), 7.60 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4H, H(C) + H(F)), 7.42 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 2H, H(G)), 7.29 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H(H)), 6.65 (s, 2H, NH2), 6.34 (dd, 3JHH = 9.5 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H1’), 6.02 (s, 1H, 5’-OH), 5.39 (s, 1H, 3’-OH), 4.44 (ddd, 3JHH = 5.6 Hz, 1H, H3’), 3.93 (dd, 2 JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, H5a’), 3.77-3.64 (m, 3H, H4’ + H5b’ + H2a’), 2.22 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 5.6 Hz, 3JHH = 12.6 Hz, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.9 (C2), 156.0 (C6), 153.3 (C(A)), 149.7 (C8), 140.5 (C(D)), 140.3 (C(E)), 132.4 (C5 + C4), 126.7 (C(F) + C(B) + C(C)), 126.2 (C(G)), 117.8 (C(H)), 87.3 (C1’), 83.0 (C4’), 71.4 (C3’), 61.5 (C5’), 38.6 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3427, 2979, 1559, 1475, 1400, 1035, 720. - UV: λMax [nm] MeCN: 327, 233, 213. - MS (FAB, m/z): ber.: 434.1703, gef.: 435.1805 (M+H+). Synthese von 8-N-(2-Aminofluorenyl)-2’-desoxyguanosin 86 Die Reaktion wurde nach AAV 3 durchgeführt. Es wurden 1.35 g (2.00 mmol) 8-N-(2- Aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)- 2’ -desoxyguanosin 79 eingesetzt. I J G H K L C M B D E Reaktionszeit: 5 h. - Ausbeute: 548 mg (1.22 mmol, 61%) eines farblosen Feststoff. - DC: RfWert (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.81. 20 Smp.: Zersetzung bei 240 °C. - [α] 546: HN F HO 5' N 5 9N 4 8 O 4' 3' O 7 A 2' 61 NH 2 N 3 NH2 1' OH - 18 ° (c = 86 187 Experimentalteil 0.16, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.55 (s, 1H, NH), 8.73 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 8.09 (d, 4JHH = 1.3 Hz, 1H, H(E)), 7.76 (dt, 3JHH = 7.4 Hz, 3JHH = 9.8 Hz, 2H, H(B) + H(L)), 7.67 (dd, 3JHH = 9.4 Hz, 4JHH = 1.9 Hz, 1H, H(F)), 7.52 (d, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(I)), 7.33 (t, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(J)), 7.21 (dt, 3 3 JHH = 7.4 4 Hz, JHH = 7.4 Hz, JHH = 1.0 Hz, 1H, H(K)), 6.36 (s, 2H, NH2), 6.34-6.29 (m, 1H, H1’), 5.98 (t, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, 5’-OH), 5.34 (d, 3JHH = 3.6 Hz, 1H, 3’-OH), 4.43-4.37 (m, 1H, H3’), 3.93-3.88 (m, 1H, H5a’), 3.89 (s, 2H, CH2-AF), 3.78-3.70 (m, 2H, H5b’, H4’), 13 2.56-2.52 (m, 1H, H2a’), 2.09-2.00 (m, 1H, H2b’). - C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.3 (C(A)), 155.7 (C2), 152.8 (C6), 149.5 (C8), 143.8 (C(D)), 143.3 (C(M)), 142.4 (C(H)), 141.4 (C(C)), 140.0 (C(A)), 134.0 (C(F)), 126.6 (C(B)), 124.9 (C4), 120.0 (C(K)), 119.0 (C(I) + C(J)), 116.3 (C(L)), 113.9 (C(E)), 112.2 (C5), 87.2 (C4’), 82.8 (C1’), 71.3 (C3’), 61.3 (C(G) + C5’), 36.5 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3330, 1676, 1593, 1561, 1432, 1415, 1356, 1325, 1095, 767, 731. - UV: λMax [nm] MeCN: 317, 260, 206. - MS (FAB, m/z): ber.: 446.1703, gef.: 447.1790 (M+H+). Synthese von N2-Formamidin-8-N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin 87 Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt. Es wurden 800 mg (1.95 mmol) D C B 8-N- A (Phenylamino)-2’-desoxyguanosin 80 eingesetzt. HN Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 563 mg (1.36 HO mmol, 67%) eines hellgelben Feststoff. - DC: RfWert (Dichlormethan/Methanol 6:1 v/v): 0.31. - 4' 5' O 7 8 N 5 9N 4 O 2' 61 NH 2 N 3 N α N(Me)2 1' OH Smp.: 161 °C. - [α]20546: + 18.8 ° (c = 1.2, 87 CH2Cl2/MeOH). - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.26 (s, 1H, NH), 8.72 (s, 1 1H, NH-Anilin), 8.53 (s, 1H, Hα), 7.74 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 2H, H(B)), 7.26 (ddd, 3JHH= 7.4 Hz, 3JHH= 7.4 Hz, 2H, H(C)), 6.92 (dd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, H(D)), 6.44 (dd, 3JHH= 5.6 Hz, 3JHH= 9.3 Hz, 1H, H1´), 5.87 (dd, 3JHH= 4.8 Hz, 3JHH= 4.8 Hz, 1H, 5´OH), 5.39 (d, 3JHH= 3.9 Hz, 1H, 3´-OH), 4.46-4.44 (m, 1H, H3´), 3.92 (d, 3JHH= 2.2 Hz, 2H, H5´a, H4´), 3.76 (dd, 3JHH= 2.0 Hz, 3JHH= 4.6 Hz, 1H, H5´b), 3.17 (d, 3JHH= 5.6 Hz, 1H, H2´a), 3.15 (s, 3H, Me-Formamidin), 3.02 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.09-2.04 (m, 1H, H2´b). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.1 (Cα), 156.2 (C6), 155.5 (C2), 147.7 (C8), 143.9 (C4), 140.3 (C5), 128.1 (C(D)), 120.4 (C(C)), 117.1 (C(B)), 188 Experimentalteil 115.2 (C(A)), 86.8 (C4´), 82.3 (C3´), 70.7 (C1´), 60.8 (C5´), 38.0 (C2´), 34.2 (MeFormamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3265, 1115, 991, 960, 915, 859, 504. - MS (FAB,m/z): ber.: 414.1812, gef.: 415.2543 (M+H+). Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 88 Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt. Es wurden 840 mg (1.75 mmol) 8-N-(4- O D C B Methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 81 einge- A HN setzt. Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 680 mg (1.42 mmol, 81%) eines farblosen Feststoff. – DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.36. - Smp.: 124 °C. - [α]20546: + 8.4 ° (c = 0.8, CH2Cl2/MeOH). - 1H- HO 4' O 7 8 5 N 61 NH 9N 4 N 5' 3 O 2' α 2 N N(Me)2 1' OH 88 NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.21 (s, 1H, NH), 8.57 (s, 1H, Hα), 8.51 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.64 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 6.85 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.42 (dd, 3JHH = 9.4 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H1’), 5.86 (dd, 3JHH = 4.8 Hz, 1H, 5’-OH), 5.37 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.44 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H3’), 3.91 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.73 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.71 (s, 3H, OMe), 3.40 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’), 3.14, 3.01 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.04 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.3 (Cα), 156.1 (C2), 153.8 (C6), 153.3 (C8), 149.9 (C(D)), 144.1 (C(A)), 120.8 (C4), 119. 3 (C(C)), 113.9 (C(B)), 112.0 (C5), 87.5 (C1’), 83.0 (C4’), 71.7 (C3’), 61.7 (C5’), 55.4 (O-CH3), 38.5 (C2’), 34.7 (Me-Formamidin). IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3338, 3161, 2944, 2910, 1651, 1599, 1531, 1475, 1361, 1139, 1038, 776. - MS (FAB,m/z): ber.: 443.4699, gef.: 444.4802 (M+H+). 189 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 89 Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt. Es wurden 700 mg (1.87 mmol) C 8-N-(4- B D Methylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 82 eingesetzt. HN HO Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 530 mg (1.23 O 2' °C. - [α] 546: NH α N N 4 3 N(Me)2 1' OH (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.78. - Smp.: 182 20 61 2 9N 4' mmol, 68%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert 5 N 8 5' 3' O 7 A 89 1 + 28.5 ° (c = 0.33, CH2Cl2/MeOH). - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO- d6): 11.24 (s, 1H, NH), 8.64 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 8.52 (s, 1H, Hα), 7.63 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 7.06 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(C)), 6.42 (dd, 3JHH = 9.4 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H1’), 5.87 (dd, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, 5’-OH), 5.39 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.454.39 (m, 1H, H3’), 3.91-3.85 (m, 1H, H5a’), 3.75-3.67 (m, 2H, H4’, H5b’), 3.01, 3.14 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.57 (ddd, 3JHH = 13.1 Hz, 3JHH = 9.5 Hz, 3JHH = 6.4 Hz, 1H, H2a’), 2.24 (s, 3H, CH3), 2.05-1.99 (m, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 156.5 (C2), 155.8 (C6), 148.1 (C8), 144.5 (C(D)), 138.2 (C(A)), 129.5 (C4), 128.9 (C(B)), 117.6 (C(C)), 115.6 (C5), 87.2 (C1’), 82.7 (C4’), 71.1 (C3’), 61.2 (C5’), 38.3 (C2’), 34.6 (Me-Formamidin), 20.3 (CH3-Toluidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3307, 1667, 1632, 1533, 1344, 1114, 1061, 960, 819. - MS (FAB, m/z): ber.: 427.1968, gef.: 428.2046 (M+H+). Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-2’-desoxyguanosin 90 Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt. Es wurden 500 mg (1.30 mmol) 8-N-(4- NC C B D A HN Cyanophenylamino)-2’-desoxyguanosin 83 eingesetzt. N 5 O 4' 3' mmol, 91%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-Wert 8 2' 61 NH 2 9N HO 5' Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 520 mg (1.18 O 7 4 N 3 N α N(Me)2 1' OH (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.14. - Smp.: 90 154 °C. - [α] 546: + 3.6 ° (c = 0.43, CH2Cl2/MeOH). - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, 20 1 DMSO-d6): 11.34 (s, 1H, NH), 9.40 (s, 1H, Hα), 9.29 (s, 1H, NH-p-Cyanophenylamin), 190 Experimentalteil 7.70 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, H(C)), 7.38 (d, 3JHH = 7.5 Hz, 2H, H(B)), 6.45 (dd, 3JHH = 9.2 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H1’), 5.75 (s, 1H, 5’-OH), 4.78 (s, 1H, 3’-OH), 4.46 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H3’), 3.93 (dd, 1H, H5b’), 3.75-3.70 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.16-3.09 (m, 1H, H2a’), 2.88, 2.72 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.12 (ddd, 2JHH = 12.2 Hz, 3JHH = 5.2 Hz, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 155.7 (C2), 155.4 (C6), 147.3 (C8), 143.8 (C(D)), 141.8 (C(A)), 132.0 (C(C)), 118.6 (C4), 116.3 (C(B)), 114.6 (C5), 100.8 (CN), 86.4 (C4’), 81.9 (C1’), 70.1 (C3’), 60.3 (C5’), 38.2 (C2’), 34.7 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3446, 2738, 2676, 1598, 1392, 1176, 1061, 916, 844, 643, 579. - MS (FAB, m/z): ber.: 438.1764, gef.: 439.1797 (M+H+). Synthese von N2-Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 91 Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt. Es wurden 520 mg (1.35 mmol) 8-N-(3,5dimethylphenylamino)-2’-desoxyguanosin C B D 84 HN eingesetzt. Reaktionszeit: 72 h. - Ausbeute: 280 mg (0.63 HO mmol, 47%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.89. - Smp.: 151 °C. - [α]20546: - 10 ° (c = 1.0, CHCl3). - 1H- 5' N 5 9N 4 8 O 4' 3' O 7 A 2' 61 NH 2 N 3 N α N(Me)2 1' OH 91 NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.23 (s, 1H, NH), 8.50 (s, 1 H, NH-3,5Dimethylanilin), 8.49 (s, 1H, Hα), 7.30 (s, 2H, H(B)), 6.53 (s, 1H, H(D)), 6.39 (dd, 3JHH= 5.9 Hz, 3JHH= 6.7 Hz, 1H, H1´), 5.81 (dd, 3JHH= 4.6 Hz, 3JHH= 9.2 Hz, 1H, 5´-OH), 5.34 (d, 3JHH= 3.9 Hz, 1H, 3´-OH), 4.42 (s, 1H, H3´), 3.88 (d, 3JHH= 2.3 Hz, 1H, H5´a), 3.733.68 (m, 2H, H5´b, H4´), 3.12 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.99 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.52-2.39 (m, 1H, H2´a), 2.20 (s, 6H, Me-aromat.), 2.04-1.99 (m, 1H, H2´b). – 13 C- NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.6 (Cα), 157.8 (C6), 156.8 (C2), 156.03 (C8), 148.5 (C4), 144.5 (C5), 140.8 (C(A)), 137.6 (C(D)), 122.3 (C(C)), 115.6 (C(B)), 87.3 (C4´), 82.1 (C3´), 71.2 (C1´), 61.3 (C5´), 38.5 (C2´), 34.8 (Me-Formamidin), 21.5 (Mearomat.). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3302, 2921, 1675, 1630, 1560, 1345, 1113. MS (FAB, m/z): ber.: 438.1764, gef.: 439.1797 (M+H+). 191 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-2’-desoxyguanosin 92 Die Reaktion wurde nach AAV 4 durchgeführt. H G Es wurden 160 mg (0.36 mmol) 8-N-(4- F E D C B Aminobiphenyl)-2’-desoxyguanosin 85 eingeHO Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 167 mg 3' (0.34 mmol, 94%) eines farblosen Feststoff. DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 20 v/v): 0.13. - Smp.: 245 °C. - [α] 546: O 2' 61 NH 2 9N 5' 4' 5 N 8 HN setzt. O 7 A 4 N 3 N α N(Me)2 1' OH 92 + 28.9 ° (c = 0.5, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.28 (s, 1H, NH), 8.68 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 8.57 (s, 1H, Hα), 7.85 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 2H, H(B)), 7.63 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4H, H(C) + H(F)), 7.42 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 2H, H(G)), 7.29 (dd, 3 JHH = 7.6 Hz, 1H, H(H)), 6.46 (dd, 3JHH = 9.3 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H1’), 5.93 (s, 1H, 5’-OH), 5.40 (s, 1H, 3’-OH), 4.47 (ddd, 1H, H3’), 3.94 (dd, 3JHH = 2.1 Hz, 1H, H5a’), 3.77-3.72 (m, 3H, H4’ + H5b’ + H2a’), 3.07, 3.06 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.08 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO- d6): 157.7 (Cα), 156.7 (C2), 156.0 (C6), 149.7 (C(A)), 148.3 (C8), 140.4 (C(D)), 140.1 (C(E)), 132.7 (C5 + C4), 129.0 (C(F)), 126.9 (C(B)), 126.8 (C(C), 126.2 (C(G)), 115.8 (C(H)), 87.4 (C1’), 83.0 (C4’), 71.3 (C3’), 61.4 (C5’), 38.6 (C2’), 34.8 (Me-1 Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm ] (KBr): 3346, 3173, 2954, 2928, 1647, 1603, 1537, 1486, 1383, 1169, 1075, 776. - MS (FAB m/z): ber.: 489.2125, gef.: 490.2229 (M+H+). 192 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)-2’-desoxyguanosin 93 Die Reaktion wurde nach AAV 4 I J durchgeführt. H K Es wurden 350 mg (0.78 mmol) 8-N-(2Aminofluorenyl)-2’-desoxyguanosin 86 eingesetzt. L G C M B D E HN F Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 237 mg HO 5' (0.47 mmol, 60%) eines roten Feststoff. - 4' DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 6:1 v/v): 0.4. - Smp.: 209 °C. - [α]20546: + 5 ° 5 N 8 2' 61 NH α 2 9N O 3' O 7 A 4 N 3 N N(Me)2 1' OH 93 (c = 0.1, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.30 (s, 1H, NH), 8.83 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 8.53 (s, 1H, Hα), 8.11 (d, 4JHH = 1.3 Hz, 1H, H(E)), 7.77-7.73 (m, 2H, H(B) + H(L)), 7.68 (dd, 3JHH = 8.4 Hz, 4JHH = 1.8 Hz, 1H, H(F)), 7.53 (d, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(I)), 7.33 (t, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(J)), 7.22 (dt, 3JHH = 7.4 Hz, 3 JHH = 7.4 Hz, 4JHH = 1.0 Hz, 1H, H(K)), 6.34 (dd, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 9.3 Hz, 1H, H1’), 5.96 (t, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, 5’-OH), 5.41 (d, 3JHH = 3.7 Hz, 1H, 3’-OH), 4.48-4.44 (m, 1H, H3’), 3.94-3.89 (m, 1H, H5a’), 3.90 (s, 2H, CH2-AF), 3.79-3.71 (m, 2H, H5b’, H4’), 3.15, 3.02 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.61-2.55 (m, 1H, H2a’), 2.08-2.01 (m, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 156.6 (C(A)), 155.9 (C2), 152.8 (C6), 148.1 (C8), 144.2 (C(D)), 143.8 (C(M)), 142.4 (C(H)), 141.4 (C(C)), 139.9 (C(E)), 134.1 (C4), 126.7 (C(F)), 125.4 (C(B)), 124.9 (C(K)), 120.0 (C(I)), 119.0 (C(J)), 116.5 (C(L)), 115.6 (C5), 114.0 (C(F)), 87.2 (C4’), 82.8 (C1’), 71.1 (C3’), 61.3 (C(G)), 48.6 (C5’), 36.5 (C2’), 34.6 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3283, 2923, 1673, 1630, 1343, 1113, 1058, 946, 731. - MS (FAB, m/z): ber.: 501.2203, gef.: 502.2237 (M+H+). 193 Experimentalteil Versuch der Darstellung von N2-Formamidin-8-N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin-5‘monophosphat 94 Die Reaktion wurde Stickstoffatmosphäre unter einer durchgeführt, um B A Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. Es wurden 44 µL (0.47 C D O O P O O mmol) Phosphorylchlorid, 4.2 µL (0.23 mmol) Wasser HN N 8 61 NH 2 2' OH α N 3 O und 38 µL (0.47 mmol) Pyridin in 2 mL abs. 5 9N 4 N 5' 4' O 7 N(Me)2 1' 94 Acetonitril bei 0 °C gelöst. Anschließend wurde 40 mg (0.10 mmol) N2-Formamidin-8N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin 87, gelöst in 1 mL abs. Acetonitril hinzugetropft und die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und 4 Stunden gerührt. Nach erfolgter Hydrolyse mit Eis bei 4 °C für eine Stunde erfolgte die Neutralisation mit Ammoniumhydrogencarbonat und Lyophillisation der Reaktionslösung. Nach abschließender RP-säulenchromatographischer Reinigung mit Wasser konnten jedoch nur Zersetzungsprodukte isoliert werden. Versuch der Darstellung 5-Chlor-cycloSal-N2-formamidin-8-N-(4- von methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosinmonophosphat 96 Die Reaktion wurde Stickstoffatmosphäre um Sauerstoff und unter einer O D C durchgeführt, B Feuchtigkeit auszuschließen. Es wurden 25 mg (0.06 mmol) N2Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 88 in 500 Cl E' F' D' C' A A' B' O OO P O HN 5' O 7 N 8 61 5 NH N 4 N 9 3 O 4' OH 2' 2 N α N(Me)2 1' 96 µL abs. Pyridin gelöst und bei – 40 °C mit einer 0.1 M Lösung des Chlorophosphidates 95 (0.1 mL) über einen Zeitraum von einer Stunde versetzt. Nach weiteren 5 h Rühren konnte jedoch keine Umsetzung des Eduktes beobachtet werden. 194 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(Phenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’- desoxyguanosin 97 Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt. D C B Es wurden 542 mg (1.31 mmol) N2-Formamidin-8N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin 87 A HN einge- setzt. Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 737 mg (1.03 mmol, 79%) eines hellgelben Feststoff. - DC: RfWert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.23. - DMTrO 4' 5' O 7 8 N 5 9N 4 O 2' 61 NH 2 N 3 N α N(Me)2 1' OH 97 Smp.: 168 °C. - [α]20546: - 2.9 ° (c = 1.0, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSOd6): 11.30 (s, 1H, NH), 8.69 (s, 1H, NH-Anilin), 8.23 (s, 1H, Hα), 7.66 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 2H, H(B)), 7.60 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 1H, H(D)), 7.33-7.30 (m, 2H, H(C)), 7.20-7.13 (m, 13H, DMTr), 6.37 (dd, 3JHH= 5.0 Hz, 3JHH= 7.7 Hz, 1H, H1´), 5.36-5.35 (m, 1H, 3´OH), 4.59 (ddd, 3JHH= 5.5 Hz, 1H, H3´), 3.90 (ddd, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 6.8 Hz, 3JHH= 6.9 Hz, 2H, H5´a, H4´), 3.70-3.68 (m, 7H, DMTr-CH3; H5´b), 3.17 (d, 3JHH= 4.6 Hz, 1H, H2´a), 2.99 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.97 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.24-2.20 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.2 (Cα), 156.7, 156.5, 156.4 (C6), 155.6, 155.2 (C2), 155.0, 154.7, 153.7, 153.4, 146.7 (C8), 146.3 (C4), 143.6 (C5), 128.4, 128.3, 128.2, 128.1 (C(D)), 128.0, 127.8, 127.1, 126.5, 126.4, 126.2, 126.1, 125.1, 119.1 (C(C)), 115.7 (C(B)), 115.4 (C(A)), 111.8 (DMTr-CH3), 111.5 (DMTr-CH3), 84.0 (C4´), 83.9 (C3´), 81.0 (C1´), 62.6 (C5´), 36.1 (C2´), 33.1 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 2931, 2835, 914, 790, 777, 727, 583, 555, 503. - MS (FAB,m/z): ber.: 715.3118, gef.: 716.3202 (M+H+). 195 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’- desoxyguanosin 98 Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt. O C D B 2 Es wurden 650 mg (1.46 mmol) N -Formamidin8-N-(4-methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 88 eingesetzt. 61 NH 5' N 3 O 2' α 2 9N 4 N 4' Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 850 mg (1.15 5 N 8 HN DMTrO O 7 A N(Me)2 1' OH mmol, 79%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf- 98 Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.38. - Smp.: 131 °C. - [α]20546: - 10.6 ° (c = 0.76, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.24 (s, 1H, NH), 8.47 (s, 1H, Hα), 8.22 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.60 (d, 3 JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 7.13-7.26 (m, 10 H, DMTr-H), 6.86 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.70-6.75 (m, 5H, DMTr-H), 6.42 (dd, 3JHH = 7.5 Hz, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H1’), 5.34 (d, 3JHH = 5.4 Hz, 1H, 3’-OH), 4.58 (ddd, 3JHH = 5.4 Hz, 1H, H3’), 4.09 (ddd, 3JHH = 5.2 Hz, 3JHH = 5.4 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.73 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.71 (s, 3H, OMe), 3.68 (s, 6H, DMTr-CH3), 3.40 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’), 3.17, 3.16 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.32 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3 JHH = 5.4 Hz, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.3 (Cα), 156.1 (C2), 153.8 (C6), 153.3 (C8), 149.9 (C(D)), 144.1 (C(A)), 140.6, 139.9, 135.8, 135.7, 132.6, 129.7, 129.6, 128.9, 127.8, 127.4, 126.8, 126.6, 126.4, 126.0, 120.8 (C4), 119.2 (C(C)), 113.9 (C(B)), 113.1 (C5), 87.5 (C1’), 83.0 (C4’), 71.7 (C3’), 61.7 (C5’), 55.4 (O-CH3), 38.5 (C2’), 34.7 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3423, 3041, 2982, 1638, 1476, 1037. - MS (FAB,m/z): ber.: 745.3224, gef.: 746.3215 (M+H+) Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’- desoxyguanosin 99 C Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt. Es wurden 500 mg (1.16 mmol) Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-2’desoxyguanosin 89 eingesetzt. B D A N2- HN DMTrO N 8 O 3' 5 2' 61 NH 2 9N 5' 4' O 7 4 N 3 N α N(Me)2 1' OH 99 196 Experimentalteil Reaktionszeit: 5 h. - Ausbeute: 675 mg (0.92 mmol, 81%) eines farblosen Feststoff. DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.35. - Smp.: 165 °C. - [α]20546: - 9.7 ° (c = 0.69, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.27 (s, 1H, NH), 8.56 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 8.23 (s, 1H, Hα), 7.56 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 7.13-7.28 (m, 8H, DMTr-H), 7.06 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(C)), 6.68-6.77 (m, 5H, DMTr-H), 6.42 (dd, 3 JHH = 7.7 Hz, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H1’), 5.34 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.48-4.41 (m, 1H, H3’), 3.90-3.81 (m, 1H, H5a’), 3.72-3.66 (m, 2H, H4’, H5b’), 3.67 (s, 6H, DMTrCH3), 3.21-3.15 (m, 1H, H2a’), 2.99, 2.96 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.24 (s, 3H, CH3), 2.19 (ddd, 3JHH = 12.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.9, 157.8, 157.0 (Cα), 156.6 (C2), 155.1 (C6), 148.1 (C8), 144.9 (C(D)), 138.7 (C(A)), 135.5, 129.6, 129.5, 129.3 (C4), 128.9 (C(B)), 127.6, 126.5, 117.4 (C(C)), 116.8 (C5), 112.9, 85.4 (C1’), 82.3 (C4’), 70.6 (C3’), 64.0 (C5’), 54.9 (OCH3), 37.5 (C2’), 34.5 (Me-Formamidin), 20.3 (CH3-Toluidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3361, 2927, 1674, 1628, 1527, 1342, 1247, 827. - MS (FAB, m/z): ber.: 729.3275, gef.: 730.3353 (M+H+). Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’- desoxyguanosin 100 Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt. Es wurden 300 mg (0.68 mmol) 2 N- NC C B D A HN Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-2’desoxyguanosin 90 eingesetzt. Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 225 mg (0.30 mmol, 45%) eines gelben Feststoff. - DMTrO 8 N 5 O 3' 2' 61 NH 2 9N 5' 4' O 7 4 N 3 N α N(Me)2 1' OH DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 100 v/v): 0.4. - Smp.: 133 °C. - [α] 546: + 10.6 ° (c = 1.68, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 20 MHz, DMSO-d6): 11.36 (s, 1H, NH), 9.61 (s, 1H, Hα), 9.40 (s, 1H, NH-pCyanophenylamin), 6.71-7.80 (m, 17H, H(C) + H(B) + DMTr-H), 6.35 (dd, 3JHH = 7.7 Hz, 3JHH = 5.0 Hz, 1H, H1’), 5.35 (s, 1H, 3’-OH), 4.58-4.51 (m, 1H, H3’), 3.90-3.86 (m, 1H, H5b’), 3.75-3.72 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.68 (s, 6H, DMTr-CH3), 3.15-3.10 (m, 1H, H2a’), 2.88, 2.72 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.12-2.04 (m, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 157.2, 156.7 (C2), 155.6 (C6), 149.6, 148.2 197 Experimentalteil (C8), 145.7, 144.9 (C(D)), 143.1 (C(A)), 133.1 (C(C)), 129.7, 129.6, 129.4, 128.9, 127.7, 127.5, 126.5, 119.7 (C4), 117.2 (C(B)), 116.8 (C5), 101.4 (CN), 85.6 (C4’), 82.5 (C1’), 70.6 (C3’), 64.0 (C5’), 54.9 (CH3-DMTr), 37.5 (C2’), 34.6 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3338, 2219, 1675, 1605, 1421, 1250, 1114, 1031, 754, 583, 546. - MS (FAB, m/z): ber.: 740.3071, gef.: 741.6171 (M+H+). Synthese von N2-Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’desoxyguanosin 101 Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt. Es wurden 280 mg (0.63 mmol) N2-Formamidin- C B D A 8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-2’- HN desoxyguanosin 91 eingesetzt. DMTrO Reaktionszeit: 12 h. - Ausbeute: 383 mg (0.51 mmol, 82%) eines rosafarbenen Feststoff. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.36. Smp.: 164 °C. - [α]20546: + 10 ° (c = 1.0, CHCl3). 1 8 N 5 3 O 3' 2' 61 NH 9N 4 N 5' 4' O 7 2 N α N(Me)2 1' OH 101 H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.25 (s, 1H, NH), 8.41 (s, 1H, NH-3,5- Dimethylanilin), 8.20 (s, 1H, Hα), 8.05 (s, 1H, H(D)), 7.24-7.10 (m, 11H, DMTr-H), 6.68 (dd, 3JHH= 8.9 Hz, 3JHH= 4.6 Hz, 4H, H(B), DMTr-H), 6.29 (dd, 3JHH= 5.1 Hz, 3JHH= 2.6 Hz, 1H, H1’), 5.28 (d, 3JHH= 4.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.52 (dd, 3JHH= 5.7 Hz, 3JHH= 6.2 Hz, 1H, H3’), 3.86-3.82 (m, 2H, H5’a, H4´), 3.64 (d, 3JHH= 1.1 Hz, 6H, DMTr-CH3), 3.12 (d, 3 JHH= 5.2 Hz, 1H, H5´b), 2.94 (d, 3JHH= 8.9 Hz, 6H, Me-Formamidin), 2.18 (s, 7H, Me- aromat., H2’a), 1.99-1.86 (m, 1H, H2’b) – 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.3 (Cα), 159.2, 159.1 (C6), 158.6, 158.4 (C2), 156.3, 152.3, 149.5, 148.0, 146.6, (C8), 146.3 (C4), 136.1 (C5), 130.6 (C(D)), 128.8 (C(B)), 118.9 (C(C)), 117.8 (C(A)), 113.7 (DMTr-CH3), 113.6 (DMTr-CH3), 85.9 (C4´), 85.3 (C3´), 80.0 (C1´), 64.4 (C5´), 54.9 (Me-Formamidin), 34.9 (C2´). 24.7, 20.0 (Me-aromat.) - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3366, 2921, 1675, 1629, 1560, 1342, 1249, 1113, 1032, 830. 198 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 102 Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt. Es wurden 182 mg (0.37 H G N2- mmol) E F Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-2’-desoxy- C D B DMTrO Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 247 mg (0.31 5' Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.4. - NH 2 2' α N(Me)2 N 3 O 3' 61 9N 4 N 4' mmol, 84%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf- 5 N 8 HN guanosin 92 eingesetzt. O 7 A 1' OH 102 Smp.: 120 °C. - [α]20546: - 15.4 ° (c= 0.5, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.29 (s, 1H, NH), 8.81 (s, 1H, NH4-Aminobiphenyl), 8.24 (s, 1H, Hα), 6.70-7.65 (m, 22H, DMTr-H, H(B) + H(C) + H(F) + H(G) + H(H)), 6.39 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H1’), 5.34 (s, 1H, 3’-OH), 4.60 (ddd, 1H, H3’), 3.91 (dd, 3JHH = 2.1 Hz, 1H, H5a’), 3.71-3.65 (m, 3H, H4’ + H5b’ + H2a’), 3.67 (s, 6H, DMTr-CH3), 3.00, 2.98 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.22 (ddd, 3 JHH = 5.1 Hz, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.7 (Cα), 156.7 (C2), 156.0 (C6), 149.7 (C(A)), 148.3 (C8), 140.4 (C(D)), 140.1 (C(E)), 139.9, 135.8, 135.7, 132.7 (C5 + C4), 132.6, 129.7, 129.6, 129.0 (C(F)), 128.9, 127.8, 127.4, 126.9 (C(B)), 126.8 (C(C), 126.2 (C(G)), 115.8 (C(H)), 87.4 (C1’), 83.0 (C4’), 71.3 (C3’), 61.4 (C5’), 55.4 (O-CH3), 38.6 (C2’), 34.8 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3380, 2931, 1672, 1628, 1527, 1343, 1249. - MS (FAB, m/z): ber.: 791,3431, gef.: 792.3535 (M+H+). Synthese von N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 103 I J H K Die Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt. Es wurden 200 mg (0.39 mmol) N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)- 2’ desoxyguanosin 93 eingesetzt. L G C M B D E HN F 8 N O 3' 5 2' 61 NH α 2 9N DMTrO 5' 4' O 7 A 4 N 3 N N(Me)2 1' OH 103 199 Experimentalteil Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 247 mg (0.30 mmol, 78%) eines lachsfarbenen Feststoff. - DC: Rf-Wert (Dichlor-methan/Methanol 9:1 v/v): 0.31. - Smp.: 180 °C. [α]20546: - 11 ° (c = 0.3, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.32 (s, 1H, NH), 8.79 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 8.25 (s, 1H, Hα), 8.03 (d, 4JHH = 1.3 Hz, 1H, H(E)), 7.76-7.70 (m, 2H, H(B) + H(L)), 7.56 (dd, 3JHH = 8.4 Hz, 4JHH = 2.0 Hz, 1H, H(F)), 6.65-7.53 (m, 16H, H(I) + H(J) + H(K) + DMTr-H), 6.40 (dd, 3JHH = 5.1 Hz, 3JHH = 7.7 Hz, 1H, H1’), 5.35 (d, 3JHH = 3.6 Hz, 1H, 3’-OH), 4.59-4.51 (m, 1H, H3’), 3.91-3.84 (m, 1H, H5a’), 3.88 (s, 2H, CH2-AF), 3.67-3.62 (m, 8H, H5b’, H4’ + DMTr-CH3), 3.183.09 (m, 1H, H2a’), 3.00, 2.98 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.22-2.18 (m, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.9, 157.8 (Cα), 157.0, 156.7 (C(A)), 155.9 (C2), 152.8 (C6), 148.2 (C8), 145.0 (C(D)), 143.8 (C(M)), 142.4 (C(H)), 141.4 (C(C)), 140.0 (C(E)), 135.6, 134.9 (C4), 133.9, 129.6, 129.5, 126.7 (C(F)), 126.5, 125.5 (C(B)), 124.9 (C(K)), 120.1 (C(I)), 119.0 (C(J)), 116.9 (C5), 116.2 (C(L)), 113.6 (C(F)), 112.9, 85.5 (C4’), 82.5 (C1’), 70.6 (C3’), 64.1 (C(G) + C5’), 54.9 (O-CH3), 36.5 (C2’), 34.5 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3354, 2928, 1674, 1628, 1455, 1424, 1342, 1175, 1031, 827, 765, 701. - MS (FAB, m/z): ber.: 803.3431, gef.: 804.3483 (M+H+). Synthese des Phosphitylierungsreagenz Bis-N,N´-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)phosphit 107 Unter Schlenkbedingungen wurden 12.9 mL (147 mmol) Phosphortrichlorid 104 mit 12.2 mL abs. Pyridin und 30 mL N Diethylether versetzt. Nach Kühlung mit einem Stickstoff/AcetonKältebad auf -78 °C wurden 10.4 mL (153 mmol) P N O α β CN 107 3-Hydroxypropionsäurenitril 105 innerhalb von 1.5 h dazugetropft. Nach langsamem Aufwärmen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung für 16 h gerührt. Das entstandene Pyridiniumhydrochlorid unter Schlenkbedingungen filtriert und mit abs. Diethylether gewaschen. Zum Filtrat wurde nach Aufnahme in 150 mL abs. Diethylether bei -10 °C innerhalb von einer Stunde 130 mL (925 mmol) Diisopropylamin hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde erneut für 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Diisopropylammoniumhydrochorid wurde über eine Schlenkfritte filtriert und wiederum mit Diethylether gewaschen. 200 Experimentalteil Anschließend wurde das Filtrat im Ölpumpenvakuum eingeengt. Das erhaltende Rohprodukt wurde unter Zugabe von 297 mg (7.06 mmol) Calciumhydrid im Vakuum destilliert. Die Übergangstemperatur des Produkts betrug 190 – 200 °C. Ausbeute: 18.4 g (61.0 mmol, 41%) einer farblosen Flüssigkeit. 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 3.51-3.42 (m, 4 H, iPr-H), 3.41-3.35 (m, 2H, H-α), 1.85-1.81 (m, 2H, H-β), 1.20-1.25 (m, 24 H, iPr-CH3). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 118.0 (CN), 60.2 (C-α), 45.3 (iPr-CH), 27.1 (iPr-CH3), 23.9 (iPrCH3), 19.8 (C-β). - 31P-NMR: δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 122.15. – IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 3332, 2952, 2929, 1633, 1605, 1565, 1414, 1256, 835. MS (FAB, m/z): ber.: 301.283, gef.: 301 [M]. Synthese von N2-Formamidin-8-N-(phenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’- diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 108 Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt. C D B 2 Es wurden 20.0 mg (0.02 mmol) N -Formamidin-8N-(phenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’desoxyguanosin 97 eingesetzt. A HN DMTrO Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 14 mg (0.01 mmol, 61%) eines farblosen Feststoffs als Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im Verhältnis 1:1. - α' NC β' O 8 N 2' N 61 NH 3 O O P 5 9N 4 N 5' 4' O 7 2 N α N(Me)2 1' 108 DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.49. - Smp.: 136 °C. -[α]20546: + 7 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 11.29 (s, 2H, NH (I+II)), 8.36 (s, 1H, Hα (I)), 8.23 (s, 1H, Hα (II)), 7.62-6.62 (m, 38H, DMTr-H (I+II) + Anilin-H (I+II), NH-Anilin (I+II)), 6.41 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.31 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.88-4.86 (m, 1H, H3’ (I)), 4.85-4.82 (m, 1H, H3’ (II)), 4.37-4.33 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.56-3.30 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.77-2.66 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.58-2.50 (m, 2H, H2b’ (I) + β’Ha (I)), 2.23 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 1.85 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 1.15-0.96 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 178.7, 159.3, 159.2, 158.2, 147.6, 147.5, 145.3, 145.3, 136.3, 133.2, 130.9, 130.8, 130.7, 130.6, 130.5, 129.3, 128.8, 128.7, 128.6, 128.4, 118.4, 118.2, 114.6, 113.7, 113.6, 87.1, 86.6, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 58.7, 58.6, 58.5, 58.5, 55.1, 54.9, 54.8, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 38.6, 201 Experimentalteil 31 38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3. - P-NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 148.03, 148.21. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3385, 2964, 2930, 1628, 1527, 1509, 1344, 1250, 1032, 978. - UV: λMax [nm] MeCN: 345, 256. - MS (ESI, m/z): ber.: 915.4197, gef.: 938.4091 (M+Na+). Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)- (N,N’-diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 109 Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt. O 2 Es wurden 20.0 mg (0.02 mmol) N -Formamidin- C D B A 8-N-(4-methoxyphenylamino)-O-5’DMTrO Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 14.0 mg (0.01 Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im Rf-Wert α' NC β' O N 5 O 2' O P N 61 NH 2 9N 5' 4' mmol, 61%) eines farblosen Feststoffs als Verhältnis 1:2. - DC: 8 HN dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 98 eingesetzt. O 7 4 N 3 N α N(Me)2 1' 109 (Dichlor- methan/Methanol 9:1 v/v): 0.52. - Smp.: 122 °C. - [α]20546: + 15 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1HNMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 10.99 (s, 2H, NH (I+II)), 8.35 (s, 1H, Hα (I)), 8.31 (s, 1H, Hα (II)), 7.68 (s, 1H, NH-p-Anisidin (I)), 7.66 (s, 1H, NH-p-Anisidin (II)), 7.596.71 (m, 34H, DMTr-H (I+II) + ANIS-H (I+II)), 6.44 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.37 (dd, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.92-4.89 (m, 1H, H3’ (I)), 4.85-4.81 (m, 1H, H3’ (II)), 4.36-4.28 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.64-3.16 (m, 44H, DMTrCH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Anis-CH3 (I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.80-2.76 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.54-2.50 (m, 2H, H2b’ (I) + β’Ha (I)), 2.20 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 1.89 (dd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, β’Ha (II)), 1.831.80 (m, 1H, β’Hb (II)), 1.24-1.10 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 178.7, 159.3, 159.2, 158.3, 155.5, 155.4, 147.6, 147.5, 145.3, 145.3, 136.1, 136.0, 136.0, 135.9, 133.9, 133.8, 130.7, 130.6, 130.6, 130.5, 128.8, 128.7, 128.6, 128.3, 128.2, 128.0, 127.2, 127.2, 120.4, 120.3, 118.9, 118.8, 118.2, 114.6, 113.6, 113.6, 87.1, 86.6, 86.5, 86.4, 86.3, 86.2, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 58.8, 58.6, 58.6, 58.5, 55.2, 54.9, 54.9, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 38.6, 38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3. - 31 P-NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 147.34, 148.63. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3411, 2965, 2360, 1628, 1527, 1510, 202 Experimentalteil 1344, 1247, 1114. - UV: λMax [nm] MeCN: 331, 258, 224. - MS (ESI, m/z): ber.: 945.4302, gef.: 968.4191 (M+Na+). Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)- (N,N’-diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 110 Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt. C D B Es wurden 50.3 mg (0.05 mmol) N2-Formamidin- A HN 8-N-(4-methylphenylamino)-O-5’-dimethoxytritylDMTrO 2’-desoxyguanosin 99 eingesetzt. Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 43.1 mg (0.03 mmol, 68%) eines farblosen Feststoffs als Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im Verhältnis 1:1. - DC: Rf-Wert α' NC β' O 8 N 2' N 61 NH 3 O O P 5 9N 4 N 5' 4' O 7 2 α N N(Me)2 1' 110 (Dichlor- methan/Methanol 9:1 v/v): 0.50. - Smp.: 111 °C. - [α]20546: - 21 ° (c = 0.07, CHCl3). 1 H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 12.04 (s, 2H, NH (I+II)), 8.47 (s, 1H, Hα (I)), 8.42 (s, 1H, Hα (II)), 6.66-8.00 (m, 36H, DMTr-H (I+II) + Tol-H (I+II)), 6.43 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.39 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 5.00-4.96 (m, 1H, H3’ (I)), 4.94-4.90 (m, 1H, H3’ (II)), 4.33-4.28 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.32-3.51 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.85-2.79 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.54-2.48 (m, 8H, H2b’ (I) + β’Ha (I) + Tol-CH3), 2.05 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 1.81 (dd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, β’Ha (II)), 1.72-1.68 (m, 1H, β’Hb (II)), 1.15-1.10 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13 C- NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.2, 158.3, 155.5, 155.4, 148.1, 147.1, 145.3, 145.3, 136.1,135.9, 133.9, 133.8, 130.6, 130.5, 129.7, 128.8, 127.2, 127.2, 120.4, 120.3, 118.9, 118.8, 117.3, 116.1, 114.6, 113.6, 113.6, 87.1, 86.9, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 54.9, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 40.7, 38.6, 38.4, 36.3, 30.2, 24.6, 20.8, 19.6. - 31P-NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 148.93, 148.87. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3853, 3744, 3675, 2927, 2219, 1669, 1628, 1528, 1249, 1115. - UV: λMax [nm] MeCN: 330, 297. - MS (ESI, m/z): ber.: 929.4353, gef.: 952.4256 (M+Na+). 203 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’diisopropyl-amino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 111 Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt. Es wurden 300 mg (0.40 mmol) NC C B D N2- A HN Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)- O - 5’di-methoxytrityl-2’-desoxyguanosin 100 DMTrO eingesetzt. Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 175 mg (0.19 mmol, 47%) eines gelben Feststoff als α' β' N 5 O 3' NC 8 O 2' O P 61 NH 2 9N 5' 4' O 7 4 N 3 N α N(Me)2 1' N 111 Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im Verhältnis 2:1. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 19:1 v/v): 0.2. - Smp.: 104 °C. [α]20546: + 10 ° (c = 0.12, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 10.59 (s, 2H, NH (I+II)), 8.68 (s, 1H, Hα (I)), 8.51 (s, 1H, Hα (II)), 7.87 (s, 2H, NH-pCyanophenylamin (I+II)), 6.70-7.60 (m, 34H, H(C) + H(B) + DMTr-H), 6.51-6.49 (m, 1H, H1’ (II)), 6.44-6.40 (m, 1H, H1’ (I)), 5.01-4.98 (m, 1H, H3’ (II)), 4.59-4.54 (m, 1H, H3’ (I)), 4.26-4.22 (m, 1H, H4’ (II)), 4.20-18 (m, 1H, H4’ (I)), 3.67-3.29 (m, 24H, DMTrCH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II)), 3.06-3.01 (m, 1H, H2a’ (II)), 2.87-2.84 (m, 1H, H2a’ (I)), 2.72, 2.48 (2x s, 2x 6H, Me-Formamidin), 2.04-1.99 (m, 2H, H2b’ (I+II)), 1.81-1.89 (m, 4H, β’Ha (I+II) + β’Hb (I+II)), 0.99-1.01 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.5, 159.3, 158.8, 155.2, 155.1, 147.8, 147.7, 145.4, 145.4, 136.2, 136.1, 136.0, 135.9, 134.3, 134.1, 131.0, 130.9, 130.9, 130.5, 129.4, 129.3, 128.6, 128.5, 128.4, 128.1, 127.5, 127.4, 120.4, 120.3, 119.1, 119.0, 118.2, 116.4, 114.8, 114.7, 101.3, 101.1, 87.0, 86.8, 86.7, 86.3, 86.2, 86.1, 85.4, 74.8, 74.6, 73.9, 73.6, 64.0, 64.0, 58.9, 58.6, 58.5, 58.3, 55.0, 54.8, 54.7, 43.4, 43.4, 43.2, 43.2, 38.4, 38.2, 37.5, 30.0, 24.7, 24.6, 24.3, 20.4, 20.3, 20.1. - 31 P- NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 150.79, 148.83. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3412, 2964, 2929, 1629, 1528, 1346, 1252, 1177, 1033, 702. - UV: λMax [nm] MeCN: 330, 271, 243. - MS (FAB, m/z): ber.: 940.4149, gef.: 941.42 (M+H+). 204 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)(N,N’-diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 112 Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt. Es wurden 100 mg (0.22 mmol) DC B 2 N- A Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-O5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 101 HN mmol, 97%) eines farblosen Feststoffs als Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im α' NC β' O N 5 2' O P 61 NH N α 2 N 3 O 4' Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 122 mg (0.12 8 9N 4 N DMTrO 5' eingesetzt. O 7 N(Me)2 1' 112 Verhältnis 1:1. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan /Methanol 9:1 v/v): 0.58. - Smp.: 124 °C. - [α]20546: - 28 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 11. 61 (s, 1H, NH (I)), 11.43 (s, 1H, NH (II)), 8.51 (s, 1H, NH-Dimethylanilin (I)), 8.43 (s, 1H, NH3,5-Dimethylanilin (II)), 6.54-7.65 (m, 36H, DMTr-H (I+II) + H-3,5-Dimethylanilin (I+II), Hα (I+II)), 6.46 (dd, 3JHH = 5.5 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.36 (dd, 3JHH = 6.2 Hz, 3 JHH = 6.2 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.96-5.02 (m, 1H, H3’ (I)), 4.79-4.85 (m, 1H, H3’ (II)), 4.33- 4.37 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.33-3.74 (m, 26H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II)), 2.59-2.79 (m, 13H, H2b’ (II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.29-2.46 (m, 3H, H2b’ (I) + β’Ha (I) + β’Hb (I)), 2.16, 2.18 (2xs, 2x 6H, DimethylanilinCH3 (I+II)), 1.89-1.94 (m, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 0.91-1.16 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.3, 159.2, 158.4, 158.0, 156.2, 146.1, 145.4, 145.3, 140.9, 140.7, 138.7, 138.6, 136.1, 116.5, 116.4, 113.7, 87.1, 86.8, 85.0, 84.8, 78.6, 78.7, 73.9, 73.1, 63.6, 62.9, 59.1, 57.2, 56.8, 54.9, 43.7, 43.6, 43.5, 41.1, 39.8, 34.8, 34.7, 24.7, 24.6, 24.5, 21.6, 21.5, 21.4, 20.6, 20.2, 20.1, 16. - 31 P-NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 149.3, 148.7. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3411, 2965, 1686, 1629, 1528, 1341, 1250, 1103. - MS (ESI, m/z): ber.: 943.4510, gef.: 965.7158 (M+Na+). 205 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’- diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 113 Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt. Es wurden 45 mg (0.05 mmol) N2-Formamidin-8- H G F E C D B N-(4-aminobiphenyl)-O-5’-dimethoxytrityl-2’- desoxyguanosin 102 eingesetzt. Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 30 mg (0.03 A HN DMTrO mmol, 60%) eines gelben Feststoffs als Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im Verhältnis 1:1. - N α' O O P 61 NH 2' N α 2 N 3 O 3' NC β' 8 5 9N 4 N 5' 4' O 7 N(Me)2 1' 113 DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.45. - Smp.: 64 °C. - [α]20546: + 13 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 12.23 (s, 2H, NH (I+II)), 8.36 (s, 1H, Hα (I)), 8.34 (s, 1H, Hα (II)), 7.96 (s, 2H, NH-4-Aminobiphenyl (I+II)), 7.52-6.67 (m, 44H, DMTr-H (I+II) + 4-AminobiphenylH (I+II)), 6.34 (dd, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.29 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3 JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 5.00-4.91 (m, 2H, H3’ (I+II)), 4.29-4.20 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.64-3.29 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.80-2.75 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.37-2.31 (m, 3H, H2b’ (I) + β’Ha (I) + β’Hb (I)), 1.81-1.73 (m, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 0.99-0.96 (m, 24H, iPrCH3 (I+II)). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 177.3, 158.2, 158.1, 157.3, 154.6, 154.2, 146.6, 146.5, 144.3, 144.2, 136.1, 136.0, 136.0, 135.9, 133.9, 133.8, 130.7, 130.6, 130.6, 130.5, 128.8, 128.7, 128.6, 128.3, 128.2, 128.0, 127.2, 127.2, 120.4, 120.3, 118.9, 118.8, 118.2, 114.6, 113.6, 113.6, 87.1, 86.6, 86.5, 86.4, 86.3, 86.2, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 58.8, 58.6, 58.6, 58.5, 55.2, 46.6, 46.6, 46.5, 46.5, 38.6, 38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 19.6, 19.5, 19.3. - 31 P-NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 149.04, 149.01. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3422, 2926, 1629, 1529, 1384, 1249, 1103. - UV: λMax [nm] MeCN: 330,296, 251, 226. - MS (ESI, m/z): ber.: 991.4510,gef.: 1014.4410 (M+Na+). 206 Experimentalteil Synthese von N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’- diisopropyl-amino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 114 Die Reaktion wurde nach AAV 6 durchgeführt. Es wurden I J 50 mg (0.06 mmol) N- G H K 2 L C M Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)- O - 5’- B D A E HN F dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 103 einDMTrO gesetzt. Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 66 mg (0.06 mmol, 100%) eines farblosen Feststoffs (zwei Diastereomere I + II). - DC: Rf-Wert α' β' N 5 O 3' NC 8 O 2' O P 61 NH α 2 9N 5' 4' O 7 4 N 3 N N(Me)2 1' 114 N (Dichlor-methan/Methanol 9:1 v/v): 0.46. Smp.: 112 °C. - [α]20546:+ 3 ° (c = 0.21, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzold6): 11.05 (s, 2 H, NH (I+II)), 8.39 (2 x s, 2 H, NH-Aminofluoren (I+II)), 8.10 (s, 1 H, Hα(I)), 8.08 (s, 1 H, Hα(II)), 8.02 (m, 2 H, H(E)(I+II)), 7.76-7.70 (m, 4H, H(F)(I+II) + H(B)(I+II)), 7.62-7.36 (m, 26 H, DMTr(I+II)), 7.28 (d, 3JHH =7,3 Hz, 2H, H(L)(I+II)), 7.21-7.15 (m, 2H, H(I)(I+II)), 7.03-7.01 (m, 4H, H(J)(I+II) + H(K)(I+II)), 6.59 (dd, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H1´(I)), 6.53 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1´(II)), 5.01-4.98 (m, 1H, H3´(I)), 4.91-4.88 (m, 1H, H3´(II)), 4.39 (m, 2H, H4´(I+II)), 3.70 (m, 10 H, H(G)(I+II), H3´(I+II), H5a´(I+II), H5b´(I+II)), 3.33-3.18 (m, 12H, DMTr-CH3(I+II)), 2.63-2.51 (m, 14H, N(Me)2(I+II), H2a´(I+II)), 1.89 (ddd, 3JHH = 5.6 Hz, 3JHH = 11.5 Hz, 2H H2b´(I+II)), 1.12 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 12H, Hα’ (I+II), Hβ’ (I+II), iPr-H(I+II)), 1.06 (d, 3JHH = 6.7 Hz, 6H, iPr-CH3(I)), 0.93 (d, 3JHH = 6.7 Hz, 6H, iPr-CH3(II)). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 160.7, 159.2, 158,2, 157.9, 156.1, 155.7, 149.3, 143.4, 136.1, 135.8, 130.6, 128.8, 128.6, 128.5, 128.3, 128.0, 127.8, 113.6, 54.9, 43.6, 34.7, 24.7, 24.6, 21.2, 20.5, 20.1, 8.4. - 31 P-NMR: δ [ppm] (202 MHz, Benzol-d6): 162.0, 161.78. -IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3377, 2966, 2930, 2836, 2760, 2722, 1681, 1607, 1575, 1457, 1427, 1344, 1301, 1251, 1178, 1154, 1115, 1076, 1033, 978, 829, 767, 732, 703. UV: λMax [nm] MeCN: 336. - MS (FAB, m/z): ber.: 1003.4823, gef.: 1026.4440 (M+Na+). 207 Experimentalteil Synthese von 3´,5´-Bis-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2´-dG 121 Unter Stickstoffatmosphäre wurden 18.09 g O (67.67 mmol) 2´-dG*H2O 52 zweimal mit jeweils 7 20 mL abs. Pyridin coevaporiert. Anschließend wurden 90 mL abs. Pyridin, 65.0 mL (173 mmol) TBDMSO TBDMS-Cl (50%ig in Toluol) und 17.1 g (249 4´ mmol) Imidazol hinzugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte N 5 9N 4 6 8 5´ 1 NH 2 N3 NH2 O 1´ 3´ 2´ OTBDMS 121 mit Hilfe der DC (DCM/MeOH 9:1). Nach Zugabe von MeOH und Toluol und Entfernen des Lösungsmittels erfolgte eine säulenchromatographische Reinigung (DCM/MeOH: 3% → 18%). Ausbeute: 32.8 g (66.3 mmol, 98%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert (DCM/MeOH 9:1): 0.31. - Smp.: 261 °C. - [α]20546: -17.6 ° (c= 1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.51 (s, 1H, NH), 7.77 (s, 1H, H8), 6.38 (s, 2H, NH2), 6.02 (dd, 3JH,H= 6.1 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 1H, H1´), 4.40 (ddd, 3JH,H= 3.0 Hz, 3JH,H= 3.0 Hz, 3JH,H= 5.6 Hz, 1H, H3´), 3.72-3.69 (m, 1H, H4´), 3.61 (dddd, 2JH,H= 15.6 Hz, 2JH,H= 11.0 Hz, 3JH,H= 5.2 Hz, 2H, H5´a, H5´b), 2.57-2.50 (m, 1H, H2´a), 2.16 (ddd, 2JH,H= 13.2 Hz, 3JH,H= 6.0 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H2´b), 0.80 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.77 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.06, -0.07 (2 * s, 2 * 3H, Si(CH3)2) 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.7 (C6), 153.7 (C2), 135.1 (C8), 133.5 (C4), 130.6 (C5), 87.0 (C4´), 82.1 (C3´), 72.1 (C1´), 62.8 (C5´), 36.6 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 22.3 (SiC(CH3)3), 18.2 (SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.0 (SiC(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 1830, 1280, 1208, 1005, 987, 968, 713, 694, 620, 572, 498. - MS (FAB, m/z): ber.: 495.2697, gef.: 496.2789 [M+H]+. 208 Experimentalteil Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 Unter Schlenkbedingungen wurden 5.00 g (10.3 mmol) d c 3´,5´-Bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-dG 121 mit 5.32 g a (20.1 mmol) Triphenylphosphin versetzt und 15 Minuten O 7 N unter Vakuum gerührt. Nach Zugabe von 175 mL abs. 1,4-Dioxan, 2.1 mL (20.16 mmol) destilliertem Benzylalkohol und 3.4 mL (20.16 mmol) DIAD wurde die Reaktionsmischung 1.5 h bei RT gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde der gelbe, ölige Rückstand in e b 5 6 1 N 8 9 TBDMSO 5´ N 2 4 N 3 NH2 O 1´ 4´ 3´ 2´ OTBDMS 40 60 mL Diethylether aufgenommen und 1 h bei -20 °C aufbewahrt. Der so entstandene Niederschlag wurde filtriert und mit kaltem Ether gewaschen. Nach Einengen des Filtrats konnte die weitere Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 10% → 30%) erfolgen. Ausbeute: 4.00 g (6.83 mmol, 68%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.84. - Smp.: 69.2 °C. - [α]20546: -1.5° (c= 1, CHCl3). 1 H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.05 (s, 1H, H8), 7.51-7.49 (m, 2H, Hc), 7.42- 7.37 (m, 2H, Hd), 7.37-7.33 (m, 1H, He), 6.48 (s, 2H, H2a), 6.21 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3 JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 5.5 (s, 2H, Ha), 4.52 (dd, 3JH,H= 7.1 Hz, 3JH,H= 5.4 Hz, 3JH,H= 2.8 Hz, 1H, H3´), 3.82 (ddd, 3JH,H= 4.3 Hz, 3JH,H= 3.7 Hz, 3JH,H= 3.7 Hz, 1H, H4´), 3.72 (dd, 2JH,H= 11.0 Hz, 3JH,H= 5.8 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H5´a), 3.65 (dd, 2JH,H= 12.9 Hz, 3 JH,H= 5.8 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H5´b), 2.73 (ddd, 2JH,H= 13.2 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 3JH,H= 5.8 Hz,1H, H2´a), 2.26 (ddd, 2JH,H= 12.9 Hz, 3JH,H= 5.8 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H2´b), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.86 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.11 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.03, 0.02 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO- d6): 160.0 (C6), 159.7 (C2), 137.4 (C8), 136.5 (Cb), 128.3 (Cc), 128.2 (Cd), 128.0 (Ce), 122.9 (C4), 113.0 (C5), 86.8 (C4´), 82.2 (C3´), 71.5 (C1´), 66.7 (Ca), 62.9 (C5´), 59.5 (C2´), 25.5 (2 x SiC(CH3)3), 21.7 (Si(CH3)2), 20.7 (Si(CH3)2), 13.9 (2 x SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3396, 2770, 2711, 1876, 1755, 1705, 1674, 1614, 1574, 1557, 1548, 1486, 1463, 1416, 1005, 985, 919, 619, 508. - MS (FAB, m/z): ber.: 585.3167, gef.: 586.3253 [M+H]+. 209 Experimentalteil Darstellung von Nitrosobenzol 120 Es wurden 2.79 g (30.0 mmol) Anilin 1 in 9 mL MeOH gelöst und mit 16.5 NO mL (120 mmol) 30% H2O2 und 13.5 mL H2O versetzt. Anschließend erfolgte 1 2 (IV) die Zugabe von 432 mg (3.0 mmol) Mo O3 und 3 mL 1 mM KOH-Lösung. 3 4 Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Zugabe von 120 45 mL H2O wurde der braune Niederschlag filtriert, zweimal mit jeweils 30 mL H2O und anschließend 15 mL kaltem MeOH gewaschen. Der Niederschlag wurde aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 420 mg (3.93 mmol, 13%) brauner Kristalle. – DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.93. – Tm: 60.4 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 7.94 (dd, 3JH,H= 8.4 Hz, 4JH,H= 1.3 Hz, 2H, H2), 7.88 (tt, 3JH,H= 7.6 Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, 1H, H4), 7.75 (dt, 3JH,H= 7.6 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 2H, H3). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 166.1 (C1), 136.6 (C3), 129.7 (C4), 120.6 (C2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3091, 3059, 1990, 1706, 1456, 1295, 1255, 1126, 923, 714. - MS (EI, m/z): ber.: 107.0371, gef.: 107 [M]. Versuch zur Darstellung von N2-Aza-anilino-2´-dG 119 Es wurden 41.0 mg (0.38 mmol) Nitrosobenzol 120 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL Essigsäure gelöst und auf 40 °C geheizt. Anschließend langsam hinzugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 26 h bei 40 °C gerührt. Unter Eiskühlung wurde die N 5 N 9 4 6 1 NH 8 wurde eine Lösung von 100 mg (0.35 mmol) 2´- HO dG·H2O 52 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL 4´ Essigsäure O 7 5´ 2 N 3 N O N c´ b´ d´ e´ 1´ 3´ OH 2´ 119 Reaktionslösung mit halb konz. NaOH-Lösung alkalisch gemacht und mit Ether dreimal extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit H2O gewaschen. Die Reaktionskontrolle erfolgte dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 2:1). Es konnten nur Zersetzungsprodukte erhalten werden. 210 Experimentalteil Versuch zur Darstellung von 3´,5´-Bis(TBDMS)-N2-aza-anilino-2´-dG 119 Es wurden 50.0 mg (0.40 mmol) O 7 Nitrosobenzol 120 in 3.5 mL Ethanol und hinzugetropft. 5´ N 4 1 NH N N 2 3 N b´ c´ d´ O 4´ e´ 1´ 3´ 2´-dG 121 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL langsam 9 TBDMSO von 200 mg (0.40 mmol) 3´,5´-Bis(TBDMS)Essigsäure 5 8 3.5 mL Essigsäure gelöst und auf 40 °C geheizt. Anschließend wurde eine Lösung N 6 2´ OTBDMS Die 119 Reaktionsmischung wurde 26 h bei 40 °C gerührt. Unter Eiskühlung wurde die Reaktionslösung mit halb konz. NaOH-Lösung alkalisch gemacht und mit Ether dreimal extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit H2O gewaschen. Die Reaktionskontrolle erfolgte dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 2:1). Bei dieser Reaktion erfolgte keine Umsetzung. Das Edukt konnte reisoliert werden. Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-Bis(TBDMS)-N2-aza- anilino-2´-dG 119b Es wurden 40.0 mg (0.38 mmol) Nitrosobenzol d b gelöst und auf 40 °C geheizt. Anschließend a O wurde eine Lösung von 183 mg (0.31 mmol) O6- 7 Benzyl-3´,5´-Bis(TBDMS)-2´-dG 40 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL Essigsäure langsam hinzugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 26 h bei 40 °C gerührt. Unter Eiskühlung wurde die Reaktionslösung mit halb konz. NaOH-Lösung alkalisch gemacht und mit Ether dreimal e c 120 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL Essigsäure N 5 N 4 6 8 9 TBDMSO 5´ 4´ 1 NH N 3 2 N N b´ c´ O e´ 1´ 3´ d´ 2´ OTBDMS 119b extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit H2O gewaschen. Die Reaktionskontrolle erfolgte dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 2:1). Bei dieser Reaktion erfolgte keine Umsetzung. Das Edukt konnte reisoliert werden. 211 Experimentalteil Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-desoxyxanthosin 124 Es wurden 300 mg (0.52 mmol) O6-Benzyl-3´,5´- d c bis(TBDMS)-2´-dG 121 mit 500 mg Na2Fe(CN)5NO · 2H2O in 5 mL 1 M NaOH gegeben. a Die O 7 Reaktionsmischung wurde 4 h bei 70 °C gerührt. Nach Abkühlen der Reaktionslösung auf 25 °C wurden 10 mL H2O hinzugegeben. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure Reaktionsmischung filtriert. Das Filtrat 5 6 N 8 TBDMSO 5´ 1 N 2 9 N 4 3 O 4´ N H O 1´ 3´ auf 3.8 eingestellt. Nach Zugabe von 5 mL MeOH wurde die e b 2´ OTBDMS wurde 124 chromatographisch (PE/EE; 4:1) gereinigt. Es konnte keine Reaktion beobachtet werden. Das Edukt konnte reisoliert werden. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-desoxyxhanthosin 124 Es wurden 300 mg (0.52 mmol) O6-Benzyl-3´,5´- d c bis(TBDMS)-2´-dG 121 auf 0 °C gekühlt und mit a O 3.2 mL (2 mmol) tert-Butylnitrit versetzt. Die 7 N Reaktionsmischung wurde 5 Minuten gerührt. Nach Einengen der Reaktionslösung erfolgte die chromatographische Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 4% → 100%). Ausbeute: 27 mg (0.05 mmol, 9%) eines orange e b 5 6 8 2 9 TBDMSO 5´ 1 N N O 4´ 4 3N H O 1´ 3´ 2´ OTBDMS 124 farbenen Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.56. -[α]20546: -0.6 ° (c= 0.64, CHCl3). - Smp.: 107 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.22 (s, 1H, NH), 8.27 (s, 1H, H8), 7.43-7.31 (m, 5H, arom.-H), 6.26 (dd, 3JH,H= 6.1 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 1H, H1´), 5.54 (s, 2H, Ha), 4.59-4.54 (m, 1H, H3´), 3.86-3.83 (m, 1H, H4´), 3.60-3.49 (m, 2H, H5´a, H5´b), 2.73-2.66 (m, 1H, H2´a), 2.26 (dddd, 2JH,H= 13.2 Hz, 3 JH,H= 6.0 Hz, 3JH,H= 2.9 Hz, 1H, H2´b), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.11 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.1, 0.08 (s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.7 (C6), 154.3 (C2), 134.6 (C8), 129.7 (Cb), 128.4 (Cc), 128.1 (Cd), 128.0 (Ce), 125.5 (C4), 117.5 (C5), 88.0 (C4´), 87.4 (C3´), 48.6 (C1´), 47.7 (Ca), 45.0 (C5´), 38.2 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 22.3 (SiC(CH3)3), 18.2 212 Experimentalteil (SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.0 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBrPressling): 3302, 2983, 2930, 2857, 1740, 1648, 1593, 1444, 1403, 1374, 1359, 1242, 1103, 1047, 836, 779, 740, 482. - MS (FAB, m/z): ber.: 586.3007, gef.: 587.3085 [M+H]+. 2. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-desoxyxhanthosin 124 Es wurden 265 mg (0.451 mmol) O6-Benzyl-3´,5´- d c bis(TBDMS)-2´-dG 121 in 6.7 mL Aceton und 1.3 a mL H2O gelöst. Nach Zugabe von 0.1 mL 70% O 7 5 6 N HClO4 wurde die Reaktionslösung auf 10 °C gekühlt und mit 57 mg (0.82 mmol) NaNO2 in 2.6 mL H2O e b 1 N 8 TBDMSO tropfenweise versetzt. Nach 1 h Rühren bei 10 °C 2 9 5´ N 4 O 4´ 3 N H O 1´ 3´ 2´ OTBDMS wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der 124 Rückstand in 13 mL CH2Cl2 aufgenommen. Die wässrige Phase wurde 3 x mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Die Reinigung erfolgte am Chromatotron (DCM/MeOH; 0% → 100%). Ausbeute: 17 mg (0.03 mmol, 6%) eines orangenen Feststoffs. Analytik siehe Seite 212. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-O2-trifluormethansulfonyl-2´-dG 123 Es wurden 15 mg (0.03 mmol) O6-Benzyl-3´,5´d bis(TBDMS)-2´-desoxyxhanthosin 124 mit 12 mg c (0.12 mmol) Triethylamin und einer katalytischen a Menge DMAP in 0.3 mL DCM versetzt. Unter 0.03 mmol) methansulfonsäureanhydrid. Die TrifluorReaktions- mischung wurde 0.5 h bei 0 °C gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels konnte die O 7 N 5 N 4 6 8 Eiskühlung erfolgte die Zugabe von 5 µL (5.23 mg; e b 9 TBDMSO 5´ 4´ 3´ 2 N 3 O N1 1´ O O O S CF3 2´ OTBDMS 123 213 Experimentalteil Aufreinigung am Chromatotron erfolgen (DCM/MeOH; 0% → 100%). Ausbeute: 8.0 mg (0.01 mmol, 37%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.98. -[α]20546: -0.2 ° (c= 0.72, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.26 (s, 1H, H8), 7.42-7.34 (m, 5H, arom.-H), 6.26 (dd, 3 JH,H= 6.4 Hz, 3JH,H= 7.4 Hz, 1H, H1´), 5.54 (s, 2H, Ha), 4.59-4.54 (m, 1H, H3´), 3.86- 3.84 (m, 1H, H4´), 3.60-3.57 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.53-3.50 (m, 1H, H2´a), 2.26 (dddd, 2 JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 5.9 Hz, 3JH,H= 2.9 Hz, 1H, H2´b), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.11 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.1, 0.07 (s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.3 (C6), 153.3 (C2), 143.8 (CF3), 131.7 (C8), 130.0 (Cb), 128.4 (Cc), 128.1 (Cd), 128.0 (Ce), 125.7 (C4), 116.5 (C5), 88.0 (C4´), 81.1 (C3´), 72.5 (C1´), 67.6 (Ca), 61.2 (C5´), 32.2 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 24.8 (SiC(CH3)3), 19.2 (SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), -3.6, -5.1 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3433, 2855, 1735, 1685, 1511, 1431, 1253, 1102, 1031, 739, 481. - MS (FAB, m/z): ber.: 686.5171, gef.: 686.6 [M+H]+. 1. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 122 Es wurden 20 mg (0.03 mmol) O6-Benzyl-3´,5´- e b bis(TBDMS)-O2-trifluormethansulfonyl-2´-dG 123 a 7 Entfernen des Lösungsmittels erfolgte die Reinigung am Chromatotron (PE/EE; 9 TBDMSO 5´ 4´ 5 N 4 N1 2 N 3 O N H H N b´ c´ e´ d´ 1´ 3´ 2´ OTBDMS 10%). Ausbeute: N 6 8 Die Reaktionsmischung wurde 10 Tage bei RT Nach d O mit 20 µL Phenylhydrazin in 0.5 mL DMF versetzt. gerührt. c 122 10 mg (0.01 mmol, 53%) 20 (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.45. – [α] eines 546: gelben Öls. - DC: + 13 °(c = 1.1, CHCl3). - 1 Rf-Wert H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 9.41 (s, 1H, NH an Cb´), 8.91 (d, 3JH,H= 2.3 Hz, 1H, NH an C2), 8.09 (s, 1H, H8), 7.34-7.30 (m, 10H, arom.-H), 6.68 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, 1H, H1´), 5.45 (s, 2H, Ha), 4.49 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 5.7 Hz, 2H, H3´, H4´), 3.70-3.63 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.60-3.57 (m, 1H, H2´a), 2.26 (dddd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 3.3 Hz, 1H, H2´b), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.85 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.07 (dd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 2.5 Hz, 6H, 214 Experimentalteil Si(CH3)2), 0.02 (s, 6H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.1 (C6), 159.8 (C2), 138.6 (C8), 137.1 (Cb), 136.3 (Cb´), 128.8, 128.5, 128.3, 128.1, 128.0, 127.7, 127.0 (arom.-C), 126.1 (C4), 118.9 (C5), 87.2 (C4´), 82.8 (C3´), 72.2 (C1´), 66.9 (Ca), 62.8 (C5´), 38.4 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), 17.6 (SiC(CH3)3), -5.0, -5.5 (Si(CH3)2). - MS (FAB, m/z): ber.: 676.5953, gef.: 677.6 [M+H]+. 1. Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-brom-2´-dG 126 Es wurden 100 mg (1.70 mmol) O6-Benzyl-3´,5´- d c bis(TBDMS)-2´-dG 40 mit 0.6 mL tert-Butylnitrit und a 0.6 mL Bromoform versetzt und 30 Minuten bei O 7 90 °C refluxiert. Die Reaktionskontrolle erfolgte dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 4:1). Nach N 5 N 4 6 1 N 8 9 TBDMSO Entfernen des Lösungsmittels erfolgte die Reinigung 5´ 4´ N 2 3 Br O 1´ 3´ 2´ OTBDMS am Chromatotron (PE/EE; 10%). 126 Das Produkt konnte nicht erhalten werden. 2. e b Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-brom-2´-dG 126 d c Es wurden 352 mg (5.12 mmol) NaNO2 und 0.66 mL a (5.1 mmol) TMS-Br in 2 mL CCl4 gelöst und auf 0 °C O 7 gekühlt. Nach Zugabe von 100 mg (1.70 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 wurde die Reaktionsmischung weitere 1.5 h bei dieser Temperatur gerührt. Nach Erwärmen auf RT erfolgte die dünnschichtchromatographische Reaktions- e b N 5 N 4 6 9 TBDMSO 5´ 4´ 1 N 8 N 3 2 Br O 1´ 3´ 2´ OTBDMS 126 kontrolle (PE/EE; 4:1). Nach Entfernen des Lösungsmittels erfolgte eine weitere Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 10%). Das Produkt konnte nicht erhalten werden. 215 Experimentalteil Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-brom-2´-dG 126 Es wurden 3.00 g (4.60 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 mit 2.62 g (7.07 mmol) Antimon(III)bromid zusammen gegeben und d c auf 0 °C gekühlt. Es wurden 41 mL zuvor auch auf a 0 °C gekühltes CH2Br2 hinzugegeben. Anschließend O 7 wurde die gesamte Reaktionsmischung auf -10 °C gekühlt und mit 2.10 mL (17.6 mmol) t-Butylnitrit 9 TBDMSO 5´ 4´ Die Reaktionskontrolle N 4 6 erfolgte 1 N N 3 2 Br O 1´ 3´ gerührt. N 5 8 versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -10 °C e b 2´ OTBDMS 126 dünnschicht-chromatographisch (PE/EE; 4:1). Der Reaktionsabbruch erfolgte durch Zugabe von 8.13 g (96.8 mmol) Natriumbicarbonat in 203 mL Eis-Wasser. Der Niederschlag wurde filtriert und das Filtrat dreimal mit Dichlormethan gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels konnte die Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 5% → 10%) erfolgen. Ausbeute: 1.21 g (1.86 mmol, 40%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.88. - [α]20546: + 3.1 ° (c= 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.53 (s, 1H, H8), 7.53-7.51 (m, 2H, Hc), 7.44-7.38 (m, 3H, Hd, He), 6.33 (dd, 3JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 1H, H1´), 5.60 (s, 2H, Ha), 4.82-4.76 (m, 1H, H3´), 3.87-3.78 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.65 (dd, 2JH,H= 11.0 Hz, 3 JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 4.2 Hz, 1H, H5´b), 2.92 (ddd, 3JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 8.9 Hz, 2 3 3 JH,H= 3 4.5 Hz, 1H, H2´b), 2.37 (ddd, JH,H= 9.3 Hz, JH,H= 6.9 Hz, JH,H= 1.8 Hz, 1H, H2´b), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.13 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.00, -0.01 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO- d6): 159.0 (C6), 152.6 (C2), 143.4 (C8), 138.6 (Cb), 128.6 (Cc), 128.4 (Cd), 128.1 (Ce), 117.7 (C4), 110.6 (C5), 87.0 (C4´), 84.0 (C1´), 71.4 (C3´), 69.0 (Ca), 62.1 (C5´), 38.1 (C2´), 25.5 (2 x SiC(CH3)3), 21.7 (Si(CH3)2), 20.7 (Si(CH3)2), 13.9 (2 x SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3629.90, 3448.12, 2928.88, 2856.67, 1735.58, 1701.46, 1654.92, 1594.63, 1566.17, 1459.15, 1313.12, 836.83. - MS (FAB, m/z): ber.: 648.2163, gef.: 649.2281 [M+H]+. 216 Experimentalteil 2. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 122 Die Synthese wurde nach AAV 7 mit 782 mg (1.25 mmol) d c 6 O -Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2a brom-2´-dG 126 durchgeführt. O 7 Ausbeute: 707 mg (1.04 mol, 83%) eines N 5 N 4 6 1 N 8 orange farbenen Feststoffs. e b 9 TBDMSO Analytik siehe Seite 214. 5´ 4´ 2 N N H 3 O H N b´ c´ d´ e´ 1´ 3´ 2´ OTBDMS 122 Synthese von 3´,5´-Bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 118 Unter Wasserstoffatmosphäre wurden 210 mg (0.32 mmol) 6 O -Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N- phenylhydrazino-2´-dG 122 mit einer Spatelspitze Pd/C und in 8 mL abs. Methanol versetzt und 5 h bei RT gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte dünnschicht-chromatographisch O 7 N 5 N 9 4 6 1 NH 8 TBDMSO 5´ 4´ 3´ O 2 N3 N H H N c´ b´ d´ e´ 1´ 2´ OTBDMS (DCM/MeOH; 118 9:1). Der Katalysator wurde mittels Zentrifuge entfernt. Nach Entfernen des Lösungsmittels erfolgte die Reinigung am Chromatotron (DCM). Ausbeute: 140 mg (0.21 mmol, 60%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.50. - [α]20546: - 2.0 ° (c= 0.18, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.58 (s, 1H, NH), 10.20 (s, 1H, NH an Cb´), 8.42 (s, 1H, NH an C2), 7.94 (s, 1H, H8), 7.74-7.63 (m, 2H, Hc´), 7.41-7.35 (m, 1H, He´), 7.18 (dd, 3 JH,H= 8.4 Hz, 3JH,H= 7.5 Hz, 2H, Hd´), 6.12 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 4.74-4.71 (m, 1H, H3´), 4.49-4.47 (m, 2H, H4´, H5´a), 4.36-4.32 (m, 1H, H5´b), 3.713.61 (m, 2H, H2´a, H2´b), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.10 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.04 (d, 3JH,H= 8.4 Hz, 4JH,H= 1.7 Hz, 6H, Si(CH3)2). - 13CNMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 163.5 (C6), 151.1 (C2), 140.8 (C8), 139.8 (Cb´), 129.8 (Cc´), 128.8 (Cd´), 128.1 (Ce´), 127.0 (C4), 109.5 (C5), 87.1 (C4´), 82.3 (C3´), 72.2 (C1´), 62.8 (C5´), 36.7 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), 17.4 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.0 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr217 Experimentalteil Pressling): 2954, 2928, 2857, 1687, 1109, 776, 740, 482. - MS (FAB, m/z): ber.: 586.3119, gef.: 587.3197 [M+H]+. Synthese von 2-N-Phenylhydrazino-2´-dG 127 Unter Schlenkbedingungen wurden 140 mg (0.21 mmol) O 6 7 3´,5´-Bis(TBDMS)-2-N-phenyl-hydrazino-2´-dG N 5 N 4 8 118 in 4 mL abs. THF und 4 mL abs. DCM gelöst und 9 HO mit 0.1 mL Et3N und 0.3 mL Et3N·3HF versetzt. Die 2 N 3 5´ 4´ O N H H N b´ c´ d´ e´ 1´ 3´ OH Reaktionsmischung wurde 24 h bei RT gerührt. Die 1 NH 2´ 127 Aufreinigung erfolgte am Chromatotron (DCM/MeOH; 9:1). Ausbeute: 100 mg (0.27 mmol, 68%) eines roten Feststoffs. – DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol; 9:1): 0.12. – Smp.: 89 °C. - [α]20546: + 5.0 ° (c= 0.15, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.48 (s, 1H, NH), 9.01 (s, 1H, NH an Cb´), 8.04 (s, 1H, NH an C2), 7.96 (s, 1H, H8), 7.73-7.69 (m, 2H, Hc´), 7.20-7.16 (m, 1H, He´), 6.79-6.75 (m, 2H, Hd´), 6.42 (dd, 3JH,H= 6.8 Hz, 3JH,H= 6.8 Hz, 1H, H1´), 5.33 (d, 3JH,H= 4.2 Hz, 1H, 3´-OH), 4.93 (dd, 3JH,H= 5.6 Hz, 3JH,H= 5.6 Hz, 1H, 5´-OH), 4.42-4.41 (m, 1H, H3´), 3.90-3.85 (m, 1H, H5´a), 3.74-3.75 (m, 2H, H5´b, H4´), 2.66-2.59 (m, 1H, H2´a), 2.19-2.10 (m, 1H, H2´b). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.7 (C6), 152.7 (C2), 145.8 (C4), 134.2 (C8), 130.5 (C5), 129.7 (Ce´), 128.7 (Cd´), 123.6 (Cc´), 114.6 (Ca´), 83.6 (C4´), 82.5 (C5´), 70.5 (C1´), 61.5 (C5´), 45.6 (C2´). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3415, 2922, 1685, 1570, 1316, 1091. – UV: λMax [nm] MeCN: 256, 390. - MS (FAB, m/z): ber.: 358.1390, gef.: 359.1 [M+H]+. 