Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Der Polycomb-Repressor-Komplex als transkriptionelle
Barriere bei der
Leukämogenese durch MLL-Fusionsproteine
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät/ Dem Fachbereich Genetik
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Katrin Lisa Hetzner
aus Fürth
Inhaltsverzeichnis
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät/ vom Fachbereich Genetik
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 07.10.2016
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Georg Kreimer
Gutachter: Prof. Dr. Robert Slany
Prof. Dr. Manfred Marschall
2
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1.
Zusammenfassung ............................................................................................. 6
2.
Einleitung .......................................................................................................... 7
2.1. Wirkungsweise von MLL und MLL-Fusionsproteinen.................................................... 8
2.2. Rekrutierung des EAP-Komplexes durch MLL-ENL ...................................................... 13
2.3. Rekrutierung verschiedener Proteinkomplexe über ENL ............................................ 15
2.3.1.
Transkriptionsregulation durch Polycombproteine ............................................. 16
2.3.2.
BCL6-Corepressor (BCoR) und seine Rolle in der Hämatopoese .......................... 18
2.3.3.
Der PAF-Komplex und seine Rolle während der Elongation ................................ 21
3.
Aufgabenstellung ............................................................................................. 27
4.
Ergebnisse ....................................................................................................... 28
4.1. Inaktivierung des PRC1-Komplexes durch ENL ............................................................ 28
4.1.1.
Struktur-Funktionsanalysen zur Inaktivierung von CBX8 durch ENL .................... 28
4.1.2.
Interaktionsstudien zu ENL und PAF1 und deren Funktion .................................. 31
4.1.2.1.
Charakterisierung der PAF-ENL Interaktion ...................................................... 33
4.1.2.2.
Funktionsanalyse der ENL-Mutante .................................................................. 35
4.1.2.3.
Überexpression von PAF1 in transienten Reportergenstudien ........................ 36
4.1.3.
Mimikry der PAF1-ENL Interaktion ....................................................................... 37
4.1.3.1.
Charakterisierung der ENL-Bindedomäne in PAF1 ............................................ 37
4.1.3.2.
Funktionelle Untersuchung zur Inhibition der ENL-PAF1-Interaktion .............. 39
4.1.4.
Funktionelle Konsequenzen der ENL-PAF-Interaktion ......................................... 41
4.1.5.
Rolle von PAF1 in der malignen Hämatopoese .................................................... 43
4.1.5.1.
Einfluss von PAF1 auf das Transformationspotential ....................................... 46
4.1.5.2.
Einfluss der PAF1-Rekrutierung auf die Transkription von MLL-ENL ................ 49
4.1.6.
Funktionale Konsequenzen der PAF-Komplex Rekrutierung................................ 51
4.1.6.1.
Transkriptionsaktivierung durch H2B-Ubiquitinylierung .................................. 51
4.1.6.2.
Chromatindekompaktierung durch den PAF-Komplex ..................................... 53
4.2. Untersuchungen zum Einfluss des BCL6-Corepressors (BCoR) auf ............................. 58
4.2.1.
Funktionelle Konsequenzen der BCoR-ENL-Interaktion ....................................... 59
4.2.2.
Einfluss von BCoR auf die maligne Hämatopoese ................................................ 61
4.2.2.1.
Etablierung eines induzierbaren Expressionsystems in .................................... 62
3
Inhaltsverzeichnis
4.2.2.2.
Funktionelle Untersuchungen zum Einfluss auf die maligne Hämatopoese .... 67
4.2.2.2.1.
Einfluss von BCoR auf Proliferation und Zellviabilität ................................... 68
4.2.2.2.2.
Untersuchungen zum Einfluss der BCoR-Expression auf den Zellzyklus ....... 70
4.2.2.2.3.
Einfluss von BCoR auf die Expression von MLL-ENL Zielgenen ..................... 71
5.
Diskussion ....................................................................................................... 75
5.1. Inaktivierung des PRC1-Komplexes durch den PAF-Komplex ..................................... 75
5.1.1.
Einfluss der PAF/MLL-ENL-Interaktion auf die maligne Hämatopoese ................ 77
5.1.2.
Mechanismus der PRC1-Inaktivierung durch den PAF-Komplex .......................... 79
5.2. BCoR als übergeordneter Repressor ........................................................................... 85
5.2.1.
BCoR als Tumorsuppressor in der malignen Hämatopoese ................................. 86
5.2.2.
Rekrutierung des BCoR-Komplexes an MLL-ENL Zielgene .................................... 90
5.2.3.
Rolle von BCoR in Leukämiezellen ........................................................................ 92
6.
Material und Methoden ................................................................................... 94
6.1. Molekularbiologische Standardmethoden .................................................................. 94
6.2. Klonierungen und Sequenzen...................................................................................... 94
6.3. Zellkultur ...................................................................................................................... 98
6.4. Nachweis der Proteinexpression mittels Western Blot .............................................. 99
6.5. Coimmunopräzipitationen und Western Blot ........................................................... 103
6.6. Luziferase-Assay (Rev-Assay) ..................................................................................... 106
6.7. Knochenmarktransformationstest ............................................................................ 109
6.8. Rekombinationsnachweis mittels PCR ...................................................................... 112
6.9. Wachstumskurve ....................................................................................................... 113
6.10. Bestimmung der Zellviabilität mittels MTT-Test ................................................... 113
6.11. Durchflusszytometrie ............................................................................................ 114
6.12. Quantitative Realtime-PCR .................................................................................... 116
6.13. Chromatinimmunopräzipitation (ChIP) ................................................................. 117
6.14. Kompaktierung des Hoxa9-Lokus .......................................................................... 121
7.
Anhang .......................................................................................................... 123
7.1. Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................. 123
7.2. Literaturverzeichnis ................................................................................................... 126
7.3. Abbildungsverzeichnis ............................................................................................... 138
7.4. Tabellenverzeichnis ................................................................................................... 139
4
Inhaltsverzeichnis
7.5. Danksagung ............................................................................................................... 141
7.6. Lebenslauf.................................................................................................................. 142
7.7. Schriftliche Versicherung ........................................................................................... 144
5
Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
MLL Fusionsproteine induzieren eine sehr aggressive Leukämieform. Die maligne Transformation beruht dabei auf der Rekrutierung eines Komplexes (EAP =Elongation Assisting
Proteins), der die transkriptionelle Elongation von MLL-Zielgenen konstitutiv aktiviert, was
zur Blockade der Differenzierung und so zur Akkumulation hämatopoetischer Vorläuferzellen führt. Für die maximale Induktion von MLL-Zielgenen muss neben der Transkriptions-Aktivierung jedoch zusätzlich noch die inhibitorische Aktivität eines generellen Transkriptionsrepressorkomplexes (Polycomb-Komplex) neutralisiert werden.
Im Rahmen dieser Promotionsarbeit sollte der molekulare Mechanismus, der über die
Interaktion mit ENL zur Inhibierung des Polycombkomplexes führt, aufgeklärt werden.
Dabei konnte der transkriptionsstimulierende Polymerase-Associated-Factor-Komplex
(PAFc) als ENL-Interaktionspartner identifiziert werden, der in transienten Reportergenstudien essentiell für die Neutralisierung der Polycomb-vermittelten Elongationsrepression war. Die Interaktion zwischen MLL-ENL und dem PAF-Komplex, sowie die durch diesen
katalysierte H2B-Ubiquitinylierung, war essentiell für das Aufrechterhalten des Transformationspotentials sowie die konstitutive Expression der MLL-Zielgene. Die Ubiquitinylierung führte zur Auflockerung der lokalen Chromatinstruktur und ermöglichte somit die
ektope Expression der MLL-ENL Zielgene.
Weiterhin konnte eine Isoform des BCL6-Corepressors (BCoR) als Interaktionspartner von
ENL in EAP-Komplex-Aufreinigungen nachgewiesen werden. Dieses Protein wirkt in transienten Reportergenstudien ebenfalls reprimierend auf die Elongation, wobei dieser Effekt, anders als bei CBX8, nicht durch die Interaktion mit ENL aufgehoben werden kann.
Vor diesem Hintergrund sollte der Einfluss von BCoR auf die Transformation hämatopoetischer Zellen untersucht werden. Die Überexpression BCoRs hatte einen negativen Einfluss auf die Proliferation, die Zellviabilität und führte zu einer schwächeren Expression
der MLL-ENL Zielgene Hoxa9, Meis1 und Myc. Die beobachteten Effekte waren jedoch
unabhängig von der physikalischen Interaktion zwischen ENL und BCoR. Die Ergebnisse
deuten darauf hin, dass es sich bei BCoR um einen generellen, übergeordneten Repressor
handeln könnte, der die Expression wichtiger Entwicklungsgene während der Differenzierung dauerhaft abschalten kann.
6
Einleitung
2. Einleitung
Viele akute Leukämien (ALL, AML) sind mit chromosomalen Translokationen assoziiert,
durch die Protoonkogene aktiviert werden (Rubnitz et al., 1994). Dabei ist das „Mixed
Lineage Leukemia“ –Gen (MLL) häufig von chromosomalen Abberationen betroffen.
Durch eine reziproke Translokation am Lokus 11q23 kommt es zur Verbindung eines Teils
des MLL-Gens mit Abschnitten anderer Chromosomen und damit zur Bildung verschiedener MLL-Fusionsproteine (Meyer et al., 2009; Slany, 2009). Die daraus resultierenden Fusionsproteine agieren als onkogene Transkriptionsfaktoren, die zur Überexpression ihrer
Zielgene führen (Ayton und Cleary, 2001). MLL Translokationen kommen in ca. 80% der
frühkindlichen akuten Leukämien vor und repräsentieren insgesamt 10% aller akuten
Leukämien (Biondi et al., 2000; Marschalek, 2010).
Die mit dieser Translokation assoziierte „Mixed Lineage Leukämie“ ist eine sehr aggressive Form dieser Erkrankung, die hauptsächlich bei Säuglingen und Kleinkindern, oder im
Erwachsenenalter als Folge einer Therapie vorheriger maligner Erkrankungen mit Topoisomerase II Inhibitoren auftritt. In dieser Leukämieform sind frühe hämatopoetische
Vorläuferzellen betroffen, die sowohl myeloische als auch lymphatische Oberflächenmarker exprimieren. Aufgrund dessen wurde die Bezeichnung „Mixed Lineage Leukämie“ geprägt (Mirro et al., 1986). Dieser Leukämietyp geht, im Gegensatz zu Leukämieformen
ohne MLL-Translokation, mit einer sehr schlechten Prognose einher, da nur etwa 40% der
betroffenen Kinder die ersten fünf Jahre nach Diagnose überleben (Pui et al., 2000; Pui et
al., 2011; Tomizawa et al., 2007).
Im Folgenden soll auf die Leukämieentstehung durch MLL-Fusionsproteine näher eingegangen werden.
7
Einleitung
2.1.
Wirkungsweise von MLL und MLL-Fusionsproteinen
MLL ist eine Methyltransferase die als histonmodifizierender Transkriptionsaktivator
agiert. Darüber hinaus ist MLL Teil eines Multiproteinkomplexes der durch Chromatinmodifikationen die Transkription fördert (Nakamura et al., 2002). Das ca. 430kDa große MLLProtein wird durch die Protease TASPASE1 posttranslational in eine N- (MLLN) und eine Cterminale Untereinheit (MLLC) gespalten. Dies ist essentiell für die korrekte Funktionsweise des Proteins (Hsieh et al., 2003; Slany, 2009). Die C-terminale SET-Domäne kodiert für
eine Methyltransferase, die spezifisch Lysin 4 von Histon 3 methyliert (H3K4me2/3). Diese
Modifikation kennzeichnet aktiv transkribiertes Chromatin und befindet sich meist an der
Transkriptionsstartstelle von Genen (Milne et al., 2002). Weiterhin interagiert der Cterminale Bereich von MLL mit der Histonacetyltransferase (MOF), die durch Acetylierung
von Histon 4 an Lysin 16 die Chromatinstruktur auflockert und somit ebenfalls positiv auf
die Transkription wirkt (Dou et al., 2005). Die zusätzliche Rekrutierung von WDR5 sorgt
für die Prozessivität, die Interaktionen mit RBBP5 und ASH2L sind für die Stabilisierung
des Komplexes verantwortlich (Schuetz et al., 2006; Southall et al., 2009) (vgl. Abb. 1).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des MLL-Wildtypproteins. Der MLL-N-Terminus ist für die DNABindung und Zielgenspezifität verantwortlich. Der C-Terminus beinhaltet eine Transaktivierungsdomäne
und die SET-Domäne, die als Methyltransferase fungiert. Verwendete Abkürzungen: MBD=MENINBindedomäne; CxxC=CxxC-Domäne; RD2=RD2-Region; PHD-Finger=Plant Homöodomäne
Der Aminoterminus (MLLN) hingegen ist für die Zielgenspezifität und DNA-Bindung des
MLL-Komplexes verantwortlich. Er beinhaltet eine Domäne für die Interaktion mit dem
Tumorsuppresor MENIN (multiple endocrine neoplasia), der Kontakt zum Transkriptionsfaktor LEDGF (Lens epithelium derived growth factor) herstellt und an die DNA von MLLZielgenen bindet. Diese Interaktionen sind für die Transformation hämatopoetischer Zellen sowie die Transkriptionsaktivierung der MLL-Zielgene unerlässlich (Yokoyama und
8
Einleitung
Cleary, 2008). Weiter C-terminal befinden sich zwei Bindedomänen, die für eine unspezifische DNA-Bindung verantwortlich sind. Die AT-Haken ermöglichen dem MLL-Protein die
Bindung an AT-reiche Regionen in der kleinen Furche der DNA. Des Weiteren erkennt MLL
durch die CxxC-Domäne unmethylierte CpG-Inseln, die sich charakteristischer Weise vor
transkriptionell aktiven Genen befinden (Zeleznik-Le et al., 1994; Birke et al., 2002). Die
CxxC-Domäne ist allerdings auch für die Rekrutierung reprimierender Polycomb-GruppenProteine und Histon-Deacetylasen verantwortlich (Xia et al., 2003). Dies scheint auf Konformationsänderungen durch die Bindung der Prolyl-Isomerase Cyclophilin 33 (Cyp33) an
die PHD-Domäne (Plant-Homöodomäne) von MLL zurückzuführen zu sein. Weiterhin interagiert der aktivierende PAF-Komplex mit der CxxC-Domäne und RD2-Region von MLL
(Milne et al., 2010; Muntean et al., 2010).
Zusammenfassend katalysiert der MLL-Komplex drei aktivierende Chromatinmodifizierungen: Methylierung (H3K4me), Acetylierung (H4K16ac) und Nukleosomen-Remodelling
(Dou et al., 2005).
Hox-Clustergene: wichtige MLL Zielgene
Die Methyltransferase MLL gilt als humanes Homolog des aus Drosophila melanogaster
stammenden Trithorax-Proteins (Trx) (Gu et al., 1992; Djabali et al., 1992). Funktionell
gesehen handelt es sich bei Trx um einen „epigenetischen“, aktivierenden Regulator zur
Aufrechterhaltung des korrekten Expressionsmusters der Hox-Clustergene (van Lohuizen
et al., 1999; Schuettengruber et al., 2011). Hox-Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren,
die beispielsweise die morphologische Identität der einzelnen Thoraxsegmente determinieren, indem sie deren Position entlang der anterior-posterioren Achse in DrosophilaEmbryonen festlegen. Weiterhin ist die Expression der Hox-Gene streng zeitlich und
räumlich reguliert, was essentiell für die Steuerung entwicklungsspezifischer Prozesse
sowohl in der Gewebeentwicklung als auch während der Hämatopoese ist (Lappin et al.,
2006). Sie spielen eine wichtige Rolle während der Entwicklung durch Regulation wichtiger physiologischer Prozesse, wie zum Beispiel Apoptose, Selbsterneuerung, Rezeptorsignalweiterleitung, Angiogenese und Hämatopoese (Shah und Sukumar, 2010). Mutationen
oder die Fehlregulation dieser Gene führen zu einem homöotischen Phänotyp, bei dem
Körpersegmente in andere umgewandelt werden (z.B. das Wachsen von Beinen anstelle
von Antennen) (Lappin et al., 2006). Ähnliche Effekte konnten auch in Mll „knock-out“
9
Einleitung
Studien an Mäusen gezeigt werden, was auf eine konservierte Funktion zwischen TrxProteinen und MLL hindeutet (Yu et al., 1995). Die reprimierenden Polycomb-GruppenProteine (PcG) agieren als funktionale Antagonisten zu Trx-Gruppen-Proteinen und regulieren ebenfalls Gene des Hox-Clusters (Ringrose und Paro, 2004).
MLL-Fusionsproteine
Etwa 10% aller akuter Leukämien (ALL: akute lymphatische Leukämie; AML: akute myeloische Leukämie) tragen MLL-Rearrangements (Krivtsov und Armstrong, 2007). Dabei
kommt es durch chromosomale Translokationen am Genlokus 11q23 zur Bildung onkogener MLL-Fusionsproteine (Ziemin-van der Poel et al., 1991; Gu et al., 1992). Mittlerweile
konnten mehr als 60 verschiedene nukleäre und cytoplasmatische Fusionspartner identifiziert werden. Zu den häufigsten und klinisch relevanten Fusionspartnern, die an nahezu
90% der MLL-Rearrangements beteiligt sind, zählen AF4, AF9, ENL, AF10, AF6, ELL, AF1P,
AF17 und SEPT6 (Krivtsov und Armstrong, 2007; Marschalek, 2011; Meyer et al., 2009;
Monroe et al., 2010; Yokoyama et al., 2010; Martin et al., 2003; So et al., 2003).
Abbildung 2: Schematische Darstellung
des MLL-Wildtypproteins und MLLFusionsproteins. Durch Translokation
entstehen
verschiedene
MLLFusionsproteine, wobei die DNABindung durch den MLL-N-Terminus
erhalten bleibt und der Fusionspartner
meist zur Transaktivierung der Zielgene
beiträgt. Verwendete Abkürzungen:
MBD=MENIN-Bindedomäne;
CxxC=
CxxC-Domäne; RD2=RD2-Region; PHDFinger=Plant Homöodomäne
MLL-Fusionsproteine sind stets nach dem gleichen Muster aufgebaut: Durch die reziproke
Translokation wird der N-terminale Bereich von MLL, unter Beibehaltung des Leserahmens, mit einem Translokationspartner fusioniert. Für die transformierende Wirkung des
Fusionsproteins ist es notwendig, dass der Bruchpunkt vor der PHD-Domäne liegt und die
10
Einleitung
DNA-Interaktionsregionen (AT-Haken, CxxC-Domäne) sowie die MENIN-Bindedomäne
erhalten bleiben (Slany et al., 1998; Muntean et al., 2008). Die C-terminale Domäne inklusive der Methyltransferase-Aktivität geht im entstehenden chimären Fusionsprotein verloren und wird durch die Eigenschaften des Fusionspartners ersetzt, welcher wiederum
meist Transaktivierungsaktivität mitbringt (vgl. Abb. 2). In den Fusionsproteinen bleiben
die DNA-Interaktionsregionen und somit auch die Zielgenspezifität erhalten. Allerdings
werden nur wenige der mehr als tausend genomischen Loci an die MLL bindet, auch
durch das Fusionsprotein dereguliert (Armstrong et al., 2002) (vgl. Abb. 2).
Abbildung 3: Schematische Darstellung der normalen (oben) und malignen (unten) Hämatopoese. Während der normalen Hämatopoese nimmt die Hox-Expression stetig ab. Bei der malignen Entartung kommt
es durch MLL-Fusionsproteine zu einer Differenzierungs-Blockade durch eine ektope Hox-Genexpression
und zur Anreicherung von Vorläuferzellen mit hohem Selbsterneuerungsspotential.
Leukämien mit einer MLL-Translokation zeichnen sich durch ein charakteristisches Genexpressionprofil aus. Dabei spielen zum Beispiel die HOX-Gene, im Speziellen HOXA9 und
HOXA7, sowie deren Cofaktor MEIS1 eine wichtige Rolle (Zeisig et al., 2004). Dabei sind
hämatopoetische Stammzellen durch eine hohe HOX-Expression charakterisiert (Sauvageau et al., 1994). Während der Differenzierung zu reifen Blutzellen muss die HOXExpression stetig verringert werden. Durch die Anwesenheit eines MLL-Fusionsproteins
11
Einleitung
hingegen, kommt es zur ektopen Expression dieser Gene, was zur Blockade in der Differenzierung und damit zur Akkumulation hämatopoetischer Vorläuferzellen führt. Durch
die Anhäufung weiterer Mutationen in diesen Zellen, kann es zur Entstehung einer akuten
Leukämie kommen (Lawrence, 1996; Zeisig et al., 2004) (vgl. Abb. 3). Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass eine Überexpression von Hoxa9 und Meis1 ausreichend für eine
Blockade der Differenzierung und stete Proliferation dieser Vorläuferzellen war (Zeisig et
al., 2004).
Der Fusionspartner ENL
Einer der häufigsten MLL-Fusionspartner in der AML ist das nukleäre Protein ENL und sein
Homolog AF9. Bei ENL handelt es sich um ein Mitglied der hoch konservierten YEATSDomänen-Proteinfamilie die als transkriptionelle Aktivatoren fungieren und ursprünglich
in Saccharomyces cerevisiae entdeckt wurden (Le Masson et al., 2003; Rubnitz et al.,
1994). Die YEATS-Domäne ist eine zwischen Pro- und Eukaryonten evolutionär konservierte Region, deren Name sich aus den fünf Anfangsbuchstaben der ersten Proteine in denen
sie entdeckt wurde zusammensetzt (Yaf9, ENL, AF9, Taf14, Sas5) (Le Masson et al., 2003).
Des Weiteren erkennt die YEATS-Domäne acetyliertes H3K9 und trägt so zur Assoziation
von Proteinkomplexen mit Chromatin bei (Li et al., 2014). Darüber hinaus scheint diese
Domäne mit Histonacetyltransferasen, Chromatin-Remodelling-Komplexen und transkriptionsregulierenden-Komplexen assoziiert zu sein (Schulze et al., 2009).
Abbildung 4: Schematische Darstellung des ENL-Wildtypproteins. Im N-Terminus ist die konservierte
YEATS-Domäne enthalten. Der C-Terminus ist für die Rekrutierung weiterer Proteine wie Dot1L und Polycombproteine zuständig und fungiert als Transaktivierungsdomäne. Verwendete Abkürzungen:
YEATS=YEATS-Domäne; CTD=C-terminale Domäne
Die C-terminale Domäne (CTD) von ENL besitzt Transaktivierungseigenschaften, da sie in
transienten Reportergenstudien die Transkription eines Reportergens positiv beeinflusste
(Rubnitz et al., 1994). Dieser Bereich ist in der Lage sowohl mit aktivierenden Proteinen
wie der Methyltransferase DOT1L, als auch mit reprimierenden Polycomb-Proteinen zu
interagieren. Die Bindungen schließen sich jedoch gegenseitig aus, was ENL die Rolle ei12
Einleitung
nes molekularen „Schalters“ zukommen lässt (Maethner et al., 2013; Yokoyama et al.,
2010). In transienten Reportergenstudien konnte jedoch gezeigt werden, dass ENLDeletionsmutanten, die die YEATS-Domäne enthielten zur autonomen Transkriptionsaktivierung des Reportergens befähigt waren, obwohl die Transaktivierungsdomäne im Cterminalen Bereich fehlte oder unvollständig war (Zeisig et al., 2005). Demnach scheint
auch der N-terminale Bereich des Proteins für diesen Prozess notwendig zu sein. Abbildung 4 zeigt den schematischen Aufbau des ENL-Proteins.
Viele MLL-ENL Fusionsproteine, die in Patienten nachgewiesen werden konnten, enthalten jedoch nur die C-terminale Domäne (CTD) des ENL Proteins. Durch StrukturFunktionsanalysen mit MLL-ENL-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass eine 90 Aminosäuren umfassende C-terminale AF9/ENL Region für die Transformation hämatopoetischer Zellen notwendig und ausreichend war (Slany et al., 1998).
2.2.
Rekrutierung des EAP-Komplexes durch MLL-ENL
Es ist allen klinisch relevanten MLL-Fusionsproteinen gemein, dass sie unabhängig von der
Natur des Fusionspartners immer zu demselben aggressiven Leukämietyp führen, der sich
durch eine starke Expression endogener MLL-Zielgene auszeichnet. Dies lässt einen allgemeinen transkriptionsaktivierenden Mechanismus, der allen chimären Proteinen zu
Grunde liegt, vermuten.
Mueller et al. gelang es durch Coimmunopräzipitationen mit dem Fusionspartner ENL
einen Multiproteinkomplex aufzureinigen und die darin enthaltenen Komponenten mittels Massenspektrometrie zu identifizieren (Mueller et al., 2007). Dieser Komplex wurde
als EAP-Komplex (Elongation Assisting Proteins) bezeichnet und enthält neben ENL/AF9
auch andere häufige MLL-Fusionspartner der AF4-Proteinfamilie (AF4, AF5q31, LAF4). Die
Existenz und Zusammensetzung dieses Multiproteinkomplexes konnte auch von anderen
Gruppen bestätigt werden (Bitoun et al., 2007; Lin et al., 2010; Monroe et al., 2011; Yokoyama et al., 2010).
Der über ENL rekrutierte Multiproteinkomplex stimuliert die transkriptionelle Elongation
der MLL-ENL Zielgene grundsätzlich durch zwei enzymatische Aktivitäten. Die Histonmethyltransferase DOT1L sorgt für die spezifische Methylierung des Histons H3 an Lysin 79
13
Einleitung
(H3K79me), was als aktivierende epigenetische Chromatinmodifikation gilt (Steger et al.,
2008). In Leukämiezellen korreliert ein hohes H3K79me2/3-Level mit starker HOXGenexpression (Deshpande et al., 2014).
Durch die Rekrutierung der Kinase pTEFb (bestehend aus CDK9 und CyclinT) kommt es
zum einen zur Phosphorylierung an Serin 2 der C-terminalen Domäne (CTD) der RNAPolymerase II (RNA-Pol II), zum anderen wird die Phosphorylierung der inhibierenden
Proteine DSIF (DRB sensitivity inducible factor) und NELF (negative elongation factor) katalysiert. Durch die Modifikation der RNA-Pol II kann diese von der abortiven in die produktive Elongation übergehen. DSIF und NELF werden durch die Phosphorylierung inaktiviert, was ebenfalls zur aktiven Elongation beiträgt (Peterlin und Price, 2006; Zhou et al.,
2012).
Abbildung 5: Schematische Darstellung des rekrutierten EAP-Komplexes. Der EAP-Komplex aktiviert die
Transkription durch H3K79 Methylierung und Phosphorylierung der RNA Polymerase II (RNA Pol II). Enzymatische Aktivitäten sind durch Pfeile, Proteinfamilien durch gleiche Farbgebung gekennzeichnet. Die reprimierende Aktivität der Polycombproteine (CBX8/RING1) muss zudem inhibiert werden. Abkürzungen:
P=Phosphorylierung; me=Methylierung; H3=Histon 3; H2A=Histon 2A; ub=Ubiquitinylierung. (Darstellung
nach Mueller et al., 2009)
Der EAP-Komplex, der in Abbildung 5 dargestellt ist, beinhaltet neben ENL/AF9 auch die
Fusionspartner AF4, AF5q31, LAF4. ENL, AF9 und AFF-Proteine sind untereinander sowie
14
Einleitung
mit DOT1L und pTEFb durch direkte Protein-Protein-Interaktionen zu einem Multiproteinkomplex verbunden (Benedikt et al., 2011; Monroe et al., 2011; Yokoyama et al., 2010).
Für die Leukämogenese scheint es demnach unerheblich welches Protein als Fusionspartner fungiert, solange der EAP-Komplex rekrutiert wird und es somit zur konstitutiven
Aktivierung der MLL-Zielgene kommen kann.
Paradoxerweise finden sich neben aktivierenden auch reprimierende Proteine aus der
PcG-Familie, wie zum Beispiel das Chromobox-Protein CBX8 und die E3-Ubiquitinligase
RING1, sowie der BCL6-Corepressor (BCoR, siehe 2.3.2), unter den Mitgliedern des EAPKomplexes (García-Cuéllar et al., 2001; Hemenway et al., 2001; Monroe et al.; 2011;
Mueller et al., 2007). ENL ist dabei in der Lage sowohl an DOT1L als auch an das reprimierende CBX8 zu binden. Diese Interaktionen schließen sich jedoch gegenseitig aus, was ENL
die Funktion eines molekularen „Schalters“ zukommen lässt (Maethner et al., 2013; Yokoyama et al., 2010). Wie bereits vorher erwähnt (siehe 2.1), agieren PcG-Proteine und MLL
als funktionelle Antagonisten bei der Transkriptionsregulation ihrer Zielgene. Dies legt die
Hypothese nahe, dass MLL-Fusionsproteine nicht nur für die konstitutive Aktivierung der
Transkription ihrer Zielgene sorgen, sondern auch die Repression durch den PolycombKomplex inhibieren müssen (Maethner et al., 2013).
Zusammenfassend können MLL-Fusionsproteine die konstitutive Expression ihrer Zielgene durch die Rekrutierung des EAP-Komplexes und der damit verbundenen Aktivierung
der RNA-Pol II, durch positive Chromatinmodifikationen und die Inaktivierung der reprimierenden PcG-Proteine, aufrechterhalten.
2.3.
Rekrutierung verschiedener Proteinkomplexe über ENL
Der MLL-Fusionspartner ENL ist für die Rekrutierung des EAP-Komplexes und der damit
verbundenen Transaktivierung der MLL-Zielgene zuständig und interagiert dabei sowohl
mit aktivierenden als auch reprimierenden Proteinen.
Aufgrund der Anwesenheit reprimierender Proteine der PcG-Familie im aktivierenden
EAP-Komplex sollen im Folgenden die Transkriptionsregulations-Mechanismen durch Polycombproteine näher beschrieben werden.
15
Einleitung
2.3.1. Transkriptionsregulation durch Polycombproteine
Polycomb-Gruppenproteine (PcG) wurden bereits 1978 erstmals als reprimierende Regulatoren von Entwicklungsgenen in Drosophila melanogaster entdeckt (Lewis et al., 1978).
Diese Proteine spielen eine essentielle Rolle sowohl bei der normalen Genregulation während der Embryonalentwicklung, der Zelldifferenzierung in Erwachsenen, der StammzellPluripotenz und X-Chromosomen-Inaktivierung als auch in der Manifestation diverser
Krebserkrankungen (Sceifo et al., 2015; Sparmann und van Lohuizen, 2006). Der der Repression zu Grunde liegende molekulare Mechanismus beruht dabei auf Chromatinmodifikationen, der auch in Säugern hoch konserviert ist (Sparmann und van Lohuizen, 2006,
Martin-Perez et al., 2010).
Polycomb-Proteine können in zwei Komplexe unterteilt werden, die sich durch unterschiedliche Zusammensetzung und Aktivität voneinander unterscheiden. Der PolycombRepressive-Complex 2 (PRC2) setzt sich aus den Kernkomponenten SUZ12 (Zinkfingerprotein), EED (Embryonic Ectoderm Development) und der Methyltransferase EZH2 (Enhancer of Zeste 2) zusammen. Diese Methyltransferase katalysiert die Mono-, Di- und Trimethylierung des Histons 3 an Lysin 27 (H3K27me1/2/3), was reprimiertes Chromatin kennzeichnet (Czermin et al., 2002). Der Polycomb-Repressive-Complex 1 (PRC1) wird auch als
„kanonischer“ Polycomb-Komplex bezeichnet und besteht aus den Kernkomponenten
BMI1 oder MEL18, einem von mehreren Chromobox-Proteinen (z.B. CBX8) und PHCProteinen, sowie den Ubiquitinligasen RING1 und RING2. Die Ubiquitinligasen katalysieren die Ubiquitinylierung von Histon 2A an Lysin 119 (H2AK119ub1) (Cao et al., 2005; Simon und Kingston, 2013) (vgl. Abb. 5 und 6). Diese Modifikation wirkt sich inhibierend auf
die Transkription aus, da sie zur Kompaktierung der lokalen Chromatinstruktur beiträgt
(Wang et al., 2004). Die Zusammensetzung des PRC1 divergiert stärker als die des PRC2Komplexes. So existieren die Chromobox-Proteine beispielsweise nur im „kanonischen“
PRC1 (Gao et al., 2012) (vgl. Abb. 6). Die Rekrutierung der Polycomb-Komplexe erfolgt
über verschiedene Mechanismen. Nach dem „hierarchischen Modell“ erfolgt zuerst die
H3K79me3 durch PRC2, die anschließend durch ein Chromobox-Protein (z.B. CBX8) des
„kanonischen“ PRC1-Komplexes erkannt wird und so den PRC1 an Chromatin rekrutiert,
der seinerseits durch H2A-Ubiquitinylierung für die Inhibierung der Transkription sorgt
(Blackledge, 2015; Fischle et al., 2003) (vgl. Abb. 6). In neueren Studien konnte jedoch
16
Einleitung
gezeigt werden, dass der PRC1 auch unabhängig von PRC2 an Chromatin rekrutiert werden kann (Tavares et al., 2012). Des Weiteren kann die Polycomb-Rekrutierung in Vertebraten nicht nur über Chromatinmodifikationen erfolgen, sondern auch über CpGreiche Regionen (z.B. Promotorregionen), über Transkriptionsfaktoren oder „nascent“RNA-Transkripte (Blackledge et al., 2015; Blackledge und Klose, 2011; Deaton und Bird,
2011; Mendenhall et al., 2010). Auch der PRC1- ist in der Lage den PRC2-Komplex über
die H2A-Monoubiquitinylierung zu rekrutieren (Blackledge et al., 2014).
Abbildung 6: Schematische Darstellung von PRC1 und PRC2 und deren enzymatische Aktivitäten nach
dem „Hierarchischen Modell“. Durch PRC2 erfolgt die H3K27 Methylierung, wodurch die Repression initiiert wird. Die Chromobox-Proteine des PRC1 erkennen und binden H3K27me. Anschließend folgt die H2A
Monoubiquitinylierung durch RING-Finger Proteine (nach Sparmann und van Lohuizen, 2006; Blackledge et
al., 2015). Abkürzungen: ub=Ubiquitin; me=Methylierung; H3=Histon 3; H2A=Histon 2A. Enzymatische Aktivitäten sind durch Pfeile gekennzeichnet.
Wie oben erwähnt agieren PcG-Proteine und Trx-Proteine als Antagonisten. Die zunächst
als paradox angesehene Existenz von Polycombproteinen im aktivierenden EAP-Komplex
scheint jedoch mittlerweile aufgeklärt. Zum einen konnte die Interaktion zwischen dem
Fusionspartner ENL und CBX8 nachgewiesen werden. Zum anderen liegt nahe, dass die
Polycomb-vermittelte Repression der MLL-ENL Zielgene inhibiert werden muss, um deren
konstitutive Expression und eine Transformation der Zellen zu ermöglichen (Maethner et
al., 2013). Der molekulare Mechanismus dahinter bleibt jedoch bis dato weitgehend unverstanden.
17
Einleitung
2.3.2. BCL6-Corepressor (BCoR) und seine Rolle in der Hämatopoese
Neben Komponenten des „kanonischen“ PRC1-Komplexes wurde auch der verwandte
Transkriptionsrepressor BCoR mit ENL/AF9 gemeinsam ko-aufgereinigt (Mueller et al.,
2007). Die Interaktion zwischen ENL/AF9 und BCoR konnte zudem von anderen Gruppen
bestätigt werden (Monroe et al., 2011; Srinivasan et al., 2003).
