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Ethanolproduktion in Streptomyceten
Untersuchungen zur Biosynthese von
Didesmethylmensacarcin
Expression einer Saccharose-Synthase in Streptomyceten
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Uwe Hardter
Freiburg, im November 2012
Dekan:
Prof. Dr. Andreas Bechthold
Vorsitzender des Promotionsausschusses:
Prof. Dr. T. Koslowski
Referent:
Prof. Dr. Andreas Bechthold
Korreferent:
Prof. Dr. Thorsten Friedrich
Tag der Abgabe:
12.12.2012
„Erst am Schluss einer Arbeit entdeckt man,
was an den Anfang gehört hätte.“
(Blaise Pascal)
Wissenschaftliche Publikationen
Ethanol Production in Actinomycetes after Expression of Synthetic adhB and pdc
Uwe Hardter, Marta Luzhetska, Sandra Ebeling and Andreas Bechthold. The Open
Biotechnology Journal. 2012 (6):13–16
Cloning and sequencing of the biosynthetic gene cluster for saquayamycin Z and
galtamycin B and elucidating the assembly of their saccharide chains
Erb, A.; Luzhetskyy, A.; Hardter, U. and Bechthold, A.
Chembiochem. 2009 May 25; 10(8):1392-401
Vorträge
„Ethanol production in Streptomyces coelicolor“(Posterpräsentation, Kurzvortrag)
,International VAAM-Workshop "Biology of Bacterial Producers of Natural Compounds",
Bonn, 30.09.2011
Generating biofuel-producing Streptomyces strains
Arbeitsgruppenseminar Schauinsland, 15.04.2010
“Generating biofuel-producing Streptomyces strains”,
Doktorandenseminar, Freiburg, 25.11.2009
“Butanol, a secondary metabolite of actinomycetes?”
Arbeitsgruppenseminar, Breitnau, 20.05.2009
Poster
Novel insights into the function of oxygenases involved in the mensacarcin biosynthesis
Sarah Maier, Tobias Pflüger, Uwe Hardter, Susana LA Andrade and Andreas Bechthold
Actinobacteria within soils: Capacities for mutualism, symbiosis and pathogenesis
Symposium, 25 – 28.10 2012 in Münster
Ethanol production in actinomycetes after expression of synthetic adhB and pdc
Uwe Hardter, Sandra Ebeling, Marta Luzhetska and Andreas Bechthold
International VAAM-Workshop "Biology of Bacterial Producers of Natural Compounds",
Bonn, 30.09.2011
Metabolic engineering of Streptomyces coelicolor to produce ethanol
Marta Luzhetska, Sandra Ebeling, Uwe Hardter and Andreas Bechthold,
Congress Biology of Streptomyces, Münster, 7.-11.10.09
The function of glycosyltransferases involved in the biosynthesis of the angucycline
antibiotic saquayamycin Z
Chargé, A.; Luzhetskyy, A.; Hardter, U. und Bechthold, A.
VAAM International Workshop. “Biology of Bacteria Producing
Natural Products”, Nonnweiler-Otzenhausen, 04. – 06.10. 2007.
The Impact of Glycosyltransferases on Natural Product Research
Chargé, A.; Hardter, U.; Linnenbrink, A. und Bechthold, A.
Tag der Forschung der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften, Freiburg,
06. Juli 2007.
Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................... 1
1
1.1
Produktion von Biokraftstoffen in Streptomyceten .................................................. 1
1.2
Untersuchungen zur Biosynthese von Didesmethylmensacarcin ............................. 2
1.3
Expression einer Saccharose-Synthase in Streptomyceten ...................................... 2
EINLEITUNG ..................................................................................................... 3
2
2.1
Das Energieversorgungssystem der Erde .................................................................. 3
2.2
Nachwachsende Rohstoffe als Energieträger der Zukunft ?.................................... 3
2.2.1 Energie aus Biomasse ................................................................................................. 3
2.2.2 Formen der Biomasse und chemische Struktur .......................................................... 3
2.2.2.1
2.3
Chemische Struktur der zuckerhaltigen Biomasse ............................................. 4
Beispiele und Gliederung der Biokraftstoffe ............................................................. 5
2.3.1.1
Biokraftstoffe der ersten Generation .................................................................. 5
2.3.1.2
Biokraftstoffe der zweiten Generation ............................................................... 5
2.3.1.3
Biokraftstoffe der dritten Generation ................................................................. 5
2.3.2 Vor- und Nachteile der Nutzung pflanzlicher Rohstoffe ........................................... 6
2.3.2.1
Biotreibstoffproduktion auf Kosten der Nahrungsmittelherstellung .................. 6
2.3.2.2
Umweltproblematik ............................................................................................ 6
2.3.2.3
Bewertung der Biokraftstoffe hinsichtlich der Umweltproblematik .................. 6
2.4
Synthetische Biologie.................................................................................................... 8
2.5
Streptomyceten ........................................................................................................... 10
2.5.1 Entwicklung der Streptomyceten ............................................................................. 10
2.5.2 Genetik der Streptomyceten ..................................................................................... 11
2.5.3 Streptomyceten als Sekundärstoffproduzenten ........................................................ 12
2.6
Mensacarcin ................................................................................................................ 12
2.6.1 Mensacarcin, ein Sekundärmetabolit von Streptomyces bottropensis ..................... 12
2.6.2 Bioaktivität von Mensacarcin ................................................................................... 13
Inhaltsverzeichnis
2.6.3 Biosynthese von Mensacarcin .................................................................................. 14
2.7
Zielsetzung dieser Arbeit ........................................................................................... 15
MATERIAL UND METHODEN ........................................................................ 17
3
3.1
Chemikalien, Medienbestandteile und Enzyme ...................................................... 17
3.1.1 Chemikalien und Medienbestandteile ...................................................................... 17
3.1.2 Enzyme, Reaktionspuffer ......................................................................................... 18
3.1.3 Kits ........................................................................................................................... 19
3.2
Nährmedien, Lösungen und Puffer .......................................................................... 19
3.2.1 Nährmedien .............................................................................................................. 19
3.2.1.1
Kultivierung von E. coli ................................................................................... 19
3.2.1.2
Kultivierung von Streptomyceten .................................................................... 20
3.2.2 Antibiotika ................................................................................................................ 20
3.2.3 Puffer und Lösungen ................................................................................................ 21
3.3
3.2.3.1
Puffer und Lösungen zur DNA Isolierung ....................................................... 21
3.2.3.2
Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese................................ 22
3.2.3.3
Puffer und Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion .......................................... 23
3.2.3.4
Puffer und Lösungen für die SDS PAGE ......................................................... 23
3.2.3.5
Puffer und Lösungen für die Proteinaufreinigung ............................................ 24
Bakterienstämme ........................................................................................................ 25
3.3.1 Escherichia coli ........................................................................................................ 25
3.3.2 Streptomyceten ......................................................................................................... 26
3.4
Kulturbedingungen .................................................................................................... 26
3.4.1 Kultivierung von E. coli ........................................................................................... 26
3.4.2 Kultivierung von Streptomyceten ............................................................................ 27
3.4.3 Herstellung von Dauerkulturen ................................................................................ 27
3.5
Cosmide, Plasmide und Vektoren ............................................................................. 28
3.5.1 Plasmide und Vektoren zum Projekt Ethanolproduktion und Butanolproduktion in
Streptomyceten ..................................................................................................................... 28
3.5.2 Cosmide, Plasmide und Vektoren zum Projekt Mensacarcin .................................. 29
Inhaltsverzeichnis
3.5.3 Plasmide und Vektoren für das Projekt Susy ........................................................... 29
3.5.4 Plasmide für allgemeine molekularbiologische Arbeiten ........................................ 30
3.6
Molekularbiologische Methoden ............................................................................... 30
3.6.1 Methoden zum Transfer von DNA ........................................................................... 30
3.6.1.1
CaCl2- vermittelte Transformation von E. coli ................................................ 30
3.6.1.1.1 Herstellung von CaCl2 kompetenten Zellen ............................................... 30
3.6.1.1.2 CaCl2-vermittelte Transformation von E. coli und Blau-Weiß–Selektion . 31
3.6.1.2
Plasmid-Transfer durch Elektroporation .......................................................... 31
3.6.1.2.1 Herstellung von Glycerol-kompetenten E. coli-Zellen zur Elektroporation
31
3.6.1.2.2 Elektroporation von E. coli ......................................................................... 32
3.6.1.3
Konjugations-vermittelter Transfer von Plasmid-DNA ................................... 32
3.6.1.3.1 Vorbereitung des Donorstamms ................................................................. 32
3.6.1.3.2 Vorbereitung des Rezipienten und Konjugation ........................................ 33
3.6.2 Amplifikation von DNA durch Polymerase-Kettenreaktion .................................... 34
3.6.2.1
Polymerase –Kettenreaktion (PCR) ................................................................. 34
3.6.2.2
PCR Bedingungen ............................................................................................ 34
3.6.2.3
Kolonie-PCR .................................................................................................... 35
3.6.2.4
Primer ............................................................................................................... 36
3.6.3 Geninaktivierung in Streptomyceten ........................................................................ 37
3.6.3.1
Redirect®Technology zur Geninaktivierung .................................................... 37
3.6.3.2
Herstellung der Resistenzkassette zur Inaktivierung von msnO2 .................... 37
3.6.3.3
Vorbereitung des E. coli-Stammes und Durchführung der Inaktivierung........ 38
3.6.3.4
Kontrolle der Geninaktivierung von msnO2 mittels PCR ................................ 39
3.6.3.5
Entfernung der Resistenzkassette ..................................................................... 40
3.6.4 Methoden zur Isolierung von DNA .......................................................................... 41
3.6.4.1
Plasmidminipräparation aus E. coli .................................................................. 41
3.6.4.2
Mini-Präparation von E. coli Plasmid-DNA mit Wizard Plus SV Minipreps
Kit (Promega) ................................................................................................................... 41
3.6.4.3
Plasmidmaxipräparation aus E. coli mit PureYieldTM Plasmid Midiprep Kit
(Promega) ......................................................................................................................... 42
3.6.4.4
Alkoholische Fällung ....................................................................................... 42
3.6.4.5
DNA Isolierung aus Actinomyceten ................................................................ 43
Inhaltsverzeichnis
3.6.5 Isolierung der gesamten RNA aus Streptomyces coelicolor .................................... 43
3.6.6 UV-metrische Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA ............................. 44
3.6.6.1
Bestimmung der DNA-Konzentration ............................................................. 44
3.6.6.2
Bestimmung der RNA-Konzentration und Reinheit ........................................ 44
3.6.7 RT-PCR .................................................................................................................... 44
3.6.8 PCR zum Nachweis der Transkripte von adhB und pdc .......................................... 45
3.6.9 DNA-Aufreinigung und Isolierung aus Agarose Gelen ........................................... 46
3.6.9.1
Agarose Gelelektrophorese .............................................................................. 46
3.6.9.2
Färben von Agarosegelen ................................................................................. 47
3.6.9.3
DNA-Isolierung und Aufreinigung aus Agarose Gelen ................................... 47
3.6.10
3.7
Klonierung von DNA ........................................................................................... 47
3.6.10.1
DNA-Analytik und Präparation durch Restriktion ....................................... 47
3.6.10.2
Ligation ........................................................................................................ 47
Biochemische Methoden ............................................................................................ 48
3.7.1 Isolierung von Proteinen aus Streptomyces ............................................................. 48
3.7.1.1
Zellaufschluss mittels der Frech Pressure Cell Press ....................................... 48
3.7.1.2
Proteinaufreinigung mittels Nickel-Affinitätschromatographie ....................... 48
3.7.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ..................................................... 49
3.8
Konstruktion von Plasmiden ..................................................................................... 50
3.8.1 Plasmide zur Etablierung der Ethanolproduktion in Streptomyceten ...................... 50
3.8.1.1
Klonierung von pUWL-H-ap ........................................................................... 50
3.8.1.2
Klonierung von pUWL-H-apf .......................................................................... 50
3.8.1.3
Klonierung von pNL1-aldh .............................................................................. 51
3.8.2 Plasmide zur Etablierung der Butanolproduktion in Streptomyceten ...................... 53
3.8.2.1
Konstruktion von pUWL-A-adhe und pUWL-H-adhe .................................... 53
3.8.3 Plasmide zur Expression einer Saccharose-Synthase in Streptomyceten ................ 55
3.9
3.8.3.1
pMK-vsifinal .................................................................................................... 55
3.8.3.2
pUCPK1 ........................................................................................................... 56
3.8.3.3
Erstellung von pUC-vsifinal ............................................................................. 57
3.8.3.4
Klonierung von pUWL-H-vsifinal ................................................................... 57
3.8.3.5
Klonierung von pAF-vsifinal ........................................................................... 58
Produktion, Isolierung und Analytik von Naturstoffen ......................................... 59
Inhaltsverzeichnis
3.9.1 Produktion von Didesmethylmensacarcin und dessen Derivaten ............................ 59
3.9.2 Isolierung von Naturstoffen ..................................................................................... 60
3.9.2.1
Extraktion von Naturstoffen ............................................................................. 60
3.9.3 Analytik von Naturstoffen ........................................................................................ 60
3.9.3.1
Analytische HPLC/ESI-MS ............................................................................. 61
3.9.3.1.1 Parameter der Esi- Ionisationsquelle .......................................................... 61
3.9.3.1.2 HPLC-Gradient und Parameter .................................................................. 62
3.9.3.2
NMR-Spektroskopie zur Strukturaufklärung von msn-UH ............................. 62
3.9.4 Aufreinigung und Konzentrierung der Sekundärstoffe ............................................ 62
3.10
3.9.4.1
Festphasenextraktion ........................................................................................ 62
3.9.4.2
Präparative Dünnschichtchromatographie ....................................................... 63
3.9.4.3
Präparative HPLC ............................................................................................ 63
Produktion,Extraktion und Analytik von Ethanol und Butanol ........................... 64
3.10.1
Ermittlung der Ethanolproduktion ....................................................................... 64
3.10.2
Extraktion von Ethanol......................................................................................... 65
3.10.2.1
Referenzprobe zur Berechnung der Ethanolkonzentration .......................... 65
3.10.3
Bestimmung der Trockenmasse ........................................................................... 65
3.10.4
Headspace-Gaschromatographie .......................................................................... 66
3.10.4.1
Prinzip der Headspace-Gaschromatographie ............................................... 66
3.10.4.2
Durchführung der Headspace-GC ................................................................ 66
3.10.4.3
Geräteparameter HS-GC .............................................................................. 67
3.10.4.3.1 Geräteparameter Gaschromatograph ........................................................ 67
3.10.4.3.2 Geräteparameter Probenaufgabesystem ................................................... 68
3.10.5
Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometer GC/MS ...................... 68
3.10.5.1
Prinzip der GC/MS ....................................................................................... 68
3.10.5.2
Durchführung der GC/MS ............................................................................ 68
3.10.5.2.1 Berechnung der Ethanolkonzentration in den Medien ............................. 69
3.11
Laborgeräte, Verbrauchsmaterialien ....................................................................... 70
3.12
Software, Datenbanken, Internetservices ................................................................ 71
4
ERGEBNISSE ................................................................................................... 72
Inhaltsverzeichnis
4.1
Untersuchungen zur Biosynthese von Didesmethylmensacarcin........................... 72
4.1.1 Biosynthesegencluster von Mensacarcin ................................................................. 72
4.1.2 Konstruktion von Cos2O2 ..................................................................................... 75
4.1.3 Konstruktion der Mutante für die heterologe Expression von Cos2O2................. 76
4.1.3.1
Konstruktion von S. albus x Cos2ΔO2 ............................................................ 76
4.1.3.2
Überexpression von msnR1 in S. albus x Cos2O2......................................... 76
4.1.3.2.1 Konstruktion von S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1 ......................................... 76
4.1.4 Produktionsanalyse von S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1 ............................................. 76
4.1.5 Aufreinigung von Msn-UH ...................................................................................... 78
4.1.5.1
Festphasenextraktion ........................................................................................ 79
4.1.5.2
Präparative Dünnschichtchromatographie ....................................................... 79
4.1.5.3
Präparative HPLC ............................................................................................ 81
4.1.6 Strukturaufklärung von Msn-UH mittels NMR-Spektroskopie ............................... 82
4.2
Ethanol-Produktion in Streptomyceten ................................................................... 85
4.2.1 Hintergrund und Zielsetzung des Projektes ............................................................. 85
4.2.2 Ethanol-Biosyntheseweg von Zymomonas mobilis und die Gene adhB und pdc ... 85
4.2.3 Erstellung eines Plasmides für die Expression von adhB und pdc .......................... 87
4.2.4 Untersuchung verschiedener Streptomyceten .......................................................... 87
4.2.5 Kontrolle der Exkonjuganden .................................................................................. 87
4.2.6 Kontrolle der Expression von adhB und pdc ........................................................... 88
4.2.7 Anzucht der Exkonjuganden .................................................................................... 88
4.2.8 Ethanolproduktion in verschiedenen Streptomyces Stämmen ................................. 89
4.2.9 Vergleich unterschiedlicher Produktionsmedien...................................................... 90
4.2.9.1
HA-, NL111- und E1-Medium ......................................................................... 90
4.2.10
Veränderung des pH-Wertes ................................................................................ 91
4.2.11
Abhängigkeit der Ethanolproduktion von der Kultivierungszeit ......................... 92
4.2.12
Semianaerobe Kultivierung .................................................................................. 93
4.2.12.1
4.2.13
Untersuchung der Evaporation von Ethanol aus dem Medium .................... 95
Coexpression von pUWL-H-ap und pNL1-aldh .................................................. 95
4.2.13.1
Generierung von S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh ............................... 96
4.2.13.2
Anzucht von S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh und Analytik der
Ethanolproduktion ............................................................................................................ 96
4.2.14
Anreicherung von NL111-Medium mit Glukose ................................................. 99
Inhaltsverzeichnis
4.2.15
Zusatz von Pyruvat zum Produktionsmedium ................................................... 100
4.2.16
Formiat-Dehydrogenase zur Regeneration von NADH ..................................... 102
4.2.16.1
Funktion von Fdh im Stoffwechsel ............................................................ 102
4.2.16.2
Klonierung von pUWL-H-apf .................................................................... 102
4.2.16.3
Konjugation und Anzucht von S. coelicolor+adh+pdc+fdh ..................... 103
4.2.16.4
Analytik der Produktionskulturen .............................................................. 103
4.2.16.4.1 Anzucht unter Zugabe Formiat ............................................................... 103
4.2.17
Ethanolproduktion in S. coelicolor M1154 ........................................................ 105
4.2.17.1
S. coelicolor M1154 ................................................................................... 105
4.2.17.2
Konjugation von S. coelicolor M1154 ....................................................... 105
4.2.17.3
Kultivierung und Analytik der Ethanolproduktion .................................... 105
4.2.17.4
Auswirkung von Pyruvat auf die Ethanolproduktion in S. coelicolor M1154
108
4.2.17.5
4.3
Beurteilung der Experimente mit S. coelicolor M1154 ............................. 109
Butanolproduktion in S. coelicolor A(3)2 ............................................................... 109
4.3.1 Eigenschaften von Butanol..................................................................................... 109
4.3.2 Expression von adhe in Streptomyceten ................................................................ 110
4.3.3 Konjugation verschiedener Streptomyceten-Stämme ............................................ 111
4.3.4 Kultivierung von S. coelicolor+adhe und S. sp. TÜ6071 WT+adhe ..................... 111
4.4
Expression einer Saccharose-Synthase in Streptomyceten .................................. 112
4.4.1 Susy ........................................................................................................................ 112
4.4.2 Ursprung und Hintergrund des Projekts ................................................................. 113
4.4.3 Fusion von Sus1 und Vsi ........................................................................................ 113
4.4.3.1
Klonierung von pUC-vsifinal ......................................................................... 114
4.4.3.2
Klonierung von pUWL-H-vsifinal ................................................................. 114
4.4.4 Konjugation verschiedener Streptomyceten mit pUWL-H-vsifinal....................... 114
4.4.5 Nachweis von Susy durch Kultivierung in Minimalmedium ................................. 114
4.4.6 Nachweis von Sysy durch SDS-PAGE .................................................................. 114
4.4.7 Verbindung von vsifinal mit einem His-Tag.......................................................... 115
4.4.7.1
Expression von pAF-vsifinal und Aufreinigung von Vsifinal mittels
Affinitätschromatographie.............................................................................................. 115
Inhaltsverzeichnis
5
DISKUSSION .................................................................................................. 116
5.1
Untersuchungen zur Biosynthese des Didesmethylmensacarcins ........................ 116
5.1.1 Die Luciferase-ähnliche Monooxygenase MsnO2 ................................................. 117
5.1.2 Msn-UH .................................................................................................................. 118
5.1.3 MsnO2 im Biosynthesestoffwechsel von Didesmethylmensacarcin ..................... 119
5.2
Susy ............................................................................................................................ 123
5.3
Ethanol und Butanolproduktion in Streptomyceten ............................................. 123
5.3.1 Butanolproduktion in Streptomyceten ................................................................... 123
5.3.2 Ethanolproduktion in verschiedenen Streptomyceten ............................................ 125
5.3.3 Medien .................................................................................................................... 125
5.3.4 PH-Wert ................................................................................................................. 126
5.3.5 Zeitabhängigkeit der Ethanolproduktion und S. coelicolor M1154 ....................... 126
5.3.6 Semianaerobe Kultivierung .................................................................................... 127
5.3.7 Anreicherung des Produktionsmediums mit Pyruvat ............................................. 128
5.3.8 Coexpression von adhB, pdc und aldh ................................................................... 129
5.3.9 Zusammenfassende Beurteilung der Ethanolproduktion in Streptomyceten ......... 129
6
LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................ 132
7
ANHANG ......................................................................................................... 137
7.1
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ 137
7.2
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................. 139
Zusammenfassung
1
Zusammenfassung
1.1 Produktion von Biokraftstoffen in Streptomyceten
Die vorliegende Arbeit umfasst drei Themenbereiche. Der Hauptteil bezieht sich auf die
Untersuchungen zur Ethanolproduktion in Streptomyceten. Verschiedene Stämme dieser
Gattung wurden mit unterschiedlichen für die Ethanolproduktion wichtigen Genen
ausgestattet. Dabei zeigte sich, dass S. coelicolor A(3)2das beste Ergebnis bezüglich der
produzierten Menge an Ethanol pro Volumen Medium lieferte. Die Ethanolausbeute war
jedoch zunächst mit 400-610 mg/L gering. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Ausbeute und
Produktionsrate zu steigern sowie sie auf einem reproduzierbar hohen Level zu etablieren. Als
Fernziel sollte die Produktion nicht mehr aus leicht verwertbarer Glukose erfolgen, sondern
stattdessen aus komplexen Kohlenhydraten wie sie zum Beispiel in Pflanzenabfällen
vorkommen.
•
adhB und pdc, zwei Gene aus dem Ethanolbiosynthesestoffwechsel von Zymomonas
mobilis wurden in verschiedenen Streptomyceten heterolog exprimiert.
•
Versuche mit verschiedenen Medien und unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen
wurden durchgeführt.
•
Die Auswirkung erhöhter Glukosekonzentration in den Produktionsmedien wurde
untersucht.
•
Pyruvat, ein wichtiges Intermediat im Bakterienstoffwechsel, wurde zugesetzt.
•
Das Gen fdh, welches für eine Formiatdehydrogenase codiert und aus dem Bakterium
Candida boindii stammt, wurde mit adhB und pdc in S. coelicolor A(3)2 coexprimiert.
Dadurch sollte die Regeneration von NADH innerhalb des Bakterienstoffwechsels
erfolgen.
•
Ebenfalls wurde versucht, die Ausbeute an Ethanol durch Extraktion bei verändertem
pH-Wert zu verbessern.
Die Ethanolproduktion konnte von circa 600 mg/L auf maximal circa 3,1 g/L
Produktionsmedium gesteigert werden. Da die Arbeiten zur Steigerung der Produktionsrate
sehr viel Zeit benötigten und die Ausbeute relativ zu anderen ethanolproduzierenden
Mikroorganismen wie Z. mobilis oder Saccharomyces cerevisiae noch immer sehr gering war,
konnten weiterführende Experimente mit cellulosehaltigen Ausgangsstoffen im Rahmen
dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden.
1
Zusammenfassung
Ergänzend zur Synthese von Ethanol, sollte die Synthese von Butanol, eines weiteren
Biokraftstoffs, in S. coelicolor etabliert werden. Dafür wurde adhe aus Z. mobilis heterolog in
S. coelicolor
exprimiert.
Produktionsmedien
Es
gefunden
konnten
werden,
jedoch
nur
Spuren
von
die
nicht
auf
einen
Butanol
in
den
funktionierenden
Butanolsyntheseweg hindeuten.
1.2 Untersuchungen zur Biosynthese von Didesmethylmensacarcin
Ein weiteres Projekt dieser Arbeit waren Untersuchungen zur Biosynthese des
Didesmethylmensacarcins. Dabei wurde innerhalb des Biosynthesegenclusters das Gen
msnO2, welches für die Oxidoreduktase MsnO2 codiert, ausgeschaltet. Das daraus
resultierende Cosmid mit dem deletierten Gen msnO2 wurde in Streptomyces albus
eingebracht und so eine Knockoutmutante erstellt. In den entstandenen Stamm mit der
Bezeichnung S. albus x Cos2ΔO2, wurde zusätzlich über das Plasmid pKR1 [1], das für
Streptomyceten spezifische Regulatorgen msnR1 eingebracht. Bei der anschließenden
Produktionsanalyse wurde ein neuer Sekundärstoff im Medium gefunden, welcher extrahiert
und aufgereinigt werden konnte. Davon wurde ein 1H-NMR gemessen. Ein darauf
basierender Strukturvorschlag für die Substanz liegt vor.
1.3 Expression einer Saccharose-Synthase in Streptomyceten
Durch die Expression eines Gens, welches für eine Saccharose-Synthase codiert, sollte für
Streptomyceten ein Abbauweg für das Disaccharid Saccharose erschlossen werden. Dafür
wurde die codierende DNA mit der Sequenz eines Signalpeptids fusioniert. Dieses sollte die
Expression des für die Saccharose-Synthase codierenden Gens verstärken, sowie den
Transport des Proteins durch die Bakterienzellwand in das Medium ermöglichen. Damit sollte
Streptomyceten die Spaltung von Saccharose ermöglicht werden. Es wurde versucht, die
Saccharose-Synthase im Medium und innerhalb der Zellen separat nachzuweisen, was jedoch
nicht gelungen ist
2
Einleitung
2
Einleitung
2.1 Das Energieversorgungssystem der Erde
Die weltweite Energieversorgung basiert bis heute zum Großteil auf fossilen Energieträgern
wie Kohle, Gas oder Erdöl. Bis zum Jahr 2005 wurden noch 81 % der Energie weltweit aus
diesen Rohstoffen gewonnen [2]. Hinsichtlich der zunehmend knapper werdenden Ressourcen
dieser Rohstoffe, gewinnt die Produktion von Biokraftstoffen aus nachwachsenden
Rohstoffen neben der Nutzung von Wind- und Solarenergie, zunehmend an Bedeutung [3].
Beispielsweise stieg die weltweite Produktion von Ethanol, einem der bedeutendsten
Biokraftstoffe, in den letzten 10 Jahren von circa 30000 x 106 L auf fast 80000 x 106 L pro
Jahr. Das entspricht einer enormen Steigerungsrate, die zum Großteil durch die vermehrte
Nutzung von Ethanol als Biokraftstoff zustande kam [4].
Neben den knapper werdenden Ressourcen fossiler Rohstoffe, stellt die Emission von CO2
und anderen Treibhausgasen, welche bei der Verbrennung dieser aus organischem
Kohlenstoff bestehenden Verbindungen entstehen, ein großes Problem dar. Demzufolge sind
sie mit hoher Wahrscheinlichkeit entscheidende Mitverursacher der globalen Erwärmung [5].
Ein wichtiges Kriterium für die Energiegewinnung der Zukunft ist somit, die Emission von
Treibhausgasen so gering wie nur möglich zu halten. Ob die Nutzung von Biokraftstoffen
dahingehend Vorteile gegenüber den fossilen Brennstoffen bringt, wird von Experten
kontrovers diskutiert und soll in den folgenden Kapiteln näher erörtert werden.
2.2 Nachwachsende Rohstoffe als Energieträger der Zukunft ?
2.2.1 Energie aus Biomasse
Nachwachsende Rohstoffe wie Holz, Ölpflanzen, Zuckerrohr, Zuckerrüben, Getreide oder
Mais liefern energietechnisch nutzbare Biomasse und somit die Grundlage für die Gewinnung
von Biokraftstoffen.
2.2.2 Formen der Biomasse und chemische Struktur
Es gibt verschiedene Formen pflanzlicher Biomasse, die industriell zur Energiegewinnung
genutzt werden. Sie lassen sich in vier unterschiedliche Gruppen einordnen [3].
Eine große Quelle möglichen Ausgangsmaterials stellt dabei die holzverarbeitende Industrie
dar. Abfälle aus der Möbelherstellung, aus Sägewerken und Papierfabriken gehören in diese
3
Einleitung
Kategorie. Papier und Kartonagen aus dem Hausmüll liefern ebenfalls verwertbare Biomasse
sowie auch landwirtschaftliche Abfälle aus Ernteresten und Überproduktion. Spezielle
Energie und Futterpflanzen wie Zuckerrohr und Zuckerrüben, Raps oder Mais bilden die
vierte Kategorie. Aus ihnen wird bis zum heutigen Tage der bei weitem größte Teil der
Biokraftstoffe hergestellt. Jedoch sind diese Ressourcen begrenzt, da sie auch zur Herstellung
von Biogas, Pflanzenölen und Nahrungsmitteln benötigt werden.
2.2.2.1 Chemische Struktur der zuckerhaltigen Biomasse
Die beschriebenen Rohstoffe können durch ihre unterschiedliche chemische Struktur klar
untergliedert werden. Diese Unterschiede sind von großer Bedeutung hinsichtlich ihrer
Verwendung zur Herstellung von Biotreibstoffen und soll im Verlauf dieser Arbeit noch
erläutert werden.
Folgende drei Strukturklassen können unterschieden werden:
1. Zucker
Einfach verwertbare Monosaccharide oder Disaccharide aus Zuckerrohr, Zuckerrüben,
Melasse oder Früchten. Sie können von den meisten Mikroorganismen metabolisiert
werden.
2. Stärke
Polysaccharid aus linearen Ketten von α-D-Glukose, welche über glykosidische
Bindungen miteinander verknüpft sind. Stärke kommt zum Beispiel in Weizen, Mais,
Reis und Kartoffeln vor. Sie muss zuerst mit Hilfe von Enzymen hydrolysiert werden.
Das kann zum Beispiel durch Vorbehandlung mit α-Amylase, Aufkochen der Stärke
und anschließender Hydrolysierung mit Glucoamylasen gemacht werden. Ein
aufwändiges und kostenintensives Verfahren, wodurch die Nutzung von stärkehaltigen
Pflanzen wirtschaftlich zurzeit noch uninteressant ist.
3. Cellulose, Hemicellulose und Lignocellulose
Cellulose besteht aus unverzweigten Ketten von β-D-Glukose. Als Hemicellulose
werden in pflanzlicher Biomasse vorkommende Gemische von verschiedenen
Polysacchariden bezeichnet. Vor allem bestehen sie aus Pentosen wie Xylose und
Arabinose. Lignocellulose ist aus Cellulosefasern, welche in eine Matrix aus
Proteinen, Pektin, Lignin und Hemicellulosen eingebettet sind zusammengesetzt [6].
Cellulose, Hemicellulose und Lignocellulose kommen zum Beispiel in Holz,
landwirtschaftlichen Abfällen und Papierabfällen vor. Diese müssen ebenfalls einer
Vorbehandlung mit konzentrierten Säuren (zum Beispiel Schwefelsäure) oder
4
Einleitung
Enzymen ausgesetzt werden, bevor Mikroorganismen die dann monomer vorliegenden
Zucker umsetzen können. Dieser Schritt macht die Nutzung wiederum kostenintensiv
und aufwändig.
Aus Lignocellulose besteht der Großteil der weltweit jährlich produzierten
pflanzlichen Biomasse [7]. Die Gesamtproduktion umfasst etwa 200 x 109 t, von
denen circa 8-20 x 109 t jährlich nutzbar wären [3].
2.3 Beispiele und Gliederung der Biokraftstoffe
Auf Basis der verschiedenen Rohstoffe, die für die Erzeugung von Biokraftstoffen verwendet
werden, können diese in solche der ersten, zweiten und dritten Generation eingeteilt werden.
2.3.1.1 Biokraftstoffe der ersten Generation
Für die Erzeugung von Biokraftstoffen der ersten. Generation werden nur einzelne
Bestandteile der Pflanze, in denen einfach verwertbare Kohlenhydrate, wie zum Beispiel
Glukose und Stärke oder das Öl der Pflanze enthalten ist, genutzt. Dazu gehören Biodiesel,
Pflanzenöl und Bioethanol welcher zum Beispiel aus Zuckerrohr oder –rüben hergestellt wird.
2.3.1.2
Biokraftstoffe der zweiten Generation
Als Rohstoffe werden hier auch die schwer zugänglichen Kohlenhydrate, zum Beispiel
Cellulose, Hemicellulose oder Lignocellulose, wie sie in Holz, Pflanzenresten oder in
Abfällen der Papierproduktion vorkommen, verwendet. Biomethan, synthetisches BtL,
Cellulose-Ethanol und Biokerosin gehören in diese Gruppe.
2.3.1.3 Biokraftstoffe der dritten Generation
Für die dritte Generation an Biokraftstoffen werden ebenfalls komplexe Kohlenhydrate zur
Herstellung genutzt. Zusätzlich wird durch höhere Biomasseproduktion eine effizientere
Flächennutzung realisiert. Zum Beispiel gehören Biokraftstoffe aus Algen zu dieser
Kategorie.
5
Einleitung
2.3.2 Vor- und Nachteile der Nutzung pflanzlicher Rohstoffe
2.3.2.1 Biotreibstoffproduktion auf Kosten der Nahrungsmittelherstellung
In den USA und Brasilien wird Bioethanol fast ausschließlich aus Mais, anderen
Getreidearten, Zucker und Ölpflanzen hergestellt. Die damit verbundene drastische
Steigerung des Bedarfs an diesen Pflanzen geht mit einer Erhöhung der Lebensmittelpreise
einher. Beispielsweise stiegen die Preise für Weizen um 143 %, für Mais um 105 %, Reis
verteuerte sich um 154 % und die Preise für Zucker und Ölpflanzen stiegen ebenfalls um
100-200 % [8].
2.3.2.2 Umweltproblematik
Da der Anbau von Pflanzen zum Zwecke der Ethanolproduktion in den USA und in Brasilien
von der Regierung stark subventioniert wird, werden immer größere Anbauflächen auf Kosten
von Regenwäldern, Graslandschaften und Getreideanbauflächen erschlossen. Das alleine
verschlechtert die CO2 Bilanz enorm, da in den Pflanzen „gespeichertes“ CO2 beim Roden
(verbrennen) der Kulturen wieder frei wird. Für die Behandlung der Anbauflächen werden
zudem Phosphate und Nitrate beingesetzt, die in Flüsse und Gewässer gelangen, dort zu
einem Sauerstoffdefizit führen und die im Wasser lebenden Tiere gefährden.
Der Einsatz von Stickstoff als Dünger führt zu einer Mehrbelastung der Atmosphäre mit NO2.
Dazu kommt ein gesteigerter Wasserverbrauch. Allein die Menge für die Verarbeitung von
Getreide zu Ethanol verursacht einen enormen Mehrverbrauch. Zur Kultivierung und Anzucht
werden noch einmal 200-mal mehr Wasser benötigt als für die anschließende Verarbeitung
[8].
2.3.2.3 Bewertung der Biokraftstoffe hinsichtlich der Umweltproblematik
Unter Experten auf dem Gebiet der Umweltforschung wird der Nutzen von Biokraftstoffen
für Mensch und Natur kontrovers diskutiert. Viele vertreten dabei die Meinung, dass durch
Biokraftstoffe die Belastung unserer Atmosphäre zunehmen und es darüber hinaus noch zu
verschiedenen anderen Problemen kommen würde. Andere hingegen sind überzeugt von den
Qualitäten der Biotreibstoffe und sehen darin großes Potential hinsichtlich der Sicherstellung
der Energieversorgung und des Schutzes unserer Umwelt.
Bringt die Nutzung von Biokraftstoffen also anstatt eines Vorteils sogar Nachteile gegenüber
der Nutzung von fossilen Brennstoffen?
6
Einleitung
T. Searchinger et al. beschreiben in ihrem Artikel „Use of U.S. Croplands for Biofuels
Increases Greenhouse Gases Through Emission from Land-Use Change“ [9] ein Modell zur
Bewertung und Berechnung der Emission von Treibhausgasen durch die Nutzung
verschiedener Rohstoffquellen. Darin werden die verschiedenen Vor- und Nachteile der
Produktion von Biokraftstoffen sehr detailliert dargestellt und wissenschaftlich erörtert. Als
grundlegendes Problem der Biokraftstoffe wird die Nutzung von speziellen Energiepflanzen,
d.h. Getreide, Mais, Zuckerrohr oder Ölpflanzen genannt, die auch für die Gewinnung von
Futter und Nahrungsmitteln benötigt werden Um die Versorgung mit Nahrungsmitteln zu
sichern und zusätzlich den durch Biokraftstoffproduktion gesteigerten Bedarf zu decken,
müssen die Erträge dieser Pflanzen gesteigert werden. Dafür müssen neue Anbauflächen
erschlossen werden, welche zum Großteil auf Kosten von Wäldern, Graslandschaften oder
ähnlichem angelegt werden. Durch Abholzen oder Umpflügen dieser Areale geht ein großer
Anteil des in den Pflanzen „gespeicherten“ Kohlenstoffs als CO2 in die Atmosphäre zurück.
Searchinger et al. bezeichnen diesen Wechsel der Landnutzung als “Landuse-change“. [9]
Ein wichtiger Faktor, der für die Biokraftstoffproduktion spricht, wird als „Feedstock-Carbon
uptake credit“ bezeichnet. Damit ist die CO2 Assimilation der wachsenden Energiepflanzen
gemeint. Sie steht der Emission durch den „Landuse-change“ gegenüber. Für die Berechnung
der Gesamtbilanz werden weitere Faktoren berücksichtigt. Sie stellen Schlüsselfaktoren dar,
welche entscheiden, ob am Ende ein Vor- oder Nachteil durch Nutzung von Biomasse zur
Kraftstoffproduktion zu Buche steht. Drei wichtige Punkte, welche die Bilanz zugunsten der
Biokraftstoffe verbessern, werden genannt:
1. Man kann davon ausgehen, dass durch Ertragssteigerung auf den bestehenden
Ackerlandschaften ein Teil der zusätzlich benötigten Menge an Energiepflanzen abgedeckt
wird, somit verringert sich die zusätzlich benötigte Anbaufläche.
2. Da die Preise für Lebensmittel durch geringeres Angebot steigen, wird auch der Verbrauch
zurückgehen. Dies wiederum führt ebenfalls dazu, dass weniger Ackerfläche zur Produktion
von Lebens- und Futtermitteln benötigt. Dafür können Energiepflanzen angebaut werden,
ohne dass neues Ackerland erschlossen werden muss.
3. Durch den vermehrten Support von Getreide, Mais und den anderen Energiepflanzen sinkt
der Export von Lebensmitteln. Somit wird auch dadurch ein Teil der früher zur anderen
Zwecken genutzten Anbauflächen für die Produktion von Energiepflanzen frei.
7
Einleitung
Ergebnis der Analysen ist, dass die Mehremission von CO2 durch die Nutzung von
pflanzlichen Rohstoffen für die Biokraftstoffproduktion früher oder später ausgeglichen wird
und längerfristig eine deutliche Verbesserung zu verzeichnen ist.
Je nachdem, welche Menge an Biokraftstoffen produziert werden soll und als entscheidendes
Kriterium, welche Rohstoffquellen für die Produktion genutzt werden, gehen die
Berechnungen über einen Zeitraum von 167 Jahren im schlechtesten Fall, bis hin zu nur 4
Jahren im günstigsten Fall. Eine enorm große Zeitspanne, die noch einmal unterstreicht, wie
entscheidend es ist, anstatt der momentan genutzten Energiepflanzen andere Rohstoffe für die
Biokraftstoffgewinnung zu nutzen und damit den Zeitrahmen, bis ein Vorteil zu verzeichnen
ist, möglichst kurz zu halten.
