EBV VCA IgG Aviditäts-Test - Szabo

®
1
EBV VCA IgG Aviditäts-Test
quantitativ
2
2-8°C
1
703259
IVD
96 TEST KIT
1
1
1. VERWENDUNGSZWECK
Der NOVITEC® VCA IgG Test ist ein quantitativer Mikrotiter-Enzymimmunassay zur Bestimmung der Avidität von IgG-Antikörpern
gegen Epstein-Barr Virus Viral Capsid Antigen (VCA) im Humanserum.
Wird dieser Test in Kombination mit anderen Testungen, wie die
Bestimmung von Anti-EBV-VCA-IgG, -IgM-Antikörpern, Anti-EBVEBNA-1-Antikörpern (EBNA-1 = EBV Nuclear Antigen 1), Anti-EBVEA-Antikörpern (EA = Early Antigen) und/oder Heterophilen
Antikörpern durchgeführt, so kann durch die Kombination dieser
Ergebnisse die Diagnose der Infektiösen Mononukleose (IM)
unterstützt werden.
5. ERFORDERLICHE MATERIALIEN, NICHT IM TESTKIT
ENTHALTEN:
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
2. ZUSAMMENFASSUNG
Die serologische Diagnose der primären EBV-Infektion ist ausreichend 1,2. Alternative Diagnostika, wie z.B. die kulturelle Anzucht von
EBV sind zeitaufwendig und erfordern frisch gewonnene NabelschnurLymphozyten. Der Antigen-Nachweis oder die Nukleinsäurebestimmung sind sichere Nachweise der Anwesenheit von EBV, erfordern
aber Biopsate oder anderes Probenmaterial und spezielle Reagenzien.
6.1
Der NOVITEC VCA IgG Test ist ein Enzym-Immuntest im Mikrotiterformat und detektiert VCA-IgG-Antikörper. Das Serum wird in die
Mikrotiter-Kavitäten pipettiert, die mit EBV-VCA-Antigenen beschichtet
sind. Die im Serum präsenten EBV-VCA-spezifischen Antikörper
binden an die festphasengebundenen Antigene. Ein Parallel-Ansatz
wird für 3 Minuten mit dem Aviditätsreagenz inkubiert und unspezifische
Bindungen werden durch Waschen entfernt. Nach Zugabe von
Meerrettich-Peroxidase-markiertem anti-humanen IgG (Immunglobulin
G, = Konjugat) und anschließendem Waschschritt wird ein chromogenes Substrat (TMB, 3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin) hinzugefügt.
Diese Reaktion wird nach Zugabe der Stopplösung spektralphotometrisch ausgewertet. Die Reduktion des Signals (OD) des
Aviditätsansatzes im Vergleich zum Ansatz ohne Aviditätsreagenz ist
bei >46% ein Hinweis auf niedrig avide anti-VCA IgG-Antikörper und
kann daher die Diagnose der EBV-assoziierten Infektiösen Mononukleose unterstützen. Prinzipien hierzu wurden von Wolter et al.,
1997; Gray, 1995 und Anderssen et al., 1994 publiziert.
®
6.2
6.3
6.4
4. REAGENZIEN
6.5
Jeder Testkit verfügt über ausreichend Reagenzien zur Durchführung
von 96 Bestimmungen.
1
1
1
2
1
2
Mikrotiter-Streifen mit 8 Kavitäten pro Streifen (96 Bestimmungen), einzeln abtrennbare Mikrotiter-Kavitäten, mit gereinigtem EBV-Glycin-Antigenextrakt beschichtet.
Positive Kontrolle (0,3 mL), bestehend aus humanem anti-VCA
Serum, 0,09 % NaN3.
Negative Kontrolle (0,3 mL), bestehend aus nicht-reaktivem
humanen Serum, 0,09 % NaN3.
High Kalibrator (1,8 mL), gebrauchsfertig vorverdünnt, bestehend aus humanem anti-VCA.
Mid Kalibrator (1,8 mL), gebrauchsfertig vorverdünnt, bestehend aus humanem anti-VCA.
Low Kalibrator (1,8 mL), gebrauchsfertig vorverdünnt, bestehend aus humanem anti-VCA. Trägerprotein und 0,09 % NaN3.
Probenverdünner (50 mL), Pufferlösung gebrauchsfertig, bestehend aus 0,01 M Phosphatpuffer-Lösung (PBS, pH 6,2-7,6),
Trägerprotein und 0,09 % NaN3.