Entdeckt wurde BCoR erstmals als Corepressor des Protoonkogens BCL6 (B-celllymhpoma Protein 6), das in vielen immunologischen Prozessen, hauptsächlich während
der B-Zell-Reifung, eine essentielle Rolle spielt (Huynh et al., 2000; Jardin et al., 2007). Bei
BCL6 handelt es sich um einen sequenzspezifischen, inhibitorischen Transkriptionsrepressor, zu dessen Zielgenen p53 und CyklinD2 gehören (Phan und Dalla Favera, 2004). Zudem
ist BCL6 oftmals von chromosomalen Translokationen betroffen, die zu dessen konstitutiver Expression führen und mit der Ausbildung von B-Zelllymphomen assoziiert sind (Niu
2002; Ye et al., 1995).
Die Transkriptionsinhibierung durch BCL6 ist auf Chromatinmodifikationen zurückzuführen, ausgelöst durch die Rekrutierung von Klasse I und II Histondeacetylasen (Lemercier et
al., 2002). Die Bindung von Histondeacetylasen erfolgt meist indirekt über einen der drei
Corepressoren (BCoR, NCoR, SMRT) von BCL6. Durch die Interaktion mit den Corepressoren werden die inhibierenden Effekte von BCL6 auf die Transkription weiter potenziert
(Huynh et al., 2000).
Das nukleäre Protein BCoR wird ubiquitär exprimiert und agiert demnach nicht ausschließlich als Corepressor von BCL6, sondern interagiert auch mit anderen Transkriptionsfaktoren und spielt zum Beispiel auch in der Embryonalentwicklung, während der Hämatopoese und in mesenchymalen Stammzellen eine wichtige Rolle (Fan et al., 2009; Gearhart et al., 2006; Sanchez et al., 2007; Srinivasan et al., 2003; Wamstad und Bardwell,
2007). Weiterhin sind heterozygote Mutationen dieses, auf dem X-Chromosom kodierenden Gens (p11.4) unter anderem für das Auftreten des relativ seltenen Oculofacialcardiodental-Syndrom (OFCD) bei Frauen verantwortlich. Bei Männern führen diese - dann hemizygoten – Mutationen bereits in utero zur Letalität (Ng et al., 2004; Hedera et al.,
2003). Zudem wurden BCoR-Mutationen in einer Reihe menschlicher Tumoren wie dem
Medulloblastom (Tiberi et al., 2014) und dem Retinoblastom (Zhang et al., 2012) vorgefunden. Weiterhin konnten durch genomweite Studien in AML-Patienten mit normalem
18
Einleitung
Karyotyp (CN-AML) somatische BCoR-Mutationen identifiziert werden (Grossmann et al.,
2011). In weiteren Analysen mit 553 AML-Patienten konnten in nahezu 4% der Kohorte
ebenfalls BCoR-Mutationen entdeckt werden. In diesen Fällen führte die Mutation zu einem Verlust der BCoR-Funktion und reduzierten mRNA-Level. Die vorgefundenen Mutationen gingen zudem mit einer schlechteren Prognose hinsichtlich der Überlebenswahrscheinlichkeit dieser Patienten einher (Grossmann et al., 2011; Tiacci et al., 2012). Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, dass BCoR in der AML als Tumorsuppressorgen fungieren
und dessen Funktionsverlust eine negative Auswirkung auf die Leukämieentstehung haben könnte (de Roji et al., 2015; Li et al., 2011).
Isoformen und ENL/AF9-Interaktionsdomäne
Der BCL6-Corepressor (BCoR) wird in mindestens 4 verschiedenen Isoformen exprimiert,
die durch alternatives Splicing sowie über die Nutzung verschiedener Promotoren und
Polyadenylierungsregionen erzeugt werden (Srinivasan et al., 2003; Wamstad und Bardwell, 2007).
Abbildung 7: Schematische Darstellung der längsten BCoR-Variante und seinen Domänen. Die längste
BCoR-Isoform ist in der Lage mit ENL/AF9 über eine 34 AS (34AA) lange Domäne zu interagieren, was einen
spezifischen
Regulationsmechanismus
vermuten
lässt
(nach
Tiacci
et
al.,
2012;
http://www.uniprot.org/Q6W2J9).
Srinivasan und Kollegen konnten zudem bei zwei murinen Bcor-Isoformen eine Interaktion mit AF9 nachweisen. In transienten Reportergenstudien konnten diese beiden Varianten die durch AF9 induzierte Expression eines Reportergens inhibieren. Die 34 Aminosäuren umfassende AF9-Interaktionsdomäne war dabei in beiden Isoformen enthalten (Srinivasan et al., 2003). Im Menschen existiert nur eine Variante die diese Sequenz ebenfalls
im C-Terminus aufweist. Durch Coimmunopräzipitationen konnte gezeigt werden, dass
dieser Bereich auch für die Interaktion mit dem AF9-Homolog ENL benötigt wird (Hetzner,
Masterarbeit 2012). Das Auftreten verschiedener „Splice-Varianten“ lässt vermuten, dass
19
Einleitung
BCoR als ubiquitärer Repressor agiert und aufgrund verschiedener Interaktionspartner in
der Lage ist die Expression diverser Zielgene zu inhibieren. Der schematische Aufbau des
kompletten BCoR-Proteins ist in Abbildung 7 dargestellt.
Repressionsmechanismus:
Der Repressionsmechanismus durch BCoR ist im Detail noch nicht komplett aufgeklärt.
Allerdings konnte durch transiente Reportergenstudien gezeigt werden, dass BCoR durch
Rekrutierung an die DNA auch unabhängig von BCL6 als Transkriptionsinhibitor agieren
kann (Huynh et al., 2000). Der BCoR-vermittelte negative Einfluss auf die Transkription ist
auf seine Assoziation mit einem PRC1-ähnlichen Komplex und den damit verbundenen
inhibierenden Chromatinmodifikationen sowie auf die Interaktion mit Histondeacetylasen
der Klasse I und II (HDAC I und II) zurückzuführen (Gearhart et al., 2006; Huynh et al.,
2000). Bei dem PRC1-ähnlichen BCoR-Komplex handelt es sich um den „nichtkanonischen“ PRC1.
In dem durch BCoR aufgereinigten Multiproteinkomplex konnten die PcG-Proteine RYPBP
(Ring1-YY1-binding protein), NSPC1 (PCGF1) sowie SCF-E3 mit den Komponenten SKP1
und KDM2B (FBXL10) und die H2A-Ubiquitin-E3-Ligasen RING1/RNF2 identifiziert werden
(Gearhart et al., 2006). Bei NSPC1 (Nervous System Polycomb 1) handelt es sich um ein
Homolog der Proteine BMI1 und MEL18, welches mit einer N-terminalen Ring-FingerDomäne versehen ist (Gong et al., 2005). Durch die Ligasen RING1/RNF2 wird die
Ubiquitinylierung von Lysin 119 des Histons H2A katalysiert. Diese Chromatinmodifikation
kolokalisierte mit dem BCoR-Komplex an ausgewählten BCL6 Zielgenen und führte zu deren verminderter Expression (Gearhart et al., 2006). Die Histondemethylase KDM2B (Lysin-(K)-specific demethylase 2B) ist für die spezifische Entfernung der Methylgruppen an
H3K36 verantwortlich und erkennt zudem unmethylierte CpG-Dinukleotide (Farcas et al.,
2012; Wu et al., 2013).
Dieser Komplex ist in seiner Zusammensetzung und der katalytischen Aktivität dem PRC1
sehr ähnlich und lässt daher einen chromatinmodifizierenden Repressionsmechanismus
durch BCoR vermuten (vgl. Abb. 8). Dabei scheint BCoR durch die Rekrutierung einer Histondemethylase und zwei verschiedenen Ubiquitin E3-Ligasen eine Kombination epigenetischer Modifikationen zur Inhibierung von Genen zu benutzen (Gearhart et al., 2006). Im
Einklang hiermit führte eine BCoR-Mutation in mesenchymalen Stammzellen eines OFCD20
Einleitung
Patienten zu erhöhten H3K4- und H3K36-Methylierungsleveln und damit zur Reaktivierung der Transkription bereits stillgelegter Gene (Fan et al., 2009).
Abbildung 8: Schematische Darstellung
des BCoR-Repressorkomplexes. Der BCoRKomplex ist ein PRC1-ähnlicher Komplex,
der ebenfalls durch inhibierende Chromatinmodifikationen reprimierend wirkt.
Dabei katalysieren RING-Proteine die
Ubiquitinylierung von Histon 2A und
FBXL10 (KDM2B) die Entfernung einer
Methylgruppe an Histon 3. Verwendete
Abkürzungen:
me=Methylierung; ub=Ubiquitinylierung;
H2A=Histon 2A; H3=Histon 3
2.3.3. Der PAF-Komplex und seine Rolle während der Elongation
Weiterhin interagiert ENL über seine YEATS-Domäne mit dem Polymerase Associated Factor Complex (PAFc) (He et al., 2011). Der PAFc ist ein Multiproteinkomplex mit den Kernkomponenten PAF1, CDC73, SKI8, CTR9, WDR61, LEO1 und Rtf1 (Jaehning, 2010; Rozenblatt-Rosen et al., 2005). Der erstmals in der Hefe entdeckte Proteinkomplex assoziiert
sowohl mit der initiierten (Serin5-phosophoryliert) als auch mit der elongierten Form (Serin2-phosphoryliert) der RNA-Polymerase II und spielt somit eine Rolle bei der Transkriptionsregulation (Wade et al., 1996; Pokholok et al., 2002).
Des Weiteren sind seine Komponenten in eine Vielzahl anderer biologischer Prozesse involviert, wie Transkriptionsaktivierung, Elongation, Histonmodifikationen, Zellzyklusregulation und mRNA-Prozessierung (vgl. Abb. 9) (Chaudhary et al., 2007; Kim et al., 2009; Kim
und Roeder, 2009).
Der PAF-Komplex ist mitunter an der Aufrechterhaltung der Stammzellidentität und für
die Regulation der HOX-Gene verantwortlich (Ding et al., 2009; Zhu et al., 2005).
21
Einleitung
Abbildung 9: Übersicht der Interaktionen und Funktionen des PAFc. Der PAF-Komplex interagiert mit verschiedenen Faktoren für die Elongation, die Transkriptionsaktivierung, Histonmodifikationen und 3‘-EndeModifikation der mRNA (nach Jaehning, 2010). Verwendete Abkürzungen: me=Methylierung; RNA-Pol
II=RNA-Polymerase II; H3K36=Histon 3 Lysin 36; H3K4=Histon 3 Lysin 4
Allerdings spielt die Deregulation verschiedener Komponenten des PAF-Komplexes auch
eine Rolle in der Kanzerogenese. So führt zum Beispiel eine „double minute“Amplifikation am Lokus 19q13 zur Überexpression von PD2/PAF1 in einer Pankreas-KrebsZelllinie (Panc1) (Batra et al., 1991). Die Überexpression dieses Proteins in NIH3T3 Zellen
resultierte ebenfalls in einer Transformation dieser Zellen, was ihm eine potentielle Rolle
als Onkogen zukommen lässt (Moniaux et al., 2006). CDC73 hingegen fungiert als Tumorsuppressorgen, dessen Überexpression in NIH3T3 und HEK293 Zellen zum Zellzyklusarrest
in der G1 Phase durch Blockade des Zellzyklusregulators CyclinD1 führt (Woodard et al.,
2005; Zhang et al., 2006). Im familiären Hyperparathyroidism-Jaw-Tumor Syndrom (HPTJT) liegt das für CDC73 (HRPT2) kodierende Gen allerdings mutiert vor, was zum Verlust
der Assoziation des PAFc mit Chromatin und der RNA-Polymerase II führt (RozenblattRosen et al., 2005). Mutationen in diesem Gen sind darüber hinaus noch mit einer Reihe
weiterer Tumoren, wie Brust-, Nieren- und Karzinomen des Gastrointestinaltraktes assoziiert (Newey et al., 2009).
Chromosomale Abberationen am Lokus 11p15.3, kodierend für CTR9, sind mit der Pathogenese verschiedenster Krebsarten, wie beispielsweise Lungenkrebs und Leukämie, in
Verbindung gebracht worden (Chaudhary et al., 2007; Redeker et al., 1995).
22
Einleitung
Der PAF-Komplex und seine Rolle bei der Transkriptionsregulation
Die Transkription bezeichnet im Allgemeinen den Prozess des „Umschreibens“ einer DNASequenz durch eine RNA-Polymerase in eine RNA-Sequenz. Die Proteinbiosynthese beschreibt die Transkription der DNA in mRNA (messenger RNA) und wird von der RNAPolymerase II katalysiert. Dieser Prozess kann in drei wesentliche Schritte unterteilt werden: Initiation, Elongation und Termination.
Während der Initiation lagert sich der Prä-Initiationskomplex an die Promotorsequenz
bzw. die Transkriptionsstartstelle des zu transkribierenden Gens an. In diesem Komplex
befindet sich unter anderem die unphosphorylierte RNA-Polymerase II, das TATABindeprotein und der Transkriptionsfaktor TFIIB. Zunächst wird die DNA-Struktur durch
eine Helikase lokal entspiralisiert (Roeder, 2005). Anschließend phosphoryliert eine Kinase Serin 5 der C-terminalen Domäne (CTD) der RNA-Polymerase II, was zur Loslösung der
Polymerase aus dem Initiationskomplex und zur Synthese einer kurzen mRNA-Sequenz
führt. Damit beginnt die Elongation (frühe Elongation), also die eigentliche Transkription,
in der zunächst nur eine kurze RNA-Sequenz gebildet wird. Um in die produktive Elongationsphase überzugehen, muss die CTD der RNA-Polymerase II durch die rekrutierte Kinase
pTEFb zusätzlich an Serin 2 phosphoryliert werden (Marshall und Price, 1995; Peterlin und
Price, 2006). Außerdem werden die inhibierenden Faktoren DSIF und NELF ebenfalls von
pTEFb phosphoryliert und somit inaktiviert. DSIF wird dabei durch Phosphorylierung der
SPT5-Untereinheit in einen positiven Elongationsfaktor umgewandelt und NELF dissoziiert
von der Promotorregion (Adelman und Lis, 2012). Diese Phosphorylierungen tragen zur
aktiven Elongation bei (Jaehning, 2010). Die Termination erfolgt nach der Polyadenylierung des 3‘-Endes der prozessierten mRNA, wonach die RNA-Polymerase II von der DNA
dissoziiert.
In höheren Organismen sind viele wichtige, an der Entwicklung und Differenzierung beteiligten Gene, wie beispielsweise Hox-Gene, auf der Ebene der transkriptionellen Elongation reguliert (Chopra et al., 2009). Dabei befindet sich die inaktive RNA-Polymerase II bereits am Promotor und kann somit ohne die Formierung eines Initiationskomplexes, nach
erfolgter Aktivierung durch bestimmte Signale, in die aktive Elongation übergehen (Strobl
und Eick, 1992). An diesen sogenannten „paused“ oder „stalled“ Promotoren liegt die
unphosphorylierte Polymerase mit den beiden inhibierenden Faktoren DSIF und NELF in
einem Komplex vor. Durch die Phosphorylierung der Polymerase und DSIF durch die Kina23
Einleitung
se pTEFb erfolgt die Loslösung von NELF sowie die Aktivierung der Polymerase und wahrscheinlich die Rekrutierung des PAF-Komplexes (Nechaev und Adelmann, 2011; Liu et al.,
2009). Der Rekrutierungsmechanismus des PAF-Komplexes ist jedoch noch nicht vollständig verstanden. Diverse Studien weisen darauf hin, dass der Komplex sowohl mit der unphosphorylierten als auch der elongierten Form der RNA-Polymerase II interagiert (Rozenblatt-Rosen et al., 2005). Andere deuten an, dass der PAF-Komplex erst nach Phosphorylierung der Polymerase und DSIF rekrutiert wird (Liu et al., 2009).
Abbildung 10: Schematische Darstellung eines „paused“ Promotors und der Elongationsaktivierung durch
den PAF-Komplex. Die RNA-Polymerase II befindet sich bereits im inaktiven Zustand an sog. „paused“ Promotoren. Durch aktivierende Signale und Rekrutierung verschiedener Faktoren (z.B. PAFc) wird die Polymerase und die inhibierenden Faktoren DSIF und NELF von der Kinase pTEFb phosphoryliert und damit
aktiviert. Der PAF-Komplex katalysiert die Modifikation der Histone und trägt somit ebenfalls zur aktiven
Elongation bei. Verwendete Abkürzungen: ub=Ubiquitin; H2B=Histon 2B; me=Methylierung; H3=Histon 3;
K=Lysin; RNA Pol II=RNA Polymerase II; P=Phosphorylierung
Weiterhin trägt der PAF-Komplex mittels aktivierender Chromatinmodifikationen zur
Transkriptionsaktivierung bei. Durch die Interaktion mit den Ubiquitinligasen RAD6 und
BRE1 wird Histon 2B an Lysin 120 monoubiquitinyliert (Jaehning 2010). Dies führt zur
H3K4me3 was dann die H2B-Deubiquitinylierung, H3K36me3 und Entfernung eines
H2A/H2B Dimers zur Folge hat. Diese Prozesse erleichtern der RNA-Polymerase II das Ablesen des DNA-Strangs und führen somit zur effektiven Elongation (Chaudhary et al.,
2007; Pavri et al., 2006). Zusammenfassend katalysiert der PAF-Komplex das „Setzen“
aktivierender Chromatinmodifikationen (H3K4me3, H3K36me3) und trägt durch die H2BUbiquitinylierung und der damit verbundenen Auflockerung der Chromatinstruktur zur
24
Einleitung
aktiven Transkription bei. Dieser Mechanismus ist in Abbildung 10 schematisch dargestellt.
Abbildung 11: Übersicht der Funktionen des PAFc. Der PAF-Komplex wirkt transkriptionsaktivierend, u.a.
durch die Rekrutierung der E3-ubiquitinligase BRE1/RAD6 und die daraus resultierende Ubiquitinylierung an
Histon 2B. Außerdem rekrutiert der PAF-Komplex MLL-Fusionsproteine und damit den EAP-Komplex, der
sich ebenfalls aktivierend auf die Elongation auswirkt. Verwendete Abkürzungen: me=Methylierung;
ub=Ubiquitinylierung; P=Phosphorylierung
Durch die Interaktion des PAF-Komplexes mit ENL kann der SEC- (Super Elongation Complex) oder EAP-Komplex an Chromatin rekrutiert werden, und somit ebenfalls die Transkription seiner Zielgene fördern (He et al., 2011). Die N-terminale YEATS-Domäne ist allerdings in vielen, in Patienten vorkommenden, MLL-Fusionsproteinen nicht vorhanden.
Dies wirft die Frage auf, ob in diesen Fällen die PAF-Interaktion eine Funktion innehat.
Milne et al. und Muntean et al. konnten zeigen, dass der PAF-Komplex mit MLL und MLLFusionsproteinen über die CxxC-RD2-Region von MLL interagieren kann. Durch diese Bindung wird der MLL-Komplex an Chromatin rekrutiert und trägt somit durch seine enzymatischen Aktivitäten, wie die H3K79-Methylierung mittels DOT1L und die Phosphorylierung
durch pTEFb, zur Transkriptionsaktivierung bei (Milne et al., 2010; Muntean et al., 2010).
Der PAF-Komplex könnte als „Brückenprotein“ zwischen Chromatin, der Polymerase und
25
Einleitung
dem SEC (Super Elongation Complex, ähnlich dem EAP-Komplex) fungieren (He et al.,
2011). Die Funktionen des PAF-Komplexes bei der Transkriptionsaktivierung sind in Abbildung 11 schematisch dargestellt.
In der vorliegenden Arbeit sollte zum einen die mögliche Involvierung des PAF-Komplexes
in der malignen Hämatopoese näher untersucht werden. Im Besonderen im Hinblick auf
die Inaktivierung der Polycomb-vermittelten Elongationsrepression und der konstitutiven
Expression der MLL-ENL Zielgene.
Zum anderen sollte die funktionelle Anwesenheit des BCL6-Corepressors (BCoR) im aktivierenden EAP-Komplex und dessen Einfluss auf die maligne Hämatopoese aufgeklärt
werden.
26
Aufgabenstellung
3. Aufgabenstellung
MLL-ENL Fusionsproteine blockieren die Differenzierung hämatopoetischer Vorläuferzellen indem sie die Expression von Genen induzieren, die die Selbsterneuerung von Vorläuferzellen bewirken. Die Transaktivierung dieser Gene beruht auf der Rekrutierung des
EAP-Komplexes durch den Fusionspartner ENL. Im aufgereinigten EAP Komplex wurden
neben aktivierenden Proteinen paradoxerweise auch Komponenten des PolycombRepressive-Complex-1 (PRC1), wie CBX8 und RING1 sowie der BCL-6-Corepressor (BCoR)
identifiziert. In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass die reprimierende Wirkung des
Chromobox-Proteins CBX8 durch die direkte Bindung an ENL aufgehoben wird.
Ziel dieser Arbeit war es aufzuklären, wie die Repressor-Aktivität des PRC1-Komplexes auf
molekularer Ebene durch die Interaktion mit ENL aufgehoben wird. Dabei sollte zunächst
eine Struktur-Funktionsanalyse Informationen, über die, für diesen Effekt notwendigen,
ENL-Domänen liefern. Weitere Untersuchungen sollten Aufschluss über die Funktion dieser Bereiche und insbesondere über die mögliche Beteiligung einer PAF-Rekrutierung an
der Neutralisierung der PRC1-Repression geben. Schließlich sollte die Bedeutung dieses
Mechanismus für das Transformationspotential und die Expression von MLL-ENL Zielgenen in Leukämiezellen untersucht werden, insbesondere im Hinblick auf Chromatinmodifikationen und Änderungen der Chromatinstruktur.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte geklärt werden, ob, analog zu CBX8, die gleichen Mechanismen auch bei der Interaktion mit BCoR zum Tragen kommen und wie sich eine
BCoR-Überexpression auf MLL-ENL transformierte murine Leukämiezellen auswirkt.
.
27
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1.
Inaktivierung des PRC1-Komplexes durch ENL
Das MLL-ENL Fusionsprotein ist in der Lage die Elongation seiner Zielgene durch Rekrutierung des EAP-Komplexes zu aktivieren (Mueller et al., 2007; Mueller et al.; 2009; Monroe
et al., 2011). Um eine konstitutive Expression ihrer Zielgene gewährleisten zu können,
müssen MLL-Fusionsproteine neben der Aktivierung zusätzlich den inhibierenden Polycomb-Komplex inaktivieren (Maethner et al., 2013).
Im Folgenden sollte die Frage geklärt werden, wie der Polycomb-Komplex in diesem Zusammenhang auf molekularer Ebene inhibiert wird.
4.1.1. Struktur-Funktionsanalysen zur Inaktivierung von CBX8 durch ENL
Wie aus den publizierten Vorarbeiten bekannt war, kann durch die direkte Interaktion
von ENL mit CBX8 dessen reprimierender Einfluss auf die transkriptionelle Elongation
neutralisiert werden (Maethner et al., 2013). Um festzustellen, ob und welche Domänen
von ENL für diesen Effekt notwendig sind wurde eine Struktur-Funktionsanalyse durchgeführt.
Abbildung 12: Schematische Darstellung des RevReportergenassays. Erst nach Phosphorylierung der
RNA-Polymerase II durch pTEFb kommt es zur produktiven Elongation und damit zur Synthese des Luziferase-Reportergens. Durch die Rekrutierung des zu testenden Proteins (Rev-CBX8 und ENL) an die Promotorregion kann dessen Effekt auf die Elongation bestimmt
werden (nach Mueller et al., 2009).
28
Ergebnisse
Dazu wurde ein spezielles Reportergen-Assay benutzt, mit dem die Auswirkung beider
Proteine spezifisch auf den Schritt der transkriptionellen Elongation untersucht werden
kann. Hierfür wurde ein modifizierter HIV-LTR-Promotor als Template benutzt. Dabei
stoppt die RNA Polymerase II nach Synthese einer kurzen RNA-Stammschleife (TAR:
transactivation response RNA) und ist erst nach der Phosphorylierung ihrer C-terminalen
„Repeat“-Domäne (CTD) durch die Kinase pTEFb in der Lage, in eine produktive Elongationsphase überzugehen. Die endogene pTEFb Aktivität führt zu einer gewissen Hintergrundtranskription, dadurch lassen sich mit diesem Testsystem auch reprimierende Effekte nachweisen. Da die synthetisierte TAR-Region zusätzlich eine Erkennungssequenz des
RNA-Bindeproteins Rev (IIB) beinhaltet, wird durch die Fusion eines zu untersuchenden
Proteins an Rev dessen Rekrutierung an die Promotorregion des Reportergens ermöglicht
(vgl. Abb. 12) (Gold et al., 1998; Zhu et al.; 1997).
Für die Durchführung des Experiments wurde ein bereits im Labor vorhandenes Rev-CBX8
Konstrukt, ein für das ENL-Wildtyp Protein codierendes Konstrukt, sowie zwei Nterminale ENL-Deletionsmutanten in HEK293 Zellen mit dem Reporterplasmid pGL3-HIVLTR cotransfiziert. Zuvor musste die korrekte Expression der generierten Mutanten mittels Western Blot Verfahren unter Verwendung eines gegen den Flag-Epitoptag gerichteten Antikörpers nachgewiesen werden (vgl. Abb. 13).
Abbildung 13: Expressionsnachweis der generierten N-terminalen ENL-Deletionsmutanten. Gezeigt sind
zwei Western Blots der Inputfraktion einer CoIP, die in Abbildung 15 gezeigt ist. Alle ENLDeletionsmutanten sind korrekt exprimiert.
29
Ergebnisse
Da die eingeführten Deletionen nicht zu einer Destabilisierung des ENL-Proteins führten,
wurden diese im Luziferase-Reportergenassay auf ihre Funktionalität hin überprüft (vgl.
Abb. 13).
A
B
C
Abbildung 14: Reportergenstudien mit N-terminalen ENL-Deletionsmutanten. (A) Schematische Darstellung der N-terminalen ENL-Deletionsmutanten. Die Bindung an CBX8 ist in allen generierten Mutanten noch
gegeben. (B) Reportergenassay der ENL-Mutante (400-559 AS). Die Luziferase-Aktivitäten des Leervektors
cotransfiziert mit den jeweiligen ENL-Konstrukten wurden gleich 1 gesetzt, wobei alle anderen Werte im
Verhältnis dazu angegeben sind. Als Negativkontrolle diente pcDNA-Rev, als Positivkontrolle Rev-CBX8. Die
Fehlerbalken geben die Standardabweichungen biologischer Triplikate wieder. (C) Rev-Reportergenassay
mit ENL-Mutante (125-559 AS). Die Darstellung und Durchführung ist analog zu (B)
In Abbildung 14(A) sind die generierten N-terminalen Deletionsmutanten schematisch
dargestellt. Wie Abbildung 14(B) und (C) zeigen, führte die Deletion der YEATS-Domäne
am N-Terminus des ENL-Proteins zu einem fast vollständigen Verlust seiner neutralisierenden Wirkung auf die CBX8-vermittelte Elongationsrepression. Dies war nicht auf eine
30
Ergebnisse
Beeinträchtigung der ENL-CBX8 Bindung zurückzuführen, da bereits gezeigt wurde, dass
für diese Protein-Protein Interaktion die C-terminale Domäne des ENL-Proteins nicht nur
notwendig, sondern auch hinreichend ist (Maethner et al., 2013). Daher liegt die Vermutung nahe, dass die YEATS-Domäne einen wichtigen Beitrag für die „neutralisierende“
Funktion des ENL-Proteins liefert. In Analogie zur bekannten „scaffold“-Funktion von ENL
bei der Transkription könnte diese zum Beispiel in der Rekrutierung weiterer Proteine
liegen.
Dies wirft die Frage nach einem möglichen Interaktionspartner auf, der an eben diese
Domäne bindet und an der Neutralisierung der CBX8-vermittelten Repression beteiligt ist.
4.1.2. Interaktionsstudien zu ENL und PAF1 und deren Funktion
Interessanterweise interagiert die ENL YEATS-Domäne mit dem Polymerase-AssociatedFactor-Complex (PAFc), der stimulierend auf die Transkription wirkt und mit der RNAPolymerase II assoziiert ist (He et al., 2011; Rozenblatt-Rosen et al., 2005). Der PAFKomplex (PAFc) ist ein Multiproteinkomplex, wobei PAF1 als Gerüstprotein fungiert.
Durch seine elongationsfördernde Aktivität könnte es sich hierbei um den Proteinkomplex
handeln, der über die Interaktion mit ENL zur aktiven transkriptionellen Elongation und
zur Inaktivierung des reprimierenden Polycomb-Proteins CBX8 beitragen könnte.
Aufgrund dessen wurden im folgenden Experiment die generierten ENL-Deletionsmutanten im Hinblick auf ihre Bindung an PAF1 untersucht. Dazu wurde eine Coimmunopräzipitation (CoIP) mit den verschiedenen flag-getaggten ENL-Konstrukten, und HAgetaggtem PAF1 durchgeführt. Hierzu wurden ΦNX-E Zellen transient mit den Konstrukten transfiziert und nach etwa 30 Stunden Zellextrakte generiert. Flag-ENL und eventuell
daran gebundene Proteine wurden mit anti-flag gekoppelten Agarosebeads präzipitiert.
Anschließend sollten die Proteine im Western Blot detektiert werden. Dafür wurden Antikörper verwendet, die spezifisch die jeweiligen Epitoptags erkennen (anti-HA, anti-flag).
31
Ergebnisse
A
B
C
Abbildung 15: Coimmunopräzipitation mit N-terminalen ENL-Deletionsmutanten und PAF1. (A) Gezeigt ist
ein Western Blot. Aufgetragen wurden 300mM Gesamtzellextrakte der Inputfraktion und des Präzipitats.
Präzipitiert wurde flag-ENL (rot markiert) mit anti-flag gekoppelten Agarosebeads. Zur Detektion diente ein
gegen den HA- sowie den flag-Epitoptag gerichteter Antikörper. Verwendete Abkürzung: CTD=C-terminale
Domäne; *=IgG
Wie in Abbildung 15 erkennbar ist, führte eine Deletion der ENL YEATS-Domäne zu einem
weitgehenden Verlust der physikalischen ENL-PAF1 Interaktion, was gut mit der verminderten Aktivität der ENL-Mutanten im Reportergenassay korreliert. Interessanterweise
war in den Coimmunopräzipitationen bei den verkürzten ENL-Derivaten in einigen Versu32
Ergebnisse
chen noch eine gewisse minimale Affinität zu PAF1 nachweisbar, was wiederum gut zu
den Rev-Luziferase Ergebnissen passt. Obwohl nicht unbedingt statistisch signifikant, waren doch in diesen Reportergenversuchen die N-terminalen ENL-Deletionsmutanten konsistent immer noch leicht aktiv (vgl. 4.1.1).
Zusammenfassend lässt sich aus diesen Experimenten schließen, dass PAF1 mit der ENLYEATS-Domäne interagiert, wobei diese Bindung in den generierten Mutanten nahezu
komplett aufgehoben wird. Die gute Korrelation zwischen biochemischer PAF1-Bindung
und der Fähigkeit des ENL-Proteins die CBX8-induzierte Repression zu neutralisieren legt
nahe, dass die Rekrutierung des PAF-Komplexes auch bei der Inaktivierung von CBX8 eine
entscheidende Rolle spielen könnte. Um dies genauer analysieren zu können, sollte im
Folgenden die Interaktion zwischen PAF1 und ENL näher charakterisiert werden.
4.1.2.1. Charakterisierung der PAF-ENL Interaktion
Die generierten ENL-Deletionsmutanten gaben bereits Aufschluss über die mögliche Lokalisation der PAF1-Bindedomäne im ENL-Protein und deuten auf eine mögliche Involvierung von PAF1 bei der Inaktivierung des Polycomb-Komplexes hin.
Abbildung 16: Sequenz der generierten ENL∆PAF1-Mutante und der YEATS-Domäne. Konservierte Sequenzen der YEATS-Domänen innerhalb der YEATS-Domänen-Proteinfamilie. Dabei ist die Region, in die die
Mutationen eingefügt wurden, rot umrandet. Die Mutationen wurden zwischen dem β-Faltblatt 1 und 2
eingefügt. Es handelt sich dabei sowohl um Punktmutationen als auch Deletionen (Zhang et al., 2011).
Um dies zu bestätigen sollte eine weitere ENL-Mutante hergestellt werden. Die eingefügten Mutationen enthalten sowohl Punktmutationen als auch eine Deletion zwischen dem
33
Ergebnisse
ersten und zweiten β-Faltblatt der ENL YEATS-Domäne. Dieser Bereich liegt in ENL und
AF9, die beide bekanntlich mit PAF1 interagieren, konserviert vor (He et al., 2011; Zhang
et al., 2011). Außerdem liegen Protein-Protein-Interaktionsdomänen erfahrungsgemäß in
den „Loops“ zwischen den β-Faltblatt-Strukturen.
Abbildung 16 zeigt die Sequenzen der YEATS-Domänen einzelner Mitglieder der YEATSDomänen-Proteinfamilie. Die Region die zwischen ENL und AF9 konserviert vorliegt und in
die die Mutationen eingefügt wurden ist rot umrandet (vgl. Abb. 16, oben). In der unteren
Abbildung sind die eingefügten Punktmutationen und die Deletionen in diesem Bereich
gekennzeichnet. Um nun die Bindung der generierten ENL∆PAF1-Mutante (fENL∆21-26QLR18-20AAA-G27A-F28Y) mit PAF1 zu untersuchen, sollte eine Coimmunopräzipitation,
analog zu dem unter 4.1.2. beschriebenen Experiment, durchgeführt werden. Allerdings
wurden zur Präzipitation Antikörper-gekoppelte Beads verwendet, die spezifisch das ENLProtein erkennen. Die Inputfraktion diente hier gleichzeitig als Expressionsnachweis der
generierten Mutante (vgl. Abb. 17: Input Spur 3, unten).
Abbildung 17: Coimmunopräzipitation
mit ENL∆PAF1-Mutante und PAF1. Gezeigt sind zwei Western Blots. Aufgetragen wurden 300mM Gesamtzellextrakte
der Inputfraktion (links) und des Präzipitats (rechts). Präzipitiert wurde mit Antikörper-gekoppelten Beads, die ENL erkennen. Detektiert wurde mit Antikörpern gegen den HA-tag (oben) sowie den
flag-tag (unten).
Obwohl die generierte ENL∆PAF1-Mutante im Gegensatz zum Wildtypprotein etwas
schwächer exprimiert war und demnach auch weniger präzipitiert wurde, konnte dennoch gezeigt werden, dass die eingeführten Mutationen in der YEATS-Domäne zu einer
deutlich verminderten Bindeaffinität zu PAF1 führten (vgl. Abb. 17). Deshalb sollte dieses
Konstrukt auf seine Funktionalität hin im Rev-Reportergenassay getestet werden.
34
Ergebnisse
4.1.2.2. Funktionsanalyse der ENL-Mutante
Im Folgenden sollte dieses Konstrukt ebenfalls in Reportergenstudien, hinsichtlich seiner
neutralisierenden Wirkung auf die CBX8-vermittelte Elongationsrepression, untersucht
werden (vgl. 4.1.1). Dafür wurden wiederum Konstrukte, die für das ENL-Wildtypprotein
und die Mutante codieren, mit einem Rev-CBX8 Konstrukt in HEK293 Zellen cotransfiziert
und am folgenden Tag am Luminometer vermessen.
Abbildung 18: Rev-Reportergenassay mit
ENL∆PAF1-Mutante.