Ein wichtiger Aspekt der in den Studien von Searchinger et al. unberücksichtigt bleibt ist die
wachsende Weltbevölkerung, durch die wiederum ein größerer Bedarf an Nahrungsmitteln
und damit an Anbauflächen für Getreide und andere Futterpflanzen entsteht. Dazu kommt das
mehr Land als Wohnfläche genutzt werden muss, wodurch eine problematische
Konkurrenzsituation entsteht.
Es wird daher weltweit mit Nachdruck daran gearbeitet, ein Verfahren zu entwickeln, um die
Produktion von Biokraftstoffen aus industriellen, landwirtschaftlichen oder Haushaltsabfällen
zu etablieren. Wie in 2.2.2 beschrieben, handelt es sich dabei um Biomasse, die aus
komplexen Kohlenhydraten, vor allem Cellulose, Hemicellulose oder Xylose bestehen. Diese
müssen zunächst aufgespalten werden und in Glukosebausteine zerlegt werden, die dann zum
Beispiel für die Ethanolproduktion verstoffwechselt werden können.
2.4 Synthetische Biologie
Das Interesse der biotechnologischen Industrie ist groß, einen Weg zu finden, um
kostengünstige und in großer Menge vorhandene cellulose- und hemicellulosehaltige
Biomasse für die Herstellung der Biokraftstoffe verfügbar zu machen.
Dabei werden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt, die auf dem Verfahren der
synthetischen Biologie basieren. Charakteristisch für die synthetische Biologie ist, dass
natürliche, biologische Systeme verändert und gegebenenfalls mit chemisch synthetisierten
Komponenten zu einer neuen Einheiten kombiniert werden, wodurch neue biologische
Prozesse ablaufen können. Ein typisches Beispiel für die synthetische Biologie ist das Design
von maßgeschneiderten Stoffwechselwegen („Metabolic Engineering“). Man versteht
darunter die Modifizierung beziehungsweise Ergänzung vorhandener Stoffwechselwege in
8
Einleitung
Mikroorganismen. Die dazu erforderlichen DNA-Sequenzen werden chemisch oder mit
molekularbiologischen
Methoden synthetisiert,
zusammengefügt
(rekombiniert)
und
anschließend in den entsprechenden Empfängerorganismus eingebracht. Somit konnten auch
Wege für artifizielle und in der Natur in dieser Form nicht vorkommende neuartige
Biosyntheseprozesse eröffnet werden. So gesehen ist die synthetische Biologie eine
Weiterentwicklung des „Metabolic Engineering“.
Bereits mehrfach wurde über die Entwicklung von ethanolproduzierenden E. coli Stämmen
berichtet. Ingram et al. gelang es bereits 1987 die Produktion von Ethanol in E. coli zu
realisieren. Sie beschreiben die heterologe Expression des sogenannten PET-Operons
(„production
of
ethanol“),
auf
welchem
die
Gene
adhB
und
pdc
aus
dem
Ethanolbiosynthesestoffwechsel von Z. mobilis unter der Kontrolle eines einzigen Promoters
liegen in E. coli TC4 [10].
Um einen Organismus zur Produktion von Biokraftstoffen aus cellulose- beziehungsweise
hemicellulosehaltigen Rohmaterialien zu generieren, müssen einerseits, wie oben beschrieben,
die genetischen Informationen zur Biosynthese des Biokraftstoffes, andererseits aber auch die
Fähigkeit zur Metabolisierung der genannten Rohstoffe vorhanden sein.
Ein bereits etabliertes Verfahren ist die schon erwähnte Vorbehandlung der Biomasse mit
Säure oder speziellen Enzymen, wodurch die komplexen Kohlenhydratketten gespalten
werden. Diese können dann von Mikroorganismen, welche entweder von Natur aus, oder
durch “Metabolic Engineering“ über die genetische Information zur Biosynthese des
Biokraftstoffes verfügen metabolisiert werden. Dies ist wie beschrieben ein zeitaufwendiges
und im Vergleich zur Herstellung von konventionellen Kraftstoffen aus Erdöl,
kostenintensives Verfahren, was die Nutzung dieser Rohstoffe unwirtschaftlich macht.
Eine andere Möglichkeit ist es, Bakterien, welche von Natur aus in der Lage sind
cellulosehaltige Rohstoffe zu verstoffwechseln, mit der genetischen Information zur
Produktion von Ethanol auszustatten.
So versuchten E. Guedon und seine Mitarbeiter, durch Expression von adhB und pdc aus Z.
mobilis in Clostridium cellulolyticum, einen Organismus für die Produktion von Ethanol zu
generieren, welcher von Natur aus zur Metabolisierung cellulosehaltiger Biomasse in der
Lage ist. Jedoch konnten sie trotz vorhandener Genexpression von adhB und pdc keine
nennenswerte Ethanolproduktion nachweisen[11].
Ein weiteres Beispiel ist die Entwicklung des gramnegativen Bakteriums Klebsiella oxytoca,
welches mit dem PET-Operon transformiert wurde [12]. Der resultierende Stamm
9
Einleitung
K. oxytoca P2 und der gentechnisch noch weiter modifizierte Stamm M5A1 können, ähnlich
wie E. coli, alle in pflanzlicher Biomasse vorkommenden Hexosen und Pentosen
metabolisieren sowie auch Cellobiose und Cellotriose aufnehmen und verstoffwechseln,
wodurch der Zusatz von Enzymen vermieden werden kann [13].
2.5 Streptomyceten
Bakterien der Gattung Streptomyces gehören zur Ordnung Actinomycetales. Es sind ubiquitär
vorkommende, grampositive, vornehmlich im Boden lebende Bakterien. Sie haben aufgrund
ihrer Eigenschaft, zahlreiche Naturstoffe zu produzieren enorme Bedeutung in medizinischen,
tiermedizinischen und landwirtschaftlichen Bereichen. Warum das so ist und in wie fern sie
auch für die Produktion von Biokraftstoffen prädestiniert sein könnten, soll anhand ihrer
geschichtlichen Entwicklung erläutert werden
2.5.1 Entwicklung der Streptomyceten
Die ersten Bakterien entstanden vor etwa 3,5 Billionen Jahren. Durch die Entwicklung der
Photosynthese und der damit verbundenen Bildung einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre der
Erde, ergaben sich neue Möglichkeiten der Energiegewinnung für verschiedene Lebewesen
und es kam zu einer explosionsartigen Entwicklung zahlreicher Bakterienarten. Zu dieser
Zeit, etwa vor 2 Billionen Jahren entstanden auch die ersten Actinomyceten. [14]. Erst sehr
viel später, etwa vor 450 Millionen Jahren entwickelten sich die ersten Streptomyceten.
Ausschlaggebend dafür könnte die Besiedlung der Erde mit Grünpflanzen gewesen sein [14],
wodurch es zu einer starken Selektion zu Gunsten von Mikroorganismen kam, welche in der
Lage sind, robuste pflanzliche Biomasse zu spalten und die darin enthaltenen Nährstoffe zu
verwerten. Streptomyceten und verschiedene Pilze gehörten zu diesen Mikroorganismen. Sie
konnten sich durch ihr myzelartiges Wachstum auf totem Pflanzenmaterial anlagern, es
durchdringen und sich davon ernähren. Möglich war dies durch ihre Fähigkeit, zahlreiche
hydrolytisch wirksame Enzyme wie Cellulasen und Xylanasen zu produzieren und an ihre
Umgebung abzugeben. Sehr wahrscheinlich kam es durch die Konkurrenz der Pilze um die
vorhandenen Nährstoffe und den daraus resultierenden Selektionsdruck dazu, dass
Streptomyceten auch bald die Fähigkeit zur Produktion von Chitanasen erlangten, wodurch
die Zellwände der Pilze aufgebrochen werden konnten [14].
Ein weiteres Charakteristikum der Streptomyceten ist ihr komplexer Lebenszyklus.
Unter optimalen Wachstumsbedingungen, zum Beispiel im Labor, bilden sie ein
fadenförmiges Substratmyzel aus. Dieses kann bei Nährstoffmangel oder anderen nicht
10
Einleitung
optimalen Wachstumsbedingungen zum Luftmyzel umgebildet werden. Daraus können
wiederum Sporen abgeschnürt werden, wodurch diese Organismen sehr widerstandsfähig
gegenüber verschiedenen Stressbedingungen sind. Diese Phase im Lebenszyklus wird als
Überdauerungsform bezeichnet. Die Bildung von Sporen ermöglicht den Bakterien auch ein
Standortwechsel. Sie können durch Wasser, Wind oder Tiere von einem Ort widriger
Wachstumsbedingungen an einen Standort mit besserem Nähstoffangebot gespült,
beziehungsweise getragen werden. Dort können die Sporen schließlich wiederum zum
Substratmyzel auskeimen, wodurch der Zyklus geschlossen wird [15]. Ein Vorteil der sich im
Laufe der Evolution ergab, nachdem sich der Sauerstoffanteil in der Atmosphäre, bedingt
durch die Photosyntheseaktivität der Pflanzen auf den heutigen Level von circa 20 %
einpendelte und sich tierisches Leben entwickelte. Dies war vor etwa 300 Millionen Jahren
der Fall [14]
Streptomyceten
gehören
zu
den
grampositiven
Bakterien
und
sind
somit
sehr
widerstandsfähige Mikroorganismen. Sie sind in der Lage, relativ niedrige pH-Werte, hohe
Temperaturen, sowie hohe Zucker- und Salzkonzentrationen zu tolerieren [16], wodurch sie
relativ leicht kultivierbar sind. Weiterhin produzieren sie zahlreiche hydrolytisch wirksame
Enzyme, eine wertvolle Eigenschaft welche sie auch für die industrielle Produktion von
Biokraftstoffen aus den unterschiedlichsten Rohstoffen und damit zur Verbesserung der CO2
Bilanz und Reduktion von Treibhausgasen prädestiniert (2.3.2.3).
Zusammenfassend kann man feststellen, dass Streptomyceten mit ihrer großen Vielfalt von
über 500 verschiedenen Arten und den oben genannten Qualitäten vielversprechende
Mikroorganismen für die Produktion von Biokraftstoffen sein könnten.
2.5.2 Genetik der Streptomyceten
Auf genetischer Ebene zeichnet Streptomyceten und andere Actinomyceten ein hoher Anteil
der Nukleotidbasen Guanin und Cytosin der genomischen DNA aus, welche meist als lineares
Chromosom vorliegt [17], [18].
Ein Umstand, welcher für die molekularbiologische Arbeit im Sinne der synthetischen
Biologie entscheidende Bedeutung hat und diese nicht unbedingt einfacher macht.
Entsprechend ihrer Codon-Präferenz, dem sogenannten „codon-usage“, exprimieren
Streptomyceten bestimmte tRNA-Moleküle in sehr geringer Menge. Somit stehen für manche
Basentripletts wie zum Beispiel UUA, UUU oder AUA auf der mRNA, keine passenden
tRNA Moleküle zur Verfügung. Dadurch kann die Translation bestimmter Gensequenzen
gehemmt und die Proteinsynthese unterdrückt werden [19], [20]. Sämtliche heterolog
11
Einleitung
exprimierten Gene aus artfremden Organismen sollten folglich der Codon Nutzung von
Streptomyceten angepasst werden. Dies wird durch stille Mutationen von seltenen Codons
erreicht. Das bedeutet, man ersetzt einzelne Nukleotide in synthetisch hergestellten Genen
durch andere Basentripletts, welche für dieselbe Aminosäure codieren. Somit kann
angenommen werden, dass es nicht aufgrund artfremder Codons zu einer ungenügenden
Genexpression kommt.
2.5.3 Streptomyceten als Sekundärstoffproduzenten
Etwa 67 % der bekannten aus Mikroorganismen stammenden Naturstoffe wurden aus
Bakterien der Ordnung Actinomycetales isoliert. 80 % der antibiotisch wirksamen Substanzen
werden dabei von Streptomyceten gebildet [21]. Somit spielen diese Bakterien eine sehr
bedeutende Rolle für die Entdeckung, Produktion und Entwicklung neuer Arzneistoffe.
Als im Erdboden lebende Bakterien sind Streptomyceten darauf spezialisiert, ihre Nährstoffe
aus pflanzlicher und tierischer Biomasse zu gewinnen, welche, wie oben bereits beschrieben,
sehr verschieden aufgebaut ist. Zudem ist das Angebot der Nährstoffe in verschiedenen Böden
unterschiedlich, weshalb bodenlebende Bakterien im Laufe der Evolution die Fähigkeit
erworben haben, eine Vielzahl verschiedener Kohlenstoffquellen zu nutzen. Wie bereits
erwähnt, sind Streptomyceten in der Lage, eine große Anzahl verschiedener hydrolytisch
wirksamer Enzyme zu synthetisieren [22], um Kohlenhydrate, Zuckeralkohole, organischen
Säuren, Aminosäuren oder bei einigen Stämmen sogar Kohlenwasserstoffe, Lignin, Tannin
oder Gummi zu metabolisieren [23]. Somit sind Streptomyceten theoretisch in der Lage, zur
Produktion von Ethanol neben Glukose eine Vielzahl anderer auch komplexer
Kohlenhydratquellen zu nutzen.
2.6 Mensacarcin
2.6.1 Mensacarcin, ein Sekundärmetabolit von Streptomyces bottropensis
Der
Actinomycet
Streptomyces
bottropensis,
dessen
ursprünglicher
Name
Streptomyces sp. Gö C4/4 war, wurde im Erdboden um die Göttinger Nordmensa entdeckt
[24]. Aus Fermenterkulturen dieses Stammes konnte der Naturstoff Mensacarcin (Abbildung
1) isoliert werden, welcher bei einem Screening auf Circulardichroismus aktive Metaboliten
aufgefallen war [24]. Neben dem Hinweis auf den Fundort der Substanz, wird durch den
Namen Mensacarcin auch auf ihre zytotoxische und zytostatische Aktivität hingewiesen.
12
Einleitung
Die Struktur des Mensacarcins wird durch das trizyklische Dekaketid Grundgerüst geprägt
und konnte aufgrund seiner aromatischen Grundstruktur und durch Fütterungsexperimente mit
isotopenmarkierten Acetateinheiten dem PKS II Metabolismus zugeordnet werden [24]. Die
Substanz weist einen hohen Oxygenierungsgrad auf, wobei vor allem die Epoxidgruppen an
C-4a/C-10a und C-12/C-13 hervorzuheben sind, welche für von Streptomyceten gebildete
Derivate des PKS II Metabolismus eine Besonderheit darstellen. Ebenfalls konnte durch
Fütterung mit L-[Methyl-13C] Methionin gezeigt werden, dass die Methylierung der
Hydroxylgruppen an C-9 und C-10 mit Hilfe von S-Adenosylmethionin erfolgen [24]. Durch
die Kultivierung von S. bottropensis unter [18O2]-Atmosphäre wurde schließlich bewiesen,
dass die Sauerstoffatome an C-2, C-4, C-4a/C-10a, C-5 und C-12/C-13 aus dem
Luftsauerstoff stammen [24].
Abbildung 1: Mensacarcin
2.6.2 Bioaktivität von Mensacarcin
Für Mensacarcin wurde gemäß [25] in Studien von Beil et al. eine zytostatische und
zytotoxische Aktivität, vergleichbar mit jener der klinisch eingesetzten Krebstherapeutika
Doxorubicin und Cisplatin nachgewiesen. Für alle drei Substanzen wurde die Aktivität gegen
HMO2-Magenkrebszellen, HEP G2-Leberkrebszellen und MCF 7-Brustkrebszellen bewiesen,
für Mensacarcin zudem die Zytotoxische und Zytostatische Wirkung gegen die multiresistente
Magenkrebszelllinie KATO III. Die Ergebnisse der Studien von Beil et al. sind in Tabelle 1
dargestellt.
Der Wirkmechanismus von Mensacarcin ist nicht vollständig aufgeklärt, jedoch sind die
Oxiranringe von Mensacarcin typische Strukturmerkmale von Zytostatika, die als Alkylantien
13
Einleitung
kovalente DNA-Addukte bilden [26]. Mensacarcinderivate ohne Epoxidstruktur in der
Seitenkette zeigen eine deutlich geringere Aktivität, was für die alkylierende Wikkomponente
spricht. Weiterhin wird eine interkalierende Funktion des nahezu planaren Grundgerüstes in
die DNA-Doppelhelix angenommen, ein Wirkmechanismus, der von den Anthracyclinen
bekannt ist [27].
Tabelle 1: Zytostatische und zytotoxische Wirkung der Substanzen Mensacarcin, Cisplatin und
Doxorubicin. Die zytostatische Wirkung wird durch die TGI dargestellt (TGI = 100 % Inhibition des
Zellwachstums). Die zytotoxische Wirkung wurde durch LC50 bestimmt (LC50 = letale Dosis für 50 % der
Zellen).
Substanz
Wert
Mensacarcin
TGI
LC50
TGI
LC50
TGI
LC50
Doxorubicin
Cisplatin
Wirkung auf Tumorzellen (Konzentration in μmol/L)
HMO 2
HEP G2
MCF 7
Kato III
0,6
5,0
0,2
< 0,5
2,4
> 50
0,4
1,6
0,1
1,0
0,2
> 50
0,4
> 50
> 50
> 50
1,5
5,0
10
> 50
36
> 50
> 50
> 50
2.6.3 Biosynthese von Mensacarcin
A. Linnenbrink konnte im Rahmen seiner Doktorarbeit das Biosynthesegenclusters von
Mensacarcin identifizieren. Es wurde beim Screening einer Cosmid-Bibliothek des Stammes
Streptomyces bottropensis auf dem Cosmid Cos2 lokalisiert [28]. Die heterologe Expression
dieses Cosmids in Streptomyces albus J1074 (im Folgenden S. albus) führte jedoch nicht wie
im natürlichen Produzenten Streptomyces bottropensis zur Produktion von Mensacarcin
(Abbildung
1),
sondern
zur
Produktion
des
nicht
methylierten
Derivates
Didesmethylmensacarcin (Abbildung 2) [28].
Ebenfalls
konnte
A.
Linnenbrink
auf
dem
Biosynthesegencluster
des
Didesmethylmensacarcins (Abbildung 2) 9 Gene identifizieren, die für Oxygenasen codieren
(msnO1-msnO9) [28]. Eine große Struktur- und Regioflexibilität macht diese Enzyme zu
wertvollen Instrumenten in der kombinatorischen Biosynthese. Daher ist es von großer
Bedeutung, die Funktion möglichst vieler Vertreter dieser Enzymklasse aufzuklären.
K. Probst gelang es, fünf der insgesamt neun identifizierten Oxygenasen zu inaktivieren und
durch Sekundärstoffanalytik der erstellten Knockoutmutanten einen hypothetischen
Biosyntheseweg für Didesmethylmensacarcin vorzuschlagen (Abbildung 25) [1]. Zur
Bestätigung der postulierten Enzymfunktionen und zur weiteren Aufklärung des
14
Einleitung
Biosyntheseweges von Didesmethylmensacarcin wurde im Rahmen dieser Arbeit die
Funktion von MsnO2 bei der Biosynthese von Mensacarcin untersucht.
Abbildung 2: Didesmethylmensacarcin
2.7 Zielsetzung dieser Arbeit
Hauptbestandteil dieser Arbeit war es, Streptomyceten die Produktion von Biokraftstoffen zu
ermöglichen. Erste Ergebnisse auf diesem Gebiet konnten bereits in Rahmen der
Diplomarbeit von Sandra Ebeling beschrieben werden [29]. Hier wurde nach Expression der
Gene adhB und pdc in S. coelicolor Ethanol nachgewiesen. Die relativ geringe Ausbeute und
Produktionsrate sollte erhöht werden. Es wurde versucht, dieses Ziel durch verschiedene
Strategien zu erreichen. Coexpression von fdh, adhB und pdc, Veränderung der
Kultivierungsbedingungen, der Medien, Zusatz von Glukose, Supplementierung mit Pyruvat,
Verminderung der Sauerstoffversorgung und Optimierung der Extraktion aus den
Produktionskulturen wurden untersucht. Die Expression der Gene adhB und pdc sollte
bewiesen werden.
Des Weiteren wurde versucht, einen Butanolsyntheseweg zu etablieren. Dafür wurde in
S. coelicolor das Gen adhe exprimiert.
Das korrespondierende Gen für das pflanzliche Protein Sus1, einer Saccharose-Synthase aus
Solanum tuberosum, sollte in Streptomyceten exprimiert werden. Um zu gewährleisten, dass
das gebildete Protein aus den Bakterienzellen in das Produktionsmedium sezerniert werden
kann, sollte es an ein Signalpeptid gekoppelt werden. Hierfür wurde ein Fusionskonstrukt aus
dem Gen susyGC, bei dem die Nukleotidsequenz von sus1 an den „codon-usage“ von
Streptomyceten angepasst wurde, und der Signalsequenz des Gens vsi,(„vsiSSQ“) erstellt
15
Einleitung
(„vsifinal“). Durch diese Verbindung von SusyGC und VsiSSQ sollte die Ausschleusung des
Proteins aus der Zelle ermöglicht werden. Anschließend sollte die Saccharose-Synthase im
Medium nachgewiesen werden.
Ein
weiterer
Teil
dieser
Didesmathylmensacarcin.
Arbeit
Dabei
waren
sollte
das
Untersuchungen
Gen
msnO2,
zur
Biosynthese
welches
innerhalb
von
des
Biosynthesegenclusters von Didesmethylmensacarcin auf Cos2 lokalisiert ist ausgeschaltet
werden. Eine msnO2 Deletionsmutante von S. albus sollte erstellt und weitergehend
untersucht werden. Ein neu gebildetes Stoffwechselprodukt sollte extrahiert und aufgereinigt
werden. Schließlich sollte eine NMR Messung zur Strukturaufklärung des Intermediates
führen und damit zur Funktionsaufklärung von MsnO2 beitragen
16
Material und Methoden
3
Material und Methoden
3.1 Chemikalien, Medienbestandteile und Enzyme
3.1.1
Chemikalien und Medienbestandteile
Tabelle 2: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile und deren Hersteller beziehungsweise
Bezugsquellen
Name
Acrylamid
Agar
Ag arose
ε-Amino-N-Capronsäure (ACA)
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Anorganische Salze, diverse
Bench Top N3026L Längenstandard
Bis(2-hydroxyethyl)aminoTris(hydroxymethyl)methan (Bis-Tris)
5-Brom-4-Chlor-3-IndolylGalaktopyranosid (X-Gal)
Bromphenolblau
Bovines Serumalbumin
Coomassie Brilliant Blue G-250
Coomassie Brilliant Blue R-250
Desoxynukleotide (dNTPs)
Diethylpyrocarbonat (DEPC)
Dextrin
Essigsäure und Eisessig
Ethidiumbromid
Hefeextrakt
HMW Native Marker
Glukose
Glycerin
Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid
(IPTG)
1 kb DNA-Ladder
LB-Medium (Lennox)
Malzextrakt
D-Mannitol
Methylenblau
3 (N-Morpholino) - Propansulfonsäure
(Mops)
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Hersteller / Bezugsquelle
Roth (Karlsruhe, D)
Roth
Roth
Roth
Roth
Sigma-Aldrich (Deisenhofen, D);
Merck (Darmstadt, D); Roth
Promega (Mannheim, D)
Roth
AppliChem GmbH (Darmstadt, D)
Roth
Promega
Roth
Serva (Heidelberg, D)
Promega
Roth
Roth
Roth
Roth
Roth
GE Healthcare
Roth
Roth
Roth
Promega
Roth
Difco (Detroit, US)
Roth
Merck
Roth
Roth
17
Material und Methoden
(Dinatrium) Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA)
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
Precision Plus Protein Standards All Blue
Rotiphorese Gel 30 % (m/V)
Saccharose
Sojamehl
N, N, N‘,N‘-Tetramethylethan-1,2-diamin
(TEMED)
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)
Tris-HCl
Tryptic Soy Broth (TSB)
Roth
Sigma-Aldrich
Biorad Laboratories GmbH
Roth
Südzucker (Mannheim, D)
W. Schoenenberger GmbH (Magstadt, D)
Roth
Roth
Roth
Roth
3.1.2 Enzyme, Reaktionspuffer
Tabelle 3: Verwendete Enzyme und deren Hersteller beziehungsweise Bezugsquellen
Enzyme
BSA
DNAse
Lysozym (aus Hühnereiweiss)
Pfu-Polymerase (5U), Pfu-Polymerasepuffer
10-fach
Proteinase K
RNAse A
Taq-Polymerase (5 U), Taq-Polymerasepuffer
10-fach
T4-DNA-Ligase, T4-DNA-Ligase-Puffer
Restriktionsendonucleasen und Puffer je nach
Enzym
Pfu-DNA-Polymerase
Alkalische Phosphatase
Quantiscript Reverse Transkriptase
Quantiscript RT Buffer
18
Hersteller / Bezugsquelle
Promega (Mannheim); Stratagene
(La Jolla, CA, USA), NEB (Ipswich, US)
Promega
Sigma-Aldrich (Deisenhofen); Fluka
(Taufkirchen, D)
Herstellung AG Bechthold
Promega
Qiagen (Hilden)
Herstellung AG Bechthold
Promega
Promega, Stratagene, NEB
Promega
Promega
Quiagen
Quiagen
Material und Methoden
3.1.3 Kits
Tabelle 4: Verwendete Kits und deren Hersteller beziehungsweise Bezugsquellen
Name
Pure Yield Plasmid Midiprep System
QuantiTect Rev. Transcription Kit
Rapid DNA Ligation Kit
SV Total RNA Isolation System
Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System
Wizard® SV Gel and PCR Clean Up System
Hersteller / Bezugsquelle
Promega
Quiagen
Roche Diagnostics (Mannheim, D)
Promega
Promega
Promega
3.2 Nährmedien, Lösungen und Puffer
3.2.1 Nährmedien
Die Angaben beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, jeweils auf 1L Medium. Die
Zusammensetzungen der Medien entsprechen den Angaben in Hopwood et al. [15]
beziehungsweise Sambrook et al. [30]. Den Festmedien wurde vor dem Autoklavieren
2 % (w/v) Agar zugesetzt. Antibiotika und andere hitzeempfindliche Substanzen wurden erst
nach dem Autoklavieren unter sterilen Bedingungen hinzugegeben.
3.2.1.1 Kultivierung von E. coli
Folgendes Medium wurde zur Kultivierung der E. coli Stämme verwendet:
Tabelle 5: Medium zur Kultivierung von E. coli.
Medium
Bestandteile
LBMedium
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
Menge /
Konzentration
10,0 g
5,0 g
10,0 g
19
Herstellung
Bestandteile in H2Obidest lösen und auf pH
7,0 einstellen, auf 1 L auffüllen und
autoklavieren
Material und Methoden
3.2.1.2 Kultivierung von Streptomyceten
In Tabelle 6 sind die Medien, welche zur Kultivierung von Streptomyces Stämmen verwendet
wurden aufgeführt.
Tabelle 6: Medien zur Kultivierung verschiedener Streptomyceten
Medium
HAMedium
TSBMedium
NL111Medium
E1Medium
MSMedium
DNPMMedium
Bestandteile
Menge/
Konzentration
Hefeextrakt
4,0 g
Malzextrakt
10,0 g
Glukose
4,0 g
CaCl2
1,0 M
Tryptic Soy broth 30,0 g
Lab Lemco
Fleischextrakt
Malzextrakt
CaCO3
Stärke
Glukose
Hefeextrakt
Pharmamedia
CaCO3
NaCl
K2HPO4 x 3 H2O
MgSO4 x 7 H2O
Leitungswasser
D-Mannitol
Sojamehl
Leitungswasser
20,0 g
100,0 g
10,0 g
20,0 g
20,0 g
2,5 g
3,0 g
1.0 g
1,0 g
1,0 g
1,0 g
ad 1000 mL
20,0 g
20,0 g
ad 1000 mL
Dextrin
Soytone
Bäckerhefe
Mops
H20 bidest
40,0 g
7,5 g
5,9 g
21,0 g
ad 1000 mL
Herstellung
Bestandteile in Leitungswasser lösen, pH auf
7,3 einstellen, auf 1 L auffüllen und
autoklavieren, CaCl2 nach dem Autoklavieren zugeben
Mit H2Obidest auf ein Liter auffüllen und
autoklavieren
Bestandteile in 1 L lauwarmem Leitungswasser auflösen, pH auf 7,2 einstellen und
autoklavieren
Auf pH 7,2 einstellen und je 100 mL in
Erlenmeyerkolben mit Schikane und Spirale
abfüllen, autoklavieren.
nach dem Autoklavieren 10 mL einer 1 M
MgCl2-Lösung durch Sterilfilter zugeben.
Auf pH 6,8 einstellen und je 100 mL in 500
mL Erlenmeyerkolben mit Schikane und
Spirale abfüllen, autoklavieren.
3.2.2 Antibiotika
Von den Antibiotika wurden Stammlösungen hergestellt, die bei –20 °C gelagert wurden.
Wässrige Lösungen wurden sterilfiltriert. Hierfür wurde ein Membranfilter mit einer
Porengröße von 0,2 µm verwendet. Zur Herstellung von antibiotikumhaltigen Medien wurden
diese nach dem Abkühlen auf etwa 50 °C, unter sterilen Bedingungen mit AntibiotikumLösungen in den angegebenen Endkonzentrationen versetzt. Aufbewahrt wurden die Medien
bei 4–6 °C im Kühlraum oder Kühlschrank.
20
Material und Methoden
Tabelle 7: Antibiotika, verwendete Konzentrationen und Lösungsmittel
Antibiotikum
Konzentration der Stammlösung
µg/µL]
Apramycin
100
Carbenicillin 50
Hygromycin
50
Kanamycin
30
Phosphomycin 100
Spectinomycin 50
Tetracyclin
5
Thiostrepton 50
Endkonzentration
µg/mL
50-75
50
50-100
30
100-400
50
5
50
Lösungsmittel
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
EtOH
DMSO
3.2.3 Puffer und Lösungen
3.2.3.1 Puffer und Lösungen zur DNA Isolierung
Tabelle 8: Puffer und Lösungen zur Isolierung von DNA aus E. coli.
Bezeichnung
Lösung P1 (Zur
Isolierung von PlasmidDNA aus E. coli)
Lösung P 2
(zur Isolierung von
Plasmid-DNA aus
E. coli)
Lösung P3
(Natriumacetatlösung)
Bestandteile
Tris-HCl
EDTA +
RNAse
NaOH
SDS
Menge / Konzentration
30 mM
3 mM
Herstellung, Anmerkung
pH 8,0 einstellen
0,3 M
1,8 %(w/v)
NaOH und SDS-Lösung
ansetzen und vor
Gebrauch 1:1 mischen;
nicht autoklavieren
Mit H2Obidest auf 100
mL auffüllen, ergibt 3 M
Lösung, mit Eisessig auf
pH 5,2 einstellen.
für genomische DNA pH
8,0; für Plasmid-DNA
pH 7,6 einstellen
Saccharoselösung
autoklavieren;
Tris/EDTA-Lösung auf
pH 8,0 einstellen und
autoklavieren; nach dem
Autoklavieren beide
Lösungen mischen
Promega, Mannheim
TE-Puffer
Tris-HCl
EDTA
10 mM
1 mM
TSE-Puffer
Saccharose
Tris-HCl
EDTA
10,3 % (m/V)
25 mM
25 mM
Wizard® Plus SV
Minipreps DNA
Purification System:
Resuspensionslösung
Wizard® Plus SV
Minipreps DNA
Purification System:
Tris-HCl (pH 50 mM
7,5) EDTA
10 mM
RNAse
100 μg/mL
Natriumacetat 60 mL (5M)
Guanidin4,09 mM
HCl
0,759 mM
Kaliumacetat 2,12 mM
21
Promega, Mannheim
Material und Methoden
Neutralisationslösung
Wizard® Plus SV
Minipreps DNA
Purification System:
Waschlösung
Eisessig
Kaliumacetat
Tris-HCl (pH
7,5) EDTA
(pH 8,0)
EtOH
60 mM
8,3 mM
0,04 mM
60 %
Promega, Mannheim
Tabelle 9: Lösungen zur Isolierung genomischer DNA aus Actinomyceten.
Bezeichnung
SET-Puffer
Menge / Konzentration
20 mmol/L
25 mmol/L
75 mmol/L
50 mg/mL
Herstellung, Anmerkung
auf pH 8 einstellen
Lysozym-Lösung
Bestandteile
Tris-HCl
EDTA
NaCl
Lysozym
Proteinase K-Lösung
Proteinase K
20 mg/mL
in SET-Puffer lösen
SDS 10 %
SDS
10 % (m/V)
nicht autoklavieren
NaCl
NaCl
5 mol/L
in SET-Puffer lösen
3.2.3.2 Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese
Folgende Puffer und Lösungen wurden zur Auftrennung von DNA –Fragmenten mit Hilfe der
Gelelektrophorese eingesetzt:
Tabelle 10: Puffer und Lösungen zur Auftrennung von DNA–Fragmenten mit Hilfe der Gelelektrophorese
Puffer / Lösung
Bestandteile
50 x TAE
Tris
EDTA
Tris
EDTA
H2Obidest
Saccharose
Indikatorfarbstoff
(Bromphenolblau oder
Xylen-Cyanol FF)
Ethidiumbromid
1 x TAE
Ladepuffer
Ethidiumbromid
(Stammlösung)
Färbebad
Menge /
Konzentration
2,00 M
0,05 M
0,04 M
1,0 mM
Ethidiumbromid
22
Herstellung
40 % (w/v)
0,25 % (w/v)
Mit Eisessig auf pH 8,0
einstellen
40 mL 50 x TAE mit
1960 mL H2Obidest
verdünnen
Nicht autoklavieren;
Lagerung bei 4 ° C
10,0 mg /mL
Lichtempfindlich
1,0 µg/mL
Lichtempfindlich
Material und Methoden
3.2.3.3 Puffer und Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion
Die Blau-Weiß-Selektion ermöglicht die Erkennung von Kolonien, die einen Vektor mit
integriertem DNA-Fragment enthalten. Grundlage der Methode ist das Vorhandensein des
lacZ Gens, welches nach Induktion durch IPTG, für die Produktion der Galaktosidase codiert.
Kommt es zur Insertion eines DNA-Fragmentes in lacZ, wird die Galaktosidasebildung
unterbunden. Die Aktivität der Galaktosidase ist auf Platten durch den Indikator X-Gal
(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galaktosid) direkt nachweisbar, denn das Enzym spaltet den
farblosen Indikator unter Freisetzung eines blauen Farbstoffes. Bakterien, die ein Plasmid
ohne DNA-Fragment aufgenommen haben, lacZ also aktiv ist bilden daher auf X-Gal-haltigen
Platten blaue Kolonien. Diejenigen, welche ein rekombinantes Plasmid tragen, in welchem
lacZ inaktiviert ist, sind weiß.
Tabelle 11: Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion
Lösungen
IPTGLösung
X-Gal
Lösung
Bestandteile Menge/
Konzentration
IPTG
0,2 M
X-Gal
Herstellung
In H2Obidest lösen und steril filtrieren 20 µL
pro Platte ausplattieren
In DMF lösen, autosteril; 20µL pro Platte
ausplattieren
100 mg/mL
3.2.3.4 Puffer und Lösungen für die SDS PAGE
Tabelle 12: Puffer und Lösungen zur Durchführung einer SDS-PAGE
Bezeichnung /Komponenten
SDS-Laufpuffer (10-fach)
SDS
Tris
Glycerin
Sammelgel:
H2Obidest
Tris-HCl-Lösung(0,5 mmol/L, pH
6,8)
SDS 10 % (m/V)
Rotiphorese Gel 30 % (m/V)
APS 10 % (m/V)
TEMED
Menge
Bemerkung
10 g/L
30,3 g/L
144,1 g/L
3,05 mL
1,75 mL
50 µL
665 µL
25 µL
5 µL
23
vor Gebrauch 1:10 verdünnen; bei 4 °C
lagern
Mengenangaben für zwei Gele; APS und
TEMED erst kurz vor dem Giesen
zusetzen, Gel mit Isopropanol
überschichten und 30 min
auspolymerisieren lassen
Material und Methoden
Trenngel 12,5 %
H2Obidest
Tris-HCl-Lösung (1,5 mol/L,
pH 8,8)
SDS 10 % (m/V)
Rotiphorese Gel 30 % (m/V)
APS 10 % (m/V)
TEMED
SDS-PAGE Ladepuffer
(2-fach)
Tris-HCl-Lösung
(0,5 mmol/L, pH 6,8)
SDS 20 % (m/V)
Glycerol
2-Mercaptoethanol
Bromphenolblau
Coomassie Blue- Färbelösung:
Coomassie Brilliant Blue R-250
Methanol
Essigsäure
Wasser
Entfärbelösung
Methanol
Essigsäure
Wasser
3,35 mL
2,5 mL
100 µL
4 mL
50 µL
5 µL
Mengenangaben für
zwei Gele; APS und
TEMED erst kurz vor dem Giesen
zusetzen, Gel mit Isopropanol
überschichten und 30 min
auspolymerisieren lassen
Vor Gebrauch 1:2 verdünnen; bei 4 °C
lagern
10 mL
6 mL
30 mL
15 mL
1,8 mg
2,5 mg
450 mL
100 mL
ad 1000 mL
450 mL
100 mL
ad 1000 mL
3.2.3.5 Puffer und Lösungen für die Proteinaufreinigung
Tabelle 13: Puffer und Lösungen zur Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatografie
Bezeichnung
Puffer A
Puffer B
Bestandteile
TRIS-HCl
NaCl
Imidazol
MgCl2
TRIS-HCl
NaCl
Imidazol
MgCl2
Konzentration
50 mM
0,3 M
10 mM
10 mM
50 mM
0,3 M
500 mM
10 mM
24
Anmerkung
pH 8
pH 8
Material und Methoden
3.3 Bakterienstämme
3.3.1 Escherichia coli
Tabelle 14: Escherichia coli Stämme (E. coli), die in der Arbeit verwendet wurden
Stamm
E. coli DH5α
E. coli ET12567
E. coli ET12567pUZ8002
E. coli XL1-Blue
Beschreibung/Eigenschaften
F-, φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYAargF) U169, deoR, recA1, endA1,
hsdR17
(r k-, m k+), phoA, supE44, thi-1,
gyrA96, relA1, λF-, dam-13::Tn9, dcm-6 hsdM,
hsdR, zjj-202::Tn10, recF143,
galK2, galT22, ara-14, lacY1,
xyl15, leuB6, thi1, tonA31,
rpsL136, his64, tsx78, mtl-I,
glnV44
wie E. coli ET12567 aber
zusätzlich mit pUZ8002
recA1, endA1, gyrA96, thi-1,
sdR17, supE44, relA1, lac [F´
proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]
25
Ref.
[31]
Invitrogen GmbH
[32]
[33]Stratagene
Material und Methoden
3.3.2 Streptomyceten
Tabelle 15: Streptomyces Stämme, die in der Arbeit verwendet wurden
Stamm
Streptomyces albus J1074
Beschreibung/Eigenschaften
Wirt zur heterologen Expression von Cos2, Cos2O2,
pKR1
Streptomyces coelicolor A3(2) Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc, susyGC, vsifinal, adhe, fdh
Streptomyces coelicolor CH999 Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc.
Streptomyces collinus Tü 1892 Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc.
Streptomyces cyanogenus S136 Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc.
Streptomyces cinnamonensis
Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc.
Streptomyces fradiae Ax
Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc.
Streptomyces fradiae Tü 2717 Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc.
Streptomyces lividans 1326
Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc.
S. coelicolor M1154
Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc, fdh
Streptomyces sp. Tü6071
Stamm für die heterologe Expression der Gene adhB,
pdc.
Ref.
[34]
[15]
[35]
[36]
[37]
[38]
[39]
[40]
[21]
[41]
[42]
3.4 Kulturbedingungen
3.4.1 Kultivierung von E. coli
E. coli-Kulturen wurden in LB-Medium (3.2.1.1.) unter Zusatz geeigneter Antibiotika stets
über Nacht, d.h. 14–18 h bei 37 °C inkubiert [43]; Agarböden wurden bei 37 °C im
Brutschrank inkubiert. Aufbewahrt wurden die Platten bei 4 °C im Kühlschrank.
Flüssigkulturen wurden bei 37 °C und 180 rpm auf dem Rundschüttler inkubiert. Das
Kulturvolumen betrug 1–5 mL im Mini-Maßstab. Für Plasmidisolationen im Midi-Maßstab
wurden 100 mL im 300 mL Erlenmeyerkolben mit einer Schikane verwendet.
Es wurden bei Bedarf Antibiotika in den beschriebenen Endkonzentrationen zugegeben
(Tabelle 7).
26
Material und Methoden
3.4.2 Kultivierung von Streptomyceten
Streptomyces Kulturen wurden auf HA- oder MS-Agarböden (3.2.1.2) mit entsprechendem
Antibiotikazusatz zur Selektion, bei 28 °C über einen Zeitraum von drei bis zehn Tagen
kultiviert. Die Platten wurden bei Raumtemperatur gelagert.