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Zeitmessgerät (Timer)
Einwegpipetten oder Einwegpipettenspitzen
Pipetten 10-1000 µL
12 x 75 mm Röhrchen für die Probenverdünnung
Mehrkanal-Pipette (50-250 µL)
Deionisiertes oder destilliertes Wasser
Waschflasche oder Dispenser für den Waschpuffer
Abdeckung für die Mikrotiterplatte
Filterpapier oder Fließpapier
Vortex-Mischgerät
Einmalhandschuhe
Mikrotiterplatten-Lesegerät (Photometer) mit 450 nm-Filter
6. WARNUNGEN UND VORSICHTSMASSNAHMEN
3. TESTPRINZIP
12
Waschpuffer (50 mL), 20fach konzentrierte Pufferlösung (PBS)
bestehend aus 0,01 M PBS (pH 6,2-7,6) und 0,05 % (v/v)
Tween.
Enzym-Konjugat (12 mL), gebrauchsfertig, bestehend aus
peroxidase-konjugiertem anti-human-IgG (aus der Ziege) in PBS
(pH 6,2-7,6) und Trägerprotein.
Farbsubstrat (18 mL), bestehend aus 3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin (TMB).
Aviditätsreagenz (6 mL) gebrauchsfertig, Lösung enthält Harnstoff.
Stopplösung (18 mL), gebrauchsfertig, bestehend aus 0,5 N
Salzsäure. Hautkontakt vermeiden! (Sollte die Lösung mit Haut
oder Kleidung in Kontakt kommen, muss sofort gründlich mit
Wasser gespült werden!)
6.6
6.7
6.8
1
Die Reagenzien sind mit Ausnahme des Waschpuffer-Konzentrates und der Kontrollen gebrauchsfertig und als solche nur für
den In-vitro-Gebrauch einzusetzen. Die Reagenzien dürfen nicht
verdünnt werden, außer es wird gesondert darauf hingewiesen.
Reagenzien nur bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum verwenden. Die Haltbarkeitsdaten sind auf den Reagenzien-Etiketten aufgedruckt. Sollten Reagenzien nach Ablauf des Haltbarkeitsdatums gebraucht werden, kann dies die Test-Präzision
beeinträchtigen.
Mikrobielle Kontaminationen der Reagenzien können die Testpräzision vermindern. Mikrobielle Kontaminationen vermeiden,
indem sterile Einweg-Pipetten zum Pipettieren aus den Reagenzgefäßen verwendet werden. Niemals bereits entnommenes
Reagenz wieder zurück in die Reagenzflasche geben.
Die Reagenzien wurden aus biologischen Materialien hergestellt und sollten wie potenziell infektiöse Materialien behandelt
werden. Die Kontrollen dieses Tests wurden auf HBsAg, antiHCV-, Anti-HIV-1- und Anti-HIV-2-Antikörper getestet und für
negativ befunden. Diese Reagenzien entsprechend den Entsorgungsrichtlinien für infektiöses Material entsorgen.
Die Probenmaterialien können potenziell infektiöse Erreger enthalten und sollten entsprechend behandelt werden. Es gelten
die Richtlinien gemäß der Biostoffverordnung vom 27. Januar
1999 BGB1 im Umgang mit infektiösem Material.
Gebrauchten Waschpuffer ebenfalls gemäß den Entsorgungsrichtlinien für infektiöses Material entsorgen.
Die Stopplösung ist ätzend und mit Vorsicht zu behandeln. Sollte
diese Lösung mit Haut, Augen oder Bekleidung in Kontakt
kommen, muß das betroffene Areal sofort mit ausreichend
Wasser für ca. 15 Minuten gespült werden. Sind die Augen betroffen, sollte sofort ein Arzt hinzugezogen werden.
In einigen Reagenzien ist NaN3 hinzugesetzt, das mit Blei und
Kupfer zu explosiven Metall-Aziden reagieren kann. Bei der
Entsorgung von Reagenzien ist daher mit genügend Leitungswasser nachzuspülen, um die Entstehung von Ansammlungen
im Abwassersystem zu verhindern. NaN3 ist ein Giftstoff und
kann bei Einnahme toxische Reaktionen verursachen.
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13.5 Der gebrauchsfertige Waschpuffer ist ein Monat bei Lagerung
bei 2-8°C stabil, vorverdünnte Seren sind maximal 24 Stunden
stabil, wenn sie bei 2-8°C gelagert wurden.
13.6 Geeichte Flaschen für die Verdünnungen verwenden, die frei
von mikrobiologischen Kontaminationen sind.
7. PHYSIKALISCHE ODER CHEMISCHE ANZEICHEN
EINER INSTABILITÄT
Sollten die Reagenzien Präzipitate aufweisen und sollten sich diese
Präzipitate nach Erwärmung nicht auflösen oder die Ergebnisse
liegen außerhalb des definierten Bereichs, könnte dies ein Hinweis
auf eine mögliche Instabilität der Reagenzien sein.