Die
LuziferaseAktivitäten des Leervektors cotransfiziert mit
den jeweiligen ENL-Konstrukten wurden als 1
definiert, wobei alle anderen Werte im Verhältnis dazu angegeben sind. Als Kontrollen
dienten pcDNA-Rev und Rev-CBX8. Die Standardabweichungen wurden aus den biologischen Triplikaten berechnet.
Wie in Abbildung 18 gezeigt werden konnte, führten die Mutationen in der YEATSDomäne, zu einem nahezu kompletten Verlust der neutralisierenden Wirkung von ENL auf
die CBX8-vermittelte Repression der transkriptionellen Elongation. Dies passt gut zur
verminderten Aktivität der N-terminalen Deletionsmutanten (vgl. 4.1.1). Die minimale
Restaktivität der ENL∆PAF1-Mutante korreliert mit dem Ergebnis der Coimmunopräzipitation, in der eine minimale Affinität der Mutante zu PAF1 festgestellt werden konnte (vgl.
4.1.2.1).
Zusammenfassend lässt sich aus den in vitro Bindungs- und Reportergenanalysen schließen, dass die Interaktion zwischen ENL und PAF1 notwendig für die Neutralisierung des
reprimierenden Effektes von CBX8 auf die transkriptionelle Elongation ist. Der Aktivitätsverlust von ENL in Bezug auf die Inhibierung der Polycomb-vermittelten Repression ging
dabei mit einem Affinitätsverlust zu PAF1 einher. Im Folgenden sollte mit einem rezipro35
Ergebnisse
ken Experiment die Auswirkung einer PAF1-Überexpression in diesem Zusammenhang
untersucht werden.
4.1.2.3. Überexpression von PAF1 in transienten Reportergenstudien
In transienten Reportergenstudien führte der Verlust der physikalischen Interaktion zwischen ENL und PAF1 zu einer verminderten Aktivität des ENL-Proteins hinsichtlich der
Neutralisierung der Polycomb-vermittelten Elongationsrepression. Demnach sollte eine
Überexpression von PAF1 einen gegenläufigen Effekt zeigen. Um dies experimentell zu
bestätigen, sollte im Folgenden die Auswirkung einer zusätzlichen PAF1-Expression im
Reportergenassay untersucht werden. Hierbei wurden das ENL-Wildtypprotein und RevCBX8-Konstrukt zusätzlich mit steigenden Konzentrationen von PAF1 (0,25-0,5µg)
cotransfiziert.
Abbildung 19: Rev-Reportergenassay mit
PAF1 Überexpression. Die jeweiligen Konstrukte cotransfiziert mit dem Leervektor
wurden gleich 1 gesetzt und alle anderen
Werte relativ dazu ausgedrückt. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen
biologischer Triplikate wieder. Zusätzlich wurde zum ENL-Wildtypprotein PAF1 in steigender Konzentration cotransfiziert.
36
Ergebnisse
Auch in diesem Experiment war ENL in der Lage die reprimierende Wirkung von CBX8 auf
die Elongation nahezu vollständig aufzuheben. Um den Effekt der PAF1-Expression besser
validieren zu können, wurde ENL hier in einer geringeren Konzentration transfiziert, weshalb dessen neutralisierende Wirkung geringer ausfiel als in den zuvor durchgeführten
Reportergenstudien. Im gezeigten Experiment wird deutlich, dass durch die zusätzliche
Expression von PAF1 der neutralisierende Effekt des ENL auf die CBX8-vermittelte Elongationsrepression potenziert wird. Dabei nimmt der Effekt, dosisabhängig, mit steigender
PAF1-Konzenration zu (vgl. Abb. 19).
4.1.3. Mimikry der PAF1-ENL Interaktion
4.1.3.1. Charakterisierung der ENL-Bindedomäne in PAF1
Im Gegensatz zur PAF1-Überexpression sollte eine Reduktion bzw. „knock-down“ des Proteins genau den gegenteiligen Effekt erzielen. Ein „knock-down“ der PAF1-Expression
führte zwar zu einer generellen Reduktion der PAF1-Expression auf RNA Ebene um ca.
50% (nicht gezeigt), aber die verbleibende Menge an PAF1 war offensichtlich noch ausreichend um die ENL-vermittelte Neutralisation der CBX8-Repression zu erlauben, da die
PAF1-reduzierten „knock-down“ Zellen noch die gleiche ENL-Aktivität aufwiesen (nicht
gezeigt). Deshalb sollte im Folgenden spezifisch die ENL-PAF1 Interaktion durch die Expression eines, die ENL-Binderegion enthaltenden, PAF1-Fragments blockiert werden.
Dazu war es notwendig zunächst die ENL-Binderegion in PAF1 zu identifizieren.
Hierfür wurden verschiedene C-terminale PAF1-Deletionsmutanten generiert, deren Bindungsaffinität zu ENL mit Hilfe einer Coimmunopräzipitation untersucht werden sollte.
Die korrekte Expression der generierten Konstrukte wurde gleichzeitig anhand der Inputfraktion nachgewiesen.
37
Ergebnisse
A
B
Abbildung 20: Coimmunopräzipitation mit PAF1-Deletionsmutanten und ENL. (A) Schematische Darstellung der generierten C-terminalen PAF1-Deletionsmutanten und deren Fähigkeit zur Interaktion mit ENL.
Als „+“ dargestellt sind Proteine, die mit ENL interagieren können, mit „-” sind PAF1-Mutanten gekennzeichnet, die die Bindefähigkeit verloren haben. (B) Gezeigt sind vier Western Blots. Aufgetragen wurden
300mM Gesamtzellextrakte der Inputfraktion (links) und des Präzipitats (rechts). Präzipitiert wurde mit
Antikörper-gekoppelten Beads, die spezifisch den flag-Epitoptag erkennen. Zur anschließenden Detektion
wurden Antikörper gegen den HA-tag (oben) sowie den flag-tag (unten) benutzt.
In der Inputfraktion zeigte sich, dass alle Proteine in ähnlicher Intensität exprimiert waren
(siehe Abb. 20: links oben: HA-PAF1; unten: flag-ENL). Wie in Abbildung 20 erkennbar ist,
führte die Deletion der Aminosäuren 267-532 zum Verlust der Affinität des PAF1-Proteins
zu ENL. Die Deletion der Aminosäuren 399-532 hatte hingegen keinen Einfluss auf die
Interaktion der beiden Proteine. Daraus lässt sich schließen, dass sich die ENLInteraktionsdomäne zwischen den Aminosäuren 267-399 des PAF1-Proteins befinden
muss. Bei den Banden, die bei ca. 50kDA sichtbar waren, handelte es sich um Immunglobuline die sich beim Eluieren des Präzipitats von den Agarosebeads lösten.
38
Ergebnisse
4.1.3.2. Funktionelle Untersuchung zur Inhibition der ENL-PAF1 Interaktion
Im weiteren Verlauf sollte die Frage geklärt werden, wie sich die Blockierung der PAF1ENL Interaktion auf die Inaktivierung der CBX8-vermittelten Repression im transienten
Reportergensystem auswirkt. Dafür sollte die Binderegion im ENL-Protein durch die Überexpression der PAF1-Interaktionsdomäne (im Folgenden als „PAF-Block“ bezeichnet) blockiert und somit die PAF1-ENL-Interaktion unterbunden werden. PAF-Block würde in diesem Experiment als „small molecule inhibitor“ fungieren (vgl. Abb. 21).
Abbildung 21: Schematische Darstellung der Inhibierung der PAF1-ENL Interaktion durch die Überexpression von PAF-Block. Durch die Überexpression der PAF1-Interaktionsdomäne (PAF-Block), soll die Binderegion für PAF1 im ENL-Protein blockiert und so die PAF1-ENL Interaktion verhindert werden.
A
B
Abbildung 22: Schematische Darstellung des PAF1-Proteins und PAF-Block (AS 267-399) sowie deren Expression im Western Blot. (A) Schematische Darstellung des PAF1-Proteins und PAF-Block (AS 267-399). Die
Interaktion mit ENL ist durch ein „+“ gekennzeichnet. (B) Expressionsnachweis mittels Western Blot der
beiden Konstrukte. Zur Detektion wurde ein anti-HA-Antikörper verwendet.
39
Ergebnisse
Zunächst sollte die korrekte Expression des generierten Konstruktes (PAF-Block) mittels
immunologischer Detektion im Western Blot überprüft werden. Zur Detektion wurde ein
gegen den HA-Epitoptag gerichteter Antikörper verwendet (vgl. Abb. 22).
Anschließend sollte es hinsichtlich seiner Funktion im Rev-Reportergenassay untersucht
werden. Hierfür wurde Rev-CBX8 mit ENL und steigenden Konzentrationen von PAF-Block
in HEK293 Zellen cotransfiziert und am folgenden Tag am Luminometer vermessen.
Abbildung 23: Rev-Reportergenassay mit
PAF-Block in Anwesenheit von ENL.
Cotransfektion von ENL, Rev-CBX8 und
steigenden Konzentrationen von PAFBlock. Die Standardabweichungen wurden
aus den triplikaten Ansätzen berechnet.
Die gezielte Blockierung der PAF1-ENL Interaktion durch die Expression von PAF-Block
konnte die neutralisierende Wirkung von ENL auf die CBX8-vermittelte Elongationsrepression dosisabhängig reduzieren (vgl. Abb. 23). Diese Ergebnisse korrelieren gut mit der
verminderten Aktivität der N-terminalen ENL-Deletionsmutanten (vgl. 4.1.1).
Aus den bisher gezeigten Experimenten geht hervor, dass die PAF-Rekrutierung über die
ENL YEATS-Domäne an der Neutralisierung der Polycomb-vermittelten Elongationsrepression beteiligt ist. Die Frage nach dem molekularen Mechanismus bleibt jedoch ungeklärt.
40
Ergebnisse
4.1.4. Funktionelle Konsequenzen der ENL-PAF Interaktion
Im nächsten Teil der Arbeit sollte die Funktion der PAF1-ENL Interaktion näher untersucht
werden. Der PAF-Komplex wirkt aktivierend auf die transkriptionelle Elongation und katalysiert die Monoubiquitinylierung an Histon 2B (Kim und Roeder, 2009). Ubiquitinyliertes
Histon 2B steht im Zusammenhang mit einem aktiven Chromatinstatus und aktiver Genexpression. Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich hierbei um einen durch den PAFKomplex induzierten Mechanismus handelt, der im transienten Modell die Inhibierung
durch CBX8 überkommt und die Expression des Reportergens stimuliert.
Eine
Chromatinimmunopräzipitation
(ChIP)
sollte
Aufschluss
über
die
H2B-
Ubiquitinylierung des Reportergenkonstrukts liefern. Dabei sollte im Besonderen eine
mögliche Änderung der Ubiquitin-Level in Verbindung mit der PAF-Komplex Rekrutierung
untersucht werden. Zudem sollte analysiert werden, ob ein Zusammenhang zwischen
aktiver Genexpression und H2B-Ubiquitinylierung besteht.
Hierfür wurde das Reportergenkonstrukt jeweils mit Rev-CBX8 sowie dem Wildtyp ENL
oder der ENL-Deletionsmutante cotransfiziert. Für dieses Experiment wurde die Mutante
gewählt, die noch eine minimale Restaktivität im Reportergenassay sowie Affinität zu
PAF1 zeigte (ENL-125-559 AS). Anschließend wurde eine Chromatinimmunopräzipitation
mit H2B-Ubiquitin-spezifischen-Antikörpern durchgeführt. Die gewonnene DNA wurde
anschließend mittels Realtime PCR unter Verwendung spezifischer, an das Luziferasereportergen hybridisierender, Primer analysiert und quantifiziert.
Erwartungsgemäß war die H2B-Ubiquitinylierung in Zellen, transfiziert mit Rev-CBX8 alleine kaum nachweisbar. Im Vergleich dazu war die aktivierende Chromatinmodifikation in
Anwesenheit des ENL-Proteins um das zehnfache angereichert. Dies korreliert gut mit der
gesteigerten Luziferase-Expression, die in Anwesenheit des ENL-Wildtyp-Proteins verzeichnet werden konnte (vgl. 4.1.1). Im Vergleich zum Vektor zeigten die mit der ENLMutante transfizierten Zellen ein knapp fünffach erhöhtes Ubiquitinylierungslevel. Dies
lässt sich durch die Restaktivität dieser Mutante im Reportergenassay und der noch vorhandenen, minimalen Affinität zu PAF1 erklären (vgl. 4.1.1; 4.1.2).
41
Ergebnisse
Trotzdem war diese Chromatinmodifikation in Anwesenheit der ENL-Mutante im Gegensatz zu ENL-transfizierten Zellen stark reduziert (vgl. Abb. 24).
Abbildung 24: H2B-Ubiquitinylierung des Luziferase-Reportergens. Gezeigt ist das Ergebnis einer ChIPAnalyse. Präzipitiert wurde mit H2B-Ubiquitin-Antikörpern. Für die PCR wurden genspezifische Primer benutzt. Normalisiert wurde auf die jeweilige Inputfraktion. Der DNA-Gehalt der mit Rev-CBX8 und dem Vektor transfizierten Zellen wurde als 1 definiert und alle anderen Werte relativ dazu ausgedrückt.
Aus diesem Experiment geht hervor, dass die Interaktion zwischen PAF1 und ENL mit erhöhter Ubiquitinylierung an Histon 2B einhergeht (vgl. Abb. 24). Des Weiteren korreliert
die gesteigerte H2B-Ubiquitinylierung mit einer erhöhten Expression des Reportergens
(siehe 4.1.1. Reportergenstudie). Im weiteren Verlauf sollte untersucht werden, ob die
Interaktion zwischen dem PAF-Komplex und ENL auch in vivo, in der malignen Hämatopoese eine Rolle spielt.
42
Ergebnisse
4.1.5. Rolle von PAF1 in der malignen Hämatopoese
Die vorherigen Studien beruhten allein auf den biochemischen Zusammenhängen der
ENL-PAF1 Interaktion. Die Rekrutierung des PAF-Komplexes könnte anhand dieser Ergebnisse nicht nur in vitro, sondern auch während der malignen Hämatopoese für die Aktivierung der MLL-ENL Zielgene, von Bedeutung sein. Dabei könnte das Fusionsprotein über
PAF1 an die Promotorregionen rekrutiert werden und so die aktive Genexpression steuern. Der PAF-Komplex ist beispielsweise in der Hefe für die Rekrutierung des Methyltransferase-Komplexes COMPASS an die RNA-Polymerase II zuständig. Als Homolog für den
COMPASS-Komplex gilt im Menschen der MLL-Komplex (Krogan et al., 2003; RozenblattRosen et al., 2005).
Damit stellte sich die Frage, ob es auch im humanen System der normalen und malignen
Hämatopoese zu einer Interaktion zwischen MLL bzw. MLL-Fusionsproteinen und dem
PAF-Komplex kommt. Des Weiteren sollte die Frage geklärt werden, ob diese Bindung
einen positiven Einfluss auf das Transformationspotential von MLL-ENL Fusionsproteinen
hat.
Abbildung 25: Schematische Darstellung des MLL-ENL-Fusionsproteins. Der MLL N-Terminus ist entweder
mit dem kompletten ENL-Protein fusioniert (ENLfull) oder nur mit dessen C-terminaler Region (ENLshort).
Die Fusion mit der C-terminalen Region ist dabei sowohl ausreichend als auch notwendig für die Transformation hämatopoetischer Zellen. Verwendete Abkürzungen: CxxC=CxxC-Domäne; YEATS=YEATS-Domäne;
CTD=C-terminale Domäne
In den vorher gezeigten Experimenten konnte eine Interaktion zwischen PAF1 und der Nterminalen ENL YEATS-Domäne nachgewiesen werden. In einigen Patienten mit einer
Translokation und der Bildung eines MLL-ENL Fusionsproteins fehlt diese ENL-Domäne
jedoch. In diesem Fall ist das MLL-Protein nur an die C-terminale Region von ENL (CTD)
fusioniert. Diese Region scheint allerdings ausreichend für die Transformation hämatopoetischer Zellen durch das Fusionsprotein zu sein (Slany et al., 1998). Diese Daten wider43
Ergebnisse
sprechen zunächst der Annahme, dass der PAF-Komplex über das MLL-ENL Fusionsprotein
gebunden werden kann und so eine Rolle während der malignen Hämatopoese spielt. In
Abbildung 25 ist das MLL-ENL Fusionsprotein schematisch dargestellt.
Anhand diverser Studien konnte bisher allerdings belegt werden, dass MLL über seine
CxxC-Domäne und RD2-Region ebenfalls mit dem PAF-Komplex interagieren kann. Hierbei
handelt es sich um eine multivalente Interaktion zwischen PAF1 und der pre-CxxCDomäne sowie der RD2-Region des MLL-Proteins (Milne et al., 2010; Muntean et al.,
2010). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der PAF-Komplex sowohl über ENL als
auch über MLL rekrutiert werden kann.
Um nun den Einfluss der PAF/MLL-ENL Interaktion auf die maligne Hämatopoese näher
untersuchen zu können, wurden zwei PAF1-bindungsdefiziente MLL-Mutanten generiert,
die in Abbildung 26 schematisch dargestellt sind. Diese wurden jeweils mit dem Cterminalen Bereich von ENL (-ENLshort) oder dem kompletten ENL (-ENLfull) fusioniert.
Das komplette ENL enthält dabei die für die PAF1-Interaktion essentielle N-terminale
YEATS-Domäne. Beide MLL-Mutanten wurden in den Veröffentlichungen von Milne et al.
und Muntean et al. bereits beschrieben und auf ihre Funktionalität hin getestet (Milne et
al., 2010; Muntean et al., 2010). Bei den eingeführten Mutationen handelte es sich entweder um eine C-terminale Deletion der RD2-Region [MLL∆-ENL (beinhaltet die AS 1-1258
des MLL-Proteins)], oder eine Punktmutation in der CxxC-Domäne des MLL, wobei ein
Arginin gegen ein Alanin ausgetauscht wurde [MLL-R1153A-ENL (R1153A, R→A)] (Milne et
al., 2010; Muntean et al., 2010). Verschiedene Studien konnten bisher belegen, dass die
CxxC-Domäne an CpG-reiche Regionen der DNA bindet, wobei die spezifischen Reste, die
für die direkte Bindung verantwortlich waren, identifiziert werden konnten. Die eingefügte Punktmutation befindet sich auf der gegenüberliegenden Seite der Bindetasche und ist
damit frei zugänglich für potentielle Interaktionen mit anderen Proteinen (Allen et al.,
2006; Cierpicki et al., 2010). Diese Mutation hat nachweislich weder einen Einfluss auf die
DNA-Bindung noch auf die korrekte Faltung der CxxC-Domäne (Allen et al., 2006).
44
Ergebnisse
Durch die eingefügten Mutationen in der MLL cDNA soll die PAF1-Bindung inhibiert werden, so dass das Protein ausschließlich über die YEATS-Domäne des kompletten ENLProteins rekrutiert werden kann (vgl. Abb. 26).
Mittels der beiden MLL-Mutanten sollte die Frage geklärt werden, welchen Einfluss die
Interaktion des PAF-Komplexes mit MLL-ENL auf die maligne Hämatopoese hat. Dafür
sollten im Folgenden ckit+ Knochenmarkzellen einer C57BL6 Maus mit den generierten
Konstrukten retroviral transduziert und anschließend transformiert werden. Als Positivkontrollen wurden in allen nachfolgenden Experimenten ein MLL-ENL Fusionsprotein mit
dem kompletten ENL-Protein (MLL-ENLfull) und ein Fusionsprotein mit der C-terminalen
Region des ENL-Proteins (MLL-ENLshort) verwendet. Zudem sollte die DNA-Bindung in
allen generierten Konstrukten unbeeinträchtigt bleiben, da diese für die Transformation
hämatopoetischer Zellen notwendig ist (Slany et al., 1998; Muntean et al., 2008).
Abbildung 26: Schematische Darstellung der generierten MLL-ENL Mutanten mit PAF1 Interaktion. Als
Positivkontrollen dienten die beiden MLL-Wildtypproteine fusioniert mit dem kompletten (MLL-ENLfull) und
dem C-terminalen Fragment von ENL (MLL-ENLshort). Des Weiteren wurden eine MLL-Deletionsmutante
(MLL∆) und eine MLL-Punktmutante (MLL-R1153A) generiert. Diese wurden ebenfalls mit dem kompletten
(-full) ENL oder der ENL-CTD (-short) fusioniert. Die Konstruktlängen beziehen sich auf die Anzahl der Aminosäuren. Das „rote X“ kennzeichnet die Mutation, wobei der AS-Austausch der Punktmutante (R→A) ebenfalls angegeben und durch einen „roten Strich“ gekennzeichnet ist. Verwendete Abkürzungen: CTD=Cterminale Region; CxxC=CxxC-Domäne; YEATS=YEATS-Domäne; AT-Hooks=AT-Haken
45
Ergebnisse
4.1.5.1. Einfluss von PAF1 auf das Transformationspotential
Laut der aufgestellten Hypothese sollten die Effekte, die aus dem Affinitätsverlust der
MLL-Mutanten zu PAF1 resultieren, durch die Fusion mit dem kompletten ENL komplementiert werden. Da in diesem Falle die PAF1-Rekrutierung über die ENL YEATS-Domäne
erfolgen könnte. Im weiteren Verlauf sollte zunächst die Frage geklärt werden ob die
PAF1/MLL-ENL-Interaktion einen Einfluss auf das Transformationspotential des Fusionsproteins hat.
Dafür wurden die oben gezeigten MLL-Konstrukte in retrovirale Expressionsplasmide kloniert, um mit diesen hämatopoetische Vorläuferzellen einer C57BL6 Maus zu transduzieren und anschließend zu transformieren.
Abbildung 27: Expression der generierten MLL-ENL Mutanten. Gezeigt ist ein Western Blot eines 500mM
Nukleärextrakts transient transfizierter ΦNX-E Zellen mit den generierten MLL-ENL Konstrukten. Zur Detektion wurde ein gegen den flag-tag gerichteter Antikörper benutzt.
Zuerst wurde die korrekte Expression der generierten Konstrukte durch transiente Transfektion in ΦNX-E Zellen überprüft und mittels Western Blot Verfahren unter Benutzung
eines gegen den Flag-Epitoptag gerichteten Antikörpers detektiert. Dabei wurde deutlich,
dass die längeren MLL-ENL Konstrukte etwas schwächer exprimiert wurden. Dies könnte
im Zusammenhang mit einer schlechteren Transfektionseffizienz der relativ großen Plasmide stehen (vgl. Abb. 27). In Abbildung 28 ist der Versuchsaufbau schematisch dargestellt.
46
Ergebnisse
Abbildung 28: Schematische Darstellung des Knochenmarktransformationstest der MLL-ENL Konstrukte.
Zuerst werden retrovirale Virenpartikel der generierten Konstrukte hergestellt, mit denen isolierte, murine
Knochenmarkvorläuferzellen transduziert werden sollen. Anschließend erfolgt die Antibiotikaselektion auf
erfolgreich transduzierte Zellen. Durch mehrmaliges Replattieren in semisolidem Medium bilden sich Kolonien transformierter Zellen.
Anhand eines Knochenmarktransformationstests sollten die MLL-ENL Mutanten hinsichtlich ihres Transformationspotentials und der Fähigkeit Kolonien zu bilden untersucht
werden. Dabei sollte die Frage geklärt werden, ob die Rekrutierung des PAF-Komplexes
eine Rolle bei der Leukämieentstehung spielt. Die aufgereinigten Knochenmarkzellen
wurden mit den retroviralen Konstrukten transduziert, mit dem geeignetem Antibiotikum
selektioniert und schließlich in biologischen Triplikaten in semisolidem Medium kultiviert
sowie seriell replattiert (vgl. Abb. 28). Normale hämatopoetische Zellen sterben in Folge
der voranschreitenden Differenzierung unter diesen Bedingungen ab. Das MLL-ENL Fusionsprotein hingegen blockiert die Differenzierung und ist in der Lage die Zellen zu immortalisieren, was in ungehemmtem Wachstum und der Bildung von Kolonien resultiert. Diese können mit dem Lebendfarbstoff Iod-Nitro-Tetrazoliumchlorid (INT) angefärbt werden.
Als Positivkontrollen dienten in diesen Experimenten jeweils das Wildtyp MLL-Protein,
fusioniert mit dem kurzen C-terminalen Bereich von ENL (MLL-ENLshort) oder dem kompletten ENL-Protein (MLL-ENLfull).
47
Ergebnisse
A
Abbildung 29: Knochenmarktransformationstest mit MLLENL Konstrukten. (A) Gezeigt sind INT-gefärbte Drittrundenkolonien in Triplikaten. Dieser Farbstoff färbt nur lebende
Zellen an. (B) Anzahl der Drittrundenkolonien in einem Balkendiagramm dargestellt. Mittelwerte und Standardabweichungen errechnen sich aus den triplikaten Ansätzen.
B
Aus den gezeigten Daten geht hervor, dass das Selbsterneuerungspotential der Zellen mit
der Fähigkeit des MLL-ENL Fusionsproteins den PAF-Komplex zu rekrutieren, korrelierte.
In der dritten Replattierungsrunde differenzieren normale bzw. nicht-transformierte hämatopoetische Zellen aus, sterben ab und können somit keine Kolonien mehr bilden. Zellen die durch ein funktionsfähiges MLL-ENL Fusionsprotein transformiert wurden, wachsen hingegen im semisoliden Medium ungehemmt weiter und bilden Kolonien. Der Affinitätsverlust zu PAF1 wirkte sich hier negativ auf das Transformationspotential der MLL-ENL
48
Ergebnisse
Konstrukte aus. Durch die Anwesenheit des kompletten ENL im Fusionsprotein konnte
dieser Effekt komplementiert werden, was mit einer Steigerung des Selbsterneuerungspotentials dieser Zellen einherging.
Diese Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass die Interaktion zwischen PAF1 und dem
MLL-ENL Fusionsprotein essentiell für dessen Transformationspotential ist. Das divergierende Transformationspotential der beiden Positivkontrollen lässt sich zum einen darüber
erklären, dass „MLL-ENLfull“ im Gegensatz zu „MLL-ENLshort“ in der Lage ist, sowohl über
MLL als auch über das ENL-Protein PAF1 zu rekrutieren, was eine Akkumulation des aktivierenden EAP-Komplexes am Chromatin zur Folge hätte. Außerdem sind ckitselektionierte Knochenmarkzellen schon weiter differenziert, was möglicherweise eine
bereits fortgeschrittene Repression des Hox-Genlokus durch den Polycombkomplex zur
Folge hätte. Dies würde die Transformation durch das MLL-ENL Fusionsprotein erschweren.
Um eine mögliche Korrelation zwischen dem Transformationspotential der MLL-ENL Konstrukte und der gesteigerten Expression seiner Zielgene Hoxa9 und Meis1 nachweisen zu
können, sollten die Zellen im weiteren Verlauf hinsichtlich ihres Hoxa9- und Meis1-mRNAGehalts untersucht werden.
4.1.5.2. Einfluss der PAF1-Rekrutierung auf die Transkription von MLL-ENL Zielgenen
Die ektope Expression von Hoxa9 und Meis1 ist für die Transformation durch MLL-ENL
Fusionsproteine essentiell (Ayton und Cleary, 2001). Der PAF-Komplex steht ebenfalls im
Zusammenhang mit der Transkriptionsaktivierung von Genen, die wichtig für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz in hämatopoetischen Vorläuferzellen sind (Ding et al.,
2009). Zudem konnte in transienten Reportergenstudien gezeigt werden, dass die Expression eines Hoxa9-Luziferase Reportergenkonstrukts durch die gleichzeitige Expression des
Fusionsproteins MLL-AF9 und PAFc deutlich gesteigert werden konnte (Muntean et al.,
2010).
Deshalb solle mittels einer Genexpressionsanalyse untersucht werden, ob die PAF1/MLLENL Interaktion Auswirkungen auf die Expression der beiden MLL-ENL Zielgene Hoxa9 und
49
Ergebnisse
Meis1 hat. Dafür wurde aus transformierten Zellen der Zweitrundenkolonien in Flüssigkultur jeweils RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und die jeweilige Transkriptmenge der
beiden Zielgene mit genspezifischen Primern in einer quantitativen Realtime PCR bestimmt. Eine Normalisierung erfolgte auf das konstitutiv exprimierte Referenzgen β-Aktin.
Abbildung 30: Expressionslevel der beiden MLL-ENL Zielgene Hoxa9 und Meis1. Gezeigt ist das relative
Expressionslevel der beiden MLL-ENL Zielgene. Als Positivkontrolle fungieren Zellen transformiert durch das
MLL-Wildtypprotein mit dem kompletten ENL (MLL-ENLfull). Alle anderen Expressionsstärken sind relativ
dazu angegeben. Alle Reaktionen wurden als technische Replikate durchgeführt, woraus sich auch die Standardabweichung errechnen ließ.
Aus diesem Experiment geht hervor, dass die Rekrutierung des PAF-Komplexes über das
Fusionsprotein einen positiven Einfluss auf die Expression beider MLL-ENL Zielgene hatte
(vgl. Abb. 30). Die gesteigerte Hoxa9- und Meis1-Expression korreliert gut mit dem erhöhten Transformationspotential dieser Konstrukte (vgl. 4.1.5.1). Durch die Reduktion der
Transkriptmengen in PAF1-bindungsdefizienten Zellen könnte das Defizit in Wachstum
und Transformation dieser Zellen erklärt werden (vgl. 4.1.5.1). Die Unterschiede der
Meis1-Expression fielen innerhalb der Konstrukte, im Vergleich zu Hoxa9, weniger stark
aus. Trotzdem ließ sich auch hier die Tendenz erkennen, dass ein Zusammenhang zwischen PAF1-Rekrutierung und Zunahme der Hoxa9- und Meis1-Transkriptmenge besteht.
In Zellen mit dem Wildtyp-MLL-Fusionsprotein und kurzem ENL-Fragment (MLL-ENLshort)
zeigte sich ebenfalls eine stark reduzierte Hoxa9- und Meis1-Expression, was das schwache Transformationspotential im vorherigen Experiment erklären würde (vgl. 4.1.5.1).
50
Ergebnisse
Zusammenfassend konnte im Zellsystem der Hämatopoese gezeigt werden, dass die
PAF1-Interaktion mit dem MLL-ENL Fusionsprotein essentiell für die Transformation
muriner hämatopoetischer Zellen ist. Dabei trägt die Interaktion zwischen dem Fusionsprotein und dem PAF-Komplex zur konstitutiven Expression der MLL-ENL Zielgene Hoxa9
und Meis1 bei.
4.1.6. Funktionale Konsequenzen der PAF-Komplex Rekrutierung
Die aus der Literatur bekannten stimulierenden Eigenschaften des PAF-Komplexes auf die
transkriptionelle Elongation lassen sich durch die im Zuge dieser Arbeit durchgeführten in
vitro Reportergenstudien ebenfalls bestätigen. Dabei war die Interaktion zwischen dem
PAF-Komplex und ENL für die Neutralisierung der Polycomb-vermittelten Repression des
Reportergens notwendig. Die Interaktion zwischen dem MLL-ENL Fusionsprotein und
PAF1 trägt zudem zur konstitutiven Expression der beiden Zielgene Hoxa9 und Meis1 bei.
Sowohl der PRC1 als auch der PAF-Komplex regulieren die Genexpression über Chromatinmodifikationen. Anhand der bisher erzielten Ergebnisse und bekannter Daten müsste
es sich dabei um antagonistische Wirkmechanismen beider Komplexe handeln. Im weiteren Verlauf sollte dieser Mechanismus, im Besonderen die Bedeutung der PAFRekrutierung im Hinblick auf Chromatinmodifikationen und Änderungen der Chromatinstruktur eingehender untersucht werden.
4.1.6.1. Transkriptionsaktivierung durch H2B-Ubiquitinylierung
In den vorher transient durchgeführten Studien konnte bereits gezeigt werden, dass der
PAF-Komplex an der H2B-Ubiquitinylierung des Reportergens beteiligt ist (4.1.4). Zudem
steht ubiquitinyliertes Histon 2B im Zusammenhang mit einem aktiven Chromatinstatus
und damit aktiver Genexpression. Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich hierbei um
einen durch den PAF-Komplex induzierten Mechanismus handelt um die konstitutive Expression der MLL-ENL Zielgene aufrechtzuerhalten.
51
Ergebnisse
Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die Interaktion zwischen dem PAF-Komplex
und dem MLL-ENL Fusionsprotein in transformierten hämatopoetischen Zellen zu einer
erhöhten Ubiquitinylierung von H2B am Lokus zweier ausgewählter MLL-ENL Zielgene
beiträgt.
Deshalb wurde eine Chromatinimmunopräzipitation (ChIP) mit den verschiedenen transformierten Zelllinien aus Zweitrundenkolonien durchgeführt. Präzipitiert wurde mit einem
H2B-Ubiquitin-Antikörper. Anschließend wurde die erhaltene DNA Menge mittels quantitativer Realtime PCR unter Verwendung genspezifischer Primer analysiert.
Abbildung 31: H2B-Ubiquitinylierung an den Hoxa9- und Meis1-Genloci. Gezeigt ist das Ergebnis einer
ChIP. Präzipitiert wurde mit einem H2B-Ubiquitin-Antikörper. Anschließend erfolgte eine quantitative Realtime PCR unter Verwendung genspezifischer Primer für den murinen Hoxa9 und Meis1 Lokus. Gezeigt ist
der relative H2B-Ubiquitinylierungsstatus am murinen Hoxa9- und Meis1-Genlokus, der sich aus den präzipitierten DNA-Mengen ableiten lässt. Der DNA-Gehalt der MLL-ENLfull –transduzierten Zellen wurde als 1
definiert, der aller anderen Proben ist relativ dazu ausgedrückt. Normalisiert wurde auf die jeweilige Inputfraktion. Die Standardabweichungen ließen sich aus den technischen Triplikaten berechnen.
Wie aus Abbildung 31 hervorgeht, ging der Verlust der PAF1-Bindung über MLL mit stark
reduzierten H2B-Ubiquitinleveln am Hoxa9- und Meis1-Lokus einher. Diese Ergebnisse
stimmen mit der niedrigen Expression der beiden Zielgene in diesen Zellen und dem damit einhergehenden schwachen Transformationspotential der Konstrukte überein (4.1.5.1
und 4.1.5.2). Durch die Interaktion mit dem PAF-Komplex über die ENL YEATS-Domäne
(MLL-ENLfull Konstrukte), konnte dieser Effekt wieder komplementiert werden. In diesen
52
Ergebnisse
Zellen konnte eine deutlich höhere H2B-Ubiquitinylierung an den untersuchten Genloci
verzeichnet werden. In der Kontrolle (MLL-ENLfull) war diese aktivierende Chromatinmodifikation um nahezu das Doppelte angereichert im Vergleich zu MLL-Mutanten, die mit
dem kompletten ENL fusioniert waren. Dies könnte durch eine höhere Affinität zu PAF1
begründet sein, da MLL-ENLfull PAF1 sowohl über seine CxxC/RD2-Domäne als auch über
die YEATS-Domäne im ENL-Protein binden könnte.
Zusammenfassend geht aus diesen Versuchen hervor, dass der PAF-Komplex über die
aktivierende H2B-Ubiquitinylierung zur ektopen Expression von MLL-ENL Zielgenen beiträgt und somit eine wichtige Rolle bei der Transformation hämatopoetischer Zellen
durch MLL-ENL Fusionsproteine spielt.
