Die Bedeutung der Mikrometastasen bei pN0 gestagten Patienten
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Aus der ABT. ALLGEMEIN- UND VISCERALCHIRURGIE DER CHIRURGISCHEN UNIVERSITÄTSKLINIK der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Die Bedeutung der Mikrometastasen bei pN0 gestagten Patienten mit Ösophaguskarzinom INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Vorgelegt 2006 von Markus Schricker geboren in Altenburg 2 Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters 1.Gutachter: Prof. Dr. med. Andreas Imdahl 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Martin Werner Jahr der Promotion: 2006 Einleitung 3 Für Martha Einleitung 4 Einleitung INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG....................................................................................................... 6 1.1 Einführung ....................................................................................................... 6 1.2 Anatomie und Physiologie des Ösophagus ..................................................... 7 1.2.1 1.3 Histomorphologischer Aufbau des Magen-Darm-Traktes ......................... 8 Ösophagus-Karzinom .................................................................................... 10 1.3.1 Ätiologie, Epidemiologie und Pathogenese ............................................ 10 1.3.2 Tumorklassifizierung............................................................................... 12 1.3.2.1 Topographische Einteilung .............................................................. 12 1.3.2.2 Stadieneinteilung und Grading ........................................................ 13 1.3.2.3 Klinische Einteilung: TNM-Stadium (Klassifikation der UICC) ......... 15 1.3.2.4 Pathologische Einteilung ................................................................. 15 1.3.3 Histologische Einteilung.......................................................................... 16 1.3.3.1 Ösophaguskarzinom vom plattenepithelialen Typ ........................... 16 1.3.3.2 Adenokarzinom des Ösophagus...................................................... 16 1.3.4 Lymphabflußwege und Metastasierung .................................................. 18 1.3.5 Diagnostik ............................................................................................... 19 1.3.6 Chirurgische Therapie ............................................................................ 21 1.3.6.1 1.3.7 Chirurgische Therapie in kurativer Zielsetzung................................ 22 Multimodale Therapie des Ösophaguskarzinoms ................................... 25 1.4 Mikrometastasen............................................................................................ 29 1.5 Zytokeratine ................................................................................................... 30 1.6 Ziel der Arbeit ................................................................................................ 31 2 MATERIAL UND METHODEN .......................................................................... 33 2.1 Patienten........................................................................................................ 33 2.2 Histologische Aufarbeitung ............................................................................ 36 5 Einleitung 2.2.1 H&E-Färbung.......................................................................................... 37 2.2.2 Immunhistochemische Färbung.............................................................. 38 2.2.2.1 LSAB-Immunhistochemie im automatisierten Verfahren (Labelled Streptavidin-Biotin) ............................................................................................ 38 2.3 3 Statistik .......................................................................................................... 41 ERGEBNISSE ................................................................................................... 42 3.1 Mikrometastasen............................................................................................ 42 3.2 Patientenevaluation und neoadjuvante Therapie........................................... 51 3.3 Prognostischer Einfluss und Korrelation ........................................................ 55 3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse ............................................................... 64 4 DISKUSSION .................................................................................................... 66 4.1 Diskussion Methodik ...................................................................................... 66 4.1.1 Diskussion des verwendeten Antikörpers AE1/AE3................................ 66 4.1.2 Diskussion der verwendeten Untersuchungsmethode............................ 68 4.2 Klinische Bedeutung ...................................................................................... 69 4.2.1 Klinische Bedeutung von Lymphknotenmikrometastasen und Zytokeratinpositivität ............................................................................................. 69 4.2.2 Bedeutung der neoadjuvanten Therapie................................................. 82 5 ZUSAMMENFASSUNG..................................................................................... 88 6 LITERATUR ...................................................................................................... 89 7 ANHANG ......................................................................................................... 103 7.1 Reagenzien.................................................................................................. 103 7.2 Geräte und Zubehör..................................................................................... 103 7.3 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................ 105 6 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Einführung Das Ösophaguskarzinom ist mit einer globalen Überlebensrate zwischen 5 und 11 Prozent ein äußerst aggressiver Tumor. Nach intentional kurativer chirurgischer Intervention werden 5-Jahre ÜLZ (Überlebenszeit, siehe Abkürzungsverzeichnis) von 20 bis 36 Prozent berichtet [34] . Wichtigster prognostischer Faktor ist die lymphogene Metastasierung. Bei 60 Prozent der Patienten liegen zum Zeitpunkt der Operation schon Lymphknotenmetastasen vor, 10 Prozent der Patienten mit einem auf die Mukosa oder Submukosa begrenzten Tumor (Stadium T1) weisen ebenfalls eine nodale Dissemination auf. Die Pathogenität dieser Erkrankung, die sich in Symptomatik und Mortalität widerspiegelt, rechtfertigt eine systematische und kontinuierliche Suche nach optimalen Therapieregimes. Beim Ösophaguskarzinom fanden sich in den letzten Jahren Änderungen hinsichtlich der histogenetischen Differenzierung mit einer Abnahme der Anzahl von Plattenepithelkarzinomen und einer Zunahme von Adenokarzinomen insbesondere des distalen Ösophagus [11] . Auch hinsichtlich des biologischen Verhaltens der Adenkarzinome konnte man während der letzten 20 Jahre eine Tendenz zu weniger gut differenzierten Tumoren mit vermehrter lymphogener Metastasierung beobachten [101]. Als Konsequenz der Einführung immunhistochemischer und molekularer Nachweismethoden in den 80er Jahren hat das Interesse an der Bedeutung der Dissemination von Tumorzellen in Lymphe und Blut deutlich zugenommen [32] . Disseminierte Tumorzellen stellen die eigentliche „minimal residual disease“ dar und sind definitionsgemäß von Mikrometastasen (MM) abzugrenzen. Letztere sind bereits Tumorzellansammlungen bis 2 mm Durchmesser, welche eine Stromareaktion des umgebenden Gewebes aufweisen und Kontakt mit Gefäßen oder dem Sinuswall des Lymphknotens haben können. Vor allem bei Patienten mit Karzinomen des Ösophagus, Magens und Dickdarms konnten MM im Knochenmark in einem Viertel aller Fälle beobachtet werden und Marker für ein metastatisches Potential darstellen [71] . O’Sullivan und Kollegen schlussfolgerten in ihrer Arbeit von 1997, dass die präoperative Identifikation von Patienten mit MM wichtig sei, da diese Patienten von einer adjuvanten Therapie profitieren könnten. 7 Einleitung Es stellt sich die Frage, ob erweiterte chirurgische Maßnahmen zur Bekämpfung der Systemerkrankung „Ösophaguskarzinom“ sinnvoll sind, und ob sich nicht eine systemische Therapie zur Verbesserung der Prognose etablieren lässt. In Studien konnte die alleinige Chemotherapie nur selten eine komplette pathohistologisch nachgewiesene Remission nach sich ziehen und die Prognose nicht verbessern [104] , die alleinige Strahlentherapie bei Patienten mit potentiell kurativ zu behandelnden Tumoren ergab Überlebenszeit) ebenfalls [33] keine Verbesserung der 2-ÜLZ (Zwei-Jahre- . Eine vor der chirurgischen Therapie zu verabreichende kombinierte neoadjuvante Therapie könnte Tumoren verkleinern, somit einer möglichen kurativen Intervention zugänglich machen und damit die maligne Systemerkrankung kontrollierbar halten [101] . Ob die Inzidenz von MM als Marker der frühen lymphogenen Aussaat dadurch ebenfalls verringert werden kann, wurde bisher in nur wenigen Studien aufgegriffen. 1.2 Anatomie und Physiologie des Ösophagus Die Speiseröhre (Ösophagus), ein etwa 22 bis 25 cm langer muskulärer Schlauch, verläuft dorsal der Luftröhre und ventral der Wirbelsäule. Die Speiseröhre ist als Teil des oberen Gastrointestinaltraktes für den Transport der bereits zerkleinerten Bissen aus dem Mund und dem Pharynx zuständig. Dabei steht die Tätigkeit der Muskelschichten des Ösophagus im Vordergrund. Die quergestreifte Muskulatur sorgt proximal für den Verschluss durch eine andauernde Kontraktion (oberer Ösophagussphinkter), während des Schluckakts erschlafft diese und es kommt durch vom Nervus Vagus koordinierte peristaltische Muskelbewegungen zum Transport der Nahrung in den Magen. Erleichtert wird der Ablauf der Kontraktionswellen dadurch, dass die Muskulatur im mittleren Abschnitt des Ösophagus in der Regel nicht tonisiert ist. Den Übergang zum Magen bildet der untere Ösophagussphinkter (Kardiasphinkter), der funktioneller Natur ist. Seine tonische Kontraktion verhindert einen Reflux von Mageninhalt in die Speiseröhre. 8 1.2.1 Einleitung Histomorphologischer Aufbau des Magen-Darm-Traktes Alle Abschnitte des Verdauungskanals – Ösophagus, Magen, Duodenum, Jejunum, Ileum, Kolon, Analkanal – weisen prinzipiell den gleichen Wandaufbau auf (Abbildung 1, S.9): - Tunica mucosae • Epithelium mucosae • Lamina propria mucosae • Lamina muscularis mucosae - Tela submucosa - Tunica muscularis • Stratum circulare • Stratum longitudinale - Tunica adventitia bzw. Tela subserosa - Tunica serosa 9 Einleitung Abbildung 1: Schema zum prinzipiellen histologischen Aufbau des Verdauungskanals (aus [43]) Als intrathorakaler Muskelschlauch, der von einem unverhornten Plattenepithel ausgekleidet wird, dient der Ösophagus dem Speisetransport in den Magen. 1 unverhorntes Plattenepithel 2 Basalzellschicht der Mukosa 3 Lamina propria mucosae 4 Lamina muscularis mucosae 5 bindegewebige Submukosa 6 glattmuskuläre Muscularis propria mit einer inneren zirkulären und einer 1 2 3 4 5 6 äusseren longitudinalen Schicht. Abbildung 2: Querschnitt durch die Ösophaguswand (Quelle: © PathoPic) Die Tunica mucosa des Ösophagus wird von einem unverhornten mehrschichtigen Plattenepithel mit hohen Bindegewebspapillen ausgekleidet (Abbildung 2, S.9). In der Lamina propria mucosae, die aus lockerem Bindegewebe, Drüsen und vielen Blutund Lymphgefäßen besteht, kommen in der Nähe des Magens zahlreiche Glandulae 10 Einleitung oesophageae cardiacae vor, die den Drüsen der Kardiaregion ähneln. Die Lamina muscularis ist im Gegensatz zum übrigen Gastrointestinaltrakt relativ dick; ihre Muskelfasern verlaufen in Längsrichtung. Die Tela submucosa besteht aus lockerem Bindegewebe, das in proximalen Abschnitten des Ösophagus zahlreiche muköse Drüsen aufweist, die ihren Inhalt an die Oberfläche des Ösophagusepithels abgeben. Hier verlaufen zudem zahlreiche Gefäße, v.a. Venen, die zusammen mit denen der gefäßreichen Lamina propria Teile der portokavalen Anastomose darstellen. Im funktionalen Zusammenhang mit der Tunica mucosa bildet die Tela submucosa bis zu 10 Längsfalten im Ösophagus aus, die beim Transport von Speisen ausgeglichen werden. Die Tunica muscularis besteht im oberen Drittel des Ösophagus aus quergestreifter und glatter, im distalen Drittel nur aus glatter Muskulatur. Die Muskelfasern laufen in ab- und aufsteigenden Schrauben gegenläufig, so dass sie sich überkreuzen. Nur in der Nähe des Magens - im abdominellen Anteil des Ösophagus - findet sich ein Serosaüberzug, sonst ist der Ösophagus über eine Adventitia mit dem umgebenden Gewebe verbunden. Die Lymphe des Ösophagus fließt oberhalb der Bifurkation Richtung oral und zervical, unterhalb der Bifurkation Richtung aboral und epigastrisch. 1.3 Ösophagus-Karzinom 1.3.1 Ätiologie, Epidemiologie und Pathogenese Die Überlebensrate von Patienten mit Ösophagus-Karzinomen ist mit einer 5-ÜLR (5Jahres-Überlebensrate) von nur 10-20% gering – selbst nach Resektion mit kurativer Intention [33] . Bei Diagnosestellung liegt meist schon ein fortgeschrittenes Tumorstadium vor. In vielen Zentren mit spezieller Erfahrung sind die Ergebnisse nach chirurgischer Resektion eines Ösophaguskarzinoms besser. Von ausgewählten Patienten, die eine ausgedehnte Lymphknotenresektion erhielten und bei denen eine R0- Resektion vorlag, wurde eine 5-ÜLR von 40% dokumentiert [2, 82]. Tabelle 1, S. 11 zeigt eine Übersicht der gastrointestinalen Tumore und die Überlebensraten in Deutschland und USA. 11 Einleitung ÜLR (in%) Deutschland Karzinom5-ÜLR (in %) USA Lokalisation 5-ÜLR 10-ÜLR Ösophagus Magen Leber Gallenwege Pankreas Dünndarm Kolon Rektum/Anus 13 19 7 14 4 55 62 60/62 15 35 11 19 7 49 59 58/65 13 34 0 13 7 32 54 48/52 Tabelle 1: relative 5- und 10-Jahres-Überlebensraten maligner Tumore nach Tumorlokalisation. (Quelle: [23]) Unter den Begriffen „Ösophaguskarzinom“ und „Karzinom des ösophago-gastralen Übergangs“ werden unabhängig vom histologischen Typ die epithelialen, malignen Neubildungen in allen Bereichen der Speiseröhre und der Kardia zusammengefasst. Das Ösophaguskarzinom geht in etwa 60 bis 70 Prozent der Fälle vom ösophagealen Plattenepithel aus. In etwa 30 bis 40 Prozent hingegen geht es von den mukösen Ösophagealdrüsen, von den Magenschleimhautheterotopien oder vom metaplastischen Zylinderepithel des Barrett-Ösophagus aus. Vereinzelt findet man neuroendokrine Tumoren des APUD-Systems, dessen Zellen der Neuralleiste entstammen. Diese Zellen besitzen die gemeinsame Fähigkeit, Amine bzw. deren Vorstufen aufzunehmen u. zu decarboxylieren („amine precursor uptake and decarboxylation“), d.h. Polypeptidhormone zu bilden [27]. Diese und andere KarzinomEntitäten, nichtepitheliale maligne Tumoren und Metastasen sind ausgesprochen selten. Histologie Häufigkeit Plattenepithelkarzinome 60 - 70 % überwiegend im mittleren und oberen Ösophagusdrittel Adenokarzinome 30 - 40 % meist im unteren Ösophagusdrittel Andere (anaplastische bzw. kleinzellige <5% Karzinome, Zylindrome, Karzinoide, Leiomyosarkome) Tabelle 2: Häufigkeiten der histologischen Subtypen des Ösophaguskarzinoms 12 Einleitung Die Inzidenz des Ösophaguskarzinom in Europa beträgt etwa 4 Fälle pro 100.000 Einwohner und Jahr. Es existieren große geographische Unterschiede: besonders häufig tritt das Ösophaguskarzinom in China, Iran und in Südafrika auf. Männer sind häufiger als Frauen betroffen; das Geschlechterverhältnis liegt bei 4:1. Die hohe Prävalenz des männlichen Geschlechtes kann wegen der Rauch- und Trinkgewohnheiten erklärt sein. Der Altersgipfel dieser Tumorentität liegt um das 65. Lebensjahr. 1.3.2 Tumorklassifizierung 1.3.2.1 Topographische Einteilung Der Ösophagus wird in einen zervikalen und einen thorakalen Anteil unterteilt, der den kurzen abdominellen Anteil mit einschließt (Abbildung 3, S.13). Der thorakale Anteil wird wiederum unterteilt in einen oberen Anteil vom Eintritt in den Thorax bis zur Trachealbifurkation; in einen mittleren Anteil von der Trachealbifurkation bis zum Hiatus und einen unteren abdominellen Anteil. Die Karzinomwahrscheinlichkeit liegt im oberen Drittel bei etwa 15 Prozent, im mittleren Ösophagusdrittel bei 45 bis 50 Prozent und im unteren Abschnitt bei 35 bis 40 Prozent. Prädilektionsstellen für das Ösophaguskarzinom sind die drei physiologischen Engen Ösophagusmundes, Höhe der Trachealbifurkation und Kardiabereich). (Bereich des 13 Einleitung Abbildung 3: topographische Einteilung des Ösophagus (nach [13]) Plattenepithelkarzinome sind im gesamten Ösophagus mit Bevorzugung des mittleren und unteren Drittels zu finden, das Adenokarzinom auf dem Boden einer Barrett-Mukosa ist im unteren Ösophagusdrittel lokalisiert. Die mit zunehmender Häufigkeit auftretenden, meist distal gelegenen Adenokarzinome sind z. T. schwer vom Kardiakarzinom des Magens zu differenzieren und können daher unter dem Oberbegriff „Karzinom des ösophago-gastralen Übergangs“ (AEGI bis AEGIII) zusammengefasst werden [65]. 1.3.2.2 Stadieneinteilung und Grading Die Stadiengruppierung (Tabelle 3, S. 14) spielt für die Indikation zur Therapie eine wichtige Rolle und hat für die Methodenwahl entscheidende Bedeutung. Für die Prognose ist unter kurativem Gesichtspunkt relevant, ob Lymphknoten befallen sind oder nicht. In Abhängigkeit vom Stadium sinken die Zahlen für die 5-ÜLR beträchtlich: Im Stadium I beträgt sie 67 Prozent, im Stadium IIa 43 Prozent, im Stadium IIb sinkt sie auf 26 Prozent. 