14. VORBEREITUNG DER TESTDURCHFÜHRUNG
14.1 Gebrauchsanleitung aufmerksam lesen und Testanweisungen
streng einhalten, bei Nichteinhaltung kann das Testergebnis
ungültig werden.
14.2 Die Reagenzien müssen vor Gebrauch Raumtemperatur erlangt haben (18-25°C).
14.3 Separate Einweg-Pipetten oder Einweg-Pipettenspitzen für
jede Probe, Kontrolle oder Reagenz verwenden. So werden
Kreuz-Kontaminationen zwischen den Reagenzien bzw. Substraten und Proben vermieden. Die Reagenzien in der exakten
Reihenfolge wie angegeben einfügen. Zur Vermeidung von
Kontaminationen bereits in die Kavitäten pipettierten Reagenzien nicht berühren.
14.4 Gebrauchsfertige (1x) Waschpufferlösung herstellen.
14.5 Auf strikte Einhaltung der Inkubationszeiten achten. Erst wenn
die letzte Kavität pipettiert wurde, erfolgt der Beginn der
Inkubationszeit. Zur Einhaltung der akkuraten Inkubationszeiten nicht mehr als 96 Kavitäten auf einmal pipettieren. Abweichungen zur Testdurchführung können zu unerwünschten
Ergebnissen führen.
14.6 BESONDERER HINWEIS: Die Reproduzierbarkeit der Werte
hängt in hohem Maße vom sorgfältigen Waschen der Mikrotiterplatten ab. Daher die Waschsequenzen in dieser Gebrauchsanweisung genau beachten.
8. GERÄTE
Die Testreagenzien wurden so entwickelt, dass sie mit kommerziell
verfügbaren Geräten ausgewertet werden können. Die Beschreibung
der verwendeten Geräte und gerätespezifische Applikationen sind
den entsprechenden Handbüchern zu den Geräten zu entnehmen.
9. PROBENGEWINNUNG
9.1
9.2
9.3
Blutprobe gemäß gängiger Praxis gewinnen. Nach vollständiger
Koagulation sollte das Serum separiert werden.
Das Serum bei 2-8°C lagern, wenn der Test innerhalb von 24
Stunden durchgeführt werden kann, oder das Serum ist bei
-20°C über Monate haltbar.
Kein hyperlipämisches, ikterisches, hämolytisches oder bakteriell kontaminiertes Serum verwenden.
10. WARNUNGEN / BIOLOGISCHE GEFAHREN
Alle aus Blut stammenden Proben sollen als potenziell infektiös
behandelt und entsprechend entsorgt werden. Es sind die Richtlinien
gemäß der Biostoffverordnung vom 27. Januar 1999 BGB1 im
Umgang mit infektiösem Material anzuwenden.
11. REAGENZIEN-VORBEREITUNG
11.1 Vor Gebrauch alle Reagenzien auf Raumtemperatur (18-25°C)
bringen und leicht schütteln.
11.2 Nach Gebrauch alle Reagenzien wieder bei 2-8 °C aufbewahren.
11.3 Die Reagenzien unterschiedlicher Chargen nicht miteinander
mischen.
11.4 Alle Reagenzien, mit Ausnahme des Waschpuffers und der
Kontrollen, sind gebrauchsfertig. Sollte versehentlich zuviel
Reagenz pipettiert worden sein, ist dieses zu entsorgen und
nicht in die Reagenzflasche zurückpipettiert werden.
11.5 Der Inhalt der Flasche mit dem 20fachen Waschlösungskonzentrat ist in 1 Liter destilliertem/deionisiertem Wasser
aufzulösen und bei 2-8°C zu lagern. Bei Eintreten einer sichtbaren Trübung ist das Reagenz zu verwerfen.
HINWEIS: Bei dem Waschlösungskonzentrat kann es zu einer
Kristallbildung kommen. Es ist unbedingt notwendig, diese
Kristalle vor dem weiteren Gebrauch aufzulösen (im Wasserbad
auf 37°C erwärmen, rühren).
14.7 Blank: Die Blankkavität wird so behandelt, wie im Testprotokoll beschrieben (alle Komponenten werden pipettiert,
statt Serum wird Probenverdünner pipettiert!). Der Blankwert
dient zum Nullabgleich des Spektralphotometers.
l Qualitativer Test: Die alleinige Verwendung des mittleren
Kalibrators ist ausreichend!
l Quantitativer Test: Alle drei Kalibratoren müssen verwendet
werden.