4.1.6.2. Chromatindekompaktierung durch den PAF-Komplex
Der PAF-Komplex induziert nachweislich die Monoubiquitinylierung an Histon 2B (H2BK120ub1) an Promotor- und in kodierenden Regionen. Diese Modifikation ist mit aktiver
Transkription assoziiert (Chaudhary et al., 2007; Xiao et al., 2005; Kim et al., 2009; Pavri et
al., 2006; Zhu et al., 2005). Der Zusammenhang zwischen H2B-Ubiquitinylierung und aktiver Genexpression konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Weiterhin stellte sich
jedoch die Frage, wie diese Chromatinmodifikation zur Stimulation der transkriptionellen
Elongation beiträgt. In diversen Studien konnte gezeigt werden, dass durch H2BUbiquitinylierung weitere Faktoren, wie zum Beispiel Acetylasen, rekrutiert werden, die
zur Dissoziation des H2A/H2B Dimers führen und somit für eine Auflockerung der Chromatinstruktur und die Zugänglichkeit des zu transkribierenden Gens sorgen (Chaudhary et
al., 2007; Fierz et al., 2011).
Aufgrund dieses Zusammenhangs sollte in weiteren Experimenten der Kompaktierungsstatus am Genlokus des MLL-ENL Zielgens Hoxa9 untersucht werden.
53
Ergebnisse
Abbildung 32: Schematische Darstellung des Experiments zur Analyse des Kompaktierungsstatus des
Chromatins. DNaseI ist hier durch Scheren dargestellt. Bei dekompaktiertem, offenem Chromatin ist das zu
untersuchende Gen (Gen X) frei zugänglich und nicht auf Histone gewickelt, währenddessen Gen X im Falle
von kompaktiertem Chromatin nicht frei zugänglich ist. Nach dem Verdau mit DNaseI wurde jeweils die
gleiche Menge an Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen und die DNA aufgereinigt. Anschließend sollte die aufgereinigte DNA-Menge mittels Realtime PCR quantifiziert werden. Dabei wurden genspezifische Primer verwendet. Aufgrund dessen kommt es nur im Falle von ungeschnittener DNA zu einem
Produkt. Verwendete Abkürzungen: qRT-PCR=quantitative Realtime PCR
Um den Einfluss der PAF-Komplex-Rekrutierung auf die Chromatinstruktur am MLL-ENL
Zielgenlokus Hoxa9 untersuchen zu können, sollten die transformierten Zellen mit dem
DNA-schneidenden Enzym DNaseI behandelt werden. DNaseI (Desoxyribonuklease I) ist
eine Endonuklease, die DNA in 5‘-Phosphodinukleotide und 5‘-Phosphooligonukleotide
spaltet (UniProtKB – P24855 DNAS1_Human). Dieser Prozess läuft relativ sequenzunspezifisch ab, obwohl es über das Genom verteilt durchaus höher frequentierte Abschnitte
gibt, sogenannte „DNaseI-Hypersensitive-Sites“ (DHS), die sich vorzugsweise in der Promotorregion, der Transkriptionsstartstelle (TSS) und in Transkriptions-End-Sites (TES) aktiv transkribierter Gene befinden (Wang et al., 2012; Boyle et al., 2008). Dabei sind DNAAbschnitte, die um Nukleosomen gewickelt sind, also kompaktiertes oder kondensiertes
54
Ergebnisse
Chromatin bzw. durch andere DNA-bindenden Proteine besetzte DNA, durch sterische
Hinderung vor dem Abbau geschützt (Bell et al., 2011).
Um den Kompaktierungsstatus am Hoxa9-Lokus zu überprüfen wurde eine bestimmte
Anzahl an Zellen in Flüssigkultur geerntet, permeabilisiert und mit DNaseI verdaut. Anschließend wurde die chromosomale DNA zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus einer
bestimmten Anzahl an Zellen extrahiert und die DNA-Menge mittels quantitativer Realtime PCR unter Verwendung genspezifischer Primer bestimmt. Wie in Abbildung 32 schematisch dargestellt ist, sollte in diesem Experiment dekompaktiertes offenes, im Gegensatz zu kompaktiertem Chromatin, leichter zugänglich für DNaseI sein und somit im Zeitverlauf stärker abgebaut werden. Dies hätte eine starke Reduktion der DNA-Menge im
Vergleich zur kompaktierten DNA zur Folge. Die aufgelockerte Chromatinstruktur würde
den Abbau der DNA begünstigen, was eine Amplifikation mit genspezifischen Primern in
der PCR-Reaktion verhindern würde.
Entsprechend der aufgestellten Hypothese würde es durch die PAF-Rekrutierung zu einer
Auflockerung der lokalen Chromatinstruktur am zu untersuchenden Genlokus kommen,
was einen Abbau der DNA durch DNaseI unterstützen würde (vgl. Abb. 32 und 33).
Abbildung 33: Hypothese zum Einfluss der PAFRekrutierung auf die Chromatinstruktur. Der PAFKomplex induziert durch Rekrutierung von E2/E3
Ubiquitinligasen H2B-K120ub1, was mit einer Dekompaktierung der Chromatinstruktur einhergeht.
Verwendete
Abkürzungen:
H2B=Histon
2B;
ub=Ubiqutin; PAFc=PAF-Komplex
Im Folgenden Experiment sollte untersucht werden, ob die gesteigerte Expression und
erhöhte H2B-Ubiquitinylierung am Genlokus des MLL-ENL Zielgens Hoxa9 mit einem de55
Ergebnisse
kompaktierten Chromatinstatus korreliert. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 32 schematisch dargestellt.
Abbildung 34: Kompaktierungsstatus
am Hoxa9-Genlokus in MLL-ENLtransduzierten Zellen. Gezeigt ist der
Abbau der chromosomalen DNA durch
DNaseI am Hoxa9-Lokus in MLL-ENLtransformierten Zellen. Die extrahierte
chromosomale DNA wurde anschließend mittels Realtime PCR mit genspezifischen Primern quantifiziert. Die
DNA-Menge nach 5 Minuten Verdau
wurde als 1 definiert und alle anderen
Mengen relativ dazu ausgedrückt. Die
Standardabweichung ließ sich aus den
technischen Triplikaten berechnen.
56
Ergebnisse
Die hier gezeigten Daten beziehen sich auf ein repräsentatives Beispiel aus drei unabhängigen Experimenten, wobei Mittelwerte und Standardabweichungen aus den technischen
Triplikaten in der quantitativen Realtime PCR berechnet wurden. Die DNA-Menge nach
fünf-minütiger Inkubation mit DNaseI wurde dabei als 1 definiert und alle anderen Werte
relativ dazu ausgedrückt. Aus den im Vorfeld durchgeführten Experimenten zur Etablierung der Methode ging hervor, dass dieser Zeitpunkt am besten dafür geeignet war, da
die Zellen permeabilisiert und die DNA zugänglich für das Enzym waren (nicht gezeigte
Daten). Laut der aufgestellten Hypothese führt die enzymatische Aktivität des PAFKomplexes zur Auflockerung der Chromatinstruktur. Dadurch wäre der untersuchte Genlokus zugänglich für das Enzym DNaseI, was einen erhöhten Abbau der DNA zur Folge
hätte.
Diese Annahme ließ sich durch oben gezeigtes Experiment bestätigen, da die PAFRekrutierung in diesen Zellen für eine Auflockerung der Chromatinstruktur am Hoxa9Lokus sorgte. Dies zeigte sich durch einen verstärkten Abbau der DNA und eine kontinuierliche Abnahme der DNA-Menge im Zeitverlauf. Verglichen mit Zellen, in denen die PAFRekrutierung unterbunden war, konnte ein stärkerer Abbau der DNA beobachte werden.
Daraus lässt sich schließen, dass der Hoxa9-Lokus ohne die Rekrutierung des PAFKomplexes über MLL-ENL stärker kompaktiert ist, was mit der geringeren Expression dieses Gens und der damit einhergehenden niedrigeren Fähigkeit zur Selbsterneuerung dieser Zellen korreliert (vgl. 4.1.5.1 und 4.1.5.2). Zudem stimmen diese Beobachtungen mit
der These überein, dass die aktivierende H2B-Ubiquitinylierung in einer Auflockerung der
Chromatinstruktur resultiert. Die beiden Wildtyp MLL-ENL Konstrukte zeigten untereinander einen ähnlichen Kurvenverlauf, wobei es bei beiden Konstrukten zu einem kontinuierlichen DNA-Abbau kam (vgl. Abb. 34).
Im ersten Teil dieser Arbeit konnte in transienten Experimenten bewiesen werden, dass
die Interaktion zwischen der ENL YEATS-Domäne und PAF1 notwendig für die Inaktivierung des reprimierenden Polycombproteins CBX8 war. Auch in hämatopoetischen Zellen
spielt die PAF1-Interaktion mit MLL-ENL hinsichtlich des Transformationspotentials und
der damit verbundenen konstitutiven Expression der MLL-ENL Zielgene Hoxa9 und Meis1
eine entscheidende Rolle. Auf molekularer Ebene kommt es durch die PAF-Rekrutierung
zur Ubiquitinylierung an Histon 2B und zur Dekompaktierung bzw. Auflockerung der loka57
Ergebnisse
len Chromatinstruktur an besagten Genloci. Dies wirkt sich positiv auf die Transkription
aus und der PRC1-vermittelten Repression entgegen. Der PAF-Komplex und der PRC1 wirken womöglich durch die unterschiedliche Modifikation des Chromatins und der damit
verbundenen Änderung der Chromatinstruktur antagonistisch auf die Genexpression.
4.2.
Untersuchungen zum Einfluss des BCL6-Corepressors (BCoR) auf die
maligne Hämatopoese
Im EAP-Komplex konnten neben aktivierenden Proteinen auch Repressoren mit aufgereinigt werden. Dabei handelte es sich um Komponenten des „kanonischen“ PRC1Komplexes, wie CBX8 und RING1, sowie den BCL6-Corepressor (BCoR), der mit Proteinen
des „nicht-kanonischen“ PRC1-Komplexes assoziiert ist (Garcia-Cuellar et al., 2001; Mueller et al., 2007). Aus bereits veröffentlichten Daten geht hervor, dass durch die direkte
Interaktion zwischen ENL und CBX8 die Polycomb-vermittelte Repression der MLL-ENL
Zielgene inhibiert werden kann (Maethner et al., 2013). Sobald das Fusionsprotein an
seine Zielgene rekrutiert wurde, kommt es zur konstitutiven Expression dieser Gene, die
nicht mehr durch den Polycombkomplex inhibiert werden kann (Maethner et al., 2013).
Dadurch verhält sich der EAP-Komplex bzw. ENL dominant gegenüber dem PRC1Komplex.
Wie bereits erwähnt, konnte ein weiteres reprimierendes Protein mit ENL co-aufgereinigt
werden. Hierbei handelt es sich um den BCL6-Corepressor (BCoR), der mit Proteinen des
„nicht-kanonischen“ PRC1-Komplexes interagiert. Dieser Komplex trägt ähnlich wie der
„kanonische“ PRC1-Komplex durch Chromatinmodifikationen zur Repression der Genexpression bei (Gearhart et al., 2006). Aus Vorarbeiten und Studien anderer Gruppen ist
bereits bekannt, dass eine Isoform von BCoR über eine AF9-/ENL-Interaktionsdomäne
verfügt, bei der es sich um einen 34 Aminosäuren umfassenden Bereich im C-Terminus
des Proteins handelt (Srinivasan et al., 2003; Hetzner, Masterarbeit 2012). Die Binderegion für BCoR im ENL-Protein befindet sich zudem in der CTD und überlappt mit der Bindedomäne für CBX8 (Hetzner, Masterarbeit, 2012). Dies lässt vermuten, dass diese Interak58
Ergebnisse
tion einem ähnlichen Mechanismus unterliegt, wie die Bindung zwischen ENL und CBX8.
Im weiteren Verlauf sollte deshalb die BCoR-ENL Interaktion hinsichtlich seiner Funktion
näher untersucht werden.
4.2.1. Funktionelle Konsequenzen der BCoR-ENL Interaktion
In transienten Studien konnte bereits gezeigt werden, dass sich BCoR, analog zu CBX8,
reprimierend auf die Expression eines Reportergens auswirkt, dabei wird im Speziellen
der Schritt der transkriptionellen Elongation inhibiert (Huynh et al., 2000; Hetzner, Masterarbeit, 2012; Srinivasan et al., 2003). Im Folgenden sollte zunächst eruiert werden, ob
die BCoR-ENL Interaktion dieselbe Funktion erfüllt wie die Interaktion zwischen CBX8 und
ENL. Um diesen Mechanismus aufzuklären, sollten BCoR und ENL im transienten Reportergenassay hinsichtlich ihrer Wirkung auf die transkriptionelle Elongation untersucht
werden.
Da nur eine BCoR-Isoform mit ENL interagieren kann, wurden für alle weiteren Untersuchungen zwei BCoR-Konstrukte verwendet: Zum einen die Spleißvariante, die die 34 Aminosäuren umfassende ENL-Interaktionsdomäne enthält (BCoR) und zum anderen die Isoform ohne diese Binderegion (BCoR∆). Für die Reportergenstudien wurden beide Konstrukte als Rev-Fusionen verwendet (Rev-BCoR; Rev-BCoR∆), die mit ENL cotransfiziert
wurden.
Abbildung 35: Expressionsnachweis von Rev-BCoR und
Rev-BCoR∆. Western Blot von 300mM Extrakten der Inputraktion einer CoIP. Zur Detektion wurde ein gegen Rev
gerichteter Antikörper verwendet. (Das gezeigte Experiment wurde bereits in der Masterarbeit Hetzner 2012 veröffentlicht. Zudem handelt es sich um die Inputfraktion
einer CoIP)
Zunächst wurde die korrekte Expression beider Konstrukte mittels Western Blot Verfahren nachgewiesen, wobei zur Detektion ein gegen Rev gerichteter Antikörper verwendet
wurde (vgl. Abb. 35). In einer CoIP wurde zudem die Affinität beider Konstrukte zu ENL
getestet. Entsprechend den Erwartungen konnte Rev-BCoR∆ im Vergleich zu Rev-BCoR
nicht mehr mit ENL interagieren (nicht gezeigte Daten).
59
Ergebnisse
Anschließend wurde die Wirkung beider Rev-BCoR Konstrukte auf die Elongation eines
Reportergens in Anwesenheit von ENL analysiert. Da sowohl ENL als auch BCoR einen Effekt auf die transkriptionelle Elongation haben, könnten diese beiden Proteine als direkte
Antagonisten wirken. Für die nachfolgende Reportergenstudie wurden HEK293 Zellen
transient mit den beiden Rev-BCoR Konstrukten und ENL cotransfiziert.
Abbildung 36: Reportergenaktivität der beiden BCoR-Isoformen cotransfiziert mit ENL. Alle Ansätze wurden in biologischen Triplikaten transfiziert, aus denen sich die Standardabweichungen berechnen ließen.
Zudem wurde dieses Experiment dreimal durchgeführt. Gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel. (Die gezeigten Experimente wurden bereits in der Masterarbeit Hetzner, 2012 veröffentlicht)
Im oben gezeigten Experiment wird ersichtlich, dass die Interaktion zwischen ENL und
BCoR, anders als zwischen ENL und CBX8, nicht zur Neutralisierung der BCoR-vermittelten
Elongationsrepression führte. Weiterhin konnten beide BCoR-Isoformen in diesem Reportergenassay die transkriptionelle Elongation reprimieren, unabhängig von der Anwesenheit ENLs und der physikalischen BCoR-ENL Interaktion. Dabei konnten in allen BCoRAnsätzen ähnliche reprimierende Effekte verzeichnet werden (vgl. Abb. 36).
Da der reprimierende Effekt von BCoR auf die Elongation in diesem Testsystem nicht
durch die Interaktion mit ENL neutralisiert werden konnte, liegt die Vermutung nahe, dass
BCoR Mitglied in einem Repressorkomplex ist, der hierarchisch auf einer höheren Ebene
als ENL und CBX8 liegt.
60
Ergebnisse
4.2.2. Einfluss von BCoR auf die maligne Hämatopoese
Während der Differenzierung zu reifen Blutzellen müssen Gene zur Aufrechterhaltung des
Stammzellphänotyps und der Pluripotenz irreversibel herunterreguliert und abgeschaltet,
sprich dauerhaft reprimiert werden. Wie bereits bekannt ist, verhält sich ENL gegenüber
CBX8 dominant, weshalb der PRC1-Komplex in Anwesenheit von ENL nicht in der Lage ist,
die durch ENL aktivierten Gene wieder abzuschalten (Maethner et al., 2013). Deshalb
stellte sich die Frage durch welchen Mechanismus die durch ENL oder MLL-ENL aktivierten Gene irreversibel reprimiert werden könnten.
Die im Vorfeld durchgeführten Experimente deuten darauf hin, dass BCoR eine Rolle bei
der dauerhaften Inaktivierung dieser Gene spielen könnte. BCoR könnte dabei gegenüber
ENL als übergeordneter Repressor fungieren und durch die direkte Interaktion mit ENL an
dessen Zielgene rekrutiert werden und diese dauerhaft abschalten. Demnach könnte
BCoR während der normalen Hämatopoese als Antagonist und Regulator von ENLZielgenen fungieren. In der malignen Hämatopoese würde BCoR die Rolle eines Tumorsuppressors einnehmen, der MLL-ENL Zielgene reprimieren und so der leukämischen
Transformation entgegenwirken könnte. Diese Hypothese wird unterstützt von bereits
publizierten Daten einer Genomsequenzierungsstudie, die zeigten dass es in einigen Fällen der AML wiederholt zu somatischen Mutationen des BCoR-Gens kommt, welches in
Folge dessen inaktiviert wird (Grossmann et al., 2011; Tiacci et al., 2012). Da BCoR jedoch
trotzdem in MLL-ENL transformierten Zellen der MEER Maus [konditionelle Mll-ENL-ERtm
Knock-in Modellmaus (Takacova et al., 2012)] exprimiert ist (AG Slany, ungezeigte Daten)
stellte sich die Frage, wie sich diese Zellen dem reprimierenden Effekt von BCoR entziehen. Eine Möglichkeit wäre, dass es in diesen Zellen nicht zur Rekrutierung von BCoR über
MLL-ENL kommt, da die ENL-bindende Spleißvariante nicht in diesen Zellen exprimiert
wird.
Im weiteren Verlauf sollte die Funktion einer BCoR-Überexpression auf MLL-ENL transformierte hämatopoetische Zellen eingehender analysiert werden. Im Besonderen sollten
mögliche Unterschiede zwischen den beiden BCoR-Isoformen näher untersucht werden.
Aus Vorversuchen war bereits bekannt, dass die Überexpression von BCoR in Zellen der
MEER Maus zur Ausdifferenzierung und somit zum Absterben der Zellen führte. Dabei
kam es zu einer starken Gegenselektion zu Gunsten der Zellen, die kein BCoR-Protein ex61
Ergebnisse
primierten (Truch, Masterarbeit 2014). Um dieses Problem zu umgehen, sollte ein stark
regulierbares, induzierbares System entwickelt werden. Mit diesem sollte die BCoRExpression gezielt angeschaltet werden und gleichzeitig in allen transduzierten Zellen induzierbar sein um somit einen Großteil an BCoR-exprimierenden Zellen zu erhalten.
4.2.2.1. Etablierung eines induzierbaren Expressionsystems in hämatopoetischen Zellen
In
der
vorliegenden
Arbeit
wurde
deshalb
das
induzierbare
Cre/loxP-
Rekombinationssystem verwendet. Dabei wird die Aktivität der Cre-Rekombinase (CreERT2 oder Cre-ER), die an die modifizierte Ligandenbindedomäne des murinen Estrogenrezeptors (ER) fusioniert wurde, postranskriptionell durch Zugabe des synthetischen Induktors 4-OHT reguliert (Feil et al., 1997; Littlewood et al., 1995; Matsuda und Cepko, 2007).
Die Cre-Rekombinase lässt sich hierbei ausschließlich über den Induktor 4-OHT induzieren, nicht aber durch natürlich vorkommende Estrogene. Ohne Induktor verbleibt die
Rekombinase in inaktivem Zustand, gebunden an Heatshock Proteine im Cytoplasma.
Durch die Aktivierung der Rekombinase wird die Exzision der zwischen den loxP-Sites liegenden DNA-Sequenz katalysiert. Dieses System erlaubt eine zeitlich streng regulierte
Induktion von Genmodifikationen in Säugerzellen (Feil et al., 2009).
Abbildung 37: Schematische Darstellung der generierten LNGFR-fBCoR-Konstrukte für die Herstellung
retroviraler Partikel. Die entsprechende cDNA wurde in den retroviralen Vektor pMSCV kloniert.
Ψ=Verpackungssignal; puro=Puromycinresistenz. Die für den LNGFR-Oberflächenrezeptor kodierende cDNA
wird von zwei loxP-sites flankiert. Dadurch kommt es durch Induktion der Cre-Rekombinase zur Exzision
dieses DNA Fragments, was die Proteinbiosynthese von fBCoR ermöglicht.
Für die induzierbare Expression der beiden BCoR-Isoformen in MLL-ENL transformierten
hämatopoetischen Zellen wurden zunächst zwei retrovirale Vektoren mit der relevanten
cDNA hergestellt. Die in Abb. 37 dargestellten Konstrukte enthalten die cDNA für den
62
Ergebnisse
„Low-affinity Nerve Growth Factor Receptor“ (LNGFR), der von zwei loxP-Sites flankiert
wird. Bei diesem Protein handelt es sich um einen Oberflächenrezeptor, der zwar exprimiert wird, aber keine funktionelle Domäne und somit keine Signalwirkung mehr besitzt.
Er dient jedoch als Kontrolle für eine erfolgreiche Transduktion sowie für die Induktion, da
er mittels Antikörper auf der Zelloberfläche detektiert werden kann. Nach erfolgreicher
Transduktion in eine Zelllinie wird die komplette Sequenz der Plasmid-cDNA transkribiert.
Dabei kommt es allerdings nur zur Expression von LNGFR, da die Translation nach dem
LNGFR-Stop-Codon abbricht. Durch Cotransduktion retroviraler Partikel, codierend für die
Cre-Rekombinase und anschließender Induktion mit 4-OHT kommt es in den Zellen zur
Exzision der für LNGFR codierenden Sequenz zwischen den loxP-Sites. Dies ermöglicht die
Translation und Expression von BCoR/BCoR∆ [vgl. Schema, Abb. 38(A)]. Mit Hilfe dieses
induzierbaren Expressionssystems kann die Induktion von BCoR/BCoR∆ durch Expression
des LNGFR-Oberflächenrezeptors kontrolliert werden.
A
B
Abbildung 38: Etablierung eines induzierbaren Expressionssystems zur Überexpression von BCoR/BCoR∆ in hämatopoetischen Zellen. (A) Schematische Darstellung des induzierbaren Expressionssystems. Nach retroviraler Transduktion oder
transienter Transfektion der LNGFR-fBCoR-Konstrukte und des für die CreERRekombinase codierenden Vektors wird der LNGFR-Oberflächenrezeptor exprimiert. Durch die Induktion mit 4-OHT erfolgt die Aktivierung der Rekombinase und
die Exzision der LNGFR-DNA, somit kommt es zur Expression von BCoR. (B) Induktion und Expression von fBCoR und CreER in transient transfizierten ΦNX-E Zellen.
Zunächst mussten die Induzierbarkeit der Konstrukte und die erfolgreiche Rekombination
auf DNA-Ebene nachgewiesen werden. Für den Induktionsnachweis wurden ΦNX-E Zellen
mit den Vektoren codierend für LNGFR-flag-BCoR sowie CreERT2 transient transfiziert und
63
Ergebnisse
mit 4-OHT induziert. Als Kontrollen dienten transfizierte Zellen ohne Induktor oder ohne
Cre-Rekombinase. Die Detektion erfolgte anschließend im Western Blot mittels anti-flag
und anti-ER gerichteter Antikörper.
Wie in Abbildung 38(B) deutlich wird, ist dieses Expressionssystem durch 4-OHT sowohl
regulier- als auch induzierbar, da flag-BCoR nur in Anwesenheit der aktiven CreRekombinase deutlich erkennbar war. Die sehr schwache BCoR-Expression ohne Induktor
lässt sich darauf zurückführen, dass das Protein wahrscheinlich trotzdem in geringen
Mengen synthetisiert wird, oder, dass die Rekombinase auch ohne Induktor eine gewisse
Hintergrundaktivität zeigt. Die Cre-Rekombinase war sowohl im induzierten als auch im
uninduzierten Zustand exprimiert. Dies lässt sich dadurch erklären, dass das Protein mittels eines gegen den Estrogenrezeptor gerichteten Antikörpers nachgewiesen wurde der
scheinbar auch an das inaktive Protein im Cytoplasma bindet.
Nachdem die Induzierbarkeit des Systems im transienten Assay nachgewiesen werden
konnte, musste dies auch in Leukämiezellen bestätigt werden. Hierfür wurden zunächst
ckit+ hämatopoetische Vorläuferzellen einer C57BL6 Maus aus dem Knochenmark isoliert
und mit retroviralen Partikeln eines MLL-ENL Konstruktes transduziert, selektioniert und
transformiert. Dafür wurden sie in semisolidem Methylzellulosemedium kultiviert und
anschließend in einer Flüssigkultur expandiert (Daten nicht gezeigt). Danach folgte analog
dazu die Cotransduktion mit retroviralen Partikeln kodierend für die CreERT2Rekombinase (pMSCVneo-CreERT2) und anschließende Neomycin-Selektion sowie Transduktion mit einem der beiden puromycinresistenten BCoR-Konstrukten (pMSCVpuroLNGFR-flag-BCoR/pMSCVpuro-LNGFR-flag-BCoR∆). Durch Zugabe des Induktors 4-OHT
konnte in den transduzierten Zellen gezielt die durch ER modifizierte Cre-Rekombinase
aktiviert werden, was die Exzision von LNGFR aus dem Genom zur Folge hatte. Dadurch
wurde die Translation eines der beiden BCoR Konstrukte ermöglicht (vgl. Schema, Abb.
38(A) und 39). Mit Hilfe dieses induzierbaren Expressionssystems kann die Induktion von
BCoR/BCoR∆ durch die Expression des LNGFR-Oberflächenrezeptors kontrolliert werden.
64
Ergebnisse
Abbildung 39: Schematische Darstellung des induzierbaren BCoR-Expressionssystems und der Versuchsaufbau in hämatopoetischen Zellen. Schematische Darstellung des induzierbaren Expressionssystems.
Murine hämatopoetische Vorläuferzellen einer C57BL6 Maus wurden mit retroviralen Partikeln codierend
für das MLL-ENL Fusionsprotein transduziert und transformiert. Anschließend erfolgte die retrovirale Transduktion mit einem der beiden LNGFR-fBCoR-Konstrukten und des für die CreER-Rekombinase codierenden
Vektors. Selektioniert wurde mit dem jeweiligen Antibiotikum. Verwendete Abkürzungen: Cre=CreRekombinase
Um nun nachweisen zu können, dass das Expressionssystem auch in hämatopoetischen
Zellen induzierbar ist, sollte zum einen das Rekombinationsereignis auf DNA-Ebene und
zum anderen die Expression des LNGFR-Oberflächenrezeptors im Durchflusszytometer
untersucht werden. Dafür wurden die zuvor transduzierten Zellen in Flüssigkultur für 72
Stunden mit 4-OHT induziert und anschließend RNA aufgereinigt und in cDNA umgeschrieben. Durch eine PCR mit LNGFR-überspannenden Primern und anschließender Auftrennung über ein Agarosegel lässt sich das Rekombinationsereignis auf DNA-Ebene eindeutig nachweisen.
65
Ergebnisse
A
B
C
Abbildung 40: Etablierung eines induzierbaren Expressionssystems zur Überexpression
von BCoR/BCoR∆ in hämatopoetischen
Zellen. (A) Nachweis der Rekombination
nach 72-stündiger Induktion in transduzierten Zellen. Gezeigt ist eine gelelektrophoretische Auftrennung der isolierten und in
cDNA umgeschriebenen RNA nach einer PCR
auf einem Agarosegel. Für die Amplifikation
wurden genspezifische Primer verwendet,
die ein LNGFR-überspannendes Amplifikat
erzeugen sollten. (B) FACS-Analyse der uninduzierten (-4-OHT) und induzierten (+4OHT) Zellen nah 72h. (C) FACS-Auswertung
zur Bestimmung des prozentualen Anteils an
LNGFR-negativen Zellen, die stattdessen das
BCoR-Protein exprimieren sollten. Gezeigt
ist die Auswertung der FACS-Analyse aus (B)
nach 72-stündiger Induktion mit 4-OHT.
In Abb. 40(A) lässt sich das Rekombinationsereignis nach 72-stündiger Induktion eindeutig
nachweisen. Die LNGFR-Bande bei 1,8kb ist in den induzierten Zellen kaum mehr detektierbar (Spur 2 und Spur 4). Dabei entsteht ein Produkt von 0,9kb, was auf das Fehlen der
LNGFR-Sequenz hinweist. Demnach ist eine 72-stündige Inkubation mit dem Induktor ausreichend um bei einem Großteil der Zellen die Rekombination zu bewirken. Dieselbe PCR
wurde auch mit genomischer DNA als Template durchgeführt, wobei die Resultate mit
den in Abbildung 40(A) gezeigten, übereinstimmen. Dieses Ergebnis korreliert gut mit der
in Abbildung 40(B) gezeigten durchflusszytometrischen Analyse dieser Zellen und der zugehörigen Auswertung in Abbildung 40(C), die den Anteil der LNGFR-negativen Zellen darstellt, die stattdessen das BCoR-Protein exprimieren sollten. Dabei hatten bereits 49% der
66
Ergebnisse
BCoR-transduzierten Zellen den Oberflächenrezeptor verloren, im Falle von BCoR∆ sogar
73%. Das heißt diese Zellen exprimieren kein LNGFR mehr an der Oberfläche. In den
BCoR∆ Zellen war allerdings der Anteil an LNGFR-negativen Zellen in der uninduzierten
Kontrollpopulation ebenfalls relativ hoch (41%). Dies könnte zum einen eine Kontaminierung mit dem Induktor vermuten lassen, oder den Verlust des transduzierten Konstrukts
in diesen Zellen. Bei der durchflusszytometrischen Analyse ist zu beachten, dass der Abbau des Rezeptors an der Oberfläche zeitlich versetzt, also erst nach dem Rekombinationsereignis eintritt. Deswegen wäre es möglich, dass die DNA-Sequenz bereits herausgeschnitten ist, das Protein jedoch noch nicht abgebaut wurde.
4.2.2.2. Funktionelle Untersuchungen zum Einfluss auf die maligne Hämatopoese
BCoR ist ein ubiquitär exprimiertes Protein, welches mit PcG-Proteinen einen PRC1ähnlichen Komplex bildet und über verschiedene Interaktionspartner an deren Zielgene
rekrutiert wird um dort zu einer Repression der Transkription zu führen (Gearhart et al.,
2006). Außerdem spielt BCoR eine wichtige Rolle in der embryonalen Entwicklung und der
Hämatopoese, wie zum Beispiel bei der Repression von Genen des HOX-Clusters während der hämatopoetischen Differenzierung (Wamstad und Bardwell, 2007; Wamstad et
al., 2008).
Die bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass BCoR Teil eines übergeordneten Repressorkomplexes sein könnte, dessen reprimierende Effekte nicht durch ENL neutralisiert werden können. Deshalb könnte BCoR in MLL-ENL transformierten Zellen der Leukämogenese entgegenwirken und als Tumorsuppressor agieren.
Wie bereits oben erwähnt ist nur eine BCoR-Isoform in der Lage mit ENL zu interagieren
(BCoR), was auf einen möglichen Regulationsmechanismus hindeuten könnte. Aufgrund
dessen werden in der vorliegenden Arbeit die beiden Spleißvarianten mit und ohne ENLAffinität gegenüber gestellt.
Im Folgenden sollte der Einfluss einer BCoR-Überexpression in MLL-ENL transformierten
hämatopoetischen Zellen im Hinblick auf verschiedene Parameter wie etwa Proliferation,
Zellviabilität und Transkription von MLL-ENL Zielgenen, sowie der Funktion der BCoR –
67
Ergebnisse
ENL Interaktion näher untersucht werden. In den folgenden Experimenten wurden jeweils
induzierte, also BCoR exprimierende, mit uninduzierten Zellen (keine BCoR-Expression)
verglichen.
4.2.2.2.1. Einfluss von BCoR auf Proliferation und Zellviabilität
Aufgrund der Annahme, dass BCoR einen gegenläufigen Effekt auf das Transformationspotential von MLL-ENL in murinen Knochenmarkzellen hat, sollte zunächst eine Wachstumskurve erstellt werden, um den Einfluss der BCoR-Überexpression auf die Proliferation MLL-ENL transformierter Zellen zu untersuchen.
Abbildung 41: Wachstumskurven der BCoR/BCoR∆ exprimierenden sowie uninduzierten Zellen. Gezeigt
sind Wachstumskurven von induzierten Zellen (+) im Vergleich zu uninduzierten Zellen (-), wobei alle 24h
die Zellzahl bestimmt wurde. Die Mittelwerte und Standardabweichungen setzen sich aus den triplikaten
Ansätzen zusammen. Mit (-) sind uninduzierte Zellen gekennzeichnet, (+) sind induzierte Zellen.
Anhand dieser Wachstumskurven wird deutlich, dass die BCoR/BCoR∆-Expression einen
negativen Einfluss auf die Proliferationsrate der transformierten Zellen hatte (vgl. Abb.
41). Dies zeigte sich dadurch, dass die uninduzierten Zellen zunächst deutlich schneller
wuchsen als die BCoR/BCoR∆-exprimierenden Zellen. Allerdings glichen sich die Wachstumsgeschwindigkeiten nach längerer Kultivierung mit dem Induktor immer mehr an (vgl.
68
Ergebnisse
Abb. 41: 96h–168h). Dies deutet darauf hin, dass die Zellpopulation nach längerer Inkubation zunehmend heterogener wird und auch Zellen vorhanden sind, die keine BCoR/
BCoR∆-Expression mehr aufweisen. BCoR und BCoR∆ exprimierende Zellen zeigten zudem
in den ersten 72 Stunden nach Induktion ebenfalls ein leicht voneinander abweichendes
Wachstum, da die BCoR∆ Zellzahl anfangs schneller zunahm. Dieser Effekt kehrt sich allerdings nach längerer Inkubationszeit wieder um.
Des Weiteren sollte mittels MTT-Test der Einfluss von BCoR auf die Viabilität bzw. die metabolische Aktivität der transformierten Zellen analysiert werden. MTT ist ein Farbstoff,
der von vitalen Zellen zum Farbstoff Formazan reduziert wird. Seine Intensität kann anschließend photometrisch bestimmt werden und dient als direktes Maß für die Vitalität
und Proliferation der Zellen (Mosmann; 1983).
Abbildung
42:
MTT-Test
von
BCoR/BCoR∆ exprimierenden Zellen.
Gezeigt ist die Auswertung eines MTTTests mittels ELISA Reader. Dabei wird
der Farbstoff MTT von vitalen Zellen zu
Formazan metabolisiert. Die Standardabweichungen ließen sich aus den
fünf angesetzten Replikaten pro Ansatz
ermitteln.
Das Ergebnis des MTT-Tests korrelierte sehr gut mit den Proliferationsraten aus den
Wachstumskurven, da auch hier in den induzierten Zelllinien eine Reduktion der Zellviabilität und Proliferation messbar war. Dabei zeigte sich bei den BCoR-Zellen eine Abnahme
um ca. 50%, bei der BCoR∆-exprimierenden Population eine Reduktion der FormazanIntensität um ca. 30% im Vergleich zu den entsprechenden uninduzierten Zellen (vgl. Abb.
42).
Zusammenfassend lässt sich aus den beiden Experimenten schlussfolgern, dass die Expression von BCoR/BCoR∆ zur Hemmung der Proliferation von Leukämiezellen führte,
wobei die beobachteten Effekte in den BCoR∆-Zellen etwas geringer ausgeprägt waren.