218 Experimentalteil Synthese von 5´-O-(DMTr)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 128 Es wurden 288 mg (0.77 mmol) O 7 2-N-Phenylhydrazino-2´-dG 127 in 12 mL versetzt Raumtemperatur Reaktionskontrolle und 20 h gerührt. erfolgte 9 bei DMTrO Die dünnschicht- chromatographisch (DCM/MeOH: 9/1). Zur 5 N 4 5´ 4´ N 3 O 1 NH 8 Pyridin gelöst und mit 376 mg (1.11 mmol) DMTrCl N 6 2 N H H N A B C D 1´ 3´ 2´ OH 128 Beendigung der Reaktion wurden je 20 mL Natriumcarbonatlösung und Dichlormethan zugegeben und die wässrige Phase dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch zweimalige Coevaporation mit Toluol entfernt. Das Produkt wurde am Chromatotron (DCM/MeOH 0% → 50%) aufgereinigt. Ausbeute: 49 mg (0.07 mmol, 10%) eines orangefarbigen Feststoffes. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol: 9/1): 0.37. - Smp.: 89 °C. - [α]20546:+ 5.0 ° (c= 0.15, CHCl3). 1 H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.20 (s, 1H, NH), 8.36 (s, 1H, H8), 7.91 (d, 3 JH,H= 8.3 Hz, 2H, HB), 7.51 (d, 3JH,H= 8.5 Hz, 2H, HC), 7.29-7.27 (m, 1H, NH an CA), 7.19-7.10 (m, 10H, Hc, Hg, Hh, Hi, NH an C2), 6.74-6.68 (m, 4H, Hd), 6.45 (dd, 3JH,H= 6.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 1H, H1´), 5.40 (d, 3JH,H= 4.7 Hz, 1H, 3’-OH), 4.43-4.40 (m, 1H, H3´), 4.03-3.99 (m, 1H, H4´), 3.68 (s, 6H, 2xOMe), 3.74-3.67 (m, 2H, H5’a, H5´b), 2.87-2.82 (m, 1H, H2´a), 2.47 (s, 3H, Me), 2.39-2.32 (m, 1H, H2´b). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160 (C6), 158.2 (2xCe), 156.0 (C2), 149.2 (CD), 145.3 (CA), 140.4 (C8), 130-128 (aromatische C), 124.7 (C4), 124.5 (C5), 113.3 (4x Cd), 86.0 (C4´), 86.9 (Ca), 83.7 (C1´), 70.9 (C3´), 61.5 (C5´), 55.3 (2xOMe), 40.1 (C2´), 21.7 (Me). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3415, 2922, 1685, 1570, 1316, 1091. - MS (FAB, m/z): ber.: 674.2853, gef.: 675.2932 [M+H]+. 219 Experimentalteil Versuch zur Darstellung von 3’-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N’-diisopropylamino)phosphinyl)]-5´-O- (DMTr)-2-N-p-tolylhydrazino-2´-dG 129 33 mg (0.049 mmol) 5’-O-DMTr-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 128 wurden in je 3 mL Dichlormethan und Acetonitril gelöst und mit 2 mL Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2cyanoethyl)-phosphit 107 versetzt und 1.5 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 5%iger O 7 Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurde die wässrige Phase dreimal mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat Lösungsmittel getrocknet, befreit und N 5 N 4 6 9 DMTrO 5´ 4´ vom chromatographisch über Aluminium(III)oxid O 2 N H H N A B C D 1´ 3´ säulen- NC N 3 O 1 NH 8 O P 2´ 129 N getrennt ( Laufmittel: DCM/MeOH 0% → 2%).Ausbeute: 30 mg (0.034 mmol, 70%) eines gelben Feststoffes, welcher sich jedoch augenblicklich an der Luft zersetzt (Grünfärbung). Synthese von 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134 In einem Kolben wurden 12.5 g (200 mmol) Natriumnitrit in 10 mL Wasser gelöst und zu einer Lösung aus 25.0 g (185 mmol) 2-(4-Aminophenyl)ethanol 133 und 125 mL eines Salzsäure/Eis-Gemisches (Verhältnis 2:3) bei 3 °C getropft. Nach anschließender Neutralisation mit Natriumcarbonat-Lösung wurde die Lösung bei 0 °C zu 300 mL einem mit Kupfercyanid-Lösung (18.5 g Kupferchlorid und 24.5 g Natriumcyanid in 125 CN α β γ δ 2 1 OH 134 mL Wasser) überschichteten Toluol/Benzol-Gemisch (Verhältnis 1:1) getropft. Nach weiterem Rühren für eine Stunde bei 0 °C, wurde die Lösung bei Raumtemperatur eine Stunde und anschließend für 1.5 Stunden bei 50 °C stehengelassen. Nach Abtrennung der organischen Phase wurde die wässrige Phase dreimal mit je 50 mL Dichlormethan extrahiert, bevor die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und vom Lösungsmittel befreit wurden. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch gereinigt (DCM/MeOH; 0% → 5%). 220 Experimentalteil Ausbeute: 12.0 g (81.6 mmol, 44%) eines orangenen Feststoffs. – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.54 – Smp.: 49 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 7.73 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, Hγ), 7.43 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, Hβ), 4.70 (t, 3JHH = 5.2 Hz, 3 JHH = 5.2 Hz, 1H, OH), 3.63 (ddd, 3JHH = 5.2 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 2H, H1), 2.79 (t, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 2H, H2) - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 146.2 (Cα), 132.1 (Cβ), 130.0 (Cγ), 119.2 (Cδ), 108.8 (CN), 61.5 (C1), 39.0 (C2) – IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2356, 2078, 1826, 1705, 1676, 1207, 741 - MS (FAB, m/z): ber.: 147.06, gef.: 148.07 (M+H+). Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-dG 135 Es wurden 32.8 g (66.3 mmol) 3´,5´-bis-Od c (TBDMS)-2´-dG 121 mit 42.3 g (161 mmol) b Triphenylphosphin und 33.2 g (225 mmol) 2-(47 gelöst. Bei 0 °C wurden 22.7 mL (22.1 g, 109 mmol) DIAD zugetropft und die Lösung über Nacht bei RT Produkt 9 TBDMSO 5´ 4´ N 4 N N 2 3 NH2 O 1´ 3´ (PE/EE: 1:1). Nach Entfernen des Lösungsmittels das 5 1 8 gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels DC wurde N 6 f CN a O Cyanophenyl)ethanol 134 in 500 mL abs. Dioxan e 2´ OTBDMS 135 säulenchromatographisch (PE/EE: 10% → 30%) gereinigt. Ausbeute: 38 g (61 mmol, 92%) eines gelben Feststoffes. - DC: Rf-Wert (PE/EE: 1:1): 0.51. - Smp.: 69 °C. - [α]20546: -0.5 ° (c= 1.67, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 7.93 (s, 1H, H8), 7.68-7.62 (m, 2H, Hd), 7.46 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, He), 6.36 (s, 2H, NH2), 6.11 (dd, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 7.4 Hz, 1H, H1´), 4.70 (ddd, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 12.4 Hz, 1H, H3´), 3.95 (q, 3JH,H= 7.1 Hz, 3JH,H= 7.1 Hz, 3 JH,H= 7.1 Hz, 1H, H4´), 3.73-3.70 (m, 1H, H5´a), 3.63 (dd, 3JH,H= 5.9 Hz, 2JH,H= 11.0 Hz, 1H, H5´b), 3.55 (dd, 3JH,H= 5.2 Hz, 3JH,H= 6.7 Hz, 2H, Ha), 2.69 (t, 3JH,H= 5.7 Hz, 2H, Hb), 2.66-2.60 (m, 1H, H2´a), 2.17 (ddd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 6.0 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H2´b), 0.78 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.75 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.07, -0.08 (2 * s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.4 (C6), 160.2 (C2), 137.9 (C8), 137.8 (Cf), 134.9 (Cb), 133.4 (Cc), 221 Experimentalteil 130.4 (Cd), 129.2 (C4), 119.1 (Ce), 114.1 (C5), 109.7 (CN), 87.3 (C4´), 82.6 (C3´), 72.5 (C1´), 67.59 (Ca), 65.9 (C5´), 60.1 (C2´), 26.0 (2 * SiC(CH3)3), 22.2 (Si(CH3)2), 21.1 (Si(CH3)2), 14.4 (2 * SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3373, 2929, 2884, 2857, 2228, 1733, 1611, 1585, 1506, 1462, 1410, 1372, 1332, 1252, 1178, 1111, 1070, 968, 939, 838, 780, 671, 640, 562. - MS (FAB, m/z) ber.: 625.3354, gef.: 625.3348 [M+H]+. Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2-brom-2´-dG 132 Es wurden 37.95 g (60.73 mmol) O6-2-(4- e d Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2´-dG zusammengegeben und auf 0 °C gekühlt. Dann hinzugegeben, die TBDMSO Reaktionskontrolle erfolgte mittels 5´ 9N 4 6 N 2 3 Br O 2´ OTBDMS DC 1 N 1´ 3´ Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -10 °C Die 5 4´ 22.0 mL (22.8 g, 119.4 mmol) t-Butylnitrit versetzt. gerührt. N 8 gesamte Reaktionsmischung auf -10 °C gekühlt und mit a O 7 wurden 150 mL zuvor auch auf 0 °C gekühltes CH2Br2 c b 135 mit 30.00 g (46.23 mmol) Antimon(III)bromid (PE/EE: 132 4:1). Der Reaktionsabbruch erfolgte durch Zugabe zu 60 g Natriumhydrogencarbonat in 1000 mL Eis-Wasser. Der Niederschlag wurde filtriert und dreimal gründlich mit DCM gewaschen. Die wässrige Phase wurde dreimal mit DCM extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels konnte die Reinigung säulenchromatographisch (PE/EE: 10% → 35%) erfolgen. Ausbeute: 20.9 g (30.3 mmol, 50%) eines gelben Sirups - DC: Rf-Wert (PE/EE: 4:1): 0.61. - [α]20546: +8.7 ° (c= 0.19, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.38 (s, 1H, H8), 7.66 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, Hd), 7.44 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, He), 6.22 (t, 3 JH,H= 6.4 Hz, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 4.58 (dd, 3JH,H= 9.4 Hz, 3JH,H= 4.8 Hz, 1H, H3´), 3.93-3.88 (m, 2H, H4´, H5´a), 3.74-3.65 (m, 2H, Ha), 3.54 (dd, 2JH,H= 11.0 Hz, 3JH,H= 4.3 Hz, 1H, H5´b), 3.11 (t, 3JH,H= 6.5 Hz, 2H, Hb), 2.82-2.76 (m, 1H, H2´a), 2.26 (ddd, 2 JH,H= 13.2 Hz, 3JH,H= 6.7 Hz, 3JH,H= 4.8 Hz, 1H, H2´b), 0.77 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.67 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.13, -0.17 (2 * s, 2 * 3H, 222 f CN Experimentalteil Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.6 (C2), 160.2 (C6), 152.9 (C5), 144.4 (C8), 143.8 (Cb), 142.3 (Cf), 132.6 (Cc), 130.4 (Cd), 121.1 (C4), 119.2 (Ce), 109.8 (CN), 87.4 (C4´), 84.3 (C3´), 71.1 (C1´), 67.8 (C5´), 62.5 (Ca), 60.1 (C2´), 26.0 (2 * SiC(CH3)3), 22.6 (Si(CH3)2), 21.1 (Si(CH3)2), 18.1 (2 * SiC(CH3)3) - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3854, 3446, 2954, 2930, 2857, 2228, 1734, 1653, 1596, 1569, 1507, 1472, 1430, 1362, 1314, 1256, 1227, 1164, 1110, 1070, 1030, 837, 778. - MS (FAB, m/z): ber.: 729.3854, gef.: 730.3899 [M+H]+. Synthese von 4-Hydrazinobiphenyl 125 1.52 g (9.00 mmol) 4-Aminobiphenyl 2 wurden in einem Gemisch aus 15 mL Wasser und 5.7 mL konzentrierter 3 6' 2 5' 4' 1' 4 1 Salzsäure suspendiert und auf -10 °C gekühlt. Dann wurde 5 6 eine Lösung aus 0.65 g (9.00 mmol) Natriumnitrit in 5 mL 3' 2' NH NH2 125 Wasser langsam zugetropft. Man ließ noch 4 Stunden bei -10 °C rühren und gab dann die hellgelbe Lösung in der Kälte zu einer Lösung von 7.6 g (40 mmol) SnCl2 in 7.6 g konzentrierter Salzsäure. Nach 1 Stunde wurde der Niederschlag abfiltriert und das Produkt durch Eintragen des Niederschlages in 25%-ige Ammoniaklösung in Freiheit gesetzt. Das Hydrazin 125 wurde mit Ether extrahiert, die organische Phase über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Ausbeute: 1.42 g (7.21 mmol, 80%) hellgelbe, glänzende Blättchen. - DC: Rf-Wert (DCM/MeOH 19:1): 0.65. - Smp.: 135 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, CDCl3): 7.48 (d, 3JH,H= 7.2 Hz, 2H, H2´, H6´), 7.42 (d, 3JH,H= 8.7 Hz, 2H, H2, H6), 7.34 (d, 3JH,H= 7.2 Hz, 2H, H3´, H5´), 7.31-7.28 (m, 1H, H4´), 6.82 (d, 3JH,H= 8.7 Hz, 2H, H3, H5), 5.17 (s, 1 H, NH), 3.54 (2H, NH2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, CDCl3):150.7 (C8), 132.5 (C4), 128.8 (C2,C2´), 128.0 (C8, C8´), 126.6 (C1, C3, C3´), 126.5 (C5), 112.5 (C7, C7´). - MS (EI, m/z): ber.: 184.10, gef.: 184 [M]. Synthese von 2-Hydrazinofluoren 125.2 9 Es wurden 1.0 g (5.5 mmol) 2-Aminofluoren 3 in 4 mL konz. Salzsäure suspendiert und auf 0 °C gekühlt. Es 7 6 8 1 H N NH 2 2 10 11 13 12 5 4 3 125.2 223 Experimentalteil erfolgte die tropfenweise Zugabe von 378 mg (5.50 mmol) Natriumnitrit, gelöst in 4 mL kaltem Wasser, und weiteres Rühren bei 0 °C für 30 Minuten. Anschließend erfolgte die tropfenweise Zugabe von 3.10 g (16.5 mmol) Zinnchlorid, gelöst in 6 mL kalter konz. Salzsäure, bei 0 °C. Nach Lagerung über Nacht wurde der Niederschlag filtriert und mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung und Petrolether:Diethylether (2:1) gewaschen. Nach Aufnahme des Niederschlags in frisch angesetzter Natronlauge wurde mit Diethylether extrahiert und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Das Hydrochlorid konnte nachließen durch Fällung mit konz. Salzsäure unter Eiskühlung erhalten werden. Das freie Hydrazin wurde durch Extraktion mit Diethylether gegen Natronlauge und abschließendem Einengen der organischen Phase erhalten. Ausbeute: 533 mg (2.36 mmol, 43%) eines orangen Feststoffs. - Smp.: 104 °C. - 1HNMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 7.89 (d, 3JHH = 7.7Hz, 1H, H(4)), 7.59-7.67 (m, 2H, H(1) + H(12)), 7.24-7.50 (m, 3H, H(3)+H(9)+) H(10), 7.08-7.21 (m, 1H, H(11)), 5.16 (s, 1H, NH), 3.91 (s, 1H, CH2-a), 3.77 (s, 1H, CH2-b), 3.72 (s, 2H, NH2). - 13 C- NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.3 (C(2)), 148.4 (C(5)), 143.3 (C(13)), 142.4 (C(8)), 141.4 (C(6)), 126.7 (C(3)), 126.6 (C(1)), 125.1 (C(11)), 120.4 (C(9)), 119.9 (C(10)), 117.8 (C(12)), 112.8 (C(4)), 36.2 (C(7)). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3822, 3736, 3650, 3283, 1582, 1455, 730. - MS (EI, m/z): ber.: 196.1008, gef.: 196 (M). Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino2’-dG 136 Die Synthese wurde nach AAV 7 durchgeführt. Es wurden 3.05 g (4.40 mmol) e d 6 O -2-(4b Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-brom2’-dG 132 eingesetzt. Ausbeute: 2.52 g (3.52 mmol, 80%) eines braunen Feststoffes. - DC: RF-Wert (PE/EE 1:1) 0.24. - [α]20546: -3° (c= 1.0, CHCl3). - Smp.: 84-87 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.46 (s, 2H, H-8), 7.43– 6.82 (m, 9H, HAr), 6.67 N c 6 5 N 8 TBDMSO N 9 5' 4' 3' 4 N 1 2 3 O CN a O 7 f N H H N A B D 1' 2' OTBDMS C 136 (dd, 3JH,H = 7.3 Hz, 3JH,H = 7.2 Hz, 1H, H-1’), 5.34 (s, 2H, NH), 4.42 – 4.19 (m, 2H, H224 Experimentalteil a), 3.72-3.71 (m, 3H, H4´, H5´a, H5´b), 3.06 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb), 2.97-2.91 (m, 1H, H2´a), 1.91 (s, 1H, H2´b), 0.75 (s, 9H, Si(CH3)3 an C3´), 0.80 (s, 9H, Si(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.15 (2 * s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C-6), 156.7 (C-2), 152.4 (C-D), 145.7 (C-A), 144.4 (C-f), 139.6 (C-8), 130.0 (C-C), 129.5 (C-c), 127.6 (C-d), 127.5 (C-e), 123.6 (C-4), 119.0 (C-B), 118.6 (-CN), 114.8 (C-5), 87.1 (C-4´), 84.0 (C-1´), 71.6 (C-3´), 67.8 (C-a), 62.8 (C-5´), 39.7 (C-2´), 34.7 (2 * SiC(CH3)3), 34.3 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3744, 3037, 1737, 1695, 1612, 1507, 1110, 838. - MS (FAB, m/z): ber.: 715.3698, gef.: 716.3736 (M+H+). Synthese O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(TBDMS)-2-(4- von methylphenylhydrazino)-2’-desoxyguanosin 138 Die Synthese wurde nach AAV 7 e d durchgeführt. b Es wurden 150 mg (2.12 mmol) O6-2-(pCyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(tert.-butyl- 7 132 eingesetzt. Ausbeute: 103 mg (1.85 mmol; 75%) als orangenes Öl erhalten. DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.48. – N N 8 TBDMSO N 9 5' 4' 3' 4 N 3 O 2 1 N H H N a' b' c' OTBDMS d' e' 1' 2' [α ]546 nm Hg = + 10.1 ° (c = 1.0, CH2Cl2).- 1H-NMR: δ [ppm] 20 °C a 6 5 CN c O trimethylsilyl)-2-brom-2’-desoxyguanosin f 138 (400 MHz, DMSO- d6): 8.62 (s, 1H, H8), 7.79-7.89 (m, 2H, Hd), 7.56-7.61 (m, 2H, He), 7.33-7.47 (m, 6H, Hb’, Hc’, NH), 6.43 (dd, 3JH,H= 6.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 1H, H1´), 4.87 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Ha), 4.47-4.53 (m, 1H, H3’), 3.79-3.88 (m, 1H, H4´), 3.59-3.70 (m, 2H, H5’), 3.213.25 (m, 2H, Hb), 2.99-3.03 (m, 1H, H2´a), 2.44 (s, 3H, He’), 2.39-2.41 (m, 1H, H2´b), 0.84 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C3´), 0.76 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C5´), 0.10 (s, 3 H, Si(CH3)2 an C3´), -0.05 (s, 3 H, Si-(CH3)2 an C3´), -0.08 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C5´). - 13 C- NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.1 (C6), 152.3 (C2), 150.1 (C(d’)), 144.2 (C8), 143.5 (Cf), 142.7 (Cc), 132.1 (Cd), 129.9 (Ce), 128.9 (C(b’)), 128.5 (C4), 123.2 (C(c’)), 120.8 (C(a’)), 118.9 (CN), 109.3 (C5), 87.1 (C4´), 83.9 (C1´), 72.2 (C3´), 66.8 (Ca), 62.3 (C5´), 58.1 (C2´), 34.4 (Cb), 25.7 (SiC(CH3)3), 21.8 (Ce’), 14.0 (SiC(CH3)3), -4.7, 225 Experimentalteil 5.6 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3211, 2929, 1696, 1569, 1471, 1361, 1254, 836. - MS (FAB, m/z): ber.: 729.3854, gef.: 730.3899 [M+H]+ Synthese von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(TBDMS)-2-(3,5- dimethylphenylhydrazino)-2’-desoxyguanosin 139 Es wurden 330 mg (0.48 mmol) O6-2-(pe Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(tert.-butyl- d trimethylsilyl)-2-brom-2’-desoxyguanosin b gelben Öl. DC: Rf-Wert (Dichlormethan /Methanol 9:1): TBDMSO 0.44. – [α] 1 N 6 5 N 8 20 546: = + 7.8 ° (c = 1.2, CH2Cl2). - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): a O 7 N 9 5' 4' 3' 4 N 2 3 O CN c 132 eingesetzt. Ausbeute: 184 mg (0.25 mmol; 52%) eines f 1 N H H N a' b' e' c' d' 1' 2' OTBDMS 139 8.86 (s, 2H, NH), 8.16 (s, 1H, H8), 7.73-7.75 (m, 2H, Hd), 7.40-7.44 (m, 2H, He), 7.26 (s, 2H, Hb’), 6.70 (s, 1H, Hd’), 6.26-6.30 (m, 1H, H1´), 4.73-4.80 (m, 2H, Ha), 4.584.64 (m, 1H, H3’), 3.81-3.83 (m, 1H, H4´), 3.55-3.64 (m, 2H, H5’), 3.12-3.17 (m, 2H, Hb), 2.95-3.00 (m, 1H, H2´a), 2.24-2.27 (m, 1H, H2´b), 2.21 (s, 6H, He’), 0.89 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C3´), 0.83 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C5´), 0.10 (s, 3 H, Si-(CH3)2 an C3´), 0.00 (s, 3 H, Si-(CH3)2 an C3´), -0.02 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C5´). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.1 (C6), 153.2 (C2), 144.8 (C(c’)), 140.2 (C8), 144.1 (Cf), 136.3 (Cc), 132.1 (Cd), 130.0 (Ce), 124.8 (C(b’)), 128.0 (C4), 121.3 (C(d’)), 118.9 (CN), 118.8 (C(a’)), 109.3 (C5), 87.9 (C4´), 83.4 (C1´), 73.5 (C3´), 65.9 (Ca), 62.8 (C5´), 59.7 (C2´), 34.5 (Cb), 25.2 (SiC(CH3)3), 21.9 (Me), 9.6 (SiC(CH3)3), -4.1, -5.4 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2930.90, 2835.32, 2226.98, 1618.35, 1463.31, 1384.12, 1301.26, 1256.47, 1175.19, 1032.77, 827.69, 703.66, 583.54. - MS (FAB, m/z): ber.: 743.4011, gef.: 744.4125 [M+H]+ 226 Experimentalteil Synthese O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2-N-4- von biphenylhydrazino-2´-dG 137 Die Synthese durchgeführt. (3.42 mmol) wurde Es nach wurden AAV 2.36 7 e g b O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl- 3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-brom-2’-dG f d c a O 132 7 eingesetzt. N 6 5 N 1 8 Ausbeute: 1.35 g (1.71 mmol, 50%) eines gelben Feststoffes. - DC: Rf-Wert (PE/EE: 9:1): 0.12. – [α]20546: +25 ° (c= 0.4, TBDMSO 9 5' N 4 N 2 3 O CN N H H N A B C F D 4' E G 1' 3' 2' 137 H OTBDMS CHCl3). - Smp.: 75-78 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.19 (s, 1H, H8), 7.77-7.33 (m, 13H, Har), 6.31 (dd, 3JH,H= 6.7 Hz, 1H, H1´), 5.37, 5.20 (2 * s, 2 * 1H, NH), 4.70 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Ha), 4.54-4.51 (m, 2H, H3´), 3.85-3.82 (m, 1H, H4´), 3.72-3.62 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.17 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb), 2.97-2.90 (m, 1H, H2´a), 2.30-2.24 (m, 1H, H2´b), 0.88, 0.84 (2 * s, 2 * 9H, Si(CH3)3 ), 0.10, 0.00 (2 * s, 2 * 6H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.2 (C6), 157.5, 153.1 (C4), 148.2 (C2), 144.1, 139.7 (C8), 132.0, 128.7, 126.1, 118.7 (CN), 115.1 (C5), 87.1 (C4´), 83.2 (C1´), 72.3 (C3´), 65.8 (Ca), 62.8 (C5´), 38.3 (C2´), 34.1 (Cb), 25.6, 25.5 (2 * SiC(CH3)3), -5.6, -5.1 (2 * Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2954, 2928, 2857, 1687, 1109, 776, 740, 482. - MS (FAB, m/z): ber.: 791.4011, gef.: 791.4035 [M+H]+. 227 Experimentalteil Synthese O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylhydrazino-2’-dG von und 140 O6-2-(4-Cyano-phenyl)ethyl-2-N-phenylazo-2’-dG 142 Die Synthese wurde nach AAV 8 durchgeführt. Es wurden 1.18 g (1.65 mmol) O6-2-(4Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2’-dG 136 eingesetzt. O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylhydrazino-2’-dG 140 Ausbeute: 385 mg (0.79 mmol, 48%) eines beigen e Feststoffes. - DC: Rf-Wert: (DCM/MeOH 9:1) 0.38. b - [α]20546: +34° (c = 1.0, DCM/MeOH 1:1). - Smp.: 95-99 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO- 7 d6): 8.22 (s, 1H, H-8), 7.75 (d, JH,H= 8.4 Hz, 2H, 4 H-B), 7.41 (d, 3JH,H= 8.4 Hz, 2H, H-d), 7.35-7.29 (m, 2H, H-C), 7.07 (dd, 3JH,H= 7.4 Hz, 4JH,H= 1.1 3 3 a N 6 5 N 1 8 3 H-e), 7.64 (dd, JH,H= 1.2 Hz, JH,H= 8.7 Hz, 2H, c O 3 HO 9 5' N 4 N 3 O 4' CN f d 2 N H H N A B C D 1' 3' 2' OH 140 Hz, 1H, H-D), 6.31 (dd, JH,H= 7.4 Hz, JH,H= 6.3 Hz, 1H, H-1’), 5.34-5.26 (m, 3H, NH, 3’-OH), 4.94-4.84 (m, 1H, 5’-OH), 4.62 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, H-a), 4.40-4.35 (m, 1H, H3’), 3.86-3.81 (m, 1H, H-4’), 3.60-3.44 (m, 2H, H-5’), 3.12 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, H-b), 2.78-2.73 (m, 1H, H-2’a), 2.24 (ddd, 3JH,H= 3.1 Hz, 3JH,H = 6.2, 1H, H-2’b). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C-6), 157.7 (C-2), 145.1 (C-A), 144.0 (C-f), 139.6 (C-8), 132.2 (C-e), 130.0 (C-d), 127.7(C-C), 123.7 (C-B), 123.3 (C-D), 119.5 (C4), 118.8 (CN), 114.9 (C-5), 109.2 (C-c), 87.7 (C-4’), 83.2 (C-1’), 70.8 (C-3’), 65.7 (Ca), 61.7 (C-5’), 38.7 (C-2’), 34.4 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3403, 2361, 2227, 1653, 1611, 1577, 1507, 1395, 1241, 1056. - MS (FAB, m/z): ber.: 487.1968, gef.: 488.2046 [M+H]+. 228 Experimentalteil O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylazo-2’-dG 142 Ausbeute: 216 mg (0.44 mmol, 27%) eines orangen e Feststoffes. - DC: Rf-Wert: (DCM/MeOH 9:1) 0.39. [α]20546: +71° (c = 1.0, DCM/MeOH 1:1). - Smp.: 95- b 99 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 3 (d, JH,H= 8.3 Hz, 2H, H-e), 7.68 (d, JH,H= 1.7 Hz, N c 6 5 N 1 8 9 HO 2H, H-C), 7.66 (d, 3JH,H= 2.1 Hz, 1H, H-D), 7.60 (d, N 5' N 4 CN a O 7 8.72 (s, 1H, H-8), 8.01-7.98 (m, 2H, H-B), 7.81-7.77 3 f d 2 N N A B C 3 O 4' D 1' 3' 2' 3 JH,H= 8.3 Hz, 2H, H-d), 6.48 (dd, 3JH,H= 6.6 Hz, 3 JH,H= 6.6 Hz, 1H, H-1’), 5.39-5.30 (m, 1H, 3’-OH), 5.01 – 4.92 (m, 1H, 5’-OH), 4.89 (t, 3 JH,H= 6.6 Hz, 2H, H-a), 4.46-4.42 (m, 1H, H-3’), 3.92-3.88 (m, 1H, H-4’), 3.58-3.49 (m, 142 OH 2H, H-5’), 3.29-3.27 (m, 2H, H-b), 2.78-2.70 (m, 1H, H-2’a), 2.40-2.31 (m, 1H, H-2’b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.4 (C-6), 152.2, 144.8 (C-f), 132.1 (C-e), 130.1 (C-d), 129.6 (C-C), 123.1 (C-B), 119.3 (-CN), 109.3 (C-c), 86.1 (C-1’), 83.8 (C4’), 71.4 (C-5’), 70.5 (C-3’), 66.9 (C-a), 61.5, 39.1 (C-2’), 34.3 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3886, 3854, 3744, 3752, 3675, 3447, 1701, 1654, 1597, 1437. MS (FAB, m/z): ber.: 485.4946, gef.: 486.1890 [M+H]+. Des Weiteren wurden 75 mg (0.15 mmol, 9%) als Mischfraktion erhalten. 1. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylhydrazino-2´-dG 140 56 mg (0.12 mmol) des Produktgemisches e d 140 / 142 wurden in Methanol gelöst und mit 25 mg (1.04 mmol) Magnesium und 56 Es wurde für Raumtemperatur 24 Stunden gerührt, mit Methanol gewaschen. 7 bei Das 5 N 4 6 9 5´ 4´ 1 N 8 die HO Reaktionslösung anschließend filtriert und a O N N 2 3 O 1´ 3´ CN c b mg (11.2 mmol) Ammoniumchlorid versetzt. f N H H N A B C D 140 2´ OH Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Chloroform aufgenommen. Anschließend wurde zweimal mit gesättigter 229 Experimentalteil Natriumchlorid-Lösung und einmal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 2. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N- phenylhydrazino-2´-dG 140 52 mg (0.11 mmol) e des d Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden mit versetzt und in Ethanol gelöst. Es wurde N 5 N 4 6 1 N 8 eine katalytische Menge Zirkoniumdioxid und 10 µL (0.17 mmol) Hydrazinhydrat a O 7 9 HO hinzugegeben und anschließend für 24 5´ 4´ N N H 2 3 O H N A B C D 140 1´ 3´ CN c b 18 mg (0.22 mmol) Natriumhydrogencrbonat f 2´ OH Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 3. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylhydrazino-2´-dG 140 e d 53 mg (0.11 mmol) des Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden zu und 35 mg (0.13 mmol) Magnesiumiodid in und für 72 Stunden bei Raumtemperatur N 5 9N 4 6 5´ 4´ 1 N 8 2 mL Ether/Benzol (1:2) gegeben. Es wurde HO eine Spatelspitze Magnesium hinzugegeben a O 7 N 2 3 O 1´ 3´ CN c b einer Lösung aus 70 mg (0.28 mmol) Iod f N H H N A B C D 140 2´ OH 230 Experimentalteil gerührt. Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 4. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylhydrazino-2´-dG 140 57 mg (0.12 mmol) e des d Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in Lösung aus 11 mg (0.21 7 mmol) Iod in Anschließend 2 wurde mL 24 THF 9 HO 5´ 4´ versetzt. Stunden N 5 N 4 6 1 N 8 Natriumborhydrid in 1 mL THF gegeben. Die Reaktionslösung wurde mit 25 mg (0.10 a O mmol) N N H 2 3 O H N A B C D 140 1´ 3´ CN c b THF gelöst. Diese Lösung wurde zu einer f 2´ OH bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Zugabe von 3 M Salzsäure wurde mit Ether extrahiert und mit 3 M Natronlauge gewaschen. Es wurde über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 5. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylhydrazino-2´-dG 140 68 mg (0.14 mmol) e des d Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in 5 mL abs. Methanol gelöst, mit Spatelspitze Pd/C (10%) versetzt und 5 min 50 µL Suspension Hydrazinhydrat über wurde Nacht die bei Raumtemperatur gerührt. Der Katalysator N 5 N 4 6 9 HO 5´ 4´ 1 N 8 mit Ultraschall behandelt. Nach der Zugabe von a O 7 N 2 3 O 1´ 3´ CN c b einer f N H H N A B C D 140 2´ OH 231 Experimentalteil wurde durch Zentrifugation und Dekantieren der Lösung entfernt. Die erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 6. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylhydrazino-2´-dG 140 53 mg (0.11 mmol) e des d Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in 5 mL abs. Methanol gelöst, mit Spatelspitze Pd/C (10%) versetzt und 10 die Suspension über Nacht N 5 N 4 6 1 N 8 min mit Ultraschall behandelt. Nach der Zugabe von 50 µL Hydrazinhydrat wurde a O 7 9 HO bei 5´ 4´ N N H 2 3 O H N A B C D 140 1´ 3´ CN c b einer f 2´ OH Raumtemperatur gerührt. Der Katalysator wurde durch Zentrifugation und Dekantieren der Lösung entfernt. Die erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 7. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylhydrazino-2´-dG 140 e d 500 mg (1.03 mmol) des Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in Spatelspitze Pd/C (10%) versetzt und 10 N 5 N 4 6 9 5´ 4´ 1 N 8 min mit Ultraschall behandelt. Nach der HO Zugabe von 100 µL Hydrazinhydrat wurde a O 7 N 2 3 O 1´ 3´ OH CN c b 30 mL abs. Methanol gelöst, mit einer f N H H N A B C D 140 2´ 232 Experimentalteil die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wurden zusätzlich 300 µL Hydrazinhydrat hinzugegeben und die Reaktionslösung auf 50 °C erhitzt. Der Katalysator wurde durch Zentrifugation und Dekantieren der Lösung entfernt. Die erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 8. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylhydrazino-2´-dG 140 60 mg (0.13 mmol) e des d Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in 5 Hydrazinhydrat versetzt. Es wurde auf die Das Lösungsmittel wurde N 5 9N 4 6 1 N 8 Zugabe von Katalysator verzichtet und stattdessen über Nacht auf 60 °C erhitzt. a O 7 HO unter 5´ 4´ N N H 2 3 O H N A B C D 140 1´ 3´ CN c b mL abs. Methanol gelöst und mit 100 µL f 2´ OH vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 9. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylhydrazino-2´-dG 140 e d 94 mg (0.20 mmol) des Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in 5 Hydrazinhydrat versetzt. Die N 5 N 4 6 9 5´ 4´ 1 N 8 Reaktionslösung färbte sich rot. Es wurde HO über das Wochenende auf 60 °C erhitzt. a O 7 N 2 3 O 1´ 3´ OH CN c b mL abs. Ethanol gelöst und mit 1 mL f N H H N A B C D 140 2´ 233 Experimentalteil Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 1. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylazo-2´-dG 142 e f d Es wurden 650 mg (1.37 mmol) des c b Reaktionsgemisches 140 / 142 in 30 mL 7 Kaliumsuperoxid versetzt. Es wurde 48 N 5 N 4 6 1 N 8 9 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach HO der Zugabe von 20 mL Wasser wurden die a O Toluol gelöst und mit 840 mg (1.18 mmol) N 2 N A B C D O 4´ Phasen getrennt. Die wässrige Phase wurde N 3 5´ CN 1´ 3´ 142 2´ OH fünfmal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. 2. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-Nphenylazo-2´-dG 142 Es wurden 40 mg (0.08 mmol) des e d Reaktionsgemisches 140 / 142 in 2 mL 7 1.5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Entfernung des Lösungsmittels HO wurde der Rückstand 4´ säulenchromatographisch gereinigt. Als a O mg (0.13 mmol) NBS versetzt. Es wurde N 5 N 4 6 5´ 1 N 8 9 N 2 3 N N A B C D O 1´ 3´ CN c b DCM gelöst und mit 40 μL Pyridin und 10 f 2´ 142 OH 234 Experimentalteil Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 5%). Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden. Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 141 und O62-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 143 Die Synthese wurde nach AAV 8 durchgeführt. Es wurden 1.35 g (1.71 mmol) O6-2-(pCyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 137 eingesetzt. O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 141 Ausbeute: 299 mg (0.53 mmol, 31%) eines hell-orangen Feststoffes. - DC: Rf-Wert (DCM/MeOH: 9:1): 0.35 - [α]20546: +54 ° e (c= 0.8, DCM/MeOH). - Smp.: 90 °C. 1 b H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.25 (s, 1H, H8), 7.77-7.32 (m, 13H, 7 5.5 Hz, 1H, 5´-OH), 4.66 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Ha), 4.41-4.38 (m, 1H, H3´), a 6 5 N 1 8 5.76, 5.37 (2 * s, 2 * 1H, NH), 5.30 (d, JH,H= 4.0 Hz, 1H, 3´-OH), 4.90 (t, 3JH,H= N HO 9 5' N 4 N 2 3 O CN c O Har), 6.34 (dd, 3JH,H= 6.6 Hz, 1H, H1´), 3 f d N H H N A B C F D 4' E G 1' 3' 2' 141 H OH 3.86-3.83 (m, 1H, H4´), 3.58-3.49 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.15 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb), 2.97-2.79 (m, 1H, H2´a), 2.29-2.23 (m, 1H, H2´b). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C6), 155.6 (C2), 153.2 (C4), 144.1 (Ca), 139.7 (C8), 134.6, 130.0 (Cb, Cb´), 118.8 (C5), 116.2 (CN), 109.1 (Cd), 87.6 (C4´), 83.1 (C1´), 70.8 (C3´), 65.8 (Ca), 61.7 (C5´), 39.7 (C2´), 34.4 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3448, 2922, 2857, 2227, 1718, 1609, 1384, 1238, 1105, 832, 763, 701. - MS (FAB, m/z): ber.: 563.2281, gef.: 563.2402 [M]. 235 Experimentalteil O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 143 Ausbeute: 240 mg (0.43 mmol, 25%) eines orangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert (DCM/MeOH: 9:1): 0.34 - [α]20546: +4 ° e (c= 1.2, DCM/MeOH). - Smp.: 92 °C. 1 b H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.15 (s, 1H, H8), 7.86-7.62 (m, 13H, 7 3 JH,H= 6.8 Hz, 2H, Ha), 4.50-4.43 (m, 1H, H3´), 3.97-3.93 (m, 1H, H4´), 3.67- a N 6 5 N 1 8 5.36 (d, 3JH,H= 4.5 Hz, 1H, 3´-OH), 4.90 (t, 3JH,H= 5.5 Hz, 1H, 5´-OH), 4.79 (t, c O Har), 6.38 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 9 HO 5' N N 4 CN f d N 2 N B A C F 3 O E D 4' G 1' 3' 143 2' H OH 3 3.63 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.26 (t, JH,H= 6.8 Hz, 2H, Hb), 3.02-2.94 (m, 1H, H2´a), 2.41-2.35 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.2 (C6), 157.5, 153.1 (C4), 148.2 (C2), 144.1, 139.7 (C8), 132.0, 128.7, 126.1, 118.7 (CN), 115.1 (C5), 87.1 (C4´), 83.2 (C1´), 72.3 (C3´), 65.8 (Ca), 62.8 (C5´), 38.3 (C2´), 34.1 (Cb). IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3473, 1718, 1637, 1384, 1237, 1150, 767, 701, 636. - MS (FAB, m/z): ber.: 561.2125, gef.: 561.3241 [M]. Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylhydrazino-O-5’-dimethoxytrityl-2’dG 144 Die Synthese wurde nach AAV 10 durchgeführt. Es wurden 371 mg (0.76 mmol) des Hydrazino-Addukt 140 eingesetzt, Ausbeute: 414 mg (0.52 mmol, 69%) eines e gelborangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert: b (DCM/MeOH 9:1) 0.84. - [α]20546: -19 ° (c = 1.2, 7 (400 MHz, DMSO-d6): 8.01 (s, 1H, H-8), 7.35 DMTrO 3 1H, 3’OH), 4.35 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, H-a), a 6 5 N 1 8 3 H-1’), 5.75 (s, 2H, NH), 5.26 (d, JH,H= 3.7 Hz, N 9 5' N 4 N 2 3 O 4' CN c O CHCl3). - Smp.: 124-125 °C. 1H-NMR: δ [ppm] 7.16 (m, 22H, HAr), 6.09 (t, JH,H= 6.5 Hz, 1H, f d N H H N A B C D 1' 3' 2' 144 OH 4.15-4.06 (m, 1H, H-3’), 3.98-3.91 (m, 1H, H-4’), 3.58 (m, 8H, -O-CH3, H-5’), 2.95 (t, 3 JH,H= 6.9 Hz, 2H, H-b), 2.69-2.59 (m, 1H, H-2’a), 2.25-2.14 (m, 1H, H-2’b). - 13C-NMR: 236 Experimentalteil δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.5 (C-6), 157.9, 157.3 (C-8), 152.9 (C-4), 144.8 (C- Ar), 143.8 (C-Ar), 141.5 (C-8), 136.2 (C-Ar), 135.5, 132.1 (C-e), 130.3, 129.6, 129.0 (C-Ar), 127.6 (C-Ar), 124.9, 113.0, 112.2, 109.2 (C-d), 86.5 (C-4’), 79.2 (C-1’), 71.1 (C3’), 65.4 (C-a), 60.9 (C-5’), 54.9, 39.1 (C-2’), 34.2 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBrPressling): 3447, 2930, 2834, 2361, 2227, 1609, 1579, 1507, 1442, 1382, 1300, 1249, 1176, 1070, 1033, 827, 789. - HRMS (FAB, m/z): ber.: 789.3275, gef.: 790.3353 [M+H]+. Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylazo-O-5’-dimethoxytrityl-2’-dG 146 Die Synthese wurde nach AAV 9 durchgeführt. e Addukts 142 eingesetzt. b Ausbeute: 125 mg (0.16 mmol, 68%) eines orangen Feststoffes. - DC: 7 (DCM/MeOH 9:1) 0.72. - [α]20546: -42° (c = 0.9, CHCl3). - Smp.: 98-102 °C. - H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.71 (s, 1H, H-8), 7.81 – 6.84 (m, 22H, HAr), 6.21 (s, 1H, H-1’), 5.43 - N a 6 5 N 1 8 DMTrO 9 5' N 4 N CN c O Rf-Wert: 1 f d Es wurden 114 mg (0.23 mmol) des Azo- 2 N N A B C 3 O 4' D 1' 3' 2' 146 OH 5.29 (m, 1H, 3’-OH), 4.76-4.71 (m, 3H, H-a, H-3´), 3.97-3.96 (m, 2H, H-5´a, H-5´b), 3.90-3.87 (m, 1H, H-4´), 3.20-3.16 (m, 6H, DMTr-CH3), 3.15 (t, 3JH,H= 6.6 Hz, 3JH,H= 6.6 Hz, 2H, H-b), 2.98-2.95 (m, 1H, H-2´a), 1.95 (s, 1H, H-2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.1 (C-6), 139.9 (C-8), 137.1, 132.1 (C-e), 130.0 (C-c), 129.6, 128.8, 127.6, 123.1, 115.2 (-CN), 112.7, 109.7, 87.6 (C-4’), 79.5 (C-1’), 70.6 (C-3’), 61.5 (C-5’), 54.1, 39.2 (C-2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3854, 3821, 3752, 3675, 3421, 1735, 1701, 1607, 1507, 1437, 1249, 1176, 1033, 827. - MS (FAB, m/z): ber.: 787.3118, gef.: 788.3201 (M+H+). 237 Experimentalteil Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-biphenylhydrazino-O-5’-dimethoxytrityl2’-dG 145 Die Synthese wurde nach AAV 10 e durchgeführt. Es wurden 150 mg (0.27 mmol) b O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-47 Ausbeute: 145 mg (0.17 mmol, 62%) eines Feststoffes. - DC: Rf-Wert 20 (PE/EE: 9:1): 0.76. - Smp.: 85 °C. - [α] 546: +92 ° (c= 0.6, DCM/MeOH). - 1H-NMR: δ N c 6 5 N 1 8 DMTrO 9 5' N 4 N 2 3 O CN a O biphenyl-hydrazino-2´-dG 141 eingesetzt. orangenen f d N H H N A B C F D 4' E G 1' 3' 2' 145 H OH [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.02 (s, 1H, H8), 7.66-6.61 (m, 26H, Har), 6.11 (dd, 3JH,H= 6.9 Hz, 1H, H1´), 5.76, 5.37 (2 * s, 2 * 1H, NH), 5.25 (d, 3JH,H= 4.0 Hz, 1H, 3´-OH), 4.38 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Ha), 3.95-3.93 (m, 1H, H4´), 3.72-3.64 (m, 8H, H5´a, H5´b, OCH3), 2.98 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb), 2.70-2.64 (m, 1H, H2´a), 2.24-2.19 (m, 1H, H2´b). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C6), 155.6 (C2), 153.2 (C4), 144.1 (Ca), 139.7 (C8), 135.6, 134.6, 130.0 (Cb, Cb´), 127.8, 122.3, 118.8 (C5), 116.2 (CN), 109.1 (Cd), 87.6 (C4´), 83.1 (C1´), 70.8 (C3´), 65.8 (Ca), 61.7 (C5´), 39.7 (C2´), 34.4 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3462, 1718, 1701, 1654, 1637, 1560, 1508, 1384, 1247, 1107, 701, 582, 465. - MS (FAB, m/z): ber.: 865.3588, gef.: 865.3781 [M]. 238 Experimentalteil Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-biphenylazo-O-5’-dimethoxytrityl-2’-dG 147 Die Synthese wurde nach AAV 9 e durchgeführt. Es wurden 143 mg (0.26 mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4- b biphenylazo-2´-dG 143 eingesetzt. 7 N a 6 5 N 1 8 eines orangenen Feststoffes. - DC: RfDMTrO [α]20546: -69 ° (c= 1.6, DCM/MeOH). - 1H- 9 5' N N 2 N N A B C F 3 O D 4' E G 1' 3' NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.15 4 CN c O Ausbeute: 168 mg (0.19 mmol, 76%) Wert (PE/EE: 9:1): 0.87. - Smp.: 112 °C. - f d 2' 147 H OH 3 (s, 1H, H8), 7.86-6.62 (m, 26H, Har), 6.38 (dd, JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 5.36 (d, 3JH,H= 4.5 Hz, 1H, 3´-OH), 4.79 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Ha), 4.50 -4.43 (m, 1H, H3´), 3.97-3.93 (m, 1H, H4´), 3.67-3.63 (m, 8H, H5´a, H5´b, OCH3), 3.26 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Hb), 3.02-2.94 (m, 1H, H2´a), 2.41-2.35 (m, 1H, H2´b). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C6), 155.6 (C2), 153.2 (C4), 144.1 (Ca), 139.7 (C8), 135.6, 134.6, 130.0 (Cb, Cb´), 127.8, 122.3, 118.8 (C5), 116.2 (CN), 109.1 (Cd), 87.6 (C4´), 83.1 (C1´), 70.8 (C3´), 65.8 (Ca), 61.7 (C5´), 39.7 (C2´), 34.4 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3416, 1637, 1617, 1560, 1508, 1458, 1384, 1314, 1247, 1175, 1075, 619, 477. - MS (FAB, m/z): ber.: 863.3431, gef.: 864.2978 [M+H]+. 239 Experimentalteil Synthese von 3'-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N'-diisopropyl-amino)-phosphinyl)]-O6-2-(4- cyanophenyl)ethyl-5’-O-dimethoxytrityl-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 148 Die Synthese wurde nach AAV 12 durchgeführt. Es wurden 200 mg e (0.25 mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenyl- b hydrazino-O-5’-dimethoxytrityl-2’-dG 144 einge7 Ausbeute: 185 mg (0.19 mmol, 75%) eines Feststoffes, welcher als Diastereomerengemisch (I+II) vorliegt. - DC: Rf- a 6 5 N 1 8 DMTrO 9 5' N 4 N 2 3 O 4' N H H N A B C D 1' 3' Wert: (DCM/MeOH 9:1) 0.93. - [α]20546: +183° (c 148 2' O 1 = 1.0, CHCl3). - Smp.: 68-71 °C. H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 7.84 (s, 1H, H-8 N CN c O setzt. beigen f d N P α O CN β (I)), 7.81 (s, 1H, H-8 (II) ), 7.71-7.41 (m, 44H, HAr(I+II), DMTr-H (I+II)), 6.25 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 2H, H-1’(I+II)), 4.744.58 (m, 2H, NH (I)), 4.47-4.37 (m, 2H, NH (II)), 4.16-4.05 (m, 4H, H-a (I+II)), 3.583.35 (m, 12H, -OCH3, H-5’a/b (I-II), H-b(I)) 3.15-3.02 (m, 2H, H-b (II)), 2.54-2.29 (m, 12H, iPr-H (I+II), H-α (I+II), H-2’a/b (I+II)), 1.81 (t, 2H, H-β (I)), 1.73 (m, 2H, H-β(II)), 1.15-1.01 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 160.1, 159.3, 158.7, 148.2, 145.8, 143.3, 138.0, 137.4, 136.1, 132.0, 131.4, 130.6, 130.1, 129.8, 119.0, 113.7, 113.0, 111.0, 87.1, 74.4, 74.2, 66.0, 54.8, 45.3, 43.6, 35,1, 24.7, 24.6, 22.8. - 31P-NMR: δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 149.35, 149.19. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3870, 3816, 3752, 3744, 3676, 3447, 2966, 1654, 1609, 1581, 1508,1465, 1383, 1250, 1179, 1034, 829. - MS (FAB, m/z): ber.: 989.4353 , gef.: 990.5 [M+H]+. 240 Experimentalteil Synthese von 3'-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N'-diisopropyl-amino)-phosphinyl)]-O6-2-(4cyanophenyl)ethyl-5’-O-dimethoxytrityl-2-N-phenylazo-2´-dG 150 Die Synthese wurde nach AAV 11 durchgeführt. e Es wurden 125 mg (0.16 mmol) des Azo-Addukts b 146 eingesetzt. Ausbeute: 78 mg (0.08 mmol, 51%) eines gelborangenen Feststoffes. - DC: 7 CHCl3). - Smp.: 86-89 °C. 1H-NMR: δ [ppm] (400 a 6 5 N 1 8 DMTrO 9 5' N 4 N 2 N N A B C 3 O 4' MHz, Benzol-d6): 7.88 (s, 1H, H-8 (I)), 7.85 (s, 1H, D 1' 3' 150 2' O H-8 (II)), 7.62-6.58 (m, 49 H, DMTr-H (I+II), HAr (I+II)), 6.27-6.18 (m, 2H, H-1´(I+II)), 5.07-4.95 (m, N CN c O Rf-Wert: (DCM/MeOH 9:1): 0.92. - [α]20546:+39° (c = 1.0, f d N P α O CN β 2H, H-3´(I+II)), 4.73-4.67 (m, 4H, H-a (I+II)), 4.134.06 (m, 2H, H-4´(I+II)), 3.54-3.26 (m, 20H, -OCH3 (I+II), H-b (I+II), H-5´(I+II)), 3.002.82 (m, 2H, H-2´a (I+II)), 2.72-2.61 (m, 8H, iPr-H(I+II), H-α (I+II)), 2.56-2.47 (m, 1H, H-2´b(I)), 2.41-2.29 (m, 1H, H-2´b(II)), 1.73-1.67 (m, 4H, H-β(I+II)), 1.13-1.05 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 190.6, 186.5, 185.4, 177.7, 169.4, 168.0, 163.6, 159.3, 153.4, 146.1, 145.8, 143.3, 136.3, 132.1, 130.7, 129.9, 129.4, 124.0, 113.8, 87.6, 87.0, 54.8, 47.5, 43.6, 35.2, 24.6. - 31 P-NMR: δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 149.46, 149.16. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3854, 3744, 3676, 3432, 2965, 2227, 1607, 1508, 1445, 1341, 1251, 1178, 1034. - MS (FAB, m/z): ber.: 987.4197, gef.: 988.7 [M+H]+. 241 Experimentalteil Synthese 3’-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N’-diisopropylamino)-phosphinyl)]-O6-2-(4- von Cyanophenyl)ethyl-O-5´-dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 149 Die Synthese wurde nach AAV 12 e durchgeführt. Es wurden 135 mg (0.15 mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-O-5´- b dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´7 Feststoffes, Diastereomerengemisch welcher (I+II) vorliegt. als - DMTrO 9:1): 0.84. - [α] 1 546: +33° (c= 0.1, CHCl3). - N 9 5' 6 5 N N 1 4 N 2 3 O N H H N A B C F D 4' E 149 2' H O N G 1' 3' Smp.: 75-78 °C. - DC: Rf-Wert (DCM/MeOH: 20 a 8 Ausbeute: 148 mg (0.14 mmol, 90%) eines orangenen c O dG 145 eingesetzt. CN f d P α O CN β H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 7.88 (s, 1H, H8 (I)), 7.86 (s, 1H, H8 (II)), 7.62-6.58 (m, 52 H, DMTr-H (I+II), Har (I+II)), 6.296.19 (m, 2H, H1´(I+II)), 5.76, 5.37 (2 * s, 2 * 2H, NH(I+II)), 5.04-5.01 (m, 2H, H3´(I+II)), 4.60-4.50 (m, 4H, Ha (I+II)), 4.13-4.08 (m, 2H, H4´(I+II)), 3.52-3.17 (m, 20H, OCH3 (I+II), Hb (I+II), H5´(I+II)), 2.98-2.93 (m, 1H, H2´a (I)), 2.89-2.84 (m, 1H, H2´a (II)), 2.71-2.68 (m, 8H, iPr-H(I+II)+α(I+II)), 2.56-2.48 (m, 1H, H2´b(I)), 2.41-2.34 (m, 1H, H2´b(II)), 1.73-1.67 (m, 4H, ß(I+II)), 1.13-1.05 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.1, 155.6, 153.2, 144.1, 139.7, 135.6, 134.6, 130.0, 127.8, 122.3, 118.8, 116.2, 109.1, 87.6, 83.1, 70.8, 65.8, 61.7, 39.7, 34.4. - 31 P-NMR: δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 149.87, 149.09. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3744, 3675, 2966, 1607, 1457, 1200, 1077, 978. - MS (FAB, m/z): ber.: 1065.4666, gef.: 1066.6 [M+H]+. 242 Experimentalteil Synthese von 3’-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N’-diisopropylamino)-phosphinyl)]-O6-2-(4- Cyanophenyl)ethyl-O-5´-dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 151 Die Synthese wurde nach AAV 11 e durchgeführt. Es wurden 163 mg (0.19 O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-O-5´- mmol) b dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 147 eingesetzt. Feststoffes, welcher als Diastereomerengemisch (I+II) vorliegt. Smp.: 63-65 °C. - DC: DMTrO 6 5 9 5' N N 1 4 N 2 N N A B C F 3 O D 4' E G 1' 3' 151 2' H O Rf-Wert (DCM/MeOH: 9:1): 0.85. - [α]20546: -13 ° (c= N 8 Ausbeute: 70 mg (66 µmol, 35%) eines orangenen c a O 7 CN f d N P α O CN β 0.4, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 7.88 (s, 1H, H8 (I)), 7.86 (s, 1H, H8 (II)), 7.62-6.58 (m, 59 H, DMTr-H (I+II), Har (I+II)), 6.29-6.19 (m, 2H, H1´(I+II)), 5.04-5.01 (m, 2H, H3´(I+II)), 4.60-4.50 (m, 4H, Ha (I+II)), 4.13-4.08 (m, 2H, H4´(I+II)), 3.52-3.17 (m, 20H, OCH3 (I+II), Hb (I+II), H5´(I+II)), 2.98-2.93 (m, 1H, H2´a (I)), 2.89-2.84 (m, 1H, H2´a (II)), 2.71-2.68 (m, 8H, iPr-H(I+II)+α(I+II)), 2.56-2.48 (m, 1H, H2´b(I)), 2.41-2.34 (m, 1H, H2´b(II)), 1.73-1.67 (m, 4H, ß(I+II)), 1.13-1.05 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.1, 155.6, 153.2, 144.1, 139.7, 135.6, 134.6, 130.0, 127.8, 122.3, 118.8, 116.2, 109.1, 87.6, 83.1, 70.8, 65.8, 61.7, 39.7, 34.4. - 31 P-NMR: δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 149.29, 149.08. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3821, 3675, 3447, 2966, 1734, 1700, 1653, 1507, 1363, 1179, 1033, 829. - MS (FAB, m/z): ber.: 1063.4510, gef.: 1064.7 [M+H]+. 243 Experimentalteil Synthese von N-Phenylhydroxylamin 155 In einem 500 mL Kolben wurden 24.1 (0.45 mol) Ammoniumchlorid in 3 240 mL dest. Wasser gelöst und 12.55 mL (97.88 mmol) Nitrobenzol 156 2 4 NH OH 1 dazugegeben. Anschließend wurde der Reaktionsansatz auf 60°C 155 erhitzt und über einen Zeitraum von 20 min sukzessive mit 17.7 g (270 mmol) Zink versetzt. Nach der Zugabe wurde die noch heiße Lösung filtriert und der Rückstand mit 200 mL dest. Wasser (90°C) gewaschen. Das Filtrat wurde mit 200 g (3.42 mol) Natriumchlorid gesättigt und über Nacht im Kühlschrank gelagert. Der entstandene Niederschlag wurde filtriert und in Diethylether aufgenommen und über Natriumsulfat getrocknet. Schließlich wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und ein leuchtend gelber, kristalliner Feststoff erhalten. Ausbeute: 4.6 g (42 mmol, 43%) eines gelben kristallinen Feststoffs. – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.61. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.32 (d, 1H, 3 JH,H= 2.2 Hz, NH), 8.25 (bs, 1H, OH), 7.19 (dd, 2H, 3JH,H= 7.4 Hz, 3JH,H= 8.4 Hz, H-3), 6.87 (d, 1H, 3JH,H= 7.9 Hz, H-2), 6.78 (t, 1H, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, H-4). - 13 C- NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 152.0 (C-1), 128.7 (C-3), 119.2 (C-4), 113.0 (C2). Weitere Analytik konnte aufgrund der Instabilität des Produktes nicht durchgeführt werden. Synthese von N-Phenylbenzohydroxamsäure 159 Es wurden 3.18 g (29.1 mmol) N-Phenylhydroxylamin 155 in 25 mL Diethylether gelöst und mit 2.2 g (40 O mmol) Natriumhydrogencarbonat in 50 mL Wasser versetzt und auf 0°C b' a' c' a d' b gekühlt. Über einen Zeitraum von 20 Minuten wurden 2.9 mL (25.1 mmol) Benzoylchlorid, gelöst in 12.5 mL Diethylether hinzugegeben, OH N c 159 d wobei die Temperatur 5 °C nicht überstieg. Nach anschließender 3stündigem Rühren wurde das Produkt filtriert und getrocknet. Ausbeute: 4.24 g (19.8 mmol, 68%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Petrolether/Ethylacetat 1:1 v/v): 0.36. - Schmelzpunkt: 117 °C. - [α]20546: + 2 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.70 (s, 1H, OH), 7.62-7.64 (m, 2H, H-b’), 7.55-7.57 (m, 2H, H-b), 7.35-7.46 (m, 5H, H-c’, H-c, H-d’), 7.18-7.22 (m, 1H, H244 Experimentalteil d). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 167.8 (quart. Bz-C), 141.9 (Ca’), 135.4 (Ca), 130.1 (Cd’), 128.4 (Cb’), 128.2 (Cc’), 127.7 (Cc), 125.5 (Cd), 122.1 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3131, 1921, 1578, 1495, 1322, 1221, 1181, 1075, 1025, 844. - MS (FAB, m/z): ber.: 213.0790, gef.: 214.0887 (M+H+). Synthese von N-Benzyl-N-phenylhydroxylamin 158 Unter Stickstoffgasatmosphäre wurden 2.00 g (18.3 mmol) 155 in 7 einen 50 mL Kolben eingewogen und in 4 mL abs. Pyridin gelöst. Dann wurden unter Lichtausschluss 2.00 mL (2.43 g; 19.3 mmol) Benzylchlorid hinzugegeben und die gelbe Lösung bei RT für 19 h 5 4 1 3 2 6 8 9 N OH 158 gerührt. Die nun orange-gelbe Lösung wurde auf 50 °C erhitzt und anschließend auf 0 °C gekühlt. Dann wurden 4 mL 2N Salzsäure (kalt) hinzugegeben. Nach Zugabe von Diethylether wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase dreimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Schließlich wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der gelbe Feststoff im Hochvakuum getrocknet. Die Reinigung des Rohproduktes erfolgte am Chromatotron mittels DCM als Eluent. Ausbeute: 771 mg (3.87 mmol, 21%) eines gelben kristallinen Feststoffs. – DC: RfWert (DCM/Methanol 9:1): 0.84. – Smp.: 66-69 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.83 (s, 1H, OH), 7.39 (d, 2H, 3JH,H= 7.1 Hz, H-7), 7.30-7.33 (m, 2H, H-8), 7.20-7.26 (m, 3H, H-3 und H-9), 7.11-7.14 (m, 2H, H-2), 6.84 (t, 1H, 3JH,H= 7.2 Hz, 3 JH,H= 7.2 Hz, H-4), 4.44 (s, 2H, H-5). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 153.8 (C-1), 138.4 (C-6), 128.4 (C-7), 128.0 (C-3) 127.6 (C-8), 126.5 (C-9), 119.6 (C-4), 114.7 (C-2), 62.1 (C-9). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3059, 2888, 1700, 1696, 1635, 1506, 1487, 1387, 1295, 1190, 1027, 892, 693, 572. - MS (FAB, m/z): ber.: 199.0997, gef.: 199.0994 [M]. 245 Experimentalteil Synthese von N-Acetyl-phenylhydroxamsäure 157 In einen 100 mL Kolben wurden unter Inertgasatmosphäre 2.00 g 3 O 2 4 6 N5 OH 1 (18.3 mmol) 155 und 1.7 g (20 mmol) Natriumhydrogencarbonat 157 eingewogen und mit 20 mL abs. Diethylether versetzt. Anschließend wurde die Suspension mit Hilfe eines Eisbades auf 0 °C gekühlt und 1.50 mL (1.65 g, 210 mmol) Acetylchlorid hinzugegeben, dabei trat eine Entfärbung der Lösung auf und die Lösung wurde trübe. Schließlich wurde bei RT für 40 h gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde die Suspension filtriert und mit dest. Wasser ausgeschüttelt. Dann wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurde das Rohprodukt (gelbes Öl) am Chromatotron mit DCM als Eluent gereinigt. Ausbeute: 1.65 g (10.9 mmol, 60%) eines braunen, viskosen Öls. – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.63. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.62 (s, 1H, OH), 7.61 (d, 2H, 3JH,H= 7.9 Hz, H-2), 7.34-7.38 (m, 2H, H-3), 7.14 (t, 1H, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, H-4), 2.20 (s, 3H, H-6). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.1 (C-5), 142.0 (C-1), 128.7 (C-3), 123.3 (C-4), 119.3 (C-2), 22.8 (C-6). - IR: Wellenzahl [cm-1]: 2901, 1641, 1593, 1545, 1308, 1177, 1101, 1034, 907, 691. - MS (FAB, m/z): ber.: 151.0633, gef.: 152.0712 [M+H]+. Versuche zur Darstellung von N-Acetyl-N-(3´5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´- desoxyguanosin-O6-yl)-phenylamin 154 mittels Mitsunobu-Reaktion: d Versuch Nr. 1 c b Zu einer Lösung aus 100 mg (0.2 mmol) 121, 53 mg 8 und 8 mL abs. THF wurden und 39 µL (0.2 µmol) DIAD hinzugefügt. Nachdem die Lösung 16 Stunden bei RT gerührt wurde, vermindertem wurde Druck das entfernt Lösungsmittel und das unter erhaltene O 7 (0.1 mmol) Triphenylphosphin, 35 mg (0.2 mmol) 157 N 5 O 4' 3' 2' NAc 61 N 2 9N TBDMSO 5' a 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 154 246 Experimentalteil Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden. Versuch Nr. 2 d Zu einer Lösung aus 100 mg (0.2 mmol) 121, 53 mg c (0.1 mmol) Triphenylphosphin und 8 mL abs. THF b wurden 35 mg (0.2 mmol) 157, 14 mg (0.2 mmol) Imidazol und 39 µL (0.2 µmol) DIAD wurde, wurde das Lösungsmittel unter vermindertem TBDMSO entfernt und das erhaltene Rohprodukt N 5 8 Nachdem die Lösung 16 Stunden bei RT gerührt Druck O 7 hinzugefügt. O 4' 3' säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente 2' NAc 61 N 2 9N 5' a 4 N NH2 3 1' OTBDMS Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 154 25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht isoliert werden. Versuch Nr. 3 Für diesen Versuch wurden zwei verschiedene Reaktionslösungen angefertigt. d c Für die Reaktionslösung I wurden zu einer Lösung aus b 79 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin und 5 mL µmol) DIAD 8 hinzugefügt. Diese Lösung wurde anschließend noch 30 Minuten bei 0 °C gerührt um TBDMSO anschließend bei -40 °C zu der Lösung II hinzugegeben zu werden, welche sich aus 100 mg (0.2 mmol) 121, 15 mg (0.1 mmol) 157 und 5 mL abs. O 7 Acetonitril bei einer Temperatur von 0 °C 54 µL (0.3 N 5 O 4' 3' 2' NAc 61 N 2 9N 5' a 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 154 Acetonitril zusammensetzte. Die gesamte Lösung wurde dann für weitere 20 Stunden bei RT gerührt und schließlich unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte zunächst mit Petrolether und 247 Experimentalteil Ethylacetat in einem Verhältnis von 2:1 und endete mit Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent. Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden. Versuch Nr. 4 Für diesen Versuch wurden zwei verschiedene d Reaktionslösungen angefertigt. c Für die Reaktionslösung I wurden zu einer Lösung aus b 79 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin und 5 mL µmol) DIAD hinzugefügt. Diese Lösung wurde bei - 40 °C zu der Lösung N 5 8 O 4' II 3' 2' NAc 61 N 2 9N TBDMSO 5' anschließend noch 30 Minuten bei 0 °C gerührt um anschließend O 7 Acetonitril bei einer Temperatur von 0 °C 54 µL (0.3 a N 4 NH2 3 1' OTBDMS hinzugegeben zu werden, welche sich aus 50 mg (0.1 154 mmol) 121, 30 mg (0.2 mmol) 157 und 5 mL abs. Acetonitril zusammensetzte. Die gesamte Lösung wurde dann ebenfalls für 20 Stunden bei RT gerührt und schließlich unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte zunächst mit Petrolether und Ethylacetat in einem Verhältnis von 2:1 und endete mit Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent. Das gewünschte Produkt wurde nicht erhalten. Versuch Nr. 5 d c Eine Lösung aus 100 mg (0.2 mmol) 121, 8 mL abs. b Dichlormethan, 150 mg (1 mmol) 157 und 262 mg (1 8 Minuten gerührt bevor die Zugabe von 193 µL (1 mmol) DIAD und 68 mg (1 mmol) Imidazol erfolgte. TBDMSO Die Lösung wurde dann 20 Stunden bei RT gerührt und anschließend unter vermindertem Druck vom O 7 mmol) Triphenylphosphin wurde zunächst für 30 N 5 O 4' 3' 2' NAc 61 N 2 9N 5' a 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 154 248 Experimentalteil Lösungsmittel befreit. Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte auch hier zunächst mit Petrolether und Ethylacetat in einem Verhältnis von 2:1 und endete mit Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent. Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden. Synthese von 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin 165 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. Es wurden 8.0 g (30 mmol) 2’-Desoxyguanosin- coevaporiert und anschließend in 400 mL absolutem Acetonitril suspendiert. Nach Zugabe von 330 mg (1.2 mmol) DMAP, 10 mL (14.4 mmol) Triethylamin und 7.0 N 5 9N 4 5' O 4' 3' 2' 61 NH 8 Monohydrat 52 zweimal mit je 40 mL absolutem Pyridin AcO mL (72 mmol) Essigsäureanhydrid wurde für O 7 2 N 3 NH2 1' OAc 165 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 5 mL Methanol, Filtration und Waschen mit Ethanol und Diethylether wurde das Produkt erhalten. Insgesamt konnten 10.3 g (29.3 mmol, 98%) eines farblosen Farbstoffes erhalten werden. – DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.64. - Smp: 235 °C. [α]20546: + 16 ° (c = 0.67, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.66 (s, 1H, NH), 7.91 (s, 1H, H8), 6.49 (s, 2H, NH2), 6.13 (dd, 3JHH = 5.8 Hz, 3JHH = 8.7 Hz, 1H, H1’), 5.29 (ddd, 3JHH = 1.9 Hz, 3JHH = 4.2 Hz, 1H, H3’), 4.15-4.20 (m, 3H, H4’, H5’a, H5’b), 2.91 (m, 1H, H2a’), 2.44 (m, 1H, H2b’), 2.07 (s, 3H, Ac-CH3), 2.03 (s, 3H, Ac-CH3). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.1 (quart. Ac-C), 169.9 (quart.Ac-C), 156.6 (C6), 153.7 (C2), 151.1 (C4), 135.1 (C8), 116.7 (C5), 82.5 (C1’), 81.4 (C4’), 74.4 (C3’), 63.5 (C5’), 35.4 (C2’), 20.7 (Ac-CH3), 20.5 (Ac-CH3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3177, 1743, 1685, 1634, 1228, 1081, 844. - MS (FAB, m/z): ber.: 351.1179, gef.: 352.1238 (M+H+). 249 Experimentalteil Synthese von 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-desoxyribosylpurin 166 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. 165 und 9.8 g (59 mmol) vorgetrocknetes (2 d bei 120 °C im Exsikkator 61 N 5 Es wurden 7.0 g (20 mmol) 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin vakuumierten Cl 7 über Phosphorpentoxid) Tetraethylammoniumchlorid in 70 mL absolutem Acetonitril gelöst und mit 2.8 mL (20 mmol) destilliertem N,N- N 8 AcO 5' O 4' 3' 2 9N 2' 4 N NH2 3 1' OAc 166 Dimethylanilin und 9.8 mL (20 mmol) Phosphorylchlorid versetzt. Die Lösung wurde anschließend zehn Minuten mit einem vorgewärmten Ölbad unter Rückfluss gerührt, bevor die flüchtigen Komponenten im Vakuum entfernt wurden und der ölige Rückstand in Chloroform und Eis aufgenommen wurde. Nach 15minütigem Rühren wurde die wässrige Phase fünfmal mit Chloroform extrahiert, bevor die vereinigten organischen Phasen zunächst dreimal mit kaltem Wasser, einmal mit 5%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet und vom Lösungsmittel befreit wurden. Eine chromatographischen Reinigung mit Dichlormethan: Methanol (0 - 25%) lieferte das gewünschte Produkt. Insgesamt konnten 5.18 g (22.1 mmol; 70%) eines farblosen Feststoffs erhalten werden. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.57. - Smp: 71 °C. - [α]20546: - 5 ° (c = 0.2, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.34 (s, 1H, H8), 7.00 (s, 2H, NH2), 6.24 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 8.2 Hz, 1H, H1’), 5.33 (m, 1H, H3’), 4.184.29 (m, 3H, H4’, H5’a, H5’b), 3.03 (ddd, 3JHH = 6.5 Hz, 3JHH = 8.3 Hz, 2JHH = 14.4 Hz, 1H, H2a’), 2.50-2.55 (m, 1H, H2b’), 2.08 (s, 3H, Ac-CH3), 2.01 (s, 3H, Ac-CH3). - 13 C- NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.1 (quart. Ac-C), 169.9 (quart.Ac-C), 159.7 (C6), 153.7 (C2), 159.6 (C4), 130.7 (C8), 123.5 (C5), 83.0 (C1’), 81.6 (C4’), 74.3 (C3’), 63.5 (C5’), 35.1 (C2’), 20.7 (Ac-CH3), 20.5 (Ac-CH3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3367, 1742, 1616, 1560, 1230, 1100, 909. - MS (FAB, m/z): ber.: 369.0840, gef.: 370.0908 (M+H+). 250 Experimentalteil Versuch zur Synthese von O6-N-(Phenylamino)-3’,5’-O-acetyl-2’-desoxyguanosin 167 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um d c Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. b a Es wurden 100 mg (0.27 mmol) 6-Chlor-3’,5’-Oacetyl-2’-iso-desoxyadenosin 166 und 100 mg (0.95 8 mmol) Phenylhydroxylamin in 12 mL abs. Ethanol vorgelegt und bei 80 °C für 15 h gerührt. Nach chromatographischer /Essigsäureethylester Reinigung 10-50%) konnte O 4' 3' (Petrolether N 5 2' NH 61 N 2 9N AcO 5' Filtration des entstandenen Niederschlags, Einengen und O 7 NH2 N 4 3 1' OAc ein 167 gekuppeltes Produkt erhalten werden, welches jedoch nicht mit der Hydroxylgruppe substituiert wurde, sondern mit der NH-Funktion. Desweiteren konnte die Abspaltung der OH-Gruppe (als Wasser) beobachtet werden. Versuche der Darstellung von N-Benzyl-N-(3´5´-diacetyldesoxyguanosin-O6-yl)- phenylamin 167 mittels Substitution: Versuch Nr.1 Zunächst wurden 100 mg (0.3 mmol) 166 und 700 mg d c (3.5 mmol) 158 mit 12 mL Ethanol versetzt, 0.1 mL (0.7 b mmol) Triethylamin und eine Spatelspitze DMAP hinzugefügt und die Lösung dann 20 Stunden bei 80 °C gerührt. Danach vermindertem wurde diente entfernt Lösungsmittel und unter erhaltene AcO Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als 4' Eluent Druck das Dichlormethan das mit einem Methanolgradienten (0 - 25%). O 7 8 N 5 O 3' 2' NBn 61 N 2 9N 5' a 4 N 3 NH2 1' OAc 167 Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden. 251 Experimentalteil Versuch Nr. 2 Einer Lösung aus 100 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.5 d c mmol) 158 und 12 mL abs. THF wurden 24 mg (1 mmol) b Natriumhydrid hinzugefügt. Die Lösung wurde dann 20 8 Dichlormethan wurden die Phasen getrennt, und die organische Phase dreimal mit Wasser extrahiert. Die AcO vereinigten organischen Phasen wurden über Lösungsmittel befreit. Der Rückstand N 5 O 3' 2' NBn 61 N 2 9N 5' 4' Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck vom O 7 Stunden bei 80 °C gerührt. Nach Zugabe von Wasser und a NH2 N 4 3 1' OAc wurde 167 säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%). Das gewünschte Produkt wurde nicht erhalten. Versuch Nr. 3 Zunächst wurde eine Lösung aus 100 mg (0.5 mmol) 166, d c 24 mg (1 mmol) Natriumhydrid und 12 mL abs. THF zwei b a Stunden bei RT gerührt. Anschließend wurden 100 mg (0.3 mmol) 158 hinzugefügt und die Lösung 20 Stunden bei 80 8 °C gerührt. Nach Zugabe von Wasser und Dichlormethan wurden die Phasen getrennt, und die organische Phase AcO dreimal mit Wasser extrahiert. Die vereinigten organischen entfernt. Der Druck wurden Rückstand flüchtige wurde Komponenten säulenchromatographisch N 5 O 3' 2' NBn 61 N 2 9N 5' 4' Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem O 7 4 N 3 NH2 1' OAc 167 gereinigt, wobei Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent diente. Das gewünschte Produkt konnte nicht isoliert werden. 252 Experimentalteil Versuch Nr. 4 d c Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3 b mmol) 158 und 12 mL abs. Ethanol ca. 70 Stunden bei 80 vermindertem Druck entfernt und das N 5 8 erhaltene Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent O 7 °C gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter O 4' diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 3' 25%). 2' NBn 61 N 2 9N AcO 5' a NH2 N 4 3 1' OAc 167 Das gewünschte Produkt wurde nicht erhalten. Versuch Nr. 5 d c b Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3 mmol) 158 und 12 mL abs. Pyridin ca. 70 Stunden bei 80 O 7 °C gerührt. Die erhaltene schwarze Lösung wurde N 5 8 verworfen, da eine Zersetzung der Edukte dünnschicht- AcO chromatographisch beobachtet wurde. 4' O 3' 2' NBn 61 N 2 9N 5' a NH2 N 4 3 1' OAc 167 Versuch Nr. 6 d c Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3 b mmol) 158 und 12 mL abs. Pyridin ca. 70 Stunden bei verworfen, da eine Zersetzung der Edukte dünnschichtchromatographisch beobachtet wurde. O 7 RT gerührt. Die erhaltene schwarze Lösung wurde 8 N 5 O 4' 3' 2' NBn 61 N 2 9N AcO 5' a 4 N 3 NH2 1' OAc 167 253 Experimentalteil Versuch Nr. 7 Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3 d c mmol) 158 und 12 mL abs. Ethanol ca. 70 Stunden bei RT gerührt. Danach vermindertem wurde Druck das entfernt Lösungsmittel und das b a unter erhaltene 8 Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - AcO 25%). Es wurden die Edukte reisoliert. O 7 N 5 O 4' 3' 2' 61 N 2 9N 5' NBn 4 NH2 N 3 1' OAc 167 Versuch Nr. 8 Es wurde eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg d c (0.3 mmol) 158 und 12 mL Formamid ca. 40 Stunden bei b 100 °C gerührt. Nach Zugabe von Wasser und Diethylether 8 dreimal mit Wasser extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter AcO vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der diente Dichlormethan mit N 5 O 3' 2' NBn 61 N 2 9N 5' 4' Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent O 7 wurden die Phasen getrennt, und die organische Phase a 4 NH2 N 3 1' OAc einem 167 Methanolgradienten (0 - 25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden d Versuch Nr. 9 c b Zu eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3 8 Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Lösung wurde ca. 40 Stunden bei 100 °C gerührt dünnschichtchromatographischen und da Überprüfung bei der keine O 7 mmol) 158 und 12 mL abs. DME wurden 80 mg (0.6 mmol) N 5 O 4' 3' 2' NBn 61 N 2 9N AcO 5' a 4 N 3 NH2 1' OAc 167 254 Experimentalteil Umsetzung der Edukte beobachtet werden konnte, wurde die Lösung dann verworfen. Versuche zur Darstellung von N-Acetyl-N-(3´5´-diacetyl-2´-desoxyguanosin-O6-yl)phenylamin 167 mittels Substitution: Versuch Nr. 1 d c Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3 b mmol) 157 und 12 mL abs. Ethanol für 3 Tage bei 80 °C gerührt. Danach vermindertem Rohprodukt Eluent wurde Druck das entfernt Lösungsmittel und das säulenchromatographisch diente Dichlormethan unter erhaltene gereinigt. mit O 7 8 Als AcO einem 4' O 3' Methanolgradienten (0 - 25%). Das gewünschte Produkt N 5 2' NAc 61 N 2 9N 5' a 4 NH2 N 3 1' OAc konnte nicht erhalten werden. 167 Versuch Nr. 2 d Zu einer Lösung aus 100 mg (0.3 mmol) 166, 30 µL (0.4 c µmol) abs. Pyridin und 12 mL abs. Ethanol wurden 50 b mg (0.3 mmol) 157 hinzugefügt. Die Lösung wurde für 3 8 Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und eine säulenchromatographische Reinigung mit AcO Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent durchgeführt. Das gewünschte Produkt wurde nicht erhalten. O 7 Tage bei 80 °C gerührt. Anschließend wurde das N 5 O 4' 3' 2' NAc 61 N 2 9N 5' a 4 N 3 NH2 1' OAc 167 255 Experimentalteil Versuch Nr. 3 Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3 d c mmol) 157, 55 µL (0.3 µmol) DIPEA und 12 mL abs. b a Ethanol für 3 Tage bei 80 °C gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das erhaltene 8 Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - AcO 25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten O 7 O 4' 3' 2' 61 N 2 9N 5' werden. N 5 NAc 4 NH2 N 3 1' OAc 167 Versuch Nr. 4 d c Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3 b mmol) 157 und 12 mL abs. Ethanol 16 Stunden bei 80 °C gerührt. Danach vermindertem wurde Druck das entfernt Lösungsmittel und das erhaltene Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - O 7 unter 8 N 5 O 4' 3' 25%). Das gewünschte Produkt wurde jedoch nicht 2' NAc 61 N 2 9N AcO 5' a 4 NH2 N 3 1' OAc 167 erhalten. Synthese von 6-Chlor-2’-iso-desoxyadenosin 168 In ein Gemisch aus 11.5 mL Triethylamin (82.9 mmol), 4.5 Danach wurde das Produkt unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. 61 N 5 mL Wasser (254 mmol) und 23.6 mL Methanol (580 mmol) wurden 1.8 g 166 (4.9 mmol) gegeben und bei RT für 3 HO Stunden gerührt. 4' Cl 7 N 8 5' O 3' 2 9N 2' 4 N 3 NH2 1' OH 168 Insgesamt konnten 1.4 g (4.9 mmol, 99%) eines farblosen Feststoffs erhalten werden. – Smp.: 113.4 °C. -DC: Rf-Wert (DCM/MeOH 9:1) = 0.77. 256 Experimentalteil – [α]20546: + 17 ° (c = 0.3, MeOH/CH2Cl2). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.33 (s, 1H, H8), 6.93 (s, 2H, NH2), 6.21 (t, 3JHH = 7.1 Hz, 1H, H1’), 5.29 (s, 1H, H3’), 4.93 (s, 1H, NH), 4.37 (t, , 3JHH = 2.6 Hz, 1H, H-3´), 4.08 (s, 2H, H5´a+b), 3.83 (dd, 3 JHH = 4.5 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H-4´), 3.54 (ddd, 3JHH = 4.6 Hz, 3JHH = 7.2 Hz, 2JHH = 11.7 Hz, 1H, H-2a´), 2.64-2.58 (m, 1H, H2b’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO- d6): 159.7 (C-2), 153.6 (C-6), 149.4 (C-4), 141.0 (C-8), 123.5 (C-5), 87.7 (C-4), 83.0 (C-1´), 70.5 (C-4´), 61.5 (C-3´), 48.6 (C-5´), 45.7 (C-2´). – MS (EI, m/z): ber.: 285.0629, gef.: 285 [M]. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2955, 1613, 1472, 1258, 1110. Synthese von 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxy- ribosylpurin 169 Zu einer Lösung aus 1.4 g (4.9 mmol) 168 und 15 mL Pyridin wurden 2 g (29 mmol) Imidazol und 2.3 g (15.2 mmol) TBDMS-Cl-Lösung hinzugegeben und Produkt unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit und säulenchromatographisch gereinigt 61 N 5 16 Stunden bei RT gerührt. Abschließend wurde das Cl 7 N 8 TBDMSO 5' O 4' 3' (DCM/MeOH; 0% - 25%). 2 9N 2' 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 169 Insgesamt konnten 2.3 g (4.5 mmol, 90%) eines hellgelben Feststoffs erhalten werden. – Smp.: 51.0 °C. -DC: Rf-Wert (DCM/MeOH 9:1) = 0.87. – [α]20546: - 35 ° (c = 0.5, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.28 (s, 1H, H8), 6.94 (s, 2H, NH2), 6.20 (t, 3JH,H= 6.7 Hz, 1H, H1´), 4.51 (ddd, 3JH,H= 2.7 Hz, 3JH,H= 3.4 Hz, 3JH,H= 5.3 Hz, 1H, H3´), 3.84-3.81 (m, 1H, H4´), 3.71 (dd, 2JH,H= 16.8 Hz, 3JH,H= 5.7 Hz, 1H, H5´a), 3.63 (dd, 2JH,H= 15.6 Hz, 3JH,H= 4.47 Hz, 1H, H5´b), 2.79-2.72 (m, 1H, H2´a), 2.31-2.25 (m, 1H, H2´b), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.84 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.10 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.02, 0.01 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.8 (C6), 153.7 (C2), 149.5 (C4), 123.6 (C5), 135.1 (C8), 87.1 (C4´), 82.7 (C3´), 71.9 (C1´), 62.6 (C5´), 38.6 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), 17.6 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.5 (Si(CH3)2). – MS (EI, m/z): ber.: 513.2358, gef.: 513 [M]. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2927, 1613, 1373, 1093. 257 Experimentalteil Versuche der Darstellung von N-Benzyl-N-(3´5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´- desoxyguanosin-O6-yl)-phenylamin 170 mittels Substitution: Versuch Nr. 1 d c Eine Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03 b mmol) 158 und 1.2 mL abs. Ethanol wurde 16 Dichlormethan mit einem Reinigung mit Methanol-Gradienten N 5 8 Lösungsmittels unter vermindertem Druck, folgte eine säulenchromatographische O 7 Stunden bei 80 °C gerührt. Nach Entfernung des O 4' 3' (0 - 25%) als Eluent. 2' NBn 61 N 2 9N TBDMSO 5' a 4 NH2 N 3 1' OTBDMS 170 Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden. Versuch Nr. 2 d c Zu einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg b (0.03 mmol) 158 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 8 mg 8 wurde 16 Stunden bei 80 °C gerührt. Anschließend wurde das Rohprodukt säulenchromatographisch TBDMSO gereinigt, wobei Dichlormethan mit einem MethanolGradienten (0 - 25%) als Eluent diente. Das gewünschte Produkt wurde nicht erhalten. O 7 (0.06 mmol) Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Lösung N 5 O 4' 3' 2' NBn 61 N 2 9N 5' a 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 170 258 Experimentalteil Versuch Nr. 3 Einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03 mmol) 158 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 5.50 µL d c (0.03 mmol) DIPEA hinzugefügt. Die Lösung wurde b anschließend 16 h bei 80 °C gerührt, bei vermindertem Dichlormethan mit einem Methanol-Gradienten (0 - TBDMSO Das gewünschte Produkt 5' O nicht erhalten 3' 2' NBn 61 N 2 9N 4' konnte N 5 8 Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt, wobei 25%) als Eluent diente. O 7 Druck vom Lösungsmittel befreit und das erhaltene a NH2 N 4 3 1' OTBDMS werden. 