Zur Stammerhaltung, Konjugation, Isolierung genomischer DNA, Gesamt-RNA und zur
Anzucht einer Vorkultur wurden Streptomyces- Stämme in TSB Flüssigmedium (3.2.1.2.)
12-72 h bei 28°C auf dem Rundschüttler mit 180rpm inkubiert. Bei Bedarf wurden
entsprechende Antibiotika zur Selektion in geeigneter Konzentration (Tabelle 7) zugegeben.
Das Kulturvolumen betrug 50 bis 100 mL und es wurden 100 mL oder 300 mL
Erlenmeyerkolben verwendet.
Für Produktionskulturen wurden je nach Wachstum 500 µL bis 2 mL der Vorkultur zur
Inkubation von NL111-, HA-, E1- oder DNPM-Flüssigmedium (3.2.1.2), ebenfalls bei Bedarf
mit Zusatz entsprechender Antibiotika, verwendet (Produktionskultur). Die Anzucht der
Produktionskulturen erfolgte über 3-12 Tage, wiederum auf dem Rundschüttler bei 180 rpm
und 28 °C. Das Kulturvolumen betrug 100-150 mL und man verwendete 300 mL oder
500 mL Erlenmeyerkolben mit Schikane und einer Spirale. Zum Verschluss wurden Papieroder Wattestopfen verwendet um ein optimales Produktionsmilieu zu generieren. Bei
Experimenten, die unter semianaeroben Bedingungen (4.2.12) stattfinden sollten, wurden die
Kolben zusätzlich mit Parafilm luftdicht verschlossen.
3.4.3 Herstellung von Dauerkulturen
Zur Konservierung der verschiedenen Stämme und Mutanten wurden SaccharoseDauerkulturen hergestellt. Die Stämme wurden wie unter (3.4.2.) beschrieben angezogen. Das
Myzel wurde durch Zentrifugation bei 3000 rpm im sterilen Falcon-Tube geerntet. Der
Überstand wurde verworfen, das Pellet wurde ein- bis zweimal mit frischem Medium
gewaschen und nach erneuter Zentrifugation in 5-10 mL Saccharoselösung 25 % (m/V)
resuspendiert. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.
27
Material und Methoden
3.5 Cosmide, Plasmide und Vektoren
3.5.1 Plasmide und Vektoren zum Projekt Ethanolproduktion und
Butanolproduktion in Streptomyceten
Tabelle 16: Verwendete Vektoren und Plasmide für das Projekt Ethanol-/Butanolproduktion in
Streptomyceten.
Bezeichnung
pNL-1
pNL1-aldh
pUWL-A
Größe
8,1 kb
9,0 kb
7,7 kb
pUC57-pdc
Eigenschaften / Beschreibung
Shuttlevektor, aac(3)IV
Plasmid zur Expression von aldh
pUWL-oriT Derivat; Austausch von
Tsrr gegen
pUWL-A mit den Genen adhB und
pdc
pMB1-Origin, pIJ101-Origin; bla,
Tsrr, oriT RK2
Vektor zur Expression rekombinanter
Gene in E. coli oder Actinomyceten
pUWL-oriT Derivat mit zusätzlich
tnp(a), und hph anstatt Tsrr
pUWL-H-tnp Derivat mit den Genen
adhB und pdc; tnp wurde bei
Klonierung entfernt
pUWL-H-tnp Derivat mit den Genen
adhB, pdc und fdh; tnp wurde bei
Klonierung entfernt
pUC57 mit dem Gen pdc
pUC57-adh
pUC57 mit dem Gen adhB
3,9 kb
pUC57-aldh
pSET152
pUC57 mit dem Gen aldh
Streptomyceten - E. coli
Shuttle-Vektor
3,6
5,5 kb
pUWL-A-ap
pUWL-oriT
pUWL-H-tnp
pUWL-H-adh-pdc
PUWL-H-apf
28
Referenz / Herkunft
[44]
Diese Arbeit
[45]
10,6 kb [29]
7,4 kb
[46]
7,8 kb
[44]
10,7 kb [29]
11,8 kb Diese Arbeit
4,5 kb
GenScript
Corporation,
Piscataway, NJ, USA
GenScript
Corporation,
Piscataway, NJ, USA
Mr. Gene
[47]
Material und Methoden
3.5.2 Cosmide, Plasmide und Vektoren zum Projekt Mensacarcin
Tabelle 17: Cosmide, Plasmide und Vektoren für das Projekt „Untersuchungen zur Biosynthese des
Didesmethylmensacarcins“
Bezeichnung
Cos2
pCDFDuet
pOJ436
Cos2ΔO2
pKR1
Eigenschaften
enthält das
Biosynthesegencluster
von
Didesmethylmensacarcin
Klonierungsvektor zur
Amplifikation der
Spectinomycin
Resistenzkassette
integrativer λCosmidvektor,Apramycin
Cos2, auf welchem das
Gen msnO2 inaktiviert ist
pUWL-H-tnp Derivat mit
msnR1
Resistenz
Apramycin
Referenz / Herkunft
[28]
Spectinomycin
Novagen®
Apramycin
[47]
Apramycin
Diese Arbeit
Carbenicillin
Hygromycin
[1]
3.5.3 Plasmide und Vektoren für das Projekt Susy
Tabelle 18: Plasmide und Vektoren für das Projekt „Susy“
Bezeichnung
pAF-vsifinal
pAF/UrdR
pMK-vsifinal
pUCPK1
pUC-vsifinal
pUWL-H-vsifinal
Eigenschaften
siehe 3.8.3.5
Resistenz
Thiostrepton,
Carbenicillin
siehe 3.8.3.5
Thiostrepton,
Carbenicillin
siehe 3.8.3.1
Carbenicillin
siehe 3.8.3.2.
Carbenicillin
siehe 3.8.3.3
Carbenicillin
Expressionsvektor zur
Hygromycin,
heterologen Expression von Carbenicillin
vsifinal(Fusionskonstrukt
von susyGC und vsiSSQ,
siehe 3.8.3.4
29
Referenz/Herkunft
diese Arbeit
[48]
Mr. Gene
[48]
diese Arbeit
diese Arbeit
Material und Methoden
3.5.4 Plasmide für allgemeine molekularbiologische Arbeiten
Tabelle 19: Diverse Plasmide für allgemeine molekularbiologische Arbeiten
Bezeichnung
pUZ8002
Eigenschaften
Kmr, tra1 und tra2 Region; oriT
Fertilitätsplasmid zur
Konjugation
pSC101-BADgbaA auf Basis des pSC101 mit
Abk: pBADαβγ
hitzesensitivem Replikon,
PBAD-Promoter des ArabinoseOperons, redα, redβ, redγ
Codiert die Gene für die λ-Red
Rekombination
pUC-57
Resistenz
Kanamycin
Referenz
[49]
Tetracyclin
[50]
Carbenicillin
pUWL-H-tnp
Hygromycin,
Carbenicillin
GenScript
Corporation,
Piscataway, NJ, USA
.
[44]
pUWL-oriT mit tnp, hph anstatt
Tsrr
3.6 Molekularbiologische Methoden
3.6.1 Methoden zum Transfer von DNA
3.6.1.1 CaCl2- vermittelte Transformation von E. coli
(Verändert nach Sambrook et al. [43]
3.6.1.1.1 Herstellung von CaCl2 kompetenten Zellen
5 mL LB-Medium (3.2.1.1.) mit entsprechendem Antibiotikum wurden mit einer
Einzelkolonie E. coli beimpft und über Nacht bei 37 °C und 180 rpm auf einem Rundschüttler
angezogen. 2 mL dieser Vorkultur dienten als Inokulum für 100 mL LB-Medium, das bis zu
einer OD600 von 0,5–0,7 unter den angegebenen Bedingungen weiter inkubiert wurde. Nach
Zentrifugation (2750 x g, 10 min, 4 °C) wurde das Zellpellet in 30 mL einer eisgekühlten
0,1 M MgCL2-Lösung resuspendiert und erneut abzentrifugiert.
Anschließend wurde das Zellpellet vorsichtig in 30 mL einer eisgekühlten 0,1 M CaCl2Lösung resuspendiert und 20 min auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (2100 x g,
10 min, 4 °C) wurden die Zellen vorsichtig in 3-5 mL eisgekühlter 0,1 M CaCl2- Lösung mit
einer 15 %-igen Lösung von Glycerin (w/v) resuspendiert und in Aliquots von circa 120 µL
bei - 80°C gelagert.
30
Material und Methoden
3.6.1.1.2 CaCl2-vermittelte Transformation von E. coli und Blau-Weiß–Selektion
Pro Transformationssatz wurden 120 µL CaCl2-kompetente E. coli Zellen mit 4 µL der
einzubringenden DNA versetzt und 30 min zur Inkubation auf Eis gelagert. Anschließend
wurde der Hitzeschock durchgeführt, indem der Ansatz 2,5 min im 42 °C warmen Wasserbad
gelagert wurde. Unmittelbar danach wurde er wiederum 15 min auf Eis gehalten. Zur
Regeneration wurde 1 mL LB-Flüssigmedium zugegeben und circa 60 min im 37 °C warmen
Wasserbad inkubiert. Nach kurzer Zentrifugation (3000 rpm, 3 min, 4 °C) wurde das Pellet im
Rücklauf resuspendiert und auf LB-Agarplatten mit entsprechendem Antibiotikum
ausplattiert. Die Platten wurden schließlich über Nacht (14-16 h) bei 37 °C im Brutschrank
bebrütet. Bei Transformationen mit Vektoren, die das lac-Z-Gen zur Komplementierung der
β-Galaktosidase enthalten, wurde Blau-Weiß-Selektion (3.2.3.3) zur Detektion der
rekombinanten Plasmide durchgeführt. Während der Regenerationsphase (1 h bei 37°C)
wurden die antibiotikahaltigen Agarplatten mit einem Gemisch aus 20 µL X-Gal-Lösung,
20 µL IPTG-Lösung und 60 µL H2Obidest (steril) überschichtet. Die Transformationsansätze
wurden anschließend wie oben beschrieben ausplattiert und inkubiert.
3.6.1.2 Plasmid-Transfer durch Elektroporation
3.6.1.2.1 Herstellung von Glycerol-kompetenten E. coli-Zellen zur Elektroporation
Die Elektroporation kam hauptsächlich im Zuge des Red®/ET® Verfahrens (3.6.3.1) zum
Einsatz. Hierbei wurden Plasmide oder lineare DNA-Fragmente in E. coli DH5α-Zellen über
Elektroporation aufgenommen. Wie bereits bei der Herstellung CaCl2-kompetenter Zellen
beschrieben, wurden 100 mL LB-Medium (3.2.1.1) mit dementsprechenden Antibiotikum mit
einer Einzelkolonie E. coli beimpft und über Nacht bei 37 °C, 180 rpm auf dem Rundschüttler
angezogen. 1 mL dieser Vorkultur wurde in frisches LB-Medium (100 mL) überimpft, das bis
zu einer OD600 von 0,4–0,7 unter den angegebenen Bedingungen weiterinkubiert wurde.
Nach Zentrifugation (3000 rpm, 10 min, 4°C) wurde das Zellpellet in 40 mL eiskaltem
H2Obidest resuspendiert und erneut abzentrifugiert (3000 rpm, 10 min, 4 C). Dieser
Waschvorgang wurde ein zweites Mal wiederholt, bevor im 3. und 4. Waschschritt die Zellen
in 40 mL eiskalter 10 %iger Glycerollösung resuspendiert wurden. Nach der letzten Ernte
wurde das Pellet mit 500 – 700 μl 10 %iger Glycerollösung versetzt, homogenisiert, zu je
80 μl aliquotiert und auf Eis bis zur zeitnahen Elektroporation gelagert. Auf Vorrat
hergestellte Zellen wurden bei -80 °C gelagert.
31
Material und Methoden
3.6.1.2.2 Elektroporation von E. coli
80 μl einer zuvor frisch hergestellten 10 %igen Glycerol-Zellkultur wurden mit 4 bis 15 μl
DNA versetzt. Die Zellsuspension wurde im Anschluss in eine sterile, 1 mm dicke
Elektroporationsküvette überführt. Es wurde ein E. coli Pulser der Firma BIO-RAD für die
Transformationexperimente verwendet. Damit wurde an den Küvetten für circa 5 ms
elektrischen Strom mit der Spannung 1,80 mV entladen, wodurch die DNA in die kurzzeitig
geöffneten Zellen gelangen konnte. Zur Regenerierung wurde 0,7 mL LB-Medium (3.2.1.1)
(ohne Antibiotikum) zugegeben und der Ansatz 70-90 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend
wurden die Zellen schonend zentrifugiert (3000 rpm, 2 min, 4 °C), in 50-100 µL LB-Medium
resuspendiert und auf LB-Agarplatten mit dem entsprechenden zur Selektion benötigten
Antibiotikum ausplattiert. Die Platten wurden unter der Impfbank getrocknet und 14 – 18 h
bei 37 °C inkubiert.
3.6.1.3 Konjugations-vermittelter Transfer von Plasmid-DNA
Fremd-DNA wurde mit dem Verfahren der Konjugation in Streptomyceten eingebracht. Basis
dieser
Methode
ist
das
Konjugationssystem
des
E. coli
Plasmids
RP4.
Die
Mobilisierungsfaktoren dieses Plasmids ermöglichen den Transfer von Plasmiden, die den
RP4 „Origin of Transfer“ (oriT) enthalten auch in entfernte Spezies [51]. Um den Abbau von
linearer DNA zu verhindern wurde als Donor der methylierungsdefiziente Stamm
E. coli ET12567 verwendet, der das RP4–Derivat pUZ8002 (Tabelle 14) enthält [52]. Das
Konjugationsprotokoll basiert auf der im "Hopwood" beschriebenen Methode [15]. Es wurde
in einigen Punkten durch Dr. Andry Luzhetskyy (AK Prof. Dr. Bechthold) modifiziert
(A. Luzhetskyy, persönliche Mitteilung)
3.6.1.3.1 Vorbereitung des Donorstamms
CaCl2-kompetente E. coli ET12567/pUZ8002-Zellen wurden mit dem gewünschten Plasmid
transformiert. Die Selektion auf Transformanten erfolgte mit Kanamycin auf Anwesenheit
von pUZ8002, und mit Thiostrepton beziehungsweise Apramycin auf das zu mobilisierende
Plasmid. Ein einzelner Transformand wurde auf LB-Medium ausgestrichen und unter
Selektionsdruck angezogen. Um einen dichten E. coli-Rasen zu erhalten wurde nach 14-16 h
ein Abstrich dieser Platte flächig auf eine frische LB-Platte ausgestrichen und weitere 14-16 h
unter Selektionsdruck inkubiert. Von dieser dicht bewachsenen Platte wurde mit einer
Impföse je die Hälfte der E. coli-Biomasse abgenommen, vorsichtig in 50-100 mL sterilem
Medium resuspendiert und ein bis zweimal gewaschen. Nach dem waschen wurde jeweils
32
Material und Methoden
schonend zentrifugiert (3000 rpm, 4°C, 2 min) Nach dem letzten Waschschritt wurde
wiederum in etwas sterilem Flüssigmedium resuspendiert und die so gewonnenen Zellen für
die anschließende Konjugation verwendet.
Analog wurde eine Kultur E. coli ET 12567/pUZ8002 mit dem „leeren“ Vektor (ohne Insert)
transformiert und auf LB-Agar kultiviert. Sie wurde als Negativkontrolle für die Expression
verwendet.
3.6.1.3.2 Vorbereitung des Rezipienten und Konjugation
3.6.1.3.2.1 Konjugation mit Myzelium
Eine Plattenkultur des entsprechenden Streptomyces Stammes wurde in einen 100 mL
Erlenmeyerkolben überführt und in HA-Medium (3.2.1.2) bei 28 °C auf dem Rundschüttler
angezogen. Nach 12-14 h wurden 200 µL dieser Kultur entnommen und in 20 mL frisches
TSB-Medium (3.2.1.2) überimpft (ab der zweiten Durchführung konnte als Inokulum auch
200 µL, der nach 3.4.3 hergestellten Saccharose-Dauerkultur entnommen werden). Es wurde
18 h bei 180 rpm und 28 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen aus je dreimal 2 mL
dieser Suspension durch Zentrifugation (4 min bei 10000 rpm) pelletiert. Nun wurde in je
1 mL frischem TSB-Medium resuspendiert und wieder 5 min bei 7000 rpm zentrifugiert.
Dieser Waschvorgang wurde einmal wiederholt. Zwei dieser Pellets wurden nun in jeweils
circa 0,7 mL sterilem Medium resuspendiert und mit dem nach 3.6.1.3.1 vorbereiteten
Donorstamm innig gemischt. Eine Kultur wurde nicht mit E. coli versetzt und diente als
Negativkontrolle für die Konjugation. Eine weitere Kultur wurde mit dem Donorstamm der
lediglich den Vektor ohne zu exprimierendes Gen enthielt vermengt und diente als
Negativkontrolle für die Expression. Die Bakteriensuspensionen wurden nun auf MS-Agar
überführt und sorgfältig mit dem Drygalski-Spatel ausgestrichen. Nach 8 bis 10 h Inkubation
bei 28 C wurde mit Phosphomycin 400 µg/mL] und dem entsprechenden zur Selektion auf
das transformierte Plasmid benötigten Antibiotikum überschichtet. Dazu wurden pro Platte in
1 mL steriles H2Obidest die entsprechenden Volumina der Antibiotikastocklösungen pipettiert,
gemischt und diese Lösung durch Schwenken und Drehen auf den Platten verteilt. Die Platten
wurden unter der Impfbank getrocknet und dann bei 28 °C inkubiert. Exkonjuganden waren in
der Regel nach 4-8 Tagen zu erkennen. Einzelklone wurden dann auf antibiotikumhaltige HAoder MS-Platten überpickt.
33
Material und Methoden
3.6.1.3.2.2 Konjugation mit Sporen
Bei S. coelicolor wurden Sporen zur Konjugation verwendet. Streptomyces coelicolor A3(2)
wurde dafür auf HA- oder MS-Agar flächig ausgestrichen und bei 28 °C kultiviert bis die
Platten dicht mit Sporen bewachsen waren. Der Bakterienrasen wurde dann mit Hilfe einer
sterilen Impföse von der Platte in HA-Medium überführt. Je 1 mL Medium in 2 mL
Eppendorfgefäßen wurde für eine mit Sporen bewachsene Platte verwendet. Die
Sporensuspension wurde für 10 min bei 50 C im Wasserbad geschockt und anschließend für
3 Stunden bei 28 Grad inkubiert. Anschließend wurde zentrifugiert, der Überstand verworfen
und in frischem HA-Medium resuspendiert. Dieser Waschschritt wurde wiederholt.
Nun wurden etwa 150 µL Sporensuspension auf MS-Agar gegeben und ausplattiert. Diese
Kulturen dienten als Negativkontrolle. Die restlichen Sporen wurden mit dem Donorstamm
vermengt und analog dem Verfahren bei Konjugation mit Myzelium (3.6.1.3.2.1.) weiter
verfahren.
3.6.2 Amplifikation von DNA durch Polymerase-Kettenreaktion
3.6.2.1 Polymerase –Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (englisch: Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine
wichtige Methode zur gezielten Amplifikation bestimmter DNA-Abschnitte [53]. Hierzu
werden zwei Primer benötigt, die den zu amplifizierenden DNA-Bereich flankieren und
jeweils
an
einen
der
DNA-Einzelstrange
binden.
Nach
Hybridisierung
der
Oligonukelotidprimer an die Matrizen-DNA werden diese von der 3‘-OH-Gruppe
komplementär zur Matrize in Richtung 5‘→3‘ durch eine DNA-Polymerase verlängert.
Die
Polymerase-Kettenreaktion
kann
in
drei
Reaktionsphasen
unterteilt
werden.
Denaturierungsphase, Anlagerungsphase und Elongationsphase. Diese drei Phasen bilden
einen PCR-Zyklus. Durch mehrfache Wiederholung dieses Zyklus kommt es zu einer
exponentiellen Vervielfältigung des gewünschten DNA-Fragments. Im Rahmen dieser Arbeit
wurde diese Methode zur Vervielfältigung von DNA-Fragmenten, die zur Klonierung
weiterverwendet werden sollten, zur Generierung einer Inaktivierungskassette, sowie zum
Nachweis von Geninaktivierungen und reversen Transkriptionsprodukten verwendet.
3.6.2.2 PCR Bedingungen
Für einen Standard-PCR Ansatz wurde ein Volumen von 100 µL gewählt. Dieser enthielt
2 µL DNA (1:10 verdünnt), die als Matrize diente. Dazu kamen je Ansatz je 2 µL
34
Material und Methoden
(c = 10 µmol/L) der entsprechenden Oligonukleotidprimer, die von MWG-Operon (Köln, D)
bezogen wurden, 2 µL dNTPs (c = 10 mmol/L), 10 µL DMSO und 10 µL Polymerase-Puffer
(10-fach), der Ansatz mit H2Obidest auf 98 µL aufgefüllt. In dieser Arbeit wurde das Hot Start
Verfahren angewendet, das bedeutet, die PCR wurde nach einem ersten Denaturierungsschritt
unterbrochen und 2 µL Polymerase wurden zupipettiert.
Zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion wurden die in Tabelle 31 aufgeführten
Geräte verwendet. Das PCR-Standardprogramm ist in Tabelle 20 aufgezeigt. Die
Schmelztemperatur der Primer wurde mit dem Programm „Clone Manager“ berechnet. Zur
Bestimmung der Temperatur der Anlagerungsphase wurden näherungsweise, ausgehend von
der berechneten Schmelztemperatur 5 °C abgezogen. Wurde die PCR mit der Pfu-Polymerase
durchgeführt, die zur Amplifikation von 500 Basenpaaren 1 min benötigt, wurde die Dauer
der Elongationsphase in Minuten bestimmt, indem die Anzahl der Basen des zu
amplifizierenden DNA-Stücks durch 500 dividiert wurde. Entsprechend wurde zur
Berechnung
der
Elongationsdauer
bei
Verwendung
der
Taq-Polymerase
eine
Elongationsgeschwindigkeit von 1000 bp pro Minute angenommen.
Tabelle 20: Standardprogramm für die PCR
PCR-Phase
Hotstart
Denaturierungsphase
Anlagerungsphase
Elongationsphase
Temperatur [°C]
95
95
Abhängig von
verwendetem Primerpaar
72
Finalelongation
72
Zeit [min]
5
0,5
0,5
Zyklusanzahl
1
25
25
Abhängig von
verwendeter Polymerase und Größe
des DNA-Fragments
8
25
1
3.6.2.3 Kolonie-PCR
Zum schnellen Nachweis von Plasmid-DNA nach Transformation von E. coli wurde eine
Kolonie-PCR durchgeführt. Dazu wurde eine Einzelkolonie mit einem sterilen Zahnstocher in
50 µL sterilem H2Obidest dispergiert. Diese Suspension wurde 5 min bei 100 °C im Heizblock
inkubiert und anschließend wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert (4 °C, 14000 rpm, 5 min).
Vom Überstand wurden 5 µL als Matrizen-DNA im PCR-Ansatz (siehe 3.6.2.2) verwendet.
35
Material und Methoden
Entsprechend wurde zum Nachweis von per Konjugation in Streptomyces Kulturen
eingebrachter DNA eine Einzelkolonie dieser Stämme verwendet und analog zum Vorgehen
bei E. coli die Kolonie-PCR durchgeführt.
3.6.2.4 Primer
In Tabelle 21 sind alle Primer, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden, nach
Projekten geordnet aufgeführt.
Tabelle 21: Verwendete Primer, Schnittstellen falls vorhanden, Sequenz und Schmelztemperatur (Tm)
Bezeichnung
Schnittstelle Sequenz
Tm
[°C]
Primer zur Geninaktivierung von msnO2
O2-red-RNdeI
5´- AGAACCCGCGAGAGGCCGTGCTCATGCG
spec(120411)
AAGCGGGGCAGCATATGCTTGAACGAATTGTTA
GAC -3´
O2-red-FNdeI
5´-TTCGTACCTGAAGCTCCTTCCCGAGAGGAA
spec(120411)
CGCGTCGTGCATATGGTCCGCAGCGCCCGCCG
CAG -3´
Primer zur Kontrolle des Einbaus und der Entfernung der Resistenzkassette in msnO2
O2Kontr5´- CGGAGTGGAAGAGGTATTTGC -3´
R(040711)
O2Kontr5´- GACAAGTCCTCCCAGACCCTT -3´
F(040711)
Primer zur Amplifikation von adhB
Primer-adhB5'- TGCTTCAGGCCAATCTGGAC- 3'
F
Primer-adhB5'- TGTTGTGGGCTGGACAATCG- 3'
R
Primer zur Amplifikation von pdc
Primer-pdc-F
5'- CACCATACGCGCAATTAACC- 3'
Primer-pdc-R
5'- CTTCTGATAAGCGGATCCTC- 3'
Primer zur Amplifikation von vsifinal
Vsi-kontr-F
5`-GGCCAGGTTGCCCTCGGAGTAGT-3`
Vsi-kontr-R
5`-GGTACGGACATGCGCCGCAC-3´
36
85
89
59,8
61,8
64
65
61
59
67,8
65,5
Material und Methoden
3.6.3 Geninaktivierung in Streptomyceten
3.6.3.1 Redirect®Technology zur Geninaktivierung
Das Prinzip ermöglicht den Austausch von Genen beziehungsweise DNA-Abschnitten,
unabhängig von Restriktionsschnittstellen und den Einbau linearer DNA-Stücke. Es beruht
auf der Hybridisierung von homologen DNA Bereichen und dem anschließenden Austausch
dieser Bereiche.
Die Redirect®Technology wurde erstmals von Datsenko et al. zur Geninaktivierung in E. coli
beschrieben [54]. Durch Weiterentwicklung der Methode von Gust et al.[55], konnte sie
ebenfalls als Methode zur Geninaktivierung in Streptomyces etabliert werden. Hierbei wird
die Geninaktivierung auf einem Cosmid in E. coli durchgeführt, und anschließend das Cosmid
in einen Streptomyces-Stamm eingebracht.
Der Austausch wird durch spezielle Phagen-Proteine vermittelt. RecE/RecT, des Phagen Rac
beziehungsweise Redα/Redβ, des Phagen λ, sowie Redγ. RecE/RecT und Redα/Redβ bilden
jeweils eine Kombination aus 5´-3´-Exonuklease (RecE beziehungsweise Redα) und einem
„DNA-binding and annealing“ Protein (RecT beziehungsweise Redβ) [50]. Redγ, ist ein
Inhibitor der wichtigsten E. coli Exonuclease RecBCD, welche normalerweise lineare DNA
abbaut und deshalb die Transformation vieler Bakterien durch lineare DNA unmöglich macht
[55]
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Methode zur Inaktivierung des Gens msnO2 im
Biosynthesegencluster von Didesmethylmensacarcin verwendet.
3.6.3.2 Herstellung der Resistenzkassette zur Inaktivierung von msnO2
Zur Geninaktivierung mittels Redirect®-Technologie wurde in einem ersten Schritt ein
lineares DNA-Fragment mittels PCR erstellt (Resistenzkassette). Die dafür verwendeten
Primer hatten eine Länge von 64 bp (Forward-Primer) und 63bp (Reverse-Primer). Sie
wurden so konstruiert, dass sie jeweils am 5`-Ende über einen Bereich von 39 bp homolog zur
Basensequenz des zu inaktivierenden Zielgens msnO2 waren. Dieser Bereich leitete sich beim
Forward-Primer vom sense-Strang des entsprechenden Gens ab. Beim Reverse-Primer
dagegen vom anti-sense-Strang. An diesen Bereich schloss sich jeweils eine NdeIRestriktionsschnittstelle bestehend aus sechs Basen an, damit die Resistenzkassette nach
erfolgter Geninaktivierung wieder entfernt werden konnte. Der dritte Bereich mit einer Länge
von 20 Basenpaaren beim Forward- und 19 Basenpaaren beim Reverse-Primer wurde so
entworfen, dass er homolog zur Sequenz am Anfang (Forward-Primer) beziehungsweise am
37
Material und Methoden
Ende (Reverse-Primer) des Spectinomycin-Resistenzgens (aadA) auf dem Plasmid
pCDFDuet war (siehe Abbildung 3). Der Forward-Primer wurde O2-red-F-spec (120411)
benannt, der Reverse-Primer O2-red-R-spec (120411) (Tabelle 21). Mit diesem Primerpaar
und dem Plasmid pCDFDuet als DNA-Matrize wurde eine PCR, wie unter 3.6.2.2.
beschrieben, durchgeführt. Die erhaltene Resistenzkassette ist schematisch in Abbildung 3
dargestellt.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der verwendeten Primer und der Matrize
Abbildung 4: Aufbau der Resistenzkassette die nach der PCR erhalten wurde; B1und B2: homologe
Bereiche zum Gen msnO2; aadA: Spectinomycin Resistenzgen; NdeI: Erkennungssequenz für das Enzym
NdeI
3.6.3.3 Vorbereitung des E. coli-Stammes und Durchführung der Inaktivierung
Das Plasmid pRedαβγ, welches neben den Genen für die λ-Red Funktion und einem
Tetracyclin-Resistenzgen zusätzlich ein hitzesensitives Replikon trägt, wurde über
Elektroporation in E. coli DH5α eingebracht (3.6.1.2). Nach dem Ausplattieren des Ansatzes
auf einer LB-Agarplatte, welche Tetracyclin als Selektionsantibiotikum enthielt, wurde diese
38
Material und Methoden
aufgrund des hitzesensitiven Replikons bei 28 °C 14-16 h inkubiert. Aus einer erhaltenen
Einzelkolonie wurden anschließend erneut elektrokompetente Zellen hergestellt. In diesen
Stamm wurde wiederum mittels Elektroporation Cos2, auf welchem sich das gesamte
Biosynthesegencluster
von
Didesmethylmensacarcin
befindet,
eingebracht.
Der
Elektroporationsansatz wurde, wie oben beschrieben, inkubiert, wobei zusätzlich Apramycin
zur Selektion auf Cos2 verwendet wurde. Eine E. coli-Kolonie, die sowohl das Plasmid
pRedαβγ als auch das Cosmid Cos2 enthielt, wurde in 5 mL LB-Medium unter Zusatz von
Tetracyclin und Apramycin 12-14 h bei 28 °C als Flüssigkultur kultiviert. Mit 1 mL dieser
Vorkultur wurden 100 mL LB-Medium beimpft. Zusätzlich erfolgte die Zugabe der
Selektionsantibiotika Tetracyclin und Apramycin. Ebenfalls wurde 1 mL einer frisch
hergestellten Arabinoselösung (c = 1 mol/L), welche die Expression des Red-Operons
induzierte, zugegeben. Die Zellen wurden bei 28 °C bis zu einer OD600 von 0,6 kultiviert und
anschließend elektrokompetent gemacht (3.6.1.2.1). Die erhaltenen kompetenten Zellen
wurden mit 10 µL der isolierten Resistenzkassette mittels Elektroporation transformiert. Nach
der Zugabe von 1 mL LB-Medium, das kein Selektionsantibiotikum enthielt, wurde der
Elektroporationsansatz für 90 min bei 37 °C inkubiert und anschließend auf einer LBAgarplatte, die Spectinomycin und Apramycin als Selektionsantibiotika enthielt, ausplattiert.
Die Inkubation der Platten erfolgte dann wie gewohnt bei 37 °C für 14-16 h im Brutschrank.
Einige der erhaltenen Einzelkolonien wurden mit einem sterilen Zahnstocher auf einer
frischen LB Agarplatte, die Apramycin und Spectinomycin enthielt, ausgestrichen. Mit
demselben
Zahnstocher
wurden
jeweils
5 mL
LB-Medium
mit
entsprechenden
Selektionsantibiotika inokuliert. Die Flüssigkultur und die Agaplatte wurden, wie in 3.2.1.1
beschrieben, kultiviert. Aus den Zellen der Flüssigkultur wurde anschließend mittels
alkalischer Lyse das Cosmid isoliert (3.6.4.1) und zur Kontrolle der erfolgten Inaktivierung
eine PCR durchgeführt (3.6.2.).
3.6.3.4 Kontrolle der Geninaktivierung von msnO2 mittels PCR
Um die erfolgreiche Inaktivierung von Cos2 zu beweisen, wurde durch PCR der Einbau der
Resistenzkassette auf Cos2 gezeigt. Dazu wurde die Standardmethode, die unter 3.6.2.2
beschrieben ist, genutzt.
In Tabelle 22 sind die Primer für die Kontroll-PCR und die PCR-Bedingungen aufgelistet, die
zum Nachweis verwendet wurden.
39
Material und Methoden
Tabelle 22 Primer für die Kontroll-PCR und die PCR-Bedingungen
Experiment
Primerpaar
Nachweis
Einbau der
RK
O2KontrR(040711)
O2KontrF(040711)
O2KontrR(040711)
O2KontrF(040711)
Nachweis
Entfernung
der RK
Tm
[°C]
59,8
Anlagerungstemperatur [°C]
57,5
Elongationszeit
[min]
3,5
gewünschtes
PCR Fragment
1480 bp
57,5
1,5
637 bp
61,8
59,8
61,8
Nachdem die Inaktivierung bewiesen war, wurden mittels des „Pure Yield Plasmid Midiprep
System“ Kits (3.1.3) größere Mengen DNA von Cos2O2 isoliert und für die weiteren
Experimente verwendet.
3.6.3.5 Entfernung der Resistenzkassette
Um
polare
Effekte
zu
vermeiden,
wurde
die
Resistenzkassette
nach
erfolgter
Geninaktivierung wieder aus dem Biosynthesegencluster entfernt. Über die flankierenden
NdeI Schnittstellen (Abbildung 4) konnte die Resistenzkassette durch Verdau mit dem Enzym
NdeI entfernt werden. Nach erfolgter Restriktion wurde die DNA mittels alkoholischer
Fällung konzentriert und aufgereinigt (3.6.4.4) Die gesamte, gefällte DNA wurde
anschließend in 20 µL H2Obidest aufgenommen und für die Ligation verwendet.
Der gesamte Ligationsansatz wurde anschließend per Hitzeschocktransformation (3.6.1.1) in
E. coli DH5α eingebracht. Die gewachsenen Einzelklone wurden dann per Doppelselektion
identifiziert. Dazu wurden sie parallel sowohl auf LB-Medium mit Apramycin als auch auf
LB-Medium, das neben Apramycin noch Spectinomycin enthielt, ausgestrichen. Bei Klonen,
die auf beiden Platten wuchsen war die Entfernung der Spectinomycinresistenzkassette nicht
gelungen. Diejenigen, welche nur auf der apramycinhaltigen Platte wuchsen wurden in
Flüssigmedium inkubiert. Bei ihnen war die Entfernung der Resistenzkassette erfolgt.
Anschließend wurde mittels des „Pure Yield Plasmid Midiprep System“ Cosmid DNA in
größeren Mengen isoliert. Zusätzlich wurde die Entfernung der Resistenzkassette per
Kontroll-PCR nachgewiesen. Dazu wurde wiederum die die Standardmethode, die unter
3.6.2.2. beschrieben ist, angewandt und die in Tabelle 22 aufgeführten Primer unter den dort
angegebenen Bedingungen verwendet.
40
Material und Methoden
3.6.4 Methoden zur Isolierung von DNA
Es wurden je nach gewünschtem Reinheitsgrad und Konzentration verschiedene Methoden
für die DNA-Isolierung genutzt. Die aufgereinigte DNA wurde bei -20°C gelagert.
3.6.4.1 Plasmidminipräparation aus E. coli
Alle Methoden zur Plasmid-DNA-Isolierungen basieren auf dem Prinzip der alkalischen Lyse.
[56]. Die verwendeten Puffer und Lösungen sind unter 3.2.3.1. in Tabelle 8 aufgeführt.
E. coli-Einzelkolonien wurden über Nacht bei 37 °C und 180 rpm in 1-5 mL LB-Medium mit
dem entsprechenden Antibiotikum angezogen. Die gesamte Bakteriensuspension wurde
zentrifugiert (10000 rpm, 5 min bei 4 °C), der Überstand verworfen und das Zellpellet in
jeweils 200 µL Puffer P1 (mit 0,2 mg/mL RNAse) resuspendiert. Nachdem 10 min bei
Raumtemperatur inkubiert wurde, gab man 200 µL Puffer P2 zu und inkubierte solange bei
RT bis eine klare Lösung entstand. Anschließend wurde der Ansatz mit 200 µL kalter
P3-Lösung versetzt, 10 min auf Eis inkubiert und 20 min bei 14000 rpm und 4 °C
zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches 1,5 mL Reaktionsgefäß überführt und die
DNA durch Zugabe von 0,8 Volumenteilen eiskaltem Isopropanol gefällt. Nach
Zentrifugation (14000 rpm, min 30 min, 4 °C) wurde abdekantiert, die pelletierte PlasmidDNA mit 200 µL eiskaltem Ethanol 70 % (V/V) gewaschen (14000 rpm, 5 min, 4 °C), circa
15 Minuten an der Luft und anschließend etwa 5 Minuten im 60 °C Schrank getrocknet.
Schließlich wurde in 30 µL H2Obidest gelöst. Die Lagerung erfolgte bei –20 °C. Die auf diese
Weise isolierte DNA wurde für Restriktionsanalysen verwendet.
3.6.4.2 Mini-Präparation von E. coli Plasmid-DNA mit Wizard Plus SV
Minipreps Kit (Promega)
Für Isolierung von Plasmid-DNA mit hohem Reinheitsgrad wurde das Wizard Plus SV
Extraktionskit von Promega (Mannheim) benutzt. Die auf diese Weise isolierte DNA wurde
als Template für PCR oder Sequenzierung verwendet. Die Anzucht und Ernte der Bakterien
wurde wie unter 3.6.4.1. beschrieben durchgeführt. Das Pellet wurde dann in 250 µL
Resuspensionslösung resuspendiert. Mit 250 µL Zelllyse-Lösung wurden die Zellen
aufgeschlossen. Nach vorsichtigem Mischen durch mehrmaliges Umkippen ließ man den
Ansatz bis zum Aufklaren der Lösung circa 5 min bei Raumtemperatur stehen. Nach Zugabe
von 10 µL Alkaline-Protease-Lösung wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das
Ausfällen der störenden Zelltrümmer, chromosomaler DNA und Proteinen wurde durch
Zugabe von 350 µL Neutralisationslösung erreicht. Nach Zentrifugation (10 min bei
41
Material und Methoden
14000 rpm) wurde der Überstand auf eine Minisäule aufgetragen und etwa eine Minute, bei
Raumtemperatur und 10000 rpm, in ein Auffanggefäß zentrifugiert. Die DNA war nun an der
Säulenmatrix gebunden. Verunreinigungen wurden mit 750 µL ethanolhaltiger Waschlösung
von der Säule entfernt. Anschließend wurde die Säule bei 65 °C im Wärmeschrank kurzzeitig
getrocknet, um jeglichen Restethanol zu entfernen. Die DNA wurde danach mit 40 µL
DNAse-freiem H2Obidest eluiert.
3.6.4.3 Plasmidmaxipräparation aus E. coli mit PureYieldTM Plasmid Midiprep
Kit (Promega)
Um größere Mengen an DNA mit hohem Reinheitsgrad aus E. coli zu gewinnen, wurde das
PureYieldTM Plasmid Midiprep System von Promega (Mannheim) verwendet.
Eine Einzelkolonie E. coli wurde über Nacht in 100 mL LB-Medium mit entsprechendem
Antibiotikum bei 37 ° C und 180 rpm kultiviert. Am nächsten Tag wurde die Kultur in sterile
Falcon-Tubes überführt und die Zellen durch Zentrifugation (10 min, 5000 rpm,
Raumtemperatur) geerntet. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in CellResuspension-Solution (Tris-HCl, EDTA, RNAse) resuspendiert und anschließend mit Cell
Lysis Solution versetzt (enthält NaOH und SDS). Nach Inkubation bei Raumtemperatur (circa
5 min) wurde Neutralization Solution (Guanidin-HCl, NaOAc, Essigsäure) zugegeben und im
Anschluss 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Nun folgte die Aufreinigung mit Vakuum über die im Kit enthaltenen Säulen. Anschließend
wurde mit nukleasefreiem Wasser eluiert. Beide Schritte erfolgten bei Raumtemperatur und
nach Vorschrift des Herstellers.
