Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie (ESR) von Albumin bei
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Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. Benno Mann Dienstort: Augusta-Kranken-Anstalt Bochum Klinik für Allgemein- und Visceralchirurgie Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie (ESR) von Albumin bei Patienten mit benignen und malignen kolorektalen Erkrankungen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Ellen Welsing aus Essen 2009 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: PD Dr. med. B. Mann Korreferent: Prof. Dr. S. Hahn Tag der mündlichen Prüfung: 08.12.2009 Für meine Kinder Justus, Vinzent und Konstantin 1 1. Einleitung 6 1.1 Epidemiologie des kolorektalen Karzinoms 6 1.2 Ätiologie des kolorektalen Karzinoms 6 1.3 Prognostische Faktoren beim kolorektalen Karzinom 7 1.4 Screeningmethoden und Prävention beim kolorektalen 8 Karzinom 1.5 Serologische Biomarker - Definitionen und 9 Anforderungen 1.6 Biologische Marker beim kolorektalen Karzinom 11 1.7 Klinische Problematik bei Biomarkern 12 1.8 Potentielle Rolle des Albumins als biologischer Marker 14 1.9 Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie 15 Untersuchung von (ESR) zur Konformationsänderungen des Serumalbumins 1.10 Fragestellung der Arbeit 16 2. Methodik 18 2.1. Patientenrekrutierung 18 Definition der Einschlusskriterien 2.2 Untersuchte Patientenkollektive 19 2 2.3 Erfasste Parameter 22 2.3.1 Albuminkonzentration präoperativ/-interventionell 22 2.3.2 CEA präoperativ bei Patienten mit Karzinomen 22 2.3.3 Determination Ratio (DR-Wert) 24 2.3.3.1 Probenverarbeitung 24 2.3.3.2 Testdurchführung 24 2.3.3.3 Testauswertung 25 2.3.4 Postoperative/-interventionelle Komplikationen 29 2.4 Statistik 29 3. Hauptteil mit Darstellung der Ergebnisse 30 3.1 Korrelationen der untersuchten Parameter mit 30 Konformationsänderungen des Albumins 3.1.1 Alter und Geschlecht 30 3.1.2 Albuminkonzentration 30 3.1.3 Konformationsänderungen des Albumins bei benignen 31 und malignen Erkrankungen des Kolorektums 3.1.3.1 Konformationsänderungen des Albumins bei Patienten 31 mit benignen Erkrankungen 3.1.3.2 Konformationsänderungen des Albumins bei Patienten mit malignen Erkrankungen im Vergleich zu benignen Erkrankungen 33 3 3.1.3.3 a) Karzinome vs. Adenome und Divertikulitis 33 b) Karzinome UICC-Stadium I vs. Adenome 35 Albumin-ESR bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen 37 – Korrelation mit dem UICC-Stadium 3.1.3.4 Korrelation der Konformationsänderungen mit CEA 38 3.1.3.5 Unterscheidung zwischen malignen und entzündlichen 40 Erkrankungen 3.1.3.6 Postoperative Ergebnisse der Albumin-ESR 42 3.1.3.6.1 bei Patienten mit Divertikulitis und Adenomen 42 3.1.3.6.2 bei Patienten mit Karzinomen 45 3.1.3.7 Korrelation der Albumin-ESR mit postoperativen 45 Komplikationen a) Major-Komplikationen 46 b) Minor-Komplikation 47 4. Diskussion 4.1 ESR als 49 Methode zur Bestimmung der 49 Konformationsänderung des Albumins 4.2 Biologische Tumormarker beim kolorektalen Karzinom 50 4.3 Albumin – physiologische Aufgaben und Alterationen 52 beim Malignom 4.4 Einfluss von demographischen und krankheitsbezogenen Parametern auf die Albumin-ESR mit 54 4 spinmarkierten Fettsäuren 4.5 Patienten mit Adenomen und Divertikulitis weisen in der 54 ESR ein anderes Spektralmuster auf als Patienten mit Karzinomen 4.6 Postoperative Veränderungen der ESR-Spektren 56 4.7 Die Änderung der ESR-spektroskopisch messbaren 57 Albuminkonformation korreliert mit dem Tumorstadium bei den UICC-Stadien I-III 4.8 Korrelation der ESR mit CEA 59 4.9 Cut-off-Wert der Determination ratio zur Unterscheidung 60 zwischen benignen und malignen Erkrankungen 4.10 Potentielle Rolle der Albumin-ESR zur Detektion von 61 kolorektalen Karzinomen 5. Zusammenfassung und Aussicht 63 6. Literaturverzeichnis 64 7. Anhang 78 Danksagung Lebenslauf 5 Abkürzungsverzeichnis 5-FU 5-Fluorouracil 5-JÜR 5-Jahres-Überlebensrate AJCC American Joint Committee on Cancer APC Adenomatous polyposis coli AWMF Arbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen Medizinischen Fachgesellschaften CA19-9 Carcinogenes Antigen 19-9 CEA Carcinoembryonales Antigen CT Computertomographie DR Determination ratio ESR Elektron-Spin-Resonanz FAP Familiäre adenomatöse Polyposis FOBT Fecal occult blood testing FOLFOX adjuvantes Chemotherapieregime für das Kolonkarzinom, bestehend aus 5-FU, Folinsäure und Oxaliplatin G Grading GEKID Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. hg Adenom mit hochgradiger Dysplasie (high grade) HNPCC Hereditäres nichtpolypöses Coloncarcinom Khz Kiloherz KRK Kolorektales Karzinom L Lymphatische Invasion lg Adenom mit leichter Dysplasie (low grade) m molar mM milimolar M Fernmetastasierung MMR Mismatch repair MMS Molecular mobility structure MRT Magnetresonanztomographie mW Mikrowatt N Lymphknotenstatus NIH National Institutes of Health PME Partielle mesorektale Exzision pN histopathologischer Lymphknotenstatus pT histopathologische Tumorinfiltration SIRS Systemic Inflammatory response syndrome T Thesla TME Totale mesorektale Exzision UICC Union Internationale Contre le Cancer 6 1. Einleitung 1.1. Epidemiologie des kolorektalen Karzinoms Karzinome des Kolons und des Rektums sind in Deutschland bei Frauen nach dem Mammakarzinom die zweithäufigste und bei Männern nach dem Bronchialkarzinom und Prostatakarzinom die dritthäufigste maligne Erkrankung. Bei beiden Geschlechtern ist das kolorektale Karzinom (KRK) die zweithäufigste Todesursache unter den Neoplasien. Die Neuerkrankungsrate liegt in Deutschland für Männer bei über 27.000 pro Jahr, für Frauen bei nahezu 30.000 pro Jahr. Legt man diese Zahlen zugrunde, hat Deutschland verglichen mit anderen europäischen Ländern bei Männern und Frauen die höchste Inzidenz. Seit Mitte der 80er Jahre steigt die Neuerkrankungsrate nicht mehr weiter an. Männer erkranken im Mittel mit etwa 67 Jahren, Frauen mit etwa 72 Jahren. Die Mortalität beträgt in Deutschland etwa 30-35/100.000 beim männlichen und 20-25/100.000 beim weiblichen Geschlecht. Das Lebenszeitrisiko, an einem KRK zu erkranken, liegt bei etwa 4-6%, an einem solchen Tumor zu sterben, bei etwa 2,5-3%. Die relative 5-JahresÜberlebensrate liegt für Männer und Frauen bei 56% (Krebs in Deutschland 2003-2004. 6. überarbeitete und aktualisierte Ausgabe. Robert-Koch-Institut und die Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. Berlin. 2008). Das KRK wird häufig in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert mit entsprechend schlechter Prognose. Die Diagnosestellung in einem frühen Stadium ist gleichbedeutend mit guter Prognose und besserer Lebensqualität. 1.2. Ätiologie des kolorektalen Karzinoms Die Ursachen des sporadischen KRK sind multifaktoriell und beinhalten Ernährung, Genussmittel und Lebensstil. Als Risikofaktoren gelten dabei Zufuhr von Fett und tierischem Eiweiß in größeren Mengen in Verbindung mit 7 ballaststoffarmer Kost, Nikotinabusus, Übergewicht und geringer körperlicher Aktivität (Kahi et al., 2008). Bei 5-10% aller KRK-Fälle liegen primär genetische Defekte als Ursache vor. Bei der Familiären adenomatösen polyposis (FAP) ist die Keimbahnmutation des adenomatösen polyposis coli (APC) Gens auf dem langen Arm des Chromosoms 5, beim Hereditären nichtpolypösen Kolonkarzinom (HNPCC) die Mutation in den DNA-Reparatur-Genen (mismatch-repair Genen) hMLH1, hMSH2, hPMS1 und hPMS2 ursächlich (Lynch et al, 2003). Daraus resultieren Mikrosatelliteninstabilitäten (MSI) des Genoms, welche auch eine Rolle bei der Ätiologie sporadischer Tumore spielen können (Kinzler, 1996, Rhyu, 1994). Insgesamt werden bei 20 % aller Fälle familiäre Dispositionen verantwortlich für das Entstehen eines KRK gemacht, wobei nicht immer strikte Kriterien für hereditäre Karzinome erfüllt werden (Lynch et al., 2003). Die Adenom-Karzinom-Sequenz mit entsprechender Akkumulation von genetischen Defekten ist die Basis für das Entsehen eines KRK. An den genetischen Veränderungen sind eine Reihe von Onkogenen (k-ras, c-myc, cneu, c-erb-2, c-src), als auch Tumorsuppressorgene (APC, DCC, DPC4/Smad4, p53, nm32) beteiligt (Fearon et al., 1990, Lynch et al., 2003). 1.3 Prognostische Faktoren beim KRK Abgesehen von patientenbezogenen Faktoren wie Alter, Geschlecht und Lebensgewohnheiten können prognostische Faktoren in weitere zwei große Gruppen eingeteilt werden: 1. Behandlungsbezogene Faktoren und 2. Tumorbezogene Faktoren. Hinsichtlich der behandlungsbezogenen Faktoren ist die Anzahl der bei der radikal onkologisch durchgeführten Operation gewonnenen Lymphknoten ein wesentlicher Parameter. Es ist gezeigt worden, dass Patienten von einer ausreichenden Lymphknotenausbeute im Sinne einer besseren Prognose profitieren. Dies liegt zum einen an der präziseren histopathologischen Stadieneinteilung, zum anderen vermutlich am therapeutischen Effekt der Lymphadenektomie als solcher (Chang et al., 2007). Hinsichtlich der tumorbezogenen Faktoren ist die Kategorieeinteilung durch das TNM-System der UICC die Basis für therapeutische Entscheidungen. Entscheidend ist hierbei hinsichtlich Prognose der Befall von Lymphknoten und 8 Fernmetastasen. Das TNM-Staging-System erlaubt jedoch keine präzise Aussagekraft mit prädiktivem Wert hinsichtlich der Prognose des einzelnen Patienten. Daher wurden bereits viele Studien zur molekularen Charakterisierung von Tumoren durchgeführt. Dies hat zu einer Beschreibung einer Reihe von molekularen Markern im Tumorgewebe geführt (Compton et al., 2003, Kahlenberg et al., 2003, Galizia et al., 2004, Rau et al., 2003, Diep et al., 2003, Gertler et al., 2004, Klump et al., 2004, Graziano et al., 2003, Popart et al., 2004, Kahi et al., 2008). Keiner dieser Faktoren hat sich allerdings in der klinischen Praxis hinsichtlich prognostischer Aussagekraft durchgesetzt. 1.4. Screeningmethoden und Prävention beim KRK Das Screening mindert effektiv die Mortalität des KRK. Aufgrund der Sanierbarkeit von Präkanzerosen und der kurativen therapeutischen Ansätze in frühen Tumorstadien, kann die Vorsorge sowohl die Inzidenz als auch die Mortalität der Erkrankung reduzieren (Walsh et al., 2003). Eine gebräuchliche, nicht-invasive Screeningmethode für das KRK ist die Untersuchung auf okkultes Blut im Stuhl (FOBT) ab dem 50. Lebensjahr, wobei die Peroxidaseaktivität des Hämoglobins gemessen wird. In einer Metaanalyse für diese Untersuchung konnte eine Reduktion der Mortalität um 23% gezeigt werden. Es wurden Daten von über 400.000 Personen ausgewertet (Towler et al., 1998) Jedoch ist die Sensitivität und Spezifität mangelhaft. In Kombination mit einer Sigmoidoskopie steigt die Rate der richtig positiven Ergebnisse (Kahi et al., 2008, Winaver et al.,2003). Die Mortalität lässt sich durch Einbeziehen der Sigmoidoskopie in das Screening asymptomatischer Personen um 60-80% senken (Kahi et al., 2004, Winaver et al., 2003). Nach prospektiven Studien vermag die komplette Koloskopie, ggf. mit Polypektomie, die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms um 76-90% zu vermindern (Müller et al., 1995). Obwohl der Gebrauch des endoskopischen Screenings steigt, fehlt die Akzeptanz in der Bevölkerung und die Bereitschaft, sich dieser Prozedur zu unterziehen (Frazier et al., 2000). Würde der Empfehlung der WHO, asymptomatische Personen ohne erhöhtes Risiko ab dem 50. Lebensjahr alle 5 Jahre sigmoidoskopisch zu untersuchen, Folge geleistet werden, ließe sich die Sterblichkeit des kolorektalen Karzinoms um mehr als die Hälfte senken (Lehnert et al.,1999). 9 Eine hypothetische Berechnung ergab eine Reduktion der KRK-Inzidenz von 60 % und eine 80%ige Reduktion der Mortalität (Frazier et al., 2000). In einer aktuellen Studie (Baxter et al., 2009) konnte gezeigt werden, dass die Koloskopie insbesondere die Wahrscheinlichkeit, ein linksseitiges Kolonkarzinom zu entwickeln, reduzieren kann. Eine soeben veröffentlichte Studie aus Heidelberg untersuchte die geschätzte Reduktion der Inzidenz des KRK durch die Screening-Koloskopie. Eine Analyse von 1,875708 Patienten erbrachte eine Verringerung der KRK-Fälle um 15000 zwischen 2003 und 2010 durch Anwendung der Screening-Koloskopie (Brenner et al., 2009). Andere nicht-invasive Untersuchungsverfahrens des Stuhls, wie die DNAAnalyse, haben sich bislang aufgrund hoher Kosten und fehlender Daten nicht durchsetzen können (Traverso et al., 2002, Davis et al., 2005, Imperiale et al., 2004). Die Entwicklung einer Serumuntersuchung zur Erfassung des persönlichen Risikos, ein KRK zu entwickeln, wäre sehr effizient und hilfreich. Bislang gibt es Untersuchungen zum „loss of imprinting“ des Insulin growth factor II Gens (IGF2). Der Verlust dieses Gens ist bei Patienten mit kolorektalem Adenom viermal und bei Patienten mit KRK 18 mal höher als in der gesunden Normalbevölkerung (Renehan et al., 2004, Cruz-Correa et al., 2004). In zwei aktuellen Studien (Leman et al., 2007, Leman et al., 2008) wurde gezeigt, dass die Nuklear Matrix Proteine CCSA-2, CCSA-3 und CCSA-4 eine exzellente Sensitivität für Patienten mit KRK aufwiesen, bei jedoch kleiner Fallzahl. Allerdings gibt es bislang kein serologisches Untersuchungsverfahren, welches mit hoher Sensitivität und Spezifität im Sinne eines Screening-Testes breit angewandt werden kann. Wünschenswert wäre ein solcher serologischer Marker, der ein effizientes Screening ermöglichen, bzw. unterstützen könnte. 