14 Einleitung Schlechtere Zahlen sieht man im Stadium III: hier beträgt die 5-ÜLR nur noch 16 Prozent. Die Prognose für Patienten im Stadium IV ist mit 3 Prozent infaust. Stadiengruppierung Stadium 0 Tis N0 M0 Stadium I T1 N0 M0 Stadium IIA T2 N0 M0 T3 N0 M0 T1 N1 M0 T2 N1 M0 T3 N1 M0 T4 jedes N M0 Stadium IV jedes T jedes N M1 Stadium IVA jedes T jedes N M1a Stadium IVB jedes T jedes N M1b Stadium IIB Stadium III Grading G1 hoch differenziert G2 Mäßig differenziert G3 Wenig differenziert Tabelle 3: Stadieneinteilung des Ösophaguskarzinoms (nach UICC 1997 [86]) und Grading 15 Einleitung 1.3.2.3 Klinische Einteilung: TNM-Stadium (Klassifikation der UICC) T – Primärtumor Tis Carcinoma in situ T1 Tumor infiltriert Lamina propria oder Submukosa T2 Tumor infiltriert die Muscularis propria T3 Tumor infiltriert die Adventitia T4 Tumor infiltriert Nachbarorgane N - Regionäre Lymphknoten Nx Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen N l Regionäre Lymphknotenmetastasen Die Klassifikation regionärer Lymphknoten richtet sich nach der Lokalisation des Primärtumors. Zervikaler Ösophagus: Zervikale Lymphknoten einschließlich supraklavikuläre Lymphknoten. Intrathorakaler Ösophagus: Mediastinale und perigastrische Lymphknoten. Lymphknoten-Metastasen am Truncus coeliacus gelten als Fernmetastasen. M – Fernmetastasen Mx Fernmetastasen können nicht beurteilt werden M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen M1a Lymphknotenmetastasen am Truncus coeliacus M1b Andere Fernmetastasen Tumor im unteren thorakalen Ösophagus M1a Metastasen in zervikalen Lymphknoten M1b Andere Fernmetastasen Tumor im oberen thorakalen Ösophagus M1a Nicht anwendbar M1b Nichtregionäre Lymphknoten / andere Metastasen Tumor im mittleren thorakalen Ösophagus Tabelle 4: klinische Einteilung nach UICC 1997 [86] 1.3.2.4 Pathologische Einteilung Die pTNM Kategorien entsprechen der postoperativen Einteilung. Die Angabe pN0 setzt die Untersuchung von mindestens 6 Lymphknoten voraus. Zur Einstufung in das Stadium N0 müssen mindestens 6 Lymphknoten Lymphadenektomie untersucht worden sein (UICC 1997 pathologische Therapie. Einteilung nach (zusätzlicher) [86] der mediastinalen ). „ypTNM“ steht für die vorangegangener multimodaler 16 Einleitung 1.3.3 Histologische Einteilung 1.3.3.1 Ösophaguskarzinom vom plattenepithelialen Typ Aus epidemiologischen Studien geht hervor, dass in den westlichen Industrienationen für das Zustandekommen eines ösophagealen Karzinoms vom plattenepithelialen Typ exogene und endogene Faktoren verantwortlich sind. Die bekanntesten Risikofaktoren sind hochprozentiger Alkoholgenuß und Nikotinabusus. Darüber hinaus besteht bei Vitamin- und Eisenmangel (Plummer-Vinson-Syndrom), bei der Achalasie, bei häufigem Verzehr nitrosaminhaltiger Speisen und bei bekannter Keratosis palmaris et plantaris ein erhöhtes Risiko. Weiterhin ist für Patienten mit Verätzungsstrikturen des Ösophagus ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung eines Plattenepithelkarzinoms beschrieben. Umgekehrt scheint ein protektiver Effekt durch Vitamin C gegeben zu sein [7] . Die Bedeutung von Präkanzerosen für die Entstehung von Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus ist umstritten. Von wesentlicher Bedeutung ist weiterhin, dass Plattenepithelkarzinome des Ösophagus bei bis zu 5 Prozent der Patienten mit einem Zweitkarzinom einhergehen. Etwa die Hälfte dieser Zweittumoren befindet sich in den oberen Luftwegen oder der Lunge [13]. Die Lebenserwartung der Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Ösophagus hat sich bei einer 5-Jahresüberlebensrate aller Patienten zwischen 5 und 11 Prozent in den letzten Jahren nicht verbessert [73]. 1.3.3.2 Adenokarzinom des Ösophagus Die Inzidenz des Adenokarzinoms des Ösophagus hat sich in den westlichen Industrienationen mehr als bei anderen Krebserkrankungen massiv erhöht; so beispielsweise in Dänemark: von 0,3 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner und Jahr stieg 1990 die Anzahl der Neuerkrankungen auf 2,3 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner und Jahr an [16] . Damit übertrifft Inzidenz und Prävalenz des Adenokarzinoms des Ösophagus in manchen westlichen Nationen bereits die des Plattenepithelkarzinoms. Das durchschnittliche Alter zum Zeitpunkt der Diagnose liegt beim Adenokarzinom des distalen Ösophagus und ösophagogastralen Übergangs bei ca. 63 Jahren und damit etwa 10 Jahre höher als beim Plattenepithelkarzinom. Wie beim 17 Plattenepithelkarzinom besteht auch beim Einleitung Adenokarzinom eine deutliche Bevorzugung des männlichen Geschlechts [33]. Es zeigt sich eine stetige Zunahme (ca. 10 Prozent pro Jahr) im Verlauf der letzten 10 Jahre von Adenokarzinomen des Ösophagus; bei Männern unter 50 Jahre mit Ösophaguskarzinom ist das Adenokarzinom inzwischen der häufigste Tumortyp. Der so genannte Barrett-Ösophagus (auch Barrett-Syndrom oder Barrett-Dysplasie genannt) spielt eine entscheidende Rolle als Präkanzerose. In der Regel kommt es hierbei durch eine langjährige Refluxösophagitis zu einem Ersatz des ösophagusspezifischen Plattenepithels durch spezialisiertes Zylinderepithel, was mit einer Epitheldysplasie und damit einer möglichen Entartung zum Adenokarzinom einhergehen kann. Bei einer Ausdehnung von über 3 cm, dem sogenannten Endobrachyösophagus (Barrett-Syndrom) nach Refluxösophagitis, treten gehäuft Adenokarzinome des Ösophagus auf, denn bei hochgradiger Dysplasie ist bei Barrett-Ösophagus mit einer 50 %igen Karzinomwahrscheinlichkeit zu rechnen. [76] Aus prospektiven Langzeitstudien geht hervor, dass bei Patienten mit einem Endobrachyösophagus im Vergleich zur Normalbevölkerung ein ca. 100-mal höheres Risiko für die Entwicklung eines Adenokarzinoms des Ösophagus besteht. Zudem wird das Barrett-Syndrom auch als Vorstufe zur Entwicklung des Adenokarzinoms der Kardia diskutiert [13] . In der Entwicklung des Ösophaguskarzinoms vom prämalignen Stadium bis hin zum Neoplasma zeigen sich häufig heterogene genetische Alterationen. In der überwiegenden Mehrheit der Fälle konnte man eine Inaktivierung des p53-Tumorsuppressorgens und des p16-Gens in einem frühen Stadium finden, die von Defekten in Genen wie APC, Rb and cyclin D1 in späteren Stadien gefolgt wurden [74] . Aufgrund dieser genetischen Veränderungen kommt es zu einer Hyper- oder Dysgeneration des Plattenepithels, weiterführend über eine Dysplasie und Carcinoma in situ zum invasiven Karzinom, beschrieben als Dysplasie-Karzinom-Sequenz. Unter Miteinbeziehung der postoperativen Letalität und aller Tumorstadien liegt die 5ÜLR nach kompletter Resektion (R0-Resektion) beim Adenokarzinom des distalen Ösophagus bei etwa 35 Prozent. In der Subgruppe der pT1 Karzinome kann nach chirurgischer Resektion mit einer 5-Jahresüberlebenszeit von über 85 Prozent gerechnet werden, so dass diese Patienten nach dem Eingriff in der Regel als geheilt anzusehen sind [13]. 18 Einleitung 1.3.4 Lymphabflußwege und Metastasierung Für die chirurgische Behandlung des Ösophaguskarzinoms ist es besonders wichtig, Lymphknotenmetastasen der Speiseröhre gut beurteilen zu können. Maligne Neubildungen des Ösophagus verhalten sich besonders aggressiv. Der fehlende Serosaüberzug (zervikaler und intrathorakaler Oesophagus) lässt Tumore früh in das periösophageale Gewebe und benachbarte Strukturen infiltrieren. Durch die enge topographische Nähe zu Wirbelsäule, Trachea, Lungen und großen Gefäßen ist bei Läsionen dieser benachbarten Strukturen oft keine kurative Operation mehr möglich. Durch den gut verzweigten submukösen Lymphgefäßplexus kommt es schnell zu einer linearen Tumorausbreitung und zu frühzeitiger lymphogen-metastatischer Aussaat, sowohl zu lokalen als auch zu entfernten Lymphknoten. Lymphogene Schleimhautmetastasen (skip lesions) befinden sich oft in beträchtlichem Abstand zum Primärtumor. Diese Umstände führen bei über 50 Prozent der Patienten mit Ösophaguskarzinom zu einer fortgeschrittenen Erkrankung zum Zeitpunkt ihrer Diagnose [89]. Tanabe et al. untersuchten 1986 präoperativ den Lymphabfluß durch 99mTcLymphszintigraphie bei 42 Ösophaguskarzinom-Patienten [90] . Vom oberen Drittel des thorakalen Ösophagus fließt die Lymphe hauptsächlich in den Hals und das obere Mediastinum, vom mittleren Drittel zusätzlich in das Abdomen, welches als Hauptlymphabflussgebiet des unteren Drittels des thorakalen Ösophagus dient. Eine Arbeitsgruppe um Qubain konnte 2001 - vom Bereich des oberen Drittels des Ösophagus ausgehend - zeigen, dass sowohl die mediastinalen Lymphknoten des N. recurrens, als auch die zervikalen Lymphknoten mit dem lymphatischen Abfluss verbunden sind. Vor allem die oberflächlichen Lymphgefäße der Ösophaguswand drainieren via Lymphknoten des N. recurrens in die zervikalen Regionen. Wenn man den lymphatischen Abfluss bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom betrachtet, ist somit anzunehmen, dass die mediastinalen Lymphknoten des N. recurrens wichtig in der Entstehung zervikaler Metastasen sind [72]. Bei mehr als der Hälfte der Fälle bestehen zum Zeitpunkt der Operation Lymphknotenmetastasen, wobei häufig auch tumorferne Lymphknotenstationen befallen sind. Lymphknotenmetastasen sind bei Adenokarzinomen häufiger. Hämatogene Metastasen werden zum Zeitpunkt der Diagnose in bis zu 10 Prozent der Fälle beobachtet. 19 Einleitung 1.3.5 Diagnostik • • Dysphagie, Gewichtsverlust, Regurgitation, Heiserkeit Lymphknotenschwellung (axillär, nuchal, infra- und supraklavikulär) • • Basis-Laboruntersuchungen Tumormarker zur Verlaufskontrolle: SCC (Plattenepithelkarzinom) CEA (Adenokarzinom) Tumorlokalisation • • Ösophagoskopie mit Biopsie Doppelkontrast-Ösophagusröntgen Tumorinfiltration • • • • Endosonographie (ggf. mit Punktion) Computertomographie Bronchoskopie bei suprabifurkaler und zervikaler Tumorlokalisation HNO-Status (Nn. Recurrentes, Zweit-Tumor) • • • Endosonographie (ggf. mit Punktion) Computertomographie (Hals/Thorax/Abdomen) Positronen-Emissions-Tomographie (PET) • • • • • Röntgen-Thorax in 2 Ebenen Perkutane Sonographie (Hals/Abdomen) Computertomographie (Hals/Thorax/Abdomen) Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Staging-Laparoskopie bei infrabifurkaler Tumorlokalisation Anamnese Labor Lymphknotenmetastasen Fernmetastasen Tabelle 5: Diagnostik zur Stadienbestimmung bei Patienten mit Ösophaguskarzinomen (nach [8]) Der endoskopische Befund muss eine Aussage über die Höhe, Lokalisation und Längenausdehnung des Tumors enthalten. Der makroskopischen Differenzierung zwischen Frühkarzinom und fortgeschrittenem Karzinom sollte die Einteilung der Japanese Society of Diseases of the Esophagus zugrunde liegen. Bei der Bestimmung des Wachstumstyps besteht, je nach Erfahrung des Untersuchers, eine direkte Korrelation zum Tumorstadium. Im Falle eines Frühkarzinoms kann mit dem sogenannten „Lugol Staining“ (Besprühen der gesamten Ösophagusschleimhaut mit 20%ger Lugol’scher Lösung) ein multifokales Tumorwachstum ausgeschlossen bzw. nachgewiesen werden. Im Falle einer nicht passierbaren Tumorstenose sollte unter Röntgenkontrolle und ggf. zweizeitig eine Bougierung auf circa 11 mm erfolgen, um die Beurteilung der Stenose und der aboral davon gelegenen Intestinalabschnitte zumindest mit dem Kinder-Endoskop zu ermöglichen. Die generelle Empfehlung zur Dilatation ist derzeit umstritten [84]. 20 Einleitung Die Endosonographie gibt Aufschluss über die Infiltrationstiefe des Tumors in Korrelation zur TNM-Klassifikation. Bei nicht passierbaren Stenosen können dünne Ultraschallsonden weiterhelfen. Die endoskopische Beurteilung des Lymphknotenstatus ist unsicher, weil eine Differenzierung zwischen entzündlich vergrößerten und metastatisch befallenen Lymphknoten nicht sicher möglich ist. In Studien von Burian et al., Kitagawa et al. und Yasuda et al. wird die Rolle des sogenannten Sentinel-Lymphknotens diskutiert, der mit höherer Wahrscheinlichkeit Lymphknotenmetastasen vorhersagen soll [14, 48, 110] . Jedoch ist dies beim Ösophaguskarzinom durch die komplexe Lymphgefäßsituation als sehr schwierig einzuordnen. Kitagawa berichtet in seinen neuesten Studien von der Wichtigkeit des präoperativen Szintigramms beim Ösophaguskarzinom, um entfernte, nicht im Lymphabflussgebiet liegende Lymphknoten zu erfassen und daraufhin auch das Bestrahlungsfeld im Rahmen einer Radiochemotherapie individuell auszurichten [48] . Für Tumore des oberen Gastrointestinaltrakts gilt, dass mittels des „Sentinel-Lymph-Node-Mapping“ nicht nur die Standardlymphadenektomie durch Erfassung atypisch gelegener Lymphknoten verbessert werden kann, sondern dass auch eine unnötige Lymphadenektomie bei Patienten mit negativem Sentinel-Lymphknoten vermieden werden kann. Damit zeigt sich aus den ersten Untersuchungen ein fließender Übergang vom eigentlichen Prinzip des „Sentinel-Lymph-Node-Mapping“ zur „Radioimmuno-guided-Surgery“ [14]. Die Kontrastdarstellung Einordnung der (Doppelkontrasttechnik) pathologischen des Veränderungen Ösophagus in den dient zur anatomischen Gesamtzusammenhang. Zu fordern sind metrische Angaben, die eine exakte Lokalisation des Tumors in Bezug zum oberen Ösophagussphinkter, zur Trachealbifurkation und zur Kardia ermöglichen. Die perkutane Sonographie dient im Rahmen des Stagings der Fernmetastasensuche (Lymphknoten, Organmetastasen). Der Computertomographie (CT) des Thorax fällt besondere Bedeutung zur Beurteilung einer möglicher Infiltration des Tumors in umgebende Leitstrukturen zu: Aorta, Vorhof, Trachea, Hauptbronchus. Dazu ist vor allem eine gute orale Kontrastierung erforderlich. Die Tumorregion sollte dabei in Dünnschichttechnik (Spiral-CT; 3 mm Schichtdicke; Pitch 1,5; arterielle Kontrastmittelphase; gezoomte 21 Einleitung Aufnahmen) untersucht werden, um Infiltrationen in umgebende Leitstrukturen mit höherer Sicherheit beurteilen zu können. Mit der CT des Abdomens werden Organmetastasen und ferne Lymphknotenmetastasen evaluiert. Bei zervikalen Ösophagusmalignomen ist eine ergänzende CT des Halses für den Lymphknotenstatus erforderlich. Bei Adenokarzinomen der distalen Speiseröhre und vorgeplanter neoadjuvanter Therapie kann die diagnostische Laparoskopie zum Ausschluss einer Peritonealkarzinose bzw. einer intraabdominellen Tumormanifestation sinnvoll sein [51] . Etwa 80 Prozent aller Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom des Ösophagus weisen einen Nikotin- bzw. Alkoholabusus auf. Eine sorgfältige Abschätzung des Operationsrisikos spielt daher eine entscheidende Rolle. In multivariaten Analysen konnten als wichtigste Faktoren für die postoperative Morbidität und Mortalität nach Ösophagusresektion die Lungen-, Herz- und Leberfunktion nachgewiesen werden. Pulmonales System Kardiovaskuläres System Leberfunktion Nierenfunktion Ernährungsstatus • Röntgen-Thorax-Übersichtsaufnahme in zwei Ebenen • Einfache Spirometrie (FEV1 >70%) • Blutgasanalyse (paO2 >55 mmHg ) • Physiotherapie (Atemübungen, Inhalation) • Basis-EKG • Ggf. Belastungs-EKG und Echokardiographie • Cholinesterase (>2000 U/l) • Protein (>6 g/l) • Quick (>70%) • Bilirubin (<1,5 mg/dl) • Kreatinin im Serum • Kreatinin-Clearance (>60 ml/dl) Bei den in aller Regel als Folge ihrer Grunderkrankung mangelernährten Patienten kann präoperativ eine kalorische enterale oder parenterale Ernährung über mindestens 14 Tage angezeigt sein. Tabelle 6: Präoperative Untersuchungsmethoden zur Risikoabschätzung (nach [8, 13]) 1.3.6 Chirurgische Therapie Eine Verbesserung der Prognose von Patienten mit Ösophaguskarzinom kann nur durch das Erreichen einer kompletten makroskopischen und mikroskopischen Tumorentfernung (R0-Resektion) erzielt werden. Somit kommt einer präoperativen exakten Erfassung der Tumorausdehnung und einer präzisen Stadieneinteilung (Staging) eine große Bedeutung zu. Die Klassifikation der Eindringtiefe des Primärtumors (T-Kategorie), des Lymphknotenstatus (N-Kategorie) und der 22 Einleitung Fernmetastasierung (M-Kategorie) sowie der Stadiengruppierung erfolgt anhand der Richtlinien der UICC (Union Internationale Contre le Cancer). Entscheidend für die Indikation zur Operation ist die Beurteilung des Risikos des geplanten Eingriffs und die Abschätzung der Wahrscheinlichkeit einer R0-Resektion. Nur die R0-Resektion Lymphabflussgebiet) (radikale beinhaltet im Tumorentfernung Vergleich zu mit regionalem Palliativmassnahmen eine Prognoseverbesserung. Welche Therapieoption nach dem heutigen Wissensstand bei welchen Patienten in Frage kommt, wird somit durch Allgemeinstatus und Tumorstadium bestimmt. Unter therapeutisch-prognostischen Gesichtspunkten und operationstechnischen Aspekten ist folgende Klassifikation der Ösophaguskarzinome bedeutsam: • Topographisch-anatomische Tracheobronchialsystem. Trachealbifurkation Einteilung Man (infracarinal), anhand unterscheidet solche in des Bezuges Tumore Höhe oder unterhalb oberhalb zum der der Trachealbifurkation (supracarinal) und Tumore, die auf den zervikalen Ösophagusanteil beschränkt sind (zervikal). • Des weiteren hat sich Ösophaguskarzinomen die (Stadium Abgrenzung I-IIB bzw. von lokal begrenzten T1-T2/N0-N1/M0) und lokoregionär fortgeschrittenen Ösophaguskarzinomen (Stadium III bzw. T3-T4/N0-N1/M0) bewährt. 1.3.6.1 Chirurgische Therapie in kurativer Zielsetzung Das Risiko der operativen Therapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom ist auch von der Erfahrung des Operateurs und der Institution abhängig. Daher sollte die operative Therapie in Zentren mit spezieller Erfahrung in der Ösophaguschirurgie erfolgen [8] . Entscheidend für die Indikation zur Operation sind die Beurteilung des Risikos des geplanten Eingriffs und die Abschätzung der Wahrscheinlichkeit einer vollständigen Tumorentfernung (R0-Resektion). Die R0-Resektion (radikale Entfernung des Tumors mit regionalem Lymphabflussgebiet) ist die wesentliche Voraussetzung für einen kurativen Behandlungserfolg. 