Inhaltsverzeichnis
Werbung
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Parvovirus B19 1 1.1.1 Entdeckung und historische Entwicklung 1 1.1.2 Taxonomie 1 1.1.3 Morphologie 2 1.1.4 Genomstruktur und Sequenzvariabilität 3 1.1.5 Virusproteine 5 1.1.5.1 Strukturproteine VP1 und VP2 5 1.1.5.2 Nichtstrukturprotein NS1 5 1.1.5.3 Weitere Nichtstrukturproteine 6 1.1.6 Epidemiologie und Übertragungswege 6 1.1.7 Infektionsverlauf und Virusreplikation 7 1.1.8 Krankheitsbilder 9 1.1.9 1.2 1.3 1 1.1.8.1 Ringelröteln 1.1.8.2 Transiente aplastische Anämie 10 1.1.8.3 Hydrops fetalis und intrauteriner Kindstod 10 1.1.8.4 Weitere assoziierte Krankheitsbilder 11 1.1.8.5 Gewebepersistenz von Parvovirus B19 12 Immunantwort 9 13 1.1.9.1 Humorale Phase 13 1.1.9.2 Zelluläre Phase 14 1.1.10 Diagnostische Verfahren 15 1.1.11 Therapie 15 Zellkultur 16 1.2.1 Vermehrung von B19V in der Zellkultur 16 1.2.2 Kurzgefasste Darstellung der Erythropoese 17 Zielsetzung der Arbeit 18 I http://d-nb.info/1035381583 Inhaltsverzeichnis 2 Material 19 2.1 Chemikalien und Reagenzien 19 2.2 Geräte und technische Hilfsmittel 19 2.3 Zellkulturen und Nährmedien 20 2.3.1 PBMCs 20 2.3.2 Antikörperproduzierende Hybridomzelllinien 21 2.4 Virämisches Blutplasma für die B19V-Infektion 22 2.5 Humane Blutseren für die B19V-Neutralisationsexperimente 23 2.6 Durchflusszytometrie 23 2.6.1 Reagenzien und Lösungen 23 2.6.2 Fluoreszenzfarbstoffgekoppelte Antikörper 24 2.6.3 Durchflusszytometer und Auswertesoftware 24 3 Methoden 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 25 Zellkultur 25 3.1.1 Gewinnung der PBMCs aus Vollblut 25 3.1.2 Kultivierung der PBMCs 26 Weitere Komponenten für die Infektionsansätze 26 3.2.1 Gewinnung der monoklonalen Antikörper 26 3.2.2 Herstellung der Fab-Fragmente 27 3.2.3 Serumproben von Probanden und Patienten 27 + Infektion der CD36 erythroiden Vorläuferzellen 29 3.3.1 Allgemeines Schema 29 3.3.2 Infektion mit temperaturbehandeltem Virus 29 Durchflusszytometrie 30 3.4.1 Allgemeines Prinzip 30 3.4.2 Analyse der Zelldifferenzierung 31 3.4.3 Analyse der Infektionsrate 32 Datenverarbeitung 33 II Inhaltsverzeichnis 4 Ergebnisse 4.1 34 Übersicht über die Vorgehensweise 34 4.2 Vorbemerkung zur Darstellungsweise der Messwerte 35 4.3 Charakterisierung der Zelldifferenzierung 35 4.3.1 Zellzahl im Kulturverlauf 35 4.3.2 Zelldifferenzierung im Kulturverlauf 36 4.4 4.5 4.6 + Infektion der CD36 Zellen mit Parvovirus B19 38 4.4.1 Einfluss der Zelldifferenzierung a u f die Infizierbarkeit 38 4.4.2 Infektion mit unterschiedlichen Viruskonzentrationen 40 4.4.3 Infektion mit unterschiedlichen Inkubationszeiten 42 4.4.4 Einfluss der Temperaturbehandlung a u f die B19V-Infektiosität 43 B19V-Neutralisation mit monoklonalen VP1-, VP2- und NS1-spezifischen Antikörpern 46 B19V-Neutralisation mit Fab-Fragmenten der monoklonalen Antikörper 48 4.6.1 Berechnung der mittleren inhibitorischen Konzentration (IC50) der MAbs und ihrer Fab-Fragmente 4.7 B19V-Neutralisation mit humanen Seren 51 4.7.1 Seropositive und -negative Probanden 52 4.7.2 Patienten mit chronischer Parvovirus-B19-Virämie 54 4.7.2.1 Fallbeispiel Patientin SvS 55 4.7.2.2 Fallbeispiel Patientin SiSt 57 4.7.2.3 Exemplarische Darstellung einzelner Patientenproben ohne Verlaufskontrollen 4.7.3 59 Neutralisationskapazität von B19V-spezifischem IgG und IgM in verschiedenen Phasen der Infektion 4.8 49 Berechnung der Verfälschung durch virämisches Probenmaterial 62 65 III Inhaltsverzeichnis 5 Diskussion 5.1 66 Kulturverlauf und Differenzierung der Zellen 66 5.2 Analyse der infizierten Zellen 67 5.3 Einfluss von Zelldifferenzierung, Viruskonzentration und Inkubationszeit auf die Infektionsrate 67 5.4 Einfluss der B19V-Temperaturbehandlung a u f die Infektiosität 68 5.5 B19V-Neutralisation mit monoklonalen VP1-, VP2- und NSl-spezifischen 5.6 Antikörpern und ihren Fab-Fragmenten 69 B19V-Neutralisation mit humanen Seren 72 5.6.1 Fallbeispiele der chronisch-virämischen Patientinnen SvS und SiSt ..72 5.6.2 Neutralisationskapazität von B19V-spezifischem IgG und IgM im Infektionsverlauf 5.7 Ausblick 74 76 Zusammenfassung 77 Abkürzungsverzeichnis 78 Literaturverzeichnis 80 Kongressbeiträge 98 Danksagung 99 Lebenslauf 101 IV