1.5. Serologische Biomarker - Definitionen und Anforderungen Biologisch handelt es sich bei serologischen Markern – häufig auch als Tumormarker bezeichnet - meistens um Proteine mit einem Lipid- oder Kohlenhydratanteil. zirkulierenden Diese im Makromoleküle Blut und können in anderen Körperflüssigkeiten Abhängigkeit von bösartigen 10 Erkrankungen in unterschiedlicher Konzentration gemessen werden. Dabei können das Vorhandensein und das Wachstum von Neoplasien eine entscheidende Rolle für die Konzentration der Marker spielen. Tumormarker werden entweder direkt von der Tumorzelle oder indirekt durch die Induktion anderer Zellen produziert (Kelloff et al., 2006). Abzugrenzen Gewebemarker von serologischen („tissue Markern factors“), („biochemical welche factors“) anhand sind bspsw. immunhistochemischer Untersuchungen am Tumorgewebe analysiert werden. Ursächlich für die gesteigerte oder veränderte Nachweisbarkeit von serologischen Markern können Genmutationen und die vermehrte Expression von Onkogenen sein, da diese eine Veränderung der Serumkonzentration oder der strukturellen Konfiguration von bestimmten serologischen Tumormarkern zur Folge haben können (Kelloff et al., 2006). Inhaltlich unterschieden werden muss bei serologischen Biomarkern zwischen diagnostischen, prädiktiven und prognostischen Markern. Hinsichtlich diagnostischer Marker wäre ein Faktor erstrebenswert, der zum einen mit großer Sensitivität und Spezifität eine Aussage über das Vorhandensein einer Tumorerkrankung noch vor der klinischen Manifestation zulässt. Ziel dabei ist es auch, molekulare Faktoren zu identifizieren, die mittels kostengünstiger, einfacher, reproduzierbarer Tests das Vorhandensein einer malignen Erkrankung in einem frühen Tumorstadium erlaubt. Prädiktive Marker werden als identifizierende Marker, welche eine Vorhersage zum Ansprechen einer bestimmten Therapie erlauben, benutzt (Kelloff et al., 2006). Dabei wäre es wünschenswert, mithilfe eines geeigneten Markers eine Gruppierung von Patienten mit und ohne Risikofaktoren herzustellen, wodurch neue Therapiestrategien angepasst werden könnten. Ein prognostischer Marker liefert eine Korrelation zum Überleben bzw. krankheitsfreiem Überleben. Dabei definiert McLeod 1999 einen Prognosefaktor als eine Variable, die 1. Informationen über das Gesamtüberleben gibt 2. die Erkenntnisse der histopathologischen Untersuchung ergänzt und 3. therapeutische Konsequenzen hat 11 Um als klinisch relevant eingestuft werden zu können, müsste ein neuer Prognosefaktor laut Duffy verschiedene Anforderungen erfüllen (Duffy et al., 2007): 1. er muss unabhängig von Staging-Systemen sein, 2. ein Indikator für ein schlechteres Überleben darstellen und / oder 3. zusätzliche prognostische Informationen zu den etablierten Staging-Systemen (UICC) liefern. Zusammenfassend sollte der ideale „Tumormarker“ ein prädiktives Instrument darstellen, der zudem eine frühe Detektion einer malignen Erkrankung erlaubt und ein therapeutisches Monitoring unterstützt, bzw. Therapieschemata beeinflussen kann. 1.6. Biologische Marker beim KRK 80 % der malignen kolorektalen Tumoren exprimieren das tumorassoziierte Antigen CEA (Carcinoembryonales prognostischer Faktor und Antigen). Seine Wertigkeit als Verlaufsparameter konnte durch zahlreiche Untersuchungen gezeigt werden (Carpelan-Holmström et al.,1995, Bermann et al., 2000, Locker et al., 2006, Bakalakos et al., 1999). 1965 wurde es von Gold und Freedman in embryonalem Gewebe und Lebermetastasen von Kolonkarzinomen erstmalig beschrieben. CEA ist der am meisten verwendete und gut verfügbare Tumormarker beim Management des KRKs. Erhöhte präoperative Serum-CEA-Werte sind mit erhöhtem Rezidivrisiko und schlechter Prognose assoziiert (Park et al., 2006). Dabei ist die prognostische Aussage der Serum-CEA-Werte unabhängig vom Stadium der Lymphknotenmetastasierung (Park et al., 2006, Wanebo et al., 1978). Allerdings ist das CEA gerade in den frühen Stadien des KRK mit einer sehr niedrigen Sensitivität und Spezifität ausgestattet (Goldstein et al., 2005). In der Früherkennung lässt es sich ebenfalls nicht einsetzen (Watine et al., 2001). Bezüglich der Berücksichtigung der präoperativen CEA-Konzentration bei Staging und Prognose des kolorektalen Karzinoms gab es in den letzten Jahren Neuerungen in den Protokollen der AJCC. Die Höhe der CEA-Freisetzung zum 12 Zeitpunkt der Primärtherapie steht in ausgeprägter Korrelation zum Tumorstadium (Hasholzner et al., 1999) und sollte laut den Empfehlungen der AJCC in der TNM-Klassifikation berücksichtigt werden (Compton et al., 2000). Basierend auf den Ergebnissen mehrerer multivariater Studien wurde das CEA von einem Expertenausschuss amerikanischer Pathologen als Prognosemarker der höchsten Kategorie I eingestuft (Henson et al., 1995). In den aktuellen Leitlinien der AWMF wird die Bestimmung präoperativer CEA-Konzentrationen sowohl für die Tumornachsorge als auch für die Prognoseabschätzung beim kolorektalen Karzinom empfohlen. Andere, breit untersuchte Substanzen haben sich in ihrer Wertigkeit nicht durchsetzen können: CA 19-9 stellt den Tumormarker der „zweiten Wahl“ dar. Hinsichtlich der Sensitivität und Spezifität ist CA 19-9 dem CEA unterlegen (Filella et al., 1994) und auch die Untersuchung der kombinierten Bestimmung beider Tumormarker ergab keine Vorteile gegenüber der isolierten CEABestimmung (Forones et al., 1999). Wird bei einem Patienten CEA nicht im Blut freigesetzt, so kann allerdings CA 19-9 als Tumormarker in Betracht gezogen werden. Im Vergleich zur Tumornachsorge ist CA 19-9 für die Prognoseabschätzung kolorektaler Karzinome von größerer Bedeutung. In mehreren Studien hatte dieser Tumormarker einen vom Tumorstadium unabhängigen und signifikanten Einfluss auf das rezidivfreie Intervall und das Überleben (Diez et al., 1994, Behbehani et al., 2000, Reiter et al., 2000, Nakagoe et al., 2003). In einer Übersichtsarbeit von Hundt et al. (2007) werden Arbeiten über serologische Biomarker zur Detektion von KRK ausgewertet. Dabei wurde die Literatur hinsichtlich Publikationen über biologische Marker auf Protein-, Kohlenhydrat-, Fett-, mRNA- und DNA-Ebene analysiert. Dabei zeigte sich eine breite Varianz in der publizierten Spezifität und Sensitivität der einzelnen Marker. 1.7. Klinische Problematik bei Biomarkern Bislang bietet der Status der Lymphknotenmetastasierung die wichtigste prognostische Wertigkeit beim KRK. Onkologisch radikal an einem 13 Kolonkarzinom operierte Patienten mit Lymphknotenbefall (N+/UICC Stadium III) werden einer adjuvanten Chemotherapie zugeführt. Operierte Patienten mit nodal nicht metastasiertem Primärtumor (pN0) weisen eine deutlich verbesserte 5-JÜR-Rate auf, verglichen mit Patienten, bei denen ein oder mehrere Lymphknoten befallen sind (pN1, pN2) (Ries et al., 2000, Le Voyer et al., 2003). Des Weiteren ist bekannt, dass Patienten mit Rektumkarzinom und positiven Lymphknoten häufiger ein Lokalrezidiv erleiden, als Patienten ohne Lymphknotenbefall (McCall et al., 1995). Beim lymphknotenpositiven Tumor (UICC St. III) stellt die adjuvante Chemotherapie beim Kolonkarzinom einen signifikanten Überlebensvorteil dar (Moertel et al., 1990) Das Standardregime besteht neuerdings in der Gabe von Oxaliplatin im Rahmen des sogenannten FOLFOX-Schemas, welches im klinischen Alltag weite Verbreitung gefunden hat (André et al., 2004, Wolpin and Meyer, 2008). Bislang hat sich im UICC-Stadium II beim Kolonkarzinom noch keine adjuvante Chemotherapie durchgesetzt. Es gibt jedoch Untergruppen von Patienten in diesem Stadium, die ein Rezidiv mit dementsprechend schlechter Prognose entwickeln (Gill et al., 2004 Benson et al., 2004, Figueredo et al., 2004, Wolpin et Meyer, 2008). Andererseits gibt es innerhalb des UICC-Stadiums III deutliche Schwankungen im Gesamtüberleben betroffener Patienten (Benson et al., 2004, Figueredo et al, 2004). So gibt es eine Vielzahl von Patienten, die offensichtlich nicht von einer applizierten adjuvanten Chemotherapie profitieren (Benson et al., 2004, Figueredo et al., 2004). Wie oben aufgeführt, wurden bereits eine Reihe von molekularen Faktoren hinsichtlich ihrer prognostischen Aussagekraft untersucht. Hinsichtlich Ansprechen auf eine chemotherapeutische Behandlung wurden ähnliche Faktoren analysiert, um zum Einen Untergruppen von Patienten mit einem hohen Risiko für ein Rezidiv nach onkologisch radikaler Operation zu identifizieren, und zum Anderen diejenigen Patienten zu identifizieren, die von einer Chemotherapie profitieren (Responder). Zu diesen potentiellen Markern zählen: Zellproliferationsinidices (Ki-67, Mib-1, proliferating cell nuclear antigen), Onkogene bzw. Tumorsuppressorgene (p53, K-ras, deleted in colorectal cancer-DCC, Bcl-2, c-erbB2) (Compton et al., 2003, Hundt et al., 2007), DNA-Reparaturgene (microsatellite instability, MSI, Sankila et al., 1999, Gryfe et al., 2000), Angiogenesemarker (vascular endothelial growth factor, 14 Tsai et al., 2006), Marker der Invasion/Metastasierung (plasminogen-related molecules, Stephens et al., 1999) und biochemische Marker (Thymidylatsynthase, Edler et al., 2000, Yamachika et al., 1998, Van Triest et al., 1999), sowie CCSA2-4 (Leman et al., 2007 und 2008). In einer soeben erschienen Arbeit wurde für das BAX Protein gezeigt, dass es als unabhängiger prädiktiver Marker im UICC Stadium II dienen könnte (Nehls et al., 2009). Die Validität dieser Marker wird sehr kontrovers diskutiert und ihre klinische Anwendung ist durch die Komplexität, die Schwierigkeit der Standardisierung, und die hohen Kosten limitiert (Graziano et al., 2003, Locker et al., 2006). Sinnvoll wäre es, Patienten selektionieren zu können, welche von einer adjuvanten Therapie profitieren. Ein biologischer Marker, der Hoch-Risiko- von Niedrig-Risiko-Patienten trennen könnte, wäre hilfreich, um unnötige Therapien zu vermeiden und Untersuchungen zur Effektivität von adjuvanten Therapien zu verbessern. Es gibt einen steigenden Bedarf an definierten Parametern, welche die Früherkennung einer Tumorerkrankung und Verlaufsbeurteilung einer Tumortherapie verbessern. 1.8. Potentielle Rolle des Albumins als biologischer Marker Humanes Serumalbumin stellt einen Hauptbestandteil im Transportsystem des Blutes dar. Es transportiert Fettsäuren, Tryptophan, Bilirubin, Calcium, Glucocorticoide und andere Komponenten, wie auch Pharmaka, zu den jeweiligen Zielzellen. Es existieren unterschiedliche Bindungsstellen für den jeweiligen Transport der Komponenten am Albuminmolekül. Für Fettsäuren sind dabei inzwischen mindestens sechs Bindungsstellen bekannt (Curry et al., 1998, Simard et al., 2006). Diese Bindungsstellen bewirken auch den Transport anderer hydrophober Substanzen, inklusive endogener Toxine. Es ist bekannt, dass Bindungen von Metaboliten, Medikamenten und Toxinen eine Konformationsänderung von Albuminmolekülen hervorrufen können, die wiederum zu einer gestörten Transportfunktion führen können (Kragh-Hansen et al., 2002). Die Transporteigenschaften des Albumins hängen von seiner Fähigkeit zur allosterischen Metabolitenbindung, von der Kapazität der Bindungsstellen, von der Intensität der Ligandenbindung und vom Grad der Dissoziation der gebundenen Ligandenkomplexe hin zu Zielzellen ab. 15 Von Tumorzellen freigesetzte Proteine können an Albumin binden und rufen damit eine strukturelle und funktionelle Modifikation des Albuminmoleküls hervor. Dadurch kommt es zu Änderungen des Bindungs- und Transportkapazitäten des Albumins für Fettsäuren (Mehta et al., 2003, Liotta et al., 2003). Diese Veränderungen sind mittels Elektronen-Spin-ResonanzSpektroskopie (ESR) messbar (Atherton et al., 1993, Kazmierczak et al., 2006, Marsh et al., 2002, Matthes et al., 2002). Kazmierczak et al. zeigten 2006, dass veränderte Werte der ESR von Albumin bei Patienten mit verschiedenen onkologischen Erkrankungen als Indikator für ein Rezidiv oder auch für das Ansprechen auf eine Therapie dienen kann. 1.9. Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie (ESR) zur Untersuchung von Konformationsänderungen des Serumalbumins Mit der Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie (ESR) kann ein Verfahren zur Bestimmung von funktionellen Charakteristika von Plasmaproteinen angewandt werden (Hinderberger et al., 2006). Aktuelle Anwendungsgebiete der ESR, einer mit kernmagnetischer Resonanz verwandten Methode, sind die Qualitätskontrolle bei der Herstellung kommerzieller Albumine, die Entwicklung von Albumin als Therapeutikum mit verbesserten Transport- und Entgiftungseigenschaften, sowie die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von Medikamentenwirkstoffen, die durch das Albumin transportiert werden. Aus einer geringvolumigen Blutprobe (Serum oder Plasma) kann der Konformationszustand und die Fettsäuretransportfunktion des Albumins analysiert werden. Dazu wird einer albuminhaltigen Probe (bspsw. Serum) eine spezifische langkettige Fettsäure zugegeben, die an das Albumin bindet. An die Fettsäure wird ein stabiles Radikal, das „Reportermolekül“, gebunden. Unter Zugabe eines polaren Lösungsmittels (meist Ethanol) in unterschiedlichen Konzentrationen werden Konformationsänderungen induziert und verschiedene Transportsituationen simuliert (Hinderberger et al., 2006). Die Mobilität des Reportermoleküls erfasst auf der Basis mathematischer Modelle (MMSTechnologie, „mobility of molecular structure“) die Konzentration der gebundenen Fettsäuren (Matthes et al., 2001). Die Analyse gibt Auskunft darüber, ob das Albumin den Liganden Fettsäure stark oder weniger stark 16 bindet, ob es seine gebundenen Fettsäuren verliert, bzw. aufgrund der Besetzung von Bindungsstellen durch Metabolite, Peptidfragmente oder Endotoxine Fettsäuren nicht mehr gebunden werden können. Die Form der gemessenen ESR-Spektren reflektiert dabei Änderungen der Albuminkonformation und die Fettsäuretransportfunktion des Albumins. Wie oben aufgeführt, ist es bekannt, dass exogene und endogene Verbindungen Modifikationen in der Konformation der Albuminmoleküle hervorrufen können (Metha et al., 2003, Liotta et al., 2003). Diese Variabilität der Serumalbuminstruktur wird bei Tumorerkrankungen beobachtet und kann mit Hilfe der Untersuchung von Bindungsparametern einer Reihe von Substraten Tumorerkrankungen am wird Albumin die erfasst Fähigkeit werden. des Bei malignen Albumins zur Konformationsänderung auf spezifische Weise blockiert. Dadurch wird die Abgabe gebundener Ladungen an die Zielzellen erschwert (Muravsky et al., 2000). Diese Funktionseinschränkungen des Albumins sind bei Krebserkrankungen teils schon im Frühstadium vermindert. Andererseits ist für Fälle von Remissionen solider oder hämatologischer Tumoren eine Normalisierung gezeigt worden (Kazmierczak et al., 2006, Gurachevsky et al., 2008). Die Vorstellung einer mittels ESR messbaren Modifikation der Albumintransportfunktion durch ein Tumorgeschehen noch vor der klinischen oder diagnostischen Präsenz könnte die Möglichkeit eines Tumorscreenings ergeben. Gegebenenfalls könnte die Albumin-ESR als Verlaufsparameter bei bereits manifestem malignen Geschehen dienen. 