23 Einleitung Suprabifurkales Ösophaguskarzinom Bei T1/T2-Tumoren ist die subtotale Ösophagusresektion mit abdominaler und mediastinaler (vermutlich auch zervikaler) Lymphadenektomie (2-Feld-Dissektion) indiziert. Fortgeschrittene Tumoren (T3/T4) sind in Anbetracht ihres frühen Bezugs zum Tracheobronchialsystem lokoregional häufig nicht R0-resektabel. Sie sollten unter Studienbedingungen einer neoadjuvanten Radiochemotherapie mit dem Ziel zugeführt werden, ein Downstaging zu erreichen und sekundär die operative Therapie zu ermöglichen. Bei diesem Konzept ist mit einer Erhöhung des postoperativen Risikos zu rechnen. Infrabifurkales Ösophaguskarzinom Bei T1/T2-Tumoren ist die subtotale Ösophagusresektion mit abdominaler und mediastinaler Lymphadenektomie (2-Feld-Dissektion) indiziert. Auch im fortgeschrittenen Tumorstadium kann dieses Vorgehen erfolgen, allerdings ist bei T4Tumoren mit einem erhöhten Operationsrisiko und ungünstiger Langzeitprognose zu rechnen. Neoadjuvante Therapiemodalitäten unter Einschluss der Strahlentherapie sind derzeit in der Erprobung. Sie sind nur innerhalb kontrollierter Studien indiziert. Als Alternative kommt bei Patienten im Stadium II/III bei hohem operativem Risiko die Radiochemotherapie zur Anwendung. Prospektive randomisierte Studien zur ausschließlichen Radiochemotherapie fehlen. Zervikales Ösophaguskarzinom Bezüglich des therapeutischen Vorgehens besteht kein Konsens. Studien sind wünschenswert. Operative Technik Thorakale Plattenepithelkarzinome intrathorakalen Ösophagus mit werden dem durch umgebenden En-bloc-Resektion Fett- und des Bindegewebe einschließlich des Ductus thoracicus, ggf. der Vena azygos und adhärenter Strukturen entfernt, am besten nach rechtsseitiger Thorakotomie. Die Speiseröhre wird kranial situationsabhängig entweder in Höhe der Thoraxkuppe oder nach Freilegung am Hals reseziert. Die mediastinale und abdominelle Lymphadenektomie 24 Einleitung ist ein fester Bestandteil der Operation. Die abdominelle Lymphadenektomie umfasst die proximale Resektion der kleinen Kurvatur des Magens und die Entfernung der zoeliakalen und suprapankreatischen Lymphknoten (entsprechend Kompartment 2 bei Magenkarzinom). Als Ösophagusersatz dient der zu einem Schlauchmagen umgeformte Magen oder, sofern dieser nicht geeignet ist, ein Kolonabschnitt. Distale Adenokarzinome (BarrettKarzinome) können sowohl transthorakal als auch durch die radikale transhiatale so genannte 2-Feld-Ösophagektomie mit ausreichender Radikalität behandelt werden. Die Lymphadenektomie im unteren hinteren Mediastinum ist notwendig und kann transhiatal erfolgen. Die abdominelle Lymphadenektomie entspricht dem Vorgehen bei intrathorakalem Plattenepithelkarzinom. Bei Patienten mit hochgradiger intraepithelialer Neoplasie (Dysplasie) in einem Barrett-Oesophagus kann primär eine komplette Entfernung durch endoskopische Mukosaresektion versucht werden. Gelingt eine komplette Entfernung einer hochgradigen intraepithelialen Neoplasie (Dysplasie) durch Mukosaresektion nicht, ist abhängig vom Operationsrisiko eine Resektion zu erwägen. Der therapeutische Wert einer photodynamischen Therapie ist derzeit durch kontrollierte Studien nicht belegt [19] . Höher gelegene Adenokarzinome werden wie Plattenepithelkarzinome operiert. Lokal begrenztes Ösophaguskarzinom (Stadium I-IIB bzw. T1-T2/N0-N1/M0) Bei Patienten mit einem lokal begrenzten, infra- oder supracarinal gelegenen Ösophaguskarzinom ist eine potentiell kurative Resektion möglich. Die abdominorechts-thorakale subtotale En-bloc-Ösophagektomie mit gezielter und standardisierter 2-Feld-Lymphadenektomie (abdominal/mediastinal) stellt bei dieser Patientengruppe bei vertretbarem allgemeinen Risiko weiterhin die Therapie der ersten Wahl dar. Hiermit kann eine 5-ÜLR von ca. 40 % erzielt werden. Als Ösophagusersatz dient wiederum der zu einem Schlauchmagen umgeformte Magen oder ein Koloninterponat. Umstritten ist die transmediastinale (sogenannte stumpfe) Dissektion der Speiseröhre, da sie die Ansprüche an einen adäquat onkologischen Eingriff nicht erfüllt. Diese Methode kann jedoch im Einzelfall unter besonderen Bedingungen indiziert sein (z.B. schwere Dysplasie, Verdacht auf Mukosakarzinom, höheres Risiko bei transthorakalem Vorgehen). 25 Einleitung Lokoregionär fortgeschrittenes Ösophaguskarzinom (Stadium III bzw. T3-T4/N0N1/M0) Bei Patienten mit einem lokoregionär fortgeschrittenen Ösophaguskarzinom sind der alleinigen Chirurgie Grenzen gesetzt. Eine kurative Resektion ist in Anbetracht der Anatomie des hinteren Mediastinums oft nicht möglich. Besonders bei supracarinaler Tumorlokalisation ist die Chance einer R0-Resektion sehr fraglich. Mit einer Ausweitung des Resektionsausmaßes konnte keine Verbesserung der Ergebnisse erzielt werden. Die schlechten Resultate werden unter anderem durch niedrige Resektabilitätsraten, aber auch durch frühzeitiges Auftreten von Lokalrezidiven sowie Fernmetastasen bedingt. So wurden in den letzten Jahren zur Erhöhung der Resektionsrate und zur Senkung der lokalen und systemischen Rezidivrate unterschiedliche multimodale Therapiekonzepte verfolgt. 1.3.7 Multimodale Therapie des Ösophaguskarzinoms Die alleinige neoadjuvante (präoperative) Radiotherapie des wahrscheinlich R0resektablen Ösophaguskarzinoms ist nicht zu empfehlen [61] . Die neoadjuvante (präoperative) kombinierte Radiochemotherapie ist prinzipiell wirksam. Sie sollte bei resektablem Tumor derzeit nur innerhalb klinischer Studien eingesetzt werden. Sie wird vor allem bei lokal fortgeschrittenen suprabifurkalen Ösophaguskarzinomen angewandt. Eine intensive Supportivtherapie ist als Begleitmaßnahme wesentlich [37]. Am häufigsten angewandte Therapiemodalitäten sind die präoperative (neoadjuvante) Chemo- und Radiotherapie, allein oder in Kombination. Diese Konzepte zielen auf eine Reduktion des Tumorvolumens (Downstaging) mit konsekutiver Verbesserung der R0-Resektionsrate sowie auf die Kontrolle einer lokalen sowie okkulten systemischen Metastasierung. Nachfolgend eine Übersicht der bisher durchgeführten Studien in Abhängigkeit vom Tumorstadium Präoperative (neoadjuvante) Therapie beim lokal begrenzten Ösophaguskarzinom Die präoperative Bestrahlung wird unter folgender Zielsetzung durchgeführt: • Tumorverkleinerung und damit Steigerung der R0-Resektionsrate 26 • Einleitung Wirkung auf lokoregionäre Lymphknoten und damit Reduzierung der Lokalrezidivrate • Reduzierung einer intraoperativen Tumordissemination Bis heute wurden einige randomisierte Studien zur neoadjuvanten Radiotherapie beim Ösophaguskarzinom publiziert [5, 6, 29, 52, 70, 103] . Hierbei kamen Strahlendosen zwischen 20 und 40 Gy zum Einsatz. Keines der Verfahren führte zu einem Anstieg der Resektionsrate und der Überlebensrate im Vergleich zum alleinigen chirurgischen Vorgehen. In einer Studie konnte eine Senkung der Lokalrezidivrate nachgewiesen werden, ohne dass eine Verbesserung der Langzeitprognose erreicht wurde [70] . Eine alleinige neoadjuvante Radiotherapie kann daher nach dem derzeitigen Stand der Erkenntnisse nicht als Erfolg versprechende Behandlungsoption bei potentiell resektablen Ösophaguskarzinomen empfohlen werden [6, 61]. Ziel einer präoperativen Chemotherapie ist neben der lokalen Tumorwirkung auch die Eradikation okkulter Fernmetastasen. Die Kombination aus Cisplatin und 5-Fluorouracil ist heute das am häufigsten eingesetzte Chemotherapieprotokoll. Bisher wurden mehrere Phase-III-Studien durchgeführt [18, 46, 53, 59, 80] . Malthaner und Fenlon konnten in einem Update in „Cochrane Reviews 2003“ elf randomisierte Studien mit 2051 Patienten zur Frage der präoperativen Chemotherapie bei resektablem thorakalen Ösophaguskarzinom analysieren [60] . Dabei zeigte sich, dass präoperative Chemotherapie mit konsekutiver Chirurgie einen Überlebensvorteil nach 3, 4 und 5 Jahren aufzuweisen scheinen, eine statistische Signifikanz der präoperativen Chemotherapie plus Chirurgie versus alleiniger chirurgischer Intervention zeigte sich nur nach dem 5. Jahr bei jedem histologischen Typ. Beeinflusst werden die Ergebnisse durch die erhöhte Toxizität und Mortalität bei Chemotherapie. Eine optimale Dosisfindung ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht erreicht worden [60]. Ziele der Kombinationstherapie (kombinierte Radiochemotherapie) sind die Nutzung synergistischer Effekte im Hinblick auf die Effizienz bei gleichzeitiger Reduktion von Nebenwirkungen und die im Kombinationsregime gegenüber der Einzeltherapie reduzierten Dosierungen. Neben einer direkt strahlensensibilisierenden Wirkung einzelner Zytostatika kann ein Synergismus auch in der Überwindung von Resistenzen der Tumorzellen gegen jeweils eine der Modalitäten resultieren. Mit diesen Verfahren lassen sich zwar die lokale Tumorkontrolle verbessern und das 27 Einleitung rezidivfreie Überleben verlängern, aber bisher keine signifikante Änderung des Gesamtüberlebens erreichen. Im Vergleich zur präoperativen Chemotherapie führt die neoadjuvante Radiochemotherapie zu einer deutlichen Steigerung der histopathologisch kompletten Remissionsrate. Da aber auch die Morbidität und die postoperativen Mortalität ansteigt, wird das Gesamtergebnis (Überlebenszeit) negativ beeinflusst. [36]. Meta-Analysen von Malthaner et al. [61] und Urschel et al. [97] konnten zeigen, dass im Vergleich zur alleinigen Chirurgie die neoadjuvante Radiochemotherapie eine signifikante Verbesserung der Drei-Jahre-Überlebenszeit und eine Verringerung der lokoregionären Rezidivrate von Patienten mit resektablen Ösophaguskarzinomen erreicht. Das relativ geringe Ausmaß des Benefits könnte durch eine sorgfältige Selektion der Patienten für die neoadjuvante Therapie vergrößert werden [61] . Ein signifikanter Einfluss erhöhter Mortalität durch die neoadjuvante Radiochemotherapie wurde in den untersuchten Studien nicht bewiesen Anwendung der kombinierten [4, 12, 54, 70, 96, 101] . Die gleichzeitige Radiochemotherapie war der sequentiellen Verabreichung überlegen [97]. Präoperative (neoadjuvante) Therapie beim lokoregionär fortgeschrittenen Ösophaguskarziom Durch alleinige Bestrahlung (neoadjuvante Radiotherapie) konnte mit einer 5-ÜLR von unter 5 Prozent bei Patienten mit einem lokoregionär fortgeschrittenen Ösophaguskarzinom keine Verbesserung der Prognose erreicht werden. Nur in frühen Stadien wurden mit Gesamtstrahlendosen 45 Gy bei selektionierten Patienten 5-ÜLR von etwa 20 Prozent erzielt. Dieses Verfahren wurde in verschiedenen Phase-II- und III-Studien extensiv untersucht [18, 53, 59] . Es zeigte sich keine Steigerung der Resektionsrate und kein Einfluß auf die 5-ÜLR (9 bis 16 Prozent), so dass dieses Verfahren als alleinige Methode weitestgehend verlassen wurde. Obwohl zwei Drittel aller Patienten mit einem Ösophaguskarzinom lokal fortgeschrittene Tumorstadien aufweisen, liegt bisher keine Phase-III-Studie über den Einsatz Patientengruppe einer vor. alleinigen In neoadjuvanten verschiedenen Chemotherapie Phase-II-Studien bei wurden dieser mediane Überlebenszeiten von 11 bis 21 Monaten angegeben. Die erzielten histopathologisch dokumentierten Remissionsraten (um 10 Prozent) sind unbefriedigend. 28 Einleitung Die niedrige Rate kompletter Remissionen nach präoperativer Chemotherapie waren Anlass für deren Kombination mit einer Strahlentherapie. Auch hier sind die Erfahrungen einer präoperativen Radiochemotherapie beim lokoregionär fortgeschrittenen Ösophaguskarzinom sehr begrenzt und nur durch Ergebnisse von wenigen Studien belegt [4, 12, 36, 37, 96, 101, 102] . Die neoadjuvante Radiochemotherapie führt hiernach offensichtlich bei nicht wenigen Patienten zum Downstaging des Primärtumors und zu einer Zunahme der R0-Resektionsrate [101] . Auch scheint eine Reduktion der Lokalrezidivrate und eine Verlängerung des rezidivfreien Intervalls hierdurch möglich, allerdings bisher ohne Verbesserung der Gesamtüberlebenszeit. Grund hierfür ist vor allem eine durch die Vorbehandlung bedingte deutlich gesteigerte postoperative Morbidität und Letalität [36]. Die neoadjuvante Radiochemotherapie beim lokoregionär fortgeschrittenen Ösophaguskarzinom ist unter den oben genannten Behandlungsmodalitäten das effektivere Verfahren. Aufgrund der weiterhin relativ hohen Toxizität und damit gesteigerten postoperativen Morbidität und Mortalität ist die Suche nach neuen Modalitäten kombinierter Behandlung (z.B. lokale Hyperthermie) und der Einsatz neuer weniger toxischer zytostatischer Substanzen Aufgabe der Zukunft. Postoperative (adjuvante) Therapie Eine postoperative Strahlenbehandlung (Adjuvante Radiotherapie) wird durchgeführt, um eventuell vorhandene mikroskopische Tumorreste im Operationsgebiet oder okkulte Mikrometastasen lokoregionär in den Lymphknoten zu devitalisieren und somit eine verbesserte Lokalkontrolle zu erreichen. Von den bisher vorliegenden vier Studien [25, 92, 107, 111] zeigte nur eine Studie in der Patientensubgruppe mit pN0-Status eine signifikante Reduktion der lokoregionären Rezidivrate [92]. Übereinstimmend wird aber vermehrt über Fernmetastasen und eine hohe Toxizitätsrate berichtet. Bei keiner Patientengruppe konnte eine Verbesserung des Gesamtüberlebens erreicht werden. Eine adjuvante Radiotherapie kann anhand dieser Daten bei Patienten nach potentiell kurativer Ösophagusresektion nicht empfohlen werden. Bis heute wurde nur eine Phase-III-Studie publiziert, die eine postoperative, adjuvante Chemotherapie (Cisplatin/Vindesin) versus alleinige Chirurgie vergleicht [3]. Auch hier besteht zwischen beiden Gruppen kein signifikanter Unterschied im Gesamtüberleben, so dass dieses Vorgehen nicht empfohlen werden kann. 29 Einleitung Zur adjuvanten Radiochemotherapie liegen derzeit keine Daten vor, die ihren Einsatz außerhalb von Studien rechtfertigen. Bis heute wurde keine Phase-III-Studie publiziert, die eine definitive Radiochemotherapie versus (neoadjuvante) Radiochemotherapie beim lokoregionär fortgeschrittenen Ösophaguskarzinom vergleicht. Stadium I und allg. Operabilität Stadium II+III und allg. Operabilität Stadium I-III und allg. Inoperabilität Stadium IV Definitive Radio-ChemoTherapie Palliative Therapie Neoadjuvante Therapie Operation Abbildung 4: Stadiengerechte Therapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom nach [8] 1.4 Mikrometastasen Beim Ösophaguskarzinom stellt der Lymphknotenstatus den wesentlichen Prognosefaktor nach kompletter Tumorresektion (R0-Resektion) dar. Nach wie vor wird bei diesen Tumorentitäten die ausgedehnte Lymphadenektomie jedoch kontrovers diskutiert. Ursache hierfür ist, dass nur eine Subgruppe von Patienten von der ausgedehnten Lymphadenektomie zu profitieren scheint [14, 83] . Immunhistochemische und molekulare Untersuchungen haben isolierte Tumorzellen in histologisch unauffälligen Lymphknoten nachgewiesen und dies als Vorstufe einer späteren Metastasierung gedeutet [30] genannten (okkulte Mikrometastasen . Diese Zellen oder Zellgruppen sind von so Metastasen) zu unterscheiden. Mikrometastasen sind histologisch nachgewiesene metastatische Zellgruppen und zeigen eine Invasion des lymphoretikulären Gewebes, meist mit Proliferation und Stromareaktion, auf. histomorphologischen Sie werden abhängig Untersuchungstechnik bei von den der einzelnen Subtilität Tumoren der in unterschiedlicher Häufigkeit beschrieben [32]. Ob Mikrometastasen als Frühform der metastatischen Absiedelung in Lymphknoten prognostische Effekte aufweisen können, ist derzeit noch nicht eindeutig geklärt. 30 Einleitung Die Möglichkeiten, Mikrometastasen zu definieren, sind zahlreich. LymphknotenMikrometastasen (LK-MM) entsprechen gemäß der Definition von Jiao und Krasna sowie Cai et al. einer kleinen metastatischen Läsion (Cluster an Zellen oder Einzelzelle), die nicht mit konventionell histologischen Untersuchungsmethoden detektierbar sind [17, 41] . Die Anzahl der erforderlichen Zellen, um zur Definition „Mikrometastase“ zu gelangen, variiert bei vielen Autoren erheblich. Es erscheint sinnvoll, keine bestimmte Mengen- oder Größenangabe zu machen, sondern den direkten Vergleich von H&E-Färbung und Immunhistochemie zu suchen. Immunhistochemische Techniken mit Antikörpern gegen humanes Zytokeratin können (bei Nichtnachweisbarkeit in der konventionellen H&E-Färbung) epitheliale Tumorzellen in Lymphknoten detektieren. Dies gelang zum Beispiel bei Patienten mit [77] kolorektalem Karzinom Magenkarzinom [38] , Mammakarzinom [94] , Ösophaguskarzinom [42] und . Es existieren bisher einige Studien, die sich mit der Bedeutung von Mikrometastasen bei Patienten mit Ösophaguskarzinom auseinandersetzen. Studiengruppen von Hosch et al. Komukai et al. [50] [34] , Natsugoe et al. [66] , Izbicki et al. [39] und berichten über einen ungünstigen Effekt von nodalen Mikrometastasen auf des Überleben von Patienten nach Ösophagusresektion, während Tanabe et al. [91] , Sato et al. [79] und Glickman et al. [30] keinen Einfluss von Mikrometastasen auf die Prognose nachweisen konnten. Die möglichen Methoden, um isolierte Tumorzellen oder mikrometastatische Cluster zu detektieren, haben in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Morphologische und nichtmorphologische Untersuchungsprinzipien wurden etabliert [32] . Jedoch können nur morphologische Methoden, insbesondere die Immunhistochemie mit Zytokeratinen, den Nachweis von Mikrometastasen epithelialer Primärtumore gemäß der aktuellen Definition erbringen. 1.5 Zytokeratine Nach wie vor wird die Hämalaun-Eosin-Färbung (H&E-Färbung) zur histopathologischen Routinefärbung von Operationspräparaten genutzt. Um kleinere epitheliale Tumorzellgruppen mit dem nötigen Gewebekontrast zu differenzieren, bedient man sich schon seit vielen Jahren der immunhistochemischen Färbung mit Zytokeratin-Antikörpern. 31 Einleitung Zytokeratine sind eine Familie wasserlöslicher Proteine mit Molekulargewichten zwischen 40-70 kD, die das Zytoskelett der Epithelzellen bilden. Mindestens 19 unterschiedliche Zytokeratine sind bis heute identifiziert worden und können in zwei Unterfamilien unterteilt werden. Unterfamilie A besteht aus relativ sauren Cytokeratinen (mit einem pH unter 5,5), wogegen die Mitglieder der Unterfamilie B einen relativ basischen pH von 6 oder mehr haben. AE1/AE3 ist ein Cocktail aus zwei monoklonalen Antikörpern, die aus der Immunisierung von Mäusen mit humanen Kalluskeratinen gewonnen wurden [106] . AE1/AE3 weist die Mehrzahl humaner Zytokeratine nach und kann daher als Werkzeug für den positiven IHC-Nachweis von Zellen verwendet werden, deren Herkunft in einfachen und stratifizierten Epithelien liegt [106] [95] ). Antikörper AE1 zeigt eine Immunreaktion mit einer antigenen Determinante, die auf den meisten Cytokeratinen der Subfamilie A vorkommt, einschließlich Cytokeratinen mit der Mollschen Bezeichnung 10, 13, 14, 15, 16 und 19 (MG 56,5, 54', 50, 50', 48 bzw. 40 kD), jedoch nicht auf den Nummern 12, 17 und 18 (MG 55, 47 bzw. 45 kD) [88] . Antikörper AE3 reagiert mit einer antigenen Determinante, die den Cytokeratinen der Subfamilie B gemeinsam ist, einschließlich der Nummern 1 und 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 (MG 65, 67, 64, 59, 58, 56, 54 bzw. 52 kD) [22]. Monoclonales-Maus-Antihuman-Zytokeratin (Klone AE1/AE3) ist zum Laborgebrauch für den qualitativen Nachweis zweier Epitope mittels Lichtmikroskopie und immunhistochemischer (IHC-) Testmethoden bestimmt, die auf der Mehrzahl von Epithelzytokeratinen in azetonfixierten gefrorenen und formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben vorkommen. Positive Ergebnisse unterstützen bei der Klassifikation gesunder und neoplastischer Gewebe, die ihrer Herkunft nach Epithelien sind [63], und dienen als Ergänzung zur konventionellen Histopathologie. 