15. TESTDURCHFÜHRUNG QUALITATIV:
15.1 Die Anzahl der Patientenproben bestimmen. Hinzu kommen
(Empfehlung als Doppelbestimmung):
2 x Normalserum, NS = Serumprobe Patient 1
2 x Aviditätsserum, AS = Serumprobe Patient 1
➤ zwei x niedriger Kalibrator
➤ zwei x mittlerer Kalibrator
➤ zwei x hoher Kalibrator
➤ zwei x Negative Kontrolle
➤ zwei x Positive Kontrolle
15.2 Es werden 10 µL jeder Probe sowie Positive und Negative
Kontrolle in je ein Teströhrchen mit 990 µL Probenverdünner
pipettiert (= Verdünnung 1:100). Gut durchmischen.
ACHTUNG: Kalibrator ist gebrauchsfertig, nicht verdünnen!
15.3 Die Anzahl der benötigten Kavitäten ist zu bestimmen für Blank,
Kalibrator, Patientenproben und Kontrollen. Die genaue Anzahl
der Kavitäten erhält man durch Trennen aus der Mikrotiterplatte.
15.4 100 µL Probenverdünner in die erste Kavität als Blank
(Abgleich) pipettieren.
15.5 100 µL mittlerer Kalibrator und Kontrollen sowie Patientenproben in die dafür vorgesehenen Kavitäten pipettieren.
15.6 Bei Raumtemperatur (22-27°C) für 60 ± 2 Minuten inkubieren.
15.7 Den Inhalt der Kavitäten absaugen.
15.8 Jede Kavität dreimal vollständig mit Waschlösung füllen und
wieder entfernen. Nach dem Waschvorgang muss die Waschlösung vollständig entfernt werden.
12. PROBEN-VORBEREITUNG
Der NOVITEC® Test wird mit Serum durchgeführt und erfordert 10 µL
Serum. Das Serum wird 1:100 in Probenpuffer (z.B. 10 µL Serum
+ 990 µL Probenpuffer) verdünnt und muss gut gemischt werden
(z.B. vortexen).
13. LAGERUNG
13.1 Das Haltbarkeitsdatum jedes Kits ist auf der Verpackung angegeben. Das Haltbarkeitsdatum der Reagenzien ist auf den
jeweiligen Reagenzfläschchen aufgedruckt.
13.2 Alle Reagenzien sind bei 2-8 °C zu lagern und vor Gebrauch auf
Raumtemperatur zu bringen. Angebrochene Mikrotiterstreifen
gut verschlossen im Beutel mit dem Trockenmittel bei 2-8°C
lagern.
13.3 Das Substrat lichtgeschützt in der Originalflasche aufbewahren.
13.4 Einmal entnommenes Reagenz bzw. Substrat niemals wieder
in das Originalfläschchen zurückgegeben. Längere Lagerung der
Reagenzien bei Temperaturen von entweder > 25°C, < 2°C
oder direktem Sonnenlicht vermeiden.
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15.8.1 100 µL des Aviditätsreagenz in die AS Ansätze pipettieren
und für 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
15.8.2 Waschen, wie in Punkt 15.8 beschrieben.
15.9 100 µL Konjugat in jede Kavität pipettieren.
15.10 Bei Raumtemperatur (22-27°C) für 30 ± 2 Minuten inkubieren.
15.11 Den Inhalt der Kavitäten absaugen.
15.12 Waschen, wie in Punkt 15.8 beschrieben.
15.13 100 µL Substrat in jede Kavität pipettieren.
15.14 Bei Raumtemperatur (22-27°C) für 30 ± 2 Minuten inkubieren (lichtgeschützt).
15.15 100 µL Stopplösung in jede Kavität pipettieren.
15.16 Den Boden der Mikrotiterplatte auf Kondenswasser, Salze
oder sonstige mögliche Störfaktoren für die anschließende
optische Messung überprüfen. Gegebenenfalls mit einem
weichen Tuch reinigen.
15.17 Mittels des Blank das Photometer abgleichen. Bei 450 nm
innerhalb von 30 Minuten nach der Zugabe der Stopplösung
auswerten. Eine monochromatische Messung ist unbedingt
erforderlich! Nicht bei bichromatischen Wellenlängen messen!
tation müssen die klinischen Symptome der Patienten und Ergebnisse
andere Labordiagnosen mitherangezogen werden1,2. Die Höhe der
gemessenen Ergebnisse sind nicht indikativ für die Gesamtmenge
an Antikörpern.
Negative Ergebnisse jedoch schließen die Diagnose Infektiöse Mononukleose nicht aus. Die Probe könnte vor dem ersten Erscheinen
von Antikörpern entnommen worden sein. Bei negativen Fällen aber
begründetem klinischen Verdacht auf eine Infektiöse Mononukleose
sollte in 4-5 Wochen eine erneut entnommene Probe getestet
werden.
16. TESTEVALUIERUNG
Für NS und AS bitte den Mittelwert aus zwei Ansätzen verwenden.