1.10 Fragestellungen der Arbeit In der vorliegenden Arbeit soll die Anwendbarkeit der ESR zur Untersuchung der Konformation des Albumins im Serum von Patienten mit KRK untersucht werden. Dazu sollen Serumproben von Patienten mit KRK und von Patienten mit benignen kolorektalen Erkrankungen hinsichtlich Konformationsänderungen des Albumins mittels ESR untersucht werden. Im Einzelnen sollen folgende Fragestellungen bearbeitet werden: 1. Treten Konformationsänderungen des Albumins in Abhängigkeit vom 17 • Alter, • Geschlecht oder von • der Albuminkonzentration auf? 2. Gibt es Konformationsänderungen des Albumins, die eine Unterscheidung zwischen malignen und benignen Erkrankungen ermöglicht? • Falls ja, gibt es einen mittels ESR ermittelten Wert, der als „cut-off“ zur Unterscheidung zwischen malignen und benignen Erkrankungen dienen kann? • Falls ja, gibt es eine Korrelation mit dem Stadium der Tumorerkrankung? • Falls ja, gibt es eine Korrelation von Konformationsänderungen des Albumins mit CEA? 3. Treten Konformationsänderungen des Albumins auf, die eine Unterscheidung zwischen entzündlichen und malignen Erkrankungen ermöglicht? • Falls ja, gibt es einen mittels ESR ermittelten Wert, der als „cut-off“ zur Unterscheidung zwischen entzündlichen und malignen Erkrankungen dienen kann? 4. Gibt es Konformationsänderungen bei Patienten • nach endoskopischer Adenomabtragung? • nach operativer Therapie von Patienten mit kolorektalen Adenomen? • Falls ja, steht die messbare Konformationsänderung Zusammenhang mit dem Auftreten einer Komplikation? in 18 2. Methodik Von Januar 2005 bis Dezember 2006 wurden aus der Klinik für Allgemein- und Visceralchirurgie der Augusta-Kranken-Anstalt in Bochum insgesamt 104 Patienten prospektiv in die vorliegende Untersuchung aufgenommen. Sämtliche Patienten wurden einer Intervention, bzw. einer Operation unterzogen. Die Patienten unterschrieben eine Einverständniserklärung (siehe Anhang). Ein Votum bei der Ethikkomission der Ärztekammer Westfalen-Lippe wurde eingeholt (Reg.-Nr.: 4XII Mann). 2.1 Patientenrekrutierung Folgende Einschlusskriterien wurden definiert: 1. Koloskopisch und CT-morphologisch (Klassifikation nach Hansen-Stock) gesicherte Sigmadivertikulitis CT-morphologische Stadieneinteilung nach Hansen-Stock,1996: Stadium I: akute Sigmadivertikulitis ohne Umgebungsreaktion Stadium IIa: akute Sigmadivertikulitis mit phlegmonöser Umgebungsreaktion Stadium IIb: akute Sigmadivertikulitis mit abszedierender Umgebungsreaktion/gedeckter Perforation Stadium IIc: akute Sigmadivertikulitis mit freier Perforation Stadium III: Chronisch rezidivierende Sigmadivertikulitis Die Patienten der Stadien IIa bis IIc wurden in die Gruppe „akute“ Divertikulitis, die Patienten des Stadiums III in die Gruppe der „chronischen“ Divertikulitis subsummiert. Bei sämtlichen in die Studie aufgenommenen Patienten wurde aufgrund des CT-morphologischen Stadiums, der klinischen Symptomatik und der Anamnese die Indikation zur operativen Therapie gestellt. Bei Patienten mit Sigmadivertikulitis wurde histopathologisch anhand des Resektates determiniert, ob es sich um eine akute, mit oder ohne Zeichen einer gedeckten Perforation, oder um eine chronische Sigmadivertikulitis handelte. 19 2. Histologisch gesichertes Adenom im Kolorektum Die histomorphologische Einteilung der Adenome in „low“- und „high grade“Adenome erfolgte gemäss dem vorhandenen Dysplasiegrad. Bei den kolorektalen Adenomen wird die geringgradige Epitheldysplasie (low grade Adenom) als reversibel und als Zeichen einer gesteigerten Regeneration, die hochgradige Epitheldysplasie (high grade Adenom) als intraepitheliale Neoplasie verstanden. 3. Histologisch gesichertes Karzinom im Kolorektum Nach endoskopischer Probenentnahme und anschließender histopathologischer Diagnosestellung erfolgte die Resektion. Die Aufarbeitung der Resektionspräparate erfolgte gemäß den Anwendungsleitlinien der Deutschen Gesellschaft für Pathologie und des Berufsverbandes Deutscher Pathologen (2003/2004). Der pathologische Befund beinhaltete die Tumorklassifikation, basierend auf dem pTNM-System, es wurde die 2003 von der UICC aktualisierte Version verwendet (Wittekind et al., 2003). Im Detail wurden das pT-Stadium (pT1-pT4), der Status der regionären Lymphknoten (pN0-pN2), der histopathologische Differenzierungsgrad (G1-G4), die Lymphgefäßinvasion (L0-L1), sowie der Residualtumorstatus (R0-R2) erfasst. Folgende Ausschlusskriterien wurden definiert: Nicht adenomatöses Malignom des Kolons und Rektums Operationen im Notfall Fehlende Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie stattgehabte neoadjuvante Therapie beim Rektumkarzinom kompensierte und dialysepflichtige Niereninsuffizienz Das diagnostische und therapeutische Vorgehen war von der Teilnahme an der Studie unabhängig. 2.2 Untersuchte Patientenkollektive Insgesamt wurde bei 117 Patienten Serum entnommen, um eine ESR des Albumins mit spinmarkierten Fettsäuren durchzuführen. Von den 117 Proben 20 waren 13 nicht verwertbar, sodass die Gesamtzahl der untersuchten Seren 104 beträgt. Von den insgesamt 104 untersuchten Patienten hatten 32 Patienten eine akute oder chronische Sigmadivertikulitis, 29 kolorektale Adenome und 43 Patienten ein kolorektales Karzinom. Patienten mit Sigmadivertikulitis (Alter 43 - 76 Jahre, Median 60 Jahre, w:m 22:10) wurden mittels konventioneller (n=19) oder laparoskopisch assistierter (n=13) Sigmaresektion behandelt. In 17 Fällen wurde durch den Pathologen eine chronische Divertikulitis und in 15 Fällen eine akute Entzündung mit phlegmonöser oder abszedierender Umgebungsreaktion diagnostiziert. Patienten mit kolorektalen Adenomen (Alter 45 - 84 Jahre, Median 68 Jahre, w:m 16:13) wurden entweder einer rektoskopischen (n=8) oder koloskopischen (n=10) Abtragung unterzogen, Kolonsegmentresektion (n=5) durch oder eingeschränkte mittels transanaler konventionelle endoskopischer Mikrochirugie (TEM) (n=6) operiert. Die histologische Begutachtung wies 16 high-grade-Adenome, 13 low-grade-Adenome nach (Siehe Ergebnistabelle im Anhang). Bei 31 Patienten der Karzinomgruppe lag ein Kolonkarzinom und bei 12 Patienten ein Rektumkarzinom vor. Die geschlechtsbezogene Verteilung zeigte bei den Frauen viermal häufiger ein Kolonkarzinom als ein Rektumkarzinom. Bei den Männern stellte sich ein Verhältnis von 1:1,3 dar. Das Alter in dieser Gruppe lag im Median bei 74 Jahren (53-86 Jahre). Patienten mit einem präoperativ bioptisch gesicherten Adenokarzinom des Kolorektums wurden radikal-onkologisch mit zentraler Ligatur der versorgenden Gefäße und Lymphadenektomie entsprechend dem Tumorsitz operiert. Die therapeutischen Verfahren sind in Tabelle 1 aufgelistet. 21 Tabelle 1: Operationsverfahren und interventionelle Verfahren bei den einzelnen Krankheitsgruppen. Sigmadivertikulitis n Patienten = 32 Konventionelle Sigmaresektion 19 Laparoskopische Sigmaresektion 6 Konversion 7 Adenom n Patienten = 29 Polypektomie Kolon 8 Polypektomie Rektum 10 TEM 6 Coecalpolresektion 2 Kolon-descendens-Segmentresektion 1 Sigmaresektion 2 Rektumkarzinom n Patienten = 12 Anteriore Resektion mit TME 9 Rektumexstirpation mit TME 2 Multiviscerale Resektion 1 Kolonkarzinom n Patienten = 31 Hemikolektomie rechts 18 Transversumresektion 2 Hemikolektomie links 11 Gemäss der Stadieneinteilung der UICC anhand des Tumorstadiums pT, des Lymphknotenstatus pN und der Metastasenkategorie pM in die Stadien I-IV fand sich folgende Verteilung: UICC I 14 Patienten UICC II 12 Patienten UICC III 11 Patienten UICC IV 6 Patienten 22 2.3 Erfasste Parameter Nach mündlicher und schriftlicher (siehe Anhang) Aufklärung und Einwilligung des Patienten zur Teilnahme an der Studie wurde die erste Entnahme von Serumblut vorgenommen. Die Daten wurden in eine Excel-Datenbank eingegeben und zur weiteren Analyse in eine Statistik-Software (SAS Enterprise Guide® 3.0, SAS® Institute Inc.) transferiert. Neben Alter und Geschlecht wurden folgende Parameter für alle Patientengruppen im Rahmen dieser Studie erfasst: 2.3.1 Albuminkonzentration präoperativ/-interventionell Präoperativ, bzw. -interventionell wurde bei allen Patienten die Konzentration des Albumins in g/dl bestimmt. Anschließend erfolgte die Skalierung mit den DR-Werten des jeweiligen Patienten. Zur Konzentrationsbestimmung wurde ein Farbtest mit Endpunkt-Methode angewandt. Albumin weist bei einem pH-Wert von 4,1 einen ausreichend kationischen Charakter auf, um eine Bindung mit dem Anionenfarbstoff Bromcresolgrün (BCG) unter Bildung eines blaugrünen Komplexes einzugehen. Die Farbintensität der blaugrünen Farbe ist direkt proportional der Albuminkonzentration und wird photometrisch gemessen. Der Normwert der Serumalbuminkonzentration liegt bei 3,5-5,0 g/dl. 2.3.2 CEA präoperativ bei Patienten mit Karzinomen Die Messung der Tumormarker erfolgte unter Verwendung von Testreagenzien und Analysegeräten der Firma Roche, Deutschland. Der Test basiert auf dem Prinzip der Antikörperbindung (Immunoassays), wobei der zu messende Parameter das Antigen darstellt. Die verwendete Technik der Chemilumineszenz („ECLIA“) macht sich das Prinzip der elektromagnetischen Trennung zunutze: an Eisenoxidkristalle mit magnetischen Eigenschaften wird ein mit Acridiniumester markierter Antikörper gekoppelt, der wiederum das zu messende Antigen bindet. Durch Anlegen eines Magnetfeldes werden die Eisenoxidkristalle mit Antigen und Antikörper an der Küvettenwand fixiert. Zuletzt wird durch Zugabe von Säure und Base die ChemilumineszenzReaktion ausgelöst: durch Oxidation des Acridiniumesters wird eine bestimmte Lichtmenge produziert, dessen Normbereich für CEA: 0-5,0 [µg/l]. Größe der Antigenmenge entspricht. 23 Diagnose / Verdachtsdiagnose Divertikulitis Adenom Karzinom CT, Koloskopie Koloskopische und histologische Diagnose Koloskopische und histologische Diagnose Präoperative Blutentnahme Albuminkonzentration, CEA, ESR Resektion/Polypektomie Histopathologie Postoperative Blutentnahme (8. Tag) Komplikationserfassung Abbildung 1: Zeitlicher Ablauf der Studie ESR 24 2.3.3 Dieser Determination Ratio (DR-Wert) wurde Spektroskopie errechnet aus aus präoperativ der und Albumin-Elektronen-Spin-Resonanzam 8. postoperativen, bzw. postinterventionellen Tag entnommenen Blutproben. 2.3.3.1 Probenverarbeitung Die gewonnenen Proben wurden bei –80° gelagert. Ans chließend erfolgte der Transport auf Trockeneis zur Firma MedInnovation, wo die ESR-Messungen gemäss publiziertem Patent (Muravsky et al., 2000) durchgeführt wurden. Kommerzielle 16-Doxyl-Fettsäure der Firma SIGMA-Aldrich GmbH, Deutschland, wurde als Spin-Sonde (Reportermolekül) genutzt (siehe Abb. 2). Diese Substanz wurde gewählt, da sie eine extrem hohe Bindungskonstante (6,9 x 107 L/mol) für mindestens drei der in Abbildung 4 gezeigten Fettsäurebindungsstellen aufweist. Dadurch wird ein mehr als 99,9%iges Binden der Spin-Sonde zu Albumin hervorgerufen (Curry et al., 1998). Ethanol (Merck, Deutschland) wurde als polares Reagens zur Modifikation der Lösungsmittelgemische eingesetzt. OH O O N ● O Abbildung 2: Struktur der 16-DOXYL-Stearinsäure. Das ungepaarte Elektron ist an der Nitroxid (NO) Gruppe der Spin Sonde lokalisiert. 2.3.3.2 Testdurchführung Die Testdurchführung erfolgte gemäss dem Patent von Muravsky aus dem Jahre 2000. Insgesamt 8 Aliquote von je 50µl Serum wurden mit verschiedenen Konzentrationen von kommerzieller 16-Doxyl-Fettsäure (SIGMA-Aldrich GmbH, Deutschland) als Spin-Sonde (0.8, 1.5 und 2.3 mM) und Ethanol (1.9, 2.9 und 3.8 Molar) als polares Reagens unter kontinuierlichem Schütteln bei 37° C für 25 10 Minuten inkubiert. Nachfolgend wurden die Proben in Glaskapillaren gefüllt und jeweils 3 mal für 1 Minute in das ESR-Spektrometer (ESR-Analyser/MMS 01-08-20) zur automatischen Messung der Spektren platziert. Die Messung im Spektrometer erfolgte mit einer Mikrowellenleistung von 15 mW bei einer Frequenz von 9,5 GHz und einer Magnetfeldstärke von 0,34 Tesla. Die Scanbreite lag bei 12 m Tesla (120 Gauss) und die Messungen wurden mit einer Modulationsfrequenz von 65 kHz und einer Modulationsamplitude von 0,7 Gauss durchgeführt. Die weitere Analyse erfolgte mit einer von der Firma MedInnovation entwickelten Software (MMS). 2.3.3.3 Testauswertung Als Wert der ESR wurde eine Diskriminationsfunktion Determination ratio (DR) definiert, welche durch Vergleich von gemessenen Werten von gesunden Probanden und einer Gruppe von Tumorpatienten gewonnen wurde (Matthes et al., 2001). Aus Studien, in denen Serum von gesunden und an einem Malignom erkrankten Patienten ESR-spektroskopisch untersucht wurde, lassen sich empirisch folgende Einsichten gewinnen: mit einer sehr hohen statistischen Signifikanz (>90%) lässt sich ein Patient mit einem DR<1 in die Gruppe der gesunden Patienten einordnen bzw. ein Patient mit DR>1 in die Gruppe von Patienten mit einem Malignom (Matthes et al., 2001). Die Datenanalyse mittels der MMS-Methode errechnet sich wie folgt: von den verschiedenen Aliquots als Funktion der Konzentration von Fettsäuren und aus der Konzentration von Ethanol wurden ESR-Spektren aufgenommen. Die jeweiligen Gesamtspektren der ESR wurden analysiert indem die relativen Verhältnisse dreier spektraler Komponenten 1), 2), 3) bestimmt wurden (siehe Abbildung 6). Die ESR-Spektren sind sehr sensitiv gegenüber der Rotationsbeweglichkeit der ESR-aktiven Fettsäuren (Abb. 6, Hinderberger et al., 2006). Spektrale Komponente 1) hat eine sehr niedrige Rotationsmobilität, 2) eine mittlere Rotationsmobilität und 3) eine hohe Rotationsmobilität (Siehe Abbildungen 3, 6). 