B1 Gress 91 2. Arbeits - Universitätsklinikum Ulm

B1 Gress
2.
Arbeits- und Ergebnisbericht zum Teilprojekt B1
Thema des Projekts:
Strukturelle und funktionelle Charakterisierung differentiell
exprimierter Gene beim Pankreaskarzinom
PD Dr. Thomas Gress
Abteilung Innere Medizin I, Universitätskliniksklinikum Ulm
2.1
Kenntnisstand bei der letzten Antragstellung und Ausgangsfragestellung
Ein Expressionsprofil liefert eine Liste mit hunderten bis tausenden von Genen, die als
potentielle Kandidatengen in Frage kommen. Keine Patentlösungen gibt es für die Selektion
relevanter Kandidatengene anhand solcher „Hochdurchsatz-Genexpressionsprofil-Analysen“
für eine weitere detaillierte Charakterisierung oder als „Targets“ für biomedizinische
Anwendung. Hier wird es erforderlich sein, neue „Hochdurchsatz-Verfahren“ zur seriellen
Charakterisierung von Kandidatengenen, sowie einfache in-vitro oder in-vivo Assays zur
Charakterisierung einer großen Zahl von Einzelgenen zu entwickeln. Angesichts der großen
Zahl von Genen, die in einem solchen Expressionsprofil enthalten sind, müssen an
Expressionsprofil-Analysen Strategien zur seriellen Charakterisierung von differentiell
exprimierten Genen angeschlossen werden. Gegenstand der letzten Antragsphase unseres
Projektes war es, Strategien und Techniken zu einer solchen „high-throughput“
Charakterisierung der ausgewählten differentiell exprimierten Gene zu entwickeln, und
anzuwenden. Die Ziele der letzten Antragsphase waren somit wie folgt definiert:
•
Etablierung von Techniken zur seriellen Analyse von Kandidatengenen
Identifizierung und Charakterisierung pankreaskarzinomspezifischer Transkriptionsfaktoren als zusätzliche Kandidatengene mit wichtiger physiologischer oder
pathophysiologischer Relevanz.
•
Selektion von differentiell exprimierten Genen oder potentiellen neuen
Transkriptionsfaktoren, die mit Proliferation, Differenzierung, Invasivität und
Metastasierung assoziiert sind, und/oder Zielgene von
mitogenen/wachstumsinhibierenden Signalkaskaden darstellen.
•
Strukturelle und funktionelle Charakterisierung unbekannter, differentiell exprimierter
Gene
91
B1 Gress
Diese Arbeiten sollen zu einer Selektion und Charakterisierung von relevanten „krankheitsassoziierten“ Genen oder „Krankheitsgenen“ führen, die unmittelbar als Grundlage für die
Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Ansätze dienen sollten.
2.2
Angewandte Methoden
Fokus unserer Arbeiten im Rahmen des SFB 518 ist die Untersuchung molekularer
Veränderungen beim Pankreaskarzinom auf der RNA Ebene. Hierzu werden verschiedene
molekulare Techniken eingesetzt, wobei die Verwendung der Array-/Chip-Technologie im
Vordergrund steht. Als Grundausstattung zum SFB hat uns das Universitätsklinikum Mittel
zur Beschaffung eines Storm 8600 PhosphorImager (Molecular Dynamics) zur Verfügung
gestellt, der essentiell für unsere bisherigen Arbeiten mit Arrays-/Chips war. Kürzlich wurden
uns vom IZKF Ulm Mittel zur Einrichtung einer DNA-Array-/Chip-Facility bewilligt, so daß
uns ab Jahresbeginn 2001 alle erforderlichen Einrichtungen zur Durchführung verschiedenster
Chip-/Array-Experimente zur Verfügung stehen. Zur individuellen Charakterisierung von
Genen kamen zell- und molekularbiologische Verfahren zum Einsatz, die im Detail in
Abschnitt 2.3 beim jeweiligen Projektteil beschrieben werden. Über den SFB 518 konnten wir
zusammen mit der Abt.Allgemeine Chirurgie und der Zentralen Tierversuchsanlage (ZVTA)
eine zentrale Ressource (Projekt C1) für Pankreaskarzinom-Xenografts einrichten. Somit
haben wir nun Zugang zu Material welches für alle unsere Arbeiten von Bedeutung war.
2.3
Ergebnisse und ihre Bedeutung:
Funktionelle und strukturelle Charakterisierung differentiell exprimierter Gene beim
Pankreaskarzinom
Ausgangspunkt für dieses Projekt waren mehr als 500 Gene, die wir im Rahmen
verschiedener differentieller Genexpressionsstudien (Gress et al Oncogene 13, 1819-1830,
1996, Gress et al, Genes Chromosom. Cancer 19, 97-103, 1997, und Geng et al
BioTechniques 25/3; 434-438, 1998) identifiziert haben. Da es sich bei etwa der Hälfte um
neue Gene mit unbekannter Funktion handelte, wurden verschiedene Strategien zur
Charakterisierung gewählt. Die einfachste Strategie bestand in der Sequenzanalyse und der
Identifizierung von neuen, differentiell exprimierten Genen, die signifikante Homologien zu
Genfamilien oder Genen mit bekannter Funktion in anderen Organismen zeigten. Ein Teil der
so in den letzten Jahren ausgewählten Gene ist unten aufgeführt. Zur Charakterisierung des
größten Teils der Gene mußte jedoch ein serieller Ansatz gewählt werden, bei dem Arrays der
differentiell exprimierten Gene für Expressionsprofil-Analysen mit geeigneten in-vivo und in92
B1 Gress
vitro Modellen verwendet werden. Dies soll die rationelle, serielle Identifizierung von
Pankreaskarzinom-spezifisch exprimierten Genen erlauben, die mit wichtigen phänotypischen
Charakteristika von Tumorzellen (Invasivität, Differenzierung, Metastasierung...) oder mit
relevanten wachstumsinhibierenden oder wachstumsfördernden Signalkaskaden (zb. TGFβ,
Ras) assoziiert sind. Hierzu musste jedoch zunächst unsere Array-Technologie optimiert
werden. Die einzelnen Arbeiten sind im folgenden Abschnitt beschrieben:
Serielle Charakterisierung differentiell exprimierter Gene
Optimierung der Array-/Chip-Technologie
Unser bis 1997 verwendetes System bestand aus in-situ cDNA-Arrays (Bakterienklone
werden auf Nylonmembranen gespottet und entsprechend prozessiert), die für differentielle
Hybridisierungen benutzt wurden. Die mit diesen Arrays erzielten Ergebnisse waren zu
variabel, um die oben formulierten differenzierten Fragestellungen mit hoher Spezifität zu
beantworten. Seit etwa 2 Jahren verwenden wir ausschließlich die weitaus teureren Arrays bei
denen PCR-Produkte der ausgewählten Klone (z.B. der differentielle exprimierten Gene) auf
Nylonmembranen transferiert werden. Aufgrund der etwa um eine logarithmische Ordnung
höheren Sensitivität markieren wir die mRNA Proben weiterhin mit 33P-dCTP. Auch wenn
wir so die individuellen Hybridisierunsergebnisse deutlich optimieren konnten, verblieb noch
das Problem der inter- und intraexperimentellen Variabilität von Hybridisierungen mit der
mRNA ähnlicher experimenteller Ansätze. Diese z.T. bis zu 20%-ige Variabilität läßt sich mit
keinem zur Zeit verfügbaren Array-/Chip-System beherrschen. Wie andere Arbeitsgruppen
können auch wir dieses Problem nur durch die wiederholte Durchführung und statistische
Auswertung
der
Expressionprofilanalysen
Expressionsprofilanalyse
fordern
wir
lösen.
inzwischen
6-8
Für
eine
Messwerte
pro
verlässliche
Gen
und
Expressionsprofil. Nur wenn die darauf folgende statistische Auswertung der Daten eine
geringe Streuung und signifikante Unterschiede zeigt, sind die Daten verwertbar.