18.3 INTERPRETATION DER AVIDITÄTS-ERGEBNISSE
Kalkulation:
Alle Probenansätze werden in Units umgerechnet, wie unter 18.1
gezeigt. Nach Gray, 1995, gibt eine Reduktion von >50% des
Signales (OD = Optische Dichte bei 450 nm) des Aviditätsansatzes
(AS) gegenüber dem Normalserumansatz (NS) einen Hinweis auf
eine niedrige Avidität der Antikörper. Unsere Studien haben gezeigt,
dass dieser Cut-off bei uns bei > 46% liegt.
16.1 Die optische Dichte (OD = Extinktion) bei einer monochromatischen Wellenlänge (450 nm) bestimmen. Die OD-Werte
des Blanks werden von allen OD-Werten der Kontrollen, der
Kalibratoren und der Patientenseren rechnerisch abgezogen.
16.2 Für einen gültigen Testlauf muss die Absorption der Negativkontrolle weniger als 0,15 O.D. betragen. Der Wert der
Positivkontrolle liegt ungefähr fünf Standardabweichungen
(Absorption) oberhalb des Cut-off-Wertes.
NS – AS = delta Units, NS = 100%,
X = delta Units x 100
NS
Interpretation:
●
Wenn die Reduktion des Unit-Wertes > 46 % beträgt,
niedrig avide Antikörper, eher für eine frische EBVInfektion sprechend.
●
Wenn die Reduktion des Unit-Wertes <46 % beträgt,
höher avide Antikörper, eher für eine abgelaufene EBVInfektion sprechend.
17. QUALITÄTSKONTROLLE
Die Bestimmung der Aktivität der Positiven und Negativen Kontrolle wird nach der im nächsten Abschnitt beschriebenen Formel durch
geführt. Beide Kontrollen sollten innerhalb des im Beiblatt angegebenen Bereiches (U/mL) liegen. Die Interpretation der Ergebnisse
soll nur vorgenommen werden, wenn die Kontrollwerte innerhalb
der angegebenen Bereiche liegen.
Statistik: N= n1 + n2 = 52
Um den Cut-off für die Bestimmung niedrig bzw. hoch-avider
Antikörper zu bestimmen, wurden Seren von N = n1+n2 = 52
Individuen getestet.
18.1 QUALITATIVE AUSWERTUNG
FORMEL ZUR BERECHNUNG DER JEWEILIGEN AKTIVITÄTEN
n1 = 28 Proben mit hoch-aviden Antikörpern (hoch), ohne klinische
Manifestation einer Infektiösen Mononukleose (abgelaufene EBVInfektion) und n2 = 24 Proben mit niedrig-aviden Antikörpern
(niedrig) mit klinischer Manifestation einer Infektiösen Monukleose
der Patienten. Beide Gruppen gehören zu unterschiedlich statistisch
verteilten Gruppen, so dass deren Mittelwert unterschiedlich genug
ist, um einen ersten Cut-off zu etablieren:
Extinktion Patient (OD) x Aktivität Kalibrator (U/mL)
Aktivität Patient (U/mL) =
Extinktion Kalibrator (OD)
Nichtreaktiv: < 150 U/mL: keine spezifischen Antikörper nachweisbar.
Deskriptive Statistik zweier Variablen
Hoch, n1 = 28 und Niedrig, n2 = 24.
Grenzwertig: 150 - 200 U/mL: als negativ bzw. grenzwertig zu
bewerten. Test wiederholen!
Positiv: > 200 U/mL: spezifische Antikörper nachweisbar.
18.2 QUANTITATIVE AUSWERTUNG
Berechnung über eine Punkt-zu-Punkt-Standardkurve: Die entsprechenden Einheiten in U/mL werden auf der X-Achse logarithmisch gegen die Rohwerte der Kalibratoren (OD) auf der Y-Achse
linear aufgetragen. Durch Auftragen der OD der Patientenprobe in
die Kurve ist die entsprechende Einheit in U/mL zu ermitteln bzw.
abzulesen.
Nichtreaktiv: < 150 U/mL: keine spezifischen Antikörper nachweisbar.
Variable
Mean
S.D.
N
Hoch
Niedrig
25,46 12,96 2 8
76,25 12,93 2 4
Median n α Minimum Maximum
(50%)
25,00
80.00
3 units* 47 units
46 units 94 units
Hoch:
95% Percentil = 46,1
5% Percentil = 3,45
Niedrig:
95% Percentil = 93,25
5% Percentil = 47,25
* = units = Delta in %,
Wilk-Shapiro test for normality for n1 = p>0.1 (W =0.9582);
n2 = p<=0.05 (W =0.9085)
Grenzwertig: 150 - 200 U/mL: als negativ bzw. grenzwertig zu
bewerten. Test wiederholen!
Positiv: > 200 U/mL: spezifische Antikörper nachweisbar.