26 schnelle Rotation: Rotationsdauer 10 ps 10 intermediäre Rotation: Rotationsdauer 1 ns „Festes Limit“: Rotationsdauer 1 µs Abbildung 3: Einfluss der Rotationszeit auf das ESR Spektrum von 16-DoxylStearinsäure (Spektren simuliert, Hinderberger et al., 2006). Abhängig von der typischen freien Rotationszeit stellt sich die Spektrenform unterschiedlich dar. Die Spektren sind sehr sensitiv darauf, wie schnell und wie ungehindert Fettsäuren rotieren können. Frei rotierende Fettsäuren (typische Rotationszeiten: 10-11=10 ps) zeigen das typische Drei-Linien-Muster links. Eine Anbindung, die zu einer Verlangsamung der Rotation in den Bereich 10-9s (1 ns) führt, ist in der Mitte zu sehen. Rechts ist eine „feste Anbindung“ gezeigt, in der Molekülrotationen länger als 10-6 s (1 µs) dauern. Abbildung 4: Proteinstruktur des Albumins (protein database (PDB) Nr: 1bj5, Curry et al., 1998). Blau markiert sind die eingebundenen Fettsäuren. 27 Stearinsäure(mM) 1 2 3 2.3 4 5 6 1.5 7 8 0.8 a 3.8 2.9 Ethanolkonzentration (M) 1.9 Abbildung 5: Messung der ESR-Spektren der einzelnen Aliquots mit 8 verschiedenen Konzentrationen an Ethanol (1.9 – 3.8 M) und Fettsäure (0.8 – 2.3 mM) aus 50 µl Serum. Bei gleichbleibender Ethanolkonzentration (bspsw. 2,9 M) und steigender Fettsäurenkonzentration (Spinsondenkonzentration) kommt es zu einer Erhöhung des Anteiles lose gebundener Fettsäuren. Bei gleichbleibender Fettsäurenkonzentration (bspsw. 1,5 mM) und steigender Ethanolkonzentration kommt es ebenfalls zu einer Erhöhung lose gebundener Fettsäuren (Abb. 5). Beide Trends lassen Fettsäurenkonzentration sich bei wie folgt erklären: gleichbleibender bei Erhöhung der Ethanolkonzentration und Albuminkonzentration gibt es mehr Fettsäuren als Bindungsstellen frei sind. Erhöht man bei ansonsten gleichbleibender Fettsäurenkonzentration die Ethanolkonzentration in der Lösung, kommt es vermehrt zur Denaturierung von Albumin, was zu einer Verringerung der Anzahl an Fettsäurebindungsstellen führt. Dadurch erhöht sich Fettsäuremoleküle im Spektrum. der spektrale Anteil lose gebundener 28 Für die Analyse wurden die Spektren 1, 5 und 8 (Abb. 5) untersucht: zur Berechnung des DR-Wertes mussten für die 3 unterschiedlichen Spinsondenkonzentrationen (0,8, 1,5 und 2,3 mM) die spektralen Anteile der fest, intermediär und lose gebundenen Fettsäuren in die Berechnung einbezogen werden, da bei diesen Spektren der relative Effekt der Änderung der Ethanolkonzentration am größten ist. Jedes dieser 8 Einzelspektren besteht aus den folgenden 3 Komponenten 1-3: 1-3 ______________________________ 1 2 3 0.335 0.337 0.339 0.341 Magnetisches Feld (T) Abbildung 6: Spektren der Albumin-ESR mit spinmarkierter 16-Doxyl-Stearinsäure 1-3: Zusammenfassung von drei Spektralkomponenten des Gesamtspektrums. Die drei Spektralkomponenten lassen sich Fettsäuren mit typischen unterschiedlichen Rotationszeiten zuordnen (siehe auch Abb. 3). 1: Es zeigt sich ein sehr breites Spektrum, Fettsäuren sind stark gebunden und damit kaum beweglich 2: Es zeigt sich ein breiteres Spektrum, die Fettsäuren zeigen eine intermediäre Rotationsmobilität 3: Fettsäuren sind frei beweglich, es findet allenfalls eine lose Bindung an Albuminmoleküle statt. 29 2.3.4 Postoperative/-interventionelle Komplikationen Komplikationen wurden gesondert dokumentiert. Hierbei wurden Minor- von Major-Komplikationen unterschieden. Unter ersten wurden postoperativer Harnwegsinfekt, Harnverhalt, postoperative Darmatonie, vital nicht bedrohliche, typische Pneumonie und Wundinfekt subsummiert. Unter Major-Komplikationen fielen interventionsbedürftige Nachblutung, Anastomoseninsuffizienz, intraabdominelle Abszedierung, Sepsis und Multiorganversagen. 2.4 Statistik Alle Parameter wurden erfasst, in eine Excel Datenbank (Microsoft Excel 2002) eingegeben und dann zur weiteren Analyse in ein Statistikprogramm (SAS Enterprise Guide® 3.0 SAS® Institute Inc. und SPSS 15.0 für Windows software) transferiert. Die quantitativen Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die einfaktorielle Varianzanalyse wurde angewandt, um zu überprüfen, ob ein Unterschied der DR-Werte zwischen den Patientengruppen Divertikulitis, Adenome und Karzinome existierte. Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen wurden mit dem t-Test für unabhängige Stichproben durchgeführt. Der t-Test für unabhängige Stichproben wurde ebenso angewandt, um Unterschiede zwischen den Gruppen “low grade” und “high grade” Adenomen und zwischen den Gruppen “akute“ und „chronische“ Divertikulitis durchzuführen. Die mehrfaktorielle Varianzanalyse wurde angewandt, um die Beziehungen der DR-Werte mit den UICC-Stadien IIV zu untersuchen. Ebenfalls wurde die mehrfaktorielle Varianzanalyse mit wiederholten Messungen zum Vergleich der prä- und postoperativen Werte angewandt. P ≤ 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Ferner erfolgte die Bestimmung des Pearson´s Korrelationskoeffizienten r für die Stärke oder Größe von Zusammenhängen oder Differenzen unabhängig von der Größe der Untersuchungsgruppe. Um Aufschluss über den Grad der erklärten Varianz zu erhalten, wurde der Determinationskoeffizent r2 bestimmt. Um zu untersuchen, ob der DR-Wert eine Aussagekraft als prädiktiver Wert hat, wurde eine binäre logistische Regression mit der Erkrankung als abhängiger und dem DR-Wert als unabhängiger Variable durchgeführt. 30 3. Hauptteil mit Darstellung der Ergebnisse 3.1 Korrelationen der untersuchten Parameter mit Konformationsänderungen des Albumins 3.1.1 Alter und Geschlecht Der t-Test für unabhängige Stichproben und der abhängigen Variable des DRWertes zeigte keine Korrelation hinsichtlich der errechneten DR-Werte vom Alter der Patienten. Ebenso hatte das Geschlecht keinen Einfluss auf Veränderungen der messbaren Albuminkonformation. Dies gilt für alle drei Patientengruppen. 3.1.2 Der Albuminkonzentration Mittelwert der präoperativ/präinterventionell bestimmten Serumalbuminkonzentration lag bei Patienten mit Sigmadivertikulitis bei 4,3 + 0,34 mg/dl, bei Patienten mit Adenomen bei 4,4 + 0,45 mg/dl und bei Patienten mit kolorektalem Karzinom bei 4,0 + 0,51 mg/dl. Um eine eventuelle Abhängigkeit des DR-Wertes von der Albuminkonzentration im Serum zu prüfen und zu quantifizieren, wurden exemplarisch die präoperativ ermittelten DR-Werte für die drei Patientengruppen auf ihre Albuminkonzentration normalisiert. Zu diesem Zweck wurden die gemessenen DR-Werte mit einem Faktor skaliert, der sich wie folgt errechnet: alle Albuminkonzentrationen wurden normalisiert, indem jede Albuminkonzentration durch den Mittelwert aller Albuminkonzentrationen der Patientengruppe dividiert wurde. Danach wurde der DR Wert durch die jetzt genormte (also auch von physikalischen Einheiten befreite) Albuminkonzentration dividiert. Dieses Verfahren führt zu einer Normalisierung, da DR-Werte von Patienten mit hohen Albuminkonzentrationen (Konzentration ist größer als der Mittelwert) im Serum kleiner werden und DR-Werte von Patienten mit niedrigen Albuminkonzentrationen (Konzentration ist kleiner als der Mittelwert) im Serum größer werden. Ein Vergleich der so berechneten Mittelwerte ergibt folgendes: 31 DR ohne Normalisierung DR mit Normalisierung Divertikulitis 0.406 0.354 Adenom 0.746 0.738 Karzinom -0.089 -0.156 Aus dieser exemplarischen Berechnung ist deutlich erkennbar, dass eine solche Normalisierung die errechneten DR-Werte nur unwesentlich beeinflusst. Daher wurde eine Normalisierung im Weiteren nicht mehr durchgeführt und die DR-Werte wie ermittelt weiter untersucht. 3.1.3 Konformationsänderungen des Albumins bei benignen und malignen Erkrankungen des Kolorektums Wie im Kapitel „Methodik“ beschrieben, erfolgte die Berechnung des sogenannten DR-Wertes (Determination ratio), der durch die Firma MedInnovation definiert wurde, als Maß für die Konformationsänderung des Albumins. Er reflektiert als linearer Faktor – nach Durchführung der Spektralanalyse – den Konformationszustand des Albumins. In der Ergebnistabelle (Anhang) sind die präoperativ und postoperativ gemessenen DR-Werte der untersuchten Patienten aufgelistet. Von den rekrutierten Patienten konnten von 93 sowohl die prä- als auch die postoperativen DR-Werte ermittelt werden. Bei 11 Patienten erfolgte keine postoperative, bzw. – interventionelle Blutentnahme, sodass bei diesen nur der präoperative Wert vorliegt. In der Tabelle finden sich zudem alle weiteren erfassten Parameter. 3.1.3.1 Konformationsänderungen des Albumins bei Patienten mit benignen Erkrankungen Der mittlere DR-Wert bei Patienten mit Sigmadivertikulitis lag bei 0,41 + 0,54, bei Patienten mit Adenom (low-grade und high grade) 0.76 + 1.34 (siehe Abb. 8, 9, 10). Innerhalb der Divertikulitis-Gruppe ergaben sich keine Unterschiede zwischen Patienten mit akuter und chronischer Entzündung (s. Abb. 7). Vergleicht man innerhalb der Adenomgruppe die DR-Werte bei Patienten mit lowgrade-Adenom (0,25 + 1,1) mit denen mit high-grade-Adenom (1,35 + 1,42), so ergibt sich ebenfalls kein signifikanter Unterschied (siehe Abb. 8) 32 Determination ratio (DR) 7 6 5 4 3 2 chronische Divertikulitis akute Divertikulitis 1 0 -1 -2 Abbildung 7: Verteilung der DR-Werte bei Patienten mit Divertikulitis. Die AlbuminESR zeigt in der Divertikulitisgruppe keinen signifikanten Unterschied zwischen Patienten mit chronischer oder mit akuter Divertikulitis. Determination ratio (DR) 5 4 3 2 1 High-grade Adenom Low-grade Adenom 0 -1 -2 Abbildung 8: Verteilung der DR-Werte bei Patienten mit Adenomen. Innerhalb der Adenomgruppe zeigt sich kein signifikanter Unterschied zwischen Patienten mit low-grade und high-grade Dysplasie hinsichtlich Konformationsänderungen des Albumins. 33 3.1.3.2 Konformationsänderungen des Albumins bei Patienten mit malignen Erkrankungen im Vergleich zu benignen Erkrankungen a) Karzinome vs. Adenome und Divertikulitis Der mittlere DR-Wert bei Patienten mit kolorektalem Karzinom lag bei -0.09 + 0.98. Eine einfaktorielle Varianzanalyse zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen der Gruppe von Patienten mit Karzinomen verglichen mit der Sigmadivertikulitis- und der Adenom-Gruppe (p=0.02). (Siehe Abbildung 9). Fasst man die Patienten mit benignen Grunderkrankungen – Sigmadivertikulitis und Adenomen – zu einer Gruppe zusammen und vergleicht sie mit den Ergebnissen der Spektralwellenanalyse bei Patienten mit maligner Erkrankung, so zeigt sich ein hochsignifikanter Unterschied zwischen der malignen und der benignen Gruppe (p<0.01). Patienten mit gutartiger Erkrankung weisen deutlich höhere DR-Werte auf als solche mit einem Adenokarzinom des Kolorektums (Abbildung 10). In Abbildung 11 ist exemplarisch das Spektralwellenmuster für einen Patienten mit kolorektalem Adenom (low grade) und einem Patienten mit KRK (UICC Stadium II) dargestellt. Determination ratio (DR) 2.50 p=0.02 p=0.02 2.00 1.50 1.00 0.50 0,00 -0.50 Adenom Divertikulitis -1.00 Karzinom -1.50 Abbildung 9: Mittlere DR-Werte mit Standardabweichungen. Bei Karzinompatienten sind die ermittelten DR-Werte signifikant niedriger als bei Patienten mit Adenomen und mit Divertikulitis. 34 Determination ratio (DR) 2,50 P<0.01 2,00 1,50 Karzinome 1,00 0,50 0,00 -0,50 -1,00 Divertikulitis und Adenome -1,50 Abbildung 10: Mittlere DR-Werte mit Standardabweichungen im Vergleich zwischen benignen und malignen Grunderkrankungen. Werden die Patienten mit benigner kolorektaler Erkrankung zu einer Gruppe zusammengefasst, ergibt sich ein hochsignifikanter Unterschied im Vergleich zu Patienten mit KRK. Abbildung A 11: Exem- plarische Darstellung der ESR-Analyse. KRK, UICC II Spektral- wellenmuster bei einem Patienten mit kolorektalem LPA affecte d albumi n B Low grade Adenom Karzinom (A, Patient-Nr. 17) und mit kolorektalem Adenom (B, Patient-Nr. 90). Markiert ungen sind des enmusters, VeränderSpektralwelldie eine Konformationsänderung des Albumins veranschaulichen. Bei dem Patienten mit KRK kommt es geringeren der zu einer Beweglichkeit Fettsäuren, da stärker gebunden sind. sie 35 b) Karzinome UICC-Stadium I vs. Adenome Es wurde überprüft, ob sich die Gruppe der Adenompatienten in ihren DR-Werten von der Patientengruppe mit einem frühen Krebsstadium UICC I unterscheidet. Der Unterschied im präoperativ ermittelten DR-Wert war nicht signifikant (0,76 + 1,34 bei Adenompatienten, 0,16 + 1,01 bei Patienten mit KRK UICC Stadium I), s. Abb. 13 Determination ratio (DR) 5 4 3 2 1 high grade Adenome KRK UICC I 0 -1 -2 Abbildung 12: Verteilung der DR-Werte bei Patienten mit high grade Adenomen und mit KRK UICC I. Es findet sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der ermittelten DR-Werte zwischen diesen beiden Patientengruppen. Auch wenn man die Gruppe der Patienten mit high grade Adenomen (DR=1,35 + 1,42) isoliert betrachtet im Vergleich zu Patienten mit KRK UICC Stadium I (DR= 0,16 + 1,01), ergibt sich kein relevanter Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen (Abb. 12). Trotz des signifikanten Unterschiedes der DR-Werte zwischen der Gruppe mit Karzinomen und der mit benignen Erkrankungen ist die Streuung der ermittelten Werte in allen Patientengruppen breit. Daher lässt sich kein cut-off-Wert ermitteln, der zu einer Unterscheidung zwischen Adenomen und KRK dienen könnte. Insbesondere hinsichtlich einer Differenzierung von Patienten mit Adenomen von 36 Patienten mit KRK UICC I ist die Varianz der Werte zu groß und die Gruppengröße zu klein (Abb.13). Low und high grade Adenome UICC I DR-Wert präoperativ Abbildung 13: Verteilung der DR-Werte bei Patienten mit Adenomen und mit KRK UICC I. Die Abbildung stellt dar, dass die Varianz der gemessenen DR-Werte in den beiden Gruppen zu groß ist, um einen cut-off-Wert zu definieren, der eine Zuordnung in eine der beiden Gruppen zuließe. 