1.6 Ziel der Arbeit Die einzige therapeutische Möglichkeit, Patienten mit Ösophaguskarzinom potentiell kurativ zu behandeln, ist die komplette chirurgische Resektion mit ausgedehnter Lymphadenektomie. Bei Patienten mit fortgeschrittenem Ösophaguskarzinom (Stadium III) führt die neoadjuvante Radiochemotherapie zum Downstaging des Primärtumors, mit auch histopathologisch nachgewiesener Tumorrückbildung und 32 Einleitung Zunahme der R0-Resektionsquote, allerdings ohne bisher gesicherte Steigerung der Überlebenszeit [36]. Die Rezidivrate nach Operation ist sogar bei Patienten, die keinen Lymphknotenbefall aufwiesen, sehr häufig. Dieses Phänomen ist der Beweis dafür, dass die Ausbreitung von Tumorzellen in Lymphknoten weit größer ist, als dies in routine-pathologischen Untersuchungen nachzuweisen ist [66]. Die konventionelle Beurteilung von regionalen Lymphknoten wird gewöhnlicherweise durch einen histologischen Schnitt für jeden LK gemacht. Während routinehistopathologische Untersuchungen metastatische Foci nur über 2mm detektieren können, beschreibt der Term Mikrometastasen Cluster an Zellen, die nicht durch diese konventionellen Methoden entdeckt werden [45]. Neues Interesse wurde immunhistochemischer in und den achtziger molekularer Jahren durch Nachweismethoden die Einführung disseminierter Tumorzellen geweckt. Dies bot Anlass zu verschieden Interpretationen und unterschiedlichen Auslegungen der TNM- und Residualtumor (R) –Klassifikation [32] . Die Ausbildung von Metastasen ist ein komplexer Prozess. Nur ein kleiner Prozentsatz von zirkulierenden Tumorzellen (0,05 Prozent) überleben und initiieren einen metastatischen Focus [32]. In dieser Studie werden Muster, Inzidenz und prognostische Bedeutung okkulter Tumorzellen in Lymphknoten (Mikrometastasen) mit immunhistochemischen Methoden untersucht. So soll die Frage geklärt werden, ob ein erweitertes Staging empfehlenswert ist und Einfluss auf die Wahl der Therapie haben könnte. Ein Großteil der Patienten wurde mit einer präoperativen Radiochemotherapie behandelt. Es ist von großem Interesse, zu untersuchen, ob die neoadjuvante Therapie die Inzidenz am mikrometastatischen Tumorfoci und die Überlebensrate beeinflussen kann, um möglicherweise auch in sehr frühen Stadien des Ösophaguskarzinoms sinnvoll zum Einsatz zu gelangen. Dabei sollen histopathologische Merkmale in den Lymphknoten als Residuen der präoperativen Radiochemotherapie aufgezeigt und mit Überlebensraten korreliert werden. Weiterhin soll ersichtlich werden, inwieweit der histologische Subtyp Einfluss auf die Prognose hat. 33 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Patienten Insgesamt wurden 162 Patienten, die im Zeitraum zwischen 1991 und 2003 an der Universitätsklinik Freiburg, Abteilung Allgemein- und Viszeralchirurgie wegen eines Ösophaguskarzinomes operiert worden waren, ausgewählt. 104 Patienten erhielten eine kombinierte Radiochemotherapie nach dem Naunheim-Protokoll [67] . Die neoadjuvante Radiochemotherapie wurde 1994 eingeführt. Die Radiotherapie wurde gleichzeitig mit Chemotherapie für vier Wochen an fünf Tagen pro Woche verabreicht. Es wurde mit einer Gesamtdosis von 36 Gy zu täglichen Dosen von 1,8 Gy an Tag 1 bis 5 für vier Wochen bestrahlt. Zusätzlich erhielten die Patienten 500 mg/m2 5-Fluorouracil an Tag 1 bis 5 für vier Wochen und 20 mg/m2 Cisplatin an Tag 1 bis 5 in der ersten und vierten Woche. Nach einer Pause von mindestens vier Wochen wurde ein Restaging und die Operation durchgeführt (durchschnittlich acht bis zehn Wochen nach dem Beginn der präoperativen Radiochemotherapie). Die Response auf die präoperative Radiochemotherapie wurde durch den Vergleich des klinischen Tumorstadiums vor Beginn der Behandlung und dem Tumorstadium des resizierten Gewebes bestimmt. Die histologische Aufarbeitung der Resektate durch Pathologen der Universität Freiburg ergab, dass 91 Patienten primär pN0 (keinen durch routine- histopathologische Methoden nachweisbarer Lymphknotenbefall) aufwiesen. Mit diesen Patienten beschäftigte sich die vorliegende Arbeit. Zunächst wurden sämtliche, bereits auf Objektträgern vorhandene H&E-Schnitte von Lymphknoten nochmals komplett auf eventuell übersehene Metastasen untersucht, dabei mussten zwei Patienten nachträglich als pN1 eingestuft werden, da bereits eine Lymphknotenmetastasierung vorlag. Von drei Patienten konnte entweder das komplette Resektat oder die Lymphknotenblöcke nicht im Archiv gefunden werden, sie wurden daher ebenfalls aus der Studie ausgeschlossen. Bei einem Patienten wurde kurz nach der Operation eine zervikale Fernmetastase diagnostiziert, auch dieser Fall wurde nicht berücksichtigt. Von den verbleibenden 85 pN0-Patienten waren fünf nicht R0-resiziert, so dass davon auszugehen ist, dass Resttumorgewebe in der Anastomose verblieben ist. Die statistische Auswertung berücksichtigt diese Fälle insbesondere. 34 Von den verbleibenden 80 Material und Methoden Patienten erhielten 59 eine neoadjuvante Radiochemotherapie (73,75 Prozent). Operativ wurde in den meisten Fällen ein transthorakaler Zugang mit einer „en-blocLymphadenektomie“ gewählt (Tabelle 7, S.35). Bei einigen Patienten wurde hauptsächlich wegen beeinträchtigter Lungenfunktion ein transhiataler Zugang bevorzugt. Eine thorakoabdominelle Resektionstechnik wurde bei 72 Patienten (90 Prozent der Fälle) durchgeführt, nur 8 Fälle (10 Prozent) wurden transmediastinal operiert. In fast allen Fällen (n=76, 95 Prozent) wurde durch einen Magenhochzug eine zervikale Anastomose erreicht, bei nur sehr wenigen Patienten (n=4, 5 Prozent) musste ein Kolon-Interponat im hinteren Mediastinum plaziert werden. Bei 58 Patienten (72,5 Prozent) der Patienten wurde eine thorakoabdominelle Zwei-FeldLymphadenektomie durchgeführt. Eine Ein-Feld-Lymphadenektomie (zervikal, thorakal oder abdominell) erhielten 12,5 Prozent der Patienten (n=10). Postoperativ war eine intensivmedizinische Überwachung für einige Tage obligat, die maschinelle Beatmung wurde meist am Tag der Operation beendet. Acht Patienten (10 Prozent) hatten einen Zweittumor (Stimmbandkarzinom, Prostatakarzinom, Ovarialkarzinom u.a.). Schwere, einschränkende Begleiterkrankungen wurden bei 61 Fällen (76,25 Prozent) festgestellt, hauptsächlich handelte es sich um kardiale und pulmonale Probleme (arterieller Hypertonus, KHK, COPD). Postoperative Komplikationen, hauptsächlich chirurgische (Anastomoseninsuffizienz, Rekurrensparesen), pulmonale (Pneumothorax, ARDS, Pleuraempyem) und kardiale, wurden bei 71 Patienten (88,75 Prozent) gesehen. Nikotinabusus bei 76,25 Prozent und Alkoholabusus bei 67,5 Prozent der Patienten waren die wichtigsten kanzerogenen und mortalitätsbezogenen Risikofaktoren. Die Lokalisation der Primärtumore des Patientengutes verteilt sich analog der empirischen Daten (siehe 1.3.1 und Tabelle 7, S.35), das Adenokarzinom trat – wie erwartet - vornehmlich im unteren und mittleren Anteil des Ösophagus auf. Dem postoperativen Grading wurde ein weiteres (Gx-)Stadium zugeordnet; hier zeigte sich vor allem bei den neoadjuvant behandelten Patienten kein nachweisbarer Tumor mehr, so dass ein Grading ebenso nicht möglich war. Die sich ergebende histologische Zuordnung der Tumore zeigt ebenfalls die Tabelle 7. Dabei entfielen auf das Plattenepithelkarzinom 72,5 Prozent (n=58), 27,5 Prozent (n=22) der Patienten hatten ein Adeno- bzw. Barettkarzinom. 35 Material und Methoden 63:17 59,6 (±9,5) Jahre n (% von n=80) Geschlecht (n/m:w) Durchschnittsalter (SD) Lokalisation Primärtumor oberes Drittel 14 (17,5%) mittleres Drittel 33 (41,3%) unteres Drittel 34 (42,5%) 1 Fall mit Befall von unterem und oberen Drittel Histologischer Typ Adenokarzinom 22 (27,5%) Plattenepithelkarzinom 58 (72,5%) Histoloisches Grading Gx 25 (31,25%) G1 3 (3,75%) G2 34 (42,5%) G3 18 (22,5%) ja 59 (73,75%) nein 21 (26,25%) kein TU nach neoadj. Behandlung nachweisbar neoadjuvante Therapie Operationstechnik Thorako-abdominal 72 (90%) Transmediastinal 8 (10%) Magenhochzug 76 (95%) Koloninterposition 4 (5%) Lymphadenektomie Ein-Feld 10 (12,5%) Zwei-Feld 58 (72,5%) nicht angegeben Zweitkarzinom Schwere Begleiterkrankungen postoperative Komplikationen 12 (15%) 8 (10%) 61 (76,25%) 71 (88,75%) Tabelle 7: klinisch-pathologische Merkmale der pN0-Patientengruppe (n=80) Wie aus der Tabelle 8, S.36 ersichtlich, verteilte sich das Geschlecht der Untersuchten zu 80 Prozent auf Männer und dementsprechend 20 Prozent auf Frauen. Das mediane Alter aller Karzinom-Patienten betrug 59,6 Jahre mit einer Standardabweichung von 9,5 Jahren. Für das plattenepitheliale Karzinom errechnete sich ein männlicher Prozentanteil von 52,9 Prozent gegenüber 15,3 Prozent weiblicher Tumorpatienten. Mit dem errechneten medianen Alter von 58,8 36 Material und Methoden (Standardabweichung 9,2 Jahre) stimmt die Auswahl dieser Patienten mit dem in der Literatur angegebenen medianen Alter von 55 Jahren annähernd überein [13]. Für das Adenokarzinom ergab sich die Anzahl von 22 Patienten mit einem weiblichen Anteil von 4,7 Prozent und einem männlichen Anteil von 21,2 Prozent. Das statistische Durchschnittsalter für diese Auswahl zum Zeitpunkt der Operation (57,4 ± 11,1 Jahre) ist aufgrund der geringen Anzahl der Patienten nur annähernd mit den Publikationsangaben (medianes Alter 63 Jahre) vereinbar. Dennoch zeigt die Tumorverteilung (Tabelle 8, S.36) in etwa die statistische Verteilung von 60 - 70 Prozent Plattenepithelkarzinome und 30 - 40 Prozent Adenokarzinome (vgl. Tabelle 2, S. 11) Tumor Geschlecht Altersverteilung männlich weiblich Gesamt n=63 n=17 n=80 78,75% 21,25% 100,00% n=45 n=13 n=58 52,94% 15,29% 72,5% n=18 n=4 n=22 21,18% 4,71% 27,5% Gesamt Plattenepithel-CA Adeno-CA zum Zeitpunkt der OP 59,6 Jahre ± 9,5 (Mean SD) 58,9 Jahre ± 9,2 (Mean SD) 57,4 Jahre ± 11,1 (Mean SD) Tabelle 8: Geschlechter- und Altersverteilung (Histologie) Aus nachfolgender Tabelle 9 sind die postoperativen T-Stadien zu entnehmen. Anzumerken ist, dass es sich hierbei für einige Fälle um Stadien nach neoadjuvanter Bestrahlung (T0) handelt und einige Primärtumore nicht mehr nachgewiesen werden konnten. T-Stadium T0 T1 T2 T3 T Ges. 25 13 21 21 80 31,25% 16,25% 26,25% 26,25% 100,00% Tabelle 9: postoperative Tumorgröße-Stadien der pN0-Patienten (n=80) 2.2 Histologische Aufarbeitung Aus der verbleibenden Patientengruppe wurden alle in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcke aus dem Archiv des pathologischen Instituts herausgesucht, hierbei konnte man sich auf die vorhandenen, schriftlich fixierten Befunde berufen. Die 37 Material und Methoden Gewebeblöcke wurden gemäß den in der Literatur angegebenen Richtwerten geschnitten (Abbildung 5, S.37). Es wurden insgesamt 6 konsekutive Schnitte entnommen, die Schnittdicke betrug 2 µm. Jeder erste, dritte und fünfte Schnitt wurde mit einer H&E-Färbung aufgearbeitet, jeder zweite, vierte und sechste Schnitt erhielt eine immunhistochemische Färbung. Der erste (H&E) und der zweite Schnitt (IHC) folgten in einem mindestmöglichen Abstand von 2 µm, um die optische Kontrolle zu gewährleisten, nach 150 µm wurde der dritte (H&E) und wiederum in einem Abstand von 2µm der vierte Schnitt (IHC) gewonnen. Nach gleichem Schema wurde mit dem fünften und sechsten Schnitt verfahren. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Lymphknoten 2µm 150µm 2µm 150µm 2µm Abbildung 5: schematische Darstellung von Schnittanzahl und -abständen durch einen Lymphknoten 2.2.1 H&E-Färbung Zur Beurteilung morphologischer Veränderungen wurde eine Standardfärbung mit Hämalaun-Eosin (H&E-Färbung) durchgeführt. Die Hämalaun-Eosin-Färbung (H&E-Färbung) ist eine geeignete Methode zur Übersichtsfärbung von Gewebe. Diese Färbetechnik wurde zur Darstellung der histologischen Routineschnitte des OP-Materials und der neu aufgearbeiteten Kontrollschnitte (Abbildung 5, S.37) eingesetzt. Nach der Entparaffinierung in Xylol und einer absteigenden Alkoholreihe wurden die Schnitte zur Kernfärbung 10 Minuten in einer 1:5 verdünnten Hämalaunlösung nach Mayer (Fa. Merck, Darmstadt) gefärbt. Anschließend wurden sie 10 Minuten unter fließendem Leitungswasser gespült und 30 Sekunden in einprozentiger wässriger 38 Eosinlösung (Fa. Merck, Darmstadt) Material und Methoden gegengefärbt. Nach einem kurzen Waschvorgang in aqua dest. wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert, einige Minuten in Xylol belassen und auf Objektträger (Fa. Langenbrinck, Teningen) eingebettet. Durch das Hämalaun werden alle basophilen Zellbestandteile wie z.B. das Chromatin der Zellkerne blau dargestellt. Diese Bläuung stellt sich beim Überspülen der Leitungswasser in ein, Farbe dabei getauchten bestimmt die Objektträger Dauer des mit elektrolythaltigem Wasserkontaktes die Farbintensität. Danach wurde mit Eosin (Rot) gegengefärbt, welches Zytoplasma und Interzellularsubstanz rosa darstellt. Die Lösung bestand aus 1 Prozent Eosin-Y, 0,5 ml Eisessig auf 0,1 l Aqua dest. Die Präparate wurden eingedeckelt und mit dem Mikroskop Axioskop 50 (Fa. Carl Zeiss) analysiert. 2.2.2 Immunhistochemische Färbung Zur immunhistochemischen Aufarbeitung der Lymphknotenblöcke wurde der Zytokeratin-Antikörper-Cocktail AE1/AE3 (DAKO, Hamburg) verwendet (siehe auch Abschnitt 1.5., S.30). Wir nutzten AE1/AE3 als gereinigte Immunglobulinfraktion von Aszites in folgender Aufarbeitung: AE1/AE3 1ml TRIS-HCl 0,05 mol/l Natriumazid 0,015 mol/l pH 7,2 Tabelle 10: Zusammensetzung des AE1/AE3-Cocktails 2.2.2.1 LSAB-Immunhistochemie im automatisierten Verfahren (Labelled Streptavidin-Biotin) AE1/AE3 wurde vor den eigentlichen Versuchen über das DAKO®-Autostainer-Gerät in Verdünnungsreihen an einem epithelialen Präparat ausgetestet und gefärbt. Verwendet wurde eine Dilution von 1:200, da in dieser Verdünnung der beste Gewebekontrast hergestellt werden konnte. 39 Material und Methoden Von den in Paraffin eingebetteten Geweben wurden serielle 2 µm dicke Schnittpräparate hergestellt und auf polysinbeschichtete Objektträger aufgezogen. Nach Inkubation im Brutschrank bei 60°C für mindestens eine Stunde wurden die Schnitte entparaffiniert. Dazu durchliefen sie folgende Alkoholreihe im Entparaffinierungsgerät: in Xylol 16 mal 1,5 min in 100%igem Ethanol 3 mal 1,5 min in 96%igem Ethanol 1 mal 1,5 min in 70 %iger Ethanol 1 mal 1,5 min Die Epitopdemaskierung erfolgte in 1fachem TRS (Target Retrieval Solution, DAKOCytomation) für 30 Minuten im Dampfgarer unterhalb des Siedepunktes bei 99°C. Der pH-Wert des TRS für den Antikörper AE1/AE3 betrug pH 6. Die proteolytische Vorbehandlung erfolgte mit Proteinase K (Fa. SIGMA, Steelze). Die Färbung mit dem Antikörper erfolgte mit dem Autostainer-Gerät. Die Inkubationszeit mit dem Primärantikörper in einer bestimmten Verdünnung betrug 30 Minuten. Nach kurzem Waschen mit Waschpuffer, wurde der Sekundärantikörper (Flasche A des ChemMate Detection Kit, DAKO-Cytomation) für 15 Minuten zugegeben. In dieser Flasche waren die Sekundärantikörper gegen beide Tierarten (Maus und Kaninchen) enthalten. Nach nochmaligem Waschen wurde die alkalische Phosphatase (Flasche B des ChemMate Detecion Kit, DAKO-Cytomation) für 15 Minuten zugegeben. Die Farbreaktion wurde durch eine 10 minütige Inkubation in Neufuchsin (Flaschen C bis G: Färbekomplex RED Chromogen 1-3, alkalische Phosphatase-Substrat-Puffer, Levamisol) hervorgerufen. Nach Waschen mit Aqua dest. wurden die Zellkerne im Hämalaun nach Mayer 6 Minuten gegengefärbt und 5 Minuten unter fließendem Wasser gebläut. Nach kurzem Eintauchen in die Gefäße einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 96%, 100% Ethanol, dann 100% Xylol) wurden die Schnitte mit Hilfe eines Folieneindecklers eingedeckelt. Die durch Neufuchsin erzeugte Farbe ist nicht in Alkohol oder anderen organischen Lösungsmitteln löslich, daher können die Präparate vor dem Eindecken entwässert werden. 40 Material und Methoden LSAB-Methode: Ein biotinylierter Sekundärantikörper bindet Enzymsubstrat an den Primärantikörper. Die alkalische Phosphatase (AP) wird im Komplex mit Streptavidin und Streptavidin zugegeben. Avidin hat vier Bindungsstellen für Biotin und bindet somit Sekundärantikörper (biotinyliert) an den Sekundärantiköper. Das Enzymsubstrat Neufuchsin wird von der AP enzymatisch gespalten, was zur Rotfärbung führt. Primärantikörper Abbildung 6: Darstellung der Labelled StreptAvidin-Biotin-Methode (LSAB-Methode) (nach [10]) Antigene Zusammensetzung der Neufuchsin - Substratlösung Zusammensetzung der Neufuchsin-Substratlösung: (empfohlen für Gewebeschnitte) • 1. Lösung A: 18 mL 0,2 M 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol mit 50 mL 0,05 M Trispuffer, pH 9,7 und 600 mg Natriumchlorid mischen. 28 mg Levamisol zufügen. • 2. Lösung B: 35 mg Naphthol AS-BI-Phosphat in 0,42 mL N,NDimethylformamid lösen. • 3. Lösung C: Unter einem Laborabzug 0,14 mL 5% Neufuchsin (5 g in 100 mL 2 N HCI) mit 0,35 mL frisch angesetztem 4% Natriumnitrit (NaNO2, 40 mg in 1 mL Aqua dest.) mischen. 60 Sekunden rühren. • 4. Lösung A und B mischen, anschließend Lösung C hinzufügen; den pH-Wert mit Salzsäure (HCI) auf 8,7 einstellen. Mischen und filtriert auf die Objektträger auftragen. • 5. 10-20 min bei Raumtemperatur inkubieren. • 6. Mit destilliertem Wasser spülen. • 7. Gegenfärben und Eindecken; wässrige (Glycergel™, C0563) oder organische Eindeckmedien. 41 Material und Methoden 2.3 Statistik Die Daten aller Ösophaguskarzinompatienten wurden fortlaufend über Jahre durch Mitarbeiter der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg erhoben, aktualisiert und ausgewertet. Die letzte Datenaktualisierung fand im April 2004 statt. Folgende Parameter wurden aufgenommen: • Geschlecht, Alter, Größe und Gewicht, • Zeitpunkt der Operation, • pTNM-Stadium, • Lokalisation des Tumors, Tumorlänge, Tumorstenose, • durchgeführte neoadjuvante Therapie, • Response auf neoadjuvante Therapie, • Operationstechnik und Operationszugang, • Länge des postoperativen stationären Aufenthaltes, • Risikofaktoren (Alkohol, Nikotin), • Histologie (Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom), • Vorhandensein eines Zweitkarzinoms, • schwere Begleiterkrankungen, • postoperative Komplikationen und • Überlebensdaten. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden mit der Überlebenszeit, Response (Ausmaß der Tumorremission nach neoadjuvanter Therapie mittels Vergleich von prä- und posttherapeutischen Stadien), Tumorfaktoren (Infiltrationstiefe, Tumorlänge) verglichen und korreliert. Die statistischen Tests wurden mit Hilfe des Programms SPSS (SPSS Inc., Chicago Ill.) durchgeführt. Unterschiede in Häufigkeiten wurden mit dem Chi-Quadrat-Test nach Pearson oder dem Exakten Test nach Fisher detektiert. Unterschiede von Mittelwerten verlangte nach dem Student t-Test. Überlebenszeiten wurden mit der Meier-Kaplan-Überlebensanalyse korreliert, die Gleichheit der Überlebenskurven wurde mit dem lok-rank-test analysiert. Ein p-Wert (p-value) weniger als 0,05 wurde als signifikant gewertet. Für multivariate Analysen wurde der Cox’s propotional hazard test benutzt. 