Die unten aufgeführte Abbildung zeigt eine Auswahl von Genen, die bei einer typischen
Auswertung eines Expressionsprofils identifiziert wurden. In diesem speziellen Fall handelt es
sich um einen Array früher Serum-responsiver Gene beim Pankreaskarzinom. Verglichen
wurde die RNA von unstimulierten, vektortransfizierten PANC-1 Zellen mit der RNA von
unstimulierten PANC-1 Zellen nach stabiler Transfektion mit einem N17Ras-Konstrukt.
Ein weiterer Ansatz zur Optimierung dieser Analysen bestand in der Verwendung von
Subtraktionsprotokollen wie der cDNA-RDA (Representational Difference Analysis) und der
SSH (Supression Subtractive Hybridization) zur Anreicherung der Hybridisierungsproben für
93
B1 Gress
Gewebe- oder Zellspezifische Gene. Hier wurden Protokolle insbesondere für die
Verwendung von mit cDNA-RDA angereicherten Hybridisierungsproben erstellt, die
publiziert wurden (Geng et al BioTechniques 25/3; 434-438, 1998) und zu Verfassung eines
Protokol-Artikels für die Serie: Methods in Molecular Biology, Genomics Protocols
(Humana Press, im Druck) geführt haben.
Abbildung 1: Beispiele (14 hochregulierte Gene) für eine statistische Auswertung der oben
aufgeführten Expressionsanalyse von Vektor-transfizierten vs. N17Ras-transfizierten PANC-1
Zellen.
18,00
16,00
Vektor
N17Ras
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
Folgende
serielle
wurden
LE
1
nach
SQ
ED
N
T2
K
A
1
fu
rin
56
3
YB
ID
Charakterisierungsexperimente
C
2
PL
O
D
in
1B
M
T
ct
ba
C
TG
F
D
K
Li
I-1
po
co
rti
n
2
A
nn
ex
in
V
C
M
T
1L
0,00
den
verschiedenen
Optimierungsschritten durchgeführt.
Untersuchung des durch TGFβ -induzierten Phänotyps von Pankreastumorzellen
Um den Phänotyp der durch TGFβ-Behandlung invasiv gewordenen Pankreaskarzinomzellen
näher zu untersuchen, haben wir Array-Hybridisierungen mit cDNA-Proben durchgeführt, die
für TGFß-regulierte Gene mittels cDNA-RDA angereichert waren. Diese komplexen cDNAProben wurden radioaktiv markiert, und mit DNA-Arrays hybridisiert, die mehr als 500 im
94
B1 Gress
Pankreaskarzinom überexprimierte Gensonden enthalten. Durch Vergleich der Profile
behandelter und unbehandelter Pankreaskarzinomzellen wollten wir Hinweise darauf
bekommen, welche Gene für die Ausbildung des TGFβ-induzierten Phänotyps verantwortlich
sind. Interessanterweise zeigte diese Untersuchung, daß nach einer 24-stündigen Behandlung
mit TGFβ die Pankreaskarzinomzellen u.a. Marker epithelialer Differenzierung wie z.B.
Zytokeratine verlieren, und Gene exprimieren, die üblicherweise nur in Zellen
mesenchymalen Ursprungs zur Expression kommen, wie z.B. Kollagene oder CTGF. Somit
kommt
es
nach
einer
24-stündigen
Behandlung
mit
TGFβ
zu
einer
epithelialen/mesenchymalen Transdifferenzierung (EMT) von Pankreaskarzinomzellen (Geng
et al 1999). Wie auch für einige wenige andere Tumorsysteme beschrieben, ist diese EMT mit
einer Zunahme des invasiven/metastatischen Potentials von Tumorzellen verbunden. Im
Rahmen dieser EMT kommt es u.a. auch zu Hochregulation und Aktivierung des Urokinase
Plasminogen Aktivator Systems und von MMP-2, die einen Teil der beobachteten Zunahme
der Invasivität vermitteln. Angesichts zunehmender Hinweise auf eine Interaktion der TGFßund der Ras-Kaskade bei der Vermittlung der durch TGFβ induzierten, phänotypischen
Effekte untersuchten wir, ob die Ras-Kaskade bei den beschriebenen Effekten von TGFβ bei
responsiven
Pankreaskarzinomzellen
von
Bedeutung
ist.
Tatsächlich
konnte
eine
Vorbehandlung von PANC-1 Zellen mit dem MEK-Inhibitor PD098059 in einer
Expressionsprofil-Analyse die Wirkung von TGFβ auf die Expression von 40-50% der TGFβTargetgene modulieren. U.a. wurde auch die durch TGFβ-induzierte EMT und die Zunahme
des metastatischen Potentials aufgehoben. 0
Identifizierung metastasierungs-assoziierter Kandidatengene
Zur Identifzierung von Metastasierungs-assoziierten Genen haben wir die SUIT-02 Zellinien
verwendet (Taniguchi et al Clin.Exp.Metastasis, 12, 238, 1994). Diese von Takeshi Iwamura
(Mijazaki,
Japan)
etablierten
Zellinien
stammen
aus
einer
Metastase
eines
Pankreaskarzinoms. Aus dieser Ursprungszellinie wurden Klone selektiert, die sich aufgrund
des spontanen metastatischen Potentials in Nacktmäusen unterscheiden. So zeigt z.B. die
Zellinie SUIT-02 Klon 007 ein starkes metastatisches Potential, während Zellinie SUIT-02
Klon 028 so gut wie nicht spontan in der Nacktmaus metastasiert. Insgesamt wurden Arrays
mit 1764 Genen in diese Expressionsprofil-Analysen miteinbezogen, wovon 86 in SUIT02007 hochreguliert, und 32 in SUIT02-007 runterreguliert waren. Die nach Klassen/Familien
geordneten Gene sind in dem unten aufgeführten Profil in Abbildung 2 aufgeführt.