37 3.1.3.3 Albumin-ESR bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen – Korrrelation mit dem UICC-Stadium Eine einfaktorielle Varianzanalyse mit der Gruppenzugehörigkeit (UICC-Stadium I-IV) als unabhängige Variable und die präoperativen DR-Werte als abhängige Variable wurde gerechnet. Der Unterschied zwischen den Gruppen UICC I bis III wurde signifikant (Abb. 14, p=0.05). Determination ratio (DR) 2,00 p=0.05 1,50 1,00 p=0.05 p=0.05 0,50 0,00 UICC-Stadium 1 UICC-Stadium 2 UICC-Stadium 3 UICC-Stadium 4 -0,50 -1,00 -1,50 Abbildung 14: Mittlere DR-Werte in den einzelnen UICC-Stadien. Es kommt zu einem signifikanten Abfall der DR-Werte mit fortschreitendem Tumorstadium in den UICC-Stadien IIII. Aufgrund der großen Standardabweichung der Werte im Stadium IV ist der Unterschied zu den anderen Tumorstadien nicht signifikant. Patienten im UICC-Stadium I zeigten einen mittleren DR-Wert von 0,16 + 1,05, im Stadium II von –0,48 + 0,53, im Stadium III von –0,76 + 0,37. Auffällig waren deutlich höhere DR-Wert im UICC-Stadium IV (Mittel 0,40 + 1,20). Betrachtet man die UICC-Stadien I bis III, so zeigt sich in der einfaktoriellen Varianzanalyse ein signifikanter Unterschied zwischen den drei Gruppen. 38 3.1.3.4 Korrelation der Konformationsänderungen mit CEA Bei Patienten mit KRK wurde präoperativ der CEA-Wert bestimmt. Es sollte überprüft werden, ob eventuelle Konformationsänderungen des Albumins mit Veränderungen des CEA und/oder CA19-9 korrelieren. Insgesamt lag bei 47,5% der Patienten mit kolorektalem Karzinom der präoperative CEA-Wert oberhalb und bei 52,5% der Fälle innerhalb des Normbereiches. Nach Differenzierung in die einzelnen UICC-Stadien zeigten 9% (n=1) im UICC-Stadium I, 27% (n=3) im Stadium II, 84% (n=5) im Stadium III und 82% (n=9) der Patienten im Stadium IV erhöhte CEA-Werte (siehe Abb. 16 A-D). In den UICC-Stadien II und III zeigten sich gegensinnige Veränderungen der CEA- und der DR-Werte. Je höher der CEA-Wert, desto niedriger war der DR-Wert. Siehe Abb. 15 A-D und Tabelle 2. CEA [U/ml] Determination ratio (DR) 8 2 7 1,5 6 1 5 0,5 4 0 CEA UICC I DR UICC I 3 -0,5 2 A 1 -1 0 -1,5 UICC I Abbildung 15 A: Paarweiser Vergleich der CEA- und DR-Werte bei Patienten im UICC-Stadium I. Es finden sich gegensinnige Werte des CEA und des DR, der Zusammenhang ist jedoch nicht signifikant, siehe auch Tabelle 2. 39 CEA [U/ml] 12 Determination ratio (DR) 0,4 0,2 10 0 -0,2 8 -0,4 -0,6 6 -0,8 CEA UICC II DR UICC II -1 4 -1,2 -1,4 2 -1,6 B 0 UICC II -1,8 Abbildung 15 B: Paarweiser Vergleich der CEA- und DR-Werte bei Patienten im UICC-Stadium II. Es finden sich gegensinnige Werte des CEA und des DR, der Zusammenhang ist jedoch nicht signifikant, siehe auch Tabelle 2. CEA [U/ml] 50 45 Determination ratio (DR) 0 -0,2 40 -0,4 35 30 -0,6 25 -0,8 20 -1 CEA UICC III DR UICC III 15 -1,2 10 5 C 0 UICC III -1,4 -1,6 Abbildung 15 C: Paarweiser Vergleich der CEA- und DR-Werte bei Patienten im UICC-Stadium III. Es finden sich gegensinnige Werte des CEA und des DR. Dieser negative Zusammenhang ist signifikant (p=0.03), siehe auch Tabelle 2. 40 Determination ratio (DR) CEA [U/ml] 900 3,5 800 3 700 2,5 2 600 1,5 500 CEA UICC IV DR UICC IV 1 400 0,5 300 D 0 200 -0,5 100 -1 0 UICC IV -1,5 Abbildung 15 D: Paarweiser Vergleich der CEA und DR-Werte bei Patienten im UICC-Stadium IV. Es finden sich gegensinnige Werte des CEA und des DR, der Zusammenhang ist jedoch nicht signifikant, siehe auch Tabelle 2. Tabelle 2: DR-Werte und CEA in den UICC-Stadien I bis IV Stadien DR / CEA Stadium I DR / CEA Stadium II DR / CEA Stadium III DR / CEA Stadium IV Korrelation (nach Pearson) r = -.285 r = -.428 r = -.856 r = -.412 Signifikanz (p) n Patienten p = 0.369 p = 0.218 p = 0.030 p = 0.207 12 10 6 11 Die Tabelle zeigt, dass in den Tumorstadien UICC I-IV sich negative Zusammenhänge zwischen den Variablen präoperativer DR-Wert und CEA-Wert finden. Aufgrund der geringen Fallzahlen pro Stadium sind allerdings die Korrelationen bis auf eine Ausnahme (Stadium III) nicht signifikant. Ab dem 2. Stadium nimmt aber die Höhe der Korrelation stark zu. Die Korrelation im Stadium III ist mit r = .86 ist sehr hoch (74% aufgeklärte Varianz). 3.1.3.5 Unterscheidung zwischen malignen und entzündlichen Erkrankungen Wie in Abb. 9 dargestellt, unterscheiden sich Patienten mit KRK signifikant hinsichtlich ihrer DR-Werte von Patienten mit Divertikulitis (p< 0.02). Abb. 16 zeigt die Verteilung der DR-Werte bei diesen beiden Patientengruppen. Um zu untersuchen, ob der DR-Wert eine Aussagekraft als prädiktiver Wert hat, um Patienten mit Divertikulitis von solchen mit KRK zu unterscheiden, wurde eine binäre logistische Regression mit der Erkrankung als abhängiger und dem DR-Wert als 41 unabhängiger Variable durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass der DRWert ein signifikanter Prädiktor der Erkrankung ist (Nagelkerke´s Pseudo R von 0,47). Der cut-off Punkt zur Zuordnung eines Patienten zur Divertikulits- oder zur KRK-Gruppe lag bei einem DR-Wert von -0,44 (95%, Koinfidenz-Intervall [-0.720.17]). Patienten mit einem niedrigeren Wert konnten der Karzinomgruppe zugeordnet werden. Die odds ratio lag bei 9.9; d.h. die Wahrscheinlichkeit, an einem Karzinom erkrankt zu sein, steigt mit jeder Einheit des DR-Wertes um den Faktor 9.9 verglichen mit der Wahrscheinlichkeit, an Divertikulitis zu leiden. Insgesamt konnten 76% der Fälle richtig klassifiziert werden. Die ROC-Kurve (Abbildung 17) zeigt ein Sensitivität von 0.83 und eine Spezifität von 0.78 für den cut-off Punkt von DR=-0.44. Der positive prädiktive Wert liegt bei 0.825, der negativ prädiktive Wert bei 0.677. Determination ratio (DR) 7 6 5 4 3 2 Divertikulitis Karzinom 1 0 -1 -2 -3 Abbildung 16: Verteilung der DR-Werte in den Patientengruppen KRK und Divertikulitis. Die Mittelwerte unterscheiden sich signifikant voneinander (s. Abb. 9). Sensitivität 42 1 - Spezifität Abbildung 17: ROC-Kurve für DR als prädiktiven Wert bei Patienten mit Divertikulitis und KRK. Die AUC (area under curve) beträgt 0.75, der Standardfehler liegt bei 0.061, p < 0.001. 3.1.3.6 Postoperative Ergebnisse der Albumin-ESR 3.1.3.6.1 bei Patienten mit Divertikulitis und Adenomen Es sollte untersucht werden, inwiefern sich die DR-Werte im postoperativen, bzw. postinterventionellen Verlauf (am 8. Tage) von den präoperativ, bzw. -interventionell ermittelten Werten unterscheiden. Zur Überprüfung wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit Messwiederholung auf einem Faktor mit den unabhängigen Variablen Gruppenzugehörigkeit und Messzeitpunkt und der abhängigen Variable DR-Wert (prä- und postoperativ) gerechnet. Es zeigte sich ein signifikanter Effekt des DR-Wertes im Vergleich der zwei Messzeitpunkte (p < 0.01). D.h., dass unabhängig von der Gruppenzugehörigkeit im 43 Durchschnitt die postoperativen DR-Werte geringer sind als die präoperativen DRWerte. Dies gilt für alle drei Krankheitsgruppen (Abbildung 18). Determination ratio (DR) Determination ratio (DR) 0,90 0,70 0,62 0,50 0,32 0,30 0,10 0,02 -0,10 -0,11 -0,24 -0,30 Adenom Karzinom Divertikulitis -0,50 -0,70 -0,90 -1,10 -1,20 -1,30 -1,50 Abbildung 18: Prä- und postoperative DR-Werte in den drei Patientengruppen Betrachtet man die einzelnen Krankheitsgruppen und führt eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit den unabhängigen Variablen Gruppenzugehörigkeit und Messzeitpunkt und der abhängigen Variable DR-Werte (prä- und postoperativ, Abbildung 18) aus, zeigt sich folgendes Ergebnis: bei Patienten mit Sigmadivertikulitis und Adenomen kommt es postoperativ zu einem signifikanten Abfall des DR-Wertes. Die präoperativen DR-Werte lagen bei Patienten mit Sigmadivertikulitis bei 0,32 + 1,54 (s. auch Abb. 9), postoperativ fand sich im Mittel ein Wert von –0,24 + 1,40. Bei Patienten mit kolorektalen Adenomen fanden sich präoperative DR-Werte von bei 0.76 + 1.34 (s. auch Abb. 9), postoperativ fand sich im Mittel ein Wert von 0,02 + 1,37. Wenn man die interventionell behandelten Patienten als eine Gruppe getrennt von den operativ behandelten Patienten betrachtet, lässt sich kein signifikanter Abfall am 8. postinterventionellen Tage darstellen (Abb. 19 und 20). 44 Determination ratio (DR) 3 2,5 2 1,5 1 präinterventionell 0,5 postinterventionell 0 -0,5 -1 -1,5 -2 Abbildung 19: Paarweise Darstellung der prä- und postinterventionellen DR-WertVerteilung bei Patienten mit Adenomen, die mittels endoskopischen Verfahren abgetragen wurden. Es zeigt sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der prä- und postinterventionellen Werte. Determination ratio (DR) 5 4 3 2 1 präoperativ postoperativ 0 -1 -2 Abbildung 20: Prä- und postoperative DR-Wert-Verteilung bei Patienten mit Adenomen, die mittels resezierendem Eingriff behandelt wurden. Es zeigt sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der prä- und postoperativen Werte. 45 3.1.3.6.2 bei Patienten mit Karzinomen Äquivalent zu den anderen Patientengruppen wurde bei maligner Grunderkrankung das prä- vs. dem postoperativen Ergebnis der gemessenen DR-Werte verglichen. Zur Überprüfung wurde eine zweifaktorielle Analyse mit den unabhängigen Variablen Gruppenzugehörigkeit und Messzeitpunkt (prä- vs. postoperativ) und der abhängigen Variable DR-Wert gerechnet. Es zeigte sich in allen 4 UICC-Stadien ein signifikanter Unterschied des DR-Wertes bzgl. des Messzeitpunktes (p < 0.01) (Abb. 21). Determination ratio (DR) 0,50 0,40 0,30 0,10 0,15 -0,10 UICC-Stadium 1 -0,30 -0,50 -0,70 UICC-Stadium 2 -0,55 UICC-Stadium 3 -0,76 UICC-Stadium 4 -0,90 -0,96 -1,10 -1,20 -1,30 -1,36 -1,46 -1,50 Abbildung 21: Prä- und postoperative DR-Werte bei den UICC-Stadien I-IV. In allen Stadien findet sich ein signifikanter Abfall der postoperativen DR-Werte im Vergleich zu präoperativ (p<0.01). 3.1.3.7 Weiterhin Korrelation der Albumin-ESR mit postoperativen Komplikationen wurde untersucht, ob eine Minor- oder Major-Komplikation im postoperativen Verlauf mit einer signifikanten Änderung des postoperativ vs. präoperativ gemessenen DR-Wertes korreliert. Komplikationen traten in der Divertikulitis- und in der Karzinom-Gruppe auf, jedoch nicht bei Patienten, die wegen kolorektaler Adenome operativ oder interventionell behandelt wurden. Hinsichtlich der postoperativ aufgetretenen Komplikationen wird auf Tabelle 3 und 4 verwiesen. 46 Die nachfolgenden Tabellen geben die Komplikationen nach Operationsverfahren aufgeführt wieder. Tabelle 3 : Major-Komplikationen bei resezierenden Verfahren Operation RektumSigmaresektion resektion MAJOR AnastomosenInsuffizienz Sepsis/SIRS Platzbauch Hemikolektomie rechts Hemikolektomie Gesamt links 6 1 1 0 8 2 1 1 0 0 1 1 0 4 2 Tabelle 4 : Minor-Komplikationen bei resezierenden Verfahren Operation RektumSigmaresektion resektion MINOR Harnwegsinfekt Pneumonie Bauchdeckenabszeß Postoperative Atonie Hämatoserom 2 1 5 0 0 Hemikolektomie rechts 3 0 2 1 2 2 1 1 1 0 Hemikolektomie Gesamt links 2 0 0 1 0 9 2 8 3 2 a) Major-Komplikationen Es wurde eine Varianzanalyse mit den unabhängigen Variablen Gruppenzugehörigkeit (Major-Komplikation ja vs. nein) sowie der Messzeitpunkt (prävs. post-operativ) und der abhängigen Variable DR-Werte berechnet (Abbildung 22). Patienten, die eine Major-Komplikation im postoperativen Verlauf erlitten, hatten postoperativ einen signifikanten Abfall der DR-Werte (p=0.01). Der präoperative Mittelwert der betroffenen Patienten (n=14) lag bei –0,32 + 0,98. Postoperativ wiesen die Patienten einen Wert von –1,70 + 0,51 auf. In der Gruppe ohne MajorKomplikationen fanden sich präoperative Werte von 0,28 + 1,32. Postoperativ lagen sie bei –0,44 + 1,32 (Abb. 22). Unter 3.1.3.6.1 wurde aufgeführt, dass der postoperative Abfall der DR-Werte in der Divertikulitis-Gruppe unter Berücksichtigung der Variablen Gruppenzugehörigkeit und Meßzeitpunkt nicht signifikant war. Die hier aufgeführte Varianzanalyse des DR-Wertes bei Patienten mit und ohne MajorKomplikation in der Divertikulitis- und Karzinom-Gruppe legen jedoch einen Zusammenhang zwischen Auftreten einer Major-Komplikation und postoperativem Abfall des DR-Wertes nahe. 47 Determination ratio (DR) 0,30 0,28 0,10 -0,10 -0,30 -0,32 -0,50 -0,44 -0,70 Major Komplikation Nein Major Komplikation Ja -0,90 -1,10 -1,30 -1,50 -1,70 -1,70 Abbildung 22: Prä- und postoperative DR-Werte bei Patienten mit und ohne MajorKomplikation. Letztere zeigen einen signifikanten Abfall im postoperativen Verlauf. b) Minor-Komplikation Auch hier wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit den unabhängigen Variablen Gruppenzugehörigkeit (Minor-Komplikation ja vs. nein) sowie der Messzeitpunkt (prävs. post-operativ) und der abhängigen Variable DR-Werte gerechnet. Der postoperative DR-Wert sank bei diesen Patienten (n=24) ebenfalls signifikant ab, der Effekt war jedoch geringer als bei der Gruppe mit Major-Komplikation (Abb. 23, p = 0.02). Der präoperative Mittelwert der betroffenen Patienten lag bei –0,15 + 1,10. Postoperativ wiesen die Patienten einen Wert von –1,28 + 0,83 auf. 48 Determination ratio (DR) 0,30 0,10 0,23 0,15 -0,10 -0,30 -0,25 Minor Komplikation Nein -0,50 Minor Komplikation Ja -0,70 -0,90 -1,10 -1,30 -1,28 Abbildung 23: Prä- und postoperative DR-Werte bei Patienten mit und ohne MinorKomplikation. Letztere zeigen einen signifikanten Abfall im postoperativen Verlauf. 