Der Cut-off dieses Tests wurde ermittelt durch Testung zahlreicher
negativer Patientenseren. Ergebnisse des Testsystems sind per se
nicht als diagnostisches Mittel verwendbar. Für eine Testinterpre910-703259
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7/16
Nach erfolgter EBV-Infektion sind das erste Auftreten und die Höhe
der Anti-EBNA-1-Antikörper häufig aussagefähig über den klinischen
Zustand des Patienten: Anti-EBNA-1-Antikörper sind während der
akuten Phase der Infektion nicht nachweisbar. Sie sind erstmals
nach etwa 1-2 Monaten nach Infektion nachweisbar und bestehen
meist lebenslang. Daher ist der Nachweis von VCA-IgG-Antikörpern
bei gleichzeitiger Anwesenheit von Anti-EBNA-1-Antikörpern ein
sicherer Ausschluß einer frischen EBV-Infektion! Anti-EBNA-1Antikörper erscheinen später als andere Anti-EBNA-Antikörper. In
Patienten mit Immunschwäche oder anderen angeborenen oder
erworbenen Immundefizienzen kann die Anti-EBNA-1 Antikörperantwort ausbleiben oder ist sehr schwach ausgeprägt. Dies ist auf
eine T-Zell-Dysfunktion zurückzuführen.
Die Avidität von anti-VCA-IgG-Antikörpern ist nach erstem Auftreten
zunächst relativ niedrig und wird durch Prozesse, wie die “somatische Mutation” innerhalb weniger Wochen höher.
Testcharakteristika bei unterschiedlichen Cut-offs:
19. GRENZEN DES VERFAHRENS
Mit diesem Test wurden keine Kreuzreaktivitäten evaluiert. Die VCAIgG-Charakteristika wurden für die Infektiöse Mononukleose erarbeitet, nicht aber für andere Erkrankungen wie das NasopharynxKarzinom, das Burkitt-Lymphom und andere lymphoproliferative Erkrankungen. Auch wurden keine Proben von Patienten mit Immunschwäche getestet. Dieser Test ist nur auf die Verwendung von Seren
abgestimmt.
Die serologische Diagnose der EBV-Infektion kann nur durch
Bestimmung von zwei oder mehr EBV-spezifischen Antikörpern
gestellt werden. Wurden EBV-spezifische Antikörper-Profile durch
Verwendung von Testkits unterschiedlicher Hersteller erstellt, so
ist Vorsicht bei der Interpretation geboten.
21. TESTCHARAKTERISTIKA
Prospektive Studien mit Serumproben von zwei US-amerikanischen
EBV-Referenzlaboratorien wurden zur Bestimmung der Testcharakteristika herangezogen.
99 Proben von Zentrum A und 317 Proben von Zentrum B wurden
verwendet. Bei 94 Proben von A und 287 Proben von B waren ausreichende Mengen an Serum vorhanden, um eine Evaluierung
durchzuführen. Die Proben von Zentrum A wurden gefroren verschickt
®
und in den NOVITEC -Testen (VCA-IgG, VCA-IgM, EBNA-1-IgG) und
einem anderen kommerziellen ELISA getestet. Die Proben von
Zentrum B wurden in der Immunfluoreszenz auf VCA-IgG-Antikörper
und in der ACIF (Anti-Komplementären Immunfluoreszenz) auf AntiEBNA-1-Antikörper getestet. Seren von Patienten, die auf eine frühe
oder kürzliche EBV-Infektion schliessen lassen, wurden auf AntiVCA-IgM-Antikörper in der Immunfluoreszenz getestet. Die Proben
von Zentrum B wurden im gefrorenen Zustand an den Hersteller
verschickt.
20. ERWARTETE ERGEBNISSE
Die zu erwartende Seroprävalenz ist abhängig von sozioökonomischen
Faktoren, der Geographie, dem Alter, der Rasse, dem verwendeten
Test und anderen, epidemiologischen und klinischen Kriterien, die
angewandt wurden, um das Patienten-Kollektiv zu selektieren.
Die Prävalenz der EBV-VCA-Antikörper und der EBV-EBNA-1-Antikörper ist von der jeweiligen geographischen Region abhängig. In
Entwicklungsländern und in tropischen Gebieten sind die meisten
Kinder im Alter von sechs Jahren bereits infiziert. Das klinische Bild
der Infektiösen Mononukleose hat einen hohen Manifestationsindex,
wenn die Erstinfetion mit dem Virus im Alter von 15-20 Jahren erfolgt. Diese späte Infektion mit EBV ist auf Nationen mit einem
hohen ökonomischen und hygienischen Standard beschränkt und
in mittleren und höheren Gesellschaftsklassen eines jeden Landes
zu beobachten.