95
B1 Gress
Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt jeweils 10 der in SUIT02-007 am stärksten hoch- oder
herunteregulierten, bekannten Gene. Interessanterweise sind Gene vermehrt exprimiert, die
mit dem metastatischen Phänotyp von Tumorzellen assoziiert sind, wie z.B. Integrine, MMP1,
MT1-MMP, tPA, während in der nicht-metastatischen Zelle z.B. TIMP3, ein Inhibitor von
Metalloproteasen, vermehrt exprimiert wird. Weitere Gene wie z.B. das zu den Serpins
gehörende Nexin und andere Gene mit bislang unbekannter Funktion werden zur Zeit näher
untersucht.
Tabelle 1
Expressions Profil SUIT 007 vs SUIT 028
2%
Cell Cycle Regulators
Intermediate Filament Markers
8%
32%
Apoptosis
6%
Oncogenes
DNA Damage Response, Repair &Recombination
13%
11%
Receptors
9%
2%
2%
Cell Fate & Development Regulators
2%
2%
Cell Adhesion & Motility
Angiogenesis Regulators
Invasion Regulators
2%
2%
Cell Cell Interactions
Growth Factors
3%
Cytokines
4%
ESTs
Others
96
B1 Gress
Abbildung 2:
In der metastatischen Linie 007 Ratio 007/028
überexprimiert
In der nichtmetastatischen Linie Ratio 028/007
028 überexprimiert
MMP-1
116,3
TIMP-3
9,3
Nexin
29,1
Caveolin-1
5,1
Vimentin
11,0
Heat shock protein HSP27
4,7
EGR-1 (KROX2)
11,0
Aquaporine 3
4,4
Zyxin related protein (ZRP-1)
10,2
Cell division protein kinase 4
4,0
Integrin alpha 7B
6,7
PIG-12
3,6
MMP-14 (MT1-MMP)
6,4
Rho GDP-dissoc. Protein inhib. 2
3,2
Annexin like EST
5,5
Caveolin-2
3,1
Integrin beta4
5,5
Cyclin B1
3.0
PCNA
2.8
Tissue type plasminogen activator 4,8
Verwendung der DNA-Array-/Chip Technologie zur Charakterisierung von
Signalkaskaden beim Pankreaskarzinom
Ziel dieses Vorhabens ist die Etablierung und Anwendung der Array-/Chip-Technologie zur
Identifizierung von target-Genen wichtiger Signalkaskaden in Pankreaskarzinomzellen. Da
unsere früheren Systeme zur Analyse der differentiellen Genexpression mit in-situ Arrays für
diese differenzierte Fragestellung nicht stabil genug waren, wurden zunächst Verfahren
etabliert, die durch eine kombinierte subtraktive Hybridisierung mit anschließender PCRAmplifikation die Herstellung von Hybridisierungsproben erlauben, die für target-Gene von
Signalkaskaden angereichert sind (Geng et al., 1998, 1999; Wenger et al., 1999). Mit
modifizierten Methoden der cDNA representational difference analysis (Geng et al., 1999;
Gress et al., 1997) konnten wir unter anderem TGFα/EGF-target-Gene in PANC-1-Zellen im
Zeitverlauf (0.5-4-24 h) identifizieren. Diese target-Gene stellen nun ein ideales read outSystem zur Untersuchung des Einflusses weiterer Signalkaskaden auf die TGFα/EGFKaskade dar. Zu diesem Zweck wurden mit diesen target-Genen Arrays-/Chips für
differentielle Genexpressionsanalysen hergestellt (expression profiling).
Durch die Benutzung dieser Subtraktionsprotokolle gelang es uns initial auch mit sogenannten
„in-situ colony Arrays“ ausgezeichnete, verläßliche Daten zu diesen differenzierten
Fragestellungen zu erhalten. Bei einem der in diesem Ansatz identifizierten TGFα/EGFTarget Gene, die gleichzeitig im Pankreaskarzinom überexprimiert sind, handelt es sich um
CTGF (Connective Tissue Growth Factor). CTGF ist Mitglied der neuen CCN-Genfamilie
97
B1 Gress
und wurde bislang überwiegend in Zellen mesenchymalen Ursprungs beschrieben.
Interessanterweise ist CTGF ein downstream-Mediator von TGFβ-Aktionen und ein
Zusammenhang mit Prozessen wie Proliferation, Embryonalentwicklung, Differenzierung,
Zelladhäsion und Fibrogenese wird vermutet. Die Bedeutung von CTGF für das
Pankreaskarzinom wurde in weiterführenden Arbeiten untersucht (Wenger et al, 1999). Dabei
zeigte sich erstmals, daß CTGF in Tumorzellen epithelialen Ursprungs nicht nur ein
immediate early target der TGFα/EGFKaskade, sondern auch ein frühes target von TGFβ
darstellt. TGFα/EGF-Stimulation bewirkt eine passagere Hochregulation der CTGFExpression nach 1-2 Stunden, während nach TGFβ-Stimulation die CTGF-Expression erst
nach 4 Stunden, dann aber protrahiert für 24-48 Stunden hochreguliert wird. Diese
Hochregulation ist mit einer Steigerung der Synthese von ECM-Komponenten durch die
Tumorzellen verbunden. Interessanterweise ist CTGF auch in Pankreastumoren stark
überexprimiert und die Stärke der Expression korreliert zur Fibrose und zur TGFβExpression. In Nacktmaus-Tumoren von Pankreaskarzinomzellen korrelierte die CTGF
Expression mit dem Grad der Fibrose und dem Kollagengehalt. Somit haben wir in diesem
Projekt ein Gen identifiziert welches möglicherweise als Mediator von TGFβ die Entstehung
der desmoplastischen Reaktion in Pankreastumoren vermittelt. Um diese Hypothese durch
experimentelle Daten weiter zu untermauern, haben wir eine transgene Maus hergestellt, die
CTGF unter der Kontrolle des Elastase-Promotors im Pankreas exprimiert. Zur Zeit werden
mehrere stärker und schwächer exprimierende Linien gezüchtet, um die Veränderungen im
Pankreas näher zu untersuchen.
Im weiteren Verlauf wurden auch für diese Fragestellung die optimierten PCR-ProduktArrays und die standardisierten Hybridisierungsverfahren mit sehr guten vorläufigen
Ergebnissen eingesetzt. Erste Ergebnisse z.B. mit N17Ras transfizierten PANC-1 Zellen zur
Identifizierung von RAS-Target-Genen sind im obigen Kapitel zur Optimierung der Array/Chiptechnologie beschrieben.
Charakterisierung einzelner Kandidatengene
Bedeutung von Proteasen und Proteaseninhibitoren als Kandidatengenen für das
Pankreaskarzinom
Bei den verschiedenen Expressionsprofil-Analysen wurden eine Reihe von Proteasen und
Proteaseninhibitoren als vermehrt im Pankreaskarzinom exprimiert identifiziert. Dazu
gehören bekannte Gene wie z.B. uPA/tPA, die Matrix Metalloproteasen (MMPs) und ihre
Inhibitoren (TIMP`s), sowie weitere, neue Proteasen/Proteaseninhibitoren. Angesichts der
potentiellen Bedeutung dieser Gene bei Prozessen wie Metastasierung, Invasion und
98
B1 Gress
Angiogenese habe wir ein besonderes Augenmerk auf diese Gruppe von Genen gerichtet. Hier
sollen nur Arbeiten beschrieben werden, die sich mit der Charakterisierung neuer Proteasen
oder Proteaseninhibitoren beschäftigen.