3.6.4.4 Alkoholische Fällung
Die Fällung von DNA zur Aufkonzentrierung erfolgte mit Isopropanol nach der Vorschrift
von Sambrook et al.[43]. Mit dieser Fällung wird gleichzeitig die Beseitigung von
niedermolekularen Verunreinigungen erreicht. Hierzu wurde die DNA-haltige Lösung
zunächst durch Zugabe von 0,1 Volumenteilen 3 M Kaliumacetat-Lösung (pH 5,2) angesäuert
und anschließend 0,8 – 1,0 Volumenteile eiskalter Isopropanol zugegeben. Nach dem
Invertieren wurde 20 min bei -20 °C (bei kleinen PCR-Fragmenten bei -80 °C) gekühlt. Die
gefällte DNA wurde anschließend durch Zentrifugation (14000 rpm, 30 min, 4 °C) pelletiert
und mit 500 μl eiskaltem Ethanol 70 % (V/V) gewaschen. Um störende Reste von Ethanol
zuverlässig zu entfernen, wurde das Pellet für 5 min im Wärmeschrank bei 65 °C getrocknet
und anschließend in H2Obidest (10–100 μl) gelöst.
42
Material und Methoden
3.6.4.5 DNA Isolierung aus Actinomyceten
Zur Gewinnung von genomischer DNA aus Wildtyp oder Mutanten verschiedener
Actinomyceten wurde die nachfolgend beschriebene Methode angewendet.
Die Zusammensetzung der dafür verwendeten Losungen und Puffer sind in Tabelle 9
aufgelistet.
Zwei mL einer etwa 24 h alten Bakterien-Kultur, die bei 28 °C und 180 rpm inkubiert worden
war, wurden abzentrifugiert (4 °C, 10000 rpm, 2 min). Der Überstand wurde verworfen und
das erhaltene Myzel mit 1 mL H2Obidest gewaschen. 500 µL SET-Puffer, 10 µL LysozymLösung und 50-100 µL des Myzels wurden in ein 1,5 mL Eppendorfgefäß pipettiert. Diese
Suspension wurde bei 37 °C für circa 60 min inkubiert und währenddessen mehrmals
invertiert. Nach Zugabe von 14 µL Proteinase K-Lösung und 50 µL SDS-Lösung wurde die
Suspension bei 55 °C inkubiert, bis eine klare Lösung entstanden war (circa 1 h).
Anschließend wurde die entstandene Lösung mit 200 µL NaCl-Lösung und 500 µL
Chloroform versetzt, von Hand 2 min kräftig geschüttelt und abzentrifugiert (4 °C,
14000 rpm, 10 min). Dieser Zentrifugationsschritt führte zu einer Phasentrennung, wobei die
isolierte DNA in der wässrigen (oberen) Phase vorlag. Diese Phase wurde mit einer Pipette
abgenommen und in ein weiteres 1,5 mL Eppendorfgefäß überführt. Nach Zugabe von
500 µL kaltem Isopropanol wurde die isolierte DNA durch Zentrifugation (4 °C, 14000 rpm,
10 min) gefällt. Der durch Zentrifugation gewonnene Rückstand wurde zweimal mit 500 µL
Ethanol (70 % (V/V)) gewaschen und das Pellet 10 min im Wärmeschrank bei 60 °C
getrocknet. Anschließend wurde die DNA in 100 µL H2Obidest aufgenommen und bei -20 °C
gelagert.
3.6.5 Isolierung der gesamten RNA aus Streptomyces coelicolor
Zur Gewinnung der Gesamt-RNA aus Streptomyces coelicolor wurde der entsprechende
Stamm in 100 mL HA-Medium (3.2.1.2.) mit Zugabe entsprechender Antibiotika (Tabelle 7)
bei 28 °C in einem Schüttelinkubator bei 180 rpm angezogen. Nach 24, 48 und 72 h wurden
je 3 mL der Kultur entnommen. Das Myzel wurde durch Zentrifugation in einem 2 mL
Eppendorftube (4 °C, 14000 rpm, 5 min) pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und die
Zellen zweimal mit H2O gewaschen. Das Eppendorftube wurde mit perforierter Alufolie
verschlossen und für 16 bis 48 Stunden in einem Gefriertrockner der Firma Christ
lyophilisiert, um die restliche Flüssigkeitsmenge zu entfernen.
43
Material und Methoden
Die nachfolgende Isolierung der RNA erfolgte mit Hilfe des Kits „SV Total RNA Isolation
System“ (3.1.3.) Um RNAse-freies Arbeiten zu gewährleisten wurden sämtliche
Arbeitsmaterialien in Alufolie verpackt und autoklaviert. RNAse-freies Wasser wurde durch
Behandlung mit DEPC (0,1% V/V) und anschließender Autoklavierung hergestellt. Für einen
Ansatz wurden etwa 30 mg gefriergetrocknetes Myzel benötigt, das mit einem autoklavierten
Zahnstocher zerkleinert wurde. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgten gemäß den
Herstellerangaben. Die isolierte RNA wurde bei -80 °C gelagert.
3.6.6 UV-metrische Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA
3.6.6.1 Bestimmung der DNA-Konzentration
Die Konzentration von DNA-Lösungen wurde durch Messung der Absorption bei 260 nm im
Photometer (Ultrospec 2100 pro, Amersham Bioscience Europe GmbH, Freiburg) bestimmt.
Die Berechnung erfolgte mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes:
A=ε*c*v*d
(A: Absorption; ε: molarer Absorptionskoeffizient in mol-1*cm-1, bei doppelsträngiger DNA
gilt ε = 50; c: Konzentration in mol/L; v: Verdünnungsfaktor; d: Schichtdicke in cm).
3.6.6.2 Bestimmung der RNA-Konzentration und Reinheit
Die wie in Kapitel 3.6.5 beschrieben gewonnene RNA, wurde mit einem Photometer
(Ultrospec 2100 pro, Amersham Bioscience Europe GmbH, Freiburg) bei 260 nm vermessen.
Um die Reinheit der RNA-Proben zu bestimmen wurde zudem die 260/280 Ratio (Absorption
bei 260 nm zu Absorption bei 280 nm) gemessen.
Berechnung der Reinheit einer RNA-Lösung:
Qualität = A
260nm
/A
280nm
Reine RNA hat einen Quotienten von circa 2. Liegt der Quotient niedriger ist noch viel
Eiweiß und / oder DNA in der Probe enthalten.
3.6.7 RT-PCR
Die RT-PCR wurde mit dem „QuantiTect Rev. Transcription Kit“ der Firma Quiagen
durchgeführt (3.1.3). Die Anwendung der Reagenzien und Materialien des Kits wurde nach
den Angaben des Herstellers durchgeführt. In Tabelle 23 ist das Pipettierchema für RT-PCR
aufgeführt. Im Termocycler wurde zunächst bei 25 °C 15 min inkubiert (Annealing), gefolgt
44
Material und Methoden
von einer 60 minütigen Trankriptionsphase. Abschließend wurde bei 72 °C für 15 min die
Reverse Traskriptase hitzeinaktiviert.
Tabelle 23: Pipettierschema für die reverse Transkription der aus S. coelicolor A(3)2+adh+pdc und
S. coelicolor M1154 +adh+pdc isolierten RNA
Stamm
Kultivierungszeit
RNA
H2O
gDNA wipeout
buffer
Quantscript RT
Buffer
RT Primer Mix
Puffermix
Quantscript RT
S. coelicolor A(3)2+adh+pdc
24 h
72 h
1000 µg
1000 µg
9,2 mL
10,15 mL
2
2
S. coelicolor M1154+adh+pdc
24 h
72 h
1000 µg
1000 µg
4,6 mL
6,9 mL
2
2
4
4
4
4
1
5
1
1
5
1
1
5
1
1
5
1
Die transkribierte RNA wurde wie in 3.6.8 beschrieben für die PCR zum Nachweis der
Gentranskripte von adhB und pdc eingesetzt.
3.6.8 PCR zum Nachweis der Transkripte von adhB und pdc
Tabelle 24: Pipettierschema für die PCR zum Nachweis der reversen Transkripte von adh und pdc.
Stamm
Kultivierungszeit
RT-Ansatz
DMSO
DNTPs
F-Primer
R-Primer
Pfu-Puffer (10x)
H2O
Pfu-Polymerase
Gesamtvolumen
S. coelicolor A(3)2 +adh+pdc
24 h
72 h
2
2
5
5
2
2
1
1
1
1
5
5
33
33
1
1
50
50
S. coelicolor M1154+adh+pdc
24 h
72 h
2
2
5
5
2
2
1
1
1
1
5
5
33
33
1
1
50
50
Nach dem in Tabelle 24 aufgeführten Pipettierschema wurde die PCR zum Nachweis der
Gentranskripte von adhB und pdc durchgeführt. Dafür wurde für die Amplifikation von adhB
das Primerpaar Primer-adhB-F/Primer-adhB-R und zur Amplifikation von pdc entsprechend
das Primerpaar Primer-pdc-F/Primer-pdc-R verwendet (Tabelle 21,) Die erhaltenen PCR
Fragmente sind in Abbildung 5 zu sehen und beweisen die vorhandene Transkription von
adhB in allen Kulturen. Das gewünschte Fragment für pdc wurde nur in den reversen
Transkripten von S. coelicolor M1154 nachgewiesen. Da pdc und adhB auf demselben
45
Material und Methoden
Plasmid sowie unter Kontrolle desselben Promotors stehen und das Transkript von adhB in
S. coelicolor A(3)2 nachgewiesen wurde, ist davon auszugehen, dass bei erfolgter Expression
von adhB auch pdc exprimiert wird. Dies konnte auch für S. coelicolor M1154+adh+pdc
gezeigt werden. Daher ist mit großer Wahrscheinlichkeit ein experimenteller Fehler der
Grund für den nicht gelungenen Nachweis der Expression von pdc in den Kulturen von
S. coelicolor A(3)2+adh+pdc.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
PCR-Produkt von pdc mit der gewünschten Größe
von 1827 bp
Bahn 1 + 17: Positivkontrolle für pdc
Bahn 2-5 und 13-16: PCR zum Nachweis von adhB in den
verschiedenen Kulturen
Bahn 6 + 12: Positivkontrolle für adhB
Bahn 7-10 und 18-21: PCR zum Nachweis von pdc in den
verschiedenen Kulturen
Bahn 11 + 22: Größenstandard 1kb-ladder (Promega)
PCR-Produkt von adhB mit der gewünschten
Größe von 1343bp
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Abbildung 5: Ergebnis der PCR nach reverser Transkription der isolierten RNA aus den Stämmen
S. coelicolor A(3)2+adh+pdc und S. coelicolor M1154+adh+pdc. Es wurde in allen Kulturen das
gewünschte Fragmenten für adhB erhalten (Bahn 2-5: S. coelicolor A(3)2+adh+pdc und Bahn 13-16:
S. coelicolor M1154+adh+pdc). Das gewünschte PCR-Produkt für pdc konnte nur in den Kulturen von
S. coelicolor M1154+adh+pdc (Bahn 7-10) nachgewiesen werden
3.6.9 DNA-Aufreinigung und Isolierung aus Agarose Gelen
3.6.9.1 Agarose Gelelektrophorese
Die verwendeten Puffer und Lösungen sind unter 3.2.3.2. aufgelistet. Die Herstellung der
Agarosegele und die Durchführung der Elektrophorese erfolgten nach den Angaben von
Sambrook et al.[43]. Es wurde Agarose in Konzentrationen von 0,7-1,5 % verwendet, je nach
Größe der aufzutrennenden DNA-Fragmente. Für Standardexperimente bei DNA-Fragmenten
mit einer Größe zwischen 0,8 und 10 kb wurden Gels mit 0,7 % Agarose verwendet. Für
analytische Trennvorgänge wurde eine Spannung von 100 V über einen Zeitraum von circa
40 min angelegt. Präparative Trennungen wurden bei 80 V Spannung circa 1 h lang
46
Material und Methoden
durchgeführt. Die Elektrophorese erfolgte bei Raumtemperatur in 1 x TAE-Puffer (Tabelle
10). Zur Größenabschätzung wurden 1 kb DNA-Ladder (Promega, Mannheim, 0,25 – 10 kb)
und Bench Top N3026L Längenstandard (Promega, Mannheim, 72 – 1353 bp) verwendet
(Tabelle 2).
3.6.9.2 Färben von Agarosegelen
Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Agarosegel in einem wässrigen
Ethidiumbromidbad (1 μg/mL Ethidiumbromid) 10 – 30 min gefärbt. Die DNA-Fragmente
wurden unter UV-Licht bei 312 nm detektiert und fotografiert.
3.6.9.3 DNA-Isolierung und Aufreinigung aus Agarose Gelen
Um definierte DNA Fragmente für bestimmte Klonierungs-Experimente aus dem Agarosegel
zu isolieren wurde ebenfalls mit Ethidiumbromid gefärbt. Mit Hilfe des UV-Transilluminators
konnten die DNA-Fragmente detektiert werden. Die entsprechende Bande konnte dann mit
einem Skalpell und unter Verwendung entsprechender Schutzkleidung und spezieller UVSchutzbrille aus dem Agarosegel ausgeschnitten werden. Für die Elution von DNAFragmenten aus dem Agarosegel wurde das Kit „Wizard® SV Gel und PCR Clean-Up
System“ der Firma Promega nach Angaben des Herstellers verwendet (Tabelle 4).
3.6.10 Klonierung von DNA
3.6.10.1 DNA-Analytik und Präparation durch Restriktion
Alle zur Restriktion von DNA verwendeten Endonukleasen (Tabelle 3) wurden gemäß den
Herstellerangaben im empfohlenen Puffersystem und bei der für das entsprechende Enzym
empfohlenen Temperatur verwendet. Für einen analytischen Verdau, betrug das
Gesamtvolumen 10-20 µL; der präparative Verdau erfolgte in einem Gesamtvolumen von bis
zu 50 µL. Die Restriktionsendonucleasen wurden falls erforderlich mittels Hitze (70 °C,
15 min), Zugabe von Ladepuffer oder Einfrieren inaktiviert.
3.6.10.2 Ligation
Bei der Ligation findet die kovalente Verknüpfung zweier DNA-Stränge zwischen der
5‘-Phosphatgruppe des einen Stranges und der 3‘-OH-Gruppe des anderen Stranges statt.
Diese Reaktion wird durch das Enzym DNA-Ligase katalysiert [57].
In dieser Arbeit wurde mit der T4-DNA-Ligase (Tabelle 3) nach Anweisung des Herstellers
durchgeführt. Das Volumen der Ligationsansätze betrug zwischen 15-20 µL, wobei das
47
Material und Methoden
Insert-Vektor-Verhältnis je nach Größe der Inserts 3:1-5:1 betrug. Die Ansätze wurden
wahlweise 14 h bei 4 °C oder 3 h bei 20 °C inkubiert. Anschließend wurden kompetente
E. coli Zellen mit dem gesamten Ligationsansatz mittels Hitzeschock oder Elektroporation
transformiert (3.6.1).
Wurde ein Vektor nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten, erfolgte vor der Ligation
eine Dephosphorylierung der Vektor-DNA. Damit wurde eine Religation des Vektors
verhindert und die Wahrscheinlichkeit des Insert-Einbaus erhöht. Für die Durchführung einer
Dephosphorylierung und der sich daran anschließenden Ligation wurde das Kit „Rapid DNA
Ligation“ gemäß Herstellerangaben verwendet.
3.7 Biochemische Methoden
3.7.1 Isolierung von Proteinen aus Streptomyces
3.7.1.1 Zellaufschluss mittels der Frech Pressure Cell Press
Die Geräthe zur Durchführung dieser Methode sind in
Tabelle 31 aufgelistet. Nach Kultivierung des Streptomyceten-Stammes in HA-Medium
(3.2.1.2) bei 28 °C, 180 rpm, 72 h, wurden die Zellen mittels Zentrifugation (4 °C, 5000 rpm,
10 min) geerntet. Alle weiteren Schritte erfolgten auf Eis. Das Zellpellet wurde in 10 mL
eisgekühltem Puffer A (Tabelle 13) aufgenommen. Nach Resuspendieren wurde mit Lysozym
versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen dreimal mit der
French Pressure Cell Press bei einem Druck von 17000 psi aufgeschlossen. Die erhaltene
Suspension wurde zentrifugiert (4 °C, 10000 rpm, 30 min) um die Zelltrümmer abzutrennen.
Der Überstand wurde gesammelt. Nach Zugabe von 10 µL DNAse wurde 15 Minuten auf Eis
inkubiert und danach erneut zentrifugiert (4 °C, 10000 rpm, 30 min). Die so erhaltene
Proteinlösung wurde zur präparativen Aufreinigung mittels Nickel Affinitätschromatographie
verwendet.
3.7.1.2 Proteinaufreinigung mittels Nickel-Affinitätschromatographie
Die präparative Aufreinigung von Proteinen, die mit einm His-Tag verbunden waren, erfolgte
mittels Ni-Affinitätschromatographie. Dazu wurde eine ÄKTA-FPLC Anlage (Tabelle 31)
verwendet, welche mit einer 5 ml Ni Sepharose™-Säule (HisTrap FF 5mL) betrieben wurde.
Als mobile Phase dienten Puffer, deren Zusammensetzung in Tabelle 13 aufgeführt sind. Das
System wurde vor der Proteinaufreinigung nach Herstellerangaben gespült und äquilibriert.
Das nach dem in Kapitel 3.7.1.1. beschriebenen Zeallaufschlußverfahren erhaltene Probengut
48
Material und Methoden
wurde nun auf die Ni Sepharose™-Säule geladen. Nachdem nicht gebundene Proteine im
Durchfluß eluiert wurden, erfolgten mehrere Waschschritte mit Puffer A (10 mmol/L
Imidazol), welchem ein geringer Anteil Puffer B (500 mmol/L Imidazol) zugemischt wurde,
bis zum Erreichen einer Basislinie. So konnten Proteine, die zum Beispiel über einen
Histidinrest ihrer natürlichen Aminosäuresequenz an die Säule gebunden haben eluiert
werden. Die Elution des aufzureinigenden Proteins erfolgte schließlich durch Erhöhung der
Imidazolkonzentration. Dafür wurde der Anteil von Puffer B im Eluentengemisch auf 50%
erhöht. Abschließend wurde die Säule wiederum nach Herstellerangaben gespült. Die aus
mehreren Fraktionen bestehende Lösung des aufgereinigten Proteins wurde durch
Ultrazentrifugation mit einem Vivaspin 20 Proteinkonzentrator auf 200 µL eingeengt. Die so
erhaltene Konzentrierte Lösung wurde für die SDS-PAGE verwendet (3.7.2).
3.7.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Mit der SDS-PAGE wurde die Zusammensetzung einer Proteinprobe untersucht. Die
Anwendung wurde in Anlehnung an die von Laemmli beschriebene Methode durchgeführt
[58]. Die Auftrennung der Proteine erfolgte in einem 12,5 % igen Trenngel. Alle verwendeten
Puffer und Lösungen sind in Tabelle 12 aufgeführt. Bei der praktischen Durchführung wurden
100 µg Protein mit dem gleichen Volumen Ladepuffer gemischt und bei 100 °C 5 min im
Wasserbad inkubiert. Nach Zentrifugation (4 °C, 14000 rpm, 5 min) wurde die Proteinprobe
in eine Geltasche pipettiert. Als Größenstandard wurde der Precision Plus Protein Standard
All Blue verwendet. Die Gelelektrophorese wurde mit SDS-Laufpuffer (1-fach) bei 40 mA für
3 h durchgeführt. Anschließend wurde das Gel mit Coomassie- Färbelösung für 30 s in der
Mikrowelle bei 600 W gefärbt. Das gefärbte Gel wurde zur Entfärbung 12 h in
Entfärbelösung inkubiert. Die Größen der Proteine ließen sich anschließend anhand des
Größenstandards abschätzen.
49
Material und Methoden
3.8 Konstruktion von Plasmiden
3.8.1 Plasmide zur Etablierung der Ethanolproduktion in Streptomyceten
3.8.1.1 Klonierung von pUWL-H-ap
Zur heterologen Expression der in 4.2.2 beschriebenen Gene adhB und pdc in verschiedenen
Streptomyceten wurde das Plasmid pUWL-H-ap (Abbildung 6) kloniert. Das fertige Plasmid
wurde von Sandra Ebeling übernommen [29].
Es basiert auf pUWL-H-tnp, einem Expressionsvektor für Streptomyceten, in dem die Gene
unter Kontrolle des starken ermE Promotors stehen. Eine Beschreibung des Plasmids ist in
Tabelle 16 zu finden.
ermE up
rep
adhB
ori
10000
8000
pdc
pUWLH-ap
2000
10684 bps
hph
4000
6000
'fd ter
oriT
ori ColE1
bla
Abbildung 6: Plasmidkarte von pUWL-H-ap
3.8.1.2 Klonierung von pUWL-H-apf
Zur Coexpression der Gene adhB, pdc und fdh wurde das Plasmid pUWL-H-apf (Abbildung
7) erstellt. Das Gen fdh wurde von der Firma Mr. Gene synthetisiert. Das erhaltene Konstrukt
wurde MRGenefdh genannt zur weiteren Klonierung verwendet. PUWL-H-ap wurde mit
HindIII und ClaI geschnitten, ebenso MRGenefdh. Da es aufgrund einer Dam-Methylierung
zur Blockade von ClaI kam, musste zunächst der methylierungsdefiziente Stamm E. coli ET
12567 mit MRGenefdh transformiert und anschließend die nicht methylierte Plasmid-DNA
isoliert werden. Diese konnte mit HindIII und ClaI geschnitten werden und schließlich fdh in
den mit denselben Enzymen geöffneten pUWL-H-ap ligiert werden. Die gesamten
50
Material und Methoden
Ligationsansätze wurden zur Tranformation von E. coli XL1 blue verwendet (3.6.1.1.2).
Einzelklone wurden auf auf LB-Medium, welches 50 µg/L Hygromycin enthielt ausgestrichen
und gleichzeitig in 1 mL hygromycinhaltigem LB-Flüssigmedium angezogen. Nach 14
Stunden wurden die Plasmide isoliert (3.6.4.1) und zur Kontrolle mit NcoI verdaut.
Cla I
HindIII
ermE up
fdh
rep
adhB
ori
10000
2000
pUWL-H-apf
11837 bps
8000
pdc
4000
hph
6000
'fd ter
ori ColE1 bla
oriT
Abbildung 7: Plasmidkarte von pUWL-H-apf
3.8.1.3 Klonierung von pNL1-aldh
Das Plasmid pUC57-aldh (Abbildung 8) wurde von der Firma Mr. Gene synthetisiert. Auf
ihm ist das Gen aldh lokalisiert, dessen Nukleotidsequenz der Codonpräferenz von
Streptomyceten angepasst wurde. Eine Beschreibung von aldh und Hintergründe zum
Experiment sind unter 4.2.13 zu finden.
Um die Klonierung in pNLI-aldh zu ermöglichen musste zunächst aldh aus pUC57-aldh in
pUWL-A umkloniert werden. Dazu wurde pUC57-aldh mit EcoRI und SpeI geschnitten. Das
etwa 910 bp große Fragment mit aldh wurde dann in den ebenfalls mit den Enzymen EcoRI
und SpeI geöffneten Vektor pUWL-A integriert. Es Entstand pUWL-A-aldh (Abbildung 9).
pUWL-A-aldh wurde anschließend mit HindIII und XbaI geschnitten. Ebenso pNL1. Somit
konnte aldh über die Restriktionsschnittstellen HindIII/XbaI in pNL1 integriert werden. Es
entstand das gewünschte Plasmid pNL1-aldh (Abbildung 10) was zur Coexpression von aldh,
adhB und pdc zusammen mit pUWL-H-ap verwendet wurde.
51
Material und Methoden
EcoRI
EcoRI
'lacZ
aldh Morella - Strep
3500
500
3000
pUC57-aldh
3644 bps
lacZ'
1000
SpeI
2500
bla
1500
2000
rep (pMB1)
Abbildung 8: Plasmidkarte von pUC57-aldh
XhoI
XhoI
HindIII
EcoRI
ermE up
rep
SpeI
XbaI
aldh Morella - Strep
8000
ori
pUWL-A-aldh
2000
6000
8585 bps
NdeI
oriT
4000
aac(3)IV
bla
'fd ter
XhoI
ori ColE1
XbaI
Abbildung 9: Plasmidkarte von pUWL-A-aldh
52
Material und Methoden
oriT
aldh Morella - Strep
tipAp
8000
pNL1-aldh
2000
pSG5 rep
8991 bps
tsr
6000
4000
oripUC18
aac(3)IV
Abbildung 10: Plasmidkarte von pNL1-aldh
3.8.2 Plasmide zur Etablierung der Butanolproduktion in Streptomyceten
3.8.2.1 Konstruktion von pUWL-A-adhe und pUWL-H-adhe
Das Gen adhe wurde mit an Streptomyceten angepasstem „codon-usage“ als pUC57-Derivat
bei der Firma Mr. Gene synthetisiert (pUC57-adhe; Abbildung 11). Um adhe in
Streptomyceten zu exprimieren musste es zunächst in einen Expressionsvektor gebracht
werden.
Dafür wurde das Gen aus pUC57-adhe in die Expressionsvektoren pUWL-A und pUWL-H
umkloniert. Dazu wurde pUC57-adhe mit den Enzymen HindIII und BamHI im
Doppelverdau geschnitten. Um die benötigten 2,6 kb Fragmente von den anderen
DNA-Stücken trennen zu können, wurde zusätzlich mit SapI geschnitten, wodurch nicht
benötigte DNA in kleinere Bruchstücke zerlegt wurde. Die Zielvektoren pUWL-A und
pUWL-H wurden ebenfalls mit HindIII und BamHI verdaut. Die gewünschten Fragmente
wurden über ein präparatives Gel von der übrigen DNA und Verunreinigungen abgetrennt.
Nun wurde adhe in den geöffneten Vektor ligiert. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 4 °C.
Nach Transformation von E. coli DH5α und anschließender Isolierung und Aufreinigung der
Plasmid-DNA, konnte man die gewünschten Expressionsplasmide (pUWL-H-adhe;
Abbildung 12 und pUWL-A-adhe; Abbildung 13) durch Kontrollverdau, wiederum mit
BamHI und HindIII, nachweisen.
53
Material und Methoden
NdeI
EcoRI
XbaI
EcoRI
HindIII
SspI
ScaI
'lacZ
bla
5000
1000
pUC57-adhe
4000
5377 bps
rep (pMB1)
2000
adhe
3000
lacZ'
ScaI
HindIII
SmaI
BamHI
HindIII
BamHI
SmaI
Abbildung 11: Plasmidkarte von pUC57-adhe
HindIII
KpnI
ermE up
adhe
rep
ori
10000
2000
pUWL-H-adhe
8000
BamHI
XbaI
10385 bps
4000
6000
EcoRI
oriT
SspI
hph
bla
'fd ter
ori ColE1
XbaI
Abbildung 12: Plasmidkarte von pUWL-H-adhe
54
Material und Methoden
SmaI
XhoI
SmaI
SmaI
XhoI
HindIII
SpeI
ermE up
rep
ori
10000
NdeI
adhe
pUWL-A-adhe
2000
8000
10290 bps
aac(3)IV
SmaI
4000
6000
XhoI
BamHI
SpeI
XbaI
'fd ter
XbaI
oriT
bla ori ColE1
DraI
DraI
DraI
Abbildung 13: Plasmidkarte pUWL-A-adhe
3.8.3 Plasmide zur Expression einer Saccharose-Synthase in Streptomyceten
3.8.3.1 pMK-vsifinal
Bei der Firma Mr. Gene wurde pMK-vsifinal (Abbildung 14) synthetisiert. Darauf lokalisiert
ist die Signalsequenz von vsi (vsiSSQ) fusioniert mit susyGC. Außerdem befinden sich darauf
eine Ribosomenbindestelle, die beiden ersten Aminosäuren des originalen vsi-Gens, sowie der
ermE-Promoter von pUWL-oriT, welcher der Signalsequenz vorgeschaltet ist. Das Startcodon
von susyGC wurde deletiert.
55
Material und Methoden
erm
KanR
E
3000
RBS
500
vsiSSQ
vsi_final
pMK-vsifinal
2500
3401 bps
1000
Susy_GC´
2000
150
0
repOri
Abbildung 14: pMK-vsifinal
3.8.3.2 pUCPK1
Das Plasmid wurde von Anke Frerich übernommen. Zur Beschreibung von pUCPK1 und der
Vorgehensweise bei der Konstruktion sei auf die Arbeit von A. Frerich verwiesen [48]. Die
Plasmidkarte von pUCPK1 ist in Abbildung 15 dargestellt.
lacZ'
aviD-Pr
ori
Susy_GC3a
5000
pUCPK1
1000
Susy_GC3b
4000
5365 bps
Susy_GC
bla
2000
3000
Susy_GC2
''lacZ
Abbildung 15: pUCPK1
56
Material und Methoden
3.8.3.3 Erstellung von pUC-vsifinal
pMK-vsifinal wurde mit HindIII geschnitten und über eine Säule aufgereinigt (3.6.9.3.).
Anschließend wurde mit XhoI verdaut. Die dabei entstandenen Plasmidteile wurden durch
Gelelektrophorese getrennt (3.6.9.1) und das gewünschte 1,1 kb große Fragment ebenfalls
über eine Säule aufgereinigt (3.6.9.3). In gleicher Weise wurde pUCPK1 geschnitten. Dabei
konnte ein 4,4 kb Fragment isoliert werden, das anschließend zur Ligation bei 4 °C, über
Nacht, mit dem 1,1 kb Fragment aus pMK-vsifinal verwendet wurde. Es entstand das
Konstrukt pUC-vsifinal (Abbildung 16)
lacZ'
'vsi_final'
ori
5000
1000
pUC-vsifinal
4000
'Susy_GC3b
5481 bps
bla
2000
3000
'Susy_GC
Susy_GC2
''lacZ
Abbildung 16: pUC-vsifinal
3.8.3.4 Klonierung von pUWL-H-vsifinal
pUWL-H-tnp wurde mit HindIII und XbaI geschnitten. Ebenso pUC-vsifinal. Zusätzlich
wurde pUC-vsifinal mit DraI verdaut um die beim Doppelverdau mit HindIII und XbaI
entstandenen Fragmente der Größe 2818 und 2663 bp effektiv trennen zu können. Das nicht
benötigte 2663 Basenpaare große Teilstück wurde dadurch in mehrere kleine Fragmente
geschnitten. So konnte das 2,8 kb große, von HindIII und XbaI flankierte Fragment, über ein
Gel aufgereinigt (3.6.9.3) und in den mit den selben Restriktionsenzymen geöffneten Vektor
ligiert werden. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 4°C wobei das Konstrukt
pUWL-H-vsifinal entstand (Abbildung 17).
Zur Kontrolle wurde das entstandene Plasmid mit NcoI verdaut. Dabei konnte man die
erwarteten Fragmente der Größe 1128, 3741 und 5698 bp durch eine analytische
Gelelektrophorese nachweisen und somit die korrekte Klonierung von pUWL-H-vsifinal
nachweisen (Abbildung 18).
57
Material und Methoden
ermE up
rep
'vsi_final'
ori
10000
'Susy_GC3b
2000
pUWL-H-vsifinal
'Susy_GC8000
10567 bps
Susy_GC2
hph
4000
6000
'fd ter
oriT
bla ori ColE1
Abbildung 17: pUWL-H-vsifinal
1
2
3
4
5698 bps
7749
2818
3741 bps
1128 bps
Abbildung 18: Ergebniss der Restriktion von pUWL-H-vsifinal mit NcoI (Bahn 3 + 4) sowie HindIII/XbaI
(Bahn 1 +2).
3.8.3.5 Klonierung von pAF-vsifinal
Es wurde vsifinal aus pUWL-H-vsifinal mit den Enzymen HindIII und Xba1 ausgeschnitten,
über ein Gel aufgereinigt und in den mit denselben Enzymen geschnittenen und ebenfalls über
ein Agarosegel aufgereinigten Vektor pAF1/urdR (Abbildung 19), [48] ligiert. Dabei entstand
pAF-vsi final.
Durch Restriktionsverdau mit den Enzymen HindIII und XbaI wurde korrekte Klonierung des
Plasmids überprüft (Abbildung 20).
58
Material und Methoden
Abbildung 19: Plasmidkarte von pAF1/urdR [48]
10
8
6
5
4
3
2,5
2
1,5
1
0,5
Abbildung 20: pAF-vsifinal mit HindIII und XbaI geschnitten (2,8 kb (vsifinal) und 6,6 kb (pAF/urdR
linearisiert).
3.9 Produktion, Isolierung und Analytik von Naturstoffen
3.9.1 Produktion von Didesmethylmensacarcin und dessen Derivaten
Zur Produktion von Didesmethylmensacarcin und dessen Derivaten wurden 200µL einer
Saccharose-Dauerkultur (3.4.3) des Stammes S. albus x Cos2 beziehungsweise dessen
Mutanten verwendet. Mit dieser wurden Vorkulturen wie unter 3.4.2. beschrieben inkubiert
und 24-36 h kultiviert. Mit 1 mL dieser Vorkultur wurden die Produktionskulturen inokuliert.
Dafür wurden 500 mL-Erlenmeyerkolben mit einer Schikane, Metallspirale und 100 mL
DNPM-Medium verwendet. Die Produktion erfolgte unter den in 3.4.2 beschriebenen
Bedingungen über fünf Tage. Anschließend konnte mit der Isolierung der produzierten
Sekundärstoffe begonnen werden.
59
Material und Methoden
3.9.2 Isolierung von Naturstoffen
3.9.2.1 Extraktion von Naturstoffen
Die gesamten Kulturen wurden zentrifugiert (4 °C, 5000 rpm, 10 min), um das Myzel vom
Überstand zu trennen. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt. Um die Löslichkeit
der vermutlich sauren Sekundärstoffe in der organischen Phase zu erhöhen, wurde der pHWert auf pH 4,0 eingestellt. Nun wurde zwei Mal mit dem gleichen Volumen
Essigsäureethylester ausgeschüttelt. Die Ethylacetatphasen wurden vereinigt und über einen
Cellulosefilter filtriert. Nachdem die organische Phase mit Hilfe eines Rotationsverdampfers
bis zur Trockene eingeengt wurde, konnten die erhaltenen Rohextrakte bis zur Analyse bei
-20 °C gelagert werden. Die Analyse des Extraktes erfolgte über HPLC oder HPLC/ESI-MS
(3.9.3.).
Um die im Myzel vorhandenen Sekundärstoffe zu analysieren, wurde das gewonnene
Zellpellet mit dem doppelten Volumen Essigsäureethylester versetzt und 15 min geschüttelt.
Die Weiterverarbeitung der organischen Phase erfolgte analog zur organischen Phase, die bei
der Extraktion des Überstandes erhalten wurde.
3.9.3 Analytik von Naturstoffen
Die Analytik der Sekundärmetabolite erfolgte über Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) (3.9.3.1). Zur Probenvorbereitung wurde die wie in 3.9.2.1 beschrieben gewonnenen
Extrakte in 1 mL Methanol gelöst und über einen RotilaboR-Spritzenfilter (0,45 µm, PVDF;
Tabelle 26) filtriert. Je nach Konzentration wurde die Probe mit Methanol im Verhältnis 1:10
bis 1:2 verdünnt. Das Injektionsvolumen betrug je nach Konzentration der Probe 20-40 µL.
Als Laufmittel wurde Acetonitril (Laufmittel A) und H2Obidest (Laufmittel B) verwendet, die
jeweils mit 0,5 % Essigsaure versetzt wurden (
Tabelle 26).
60
Material und Methoden
3.9.3.1 Analytische HPLC/ESI-MS
Zur Analyse der Sekundärstoffe mittels HPLC/ESI-MS wurde das Agilent 1100 System
verwendet,
das
mit
einem
automatischen
Probengeber
(G1313A)
und
einem
Fraktionssammler (G1364A) ausgestattet war. Die Auftrennung der Sekundärstoffe erfolgte
über ein Säulensystem bestehend aus einer Vorsäule, XBridgeTM C18 (20 mm × 4,6 mm;
Partikelgröße: 3,5 µm) und einer XbridgeTM C18-Säule (100 mm × 4,6 mm; Partikelgröße:
3,5 µm) als Hauptsäule. Als Detektoren kamen ein Diodenarray-Detektor (DAD) und ein
Quadrupol Massendetektor (MSD) zum Einsatz. Die Ionisierung der Analyten erfolgte mit
einer API-ESI- (atmospheric pressure electrospray ionization) Quelle. Die Parameter der
Ionisationsquelle
sind
Didesmethylmensacarcin
in
Tabelle
und
dessen
25
aufgelistet.
Derivaten
Der
verwendete
zur
Analyse
Gradient
und
von
weitere
Einstellungen sind in Tabelle 26 beschrieben. Die Steuerung der Anlage und die Auswertung
der Daten erfolgte mit Hilfe der Software LC/MSD ChemStation Rev. A.09.03.
3.9.3.1.1 Parameter der Esi- Ionisationsquelle
Tabelle 25: Parameter der ESI-Ionisationsquelle
Parameter
Einstellung
MSD Scan von 200-1000 Da
MSD (+), MSD(-) Modus
Drying gas flow
12 L/min
Drying gas temperature
350 °C
Nebulizer pressure
50 psig
Capillary voltage (Vcap positive)
3000 V
Capillary voltage (Vcap negative)
3000 V
61
Material und Methoden
3.9.3.1.2 HPLC-Gradient und Parameter
Tabelle 26: HPLC-Gradient zur Analyse von Didesmethylmensacarcin und dessen Derivaten. (Methode:
mens04-R); Laufmittel A: Acetonitril (0,5 % (V/V) Essigsäure), Laufmittel B: H2Obidest (+ 0,5 % (V/V)
Essigsäure).
Zeit [min]
0
6
7
25
28
30
35
Fluss
Säulenofen
Detektion
Laufmittel A [%]
Laufmittel B [%]
20
80
20
80
30
70
95
5
95
5
20
80
20
80
0,5 mL/min
30 °C
230 nm (Ref. 400 nm), 254 nm (Ref. 400 nm), 330 nm (Ref. 500 nm),
400 nm (Ref. 600 nm)
3.9.3.2 NMR-Spektroskopie zur Strukturaufklärung von msn-UH
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Struktur eines unbekannten Naturstoffes mittels NMRSpektroskopie (Nuclear Magnetic Resonance) aufgeklärt. Die Durchführung der Messung
erfolgte in Kooperation mit S. Ferlaino (Universität Freiburg). A. Gässner (Universität
Freiburg) und Dr. R. Murillo (Universität von Costa Rica) übernahmen die Interpretation und
Auswertung der Spektren. Es wurden 1H- und
13
C-1D-NMR Aufzeichnungen gemacht. Die
Spektren wurden auf einer Varian VNMRS600-Apparatur aufgenommen. Chemische
Verschiebungen wurden auf das deuterierte Lösungsmittel ([D1]CDCl3) referenziert.
3.9.4 Aufreinigung und Konzentrierung der Sekundärstoffe
3.9.4.1 Festphasenextraktion
Die Aufkonzentrierung und Aufreinigung des Sekundärstoffes MSN-UH aus dem Rohextrakt
der Mutante S. albus x Cos2ΔO2 erfolgte in mehreren Schritten. Zunächst wurde eine
Festphasenextraktion durchgeführt. Als Säulenmaterial wurde die Oasis® HLB 35 cc Vac
Cartridge verwendet. Die Säule wurde zunächst mit absteigenden Konzentrationen eines
Methanol in Wasser Gemisches konditioniert, bis eine Konzentration von 20 % (V/V)
Methanol erreicht worden war. Anschließend wurde die Säule mit dem Rohextrakt beladen.
Dafür wurde der Rohextrakt mit Methanol, welches jeweils in derselben Konzentration
verwendet wurde wie zur anschließenden Elution, angelöst. Begonnen wurde mit 20 % (V/V)
Methanol. Da sich der gesamte Extrakt nicht in 20 % (V/V) Methanol löste, wurde der
62
Material und Methoden
ungelöste Teil abzentrifugiert (20 °C, 5000 rpm, 10 min) und nur der gelöste Teil des
Rohextrakts auf die Säule aufgetragen. Die Elution erfolgte dann mit 100 mL Methanol
20 % (V/V). Das Eluat wurde in einem Rundkolben gesammelt. Nun wurde die
Methanolkonzentration sowohl zum Anlösen des verbliebenen Rohextraktes, wie auch zur
Elution um jeweils 10 % erhöht bis schließlich bei 100 % Methanol der gesamte Rohextrakt
über die Säule gelaufen war. Jede Fraktion wurde einzeln aufgefangen. Bevor mit einem
neuen Elutionsschritt begonnen wurde, wurde der verbliebene, ungelöste Rohextrakt in 2 mL
des neuen Eluenten aufgenommen und durch Behandlung im Ultraschallbad gelöst. Ungelöste
Teile wurden unter den oben genannten Bedingungen erneut abzentrifugiert. Die erhaltenen
Fraktionen wurden separat in Rundkolben gesammelt und bis zur Trockene einrotiert. Jede
Fraktion wurde per analytischer HPLC vermessen.