42 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Mikrometastasen und Zytokeratinpositivität Die Analyse der bereits vorhandenen H&E-Schnitte aus der routinepathologischen Untersuchung zum Zeitpunkt der Operation und Gewebeentnahme wurden retrospektiv komplett aufgearbeitet. Die eingedeckelten Präparate der frühen Jahrgänge (1990-1992) zeigten starke altersbedingten Materialschäden und konnten nicht vollständig reevaluiert werden. In der immunhistochemischen Aufarbeitung konnten Lymphknotenschnitte von 85 Patienten begutachtet werden. Insgesamt wurden 1435 Lymphnoten aus 429 Gewebe-Blöcken untersucht. Dies entspricht einer Anzahl von 2566 Schnitten. Pro Block wurden durchschnittlich 3,4 Lymphknoten untersucht, pro Fall ergab sich eine durchschnittliche Lymphknotenanzahl von 17,24 (SD ± 11,1). Unklare Befunde und gefundene Mikrometastasen wurden eingehend mit zwei erfahrenen Pathologen nachbesprochen. Tumorverdächtige Zellen wurden nur dann als vitale Mikrometastasen gewertet, wenn folgende Kriterien übereinstimmten: - Fehlende Nachweisbarkeit in der routinehistologischen H&E-Färbung - zytokeratinpositives Zytoplasma - große Zellen (im Vergleich zur Umgebung) - relativ großer, unförmiger Zellkern - große, auffällige Nukleolen - wenig Zytoplasma - tumorassoziierter Bezug zum Nachbargewebe (Ausschluss operationsbedingte Kontamination mit Tumorzellen) - stromale Reaktion des lymphoiden Gewebes - eventuell gleichzeitig auftretende Lymphangiosis carcinomatosa bzw. Tumorzellen auch in anderen LK-Präparaten des gleichen Patienten Insgesamt wurden bei 85 Patienten, deren Lymphknoten untersucht wurden, sechs (8,25 Prozent) Mikrometastasen entsprechend den vordefinierten Kriterien gefunden. Bei einem Fall mit MM handelte es sich um keine vollständige R0-Resektion. Nach Ausschluss der fünf nicht R0-resizierten Patienten entspricht dies einer Detektionsrate von 6,25 Prozent (pN+) bei nunmehr 80 Patienten. Die ZytokeratinPositivität (CK+ges) lag mit 42,5 Prozent erheblich höher. Sie subsumiert sämtliche 43 Ergebnisse Fälle, bei denen zytokeratinpositive Zellen in oder an den Lymphknoten nachgewiesen werden konnten. Dies schließt vitale Mikrometastasen, avitale Mikrooder Makrometastasen, nahe Infiltration des benachbarten Fettgewebes, perineurale Infiltration und Lymphangiosis carcinomatosa mit ein. Die Lymphangiosis carcinomatosa (12,5 Prozent) ist als zytokeratinpositives Tumorzellwachstum entlang von Lymphkapillaren und Lymphkollektoren charakterisiert. Eine perineurale Infiltration (Wachstum von Tumorzellen entlang von Nervensträngen) wurde bei 5 Prozent der Fälle beobachtet. Die lymphknotenbezogene Zytokeratinpositivität (CKLK+) schließt Mikrometastasen, nur die avitale nach Mikro- histologischen und Kriterien Makrometastasen, diagnostizierten sowie übrige zytokeratinpositive Zellen (inklusive zytokeratinpositiver Restaktivität in fibrotischen oder narbigen Arealen) mit ein. Die CKLK+ war mit 23,75 Prozent ebenfalls noch deutlich erhöht gegenüber dem singulären Nachweis von Mikrometastasen (Tabelle 11). n Patienten (%) auf LK begrenzt (CKLK+) (%) 34 (42,5) 19 (23,75) 5 (6,25) 5 (6,25) 13 (16,25) 13 (16,25) avitale Mikrometastasen 4 (5) 4 (5) avitale Makrometastasen 11 (13,75) 11 (13,75) 10 (12,5) - perineurale Infiltration 4 (5) - Infiltration Fettgewebe 9 (11,25) - 17 (21,25) 12 (15) Histologische Merkmale Zytokeratinpositivität Mikrometastasen (pN+) avitale Mikro-oder Makrometastasen Lymphangiosis carcinomatosa Narben und Fibrosen Tabelle 11: Histologische Merkmale und Zytokeratinpositivität bei n=80 Patienten Während vitale Tumorzellnester nur dann als vitale Mikrometastasen eingestuft wurden, wenn sie die oben genannten Kriterien erfüllten, zählte zur CKLK+ nur die Anfärbbarkeit durch AE1/AE3. Auch hier wurden histologische Merkmale (Assoziation zum umgebenden Gewebe, Stromareaktion) kritisch angewendet, um eine Kontaminationswahrscheinlichkeit weitestgehend auszuschließen. Die Kontaminationsrate war mit über 82 Prozent sehr hoch, die zytokeratinpositiven Partikel konnten zuverlässig anhand morphologischer Kriterien erkannt und als 44 falsch-positiv ausgeschlossen Ergebnisse werden. Oftmals handelte es sich um operationsbedingte Kontamination von Tumorzellen, des weiteren um Fremdpartikel durch die Aufarbeitung der Präparate. Durch aufgefaltete Lymphknotenschnittflächen war es in wenigen Fällen nicht möglich, eventuell vorhandene zytokeratinpositive Zellen suffizient zu differenzieren. In einem Fall trat neben einer vitalen Mikrometastase auch eine avitale Makrometastase auf, in drei weiteren Fällen war gleichzeitig eine perineurale Infiltration (1 Fall) oder Lymphangiosis carcinomatosa (2 Fälle) zu sehen (Tabelle 12). Mikrometastasen Fall 1 Fall 2 Fall 3 Fall 4 Fall 5 Anzahl untersuchte LK pro Fall 15 22 26 12 20 Lokalisation Nicht angegeben Cardia Periösophageal TrachealBifurkation Zwerchfellschenkel Primärtumor * AC SCC SCC SCC AC Tumorlokalisation (Drittel) Mittleres unteres unteres Oberes Unteres Begleiterscheinungen¶ Ly.carc. Ly.carc. avitale LKMetastase Perineurale Infiltration --- pT-Stadium 3 1 0 3 3 neoadjuvante Therapie? nein nein ja Ja nein Tabelle 12: klinisch pathologische Zusammenhänge bei n=5 gefundenen Mikrometastasen * AC= Adenokarzinom, SCC=Platteneptithelkarzinom (Squamous cell carcinoma) ¶ Ly.carc.= Lymphangiosis carcinomatosa In keinem Fall wurden mehr als eine Mikrometastase pro Patient festgestellt. Die durchschnittlich untersuchte Lymphknotenanzahl bei den Patienten mit Mikrometastasen (pN+) war 19 (SD ± 5,7), die der pN0 gebliebenen 17,12 (SD ± 11,4). Tabelle 13 gibt eine aufgeschlüsselte Übersicht. ja Mittlere LK-Anzahl 19,00 5 Standard-. Abweichung 5,568 nein 17,12 75 11,354 Total 17,24 80 11,070 Mikrometastasen Fälle. Tabelle 13: durchschnittliche Lymphknotenanzahl bei Patienten mit oder ohne Mikrometastasen 45 Ergebnisse Die Lokalisation der Mikrometastasen entsprach (bis auf einen unklaren Fall) lokoregionären Lymphknoten bei entsprechender Position des Primärtumors. Beispielsweise waren bei einer Tumorlokalisation im unteren Drittel die cardianahen Lymphknoten betroffen, desweiteren Lymphknoten im Zwerchfellschenkel und periösophageal. Bei Position des Primärtumors im oberen Drittel des Ösophagus wurde eine Mikrometastase in den Lymphknoten der Trachealbifurkation gefunden. Mikrometastasen wurden unabhängig vom histologischen Grading (Grad 1 bis 3) detektiert; einschränkend bleibt zu bemerken, dass in 25 von 80 Fällen ein Grading nicht vorlag. Auch das pT-Stadium präsentierte sich heterogen: dreimal gelang ein Mikrometastasen-Nachweis bei T3-Tumoren, einmal im T0-Stadium und ein weiteres Mal im Stadium T1. Eine neoadjuvante Therapie erhielten drei von fünf Patienten mit detektierten Mikrometastasen. In einem Fall gelang es nicht, ein CK-positive Zelle genauer zu differenzieren, eine daraufhin durchgeführte CD-68-Färbung (Immunhistochemie) konnte diese Zelle eindeutig als Makrophagen identifizieren. CK-Positivität (LK begrenzt) ja ØLK-Anzahl Fälle Mean N 20,21 19 8,600 nein 16,31 61 11,640 Total 17,24 80 11,070 Std. Deviation Tabelle 14: durchschnittliche Lymphknotenanzahl bei Patienten mit oder ohne nachgewiesener CKPositivität In der Tabelle 14 erkennt man, dass mit einem Mittelwert von 20,2 (SD 8,6) deutlich mehr Lymphknoten untersucht wurden, wenn Zytokeratinpositivität festgestellt wurde (p=0,182). Abbildung 7; S.46 zeigt die Verteilung der untersuchten Lymphknoten bei CKLK+ und CKLK-. 46 Ergebnisse 60 47 Untersuchte Lymphknoten 50 1 40 30 20 10 0 ja nein CK-Positivität (LK begrenzt) Abbildung Abbildung7:7Verteilung Verteilungder derLymphknotenanzahl Lymphknotenanzahlbei bei vorhandener detektierter oder nicht detektierte vorhandener CK-Positivität CK-Positivität CK-Positivität (LK begrenzt) 50 n=43 ja nein 40 72,9% Fälle 30 20 p=0,186 n=18 n=16 10 n=3 27,1% 85,7% 14,3% 0 ja nein prae OP: Neoadjuvante Therapie Abbildung 8: Anteile der Zytokeratinpositivität bei vorhandener (n=59) und nicht vorhandener (n= 21) neoadjuvanter Therapie Abbildung 8, S. 46 zeigt die Anteile der Zytokeratinpositivität bei vorhandener und nicht vorhandener neoadjuvanter Therapie. Erfolgte eine neoadjuvante Therapie, so 47 Ergebnisse wurde unter diesen Fällen 27,1 Prozent CK-Positivität detektiert. Wurden Patienten nicht präoperativ behandelt, lag der Anteil der CK-Positivität bei 14,3 Prozent (p=0,186). CK-Pos. ohne MM Diagnostik: N-Staging prae OP Total ja nein cN0 3 32 35 cN1 9 28 37 cNx 2 6 8 14 66 80 Total Tabelle 15: Auftreten von Zytokeratinpositivität in verschiedenen präoperativen N-Stadien In den abgebildeten Tabellen 15 und 16, S.47 ist der Nachweis von Mikrometastasen oder Zytokeratinpositivität (ohne Mikrometastasen) im Zusammenhang mit der präoperativen cN-Situation zu sehen. Mikrometastasen verteilten sich in drei Fällen auf das Stadium cN0 und in zwei Fällen auf das Stadium cN1 (Tabelle 16). Micrometastasen Diagnostik: N-Staging prä-OP Total ja nein cN0 3 32 35 cN1 2 35 37 cNx 0 8 8 5 75 80 Total Tabelle 16: Auftreten von Mikrometastasen in verschiedenen präoperativen N-Stadien Zytokeratinpositivität (siehe Tabelle 15) wurde bei 9 Fällen (64 Prozent) im cN1Stadium detektiert, 3 Patienten mit nodalem Zytokeratinnachweis hatten ein cN0Stadium, in 2 Fällen war die präoperative nodale Situation nicht eindeutig (cNx). Alle ehemaligen cN1-Fälle waren histopathologisch pN0 gestagt, davon entfielen n=33 (89 Prozent) auf Fälle mit Radiochemotherapie (Tabelle 17). prae OP: Neoadjuvante Therapie Diagnostik: N-Staging prae OP Total Total ja nein 0 23 12 35 1 33 4 37 X 3 5 8 59 21 80 Tabelle 17: Verteilung der Patienten mit oder ohne neoadjuvanter Behandlung in verschiedene präoperativen N-Stadien 48 Ergebnisse In der nachfolgenden Bilderserie sind in der Abbildung 9, S.49-50 im Bild (1) und (2) der Nachweis einer Mikrometastase im Randbereich eines Lymphknotens durch Immunhistochemie mit 10facher (1) und 40facher (2) Vergrößerung zu sehen. Eine weitere Mikrometastase im Randsinus eines Lymphknotens ist im Bild (3) (20fach) und Bild (4) (100fach) in der AE1/AE3-Anfärbung zu sehen. Gut zu erkennen ist der relativ große Zellkern, die ausgeprägten, auffälligen Nukleolen und exzellente zytoplasmatische Anfärbbarkeit durch den Antikörper AE1/AE3. Disseminierte, ungeordnet im Lymphknoten liegende Tumorzellen sind in Bild (5) in 5facher Vergrößerung zu sehen. Die Darstellung einer malignen Einzelzelle (6) wiederholt die eingangs erwähnten Kriterien einer Tumorzelle. In Bild (7) (10fach) ist ein Tumoreinbruch in eine Lymphkapillare zu erkennen (Lymphangiosis carcinomatosa). Ein Cluster von Tumorzellen ist in (8) zu sehen und wurde als Mikrometastase gewertet, da diese Zellen nicht in der H&E-Färbung zu sehen waren. Eine Stromareaktion des umgebenden lymphatischen Gewebes ist dabei sehr gut abzugrenzen. In Abbildung (9) und (10) wurden im Randsinus eines Lymphknotens gefundene Tumorzellen anhand zweier im Abstand von 2 µm gefertigter Schnitte verglichen: (9) zeigt die H&E-Färbung (20fach), in der die metastatischen Zellen nur schwer zu detektieren sind; in (10) sind die selben Zellen durch die gute Kontrastierung durch AE1/AE3 und dem Färbereagenz Neufuchsin sehr leicht vom übrigen Lymphknotengewebe abzugrenzen. In (11) erkennt man eine avitale Makrometastase, die vorher nicht gefunden wurde. Alle Zellen sind nicht mehr vital, eine Anfärbung durch AE/AE3 ist jedoch gegeben. Um das nekrotische Metastasengewebe findet sich fibrotisches Narbengewebe als Resultat der Radiochemotherapie. Der Antikörper färbt auch Mesothelien (12) an. Diese sind jedoch aufgrund typischer histologischer Merkmale leicht von Tumorzellen zu differenzieren. Als ein typisches Artefakt sind im Bild (13) zytokeratinanreichernde Partikel zu identifizieren. Diese haben keine typischen Merkmale von vitalem oder avitalem Tumorgewebe, es besteht kein Bezug zum umgebenden Gewebe. Solche Verschmutzungen kamen häufig vor und wurden nach Diskussion mit zwei Pathologen von der Analyse ausgeschlossen. 49 Ergebnisse 1 2 3 4 5 6 7 8 50 Ergebnisse 9 10 11 12 13 Bildnachweis: (Abbildung 9) Bildnachweis: 1.Nachweis einer MM im Randbereich eines LK (10x) 9. Tumorzellen im Randsinus eines LK (H&E, 20x) 2.Nachweis einer MM im Randbereich eines LK (40x) 10. Tumorzellen im Randsinus eines LK (IHC, 10x) 3.MM im Randbereich eines LK (20x) 11. avitale Makrometastase im LK (2,5x) 4.MM im Randbereich eines LK (100x) 12. Anfärbung von Mesothelien durch AE1/AE3 (10x) 5. disseminierte Tumorzellen in einem LK (5x) 6. Darstellung einer malignen Einzelzelle (100x) 7. Tumoreinbruch in eine Lymphkapillare (10x) 8. Cluster von Tumorzellen (20x) 13. Artefakt: zytokeratinanreichernde Partikel (40x) 51 Ergebnisse 3.2 Patientenevaluation und neoadjuvante Therapie 59 von 80 Patienten erhielten eine präoperative Radiochemotherapie nach dem Naunheim-Protokoll. Um die Effizienz von neoadjuvanten Therapieprotokollen einschätzen zu können, muss ein Vergleichsparameter geschaffen werden. In diesem Fall bietet sich die Gegenüberstellung des prätherapeutischen T-Stadiums (cT-Stadium) mit dem pathohistologischen T-Stadium (pT-Stadium) an. Präoperativ (cT) Postoperativ (pT) Häufigkeit (Prozent) Häufigkeit (Prozent) T-Stadium k.A. 7 (8,8) 0 0 (0) 25 (31,3) 1 5 (6,3) 13 (16,3) 2 22 (27,5) 21 (26,3) 3 42 (52,5) 21 (26,3) 4 3 (3,8) 0 (0) 1 (1,3) 0 (0) X Gesamt 80 0 (100,0) 80 (0) (100) Tabelle 18: präoperatives und postoperatives T-Stadium von n=80 Patienten Neoadjuvante Therapie pT-Klassifizierung Total Total ja 25 nein 0 25 1 8 5 13 2 15 6 21 3 11 10 21 59 21 80 0 Tabelle 19: Verteilung der postoperativen pT-Stadien nach vorhandener oder nicht vorhandener neoadjuvanter Therapie Neoadjuvante Therapie Response Histologie n (%von n=59) SCC AC Komplett 24 (41%) 19 (46,4%) 5 (27,8%) Partiell 32 (54%) 20 (48,8%) 12 (66,7%) Kein 2 (3,3%) 1 (2,4%) 1 (5,5%) Progress 1 (1,7%) 1 (2,4%) 0 (0% 59 (100%) 41 (100%) 18 (100%) Total Tabelle 20: Response nach erfolgter neoadjuvanter Therapie (pathologischer Befund) Tabelle 20 gibt Aufschluss über das Ausmaß der Remission nach neoadjuvanter Therapie. Die Tumorremission ergab sich durch den Vergleich des klinischen 52 Ergebnisse Tumorstaging vor Therapiebeginn (cTNM) und des pathologischen Befundes nach Resektion (pTNM) (siehe Tabelle 18, S.51). Das pathohistologische Staging konnte nach Resektion ein pT0-Stadium bei 31,3 Prozent (n=25) nachweisen. Alle 25 Patienten sind radiochemothapiert worden (Tabelle 19, S.51) und wiesen eine komplette Remission bei fehlender Nachweisbarkeit des Primärtumors (pT0) im pathologischen Präparat auf. Aus Tabelle 19 wird weiterhin die Verteilung über die restlichen postoperativen T-Stadien nach Radiochemotherapie ersichtlich. Downstaging des T-Stadiums gegenüber der präoperativen Situation wurde als partielle Remission gekennzeichnet. Entsprach der pathohistologische Befund dem der prätherapeutischen TNM-Klassifikation, wurde von keiner Remission, bzw. bei Verschlechterung von Progress ausgegangen. Eine komplette Remission von 59 vorbehandelten pN0-Patienten konnte bei 41 Prozent (n=24) festgestellt werden, eine partielle Remission wiesen 54 Prozent (n=32) der Fälle auf. Kein Ansprechen oder Progression des Tumors unter neoadjuvanter Therapie wurde bei zwei (3,3 Prozent), bzw. einem (1,7 Prozent) Patienten registriert. Unter Berücksichtigung der Histologie bedeutet dies beim Plattenepithelkarzinom (SCC): ausgehend von 41 Patienten (69,5 Prozent) von 59 Fällen, die eine präoperative Radiochemotherapie erhalten haben: komplette Remission (46,4 Prozent, n=19), partielle Remission (48,8 Prozent, n=20) und keine Remission/Progress (4,8 Prozent, n=2). Für das Adenokarzinom (AC), dessen Anteil der vorbehandelten Fälle 30,5 Prozent (n=18) beträgt, errechnet sich folgende Situation: komplette Remission (27,8 Prozent, n=5), partielle Remission (66,7 Prozent, n=12) und keine Remission (5,5 Prozent, n=1). Durch Bildgebung, Endosonographie und klinische Untersuchung ergab sich bei 33 (55,9 Prozent) von 59 neoadjuvant behandelten Patienten aufgrund hochgradigem Metastasen-Verdachtes ein präoperatives cN1-Stadium, im Operationsresektat konnten routinehistopathologisch nachgewiesen werden (Stadium ypN0). keine Lymphknotenmetastasen mehr 53 Ergebnisse Wichtige histologische Merkmale der Lymphknoten, u.a. Narben, Fibrosen und Zunahme der retikulären Lymphknotenstrukturen als Residuen oder Auswirkungen der neoadjuvanten Therapie, wurden dokumentiert und statistisch ausgewertet. Zudem wurde, wie aus Tabelle 21, S. 53 ersichtlich, die unterschiedliche Zytokeratinaktivität (vitale Mikrometastasen, avitale Mikro-und Makrometastasen, perineurale Infiltration, Lymphangiosis carcinomatosa, Infiltration des Fettgewebes) in die deskriptive Analyse eingeschlossen. Alle Patienten (n=13) mit dem Nachweis avitaler Mikro- oder Makrometastasen hatten eine neoadjuvante Therapie erhalten (p=0,017); desweiteren wurden Narben und Fibrosen als Ausdruck der Reaktivität Merkmal neoadjuvante Therapie p ja nein 2 (40%) 3 (60%) 0,11 13 (100%) 0 (0%) 0,017* 17 (100%) 0 (0%) 0,004* Lymphangiosis carcinomatosa 6 (60%) 4 (40%) 0,442 Perineurale Infiltration 5 (100%) 0 (0%) 0,318 Infiltration Fettgewebe 8 (89%) 1 (11%) 0,433 Mikrometastasen avitale Mikro-oder Makrometastasen Fibrose oder Narbe * signifikant gegen präoperative Therapie, Exakter Test nach Fischer Tabelle 21: Vorkommen histologischer Merkmale bei Patienten mit oder ohne neoadjuvanter Therapie des lymphatischen Gewebes auf die Radiochemotherapie ebenfalls ausschließlich (n=17) bei Patienten mit präoperativer Therapie gesehen (p=0,004). Mikrometastasen verteilen sich zu 40 Prozent (n=2) auf vorbehandelte und zu 60 Prozent (n=3) auf nicht vorbehandelte Patienten. Lymphangiosis carcinomatosa wurde bei 60 Prozent (n=6) der Patienten mit und bei 40 Prozent (n=4) der Patienten ohne Radiochemotherapie gesehen. Der Nachweis perineuraler Infiltrationen gelang nur bei vorbehandelten Fällen. Die Infiltration des Fettgewebes verteilte sich mit 89 Prozent (n=8) auf neoadjuvante Therapierte. Nur ein Patient mit infiltriertem Fettgewebe hatte keine Vorbehandlung erhalten. Response CK-Positivität (LK begrenzt) Total ja nein komplett 9 partiell 7 keine 0 Progress 0 Total 15 25 2 1 43 24 32 2 1 59 16 Tabelle 22: unterschiedliche Response bei nachgewiesener oder nicht nachgewiesener CK-Positivität 54 Tabelle 22, S.53 zeigt das Ergebnisse Auftreten der lymphknotenbegrenzten Zytokeratinpositivität unter Beachtung der Response auf die multimodale Therapie. Dabei konnte keine signifikant statistische Korrelation festgestellt werden: 9 CKLK+Patienten wiesen eine komplette und 7 eine partielle Response im chirurgischen Resektat auf, somit konnte bei allen vorbehandelten CKLK+-Patienten eine partielle oder komplette Remission nachgewiesen werden. Aufgrund des Auftretens von 3 Fällen mit Mikrometastasen bei nicht-neoadjuvant behandelten Patienten verringert sich die CKLK+-Gesamtanzahl auf n=16. Die perioperative Mortalität von allen Patienten war 12,5 Prozent (n=10), sie verteilte sich zu 60 Prozent (n=6) auf Patienten mit neoadjuvanter Therapie. Hauptursache der Hospitalletalität waren Sepsis und pulmonale Komplikationen (ARDS). Komplikationen: Total Neoadjuvante Therapie ja nein ja 53 6 59 nein 18 3 21 71 9 80 Total Tabelle 23: postoperative Komplikationen bei Patienten mit oder ohne neoadjuvanter Therapie In der Tabelle 23 sind die postoperativen Komplikationen (chirurgisch, pulmonal, kardial, Sepsis) bei erhaltener oder nicht erhaltener präoperativer Radiochemotherapie aufgeschlüsselt. Es ergibt sich eine Komplikationsrate bei neoadjuvanter Therapie von fast 90 Prozent, bei nicht vorbehandelten Patienten belief sich diese auf 86 Prozent. Unter Komplikationen wurden im weitesten Sinne verstanden: Pneumonie, Pleuraempyem, Reintubation, Tracheostomaanlage, Anastomoseninsuffizienz oder –stenose, Recurrensparese, Mediastinitis, Peritonitis, Platzbauch und ARDS. 55 Ergebnisse 3.3 Prognostischer Einfluss und Korrelation Langzeitüberleben 1,0 0,8 0,6 n=80 0,4 0,2 0,0 0 2 4 6 8 10 12 [Jahre] nach OesophagusResektion Abbildung 10: Kumulatives Gesamtüberleben von n=80 pN0-Patienten 1,0 Micrometastasen Langzeitüberleben ja (n=5) 0,8 nein (n=75) p=0,85 0,6 0,4 0,2 0,0 0 2 4 6 8 10 12 [Jahre] nach OesophagusResektion Abbildung 11: Kumulatives Überleben von pN0-Patienten mit (n=5) oder ohne Mikrometastasen (n=75) Abbildung 10, S. 55 zeigt das Langzeitüberleben aller 80 Patienten. Die 5-JahreÜberlebensrate betrug 39 Prozent. Alle Patienten wurden in einem regelmäßigen Abstand in ihrem Life-Status überprüft. Die letzte Aktualisierung erfolgte im April 2004. 