69
Ergebnisse
4.2.2.2.2. Untersuchungen zum Einfluss der BCoR-Expression auf den Zellzyklus
Die bisherigen Untersuchungen deuten darauf hin, dass eine BCoR-Überexpression der
Proliferation und Zellviabilität transformierter Zellen entgegen wirkt. Die daraus resultierende Frage ist, ob dies auf ein vermindertes Zellwachstum oder eine höhere Apoptoserate zurückzuführen ist. Deshalb sollte anhand einer Zellzyklusanalyse bestimmt werden,
wie sich die Induktion auf den Zellzyklus auswirkt, insbesondere auf die Verteilung der
Zellen in den einzelnen Phasen. Dafür wurden die BCoR/BCoR∆-Zellen ausgesät und im
Abstand von 24 Stunden jeweils mit 4-OHT induziert, um eine Zeitkinetik mit 0h, 24h, 48h,
72h und 96h nach Induktion erstellen zu können. Anschließend erfolgte die Inkubation
mit Propidiumiodid (PI) und eine durchflusszytometrische Analyse. Propidiumiodid interkaliert in Nukleinsäuren, wodurch es sich zum Anfärben von DNA verwenden lässt
(Krishan; 1975). Da sich mit Voranschreiten des Zellzyklus der Chromosomengehalt der
Zelle ändert (Verdopplung in der S-Phase), kann durch die unterschiedliche PI-Intensität in
der durchflusszytometrischen Analyse bestimmt werden, welcher Anteil an Zellen in welcher Zellzyklusphase ist.
Abbildung 43: Zellzyklusanalyse
der BCoR-Zellen. Gezeigt ist das
Ergebnis einer Zellzyklusanalyse
BCoR-exprimierender Zellen, die
über einen Zeitraum von 96h mit
4-OHT induziert wurden. Anschließend erfolgte die PIFärbung. Dargestellt ist der prozentuale Anteil an Zellen in der
jeweiligen Zellzyklusphase.
Die einzelnen Phasen des Zellzyklus und der prozentuale Anteil der sich darin befindenden Zellen sind in Abbildung 43 und 44 grafisch dargestellt. Hierbei wird deutlich, dass es
durch die Überexpression von BCoR zu einer erhöhten Apoptoserate kam. Da, nach Induktion, der Anteil an BCoR Zellen in der S-Phase, also aktiv proliferierender Zellen stetig
abnahm, wohingegen die absterbenden Zellen (% Sub G1 Phase) zunahmen (>30% nach
72h). Des Weiteren zeigte sich, wahrscheinlich bedingt durch die Zunahme apoptotischer
70
Ergebnisse
Zellen, auch eine Abnahme der Zellen in der G0/G1 Phase (vgl. Abb. 43). Diese Ergebnisse
stimmen mit der niedrigeren Proliferationsrate in diesen Zellen überein (vgl. 4.2.2.2.1).
Abbildung 44: Zellzyklusanalyse
der BCoR∆ Zellen. Gezeigt ist das
Ergebnis einer Zellzyklusanalyse
BCoR∆ exprimierender Zellen, die
über einen Zeitraum von 96h mit
4-OHT induziert wurden. Anschließend erfolgte die PIFärbung. Dargestellt ist der prozentuale Anteil an Zellen in der
jeweiligen Zellzyklusphase.
Diese Effekte konnten auch in den BCoR∆-Zellen beobachtet werden, jedoch in geringerem Ausmaß (vgl. Abb. 44). Auch in diesem Experiment zeigte sich, dass durch die Induktion und die daraus resultierende BCoR/BCoR∆-Expression nach einer gewissen Zeit (ca.
96h) Ausreiser in der Zellpopulation entstanden, da sich die Kurven ab diesem Zeitpunkt
langsam wieder an das Ausgangsniveau anglichen.
4.2.2.2.3. Einfluss von BCoR auf die Expression von MLL-ENL Zielgenen
Aus den bisher erhaltenen Ergebnissen geht hervor, dass sich die Überexpression von
BCoR/BCoR∆ negativ auf Proliferation und Viabilität von MLL-ENL transformierten murinen Knochenmarkzellen auswirkt, wobei die Apoptoserate in diesen Zellen zunimmt. Da
BCoR als Transkriptionsrepressor fungiert, liegt die Vermutung nahe, dass es auch in diesem Zellsystem zu einer Repression bestimmter Gene kommt, die für die Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps entscheidend sind (Huynh et al., 2000). Zwei essentielle
regulatorische Gene während der hämatopoetischen Entwicklung sind HOXA9 und dessen
Coregulator MEIS1, die beide in hämatopoetischen Vorläuferzellen stark exprimiert werden und zur Aufrechterhaltung des Stammzellphänotyps beitragen (Slany, 2005). Da
HOXA9 und MEIS1 in fast allen Fällen der MLL-induzierten Leukämien stark hochreguliert
71
Ergebnisse
werden, wurden diese beiden Zielgene für weitere Untersuchungen bezüglich des Einflusses von BCoR/BCoR∆ ausgewählt (Zeisig et al., 2004; Armstrong et al., 2002). Um einen
weiteren Anhaltspunkt hinsichtlich der herabgesetzten Proliferationsrate zu erhalten
wurde zusätzlich das Expressionslevel des Protoonkogens c-Myc getestet. Hierbei handelt
es sich um einen Transkriptionsfaktor, der unter anderem eine wichtige Rolle bei der Regulation essentieller Gene im Zellzyklus und für die Proliferation spielt (NCBI: Gene ID
17869; Myc Mus Musculus). MLL-ENL kooperiert zudem mit c-Myc und benötigt dieses
Protein für die Blockierung der Differenzierung (Schreiner et al., 2001).
Im Folgenden sollte über eine Genexpressionsanalyse untersucht werden, ob
BCoR/BCoR∆ einen Effekt auf die Expression der beiden MLL-ENL Zielgene (Hoxa9 und
Meis1) und auf das Protoonkogen c-Myc hat. Dafür wurden wiederum BCoR/BCoR∆exprimierende Zellen mit 4-OHT induziert und jeweils nach 24 Stunden RNA isoliert. Anschließend erfolgte die Analyse mittels Realtime PCR unter Verwendung genspezifischer
Primer. Beide Zelllinien wurden dabei jeweils mit den uninduzierten Zellen (0h) verglichen. Die 0h-Werte wurden hierfür als 1 definiert und alle anderen Werte relativ dazu
ausgedrückt.
Da BCoR∆ im Gegensatz zu BCoR nicht mit ENL/MLL-ENL interagieren und somit nicht
über ENL an die jeweiligen Chromatinabschnitte rekrutiert werden kann, würde man in
diesem Experiment eine starke Abweichung zwischen den beiden Zelllinien im Hinblick
auf die Expression der untersuchten Gene erwarten.
72
Ergebnisse
Abbildung 45: Relative Expression von Hoxa9, Meis1 und mMyc in BCoR exprimierenden Zellen. Gezeigt
sind die relativen mRNA-Level der drei Zielgene über einen Zeitraum von 0-96h nach Induktion mit 4-OHT.
Die Analyse mittels quantitativer Realtime PCR erfolgte mit genspezifischen Primern.
Wie aus Abbildung 45 hervorgeht, führt die BCoR-Überexpression zu einem Rückgang der
relativen Expressionslevel beider MLL-ENL Zielgene sowie mMyc. Nach 24-stündiger Induktion mit 4-OHT ließ sich in den BCoR exprimierenden Zellen eine Reduktion der Expressionslevel von Hoxa9 um 30% und Meis1 um 40% im Vergleich zu uninduzierten Zellen verzeichnen (vgl. Abb. 45). Dieser Effekt war nach 24 Stunden am stärksten ausgeprägt, da die Expression mit der Zeit wieder leicht zunahm. Auch die Myc-Expression sank
nach Induktion ab, was mit den vorherigen Ergebnissen, das Zellwachstum und die
Proliferation betreffend, korreliert.
Auch bei den BCoR∆-Zellen ließen sich ähnliche Effekte nach Induktion mit 4-OHT nachweisen. Die Expression von Hoxa9 und Meis1 sank auch hier nach 24 Stunden um 30%
bzw. 20% ab und stieg im weiteren Versuchsverlauf wieder leicht an (vgl. Abb. 46). Dabei
wurde Meis1 jedoch weniger stark herunterreguliert als in den BCoR exprimierenden Zellen. Die mMyc-Expressionslevel sind hierbei vergleichbar mit denen der BCoR-Zellen (vgl.
Abb. 45 und 46). Dies deutet darauf hin, dass beide BCoR-Isoformen, im Falle einer Über-
73
Ergebnisse
expression, auch ohne die Interaktion mit ENL eine reprimierende Wirkung auf die untersuchten Gene haben.
Abbildung 46: Expression von Hoxa9, Meis1 und mMyc in BCoR∆ exprimierenden Zellen. Gezeigt ist die
relative mRNA-Expression der drei Zielgene über einen Zeitraum von 0-96h nach Induktion mit 4-OHT. Die
Analyse mittels quantitativer Realtime PCR erfolgte mit genspezifischen Primern.
Zusammenfassend scheint BCoR in diesem Zellsystem als allgemeiner Repressor zu fungieren, dessen Effekt unabhängig von der Interaktion mit ENL zu sein scheint. Dabei ist er
an der Repression sowohl für die Aufrechterhaltung des Stammzell- oder Leukämischen
Phänotyps essentieller Gene wie Hoxa9 und Meis1, als auch des proliferationsstimulierenden Proteins Myc beteiligt. Dies führt zu einer verringerten Wachstumsrate und
schwächeren Ausprägung des transformierten Phänotyps und somit zum Wachstumsstopp oder Differenzierung der untersuchten Zellen.
(* Teile dieser Arbeit unter 4.2 sind bereits in der Masterarbeit von Kueffel, 2015 erschienen)
74
Diskussion
5. Diskussion
PcG- und Trx/MLL-Proteine agieren als funktionelle Antagonisten bei der Transkription
wichtiger Entwicklungsgene, wie zum Beispiel der Gene des Hox-Clusters (Ringrose und
Paro, 2004).
Normalerweise herrscht in der Zelle ein Gleichgewicht zwischen diesen antagonistisch
wirkenden Regulatoren der Genexpression. In der „Mixed Lineage“ Leukämie kommt es
durch die Translokation am Lokus 11q23 zur Entstehung von MLL-Fusionsproteinen, deren Zielgenspezifität erhalten bleibt, wohingegen der C-Terminus von MLL durch einen
beliebigen Fusionspartner ersetzt wird (Slany et al., 1998; Muntean et al., 2008). MLLFusionsproteine blockieren die Differenzierung hämatopoetischer Vorläuferzellen, indem
sie die Expression von Genen induzieren, die an der Selbsterneuerung von Vorläuferzellen
beteiligt sind (Lawrence, 1996; Zeisig et al., 2004). Die Transaktivierung dieser Gene beruht auf der Rekrutierung des transkriptionsstimulierenden EAP-Komplexes über die Fusionspartner ENL oder AF9. Neben aktivierenden Proteinen konnten im EAP-Komplex jedoch auch Komponenten des Polycomb-Repressive-Complex1 (PRC1), wie CBX8 und
RNG1B sowie der BCL6-Corepressor (BCoR) identifiziert werden (García-Cuéllar et al.,
2001; Mueller et al., 2007). In bereits publizierten Vorarbeiten konnte gezeigt werden,
dass die reprimierende Wirkung des Chromobox-Proteins CBX8 durch die direkte Interaktion mit ENL aufgehoben werden kann (Maethner et al., 2013). Für die Aufrechterhaltung
der ektopen Expression der MLL-ENL Zielgene muss somit nicht nur die Genexpression
aktiviert, sondern auch die reprimierenden Effekte der Polycomb-Proteine inaktiviert
werden.
In der vorliegenden Arbeit sollte der molekulare Mechanismus, der dieser Inaktivierung
zugrunde liegt, aufgeklärt werden.
5.1.
Inaktivierung des PRC1-Komplexes durch den PAF-Komplex
Der MLL-Fusionspartner ENL spielt im EAP-Komplex eine entscheidende Rolle, da er über
Protein-Protein-Interaktionen für die Rekrutierung der einzelnen Komponenten sorgt
(Benedikt et al., 2011; Monroe et al., 2011; Yokoyama et al., 2010). Die Binderegionen im
75
Diskussion
ENL-Protein liegen dabei hauptsächlich in der C-terminalen coiled-coil Domäne. Auch die
Interaktionsdomäne mit dem reprimierenden Polycomb-Protein CBX8 findet sich in dieser
Region (García-Cuéllar et al., 2001; Mueller et al., 2007). Aus bereits publizierten Studien
geht hervor, dass die Interaktion zwischen dem Polycomb-Protein CBX8 und ENL notwendig für die Neutralisierung der Polycomb-vermittelten Elongationsrepression eines Reportergens war (Maethner et al. 2013). Durch Strukturfunktionsanalysen konnte in der
vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die N-terminale ENL YEATS-Domäne ebenfalls
für dessen neutralisierende Wirkung von Bedeutung ist (vgl. 4.1.1). Weiterhin konnte der
elongationsstimulierende PAF-Komplex (PAFc) als Interaktionspartnerpartner der ENL
YEATS-Domäne identifiziert werden (vgl. 4.1.2). Der PAF-Komplex ist mit der Serin2- und
Serin5-phosphorylierten RNA-Polymerase II assoziiert und spielt sowohl eine Rolle bei der
Initiation als auch der Elongation (Shilatifard, 2006). Die Ergebnisse dieser Arbeit korrelieren gut mit früheren Studien, die die ENL YEATS-Domäne als „Brücke“ zwischen SECKomplex (Super Elongation Complex, oder EAP-Komplex) und PAF-Komplex bezeichnen.
Über die Interaktion kann der SEC-Komplex an die RNA-Polymerase II und ChromatinTemplates rekrutiert werden. Dieser Rekrutierungsmechanismus konnte auch mit Coimmunopräzipitationen bestätigt werden, da N-terminale ENL-Deletionsmutanten eine
reduzierte Bindeaffinität für die große Untereinheit der RNA-Polymerase II (RPB1) aufwiesen. Durch die Positionierung in unmittelbare Nähe des zu transkribierenden Gens, können die Komponenten des EAP-/SEC-Komplexes die produktive Elongation stimulieren (He
et al., 2011).
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen
ENL und dem PAF-Komplex eine wichtige Rolle bei der Neutralisierung der Polycombvermittelten Elongationsrepression spielt. Da für die Inhibierung des PolycombKomplexes die Interaktion zwischen ENL, CBX8 und PAFc notwendig zu sein scheint, muss
in Zukunft die Frage geklärt werden, ob es sich hierbei um simultane Interaktionen handelt. Außerdem stellt sich weiterhin die Frage, warum bis jetzt weder bei EAP- noch PAFKomplex Aufreinigungen der jeweils andere Interaktionspartner identifiziert werden
konnte, obwohl zweifellos eine Bindungsaffinität zwischen ENL und PAF1 besteht (He et
al., 2011). Dies könnte dadurch bedingt sein, dass die Interaktion der beiden Komplexe
nur von kurzer Dauer und nur an wenigen Genloci vorhanden ist.
76
Diskussion
5.1.1. Einfluss der PAF/MLL-ENL-Interaktion auf die maligne Hämatopoese
Da der PAF-Komplex die Expression wichtiger Schlüsselgene für die Pluripotenz in embryonalen Stammzellen reguliert, wäre es möglich, dass er auch in die Regulation der Genexpression während der Hämatopoese involviert ist. Verschiedene PAFc-Komponenten, wie
CTR9, WDR6 und RTF1 sind dafür bekannt, zum Beispiel die, für die Aufrechterhaltung der
Stammzell-Selbsterneuerung wichtige Oct4-Genexpression positiv zu beeinflussen (Ding
et al., 2009). Aus den Ergebnissen der in vitro Studien in dieser Arbeit ergibt sich zwangsläufig die Frage, ob eine PAF/MLL-ENL Interaktion besteht und ob diese auch einen Einfluss auf die maligne Hämatopoese hat. Die für die PAF1-Bindung essentielle ENL YEATSDomäne fehlt jedoch in vielen Patienten mit einer MLL-ENL induzierten akuten Leukämie.
In den meisten Fällen ist das MLL-Protein lediglich an die C-terminale Domäne (CTD) von
ENL fusioniert. Dieser 84 Aminosäuren umfassende Bereich des ENL-Proteins ist jedoch
ausreichend für die Transformation hämatopoetischer Zellen durch das Fusionsprotein
(Slany et al., 1998). Diese Daten widersprechen zunächst der Annahme, dass der PAFc
eine Rolle bei der Transformation hämatopoetischer Zellen durch MLL-ENL spielen könnte. Muntean et al. und Milne et al. konnten jedoch zeigen, dass das MLL-Protein über seine CxxC-RD2 Region ebenfalls mit dem PAF-Komplex interagieren kann. Wodurch das
Fehlen der ENL YEATS-Domäne und die damit verbundene Rekrutierungsfunktion über
PAFc an Chromatin, komplementiert werden könnte (Muntean et al., 2010; Milne et al.,
2010). In Anlehnung an diese Studien wurden in der vorliegenden Arbeit zwei MLLMutanten generiert, die zwar hinsichtlich der DNA-Bindung nicht eingeschränkt waren,
jedoch nicht mehr mit PAFc interagieren konnten. Um nun den Einfluss der Interaktion
zwischen MLL-ENL und dem PAF-Komplex auf die maligne Hämatopoese untersuchen zu
können, wurden beide MLL-Mutanten mit der C-terminalen ENL-Region respektive dem
kompletten ENL fusioniert. Dadurch konnte die PAF-Bindung ausschließlich über das
komplette ENL-Protein mit der YEATS-Domäne erfolgen.
Analog zu den veröffentlichten Arbeiten von Muntean und Milne und Kollegen, korrelierte die physikalische Affinität zu PAF1 mit einer gesteigerten Wachstumsrate und einem
erhöhten Selbsterneuerungspotential der transformierten Zellen (Milne et al., 2010;
Muntean et al., 2012) (vgl. 4.1.5.1). Die beobachteten Effekte waren dabei weder auf eine
Destabilisierung des Fusionsproteins noch auf den Verlust der DNA-Bindung zurückzufüh77
Diskussion
ren (Milne et al., 2010; Muntean et al., 2010) (vgl. 4.1.5.1). Diese Ergebnisse lassen den
Schluss zu, dass die Interaktion zwischen dem PAF-Komplex und dem MLL-ENL Fusionsprotein essentiell für die Transformation hämatopoetischer Vorläuferzellen ist. Zudem
geht das erhöhte Selbsterneuerungspotential mit gesteigerten mRNA-Expressionsleveln
der beiden MLL-ENL Zielgene Hoxa9 und Meis1 einher. Dabei wirkt sich die PAF/MLL-ENL
Interaktion positiv auf die Expression dieser beiden Gene aus (vgl. 4.1.5.2). Durch diese
Interaktion könnte zum einen die Rekrutierung des EAP-Komplexes an MLL-ENL Zielgene
begünstigt werden und zum anderen die transkriptionelle Elongation dieser Gene durch
die katalytischen Eigenschaften beider Komplexe aktiviert werden (Chopra et al., 2009;
Jaehning et al., 2010; Muntean et al., 2010; Milne et al., 2010). Für die Rekrutierung an
Zielgene wird jedoch nicht nur die Interaktion der beiden Komplexe miteinander, sondern
auch die Bindung des MLL-Proteins an Chromatin benötigt (Milne et al., 2010; Muntean et
al., 2010).
In den hier gezeigten Experimenten konnte interessanterweise ein Unterschied hinsichtlich des Transformationspotentials und der Expression der Zielgene zwischen einer Fusion
des MLL mit dem vollständigen ENL und der verkürzten Variante, bei der nur der ENL CTerminus an MLL fusioniert ist, verzeichnet werden. In allen Experimenten wird deutlich,
dass Zellen, transformiert durch das Fusionsprotein mit dem kompletten ENL im Vergleich
zu der Fusion mit dem ENL C-Terminus alleine, sowohl höhere Hoxa9- und Meis1Expressionslevel als auch ein erhöhtes Transformationspotential aufwiesen. Beide Fusionsproteine werden jedoch nachweislich in AML-Zellen von Patienten gefunden und sind
zudem in der Lage mit PAF1 zu interagieren. Zur Lösung dieser Fragestellung könnten
mehrere Möglichkeiten zutreffen. Zum einen müsste das Fusionsprotein mit dem kompletten ENL sowohl über MLL als auch die ENL YEATS-Domäne mehr PAF binden können.
Dies könnte die Expression der Zielgene potentieren und sich positiv auf das Transformationspotential auswirken. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Sensibilität von Vorläuferzellen für eine MLL-AF9 induzierte Transformation mit fortschreitender Differenzierung dieser Zellen abnimmt. Leukämie-Stammzellen (LSK), nicht aber GMPs (granulocyte
macrophage progenitors), können durch das Fusionsprotein effektiv transformiert werden (Chen et al., 2008). Die Sensibilität dieser Zellen für die Transformation durch MLLFusionsproteine scheint zudem mit der Expression des PAF-Komplexes zu korrelieren. In
embryonalen Stammzellen (ESC) nimmt die Expression des PAF-Komplexes mit zuneh78
Diskussion
mender Differenzierung stetig ab (Ding et al., 2009). Auch in einer Hoxa9-ER transformierten AML-Zelllinie konnte durch das Entziehen des Induktors 4-OHT die Differenzierung
dieser Zellen eingeleitet werden, und durch Microarray-Analysen eine Reduktion der PAFKomplex-Expression verzeichnet werden (Tan et al., 2010; Tan, Doktorarbeit 2012). Die
PAF-Expression könnte somit mit der Sensitivität dieser Zellen für eine Immortalisierung
durch MLL-Fusionsproteine korrelieren. Dies würde bedeuten, dass die in dieser Arbeit
verwendeten ckit+ Zellen schon weiter differenziert waren, somit von Grund auf geringere
PAF-Expressionslevel aufwiesen und weniger sensitiv für die Transformation waren. Das
MLL-Fusionsprotein mit dem C-terminalen ENL-Fragment würde demnach weniger PAF
binden können und somit ein schwächeres Transformationspotential aufweisen (vgl.
4.1.5.1 und 4.1.5.2).
5.1.2. Mechanismus der PRC1-Inaktivierung durch den PAF-Komplex
In der „Mixed Lineage“ Leukämie spielt die konstitutive Expression von HOXA9 und MEIS1
eine entscheidende Rolle. Obwohl schon relativ viel über die Rekrutierung des EAPKomplexes und die Funktion seiner Komponenten in MLL-ENL induzierten Leukämien bekannt ist, konnte der genaue molekulare Mechanismus hinter der Deregulation der MLLENL Zielgene noch nicht eindeutig aufgeklärt werden. Die Assoziation von MLL-ENL Fusionsproteinen mit dem PAF-Komplex scheint dabei essentiell für die Transformation hämatopoetischer Zellen zu sein.
Wie bereits erwähnt, spielt der PAF-Komplex eine entscheidende Rolle bei der Regulation
der transkriptionellen Elongation, ein Mechanismus über den auch die Gene des HoxClusters reguliert werden (Chopra et al., 2009; Jaehning, 2010). Auch in Reportergenstudien hatte PAFc in Anwesenheit von MLL-AF9 einen additiven Effekt auf die Expression
eines Hoxa9-Luziferase Reportergenkonstrukts (Muntean et al., 2010). Zudem konnte in
der vorliegenden Arbeit eine erhöhte Expression der beiden MLL-Zielgene durch die Rekrutierung des PAFc gezeigt werden (vgl. 4.1.5.2).
Der PAF-Komplex katalysiert durch die Bindung der Ubiquitin-Ligasen RNF20 und RNF40
die Ubiquitinylierung an Histon 2B, was mit aktiver Genexpression assoziiert ist (Weaky
und Workman, 2008). Auch in dieser Arbeit konnte ein Zusammenhang zwischen aktiver
79
Diskussion
Genexpression und H2B-Ubiquitinylierung durch Rekrutierung des PAF-Komplexes an
MLL-ENL Zielgene und ein Luziferase-Reporterkonstrukt eindeutig bestätigt werden (vgl.
4.1.4 und 4.1.6.1). Zhu und Kollegen konnten zeigen, dass die Monoubiquitinylierung des
Histons 2B spezifisch die Hox-Genexpression reguliert (Zhu et al., 2005). RNF20 spielt zudem in MLL-AF9 induzierten Leukämien eine wichtige Rolle, da die H2B-Ubiquitinylierung
die Dot1L-induzierte, aktivierende H3K79-Methylierung stimuliert. Dies führte zur erhöhten Expression des MLL-Zielgens Hoxa9 (Wang et al., 2013). Auch ein „knock-down“ von
RNF20 oder Dot1L hatte hauptsächlich Einfluss auf die Expression der MLL-AF9 Zielgene.
Was bedeuten könnte, dass die beiden katalysierten Modifikationen nur in einem bestimmten Chromatin-Umfeld transkriptionsfördernd wirken, so zum Beispiel bei Genen
des HOXA-Clusters, die sich durch eine einzigartige Chromatinstruktur auszeichnen (Bernstein et al., 2005; Ferraiuolo et al., 2010; Rinn et al., 2007).
Die H2B-Monoubiquitinylierung ist zudem Voraussetzung für weitere aktivierende Chromatinmodifikationen, wie H3K4-Mono- oder Trimethylierung oder H3K79-Dimethylierung
(Jaehning, 2010; Zhu et al., 2005). Diese Modifikationen werden zum Beispiel durch den
MLL-Komplex (H3K4me) und die Methyltransferase Dot1L (H3K79me) katalysiert. Diese
Tatsache deutet daraufhin, dass die Transkription, speziell die der Hox-Gene, durch ein
Zusammenwirken des PAF-Komplexes, MLL oder MLL-Fusionsproteinen und dem EAPKomplex reguliert wird.
In diesem Zusammenhang stellte sich die Frage, durch welche Mechanismen die H2BUbiquitinylierung in einer aktiven Genexpression resultieren kann. Aus der Literatur ist
bekannt, dass diese Chromatinmodifikation zur Änderung der lokalen Chromatinstruktur
führt (Chaudhary et al. 2007; Jaehning et al. 2010). Dies steht im Zusammenhang mit der
Rekrutierung weiterer Faktoren und Multiproteinkomplexen, wie dem Histonchaperon
FACT (facilitates chromatin transcription) und dem SAGA-Komplex (Chaudhary et al.,
2007; Weake und Workman, 2008) an Chromatin (Pavri et al., 2006; Chaudhary et al.
2007). Auf molekularer Ebene trägt die H2B-Ubiquitinylierung letztendlich zur Dissoziation eines H2A/H2B-Dimers in der Promotorregion bei und erhöht somit die Zugänglichkeit
des Chromatins für die RNA-Polymerase II und weitere Faktoren der Transkriptionsmaschinerie (Fierz et al., 2011). Demnach resultiert diese Modifikation durch Auflockerung
der lokalen Chromatinstruktur in der produktiven Elongation (Chaudhary et al. 2007; Fierz
80
Diskussion
et al., 2011). Auch in dieser Arbeit korrelierte eine gesteigerte H2B-Ubiquitinylierung in
der Promotorregion der MLL-ENL Zielgene mit einer aufgelockerten Chromatinstruktur
sowie gesteigerten Expressionsraten (vgl. 4.1.5.2-4.1.6.2).
PcG-Proteine (PRC1 und PRC2) und der MLL-Komplex agieren als epigenetische, funktionelle Antagonisten der Regulation wichtiger Entwicklungsgene, wie beispielsweise Genen
des HOX-Clusters. Die Promotoren dieser Gene sind oftmals durch bivalentes Chromatin
gekennzeichnet (Montavon und Duboule, 2013). Dabei befinden sich sowohl aktivierende
(H3K4me3) als auch inhibierende (H2A-Ubiquitinylierung/H3K27me3) Chromatinmodifikationen am Genlokus. Die RNA-Polymerase II befindet sich an diesen Promotoren im unphosphorylierten, inaktiven Zustand und wird durch die beiden Faktoren NELF und DSIF
inhibiert (Nechaev und Adelmann, 2011; Liu et al., 2009). Die durch den PRC1-induzierte
H2A-Ubiquitinylierung trägt zudem zur Kompaktierung des Genlokus bei, was die Zugänglichkeit für die Polymerase erschwert (Francis et al., 2004; Stock et al., 2007; Zhou et al.,
2008). Durch die Rekrutierung des PAF-Komplexes und der Kinase pTEFb kommt es zur
Phosphorylierung der CTD der Polymerase, sowie NELF und DSIF, wodurch die produktive
Elongation eingeleitet wird (Nechaev und Adelmann, 2011; Liu et al., 2009).
Die Rekrutierung des PAF-Komplexes an MLL-ENL Zielgene könnte durch seine enzymatische Aktivität der Polycomb-vermittelten Repression der Genexpression entgegenwirken
und deren konstitutive Expression gewährleisten. Die aktivierende H2B-Ubiquitinylierung
könnte dabei der inhibierenden H2A-Ubiquitinylierung, induziert durch den PRC1, entgegenwirken und durch die Auflockerung der Chromatinstruktur zur produktiven Elongation
und Transkription beitragen. Demnach wären der PAF- und der Polycombkomplex Gegenspieler hinsichtlich der Regulation der transkriptionellen Elongation. Die Überexpression
von RNF20/40 geht neben der erhöhten Hox-Genexpression auch mit niedrigen
H3K27me3-Leveln einher (Zhu et al. 2005). Diese Modifikation wird vom PRC2 katalysiert
und dient der Rekrutierung des PRC1 über Chromobox-Proteine (Blackledge et al., 2015).
Diese Ergebnisse würden eine antagonistische Wirkungsweise der PcG-Proteine und des
PAF-Komplexes weiter unterstreichen.
Durch die aus der Literatur bekannten Daten und den Ergebnissen dieser Arbeit ließe sich
folgende Hypothese ableiten: Durch die Interaktion zwischen MLL-ENL und PAF1 kommt
es zur Rekrutierung des EAP-und PAF-Komplexes an MLL-Zielgene. Der PAF-Komplex kata81
Diskussion
lysiert die Monoubiquitinylierung von Histon 2B, was die Auflockerung der lokalen Chromatinstruktur zur Folge hat. Dadurch wird der Genlokus zugänglich für die Methyltransferase DOT1L, die über den EAP-Komplex rekrutiert wird (Fierz et al., 2011). Zudem trägt
der PAF- und EAP-Komplex durch posttranslationale Modifikationen zur Aktivierung der
RNA-Polymerase II bei (Jaehning, 2010; Peterlin und Price, 2006; Zhou et al., 2012). All
dies wirkt der Polycomb-vermittelten Repression entgegen (vgl. Abb. 47).
Abbildung 47: Hypothese der Inaktivierung der Polycomb-vermittelten Repression durch den PAFKomplex. Durch die Interaktion zwischen MLL-ENL und PAFc kommt es zur Rekrutierung des EAP- und PAFKomplexes an reprimierte MLL-ENL Zielgene. Durch die katalytischen Eigenschaften beider Komplexe (H2BUbiquitinylierung, H3K79-Methylierung, Phosphorylierung) kommt es zur Auflockerung der Chromatinstruktur und zur Aktivierung der RNA-Polymerase II. Diese Modifikationen tragen zur Inhibierung des Polycombkomplexes und zur konstitutiven Expression der MLL-ENL Zielgene bei. Verwendete Abkürzungen:
H3=Histon 3; H2=Histon 2; ub=Ubiquitinylierung; me=Methylierung; P=Phosphorylierung; RNA Pol II=RNAPolymerase II
82
Diskussion
Neben aktivierenden Effekten scheint der PAF-Komplex allerdings auch reprimierend auf
die Transkription zu wirken (Chen et al., 2015; Yu et al., 2015). Dies wäre zunächst ein
Widerspruch zu der hier aufgestellten Hypothese. Eine mögliche Erklärung dafür wäre
eine zelltyp- und zielgenspezifische Wirkung des Komplexes. In HeLA Zellen wirkt sich die
RNF20-induzierte H2B-Ubiquitinylierung beispielsweise inhibierend auf die MYCExpression aus, in LNCaP-Zellen hingegen aktivierend (Jääskeläinen et al., 2012; Shema et
al., 2008). Chen und Kollegen konnten zeigen, dass der PAF-Komplex in einer Colonkarzinom- (HCT116) und Brustkarzinom-Zelllinie (MCF7) für die Aufrechterhaltung des „pausierenden“ Zustandes der RNA-Polymerase II zuständig ist. Der „knock-down“ einzelner
Komponenten des PAF-Komplexes führte in dieser Studie zur Freisetzung der RNAPolymerase II und aktiver Genexpression (Chen et al., 2015). Die Rolle des PAF-Komplexes
während der Transkription scheint demnach sowohl zelltypspezifisch als auch genspezifisch zu sein und somit in seiner Wirkung divergieren. Dies könnte darauf hindeuten, dass
der Komplex auch in hämatopoetischen Vorläuferzellen, ausdifferenzierten und malignen
hämatopoetischen Zellen unterschiedliche Effekte hinsichtlich der Transkriptionsregulation hat. Dafür sprechen auch Ergebnisse einer 2015 veröffentlichten Studie, in der gezeigt
werden konnte, dass sich der PAF-Komplex abhängig vom genetischen Hintergrund und
dem physiologischen Status der Zellen, entweder positiv oder negativ auf die Freisetzung
der RNA-Polymerase II aus dem „pausierenden“ Zustand und der damit verbundenen
produktiven Elongation auswirken kann. In THP1-Zellen (humane AML-Zelllinie mit einem
MLL-AF9 Fusionsprotein) stimuliert der Komplex die Transkription bzw. Elongation (Yu et
al., 2015). Diese Beobachtung würde mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen gut
korrelieren.
Einzelne Komponenten des PAF-Komplexes stehen im Zusammenhang mit Karzinogenese.
Chromosomale Abberationen am Lokus 11p15.3, kodierend für CTR9, sind zum Beispiel
mit der Pathogenese verschiedenster Krebsarten, wie Lungenkrebs und Leukämien, in
Verbindung gebracht worden (Chaudhary et al., 2007; Redeker et al., 1995). Im familiären
Hyperparathyroidism-Jaw-Tumor Syndrom (HPT-JT) liegt das für CDC73 (HRPT2) kodierende Gen mutiert vor, was den Verlust der Assoziation einzelner PAF-KomplexKomponenten und des PAFc mit Chromatin sowie der RNA-Polymerase II zur Folge hat
(Muntean et al., 2013; Rozenblatt-Rosen et al., 2005). Mutationen in diesem Gen sind
83
Diskussion
darüber hinaus noch mit einer Reihe weiterer Tumoren, wie Brust-, Nieren- und Karzinomen des Gastrointestinaltraktes assoziiert (Newey et al., 2009).