3.9.4.2 Präparative Dünnschichtchromatographie
Zur weiteren Aufreinigung des neu gebildeten Sekundärstoffes Msn-UH wurde die
präparative Dünnschichtchromatographie verwendet. Dazu wurden die erhaltenen Rückstände
der in 90 % (V/V) Methanol gelösten Fraktionen der Festphasenextraktion (3.9.4.1) in reinem
Methanol gelöst und auf eine Kieselgelplatte (Kieselgel 60 F254) aufgetragen. Als Fliesmittel
wurde ein Gemisch aus Methanol:Dichlormethan (9:1 (V/V) + 0,01 % Essigsäure) verwendet.
Die Platte mit aufgetragenem Rohextrakt wurde in einer DC-Kammer entwickelt
(Trennstrecke: 12 cm). Die gewünschte Bande (Rf-Wert: 0,85) wurde mit Hilfe eines
Skalpells ausgekratzt und mit 1 mL Methanol extrahiert. Die entstandene Suspension wurde
anschließend zentrifugiert (4 °C, 14000 rpm, 5 min) und der Überstand abgenommen. Die
Methanol-Extraktion wurde solange wiederholt bis keine Gelbfärbung des Methanols mehr zu
erkennen war. Der vereinigte Überstand wurde eingeengt und die verbliebene Lösung über
einen 0,45 µm-Filter filtriert. Der dabei erhaltene Rückstand von Msn-UH wurde dann mittels
präparativer HPLC vollständig aufgereinigt.
3.9.4.3
Präparative HPLC
Der durch Festphasenextraktion (3.9.4.1) und präparative DC (3.9.4.2) voraufgereinigte
Extrakt wurde in einem weiteren Schritt präparativ mittels einer HPLC Anlage von noch
vorhandenen Verunreinigungen getrennt. Dazu wurde der wie in 3.9.4.2 beschrieben
gewonnene Rückstand in Methanol gelöst und über einen RotilaboR-Spritzenfilter (0,45 µm,
PVDF; Tabelle 32) filtriert. Das Injektionsvolumen betrug je nach Konzentration 50-200 µL.
Für das Experiment wurde ein Säulensystem der Firma Waters verwendet, bestehend aus
63
Material und Methoden
einer Vorsäule XBridgeTM C18 (20 mm × 4,6 mm; Partikelgröße: 3,5 µm) und einer
XbridgeTM C18-Säule (100 mm × 4,6 mm; Partikelgröße: 3,5 µm) als Hauptsäule. Die
Steuerung des Systems und die Datenauswertung erfolgten mit dem Programm „EmpowerR
2002 Waters Corporation“. Als Laufmittel wurden Acetonitril (Laufmittel A) und H2Obidest
(Laufmittel B) verwendet. Der zur präparativen Aufreinigung von Msn-UH verwendete
Gradient und weitere Einstellungen sind in Tabelle 27 beschrieben.
Tabelle 27 HPLC-Gradient zur Aufreinigung von Msn-UH (Methode: UH_Meth_I); Laufmittel A:
Acetonitril, Laufmittel B: H2Obidest.
Zeit [min]
Laufmittel A [%]
Laufmittel B [%]
0
40
60
4
45
55
14
95
5
16
95
5
16,1
40
60
20
40
60
Fluss:
Detektion:
0,5 mL/min
200 nm-500 nm
3.10 Produktion,Extraktion und Analytik von Ethanol und Butanol
3.10.1 Ermittlung der Ethanolproduktion
Um reproduzierbare Ergebnisse für die Ethanolproduktion zu erhalten, wurden die
verschiedenen Experimente mindestens dreimal wiederholt. Aus den einzelnen Ergebnissen
wurden jeweils die Mittelwerte berechnet und in den Tabellen und Abbildungen angegeben.
Versuche, die nicht nachvollziehbare, stark abweichende Werte lieferten, wurden dabei nicht
berücksichtigt.
Im Verlaufe der Arbeiten zeigte sich, dass es bei Inkubation aus Dauerkulturen zum Verlust
von Expressionsplasmiden kam, die auf dem nicht integrativen Vektor pUWL-H basieren.
Deshalb mußten die Stämme vor jedem Experiment immer frisch konjugiert werden. Bei
frisch konjugierten Stämmen konnte das Plasmid wie in 4.2.5 beschrieben nachgewiesen
werden.
64
Material und Methoden
3.10.2 Extraktion von Ethanol
Die gesamten Kulturvolumina wurden in 50 mL Falcontubes überführt und abzentrifugiert.
Der Überstand wurde in neue Reaktionsgefäße überführt. Das Myzel wurde verworfen oder
zur Bestimmung der Trockenmasse verwendet (3.10.3). Je 30 mL Medium wurde mit 15 mL
Ethylacetat überschichtet und 20 min kräftig geschüttelt. Dann wurde die organische Phase in
ein neues Falcontube überführt. Es wurde noch einmal mit 15 mL Ethylacetat überschichtet
und erneut extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und über Natriumsulfat
getrocknet. Der so gewonnene Extrakt wurde gefiltert, in spezielle Septumfläschchen aus Glas
(Abbildung 21) überführt und für die GC/MS Analytik verwendet.
Abbildung 21: Vorbereitete Proben für die GC/MS
3.10.2.1 Referenzprobe zur Berechnung der Ethanolkonzentration
Um eine quantitative Auswertung der der GC/MS zu ermöglichen wurden zusätzlich je
Experiment 100 mL Medium mit genau 100µL Ethanol versetzt, was einer Konzentration von
1‰ bzw. 790 mg/L entpricht. Anschließend wurde die Extraktion analog zu den
Produktionskulturen wie oben beschrieben durchgeführt. Somit konnte man die bei der
quantitativen Auswertung der GC/MS erhaltenen Flächen für die Ethanolpeaks auf die
Peakfläche, welche genau 790 mg Ethanol pro Liter Medium entspricht referenzieren und
eventuelle Verluste durch das Extraktionverfahren brücksichtigt werden
3.10.3 Bestimmung der Trockenmasse
Die Kulturen wurden durch Zentrifugation geerntet (3.10.2). Das Myzel einer 100 m/l Kultur
wurde danach im geöffneten und zuvor gewogenen Falcontube bei 65° ein bis zwei Tage im
Wärmeschrank gelagert. Anschließend wurde das Falcontube mit Inhalt gewogen und durch
subtrahieren der Tara die Trockenmasse bestimmt.
65
Material und Methoden
3.10.4 Headspace-Gaschromatographie
Mit dem Verfahren der Headspace Gaschromatographie konnten Ethanol und Butanol in
verschiedenen Experimenten bestimmt werden.
3.10.4.1 Prinzip der Headspace-Gaschromatographie
Headspace (= Kopfraum / Gasraum)-Gaschromatographie (HS-GC) ist die Bezeichnung für
ein instrumentelles Analyseverfahren, bei dem geringe Konzentrationen von leichtflüchtigen
Substanzen aus dem über der Probe befindlichen Dampfraum bestimmt werden können.
Somit ist es nicht nötig, vorher eine aufwendige Extraktion der zu analysierenden Stoffe
durchzuführen. Die Probe kann dafür in flüssiger oder fester Form vorliegen.
Die Headspace-Technik ist mit Hilfe beheizter Autosampler automatisiert und damit ein
schnelles sowie kostengünstiges analytisches Verfahren. Es wird häufig in der
Lebensmittelindustrie zur Bestimmung von Ethanol in Nahrungsmitteln und in der
forensischen Medizin zur Bestimmung von Blutalkoholspiegeln benutzt.
3.10.4.2 Durchführung der Headspace-GC
Die Bestimmung von Ethanol und Butanol wurde jeweils mit derselben Messmethode und
den gleichen Geräteeinstellungen durchgeführt.
Je 400 μl der zu untersuchenden Bakterien-Suspension wurden mit 100 μl n-Propanol
(1 ‰ (V/V)) als internem Standard versetzt. Die Probe wurde in einem 20 mL
Septumfläschchen gasdicht verschlossen und im Headspace-Gerät eine bestimmte Zeit bei
einer vorgewählten Temperatur erhitzt (Geräteparameter siehe Tabelle 28). Damit wurde
sichergestellt, dass sich ein Gleichgewicht zwischen der zu messenden Substanz im
Dampfraum und der gesamten Probe einstellen konnte.
Zu jeder Messreihe wurde vorher ein Faktor bestimmt, mit dessen Hilfe die unbekannten
Konzentrationen in den Proben berechnet werden konnten. Dazu versetzte man 400 μl 1,4 ‰
EtOH mit 100 μl 1,0 ‰ n-Propanol und analysierte dies gaschomatopraphisch. Der Faktor
wurde nach folgender Formel berechnet:
f = Korrekturfaktor
c = Konzentration in ‰ [V/V]
A = Peakfläche
66
Material und Methoden
Durch Umstellen ergibt sich für die Berechnung der Ethanolkonzentration folgende Formel:
f = Korrekturfaktor
c = Konzentration in ‰ [V/V]
A = Peakfläche
Damit wurde die Ethanolkonzentration in ‰ [V/V] berechnet. Durch folgende Umrechnung
gelangt man zur Konzentration in mg/L:
3.10.4.3 Geräteparameter HS-GC
3.10.4.3.1 Geräteparameter Gaschromatograph
Tabelle 28: Parameter und Einstellungen des Gaschromatographs bei der HS-GC
Gaschromatograph HP6890 (Agilent)
Oven
Front inlet
Column:Capillary Column (Perkin Elmer PE-2)
Detector: Flame ionisation detector (FID)
67
Initial temp.: 150 °C;
Run time: 4,00 min;
Mode: Split
Initial temp.: 80 °C
Pressure: 1,254 bar
Split ratio: 0,1:1
Split flow: 0,2 mL/min;
Total flow: 4,4 mL/min
Gas type: Helium
Methyl-5-Phenylsilicon
Nominal length: 50,0 m;
Nominal diameter: 320,00 μm;
Nominal film thickness: 2,00 μm
Temperature: 250 °C;
Hydrogen flow: 39,0 mL/min;
Air flow: 390,0 mL/min
Mode: constant makeup flow
Makeup flow: 25,0 mL/min
Makeup gas: Nitrogen
Material und Methoden
3.10.4.3.2 Geräteparameter Probenaufgabesystem
Tabelle 29: Parameter und Einstellungen des Probenaufgabesystems bei der HS-GC
Headspace-Probenaufgabesystem HS7694 (Agilent)
Zone Temps
Oven: 75 °C;
Loop: 95 °C
Transfer line: 110 °C
Event Times
GC cycle time: 11,0 min;
Vial equilibration time: 5,0 min;
Pressurize time: 0,2 min;
Loop fill time: 0,2 min;
Loop equilibration time: 0,2 min;
Inject time: 0,1 min
3.10.5 Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometer GC/MS
Als weitere Methode, zur Bestimmung von Ethanol diente die Gaschromatographie in
Verbindung mit der Massenspektrometrie.
3.10.5.1 Prinzip der GC/MS
Die Gaschromatographie (GC) ist eine analytische Trennmethode, bei welcher die zu
analysierende Substanz verdampft und über ein mobiles Trägergas (mobile Phase) in die
Trennsäule transportiert wird. Die Analyten gehen dabei mit der stationären Phase
Wechselwirkungen nach dem Prinzip der Verteilung (stationäre Phase = Flüssigkeit) oder
Adsorption (stationäre Phase = Feststoff) ein.
3.10.5.2 Durchführung der GC/MS
Für die zu Analytik von Ethanol durchgeführten gaschromatographischen Messungen wurde
ein HP6890 series GC‐System verwendet, das mit einem Agilent 5973 Network Mass
Selective Detector gekoppelt war. Als Säule kam eine Kapillarsäule (Optima 1) (30 m ×
0.25 mm, beschichtet mit 0.25 μm Dimethylpolysiloxan) zum Einsatz (RTX‐1 MS, Restek,
Bad Homburg, Deutschland) Als Trägergas wurde Helium verwendet und die Flußrate betrug
1,0 mL/min. Injektor‐ und Detektortemperatur wurden jeweils auf 280 °C eingestellt.
Injektionsvolumina von 1 μl wurden 1:10 gesplittet. Es wurde das in Tabelle 30 aufgeführte
Temperaturprogramm verwendet.
68
Material und Methoden
3.10.5.2.1 Berechnung der Ethanolkonzentration in den Medien
Zur Kalibrierung des Systems wurde eine Messreihe unter Verwendung von Ethanol in einer
Konzentration von 0,1 ‰ bis 5 ‰ (V/V) gelöst in Ethylacetat durchgeführt. Damit konnte im
Konzentrationsbereich der zu vermessenden Proben ein linearer Zusammenhang von
Peakfläche und Ethanolkonzentration festgestellt werden.
Als interner Standard wurde allen Proben n-Propanol in der Konzentration 1 ‰ (V/V)
zugesetzt. Nach Integration der Peaks für Ethanol und n-Propanol wurde aus dem Verhältnis
der Peakflächen für Ethanol (ArEtOH) und Propanol (ArProp) der Referenzprobe (3.10.2.1),
die jeweils 1‰ Ethanol und 1‰ Propanol enthielt ein Faktor fr berechnet.
Anschließend wurde in den einzelnen Proben jeweils wieder das Verhältnis von ApEtOH zu
ApProp gebildet und daraus der entsprechende Faktor fp für die Proben berechnet
Aus fr und fp konnte dann die Konzentration von Ethanol in Promille berechnet werden.
Um die Konzentration von Ethanol in g/L zu berechnen, mußte die folgende Umrechnung
erfolgen:
Wobei die Dichte von Ethanol (ρ = 789 g/L) beträgt.
Tabelle 30 GC/MS Temperaturgradient
Parameter
Temperatur (°C)
Dauer (min)
Aufheizrate (°C/min)
Gradient
60
2
10
69
220
10
55
270
5
55
Material und Methoden
3.11 Laborgeräte, Verbrauchsmaterialien
Tabelle 31: Laborgeräte
Gerät/ Bezeichnung
Agarosegel-Elektrophoresekammer und
Zubehör
Äkta-FPLC
Coulter-Optima LE-80K Ultrazentrifuge
E. coli Pulser
French Pressure Cell Press
Gefriertrocknungsanlage Alpha 2-4 LSC
Headspace-Probenaufgabesystem: HS7694
HisTrap™ FF Column
HPLC analytisch: 717 plus Autosampler, 2
Pumpen Waters 515, Säulenofen Jetstream
2,Waters 2996 Photodioden Array Detector
HPLC/ESI-MS analytisch und präparativ:
Agilent 1100 Serie, automatischer
Probengeber G1313A, Säulenofen G1316A,
quarternäre Pumpe G1311A, DAD G1315B,
QuadrupolMassendetektor G1946D, ESI-Quelle
HPLC/MS/MS:
Agilent 1100 Series, G1314B VWD
Detektor,
G1379B Degasser, G1312A binäre Pumpe,
1329A
Autosampler, Agilent 6460 Triple Quad
PCR Maschinen: Mastercycler Epgradient
GeneAmp® PCR System 9700
Protein-Elektrophorese-Kammer (vertikal):
Mini-PROTEAN mit Zubehör und
Spannungsgeber PAC3 beziehungsweise
MiniVE mit Zubehör
Vivaspin 20
Schüttelinkubator Multitron
SE 600 Elektrophoresekammer mit Zubehör
und Spannungsgeber
Spektralpolarimeter J-810
Spektrometer Ultrospec 2100 pro
Spektrometer Uvikon 933
Thermomixer comfort
UV-Transilluminator Image Master VDS zur
Geldokumentation (312 nm)
Vacuum-Konzentrator
Hersteller
GE Healthcare (Freiburg, D)
GE Healthcare
Beckmann Coulter (Krefeld, D)
Biorad Laboratories GmbH (München, D)
beziehungsweise GE Healthcare Europe
GmbH (Little Chalfont, GB)
Thermo Spectronic (Rochester, US)
Martin Christ (Osterode, D)
Agilent
GE Healthcare
Waters (Milford, US)
Agilent (Waldbronn, D)
Agilent (Waldbronn, D)
Eppendorf (Hamburg, D)
Applied Biosystems (Forster City, US)
Biorad Laboratories GmbH
Sartorius Stedem Biotech GmbH
Infors (Bottmingen, CH)
Hoefer (Freiburg, D)
Jasco (Easton, USA)
Amersham Pharmacia (Oldendorf, D)
Kontron Instruments (Neufahrn, D)
Eppendor (Hamburg, D)
Amersham Pharmacia (Oldendorf, D)
Firma H. Saur Laborbedarf
(Reutlingen, D)
70
Material und Methoden
Varian VNMRS600
Zentrifuge 5415 R: Minireaktionsgefäße
1,5/2 mL
Zentrifuge Avanti J-20XP: Falcon Tubes
15/50 mL
Zentrifuge Rotina 35 R: 500 mL Gefäße
Varian Deutschland GmbH
(Darmstadt, D)
Eppendorf (Hamburg, D)
Beckmann Coulter (Krefeld, D)
Andreas Hettich GmbH & Co. KG
(Tuttlingen, D)
Tabelle 32: Verbrauchsmaterialien
Bezeichnung
Hersteller
Oasis HLB 35 cc Vac Cartridge, 6 g Sorbent
per Cartridge, 60 µm Particle Size
Rotilabo®-Petrischalen, ᴓ 10 cm
Waters (Eschborn, D)
Rotilabo®-Spritzenfilter, 0,45 µm, PVDF
Roth
Rotilabo®-Spritzenfilter, steril, 0,2 µm
PVDF
Vivaspin MWCO 30000
Roth
Roth
Sartorius (Gottingen, D)
3.12 Software, Datenbanken, Internetservices
Tabelle 33: Im Rahmen dieser Arbeit verwendete Software, Datenbanken und Internetservices
Bezeichnung
blastp
ChemStation Rev. A09.03
Clone Manager Suite 7
Empower 2002
Isis Draw v.2.5
Restriction enzyme guide
Hersteller / Anbieter
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.htmL [59]
Agilent
Scientific & Educational Software (Durham, US)
Waters (Milford, US)
MDLTM Information Systems
http://www.promega.com/guides/re_guide/RESearch.asp?sear
ch=buffer
71
Ergebnisse
4
Ergebnisse
4.1 Untersuchungen zur Biosynthese von Didesmethylmensacarcin
4.1.1 Biosynthesegencluster von Mensacarcin
A. Linnenbrink konnte im Rahmen seiner Doktorarbeit das Biosynthesegenclusters von
Mensacarcin identifizieren. Es wurde beim Screening einer Cosmid-Bibliothek des Stammes
Streptomyces bottropensis auf dem Cosmid Cos2 lokalisiert [28]. Die heterologe Expression
dieses Cosmids in Streptomyces albus J1074 (im Folgenden S. albus) führte jedoch nicht, wie
im natürlichen Produzenten Streptomyces bottropensis zur Produktion von Mensacarcin
(Abbildung
22),
sondern
zur
Produktion
des
nicht
methylierten
Derivates
Didesmethylmensacarcin (Abbildung 23) [28].
Strukturell
besitzt
Polyketidstoffwechsel
Mensacarcin
gebildet
wird.
ein
Dekaketid-Grundgerüst,
Das
Molekül
enthält
neun
welches
im
charakteristische
Sauerstoffatome. Durch Fütterungsexperimente mit isotopenmarkierten Vorstufen konnte
gezeigt werden, dass fünf Sauerstoffatome dem Luftsauerstoff entstammen und enzymatisch
in das Molekül eingebaut werden wohingegen die verbleibenden vier Sauerstoffatome aus
Acetateinheiten stammen, welche bei der Verknüpfung von Malonyl-Einheiten während der
Polyketidsynthese entstehen [24].
Ebenfalls
konnte
A.
Linnenbrink
auf
dem
Biosynthesegencluster
des
Didesmethylmensacarcins (Abbildung 24) 9 Gene identifizieren, die für Oxygenasen (msnO1msnO9) codieren [28]. Eine große Struktur- und Regioflexibilität macht diese Enzyme zu
wertvollen Instrumenten in der kombinatorischen Biosynthese. Daher ist es von großer
Bedeutung, die Funktion möglichst vieler Vertreter dieser Enzymklasse aufzuklären.
Fünf der insgesamt neun identifizierten Oxygenasen wurden von K. Probst inaktiviert [1].
Durch Sekundärstoffanalytik der erstellten Knockoutmutanten konnte ein hypothetischer
Biosyntheseweg für Didesmethylmensacarcin postuliert werden (Abbildung 25).
Die Funktion von MsnO2 wurde nicht untersucht, ist jedoch für die vollständige Aufklärung
des Biosyntheseweges von großer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde msnO2 auf
Cos2 inaktiviert. Das Cosmid mit inaktiviertem msnO2 wurde anschließend in S. albus
exprimiert. Durch Sekundärstoffanalytik der Knockoutmutante konnte die neu gebildete
Substanz Msn-UH detektiert werden. Ein 1-H NMR wurde gemessen und ein
Strukturvorschlag von Msn-UH postuliert.
72
Ergebnisse
Abbildung 22: Mensacarcin
Abbildung 23: Didesmethylmensacarcin
73
Ergebnisse
regulat
ors
Abbildung 24: Positionierung der einzelnen Gene im Biosynthesegencluster von Didesmethylmensacarcin
(36820 bp) Gene, die für Proteine derselben Enzymklasse codieren sind jeweils in gleicher Farbe
dargestellt. Das Cluster beinhaltet die minimale PKS (MsnK1-K3, grün), Cyclasen (MsnC1-C3, blau)
Oxidoreduktasen (MsnO1-O11, rot). Regulatorische Aufgaben übernehmen MsnR1 und MsnR2. MsnH0H8 codieren für Proteine mit einer bis zum jetzigen Zeitpunkt unbekannten Funktion [28].
Abbildung 25: Darstellung des hypothetischen Biosynthesewegs, der von K. Probst für den Sekundärstoff
Didesmethylmensacarcin postuliert wurde [1]. Die im Rahmen der Arbeit von K. Probst untersuchten
Proteine sind blau hinterlegt. MsnO2, das im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde ist rot hinterlegt.
Die Funktion von MsnO1, MsnO10 und MsnO11 wurde nicht aufgeklärt. Ihre Funktionen wurden
anhand von bekannten Enzymen, welche durch Vergleich der Aminosäuresequenz (blastp) gefunden
wurden vorhergesagt [1].
74
Ergebnisse
4.1.2 Konstruktion von Cos2O2
Mittels der Redirect® Technology wurde das Gen msnO2 auf dem Cosmid Cos2 inaktiviert.
Dazu wurde wie unter 3.6.3 beschrieben verfahren. Das Konstrukt wurde Cos2O2_spec
benannt. Anschließend wurde das Spectinomycin-Resistenzgen wieder entfernt, um polare
Effekte bei der folgenden heterologen Expression zu vermeiden (3.6.3.5). Dabei entstand
Cos2O2. Die Inaktivierung wurde durch PCR mit den Primern O2Kontr-F(040711) und
O2Kontr-R(040711) kontrolliert und nachgewiesen (3.6.3.4).
10 kb
3 kb
2 kb
1,5 kb
1 kb
1
2
3
4
L
Abbildung 26: Analytische Agarose-Gelelektrophorese der Kontroll-PCR für die Inaktivierung von
msnO2 auf Cos2. Die erhaltenen PCR-Produkte bei Verwendung von Cos2 (Bahn 1), Cos2ΔO2_spec
(Bahn 2 und 3) beziehungsweise Cos2ΔO2 (Bahn 4) als Matrize sind gezeigt. Die Größen der DNAFragmente sind 1750 bp für Cos2, 637 bp für Cos2ΔO2 und 1480 bp für Cos2ΔO2_spec. Als
Größenstandard diente eine 1 kb DNA Ladder der Firma Promega (L).
Bei Verwendung von Cos2 als Matrize für die Kontroll-PCR ist auf dem Agarosegel ein
Fragment der Größe 1750 bp zu sehen. Es handelt sich um das Amplifikat des nativen Gens
msnO2 auf Cos2 durch die verwendeten Primer (Abbildung 26, Bahn 1). Bahn 4 zeigt ein
Fragment der Größe 1480 bp, welches, wie mittels Clone Manager vorhergesagt, nach PCR
mit Cos2O2_spec erhalten wurde (Abbildung 26, Bahn 4). Die Substitution eines
Genabschnittes von msnO2 durch die Spectinomycin-Resistenzkassette wurde dadurch
bestätigt. Nach Elimination des Spectinomycin-Resistenzgens wie in 3.6.3.5 beschrieben
entstand das Cosmid Cos2ΔO2. Bei einer PCR mit diesem Cosmid als Matrize wurde das
erwartete Fragment der Größe 637 bp erhalten. Damit wurde der Nachweis für die
erfolgreiche Elimination des Gens aadA erbracht (Abbildung 26, Bahn 2 und 3).
75
Ergebnisse
4.1.3 Konstruktion der Mutante für die heterologe Expression von Cos2O2
4.1.3.1 Konstruktion von S. albus x Cos2ΔO2
Cos2ΔO2 wurde mittels intergenerischer Konjugation (3.6.1.3) in S. albus eingebracht, der als
Wirt für die heterologe Expression gewählt wurde. Der daraus resultierende Stamm war
S. albus x Cos2ΔO2. Zur Kontrolle der korrekten Integration von Cos2ΔO2 in das Genom
von S. albus, wurde die genomische DNA des Stammes isoliert (3.6.4.5). Mit der isolierten
DNA als Template und dem Primerpaar O2Kontr-R(040711)/ O2Kontr-F(040711) wurde eine
PCR durchgeführt. Dabei konnte mittels Agarose-Gelelektrophorese ein Fragment der Größe
637 bp nachgewiesen werden und somit die korrekte Integration von Cos2ΔO2 in das Genom
gezeigt werden.
4.1.3.2 Überexpression von msnR1 in S. albus x Cos2O2
K. Probst stellte im Rahmen ihrer Forschungsarbeit fest, dass es durch Überexpression des
biosynthesespezifischen Regulatorgens msnR1 zu einer signifikanten Steigerung der
Produktion von Didesmethylmensacarcin kam, wenn das für MsnR1 codierende Gen und
Cos2 in S. albus coexprimiert wurden [1]. Des Weiteren konnte nur dann eine Akkumulation
von neuen Intermediaten in den untersuchten Oxygenasemutanten festgestellt werden, wenn
msnR1 coexprimiert wurde [1]. Daher wurde msnR1 in S. albus x Cos2O2 eingebracht.
4.1.3.2.1 Konstruktion von S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1
Zur Überexpression des Gens msnR1 wurde das Plasmid pKR1verwendet, in dem das Gen
unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors ermE steht [1]. PKR1 wurde mittels
intergenerischer Konjugation (3.6.1.3) in den Stamm S. albus x Cos2O2 eingebracht. Der
entstandene Stamm wird im Folgenden S. albus x Cos2O2 x pKR1 genannt. Die Mutante
wurde unter den angegebenen Bedingungen kultiviert (3.4.2). In gleicher Weise wurde
S. albus x Cos2 x pKR1 konstruiert, der zur Kontrolle jeweils parallel zu S. albus x Cos2O2
x pKR1 kultiviert wurde und als Referenz für die Produktionsanalyse diente.
4.1.4 Produktionsanalyse von S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1
Nach einer Kultivierungszeit von fünf Tagen wurden die Produktionsmedien von
S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1 und S. albus x Cos2 x pKR1 untersucht. Dazu wurden die
gebildeten Sekundärstoffe wie unter 3.9.2.1 beschrieben extrahiert. Anschließend wurden die
76
Ergebnisse
Rohextrakte mittels HPLC/ESI-MS untersucht (Methode: mens04-R) (3.9.3.1). Die erhaltenen
HPLC-Chromatogramme sind in Abbildung 27 dargestellt, die dazugehörigen UV-Spektren in
Abbildung 28 sowie die MS-Spektren in Abbildung 29.
Es konnte ein neuer Metabolit (Msn-UH) bei einer Retentionszeit von 19,8 min detektiert
werden. Das UV-Spektrum (Abbildung 28) dieser Substanz zeigt drei Hauptmaxima bei 228,
257 und 432 nm. Im Vergleich dazu liegen die Maxima von Didesmethylmensacarcin bei 230,
267 und 326 nm. Somit weisen die Maxima 1 und 2 von Msn-UH im Vergleich zum
Didesmethylmensacarcin
eine
hypsochrome
Verschiebung
auf,
Maximum
3
eine
bathochrome. Für das korrespondierende Signal im MS-Spektrum des negativen
Detektionsmodus konnten 2 Peaks mit den m/z-Werten 484 und 339 ermittelt werden
(Abbildung 29).
MSN-UH
DDM
Abbildung 27: HPLC-Chromatogramme (λ = 254 nm) der Rohextrakte von S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1
(oben) und S. albus x Cos2 x pKR1 (unten). Im Rohextrakt von S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1 wurde ein
neuer Sekundärmetabolit mit der Retentionszeit von 19,8 min detektiert (Msn-UH).
Didesmethylmensacarcin (DDM) wurde im Rohextrakt von S. albus x Cos2 x pKR1 nachgewiesen.
77
Ergebnisse
Abbildung 28: UV- Spektren von Didesmethylmensacarcin mit den Hauptmaxima bei 230, 267 und 326
nm (links) und Msn-UH, Hauptmaxima bei 228, 257 und 432 nm (rechts).
Abbildung 29: MS-Spektrum (Negativmodus) des Substanzpeaks von Msn-UH im Rohextrakt von
S. albus x Cos2 x pKR1.
4.1.5 Aufreinigung von Msn-UH
Zur vollständigen Isolierung des Metaboliten Msn-UH wurde die Substanz in mehreren
Schritten aufgereinigt. Aus vier Litern Kulturbrühe des Stammes S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1
wurden die produzierten Sekundärstoffe mit Ethylacetat extrahiert (3.9.2.1). Dabei wurden
3,44 g trockener Rohextrakt mit brauner Farbe erhalten.
78
Ergebnisse
4.1.5.1 Festphasenextraktion
In einem ersten Schritt wurde der Rohextrakt über eine Festphasenextraktion aufgereinigt
(3.9.4.1). Dafür wurde eine Waters Oasis®HLB 35 cc Säule benutzt (3.9.4.1). Die einzelnen
Fraktionen wurden per analytischer HPLC vermessen. In der mit 90 prozentigem Methanol
eluierten Fraktion (90 %-Fraktion) konnte Msn-UH detektiert werden. Neben dem
gewünschten Peak bei 19,7 min waren weitere Signale vorhanden (Abbildung 30). Vor allem
ein großer Substanzpeak bei 20,04 min musste abgetrennt werden.
Abbildung 30: HPLC Diagramm der 90 % Fraktion nach SPE
4.1.5.2 Präparative Dünnschichtchromatographie
Zur weiteren Aufreinigung wurde die durch Festphasenextraktion gewonnene 90 %-Fraktion
(4.1.5.1) mittels präparativer Dünnschichtchromatographie erneut aufgetrennt (3.9.4.2). Als
Lösungsmittel wurde MeOH:CHCl2 9:1 (V/V) + 0,01 % HOAc verwendet. Auf den DC
Platten waren zwei deutlich gelb gefärbte Hauptbanden zu sehen. Eine scharfe Bande mit dem
Rf-Wert 0,85 und eine breitere Bande mit einem Rf-Wert von 0,8 (Abbildung 31). Nach dem
Auskratzen wurde mit Methanol extrahiert und die gewonnenen Extrakte jeweils per
analytischer HPLC vermessen. In Bande I (Rf = 0,85) konnte Msn-UH detektiert werden.
Neben dem Substanzpeak bei 19,7 min waren Verunreinigungen zu sehen (HPLC
Chromatogramm siehe Abbildung 32). Deshalb erfolgte ein weiterer Aufreinigungsschritt
über präparative HPLC (4.1.5.2).
79
Ergebnisse
Laufmittelfront
Bande I Rf = 0,85
Bande II Rf = 0,8
Startlinie
Abbildung 31: DC zur präparativen Auftrennung der 90 %-Fraktion der Festphasenextraktion. Bande I,
Rf-Wert = 0,85 (obere dunkelgelb gefärbte Bande), Bande II, Rf-Wert = 0,80 (untere breite Bande,
hellgelb). Msn-UH konnte in Bande I nachgewiesen werden.
Abbildung 32: HPLC Diagramm der mit Methanol extrahierten Bande der präparativen DC mit dem
Rf-Wert = 0,85. Substanzpeak von Msn-UH bei 19,7 min sowie die Signale der Verunreinigungen sind zu
sehen.
80
Ergebnisse
4.1.5.3 Präparative HPLC
Mit den Methanolextrakten aus der präparativen DC wurden eine präparative HPLC
durchgeführt (3.9.4.3). Unter Verwendung der Methode UH_Meth_1 konnte Msn-UH isoliert
werden. So wurden 4,2 mg reines Msn-UH gewonnen, welches für die im Kapitel 4.1.6
beschriebene NMR-Analyse verwendet wurde. Im HPLC Diagramm der zur Kontrolle
durchgeführten analytischen Messung (Abbildung 33) mit der Methode Mens-O4_R zeigte
sich, dass der Massenpeak bei m/z=484 fast vollständig verschwunden war und nur noch der
Peak bei m/z=339 zu sehen war (Abbildung 34).
Abbildung 33: UV Absorptionsspektrum bei 254nm von Msn-UH nach präparativer HPLC
Abbildung 34: MS-Spektrum (Negativmodus) des Substanzpeaks von Msn-UH nach präparativer HPLC
81
Ergebnisse
4.1.6 Strukturaufklärung von Msn-UH mittels NMR-Spektroskopie
Die Strukturanalyse erfolgte mittels NMR-Spektroskopie und wurde in Kooperation mit
S. Ferlaino (Pharmazeutische und Medizinische Chemie, Universität Freiburg) durchgeführt.
Die Probe wurde für die Messung in CDCl3 gelöst. Es wurden 1H- und
13
C-1D-NMR
1
Aufzeichnungen gemacht. Das H-Spektrum (Abbildung 35) konnte interpretiert werden,
wohingegen für das 13C- NMR zu wenig Probengut vorhanden war. Neben dem 1H-1D-NMR
wurden
außerdem
2D-NMR-Experimente
in
Form
von
1
H/1H-COSY
(correlation
spectroscopy), HMBC (heteronuclear multiple bond correlation), HSQC (heteronuclear
single quantum coherence) durchgeführt. Unter Einbeziehung der mittels HPLC/ESI-MS
Analytik (4.1.4) ermittelten Werte für Masse und UV-Absorbtionsmaxima wurden die
1
H-NMR-Spektren ausgewertet und der darauf begründete Strukturvorschlag für Msn-UH
erstellt (Abbildung 36).
Vier Signale (C, D (2x), E) konnte man im Bereich der chemischen Verschiebung von
aromatischen Wasserstoffkernen den Positionen C-4, C-6, C-7 und C-8 zuordnen (siehe
Tabelle 34). Weiter wurden fünf Signale für aliphatische Wasserstoffkerne erhalten. Damit
konnte zum einen die Methylierung an C-3 (Signal K) begründet werden, zum anderen die
Wasserstoffatome an C-12, C-13 und C-14 zugeordnet werden (Signale H, I, F und M). Durch
das Signal G wurde die Hydroxylgruppe an C-13 angezeigt. Ebenfalls konnten durch die
Signale A und B zwei phenolische Hydroxylgruppen an C-10 und C-9 identifiziert werden.
Die zur Auswertung herangezogenen Signale sind im abgebildeten 1H-NMR-Spektrum
gekennzeichnet (Abbildung 35). In Tabelle 34 wurden die den Spektren entnommenen Werte
aufgeführt und den entsprechenden Wasserstoffkernen zugeordnet. Die Interpretation der
Spektren erfolgte durch A. Gässner (Universität Freiburg, AG Bechthold) und Dr. R. Murillo
(Universität von Costa Rica).
82
Ergebnisse
Abbildung 35: 1H-NMR-Spektrum von Msn-UH
OH
8
9
O
10
OH
1
2
15
16
O
OH
11
13
12
17
7
6
5
3
4
O
Abbildung 36: Strukturvorschlag für Msn-UH.
83
CH3
CH3
14
Ergebnisse
Tabelle 34: Die dem 1H-NMR-Spektrum von Msn-UH zur Strukturaufklärung entnommenen Daten.
Chemische Verschiebung (δH), Signalformen (Multiplett (m), Dublett (d) und Singulett (s)) sowie die
Intensität der Signale und die entsprechenden Positionen im Molekül (Abbildung 36) sind aufgeführt.
Position im
Molekül
4
Signal
δH[ppm]
Signalform
Intensität
Cosy
D
7,73
m
2 (1+1)
(2,43)
6
C
7,87
m
1
7
D
7,73
m
2 (1+1)
8
E
7,33
m
1
12-1
H
3,16
dd
1
12-2
I
2,99
dd
1
13
F
4,48
ddd
1
14
N
1,31
m
3
16
G
3,67
s
-
17
K
2,43
d
3
18
B
11,98
s
1
19
A
12,40
s
1
84
7,33
7,87
4,49
2,99
3,16
4,49
2,99
1,31
4,49
0,91
10,26
Ergebnisse
4.2 Ethanol-Produktion in Streptomyceten
4.2.1 Hintergrund und Zielsetzung des Projektes
Clostridium
acetobutylicum
oder
Zymomonas
mobilis
sind
anaerob
wachsende
Mikroorganismen, welche für die großtechnische Herstellung von Biokraftstoffen verwendet
werden. Für die Fermentation sind diese auf einfach verwertbare Kohlenhydrate angewiesen.
Z. mobilis beispielsweise kann nur Glukose und Fruktose verwerten [60]. So kommt es zu
einem enormen Bedarf an stärkehaltigen Nahrungs- und Futterpflanzen. Um den
Herstellungsprozess und die Nutzung von Biokraftstoffen aus ökologischer und ethischer
Sicht zu verbessern, ist es wichtig, als Rohstoffquellen komplexe Kohlenhydrate aus
cellulosehaltigen Abfällen zu nutzen.
Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales und im speziellen der Gattung Streptomyces
haben die Eigenschaft, ein große Anzahl verschiedener Enzyme zu produzieren, und sind
damit auch in der Lage komplexe Kohlenhydrate zu Monosacchariden zu spalten und diese
für die Produktion von Ethanol zu nutzen [61]. Es werden beispielsweise Cellulasen,
Chitanasen, Hemicellulasen, Amylasen und Proteasen gebildet.
Außerdem hat man eine große Auswahl an unterschiedlichen Stämmen, allein 500
verschiedene
Streptomyceten-Arten
sind
bisher
bekannt,
um
einen
den
Produktionsbedingungen optimal angepassten Stamm zu finden (2.5).
Da Streptomyceten von Natur aus nicht in der Lage sind, Ethanol zu produzieren, sollte durch
die heterologe Expression von spezifischen Genen aus dem Biosynthese-Stoffwechsel Ethanol
produzierender Bakterien ein künstlicher Syntheseweg erschlossen werden, wodurch
Streptomyceten die Ethanolproduktion ermöglicht werden soll.
4.2.2 Ethanol-Biosyntheseweg von Zymomonas mobilis und die Gene adhB
und pdc
In Abbildung 37 ist der Abbau von Glukose zu Pyruvat in Zymomonas mobilis (EntnerDoudoroff-Weg), beziehungsweise in S. cerevisiae (Embden-Meyerhof-Parnas-Weg), sowie
der weitere Stoffwechselweg zum Ethanol dargestellt. Die Gene pdc und adhB codieren hier
für eine Pyruvatdecarboxylase (pdc) beziehungsweise eine Alkoholdehydrogenase (adhB),
welche zwei wichtige Schritte des Biosynthesestoffwechsels von Ethanol ausgehend von
Pyruvat katalysieren. Für Streptomyces coelicolor zeigten Cochrane und Mitarbeiter, dass
diese Mikroorganismen in der Lage sind Glukose über den Emden-Meyerhof-Parnas-Weg zu
85
Ergebnisse
metabolisieren
[62].
Somit
kommt
Pyruvat
als
natürliches
Intermediat
im
Streptomycetenstoffwechsel vor.
CH2OH
HO
HO
O
O
Z.