49 4. Diskussion 4.1 ESR als Methode zur Bestimmung der Konformationsänderung des Albumins Die ESR-Spektroskopie ist eine Magnetresonanzmethode, die eng mit der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie („nuclear magnetic resonance“, NMR) und mit bildgebenden Methoden auf Basis der kernmagnetischen Resonanz verwandt ist. Der Hauptunterschied besteht darin, dass in NMR-basierten Methoden Kernspins (v.a. von Wasserstoff, 1 H) detektiert werden, während in ESR- Methoden ungepaarte Elektronenspins (freie Radikale) vonnöten sind. Dabei ist die Tatsache, dass Radikale in biologischen Systemen recht selten in natürlicher Art und Weise vorkommen (anders als Wasserstoff) zwar ein Nachteil, macht die ESR Spektroskopie aber zu einer besonders selektiven Methode: man führt künstlich stabile, freie Radikale in sein zu untersuchendes System ein - ein Ansatz, den man als „Spinmarkierung“ bezeichnet, und der auch in dieser Arbeit genutzt wird. Einer albuminhaltigen Probe wird eine spinmarkierte Fettsäure (16-DoxylStearinsäure, s. Abb. 1) zugegeben, die an das Albumin bindet. Unter Zugabe eines polaren Lösungsmittels (Ethanol) werden Transportsituationen mit unterschiedlich polaren Milieus simuliert. Die in der ESR gemessenen Spektren werden auf der Basis mathematischer Modelle (Molecular Mobility Rotation = MMS-Technologie) berechnet. Die Analysen zeigen anhand der Messung und Analyse der Rotationsbewegung der spinmarkierten Fettsäuren, ob diese an das Albumin stark (entspricht starker Verlangsamung der Rotationsdynamik) oder weniger stark (entspricht geringerer Verlangsamung der Rotationsdynamik) binden (s. Abb. 2) (Hinderberger et al., 2006). Daraus lässt sich wiederum schließen, ob Albumin seine „Beladung“ an Fettsäuren verliert, bzw. ob es sich physiologisch wieder von seiner Ladung befreien kann (Muravsky et al., 2000, Matthes et al., 2001). Durch Veränderungen in der Bewegung der markierten Proben, sowie deren Distanz untereinander lassen sich sekundäre Veränderungen im Konformationszustand untersuchter Proteine darstellen. Im Laufe der letzten 50 Jahre ist es offensichtlich geworden, dass die ESR-Spektroskopie ein diagnostisches Potential birgt (Salikhov et al., 2005) In der vorliegenden Arbeit wurde die ESR nach den Protokollen bereits publizierter Arbeiten angewandt. Sie wurde mit spinmarkierter 16-DOXYLStearinsäure als Reportermolekül durchgeführt (Muravsky et al., 2000). Aus der statistischen ESR-Analyse, die sowohl physikochemische Aspekte (Bindungsaffinitäten) als auch externe Parameter (z.B. Ethanolkonzentration) beinhaltet, konnte mit hoher statistischer Signifikanz gezeigt werden, dass Normalgesunde, bzw. Patienten mit benignen chronischen Erkrankungen einen niedrigeren DR-Wert aufweisen als solche mit maligner Grunderkrankung (Kazmierczak et al., 2006). 4.2 Biologische Tumormarker beim Kolorektalen Karzinom Die Bestimmung von Tumormarkern erfolgt durch Messung von Proteinen im Plasma, die von Tumorzellen stammen, von gesunden Zellen sezerniert werden oder durch Botenstoffe induziert werden. Wichtig dabei zu unterscheiden ist, dass es klinisches Interesse an detektierenden, prädiktiven und prognostischen Markern gibt (Duffy et al., 2007). Zwar haben sich in den letzten Jahren bedeutende Fortschritte in der Diagnostik und Therapie der kolorektalen Tumore ergeben, die die Prognose des Patienten entscheidend verbessert haben. Als Beispiel hierfür ist insbesondere zu erwähnen, dass sich die neoadjuvante Radiochemotherapie und anschließende totale mesorektale Rektumresektion für Patienten mit Rektumkarzinom im UICC-Stadium II als vorteilhaft hinsichtlich deren Gesamtüberleben herausgestellt hat (Sauer et al., 2004). Allerdings besteht noch Bedarf an einem prädiktiven Serummarker, der Patienten selektionieren könnte, welche beispielsweise auf eine neoadjuvante Therapie ansprechen (responder) im Gegensatz zu solchen, die nicht profitieren (non-responder). Hinsichtlich prognostischer Marker hat das CEA Einzug in die klinische Routine gehalten. Park et al. (2006) haben insgesamt 631 Patienten mit Rektumkarzinom im UICC-Stadium II und III beobachtet, welche - ohne neoadjuvante Therapie einer kurativen Resektion unterzogen wurden. Die untersuchte Variable war 51 dabei die perioperative CEA-Veränderung (7 Tage prä- und 7 Tage postoperativ). Als Ergebnis dieser Untersuchung lässt sich festhalten, dass Patienten im UICC-Stadium III bei prä- und postoperativ erhöhten CEA-Werten eine höhere Rezidivrate hatten und ein schlechteres Gesamtüberleben aufwiesen als Patienten, deren CEA-Wert nur präoperativ erhöht war. Eine solche Unterscheidung konnte im Stadium II nicht herauskristallisiert werden. Die Aufnahme des präoperativen CEA-Wertes als Ergänzung der pTNMKlassifikation wird empfohlen (Compton et al., 2000), ist aber noch nicht etabliert. Erhöhte CEA-Werte sind assoziiert mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium, erhöhtem Risiko eines Rezidives und reduziertem Überleben (Compton et al., 2000). Auch wenn einige Daten dafür sprechen, dass Patienten mit einem präoperativ erhöhten CEA-Wert von einer adjuvanten Therapie profitieren könnten, sind die Daten zu inhomogen, um das CEA diesbezüglich als prädiktiven Marker zu verwenden (Locker et al., 2006). In der vorliegenden Untersuchung fanden sich präoperativ erhöhte Werte insbesondere im Stadium III. Eine Erhöhung des CEA kann allerdings auch bei zahlreichen gutartigen Erkrankungen wie der Leberzirrhose, einer Pankreatitis, des Lungenemphysems, der Bronchitis, der Colitis ulcerosa und beim Nikotinabusus auftreten. Als Hinweis auf oder als Verlaufsparameter von gastrointestinalen Tumoren insbesondere des kolorektalen Karzinoms - kann zudem das CA 19-9 bestimmt werden. Das CA 19-9 als eher unspezifischer Zusatzmarker für das kolorektale Karzinom kann bei Cholestase, Cholangitis, Pankreatitis, Magen-Darm-Ulcera, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Pankreatitis und entgleistem Diabetes mellitus erhöht sein (Moertel et al., 1993). Bei Bestimmung des CEA beim kolorektalen Karzinom wird die Tumormarkerkinetik und nicht der Einzelwert erfasst. So gilt z.B. eine neu aufgetretene Erhöhung eines Tumormarkers nach primär erfolgreicher Tumorbehandlung als Hinweis auf das Vorliegen eines Rezidives und das Abfallen eines initial erhöhten Wertes als Hinweis auf das Ansprechen einer Tumorbehandlung (Berman et al., 2000). Werden CEA und CA19-9 miteinander verglichen (Reiter et al., 2000) zeigt sich eine unabhängige prognostische Relevanz nur für das CA19-9. Nach Ausschluß der Patienten mit Dukes A und D Tumoren war CA19-9 (cut-off 60 U/ml) ein stärkerer Prädiktor für das Überleben als CEA. 52 Filella et al. fand bei 162 Patienten für CA19-9 (cut-off-Wert 37 U/ml) und CEA vergleichbare Ergebnisse in der Auswertung des rezidivfreien Überlebens (1994). Bestätigt wurden diese Ergebnisse in einer Untersuchung von 62 kurativ resezierten Patienten mit KRK im Stadium B oder C und Zustand nach adjuvanter Therapie (Behbehani et al., 2000). Besonderer Bedarf besteht hinsichtlich Markern, die zur Detektion des KRK beitragen können. So hat beim Screening des KRK das CEA bei niedriger Organ- und Tumorspezifität keinen Stellenwert (Yamashita et al., 2009). 4.3 Albumin – physiologische Aufgaben und Alterationen beim Malignom Zwei Drittel der im Plasma vorhandenen Proteine stellen Albuminmoleküle dar, sodass das Albumin den wesentlichen Anteil der Plasmaproteine ausmacht. Seine physiologischen Funktionen bestehen in der Aufrechterhaltung des onkotischen Druckes und im Transport einer Vielzahl von anderen Proteinen, sowie von verschiedenen niedermolekularen Substanzen. Ferner bildet das Albumin ein Reservoir für Aminosäuren zum Einbau in andere Proteine. Es hat eine lange Halbwertszeit von 15-19 Tagen, wodurch sich die Halbwertszeit von gebundenen niedermolekularen Verbindungen dadurch verlängert, dass sie ansonsten metabolisiert oder renal eliminiert würden (Dennis et al., 2002). Darüber hinaus transportiert das Albumin Fettsäuren. Obwohl inzwischen sechs Bindungsstellen für Fettsäuren im Albuminmolekül identifiziert worden sind, transportiert es unter physiologischen Bindungen ein bis zwei langkettige Fettsäuremoleküle (Peters, 1996, Curry et al., 1998). Transportproteine wie Albumin binden Peptide, die unter unterschiedlichen biologischen Bedingungen freigesetzt werden. Es ist bekannt, dass maligne Erkrankungen sowohl die Konzentration, als auch die Funktionalität von humanem Serumalbumin beeinflussen können (Li et al., 2002, Mashevsky et al., 1994). Eine Arbeit aus dem Jahre 2005 (Lowenthal et al.) untersuchte Albuminassoziierte Peptide bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom. Die aus dem Serum von Patientinnen mit unterschiedlich fortgeschrittenem Ovarialkarzinom gewonnenen Proteine und Peptide, die aus 53 ihrer Bindung zu Albumin isoliert und analysiert wurden, waren unterschiedlichster biologischer Funktion. Bei Patienten mit Magenkarzinom haben sich Konformationsänderungen des Albumins als Indikator für ein fortgeschrittenes Tumorstadium herausgestellt, allerdings wurde in der entsprechenden Arbeit nur eine geringe Fallzahl von 20 Patienten untersucht (Afanaséva et al., 2004). In einer Untersuchung aus dem Jahre 2004 wurde der Zusammenhang zwischen einer Hypalbuminämie, dem Tumorvolumen und dem C-reaktivem Protein an 57 Patienten mit Lebermetastasen eines KRK untersucht. Es fand sich eine unabhängige Korrelation eines erniedrigten Albuminwertes mit dem C-reaktiven Protein, aber nicht mit dem Tumorvolumen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass eine Hypalbuminämie die systemische Entzündungsreaktion, jedoch nicht die Tumorgröße reflektieren (Al-Shaiba et al., 2004). Ein erniedrigtes Serumalbumin und ein erhöhtes CRP bieten als Ausdruck einer systemischen Tumorerkrankung einen Hinweis auf frühes Auftreten eines Tumorrezidivs und reduziertes Überleben bei Patienten mit Mamma- oder Rektumkarzinom (Kazmierczak et al., 2006). Es ist davon auszugehen, dass neben tumorspezifischen Einflüssen auch patientenbezogene Faktoren die große Variabilität im Krankheitsverlauf von Tumorpatienten bedingen. Daher können „wirtsspezifische“ Veränderungen in den Konzentrationen von AkutePhase-Proteinen wie CRP und Erniedrigungen der Albuminkonzentration im Serum als Ausdruck der systemischen entzündlichen Reaktion als unabhängige prognostische Faktoren gelten (McMillan et al., 2007). McMillan und seine Mitarbeiter haben im Jahr 2007 in einer Untersuchung an 149 Patienten mit primär operablem KRK und 84 Patienten mit primär nicht resektablen Lebermetastasen eines KRK die Beziehung zwischen klinikopathologischen Charakeristika, der systemischen entzündlichen Antwort und dem Überleben dieser Patienten analysiert. Dabei beinhaltete der modifizierte Glasgow Prognostic Score (mGPS) die Konzentration des C-reaktiven Proteins und des Albumins im Serum. Hierbei fand sich in der multivariaten Analyse eine unabhängige Assoziation des UICC-Stadiums, der Monozytenzahl und des mGPS mit dem tumorbezogenen Überleben. Kazmierczak et al. zeigten 2006, dass die ESR mit spinaktivierten Fettsäuren von Albumin bei Patienten mit 54 verschiedenen onkologischen Erkrankungen als Indikator für ein Rezidiv oder auch für das Ansprechen auf eine Therapie dienen kann. 4.4 Einfluss von demographischen und Krankheitsbezogenen Parametern auf die Albumin-ESR mit spinmarkierten Fettsäuren In der vorliegenden Arbeit werden erstmalig über 100 Patienten mit drei unterschiedlichen Albuminkonformation kolorektalen mittels Erkrankungen hinsichtlich der Elektron-Spin-Resonanz-Spektroskopie untersucht. Das Patientenkollektiv bestand dabei aus drei ähnlich großen Gruppen. Im Detail wurden untersucht: • 32 Patienten mit Sigmadivertikulitis • 29 Patienten mit kolorektalen Adenomen • 43 Patienten mit kolorektalen Karzinomen Auf die Interpretation der Ergebnisse bei den einzelnen Krankheitsgruppen wird weiter unten eingegangen. Das Spektralmuster bei allen zugrunde liegenden Erkrankungen hat sich als unabhängig von demographischen Faktoren wie Alter und Geschlecht erwiesen. Die gemessenen Veränderungen der Albuminkonzentration scheinen demnach nicht damit in Verbindung zu stehen. Publizierte Daten hinsichtlich dieser Fragestellung liegen nicht vor. Der Konformationszustand des Albumins, der mittels ESR darstellbar ist, scheint ein rein im Rahmen der Grunderkrankung zu deutendes Phänomen zu sein. 4.5 Patienten mit Adenomen und Divertikulitis weisen in der ESR ein anderes Spektralmuster auf als Patienten mit Karzinomen Im vorliegenden Patientenkollektiv zeigen sich sowohl bei Patienten mit adenomatösen Veränderungen als auch bei solchen mit Divertikulitis in der Albumin-ESR andere Spektren als bei Karzinompatienten. Da die Spektren den Konformationszustand des Albumins im Serum widerspiegeln, lassen sich anhand der erhobenen Daten die Ergebnisse zwischen malignen und benignen 55 Grunderkrankungen deutlich unterscheiden. Da in dieser Arbeit unter anderem die Wertigkeit der Albumin-ESR als Detektionsparameter für das KRK überprüft werden sollte, wurden die Patienten mit benignen Grunderkrankungen (Adenom und Divertikulitis) zu einer Gruppe zusammengefasst und Ergebnisse mit denen der Patientengruppe mit einem Adenokarzinom verglichen. Dabei ergab sich folgendes Bild: der auf der Basis der Albumin-ESR errechnete DR-Wert (Determination ratio) war bei Patienten mit maligner Erkrankung signifikant niedriger. Dies ist ein eindeutiger Hinweis auf eine Konformationsänderung des Albumins bei Patienten mit KRK. In dieser Arbeit wurden keine normalgesunden Patienten untersucht. Die Untersuchung der Proben von Patienten mit benignen Tumoren und mit Divertikulitis ergab sehr ähnliche Spektralmuster. Die Ergebnisse der Albumin-ESR von Patienten mit benignen Grunderkrankungen der vorliegenden Arbeit liefern eine Verteilung der Spektralwellen, wie sie für gesunde Individuen gezeigt worden ist (Matthes et al., 2001). Die für Karzinompatienten errechneten Werte entsprechen ebenfalls zuvor publizierten Daten (Matthes et al., 2001, Kazcmierzak et al., 2006). Bezogen auf die potentielle Rolle der Albumin-ESR als Detektionsmarker lassen sich aus den vorliegenden Ergebnissen hinsichtlich der DR-Werte bei Patienten mit Adenomen zwei Konsequenzen für den klinischen Alltag ziehen. 