Der PAF-Komplex scheint eine entscheidende Rolle bei der Leukämieentstehung zu spielen und dabei maßgeblich an der Elongationsregulation und konstitutiven Expression der
MLL-ENL Zielgene Hoxa9 und Meis1 beteiligt zu sein. Da die Interaktion zwischen PAFKomplex und Wildtyp-MLL ebenfalls von Bedeutung für die Transkriptionsregulation der
HOX-Gene während der normalen Hämatopoese ist, stellt sich die Frage, ob dabei ein
Unterschied zwischen normalen und malignen hämatopoetischen Zellen besteht. Muntean und Kollegen konnten zeigen, dass die Inhibition der PAF-MLL-Interaktion einen größeren Einfluss auf die maligne, als auf die normale Hämatopoese hatte. In Zellen mit einem MLL-AF9 Fusionsprotein hatte die Inhibierung der Interaktion einen signifikanten,
negativen Effekt auf Transformation und Wachstum, wohingegen normale hämatopoetische Zellen weitestgehend unbeeinflusst blieben. Außerdem war dieser Effekt Leukämiezelltypspezifisch, da in E2A-HLF Zellen kein Einfluss auf die Transformation beobachtet
werden konnte (Muntean et al., 2013). Dies könnte ein Hinweis dafür sein, dass die MLLPAFc-Interaktion in MLL-assoziierten Leukämien eine zentralere Rolle spielt als in anderen
Leukämietypen und normalen hämatopoetischen Zellen. Was mit möglichen Unterschieden in Rekrutierung und Bindung von MLL und MLL-Fusionsproteinen an ihre Zielgene
zusammenhängen könnte. Die PHD-Domäne im MLL-C-Terminus erkennt spezifisch H3K4di- und trimethyliertes Chromatin und ist neben der CxxC-Domäne wichtig für die Bindung
an seine Zielgene (Milne et al., 2010). Diese Domäne fehlt in MLL-Fusionsproteinen jedoch, was den Schluss zulässt, dass hier die Interaktion und Rekrutierung des PAFKomplexes eine wichtigere Rolle spielen könnte. In Zukunft sollte geklärt werden, ob die
Blockierung dieser Interaktion zum Beispiel mit „small molecule“ Inhibitoren eine alternative, zelltypspezifischere Therapiemöglichkeit zur Behandlung von MLL-assoziierten Leukämien bieten könnte.
84
Diskussion
5.2.
BCoR als übergeordneter Repressor
In der „Mixed Lineage Leukemia“ kommt es, bedingt durch Translokationen am Lokus
11q23, zur Bildung verschiedener MLL-Fusionsproteine. Dies führt durch Rekrutierung des
transkriptionsaktivierenden EAP-Komplexes zu einer dauerhaften Aktivierung des HOXGenlokus, wodurch die Transformation hämatopoetischer Vorläuferzellen erreicht wird.
Der Fusionspartner ENL nimmt dabei durch die Rekrutierung der einzelnen EAPKomponenten eine „scaffold“ Funktion ein. In Komplexaufreinigungen konnten nicht nur
aktivierende, sondern auch reprimierende Proteine, wie das Chromobox-Protein CBX8,
die E3-Ubiquitinligase RING1 und der BCL6-Corepressor (BCoR) identifiziert werden
(García-Cuéllar et al., 2001; Mueller et al., 2007). CBX8 und RING1 bilden mit anderen
Proteinen den „kanonischen“ PRC1-Komplex, wohingegen BCoR Mitglied in einem PRC1ähnlichen Komplex, bzw. dem „nicht-kanonischen“ PRC1, ist (Blackledge, 2015; Gearhart
et al., 2006). Nachdem sich der erste Teil dieser Arbeit mit dem molekularen Mechanismus beschäftigt, wie eine Interaktion zwischen ENL und CBX8 die reprimierende Wirkung
des PRC1 auf die Elongation aufheben und so die konstitutive Expression der MLL-ENL
Zielgene gewährleisten kann (Maethner et al., 2013) sollte im zweiten Teil dieser Arbeit
auch die Interaktion zwischen ENL/MLL-ENL und BCoR sowie die Bedeutung dieser Wechselwirkung auf die maligne Hämatopoese näher untersucht werden.
BCoR wurde erstmals als Corepressor des Protoonkogens BCL6 (B-Cell Lymphoma Protein
6) identifiziert, der dessen negative Wirkung auf die Transkription in Reportergenstudien
potenzieren konnte (Huynh et al., 2000). Während BCL6 spezifisch nur in B- und T-Zellen
exprimiert wird, handelt es sich bei BCoR um ein ubiquitär auftretendes Protein (Jardin et
al., 2007; Huynh et al., 2000). Deshalb liegt es nahe, dass BCoR auch unabhängig von BCL6
als Corepressor anderer Transkriptionsfaktoren fungieren kann. Dies konnte in transienten Reportergenstudien bestätigt werden, in denen BCoR mittels einer GAL4-DNABindedomäne (GAL4-BCoR) auch ohne BCL6 als Transkriptionsrepressor agieren konnte
(Huynh et al. 2000). Zudem konnte in einem Rev-Reportergenassay gezeigt werden, dass
Rev-BCoR spezifisch den Schritt der transkriptionellen Elongation inhibiert (Hetzner, Masterarbeit, 2012). In bereits publizierten Studien konnte mittels Coimmunopräzipitation
eine Interaktion zwischen AF9 und zwei murinen Bcor-Isoformen festgestellt werden. Als
Binderegion wurde dabei ein 34 Aminosäuren langes Sequenzmotiv im C-Terminus des
85
Diskussion
Bcor-Proteins identifiziert (Srinivasan et al., 2003). Dieses Sequenzmotiv ist auch für die
Interaktion zwischen einer humanen BCoR-Isoform und dem AF9-Homolog ENL verantwortlich (Hetzner, Masterarbeit, 2012). Die ENL-Binderegion für BCoR liegt dabei, analog
zur CBX8-Interaktionsdomäne, in den letzten 15 Aminosäuren des Proteins (Hetzner,
Masterarbeit, 2012; Maethner et al., 2013). Aufgrund dessen könnte eine funktionelle
Analogie zwischen der CBX8-ENL und der BCoR-ENL Interaktion vermutet werden. Durch
die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Reportergenstudien konnte jedoch gezeigt
werden, dass die BCoR-vermittelten reprimierenden Effekte auf die Elongation, im Gegensatz zu CBX8, nicht durch die Interaktion mit ENL neutralisiert werden können (vgl.
4.2.1). Dabei war es unerheblich ob BCoR mit ENL intergieren konnte oder nicht. BCoR
scheint folglich Mitglied eines hierarchisch übergeordneten Repressorkomplexes zu sein,
der nicht durch ENL inhibiert werden kann. Da sowohl BCoR als auch ENL spezifisch die
Elongation regulieren, könnte es sich bei den beiden Proteinen um direkte Gegenspieler
der Transkriptionsregulation handeln (Mueller et al., 2009). Dabei könnte die Expression
verschiedener Isoformen des BCoR-Proteins mittels alternativem „Splicing“, der Steuerung der Spezifität von BCoR als Corepressor dienen. Dies wäre mit Literaturdaten vereinbar, die zeigen, dass nur die AF9-bindende Bcor-Isoform in der Lage war, die AF9vermittelte Aktivierung der Elongation eines Reportergens zu unterdrücken (Srinivasan et
al., 2003). Somit wird der BCoR-Komplex über AF9/ENL an Zielgene rekrutiert und kann
diese inaktivieren, nicht aber umgekehrt. Ein möglicher biologischer Grund könnte darin
liegen, dass BCoR dazu dient, die durch ENL aktivierten Gene dauerhaft abzuschalten, da
der PRC1 mit CBX8 nicht dazu in der Lage wäre.
5.2.1. BCoR als Tumorsuppressor in der malignen Hämatopoese
Während der Differenzierung zu reifen Blutzellen müssen wichtige Gene zur Aufrechterhaltung des Stammzellphänotyps, wie zum Beispiel HOX-Clustergene, irreversibel abgeschaltet werden. BCoR ist ein ubiquitär exprimierter Corepressor und spielt auch in der
Embryonalentwicklung, in mesenchymalen Stammzellen und in der Hämatopoese eine
entscheidende Rolle (Gearhart et al., 2006; Sanchez et al., 2007; Srinivasan et al., 2003;
Wamstad und Bardwell, 2007; Fan et al., 2009). In einer Studie von Cao und Kollegen
86
Diskussion
konnte gezeigt werden, dass BCoR maßgeblich an der Regulation von Hox-Clustergenen
und damit auch der Differenzierung hämatopoetischer Zellen beteiligt ist. Dabei wurde
eine Bcor „knock-out“ Maus generiert und funktionelle Untersuchungen an isolierten
Knochenmarkzellen durchgeführt. Der „knock-out“ des Proteins führte zu erhöhten
mRNA-Leveln der Gene Hoxa5, Hoxa7 und Hoxa9 sowie zu einer gesteigerten Proliferationsrate dieser Zellen in Flüssigkultur und Methylcellulose. Zudem konnte mittels ChIPAnalyse die spezifische Bindung BCoRs am Hoxa7-Lokus nachgewiesen werden (Cao et al.,
2016). Die Ergebnisse aus dieser Arbeit deuten darauf hin, dass BCoR als übergeordneter
Repressor fungieren könnte, der anders als der PRC1 mit CBX8, nicht von ENL inhibiert
werden kann. Demnach stellte sich die Frage, ob der BCoR-Repressorkomplex sowohl in
der normalen als auch der malignen Hämatopoese für die dauerhafte Repression wichtiger Pluripotenzgene zuständig sein könnte. Darauf basierte die Hypothese, dass BCoR in
der malignen Hämatopoese die Funktion eines Tumorsuppressors einnehmen könnte, der
MLL-ENL Zielgene dauerhaft reprimiert und so dem leukämischen Phänotyp entgegenwirkt. Dies steht im Einklang mit diversen Studien, in denen inaktivierende, somatische
BCoR-Mutationen in einigen humanen Tumoren, wie dem Retinoblastom, dem Meduloblastom und der AML, identifiziert werden konnten (Zhang et al., 2012; Tiberi et al., 2014;
Grossmann et al., 2011). Der durch Mutationen bedingte Funktionsverlust BCoRs geht
weiterhin mit einer schlechteren Überlebenswahrscheinlichkeit der Krebspatienten einher (Damm et al., 2013; Grossmann et al., 2011; Tiacci et al., 2012).
Die aufgestellte Hypothese konnte in dieser Arbeit bestätigt werden, da die induzierte
Überexpression von BCoR in MLL-ENL transformierten Knochenmarkzellen zu einer deutlich verringerten Wachstumsrate führte, im Vergleich zu uninduzierten Zellen. Analog
dazu konnte mittels MTT-Test gezeigt werden, dass BCoR einen negativen Einfluss auf die
Zellviabilität transformierter Zellen hatte (vgl. 4.2.2.2.1). Demnach scheint BCoR der leukämischen Transformation durch MLL-ENL entgegenzuwirken. Anders als angenommen
korreliert die reduzierte Proliferationsrate jedoch nicht mit einem Zellzyklusarrest. Die
Überexpression von BCoR führt vielmehr zu einer erhöhten Anzahl an absterbenden Zellen, was mittels Zellzyklusanalyse gezeigt werden konnte. Der relative Anteil an Zellen in
den anderen Zellzyklusphasen änderte sich hingegen nur geringfügig (vgl. 4.2.2.2.2). Die
reduzierte Wachstumsrate der BCoR-exprimierenden Zellen könnte demnach auf eine
gesteigerte Apoptoserate zurückzuführen sein. Die Zunahme an toten Zellen könnte zum
87
Diskussion
einen dadurch begründet sein, dass BCoR spezifisch anti-apoptotische Gene hemmt, zum
anderen jedoch auch eine Folge der Überexpression BCoRs und einem damit verbundenen zytotoxischen Effekt sein. In Vorversuchen konnte bereits gezeigt werden, dass es
durch die Überexpression des BCoR-Proteins zu einer Gegenselektion kommt, aufgrund
dessen nur Zellen überleben, die das Protein nicht exprimierten (Truch, Masterarbeit,
2014).
Im weiteren Verlauf sollte evaluiert werden, ob die reduzierte Proliferationsrate mit verringerten Expressionsleveln der MLL-ENL Zielgene Hoxa9 und Meis1 korreliert. Dieser Zusammenhang konnte mittels Genexpessionsanalyse bestätigt werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass die relativen mRNA-Level beider Zielgene, im Vergleich zu uninduzierten Zellen, reduziert waren. Diese Resultate korrelieren gut mit bereits veröffentlichten
Studien, in denen ein BCoR „knock-out“ zur gesteigerten Expression der Hox-Clustergene
führte (Cao et al., 2016) und der Auswertung einer ChIP-Analyse in B-Zellen, in der BCoR
nahe der Promotorregion von Hoxa9 und Meis1 identifiziert werden konnte [(Hatzi et al.,
2013) Truch Masterarbeit, 2014]. Zudem war das Expressionslevel des Transkriptionsfaktors c-Myc ebenfalls herabgesetzt. Dabei handelt es sich um ein Protein, welches sich positiv auf die Proliferation auswirkt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem eingeschränkten Wachstum BCoR-exprimierender Zellen (vgl. 4.2.2.2.3).
Die beobachteten Effekte waren jedoch insgesamt relativ gering ausgeprägt, was ein
Hinweis dafür sein könnte, dass nicht alle induzierten Zellen auch tatsächlich das Protein
exprimierten. Damit würde auch die Beobachtung korrelieren, dass alle Effekte nach längerer Inkubationszeit rückläufig waren, was ein Indiz für eine zunehmend heterogener
werdende Population und eine Gegenselektion sein könnte.
BCoR ist Mitglied eines „nicht-kanonischen“ PRC1-Komplexes, der anders als der „kanonische“ PRC1, nicht über H3K27me3 und Chromoboxproteine an Chromatin rekrutiert wird,
sondern über die Methyltransferase KDM2B an unmethylierte CpG-Inseln in Transkriptionsstartstellen (TSS) (Blackledge et al., 2015; Yamamoto et al., 2014). Dieser Komplex
reprimiert die Genexpression ebenso wie der „kanonische“ PRC1 über epigenetische Modifikationen. Dabei katalysiert KDM2B die Demethylierung von H3K36 und RING1B sorgt
für die Ubiquitinylierung von Histon 2A (Yamamoto et al., 2014). PCGF1, eine weitere
Kernkomponente des BCoR-Komplexes, ist zudem an der Inhibition der HOXA-Clustergene
88
Diskussion
beteiligt. Ross und Kollegen konnten nachweisen, dass der Verlust von Pcgf1 und dem
Transkriptionsfaktor Runx1 in frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen (Lin -) zu einem
erhöhten Selbsterneuerungspotential und einer Blockade in der Differenzierung führte
(Ross et al., 2012). Darüber hinaus stimuliert PCGF1 die effiziente H2A-Ubiquitinylierung
durch RING1 (Yamamoto et al., 2014). Der BCoR-Komplex scheint somit an der Initiierung
der Differenzierung hämatopoetischer Zellen beteiligt zu sein (Ross et al., 2012).
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass BCoR die Aufgabe eines
Tumorsuppressors übernimmt und der MLL-ENL-induzierten Leukämie entgegenwirkt.
Der BCoR-Komplex würde somit hierarchisch auf einer höheren Ebene als der „kanonische“ PRC1 und ENL/MLL-ENL stehen. Demnach könnte BCoR dazu dienen, ENL oder MLLENL Zielgene dauerhaft zu inaktivieren, da dies durch den „kanonischen“ PRC1 und CBX8
nicht möglich wäre. In der normalen Hämatopoese müssen die Gene des HOX-Clusters
nach und nach inaktiviert werden, um die Differenzierung der Zellen zu ermöglichen
(Slany et al., 2009). Für diese irreversible Inhibierung könnte der BCoR-Komplex zuständig
sein, der nicht durch ENL oder MLL-ENL inaktiviert werden kann. Es wäre somit möglich,
dass der BCoR-Komplex mit zunehmender Differenzierung der hämatopoetischen Vorläuferzellen die Rolle des „kanonischen“ PRC1 übernimmt und die HOX-Clustergene dauerhaft abschaltet (vgl. Abb. 48).
„kanonischer“ PRC1
„nicht-kanonischer“ PRC1
Abbildung 48: BCoR als übergeordneter Repressorkomplex in der Hämatopoese. Während der Reifung
hämatopoetischer Vorläuferzellen (HPC) könnte der „kanonische“ PRC1 gegen den „nicht-kanonischen“
PRC1 ausgetauscht werden und so ENL/MLL-ENL Zielgene irreversibel reprimiert werden. BCoR fungiert
dabei als übergeordneter Repressor und ermöglicht durch die Inhibierung der Hox-Genexpression die Zelldifferenzierung.
89
Diskussion
Auch Cao und Kollegen konnten zeigen, dass BCoR durch die Repression der HoxClustergene eine wichtige Rolle bei der Regulation der Hämatopoese spielt. Ein „knockdown“ von Bcor führte in dieser Studie zu einer signifikanten Abnahme der H2AUbiquitinylierungslevel spezifisch an den Promotoren für Hoxa5, Hoxa7 und Hoxa9. Die
globalen H2A-Ubiquitinylierungslevel blieben dabei jedoch unverändert. Des Weiteren
korrelierte die Anwesenheit von RING1B auf Proteinebene mit der BCoR-Expression. Zudem konnte gezeigt werden, dass in AML- und MDS- (Myelodysplastic Syndrome) Patientenproben mit einer „loss of function“ Mutation im BCoR-Gen sowohl proliferationsrelevante als auch differenzierungsspezifische Gene hochreguliert wurden. Darunter befanden sich MYC-Zielgene und HOXA9 (Cao et al., 2016).
Die genaue Rolle des Proteins in der MLL-ENL induzierten Leukämogenese bedarf jedoch
weiterer Untersuchungen, insbesondere muss der Frage nachgegangen werden, wie BCoR
durch MLL-ENL inaktiviert wird beziehungsweise ob BCoR in diesen Zellen exprimiert ist.
Cao und Kollegen konnten schließlich zeigen, dass die BCoR-Expression in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) sehr hoch ist und während der Differenzierung abnimmt (Cao et
al., 2016).
5.2.2. Rekrutierung des BCoR-Komplexes an MLL-ENL Zielgene
Humanes BCoR wird in mindestens vier Isoformen exprimiert, wobei nur die längste
Spleißvariante über eine ENL-/AF9-Interaktionsdomäne verfügt (Huynh et al., 2000; Srinivasan et al., 2003). Um mögliche funktionelle Unterschiede hinsichtlich der Rekrutierung
an MLL-ENL Zielgene untersuchen zu können, wurden in dieser Arbeit zum einen das
komplette BCoR und zum anderen die Isoform ohne ENL-Interaktionsdomäne (BCoR∆)
verwendet. Die Expression verschiedener BCoR-Spleißvarianten könnte auf eine mögliche
Regulation der ENL-Aktivität hindeuten, wobei BCoR∆ aufgrund der fehlenden Interaktionsdomäne nicht an ENL/MLL-ENL Zielgene rekrutiert werden kann.
Diese Annahme konnte anhand der vorliegenden Arbeit jedoch nicht bestätigt werden, da
beide BCoR-Varianten sowohl ähnliche Effekte auf das Zellwachstum, den Zellzyklus und
90
Diskussion
die Repression der MLL-ENL Zielgene Hoxa9 und Meis1 sowie den Transkriptionsfaktor cMyc hatten. Der minimale Unterschied zwischen den Isoformen kann dabei nicht auf die
Affinität zu ENL zurückgeführt werden. Die erhaltenen Ergebnisse deuten vielmehr darauf
hin, dass BCoR und BCoR∆ auch über alternative Mechanismen an die DNA rekrutiert
werden können.
Da BCoR selbst über keine DNA-Interaktionsdomäne verfügt, könnte die Rekrutierung
über verschiedene Interaktionspartner erfolgen. Ursprünglich wurde BCoR als Corepressor des Protoonkogens BCL6 entdeckt, der mit dessen POZ-Domäne interagiert und so an
BCL6 Zielgene rekrutiert wird (Huynh et al., 2000). Die ubiquitäre Expression von BCoR
und die Interaktion mit ENL/AF9 weisen jedoch darauf hin, dass das Protein auch unabhängig von BCL6 als Transkriptions-Corepressor agieren könnte (Huynh et al., 2000; Srinivasan et al., 2003). Hatzi und Kollegen konnten zudem durch ChIP-Analysen bestätigen,
dass BCoR an einer Vielzahl von Genen zu finden war, die nicht von BCL6 reguliert werden
(Hatzi et al., 2013).
Über die H3K36-spezifische Demethylase KDM2B ist bekannt, dass sie mit BCoR interagiert und den Komplex an unmethylierte CpG-Inseln rekrutiert (Farcas et al., 2012; Wu et
al., 2013). Zudem konnte mittels ChIP-Seq Analysen in embryonalen Stammzellen (ESC)
die Anreicherung von KDM2B unter anderem an Transkriptionsstartstellen der Hox-Gene
gezeigt werden (Wu et al., 2013). Dies wäre ein möglicher Mechanismus, über den beide
BCoR-Isoformen unabhängig von ENL an Hoxa9 rekrutiert werden können.
In der malignen Hämatopoese fungiert KDM2B allerdings auch als Onkoprotein, indem es
sich negativ auf die Transkription des Tumorsuppressorgens p15ink4b in Hoxa9/Meis1induzierten Leukämiezellen auswirkt (He et al., 2008; He et al., 2011). p15ink4b codiert für
einen CDK4/6-Inhibitor und ist somit am Zellzyklusarrest beteiligt (He et al., 2008). BCoR
hingegen wirkt sich in mesenchymalen Stammzellen (MSC) eines OFCD-Patienten inhibierend auf das Zellwachstum aus (Fan et al., 2009). Aufgrund dieser Ergebnisse liegt die
Vermutung nahe, dass die einzelnen BCoR-Komplex-Komponenten zielgen- und zelltypspezifisch verschiedene Aufgaben erfüllen.
Allerdings könnte auch die Überexpression der beiden BCoR-Isoformen dazu beigetragen
haben, dass beide Varianten durch alternative Mechanismen an MLL-ENL Zielgene rekru91
Diskussion
tiert wurden. Dies muss nicht den tatsächlichen Gegebenheiten in Zellen mit endogener
BCoR-Expression entsprechen. Der genaue Rekrutierungsmechanismus des BCoRKomplexes in der malignen Hämatopoese bedarf demnach weiterer Untersuchungen.
Auch müsste genauer untersucht werden, welchen Zweck die Expression verschiedener
Spleißvarianten erfüllt.
5.2.3. Rolle von BCoR in Leukämiezellen
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass BCoR dem MLL-ENL transformierten Leukämiephänotyp entgegenwirkt. Die Überexpression dieses Proteins in murinen Leukämiezellen führte zur Hemmung der Proliferation und zu einer verminderten
Expression der MLL-ENL Zielgene Hoxa9, Meis1 sowie c-Myc. Demnach fungiert BCoR als
Tumorsuppressor, was mit diversen Studien im Einklang steht, in denen postuliert wurde,
dass das Protein in einigen Leukämien aufgrund somatischer Mutationen funktionslos ist
(Yamamoto et al., 2014). Der Funktionsverlust könnte Aufschluss darüber geben, wie die
Tumorsuppressorwirkung in diesen Zellen ausgeschaltet wird. In vorherigen Untersuchungen konnte jedoch auf mRNA-Ebene gezeigt werden, dass BCoR auch in MLL-ENL
transformierten murinen Leukämiezellen exprimiert wird (unveröffentlichte Daten). Dies
korreliert gut mit den Ergebnissen aus der Studie von Cao und Kollegen, in der Bcor in
HL60-Zellen und NB4-Zellen (humane promyelozitische Leukämiezellen) auf mRNA- und
Proteinebene stark exprimiert war (Cao et al., 2016). Diese Resultate werfen die Frage
auf, wie MLL-ENL die BCoR-vermittelte Repression umgehen kann und seine Zielgene
konstitutiv aktiviert.
Die Vermutung, dass BCoR nicht mit dem MLL-ENL Fusionsprotein interagieren kann und
somit nicht an Zielgene rekrutiert wird, konnte mittels Coimmunopräzipitationen bereits
widerlegt werden (Truch Masterarbeit, 2014). Eine andere Möglichkeit wäre, dass zwar
die BCoR-mRNA in diesen Zellen exprimiert wird, das Protein selbst jedoch durch Degradation oder Hemmung durch inhibitorische Proteine in diesen Zellen nicht funktionell
aktiv ist. Weiterhin wurde in diesen Zellen nicht überprüft, ob BCoR möglicherweise mutiert vorliegt. In OFCD-Patienten führt die Mutation im BCoR-Gen zum Verlust des Exons 9
92
Diskussion
und 10, was die Interaktionsfähigkeit des Proteins mit PRC1-Komponenten beeinflusst (Ng
et al., 2004). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Pcgf1-Expression mit zunehmender Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) zu Vorläuferzellen (HPCs) zunimmt, während die Expression von Hoxa9 und BMI1 abnimmt. Bei BMI1 handelt es sich
um ein PCGF1-Homolog des „kanonischen“ PRC1, das hauptsächlich in hämatopoetischen
Stammzellen exprimiert ist und dort die Selbsterneuerung fördert (Hosen et al., 2007;
Park et al., 2003; Ross et al., 2012). Diese Daten deuten darauf hin, dass während der
Hämatopoese eine Fluktuation zwischen den verschiedenen Komponenten der PRC1Komplexe herrscht. Demnach könnte der „kanonische“ PRC1 mit zunehmender Differenzierung von HSCs zu HPCs durch den BCoR-Komplex abgelöst werden (vgl. Abb. 48). Dieser
Mechanismus würde auch eine Erklärung dafür liefern, dass BCoR nur in bestimmten Zellen aktiv sein könnte, in denen auch weitere Komplex-Komponenten exprimiert werden.
Ebenfalls möglich wäre, dass ENL als Schalter zwischen aktiver und reprimierter Transkription fungiert. Es konnte bereits gezeigt werden, dass sich die Bindung der aktivierenden
Methyltransferase Dot1L und BCoR gegenseitig ausschließen (Truch Masterarbeit, 2014).
Demnach könnte BCoR in MLL-ENL Leukämiezellen durch DOT1L verdrängt werden, wobei
die konstitutive Expression der MLL-ENL Zielgene gewährleistet wäre.
In weiteren Studien müsste demnach der genaue Rekrutierungsmechanismus an MLL-ENL
Zielgene und die Funktionalität des BCoR-Komplexes in MLL-ENL transformierten Leukämiezellen näher untersucht werden.
93
Material und Methoden
6. Material und Methoden
6.1.
Molekularbiologische Standardmethoden
Generelle molekularbiologische Standardmethoden wie Klonierungen, Transformation
elektrokompetenter Bakterien, Restriktionsverdaue, Ligationen, Plasmidpräparationen
und ähnliches wurden gemäß allgemeiner Methodensammlungen durchgeführt ( vgl. z.B.
Sambrook und Russel, 2000).
Chemikalien, Puffer, Reagenzien
Sämtliche verwendete Enzyme, Chemikalien, Medien und Kits für die Durchführung molekularbiologischer Standardmethoden stammen, soweit nicht anders vermerkt, von den
Firmen Amersham Biosciences, Clontech, Eppendorf, MBI Fermentas, Gibco, Invitrogen,
Merck, New England Biolabs, Promega, Qiagen, Roche, Roth, Sigma und Stratagene.
6.2.
Klonierungen und Sequenzen
Sequenzen
Sämtliche angegebenen DNA-, RNA- sowie Proteinsequenzen wurden den NCBI Datenbanken RefSeq, GenBank und der Ensembl-Datenbank entnommen (soweit nicht anders
angegeben). Sequenzvergleiche wurden mittels Programmanwendungen basierend auf
dem Blast-Algorithmus (Altschul et al., 1990) durchgeführt. Die Sequenzierung generierter
Plasmidkontrukte erfolgte extern durch die Firmen GATC (Konstanz) und Macrogen (Amsterdam).
Verwendete Vektoren
Bei Klonierungen, Expressionsnachweisen mittels Western Blot, Bindungsanalysen, sowie
für die Reportergenanalysen konnte auf folgende Standardvektoren zurückgegriffen werden.
94
Material und Methoden
Tabelle 1: verwendete Plasmide
Plasmid
Beschreibung
pcDNA3
High-Copy Expressionsplasmid Invitrogen (Karlsruhe)
pMSCVneo/puro/hygro
Low-Copy retroviraler Vektor
Clontech (Palo Alto, USA)
pGL3-HIV-LTR
Luziferase-Reporterplasmid
Promega (Mannheim)
pcDNA3.1-V5/His-TOPO-REV Expressionsvektor
Hersteller
Invitrogen (Karlsruhe)
für Rev-Fusionskonstrukte
PCR-Bedingungen und Primer
PCR-Produkte für Klonierungen wurden mit dem KOD Hot Start DNA Polymerase Kit
(Merck, Darmstadt), dem Q5 Hot Start Polymerase Kit (NewEngland Biolabs, Ipswich USA)
amplifiziert. Dabei wurden die PCR-Bedingungen gemäß der Angaben des Herstellers und
der zu amplifizierenden Sequenz modifiziert. Interne Deletionen oder Mutationen wurden
mittels „overlap PCR“ und entsprechenden Primern generiert oder mit Gibson Assembly
(NewEngland Biolabs, Ipswich USA) kloniert. Die nachfolgende Tabelle enthält die in dieser Arbeit für Klonierungen verwendeten Primer, wobei deren Sequenz jeweils in 5‘→ 3‘
Richtung angegeben ist. Dabei wurden alle Primer und Oligonukleotide von der Firma
SIGMA Aldrich (Taufkirchen) synthetisiert, in MQ Wasser gelöst und auf eine Endkonzentration von 100pmol eingestellt.
Tabelle 2: verwendete Primer
Primerbezeich-
Sequenz in 5‘→3‘
nung
BCoR-EcoRV-fw
gaattggatatcatgctctcagcaacccccctg
BCoR-XhoI-rev
caattcctcgagtcaccagtagttgtctgaggccag
ENL2_fw
aattgaattccaacaaccccaccacggagttcc
ENL4_fw
aattgaattcaggacccctgcgctccatggtg
ENL4_rev
aattctcgagtcatgtggccacggcctccagg
ENL-EcoRI-fw
aattgaattcatggacaatcagtgcaccgtcc
ENL-QLR1820AAA-G27AF28Y_fw
ggcatcgcgccgctgccgctgcctacactcacgactggatg
95
Material und Methoden
ENL-QLR18catccagtcgtgagtgtaggcagcggcagcggcgcgatgcc
20AAA-G27AF28Y_rev
ENL1680revXhoI- aattgtcgacctcgagtcatgtggccacggcctcc
SalI
flag-loxP-LNGFR-
gtcgtccttgtagtccatggtataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcactctt-
rev
gaaggctatgtag
MSCV-loxP-
cggaattagatccaccatggataacttcgtatagcatacattatacgaagttatagcat-
LNGFR-fw
gggggcaggtgccacc
MLL-1220-fw
cacaggtcaaaaatattcgac
MLL-3774-NruI-
aatttcgcgaactgcttttctttggggcag
rev
MLL-NruI-rev
aatttcgcgacccatctgctggaattttttgc
MLL-ov-fw-
gtcgatcggcccggtgtgggcagtg
R1153A
MLL-ov-rev-
cacaccgggccgatcgacgtcctttc
R1153A
PAF1-1-fw
gaattggaattcatggcgcccaccatccagacc
PAF1-399-rev
gaattgctcgagtcactttcgcatccatggcaccacc
PAF1-798-rev
gaattgctcgagtcactcttctacaggcaggaaatagg
PAF1-1197-rev
gaattgctcgagtcactcctgctcctcatctgagcc
PAF1-NLS-799-fw gaattggaattcccaaagaagaaaaggaaggtgacgttgaagaaacgaaagcggg
Klonierungen
Sämtliche Schritte während der Klonierung von Plasmidkonstrukten wurden nach gängigen molekularbiologischen Methoden durchgeführt, die den entsprechenden Methodensammlungen zu entnehmen sind (Sambrook und Russel, 2000). Diese beinhalten unter
anderem präparative und analytische Restriktionsverdaue, Ligationen, Transformationen,
alkalische Plasmidpräparationen mit 1,5 ml Volumen (Miniprep), sowie DNA- und Proteingele. Alkalische Plasmidpräparationen mit einem Volumen von 100ml wurden mit
Hilfe des Plasmid Midi-Kits der Firma Qiagen durchgeführt. Wohingegen der QiaQuick
Spin-Mini-Kit (Firma Qiagen) benutzt wurde, um besonders reine DNA für weitere Klonie96
Material und Methoden
rungen oder Sequenzierungen zu erhalten. Zur Aufreinigung enzymatisch behandelter
DNA, sowie zur Extraktion von PCR-Produkten oder verdauter DNA-Fragmente aus Agarosegelen wurde der QiaQuick Gel Extraction Kit verwendet (Firma Qiagen)oder das Zymoclean Kit (Firma Zymo Research Corporation, Irvine USA). Die Überprüfung der generierten Konstrukte erfolgte über Sequenzierung durch die Firma GATC (http://www.gatcbiotech.com) und Macrogen (http://dna.macrogen.com/ezseq/order/).
Klonierung von LNGFR-BCoR Konstrukten
Für weitere Untersuchungen bezüglich des Einflusses von BCoR auf transformierte MausKnochenmarkzellen sollte ein induzierbares BCoR Expressionssystem generiert werden.
Dabei wurde sich das Cre/loxP System zu Nutze gemacht. Hierfür wurde die für BCoR codierende cDNA 3‘ hinter eine LNGFR cDNA (Low Affinity Nerve Growth Factor) kloniert,
welche zusätzlich am 5‘ und 3‘ Ende von „loxP Sites“ flankiert sein sollte. Durch Cotransfektion der CreERT2-Rekombinase, die an die Ligandenbindungsdomäne des murinen Estrogenrezeptor fusioniert ist, und der Zugabe des Induktors 4-OHT (4-Hydroxytamoxifen:
Antiestrogen-Derivat) kommt es zur Exzision der LNGFR cDNA und somit zur Transkription
und Expression von flag-BCoR. Bei LNGFR handelt es sich um einen verkürzten Oberflächenrezeptor, ohne Signalweiterleitungsfunktion. Dieses System bietet zwei Vorteile, ohne Zugabe des Induktors sollte es ausschließlich zur Expression des LNGFR-Proteins kommen, was zusätzlich als Oberflächen- und Selektionsmarker für die Aufnahme des Konstrukts fungiert. Aufgrund der Expression dieses Oberflächenrezeptors ist es möglich, die
erfolgreich transduzierten Zellen mittels eines Antikörpers zu detektieren und über eine
MACS-Säule (Milteny BioTech GmbH, Bergisch Gladbach) aufzureinigen. Durch Zugabe
von 4-OHT liegt die Cre-Rekombinase in ihrer aktiven Form vor, was zur Exzision der
LNGFR cDNA und somit zur Expression von flag-BCoR führt.
Klonierung der MLL-ENL-Mutanten
Die für die MLL-ENL-Mutanten verwendeten cDNA-Sequenzen lagen bereits im Labor vor,
wobei die Deletion sowie die Punktmutation im MLL-Gen durch PCR sowie Overlap-PCR
eingefügt wurden. Anschließend sollten beide Mutanten sowohl mit dem kompletten ENL
als auch dem kurzen C-terminalen Fragment fusioniert werden. Alle Konstrukte sollten im
retroviralen pMSCVneo-Vektor vorliegen. Die retroviralen Konstrukte dienten der Herstel97
Material und Methoden
lung stabil transformierter Zelllinien und konnten zudem für Knochenmarkstransformationstests verwendet werden.
6.3.
Zellkultur
Zelllinien
Für Expressionstests klonierter Konstrukte, Coimmunopräzipitationen (CoIP), LuziferaseReportergenassays und die Produktion retroviraler Partikel wurden φNX-E Zellen verwendet. Dabei handelt es sich um eine von HEK293-T Zellen (humane Fibroblasten) abgeleitete humane Zelllinie, die zusätzlich die retroviralen Gene gag, pol und env für die Verpackung und Produktion retroviraler Partikel enthalten.
Für die Etablierung MLL-ENL-transformierter Suspensionszelllinien wurden ungefärbte
Dritt- bzw. Zweitrundenkolonien aus CD117-positiven (ckit+) murinen Knochenmarkzellen
(C57BL6) aus dem Knochenmarktransformationstest verwendet (siehe 6.7) (Lavau et al.,
1997).