Klonierung neuer Proteasen/Proteaseninhibitoren:
TMPRSS3:
Bei einem der isolierten Gene handelt sich um eine neue Serin Protease der Chymotrypsin
Familie, deren 2.3 kb mRNA sehr stark im Pankreaskarzinom exprimiert wird. Dieses Gen
wurde TMPRSS3 (Transmembrane Protease Serine 3) genannt. Die TMPRSS3-Expression
korreliert mit dem metastatischen Potential von Pankreaskarzinomzellen. TMPRSS3 ist
membrangebunden und hat eine glykosilierte extrazelluläre Region, die eine Serin-Proteasen
Domäne enthält. In einer Reihe von biochemischen und funktionellen in-vitro und in-vivo
Experimenten konnte das Substrat von TMPRSS3 leider nicht identifiziert und die
proteolytische Aktivität nicht näher charakterisiert werden. Diese Arbeiten wurden bereits
publiziert (Wallrapp et al, 2000).
KOP:
Ein weiteres interessantes Gen kodierte für ein neues transmembranes Protein mit zwei
Kunitz-type Serin Proteasen Inhibitor Domänen welches KOP genannt wurde (Kunitz domain
containing protein overexpressed in pancreatic cancer). Dieser neue Serin-Proteasen Inhibitor
war aufgrund seiner Lokalisation an der Oberfläche der Tumorzellen ebenfalls ein
interessantes Gen bezüglich der Regulation von Invasion und Metastasierung und als „DrugTarget“. KOP war ausschließlich in Tumorgeweben und Zellinien und nicht in entzündlichen
oder normalen Geweben exprimiert. Die vorläufige Charakterisierung dieses Gens wurde
bereits publiziert (Müller-Pillasch et al 1998).
Identifizierung von neuen onkofötalen Genen
Häufig sind entwicklungsbiologisch relevante Gene später auch bei der Kanzerogenese von
Bedeutung. Die Identifizierung solcher onkofötaler Gene war auch einer der Schwerpunkte
unserer Arbeiten. Dabei konnten wir ein im Pankreaskarzinom vermehrt exprimiertes Gen
klonieren, welches 4 K-homologe (KH) Domänen enthielt, und KOC genannt wurde. (MüllerPillasch et al 1997). KH-Domänen werden in einer Reihe von RNA-bindenden Protein wie
z.B. hnRNP oder FMR gefunden und spielen unter anderem eine Rolle bei der
transkriptionellen Regulation der Expression einzelner Gene und bei der Lokalisation der
99
B1 Gress
RNA in der Zelle.
Weiterhin konnten wir zeigen, daß KOC während der
Embryonalentwicklung in Maus und Xenopus in frühen Stadien ubiquitär exprimiert wird. In
späteren Gestationsphasen wird eine spezifischere KOC-Expression im Darm, Pankreas,
Niere und Hirn gefunden. Somit handelt es sich um ein Gen welches sowohl bei der
Kanzerogenese als auch der Embryonalentwicklung im Pankreas eine Rolle spielt. Für eine
detaillierte Darstellung der Ergebnisse wird auf die bereits erschienen Publikationen
verwiesen (Müller-Pillasch et al 1999, und Müller-Pillasch et al 1997). Weitere Arbeiten zur
Charakterisierung von KOC wie z.B. die Herstellung einer transgenen Maus sind zur Zeit im
Gange.
Identifizierung eines Receptors für ein Toxin als neues therapeutisches Target
Im folgenden soll kurz über ein Gen berichtet werden, welches den Erfolg unserer Strategie
besonders deutlich zeigt. Es handelt sich hierbei um ein Gen, welches für ein transmembranes
Protein kodiert, das als Rezeptor für ein Toxin fungiert. Dieser Rezeptor wird in
Pankreaskarzinomen und in einer Reihe anderer gastrointestinaler Tumore vermehrt
exprimiert, wird in metastatischen Zellen vermindert exprimiert und in seiner Expression
durch TGFß reguliert. Da das Toxin problemlos in größeren Mengen produziert werden kann,
stellt es ein potentielles therapeutisches Agens dar, welches wir zur Zeit näher untersuchen.
Erste Ergebnisse sind im folgenden Abschnitt aufgeführt. Wir bitten um Verständnis dafür,
daß wir keine weiteren Daten zu dem Toxin aufführen können, da wir ein laufendes
Patentverfahren nicht gefährden möchten.
Bisherige Ergebnisse:
! Durch aufgereinigtes Toxin läßt sich an den Pankreaskarzinomzellinien Panc-1 und
MiaPaca2 ein dosisabhängiger zytotoxischer Effekt erzielen, der innerhalb von 30
Minuten zum Absterben von bis zu 90% der Zellen führt. Dies wurde im Trypanblau
Assay nachgewiesen. Diese Zellyse wird durch eine Membranleckage mit nachfolgendem
Ionen-Dysequilibrium bewirkt, was durch vermehrte Freisetzung des zuvor inkorporierten
radioaktiven Rubidiums (86Rb-Release Assay) nachgewiesen werden konnte (Abb. 3). Da
HFL Fibroblasten, die kein Toxinrezeptor exprimieren, nach Inkubation mit dem Toxin
keinerlei zytotoxischen Effekt zeigen, kann der Toxin-Effekt als spezifisch für die
Rezeptor exprimierende Zellen angesehen werden.
! Die Toxinrezeptor-Expression läßt sich durch exogene Zugabe von TGFß über 24 Stunden
signifikant herunterregulieren; dies wurde an Panc-1 Zellen gezeigt. Ebenso scheint bei
100
B1 Gress
Panc-1 Zellen FGF ein vermindernden Effekt auf die Toxinrezeptor-Expression zu haben,
während EGF und HGF ohne Effekt sind.
! Bei Panc-1 Zellen, die mit exogenem TGFß über 24 Stunden inkubiert wurden, und bei
Panc-1 Zellen, die stabil mit TGFß transfiziert wurden (von PD.Dr.Löhr, Rostock zur
Verfügung gestellt), zeigt bei gleichzeitig verminderter Rezeptor-Expression das Toxin
einen signifikant verminderten zytotoxischen Effekt (Abb. 3). Somit ist die Höhe der
Toxinrezeptor-Expression korreliert mit der Suszeptibilität für das Toxin.
! Der Toxinrezeptor ist hoch exprimiert im gesamten Gastrointestinaltrakt des Menschen,
daneben auch in Trachea, Lunge und Niere sowie Schilddrüse, Nebenniere und
Brustdrüse. Keine Expression findet sich in ZNS, Herz, Gefäßen, Muskel und Blutzellen.