-Weg)
Z.mobilis
mobilis (Entner-Doudoroff
(Entner-Doudorff-Weg)
S. cerevisiae (Embden Meyerhof-Weg)
OH S. cerevisiae(Embden-Meyerhof-Parnas-Weg)
OH
O
H3C
D-Glukose
O
Pyruvat
Pyruvatdecarboxylase
pdc
PDC
Alkoholdehydrogenase
- CO2
adhB
AdhB
O
HO
H3C
CH3
Ethanol
NAD+
NADH+H+
H
Acetaldehyd
Abbildung 37: Glukose-Abbau zu Pyruvat in Z. mobilis (Entner-Doudoroff-Weg) und in S. cerevisiae
(Embden-Meyerhof-Parnas-Weg). Pyruvat wird unter Katalyse des Enzyms Pyruvatdecarboxylase (Pdc)
zum Acetaldehyd decarboxyliert. Dieses wird mit Hilfe der Alkoholdehydrogenase (AdhB) schließlich zu
Ethanol verstoffwechselt.
86
Ergebnisse
4.2.3 Erstellung eines Plasmides für die Expression von adhB und pdc
Zur heterologen Expression der in 4.2.2. beschriebenen Gene adhB und pdc in verschiedenen
Streptomyceten wurde das Plasmid pUWL-H-ap erstellt (3.8.1.1).
4.2.4 Untersuchung verschiedener Streptomyceten
Um die Ethanolproduktion von Streptomyceten zu testen wurde pUWL-H-ap mittels
intergenerischer Konjugation in verschiedene Stämme eingebracht. Dazu wurde wie in 3.6.1.2
beschrieben zunächst E. coli ET 12567 pUZ8002 mit pUWL-H-ap transformiert. Ebenso
wurde pUWL-H-tnp zur Konstruktion eines Referenzstammes in E. coli ET 12567 pUZ8002
eingebracht. Anschließend wurde die Konjugation wie unter 3.6.1.3. beschrieben
durchgeführt.
Folgende Stämme wurden untersucht:
-
Streptomyces coelicolor A3(2)
-
Streptomyces collinus Tü1892
-
Streptomyces sp. Tü6071 WT
-
Streptomyces fradiae Tü 2717
-
Streptomyces fradiae AX
-
Streptomyces cinnamonensis
-
Streptomyces coelicolor M1154
-
Streptomyces cyanogenus S136
-
Unbekannter thermophiler Stamm (von Dr. A. Luzhetskyy für das Experiment
erhalten)
Nach fünf bis sieben Tagen konnten auf den Platten von S. coelicolor A3(2) (im Folgenden
S. coelicolor), S. sp. Tü6071 WT, S. fradiaeTü 2717 (im Folgenden S. fradiae),
S. cyanogenus S136, S. coelicolor M1154 und S. cinnamonensis Exkonjuganden erhalten.
Diese wurden auf MS- oder HA-Medium, jeweils mit 50 µg/µL Hygromycin und 400 µg/mL
Phosphomycin überpickt. Von Streptomyces collinus Tü1892, Streptomyces fradiae AX sowie
dem unbekannten thermophilen Stamm konnten keine Exkonjuganden erhalten werden.
4.2.5 Kontrolle der Exkonjuganden
Vor Inkubation von Produktionskulturen der verschiedenen Stämme wurde geprüft, ob das
gewünschte Expressionsplasmid in den Bakterien vorhanden ist. Dazu wurde aus einer
Vorkultur eine geringe Menge Myzelium entnomen und die gesamte DNA entsprechend der
in 3.6.9.3 beschriebenen Methode isoliert. Anschließend wurde E. coli mit der auf diese
87
Ergebnisse
Weise erhaltenen DNA transformiert, und auf hygromycinhaltigen Agarböden kultiviert. Nur
wenn ein aus den Streptomyceten stammendes Plasmid aufgenommen wurde, konnten die
E. coli Kulturen wachsen. Schließlich einzelne Klone gepickt und die darin enthaltenen
Plasmide isoliert. Durch Restriktionsanalyse konnten diese schließlich als pUWL-H-ap
identifiziert werden.
4.2.6 Kontrolle der Expression von adhB und pdc
Um die Expression der Gene für die Ethanolproduktion nachzuweisen wurde die RNA aus
den Produktionskulturen von S. coelicolor A(3)2+adh+pdc, S.coelicolor M1154+adh+pdc
sowie den Referenzstämmen S.coelicolor x pUWL-H und S. coelicolor M1154 x pUWL-H
isoliert (3.6.5.) und damit eine RT-PCR durchgeführt (3.6.7). Die Konzentration der isolierten
RNA wurde mit einem Photometer wie in 3.6.6.2 beschrieben bestimmt. Ebenfalls wurde die
Reinheit der RNA durch ermitteln der A260/A280 Ratio bestimmt (3.6.6.2). Die
entsprechenden Werte sind in Tabelle 35 aufgeführt. Die reverse Transkription erfolgte mit
dem QuantiTect Rev. Transcription Kit (Quiagen) wie im Kapitel 3.6.7 beschrieben.
Schließlich wurden die reversen Transkripte der isolierten RNA durch eine PCR amplifiziert
(3.6.8). Somit konnte die Expression von adhB und pdc erfolgreich nachgewiesen werden.
Tabelle 35: Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der isolierten RNA
OD
Bezeichnung
[260 nm]
S. coelicolor A(3)2+adh+pdc (nach 24 h) 0,533
S. coelicolor A(3)2+adh+pdc (nach 72 h) 0,123
S. coelicolor M1154+adh+pdc (nach 24 h) 0,307
S. coelicolor M1154+adh+pdc (nach 72 h) 0,899
RNA-Konzentration
[ng/µL]
3518
541
1351
1978
A260/A280
ratio
1,880
1,840
1,870
1,860
4.2.7 Anzucht der Exkonjuganden
Die mit pUWL-H-ap konjugierten Stämme sowie die entsprechenden Referenzkulturen
wurden wie in Kapitel 3.4.2 beschrieben kultiviert. Je nach Experiment wurde fünf bis zwölf
Tage lang inkubiert.
Die Analytik der Produktionskulturen erfolgte per Headspace-Gaschromatographie (HS-GC),
beziehungsweise per GC/MS, wie in 3.10.4 und 3.10.5 beschrieben. Die Headspace Methode
ermöglichte die Bestimmung von im Medium enthaltenen flüchtigen Komponenten ohne eine
vorherige Extraktion der Substanz. Für die Messung mittels GC/MS mußten die Kulturen
zunächst extrahiert werden. Durch Kopplung mit dem Massenspektrometer und der
88
Ergebnisse
Möglichkeit zum Abgleich des Spektrums mit einer Datenbank (NIST) konnte mit dieser
Methode eine genaue Charakterisierung der gemessenen Substanz erfolgen.
4.2.8 Ethanolproduktion in verschiedenen Streptomyces Stämmen
In bisherigen Untersuchungen wurde die Produktion von S. coelicolorA(3)2 in HA und
NL111-Medium verglichen. Dabei zeigte sich, dass in NL111 etwa 40 mal mehr Ethanol
enthalten war als in HA-Medium [29]. Aufgrund dieser Informationen wurden die im
Folgenden beschriebenen Experimente mit den unterschiedlichen Stämmen in diesem
Medium durchgeführt. Die Anzucht und Extraktion der Kulturen wurde wie in den Kapiteln
3.2.1.2 bzw 3.10 beschrieben. Anschließend erfolgte die Analyse per HS-GC. Die Werte für
die Ethanolkonzentration in den Kulturbrühen der unterschiedlichen Stämme sind in Tabelle
36 aufgeführt.
Bei S. cinnamonensis+adh+pdc konnten 0,03 mg Ethanol pro Liter Kulturbrühe detektiert
werden. Da im Medium des Referenzstammes 0,05 mg/L detektiert wurden, führte die
Expression der Gene adhB und pdc in diesem Stamm zu keiner Ethanolproduktion.
In den Kulturen von S. fradiaeTü 2717+adh+pdc (im Weiteren „ S. fradiae“) wurden
158 mg/l Ethanol detektiert, respektive 1 mg/l im Medium des Referenzstammes. Man konnte
somit eine deutliche Ethanolproduktion feststellen.
Die für Streptomyces sp. Tü6071 WT ermittelten Werte lagen für den Stamm mit dem
Expressionsplasmid pUWL-H-ap bei 0,03 mg Ethanol pro Liter Kulturbrühe, respektive
0,01 mg/L für den Referenzstamm und sprechen somit nicht für eine durch die Expression
von adhB und pdc induzierte Ethanolsynthese
Bei Streptomyces cyanogenus +adh+pdc wurden 64 mg/L Ethanol in den Produktionsmedien
gemessen
im
Vergleich
zu 0,9
mg/L
beim
untersuchten
Referenzstamm
S. cyanogenus S136 x pUWL-H sprechen dafür, dass in diesem Stamm Ethanol produziert
wurde, wobei die Menge im Vergleich zu S. coelicolor und auch S. fradiaerelativ gering ist.
Die Kulturen von Streptomyces coelicolor A(3)+adh+pdc erbrachten die höchste gemessene
Ethanolmenge im Medium. Sie betrug 610 mg/L respektive 4,9 mg/L im Referenzstamm. Die
produzierte Ethanolmenge war somit um ein Vielfaches höher als in allen anderen
untersuchten Stämmen. Der Quotient aus Ethanolkonzentration in der Produktionskultur und
der entsprechenden Konzentration der Referenzkultur liegt mit 104 jedoch unterhalb des
Wertes für S. fradiae, was an den höheren Referenzwerten von S. coelicolor A(3)2 (im
Weiteren S. coelicolor) relativ zu den anderen Stämmen liegt.
89
Ergebnisse
Die Experimente mit Streptomyces coelicolor M1154 wurden separat durchgeführt und
werden in Kapitel 4.2.17 beschrieben.
Tabelle 36: Ethanolkonzentration (mg/L) in den Produktionsmedien der unterschiedlichen Stämme.
Werte für die Produktionskulturen (enthalten pUWL-H-ap): cET1; Werte für die Referenzkulturen
(enthalten pUWL-H): cET2. Es wurde fünf Tage lang in NL111-Medium kultiviert.
Stamm
Referenzkultur
cET2 [mg/L]
0,05
cET1/cET2
S. cinnamonensis
Produktionskultur
cET1 [mg/L]
0,03
S. sp Tü6071
0,03
0,01
3
S. fradiaeTü2717
158
1
158
S. cyanogenus S136
64
0,9
71,1
S. coelicolor A(3)2
610
4,9
124,5
0,6
4.2.9 Vergleich unterschiedlicher Produktionsmedien
4.2.9.1 HA-, NL111- und E1-Medium
Nachdem es beim Vergleich von HA- und NL111-Medium zu einer deutlichen Steigerung der
Ethanolproduktion bei Verwendung von NL111-Medium kam [29], sollte mit E1-Medium ein
weiteres
für
Streptomyces
geeignetes
Produktionsmedium
getestet
werden.
S. coelicolor+adh+pdc und Streptomyces fradiae+adh+pdc, welche sich nach den bislang
durchgeführten
Experimenten
als
die
am
besten
geeigneten
Vertreter
für
die
Ethanolproduktion herauskristallisierten, wurden dazu fünf Tage lang in NL111- und
E1-Medium bei 28°C kultiviert. Ebenfalls wurden jeweils Referenzkulturen die anstatt des
Expressionsplasmids pUWL-H-ap den leeren Vektor pUWL-H-tnp enthielten inkubiert. Die
Analytik erfolgte aufgrund der höheren Genauigkeit per GC/MS (3.10.5.2) Hierzu wurden die
Kulturen zunächst extrahiert (3.10.2) und für die GC/MS vorbereitet.
In NL111-Medium konnte im Vergleich zu E1-Medium sowohl für S. fradiaeals auch für
S. coelicolor eine erhöhte Ethanolproduktion festgestellt werden (Tabelle 37, Abbildung 38).
90
Ergebnisse
Tabelle 37: Ethanolproduktion von S. coelicolor und S. fradiae in NL111- und E1-Medium. Es wurden
jeweils Produktionskulturen (enthalten pUWL-H-ap) der beiden Stämme S. coelicolor und S. fradiae sowie
die entsprechenden Referenzkulturen (enthalten pUWL-H) in E1- und NL111-Medium fünf Tage lang
kultiviert.
Stamm
S. coelicolor+pUWL-H
NL111
Ethanol [mg/L]
<10
E1
Ethanol [mg/L]
<10
S. fradiaeTü2717+pUWL-H
<10
<10
S. coelicolor+adh+pdc
610
310
S. fradiaeTü2717+adh+pdc
158
122
Vergleich von NL111 und E1-Medium
700
Ethanol mg/L
600
500
S. coelicolor x pUWL-H
400
S. coelicolor + adh+pdc
300
S. fradiae x pUWL-H
200
S. fradiae+adh+pdc
100
0
NL111 Medium
E1 Medium
Abbildung 38: Ethanolproduktion von S. coelicolor+adh+pdc und S. fradiae+adh+pdc in NL111 und E1Medium. Es wurden zum Vergleich die entsprechenden Referenzkulturen (S. coelicolor x pUWL-H und
S. fradiaex pUWL-H) in E1 und NL111-Medium fünf Tage lang kultiviert.
4.2.10 Veränderung des pH-Wertes
Das Experiment wurde mit S. coelicolor A(3)2 Kulturen durchgeführt. Die unten dargestellte
(Abbildung 39) und von AdhB katalysierte Gleichgewichtsreaktion ist vom pH-Wert
abhängig. Bei höheren Werten liegt das Reaktionsgleichgewicht auf der Seite des
Acetaldehyds, während es sich bei niedereren pH-Werten in Richtung von Ethanol verschiebt.
So wurde durch Einstellung eines sauren pH-Wertes vor der Extraktion versucht das
Gleichgewicht auf die Seite von Ethanol zu verschieben. Die Kulturen wurden nach vier
Tagen vom Schüttler genommen, die Zellen abzentrifugiert und der pH-Wert des Überstandes
gemessen. Er lag im niederen alkalischen Bereich und betrug im Durchschnitt 7,6. Mit HCL
wurde der Wert auf 5,5 eingestellt. Danach wurde das Medium nochmals für 24 h bei 28 °C
91
Ergebnisse
inkubiert. Es waren keine Zellen mehr enthalten. Nach Extraktion (3.10.2) und Analytik der
Kulturen per GC/MS (3.10.4.3.2) konnte kein Unterschied, beziehungsweise keine
Verbesserung der Ethanolausbeute festgestellt werden.
pH=6
O
HC
OH
Adh
H3C
CH3
pH=8
CH3
Ethanol
Acetaldehyd
Abbildung 39: Alkoholdehydrogenasereaktion
4.2.11 Abhängigkeit der Ethanolproduktion von der Kultivierungszeit
Um die Ethanolproduktion in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit zu ermitteln, wurden
S. coelicolor Stämme, welche mit dem Expressionskonstrukt pUWL-H-ap konjugiert wurden,
sowie als Referenz Stämme, welche den leeren Vektor pUWL-H-tnp enthielten, über einen
Zeitraum von neun Tagen kultiviert. Es wurde NL111-Medium verwendet. Auf diese Weise
konnte ein Maximum nach einer Kulturzeit von sieben Tagen festgestellt werden, das mit
1069 mg/l um mehr als 50 % über dem nach fünf Tagen gemessenen Wert lag (687,9 mg/L)
(Tabelle 38; Abbildung 40). Wurde die Kultivierung weiter fortgesetzt, sanken die ermittelten
Ethanolkonzentrationen wieder.
Tabelle 38 Zeitabhängige Ethanol-Produktion von S. coelicolor+adh+pdc sowie der Referenzkultur
S. coelicolor x pUWL-H in NL111-Medium über neun Tage.
Produktionszeit
[Tage]
1
3
5
7
9
S. coelicolor x pUWL-H
Ethanol[mg/L]
<10
<10
<10
15,58
12
92
S. coelicolor+adh+pdc
Ethanol[mg/L]
10,9
186,6
687,9
1069,4
500
Ergebnisse
Ethanol-Produktionsverlauf
1200
Ethanol mg/l
1000
800
600
S. coelicolor+ pUWL-H
400
S. coelicolor+adh+pdc
200
0
1
3
5
7
9
Produktionstage
Abbildung 40: Darstellung des Produktionsverlaufes von S. coelicolor+adh+pdc und der Referenzkultur
S. coelicolor x pUWL-H in NL111-Medium über neun Tage.
4.2.12 Semianaerobe Kultivierung
Um
die
Produktionsbedingungen
unter
Sauerstoffmangel
zu
testen,
wurden
S. coelicolor+adh+pdc und S. fradiaeTÜ 2717+adh+pdc unter semianeaeroben Bedingungen
kultiviert. Dafür wurden die Kulturen wie in 4.2.7 beschrieben in NL111-Medium angeimpft
und nun sieben Tage lang inkubiert. Die Kolben wurden mit Parafilm verschlossen, um zu
verhindern, dass während der Produktion Luftsauerstoff an die Kulturen kommt. Damit wurde
ein Milieu geschaffen, das nicht komplett anaerob war, jedoch im Vergleich zur bislang
praktizierten Methode weniger Sauerstoff zur Verfügung stellte. Streptomyceten sind
Aerobier, die jedoch aufgrund ihrer enzymatischen Ausstattung auch zu einem vollständig
fermentativen Stoffwechsel in der Lage sein müssten. [63]. Dies konnte jedoch bislang noch
nicht beobachtet werden. Daher ist davon auszugehen, dass es ein Vorteil beziehungsweise
notwendig für das Wachstum von Streptomyceten ist, dass noch Restsauerstoff im
Kulturbehältnis vorhanden ist. Messungen der Trockenmasse (3.10.3) bei S. coelicolor
bestätigten ein geringeres Wachstum der Bakterien unter den modifizierten Bedingungen
(Tabelle 39).
Nach sieben Tagen wurden die Kulturen geerntet und die Ethanolmengen bestimmt. Es
konnte unter diesen Bedingungen sowohl bei S. fradiaeals auch bei S. coelicolor eine
deutliche Steigerung der Ethanolproduktion beobachtet werden.
93
Ergebnisse
Tabelle 39: Bestimmung der durchschnittlichen Trockenmasse der Zellen bei einem Kulturvolumen von
100 mL und einer Produktionszeit von sieben Tagen unter aeroben sowie unter semianaeroben
Bedingungen.
Kultur
Zellmasse [g/100mL Kultur]
aerob
semianaerob
S. coelicolor x pUWL-H
2,1
0,2
S. coelicolor+adh+pdc
2,3
0,8
Tabelle 40 Ethanolkonzentration [mg/L] in S. coelicolor+adh+pdc, S. fradiae+adh+pdc sowie den
jeweiligen Referenzkulturen S. coelicolor x pUWL-H und S. fradiae x pUWL-H unter aeroben und
semianaeroben Kulturbedingungen. Die Produktion erfolgte über sieben Tage in NL111-Medium.
Stamm
Ethanol[mg/L]
aerob
S. coelicolor x pUWL-H
S. fradiae x pUWL-H
S. coelicolor+adh+pdc
S.fradiae+adh+pdc
semianaerob
<10
<10
985
158
<10
<10
1508
422
Ethanolproduktion unter semianaeroben Bedingungen
1600
1400
Ethanol mg/L
1200
S. coelicolor x pUWL-H
1000
800
S. fradiae x pUWL-H
600
S. coelicolor+adh+pdc
400
S.fradiae+adh+pdc
200
0
aerob
semianaerob
Abbildung 41: Ethanolkonzentration [mg/L] unter aeroben sowie semianaeroben Kulturbedingungen in
den Produktionskulturen von S. coelicolor+adh+pdc (grüne Säule) und S. fradiae+adh+pdc (violette Säule).
Zum Vergleich jeweils die Referenzkulturen (Ethanolkonzentration jeweils <10 mg/L, blaue
beziehungsweise rote Säule). Die Produktion erfolgte über sieben Tage in NL111-Medium.
94
Ergebnisse
4.2.12.1 Untersuchung der Evaporation von Ethanol aus dem Medium
Ergänzend zu den oben beschriebenen Versuchen wurden Experimente durchgeführt, um die
Evaporation definierter Mengen an zugesetztem Ethanol aus dem Medium während aerober
und semianaerober Kultivierung zu untersuchen. Erlenmeyerkolben wurden mit jeweils genau
100 mL HA-Medium (aufgrund des erleichterten Extraktionsverfahrens aus HA- gegenüber
NL111-Medium) befüllt. Nun wurden die Medien mit Ethanol in den Konzentrationen 0,5 ‰,
1 ‰, 2 ‰, 3 ‰ und 1 % (V/V) versetzt. Für jede Konzentraion wurde je ein Kolben, wie bei
aerober Kultivierung, mit normelem Stopfen verschlossen und ein weiterer, wie bei
semianaerober Kultivierung, zusätzlich mit Parafilm umwickelt. Es wurde nun eine
Kultivierung über fünf Tage bei 28 °C auf dem Schüttelinkubator simuliert. Nach fünf Tagen
wurden die Ethanolmengen wie in 3.10.5.2.1 beschrieben bestimmt. Dabei konnte man bis zu
einer Ausgangskonzentration von 3 ‰ im Rahmen der Messgenauigkeit keine Unterschiede
zwischen aerober und semianaerober Kultivierung feststellen. Ebenfalls stellte man fest, dass
sich die Ethanolkonzentration gegenüber den Ausgangswerten nicht verringerte. Erst bei einer
Ausgangskonzentration von 1 % Etanol [V/V] stellte man in den aerob kultivierten Proben
eine Verringerung der Ethanolkonzentration von Ursprünglich 1 % (V/V) auf 0,94 % (V/V)
fest. In den semianaerob kultivierten Proben war auch bei dieser Konzentration kein Verlust
feststellbar (Tabelle 41).
Tabelle 41: Ermittelte Werte für die Evaporation von Ethanol bei einer Kultivierung über fünf Tage und
verschiedenen Ausgangskonzentrationen (0,5 ‰ bis 10 ‰). *Experimentell bedingt war der berechnete
Ethanolgehalt am Versuchsende in einigen Fällen größer 100 %.
Ausgangskonzentration
Ethanol
[‰]
[mg/L]
0,5
394,5
1
789
2
1578
3
2367
10
7890
EtOH [‰] Ende
EtOH [mg/L] Ende
Restanteil [%]
aerob
0,50
1,01
1,96
3,14
9,48
aerob
392
796
1550
2477
7479
aerob
99,4
100,9*
98,2
104,6*
94,8
semianaerob
0,49
0,98
2,03
3,10
10,01
semianaerob
388
770
1599
2445
7895
semianaerob
98,4
97,6
101,3*
103,3*
100,1*
4.2.13 Coexpression von pUWL-H-ap und pNL1-aldh
Um gemeinsam mit den Genen adhB und pdc ein weiteres für die Ethanol-Biosynthese
hilfreiches Gen zu exprimieren, wurde bei der Firma Mr. Gene die Synthese von aldh in
Auftrag gegeben. Aldh stammt aus dem Ethanolstoffwechsel von Morella sp. HUC22-1 [64]
(Abbildung 42) und katalysiert in diesem anaerob lebenden Bakterium die Umwandlung von
95
Ergebnisse
Acetyl-CoA zu Acetaldehyd. Dieses wiederum kann in Streptomyceten unter Katalyse von
AdhB, welches aus Zymomonas mobilis stammt, zu Ethanol reduziert werden. Das Gen aldh
wurde mit an Streptomyceten angepasstem „codon-usage“ synthetisiert Die Umklonierung
aus pUC57-aldh und Erstellung des Expressionskonstruktes pNL1-aldh wird in 3.8.1.3.
beschrieben.
Abbildung 42: Ethanolstoffwechsel in Morella sp. HUC22-1 mit den von Aldh und Adh katalysierten
Reaktionen.
4.2.13.1 Generierung von S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh
pNL1-aldh wurde per intergenerischer Konjugation in Streptomyces coelicolor+adh+pdc
eingebracht (3.6.1.3.). So wurde der Stamm S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh erhalten.
Als Referenz wurde S. coelicor +adh+pdc x pNL1 mit dem leeren Vektor pNL1 generiert.
4.2.13.2 Anzucht von
S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh
und
Analytik der
Ethanolproduktion
Die Anzucht der Exkonjuganden erfolgte wie in 4.2.12. beschrieben unter semianaeroben
Bedingungen. Als Medium wurde NL111 verwendet. Zum Vergleich wurden parallel zu
S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh
unter
denselben
Bedingungen
Kulturen
von
S. coelicolor+adh+pdc, ebenso wie S. coelicolor+adh+pdc x pNL1 kultiviert. Die Produktion
wurde über neun Tage aufrechterhalten und die Ethanolkonzentration in den Medien jeweils
96
Ergebnisse
nach eins, drei, fünf, sieben und neun Tagen bestimmt. Die ermittelten Werte sind in Tabelle
42 zusammengefasst sowie in Abbildung 43 und Abbildung 44 grafisch dargestellt.
Es
konnte
beobachtet
werden,
S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh
dass
die
(914,5 mg/L)
maximale
gegenüber
Ethanol-Produktion
in
S. coelicolor+adh+pdc
(1672,7 mg/L) geringer ist (Tabelle 42). Die Produktionskurve in Abbhängigkeit von der Zeit
(Abbildung 43) zeigt für S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh an den Tagen eins, drei und
fünf höhere Werte als für S. coelicolor+adh+pdc. Für S. coelicolor+adh+pdc x pNL1 wurden
zu diesen Zeitpunkten ebenfalls höhere Werte als für S. coelicolor+adh+pdc gemessen. Somit
kann ausgeschlossen werden, dass die Ethanolproduktion in den ersten fünf Tagen aufgrund
der Coexpression von aldh erhöht wurde.
Tabelle 42: Verlauf der Ethanolproduktion [mg/L] in NL111-Medium über einen Zeitraum von neun
Tagen bei Coexpression von adhB, pdc und aldh in S. coelicolor.
Ethanol [mg/L]
Kulturzeit [Tage] S.coelicolor x pUWL-H S. coelicolor
S. coelicolor
+adh+pdc
+adh+pdc
+pNL1
1
16,0
51,3
307,7
3
13,9
103,3
604,9
5
26,4
361,4
673,8
7
32,4
1672,7
1283,3
9
19,9
1073,0
1341,3
97
S. coelicolor
+adh+pdc+
pNL1-aldh
183,9
804,2
770,7
400,8
914,5
Ergebnisse
Coexpression von adhB, pdc und aldh
1800
1600
S. coelicolorxpUWL-H
Ethanol [mg/L]
1400
1200
S. coelicolor+adh+pdc
1000
800
600
S. coelicolor+adh+pdc+pNL1
400
200
S. coelicolor+adh+pdc+pNL1aldh
0
1
3
5
7
9
Kulturzeit [Tage]
Abbildung 43: Verlauf der Ethanolproduktion über einen Zeitraum von neun Tagen in NL111-Medium
bei Coexpression von adhB, pdc und aldh in S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh. Zum Vergleich wurden
S. coelicolor x pUWL-H, S. coelicolor+adh+pdc und S. coelicolor+adh+pdc+pNL1 untersucht.
Ethanol [mg/L]
Coexpression von adhB, pdc und aldh
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
S. coelicolorxpUWL-H
S. coelicolor+adh+pdc
S. coelicolor+adh+pdc+pNL1
1
3
5
7
9
S. coelicolor+adh+pdc+pNL1aldh
Kulturzeit [Tage]
Abbildung 44: Ethanolproduktion über einen Zeitraum von neun Tagen in NL111-Medium bei
Coexpression von adhB, pdc und aldh in S. coelicolor+adh+pdc x pNL-aldh. Zum Vergleich wurde
S. coelicolor x pUWL-H, S. coelicolor+adh+pdc und S. coelicolor+adh+pdc+pNL1 angezogen.
98
Ergebnisse
4.2.14 Anreicherung von NL111-Medium mit Glukose
Weitere Experimente wurden wie unter den in 4.2.12 beschrieben Bedingungen mit
S. coelicolor+adh+pdc durchgeführt. Pro 100 mL NL111-Medium wurden 5 mL einer
sterilen Glukoselösung (50 % m/V) zugegeben. Das entspricht 25 g Glukose pro Liter
Medium. Dadurch konnte die Ethanolproduktion sowohl unter aeroben, als auch unter
semianaeroben Bedingungen deutlich gesteigert werden. Die durchschnittlich erhaltene
Ethanolkonzentration lag im Falle der semianaeroben Kultivierung des Stammes
S. coelicolor+adh+pdc bei 2657 mg/L im Vergleich zu 1611 mg/L in NL111-Medium ohne
Glukosezusatz. Die gemessenen Werte sind in Tabelle 43 zusammengefasst und in Abbildung
45 grafisch dargestellt.
Tabelle 43 Ergebnis der Produktion in NL111-Medium mit Zusatz von 2,5 % [m/V] Glukose
Stamm
S. coelicolor x pUWL-H
S. coelicolor x pUWL-H
(semianaerob)
S. coelicolor+adh+pdc
S. coelicolor+adh+pdc
(semianaerob)
NL111Medium
<10
<10
Ethanol [mg/L]
NL111-Medium + 2,5 % [m/V]
Glukose
18
15
618
1611
1245
2657
99
Ergebnisse
Ethanolproduktion in NL111-Medium + 2,5 % Glukose
3000
2500
Ethanol mg/L
S. coelicolor xpUWL-H aerob
2000
S. coelicolor+adh+pdc aerob
1500
1000
S. coelicolor x pUWL-H semianaerob
500
S. coelicolor+adh+pdc semianaerob
0
Nl111
NL111+Glukose
Abbildung 45: Grafische Darstellung der Ethanolproduktion von S. coelicolor+adh+pdc in
NL111-Medium und Zusatz von 2,5 % [m/V] Glukose unter aeroben sowie semianaeroben Bedingungen.
Zum Vergleich jeweils die Werte der Referenzkulturen S. coelicolor x pUWL-H.
4.2.15 Zusatz von Pyruvat zum Produktionsmedium
Die Bedeutung von Pyruvat im Stoffwechsel der Streptomyceten wird in 5.3.7 diskutiert.
Durch Erhöhung des Angebotes an Pyruvat im Produktionsmedium sollte versucht werden,
die Ethanolproduktion zu steigern.
S. coelicolor+adh+pdc und als Referenz S. coelicolor x pUWL-H wurden wie in 4.2.12
beschrieben jeweils unter aeroben und semianaeroben Bedingungen inkubiert. Als Medium
wurde NL111, dem 2,5 % Glukose zugesetzt wurden, verwendet (4.2.14). Außerdem wurden
0,5 g Natrium-Pyruvat pro 100 mL Produktionsmedium zugesetzt, das entspricht circa
4,5 mmol/L Medium. Zum Vergleich wurden Kulturen ohne Pyruvatzusatz inkubiert. Nach
mehreren Experimenten wurde sowohl unter aeroben als auch unter semianaeroben
Bedingungen nach Pyruvatzusatz eine geringere Ethanolkonzentration gemessen (2626 mg/L
semianaerob; 867 mg/L aerob) als bei den Kulturen ohne Pyruvatzugabe (3161 mg/L
semianaerob,
respektive
1334 mg/L
aerob).
Somit
konnte
eine
Steigerung
der
Ethanolproduktion durch Zugabe von Pyruvat nicht erreicht werden. Die gemessenen Werte
sind in Tabelle 44 zusammengefasst und in Abbildung 46 grafisch dargestellt.
100
Ergebnisse
Tabelle 44: Ethanolproduktion [mg/L] in S. coelicolor+adh+pdc
Produktionsmediums (NL111 + 2,5 % Glukose) mit Pyruvat.
Stamm
S. coelicolor x pUWL-H aerob
S. coelicolor x pUWL-H semianaerob + Pyruvat
S. coelicolor+adh+pdc aerob
S. coelicolor+adh+pdc aerob + Pyruvat
S. coelicolor+adh+pdc semianaerob
S. coelicolor+adh+pdc semianaerob + Pyruvat
bei
Anreicherung
des
Ethanol mg/L
21
15
1334
867
3161
2626
Auswirkung von Pyruvat auf die Ethanolproduktion
3500
Ethanol [mg/l]
3000
2500
S. coelicolor x pUWL-H
2000
S. coelicolor x pUWL-H + Pyruvat
S. coelicolor+adh+pdc
1500
S. coelicolor+adh+pdc + Pyruvat
1000
500
0
aerob
semianaerob
Kultivierungsbedingungen
Abbildung 46: Grafische Darstellung der durchschnittlichen Ethanolproduktion [mg/L] bei Anreicherung
des Produktionsmediums (NL111 + 2,5 % Glukose) mit Pyruvat. Die Kulturen wurden jeweils mit und
ohne Pyruvat sowie unter aeroben (linke Gruppe) und semianaeroben Bedingungen (rechte Gruppe)
inkubiert. S. coelicolor x pUWL-H (blau ohne Pyruvat, rot mit Pyruvat), S. coelicolor+adh+pdc (grün ohne
Pyruvat, violett mit Pyruvat)
101
Ergebnisse
4.2.16 Formiat-Dehydrogenase zur Regeneration von NADH
4.2.16.1 Funktion von Fdh im Stoffwechsel
Bei der Firma Mr. Gene wurde ein Plasmid geordert, auf dem sich das Gen fdh befindet,
welches für eine Formiatdehydrogenase (FDH) codiert. Durch dieses Enzym, einer NAD+abhängigen Formiatdehydrogenase, die aus dem Bakterium Candida boindii stammt [65],
wird die Oxidation von Formiat zu Kohlendioxid unter gleichzeitiger Reduktion von NAD+
zu NADH katalysiert, so dass in vivo NADH, das Coenzym für AdhB, regeneriert wird.
4.2.16.2 Klonierung von pUWL-H-apf
Zur Coexpression der Gene adhB, pdc und fdh wurde das Plasmid pUWL-H-apf wie in
3.8.1.2 beschrieben erstellt. Die drei Gene stehen alle unter der Kontrolle des ermE
Promotors. Um den korrekten Einbau von fdh zu kontrollieren, wurde pUWL-H-apf mit NcoI
verdaut. Dabei wurden charakteristische DNA-Fragmente der Größe 5996, 3310, 1128 und
995 bp erwartet. Zum Vergleich wurde parallel pUWL-H-ap ebenfalls mit NcoI verdaut, um
auszuschließen, dass es sich bei den Plasmiden um Religanden handelte. Wäre dies der Fall,
würden Fragmente der Größe 5996, 2167, 1128 und 995 bp entstehen. Durch eine Agarose
Gelelektrophorese der verdauten Plasmide konnte gezeigt werden, dass es sich um das
korrekte Expressionskonstrukt handelte (Abbildung 47).
5996 bp
3310 bp
2167 bp
1128 + 995 bp
1
2
Abbildung 47: Ergebnis des analytischen Verdaus von pUWL-H-apf (Bahn 2) und pUWL-H-ap (Bahn 1)
mit dem Restriktionsenzym NcoI
102
Ergebnisse
4.2.16.3 Konjugation und Anzucht von S. coelicolor+adh+pdc+fdh
pUWL-H-apf wurde wie in 3.6.1.3. beschrieben per Konjugation in S. coelicolor A(3)2
eingebracht. Es wurde S. coelicolor+adh+pdc+fdh erhalten. Die Kulturen wurden für eine
Dauer von 10 Tagen in 100 mL NL111-Medium (+ 2,5 % Glukose) inkubiert. Da die
erwünschte Regeneration von NADH durch Oxidation von Formiat erfolgen sollte wurde den
Kulturen Formiat in unterschiedlichen Mengen zugesetzt. Zunächst wurde dem Medium kein
Formiat zugesetzt, es müsste somit intermediär im Bakterienstoffwechsel produziertes
Formiat oxidiert werden. In einer anderen Charge wurden 490 µL Ameisensäure (entspricht
4,9 g/L oder ~100 mmol/L) zugesetzt. Man orientierte sich hier an Literaturangaben für
E. coli, worin Mengen zwischen 50 und 200 mmol/L angegeben werden, [66]. Eine dritte
Charge wurde mit lediglich 100 µL Formiat versetzt, das entspricht etwa 20 mmol/L.
Um einen Vergleich zwischen aeroben und semianaeroben Bedingungen (4.2.12) zu
simulieren, wurden jeweils gleich viele Kulturen aerob beziehungsweise semianaerob
kultiviert. Bei semianaeroben Kulturen wurden die Kolben mit Parafilm verschlossen
(4.2.12). Zumm Vergleich wurde S. coelicolor+adh+pdc und S. coelicolor x pUWL-H unter
gleichen Bedingungen kultiviert (Tabelle 45).
Tabelle 45: Anzuchtschema für das Experiment zur Coexpression von fdh zusammen mit adhB und pdc.
Die Kultivierung erfolgte jeweils in NL111-Medium. Diesem wurden pro 100 mL bei Experiment 1 2,5 %
Glukose und 490 µL (~100 mmol/L) Ameisensäure zugegeben. Bei Experiment 2, wurden 2,5 % Glukose
und 100 µL Ameisensäure (~20 mmol/L) zugesetzt. Bei Experiment 3, wurden lediglich 2,5 % Glukose
zugegeben.
Stamm
S. coelicolor x pUWL-H
S. coelicolor+adh+pdc
S. coelicolor+adh+pdc+fdh
aerob
x
x
x
semianaerob
x
x
x
4.2.16.4 Analytik der Produktionskulturen
Die Extraktion erfolgte nach der beschriebenen Methode mit Ethylacetat (3.10.2.)
Anschließend wurde die Ethanolkonzentration wie unter 3.10.4.3.2 beschrieben per GC/MS
bestimmt.
4.2.16.4.1 Anzucht unter Zugabe Formiat
Nach 6 Tagen Inkubation wurde der Versuch bei welchem 100 mmol/L Formiat zugesetzt
wurden abgebrochen da kein Wachstum festgestellt werden konnte. Alle Kulturen waren
103
Ergebnisse
abgestorben. Mehrfache Wiederholung des Experiments unter diesen Bedingungen lieferte
dasselbe Ergebnis.
Bei der geringeren Formiatkonzentration (20 mmol/L) konnte Wachstum festgestellt werden.
Jedoch war sehr viel weniger Myzel vorhanden als bei den ohne Formiat durchgeführten
Experimenten. Es ist davon auszugehen, dass durch die Zugabe von Formiat das Wachstum
der Bakterien gehemmt wird.
Die Ethanolproduktion war bei S. coelicolor+adh+pdc unter semianaeroben Bedingungen am
höchsten. Das zusätzlich exprimierte Gen fdh führte zu keiner Steigerung der Produktion,
sondern zu einer Verminderung der gemessenen Ethanolmenge. Unter aeroben Bedingungen
war für S. coelicolor+adh+pdc+fdh eine geringfügig höhere Menge Ethanol gemessen
worden. Dies könnte durchaus für die Funktion der Formiat-Dehydrogenase sprechen.
Somit war die Erkenntnis aus diesem Experiment, dass bei Expression von fdh unter aeroben
Bedingungen und Zugabe einer geringen Menge (~ 20 mmol/L) Formiat mehr Ethanol
produziert werden kann als unter semianaeroben Bedingungen (Tabelle 46; Abbildung 48).
Tabelle 46: Gemessene Ethanolkonzentration [mg/L] in den Produktionsmedien bei Coexpression von
adhB, pdc und fdh in S. coelicolor sowie den Referenzkulturen S. coelicolor+adh+pdc und
S. coelicolor x pUWL-H. Es wurde NL111-Medium (+ 2,5 % Glukose) verwendet und unter aeroben sowie
semianaeroben Bedingungen inkubiert. Bei den mit (F) gekennzeichneten Kulturen wurden 20 mmol
Formiat pro Liter Medium zugesetzt.
Stamm
S. coelicolor x pUWL-H
S. coelicolor+adh+pdc+fdh
S. coelicolor+adh+pdc+fdh (F)
S. coelicolor+adh+pdc
S. coelicolor+adh+pdc (F)
Aerobe Kultivierung
26
1168
1340
1324
1126
104
Ethanol [mg/L]
Semianaerobe Kultivierung
27
1595
1008
2623
2333
Ergebnisse
Coexpression von adhB, pdc und fdh
3000
Ethanol [mg/L]
2500
2000
S. coelicolor x pUWL-H
1500
S. coelicolor+adh+pdc+fdh
1000
S. coelicolor+adh+pdc+fdh(F)
S. coelicolor+adh+pdc
500
S. coelicolor+adh+pdc(F)
0
Aerob
Semianaerob
Kulturbedingungen
Abbildung 48: Grafische Darstellung der gemessenen Ethanolmengen bei Coexpression von adhB, pdc
und fdh unter aeroben sowie semianaeroben Bedingungen. Die Ethanolkonzentration [mg/L] für
S. coelicolor x pUWL-H, S. coelicolor+adh+pdc, S. coelicolor+adh+pdc+fdh sind dargestellt. Zum Vergleich
die Ethanolkonzentration bei Zugabe von 20 mmol/L Formiat zu Kulturen von S. coelicolor+adh+pdc (F)
und S. coelicolor+adh+pdc+fdh (F)
4.2.17 Ethanolproduktion in S. coelicolor M1154
4.2.17.1 S. coelicolor M1154
S. coelicolor M1154 basiert auf S. coelicolor M145. Durch Deletion verschiedener endogener
Biosynthesegencluster für die Produktion von Prodiginin, CPK („cryptic type I polyketide
synthase“) und CDA („calcium dependent antibiotic“) konnte in diesem Stamm die
Produktion von Sekundärstoffen erhöht werden [41]. Ob ebenfalls eine erhöhte
Produktionsrate von Ethanol erzielt werden kann, wurde durch Expression von adhB und pdc
in diesem Stamm untersucht.