56 Ergebnisse Im Median ergab die Analyse die Überlebenszeit aller Patienten 3,7 Jahre ± 0,63 Jahre (Konfidenzintervall 2,4 / 5,0 Jahre). 5 In Abbildung 11, S.55 ist die Korrelation von Patienten mit Mikrometastasen (n=5) und ohne Mikrometastasen (n=75) ersichtlich. Die mittlere Überlebenszeit (Median) für Patienten mit Mikrometastasen war 4,1 Jahre (±2,6), das Konfidenzintervall (CI) betrug 0 und 9,2 Jahre. Die 5-Jahre-Überlebensrate war 30 Prozent. Der Vergleich beider Gruppen ergab einen nicht signifikanten p-Wert von 0,85 (log-rank-test). Ohne MM ergab sich eine mittlere ÜLZ von 3,7 Jahren (±0,7) (CI 2,3 bis 5,2 Jahre). Langzeitüberleben Langzeitüberleben In der Abbildung 12 ist das Gesamtüberleben nach der auf den Lymphknoten 1,0 1,0 CK-Positivität CK-Positivität (LK (LK begrenzt) begrenzt) 0,8 0,8 ja ja nein nein jaja- censored censored pp == 0,022 0,022 nein- 0,6 0,6 neincensored censored 0,4 0,4 0,2 0,2 0,0 0,0 00 22 44 66 88 10 10 12 12 [Jahre] [Jahre] nach nach OesophagusOesophagusResektion Resektion Abbildung 12: Vergleich der Überlebensraten von pN0-Patienten mit (n=19) oder ohne nachgewiesener CK-Positivität (n=61) begrenzten CK-Positivität (CKLK+) aufgeschlüsselt. Es ergibt sich eine signifikante Korrelation (p=0,022; log-rank-test) zwischen der Gruppe mit zytokeratinhaltigen Lymphknoten und der ohne. Die mittlere Überlebenszeit für CKLK+ beträgt im Median 1,4 Jahre (± 0,2 Jahre), in einem Konfidenzintervall von 0,9 und 1,8 Jahren. In der Gegengruppe CKLK- (Patienten mit zytokeratinnegativen Lymphknoten) wurde eine mediane Überlebenszeit von 4,6 Jahren (± 0,6 Jahre) bei einem Konfidenzintervall von 3,4 bis 5,7 Jahren beobachtet. Die 5-ÜLZ war bei CKLK- mit 43 Prozent höher als bei CKLK+ mit 26 Prozent. Bereits nach 7 Jahren lebten nur noch 9 Prozent aus der CKLK+-Gruppe (zu diesem Zeitpunkt waren es 39 Prozent aus der CKLK--Gruppe), zum letzten Evaluierungszeitpunkt (nach 12 Jahren) gab es keine weitere Veränderung. 57 Ergebnisse Zum Vergleich: 107 in der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg operierte Ösophaguskarzinompatienten mit Lymphknotenbefall (pN1) aus dem gleichen Zeitraum wie das pN0-Kollektiv dieser Arbeit hatten eine 2-ÜLZ von 18 Prozent und eine 5-ÜLZ von 8 Prozent (Median 0,92 ±15; Konfidenzintervall 0,63;1,20). Damit präsentiert sich die Überlebensrate dieser pN1-Patienten als nur wenig schlechter als die der CKLK+-Patienten dieser Studie. 1,0 1,0 CKLK+ CKLK+==nein nein prae praeOP: OP: Neoadjuvante Neoadjuvante Therapie Therapie Überlebensrate Überlebensrate 0,8 0,8 jaja nein nein 0,6 0,6 ja-censored ja-censored nein-censored nein-censored 0,4 0,4 p=0,24 p=0,24 0,2 0,2 0,0 0,0 00 22 44 66 88 10 10 12 12 [Jahre] [Jahre]nach nachOesophagus-Resektion Oesophagus-Resektion Abbildung 13: Vergleich von Überlebensraten von neoadjuvant (n=59) und nicht neoadjuvant (n=21) behandelten pN0-Patienten Betrachtet man das Überleben der Patienten mit oder ohne neoadjuvante Therapie bei denjenigen Patienten ohne Nachweis von Zytokeratinpositivität, so sieht man CK-Pos. CK-Pos.ohne ohne MM MM 1,0 1,0 Langzeitüberleben Langzeitüberleben jaja nein nein 0,8 0,8 jajacensored censored Textbox Textbox nein- 0,6 0,6 neincensored censored 0,4 0,4 0,2 0,2 p=0,01 p=0,01 0,0 0,0 00 22 44 66 88 10 10 12 12 [Jahre] [Jahre] nach nach OesophagusOesophagusResektion Resektion Abbildung 14: Vergleich von Überlebensraten von pN0-Patienten mit (n=14) und ohne (n=61) CK-Positivität unter Nicht-Berücksichtigung von Mikrometastasen (n=5) 58 Ergebnisse einen (zwar nicht signifikanten) Überlebensvorteil für diejenigen, die eine präoperative Radiochemotherapie erhielten (p=0,24) mit einer medianen ÜLZ von 5,4 Jahren (±0,6, mit RCTX) gegen 4,9 Jahre (±1,1; ohne RCTX). (Abbildung 13, S.57). Zudem wurde das Langzeitüberleben bei Patienten mit und ohne CK-Positivität ohne Beachtung von Mikrometastasen evaluiert. Hier zeigt sich ein signifikanter (p=0,01) Unterschied im Gesamtkollektiv (Abbildung 14, S.57). neoadjuvante Therapie CK-Positivität (LK begrenzt) CK-Positivität (LK begrenzt), ohne MM Mikrometastasen Plattenepithelkarzinom p – value 0,36 0,16 0,047* 0,68 Adenokarzinom p – value 0,08 0,029* 0,13 0,16 Tabelle 24: histologiebezogener Vergleich der Überlebenszeiten von Patienten mit neoadjuvanter Therapie, CK-Positivität (LK begrenzt, mit und ohne MM), oder Mikrometastasen (log-rank-Test) *signifikant In Tabelle 24 wird der Zusammenhang der histologischen Entität mit verschiedenen Faktoren ersichtlich. Kein signifikanter Unterschied (p=0,16) wurde für die Entität Plattenepithelkarzinom bezüglich der lymphknotenbegrenzten Zytokeratinpositivität festgestellt, während für Patienten mit Adenokarzinom bei nachgewiesener CKLK+ eine signifikante Prognoseverschlechterung besteht (p=0,029). Patienten mit Adenokarzinomen scheinen eher von einer neoadjuvanten Therapie zu profitieren (p=0,08), als Patienten mit Plattenepithelkarzinomen, bei denen die Überlebensrate sogar geringer ausfällt. Fälle mit Plattenepithelkarzinomen, bei denen ehemalige Lymphknotenmetastasen festgestellt wurden (CKLK+ ohne MM), hatten ein geringeres Überleben gegenüber denjenigen Zytokeratinpositivität (p=0,05) (siehe Abbildung 15, S.59). ohne avitale 59 Ergebnisse Plattenepithelkarzinom Plattenepithelkarzinom CK-Pos. CK-Pos.ohne ohne MM MM Langzeitüberleben Langzeitüberleben 1,0 1,0 0,8 0,8 jaja nein nein 0,6 0,6 censored Textbox censored Textbox neinnein- 0,4 0,4 0,2 0,2 p=0,05 p=0,05 0,0 0,0 00 22 44 66 88 10 10 12 12 [Jahre] [Jahre] nach nach OesophagusOesophagusResektion Resektion Abbildung 15: Langzeitüberleben von Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Ösophagus mit oder ohne CK-Positivität (ohne MM) In den Tabellen 25 (S.59) und 26 (S. 60) wurden Überlebenszeiten der ausgewählten pN0-Patienten mit verschiedenen Merkmalen korreliert. Allein die histologische Entität führt zu einem signifikanten (p=0,0164) Überlebensvorteil beim Stratum P Merkmal vs Merkmal (1) Adenokarzinom (n=22) Plattenepithelkarzinom (n=58) 0,0164 (2) Neoadj. Therapie (n=59) keine neoadj. Therapie (n=21) 0,9841 (3) Ly. carc.(n=10) keine Ly.carc. (n=70) 0,0258 (4) Neoadj. Ja (5) Neoadj. nein Adenokarzinom (n=4) (6) Neoadj. Ja (7) Neoadj. nein Mikrometastasen (n=3) keine Mikrometastasen (n=18) 0,5497 (8) Neoadj. Ja Ly. carc.(n=6) keine Ly.carc. (n=53) 0,0594 (9) Neoadj. nein Ly. carc.(n=4) keine Ly.carc.(n=17) 0,2267 (10) Neoadj. Ja Adenokarzinom (n=18) Plattenepithelkarziom (n=41) 0,0054 Plattenepithelkarziom (n=17) 0,88 * ** Mikrometastasen (n=2) keine Mikrometastasen (n=57) 0,2447 avit.Metastasen (n=13) keine av. Metastasen (n=46) 0,0366 * SCC in der eigentlichen Prognose schon schlechter ** Selektivität durch pN0-Status gegeben Tabelle 25: Vergleich verschiedener Merkmale und deren Signifikanzen (Wilcoxon-Test), 1.Teil (Fortsetzung in Tabelle 26, S.60) Adenokarzinom mit einer 5-ÜLZ von 70 Prozent im Gegensatz zu der des Plattenepithelkarzinoms mit 31 Prozent (bei ausgewählten pN0-Patienten) und enspricht somit den in der Literatur vorhandenen Angaben respektive des limitierenden Faktors der primären nodalen Negativität. Die neoadjuvante Therapie ohne Beachtung des histologischen Typs bringt keine Vorteile betreffs der 60 Ergebnisse Überlebenszeit (5-ÜLZ mit neoadjuvanter Therapie 41 Prozent, ohne neoadjuvante Therapie 40 Prozent; p=0,98). Wurden Patienten vorbehandelt, so ergibt sich ein signifikanter Unterschied (p=0,0054) zwischen Adenokarzinom und PlattenepithelMedian SE 95%CI 2-ÜLZ 5-ÜLZ Median SE 95%CI 2-ÜLZ 5-ÜLZ ÜLZ von bis % % ÜLZ von bis % % (1) 7,85 1,06 5,78 9,92 81 70 3,51 0,60 2,34 4,68 59 31 (2) 4,07 0,54 3,00 5,13 65 41 3,73 1,62 0,57 6,90 65 40 (3) 0,65 0,45 0,00 1,54 38 19 4,19 0,58 3,05 5,32 69 42 (4) 7,25 0,91 5,47 9,04 88 75 3,32 1,29 0,79 5,86 56 27 (5) 0,65 - - - 50 50 3,73 0,94 1,89 5,58 70 41 (6) 0,75 - - - 50 - 4,19 0,75 2,71 5,66 66 41 (7) 7,98 - - - 67 67 3,73 1,54 0,72 6,74 66 38 (8) 0,86 0,64 0,00 2,12 45 0 4,19 0,98 2,27 6,10 67 41 (9) 0,06 0,32 0,00 0,68 25 25 4,79 0,93 2,97 6,61 74 44 (10) 1,35 0,78 0,00 2,89 45 26 4,55 0,80 2,98 6,12 72 41 Tabelle 26: Vergleich verschiedener Merkmale (abgebildet sind mediane ÜLZ, Standardabweichung (SE), 95%-Konfidenzintervall, 2-ÜLZ, 3-ÜLZ) 2.Teil (Fortsetzung von Tabelle 25) karzinom (5-ÜLZ 75% vs. 27 Prozent). Fälle, bei denen eine Lymphangiosis carcinomatosa nachgewiesen wurde, haben eine deulich geringere 5-ÜLZ (19 Prozent) als Fälle ohne diesen Nachweis (42 Prozent, p=0,0258). Das Vorhandensein von avitalen Mikro- oder Makrometastasen als Residuen einer präoperativen Radiochemotherapie machte sich ungünstig in der Überlebenrate bemerkbar: nach fünf Jahren lebten nur noch 26 Prozent der Patienten mit diesem Kriterium, hingegen überlebten 41 Prozent ohne Residuen diesen Zeitraum. Die Präsenz von Mikrometastasen, gemäß der in dieser Studie definierten Kriterien, zeigte keine Signifikanz im Überleben auf – unabhängig von der neoadjuvanten Therapie. 61 Ergebnisse 1,0 prae OP: Neoadjuvante Therapie 0,8 ja Überlebensrate nein ja-censored p=0,31 nein-censored 0,6 n=43 0,4 n=18 0,2 0,0 0 2 4 6 8 10 12 [Jahre] nach Oesophagus-Resektion Abbildung 16: Vergleich von Überlebensraten bei Patienten mit oder ohne neoadjuvante Therapie nach Ausschluss von CK-positiven Patienten Nach Ausschluss der zytokeratinpositiven Patienten hat – wie aus der Abbildung 16 ersichtlich – die neoadjuvante Therapie ebenfalls keine, bzw. nur wenig prognostische Auswirkung (p=0,31, log-rank-test) im verbliebenen Gesamtkollektiv (n=61). Schliesst man nur die zytokeratinpositiven Patienten unter Beibehaltung derer mit Mikrometastasen aus, ergibt sich ebenfalls kein Unterschied im Überleben (p=0,46, log-rank-test). Nur nach histologischer Unterscheidung kann man bei Response 1,0 keine komplett partiell 0,8 Progress Überlebensrate keine-censored komplettcensored 0,6 partiellcensored n=1 n=32 0,4 p=0,012 0,2 n=24 n=2 0,0 0 2 4 6 8 10 [Jahre] nach Oesophagus-Resektion Abbildung 17: Vergleich von Überlebensraten bei pN0-Patienten mit unterschiedlicher Response auf präoperative Therapie 62 Ergebnisse neoadjuvant therapierten Patienten mit Adenokarzinom des Ösophagus (und nach Ausschluss von Zytokeratinpositivität) einen Überlebensvorteil (p=0,03) herausfiltern. Wie bereits beschrieben, haben Patienten mit Adenokarzinom in diesem pN0Kollektiv auch unter Einbeziehung von zytokeratinpositiven Patienten einen Vorteil durch die neoadjuvante Therapie (p=0,005) gegenüber Patienten mit Plattenepithelkarzinom. Die Abbildung 17, S. 61 zeigt den signifikanten (p=0,012) Überlebensvorteil derjenigen Patienten, die eine komplette oder partielle Remission nach Radiochemotherapie hatten. 1,0 Überlebensrate 0,8 T größer 0? T=0 T>0 T = 0-censored T > 0-censored 0,6 Textbox 0,4 p=0,34 0,2 0,0 0 2 4 6 8 10 [Jahre] nach Oesophagus-Resektion Abbildung 18: Vergleich der Überlebenskurven von neoadjuvant therapierten Patienten mit pT0 Stadien und pT>0 – Stadien (log-rank-Test) In Abhängigkeit vom pT-Stadium zeigt die Abbildung 18 jedoch keinen Unterschied in der Überlebenszeit zwischen Patienten mit höheren pT-Stadien (T>0) und Patienten mit pT0 nach neoadjuvanter Therapie. In einer multivariaten Analyse (Tabelle 27, S. 63) der Parameter Mikrometastasen, lymphknotenbegrenzte Zytokeratinpositivität, Gesamtzytokeratinpositivität, Lymphangiosis carcinomatosa, neoadjuvante Therapie und histologischer Subtyp mittels Durchführung eines Cox’s proportional hazard test bestätigen sich letztendlich die Ergebnisse der univariaten Auswertungen. Mikrometastasen haben keinen prognostischen Einfluss. Das Auftreten lymphknotenbegrenzter Zytokeratinpositivität (p=0,043) und die Entität „Plattenepithelkarzinom“ (p=0,047) sind unabhängige, ungünstige Prognosefaktoren der Subgruppe von 80 pN0-Patienten dieser Studie. 63 Ergebnisse Eine durchgeführte neoadjuvante Therapie hat in der multivariaten Auswertung keinen Einfluss auf die Prognose. B Sig. Hazard ratio 95,0% Konfidenzintervall unteres oberes Mikrometastasen (ja vs. nein) -,695 ,096 ,499 ,220 1,131 CK-Positivität (LK-begrenzt) (ja vs. nein) ,559 ,043* 1,750 1,019 3,005 CK-Positivität (gesamt) (ja vs. nein) -,105 ,712 ,900 ,516 1,571 Lymphangiosis carcinomatosa (ja vs. nein) ,549 ,058 1,732 ,981 3,056 Neoadjuvante Therapie (ja vs. nein) -,035 ,868 ,966 ,642 1,454 Histologischer Subtyp (AC vs. SCC) ,495 ,047* 1,640 1,008 2,670 B = Parameterschätzer, Sig =Signifikanz * signifikant Tabelle 27: multivariate Analyse zur prognostischen Signifikanz verschiedener Parameter mittel Cox’s proportional hazard test bei 80 pN0-Ösophaguskarzinompatienten 64 Ergebnisse 3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse Durch die immunhistochemische Aufarbeitung (AE1/AE3) von 1435 Lymphknoten der 80 teilweise vorbehandelten pN0-Ösophaguskarzinompatienten konnten in 6,25 Prozent der Fälle Mikrometastasen detektiert werden. Der Nachweis von einer Gesamtzytokeratin-Positivität (CK+ges), die Mikrometastasen, avitale Mikro- oder Makrometastasen, Lymphangiosis carcinomatosa, perineurale und Fettgewebsinfiltration, sowie Narben und Fibrosen repräsentiert, war mit 42,5 Prozent der Fälle erheblich höher. Die spezifizierte, auf den Lymphknoten begrenzte Zytokeratinpositivität Makrometastasen, (CKLK+), sowie die Mikrometastasen, übrige avitale zytokeratinpositive Mikro- Zellen oder (inklusive zytokeratinpositiver Aktivität in fibrotischen oder narbigen Arealen) subsumiert, betrug 23,75 Prozent der Fälle. In keinem Fall wurde mehr als eine MM pro Fall festgestellt. MM wurden - bei eingeschränkter Aussage durch die kleine Anzahl der Fälle - unabhängig vom histologischen Grading, Tumorgröße, -subtyp und -lokalisation sowie Vorbehandlung detektiert. Es wurden durchschnittlich 20 Lymphknoten bei Patienten mit Zytokeratinpositivität untersucht, während bei zytokeratinnegativen Patienten nur 16 Lymphknoten aufgearbeitet wurden. 64 Prozent der zytokeratinpositiven Fälle wurden mit einem präoperativen cN1-Stadium ausgewiesen. Von 59 neoadjuvant behandelten Patienten konnten bei 41 Prozent (n=24) eine komplette, bei 54 Prozent (n=32) eine partielle und bei 3,3 Prozent (n=2) keine Remisson beobachtet werden. Ein Fall wies einen Progress auf. Alle Fälle mit dem Nachweis avitaler Mikro- oder Makrometastasen hatten eine neoadjuvante Therapie erhalten. Keine statistische Signifikanz zeigte die Korrelation von zytokeratinpositiven Patienten mit dem Grad der Remission nach RCTX. Die 5-ÜLR aller pN0-Patienten betrug 39 Prozent mit einer mittleren ÜLZ von 3,7 Jahren. Patienten mit MM (n=5) zeigten mit einer mittlere ÜLZ von 4,1 Jahren keinen prognostischen Unterschied zu Patienten ohne MM (mittlere ÜLZ 3,7 Jahre). Als prognostisch ungünstig erwies sich die Gruppe der Patienten mit auf den Lymphknoten begrenzter Zytokeratinpositivität (CKLK+): mit 1,4 Jahren zeigte sich eine deutlich schlechtere mittlere ÜLZ als bei Patienten ohne Zytokeratinpositivität (CKLK-) (4,6 Jahre; p=0,02). Noch deutlicher zeigte sich die schlechtere Prognose zytokeratinpositiver Patienten nach Ausschluss der Patienten mit MM (p=0,01). 65 Ergebnisse Neoadjuvante Therapie hatte ohne Beachtung des histologischen Subtyps für das Gesamtkollektiv keinen Überlebensvorteil. Nach Ausschluss der zytokeratinpositiven Patienten zeigte sich eine mittlere ÜLZ von 5,4 Jahren bei vorbehandelten Patienten gegenüber 4,9 Jahre bei nicht vorbehandelten (p=0,24). Allein die Entität „Adenokarzinom“ hatte bei pN0-Patienten eine deutlich bessere Prognose als Patienten mit Plattenepithelkarzinomen (p=0,02). Patienten mit Adenokarzinomen scheinen eher von einer neoadjuvanten Therapie zu profitieren (p=0,005), als Patienten mit Plattenepithelkarzinomen, bei denen die Überlebensrate geringer ausfällt. Auch nach Ausschluss zytokeratinpositiver Patienten haben Adenokarzinom-Patienten eine signifikant bessere Prognose nach RCTX (p=0,03). Fälle mit Plattenepithelkarzinomen, bei denen ehemalige Lymphknotenmetastasen festgestellt wurden (CKLK+ ohne MM), hatten ein geringeres Überleben gegenüber denjenigen ohne avitale Zytokeratinpositivität (p=0,05). Konnte eine Lymphangiosis carcinomatosa nachgewiesen werden, ergab sich eine deutlich geringere mittlere ÜLZ von 0,7 Jahren versus 4,7 Jahre ohne Lymphangiosis carcinomatosa (p=0,03). Wurden Patienten, bei denen avitale Metastasen nachgewiesen wurden, neoadjuvant therapiert, hatten diese Fälle eine signifikant schlechtere Prognose als vorbehandelte Patienten ohne avitale Metastasen (p=0,04). Patienten mit partieller oder kompletter Remission nach RCTX zeigen einen signifikanten Überlebensvorteil gegenüber fehlender Remission oder Progress (p=0,023). In der multivariaten Auswertung durch Anwendung einer Cox-Regression-Analyse stellte sich sowohl die lymphknotenbegrenzte Zytokeratinpositivität als auch der histologische Subtyp Platteneptithelkarzinom als ungünstige Prognosefaktoren heraus. 