! Hohe Toxinrezeptor-Expression findet sich außer bei Pankreaskarzinomen auch bei bisher
untersuchten Geweben von Primärtumoren des Colons und der Papilla Vateri (Abb.4).
! Injiziert man das Toxin in Nackmaus-Tumoren von Toxinrezeptor-tragenden Tumorzellen
kommt es zum Absterben der Tumorzellen im Xenograft während das Stroma intakt bleibt
(Abbildung 5).
80
% Rb Release
70
60
50
40
30
20
10
0
TGF MOCK
0,12µg/ml
TGF MOCK
TGF MOCK
0,25µg/ml
0,5µg/ml
TGF MOCK
1 µg/ml
Abbildung 3: Effekt von Toxin bei TGF-ß bzw. Mock-transfizierten Panc-1 Zellen,
quantifziert durch Übertritt von zuvor eingebautem
86
Rb in den Überstand nach 15 Minuten
Inkubation mit Toxin.
101
B1 Gress
Soft tissue sarcoma
Retroperitoneal tumor
Carcinoma of the Papilla Vateri
Carcinoma of the Caecum
Carcinoma of the Rectum
Carcinoma of the Colon
Carcinoma of the Colon
Gastric Cancer
Breast Cancer
Breast Cancer
Pancreatic carcinoma
Pancreatic carcinoma
Pancreatic carcinoma
Pancreatic carcinoma
Pancreatic carcinoma
Healthy Pancreas
Chronic Pancreatitis
Abbildung 4: Expression von Toxinrezeptor in diversen Tumoren und im gesunden Pankreas
bzw. bei chronischer Pankreatitis.
Abbildung 5: Übersichtsaufnahme von PANC-1 Nacktmaus Xenografts, die entweder mit
0,9% NaCl (linke Abbildung) oder dem Toxin (rechte Abbildung) injiziert wurden.
Biglycan
Eines der interessantesten Gene welches als im Pankreaskarzinom überexprimiert und durch
TGFß-reguliert identifiziert wurde, ist das „kleine leuzinreiche Proteoglycan (SLRP)“
Biglycan. Zu der SLRP-Familie gehören neun Mitglieder wie z.B. auch Decorin, die durch die
Ablagerung in der extrazellulären Matrix (ECM) und den leuzinreichen Proteinkern
charakterisiert sind. SLRPs scheinen Prozesse wie Matrixaufbau, Zelladhäsion, Migration und
Zellwachstum zu regulieren. TGFβ führte zu einer starken Induktion des SLRPs Biglycan in
responsiven Pankreaskarzinomzellen wie z.B. PANC-1. Diese Induktion der Expression
begann nach 8 Stunden und war nach 24 Stunden maximal.
102
B1 Gress
Immunfluoreszenzanalysen konnten zeigen, daß in-vivo in Pankreaskarzinomgeweben, der
größte Teil des Biglycans in den Stromazellen synthetisiert wird. Wegen der beindruckenden
Mengen an Biglycan im Stroma behandelten wir TGFß-responsive und nicht-responsive
Pankreaskarzinomzellen mit Biglycan und konnten feststellen, daß dies zu einer signifikanten
Proliferationshemmung aller Pankreaskarzinomzellen führte, die nach 24 Stunden maximal
war. Eine Zellzyklusanalyse zeigte, daß diese Proliferationshemmung mit einem G1-Arrest
assoziiert war. Weitere Arbeiten zur Aufklärung des zugrunde liegenden molekularen
Mechanismus sind zur Zeit im Gange.
Im Pankreaskarzinom vermehrt exprimierte Kinasen
In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Herrn Dr.Seufferlein (Projekt B3) werden im
Rahmen des SFB 518 im Pankreaskarzinom vermehrt zur Expression kommende neue
Kinasen charakterisiert. Dies hat unter anderem zur Klonierung und Charakterisierung der
Protein Kinase D2, einem neuen Mitglied der Protein Kinase D Familie von Serin-Threonin
Kinasen geführt (Sturany et al J.Biol.Chem. in press). (Weitere Details siehe Arbeitsbericht
und Fortsetzungsantrag Dr.Seufferlein).
Ziel
Identifizierung
und
Charakterisierung
Transkriptionsfaktoren
dieses Projektes war es Arrays-/Chips von
pankreaskarzinomspezifischer
Genfamilien
mit
wichtigen
physiologischen/pathophysiologischen Funktionen herzustellen, die dann in die oben
beschriebenen, seriellen Expressionsprofil-Analysen integriert werden sollten. Dies soll das
zu untersuchende Genspektrum erweitern, und mögliche Kandidatengene mit wichtigen
biologischen Funktionen identifizieren.
Dieser Projektteil wurde etwas modifiziert, da wir die geplanten Experimente nicht nur auf
pankreaskarzinom-spezifische, potentielle Transkriptionsfaktoren beschränken, sondern auch
auf weitere Familien oder Gruppen von Genen mit potentiell wichtigen biologischen
Funktionen bei der Kanzerogenese ausweiten wollten. Bisher wurden Arrays-Chips für
folgende Genfamilien/klassen hergestellt:
„Differentiell exprimierte Gene“:
ca. 500 Gene
„Potentielle Transkriptionsfaktoren“:
ca 400 Gene
„Zell-Zyklus-assoziierte Gene“:
ca 150 Gene
„Early Serum-Antwort Gene“:
ca 200 Gene
„Phosphatasen“:
ca 200 Gene
„G-Protein-gekoppelte Rezeptoren“:
in Entwicklung ca 250 Gene
103
B1 Gress
„Protein Kinasen“:
in Entwicklung ca 450 Gene
„Zelladhäsions-Proteine“:
in Entwicklung ca 150 Gene
Ein Teil der Arrays wurde bereits in die oben beschriebenen Expressionsprofil-Analysen
eingebaut.