Zellkulturmedien und Inkubationsbedingungen
Die Kultivierung adhärent wachsender Zellen erfolgte im Medium DMEM (Thermo Fisher
Scientific, USA), dem vor dessen Verwendung noch 10% fötales Kälberserum (FCS, Thermo Fisher Scientific, USA) sowie 1% Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher Scientific,
USA) zugegeben wurde. Adhärent wachsende Zellen wurden bei 37°C, 10% CO2 und 100%
relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. Im Folgenden werden diese beiden Zusätze nicht
mehr weiter erwähnt.
Die Suspensionszelllinien wurden in RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific, USA) mit 10%
FCS und 1% Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher Sientific, USA) kultiviert. Die Inkubation erfolgte bei 37°C und 7,5 CO2.
98
Material und Methoden
6.4.
Nachweis der Proteinexpression mittels Western Blot
Die transiente Proteinexpression aller klonierter Konstrukte wurde mittels Western Blot
in den eukaryontischen Zelllinien ФNX-E oder HEK293-T nachgewiesen.
Calciumphosphat Transfektion: verwendete Puffer
2x HBS pH 7,05: 50mM HEPES; 0,3M NaCl; Na2HPO4
Tabelle 3: Transfektionsmix
2,5x106 Zellen / 60mm Kulturschale
6x106 Zellen / 100mm Kulturschale
6µg Plasmid
20µg Plasmid
262µl steriles H2O
875µl steriles H2O
2µl 100mM Chloroquin (Sigma Aldrich) 5µl Chloroquin (Sigma Aldrich)
30µl 2,5mM CaCl2
100µl 2,5mM CaCl2
300µl 2x HBS
1ml 2x HBS
Calciumphosphat-Transfektion:
Für den Expressionsnachweis klonierter Konstrukte wurden am Tag vor der Transfektion
2,5x106 (6x106) φNX-E Zellen in einer 60mm (100mM) Zellkulturschale mit 5ml (10ml)
DMEM ausgesät, welches am Transfektionstag durch 3,4ml (8ml) frisches DMEM mit allen
Zusätzen ersetzt wurde.
Anschließend sollte der DNA-Transfektionsansatz zu 300µl (1ml) 2xHBS zugetropft werden, der mittels einer serologische 1ml Pipette aufgesprudelt wurde. Nach fünfsekündigem vortexen wurde der Transfektionsmix vorsichtig unter Schwenken auf die Zellen getropft. Die Inkubation erfolgte für 7-9h unter Standardbedingungen (siehe 6.3), bis das
Medium erneut gegen 5ml (10ml) frisches getauscht wurde. Am nächsten Tag erfolgte ein
erneuter Austausch des Mediums.
Zum Nachweis der Induzierbarkeit der Cre-Rekombinase sowie der anschließenden Expression von flag-BCoR/flag-BCoRΔ in transient transfizierten ɸNX-E Zellen wurde zusätzlich am Abend nach der Transfektion sowie bei jedem Medienwechsel 4-OHT in einer
Konzentration von 1µl/ml zugegeben. Die Ernte und Proteinextraktion erfolgte nach 48h.
99
Material und Methoden
Tabelle 4: verwendete Puffer: Proteinextrakte
Puffer oder Lösung
Zusammensetzung
hypotoner Lysepuffer 20mM HEPES pH 7,5; 10mM KCl; 0,5mM EDTA; 0,1 % Triton X100; 10 % Glycerol; 4mM DTT; 0,5mM Na3VO4; 2mM NaF; 1mM
PMSF; 8μg/ml Aprotinin; 20μg/ml Leupeptin; 40μg/ml PepstatinA
300mM Lysepuffer
500mM
Hypotoner Lysepuffer mit 300mM NaCl
Lysepuffer Hypotoner Lysepuffer mit 500mM NaCl, 5mM NaCl
(Nukleärextrakt)
Gesamtproteinextrakte:
Nach ca. 30 stündiger Inkubation erfolgte die Zellernte, wobei die Zellen mit 1,4ml PBS
abgelöst und in 1,5ml Eppendorf Reagenzgefäße überführt und für 2 Minuten bei 2550rcf
zentrifugiert wurden. Anschließend folgte ein zweiminütiger Zentrifugationsschritt bei
2550rcf. Das erhaltene Zellpellet wurde dann im dreifachen Pelletvolumen 300mM hypotonen Zelllysepuffer resuspendiert und für 10 Minuten auf Eis lysiert. Darauf folgte ein
zehnminütiger Zentrifugationsschritt bei 4°C und 14000rpm. Zum dreifachen Volumen
des Überstands (cytoplasmatischer Extrakt) wurde ein Volumen des 4x reduzierenden
SDS-Ladepuffers gegeben (Roti®Load, Roth). Die Extrakte wurden nun für drei Minuten
bei 95°C aufgekocht, eine Minute bei 14000rpm zentrifugiert und entweder sofort weiter
verwendet oder bei -20°C aufbewahrt.
300mM Nukleärextrakt
Die hauptsächlich im Zellkern enthaltenen mutierten MLL-ENL Fusionsproteine ohne
CxxC-Domäne, sowie beide BCoR-Isoformen konnten nur mit einem Kernextrakt isoliert
werden. Dabei wurden die Zellen nach 30 bis 48 stündiger Inkubation zunächst mit 1,4ml
PBS abgelöst und geerntet, bei 2550rcf für 2min zentrifugiert und anschließend im dreifachen Pelletvolumen hypotonen Lysepuffer resuspendiert. Nach fünfminütiger Inkubation
bei 4°C auf Eis wurde der Überstand (=cytosolische Fraktion) verworfen und der noch intakte Zellkern wiederum bei 2550rcf und 4°C für 2 Minuten zentrifugiert. Die so erhaltenen pelletierten Zellkerne wurden mit dem dreifachen Volumen an 300mM Lysepuffer für
10 Minuten auf Eis lysiert und anschließend bei 4°C und 14000rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Die im Überstand enthaltenen nukleären Proteine wurden daraufhin mit 4x redu100
Material und Methoden
zierendem SDS-Auftragspuffer (Rotiload 1, Roth, Karlsruhe) versetzt und für 5 Minuten
bei 95°C aufgekocht. Die Extrakte konnten anschließend bis zur Verwendung bei -20°C
aufbewahrt werden.
500mM Nukleärextrakt
Da die MLL-ENL Fusionsproteine ausschließlich im Zellkern exprimiert werden und darüber hinaus als DNA-interagierende Proteine stark an ihre Zielgenen binden, musste hier
ein Nukleärextrakt hergestellt werden, der es ermöglicht die Kernmembran aufzubrechen
und die darin enthaltenen Proteine zu extrahieren. Die Zelllyse erfolgte analog zur Extraktion mit 300mM Lysepuffer (siehe oben 300mM Nukleärextrakt), wobei die pelletierten
Zellkerne hier nach dem Zellaufschluss in hypotonen Lysepuffer mit dem dreifachen Volumen an 500mM Lysepuffer resuspendiert wurden.
Western Blot:
Tabelle 5: Polyacrylamidgel und Western Blot
Puffer oder Lösung
Zusammensetzung
SDS-Laufpuffer (10x)
25mM Tris pH 8,3; 192mM Glycin; 0,1%
SDS
Transferpuffer
10mM CAPS pH 11,0; 20% Methanol
MLL-Transferpuffer
10mM CAPS pH 11,0; 1% Methanol; 0,01%
SDS
TBST
10mM Tris/HCl pH 7,5; 150mM NaCl; 0,2%
Tween20
5% Blotto
TBST mit 5% Magermilchpulver
Verwendete Größenstandards

Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder: 10-260kDa (Thermo Scientific)

ColorPlus Prestained Protein Ladder, Broad Range: 10-230kDa (NEB)

Spectra Multicolor High Range Protein Ladder: 40-300kDa (Thermo Scientific)
101
Material und Methoden
Tabelle 6: verwendete Antikörper
primärer Antikörper
eingesetzte Konzentration
Monoklonaler Maus anti-flag IgG (Sigma) (1µg/µl)
3µg
Monoklonaler Maus anti-HA IgG (Sigma Aldrich) (3µg/µl)
3µg
Monoklonaler Maus anti-Rev-6 IgG (Santa Cruz) (0,1µg/µl)
1,25µg
Monoklonaler Maus anti-ER-Rezeptor IgG (ThermoFisher Scien- 1µg
tific) (0,2µg/µl)
sekundärer Antikörper
eingesetzte Menge in
µl
HRP-gekoppelter Kaninchen anti-Maus IgG (Sigma Aldrich) (10- 2µl
20µg/µl)
Die Proben wurden je nach erwarteter Größe der zu detektierenden Proteine auf ein
6%iges, 8%iges oder 10%iges 1mm diskontinuierliches SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen.
Die Extrakte sollten bei 11mA in das Sammelgel einlaufen. Anschließend wurde die
Stromstärke auf 25mA erhöht.
Daraufhin erfolgte der Transfer der Proteine mittels Wet-Blot-Verfahren auf eine Nitrocellulosemembran bei konstanten 70V für eine Stunde, unter Verwendung des MLLTransferpuffers für große Proteine oder des Transferpuffers mit 20% Methanol (siehe
oben gezeigte Tabelle 5). Daraufhin wurde die Membran für zehn Minuten in 10ml
5%igem Blotto auf dem Schüttler blockiert. Nach Zugabe des jeweiligen Primärantikörpers
erfolgte eine Inkubation über Nacht bei 4°C oder für zwei Stunden bei Raumtemperatur
auf dem Schüttler. Danach musste der Blot einmal kurz und dann für fünf Minuten mit
TBST gewaschen und in 10ml 5%igem Blotto mit dem HRP- (Meerrettichperoxidase) gekoppelten Sekundärantikörper für 45 Minuten unter Schwenken bei Raumtemperatur
inkubiert werden. Anschließend wurde die Membran einmal kurz und viermal für fünf
Minuten mit TBST gewaschen. Daraufhin erfolgte das Entwickeln der Membran durch
Zugabe von 1,5ml ECL-Lösung (Roti-Lumin 1+2, Roth, Karlsruhe) nach Angaben des Herstellers. Bei schwach exprimierten Proteinen, oder beim Auftreten einer zu geringen Signalintensität wurde der Blot erneut oder direkt mit einer Enhancer Lösung entwickelt
102
Material und Methoden
(SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Scientific). Die Detektion erfolgte am C-DiGit Blot Scanner (LI-COR Biosciences) oder durch auflegen von Röntgenfilmen für 3 Sekunden bis 10 Minuten. Die verwendeten Lösungen, Puffer und Antikörper sind unter 6.4 in den jeweiligen Tabellen aufgelistet. Für die Auswertung der mit
Hilfe des Scanners entwickelten Blots wurde die Software Image Studio Digits verwendet.
6.5.
Coimmunopräzipitationen und Western Blot
Calciumphosphat-Transfektion: siehe 6.4
Tabelle 7: verwendete Konstrukte
Konstrukt
Protein
pcDNA-HA-PAF1
N-terminales HA-getaggtes PAF1
pcDNA-HA-PAF1-1-399
N-terminales HA-getaggtes PAF1, AS 1-399
pcDNA-HA-PAF1-1-266
N-terminales HA-getaggtes PAF1, AS 1-266
pcDNA-HA-PAF1-1-133
N-terminales HA-getaggtes PAF1, AS 1-133
pcDNA-HA-PAF1-267-399
N-terminales HA-getaggtes PAF1, AS 267399; entspricht ENL-Interaktionsdomäne
pcDNA-flag-ENL
N-terminales flag-getaggtes ENL
pcDNA-flag-ENL-377nt-end
N-terminales flag-getaggtes ENL, AS 125559
pcDNA-flag-ENL-1197nt-end
N-terminales flag-getaggtes ENL, AS 400559 keine Interaktion
pcDNA-flag-ENL∆21-26-QLR18-20AAA-
N-terminales flag-getaggtes ENL, Deletion
G27A-F28Y
der AS 21-26, Punktmutationen in den AS
18-20 und 27, 28 zu Alanin
pMSCVneo-flag-ENL
N-terminales flag-getaggtes ENL
pcDNA-flag-MLL-ENL
N-terminales flag-getaggtes MLL-ENL Fusionsprotein
pcDNA-HA-Dot1L
N-terminales HA-getaggtes Dot1L
103
Material und Methoden
Tabelle 8: verwendete Beads
Bezeichnung
gekoppelter Antikörper, Herkunft
A/G-Agarose
Protein A/G (Santa-Cruz, Santa Cruz, USA)
anti-ENL-Agarose
anti-ENL (Labor Slany), 1:10000
anti-flag-Agarose
anti-flag-tag (Sigma, Taufkirchen)
CoIP: Verwendete Puffer

Hypotoner Lysepuffer: 20mM HEPES pH 7,5; 10mM KCl; 0,5mM EDTA; 0,1 % Triton X100; 10 % Glycerol; 4mM DTT; 0,5mM Na3VO4; 2mM NaF; 1mM PMSF; 8μg/ml Aprotinin; 20μg/ml Leupeptin; 40μg/ml PepstatinA

300mM Lysepuffer (300mM NaCl): hypotoner Lysepuffer mit 300mM NaCl

500mM Lysepuffer (500mM NaCl): hypotoner Lysepuffer mit 500mM NaCl

Waschpuffer (300mM Lysepuffer): hypotoner Lysepuffer mit 300mM NaCl

Waschpuffer (300mM Lysepuffer) +0,25% BSA: hypotoner Lysepuffer mit 300mM NaCl
+0,25% BSA
Coimmunopräzipitation (CoIP): Interaktionsstudien zu ENL und PAF1
Für die Coimmunopräzipitation (CoIP) wurden am Tag vor der Transfektion 6x106 ΦNX-E
Zellen in einer 100mm Zellkulturschale mit 10ml DMEM ausgesät, welche am Tag danach
mit insgesamt 20µg DNA mittels Calciumphosphat Transfektion transfiziert wurden (siehe
6.4). Nach ca. 30 Stunden konnten die Zellen laut des angegebenen Protokolls unter 6.4
geerntet und Gesamtzellextrakte hergestellt werden.
Anschließend wurden dem Gesamtzellextrakt jeweils 40µl als Input-Fraktion entnommen
und mit 10µl 5x non-reducing Sample Buffer (ThermoFisher Scientific, Bonn) versetzt, bei
65°C für 3min aufgekocht und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.
Das restliche Lysat wurde anschließend mit 15µl, der vorher 4x mit je 500µl 300mM Lysepuffer gewaschenen A/G-Agarose-Beads (Santa Cruz, Santa Cruz, USA), für 30 Minuten
bei 4°C auf dem Rotator inkubiert (Preclearing). Dieser Schritt sollte unspezifisch bindende Proteine aus dem System entfernen. Nach zweiminütiger Zentrifugation bei 4°C und
14000rpm wurde das Agarosepellet verworfen, der Überstand in ein neues EppendorfReaktionsgefäß überführt und mit ca. 12-15µl Antikörper-gekoppelten-Agarose-Beads
104
Material und Methoden
versetzt (Beads wie oben 4x mit 300mM Lysepuffer gewaschen). Die Inkubation der Extrakte erfolgte rotierend über Nacht bei 4°C (Beads siehe oben Tabelle 8). Anschließend
wurden die Proben 2min bei 4°Cund 14000rpm abzentrifugiert, das Pellet mit den gebundenen Proteinen 8x mit je 500µl 300mM Lysepuffer + 0,25% BSA, dann 2x mit 300mM
Lysepuffer gewaschen. Dabei wurde die Agarose-Lysepuffer-Suspension im letzten
Waschschritt in ein neues Eppendorf Gefäß überführt. Nach erneuter, kurzer Zentrifugation und Abnehmen des Überstandes erfolgte die Elution der gebundenen Proteine durch
die Zugabe von 40µl 300mM Waschpuffer und 10µl des 5x non-reducing Sample Buffer
(Thermo Fisher Scientific, Bonn) unter dreiminütigem Erhitzen bei 65°C. Anschließend
wurden die Proben sofort verwendet oder bei -20°C aufbewahrt.
Detektion der Interaktionen mittels Western Blot
Anschließend erfolgte die Detektion der Proteine und deren Interaktionspartner mittels
Western Blot. Hierfür sollten, um flag-getaggtes ENL nachzuweisen, je 1,5-3µl (Input) pro
Probe, 2-5µl pro Probe der CoIP, sowie für den Nachweis von HA-PAF1 10-12µl Input und
15-17µl der CoIP-Fraktion pro Probe auf ein 10-12,5%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen werden. Die Gelelektrophorese und der Western Blot erfolgten nach dem oben bereits erwähnten Protokoll (siehe 6.4). Als Primärantikörper wurden beide unter 6.2 aufgelisteten monoklonalen anti-flag-Antikörper, sowie der anti-HA-Antikörper und der zugehörige Sekundärantikörper verwendet.
CoIP: Interaktionsstudien zu MLL-, MLL-ENL-Konstrukten und PAF1
Um die Interaktion zwischen PAF1 und diversen MLL/MLL-ENL Konstrukten nachweisen
zu können ergaben sich folgende Abweichungen während der Coimmunopräzipitation: es
wurden 300mM bzw. 500mM Nukleärextrakte wie unter 6.4 beschrieben hergestellt. Die
so erhaltenen Extrakte wurden anschließend mit hypotonem Lysepuffer auf 300mM NaCl
verdünnt und nach der Präzipitation 10x mit 300mM Lysepuffer+ 0,25% BSA gewaschen.
Außerdem wurden zur Detektion der präzipitierten Proteine 5-10µl, sowie von der CoIPFraktion 10-16µl pro Probe auf ein 6-10% PAA-Polyacrylamidgel aufgetragen. Die MLLKonstrukte wurden zudem mit dem MLL-Transferpuffer geblottet.
105
Material und Methoden
6.6.
Luziferase-Assay (Rev-Assay)
Reportergenassay: verwendete Konstrukte

pGL3-HIV1-LTR: Reporterplasmid

pcDNA-Rev: Leervektor/ Negativkontrolle

pcDNA3: Leervektor
Reportergenassay: Struktur-Funktionsanalysen zur Inatkivierung von CBX8 durch ENL
Tabelle 9: Rev-Assay: ENL und CBX8
Konstrukt
Nukleotide
Aminosäuren Mutation
eingesetzte
Menge
pcDNA-Rev-CBX8
1-1167
1-389
-
1µg
pcDNA-flag-ENL
1-1679
1-559
pcDNA-flag-ENL-
370-1679
125-559
N-terminale Deletion
0,1µg
1196-1679
400-559
N-terminale Deletion
0,1µg
0,1µg
125-end
pcDNA-flag-ENL400-end
pcDNA-flag-
1-61/79-
Punktmutationen, Dele- 0,1µg
ENL∆21-26-
1679
tionen
QLR18-20AAA-
in
PAF1-
Binderegion
G27A-F28Y
Liposomen-vermittelte Transfektion: verwendete Puffer und Medien
DMEM : serumfrei, ohne FCS, ohne Pen/Strep
DMEM: mit FCS
Roti®-Fect (Roth, Karlsruhe): Transfektionsagenz
Lipofektion:
Am Tag vor der Transfektion wurden je 1,5x105 ΦNX-E-Zellen pro Well in eine 24-WellPlatte ausgesät. Das Medium wurde am Tag der Transfektion gegen 1ml frisches DMEM
ohne Antibiotika ersetzt. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Liposomenbildners Roti®Fect (Roth, Karlsruhe), einem Gemisch aus polykationischen Lipiden und einem neutralen
106
Material und Methoden
Colipid, welches DNA oder RNA zu kompakten Strukturen kondensiert, somit die Membrangängigkeit
erhöht
und
zu
einer
hohen
Transfektionseffizienz
führt
(http://www.roth.com). Die Proben sollten in Triplikaten transfiziert werden, wobei die
entsprechende Gesamt-DNA Menge für drei Wells jeweils in einem Mikrozentrifugengefäß vorgelegt wurde und anschließend in gleichen Mengen auf die Wells verteilt wurde.
Dabei sollte ein Well insgesamt 1µg Plasmid-DNA und 0,1µg DNA des Reporterpalsmids
enthalten, somit wurde für drei Wells 3µg Plasmid, sowie 0,3µg Reportergen gerechnet.
Zusätzlich wurden noch 0,1µg des Leervektorplasmids oder ein für Wildtyp-ENL bzw. mutiertes ENL codierendes Plasmid zugegeben. Die DNA-Ansätze wurden mit 5µl Roti®-Fect
pro µg zu transfizierender DNA in einem Volumen von 60µl Antibiotika- und Serumfreien
DMEM für 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden je 56µl des
Ansatzes in jedes Well getropft und für sechs Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das Medium vollständig abgezogen und durch 1ml DMEM mit allen Zusätzen
ersetzt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C im Brutschrank.
Reportergenassay: BCoR und ENL
Tabelle 10: Rev-Assay: BCoR und ENL
Konstrukt
eingesetzte Menge
pcDNA-Rev-CBX8
1µg
pcDNA-flag-ENL
0,1µg
pcDNA-flag-BCoR
1µg
pcDNA-flag-BCoR∆ 1µg
Lipofektion
Die Transfektion erfolgte analog zur oben durchgeführten, unter Verwendung derselben
Puffer, Medien und Reagenzien. Dabei wurden wiederum für ein Well 0,1µg Reporterplasmid, 1µg Plasmid-DNA mit zusätzlich 0,1µg flag-ENL oder dem Leervektor, sowie ein
für Rev-CBX8/Rev-BCoR/Rev-BCoR∆ codierendes Konstrukt cotransfiziert.
107
Material und Methoden
Reportergenassay: PAF1-Überexpression
Tabelle 11: Rev-Assay: PAF-Überexpression
Konstrukt
eingesetzte Menge
pcDNA-Rev-CBX8 1µg
pcDNA-flag-ENL
0,1µg
pcDNA-HA-PAF1
0,25 – 0,5µg
pcDNA3
0,1 – 0,5µg
Lipofektion
Die Transfektion erfolgte analog zu dem oben bereits Erwähntem, unter Verwendung
derselben Puffer, Medien und Reagenzien. Dabei wurden wiederum für ein Well 0,1µg
Reporterplasmid, 1µg Plasmid-DNA mit zusätzlich 0,1µg flag-ENL oder dem Leervektor,
sowie ein für PAF1 codierendes Konstrukt in steigender Konzentration mit der entsprechenden Menge Roti®-Fect und Serum- und Antibiotikafreiem Medium gemischt und auf
die Zellen getropft.
Reportergenassay PAF-Block
Tabelle 12: Rev-Assay: PAF-Block
Konstrukt
eingesetzte Menge
pcDNA-Rev-CBX8
1µg
pcDNA-flag-ENL
0,1µg
pcDNA-PAF-Block 0,25-0,5µg
Lipofektion
Die Transfektion erfolgte analog zu oben, unter Verwendung derselben Puffer, Medien
und Reagenzien. Dabei wurden wiederum für ein Well 0,1µg Reporterplasmid, 1µg Plasmid-DNA mit zusätzlich 0,1µg flag-ENL oder dem Leervektor, sowie ein für PAF-Block codierendes Konstrukt in steigender Konzentration mit der entsprechenden Menge Roti®Fect und Serum- und Antibiotikafreiem Medium gemischt und auf die Zellen getropft.
108
Material und Methoden
Zelllyse und Messung: verwendete Puffer und Lösungen
CCLR-Puffer: 25mM Tricine pH 7,8; 2mM EGTA; 10% Glycerol; 1% TritonX-100
10mM Luziferin: bei -80°C aufbewahrt
Zelllyse und Messung:
24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen mit je 300µl pro Well eisgekühltem 1x
CCLR-Puffer lysiert, in ein Eppendorfgefäß überführt und für 1 Minute bei 14000rpm abzentrifugiert. Anschließend wurden 10µl des Proteinextrakts in einem Luminometer (Monolight 2010, Analytical Luminoscence Laboratory) für 10 Sekunden vermessen.
6.7.
Knochenmarktransformationstest
Primäre murine hämatopoetische Vorläuferzellen wurden im Zuge diese Assays mit replikationskompetenten retroviralen Partikeln transduziert um deren Wachstum in semisolidem Methylcellulose-Medium zu beobachten. Dabei sollten die Zellen entweder durch
MLL-ENL Fusionsproteine direkt transformiert werden oder die Auswirkung verschiedener
Konstrukte auf das Transformationspotential von Zellen, die bereits mit Hilfe eines induzierbaren Systems endogenes Mll-ENL exprimieren (MEER-Maus) (Zeisig et al., 2004), untersucht werden. Mit diesem Test wird sich die Fähigkeit immortalisierter Zellen, in Methylcellulose Kolonien zu bilden, zu Nutze gemacht. Das unbegrenzte Wachstum dieser
Zellen dient als direkter Indikator für die Transformationseffizienz. Sind die hämatopoetischen Zellen jedoch nicht immortalisiert differenzieren sie aus und sind nicht in der Lage
unbegrenzt Kolonien zu bilden. Dieser Test wurde im Zuge der Forschung am MLL-ENL
Fusionsprotein etabliert (Lavau et al., 1997).
Herstellung retroviraler Partikel
Für die Herstellung retroviraler Partikel wurden am Tag vor der Transfektion pro Ansatz
6x106 ΦNX-E Zellen in 100mm Zellkulturschalen in 10ml DMEM ausgesät. Am nächsten
Tag wurde das Medium unmittelbar vor der Transfektion gegen 8ml frisches DMEM getauscht. Woraufhin der Transfektionsmix mit 20µg DNA des retroviralen Vektors (pMSCVbasierende Konstrukte) nach oben genanntem Protokoll (siehe 6.4: Calciumphosphat
109
Material und Methoden
Transfektion) unter Schwenken auf die Zellen getropft werden sollte. Nach 8 Stunden
wurde das Medium gegen 10ml frisches DMEM ersetzt. Am Tag nach der Transfektion
wurde das Medium erneut gewechselt, wobei durch Zugabe von 5ml frischem DMEM der
Virusüberstand konzentriert werden sollte. Nach weiterer Inkubation über 24 Stunden
wurde der Virusüberstand (24h Viren) abgenommen und wiederum 5ml Medium zu den
Zellen gegeben, um mit ihnen nach weiteren 24 Stunden Inkubation ebenso zu verfahren
(48h Viren). Die Überstände wurden für 5 Minuten bei 1000rpm zentrifugiert und anschließend in Aliquots von je 1,8ml bei -80°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
Isolation primärer hämatopoetischer Vorläuferzellen aus murinem Knochenmark
Aktivierungsmedium: RPMI supplementiert mit: 100μM β-Mercaptoethanol (Gibco);
10ng/ml IL-3; 10ng/ml IL-6; 100ng/ml SCF (Strathmann Biotech)
Aktivierungsmedium für MEER-Zellen: analog zu oben genanntem plus 100nM 4Hydroxytamoxifen (4-OHT)
Die Isolation der CD117+ Zellen erfolgte in den Mausstämmen C57BL6 oder MEER-Maus
[konditionelle Mll-ENL-ERtm Knock-in Modellmaus (Takacova et al., 2012)]. Dabei wurden
die Mäuse zur Knochenmarksentnahme mittels CO2-Begasung getötet, deren Tibiae und
Femora präpariert und mittels 0,4mm Kanüle mit RPMI ausgespült. Der Überstand wurde
nach fünfminütiger Zentrifugation bei 1000rpm verworfen und das Zellpellet in 3ml
PharmLyse-Buffer (BD Biosciences, New Jersey, USA) zur Erythrozytenlyse resuspendiert
und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde erneut für 5 Minuten bei 1000rpm zentrifugiert, das Pellet in 10ml MACS Puffer (PBS mit 0,5% BSA, 2mM
EDTA) aufgenommen und durch ein MACS-Zellsieb (30µm Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) vereinzelt, gezählt und nochmals zentrifugiert. Die Aufreinigung der CD117 positiven (ckit+) Zellen erfolgte nach Angaben des Herstellers mittels „magnetic activated cell
sorting“ (=MACS, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) unter Verwendung Magnetgekoppelter anti-CD117 Beads. Daraufhin wurden je 1x105 Zellen der angereicherten ckit+
Population in Aktivierungsmedium (siehe oben) aufgenommen und in Aliquots von je
200µl pro Well in einer 96-Well Spitzbodenplatte über Nacht bei 37°C inkubiert.
110
Material und Methoden
Retrovirale Transduktion
Am nächsten Tag erfolgte die Infektion der CD117 positiven Zellen mit den vorbereiteten
„24h-Virusüberständen“. Dafür wurde die 200µl Zellsuspension zu 1,8ml Virusüberstand
und 2µl Polybren gegeben und für 2,5 Stunden bei 3300rpm und 34°C zentrifugiert
(„spinokuliert“). Anschließend folgte die erneute Inkubation der in 200µl Aktivierungsmedium aufgenommenen Zellen in einer 96-Well Spitzbodenplatte über Nacht bei 37°C. Die
Transduktion mit den „48h-Virusüberständen“ erfolgte analog dazu mit den bereits einmal infizierten Zellen. Danach wurden die Zellen zwischen 4 und 48 Stunden in Aktivierungsmedium inkubiert.
Kultivierung in Methylcellulose
Der retroviralen Transduktion folgte die Kultivierung der Zellen in semisolidem Methylcellulosemedium (Methocult M3234, Stem Cell Technologies, Ottawa, Kanada). Hierfür wurden pro Ansatz 40-80µl Zellen (entspricht 2-4x104 Zellen) mit 1ml Methylcellulose mit
10ng/ml IL-3; 10ng/ml IL-6; 100ng/ml SCF; 10ng/ml GM-SCF und dem jeweiligen Antibiotikum zur Selektion unter vortexen gemischt, kurz abzentrifugiert und in eine 24-Well
Platte ausplattiert. Zur Selektion dienten Hygromycin (500µg/ml), Neomycin (500µg/ml)
und Puromycin (1µg/ml). Für Doppeltransduktionen wurde die Menge der entsprechenden Antibiotika halbiert. Bei Zellen die mit einem induzierbaren ER-Fusionskonstrukt
transduziert waren oder bei CD117-positiven Zellen der MEER-Maus mit einem induzierbaren Mll-ENL-Fusionsprotein, wurde dem Medium zusätzlich 100nM 4-Hydroxytamxifen
(4-OHT) zugesetzt. Die Inkubation erfolgte 3-4 Tage, bis eine Gelbfärbung der Methylcellulose aufgrund eines pH-Wert Anstiegs zu verzeichnen war. Zu diesem Zeitpunkt wurden
die Ansätze zum ersten Mal replattiert (2. Runde). Hierbei wurden die MethylcelluloseZellen mit 10ml RPMI gewaschen, anschließend für 5 Minuten bei 1000rpm zentrifugiert,
das Zellpellet je nach Größe in 200-500µl RPMI aufgenommen und in einer NeubauerZählkammer gezählt. In die nächste Runde wurden 2x104 Zellen in je 1ml frischer Methylcellulose mit allen Zusätzen und 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco), jedoch ohne das Selektionsantibiotikum, ausplattiert und erneut 3-4 Tage bei 37°C inkubiert. Analog dazu
erfolgt eine dritte Replattierungsrunde. Woraufhin die Kolonien mit je 100µl des Vitalfarbstoffs para-Iodonitrotetrazolium (INT 1mg/ml in PBS, Sigma) über Nacht gefärbt und
111
Material und Methoden
am nächsten Tag fotografiert. Die Koloniezahl konnte mittels der frei erhältlichen Analysesoftware „openCFU“ bestimmt werden.
6.8.
Rekombinationsnachweis mittels PCR
Um das Rekombinationsereignis nachweisen zu können, wurden die BCoR/BCoRΔ34 Zellen jeweils in Duplikaten in 2ml RPMI expandiert. Anschließend wurden die Zellen in jeweils einem Well mit 4-OHT (100nM) für 72h induziert. Danach wurde aus allen Wells ein
Teil der Zellen entnommen und DNA (DNA Blood Kit, Qiagen) sowie RNA (RNeasy SpinMini Kit Qiagen) isoliert. Die cDNA-Synthese erfolgte unter Verwendung des AffinityScript
qPCR cDNA Synthesis Kits (Stratagene) mit 1µg RNA. Die Anwendung der Kits erfolgte jeweils nach Angaben der Hersteller. Für die PCR wurden etwa 100ng DNA sowie 2μl der
1:10 verdünnten cDNA eingesetzt. Verwendet wurde der OneTaq 2X Master Mix (NEB)
sowie der Techne TC-312 Thermal Cycler mit folgendem PCR-Programm:
2min 94°C
30s 94°C
1min 58°C
35 Zyklen
2min 68°C
5min 68°C
Tabelle 13: verwendete Primer LNGFR-BCoR
Bezeichnung
Sequenz in 5‘→3‘
fw-pMSCV-1137
cgagacggcacctttaaccg
rev-hBCoR-562-542 cgcagataactagcaccattgat
Die Produkte wurden über ein 1%-iges Agarosegel, in welchem die DNA mittels Roti-Safe
Gel Stain (Roth) unter einer UV-Lichtquelle detektiert wurde, überprüft.
112
Material und Methoden
6.9.
Wachstumskurve
Wachstumskurve BCoR/BCoR∆ Zellen
Um die Proliferation der mit BCoR/BCoR∆-transduzierten MEER-Zellen bestimmen zu
können wurden in eine 24-Well Platte je 2x104 Zellen in 1ml RPMI mit 0,5x4fach Cytokinen in je sechs Ansätzen ausgesät. Dabei wurden jeweils Triplikate Ansätze der beiden
transduzierten Zelllinien mit 4-OHT induziert, um in diesen die BCoR/BCoR∆ Expression zu
ermöglichen. Anschließend wurden alle 24 Stunden je 10µl der Zellen mit 10µl Trypanblau
(Sigma Aldrich, Taufkirchen) gemischt und in einer Neubauerzählkammer gezählt sowie
Mittelwerte und Standardabweichungen aus den Triplikaten Ansätzen errechnet. Danach
wurden aus den ermittelten Mittelwerten Wachstumskurven erstellt.
6.10. Bestimmung der Zellviabilität mittels MTT-Test
Um die Anzahl der lebenden Zellen genauer bestimmen zu können wurden die
BCoR/BCoR∆ transduzierten Zellen in Duplikaten in 1ml RPMI mit 0,5fach Cytokinen ausgesät und je ein Ansatz mit 4-OHT induziert. Nach 24 stündiger Inkubation wurden die
Zellen für 2min bei 2550rcf abzentrifugiert, in 1ml frisches RPMI aufgenommen und gezählt. Anschließend wurden 5x103 Zellen in eine 96-Well Platte in je 150µl Medium ausgesät, wobei pro Zelltyp jeweils fünf Ansätze (BCoR/BCoR∆ jeweils mit und ohne 4-OHT)
ausplattiert wurden. Nach 72h Inkubation bei 37°C wurden je 10µl MTT Lösung (Sigma
M2128 in PBS, Endkonzentration 0,5mg/ml) pro Well zugegeben und für weitere 8h inkubiert. Durch Zugabe von 100µl 10%SDS in 0,005M HCl konnte die Reaktion gestoppt werden. Nach mindestens 24stündiger Inkubation bei 37°C wurde die Intensität der Färbung
mittels ELISA-Reader bestimmt werden. Für die Auswertung wurden Mittelwerte und
Standardabweichungen bei 550nm ermittelt.
113
Material und Methoden
6.11. Durchflusszytometrie
Für die durchflusszytometrische Analyse verschiedener Zelltypen oder die Expression bestimmter Oberflächenmarker wurde das FACScalibur II Durchflusszytometer (Becton Dickinson), sowie die Auswertungssoftware Cyflogic verwendet.