Tabelle 1. Kriterien für die Interpretation
Interpretation
VCA IgG EBNA-1 IgG VCA IgM Heterophile Ak
Abgelaufene Infekt.
Kürzliche Infektion
Frische Infektion
Frische Infektion
Keine Infektion
Ein typisches Antikörperprofil ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1.
+*
+
+
-
+
+
-
+
+ oder +
-
+ oder + oder + oder -
* Einige Proben waren VCA-IgG negativ und EBNA-1-IgG positiv. Diese
sollten als abgelaufene oder kürzliche Infektion klassifiziert werden.
Auf der Basis dieser Kriterien wurden die ELISA-Ergebnisse des
Zentrums A mit den Ergebnissen aus Zentrum B (IFA/ACIF) verglichen
Tabelle 2. ELISA-Ergebnisse von Zentrum A
ELISA X
Kürzliche Inf. Frische Inf.
NOVITEC®
NOVITEC®
Kürzliche Infektion
Frische Infektion
Keine Infektion
Während der akuten Phase der IM treten IgG- und IgM-Antikörper
gegen das virale Kapsidantigen (VCA) nahezu gleichzeitig auf. Auf
Grund der variablen Inkubationszeit und unterschiedlichen Ausprägung der Symptome, zeigen zum Zeitpunkt der Serumentnahme
(beim Arzt) nahezu alle Proben einen relativ hohen IgG-Titer.
10-15% der IM-Patienten haben zum Zeitpunkt der ersten Probenentnahme keine messbaren VCA-IgM-Titer. Generell sind sowohl
IgG- als auch IgM-Antikörper erstmals nach 2-3 Wochen nachweisbar
und erreichen einen hohen Titer nach etwa 4-6 Wochen. VCAIgM-Antikörper sind schnell nicht mehr nachweisbar, während VCAIgG-Antikörper oft lebenslang erhalten bleiben. VCA-IgM-Antikörper
sind nicht notwendigerweise bei Reaktivierungen nachzuweisen.
910-703259
65
0
5
8
7
1
NOVITEC®
Tabelle 3. IFA/ACIF-Ergebnisse von Zentrum B
IFA/ACIF
Kürzliche Inf. Frische Inf.
Kürzliche Infektion
247
3
Frische Infektion
6
3
Keine Infektion
0
0
4
Keine Infekt.
0
0
8
Keine Infekt.
1
3
24
7/16
Ausgehend davon, dass die Ergebnisse zu „Keine Infektion“ richtig
negativ sind, wurden für die NOVITEC®-Tests folgende Leistungscharakteristika aufgestellt:
22. LITERATUR
1.
Tabelle 4. Relative Leistungscharakteristika
Zentrum/
Methode
Relative
Sensitivität
KonfidenzIntervall†
Relative
Spezifität
Konfidenz†
Intervall
Zentrum A (ELISA)
94,9%
93%
(80/86)
85-97%
100%
(8/8)
63-100%
99-100%
86%
(24/28)
67-96%
2.
3.
Übereinstimmung
Zentrum B (IFA)
100%
97,2%
(259/259)
Übereinstimmung
4.
† Das Konfidenzintervall (95%) wurde nach der „Exakt Methode“
berechnet.
5.
HINWEIS: Die Bezeichnung relativ bezieht sich auf den Vergleich
der Testergebnisse untereinander. Die Testergebnisse wurden nicht
korreliert mit An- oder Abwesenheit der Erkrankung. Die Richtigkeit
dieses Testvergleiches erlaubt keine Vorhersage einer Erkrankung
(„prädiktiver Wert“). Zentrum A hatte im Gegensatz zu Zentrum B
nicht das Alter der Patienten, denen Proben entnommen wurden,
mitgeteilt. Die Altersgrenzen und die Einteilung nach Infektion sind
in der Tabelle 5 wiedergegeben:
6.
7.
Lennette, ET. Epstein-Barr Virus (EBV). In Diagnostic Procedures for
Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections, 7th Ed.(EH Lennette,
DA Lennette, ET Lennette) American Public Health Association,
Washington D.C., 1995.
Lennette, ET. Epstein-Barr Virus. In Manual of Clinical Microbiology,
6th Ed. (PR Murray, EJ Baron, MA Pfaller, FC. Tenover, RH Yolken).
ASM Press, Washington D.C., 1995.
Evans, AS and JC Niederman. Epstein-Barr Virus. In Viral Infections
of Humans, Epidemiology and Control, 2nd Ed. (AS Evans) Plenum
Medical Book Company, New York, New York, 1982.
Andersson et al., 1994. The avidities of IgG directed against viral
capsid antigen (VCA) or early antigen (EA): useful markers for a
more significant Epstein-Barr virus serology. J Med Virol, 43: 238244.