2.4
Vergleiche mit Arbeiten außerhalb des Sonderforschungsbereichs und Reaktionen
der wissenschaftlichen Öffentlichkeit auf die eigenen Arbeiten
Wie bereits oben erwähnt, handelt es sich bei unserem bereits 1996 publizierten
Expressionsprofil des Pankreaskarzinoms um das erste Expressionprofil eines soliden
Tumors. Diese Vorreiterstellung ist inzwischen auch international anerkannt. Weiterhin haben
wir bereits seit vielen Jahren Erfahrungen in der Auswertung von Expressionsprofil-Analysen
sowie in der Charakterisierung von Kandidatengenen. Auch dieser Vorsprung wird weltweit
anerkannt was auch an der steigenden Zahl von Einladungen zu Vorträgen bei Symposien und
Seminaren sowie zu Übersichtsartikeln (siehe Publikationsliste) zu erkennen ist. Die oben
erwähnte
Kandidatengen-Strategie
zur
seriellen
Charakterisierung
von
in
einer
„Expressionsprofilanalyse“ identifizierten Gene, wurde ebenfalls von uns entwickelt. In den
letzten Jahren hat es auf dem Gebiet der DNA-Chip/-Array Technologie enorme technische
Fortschritte gegeben, die zu einer weiten Verbreitung geführt haben. Entscheidende
Fortschritte im Vergleich zu unseren früheren Arbeiten sind die Einführung von PCR-Product
Arrays auf Glass oder Nylon, die weitaus stabilere und reproduzierbarere Daten generieren
können. Die Einführung von Techniken und bioinformatischen Tools zur simultanen oder
parallelen Zweifarbenanalyse von Expressionsanalysen haben ebenfalls zu einer Optimierung
dieser Technologie geführt. Von größter Bedeutung waren sicherlich die Verbesserungen der
„Hardware“ und „Software“. Spotting-Robotor und Array Scanner sind inzwischen in einer
guten Qualität kommerziell erhältlich, im Laufe des letzten Jahres wurde BildanalyseSoftware erhältlich, die reproduzierbar gute Ergebnisse bei der Auswertung der
Hybridisierungsergebnisse bringt (z.B. Aida, Arrayvision, Genpix). Somit gibt es für viele
der technischen Herausforderungen mit denen wir gerade in der Anfangszeit dieses Projekts
(91-94) größte Schwierigkeiten hatten, inzwischen kommerzielle Lösungen. Die Akzeptanz
der Array-Technologie ist somit größer geworden, und sie stellt eine der Hauptsäulen im
„functional Genomics“ Zeitalter dar. Eine weitere entscheidende technische Neuentwicklung
stellt die Einführung der LCM-Mikrodissections Technik (LCM=Laser Capture Microscopy)
dar. Diese Technik erlaubt es erstmals eine größere Menge von Tumorzellen zu
104
B1 Gress
mikrodissezieren, um RNA aus einer reinen Tumorzellpopulation zu erhalten. Ähnliches gilt
für den Einsatz von Xenograft-Tumoren in denen es zu einer ca 5-fachen Anreicherung der
Tumorzellen im Vergleich zum Stroma kommt. Durch die Verfügbarkeit dieser beiden
Verfahren fallen Fehler durch das z.B. im Pankreaskarzinom sehr reichlich vorhandene
Stroma weg.
Mit dieser stark verbesserten Technik lassen sich inzwischen mit weitaus
geringerem Aufwand, aber mit vielfach höheren Kosten, gute Expressionsprofil-Analysen von
Tumorgeweben oder Zellen durchführen, als es mit den uns von 6-8 Jahren zur Verfügung
stehenden Verfahren möglich war (in-situ cDNA Genbibliotheks-Membranen mit
selbstentwickelten Bild- und Auswerteverfahren). Prominente Beispiele kommen aus der auf
diesem Gebiet führenden Arbeitsgruppe von Pat Brown (Stanford, USA), die viele Arbeiten
publizieren konnten, die eindrucksvoll belegen welche Bedeutung die durch Array-/ChipTechnologie beschriebenen Expressionsprofile für eine molekulare Klassifikation und
Differenzierung von Tumorzellen haben (z.B. Alizadeh et al, Nature 403, 503, 2000; Ross et
al, Nature Genetics 24, 227-235, 2000). Auch unsere Arbeiten haben von diesen technischen
Neuentwicklungen profitiert, auch wenn wir wegen fehlender finanzieller Möglichkeiten nur
langsam diese neuen Technologien erwerben und einsetzen konnten. Auch wir haben wie
oben erwähnt inzwischen die weitaus teureren cDNA-PCR-Produkt Arrays eingeführt, die wir
zunächst in begrenzten Zahlen am DKFZ in Heidelberg herstellen konnten. Inzwischen hat
uns die medizinische Fakultät der Universität Ulm Mittel bereitgestellt, um in
Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof.Döhner eine DNA-Chip Facility am IZKF
Ulm einzurichten. Diese ab Anfang 2001 zur Verfügung stehende Facilility verfügt über alle
erforderliche
Hardware
und
Software
für
„high-throughput“
DNA-Chip
Projekte
(BioRobotics MicroGrid II Spotting Roboter, Axon Arrayscanner, Arrayvision und GenPix
Software). Ebenfalls mit Mitteln der Fakultät als Grundausstattung zum SFB 518 wurde eine
LCM-Facility und mit Mitteln des SFB518 eine Xenograft-Facility eingerichtet. Somit haben
wir jetzt alle Voraussetzungen zur Optimierung der DNA-Chip-Technologie nach neusten
Standards. Einziges weiter bestehendes Problem sind die hohen Kosten für DNA-Chips, die
mit keinem Verbrauchsmittel-Etat abgedeckt werden können. Die Kosten für kommerzielle
„whole genome“ Chips sind prohibitiv und können nur in Ausnahmefällen für ausgewählte
Projekte verwendet werden (z.B Incyte Arrays mit 8000 Genen je ca 3500 DM, Affimetrix
Arrays mit 6500 Genen je ca 2500 DM, RZPD Unigene Arrays mit 35 000 Genen je ca. 5000
DM). Häufig reichen die zur Verfügung stehenden Mittel nicht mehr aus, z.B. um adäquate
Kontrollen durchzuführen, was die Wertigkeit dieses Verfahren massiv einschränkt. Die von
uns selbst hergestellten Arrays sind zwar vergleichsweise preiswert (100 Arrays mit 100
105
B1 Gress
Klonen kosten etwa 1500 DM) und können bis zu 5 mal wiederverwendet werden, sind aber
immer noch ein enormer Kostenfaktor der jeden Verbrauchsmittel-Etat sprengt. Bei
zunehmendem Bedarf an DNA-Chip-Technologie im Rahmen des SFB`s haben wir deshalb
die Einrichtung einer zentralen Facility für cDNA- und genomische Arrays/Chips
vorgeschlagen (SFB 518, Projekt C4), die den Zugang zu der Technologie gewährleistet und
Mittel für adequate Chip-Analysen zur Verfügung stellt. Andererseits soll durch eine
entsprechende Vorauswahl der Projekte über eine qualifiziertes Steering Kommittee der
Zugang zur dieser Technologie auf Projekte beschränkt werden, die für eine
Expressionsprofil-Analyse geeignet sind und die hohen Kosten rechtfertigen.
2.5
Offene Fragen
Aus dem oben geschilderten Arbeitsbericht ergeben sich eine Vielzahl von offenen Fragen,
die nur zu einem Teil im Rahmen des SFB 518 Folgeprojekt bearbeitet werden können:
! Serielle Charakterisierung von Kandidatengenen. In der laufenden Antragsphase
haben wir serielle Analysen zur Identifizierung TGFβ-regulierter und metastasierungsassoziierter Gene abgeschlossen, Arbeiten zur Identifizierung von Zielgenen der RasKaskade stehen kurz vor dem Abschluß. Weitere serielle Experimente sind für eine Reihe
von Fragestellungen erforderlich. Dazu gehören z.B.:
-
Detailierte Analyse des Einfluß vom Signalkaskaden und insbesondere der
Ras- und TGFβ
β -Kaskaden auf das Expressionsprofil der Kandidatengene.