4.2.17.2 Konjugation von S. coelicolor M1154
Wie in 3.6.1.3. beschrieben, wurde pUWL-H-ap per intergenerischer Konjugation in
S. coelicolor M1154 eingebracht. Es entstand S. coelicolor M1154+adh+pdc.
4.2.17.3 Kultivierung und Analytik der Ethanolproduktion
Unter Berücksichtigung der bisherigen Resultate wurde neun Tage lang in NL111-Medium,
welchem 2,5 % Glukose zugesetzt wurde, inkubiert. Die Kultivierung wurde wie in 4.2.12
beschriebenen unter aeroben sowie semianaeroben Bedingungen durchgeführt.
105
Ergebnisse
Referenzkulturen von S.coelicolor M1154 der den Vektor pUWL-H enthielt, wurden erstellt
und zum Vergleich angezogen. Die Bestimmung der Ethanolkonzentration in den
Produktionsmedien erfolgte per GC/MS (3.10.5.2) jeweils nach drei, fünf, sieben und neun
Tagen.
Die höchsten gemessenen Werte für die Ethanolkonzentration waren mit 1062 mg/L, unter
aeroben Bedingungen, beziehungsweise 1495 mg/L bei semianaerober Kultivierung (Tabelle
47), geringer als bei S. coelicolor A(3)2. Allerdings konnte nach neun Tagen (1495 mg/L)
semianaerober Kultivierung im Vergleich zu Tag sieben (1110 mg/L) noch eine deutliche
Steigerung beobachtet werden (Abbildung 49). Dies war bei S. coelicolor A(3)2 nicht zu
beobachten.
Das Experiment wurde wiederholt und nun über einen längeren Zeitraum durchgeführt.
Die Kultivierung über 12 Tage führte zu keinen neuen Erkenntnissen. Wiederum zeigte sich
eine Steigerung der Menge an Ethanol über Tag sieben (1180 mg/L) hinaus. Das Maximum
wurde nach neun Tagen (1639 mg/L) und semianaerober Kultivierung erreicht (Abbildung
50).
Tabelle 47: Ethanolkonzentration nach Expression von pUWL-H-ap in S. coelicolor M1154 über einen
Zeitraum von neun Tagen in NL111-Medium (+2,5 % Glukose) jeweils unter aeroben sowie
semianaeroben Bedingungen. Zum Vergleich wurde S. coelicolor M1154 x pUWL-H untersucht.
Stamm
S. coelicolor M1154 x pUWL-H (aerob)
S. coelicolor M1154+adh+pdc (aerob)
S. coelicolor M1154 x pUWL-H (semianaerob)
S. coelicolor M1154+adh+pdc (semianaerob)
106
Tag 1
3,35
22
8
55
Ethanol [mg/L]
Tag 3 Tag 5 Tag 7
6,9
8,1
7,2
255
302
590
12,5
5,8
7,9
450
1010
1110
Tag 9
15,1
1062
19,9
1495
Ergebnisse
Ethanolproduktion in S.coelicolor M1154+adh+pdc
1600
S. coelicolor M1154 x pUWL-H aerob
Ethanol [mg/l]
1400
1200
S. coelicolor M1154+adh+pdc aerob
1000
800
S. coelicolor M1154 x pUWL-H
semianaerob
600
400
S. coelicolor M1154+adh+pdc
semianaerob
200
0
1
3
5
7
9
Kultivierungszeit [Tage]
Abbildung 49: Grafische Darstellung der Ethanolkonzentration bei Expression von adhB und pdc in
S. coelicolor M1154 über einen Zeitraum von neun Tagen in NL111-Medium (+2,5 % Glukose) jeweils
unter aeroben sowie semianaeroben Bedingungen. Als Referenz diente S. coelicolor M1154 x pUWL-H
Ethanolproduktion in S. coelicolor M1154+adh+pdc
1800
1600
S. coelicolor M1154xpUWL-H aerob
Ethanol [mg/l]
1400
1200
S. coelicolor M1154+adh+pdc aerob
1000
800
S. coelicolor M1154xpUWL-H
semianaerob
600
400
S. coelicolor M1154+adh+pdc
semianaerob
200
0
1
3
5
7
9
12
Kultivierunszeit [Tage]
Abbildung 50: Grafische Darstellung der Ethanolkonzentration bei Expression von adhb und pdc in
S. coelicolor M1154 über einen Zeitraum von 12 Tagen in NL111-Medium (+2,5 % Glukose) jeweils unter
aeroben sowie semianaeroben Bedingungen. S. coelicolor M1154 x pUWL-H diente als Referenz
107
Ergebnisse
4.2.17.4 Auswirkung von Pyruvat auf die Ethanolproduktion in S. coelicolor
M1154
Es wurden ebenfalls Experimente durchgeführt, bei denen das Medium mit Pyruvat
angereichert wurde. Wiederum wurde NL111-Medium (+ 2,5 % Glukose) verwendet. Den
Kulturen von S. coelicolor M1154+adh+pdc wurden 4,5 mmol Pyruvat zugesetzt (4.2.15).
Zum
Vergleich
wurden
Kulturen
von
S. coelicolor M1154+adh+pdc
sowie
S. coelicolor M1154 x pUWL-H ohne Pyruvatzusatz untersucht. Die Kultivierung erfolgte
jeweils sowohl aerob als auch semianaerob (4.2.12) über sieben. Tage. Danach wurde die
Ethanolkonzentration in den Medien per GC/MS bestimmt (3.10.5.2). Ohne Pyruvatzugabe
wurden 1645 mg/L (semianaerob) respektive 448 mg/L (aerob) gemessen, im Vergleich zu
1154 mg/L (semianaerob) respektive 372 mg/L (aerob) bei Zusatz von Pyruvat Die
Ergebnisse sind in Tabelle 48 zusammengefasst und in Abbildung 51 grafisch dargestellt.
Während sich die Zugabe von Pyruvat unter semianaeroben Bedingungen ähnlich stark
auswirkt wie bei S. coelicolor A(3)2 (siehe 4.2.15) war der negative Effekt unter aeroben
Verhältnissen im Vergleich gering.
Tabelle 48: Auswirkung von Pyruvat auf die Ethanolproduktion in S. coelicolor M1154+adh+pdc.. Die
Anzucht erfolgte unter aeroben sowie semianaeroben Bedingungen in NL111 Produktionsmedium (+
2,5 % Glukose). Als Referenz wurden S. coelicolor M1154+adh+pdc sowie S. coelicolor M1154 x pUWL-H
ohne Zusatz von Pyruvat kultiviert.
Stamm
S. coelicolor M1154 x pUWL-H
S. coelicolor M1154+ adh+pdc
S. coelicolor M1154+ adh+pdc (+ Pyruvat)
aerob
22
448
372
108
Ethanol [mg/L]
semianaerob
23
1645
1154
Ergebnisse
Einfluß von Pyruvat auf die Ethanolproduktion in
S. coelicolor M1154
1800
1600
Ethanol [mg/L]
1400
1200
S. coelicolor M1154 x pUWL-H
1000
S. coelicolor M1154+adh+pdc
800
600
S. coelicolor M1154+adh+pdc(Pyruvat)
400
200
0
Aerob
Semianaerob
Kulturbedingungen
Abbildung 51: S. coelicolor M1154 x pUWL-H (blaue Säulen) und S. coelicolorM1154+adh+pdc wurden
unter aeroben sowie semianaeroben Bedingungen kultiviert. S. coelicolor M1154+adh+pdc wurde jeweils
mit (graue Säulen) und ohne (rote Säulen) Zusatz von Pyruvat (4,5 mmol/L) zum Produktionsmedium
(NL111 + 2,5 % Glukose) kultiviert.
4.2.17.5 Beurteilung der Experimente mit S. coelicolor M1154
Die maximal gemessene Menge an Ethanol war bei diesem Stamm geringer als in
S. coelicolor A(3)2. Allerdings konnte in den Produktionskulturen eine innerhalb der
untersuchten Streptomyces Stämme vergleichsweise große Menge Ethanol bestimmt werden.
Die primär erhoffte Steigerung der maximalen Ethanolproduktion durch S. coelicolor M1154
konnte jedoch nicht beobachtet werden.
4.3 Butanolproduktion in S. coelicolor A(3)2
4.3.1 Eigenschaften von Butanol
Butanol gehört wie Ethanol zu den einwertigen Alkoholen und ist ein wichtiger Vertreter der
Biokraftstoffe. Es besitzt gegenüber Ethanol eine höhere Energiedichte [67] und ist außerdem
mit allen organischen Lösungsmitteln, also auch mit konventionellen Kraftstoffen in
beliebiger Konzentration mischbar. Ethanol hingegen kann nur bis maximal 85 % mit diesen
gemischt werden [68]. Des Weiteren besitzt Butanol einen geringeren Gasdruck, verglichen
mit Ethanol und ist nicht hygroskopisch [68]. Dadurch wird der Einsatz als Kraftstoff
109
Ergebnisse
bedeutend sicherer und es ist möglich die Beimischung zu anderen Kraftstoffen schon
frühzeitig in der Raffinerie zu erledigen, während man mit der Beimischung von Ethanol
möglichst lange warten muss und es erst kurz vor dem Verbrauch zusetzten darf [68].
Herkömmliche Benzinmotoren müssen ebenfalls nicht speziell für den Gebrauch von Butanol
modifiziert werden [69]. Da es mit Wasser nicht mischbar ist, wird die Gefahr einer
Verschmutzung des Grundwassers verglichen mit Bioethanol zudem gemindert[68].
4.3.2 Expression von adhe in Streptomyceten
Um die Produktion von Butanol in Streptomyceten zu ermöglichen, wurde adhe aus
Clostridium acetobutylicum in verschiedenen Streptomyceten heterolog exprimiert.
Im Butanol-Biosyntheseweg (Abbildung 52) von Clostridium acetobutylicum kann man dem
Gen adhe (oder adhe1) die Codierung für ein bifunktionelles Enzym zuordnen [67]. Dieses
besitzt die Funktion einer Butyraldehyd-Dehydrogenase und einer Butanol-Dehydrogenase
[67] und katalysiert die Umwandlung von intermediär gebildetem Butyryl-CoA über
Butyraldehyd zu Butanol (Abbildung 52).
Bei der Firma Mr. Gene wurde das Gen adhe mit an Streptomyceten angepasstem „codonusage“ synthetisiert und in pUC57 kloniert (pUC57-adhe) (Abbildung 11). Um adhe in
Streptomyceten zu exprimieren, wurde es in die Expressionsvektoren pUWL-H und pUWL-A
umkloniert (3.8.2.1).
110
Ergebnisse
Abbildung 52: Vereinfacht dargestellter Butanol-Biosyntheseweg von Clostridium acetobutylicum. Als
bifunktionelles Enzym katalysiert das von adhe (oder adhe1) codierte Protein die Umwandlung von
Butyryl-CoA (Funktion einer Butyraldehyd-Dehydrogenase) zu Butyraldehyd sowie die nachfolgende
Reduktion zu Butanol (Funktion einer Butanol-Dehydrogenase)[67].
4.3.3 Konjugation verschiedener Streptomyceten-Stämme
pUWL-A-adhe und pUWL-H-adhe wurden per intergenerischer Konjugation wie in 3.6.1.3.
beschrieben in S. coelicolor A3(2) (im weiteren S. coelicolor), S. cyanogenus S136,
S. fradiae Tü2717, S. collinus Tü1892 und S. sp. Tü6071 WT eingebracht. Mit pUWL-A-adhe
konnten keine Exkonjuganden erhalten werden. Mit pUWL-H-adhe war die Konjugation der
Stämme S. sp. Tü6071 WT und S. coelicolor erfolgreich. Es wurden S. coelicolor+adhe und
S. sp. Tü6071WT+adhe generiert.
4.3.4 Kultivierung von S. coelicolor+adhe und S. sp. TÜ6071 WT+adhe
Die mit pUWL-H-adhe konjugierten Stämme wurden nun wie unter 3.4.2. beschrieben fünf
Tage lang in NL111-Medium (+ 50 µg/µL Hygromycin) inkubiert. In gleicher Weise wurde
jeweils ein Referenzstamm, S. coelicolor x pUWL-H und S. sp. Tü6071WT x pUWLkultiviert. Nach sieben Tagen wurden die Kulturen vom Schüttelinkubator genommen und per
GC/MS beziehungsweise Headspace-GC vermessen. Nach einigen Versuchen stellte sich
111
Ergebnisse
heraus, dass die konjugierten Stämme nicht zur Produktion von Butanol fähig waren. In den
Kulturen konnte mittels Headspace-GC kein Butanol und per MS gekoppelter GC (GC/MS)
lediglich Spuren von Butanol nachgewiesen werden. Daher wurden die Arbeiten an diesem
Projekt eingestellt.
4.4 Expression einer Saccharose-Synthase in Streptomyceten
4.4.1 Susy
Die Saccharose-Synthase („Susy“; „sucrose synthase“) ist ein Enzym, welches im
pflanzlichen
Organismus
die
Spaltung
von
Saccharose
unter
Einbau
eines
Nukleosiddiphosphates zu NDP-Glukose und Fruktose sowie die entsprechende Rückreaktion
katalysiert (
Abbildung 53) [70]. Sus 1 (Saccharose-Synthase 1) ist das entsprechende Enzym aus der
Kartoffelpflanze (Solanum tuberosum), mit welchem die Experimente dieser Arbeit
durchgeführt wurden.
Ch2OH
CH2OH
O H
H
O H
H
+ H2O
H
OH
OH H
O
OH
CH2OH
H
OH
OH H
H+
UDP
CH2OH
Ch2OH
O H
H
O H
H
+
H
OH
OH H
OH
CH2OH
O-UDP OH
H
OH
OH H
UDP-D-Glucose
D-Saccharose
D-Fruktose
Abbildung 53: Reaktion der Saccharoseutilisation. Durch das Enzym Saccharose-Synthase (Susy) wird die
Spaltung von Saccharose zu UDP-Glukose und Fruktose wie auch die Rückreaktion der
Saccharosesynthese katalysiert.
112
Ergebnisse
4.4.2 Ursprung und Hintergrund des Projekts
Um es Streptomyceten zu ermöglichen, Saccharose als Kohlenstoffquelle zu nutzen, sollte im
Rahmen dieser Arbeit ein künstliches Enzym generiert und in Streptomyceten exprimiert
werden. Es sollte diesen Organismen damit die Aufspaltung von Saccharose in aktivierte
Glukose und Fruktose ermöglichen.
Die Idee zu diesem Projekt entstand während der Forschungsarbeit von A. Frerich an S.
viridochromogenes Tü57, dem Produzenten von Avilamycin [48]. Eine Mutante dieses
Stammes, bei welcher das Gen aviD ausgeschaltet wurde, war nicht mehr zur Produktion von
Avilamycin fähig. Als Funktion für aviD wurde die Generierung von UDP-Glukose postuliert.
Um den Beweis dafür zu liefern sollte in einer aviD Mutante von S. viridochromogenes Tü57
die Saccharose-Synthase 1 aus Solanum tuberosum (Sus1) heterolog exprimiert werden.
Durch Spaltung von Saccharose sollte dann UDP-Glukose generiert werden was als
aktivierter Zucker für die Produktion von Avilamycin gebraucht wird. Somit sollte es zur
Regeneration der Avilamycinproduktion kommen.
Erste
Versuche
der
Expression
einer
künstlichen
Saccharose-Synthase
in
S.
viridochromogenes Tü 57 wurden von A. Frerich durchgeführt [48]. Dabei wurde das Plasmid
pUCPK1 (Abbildung 15) verwendet, auf dem die Nukleotidsequenz von sus1 der CodonPräferenz von Streptomyceten angepasst wurde. Das Gen mit an Streptomyceten angepasstem
„codon-usage“ wurde susyGC benannt
Die Avilamycinproduktion konnte dadurch nicht regeneriert werden. Es wurde vermutet, dass
die Expression von sus1 nicht erfolgte. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun SusyGC mit
einem Signalpeptid verbunden werden, wodurch die Expression und Sezernierung des
Proteins realisiert werden sollte.
4.4.3 Fusion von Sus1 und Vsi
Durch Fusion mit VsiSSQ, dem Signalpeptid von Vsi wurde versucht die Expression und
Sezernierung von SusyGC zu verbessern. Entsprechend konnten Sianidis und Mitarbeiter für
die heterologe Expression eines Xyloglucanase-Gens aus Josenia sp. Stämmen zeigen, dass
die Produktion und Sezernierung des entsprechenden Proteins in Streptomyces lividans TK24
stark erhöht wurde, wenn dieses mit dem Signalpeptid von Vsi verbunden wurde [71].
Vsi steht für das „Subtilisin Inhibitor Protein“ welches aus Streptomyces venezuelae isoliert
wurde. VsiSSQ, die Signalsequenz von Vsi, ist ein Polypeptid, welches aus 23 Aminosäuren
besteht. Die Nukleotidsequenz von vsiSSQ wurde wiederum dem Codon-Gebrauch von
113
Ergebnisse
Streptomyceten angepasst. Bei der Firma Mr.Gene wurde schließlich die Synthese des
Plasmids pMK-vsifinal (Abbildung 14) in Auftrag gegeben. Eine Beschreibung davon ist in
3.8.3.1. zu finden.
4.4.3.1 Klonierung von pUC-vsifinal
Die Klonierung von pUC-vsifinal ist in 3.8.3.3 beschrieben. Auf dem Plasmid ist das
komplette Fusionskonstrukt aus susyGC und vsiSSQ lokalisiert („vsifinal“). Es wurde für die
nachfolgende Klonierung von pUWL-H-vsifinal genutzt.
4.4.3.2 Klonierung von pUWL-H-vsifinal
Die Umklonierung von „vsifinal“ aus pUC-vsifinal in den Expressionsvektor pUWL-H-tnp
führte schließlich zum Expressionsplasmid pUWL-H-vsifinal. Die Vorgehensweise ist in
3.8.3.4. beschrieben.
4.4.4 Konjugation verschiedener Streptomyceten mit pUWL-H-vsifinal
Um zu zeigen, dass Susy exprimiert und auch sezerniert wird, wurden S. lividans,
S. fradiaeTü2717, S. coelicolor M1154 und S. coelicolor A(3)2 mit pUWL-H-vsifinal wie
unter 3.6.1.3 beschrieben konjugiert.
4.4.5 Nachweis von Susy durch Kultivierung in Minimalmedium
Die mit pUWL-H-vsifinal konjugierten Stämme wurden fünf Tage lang wie unter 3.4.2.
beschrieben kultiviert. Dafür wurde Minimalmedium (MM) verwendet, welches als einzige
nutzbare Kohlenstoffquelle Saccharose enthielt. Somit konnte theoretisch schon das
Bakterienwachstum als Indiz für die Funktion von Susy angesehen werden. Schließlich
sollten die Streptomyces Kulturen nur dann zum Wachstum in der Lage sein, wenn das
Disaccharid Saccharose in die verwertbaren Kohlenhydrate Fruktose und Glukose gespalten
wird, wofür wiederum Susy aktiv sein muss. Referenzkulturen wurden ohne Saccharosezusatz
im Medium kultiviert, das heißt. gänzlich ohne Kohlenstoffquelle. Hier durfte kein
Bakterienwachstum möglich sein. Qualitative Aussagen bezüglich des Wachstums waren
nicht möglich, da es sowohl in MM mit Zusatz von Saccharose, sowie auch in MM gänzlich
ohne Kohlenstoffquelle zum Wachstum der Kulturen kam.
4.4.6 Nachweis von Sysy durch SDS-PAGE
Das Protein sollte per SDS-Page sowohl im Produktionsmedium als auch im Inneren der
Zellen nachgewiesen werden. Dafür wurden die Zellen im Anschluss an die Kultivierung
114
Ergebnisse
unter 3.7.1.1. beschrieben geerntet und aufgeschlossen. Nach Aufkonzentrierung der Proteine
über einen Zentrifugalkonzentrator wurde eine SDS-PAGE durchgeführt (3.7.2)
Eine Auswertung des Experiments war nicht möglich, da auf dem erhaltenen Gel zu viele
Proteinbanden zu sehen waren und somit Susy mit der Größe 92,4 kDa nicht differenziert
werden konnte.
4.4.7 Verbindung von vsifinal mit einem His-Tag
Um Susy von anderen Proteinen abzutrennen und separat über SDS-PAGE nachzuweisen,
sollte es mit einem His-Tag versehen werden. Dazu wurde das Plasmid pAF/UrdR
(Abbildung 19) verwendet. Das von A. Frerich erstellte Plasmid basiert auf pUWL201 und
enthält urdR, C-Terminal mit einem His-Tag verknüpft [48]. Anstelle von urdR kann über
HindIII/XbaI ein beliebiges Gen in den Vektor kloniert und so mit einem C-Terminalen HisTag verbunden werden. Dies wurde mit vsifinal auf die in Kapitel 3.8.3.5 beschriebene Weise
durchgeführt, wodurch pAF-vsifinal erhalten wurde.
4.4.7.1 Expression von pAF-vsifinal und Aufreinigung von Vsifinal mittels
Affinitätschromatographie
pAF-vsifinal wurde per Konjugation in S. coelicolor A(3)2 eingebracht und fünf Tage lang in
HA-Medium (Tabelle 6) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen vom Medium durch
Zentrifugation abgetrennt. Mit der in 3.7.1.1 beschriebenen Methode wurde ein Zellaufschluß
durchgeführt. Anschließend konnten sowohl die im Medium als auch die im Zellinnneren
vorhandenen Proteine über Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt werden(3.7.1.2).
Die Analytik der so gewonnenen Proteinlösungen erfolgte per SDS-PAGE (3.7.2). Wiederum
war kein Protein der Größe 92,4 kDA auf dem Gel zu sehen. Vsifinal konnte somit auch nach
Fusion mit C-terminalem His-Tag weder im Medium, noch im Zellineren nachgewiesen
werden.
115
Diskussion
5
Diskussion
5.1
Untersuchungen zur Biosynthese des Didesmethylmensacarcins
A.
Linnenbrink
gelang
die
Identifizierung
des
Biosynthesegenclusters
von
Didesmethylmensacarcin [28]. Es wurde auf dem Cosmid Cos2 lokalisiert. Um genauere
Informationen über den Ablauf der Biosynthese des Didesmethylmensacarcins zu erhalten
sollte durch Inaktivierung verschiedener Gene des Cluster die Funktionen der entsprechenden
Proteine während der Biosynthese von Didesmethylmensacarcin (Abbildung 54) aufgeklärt
werden. K. Probst untersuchte die Funktion von sechs Oxygenasen, MsnO4, MsnO5, MsnO6,
MsnO7, MsnO8 und MsnO9, deren korrespondierende Gene auf dem Biosynthesegencluster
(Abbildung 24) liegen [1]. Ebenfalls konnte sie zeigen, dass es nur dann zur Akkumulation
von neuen Sekundärstoffen kam, wenn in den entsprechenden Mutanten das Regulatorgen
msnR1 unter der Kontrolle des ermE Promotors überexprimiert wurde [1]. Nach Analytik
neuer
Sekundärstoffe
konnte
K.
Probst
einen
vorläufigen
Biosyntheseweg
für
Didesmethylmensacarcin postulieren (Abbildung 25). Nicht untersucht wurden die
Oxygenasen MsnO1, MsnO2 sowie MsnO10 und MsnO11. MsnO1 und msnO10 codieren für
Ketoreduktasen [28]. Ihnen wurden Funktionen im frühen Biosynthesestoffwechsel
zugeordnet, während MsnO11, ebenfalls eine Ketoreduktase, für die Reduktion einer
Carbonylfunktion an der Polyketidkette verantwortlich gemacht wurde [1]. Die Untersuchung
der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase MsnO2 sollte wichtige Informationen zur
Charakterisierung der genauen Funktion von MsnO4 und der weiteren Aufklärung des
Biosyntheseweges von Didesmethylmensacarcin liefern.
116
Diskussion
OH
8
OH
OH O
O
OH
10
9
1
O
7
4
5
6
O
13
11
2
CH3
12
3
14
CH3
OH
Abbildung 54: Didesmethylmensacarcin
5.1.1 Die Luciferase-ähnliche Monooxygenase MsnO2
Aufgrund
seiner
Aminosäuresequenz
wird
MsnO2
den
Luciferase-ähnlichen
Monooxygenasen zugeordnet [28], welche nach der bakteriellen Luciferase von Vibrio
harveyi benannt sind. Dabei handelt es sich um eine Flavin-abhängige Monooxygenase,
welche einen langkettigen Alkylaldehyd zur Carbonsäure oxidiert und dabei Energie in Form
von sichtbarem Licht emittiert [72].
MsnO2 wurde auf Cos2 inaktiviert und eine msnO2–Mutante von S. albus erstellt. Darin
wurde msnR1 überexprimiert und es konnte im entsprechenden HPLC-Chromatogramm
(Abbildung 27) der neue Metabolit Msn-UH detektiert werden (4.1.4). Nach Aufreinigung des
Sekundärmetaboliten (4.1.5) wurde ein 1-H-NMR gemessen (Abbildung 35). Darauf
basierend wurde ein Strukturvorschlag für Msn-UH erhalten (Abbildung 55).
117
Diskussion
O
OH
8
10
9
OH
10a
1
2
O
OH
11
13
12
CH3
14
7
4a
5
6
3
4
CH3
15
O
Abbildung 55: Strukturvorschlag für Msn-UH
5.1.2 Msn-UH
Die Struktur von Msn-UH, ein Dekaketid, unterscheidet sich von Didesmethylmensacarcin
(Abbildung
54)
durch
Fehlen
der
sauerstoffhaltigen
funktionellen
Gruppen
am
Polyketid-Grundgerüst an den Positionen C-2 und C-4 sowie an C-4a/C-10a. Des Weiteren
findet man eine Hydroxylgruppe an C-13 anstelle der Epoxidgruppe an C-12/C-13 des
Didesmethylmensacarcins. Außerdem ist die Carbonylgruppe an C-10 von Msn-UH bei
Didesmethylmensacarcin zu einem sekundären Alkohol reduziert. Damit zeigt Msn-UH große
Ähnlichkeit zum Biosynthese-Intermediat Msn-KP3` (Abbildung 56), einem Derivat von
Msn-KP3, welches von K. Probst nach Analytik der Deletionsmutante von msnO4 erhalten
wurde [1]. Msn-KP3 unterscheidet sich von Msn-KP3´dadurch, dass es mit einem NAcetylcysteinrest verbunden ist. Die Massendifferenz von 163 Da von Msn-KP3 (m/z = 484)
und Msn-KP3´ (m/z = 321) lässt sich damit begründen. Wie im Kapitel 4.1.4 beschrieben,
wurden auch im Massenspektrum von Msn-UH zwei Signale mit den m/z - Werten 339 und
448 detektiert. Das Signal bei m/z = 448 ist im Laufe der Aufreinigung fast vollständig
verschwunden. Wie K. Probst postulierte, handelt es sich bei der Bindung von Acetylcystein
an Msn-KP3´um eine Detoxifikationsreaktion von S. albus mit Hilfe von Mycothiol als
Detoxifikationsreagenz [1]. Die Bindung von N-Acetylcystein an Msn-UH würde auch das
Aufreten des Signals m/z = 484 im MS-Spektrum dieser Substanz erklären. Hierzu müßte eine
Dehydratisierung an C-13 unter Ausbildung einer Doppelbindung an C-12/C-13 erfolgen.
Damit würde das von K. Probst beschriebene Produkt Msn-KP3` entstehen, welches die
118
Diskussion
Masse 321 Da besitz [1]. Bei einer Verbindung mit N-Acetylcystein (163 Da) würde
Msn-KP3 mit der Masse 484 Da entstehen. Das UV Spektrum und die Retentionszeit von
Msn-UH und Msn-KP3 unterscheiden sich nicht. Somit liegt es nahe, dass der Massenpeak
bei m/z = 484 durch geringe Mengen an Msn-KP3 verursacht wird. Demnach muß ebenfalls
angenommen werden, dass die Aufgabe von MsnO2, welches wie in Kapitel 5.1.3
beschrieben die Einführung der Doppelbindung an C-12/C-13 katalysiert, zu einem geringen
Anteil durch ein anderes Enzym übernommen wird und es dadurch zur Bildung von Msn-KP3
in sehr geringer Konzentration kommt. Durch den mit der Aufreinigung verbundenen
allgemeinen Substanzverlust ist die Konzentration von Msn-KP3 am Ende so gering, dass es
nicht mehr nachgewiesen werden kann. Damit könnte das Verschwinden des Signals bei
m/z = 484 während der Aufreinigung von Msn-UH erklärt werden.
OH
O
O
OH
13
8
9
10
1
7
6
5
2
3
4
11
12
CH3
14
CH3
15
O
Abbildung 56: Msn-KP3´. Sekundärmetabolit der bei Expression von S. albus x Cos2ΔO4 x pKR1, der
Deletionsmutante des Gens msnO4 gebildet wird [1].
5.1.3 MsnO2 im Biosynthesestoffwechsel von Didesmethylmensacarcin
Interessanterweise zählt MsnO2 wie MsnO4 zur Familie der Luciferase-ähnlichen
Monooxygenasen und es erscheint plausibel, dass die von den beiden Enzymen katalysierten
Reaktionen eng miteinander zusammenhängen.
Die beiden Metabolite Msn-UH und Msn-KP3´welche bei der Analytik der entsprechenden
Deletionsmutanten erhalten wurden, unterscheiden sich durch die in Msn-UH vorhandene
Hydroxylgruppe an C-13, während in Msn-KP3` eine Doppelbindung an C-12/C-13
lokalisiert ist.
119
Diskussion
Aus den strukturellen Unterschieden des Intermediates Msn-UH gegenüber dem Endprodukt
Didesmethylmensacarcin sowie den Informationen die aus der Arbeit von K. Probst bekannt
sind [1], kommen für MsnO2 die im Folgenden diskutierten Reaktionsmöglichkeiten in Frage.
Die bei Msn-UH noch nicht erfolgte Reduktion des Carbonylkohlenstoffs an C-10, die
Einführung der Epoxid-Struktur an C-4a/C-10a oder die Katalyse der Hydroxylierung an C-2
respektive C-4 sowie die Einführung der Doppelbindung an C-12/C-13 sind mögliche
Reaktionen an denen MsnO2 beteiligt sein könnte.
Theoretisch kommt auch die Einführung der Epoxidgruppe an C-12/C-13 in Frage. Diese
Aufgabe wurde jedoch im Rahmen der Arbeit von K. Probst bereits MsnO8 zugeordnet[1].
Wie für MsnO4 kann auch für MsnO2 die Reduktion der Ketogruppe an C-10 zum
sekundären Alkohol ausgeschlossen werden, da solche Reaktionen gewöhnlich zumindest bei
der Synthese von PKS-II-Derivaten von Ketoreduktasen übernommen werden [73].
Außerdem ist diese Ketogruppe auch bei Msn-KP3´ (Abbildung 56) vorhanden, einem
Stoffwechselintermediat, welches bei der Deletion von MsnO4 und aktivem MsnO2 gebildet
wird. Somit kann diese Aufgabe für MsnO2 mit großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen
werden. Für die Hydroxylierung an C-2 oder C-4 kommen sowohl MsnO4 als auch MsnO2 in
Frage. So sind aus anderen Biosynthesestoffwechseln Enzyme bekannt, die wie MsnO4 und
MsnO2 zu den Flavin-abhängigen Monooxygenasen gehören und dort entsprechende
Reaktionen katalysieren [1]. Ein Beispiel ist DnrF, was die Hydroxylierung des C-11
Kohlenstoffs bei der Biosynthese von Anthracyclin katalysiert [1], [74]. Jedoch ist weder in
Msn-KP3´, was bei Deletion von MsnO4 und damit funktionierender MsnO2 erhalten wurde,
eine Hydroxylgruppe an diesen Positionen zu finden, noch in Msn-UH, was bei funktioneller
MsnO4 jedoch inaktivierter MsnO2 akkumulierte. Somit kann man, vorausgesetzt die
Enzyme arbeiten unabhängig voneinander, postulieren, dass weder MsnO2, noch MsnO4 für
die Hydroxylierung an C-2, beziehungsweise C-4 zuständig ist. MsnO5, MsnO6 und MsnO9
könnten diese Aufgabe übernehmen. Auch für die Epoxidierung an C-4a/C-10a existieren
Beispiele aus anderen Biosynthesewegen, worin die Katalyse der entsprechenden Reaktionen
durch Flavin-abhängige Monooxygenasen wie MsnO2 beschrieben wird [1]. So ist bekannt,
dass die FAD-abhängige Monooxygenase MonCI während der Biosynthese von Monensin A
eine Epoxid-Struktur einführt [1], [69]. Unter Berücksichtigung der bislang durchgeführten
Experimente wäre der in Abbildung 57 dargestellte und im Folgenden beschriebene
Biosyntheseablauf ausgehend von Msn-UH plausibel.
120
Diskussion
Das Intermediat Msn-KP2, welches bei der Expression der Deletionsmutante von MsnO8
erhalten wurde [1], ist an den Positionen C-2 und C-4 bereits hydroxyliert. Ebenfalls ist die
Epoxidgruppe an C-4a/C-10a schon eingeführt. Msn-KP3`als Sekundärmetabolit der
Deletionsmutante von MsnO4 [1] besitzt keine der genannten funktionellen Gruppen. MsnUH ebenfalls nicht. Somit könnte MsnO2, ausgehend von Msn-UH unter Abspaltung der
Hydroxylgruppe an C-13, die Doppelbindung an C-12/C-13 einführen. Dabei entsteht MsnKP3´, was, wie in der Arbeit von K. Probst beschrieben, bei Deletion von MsnO4 akkumuliert
und zur Detoxifikation mit Hilfe von Mycothiol mit einem N-Acetylcysteinrest verbunden
wird, wodurch Msn-KP3 entsteht [1]. Die Hydroxylierungen an C-2 und C-4, sowie die
Reduktion der Ketogruppe an C-10 könnten mit Hilfe der Enzyme MsnO5, MsnO6 und
MsnO9 erfolgen. Aus den Experimenten von K. Probst ging hervor, dass es bei Deletion von
MsnO5 und MsnO6 jeweils neben dem Shuntprodukt Msn-KP1 zur Akkumulation von
Msn-KP4 kommt, dessen Struktur nicht aufgeklärt werden konnte [1]. Jedoch ergab die
Auswertung des UV Spektrums, dass es sich um eine eng mit Msn-KP3´ verwandte
anthrachinonartige Struktur handelt [1] und sich demnach an C-10 eine Carbonylfunktion
befinden muß. MsnO5 und MsnO6 konnten aufgrund ihrer Aminosäuresequenz den
Anthronoxidasen zugeordnet werden [1]. So könnte eines dieser beiden Enzyme für die
Reduktion der Ketogruppe an C-10, ausgehend von Msn-KP4 verantwortlich sein. Für die
Hydroxylierung an C-4 und C-10 kommt MsnO9 in Frage. Außerdem auch MsnO5 oder
MsnO6, je nachdem welches der beiden Enzyme nicht für die Reduktion der Ketogruppe an
C-10 verantwortlich ist. Msn-KP1 (Abbildung 57), das bei Deletion der Enzyme MsnO5,
MsnO6 und MsnO9 akkumuliert [1], hat ebenfalls eine anthrachinonartige Struktur und an C4
keine Hydroxylgruppe, was ebenfalls dafür sprechen würde, dass die Reduktion der
Carbonylfunktion an C-10 erst durch Katalyse von MsnO5/O6 erfolgt und diese Enzyme
zusammen mit MsnO9 auch für die Hydroxylierung an C-4 verantwortlich sind. Die
Zuordnung dieser Enzymfunktionen ist jedoch rein hypothetisch.
K. Probst postulierte, dass MsnO4 die Reduktion der Ketogruppe an C-10 kathalysiert, oder
aber die Einführung der Epoxid-Struktur an C-4a/C-10a. Allerdings konnte auch die
Einführung der Hydroxylgruppen an C-2 respektive C-4 nicht ausgeschlossen werden [1].
Unter Berücksichtigung dieser Arbeitshypothese und den hier diskutierten Reaktionsabläufen
zufolge, sollte MsnO4 mit großer Wahrscheinlichkeit für die Katalyse der Epoxidierung an C4a/C-10a verantwortlich sein und diese Reaktion ausgehend von Msn-KP3´katalysieren.
121
Diskussion
Als letzten Schritt der Biosynthese von Didesmethylmensacarcins hatte K. Probst bereits die
Epoxidierung an C-12/C-13 durch MsnO8 postuliert [1], womit die Synthese von
Didesmethylmensacarcin abgeschlossen ist.
Abbildung 57: Postulierter Biosyntheseweg für Didesmethylmensacarcin unter Berücksichtigung der
Informationen aus der Arbeit von K. Probst [1] und den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen zur
Funktion von MsnO2. Msn-UH wurde als neuer Metabolit im Kulturüberstand der Deletionsmutante von
MsnO2 identifiziert. MsnO2 wurde für die Einführung der Doppelbindung an C12/C13verantwortlich
gemacht.
122
Diskussion
5.2 Susy
Mit pUWL-H-vsifinal (3.8.3.4) wurde ein Expressionskonstrukt erstellt, welches die
Expression und Sezernierung von Susy durch Fusionierung mit dem Signalpeptid VsiSSQ
ermöglichen sollte. Ebenfalls wurde das Fusionskonstrukt aus Susy und VsiSSQ in
pAF-vsifinal
(3.8.3.5)
mit
einen
His-Tag
verbunden
dmit
das
Protein
mittels
Affinitätschromatographie aufgereinigt und von anderen Proteinen abgetrennt werden kann.
Es wurden keine auswertbaren Ergebnisse erzielt und Susy konnte nicht nachgewiesen
werden. Da die Arbeiten an diesem Projekt sehr schnell eingestellt wurden soll es hier nicht
weiter diskutiert werden.
5.3 Ethanol und Butanolproduktion in Streptomyceten
5.3.1 Butanolproduktion in Streptomyceten
Es konnte in keiner der untersuchten Produktionskulturen Butanol nachgewiesen werden. Die
Expression von adhe wurde nicht überprüft. Jedoch ist die Expression von Genen, welche
unter der Kontrolle des ermE-Promotors stehen in Streptomyceten sehr wahrscheinlich und
wurde für adhB und pdc in dieser Arbeit ebenfalls nachgewiesen (4.2.6.). Daher ist es
unwahrscheinlich, dass der Grund für die Ausbleibende Butanolproduktion an der nicht
erfolgten Expression von adhe liegt.
Wahrscheinlicher ist, dass zur Butanolproduktion in Streptomyceten die Expression von adhe
alleine
nicht
ausreicht.
Adhe
katalysiert
bei
der
Biosynthese
von
Butanol
in
Clostridium acetobutylicum die letzten beiden Teilschritte der Biosynthese ausgehend von
Butyryl-CoA über Butyraldehyd zu Butanol (Abbildung 58). Im Streptomycetenstoffwechsel
entsteht das Intermediat Pyruvat, zum Beispiel durch Glykolyse. Betrachtet man den
Biosynthesestoffwechsel der erfolgreich etablierten Ethanolproduktion in S. coelicolor
(4.2.8), kann festsgestellt werden, dass die Synthese dort ausgehend von Pyruvat in zwei
Reaktionsschritten zum Ethanol führt. Beide dafür benötigten Enzyme werden durch
heterologe Expression von adhB und pdc bereitgestellt. Zur Produktion von Butanol hingegen
sind ausgehend vom Pyruvat außer den oben genannten und von Adhe katalysierten
Teilreaktionen noch weitere Reaktionsschritte nötig. Im Biosynthesestoffwechsel von
Clostridium acetobutylicum werden diese zum Beispiel von Thl, einer Thiolase, Hbd
(Hydroxybutyryldehydrogenase), CRT und BCD (Butyryl-CoA-Dehydrogenase), katalysiert
werden (Abbildung 58). Möglicherweise würde eine Expression der für diese Proteine
codierenden Gene zusammen mit adhe zur Synthese von Butanol führen. Eine Überprüfung
123
Diskussion
dieser Hypothese wäre durch die Generierung eines künstlichen Stoffwechselweges
ausgehend von Pyruvat, mit einzelnen oder sogar allen erforderlichen Enzymen für die
Butanolproduktion möglich.