1. die Durchführung der ESR zur Detektion von kolorektalen Karzinomen scheint durchaus geeignet. Oder an dieser Stelle umgekehrt formuliert: liegt bei einem Patienten der klinische oder (familien-)anamnestische Verdacht nahe, dass ein Malignom vorliegen könnte, scheint die Albumin-ESR mit einiger Sicherheit diesen Verdacht aus dem Wege räumen oder bestätigen zu können, da die Spektralwellenverteilung bei karzinomatöser Erkrankung differiert. Nichtsdestotrotz ließ sich kein signifikanter Unterschied zwischen Patienten mit Adenomen und Patienten mit einem frühen Tumorstadium UICC I errechnen – allerdings sind die Fallzahlen, insbesondere in der Karzinom-Untergruppe UICC I, gering. Selbstverständlich sind größere Folgestudien zur Überprüfung der hier gemachten Beobachtung notwendig. 2. Nicht selten ergibt sich im klinischen Alltag die Situation, dass endoskopisch eine interventionell nicht abtragbare Läsion unklarer Dignität, die makroskopisch als Adenom eingeschätzt wird, vorliegt. Ein nicht erniedrigter DR-Wert könnte in solch einem Falle unterstützend in der Entscheidung 56 mitwirken, den betreffenden Patienten nicht radikal, sondern bspsw. mittels einer laparoskopischen Polypabtragung zu behandeln. In der nicht seltenen Situation, dass makroskopisch eine Läsion unklarer Dignität vorliegt, und entnommene Probebiopsien keinen Malignitätsnachweis liefern, könnte die Durchführung der Albumin-ESR richtungsweisend werden. 3. Die Patientengruppe mit Divertikulitis wurde unterteilt in Patienten mit chronischer und solche mit akuter Entzündung. Zwischen den Gruppen zeigte sich dabei kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der ESR-Spektren. Eine akute Inflammation scheint bei diesen Patienten den Konformationszustand des Albumins nicht zu beeinflussen. Allerdings muss darauf hingewiesen werden, dass sämtliche Patienten mit akuter Sigmadivertikulitis präoperativ antibiotisch behandelt wurden. Das Verteilungsmuster der Spektralwerte und die errechneten DR-Werte waren vergleichbar mit denen bei Patienten mit adenomatösen Erkrankungen. Allerdings lässt sich im Unterschied zur Adenomgruppe anhand der Verteilung der DR-Werte ein cut-off-Wert berechnen, mit dem Karzinompatienten mit guter Sensitivität und Spezifität von solchen mit Divertikulitis unterschieden werden können. 4.6 Postoperative Veränderungen der ESR-Spektren In der vorliegenden Untersuchung wurde bei allen Patienten, die operativ oder interventionell behandelt wurden, präoperativ und am 8. postoperativen Tage Serum entnommen und die Albumin-ESR durchgeführt. In sämtlichen Patientengruppen ließ sich dabei ein Absinken des postoperativen DR-Wertes verglichen mit dem präoperativen Wert beobachten. Die Halbwertszeit von Albumin liegt bei ca. 16 Tagen. Es ist bekannt, dass septische und inflammatorische Krankheitszustände durch ESR messbare Konformationsänderungen im gleichen Sinne wie in der vorliegenden Arbeit beschrieben, hervorrufen können (Gurachevsky et al., 2008). Im Rahmen der postoperativ einsetzenden katabolen Phase kommt es zur Ausschüttung von Mediatoren. Anhand der vorliegenden Ergebnisse lässt sich spekulieren, dass es in der ersten postoperativen Woche zu einer Akkumulation von Botenstoffen kommt, die an Albumin binden und dessen mittels ESR hier nachgewiesene Konformationsänderung hervorrufen. 57 Eine weitere Beobachtung der vorliegenden Arbeit ist, dass diejenigen Patienten, die im postoperativen Verlauf eine Komplikation entwickelten, einen deutlicheren Abfall der DR-Werte zeigten als solche mit unkompliziertem Verlauf. Die Komplikationen wurden in die Kategorien der schwerwiegenden und der weniger schwerwiegenden Komplikationen unterteilt. Diejenigen Patienten, die ernstere Komplikation hatten, zeigten dabei wiederum eine ausgeprägtere Konformationsänderung des Albumins. Dies ist ebenfalls am ehesten mit der vermehrten Freischüttung von Endotoxinen bei einer septischen oder im Rahmen eines SIRS auftretenden Komplikation mit konsekutiver Bindung von Liganden und damit detektierbaren Konformationsänderung zu erklären. 4.7 Die Änderung der ESR-spektroskopisch messbaren Albuminkonformation korreliert mit dem Tumorstadium bei den UICC-Stadien I-III In dieser Arbeit wird erstmalig die ESR von Albumin bei Patienten mit verschiedenen benignen und malignen kolorektalen Erkrankungen durchgeführt. Insbesondere wurden die Patienten mit KRK hinsichtlich ihres UICC-Stadiums in Gruppen untersucht und die etablierte pTNM-Klassifikation dadurch mit den gemessenen DR-Werten korreliert. In diesem Abschnitt soll die potentielle Rolle der Albumin-ESR als prädiktiver und auch als prognostischer Tumormarker diskutiert werden: Betrachtet man die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für die Patienten im UICC-Stadium I bis III, so zeigt sich, dass stadiumabhängig der DR-Wert niedriger wird. Patienten im UICC-Stadium I haben einen DR-Wert von 0,15 +/1,05, im Stadium II von -0,48 +/- 0,53 und im Stadium III von -0,76 +/- 0,37. Je fortgeschrittener das Tumorstadium also ist, desto ausgeprägter kommt es zu Konformationsänderungen im Albuminmolekül. Einschränkend diesbezüglich muss jedoch erwähnt werden, dass die Messwerte bei Patienten im metastasierten UICC-Stadium IV ein ganz anderes Bild zeigen: bei ihnen wurden durchgehend höhere DR-Werte gemessen als in den weniger 58 fortgeschrittenen Tumorstadien – eine Tatsache, die bislang nicht zu erklären ist. Es wäre zu erwarten gewesen, dass bei diesen Patienten die niedrigsten DR-Werte vorliegen. Stattdessen weisen diese Patienten höhere DR-Werte auf, die im Bereich derjenigen Patienten mit benignen kolorektalen Erkrankungen liegen. Vermutlich sind bislang unbekannte Mechanismen bei systemisch tumorkranken Patienten dafür verantwortlich. Es stellt sich die Frage, ob die Albumin-ESR als Ergänzung des pTNMStadiums dienen kann. Wie in der Einleitung dieser Arbeit bereits erwähnt, besteht ein klinisches Problem beim Kolonkarzinom darin, diejenigen Patienten im UICC-Stadium II und III zu detektieren, die einen Nutzen aus einer adjuvanten Chemotherapie hinsichtlich Ihres Gesamtüberlebens ziehen können. Als überprüfte prognostische Faktoren beim KRK gelten die Tiefeninfiltration des Primärtumors und das Vorhandensein einer Lymphknotenmetastasierung, die in der pT und pN-Kategorie der UICC berücksichtigt werden. Es ist jedoch bekannt, dass es einerseits Patienten mit einem Kolonkarzinom im UICCStadium II gibt, die durchaus von einer adjuvanten Chemotherapie profitieren könnten. Andererseits gibt es viele Patienten im Stadium III, die trotz einer applizierten Chemotherapie ein Tumorrezidiv und auch ein schlechtes Überleben aufweisen (Wolpin et al., 2008). Für das Rektumkarzinom wurde gezeigt, dass Patienten mit erhöhtem CEA weniger von einer neoajuvanten Radiochemotherapie profitieren als solche mit prätherapeutisch normalem CEAWert (Park et al., 2006). Auf Ebene der Genmutationsanalyse wurde für das metastasierte kolorektale Karzinom aktuell empfohlen, vor Beginn einer Therapie mit Anti-Epidermal-Growth-Receptor-Antikörpern eine Analyse des KRAS-Genes durchzuführen (Allegra et al., 2009). Es ist von großer klinischer Bedeutung, zu klären, ob sich in der günstigen Prognosegruppe UICC II Patienten befinden, welche zwar nach den aktuell geltenden Kriterien keine adjuvante Therapie erhalten, aber die von einer solchen Therapie profitieren können. Für die ungünstige Prognosegruppe sollte eine Differenzierung von Patienten erfolgen in solche, die von einer adjuvanten Chemotherapie Nutzen ziehen. Da die bislang überprüften biologischen Marker diese Fragen nicht beantworten können (Yamashita et al., 2009), wäre es von Interesse, in Folgestudien zu 59 überprüfen, ob die ESR von Albumin als biologischer Marker in dieser Fragestellung hilfreich sein kann. Eine Frage, die sich aus den vorliegenden Ergebnissen diesbezüglich aufwerfen ließe, wäre z.B., ob erniedrigte DR-Werte bei der ESR des Albumins mit dem Überleben betroffener Patienten korrelieren. Ferner sollte überprüft werden, ob diejenigen Patienten mit Kolonkarzinom im UICC-Stadium III, die klinisch erwiesenermaßen hinsichtlich Ihres Überlebens von einer applizierten adjuvanten Chemotherapie profitieren, a priori niedrigere ESR-Werte aufweisen als solche mit schlechterem Gesamtüberleben. In ähnlicher Weise sollte untersucht werden, ob es Patienten im UICC-Stadium II gibt, die präoperativ deutlich erniedrigte DR-Werte haben und im Verlauf ein Rezidiv entwickeln. Es müssten anschließend cut-off-Werte für die DR definiert werden, die als suspekt hinsichtlich eines aggressiven Tumorgeschehens gelten. Patienten im Stadium II, die einen solchen cut-off-Wert unterschreiten, sollten randomisiert werden in eine Gruppe, die adjuvant chemotherapiert wird und eine Gruppe, die gemäß den aktuellen Leitlinien nicht adjuvant therapiert wird. Aus den vorliegenden Ergebnissen und den aufgeführten Überlegungen lässt sich die Schlussfolgerung ziehen, dass die ESR von Albumin hinsichtlich ihrer potentiellen Rolle der Ergänzung des pTNM-Systems anhand verschiedener klinischer Fragestellungen an einem großen Patientenkollektiv aller UICCStadien überprüft werden sollte. 4.8 Korrelation der ESR mit CEA Da CEA in der serologischen Diagnostik beim KRK wie oben aufgeführt etabliert ist, wurde untersucht, ob sich gleichsinnige Ergebnisse bei eventuell vorhandenen Veränderungen dieses Markers mit dem DR-Wert ergeben. Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigt, dass die Albumin-ESR bei Patienten mit präoperativ erhöhten CEA durchaus deutlich erniedrigte Werte anzeigt. Dies ist insbesondere in den UICC-Stadien II und III der Fall. Aufgrund dieser Korrelation lässt sich unterstreichen, dass die Albumin-ESR durchaus zur Detektion des KRK geeignet zu sein scheint – eventuell als Ergänzung zum CEA, das sich als Verlaufsparameter etabliert hat. Zur Überprüfung dieser Hypothese sind große Patientenzahlen vonnöten. 60 4.9 Cut-off-Wert der Determination ratio zur Unterscheidung zwischen benignen und malignen Erkrankungen Von der Firma MedInnovation wurde auf empirischer Basis ein cut-off-Wert vorgeschlagen und aufgrund der statistisch relevanten Korrelation als Grenze der Wert 1 festgelegt. DR-Werte kleiner 1 wiesen eine aktive Tumorerkrankung nach (Matthes et al., 2001). Werte kleiner 1 wurden mit einer Sensitivität von 87% und einer Spezifität von 94% einem malignen Geschehen zugeordnet. Der DR-Wert ergibt sich als lineare Kombination der Verhältnisse der spektralen Komponenten 1) bis 3) (s. Abb. 5) für Proben verschiedener Konzentration an Fettsäuren und Ethanol. Der DR-Wert ist linear zu den Konzentrationen der Anteile der jeweiligen Fettsäurenkomponenten am Gesamtspektrum. D.h., die verschiedenen Anteile an Fettsäuren werden linear gewichtet (z.B. geht ein 60 %iger Anteil festgebundener Fettsäuren mit der Gewichtung 0,6 in die Berechnung des DR-Wertes ein). Zwar ist der empirisch als absolut festgelegte cut-off-Wert von 1 in dieser Studie nicht reproduzierbar als Unterscheidungskriterium zwischen benignen und malignen Erkrankungen. Vielmehr liegt ein Trennwert zwischen entzündlichen und malignen Erkrankungen deutlich niedriger, nämlich bei –0,44. Als eigentliches Unterscheidungskriterium scheinen sich stattdessen signifikante relative Unterschiede zwischen den DR-Werten von Patienten mit benignen und malignen Entitäten zu eignen. Ferner ist zu betonen, dass der DR-Wert auch bei anderen malignen Erkrankungen oder bei septischen Prozessen erniedrigt sein kann und keinesfalls eine Organspezifität aufweist (Seidel et al., 2005, Gurachevsky et al., 2008). 61 4.10 Potentielle Rolle der Albumin-ESR zur Detektion von kolorektalen Karzinomen In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass bei Patienten mit malignen kolorektalen Tumoren eine Änderung des Konformationszustandes des Albumins mittels ESR zuverlässig darstellbar ist. Verglichen mit Patienten mit benignen Kolonerkrankungen stellen sich signifikant niedrigere DR-Werte dar. Diese Beobachtung ist in Einklang zu bringen mit Publikationen über andere maligne Erkrankungen (Kazmierczak et al., 2006, Seidel et al., 2005). Hervorzuheben ist die Tatsache, dass Patienten mit Adenomen des Kolorektums keine erniedrigten ESR-Werte aufweisen. Dies gilt sowohl für low grade Adenome als auch für Adenome mit höhergradigen Dysplasien. Dieses Ergebnis ist als Folge davon zu interpretieren, dass Tumorzellen eine Reihe von bioaktiven Proteinen und Peptidfragmenten in die Blutzirkulation freisetzen (Lowenthal et al., 2005). Es ist gezeigt worden, dass solche freigesetzten bioaktiven Substanzen an Albumin binden, wodurch sich deren Halbwertszeit verlängert (Mehta et al., 2003, Liu et al., 2004). Diese Bindungen an das Albumin können allosterische Veränderungen an seiner Proteinstruktur hervorrufen. Dies hat zur Folge, dass seine Bindungs- und Transporteigenschaften modifiziert werden, wobei eine wesentliche dieser Modifikationen die Änderung der Fettsäurebindungen an Albumin ist. Fettsäuren können als Konsequenz dieser Modifikationen weniger oder gar nicht an Albumin binden, da ihre Bindungsstellen wegfallen (Liu et al., 2004) Diese Veränderungen sind mittels ESR detektierbar und die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind ein deutlicher Hinweis dafür, dass ebensolche Veränderungen bei Patienten mit malignen kolorektalen Tumoren auftreten. Die klinische Konsequenz, die sich aus diesen Ergebnissen herleiten lässt, ist, dass sich die ESR mit spinaktivierten Fettsäuren zur Detektion eines KRK eignet. Durch die Zugabe von Ethanol wird zum einen die Tertiärstruktur des Proteins teilweise denaturiert, und zum anderen die Solvatation der spinmarkierten Fettsäuren modifiziert. Diese Effekte führen zu einer teilweisen „Öffnung“ der Bindungsstellen im Labor und simulieren die normale Transportaktivität des 62 Albumins im Serum. Methodisch macht man sich in der komplexen ESRAnalyse also zunutze, dass maligne Karzinome schon in sehr frühen Stadien Biomarker in das Blut abgeben (z.B. Peptide), die ebenfalls an Albumin binden. Daher ergibt sich eine Fettsäurebindungsaffinität, die für gesunde und Patienten mit Malignomen deutliche Unterschiede aufweist. Entscheidend für die weitere Validierung der untersuchten Methodik ist es, abgesehen von klinisch-prognostischen Fragestellungen, zu evaluieren, ob sich eine Determinante auf dem Boden von spektroskopisch detektierbaren Veränderungen des Albuminmoleküls definieren lässt, die zuverlässig die Bindung von Substanzen, die beim malignen Geschehen freigesetzt werden, anzeigt. Wesentlich ist es auch, zu betonen, dass bislang noch nicht bekannt ist, wie die exakten allosterischen Veränderungen an den FettsäureBindungsstellen des Albuminmoleküls definiert sind (Hinderberger et al., 2008). Wie oben bereits aufgeführt, lassen sich mittels der hier bearbeiteten Methode bei verschiedenen Malignomen indirekt Konformationsveränderungen des Albumins detektieren. Besonders interessant wäre es, entitätsspezifische Konformationsänderungen des Albumins mittels speziellerer Methoden, wie Double-electron-electron-Resonance Spektroskopie (DEER) zu identifizieren (Hinderberger et al., 2008). Bei der Bestimmung von vielen bislang untersuchten Biomarkern handelt es sich häufig um kostenintensive Untersuchungen. Die ESR ist mittels eines Tischspektrometers eine einfach Handzuhabende und preisgünstige (45000 – 60000 Euro) Methode. In kurzer Zeit kann eine große Anzahl an Messungen durchgeführt werden. Daher birgt sie ein großes Potential, eine standardisierte und effiziente Methodik in klinisch-chemischen Laboratorien zu werden. Eine einzelne Serumuntersuchung kostet dabei ca. 15 Euro. Da die Methode in der medizinischen Diagnostik noch nicht etabliert ist, wäre es von Interesse, Netzwerke zwischen mehreren an Studien teilnehmenden Zentren zu initiieren, um die Validität erhobener Ergebnisse zu überprüfen. 