Diese Arbeiten werden wir vorwiegend mit Pankreaskarzinomzellen die stabil mit
induzierbaren Konstrukten transfiziert wurden, oder mit Wachstumsfaktoren bzw.
Inhibitoren behandelten Zellen durchführen. Induzierbare Systeme wurden
inzwischen etabliert und folgende Ansätze sind geplant bzw. am Laufen:
Dominant-negativ HRas, NRas und KRas Konstrukte (Kollaborationsprojekt mit
Prof.Gierschik, Abt. Pharmakologie), Einfluß neuer Protein-Kinasen auf das
Expressionsprofil
(Kollaboration Dr.Seufferlein Innere Medizin I), Dominant-
negativ Typ II TGFß-Rezeptor (Kollaboration Dr.Menke, Innere Medizin I).
Weiterhin soll die Interaktion der TGFß und der Ras-Kaskade bei der Vermittlung
des TGFß-induzierten Phänotyps unter Verwendung der aufgeführten dominantnegativen
Konstrukte
untersucht werden.
106
und
entsprechender
pharmakologischer
Inhibitoren
B1 Gress
-
Expressionsprofil-Analysen
von
sogenannten
„Vorläuferläsionen“
im
Pankreaskarzinom. In diesem Projektteil soll das Expressionsprofil in
mikrodissezierten Zellen aus präneoplastischen Läsionen bestimmt und mit den
Profilen von Pankreaskarzinomzellen, gesunden Gangzellen und Azinuszellen
verglichen werden. Mit diesen Experimenten soll versucht werden die Frage zu
beantworten, ob sich neue Gene/Gengruppen identifizieren lassen deren
Expression mit der Entwicklung bzw. dem Phänotyp der präneoplastischen
Läsionen assoziiert sind. Weiterhin ist von Interesse, ob sich durch den Vergleich
der Expressionsprofile klären läßt, aus welcher Ursprungszelle sich die
präneoplastischen Läsionen entwickeln, und ob sie wirklich Vorläufer der duktalen
Tumorzellen
Prof.Mattfeld
darstellen.
Diese
(Abt.Pathologie,
Arbeiten
Universität
sollen
in
Ulm),
Zusammenarbeit
sowie
mit
Prof.G.Klöppel
(Abt.Pathologie, Universität Kiel), PD.Dr.S. Hahn (Medizinische Klinik,
Universität Bochum) durchgeführt werden.
-
Expressionsprofil-Analysen mit in-vitro Modellen zellulärer Differenzierung
Hier sollen verschiedene im Rahmen des SFB 518 etablierte in-vitro Modelle
zellulärer Differenzierung eingesetzt werden, um differenzierungs-assoziierte
Kandidatengene identifizieren.
-
Identifizierung von Expressionsmustern die für duktale Pankreaskarzinome
spezifisch sind. Über unsere bisherigen Expressionsprofil-Analysen hinaus
möchten wir mit den neuen DNA-Array- und Tumorzellanreicherungs-Techniken
(LCM und Xenografts) Expressionsmuster bzw. Cluster von Genen identifizieren,
deren Expression spezifisch für duktale Pankreaskarzinome sind. Hierbei möchten
wir Vergleiche erstellen mit den Expressionsprofilen anderer nicht-duktaler
Pankreaskarzinome (azinäre, endokrine, intraduktale, papilläre, ampulläre, seröszystische, muzinös-zystische), sowie anderer gastrointestinaler (Magen, Colon)
und extraintestinaler Tumore (z.B. Lunge, Prostata, Hoden, Mamma, Ovar). Diese
Arbeiten
sollen
einerseits
die
pathophysiologische
Besonderheiten
der
Kanzerogenese des duktalen Pankreaskarzinoms herausstellen, zum anderen sollen
die Daten eine molekulare Klassifikation von Tumoren erlauben, die als Grundlage
für diagnostische Ansätze dienen kann.
! Korrelation von Expressionsprofil-Analysen zu klinischen Daten. Wie Beispiele aus
der jüngsten Literatur zeigen (z.B. Alizadeh et al, Nature 403, 503, 2000), läßt sich mit
Expressionsprofilen eine neue molekulare Klassifikation von Tumoren erstellen. Eine
107
B1 Gress
solche molekulare Klassifikation kann Subgruppen von Tumoren erkennen, die sich z.B,
bezüglich der Prognose oder dem Ansprechen auf Therapieverfahren unterscheiden. Dies
soll in Zusmmenarbeit mit der Abteilung Allgemeine Chirurgie und der zentralen
Ressourcen-Facility des SFB518 (Projekt C1) durchgeführt werden. Besonders geeignet
ist in diesem Zusammenhang die Gruppe von kurativ operierten Patienten mit
Pankreaskarzinomen, die im Rahmen adjuvanter Therapiestudien prospektiv evaluiert
werden und für die genügend reseziertes Tumormaterial für Expressionsprofil-Analysen
zur Verfügung steht.
! Aufbau von Assays für die standardisierte „high-throughput“ Charakterisierung
von Kandidatengenen. Im Zuge der Charakterisierung ausgewählter Kandidatengene
müssen Assays ausgebaut oder etabliert werden, die in einem „high-throughput“ Ansatz
eine standardisierte, individuelle Gencharakterisierung erlauben. Zwar wird es uns mit den
oben genannten seriellen Charakterisierungsexperimenten gelingen, die Zahl von
Kandidatengenen einzuengen, trotzdem werden wir mit einer größeren Zahl von
Kandidaten (10-20) weiterarbeiten müssen. Da die volle molekulare und zellbiologische
Charakterisierung eines Gens mindestens 2-3 Jahre dauert, müssen hier im voraus
einfache, standardisierte Assays etabliert sein, die zügig essentielle funktionelle Daten
liefern. Hierzu gehören z.B. Selektion von „volle Länge“ cDNA-Klonen, Optimierung
von Verfahren zur raschen in-vitro Expression von Kandidatengenen in Säugetierzellen,
subzelluäre Lokalisierung der exprimierten Proteine, Funktionsuntersuchungen wie
Klonalitäts-Assays, Invasionsassays usw.
2.6
Publikationen (1998-2000)
Müller-Pillasch F., Wallrapp C., Bartels K., Varga G., Friess F., Büchler M, Adler G,
Gress,TM. Cloning of a new Kunitz-type protease inhibitor overexpressed in pancreatic
cancer. Biochim.Biophys.Acta 1395, 88-95 (1998)
Geng M., Wallrapp C., Müller-Pillasch F., Frohme M., Hoheisel J.D., Gress,TM. Isolation of
differentially expressed genes by combining representational difference analysis (RDA) and
cDNA library arrays. BioTechniques 25/3; 434-438 (1998)
Wenger C., Ellenrieder, V., Alber, B., Lacher, U., Hameister, H., Wilda, M., Iwamura, T.,
Beger, H.G., Adler, G., Gress,TM. Expression and Differential Regulation of Connective
Tissue Growth Factor in Pancreatic Cancer Cells. Oncogene 18, 1073-1080 (1999)
Geng, MM, Ellenrieder, V, Wallrapp, C, Müller-Pillasch, F, Hendler S, Adler G, Gress,TM.