170 Versuch Nr. 4 d c Zu einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg b (0.03 mmol) 158 und 1.2 mL abs. Dimethylsulfoxid 8 diese 16 Stunden bei 80 °C gerührt wurde. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck konnte das gewünschte Produkt jedoch nicht erhalten werden. O 7 wurden 5.50 µL (0.03 mmol) DIPEA hinzugefügt bevor N 5 O 4' 3' 2' NBn 61 N 2 9N TBDMSO 5' a 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 170 259 Experimentalteil Versuche zur Darstellung von N-Acetyl-N-(3´5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´- desoxyguanosin-O6-yl)-phenylamin 170 mittels Substitution: d Versuch Nr. 1 c Eine Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03 b mmol) 157 und 1.2 mL abs. Ethanol wurde 16 erfolgte keine Umsetzung. Die Edukte konnte reisoliert werden. O 7 Stunden bei 80 °C gerührt. Bei dieser Reaktion N 5 8 O 4' 3' 2' NAc 61 N 2 9N TBDMSO 5' a NH2 N 4 3 1' OTBDMS 170 Versuch Nr. 2 d c b Zu einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03 mmol) 157 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 8 mg O 7 N 5 8 (0.06 mmol) Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Lösung wurde 16 Stunden bei 80 °C gerührt. Bei dieser TBDMSO Reaktion konnte keine Umsetzung beobachtet werden. 4' O 3' 2' NAc 61 N 2 9N 5' a 4 NH2 N 3 1' OTBDMS 170 Versuch Nr. 3 d c b Einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03 mmol) 157 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 5.5 µL (0.03 µmol) DIPEA wurde anschließend 16 h bei 80 °C gerührt. Bei dieser Reaktion erfolgte keine Umsetzung. O 7 hinzugefügt. Die Lösung 8 N 5 O 4' 3' 2' NAc 61 N 2 9N TBDMSO 5' a 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 170 260 Experimentalteil Versuch Nr. 4 d c b Zu einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03 mmol) 157 und 1.2 mL abs. Dimethylsulfoxid diese 16 Stunden bei 80 °C gerührt wurde. Eine Umsetzung konnte bei dieser Reaktion nicht O 7 wurden 5.5 µL (0.03 µmol) DIPEA hinzugefügt bevor 8 beobachtet werden. N 5 O 4' 3' 2' NAc 61 N 2 9N TBDMSO 5' a 4 NH2 N 3 1' OTBDMS 170 Synthese von N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoylchlorid 172 C Es wurden 34.5 g (132 mmol) PPh3, 7.3 mL (53 mmol) Triethylamin D A in 21.1 mL (220 mmol) Tetrachlorkohlenstoff vorgelegt und unter F F Eiskühlung mit 3.4 mL (44 mmol) Trifluoressigsäure 171 versetzt B Cl E N F 172 und für 10 min. gerührt. Nach anschließender Zugabe von 6.3 mL (53 mmol) Anilin 1, gelöst in 21.1 mL Tetrachlorkohlenstoff, wurde die Lösung für 20 h refluxiert. Nach Einengen der Lösung wurde der Rückstand in Hexan aufgenommen und filtriert. Der Niederschlag wurde mehrmals mit Hexan gewaschen. Nach dem Einengen des Filtrats wurde der Rückstand im Vakuum destilliert. Die Übergangstemperatur betrug 33 °C (Ölpumpenvakuum). Ausbeute: 2.04 g (9.82 mmol, 22%) einer farblosen Flüssigkeit - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, CDCl3): 7.44 (t, 3JH,H= 7.86 Hz, 3JH,H= 7.86 Hz, 2H, HC), 7.30 (t, 3JH,H= 7.48 Hz, 3 JH,H= 7.48 Hz, 1H, HD), 7.10 dd, 3JH,H= 8.46 Hz, 4JH,H= 1.09 Hz, 2H, HB). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, CDCl3 ): 143.6 (CA), 129.3 (CC), 127.5 (CE), 120.8 (CB), 118.3 (CF3), 115.6. - 19 F-NMR: δ [ppm] (188 MHz, CDCl3 ): - 76. - IR: Wellenzahl [cm-1] (NaCl): 3071, 1696, 1489, 1287, 1222, 1162, 947, 827, 764, 691. - MS (FAB, m/z): ber.: 207.0063, gef.: 207.0063 (M+H+). 261 Experimentalteil Synthese von O6-N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)2’-desoxyguanosin 173 . D Unter Stickstoffatmosphäre wurden 1.4 g (2.8 mmol) C TBDMS-dG 121 in 56 mL abs. Dichlormethan gelöst. Es wurden 1.3 g (0.4 mmol) sowie eine N N-Phenyl-2,2,2- 10 O trifluoracetimidoyl-chlorid, 0.78 mL (4.8 mmol) abs. Triethylamin A B Spatelspitze Dimethylaminopyridin hinzugegeben. Die Lösung wurde über Nacht gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte N 5 6 N 4 N 3 8 TBDMSO 5' 1' mittels DC in DCM/MeOH 9:1. Das Lösungsmittel 3' N 2 O 4' 1 F F F 2' NH2 173 OTBDMS wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal mit Hilfe des Chromatotron gereinigt. Zunächst mit DCM als Eluenten und bei zweiten Durchlauf mit PE mit einem Ethylacetatgradienten von 0-10%. Ausbeute: 750 mg (1.13 mmol, 40%) eines hellgelben klebrigen Öls. -[α]20546: -93° (c=0.025, CHCl3)- 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.19 (s, 1H, H8), 7.31-7.27 (m, 2H, HC), 7.17-7.11 (m, 3H, HB, HD), 6.77 (bs, 2H, NH2), 6.15 (dd, 3JH,H= 6.6 Hz, 3 JH,H= 6.6 Hz, 1H, H1´), 4.52-4.49 (m, 1H, H3´), 3.81 (dd, , 3JH,H= 7.8 Hz, 3JH,H= 5.1 Hz, 1H, H4´), 3.71-3.61 (m, 2H, H5´), 2.75-2.70 (m, 1H, H2´a), 2.26 (ddd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 6.1 Hz, 3JH,H= 3.7 Hz, 1H, H2´b), 0.88 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.84 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.09 (s, 6H, Si(CH3)2 an C5’), 0.01 (s, 3H, Si(CH3) an C3’), 0.00 (s, 3H, Si(CH3) an C3’). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6 ): 159.2 (C6), 155.8 (C2), 155.7 (C10), 143.6 (C8), 139.9 (C4), 129.4 (C5), 129.3 (CC), 128.9 (CA),126.9 (CD), 121.5 (CB), 118.9 (CF3), 87.0 (C4´), 82.8 (C1´), 72.0 (C3´), 62.5 (C5´), 39.9 (C2´), 25.6 ( SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), 17.6 (SiC(CH3)3), -5.5, -5.6 (SiC(CH3)2). - 19 F-NMR: δ [ppm] (188 MHz, CDCl3 ): - 58. - IR: Wellenzahl [cm-1] (NaCl): 3853, 3821, 3801, 3752, 3744, 3675, 3628, 3339, 2930, 2857, 2359, 1718, 1684, 1653, 1635, 1576, 1507, 1472, 1405, 1323, 1205, 1068, 836, 779, 668. - MS (FAB, m/z): ber.: 666.2993, gef.: 667.3071 (M+H+). 262 Experimentalteil Versuch der Darstellung O6-(N-Phenylacetamido)-3’,5’-bis-O-(tert- von butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 170 Unter Stickstoffatmosphäre wurden in einen 13 12 100 mL Kolben 1 g aktiviertes Molsieb gegeben. Es 11 10 wurden 150 mg (0.22 mmol) 173 sowie 72 mg (0.48 O mmol) 157 hinzugegeben und in 3 mL abs. DCM gelöst. Die Lösung wurde für 1 h bei RT gerührt und anschließend auf -20°C abgekühlt und 40 μL (0.22 N 5 6 N 4 N 3 8 TBDMSO 5' 1' CH3 O 1 N NH2 170 2' 3' 14 2 O 4' mmol) TMSOTf zugegeben. Anschließend für 3 h bei N OTBDMS RT gerührt. Dann mit 0.2 mL Triethylamin versetzt und filtriert, das Filtrat wurde eingeengt und am Chromatotron, mit DCM, mit einem Methanolgradienten von 0-5%, als Eluenten getrennt. Das gewünschte Produkt konnte auf diesem Weg nicht erhalten werden. 1. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’desoxyguanosin 170 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. 159 und 3.6 mg (0.0032 mmol) [IrCl(cod)]2 in 2 mL Dichlormethan gelöst und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden O 7 3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin 174, 17.5 N 5 8 O 4' 3' 2' N A C B 61 N 2 9N TBDMSO 5' D A' D' Es wurden 50 mg (0.08 mmol) O6-Benzotriazolylmg (0.08 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure O B' C' 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 170 6 mg (0.08 mmol) Calciumhydroxid hinzugegeben und weitere 72 h bei Raumtemperatur gerührt. Es konnte jedoch kein Umsatz beobachtet werden. Das Edukt konnte reisoliert werden. 263 Experimentalteil 2. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’desoxyguanosin 170 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. Acetonitril gelöst und 24 h N 5 8 O 4' bei 3' 2' N A C B 61 N 2 9N TBDMSO 5' 159 und 3.6 mg (0.0032 mmol) Pd(PPh3)4 in 2 mL O 7 3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin 174, 17.5 D A' D' Es wurden 50 mg (0.08 mmol) O6-Benzotriazolylmg (0.08 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure O B' C' 4 N NH2 3 1' OTBDMS Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 170 6 mg (0.08 mmol) Calciumhydroxid hinzugegeben und weitere 72 h bei Raumtemperatur gerührt. Es konnte jedoch kein Umsatz beobachtet werden. Das Edukt konnte reisoliert werden. 3. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’- desoxyguanosin 170 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. Dichlormethan, 121, mit gelöst 0.52 mL in (3.7 20 mmol) O 7 mL N 5 8 Triethylamin, 10 mg (0.08 mmol) DMAP und 500 O 4' mg (1.6 mmol) Mesitylsulfonylchlorid versetzt 3' 2' N A C B 61 N 2 9N TBDMSO 5' D A' D' Es wurden 495 mg (1 mmol) 3’,5’-bis-TBDMS-2’desoxyguanosin O B' C' 4 N 3 NH2 1' OTBDMS und für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 170 Anschließend wurde die Reaktion auf 0 °C gekühlt und mit 1 mL (9.5 mmol) NMethylpyrrolidin, gelöst in 3 mL Dichlormethan, langsam versetzt und für 3 h in der Kälte gerührt, bevor die Zugabe von 280 mg (1.4 mmol) N- Phenylbenzohydroxamsäure 159, gelöst in 3 mL Dichlormethan erfolgte und für 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach anschließendem Einengen und Trennung des Substanzgemisches mit Dichlormethan/Methanol (0-20%) konnte jedoch kein gekuppeltes Produkt erhalten werden. 264 Experimentalteil 1. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 160 Es wurden 28.5 mg (0.1 mmol) 2’- Desoxyguanosin-Monohydrat 52, gelöst in 2 mL gerührt. Es konnte jedoch keine Umsetzung O 7 (0.46 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure 159 N 5 8 O 4' beobachtet werden. 3' 2' N A C B 61 N 2 9N HO 5' D A' D' Wasser (pH=9), mit 2 mL Acetonitril und 100 mg versetzt und für 7 Tage bei Raumtemperatur O B' C' 4 N NH2 3 1' OH 160 2. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 160 Es wurden 28.5 mg (0.1 mmol) 2’- Desoxyguanosin-Monohydrat 52, gelöst in 2 mL gerührt. Es konnte jedoch keine Umsetzung O 7 mg (0.46 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure N 5 8 O 4' beobachtet werden. 3' 2' N A C B 61 N 2 9N HO 5' D A' D' Wasser (pH=10), mit 2 mL Acetonitril und 100 159 versetzt und für 7 Tage bei Raumtemperatur O B' C' 4 N NH2 3 1' OH 160 3. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 160 Es wurden 28.5 mg (0.1 mmol) 2’- Desoxyguanosin-Monohydrat 52, gelöst in 2 mL gerührt. Es konnte jedoch keine Umsetzung beobachtet werden. O 7 (0.46 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure 159 N 5 8 O 4' 3' 2' N A C B 61 N 2 9N HO 5' D A' D' Wasser (pH=10), mit 2 mL Pyridin und 100 mg versetzt und für 7 Tage bei Raumtemperatur O B' C' 4 N 3 NH2 1' OH 160 265 Experimentalteil Synthese O6-(Benzotriazol-1-yl)-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’- von desoxyguanosin 174 Unter Inertgasatmosphäre wurden 1.10 g N N O (2.21 mmol) 3’,5’-Bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’7 desoxyguanosin 121 und 2.03 g (4.59 mmol) BOP 8 in einem 100 mL Kolben eingewogen, in 23 mL abs. DMF gelöst und mit 0.80 mL (0.60 g, 4.6 TBDMSO mmol) DIPEA versetzt. Anschließend wurde die O 4' 3' Lösung bei RT für 72 h gerührt, dabei färbte sich die Lösung langsam rot-braun. Dann wurde das N 5 2' 15 16 14 13 11 12 61 N 2 9N 5' N 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 174 DMF unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (50 mL) aufgenommen, mit dest. Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und schließlich das Ethylacetat am Rotationsverdampfer entfernt. Das rot-braun viskose Rohprodukt wurde am Chromatotron gereinigt. Als Eluent wurde mit PE (EEGradienten von 50% → 100%) begonnen, dann EE mit einem DCM Gradienten von 0% → 100% verwendet und schließlich DCM mit einem Methanolgradienten von 0% → 10% abgeschlossen. Ausbeute: 0.89 g (1.45 mmol, 65%) eines gelben kristallinen Feststoffs. – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.89. - Smp: 88-90 °C. - [ α ]20 : + 27° (c = 0.22, CHCl3). - 1H546 NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.30 (s, 1H, H-8), 8.11 (d, 1H, 3JH,H= 8.4 Hz, H14), 7.75 (d, 1H, 3JH,H= 8.3 Hz, H-11), 7.64 (t, 1H, 3JH,H= 7.2 Hz, 3JH,H= 7.2 Hz, H-12), 7.51-7.55 (m, 1H, H-13), 6.74 (bs, 2H, NH2), 6.25 (dd, 1H, 3JH,H= 6.7 Hz, 3JH,H= 6.7 Hz, H-1’), 4.54 (ddd, 1H, 3JH,H= 3.4 Hz, 3JH,H= 3.4 Hz, 3JH,H= 8.6 Hz, H-3’), 3.83-3.86 (m, 1H, H-4’), 3.70 (dddd, 2H, 3JH,H= 5.2 Hz, 2JH,H= 11.1 Hz, 2JH,H= 15.6 Hz, H-5’a, H-5’b), 2.75-2.82 (m, 1H, H-2’a), 2.31 (ddd, 1H, 3JH,H= 3.6 Hz, 3JH,H= 6.1 Hz, 2JH,H= 13.2 Hz, H-2’b), 0.89 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.86 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.11 (s, 6H, Si(CH3)2 an C3’), 0.04, 0.03 (2·s, 2·3H, Si(CH3)2). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C-6), 158.9 (C-2), 156.7 (C-4), 142.6 (C-15), 139.7 (C-8), 129.2 (C10), 128.9 (C-12), 124.9 (C-13), 119.3 (C-14), 111.8 (C-5), 109.0 (C-11), 86.9 (C-4’), 82.6 (C-1’), 71.8 (C-3’), 62.4 (C-5’), 38.8 (C-2’), 26.1 (SiC(CH3)3), 24.6 (SiC(CH3)3),17.9 (SiC(CH3)3), 17.5 (SiC(CH3)3), -5.1 (SiC(CH3)2), -6.5 (SiC(CH3)2). IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3204, 2954, 2928, 2884, 1514, 1445, 1280, 266 Experimentalteil 1227, 1190, 946, 882, 780, 742. - MS (FAB, m/z): ber.: 612.3024, gef.: 613.3102 [M+H]+. Synthese von C8-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin 175.2 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um D C B Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. 6 Es wurden 50 mg (0.08 mmol) O -Benzotriazolyl3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxy-guanosin 174, 26 mg TBDMSO (0.12 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure 158 und 4' 39 mg (0.12 mmol) Cäsiumcarbonat in 2 mL 1,2Dimethoxyethan gelöst und 12 h bei A BzN 5' 8 N 5 9N 4 O 3' O 7 2' 61 NH 2 N 3 NH2 1' OTBDMS 175.2 Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 3 mL Wasser wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase dreimal mit Dichlormethan extrahiert, bevor die vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet und vom Lösungsmittel befreit wurden. Eine chromatographische Reinigung erfolgte am Chromatotron mit Dichlormethan/Methanol (0-5%). Ausbeute: 11.0 mg (0.02 mmol, 20%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Ethylacetat/Petrolether 1:1 v/v): 0.25. - Schmelzpunkt: 148 °C. - [α]20546: + 61 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.78 (s, 1H, NH), 7.14-7.63 (m, 10H, HB, HC, HD, Bz-H), 6.36 (s, 2H, NH2), 5.97-6.07 (m, 1H, H1´), 4.39-4.49 (m, 1H, H3´), 3.68-3.75 (m, 3H, H5´, H4´), 2.95-3.01 (m, 1H, H2´a), 1.71-1.75 (m, 1H, H2´b), 0.86 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.06 (s, 6H, (Si(CH3)2)2), 0.03 (s, 6H, (Si(CH3)2)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 167.4 (quart. Bz-C), 155.3 (C6), 152.0 (C2), 149.5 (C8), 143.2 (C4), 141.9 (Ca’), 141.3 (C5), 135.3 (CA), 130.1 (Cd’), 128.4 (Cb’), 128.2 (C(D)), 128.0 (Cc’), 127.0 (C(C)), 122.5 (C(B)), 86.8 (C4´), 82.5 (C3´), 72.3 (C1´), 62.7 (C5´), 36.5 (C2´), 25.4 (Si(CH3)2), 25.3 (Si(CH3)2), 17.7 (SiC(CH3)3), 17.4 (SiC(CH3)3), -5.1 (SiC(CH3)3), -5.3 (SiC(CH3)3).- IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3853, 3744, 3447, 2927, 1700, 1696, 1653, 1570, 1437, 1030. - MS (FAB, m/z): ber.: 690.3381, gef.: 691.3403. 267 Experimentalteil 1. Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’- desoxyguanosin 175 Unter Inertgasatmosphäre wurden 321 mg (520 µmol) 12 13 11 174, 340 mg (1.04 mmol) Cäsiumcarbonat und 157 mg (1.04 mmol) 157 in einen 25 mL Kolben eingewogen und in 7 mL abs. DME suspendiert. Anschließend wurde die Suspension bei RT für 2 h gerührt. Danach wurde die Suspension in DCM aufgenommen und mit dest. Wasser ausgeschüttelt. O TBDMSO N 14 5' 15 8 N 5 3' 2' 61 NH 2 9N O 4' O 7 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 175 Die wässrige Phase wurde noch zweimal mit DCM extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Magensiumsulfat getrocknet. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt am Chromatotron mit DCM/MeOH 19:1 gereinigt. Ausbeute: 171 mg (272 µmol, 52%) eines hellbraunen Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 19:1): 0.17. – Smp.: 227-229 °C (Zersetzung). - [ α ]20 : + 90° (c = 546 0.17, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.65 (s, 1H, H-1), 7.60-7.62 (m, 2H, H-11), 7.33-7.36 (m, 2H, H-12), 7.12-7.15 (m, 1H, H-13), 6.40 (bs, 2H, NH2), 5.90-6.09 (m, 1H, H-1’), 4.49-4.58 (m, 1H, H-3’), 3.66-3.75 (m, 4H, H-2’a, H-4’, H-5’a und H-5’b), 3.06-3.17 (m, 1H, H-2’b), 2.19 (s, 3H, H-15), 0.86 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.80 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.07 (m, 6H, Si(CH3)2), -0.04 (s, 6H, Si(CH3)2). 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.2 (C-14), 156.2, 153.5, 141.6, 129.1, 128.6, 128.3, 122.9, 118.9, 118.7, 115.1, 87.3 (C-4’), 83.2 (C-1’), 72.2 (C-3’), 63.8 (C5’), 25.6 (SiC(CH3)3), 25.5 (SiC(CH3)3), 22.4 (C-15), 17.8 (SiC(CH3)3), 17.5 (SiC(CH3)3), -5.4 (SiC(CH3)2), -5.5 (SiC(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2954, 2886, 1704, 1602, 1542, 1431, 1330, 1112, 1031, 812, 779, 691. - MS (FAB, m/z): ber.: 628.3225, gef.: 629.3303 [M+H]+. 268 Experimentalteil 2. Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’- desoxyguanosin 175 Unter Inertgasatmosphäre wurden 100 mg (161 µmol) 174 und 157 mg 12 13 (1.04 mmol) 157 in einen 25 mL Kolben eingewogen und in 5 mL abs. Pyridin suspendiert. Anschließend wurde die Suspension bei 11 RT für 16 h gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel 14 O 4' 3' entfernt und das Rohprodukt am Chromatotron mit 2' 61 NH 2 9N 15 5' N 5 8 N O TBDMSO O 7 NH2 N 4 3 1' OTBDMS DCM/MeOH 19:1 gereinigt. 175 Ausbeute: 75 mg (120 µmol, 75%) eines hellbraunen Feststoffs. Analytik siehe Seite 268. Versuch zur direkten Synthese von C8-N-(N-Acetylylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’desoxyguanosin 175 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um C D B Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. Es wurden 50 mg (0.1 mmol) 3’,5’-bis-TBDMS-2’- A desoxyguanosin 121, 36 mg (0.16 mmol) N- TBDMSO Acetylbenzohydroxamsäure 157 und 57 mg (0.11 mmol) BOP in 2 mL DMF gelöst und 96 h bei Raumtemperatur gerührt. Es konnte jedoch kein N O N 5 8 O 3' 2' 61 NH 2 9N 5' 4' O 7 4 N 3 NH2 1' OTBDMS 175 Umsatz beobachtet werden. 269 Experimentalteil Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-2’-desoxyguanosin 176 Die Synthese wurde nach AAV 3 durchgeführt. Es wurden 12 13 11 140 mg (222 µmol) 175 eingesetzt. Ausbeute: 85 mg (0.21 mmol, 96%) eines gelb-hellbraunen Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.11. – Smp.: 138-140 °C. - [ α ]20 : + 55° (c = 0.29, DCM/MeOH 1 14 5' 15 N 5 9N 4 8 O 4' 546 1:1). - N O HO O 7 3' H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.83 (s, 2' 61 NH 2 N 3 NH2 1' OH 176 1H, H-1), 7.35-7.50 (m, 5H, H-11, H-12 und H-13), 6.44 (bs, 2H, NH2), 6.04-6.10 (m, 1H, H-1’), 5.24 (bs, 1H, OH), 4.96 (bs, 1H, OH), 4.35-4.40 (m, 1H, H-3’), 3.80-3.83 (m, 1H, H-4’), 3.53-3.67 (m, 2H, H-5’a und H-5’b), 3.06-3.12 (m, 2H, H-2’a und H-2’b), 2.02 (s, 3H, H-15). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO- d6): 128.9, 126.1 und 125.0 (C-11, C-12 und C-13), 87.9 (C-4’), 83.6 (C-1’), 71.3 (C- 3’), 62.3 (C-5’), 45.5 (C-2’), 22.3 (C-15). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2937, 1718, 1680, 1671, 1647, 1576, 1369, 842. - MS (FAB, m/z): ber.: 400.15, gef.: 401.3 [M+H]+. Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-N2-formamidin-2’-desoxyguanosin 177 Die Synthese wurde nach AAV 4 durchgeführt. Es 12 13 11 wurden 75 mg (0.18 mmol) 176 eingesetzt Ausbeute: 50 mg (0.11 mmol, 61%) eines gelben, leicht bräunlichen Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 7:3): 0.81. – Smp.: 153-155 °C. - [ α ]20 : + 59° (c = 0.29, 546 DCM/MeOH 1:1). - 1H-NMR: δ [ppm] (500 MHz, DMSOd6): 11.48 (s, 1H, H-1), 8.47 (s, 1H, Hα), 7.33-7.45 (m, O HO N 8 14 5' 15 N 5 3' 3 2' 61 NH 9N 4 N O 4' O 7 2 N α N 1' OH 177 5H, H-11, H-12 und H-13), 6.11-6.15 (m, 1H, H-1’), 5.30-5.33 (m, 1H, H-3’), 4.87-4.90 (m, 1H, H-5’a), 4.42-4.47 (m, 1H, H-5’b), 3.80-3.86 (m, 1H, H-4’), 3.52-3.65 (m, 2H, H2’a und H-2’b), 3.13 (s, 3H, Me-Formamidin), 3.03 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.03 (s, 3H, H-15). - 13 C-NMR: δ [ppm] (125.7 MHz, DMSO-d6): 158.4, 129.0, 126.7, 87.8, 83.9, 70.8, 61.4, 40.7, 34.5, 22.1. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2931, 1734, 270 Experimentalteil 1653, 1594, 1569, 1491, 1436, 1357, 1286, 1055, 844. - MS (FAB, m/z): ber.: 455.1917, gef.: 456.1977 [M+H]+. Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-N2-formamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2’- desoxyguanosin 178 Die Synthese wurde nach AAV 5 durchgeführt. Es 12 13 11 wurden 45 mg (98 µmol) 177 eingesetzt. Ausbeute: 42 mg (55 µmol, 56%) eines weiß-hellbraunen Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.13. 1 O DMTrO Smp.: 111 °C. - [ α ]20 : + 21° (c = 0.1, CHCl3). 546 N 15 N 5 3' 3 2' 61 NH 9N 4 N O 4' H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.48 (s, 8 14 5' O 7 2 N α N 1' OH 178 1H, H-1), 8.19 (s, 1H, H-16), 7.11-7.41 (m, 14H, H- 11, H-12, H-13 und arom. H vom DMTr) 6.67-6.74 (m, 4H, H-11, H-12, H-13 und arom. H vom DMTr), 6.17-6.23 (m, 1H, H-1’), 5.31-5.39 (m, 1H, H-3’), 4.58-4.62 (m, 1H, H-4‘), 3.89-3.94 (m, 1H, H-5’a), 3.68-3.70 (m, 8H, OCH3-DMTr und H-5’b), 3.00 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.94 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.04 (s, 3H, H-15), die 2’-Protonen wurden vom Wasser und DMSO Signal überlagert. - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.9 (Cα), 129.4, 128.9, 127.2, 126.6, 112.6, 112.4, 85.5 (3.9), 82.9 (C1’), 70.5 (4.6), 54.6 (OCH3-DMTr), 40.6 (Me-Formamidin), 34.4 (Me-Formamidin), 22.4 (C-15). - MS (FAB, m/z): ber.: 757.3224, gef.: 758.3336 [M+H]+. 271 Experimentalteil Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)- N2-formamidin-3’-O-[(2-cyanoethoxy)-(N,N- diisopropylamino)-phosphinyl]-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2’-desoxyguanosin 179 Die Synthese wurde nach AAV 6 durchgeführt. Es 12 13 11 wurden 39 mg (51 µmol) 178 eingesetzt. Ausbeute: 34 mg (35 µmol, 68%) eines weißen Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): O DMTrO 0.26. – Smp.: 68-70 °C. - [ α ]20 : + 74° (c = 0.06, 546 CHCl3). - 1 5' 3' α' β' 15 8 O 61 NH 2 9N 2' O P 5 N O 4' H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): NC 11.39 (s, 2H, NH (I+II)), 8.36 (s, 1H, Hα (I)), 8.23 N 14 O 7 4 N 3 N α N 1' 179 N (s, 1H, Hα (II)), 7.62-6.62 (m, 36H, DMTr-H (I+II) + Anil-H (I+II)), 6.41 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.31 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.88-4.86 (m, 1H, H3’ (I)), 4.85-4.83 (m, 1H, H3’ (II)), 4.37-4.33 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.56-3.30 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Me-Formamidin + H15 (I+II)), 2.77 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.58 (m, 2H, H2b’ (I) + β’Ha (I)), 2.23 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 2.04 (s, 6H, H-15 (I+II)), 1.85 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 1.15-0.96 (m, 24H, iPrCH3 (I+II)). - 13 C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 178.7, 159.3, 159.2, 158.2, 147.6, 147.5, 145.3, 145.3, 136.3, 133.2, 130.9, 130.8, 130.7, 130.6, 130.5, 129.3, 128.8, 128.7, 128.6, 128.4, 118.4, 118.2, 114.6, 113.7, 113.6, 87.1, 86.6, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 58.7, 58.6, 58.5, 58.5, 55.1, 54.9, 54.8, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 38.6, 38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3. - 31P-NMR: δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 147.4 und 147.1 (Diastereomere des Phosphoramidits), 9.5 (HPhosphonat). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2968, 2932, 1700, 1696, 1680, 1672, 1629, 1554, 1517, 1493, 1368, 1326, 1116, 1079, 979. - MS (ESI+, m/z): ber.: 957.4302, gef.: 980.4199 [M+Na]+. 272 Experimentalteil 8.6 Oligonucleotide Synthese des Standardoligonucleotids 56 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdGpdCpdCpdApdTpdC-3´ M: 3582.4 HPLC: tR (Methode A): 27.33 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 594.46 (-6), 713.32 (-5), 892.16 (-4), 1189.34 (-3). Synthese des Standardoligonucleotids 183 5´-dGpdApdTpdGpdGpdCpdGpdCpdCpdGpdApdG-3´ M: 3711.5 HPLC: tR (Methode A): 26.48 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 615.93 (-6), 739.36 (-5), 924.39 (-4), 1232.76 (-3). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 184 5´-dCpdTpdCpdG(Anilin)pdGpdCpdGpdCpdCpdApdTpdC-3´ M: 3673.4 HPLC: tR (Methode A): 29.49 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 609.7 (-6), 731.42 (-5), 1219.37 (-3). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 185 5´-dCpdTpdCpdG(4-Aminobiphenyl)pdGpdCpdGpdCpdCpdApdTpdC-3´ M: 3750.4 HPLC: tR (Methode A): 34.23 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 626.01 (-6), 751.71 (-5), 940.15 (-4). 273 Experimentalteil Synthese des modifizierten Oligonucleotids 186 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdG(Anilin)pdCpdCpdApdTpdC-3´ M: 3673.4 HPLC: tR (Methode A): 30.35 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 523.46 (-7), 731.78 (-5), 914.92 (-4). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 188 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdG(Anisidin)pdCpdCpdApdTpdC-3´ M: 3703.4 HPLC: tR (Methode A): 32.48 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 468.03 (-8), 737.18 (-5), 921.79 (-4). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 187 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdG(4-Aminobiphenyl)pdCpdCpdApdTpdC-3´ M: 3750.4 HPLC: tR (Methode A): 34.58 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 626.44 (-6), 751.62 (-5), 939.50 (-4). Synthese des Standardoligonucleotids 57 5´-dGpdTpdApdGpdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3643.5 HPLC: tR (Methode A): 27.71 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 454 (-8), 519 (-7), 606 (-6). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 189 5´-dGpdTpdApdG(Anilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3736.63 HPLC: tR (Methode A): 30.93 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 465.39 (-8), 531.98 (-7), 620.71 (-6). 274 Experimentalteil Synthese des modifizierten Oligonucleotids 196 5´-dG(Anilin)pdTpdApdGpdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3736.63 HPLC: tR (Methode A): 37.04 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 531.38 (-7), 619.84 (-6), 743.78 (-5), 930.72 (-4), 1240.74 (-3). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 190 5´-dGpdTpdApdG(4-Anisidin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3765.56 HPLC: tR (Methode A): 30.67 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 472.03 (-8), 550.31 (-7), 624.60 (-6). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 191 5´-dGpdTpdApdG(4-Toluidin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3749.56 HPLC: tR (Methode A): 32.35 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 471.85 (-8), 536.15 (-7), 625.30 (-6). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 192 5´-dGpdTpdApdG(4-Cyanoanilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3735.55 HPLC: tR (Methode A): 32.29 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 468.24 (-8), 535.41 (-7), 624.75 (-6). 275 Experimentalteil Synthese des modifizierten Oligonucleotids 193 5´-dGpdTpdApdG(3,5-Dimethylanilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3764.68 HPLC: tR (Methode A): 32.83 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 468.79 (-8), 536.02 (-7), 625.26 (-6). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 194 5´-dGpdTpdApdG(4-Aminobiphenyl)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3812.73 HPLC: tR (Methode A): 35.28 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 474.91 (-8), 542.87 (-7), 633.08 (-6). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 197 5´-dG(4-Aminobiphenyl)pdTpdApdGpdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3812.73 HPLC: tR (Methode A): 34.08 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 476.18 (-8), 540.48 (-7), 631.24(-6). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 195 5´-dGpdTpdApdG(2-Aminofluoren)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3823.74 HPLC: tR (Methode A): 35.17 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 476.33 (-8), 544.48 (-7), 635.30 (-6). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 200 5´-dGpdTpdApdG(N2-Azo-Anilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3733.74 HPLC: tR (Methode A): 32.51 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 621 (-6), 745 (-5), 931 (-4). 276 Experimentalteil Synthese des modifizierten Oligonucleotids 201 5´-dGpdTpdApdG(N2-Azo-Biphenyl)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3810.74 HPLC: tR (Methode A): 36.08 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 632 (-6), 750 (-5). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 198 5´-dGpdTpdApdG(N2-Hydrazino-Anilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3735.74 HPLC: tR (Methode A): 31.33 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 466 (-8), 531 (-7), 619 (-6). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 199 5´-dGpdTpdApdG(N2-Hydrazino-Biphenyl)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´ M: 3812.74 HPLC: tR (Methode A): 34.29 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 631 (-6), 757 (-5), 1263 (-3). Synthese des Standardoligonucleotids 58 5´-dApdApdApdTpdGpdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9104 HPLC: tR (Methode B): 26.24 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 700 (-13), 759 (-12), 826(-11). Synthese des Standardoligonucleotids 202 5´-dCpdGpdTpdTpdCpdGpdTpdCpdCpdTpdGpdApdApdGpdGpdApdGpdGpdApdTpdApdGp dGpdT pdTpdCpdApdTpdTpdT-3´ M: 9308.1 HPLC: tR (Methode B): 19.17 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 716 (-13), 775 (-12), 846 (-11), 931 (-10). 277 Experimentalteil Synthese des modifizierten Oligonucleotids 203 5´-dApdApdApdTpdG(Anilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCp dApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9195 HPLC: tR (Methode B): 28.43 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 723 (-13), 781 (-12), 881 (-11). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 204 5´-dApdApdApdTpdG(Anisidin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCp dApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9225.1 HPLC: tR (Methode B): 28.19 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 708 (-13), 767(-12), 835 (-11), 921 (-10). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 205 5´-dApdApdApdTpdG(Toluidin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCp dApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9209.1 HPLC: tR (Methode B): 27.15 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 708 (-13), 837 (-11). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 206 5´-dApdApdApdTpdG(3,5-Dimetyhlanilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCp dTpdTpdCpdApdGpdGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9223.1 HPLC: tR (Methode B): 33.16 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 719 (-13), 769 (-12), 837 (-11), 910 (-10). 278 Experimentalteil Synthese des modifizierten Oligonucleotids 207 5´-dApdApdApdTpdG(4-Aminobiphenyl)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCp dCpdTpdTpdCpdApdGpdGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9271.2 HPLC: tR (Methode B): 28.61 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 772 (-12), 842 (-11), 926 (-10). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 208 5´-dApdApdApdTpdG(2-Aminofluoren)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTp dTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9283.2 HPLC: tR (Methode B): 32.48 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 713 (-13), 772 (-12), 843 (-11), 927 (-10), 1030 (-9). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 211 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Azo-Anilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTp dTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9193 HPLC: tR (Methode B): 30.71 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 757 (-12), 841 (-11), 1016 (-10) Synthese des modifizierten Oligonucleotids 212 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Azo-Biphenyl)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTp dCpdCpdTpdTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9269.2 HPLC: tR (Methode B): 34.32 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 656 (-14), 712 (-13), 771 (-12), 853 (-11), 926 (-10). 279 Experimentalteil Synthese des modifizierten Oligonucleotids 209 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Hydrazino-Anilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCp dCpdTpdTpdCpdApdGpdGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9195 HPLC: tR (Methode B): 29.65 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 658 (-14), 709 (-13), 768 (-12), 803 (-11). Synthese des modifizierten Oligonucleotids 210 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Hydrazino-Biphenyl)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCp dCpdTpdCpdCpdTp dTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´ M: 9271.2 HPLC: tR (Methode B): 33.47 min. MS: ESI, m/z (Ladung): 723 (-13), 779 (-12), 844 (-11). 280 Gefahrstoffverzeichnis 9. Gefahrstoffverzeichnis Substanz Gefahrensymbole R-Sätze S-Sätze Aceton F, Xi 11-36-66-67 9-16-26 Acetonitril F, T 11-23/24/25 16-27-45 Acetylchlorid F, C 11-14-34 9-16-26-45 4-Aminobiphenyl T 45-22 53-45 2-Aminofluoren Xn 20/21/22-40 ? 2-(4-Aminophenyl)ethanol A - ? Ammoniak C, N 34-50 26-36/37/39-45-61 Ammoniumchlorid Xn 22-36 22 Ammoniumsulfat - - - Anilin T, N 28.6-36/37-45-61 p-Anisidin T+, N 20/21/22-4048/23/24/2550 45E26/27/2833-50 Antimon(III)bromid C,N 34-51/53 26-45-61 Benzol T, F 45-46-1136/3848/23/24/2565 53-45 Benzoylchlorid C 34 26-45 Benzylalkohol Xn 20/22 26 Benzylbromid Xi 36/37/38 39 Benzylchlorid T 53-45 BOP Xi 45-E22-E2337/38-41 36/37/38 Bromoform T, N 28-45-61 N-Bromsuccinimid Xn 23-36/3851/53 22-36/37/38 53-28.1-36/37-4561 - 26-36 281 Gefahrstoffverzeichnis tertButylnitrit F, Xn 11/20-22 16-24-46 Cäsiumcarbonat Xi 36/37/38-46 - Chloroform Xn 36/37 p-Cyanoanilin Xn 22-38-4048/20/22 20/21/2236/37/38 DBU C 22-34-52/53 26-36/37/39-45 2’-Desoxyguanosin - - - Dibrommethan X n, N 20-52/53-59 26/59/61 DCI F, T 11-23/24/25 16-28-36/37-39-45 DIAD Xn 36/37/38-4048/20/22 36 Dibrommethan Xn 20-52/53 24-61 Dichlormethan Xn 40 23-24/25-36/37 Diethylether F+, Xn 12-19-22-6667 9-16-29-33 Diisopropylamin F, C 11-20/22-34 16-26-36/37/39-45 Diisopropylethylamin F, C 11-22-3452/53 16-26-36/37/3945-61 1,2-DME Xn 20/21/22-37 24/25 N,N-Dimethylamin F, C 11-20/22-34 4-Dimethyl-aminopyridin T 24/25-36/38 3-16-26-2936/37/39-45 22-36/37-45 3,5-Dimethylanilin T, N 23/24/25-3351/53 (1/2)28-36/37-4561 N,N-Dimethyl-formamiddiethylacetal Xi 10-36/37/38 16-26-36 DMSO - - - 1,4-Dioxan F, Xn 11-19-36/3740-66 9-16-36/37-46 DTT Xn 22-36/38 - Essigsäure C 10-35 23.2-26-45 Essigsäureanhydrid C 10-20/22-34 26-36/37/39-45 - 282 Gefahrstoffverzeichnis Ethanol F 11 7-16 Ethylacetat F, Xi 11-36-66-67 16-26-33 Formamid T 61 53-45 Hexan F, Xn, N 9-16-29-33-36/3761-62 Hydrazin-Hydrat T, C, N Imidazol C 11-38-48/2051/53-62-6567 45-1023/24/25-3445-50/53 22-34-63 22-26-36/37/39-45 KBr - - - Kaliumcarbonat Xi 36/37/38 22-26 Kaliumphosphat Xi 36/38 - Kalium-superoxid O, C 8-35 17-26-36/37/39-45 Kieselgel T - 22 Kupfer(I)chlorid Xn, N 22-50/53 22-60-61 Mesitylensulfonylchlorid C 34 26-36/37/39-45 Methanol F, T Methylamin F+, Xn β-Mercaptoethanol T, N Molybdän(VI)oxid Xn Natriumacetat - 11-23 /24/ 25-39/23/ 24/25 12-20-37/3841 22-24-3451/53 36/3748/20/22 - Natriumborhydrid F, T 15-24/25-35 Natriumcacodylat N, T 23/25-50/53 Natriumcyanid T+, N 26/27/28-3250/53 Natriumhydrogencarbonat - - - Natriumhydrid F, C 15-34 7/8-26-36/37 /3943.6-45 ? 7-16-36-37-45 16-26-29 26-36/37/39-45 (2)-22-25 14-26-36/37/3943-45 1/2-20/21-28-4560-61 7-28-29-45-60-61 283 Gefahrstoffverzeichnis Natriumhydroxid C 35 26-36/37/39-45 Natriumnitrit O, T, N 8-25-50 45-61 Natriumsulfat - - - Na2Fe(CN)5NO · 2H2O T 23/24/25-32 ? Nitrobenzol T, N 23/24/25-4048/23/ 2451/53-62 28.3-36/37-45-61 Oxone® O, C 8-34 26-36/37/39-45 Pd/C - - - Perchlorsäure C, O 5-8-35 Petrolether F, Xn 11-52/53-65 45-23/24/2536/38-4348/23/24/2550-68 14-26/28-3548/20 14-22-26-3548/23 23B-26-36/37/3945 9-16-23.2-24-3362 Phenylhydrazin T, N 53-45-61 Phosphortrichlorid T+, C Phosphorylchlorid T+, C Pyridin F, Xn 11-20/21/22 26-28.1 rac-BINAP Xi 38 - Salzsäure C 34-37 26-36/37/39-45 TBDMS-Cl C 22-35-40 26-27-2836/37/39-45 TBAI Xn 22 Tetrachlorkohlenstoff T, N 23/24/25-4048/23-52/5359 (1/2-)23-36/37-4559-61 Tetrahydrofuran F, Xi 11-19-36/37 16-29-33 p-Toluidin T, N 23/24/25-3640-43-50 28-36/37-45-61 Toluol F, Xn 11-20 16-23-25-29 Triethylamin F, C 11-20/21/ 2235 3-16-26-2936/37/39-45 Triethylamin-Trihydrofluorid T+, C 26/27/28-35 7/9-26-36/37/39-45 7/8-26-36/37/39-45 7/8-26-36/37/39-45 284 Gefahrstoffverzeichnis Triethylammoniumchlorid C 34 26-36/37/39-45 Trifluoressigsäure C 20-35-52/53 9-26-27-28-45-61 Trifluoressigsäureanhydrid C 14-20-3552/53 9-26-36/37/39-4561 Trimethylsilylbromid C 10-34 ? Triphenylphosphin Xn 22-43-53 36/37-60 Tris Xi 36/37/38 - Wasserstoffperoxid 30% Xn 22-41 26-39 Zink-Pulver N 50/53 60-61 Zinnchlorid Xn 22-36/37/3843 24-26-37 Zirkoniumoxid A - - 285 Literatur 10. Literatur [1] Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch. 259. Auflage, de Gruyter, 2002. [2] Jemal, A.; Sigel, R.; Ward, E.; Murray, T.; Xu, J.; Thun, M.J. Cancer Statistics, CA Cancer J. Clin. 2007, 57, 43-66. [3] www.quarks.de/krebs/0206.htm (letzter Zugriff: 7.2.2007) [4] Spivak, J.L. The Anaemia of Cancer, Nature Reviews Cancer 2005, 5, 543-555. [5] Tas, F. Anaemia in oncology practice: relation to diseases and their therapies. Am. J. Clin. Oncol. 2002, 25, 371-79. [6] Knight, K.; Wade, S.; Balducci, L. Prevalences and outcomes of anaemia in cancer: a systematic review of the literature, Am. J. Med. 2004, 116, 11-26. [7] Weymayr, C.; Koch, K. Mythos Krebsvorsorge. Schaden und Nutzen der Früherkennung, Eichborn Verlag, Frankfurt/Main, 2003. 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Anhang Synthese-Protokoll für unmodifizierte Phosphoramidite Schritt Funktion Zeit [s] 1 Begin 2 MeCN to waste 3 3 MeCN to Column 10 4 Reverse Flush 10 5 Block Flush 4 6 Phos Prep 3 7 Column 1 On 8 Block Vent 2 9 DCI to Waste 1.7 10 Base+DCI to Column 5 11 DCI to Column 2 12 Base+DCI to Column 5 13 DCI to Column 2 14 Base+DCI to Column 5 15 Push to Column 16 Column 1 Off 17 Wait 25 18 Cap Prep 3 19 MeCN to Waste 4 20 Reverse Flush 7 21 Block Flush 3 22 Cap to Column 10 23 Wait 5 24 MeCN to Waste 4 25 Reverse Flush 7 26 Block Flush 3 301 Anhang 27 Ox. to Column 8 28 MeCN to Waste 4 29 Block Flush 3 30 Wait 15 31 MeCN to Column 10 32 Flush to Waste 6 33 MeCN to Column 10 34 Reverse Flush 7 35 Block Flush 3 36 Start Detrityl 37 MeCN to Waste 4 38 MeCN to Column 10 39 Reverse Flush 7 40 Block Flush 3 41 If Monitoring 42 DCM to Column 35 43 Deblok. to Column 3 44 Monitor Trityl 45 Deblok. to Column 46 Monitor Noise 47 Deblok. to Column 48 Stop Monitor 49 MeCN to Column 10 50 Reverse Flush 8 51 If not Monitoring 52 Deblok. to Column 6 53 Trityl Flush 5 54 Deblok. to Column 6 55 Wait 5 56 Trityl Flush 5 57 Deblok. to Column 6 58 Wait 5 85 10 302 Anhang 59 Trityl Flush 5 60 Deblok. to Column 6 61 Wait 5 62 Trityl Flush 5 63 MeCN to Column 10 64 Trityl Flush 8 65 End Monitoring 66 MeCN to Column 8 67 Reverse Flush 7 68 Block Flush 4 69 End 303 Anhang Synthese-Protokoll für modifizierte Phosphoramidite Schritt Funktion Zeit [s] 1 Begin 2 MeCN to waste 3 3 MeCN to Column 10 4 Reverse Flush 10 5 Block Flush 4 6 Phos Prep 3 7 Column 1 On 8 Block Vent 2 9 DCI to Waste 2 10 DCI to Column 3 11 Base+DCI to Column 5 12 Base+DCI to Column 5 13 Wait 500 14 DCI to Column 3 15 Base+DCI to Column 5 16 Base+DCI to Column 5 17 Wait 500 18 MeCN to Column 5 19 Push to Column 20 Block Vent 2 21 DCI to Waste 2 22 DCI to Column 3 23 Base+DCI to Column 5 24 Base+DCI to Column 5 25 Wait 500 26 DCI to Column 3 27 Base+DCI to Column 5 28 Base+DCI to Column 5 29 Wait 500 304 Anhang 30 MeCN to Column 5 31 Push to Column 32 Block Vent 2 33 DCI to Waste 2 34 DCI to Column 3 35 Base+DCI to Column 5 36 Base+DCI to Column 5 37 Wait 500 38 DCI to Column 2 39 Base+DCI to Column 5 40 Base+DCI to Column 5 41 Wait 500 42 MeCN to Column 5 43 Push to Column 44 Block Vent 2 45 Wait 30 46 Cap Prep 3 47 MeCN to Waste 4 48 Reverse Flush 7 49 Block Flush 3 50 Cap to Column 10 51 Wait 5 52 MeCN to Waste 4 53 Reverse Flush 7 54 Block Flush 3 55 Ox. to Column 8 56 MecN to Waste 4 57 Block Flush 3 58 Wait 15 59 MeCN to Column 10 60 Flush to Waste 6 61 MeCN to Column 10 305 Anhang 62 Reverse Flush 7 63 Block Flush 3 64 Start Detrityl 65 MeCN to Waste 4 66 MeCN to Column 10 67 Reverse Flush 7 68 Block Flush 3 69 If Monitoring 70 DCM to Column 35 71 Deblok. to Column 3 72 Monitor Trityl 73 Deblok. to Column 74 Monitor Noise 75 Deblok. to Column 76 Stop Monitor 77 MeCN to Column 10 78 Reverse Flush 8 79 If not Monitoring 80 Deblok. to Column 6 81 Trityl Flush 5 82 Deblok. to Column 6 83 Wait 5 84 Trityl Flush 5 85 Deblok. to Column 6 86 Wait 5 87 Trityl Flush 5 88 Deblok. to Column 6 89 Wait 5 90 Trityl Flush 5 91 MeCN to Column 10 92 Trityl Flush 8 93 End Monitoring 85 10 306 Anhang 94 MeCN to Column 8 95 Reverse Flush 7 96 Block Flush 4 97 End 307 Anhang Natrix Kristallisations-Screen 308 Anhang MPD Kristallisations-Screen 309 Anhang Verbindungsliste OBn O N N NH N N NH2 N HO TBDMSO O OTBDMS 52 N Aryl HN N HO O N O Aryl: phenyl 87 4-methoxyphenyl 88 4-methylphenyl 89 4-cyanophenyl 90 3,5-dimethylphenyl 91 4-biphenyl 92 2-fluorenyl 93 TBDMSO N N Br N TBDMSO O N H H N Aryl O OTBDMS OTBDMS Aryl: phenyl 136 4-biphenyl 137 4-methylphenyl 138 3,5-dimethylphenyl 139 132 OCPE N N HO N(iPr)2 OCPE N N N O P Aryl: phenyl 108 4-methoxyphenyl 109 4-methylphenyl 110 4-cyanophenyl 111 3,5-dimethylphenyl 112 4-biphenyl 113 2-fluorenyl 114 OCPE N N(Me)2 N(Me)2 OH N N O N NC Aryl: phenyl 66 4-methoxyphenyl 67 4-methylphenyl 68 4-cyanophenyl 69 3,5-dimethylphenyl 70 4-biphenyl 71 2-fluorenyl 72 N DMTrO NH O OTBDMS NH N N N NH2 N Aryl HN O N N O 63 OBn TBDMSO NH2 N O OH Aryl HN N Br N N N OCPE N H O H N Aryl N HO N N N N Aryl O OH OH Aryl: phenyl 140 4-biphenyl 141 Aryl: phenyl 142 4-biphenyl 143 310 Anhang OCPE N N N N N DMTrO OCPE N H H N N Aryl DMTrO O NC O O P N N N N Aryl O NC N(iPr)2 O Aryl: phenyl 148 4-biphenyl 149 O P N(iPr)2 Aryl: phenyl 150 4-biphenyl 151 N N O N O N N TBDMSO N N N N O NH2 N TBDMSO N NH AcN N DMTrO OTBDMS 174 5'-d(CTCG*GCGCCATC) G*: C8-Anil 184 C8-4-ABP 185 5'-d(GTAG*AATTCTAC) G*: C8-Anil 189 C8-Anis 190 C8Tol 191 C8-4-Cyano 192 C8-3,5-DMA 193 C8-4-ABP 194 C8-2-AF 195 N2-Hydr. Anil 198 N2-Hydr. 4-ABP 199 N2-Azo Anil 200 N2-Azo 4-ABP 201 NC OTBDMS 175 N N N(Me)2 O NH2 O O NH AcN O O P N(iPr)2 179 5'-d(CTCGGCG*CCATC) G*: C8-Anil 186 C8-4-ABP 187 C8-Anis 188 5'-d(G*TAGAATTCTAC) G*: C8-Anil 196 C8-4-ABP 197 5'-d(AAATG*AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) G*: C8-Anil 203 C8-Anis 204 C8Tol 205 C8-3,5-DMA 206 C8-4-ABP 207 C8-2-AF 208 N2-Hydr. Anil 209 N2-Hydr. 4-ABP 210 N2-Azo Anil 211 N2-Azo 4-ABP 212 311 Persönliches 12. Persönliches Veröffentlichungen - Vukadinović, D; Böge, N.P.H.; Balzarini, J.; Meier, C. Nucl., Nucl., Nucleic Acids, 2005, 24, 939-942. - Böge, N.; Gräsl, S.; Meier, C. J. Org. Chem. 2006, 71, 9728-9738. - Böge, N.; Szombati, Z.; Meier, C. Nucl., Nucl., Nucleic Acids 2007, 26, 705708. - Böge, N.; Krüger, S.; Schröder, M.; Meier, C. Synthesis 2007, 24, 3907-3914. - Böge, N.; Krüger, S.; Meier, C. Coll. Czech. Chem. Commun. 2008, submitted. - Böge, N.; Schröder, M.; Meier, C. Synlett 2008, submitted. - Böge, N.; Jacobsen, M.; Di Pasquale, F.; Marx, A; Meier, C. Angew. Chem. 2008, submitted. Posterbeiträge 12.5.2005 Criegee-Festveranstaltung an der Universität Karlsruhe 3.9.-6.9.2006 17th International Roundtable on Nucleotides and Nucleic Acids in Bern Nucleosides, 312 Persönliches Persönliche Daten Nicolas Böge am 21.4.1981 geboren in Hamburg Schul- und Hochschulausbildung 1987-1991 Besuch der Grundschule Turmweg in Hamburg 1991-2000 Besuch des Gymnasium Eppendorf mit Abschluss Abitur Oktober 2000 Beginn des Chemie-Studiums an der Universität Hamburg 16.9.2004 Mündliche Diplomhauptprüfungen an der Universität Hamburg 1.10.2004-24.3.2005 Anfertigung der Diplomarbeit („Arylamin-modifizierte Oligonucleotide“) im Arbeitskreis von Prof. Dr. C. Meier im Institut für Organische Chemie an der Universität Hamburg 24.3.2005 Verleihung des akademischen Grad des Diplom-Chemiker 1.4.2005 Beginn der Promotion im Arbeitskreis von Prof. Dr. C. Meier im Institut für Organische Chemie an der Universität Hamburg Universitäre Arbeiten 2004-2006 Betreuung des „Integrierten Synthesepraktikum“ 2004-2006 Betreuung des „Fortgeschrittenenpraktikum in Organischer Chemie“ 2006-2007 Betreuung des „Grundpraktikum in Allgemeiner Chemie“ Stipendien und Einladungen - Einladung zur Criegee-Festveranstaltung 2005 in Karlsruhe durch Prof. Richert - Reisekostenstipendium durch die „Gesellschaft deutscher Chemiker“ (Fachgruppe Biochemie) zur Teilnahme am 17. International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids in Bern 2006 313 Persönliches Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig angefertigt habe und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwandt habe. Ich erkläre außerdem, dass diese Dissertation werde in gleicher noch in anderer Form bereits in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat. Ich habe früher außer mit den im Zulassungsversuch urkundlich vorgelegten Graden keine weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht. Hamburg, den 17.1.2008 314