66 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Diskussion Methodik 4.1.1 Diskussion des verwendeten Antikörpers AE1/AE3 Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Antikörper AE1/AE3 zur Detektion von Mikrometastasen wurde schon in mehreren Studien zu einer ähnlichen Fragestellung verwendet (vgl. Tabelle 28, S.66). Literaturquelle Thema n Antikörper Mikrometastasen /%N0 Fukagawa T. Et al.CANCER August 15, 2001 / Volume 92 [26] / Number 4 Mikrometastasen bei Magenkarzinom im Stadium pT2N0M0 107 AE1/AE3 (Boehringer Mannheim, Indianapolis) nur durch IHC identifizierbar als Einzelzelle oder Cluster/ 35,5%N0 Tanabe et al. Journal of Surgical Oncology [91] 2003;82:153–159 Mikrometastasen in LK bei Plattenepithel-CA des Ösophagus 78 AE1/AE3 (Dako, Kyoto,Japan) Einzelzelle oder Cluster <5 Zellen/ 26,1%N0 Yasuda et al. Annals of Surgical Oncology 2002, 9(8):771–774 Prognostische Auswirkungen von Mikrometastasen bei N0gestagten Patienten mit Magen-CA 64 CAM 5.2 (Becton Dickinson, San Jose, CA) nur durch IHC identifizierbar als Einzelzelle oder Cluster/ 32,0%N0 Lee et al. CANCER June 1, 2002 Vol. 94 [55] (11) Prognostische Relevanz von IHC-identifizierten Mikrometastasen bei Patienten mit Magen-CA 153; 46: ECG 107:ACG AE1/3 (Dako, Santa Barbara, CA) 1 oder mehr Zellen mit epithelialer Morphologie, die mit CK angefärbt wurden/24%N0 Morgagni et al. World Journal of Surgery [64] 2003, 27: 558-561 LK-Mikrometastasen bei Magenfrühkarzinom und ihr Einfluß auf die Prognose 300 MNF 116 (DAKO, Milan, Italy) einzelzelle oder Cluster nur durch IHC identifizierbar/ 10%N0 Doki et al. Journal of surgical research [21] 2002, 107:75-81 CK in LK bei Ösophaguskarzinom (N0) zeigt klinische Signifikanz bei Mikrometastasen 41 AE1/3 (DAKO) anti E-cadherin anti CD68 AK Nuklei sichtbar durch postHE 24%N0, nur CK-Anreicherung 44%N0, AE1/3 deutl. überlegen Natsugoe et Mikrometastasen und al.CANCER TumorCell-Microinvolvement September 1, 1998 / bei SqCC (N0+N1) Volume 83 / Number 5 41 N0 AE1/AE3 (Boehringer Mannheim, Germany) CK pos. 36,6%N0 MM+/-TCM 31,7%N0 Glickman et al. CANCER February 15, 1999 / Volume 85 [30] / Number 4 78 N0 AE1/AE3 (DAKO Carpinteria, CA) 31% N0 (Adenokarzinom) 17% N0 (Plattenepithelkarzinom, Keine Korrelation mit schlechterer Prognose [109] [66] Die prognostische Signfikanz von LK-Mikrometastasen bei Patienten mit Ösophaguskarzinom Tabelle 28: vergleichbare Arbeiten mit Patientenanzahl, verwendetem Antikörper und Ergebnissen 67 Diskussion Dieser Antikörper eignet sich besonders gut für den Nachweis von Zellen epithelialen Ursprungs eignet, durch die fehlende Anfärbbarkeit des Lymphknotengewebes lässt sich somit ein guter Kontrast zur Detektion von Mikrometastasen herstellen. Woodcock beschrieb schon 1982 die zuverlässige, spezifische ZytokeratinAnfärbung epithelialer Zellen durch AE1/AE3 [106] . Sato et al. testete in einer Studie 2001 neben AE1/AE3 auch weitere epidermale Zellmarker aus. Dabei zeigten die Antikörper Ber-EP4 und anti-epithelial membrane-antigen (EMA) eine schwächere und mehr heterogene Immunreaktivität als AE1/AE3, so dass letztendlich dieser zur Detektion von Mikrometastasen verwendet wurde [79] . Izbicki et al. verwendete Ber- EP4, weil dieser Antikörper im Gegensatz zu AE1/AE3 mit epithelialen, jedoch nicht mit mesothelialen Zellen reagiert [39] . In einer Studie von DakoCytomation über die Anfärbbarkeit von normalem Gewebe durch AE1/AE3 wurde ebenfalls gezeigt, dass mesotheliale Zellen stark mit dem Antikörper reagieren [20] . Wie aus der Abbildung 9, S. 50 entnommen werden kann, wurde dieses Phänomen auch in der vorliegenden Arbeit registriert. Durch die typische Morphologie und Lokalisation der mesothelialen Zellen stellte sich die Differenzierung zu Zellen malignen Ursprungs als nicht schwierig heraus. Aus den Testergebnissen der Studie von DakoCytomation wurde ebenfalls abgeleitet, dass AE1/AE3 sehr gut zum Nachweis abnormalen Gewebes epithelialen Ursprungs geeignet ist. In der vorliegenden Studie wurde eine Verdünnung des Antikörpers von 1:200 verwendet, die nur wenig von den Literaturangaben abweicht (1:50 bis 1:500). Diese Dilution ergab den besten Gewebekontrast in den durch institutseigene Vorbehandlung präparierten Schnitten. Die unerwartet hohe Artefaktrate lässt sich durch verschiedene Aspekte erklären. Zum einen ist schon bei der Operation eine große Kontaminationswahrscheinlichkeit mit Epithelien oder Tumorzellen durch das operierende Personal gegeben, zum anderen ist selbige im Zuschnitt und Gewebekonservierung nicht wesentlich geringer. Selbst bei der erneuten Aufarbeitung der paraffinierten Gewebeblöcke ist eine Verschmutzung der Präparate durch Epithelreste nicht unwahrscheinlich. Durch die schon erwähnten Kriterien einer Tumorzelle ließ sich jedoch auch dieses differentialdiagnostische Problem lösen, die endgültige Festlegung zur positiven Aussage „Mikrometastase“ oblag einem Pathologen, mit dem alle zweifelhaften Fälle diskutiert wurden. 68 Diskussion 4.1.2 Diskussion der verwendeten Untersuchungsmethode In vielen Studien über Mikrometastasen bei Ösophagus- oder Magenkarzinom zeigte sich, dass der Nachweis von malignen Zellen durch die konventionelle H&E- Färbung ineffizient ist. (z.B. [17]). Nach Hermanek et al. müssen Mikrometastasen im Sinne von okkulten Metastasen klar von isolierten (disseminierten oder zirkulierenden) Tumorzellen (ITC) abgegrenzt werden. Von einer Mikrometastase könne demnach nur gesprochen werden, wenn eine Implantation von Tumorzellen in das betroffene Organ entsprechende Rückwirkungen wie Extravasation, Proliferation und Stromareaktion hervorgerufen hat. Diese Bedingungen führen dazu, dass die Diagnose „Mikrometastase“ nur durch die histologisch-morphologische Untersuchung gestellt werden kann, was bei RTPCR-Methoden oder Zusammenhang mit Durchflußzytometrie der bereits nicht erwähnten möglich ist [32] . Kontaminationsrate Auch im ist die Durchflußzytometrie als alternatives Verfahren zur Detektion von Mikrometastasen als vermindert aussagefähig einzustufen. Leers et al. berichtet dennoch von Vorteilen dieser Methode: so werde der gesamte Lymphknoten untersucht, es ergäben sich Aussagen über die DNS-„ploidy“ und man könne metastatische Zellen zu weiteren Forschungsvorhaben separieren [57] . Yamamoto et al. konnten 1997 in einer Studie über den prediktiven Wert der Detektion von Mikrometastasen mittels Gentechnik feststellen, dass positive PCR-Ergebnisse zwar sehr gut Tumor-DNA nachweisen können, dies aber nicht zwingend zum Schluss führt, dass lebensfähige Tumorzellen existieren [108] . Es wurden noch keine exakten Tumor-Gene beschrieben, die den spezifischen Nachweis von malignen Zellen erbringen können, da die meisten molekular-biologischen Tests nur die Expression von z.B. Keratin 19 oder CEA als Marker für epitheliale Tumorzellen nachweisen können. Transkripte dieser Gene sind jedoch auch im Blut, Knochenmark und Lymphknoten gesunder Personen nachgewiesen worden, was für eine geringe Spezifität der RT-PCR-Methode spricht. Desweiteren beeinflussen benigne epitheliale oder mesotheliale Zellen den Aussagewert des molekularen Nachweises. [57] . Zudem ist die ultrasensitive gentechnische Methode äußerst störanfällig, z.B. durch illegitime Transkriptionen [9]. Hermanek et al. konstatierte zum Vergleich der aufgeführten Techniken, dass nichtmorphologische Nachweistechniken zu mehr falsch-positiven Ergebnissen als morphologische Untersuchungsmethoden (insbesondere Immunhistochemie mit Zytokeratinen) führen. Andere Studien, in denen genetische Mutationen des K-ras 69 Diskussion oder p53-Gens untersucht wurden, zeigten eine höhere Sensitivität, okkulte Lymphknotenmetastasen zu detektieren als konventionelle histologische Methoden. Die Immunhistochemie mit Antizytokeratin-Antikörpern hingegen ist einfacher, schneller, ausreichend sensitiv und spezifisch und genauso exakt wie genetische Analysen in Fällen von Patienten mit Adenokarzinomen des Kolons und Rektums [78]. 4.2 Klinische Bedeutung 4.2.1 Klinische Bedeutung von Lymphknotenmikrometastasen und Zytokeratinpositivität Viele Studien haben den Einfluss von Lymphknotenbefall und Invasionstiefe des Primärtumors als bedeutendste prognostische Parameter erkannt. Lymphknotenmetastasen sind ein wichtiger Parameter für eine schlechte Prognose bei Patienten mit Ösophaguskarzinom [75] . Der präzise Lymphknotenstatus unter Einbeziehung von okkulten Tumorzellen im Sinne von Lymphknotenmikrometastasen musste hinsichtlich seiner klinischen Relevanz hinterfragt werden. Verschiedene Studien näherten sich der Frage zur Bedeutung von Mikrometastasen auf unterschiedliche Art und Weise. Ob Mikrometastasen eine klinische Signifikanz aufweisen, wurde in vielen Studien bei vielen Tumortypen kontrovers diskutiert. Einige Autoren haben über einen fehlenden Einfluss von Mikrometastasen auf die Prognose berichtet: • McGuckin et al. bei Brustkrebs [62] • Greenson et al. beim kolorektalen Karzinom [31] • Ishida et al. beim Magenkarzinom [38] • Maehara et al. beim Magenfrühkarzinom [58]. Andere jedoch fanden ungünstige Effekte auf postoperative Überlebenskurven: • Galea et al. beim Mammakarzinom [28] • Jeffers et al. beim kolorectalen Karzinom [40]. Es ist bekannt, dass ein großer Teil von Ösophaguskarzinom-Patienten, die augenscheinlich keine Lymphknotenmetastasen hatten, früh an einer metastasierenden Erkrankung verstirbt. Es muss daher evaluiert werden, inwieweit okkulte, in der routinehistologischen Untersuchung nicht nachweisbare Metastasen, die Prognose beeinflussen. 70 Diskussion In der vorliegenden Arbeit zeigen diejenigen Patienten, in deren Lymphknoten Zytokeratinpositivität nachgewiesen wurde, eine deutlich schlechtere Prognose unabhängig von der präoperativen Behandlung (5-ÜLZ CKLK+ 29 Prozent vs. CKLK- 43 Prozent, p=0,02) (siehe Abbildung 12, S.56). Dies könnte bedeuten, dass nur diejenigen Patienten ein Benefit von der neoadjuvanten Therapie haben, die primär keinen Lymphknotenbefall aufzeigen. Dies wird bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom besonders deutlich: waren ehemalige Metastasen vorhanden (Zytokeratinpositivität ohne Mikrometastasen), ist die Überlebenszeit deutlich geringer als ohne den Nachweis avitaler Metastasen (siehe Abbildung 15, S. 59). Es existieren einige Studien, die den prognostischen Einfluss von Mikrometastasen bei Patienten mit Ösophaguskarzinom untersucht haben (Tabelle 29, S.71). Studiendesign, Auswahl der Patienten und Methodik unterscheiden sich in diesen Arbeiten sehr. Somit scheint es nicht verwunderlich, dass die Ergebnisse ebenfalls sehr voneinander abweichen. Stets stoßen die einzelnen Analysen durch geringe Fallzahlen an die Grenzen der statistischen Aussagekraft. Nur eine größer angelegte und prospektive Studie mit höherer Fallzahl kann eine verlässlichere Aussage über die Bedeutung von Mikrometastasen liefern. Eine so große Anzahl an Patienten kann allerdings nur in einer multizentrischen Analyse gewährleistet sein. Alle bisherigen Studien waren retrospektiv angelegt; um die Frage nach dem Einfluss von Mikrometastasen auf die Prognose zu beantworten, ist eine große prospektive Studie vonnöten. Äußerst wichtig dabei wäre eine einheitliche Definition von Mikrometastasen, ein standardisiertes Studienprotokoll und getrennte Analysen für jeden histologischen Subtyp. Einige Autoren sprechen von „occult lymph node metastases“ [30] und verzichten weitestgehend auf histologische Abgrenzungen, andere unterscheiden „tumor cell microinvolvement“ und „micrometastases“ durch die Art der nodalen Stromareaktion [66] . Tanabe et al. unterschieden „micrometastases“ von „tumor cell deposits“ nach Anzahl der Zellen (>5) bedeutungslosen [91] . Doki et al. grenzten „micrometastatic cancer cells“ von „cytokeratin deposits“ ab [21] . Drei Autoren setzten Definitionskriterien für die Größe von Mikrometastasen fest, so beschrieben bei Glickman et al., Natsugoe et al., Komukai et al.: „weniger als 2 mm im Diameter“ „weniger als 0,5 mm im Diameter“ Tumorzellen“ [50]. [66] [30] , und „genauso viel oder weniger als fünf 71 Diskussion 2-ÜLZ No. LK øLK/ Pat. N MM(%) MM+ (%) AK Einfluss Prognose 399 10 pN0-1 15/30 (50) 68 25 Ber-EP4 Ja T1-3 1954 24 pN0-1 15/41 (37) 85 38 AE1/AE3 Ja AC T1-3 341 7 pN0 15/49 (31) 55 58 AE1/AE3 Nein SCC T1-3 233 8 pN0 5/29 (17) 88 89 AE1/AE3 Nein 2000 SCC T1-3 2845 75 pN0 14/37 (38) 91 50 AE1/AE3 Ja [79] [21] 2001 SCC T1-4 1840 37 pN0 20/50 (40) 86 85 AE1/AE3 Nein 2002 SCC T3-4 2168 53 pN0 11/41 (27) 73* 29* AE1/AE3 Ja 2002 AC/SCC T1-3 2001 16 pN0 14/124 (11) 77 64 AE1/AE3 Nein 2003 1948 42 pN0 12/46 (26) n.a. n.a. AE1/AE3 Nein Freiburger Arbeitsgruppe 2005 AC/SCC T1-4 1435 17 pN0 6/83 (7) 65 60 AE1/AE3 Nein Referenz Jahr [39] Izbicki et al. 1998 [30] 1999 AC/SCC Adenokarzinom Plattenepithelkarzinom Komukai et al. Sato et al. Doki et al. [50] Vazquez-Sequeiros et [98] al. Tanabe et al. T 1997 AC/SCC T1-4 [66] Natsugoe et al. Glickman et al. Entität [91] SCC SCC T1 MM+ (%) * 5-ÜLZ, n.a.: nicht angegeben, AK: verwendeter Antikörper, AC: Adenokarzinom, SCC: Plattenepithelkarzinom Tabelle 29: Vergleich diskutierter Arbeiten hinsichtlich Ergebnis, Antikörper und Prognose Alle Mikrometastasen, die in der hier präsentierten Studie gefunden wurden, waren weniger als 0,5 mm im Diameter, Cluster mit mehr als 5 Zellen inbegriffen. Sato et al. unterteilte detektierte Mikrometastasen in Stage I bis III (nach Zellanzahl) [79] und Methoden Demeure konstatierten zudem, dass routinehistologische . Keene metastatische Foci nur über 2 Millimeter nachweisen könnten, und der Term „Mikrometastase“ für jeden Cluster von Tumorzellen zuträfe, sobald dieser nicht durch die konventionelle Nachweistechnik detektiert werden kann [45] . Es wurde berechnet, dass routinehistopathologische Untersuchungen nur eine einprozentige Chance haben, winzige Foci von „metastatic cancer“ zu detektieren, die weniger als 3 Zellen aufweisen. Mikroskopische Untersuchungen mit Immunhistochemie von mehreren Schnitten durch einen Sentinel-Lymphknoten von Patienten mit Brustkrebs oder Melanom konnten die Detektionsrate des „metastatic cancer“ erhöhen [45] . Es ist nicht verwunderlich, dass die Detektionsrate mit Anzahl der Schnitte steigt, da zumeist in der Routinehistologie nur ein bis zwei Schnitte pro Lymphknoten angefertigt werden und kleine Tumorzelleinschlüsse durchaus übersehen werden können. Izbicki, Hosch et al. ergänzten, dass die Untersuchung von mehr als drei Schnitten routinemäßig nicht durchführbar ist, diese Menge jedoch suffizient für die Detektion okkulter Tumorzellen zu sein scheint Diskrepanz von Studienergebnissen sind [39] durch . Weitere Gründe für die unterschiedliche klinische 72 Diskussion Hintergründe von pN0-Patienten und die sehr unterschiedliche Anzahl an untersuchten Lymphknoten gegeben. Wong et al. konstatierte dazu, dass die Anzahl untersuchter Lymphknoten die Staging-Genauigkeit bei kolorektalen Karzinomen beeinflusst [105] . Wie die Abbildung 7, S. 46 im Ergebnisteil dieser Arbeit zeigt, stieg die Detektionsrate bei Nachweis von Zytokeratinpositivität durch eine größere Lymphknotenanzahl. Demnach scheint die Staginggenauigkeit nicht nur von der Anzahl der Schnitte, sondern auch von der Anzahl der untersuchten Lymphknoten abhängig zu sein. In einer vergleichbaren Studie von Natsugoe et. al. 1998 wurden 1945 Lymphknoten von 69 Patienten (pT1-3, N0-1, M0) mit Plattenepithelkarzinom untersucht [66] . Die Autoren stellten fest, dass Mikrometastasen, die sie als individuelle, durch AE1/AE3 immunhistochemisch nachgewiesene Tumorzellen oder –cluster unter 0,5 mm mit einer umgebenden Stromareaktion definierten, einen unabhängigen prognostisch ungünstigen Faktor darstellen. Dabei hatten die Patienten, die – vorher N0 – Mikrometastasen aufwiesen, ein ähnliches schlechtes Outcome wie Patienten im N1Status. Unterschieden wurde in dieser Studie „micrometastases“ (MM) vom sogenannten „tumor cell microinvolvement“ (TCM) ohne umgebende Stromareaktion. TCM allein (4,9 Prozent der Fälle, n=2) hatte keinen Einfluss auf die Prognose, allerdings scheint die Anzahl der Patienten zu gering zu sein, um diese Aussage sicher treffen zu können. Die Studie von Natsugoe et al. lässt unklar, ob sich das durch die Autoren berechnete kumulative Überleben nur auf die Patienten mit Mikrometastasen bezieht, oder ob sie die TCM-Fälle mit berücksichtigten. Falls letzteres der Fall ist, kann man die Signifikanz auf das Überleben mit dem signifikant negativen Einfluss von zytokeratinpositiven (CKLK+) Lymphknoten auf die Überlebenszeit von Patienten in der vorliegenden Studie durchaus vergleichen. Einschränkend ist zu sagen, dass Natsugoe et al. nur Patienten mit Plattenepithelkarzinom analysierte und der Einfluss von neoadjuvanter Therapie nicht berücksichtigt wurde. Ebenfalls wird keine Aussage über den Vitalitätsstatus der detektierten Tumorzellen gemacht, während in der vorliegenden Arbeit enge Kriterien zur Definition einer Mikrometastase gesetzt wurden. Natsugoe et al regt an, dass Patienten mit neu entdeckten Mikrometastasen auf pN1 reklassifiziert werden sollten. 