Use of representational difference analysis to study the effect of TGFβ on the expression
profile of a pancreatic cancer cell line. Genes Chromosom. Cancer 26, 70-79 (1999)
108
B1 Gress
Müller-Pillasch F, Pohl B, Wilda, M, Lacher U., Beil U., Wallrapp C., Hameister H, Knöchel
W., Adler G,. Gress,TM. Expression of the highly conserved RNA-binding protein koc in
embryogenesis. MOD, 88, 95-99 (1999)
Wallrapp, C., Hähnel, S., Müller-Pillasch, F., Burghardt, B., Iwamura, T., Ruthenbürger,
M., Lerch, M.M., Adler, G. Gress,TM. A novel transmembrane serine protease (TMPRSS3)
overexpressed in pancreatic cancer. Cancer Research, 60, 2602-2606 (2000)
Sturany S, Van Lint J, Müller F, Wilda M, Hameister H, Höcker M, Brey A, Gern U,
Vandenheede J, Gress,TM, Adler G, Seufferlein T. Molecular cloning and characterisation of
the human protein kinase D2: a novel member of the protein kinase D family of serine
threonine kinases. J. Biol.Chem. in press.
Übersichtsartikel/Bücher:
Wallrapp C, Müller-Pillasch F, Micha A, Wenger C, Geng MM, Solinas-Toldo S, Lichter P,
Frohme M, Hoheisel JD, Adler G, Gress TM. Strategies for the Detection of Disease Genes in
Pancreatic Cancer. Annals of the New York Academy of Sciences USA, 880, 122-146
(1999).
Wallrapp C, Müller-Pillasch F, Micha A, Wenger C, Geng MM, Solinas-Toldo S, Lichter P,
Frohme M, Hoheisel JD, Adler G, Gress TM. Novel technology for detection of genomic and
transcriptional alterations in pancreatic cancer. Annals of Oncology 10, Suppl.4: 64-68
(1999).
Ellenrieder, V., Adler, G., Gress, T.M. Metastasis and invasion in pancreatic cancer. Annals
of Oncology 10, Suppl.4.: 46-50 (1999).
Geng, M, Wallrapp, C, Müller-Pillasch, F, Frohme, M, Hoheisel JD. Gress TM. Isolation of
differentially expressed genes by combining representational difference analysis (RDA) and
cDNA library arrays. In: Expression Genetics: Accelerated and High-Throughput Methods.
McClealand M, and Pardee AB., Eaton Publishing, Natick (MA), 145-154 (1999).
Gress TM (editor). Molecular Pathogenesis of Pancreatic Cancer. Biomedical and Health
Research Series Volume 41. IOS Press Amsterdam (2000).
Wallrapp C, Gress TM. Isolation of differentially expressed genes by representational
difference analysis. Genomics Protocols, Methods in Molecular Biology series, edited by
M.Starkey, The Humana Press Inc. in press.
Wenger C, Müller-Pillasch F, Buchholz M, Wallrapp C, Ellenrieder V, Adler G, Gress TM.
Application of array technology for expression profiling analyses of pancreatic cancer tissues
and cells. In: Molecular Pathogenesis of Pancreatic Cancer. Biomedical and Health Research
Series Volume 41. Edited by T.M.Gress, IOS Press Amsterdam, 74-79 (2000).
Wallrapp C, Hähnel S, Sorio C, Scarpa A, Gress TM. Genomic RDA for the identification of
chromosomal aberrations in pancreatic cancer: merits and drawbacks In: Molecular
Pathogenesis of Pancreatic Cancer. Biomedical and Health Research Series Volume 41.
Edited by T.M.Gress, IOS Press Amsterdam, 19-22, (2000).
Ellenrieder V, Sommer G, Geng MM, Adler G, Gress TM. Identification and characterisation
of TGFβ1 target genes in the pancreatic cancer cell line PANC-1. In: Molecular Pathogenesis
109
B1 Gress
of Pancreatic Cancer. Biomedical and Health Research Series Volume 41. Edited by
T.M.Gress, IOS Press Amsterdam, 64-68 (2000).
Buchholz, M, Boeck, W., Gress, T.M. Genexpressionsprofile in Tumordiagnostik und
Krankheitsmanagement. Medgen 12, 321-324 (2000).
Patente:
Erfindungs-/Patentanmeldung 10043964.0 vom 06.09.2000 (DPMA, München)
2.7
Zitierte Literatur
Almoguera C et al, Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-K-ras
genes Cell 1988; 53: 549-554
Caldas C et al, Detection of K-Ras mutations in the stool of patients with pancreatic
adenocarcinoma and pancreatic ductal hyperplasia. Cancer Res 1994a; 54: 3568-73
Caldas C et al, Frequent somatic mutations and homozygous deletions of the p16 (MTS1)
gene in pancreatic carcinoma. Nature Genet 1994b; 8: 27-32
Gress TM et al, Hybridization fingerprinting of high density cDNA-library arrays with
cDNA-pools derived from whole tissues. Mammalian Genome 1992; 3: 609-619
Gress TM et al, European Pancreatic Cancer Reference Library System (EPCRLS). Eur J
Cancer 1994; 30A: 1391-1394
Gress TM et al, A pancreatic cancer-specific expression profile. Oncogene 1996; 13: 18191830
Gress TM et al, Identification of genes with pancreatic cancer-specific expression by use of
cDNA representational difference analysis. Genes Chrom Cancer 1997; 19, 97-103.
Groudine M & Weintraub H, Activation of cellular genes by avian RNA tumor viruses.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1980; 77: 5351-5354
Hahn SA et al, DPC4. A candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1.
Science 1996; 271: 350-353
Korc M et al, Overexpression of the epidermal growth factor receptor in human pancreatic
cancer is associated with concomitant increases in the levels of epidermal growth factor and
transforming growth factor alpha. J Clin Invest 1992; 90: 1352-1360
Lemoine NR et al, The erbB-3 gene in human pancreatic cancer. J-Pathol.1992b, 168: 269273
Leung HY et al, Expression and functional activity of fibroblast growth factors and their
receptors in human pancreatic cancer. Int J Cancer 1995; 59: 667-675
Mueller-Pillasch F et al, Cloning of a gene highly overexpressed in cancer coding for a novel
KH-domain containing protein. Oncogene 1997b; 14: 2729-2733
110
B1 Gress
Scarpa A et al, Pancreatic
Adenocarcinomas
Am.J.Pathol. 1993; 142: 1534-1543
frequently show
p53
gene
mutations.
Solinas-Toldo S et al, Mapping of chromosomal imbalances in pancreatic carcinoma by
comparative genomic hybridization. Cancer Res 1996; 56: 3803-3807.
111
B1 Gress
112