Analyse der BCoR/BCoR∆ Expression mit Hilfe des LNGFR Oberflächenmarkers
Tabelle 14: verwendete FACS-Antikörper
Blockierungsantikörper
Fluorochrom-Antikörper
Maus anti-CD16/CD32 (Becton Dickinson) Anti-CD271 (LNGFR)-FITC (Miltenyi Biotec)
Durch Zugabe des Induktors 4-OHT kommt es zur Exzision des für den Oberflächenmarker
LNGFR codierenden Genabschnitts der transduzierten LNGFR-BCoR Konstrukte. Dies hat
zur Folge, dass das Protein nicht mehr in den Zellen exprimiert werden kann und es somit
mit der Zeit, durch stetigen Abbau in der Zelle und Zellteilung, nicht mehr auf deren Zelloberfläche mittels Durchflusscytometer nachweisbar ist. Stattdessen wird in diesen Zellen
der 3‘ nach dem LNGFR-Lokus befindliche Genabschnitt abgelesen und synthetisiert.
Hierbei handelt es sich um einen für BCoR/BCoR∆ codierenden Sequenzabschnitt. Somit
sollte in den Zellen mit fehlender LNGFR-Sequenz eine der beiden BCoR-Varianten exprimiert werden.
Für die durchflusszytometrische Analyse wurden zunächst mit BCoR oder BCoR∆ transduzierte Zellen in Duplikaten in 1ml RPMI (+0,5x4fach Cytokine) ausgesät und jeweils eines
der Duplikate mit 4-OHT für 72h induziert. Anschließend wurden ca. 105-106 Zellen geerntet und für 2min bei 2550rcf abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 100µl PBS mit 0,1%
Natriumazid und 0,1% BSA aufgenommen und mit 1µl FC-Blockierungsantikörper und 5µl
FITC-gekoppeltem anti-LNGFR Antikörper versetzt und für 20min auf Eis unter Lichtausschluss inkubiert. Als ungefärbte Kontrolle dienten 20µl eines Zellansatzes, der nicht mit
einem fluorophor-gekoppeltem Antikörper inkubiert wurde. Anschließend wurden die
Ansätze für 2min bei 2550rcf abzentrifugiert und das Pellet in 500µl PBS mit 0,1% Natriumazid und 0,1% BSA aufgenommen. Danach erfolgte die Analyse am Durchflusszytometer.
114
Material und Methoden
Zellzyklusanaylse mittels Propidiumiodid (PI)-Färbung
PI-Lösung: 50µg/ml PI; 0,1mg/ml RNase A; 0,05% Triton X-100 in PBS
Um die unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus bzw. die Änderungen der verschiedenen
Phasen im Hinblick auf die BCoR- bzw. BCoR∆-Expression untersuchen und vergleichen zu
können, sollte eine Zellzyklusanalyse mittels PI-Färbung der chromosomalen DNA durchflusszytometrisch durchgeführt werden. PI interkaliert in die DNA und färbt diese an
(Krishan et al.; 1975). Durch die Änderung des Chromosomen-Gehalts in der Zelle während des Durchlaufens des Zellzyklus lassen sich die einzelnen Phasen anhand der unterschiedlichen Intensität der Färbung am Durchflusszytometer bestimmen.
Hierzu wurden die durch BCoR/BCoR∆ transduzierten Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit 4-OHT induziert, so dass daraus eine Zeitkinetik für 0h, 24h, 48h, 72h und
96h induzierte Zellen resultiert. Für die durchflusszytometrische Analyse wurden ca. 105106 Zellen geerntet, für 2min bei 2550rcf abzentrifugiert und das Pellet in 300µl PBS aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von 100% EtOH (Endkonzentration 70%) fixiert und für 15min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte ein erneuter Zentrifugationsschritt für 2min bei 2500rcf, woraufhin das Pellet in 300µl PI-Lösung aufgenommen und für 15min bei 37°C inkubiert wurde. Daraufhin wurde das Pellet mit 1ml PBS
gewaschen, erneut zentrifugiert und schließlich in 500µl PBS aufgenommen und am
Durchflusszytometer (FL2-H) analysiert.
.
Zellzahl
PI-Intensität/ DNA-Gehalt
Abbildung 49: Auswertung PI-Färbung. Im Histogramm ist eine Beispiel eines PI-Histogramms dargestellt.
Die Zellzahl ist dabei gegen die Intensität der Fluorszenz (DNA-Gehalt) aufgetragen. Dadurch lassen sich die
Peaks den einzelnen Zellzyklusphasen zuordnen.
115
Material und Methoden
6.12. Quantitative Realtime-PCR
Tabelle 15: verwendete Primer qRT-PCR
Primer-Bezeichnung
Sequenz (5‘→3‘)
hBCoR-563-542rev
fw-pMSCV-1137
β-Actin220-fw
β-Actin501-rev
cgcagataactagcaccattgat
cgagacggcacctttaaccg
ccaactgggacgacatggag
ctcgtagatgggcaacgtgtg
mHoxa9-378-fw
mHoxa9-611-rev
cggccttatggcattaaacctg
gagcgagcatgtagccagttg
mHoxa9-ChIP-57-fw
gcgaggtgacccctcagcaag
mHoxa9-ChIP-349-rev tgcacatcggccagatcacc
Luci-495-fw
acgttcgtcacatctcatctacc
Luci-796-rev
acattaagacgactcgaaatccac
mMeis1-129-fw
mMeis1-379-rev
mMeis-ChIP-72-fw
cctctgcactcgcatcagtac
gtttggcgaacaccgctatatc
gcagcatcgatcgtggctc
mMeis-ChIP-rev
tcaaatgcacaagccctagcg
mMyc_42-36-fw
mMyc_121-100-rev
gatgcccctcaacgtgaacttc
cgtcgcagatgaaatagggctg
RNA Isolation und cDNA Synthese
Die Isolation der Gesamt-RNA aus diversen Zelllinien erfolgte mittels RNeasy Mini Kit der
Firma Qiagen (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers. Die so isolierte RNA
wurde zum Schluss in 30µl RNase-freiem Wasser eluiert und anschließend mit DNaseI
verdaut und vermessen (DNA-free-Kit, Ambion, Austin, USA). Danach wurde je 1µg der
RNA in die cDNA-Synthese-Reaktion eingesetzt, wobei Oligo dT und „random“ Primer zu
gleichen Teilen verwendet wurden (qPCR cDNA Kit, Agilent, Santa Clara USA). Die erhaltene RNA wurde bei -80°C und die cDNA bei -20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Quantitative Realtime PCR
Für die Quantifizierung der isolierten RNA-Mengen wurde der Brilliant II SYBR®Green
QPCR Master Mix Kit der Firma Agilent (Santa Clara, USA) verwendet. Dafür wurden pro
116
Material und Methoden
Ansatz je 2µl der cDNA (unverdünnt oder 1:10 verdünnt) mit 100nM genspezifischer Primer eingesetzt, wobei alle Ansätze als technische Triplikate angesetzt und mit der
Mx3000p Real-time PCR Maschine (Stratagene, La Jolla, USA) vermessen wurden. Normalisiert wurde auf das konstitutiv exprimierte Gen β-Aktin zur Analyse der Genexpression,
oder auf die Input-Fraktion bei Chromatinimmunopräzipitationen. Die Integrität der erhaltenen Produkte konnte mit Hilfe der ermittelten Schmelzkurve oder eines Agarosegels
verifiziert werden. Die Programme wurden hierbei individuell an die spezifischen
Schmelztemperaturen der ausgewählten Primer sowie an die Länge des zu erhaltenden
Produkts angepasst.
Hoxa9/Meis1/Myc Expression/ Kompaktierung
3min 95°C
15sec 95°C
30sec 60°C
30sec 72°C
30sec 95°C
30sec 70°C
30sec 93°C
43 Zyklen
1 Zyklus
6.13. Chromatinimmunopräzipitation (ChIP)
Verwendete Puffer und Lösungen
SDS-Lysepuffer: 50mM Tris/HCl pH 8,0; 10mM EDTA pH 8,0; 1% SDS; 1mM PMSF; SIGMAProtease-Inhibitor-Mix
hypotoner Lysepuffer: 20mM HEPES pH 7,5; 10mM KCl; 0,5mM EDTA; 0,1 % Triton X-100;
10 % Glycerol; 4mM DTT; 0,5mM Na3VO4; 2mM NaF; 1mM PMSF; 8μg/ml Aprotinin;
20μg/ml Leupeptin; 40μg/ml PepstatinA
Low Salt Puffer: hypotoner Lysepuffer mit 4mM DTT
High Salt Puffer: hypotoner Lysepuffer mit 4mM DTT; 500mM LiCl
Detergenz: hypotoner Lysepuffer mit 4mM DTT; 500mM LiCl, 0,1% SDS
Elutionspuffer: 1% SDS; 0,1M NaHCO3; ad 50ml
117
Material und Methoden
Tabelle 16: verwendete Antikörper ChIP
Antikörper
eingesetzte Hersteller
Menge
polyklonaler Kaninchen anti-Ubiquityl-Histon- 2µg
Cell Signaling, Danvers, USA
H2B
polyklonaler Kaninchen anti-IgG/IgM
2µg
Thermo Fisher Scientific,
Bonn
Änderungen der Chromatinmodifikation am Hoxa9- und Meis1-Lokus
Um die Änderung der Chromatinmodifikationen während der normalen Hämatopoese
und in durch MLL-ENL transformierten malignen Vorläuferzellen am Hoxa9-Lokus analysieren zu können, wurden Knochenmarksvorläuferzellen der MEER-Maus (durch 4-OHT
induzierbares Mll-ENL-ER „knock-in“ Mausmodell) verwendet, deren Differenzierung
durch Entzug des Induktors über einen Zeitraum von 168h eingeleitet wurde. Dadurch
konnten die Änderungen der Chromatinmodifikationen am Hoxa9-Lokus im zeitlichen
Verlauf untersucht werden.
Für das „Crosslinking“ DNA-bindender Proteine oder Chromatinmodifikationen an die
DNA wurden alle 24h jeweils ca. 1x107 Suspensionszellen geerntet, mit 1ml 10% Formaldehyd versetzt und bei Raumtemperatur für 10min auf dem Rotator inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1ml 2,5M Glycin und weiterer fünfminütiger Rotation abgestoppt. Nach einem fünfminütigem Zentrifugationsschritt bei 1000rpm
wurde das Zellpellet mit 1ml PBS gewaschen und für 2min bei 2550rcf abzentrifugiert.
Nach dem vollständigen Absaugen des Überstandes wurde das Pellet in 300µl SDSLysepuffer resuspendiert, 10min bei 4°C inkubiert und anschließend viermal durch eine
0,4mm Nadel in ein frisches Eppendorfgefäß gedrückt. Durch das Sonifizieren mit dem
Biorupter der Firma Diagenode für 15 Zyklen mit jeweils 30sek „on“ und 30sek „off“ bei
5°C wurde die DNA in etwa gleichgroße Fragmente zerkleinert. Nach einem ein minütigem Zentrifugationsschritt bei 13000rpm, wurde der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit 1,2ml hypotonem Lysepuffer mit 10µl SIGMA Inhibitoren
und 10µl 100mM PMSF verdünnt. Davon wurden 50µl als Inputfraktion abgenommen und
bis zum reversen „Crosslinking“ bei -20°C aufbewahrt. Anschließend folgte das „Preclearing“ mit 11µl, vorher in 1ml hypotonen Lysepuffer gewaschenen, magnetischen IgG118
Material und Methoden
Beads pro Probe, für 30min bei 4°C auf dem Rotator. Nach erneuter Zentrifugation für
1min bei 13000rpm wurde der Überstand zu 2-5µg des präzipitierenden Antikörpers gegeben (Tabelle 16) und für 24h bei 4°C unter Rotation inkubiert. Am folgenden Tag wurden 25µl vorher gewaschene magnetische IgG-Beads zu jeder Probe gegeben und für weitere 24h bei 4°C inkubiert. Danach wurden die Proben jeweils zweimal mit 480µl der folgenden gekühlten Puffer in angegebener Reihenfolge gewaschen und der Überstand verworfen: Low Salt Puffer, High Salt Puffer, Detergenz und TE 80/10. Während des letzten
Waschschritts mit TE wurden die Beads resuspendiert und in ein neues Reaktionsgefäß
überführt. Anschließend wurde das erste Mal mit je 100µl Elutionspuffer pro Probe unter
15minütiger Inkubation auf dem Rotator bei Raumtemperatur eluiert. Nach kurzer Zentrifugation folgte die zweite Elution mit wiederum 100µl Elutionspuffer für 1min bei 65°C
und 15min bei Raumtemperatur auf dem Rotator. Danach wurden beide Eluate vereinigt
und es folgte das „reverse Crosslinking“ durch Zugabe von je 8µl NaCl pro Probe über
Nacht bei 65°C. Gleichzeitig wurde die vorher abgenommene Inputfraktion mit 150µl Elutionspuffer und 8µl 5M NaCl versetzt und ebenfalls bei 65°C über Nacht inkubiert. Am
nächsten Tag erfolgte der Proteinase K Verdau durch Zugabe von 4µl 0,5M EDTA, 8µl 1M
Tris pH 6,8 und 1µl Proteinase K (20mg/ml; Roth, Karlsruhe) zu jeder Probe und Inkubation für 1h bei 45°C. Die Aufreinigung der präzipitierten DNA erfolgte mittels des Gel
Extraction Kits der Firma Qiagen (Qiagen, Hilden). Hierzu wurde das 5fache Volumen
(1000µl) an PB Puffer zu jeder Probe gegeben und über eine Qiagen Säule aufgereinigt.
Nach dem Waschen der Säule mit 750µl PE Puffer folgte die Elution der DNA nach einminütiger Inkubation bei Raumtemperatur in 50µl EB Puffer. Danach wurde die erhaltene
DNA bei -20°C gelagert oder unverdünnt (Präzipitat) bzw. 1:100 verdünnt (Input) in eine
quantitative Realtime-PCR eingesetzt (siehe 6.11).
Analog dazu wurde mit Zellen verfahren, die durch die generierten MLL-ENL Mutanten
transformiert wurden.
119
Material und Methoden
H2B-Ubiqutinylierung im transienten Reporterplasmid-Modell
Tabelle 17: verwendete Konstrukte im transienten Modell
Konstrukt
Nukleotide Aminosäuren Mutation
eingesetzte
Menge
pGL3-HIV-LTR
-
-
pcDNA-flag-
1-1679
1-559
370-1679
125-559
-
0,5µg
0,5µg
ENL
pcDNA-flagENL-125-end
pcDNA-Rev-
N-terminale
Deletion, 0,5µg
verminderte PAF-Bindung
1-1167
1-389
-
5µg
CBX8
Um die Rolle der Rekrutierung des PAF-Komplexes bei der H2B-Ubiquitinylierung eines
transienten Reporterplasmid identifizieren zu können, sollte zunächst eine Chromatinimmunopräzipitation in mit verschiedenen Konstrukten transient transfizierten ΦNX-E
Zellen durchgeführt werden. Hierzu wurden in eine 6-Well Platte 0,8x106 Zellen in 5ml
DMEM ausgesät und am nächsten Tag mittels Lipofektion (siehe 6.6) mit insgesamt 6µg
DNA pro Well transfiziert. Hierbei codierte der pGL3-HIV-LTR Vektor für das Reporterplasmid. Ein für Rev-CBX8 codierendes Konstrukt wurde in alle Ansätze transfiziert, sowie
zusätzlich ein für flag-ENL, mutiertes flag-ENL oder den Leervektor codierendes Konstrukt
cotransfiziert. Die DNA wurde in 150µl Serum- und Antibiotikafreiem Medium aufgenommen, sowie mit 25µl Roti®Fect (Roth, Karlsruhe) und 125µl Serum- und Antibiotikafreiem DMEM gemischt und für 25min inkubiert und anschließend auf die Zellen getropft.
Nach sechsstündiger Inkubation bei 37°C erfolgte der Austausch gegen 5ml Vollmedium
mit allen Zusätzen. Das „Crosslinking“ erfolgte nach 24 stündiger Inkubation mit 0,5ml
10% Formaldehyd und 0,5ml 2,5% Glycin wie oben beschrieben. Die Chromatinimmunopräzipitation wurde analog zu oben beschriebenem Protokoll mit 2µg des anti-Ubiquityl
Histon H2B Antikörpers durchgeführt. Anschließend wurde die DNA in eine quantitative
Realtime-PCR eingesetzt.
120
Material und Methoden
6.14. Kompaktierung des Hoxa9-Lokus
Verwendete Puffer, Lösungen und Enzyme
DNaseI Puffer mit 0,1% Triton X-100: 10mM Tris/HCl pH 7,5; 2,5mM MgCl2; 0,5mM CaCl2;
0,1% Triton X-100
DNaseI (RNase free): NewEngland Biolabs; 2000U/ml
PBS: Gibco
PBS + 3mM EDTA
0,5M EDTA pH 8,0
DNaseI Verdau
Um den Einfluss der PAF-Komplex-Rekrutierung auf den Chromatinstatus an bestimmten
MLL-ENL Zielgenen untersuchen zu können, sollte aus den MLL-ENL Mutanten transformierten Zellen (siehe 6.) chromosomale bzw. die gesamte DNA aufgereinigt und mit dem
DNA verdauenden Enzym DNaseI zwischen 0 und 60min verdaut werden. Hierbei sollten
alle durch DNA-bindende Proteine oder Histone, im Falle von kompaktierter DNA, aufgrund sterischer Hinderung unverdaut bleiben. Anschließend sollte die so erhaltene relative DNA-Menge und die Effizienz des Verdaus mittels quantitativer Realtime-PCR unter
Verwendung genspezifischer Primer bestimmt werden.
Die Transfektion der ΦNX-E Zellen erfolgte mittels Lipofektion mit 0,8x106 Zellen in 5ml
DMEM (sieh 6.6) analog zur Chromatinimmunopräzipitation unter Verwendung derselben
Konstrukte und DNA-Mengen (siehe 6.12).
Die unter 6.7 beschriebenen Vorläuferzellen einer C57BL6 Maus wurden mit den für die
verschiedenen MLL-ENL Mutanten und Wildtyp MLL-ENL codierenden Konstrukten transduziert und in Methylcellulose ausplattiert und unter Zugabe des geeigneten Antibiotikums selektioniert (siehe 6.7). Anschließend wurden die so transformierten Zellen nach
der ersten Runde nach 3-4 Tagen in 2ml RPMI mit 0,5x4fach Cytokinen aufgenommen
und für neun Tage bis zu einem Volumen von 9ml expandiert. Anschließend wurden 2x106
Zellen geerntet, für 5min bei 1000rpm abzentrifugiert und das Pellet in 1ml PBS gewaschen und erneut für 2min bei 2550rcf zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet zum
Aufschließen der Zellen in 650µl 1xDNaseI Puffer mit 0,1% Triton resuspendiert und für
5min bei 37°C inkubiert. Danach wurden 100µl der gemischten Suspension entnommen
121
Material und Methoden
und als 0min Probe mit 1µl 0,5M EDTA (5mM) und 100µl PBS mit 3mM EDTA versetzt und
auf Eis gestellt. Zu den verbleibenden Zellen in DNaseI Puffer wurden 6U DNaseI (NewEnglandBiolabs) zugegeben und für weitere 5min, 10min, 20min, 40min und 60min bei
37°C verdaut. Nach den angegeben Zeitpunkten wurden jeweils 100µl der Suspension mit
je ca. 3,3x105 Zellen entnommen und ebenfalls mit 5mM EDTA behandelt, in 100µl PBS
mit 3mM EDTA aufgenommen und auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte die Aufreinigung der chromosomalen DNA mittels des Qiagen Blood Kit (Qiagen, Hilden) nach den
Angaben des Herstellers. Dazu wurden die Ansätze zunächst mit je 200µl AL-Puffer und
20µl Proteinase K (20mg/ml) (Roth, Karlsruhe) versetzt, für 10min bi 56°C verdaut und mit
Hilfe des Kits aufgereinigt. Die so gewonnene Gesamt-DNA wurde in 50µl MQ und im eluiert.
Quantifizierung der unverdauten DNA-Menge mittels Realtime PCR
Um nun die Menge an unverdauter, also kompaktierter DNA im Zeitverlauf quantifizieren
zu können, wurden 2µl der 1:10 verdünnten isolierten DNA in eine quantitative Realtime
PCR eingesetzt. Hierfür wurden für die transformierten Zellen spezifische Primer im 5‘
UTR des Hoxa9-Lokus eingesetzt (Tabelle 15: mHoxa9-ChIP-57-fw; mHoxa9-ChIP-349-rev).
Die PCR Konditionen wurden analog zu den in 6.11 gewählt.
122
Anhang
7. Anhang
7.1.
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
AA (AS)
Aminoacid (Aminosäure)
BCL-6
B-Zell Lymphomaprotein 6
BCoR
BCL6-Corepressor
bp
Basenpaare
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
ca.
circa
CAPS
Cyclohexylaminopropansulfonsäure
cDNA
durch reverse Transkription erhaltene DNA
(„complementary DNA“)
CoIP
Coimmunopräzipitation
C-Terminus
Carboxyterminus eines Proteins
d.h.
das heißt
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxynukleotid-triphosphat
DTT
Dithiotreitol
et al.
et alii (lat.), und andere
ect.
et cetera (lat.)
EDTA
Ethylendiaminotetraacetat
ENL
Eleven-Nineteen-Leukemia Protein
FCS
fötales Kälberserum
fw
forward
g
Gramm
123
Anhang
h
Stunde
HCL
Salzsäure
IP
Immunopräzipitation
k
Kilo
l
Liter
µ
Mikro
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
m
Meter
MCS
multiple cloning site
met
Methylierung
min
Minute
ml
Milliliter
MLL
Mixed-Lineage-Leukemia Protein
MLL-ENL
Fusionsprotein aus MLL und ENL
mM
Millimolar
mm
Millimeter
mol
Mol
mRNA
Messenger RNA
MSCV
Murine Stem Cell Virus
n
Nano
NaCl
Natriumchlorid
N-Terminus
Aminoterminus eines Proteins
p
Piko
PAF
Polymerase Associated Factor
Pen/Strep
Penicillin / Streptomycin
PCR
polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion
pH
negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
124
Anhang
pmol
Pikomol
%
Prozent
RNA
Ribonukleinsäure
sek.
Sekunde
SDS
Sodiumdodecylsulfat
Tris
Trishydroxymethylaminomethan
U
Units (=Einheiten)
Ub
Ubiquitinylierung
z.B.
zum Beispiel
125
Anhang
7.2.
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7.3.
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung des MLL-Wildtypproteins. .................................................. 8
Abbildung 2: Schematische Darstellung des MLL-Wildtypproteins und MLL-Fusionsproteins. ...... 10
Abbildung 3: Schematische Darstellung der normalen (oben) und malignen. ................................ 11
Abbildung 4: Schematische Darstellung des ENL-Wildtypproteins.................................................. 12
Abbildung 5: Schematische Darstellung des rekrutierten EAP-Komplexes. .................................... 14
Abbildung 6: Schematische Darstellung von PRC1 und PRC2 und deren enzymatische. ................ 17
Abbildung 7: Schematische Darstellung der längsten BCoR-Variante und seinen Domänen.. ........ 19
Abbildung 8: Schematische Darstellung des BCoR-Repressorkomplexes. ....................................... 21
Abbildung 9: Übersicht der Interaktionen und Funktionen des PAFc.............................................. 22
Abbildung 10: Schematische Darstellung eines „paused“ Promotors ............................................. 24
Abbildung 11: Übersicht der Funktionen des PAFc. ......................................................................... 25
Abbildung 12: Schematische Darstellung des Rev-Reportergenassays. .......................................... 28
Abbildung 13: Expressionsnachweis der generierten N-terminalen ENL ........................................ 29
Abbildung 14: Reportergenstudien mit N-terminalen ENL-Deletionsmutanten ............................. 30
Abbildung 15: Coimmunopräzipitation mit N-terminalen ENL-Deletionsmutanten und PAF1. ...... 32
Abbildung 16: Sequenz der generierten ENL∆PAF1-Mutante und der YEATS. ................................ 33
Abbildung 17: Coimmunopräzipitation mit ENL∆PAF1-Mutante und PAF1.. .................................. 34
Abbildung 18: Rev-Reportergenassay mit ENL∆PAF1-Mutante. ..................................................... 35
Abbildung 19: Rev-Reportergenassay mit PAF1 Überexpression. ................................................... 36
Abbildung 20: Coimmunopräzipitation mit PAF1-Deletionsmutanten und ENL.............................. 38
Abbildung 21: Schematische Darstellung der Inhibierung der PAF1-ENL Interaktion. .................... 39
Abbildung 22: Schematische Darstellung des PAF1-Proteins und PAF-Block (AS 267-399). ........... 39
Abbildung 23: Rev-Reportergenassay mit PAF-Block in Anwesenheit von ENL. ............................. 40
Abbildung 24: H2B-Ubiquitinylierung des Luziferase-Reportergens ............................................... 42
Abbildung 25: Schematische Darstellung des MLL-ENL-Fusionsproteins. ....................................... 43
Abbildung 26: Schematische Darstellung der generierten MLL-ENL Mutanten .............................. 45
Abbildung 27: Expression der generierten MLL-ENL Mutanten.. .................................................... 46
Abbildung 28: Schematische Darstellung des Knochenmarktransformationstest der .................... 47
Abbildung 29: Knochenmarktransformationstest mit MLL-ENL Konstrukten. ................................ 48
Abbildung 30: Expressionslevel der beiden MLL-ENL Zielgene Hoxa9 und Meis1........................... 50
Abbildung 31: H2B-Ubiquitinylierung an den Hoxa9- und Meis1-Genloci....................................... 52
Abbildung 32: Schematische Darstellung des Experiments zur Analyse.......................................... 54
138
Anhang
Abbildung 33: Hypothese zum Einfluss der PAF-Rekrutierung auf die Chromatinstruktur. ............ 55
Abbildung 34: Kompaktierungsstatus am Hoxa9-Genlokus in MLL-ENL-transduzierten ................. 56
Abbildung 35: Expressionsnachweis von Rev-BCoR und Rev-BCoR∆. .............................................. 59
Abbildung 36: Reportergenaktivität der beiden BCoR-Isoformen cotransfiziert mit ENL. .............. 60
Abbildung 37: Schematische Darstellung der generierten LNGFR-fBCoR-Konstrukte ..................... 62
Abbildung 38: Etablierung eines induzierbaren Expressionssystems zur Überexpression .............. 63
Abbildung 39: Schematische Darstellung des induzierbaren BCoR-Expressionssystems ................ 65
Abbildung 40: Etablierung eines induzierbaren Expressionssystems zur Überexpression .............. 66
Abbildung 41: Wachstumskurven der BCoR/BCoR∆ exprimierenden sowie uninduzierten ........... 68
Abbildung 42: MTT-Test von BCoR/BCoR∆ exprimierenden Zellen. ................................................ 69
Abbildung 43: Zellzyklusanalyse der BCoR-Zellen. ........................................................................... 70
Abbildung 44: Zellzyklusanalyse der BCoR∆ Zellen. ......................................................................... 71
Abbildung 45: Relative Expression von Hoxa9, Meis1 und mMyc in BCoR exprimierenden ........... 73
Abbildung 46: Expression von Hoxa9, Meis1 und mMyc in BCoR∆ exprimierenden Zellen. ........... 74
Abbildung 47: Hypothese der Inaktivierung der Polycomb-vermittelten Repression ..................... 82
Abbildung 48: BCoR als übergeordneter Repressorkomplex in der Hämatopoese. ........................ 89
Abbildung 49: Auswertung PI-Färbung. ......................................................................................... 115
7.4.
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: verwendete Plasmide ...................................................................................................... 95
Tabelle 2: verwendete Primer .......................................................................................................... 95
Tabelle 3: Transfektionsmix ............................................................................................................. 99
Tabelle 4: verwendete Puffer: Proteinextrakte ............................................................................. 100
Tabelle 5: Polyacrylamidgel und Western Blot .............................................................................. 101
Tabelle 6: verwendete Antikörper ................................................................................................. 102
Tabelle 7: verwendete Konstrukte ................................................................................................. 103
Tabelle 8: verwendete Beads ......................................................................................................... 104
Tabelle 9: Rev-Assay: ENL und CBX8 .............................................................................................. 106
Tabelle 10: Rev-Assay: BCoR und ENL ............................................................................................ 107
Tabelle 11: Rev-Assay: PAF-Überexpression .................................................................................. 108
Tabelle 12: Rev-Assay: PAF-Block................................................................................................... 108
Tabelle 13: verwendete Primer LNGFR-BCoR ................................................................................ 112
139
Anhang
Tabelle 14: verwendete FACS-Antikörper ...................................................................................... 114
Tabelle 15: verwendete Primer qRT-PCR ....................................................................................... 116
Tabelle 16: verwendete Antikörper ChIP ....................................................................................... 118
Tabelle 17: verwendete Konstrukte im transienten Modell .......................................................... 120
140
Anhang
7.5.
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich von ganzem Herzen bei meinem Doktorvater Prof. Dr.
Robert Slany für die Überlassung des sehr interessanten Themas und die sehr gute und
fürsorgliche Betreuung und Förderung während meiner Promotionszeit bedanken. Im
Besonderen möchte ich mich für die fachlichen als auch persönlichen Ratschläge, Diskussionen und Anregungen und für das stets offene Ohr bei Problemen jeglicher Art bedanken.
Herrn Prof. Dr. Manfred Marschall danke ich ganz herzlich für die Bereitschaft das Zweitgutachten zu erstellen, für die guten Ratschläge und das Interesse an meiner Arbeit.
Vielen Dank auch an Prof. Dr. Falk Nimmerjahn und Prof. Dr. Anja-Katrin Bosserhoff für
die Bereitschaft als Prüfer zu fungieren.
Darüber hinaus gilt mein Dank allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der AG Slany,
für die unterhaltsamen Stunden im Labor und die stets tatkräftige, sehr freundliche und
geduldige Unterstützung während der Promotionszeit. Im Besonderen möchte ich mich
bei Constanze Breitinger, Elisa Füller und Julia Steger, die mir als Kolleginnen und Freundinnen sehr ans Herz gewachsen sind, für die Hilfe, viele erheiternde Stunden und Gespräche im Labor, Schreibraum und auch im privaten Umfeld bedanken.
All meinen Freunden möchte ich für das stets offene Ohr und die gebotene Ablenkung
während dieser Zeit danken.
Für alle computertechnischen Hilfestellungen und die Geduld dabei danke ich Norman.
Ganz besonders gilt mein Dank an dieser Stelle Stefan, der mich während des Studiums
und der Promotionszeit immer unterstützt und aufgebaut hat und stets für mich da war.
Abschließend danke ich meiner ganzen Familie, im Besonderen meinen Eltern und meiner
Schwester, die mich durch alle Höhen und Tiefen begleitet haben und immer hinter mir
standen. Mein größter Dank gilt meiner Schwester Anna, die immer für mich da war und
ist und mich während der doch sehr anstrengenden Schreibphase ertragen und unterstützt sowie immer neu motiviert hat.
141
Anhang
7.6.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name, Vorname
Straße
PLZ/ Wohnort
Email
Geburtsdatum
Familienstand
Hetzner Katrin
Braunsbacher Str. 24
90765 Fürth
[email protected]
30.11.1987
ledig
Akademischer und Beruflicher Werdegang
seit 10/2012
Promotion an der naturwissenschaftlichen Fakultät (AG Robert Slany)
wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Lehrstuhl für
Genetik im Fachbereich „Molekulare Tumorforschung“ mit dem Ziel der
Promotion zum Dr. rer. nat. in 2016
Dissertationsthema: Der Polycomb-Repressive-Komplex als transkriptionelle Barriere bei der Leukämogenese durch MLL-Fusionsproteine
erlernte molekularbiologische Methoden: PCR, Realtime PCR, DNAund Proteinaufreinigungen, FACS, Fluoreszenzmikroskopie, KonfokaleLasermikroskopie, Western Blot, ELISA, ChIP, CoIP, Arbeiten mit verschiedenen Bakterien und eukaryontischen Zellkulturen, tierexperimentelle Versuche, Knochenmarktransformationstests, Klonierungen
10/2010 – 10/2012
Masterstudium Zell- und Molekularbiologie (Master of Science: 1,4)
an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Spezialisierungen in den Bereichen Virologie, Immunologie, Mikrobiologie und molekulare Onkologie, Genetik
Masterarbeit: Lehrstuhl für Genetik im Fachbereich molekulare Tumorforschung
Thema: BCL-6-Corepressor (BCoR) und seine Rolle bei der leukämischen
Transformation myeloischer Zellen
09/2011 – 11/2011
Externes Praktikum: Abteilung für molekulare Onkologie am Helmholtz
Zentrum München (AG Gires) (9 Wochen)
Thema: Untersuchung der Regulation von CyklinD1 durch den Tumorund Stammzellmarker EpCAM und dem Adapterprotein FHL2
10/2007 – 09/2010
Bachelorstudium Biologie (Bachelor of Science)
an der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Bachelorarbeit: Lehrstuhl für Genetik im Fachbereich molekulare Tumorforschung
Thema: Untersuchungen zum Transaktivatorpotential des HOXA9Proteins
142
Anhang
Schulische Ausbildung
09/1998 – 06/2007
Helene-Lange-Gymnasium Fürth,
mit Erwerb der allgemeinen Hochschulreife am 29.06.2007
Nebenberufliche Tätigkeiten
seit 04/2016
Ehrenamtliche Tätigkeit: Kinderbetreuung in einer Flüchtlingsunterkunft
Firma: Freiwilligen Zentrum Fürth
05/2008 – 09/2011
Tätigkeit als Check-In-Agent am Flughafen Nürnberg
Firma: Faulhaber-Remke-Services GmbH
09/2007 – 04/2008
Tätigkeit als Ramp-Agent am Flughafen Nürnberg
Firma: Faulhaber & Partner
Zusatzqualifikationen
Sprachen
EDV-Kenntnisse
Versuchstierkunde
Interessen
Englisch: fließend in Wort und Schrift
Französisch: Grundkenntnisse
Spanisch: Grundkenntnisse
Microsoft Office (Word, Power Point, Excel), Corel Draw, CellQuest,
Cyflogic, Bioanalytische Tools: ständig in Anwendung
erfolgreiche Teilnahme am Seminar: „Einführung in die Versuchstierkunde und tierexperimentelle Technik“ der Kategorie B-FELASA
Joggen und Fitness, Skifahren, Kino, Freunde und Familie treffen, Lesen,
Kochen, Reisen
Publikationsliste
Garcia-Cuellar MP, Füller E, Mäthner E, Breitinger C, Hetzner K, Zeitlmann L, Borkhardt A, Slany RK
(2014): Efficacy of cyclin-dependent-kinase 9 inhibitors in a murine model of mixed-lineage leukemia.
Leukemia.; 28(7):1427-35
Steger J, Füller E, Garcia-Cuellar MP, Hetzner K, Slany RK (2015): Insulin-like growth factor 1 is a direct
HOXA9 target important for hematopoietic transformation. Leukemia.; 29(4): 901-908
Garcia-Cuellar MP, Steger J, Füller E, Hetzner K, Slany RK (2015): Pbx3 and Meis1 cooperate through
multiple mechanisms to support Hox-induced murine leukemia. Haematologica.; 100(7): 905-913
143
Anhang
7.7.
Schriftliche Versicherung
Ich versichere, dass ich diese Promotionsarbeit ohne fremde Hilfe und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Quellen angefertigt habe und dass die Arbeit in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegen hat. Alle Ausführungen, die wörtlich oder sinngemäß übernommen wurden,
sind als solche gekennzeichnet.
Fürth, den 14.06.2016
Katrin Lisa Hetzner
144