63 5. Zusammenfassung und Aussicht: Zusammengefasst liefert die vorliegende Arbeit folgende Ergebnisse: • Bei Patienten mit kolorektalem Karzinom zeigt sich, verglichen mit Patienten mit gutartigen kolorektalen Erkrankungen, eine mittels ESR detektierbare Konformationsänderung des Albumins. • Zur Differenzierung von Patienten mit Karzinom und Divertikulitis anhand der Albumin-ESR lässt sich ein cut-off-Wert berechnen. • Es wird erstmalig gezeigt, dass mit Fortschreiten der Tumorerkrankung in Korrelation zu den UICC-Stadien I-III eine veränderte messbare Albuminkonformation mittels ESR zu registrieren ist. • Die gemessenen Spektralwerte sinken im unmittelbaren postoperativen Verlauf ab und zeigen somit eine Veränderung der Albumintransportfunktion an. • Komplizierte postoperative Verläufe mit septischem Krankheitsbild führen zu deutlichen Veränderungen der mittels Albumin-ESR ermittelten Spektren. Als Aussichten für zukünftige Untersuchungen sollten folgende Fragestellungen aufgestellt werden: • Die erhobenen Ergebnisse müssen an einem größeren Patientenkollektiv validiert werden. • Insbesondere: kann das stadienabhängige Absinken des DR-Wertes bestätigt werden? • Kann die Albumin-ESR hinsichtlich Rezidiverkennung und/oder Ansprechen auf eine Therapie dienen? • Kann die Albumin-ESR das TNM-System der UICC ergänzen und als prognostischer Marker dienen? • Welche sind die spezifischen Veränderungen der Albuminkonformation beim kolorektalen Karzinom und lassen sie sich von Veränderungen bei anderen Malignomen differenzieren? 64 6. Literaturverzeichnis Afanas'eva, A. N., Evtushenko, V. A. (2004). Conformation changes in albumin molecule as a marker of dissemination of the tumor process. Bull Exp Biol Med 138, 177-178 Allegra, C. J., Jessup, J. M., Somerfield, M. R., Hamilton, S. R., Hammond, E. H., Hayes, D. F., McAllister, P. K., Morton, R. F., Schilsky, R. L. (2009). 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Minor Histo- DR DR Komp. logie prä post ja/nein ja/nein 4,8 n n high grade 3,33 -0,32 4 j n pT3pN1M0 -0,32 -1,73 1 A TEM 79 m 2 K RR 76 m 4 D SK 65 w 4,8 n j chronisch -0,32 -0,36 5 A RR 64 m 3,7 n n high grade -0,81 -1,28 6 A TEM 45 m 4,8 n n high grade 1,27 n.u. 8 K SK 74 m 4,6 n j pT4pN2pM1 3,14 -1,43 9 A PR 60 w 4,5 n n low grade 3,26 10 K HR 76 m 3,5 n j pT3pN2pM1 -0,93 -1,74 11 D SK 71 w 4 n j chronisch -0,03 -0,85 12 A PR 72 m 4,3 n n low grade -0,65 -0,57 13 D SL 70 w 4,4 n n akut -0,55 -0,83 14 K RR 61 m 4,1 j n pT1pN0M0 -0,97 -1,63 15 A HL 63 w 4,3 n n low grade 0,12 -0,83 16 K HR 79 w 5,6 4,3 n n pT3pN0M0 -0,21 -0,44 17 K HR 86 w 1,4 4 n n pT3pN0M0 -0,59 -1,86 18 A PR 61 w 4,3 n n low grade 0,57 -0,03 19 A PK 68 m 4,5 n n low grade -0,59 -0,28 21 D SL 51 w 4,6 n n chronisch -0,88 -0,68 22 D SK 49 m 4,7 n n akut -0,67 -1,26 24 D SK 47 w 4,2 n n chronisch -0,62 -0,68 25 A PK 68 m 3,1 n n low grade 0,29 n.u. 26 K HL 79 w 805 3,9 n j pT3pN1pM1 -0,65 -1,42 27 K SK 61 m 4,7 4,8 n n pT4pN0M0 -0,35 -0,97 28 D HL 43 w 4,5 n n akut -0,57 -0,45 29 D HL 50 w 4,3 n n akut -0,90 -0,63 30 A PR 63 m 4,6 n n low grade -0,33 -0,37 32 K SK 76 w 3,5 n j pT3pN1M0 -0,84 -1,21 33 A PK 65 m 4,2 n n low grade -0,48 -0,01 34 A PR 79 w 4,4 n n high grade 1,46 -0,64 6,7 18,9 260 4,2 6,8 -0,41 79 Nr. Gruppe OP/ (D/A/K) Alter m/w Intervention CEA (ug/l) Albumin Major (g/dl) Komp. Minor Histo- DR DR Komp. logie prä post ja/nein ja/nein 35 D SK 75 w 4,8 n n chronisch 5,78 -0,85 37 K HR 85 m 3,5 n n pT3pN0M0 -1,24 -1,74 38 A TEM 73 m 4,2 n n high grade -0,24 -0,39 39 D HL 64 w 4,3 n j chronisch 3,29 0,96 40 K TR 70 w 12,7 4,2 n j pT4pN2pM1 -0,61 -1,66 42 K HL 68 m 3,7 4,1 n n pT4pN0M0 -0,58 -0,69 43 A PK 67 w 4,4 n n low grade -0,55 -0,48 44 K RE 72 m 3,8 4,1 n n pT1pN0M0 -0,28 -1,41 45 K HL 53 m 1,8 4,4 n n pT1pN0M0 -0,35 0,51 47 K SK 71 m 12,9 4,1 n j pT3pN1M0 -0,74 -0,81 48 K HR 73 m 10,3 4,1 j n pT4pN2M0 -0,53 -1,22 49 K TR 65 m 1,4 3,5 n n pT1pN0M0 1,27 -0,34 50 K HR 77 m 2,3 3,8 n j pT3pN0M0 -0,65 -1,96 51 A HR 70 w 3,8 n n high grade 0,22 -1,62 52 D SK 66 m 3,8 n n chronisch -0,29 -0,59 53 D SK 64 w 4,6 n j chronisch -0,73 -0,78 54 A TEM 67 m 4,5 n n high grade -0,76 -0,33 55 K SK 78 w 4 n j pT1pN0M0 -0,50 -2,09 56 D SK 54 w 4,5 n n chronisch -0,23 -0,67 58 A PK 65 m 5 n n low grade -0,25 -1,76 60 K HR 60 m 2,2 4,5 n n pT1pN0M0 0,51 2,43 61 K HL 84 m 68,1 3,4 j n pT4pN2M1 -0,56 -1,81 62 K HR 84 w 3,3 3,5 n j pT3pN0M0 -0,47 -1,97 63 K RR 67 w 6,7 4,5 n j pT3pN0M0 -0,34 -1,23 64 K HR 82 w 1,5 3,8 n j pT2pN0M0 -0,41 -1,07 65 D SK 65 w 4,3 n n chronisch -0,31 n.u. 66 K HR 68 w 4,5 n n pT4pN2pM1 0,67 -0,32 67 A PR 69 w 4,6 n n low grade 1,38 n.u. 68 D SK 48 m 3,9 n n akut -0,36 -0,42 69 D SK 47 m 4,5 n n akut -0,19 -0,86 70 D SK 49 w 4,1 n n akut -0,61 -0,89 72 D SK 60 w 4,3 n n akut -0,65 1,25 7,3 20 80 Nr. Gruppe OP/ (D/A/K) Alter m/w Intervention CEA Albumin Major Minor Histo- DR DR (ug/l) (g/dl) Komp. Komp. logie prä post ja/nein ja/nein 73 D SK 55 w 3,5 n n chronisch -0,64 1,96 74 A PK 68 m 4,2 n n high grade 1,86 0,03 75 K RR 66 m 2,6 4,3 j j pT2pN0M0 0,43 -1,83 76 K HR 76 m 6 3,9 n n pT4pN2M0 -0,26 -1,40 77 A HL 82 w 4,1 n n high grade -0,26 -1,47 78 K RR 74 w 2,2 4,3 n j pT4pN2M0 1,55 1,58 79 K RR 81 m 23 3,8 n n pT3pN2M0 0,68 0,47 83 K RR 71 m 3 4,4 n j pT1pN0M0 1,86 -0,56 84 A TEM 65 w 3,9 n n high grade 3,18 n.u. 85 K HR 85 w 1,9 3,9 n j pT1pN0M0 0,42 -1,89 86 K HL 61 w 1,6 4,4 n n pT2pN0M0 0,79 n.u. 87 K SK 83 w 2,2 4,3 n j pT3pN0M0 0,21 n.u. 88 K SK 81 w 44,4 2,6 j j pT4pN1M0 -1,43 -2,20 89 K HR 77 w 73,7 4 n j pT4pN1M0 0,73 -1,6 90 A KS 69 m 4,5 n n low grade 1,62 n.u. 91 D SK 72 w 5 n n chronisch 2,48 n.u. 92 D SK 60 w 4,6 j n akut 1,74 n.u. 93 A PK 75 w 4,6 n n low grade 2,47 1,46 94 K HR 84 w 1,6 4,6 n n pT3pN2M0 0,67 -0,74 95 C RR 73 m 1,4 4,7 n n pT3pN0M0 -0,02 0,21 96 C TEM 55 m 1,5 4,4 n n pT1pN0M0 1,19 n.u. 97 A HR 65 w 4,5 n n high grade 1,59 2,65 98 D SK 69 m 4 n j akut 0,46 -1,01 99 A RR 74 w 4,6 n n high grade 1,19 0,16 100 D SK 62 w 4,1 n n akut 1,54 0,48 101 A KS 62 w 4,5 n n high grade 4,05 2,15 102 K HL 81 w 4 j n pT3pN1M0 -0,70 -0,96 103 D SK 64 w 4,7 n n chronisch 1,26 2,76 104 D SL 61 w 4,6 n n chronisch 1,42 0,69 105 K HR 66 w 3,2 j n pT3pN0M0 -1,59 -2,44 106 A KS 84 w 4 n n low grade -0,2 0,93 107 K RE 75 w 3,3 n n pT2pN0M0 -1,77 -2,02 10,7 1,4 81 Nr. Gruppe OP/ (D/A/K) Alter m/w Intervention CEA Albumin Major Minor Histo- DR DR (ug/l) (g/dl) Komp. Komp. logie prä post ja/nein ja/nein 108 D SK 46 w 3,8 n n akut -0,41 1,09 109 D SK 74 w 4,4 n n chronisch -0,15 -2,15 110 D SL 45 w 3,9 n n akut 0,85 -0,9 111 K HR 69 w 2,9 n j pT3pN0M0 -0,03 -2,22 112 D SL 76 m 4 n n chronisch 1,06 -1,95 113 D SK 52 m 4 n n akut 0,02 -1,55 114 D SL 53 m 4,2 j n akut 1,86 -0,82 115 D SL 49 w 4 n n chronisch 2,69 4,36 116 A KS 77 m 4,3 n n high grade 0,57 -2,22 117 A PK 65 w 4,5 n n low grade 1,5 1,06 118 K RR 62 m 4,3 n n pT2pN0M0 1,58 -1,55 43,5 2,2 Im Einzelnen beinhalten die einzelnen Spalten folgende Informationen: Die Ziffern in der 1.Spalte von links dienen als Identifizierungsnummer für die Patienten, nicht als fortlaufende Nummerierung. Die 2. Spalte zeigt die Grunderkrankung auf: D=Sigmadivertikulitis, A= Adenom, K=Karzinom. 3. OP=Operation oder Interventionelles Verfahren: PK= Polypektomie Kolon, PR= Polypektomie Rektum, KS= Kolonsegmentresektion, TEM= transanale endoskopische Mikrochirurgie, SK= Konventionelle Sigmaresektion, SL= Laparoskopische Sigmaresektion, HR= Hemikolektomie rechts, TR= Transversumresektion, HL= Hemikolektomie links, RR= Rektumresektion, RE= Rektumexstirpation. 82 EINWILLIGUNGSERKLÄRUNG Hiermit willige ich Name, Vorname Geburtsdatum freiwillig ein, an der Pilotstudie ESR-Tumortest zur Diagnostik bei Patienten mit Kolonkarzinom verschiedener Stadien im Vergleich zu Patienten mit einer Divertikulitis und Adenomen Als Patient teilzunehmen, nachdem ich von Ärztin/Arzt Über Wesen, Bedeutung, Tragweite, möglichen Nutzen und etwaige Risiken aufgeklärt wurde. Diese Information wurde mir auch in schriftlicher Form ausgehändigt. Meine Einwilligung kann jederzeit, auch nachdem ich sie unterschrieben habe, ohne Angabe von Gründen widerrufen und auf eine weitere Teilnahme an der Studie verzichtet werden. Daraus würden mir für die weitere ärztliche und pflegerische Betreuung keine Nachteile erwachsen. Ich verpflichte mich, während der Teilnahme an dieser Studie jede ärztliche Behandlung anderer Art und die Einnahme rezeptfreier Arzneimittel dem Prüfarzt mitzuteilen. Ich willige darin ein, dass mich betreffende personenbezogene Daten und Gesundheits- bzw. Krankheitsdaten im Rahmen und zum Zweck des o. g. Forschungsvorhabens verarbeitet werden. Ich willige darin ein, dass meine im Rahmen der o.g. Studie erhobenen Daten aufgezeichnet, verschlüsselt (pseudonymisiert), verschlüsselt (pseudonym) gespeichert und an die MedInnovation GmbH sowie die zuständigen Behörden weitergeleitet und anonymisiert veröffentlicht werden. Ferner bin ich damit einverstanden, dass einem zur Verschwiegenheit verpflichteten Beauftragten der MedInnovation GmbH sowie der zuständigen Überwachungsbehörde zu Prüfzwecken stichprobenartig Einsicht in die im Rahmen der o. g. Studie aufgezeichneten Daten, soweit es sich um personenbezogene Daten handelt, gewährt wird. Im Rahmen der vorstehend beschriebenen Weitergabe von Daten und Einsichtnahmegewährung in die mich betreffenden Aufzeichnungen entbinde ich hiermit den Studienarzt von seiner ärztlichen Schweigepflicht. Darüber hinaus bin ich mit der Entnahme, Untersuchung sowie pseudonymisierten Lagerung meines Blutes für den Zweck der Studie durch den Studienarzt bzw. die MedInnovation GmbH einverstanden. Ich bin geschäftsfähig und in der Lage, meinen Willen aufgrund der mir gegebenen Informationen selbst zu bestimmen. Datum: Patient aufklärende Ärztin/Arzt Danksagungen Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. med. B. Mann für die Überlassung des Themas und seine Betreuung, Frau Dr. rer. nat. K. Schnurr für die Unterstützung der Studie und Einarbeitung in das Gebiet der ESR, Herrn Dr. rer. nat. Dariush Hinderberger für die fachliche Beratung, den Labormitarbeitern aus der Augusta-Kranken-Anstalt für die sorgfältige Bearbeitung der Proben. Herrn Dr. med. Marcos Gelos danke ich für seine Betreuung, Motivation und Kritik und meiner Familie, dass sie die zahllosen Stunden der Abwesenheit mitgetragen hat. Lebenslauf Ellen Welsing, geboren am 06. Juli 1967 in Essen, verheiratet, 3 Kinder, deutsch Schule, Studium und beruflicher Werdegang Seit Feb. 2009 Oberärztin an der Klinik für Allgemein- und Viszeralchirurgie, St. Josefs-Hospital Bochum-Linden (Leiterin: Prof. Dr. G. Möslein) Seit April 2005 Beginn der Promotion mit dem Titel: „Elektronen-SpinResonanz-Spektroskopie (ESR) von Albumin bei Patienten mit benignen und malignen kolorektalen Erkrankungen“ Sep. 2004 – April 2005 Mutterschutz/Elternzeit drittes Kind Seit August 2003 Weiterbildung Visceralchirurgie August 2003 Fachärztin für Chirurgie Mai 2001 – Dez. 2001 Mutterschutz/Elternzeit zweites Kind Jan. 1999 – Jan. 2009 Assistenzärztin an der Klinik für Allgemein- und Visceralchirurgie, Augusta-Kranken-Anstalt Bochum (Leiter: PD Dr. B. Mann) Juni 1998 – Jan. 1999 Mutterschutz/Elternzeit erstes Kind Seit Juli 1998 Approbation als Ärztin Jan. 1997 – Juni 1998 Ärztin im Praktikum an der Klinik für Allgemein- und Visceralchirurgie, Augusta-Kranken-Anstalt Bochum (damaliger Leiter: Prof. Dr. St. John) Okt. 1988 – Juni 1996 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum April 1996 Drittes Staatsexamen April 1995 – April 1996 Praktisches Jahr an der Augusta-Kranken-Anstalt Bochum (Wahlfach Gynäkologie) März 1995 Zweites Staatsexamen 2. klinischer Studienabschnitt Juli 1991 Erstes Staatsexamen Okt. 1990 – Juni 1991 1. klinischer Studienabschnitt Juli 1990 Ärztliche Vorprüfung Aug. 1987 – Okt. 1988 Krankenpflegeausbildung am Universitätsklinikum Essen Aug. 1978 – Juni 1987 Besuch des Städtischen Borbeck, Allgemeine Hochschulreife Mädchengymnasiums Essen-