Gray, 1995. Avidity of EBV VCA-specific IgG antibodies: Distinction
between recent primary infection, past infection and reactivation. J
Virol Methods, 52: 95-104.
Wolter et al., 1997. Avidity determination of a basic immunological
mechanism allows improvement of the serodiagnosis of infections.
Clin Lab 43: 125-135.
Gärtner BC, Hess RD, Bandt D, Kruse A, Rethwilm A, Roemer K,
Mueller-Lantzsch N. Evaluation of four commerically available
Epstein-Barr Virus enzyme immunoassays with an immunofluorescence assay as the reference method. Clin Diag Lab Immunol,
10:78-82, 2003.
Tabelle 5. Infektions-Klassifizierung anhand des Alters
Alter
(Jahre)
Kürzliche Infektion Keine Infektion Abgelauf. Infektion
<8
2(11%)
6 (32%)
11 (58%)
8-18
5 (12%)
13 (31%)
24 (58%)
18-25
1 (4%)
1 (4%)
24 (92%)
25-45
2 (2%)
3 (3%)
105 (95%)
> 45
1 (1%)
0
78 (99%)
Daten zur Testpräzision
Die Testpräzision wurde durch Bestimmung von acht Proben, die
in Duplikaten pro Lauf und je zweimal an 20 darauffolgenden Tagen
ermittelt.
Tabelle 6. Testpräzision
Zentrum A
Zentrum B
Intraassay Interassay Intraassay Interassay
Units/mL Beurteilung Var. (%CV)
Var. (%CV) Var. (%CV) Var.
(%CV)
1757
1542
1359
961
944
739
493
460
255
245
Hoch
Hoch
Hoch
Moderat
Moderat
Moderat
Moderat
Moderat
Niedrig
Niedrig
3
4
3
4
4
5
6
5
5
8
5
6
6
7
7
7
10
8
8
10
3
5
6
5
5
6
10
6
14
10
6
6
7
8
13
13
14
16
19
19
Weitere Leistungscharakteristika des VCA-IgG- Tests sind unserer
Multicenter-Studie zu entnehmen, wie in Gärtner et.al., 2003,
publiziert4.
910-703259
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Symbols used and their Explanation
ZUSAMMENFASSUNG TESTDURCHFÜHRUNG
NOVITEC® EBV VCA IgG Aviditäts-Test
●
Waschpuffer aus Waschkonzentrat herstellen.
●
Jede Kontrolle und jede Patientenprobe 1:100 in
Probenverdünner verdünnen.
●
100 µL Probenverdünner in die erste Kavität als Blank
(Abgleich) pipettieren.
●
Je 100 µL der vorverdünnten Kalibratoren und verdünnten
Kontrollen und Patientenproben in Kavitäten pipettieren
und bei Raumtemperatur 60 Min. inkubieren.
●
Kavitäten absaugen und dreimal mit Waschlösung
waschen.
●
Je 100 µL des Aviditätsreagenz in die AS-Ansätze
pipettieren und für 3 Minuten bei Raumtemperatur
inkubieren.
●
Kavitäten absaugen und dreimal mit Waschlösung
waschen.
●
100 µL Konjugat in Kavitäten pipettieren und bei Raumtemperatur 30 Min. inkubieren.
●
Kavitäten absaugen und dreimal mit Waschlösung
waschen.
●
100 µL Substrat in Kavitäten pipettieren und bei Raumtemperatur 30 Min. inkubieren (lichtgeschützt).
●
100 µL Stopplösung in Kavitäten pipettieren und Ergebnisse bei 450 nm ablesen.
Product Code
Katalog-Nummer
Katalog nr
Référence
Codice
Código
IVD
In vitro diagnostic medical device
Zur in-vitro diagnostischen Anwendung
Kun til in-vitro diagnostisk bruk
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Dispositivo medico diagnostico in vitro
Dispositivo médico para uso diagnostico in vitro
Batch Number
Chargen-Bezeichnung
Lot nr
Désignation du lot
Lotto numero
Denominacion de lote
Use before (last day of month)
Verwendbar bis (letzter Tag des Monats)
Brukes innen
Utiliser avant (dernier jour du mois indiqué)
Utilizzare prima del (ultimo giorno del mese)
Estable hasta (usar antes de ultimo dia del mes)
Attention: Consult instructions before use
Achtung: Gebrauchsinformation beachten
OBS: Se bruksanvisningen
Attention: Consulter le mode d’emploi
Attenzione: Consulti le istruzioni per uso
Atentión: Consultar las instrucciones
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To be stored at 2°C to 8°C
Bei 2°C bis 8°C lagern
Oppbevares ved 2°C - 8°C
A conserver de 2°C á 8°C
Conservazione da 2°C - 8°C
Almacenar a 2°C - 8°C
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