Abbildung 58: Vereinfacht dargestellter Butanol-Biosyntheseweg in Clostridium acetobutylicum. Rot
hinterlegt sind die Teilreaktionen (Umwandlung von Butyryl-CoA zu Butyraldehyd sowie die
nachfolgende Reduktion zu Butanol), welche durch das von adhe (oder adhe1) codierte bifunktionelle
Enzym katalysiert werden. Grau hinterlegt sind potentiell wichtige Enzyme, um die Butanolproduktion in
Streptomyceten zu ermöglichen.
124
Diskussion
5.3.2 Ethanolproduktion in verschiedenen Streptomyceten
Zur etablierung der Ethanolproduktion in Streptomyceten, wurden verschiedene Stämme mit
dem pUWL-H-ap konjugiert, einem Expressionsplasmid für die Gene adhB und pdc. Für die
Produktion wurde in unterschiedlichen Medien kultiviert. Streptomyces coelicolor A(3)2 (im
weiteren S. coelicolor) lieferte bei allen Experimenten die besten Ergebnisse (maximal
3161 mg/L). Der eng verwandte Stamm Streptomyces coelicolor M1154 lieferte ebenfalls
vergleichbar hohe Werte für die Ethanolkonzentration (maximal 1620 mg/L). Außer diesen
beiden Stämmen wurden noch für Streptomyces fradiae Tü 2717 nennenswerte
Ethanolmengen in den Produktionsmedien detektiert, die aber deutlich unter den Werten für
S. coelicolor und S. coelicolor M1154 lagen (maximal 422 mg/L) In den anderen untersuchten
Stämmen konnte eine geringe bis keine Ethanolproduktion festgestellt werden. Es waren
somit große Unterschiede bei den verschiedenen Stämmen bezüglich der Ethanolproduktion
zu verzeichnen. Jeder Mikroorganismus besitzt einen individuellen Stoffwechsel, wodurch
auch die die Voraussetzungen für die Synthese neuer Sekundärstoffe individuell verschieden
sind. Die am besten für die Ethanolproduktion abgestimmte Stoffwechselsituation ist ein
Faktor, der das Ergebnis entscheidend beeinflußt. Im Falle der untersuchten Stämme scheint
S. coelicolor am besten für die Ethanolproduktion geeignet zu sein. Vermutlich können aber
bei der großen Artenvielfalt innerhalb der Streptomyceten Vertreter gefunden werden die
dazu in der Lage sind noch mehr Ethanol zu produzieren.
5.3.3 Medien
Die verwendeten Medien beeinflussen ebenfalls entscheidend die Ethanolproduktion. Auch
für die Produktion anderer Sekundärstoffe unterschiedlichster Mikroorganismen variieren
Menge und Zusammensetzung der gebildeten Stoffe je nach Nährstoffangebot in den
Produktionsmedien. So spielt die Zusammensetzung des Mediums zum Beispiel bei der
Produktion von Antibiotika in S. coelicolor A(3)2 eine entscheidende Rolle [75]. Für jeden
Organismus gibt es ein Medium, das für die Produktion eines bestimmten Sekundärstoffes am
besten geeignet ist. Bezüglich der Ethanolproduktion in Streptomyceten wurden in NL111Medium die höchsten Ethanolkonzentrationen gemessen. Neben der Kombination aus dem
entsprechenden Mikroorganismus und dem dafür optimalen Medium wurde die absolute
Glukosekonzentration im Medium als wichtiger Faktor für eine gute Ethanolausbeute erkannt.
Durch Zusatz von Glukose zu den Produktionsmedien konnte die Ethanolmenge um 75 % bei
semianaerober Kultivierung und bis zu 100 % bei aerober Kultivierung gesteigert werden.
125
Diskussion
5.3.4 PH-Wert
Wie in 4.2.10 beschrieben ist die von AdhB katalysierte Reduktion von Acetaldehyd zu
Ethanol (Abbildung 39) eine vom pH-Wert abhängige Gleichgewichtsreaktion. Im alkalischen
Bereich liegt das Reaktionsgleichgewicht auf der Seite des Acetaldehyds, während es sich im
sauren Milieu zu Ethanol hin verschiebt. Durch Einstellung eines sauren pH-Wertes vor der
Extraktion sollte das Gleichgewicht auf die Seite von Ethanol verschoben und damit die
Ethanolausbeute gesteigert werden. Nach dem Ernten der Kulturen wurde der pH-Wert auf
5,5 eingestellt und das Medium nochmals für 24 Stunden bei 28 Grad inkubiert. Es waren
keine Zellen mehr enthalten und so war die Voraussetzung für den Versuch, dass AdhB in das
Medium sezerniert wird und sich nach dem Ernten der Zellen noch AdhB im Medium
befindet, dessen Aktivität für die Katalyse der Reaktion ausreichend ist. Nur dann könnte
Acetaldehyd zu Ethanol reduziert und aufgrund des veränderten pH-Wertes eine erhöhte
Ethanolkonzentration in den Medien festgestellt werden.
Die gemessenen Ethanolmengen waren mit denen vergleichbar die man nach Extraktion ohne
Einstellung eines sauren pH-Wertes erhalten hatte. Somit konnte keine höhere
Ethanolkonzentration festgestellt werden. Möglicherweise ist also AdhB nach dem Abernten
der Zellen nicht mehr in ausreichender Konzentration im Medium haltbar, beziehungsweise
ist seine Aktivität unter den veränderten Bedingungen zu gering. Ebenso ist es möglich, dass
AdhB nicht wie oben vorausgesetzt, aus den Zellen in das Medium sezerniert wird und somit
die Reduktion von Acetaldehyd ausserhalb der Bakterienzelle nicht ablaufen kann.
5.3.5 Zeitabhängigkeit der Ethanolproduktion und S. coelicolor M1154
Experimente zur Bestimmung der optimalen Kulturdauer wurden mit S. coelicolor A(3)2 und
S. coelicolor M1154 durchgeführt. Nach sieben Tagen konnte dabei die maximale
Ethanolmenge
in
den
Kulturen
von
S. coelicolor A(3)2
detektiert
werden.
Bei
S. coelicolor M1154 stieg die Ethanolkonzentration nach dem siebten Tag weiter an und
erreichte das Maximum nach neun Tagen. Dieses lag jedoch mit circa 1,6 g/L (Abbildung 50)
deutlich unter dem für S. coelicolor A(3)2 gemessenen Wert von circa 2,6 g/L (Tabelle 43),
der
nach
sieben
Tagen
erreicht
wurde.
Bei
S. coelicolor M1154
wurden
die
korrespondierenden Biosynthesegencluster für Prodiginin, CPK („cryptic type I polyketide
synthase“) und CDA („calcium dependend antibiotic“) deletiert (4.2.17.1). Bei länger
andauernder Kultivierung könnte die Anreicherung dieser Stoffe für den Organismus toxisch
sein .Dementsprechend würde sich das Fehlen dieser Sekundärstoffe im Medium positiv auf
126
Diskussion
die Lebensdauer und Produktivität der Kulturen auswirken. Eine Steigerung der Produktion
verschiedener Sekundärstoffe beschrieb J. P. Gomez-Escribano [41] für S. coelicolor M1154.
Für Ethanol konnte dies bei den hier durchgeführten Erxperimenten nicht festgestellt werden.
5.3.6
Semianaerobe Kultivierung
Durch luftdichtes Verschließen der Erlenmeyerkolben wurde die Versorgung der Kulturen mit
Sauerstoff vermindert. So wurde sowohl bei S. fradiae als auch bei S. coelicolor eine
deutliche Steigerung der Ethanolproduktion beobachtet. Unter sonst identischen Bedingungen
wurden bei S. coelicolor A(3)2 durchschnittlich etwa 50 % höhere Ethanolkonzentrationen
gemessen. Bei S. fradiae wurden sie sogar nahezu verdreifacht (4.2.12.; Tabelle 40).
Durch die in 4.2.12.1 beschriebenen Experimente konnte man zeigen, dass im Bereich der
Ethanolkonzentrationen, die für die verschiedenen Produktionskulturen gemessen wurden,
Effekte durch Evaporation von Ethanol zu vernachlässigen beziehungsweise nicht
nachweisbar sind. Ebenfalls bedeutet dies, dass eine Steigerung der Ethanolkonzentration, die
bei semianaerober Kultivierung beobachtet wurde nicht auf eine verminderte Evaporation
zurückgeführt werden kann.
Streptomyceten
nutzen
zum
Abbau
der
Glukose
hauptsächlich
Glykolyse,
Pentosephosphatweg und den Krebszyklus [76], [77]. Während der Glykolyse wird Pyruvat
und NADH gebildet [76]. Unter aeroben Bedingungen kann NADH in die Atmungskette
einfließen und wird dort, bei der Reduktion von Sauerstoff zu Wasser, zu NAD+ oxidiert.
NADH ist für die Umsetzung von Acetaldehyd zu Ethanol ebenso obligativ wie bei der
Reduktion von O2 zu H2O. Somit konkurrieren beide Reaktionen um das in den Zellen
vorhandene NADH. Dies kann unter den im Experiment vorherrschenden Bedingungen zu
einem Mangel an NADH und einer damit verbundenen Störung des Redox-Gleichgewichtes
innerhalb der Zellen führen (siehe auch 5.3.9). In diesem Fall kann die Reduktion von
Acetaldehyd
nicht
stattfinden.
Man
beabsichtigte
durch
Verringerung
des
Sauerstoffangebotes, den Anteil von in der Atmungskette oxidiertem NADH zu verringern
und es somit für die Reduktion von Acetaldehyd zu Ethanol verfügbar zu machen, wodurch
die Ethanolproduktion erhöht werden sollte.
In wissenschaftlichen Publikationen wurde mehrfach über die Auswirkung des Angebotes an
NADH bei der Produktion von Ethanol in E. coli berichtet. So beschreibt S. Berríos-Riverra,
dass es vor allem unter aeroben Bedingungen zu einem Absinken der Ethanolproduktion
aufgrund zu geringer NADH Konzentration kommt [66].
127
Diskussion
Eine Erhöhung der NADH-Konzentration war auch das Ziel der Expression von fdh, einem
Gen, das für die Produktion einer Formiatdehydrogenase (FDH) codiert. Durch FDH sollte in
vivo die Oxidation von Formiat zu Kohlendioxid unter gleichzeitiger Reduktion von NAD+ zu
NADH katalysiert werden und so eine bessere Versorgung mit NADH gewährleisten. Im
Gegensatz zur Kultivierung unter semianaeroben Bedingungen, konnte durch dieses
Experiment keine Steigerung der Ethanolproduktion erreicht werden, was jedoch mit großer
Wahrscheinlichkeit darauf zurückzuführen ist, dass für die Bakterien endogen zugesetztes
Formiat toxisch ist und die Kulturen deshalb im Wachstum stark gehemmt werden oder
absterben.
5.3.7 Anreicherung des Produktionsmediums mit Pyruvat
Als Intermediat des Glukoseabbaus spielt Pyruvat auch im Stoffwechsel der Streptomyceten
eine wichtige Rolle [63], [78]. Es ist an zahlreichen anabolen und katabolen
Stoffwechselwegen beteiligt [79]. Nach Decarboxylierung wird die entstandene Acetylgruppe
an Coenzym-A gebunden. Acetyl-CoA kann in verschiedenen Biosynthesewegen zum
Beispiel zu Fettsäuren, Phospholipiden, aber auch zu Laktat, Acetat und, bei Anwesenheit der
entsprechenden Enzyme, zu Ethanol verstoffwechselt werden. Unter aeroben Bedingungen
geht Acetyl-CoA in den Citratzyklus ein wo es vollsändig zu CO2 oxidiert wird und damit zur
Energiegewinnung in Form von ATP genutz wird [79]. Somit bleibt dem Organismus nur ein
kleiner Anteil des endogen gebildeten Pyruvats zur Synthese von Ethanol. Durch Zusatz von
Pyruvat zum Produktionsmedium sollte daher versucht werden die Ethanolproduktion zu
steigern.
Die Versuche wurden mit S. coelicolor M1154 (4.2.17.4) und S. coelicolor A(3)2 (4.2.15)
durchgeführt. In beiden Fällen zeigte sich eine verminderte Ethanolkonzentration im
Produktionsmedium bei Zugabe von Pyruvat. (Tabelle 44, Tabelle 48).
Damit es durch Anreicherung des Mediums mit Pyruvat zu einer Erhöhung der
Ethanolsynthese kommen kann, muss das zugesetzte Pyruvat in die Zellen der Bakterien
aufgenommen werden, wo die Ethanolbiosynthese stattfindet. Da für den Import von
Carbonsäuren in bakterien verschiedene Transportsysteme bekannt sind, ist davon
auszugehen, dass der Transport von Pyruvat in das Zellinnere gewährleistet ist. Vermutlich ist
Pyruvat kein limitierender Faktor bei der Ethanolsynthese in den untersuchten Stämmen.
128
Diskussion
5.3.8 Coexpression von adhB, pdc und aldh
Neben AdhB und Pdc ist Aldh ein weiteres für die Ethanol-Biosynthese hilfreiches Protein.
Es handelt sich um eine Acetaldehyd-Dehydrogenase aus dem Ethanolstoffwechsel von
Morella sp. HUC22-1 [64], (Abbildung 42) Das Enzym katalysiert in diesem anaerob
lebenden Bakterium die Umwandlung von Acetyl-CoA zu Acetaldehyd. Dieses wiederum
kann in Streptomyceten unter Katalyse von AdhB, welches aus Zymomonas mobilis stammt,
zu Ethanol reduziert werden. Die Coexpression von aldh zusammen mit adhB und pdc sollte
das Angebot an Acetaldehyd erhöhen und somit die Produktion von Ethanol steigern.
Nachdem
durch
extern
zugesetzten
Pyruvat
wie
beschrieben
keine
verbesserte
Ethanolproduktion zu verzeichnen war, wurde mit der Expression von aldh beabsichtigt, die
Konzentration eines Intermediates, was zu einem späteren Zeitpunkt der Ethanolsynthese
vorkommt, durch Steigerung der zelleigenen Syntheserate zu erhöhen. Bis zum fünften Tag
der Kultivierung konnte eine im Vergleich zu S. coelicolor+adh+pdc eine höhere
Ethanolkonzentration in den Produktionsmedien gemessen werden (Tabelle 46). Ab dem
siebten Tag des Experimentes, waren die gemessenen Werte jedoch deutlich unter denen, die
für S. coelicolor+adh+pdc erhalten wurden. Für S. coelicolor+adh+pdc x pNL1 wurden bis
zum fünften Tag ebenfalls höhere Werte als für S. coelicolor+adh+pdc gemessen. Somit kann
ausgeschlossen werden, dass die Ethanolproduktion in dieser frühen Produktionsphase durch
Aldh erhöht wurde.
5.3.9 Zusammenfassende Beurteilung der Ethanolproduktion in
Streptomyceten
S. coelicolor+adh+pdc lieferte von allen in dieser Arbeit untersuchten Stämmen die besten
Ergebnisse bezüglich der gemessenen Ethanolkonzentration in den Produktionsmedien.
(4.2.8) Die Werte konnten von durchschnittlich 610 mg/L in NL111-Medium und unter
aeroben Kulturbedingungen (Tabelle 36) auf maximal 3161 mg/L bei Verwendung von
NL111-Medium, dem 2,5 %Glukose zugesetzt wurden und Kultivierung unter semianaeroben
Bedingungen (4.2.12, Tabelle 44) gesteigert werden. Diese Steigerung der Ethanolproduktion
war im Wesentlichen durch Anreicherung der Produktionsmedien mit Glukose (4.2.14) und
das Verschließen der Erlenmeyerkolben mit Parafilm (semianaerobe Bedingungen, 4.2.12)
erzielt worden. Aufwendige Experimente, wie die Coexpression von adh und pdc zusammen
mit aldh oder fdh, führten zu keiner Verbesserung der Produktionsrate.
129
Diskussion
Betrachtet man die maximal gemessenen Ethanolkonzentrationen von circa 3 g/L Medium im
Vergleich zu anderen für die Produktion von Biokraftstoffen etablierten, teilweise
biotechnologisch weiterentwickelten Mikroorganismen, wie Z. mobilis CP4:PZB5 (23 g
Ethanol pro Liter Medium aus Xylose [80]), E. coli KO11 (60 g/L aus Xylose [81]),
Klebsiella oxytoca M5A1 (46 g/L aus Xylose, [12]) oder S. cerevisiae (>90 g/L aus Glukose
[82]), produzieren diese alle ein Vielfaches mehr an Ethanol als die untersuchten
Streptomyceten. Die in 2.5.3 diskutierten Qualitäten der Streptomyceten im Bezug auf die
mögliche Nutzung alternativer Rohstoffe die aus komplexen Kohlenhydraten bestehen und in
Planzenresten sowie verschiedenen industriellen Abfällen vorkommen wurden in dieser
Arbeit nicht untersucht, da zunächst die Ethanolproduktion generell auf ein Niveau gesteigert
werden sollte, welches die Verwendung dieser Bakterien als Biokraftstoffproduzenten
interessant macht. Mit den bislang erzielten maximalen Produktionsraten ist dieses Niveau
nicht erreicht. Über mögliche Gründe für die noch immer relativ geringe Ethanolausbeute
kann nur spekuliert werden. Einige davon seien hier, rein hypothetisch und als Ausblick für
weiterführende Forschungsarbeiten genannt.
Die Aktivität der aus einem fremnden Organismus (zum Beispiel Z. mobilis) stammenden
Enzyme in Streptomyces sollte überprüft werden. Eventuell müßte bei zu geringer Aktivität
ein Enzym eines anderen Microorganismus gewählt werden.
Eine Hemmung der Ethanolsynthese durch bereits produziertes Ethanol ist ebenfalls möglich.
So könnte durch die steigende Konzentration des Alkohols im Medium, die Syntheserate
gesenkt werden, wie es häufig bei der Regulation von Biosynthesestoffwechseln der Fall ist.
Eventuell könnte auch im Medium vorhandnes Ethanol von Zellen wieder aufgenommen und
verstoffwechselt werden. Eine solche Stoffwechselsituation wird zum Beispiel im
Zusammenhang mit Aminosäuren [83] als Substratzyklus oder „Futile Cycle“ bezeichnet.
Futile“ kommt aus dem englischen und bedeutet nutzlos. Da während eines solchen
Substratzyklus die Synthese und der Abbau des Stoffwechselproduktes gleichzeitig ablaufen,
scheint die Bezeichung durchaus plausibel, schließlich wird die Produktausbeute verringert
und zudem Energie für den zusätzlichen katabolen Stoffwechsel verbraucht [83]. Durch
kontinuierliche Entfernung des Ethanols aus den Medien während der Kultivierung könnte die
Hemmung der Biosynthese und die Wiederaufnahme und metabolisierung von Ethanol
verhindert werden.
130
Diskussion
Andererseits ist der Ablauf eines Biosynthesestoffwechsels auf ein sehr genau
ausbalancieirtes Gleichgewicht verschiedener Stoffwechselintermediate angewiesen, welches
durch „Futile Cycles“ aufrecht erhalten werden kann. [84, 85]
Durch den in Streptomyces künstlich generierten Ethanolstoffwechsel werden Intermediate
natürlicher Stoffwechselwege, zum Beispiel Pyruvat, Acetyl-CoA oder NADH verbraucht.
Somit könnte über den Substratzyklus von Ethanol das natürliche Gleichgewicht dieser
Intermediate wieder hergestellt werden.
Über die Bedeutung von NADH im Ethanolstoffwechsel wurde schon in 5.3.6 diskutiert. Der
Redox-Zustand einer Zelle ist grundlegend vom Verhältnis NAD+/NADH abhängig [86].
Jeder in einem Organismus neu eingeführte Stoffwechselweg kann dieses Redox System aus
dem
Gleichgewicht
bringen
und damit
die Produktion der
Biosyntheseprodukte
hemmen[86].Somit auch der künstlich generierte Ethanolbiosyntheseweg
Ein ausbalanciertes Gleichgewicht dieser Redoxpartner ist Voraussetzung für den Ablauf des
durch semianaerobe Kultivierung bobachtete Steigerung der Produktion (4.2.12) unter dem
Aspekt, das sie durch die verminderte Oxidation von NADH in der Atmungskette erzielt
wurde (5.3.6), könnte der Versuch ein ausbalanciertes Redox-System im speziellen aber auch
das Gleichgewicht der gesamten intermediären Komponenten herzustellen ein interessanter
Ansatzpunkt für weitere Arbeiten sein.
131
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136
Anhang
7
Anhang
7.1 Abkürzungsverzeichnis
A
Abb.
AS
BLAST
BSA
bp
bzw.
°C
C
Carb
CoA
Da
DAD
DC
Δ
DMSO
DC
d.h.
DNA
dt.
E. coli
EDTA
Adenin
Abbildung
Aminosäure
Basic Local Alignment Search Tool
Rinderserumalbumin
Basenpaar(e)
Beziehungsweise
Grad Celsius
Cytosin
Carbenicillin
CoenzymA
Dalton
Engl.: “diode array detector”
Dünnschichtchromatographie
“delta” steht für Deletion eines Gens
Dimetylsulfoxid
Dünnschichtchromatographie
das heißt
Desoxyribonukleinsäure
deutsch
Escherichia coli
Ethylendiamintetraessigsäure
ESI
EtOH
et al.
g
G
h
HCl
His
HOAc
HPLC
Electron-Spray-Ionisation (dt.: Elektronen-Spray-Ionisation)
Ethanol
et alii (lat. = und andere)
Gramm
Guanin
Stunde(n)
Salzsäure
L-Histidin
Essigsäure
High-Performance-Liquid-Chromatography (dt.: HochleistungsFlüssigchromatographie)
Isopropyl-β-D-thiogalactosid
Kilo-Dalton
Kilobasenpaar(e)
Liter
β-Galaktosidase
Lateinisch
Meter
Mol
Molare Masse
Verhältnis Masse/Ladung bei der MS
IPTG
kDa
kb
L
LacZ
lat.
m
M
Mr
m/z
137
Anhang
MALDI
MCS
MeOH
mg
min
MS
msn
mL
mm
Mr
MS
µ
µg
µL
nm
NaOH
NMR
Nr.
NTA
ori
PAGE
PCR
pBSK(-)
ppm
Ref
RNA
ρ
rpm
s
S.
Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation (dt.: Matrix-unterstützte
Laserdesorption/-ionisation)
Multiple-Cloning-Site
Methanol
Milligramm
Minute(n)
Massenspektrometrie
Gen, das zum Biosynthesegencluster von Didesmethylmensacarcin gehört
Milliliter
Millimeter
relative Molekülmasse
Mass-Spectometry (Massen-Spektrometrie)
mikro
Mikrogramm
Mikroliter
Nanometer
Natronlauge
Nuclear-Magnetic-Resonance (dt.: Kernspin-Resonanz)
Nummer
Nitrilotriessigsäure
Replikationsursprung(engl.: origin of replication)
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Polymerase-Chain-Reaction (dt.: Polymerase-Kettenreaktion)
pBluescript SK(-)
Englisch: „parts per million“
Referenz
Ribonukleinsäure
Grichisch „Rho“ = Dichte [kg/m3]
revolution per minute (dt.: Umdrehungen pro Minute)
Sekunde(n)
Streptomyces
sp.
Species ; Art(en)
SDS
Sodiumdodecylsulfat(=Natriumdodecylsulfat)
Tab.
TOF
tRNA
U
UV
V
VIS
WT
X-Gal
z. B.
Tabelle
Time of flight (dt.: Flugzeit)
Transfer-Ribonukleinsäure
Unit
Ultraviolettes Licht
Volt
Sichtbares “visible” Licht
Wild-Typ
5-Brom-4Chlor-3-Indolyl-b-Galactosid
zum Beispiel
138
Anhang
7.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Mensacarcin ____________________________________________________________________ 13
Abbildung 2: Didesmethylmensacarcin __________________________________________________________ 15
Abbildung 3: Schematische Darstellung der verwendeten Primer und der Matrize _______________________ 38
Abbildung 4: Aufbau der Resistenzkassette die nach der PCR erhalten wurde; B1und B2: homologe Bereiche zum
Gen msnO2; aadA: Spectinomycin Resistenzgen; NdeI: Erkennungssequenz für das Enzym NdeI ____________ 38
Abbildung 5: Ergebnis der PCR nach reverser Transkription der isolierten RNA aus den Stämmen S. coelicolor
A(3)2+adh+pdc und S. coelicolor M1154+adh+pdc. Es wurde in allen Kulturen das gewünschte Fragmenten für
adhB erhalten (Bahn 2-5: S. coelicolor A(3)2+adh+pdc und Bahn 13-16: S. coelicolor M1154+adh+pdc). Das
gewünschte PCR-Produkt für pdc konnte nur in den Kulturen von S. coelicolor M1154+adh+pdc (Bahn 7-10)
nachgewiesen werden _______________________________________________________________________ 46
Abbildung 6: Plasmidkarte von pUWL-H-ap ______________________________________________________ 50
Abbildung 7: Plasmidkarte von pUWL-H-apf _____________________________________________________ 51
Abbildung 8: Plasmidkarte von pUC57-aldh ______________________________________________________ 52
Abbildung 9: Plasmidkarte von pUWL-A-aldh_____________________________________________________ 52
Abbildung 10: Plasmidkarte von pNL1-aldh ______________________________________________________ 53
Abbildung 11: Plasmidkarte von pUC57-adhe ____________________________________________________ 54
Abbildung 12: Plasmidkarte von pUWL-H-adhe ___________________________________________________ 54
Abbildung 13: Plasmidkarte pUWL-A-adhe ______________________________________________________ 55
Abbildung 14: pMK-vsifinal ___________________________________________________________________ 56
Abbildung 15: pUCPK1 _______________________________________________________________________ 56
Abbildung 16: pUC-vsifinal ___________________________________________________________________ 57
Abbildung 17: pUWL-H-vsifinal ________________________________________________________________ 58
Abbildung 18: Ergebniss der Restriktion von pUWL-H-vsifinal mit NcoI (Bahn 3 + 4) sowie HindIII/XbaI (Bahn 1
+2). ______________________________________________________________________________________ 58
Abbildung 19: Plasmidkarte von pAF1/urdR [48] __________________________________________________ 59
Abbildung 20: pAF-vsifinal mit HindIII und XbaI geschnitten (2,8 kb (vsifinal) und 6,6 kb (pAF/urdR linearisiert).
_________________________________________________________________________________________ 59
Abbildung 21: Vorbereitete Proben für die GC/MS _________________________________________________ 65
Abbildung 22: Mensacarcin ___________________________________________________________________ 73
Abbildung 23: Didesmethylmensacarcin _________________________________________________________ 73
Abbildung 24: Positionierung der einzelnen Gene im Biosynthesegencluster von Didesmethylmensacarcin (36820
bp) Gene, die für Proteine derselben Enzymklasse codieren sind jeweils in gleicher Farbe dargestellt. Das Cluster
beinhaltet die minimale PKS (MsnK1-K3, grün), Cyclasen (MsnC1-C3, blau) Oxidoreduktasen (MsnO1-O11, rot).
Regulatorische Aufgaben übernehmen MsnR1 und MsnR2. MsnH0-H8 codieren für Proteine mit einer bis zum
jetzigen Zeitpunkt unbekannten Funktion [28]. ___________________________________________________ 74
139
Anhang
Abbildung 25: Darstellung des hypothetischen Biosynthesewegs, der von K. Probst für den Sekundärstoff
Didesmethylmensacarcin postuliert wurde [1]. Die im Rahmen der Arbeit von K. Probst untersuchten Proteine
sind blau hinterlegt. MsnO2, das im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde ist rot hinterlegt. Die Funktion von
MsnO1, MsnO10 und MsnO11 wurde nicht aufgeklärt. Ihre Funktionen wurden anhand von bekannten
Enzymen, welche durch Vergleich der Aminosäuresequenz (blastp) gefunden wurden vorhergesagt [1]. _____ 74
Abbildung 26: Analytische Agarose-Gelelektrophorese der Kontroll-PCR für die Inaktivierung von msnO2 auf
Cos2. Die erhaltenen PCR-Produkte bei Verwendung von Cos2 (Bahn 1), Cos2ΔO2_spec (Bahn 2 und 3)
beziehungsweise Cos2ΔO2 (Bahn 4) als Matrize sind gezeigt. Die Größen der DNA-Fragmente sind 1750 bp für
Cos2, 637 bp für Cos2ΔO2 und 1480 bp für Cos2ΔO2_spec. Als Größenstandard diente eine 1 kb DNA Ladder der
Firma Promega (L). _________________________________________________________________________ 75
Abbildung 27: HPLC-Chromatogramme (λ = 254 nm) der Rohextrakte von S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1 (oben) und
S. albus x Cos2 x pKR1 (unten). Im Rohextrakt von S. albus x Cos2ΔO2 x pKR1 wurde ein neuer
Sekundärmetabolit mit der Retentionszeit von 19,8 min detektiert (Msn-UH). Didesmethylmensacarcin (DDM)
wurde im Rohextrakt von S. albus x Cos2 x pKR1 nachgewiesen. _____________________________________ 77
Abbildung 28: UV- Spektren von Didesmethylmensacarcin mit den Hauptmaxima bei 230, 267 und 326 nm
(links) und Msn-UH, Hauptmaxima bei 228, 257 und 432 nm (rechts). _________________________________ 78
Abbildung 29: MS-Spektrum (Negativmodus) des Substanzpeaks von Msn-UH im Rohextrakt von S. albus x Cos2
x pKR1. ___________________________________________________________________________________ 78
Abbildung 30: HPLC Diagramm der 90 % Fraktion nach SPE _________________________________________ 79
Abbildung 31: DC zur präparativen Auftrennung der 90 %-Fraktion der Festphasenextraktion. Bande I, RfWert = 0,85 (obere dunkelgelb gefärbte Bande), Bande II, Rf-Wert = 0,80 (untere breite Bande, hellgelb). MsnUH konnte in Bande I nachgewiesen werden. ____________________________________________________ 80
Abbildung 32: HPLC Diagramm der mit Methanol extrahierten Bande der präparativen DC mit dem
Rf-Wert = 0,85. Substanzpeak von Msn-UH bei 19,7 min sowie die Signale der Verunreinigungen sind zu sehen.
_________________________________________________________________________________________ 80
Abbildung 33: UV Absorptionsspektrum bei 254nm von Msn-UH nach präparativer HPLC _________________ 81
Abbildung 34: MS-Spektrum (Negativmodus) des Substanzpeaks von Msn-UH nach präparativer HPLC ______ 81
1
Abbildung 35: H-NMR-Spektrum von Msn-UH ___________________________________________________ 83
Abbildung 36: Strukturvorschlag für Msn-UH. ____________________________________________________ 83
Abbildung 37: Glukose-Abbau zu Pyruvat in Z. mobilis (Entner-Doudoroff-Weg) und in S. cerevisiae (EmbdenMeyerhof-Parnas-Weg). Pyruvat wird unter Katalyse des Enzyms Pyruvatdecarboxylase (Pdc) zum Acetaldehyd
decarboxyliert. Dieses wird mit Hilfe der Alkoholdehydrogenase (AdhB) schließlich zu Ethanol verstoffwechselt.
_________________________________________________________________________________________ 86
Abbildung 38: Ethanolproduktion von S. coelicolor+adh+pdc und S. fradiae+adh+pdc in NL111 und E1-Medium.
Es wurden zum Vergleich die entsprechenden Referenzkulturen (S. coelicolor x pUWL-H und S. fradiaex pUWL-H)
in E1 und NL111-Medium fünf Tage lang kultiviert. ________________________________________________ 91
Abbildung 39: Alkoholdehydrogenasereaktion ____________________________________________________ 92
140
Anhang
Abbildung 40: Darstellung des Produktionsverlaufes von S. coelicolor+adh+pdc und der Referenzkultur
S. coelicolor x pUWL-H in NL111-Medium über neun Tage. __________________________________________ 93
Abbildung 41: Ethanolkonzentration [mg/L] unter aeroben sowie semianaeroben Kulturbedingungen in den
Produktionskulturen von S. coelicolor+adh+pdc (grüne Säule) und S. fradiae+adh+pdc (violette Säule). Zum
Vergleich jeweils die Referenzkulturen (Ethanolkonzentration jeweils <10 mg/L, blaue beziehungsweise rote
Säule). Die Produktion erfolgte über sieben Tage in NL111-Medium. __________________________________ 94
Abbildung 42: Ethanolstoffwechsel in Morella sp. HUC22-1 mit den von Aldh und Adh katalysierten Reaktionen.
_________________________________________________________________________________________ 96
Abbildung 43: Verlauf der Ethanolproduktion über einen Zeitraum von neun Tagen in NL111-Medium bei
Coexpression von adhB, pdc und aldh in S. coelicolor+adh+pdc x pNL1-aldh. Zum Vergleich wurden
S. coelicolor x pUWL-H, S. coelicolor+adh+pdc und S. coelicolor+adh+pdc+pNL1 untersucht. _______________ 98
Abbildung 44: Ethanolproduktion über einen Zeitraum von neun Tagen in NL111-Medium bei Coexpression von
adhB, pdc und aldh in S. coelicolor+adh+pdc x pNL-aldh. Zum Vergleich wurde S. coelicolor x pUWL-H,
S. coelicolor+adh+pdc und S. coelicolor+adh+pdc+pNL1 angezogen. __________________________________ 98
Abbildung 45: Grafische Darstellung der Ethanolproduktion von S. coelicolor+adh+pdc in NL111-Medium und
Zusatz von 2,5 % [m/V] Glukose unter aeroben sowie semianaeroben Bedingungen. Zum Vergleich jeweils die
Werte der Referenzkulturen S. coelicolor x pUWL-H. ______________________________________________ 100
Abbildung 46: Grafische Darstellung der durchschnittlichen Ethanolproduktion [mg/L] bei Anreicherung des
Produktionsmediums (NL111 + 2,5 % Glukose) mit Pyruvat. Die Kulturen wurden jeweils mit und ohne Pyruvat
sowie unter aeroben (linke Gruppe) und semianaeroben Bedingungen (rechte Gruppe) inkubiert. S. coelicolor x
pUWL-H (blau ohne Pyruvat, rot mit Pyruvat), S. coelicolor+adh+pdc (grün ohne Pyruvat, violett mit Pyruvat) 101
Abbildung 47: Ergebnis des analytischen Verdaus von pUWL-H-apf (Bahn 2) und pUWL-H-ap (Bahn 1) mit dem
Restriktionsenzym NcoI _____________________________________________________________________ 102
Abbildung 48: Grafische Darstellung der gemessenen Ethanolmengen bei Coexpression von adhB, pdc und fdh
unter aeroben sowie semianaeroben Bedingungen. Die Ethanolkonzentration [mg/L] für S. coelicolor x pUWL-H,
S. coelicolor+adh+pdc, S. coelicolor+adh+pdc+fdh sind dargestellt. Zum Vergleich die Ethanolkonzentration bei
Zugabe von 20 mmol/L Formiat zu Kulturen von S. coelicolor+adh+pdc (F) und S. coelicolor+adh+pdc+fdh (F) 105
Abbildung 49: Grafische Darstellung der Ethanolkonzentration bei Expression von adhB und pdc in S. coelicolor
M1154 über einen Zeitraum von neun Tagen in NL111-Medium (+2,5 % Glukose) jeweils unter aeroben sowie
semianaeroben Bedingungen. Als Referenz diente S. coelicolor M1154 x pUWL-H ______________________ 107
Abbildung 50: Grafische Darstellung der Ethanolkonzentration bei Expression von adhb und pdc in S. coelicolor
M1154 über einen Zeitraum von 12 Tagen in NL111-Medium (+2,5 % Glukose) jeweils unter aeroben sowie
semianaeroben Bedingungen. S. coelicolor M1154 x pUWL-H diente als Referenz ______________________ 107
Abbildung 51: S. coelicolor M1154 x pUWL-H (blaue Säulen) und S. coelicolorM1154+adh+pdc wurden unter
aeroben sowie semianaeroben Bedingungen kultiviert. S. coelicolor M1154+adh+pdc wurde jeweils mit (graue
Säulen) und ohne (rote Säulen) Zusatz von Pyruvat (4,5 mmol/L) zum Produktionsmedium (NL111 + 2,5 %
Glukose) kultiviert. _________________________________________________________________________ 109
141
Anhang
Abbildung 52: Vereinfacht dargestellter Butanol-Biosyntheseweg von Clostridium acetobutylicum. Als
bifunktionelles Enzym katalysiert das von adhe (oder adhe1) codierte Protein die Umwandlung von Butyryl-CoA
(Funktion einer Butyraldehyd-Dehydrogenase) zu Butyraldehyd sowie die nachfolgende Reduktion zu Butanol
(Funktion einer Butanol-Dehydrogenase)[67]. ___________________________________________________ 111
Abbildung 53: Reaktion der Saccharoseutilisation. Durch das Enzym Saccharose-Synthase (Susy) wird die
Spaltung von Saccharose zu UDP-Glukose und Fruktose wie auch die Rückreaktion der Saccharosesynthese
katalysiert. _______________________________________________________________________________ 112
Abbildung 54: Didesmethylmensacarcin ________________________________________________________ 117
Abbildung 55: Strukturvorschlag für Msn-UH ____________________________________________________ 118
Abbildung 56: Msn-KP3´. Sekundärmetabolit der bei Expression von S. albus x Cos2ΔO4 x pKR1, der
Deletionsmutante des Gens msnO4 gebildet wird [1]. _____________________________________________ 119
Abbildung 57: Postulierter Biosyntheseweg für Didesmethylmensacarcin unter Berücksichtigung der
Informationen aus der Arbeit von K. Probst [1] und den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen zur Funktion
von MsnO2. Msn-UH wurde als neuer Metabolit im Kulturüberstand der Deletionsmutante von MsnO2
identifiziert. MsnO2 wurde für die Einführung der Doppelbindung an C12/C13verantwortlich gemacht. ____ 122
Abbildung 58: Vereinfacht dargestellter Butanol-Biosyntheseweg in Clostridium acetobutylicum. Rot hinterlegt
sind die Teilreaktionen (Umwandlung von Butyryl-CoA zu Butyraldehyd sowie die nachfolgende Reduktion zu
Butanol), welche durch das von adhe (oder adhe1) codierte bifunktionelle Enzym katalysiert werden. Grau
hinterlegt sind potentiell wichtige Enzyme, um die Butanolproduktion in Streptomyceten zu ermöglichen. __ 124
142
Danksagung
Danken möchte ich,
Prof. Dr. Andreas Bechthold, der mir die Möglichkeit zur Anfertigung dieser Arbeit gab. Für
die Unterstützung und Hilfe sowie für seine Geduld und sein Verständnis.
Prof. Dr. Thorsten Friedrich für die Übernahme des Korreferats
Jun.-Prof. Dr. Stefan Günther, das er als Drittprüfer zur Verfügung stand
Elisabeth Welle für ihre stets große Hilfsbereitschaft bei Problemen aller Art. Vor allem für
die kompetente Unterstützung bei der Durchführung von SPE, DC und HPLC.
Dr. Marta Luzhetska, für ihre Betreuung während ihrer Zeit in Freiburg.
Frau Weber für die Ruhe im Büro und einigen hilfreichen Tips aus ihrer langjährigen
Laborerfahrung.
Dr. Lutz Petzke für die Korrekturlesung.
Tina Strobel, Sarah Maier und Julia Wunsch-Palasis, die mir ebenfalls bei der Korrektur
geholfen haben.
Suzan Samra für ihre große Hilfe beim Formatieren dieser Arbeit.
Arne Gässner für die Durchführung der HPLC Messungen sowie seine große Hilfe bei der
Auswertung von NMR-Spektren.
Dr. R. Murillo (Universität von Costa Rica) für die Interpretation von NMR-Spektren
Allen Mitarbeitern des Arbeitskreises von Professor Dr. Andreas Bechthold, die mich
während meiner Promotion begleitet und unterstützt haben
Meinen Eltern, für ihre Unterstützung, ihre Hilfe und ihr großes Vertrauen, das ich von ihnen
immer erfahren habe.
Meiner Frau Simone und Paula, die mir aus unendlich vielen Motivationstiefs geholfen haben
und immer für mich da sind.
143
Bildungsgang
1983 – 1987
Grund- und Hauptschule Münsingen
1987 – 1996
Gymnasium Münsingen, Abschluss Abitur
1998 – 2005
Studium der Pharmazie
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
2006
3. Staatsexamen Pharmazie und Approbation als Apotheker
2007
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Diplomarbeit
SaqGT1
und
„Heterologe
SaqGT2
Expression
des
der
Glykosyltransferasen
Saquayamycin
Z-Produzenten
Micromonospora sp. TÜ6368
2007-2012
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Arbeiten zur vorliegenden Dissertation
144