107 in der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg operierte Ösophaguskarzinompatienten mit Lymphknotenbefall (pN1) aus dem gleichen Zeitraum wie das pN0-Kollektiv dieser Arbeit hatten eine 2-ÜLZ von 18 Prozent und 73 Diskussion eine 5-ÜLZ von 8 Prozent (Median 0,92 ±0,15; Konfidenzintervall 0,63;1,20; Datenpool der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg). Diese Zahlen sind nur wenig schlechter als jene bei zytokeratinpositiven Patienten mit einer medianen Überlebenszeit von 1,4 Jahren (±0,2), hingegen deutlich schlechter als bei Patienten mit Lymphknotenmikrometastasen mit einer medianen Überlebenszeit von 4,1 Jahren (±2,6). PN0-Patienten, bei denen Zytokeratinpositivität in Lymphknoten (CKLK+) immunhistochemisch nachgewiesen werden konnten (pN0LK+), haben demnach eine ähnlich schlechte Prognose wie pN1-Patienten . Diese Erkenntnis steht im Gegensatz zu dem alleinigen Nachweis von Mikrometastasen, die keinen unabhängigen Einfluss auf die Prognose haben. Der prognostische Einfluss von zytokeratinpositiven Lymphknoten ist weniger durch das Vorhandensein von Mikrometastasen, als vielmehr durch Residuen von ehemaligen teilvitalen oder avitalen Lymphknotenmetastasen zu erklären. Natsugoe definierte metastatische Tumorzellen mit folgenden Eigenschaften: Tumorzellen mit einer Stromareaktion des umgebenden Gewebes, Bildung von Narbengewebe und desmoplastischem Gewebe. Nichtmetastatische Tumorzelleinschlüsse weisen keine Stromareaktion auf. In Studien, in denen dieser Unterschied zugrunde gelegt wurde, zeigte sich, dass nichtmetastatische Lymphknotenbeteiligungen einen zu vernachlässigenden Einfluss auf die Prognose haben. In Anlehnung an die Ergebnisse diskutierte der Natsugoe die Relevanz einer erweiterten Lymphadenektomie beim Plattenepithelkarzinom des Ösophagus. Die Rate von Lymphknotenmetastasen ist offensichtlich höher, als Routinemethoden dies zeigen. Deshalb müssen Prozeduren, die auch die versteckten Tumorzellen in Lymphknoten ausräumen, erweitert werden. Die Ergebnisse der voriegenden Arbeit deuten jedoch daraufhin, dass Mikrometastasen keinen Einfluss auf die Prognose haben und eine erweiterte Lymphadenektomie in dieser Beziehung keinen Vorteil bringt. Hingegen könnte bei denjenigen Patienten, die trotz präoperativer Radiochemotherapie noch Residuen von ehemaligen Lymphknotenmetastasen aufweisen, eine erweiterte Lymphknotenentfernung sinnvoll sein. Das präoperative nodale Staging ist jedoch zu ungenau, um diese Gruppe von Fällen exakt zu erfassen. Glickman et al. untersuchten in einer Studie mit 78 pN0-Patienten (Adenokarzinome und Plattenepithelkarzinome), von denen 34 eine präoperative Radiochemotherapie erhalten hatten, ebenfalls Lymphknotenmikrometastasen [30] die prognostische Signifikanz okkulter . Bei 31 Prozent der Adenokarzinom-Patienten und 74 Diskussion 17 Prozent der Plattenepithel-Patienten wurden okkulte Lymphknotenmetastasen nachgewiesen. Dabei wurden alle mit AE1/AE3 positiv angefärbten Zellen oder Zellgruppen mit typischen Lymphknotenmetastasen Tumorzell-Merkmalen gewertet, was der in dieser als okkulte Arbeit definierten Zytokeratinpositivität im Wesentlichen entspricht. Glickman konstatierte, dass weder beim Adenokarzinom (p=0,46) noch beim Plattenepithelkarzinom (p=0,9) okkulte Lymphknotenmetastasen mit einer schlechteren Überlebenszeit korrelierten. Beim Adenokarzinom zeigte sich eine signifikante Korrelation mit der Invasionstiefe des Primärtumors, jedoch Parametern, bis mit auf keinen die weiteren Tatsache, klinischen dass oder Patienten pathologischen mit okkulten Lymphknotenmetastasen eher eine präoperative Radio- oder Chemotherapie erhalten hatten. Dies deckt sich mit den Ergebnissen in dieser Arbeit (siehe Tabelle 21, S.53). Trotzdem zeigt sich auch hier die sehr differente Definition von Mikrometastasen. Glickman benutzt wohl sehr bedacht nicht den Begriff der „Mikrometastase“, vielmehr spricht er von versteckten, zytokeratinpositiven Tumorzellen oder –verbänden, deren Nachweis in der Routinehistologie nicht möglich ist. Die Studie von Glickman et al. könnte Patienten mit einer pN0Erkrankung eingeschlossen haben, deren metastatische Zellen durch sorgfältigere Untersuchung mittels H&E-Färbungen detektierbar gewesen wären, da jeweils nur ein H&E-Schnitt angefertigt wurde. In der Studie von Komukai et al. könnten Patienten mit Metastasen, die in der H&E-Färbung schwierig zu entdecken waren, ausgeschlossen worden sein, da sehr viele konsekutive Schnitte von einem Lmphknoten hergestellt wurden [50] . Trotz der sorgfältigen Abschätzung des Definitionsprozesses von MM durch zahlreiche Kriterien war es schwierig, einen signifikanten Einfluss zu finden. Nur zum Teil decken sich also die in der vorliegenden Arbeit benutzten Kriterien mit denen der Glickman-Gruppe; Unterschiede in der Auswertung hinsichtlich der prognostischen Signifikanz sind demnach zu erwarten. Glickman fand eine Korrelation zwischen einem höheren TStadium (UICC) und dem gehäuften Auftreten von Mikrometastasen heraus, in der vorliegenden Arbeit ließen sich weder Mikrometastasen (p=0,19) noch Zytokeratinpositivität (p=0,08) signifikant mit einem höherem T-Stadium verbinden. Die Differenzierung zwischen den histologischen Subtypen des Ösophaguskarzinoms in der Studie von Glickman et al. führt zu noch geringeren Fallzahlen und lässt somit an der statistischen Aussagekraft zweifeln. Noch mehr 75 Diskussion stellt die geringe Fallzahl sowohl an Patienten als auch an Mikrometastasen in jeder der hier diskutierten Studien eine ausreichend zuverlässige Interpretation der Ergebnisse in Frage. Die alleinige Anwesendheit von Mikrometastasen stellt daher keine Indikation für eine erweiterte Lymphadenektomie dar, was auch durch die präsentierten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigt wird. Falsch negative Ergebnisse, allen voran die Abhängigkeit des Nachweises von okkulten Tumorzellen von der Anzahl der untersuchten Lymphknoten, bedeutet sowohl bei Glickman et al. und in der vorliegenden Arbeit eine potentielle Limitierung. Zwar nicht signifikant (p=0,182), besteht in der vorliegenden Studie dennoch ein Unterschied von durchschnittlich 16,3 (± 11,6) untersuchten LK bei zytokeratinnegativen gegen durchschnittlich 20,2 (± 8,6) LK bei zytokeratinpositiven Patienten (siehe auch Abbildung 7, S. 46). So lässt sich annehmen, dass die Detektionsrate versteckter maligner Zellen in Lymphknoten von ÖsophaguskarzinomPatienten steigt, je mehr Lymphknoten untersucht werden. Vor allem in japanischen Studien (Tabelle 29, S. 711), denen durch erweiterte Lymphadenektomien wesentlich mehr Lymphknoten zur Verfügung standen [21, 50, 79, 91] , zeigten sich ebenfalls höhere Detektionsraten. Weitere erwähnenswerte Einschränkungen entstehen dadurch, dass nicht alle regionalen Lymphknoten operativ entfernt und systematisch aufgearbeitet werden und somit mögliche Mikrometastasen oder zytokeratinpositive Tumorzellen übersehen werden. Ebenso hat die Anzahl der Schnitte Einfluss auf das Ergebnis: Ishida et al. konnten zeigen, dass die Analyse vieler Schnitte, verglichen mit der Analyse von nur einem Schnitt, die Detektionssensitivität von kleinen metastatischen Foci in Lymphknoten erhöhen konnte [38] . Ziel der vorliegenden Studie war es, durch die Festlegung von sechs aufeinander folgenden repräsentativen Schnitten pro Lymphknoten eine möglichst große Wahrscheinlichkeit zu erreichen, Mikrometastasen zu finden. In den in der Tabelle 29, S. 70 aufgeführten Studien wurden vier [26] bis zehn [91] Schnitte pro Lymphknoten ausgewertet, wobei der konsekutive Abstand im Durchschnitt 150 bis 250 µm betrug. Die in dieser Studie verwendeten Parameter wie Schnittanzahl, -abstand und –dicke orientierten sich an den bereits erwähnten Referenzen. Glickman erwähnt zudem, dass er nur eine 2ÜLZ beachtet hat und Mikrometastasen möglicherweise einen Einfluss auf das spätere Überleben haben könnten. In der vorliegenden Arbeit bleibt der Effekt von 76 Diskussion Mikrometastasen sowohl nach zwei als auch nach fünf Jahren bedeutungslos für die Prognose. Allerdings ist das Vorhandensein von Lymphknotenmakrometastasen der bedeutsamste prognostische Faktor für Patienten mit Ösophaguskarzinom. Es konnte anhand der Ergebnisse dieser Arbeit deutlich gezeigt werden, dass ehemals vorhandene Metastasen (avitale Mikro- oder Makrometastasen) selbst nach präoperativem, multimodalem Therapiekonzept noch immer einen ungünstigen Effekt auf die Überlebenszeit haben. Nach den Ergebnissen der hier vorgestellten Arbeit findet sich ein signifikanter negativer Effekt von zytokeratinpositiven Zellen auf die Prognose vor allem bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom. Aufgrund der geringen Fallanzahl bleibt die nicht signifikante Aussage beim Adenokarzinom fraglich. Eine andere Studie von einer Arbeitsgruppe um Izbicki untersuchte 399 Lymphknoten von 68 Patienten mit Ösophaguskarzinom ohne offenkundige Metastasen (M0) durch immunhistochemische Methoden (Ber-EP4) auf okkulte Tumorzellen [39] . Dabei war der pN-Status unerheblich. Von den 399 primär tumorfreien Lymphknoten wiesen 67 Lymphknoten (17 Prozent) Ber-EP4-positive Zellen (gefunden bei 42 von 68 Patienten) auf. 15 von 30 Patienten (N0) konnten damit als Ber-EP4-positiv bezeichnet werden. Durch Korrelation mit Überlebensdaten fand Izbicki heraus, dass Ber-EP4-positive Zellen in primär tumorfreien Lymphknoten ein unabhängig prognostischer Wert waren, es ließ sich ein signifikant verringertes rezidivfreies Intervall und verringertes Gesamtüberleben beweisen (sowohl bei Patienten mit und ohne primär befallenen Lymphknoten). Zusammenfassend ging die Arbeitsgruppe davon aus, dass immunhistochemische Untersuchungen von Lymphknoten das pathologische Staging verbessern können. Izbicki et al. diskutierte, dass die lymphatische Dissemination von Tumorzellen eher auftreten könnte als hämatogene Aussaat. Lymphknotenmikrometastasen wurden sogar in T1-Stadien detektiert (in dieser als auch in anderen Studien). Die Daten von Izbicki müssen jedoch aus verschiedenen Gründen hinterfragt werden. Zum einen werden Patienten mit oder ohne Mikrometastasen bezüglich der Prognose unabhängig vom Vorhandensein offenkundiger Lymphknotenmetastasen verglichen; bei Ausschluss derjeniger Patienten mit pN1-Status würde sich wahrscheinlich keine signifikante Korrelation ergeben. Zum anderen wurden von den initial 1308 Lymphknoten nur 680 histologisch oder immunhistochemisch aufgearbeitet, die restlichen wurden von den operierenden Chirurgen als nicht tumorfrei eingeschätzt. Somit basiert das Protokoll 77 Diskussion dieser Arbeit auf einer sehr zweifelhaften Präselektion von Lymphknoten, denen man makroskopisch eventuelle kleinere Metastasen nur schwerlich ansehen kann. Die Anzahl von 399 routinepathologisch tumorfreien Lymphknoten ist für eine suffizient prognostische Aussage zu klein. Der in Denver ansässige Pathologe A. S. Knisely nahm im New England Journal of Medicine in einem Leserbrief auf die in der Publikation von Izbicki abgebildeten Tumorzellen Bezug und zweifelte aufgrund der dargestellten zytokeratinaufnehmenden Partikel zu recht an deren Malignität [49]. Die Daten der vorliegenden Arbeit trennen eindeutig Mikrometastasen durch strenge Definition von zytokeratinaufnehmenden, avitalen Partikeln. Hier ist wohl auch der Grund zu suchen, weshalb nur wenige okkulte Mikrometastasen in Lymphknoten gefunden wurden. Wie bereits eingangs erwähnt, scheinen diese metastatischen Foci keinen Einfluss auf das Überleben der untersuchten 80 Patienten zu haben; aufgrund der geringen Fallzahl und sich widersprechender Literaturquellen bezüglich der prognostischen Korrelation okkulter Tumorzellen bei Patienten mit Ösophaguskarzinom ist eine multizentrische Studie für eine sicherere Aussage notwendig. Dies sieht die Arbeitsgruppe um Sato ähnlich [79] . Das Ziel dieser Studie war es ebenfalls, zu untersuchen, ob die Anwesendheit von Lymphknotenmikrometastasen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (Stadium pN0) einen prognostischen Einfluss hat. Etwa 1840 LK wurden von 50 pN0-SCC-Patienten untersucht, die sich einer kurativen Resektion des Primärtumors und einer systematischen Lmphadenektomie unterzogen haben. Zusätzlich wurden drei Mikrometastasen-Stadien etabliert: Stage I: eine individuelle AE1/3-positive Zelle; Stage II: multiple individuelle positive Zellen; Stage III: ein oder mehrere positive Cluster. Mikrometastasen wurden bei 20 Patienten detektiert (40 Prozent). Ein höheres Mikrometastasen-Stage (s.o.) war mit einer größeren T-Kategorie assoziiert (pT; p=0,023). Rezidive wurden bei neun Patienten beobachtet. Jedoch war die Rezidivhäufigkeit bei Patienten mit oder ohne Mikrometastasen etwa gleich. 23 von 30 Patienten ohne Mikrometastasen überlebten, während 15 von 20 Patienten mit Mikrometastasen noch lebten (5-ÜLZ von 75 vs. 78 Prozent, p=0,91). 26 von 30 Patienten ohne Mikrometastasen hatte kein Rezidiv, während 15 von 20 Patienten mit Mikrometastasen rezidivfrei blieben (5-Jahre-rezidivfreies-Überleben von 86 vs 73 Prozent, p=0,37). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Prognose betreffend des Stage-Grades der Mikrometastasen (s.o.). Multivariate Analysen 78 Diskussion zeigten ebenfalls, dass Mikrometastasen kein unabhängiger prognostischer Faktor sind (p=0.73). Zusammenfassend erklärt Sato, dass die immunhistochemische Detektion von Mikrometastasen ein Indikator für die lymphatische Dissemination von Tumorzellen sein kann. Jedoch hat der Nachweis von MM keinen Einfluss auf die Prognose bei nodal-negativen Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus. Diese Erkenntnis deckt sich mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie (p=0,68; siehe auch Tabelle 24, S. 58). Vor allem in der Arbeitsgruppe um Sato ist die Anzahl der gefundenen Mikrometastasen sehr hoch. Die durchschnittliche Lymphknotenanzahl pro Patient betrug 37 (in der hier vorgestellten Arbeit 17 LK pro Patient). Wie bereits erwähnt, steigt die Detektionsrate maligner Tumorzellen in Lymphknoten durch die Anzahl der resizierten Lymphknoten, jedoch zeigt die Arbeit von Sato et al. trotz der großen Anzahl an untersuchten Lymphknoten ebenfalls die fehlende prognostische Signifikanz von Mikrometastasen auf. Es ist anzunehmen, dass das Staging bei zu wenig Lymphknoten zu gut ausfallen kann. Weiterhin könnten in den hier untersuchten Lymphknoten durch die präoperative Radiochemotherapie viele mikrometatastatische Foci eradiziert worden sein. Allerdings ist die Arbeit von Sato et al. in einigen Punkten auch kritisch zu bewerten. So wurde nur ein einziger zusätzlicher „cross-section“-Schnitt, möglichst nahe am routinepathologischen Schnitt durchgeführt und immunhistochemisch angefärbt. Entsprechend univariater und multivariater Analysen haben Mikrometastasen keinen signifikanten Einfluss auf die Prognose in der Arbeit von Sato et al., die die Tumorgröße als bedeutsamsten unabhängigen Faktor betreffend die Prognose annimmt. Nachfolgend bestimmt das Geschlecht die Prognose: weibliches Geschlecht hat nach Ausschluss nodalpositiver Patienten eine bessere Prognose. Der Co-Autor Y. Shimada zeigte in einer eigenen Studie weitere, molekulare Prognosefaktoren von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus auf. In einer multivariaten Auswertung bezeichnete der Autor neben dem pN-Status und Geschlecht cyclin D1, E-cadherin, EGFR sowie die „cell regrowth capability“ als wichtige Faktoren für die Vorhersage des Survival oder Rezidivwahrscheinlichkeit [81] . Ein anderer Grund dafür, weshalb Mikrometastasen das Outcome bei Sato et al. nicht zu beeinflussen scheinen, ist, dass das Überleben von pN0-Patienten mit Mikrometastasen relativ besser ist als das in den anderen Studien. Die Strategie der systematischen Lymphadenektomie könnte einen Einfluss auf die Prognose haben, sogar wenn Mikrometastasen 79 Diskussion vorhanden sind. Das Ösophaguskarzinom ist dafür bekannt, häufig – sogar in sehr frühen Stadien - in Lymphknoten zu metastasieren. Zudem erreicht diese extensive lymphatische Aussaat nicht nur regionale, sondern auch zervikale oder entfernte abdominelle Lymphknoten, herausgefunden wurde [1, 68] wie durch erweiterte Lymphadenektomien . Wenn Lymphknoten nicht resiziert werden, könnte dies einen negativen Einfluss auf die Prognose bei eventuellem Vorhandensein von Mikrometastasen haben. Dieser Effekt wurde bei Shimada et al. wahrscheinlich deshalb nicht gesehen, weil Mikrometastasen in der frühen Phase der lymphatischen Dissemination effektiv entfernt wurden. Die 5-ÜLR von pN0-Patienten liegt in einigen Zentren bei etwa 70 Prozent, sogar nach erweiterter radikaler Ösophagektomie [69] . Jedoch bringt die erweiterte Lymphadenektomie hohe Raten an Morbidität mit sich, eine akkurate Einschätzung der Patienten und ihres individuellen Operationsrisikos ist somit unumgänglich, zumal die ÜLZ nodalpositiver Patienten in Verbindung mit radikalen Operationstechniken enorm sinkt [69]. Selbst bei pN0-Patienten sind Erkrankungsrezidive in entfernteren Organen nicht selten . Dies legt den Schluss nahe, dass maligne Einzelzellen oder Cluster, die nicht durch klinische oder histologische Techniken entdeckt werden konnten, schon vor der chirurgischen Intervention disseminiert haben [50]. Komukai et al. untersuchten 2845 zervikale, mediastinale und abdominelle Lymphknoten, die systematisch bei 37 pN0-Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus [50] entfernt wurden. Durchschnittlich wurden 75 Lymphknoten pro Patient untersucht. Nodale Mikrometastasen wurden bei 14 von 37 Patienten gefunden (38 Prozent). Postoperative Rezidive waren bei pN+-Fällen mit 50 Prozent signifikant (p=0,008) höher als bei MM- mit 9 Prozent. Gesamtüberleben und Rezidivfreies Überleben war in der ersten Gruppe signifikant schlechter als in der zweiten Gruppe. Nodale Mikrometastasen haben einen unabhängigen prognostischen Einfluss auf das rezidivfreie Überleben, wie in einer multivariaten Analyse dieser Studie bewiesen. Gleiche Inzidenzen wie in der Arbeitsgruppe um Komukai (~40 Prozent) liegen in den Studien von Natsugoe et al. und Izbicki et al. vor. Die Ergebnisse in der hier präsentierten Arbeit weichen jedoch davon ab: die Inzidenz von Mikrometastasen betrug 8,25 Prozent, die Inzidenz von Zytokeratinpositivität war jedoch, wie bereits bekannt, mit 42,5 Prozent deutlich höher. Falsch positive Ergebnisse durch die sehr geringe Fallanzahl (n=37) und hohe 80 Diskussion Detektionsraten aufgrund der enorm großen Anzahl an untersuchten Lymphknoten pro Patient sind in der Studie von Komukai durchaus wahrscheinlich In der Studie von Komukai et al. sind Lymphknotenmikrometastasen der einzige unabhängige Risikofaktor für ein postoperatives Rezidiv bei Patienten ohne histologisch offenkundige Lymphknotenmetastasen. Die Hälfte dieser Patienten hatte eine Rezidiverkrankung nach Ösophagektomie. Kontrovers sah dies Tanabe et al. in einer ähnlichen Studie: keiner der primär pN0-Patienten hatte ein Tumorrezidiv nach Ösophagektomie, ungeachtet des Auftretens (oder Nichtauftretens) von nodalen Mikrometastasen [91] . In der vorliegenden Arbeit gingen die eventuellen Rezidiverkrankungen nicht in das Follow-Up mit ein, derzeit werden jedoch die Rezidivdaten gesammelt und ausgewertet – und ist aktuell Gegenstand einer anderen Studie. Die Arbeitsgruppe von Komukai konnte zeigen, dass die Mehrzahl der Patienten mit Rezidiv an hämatogener Fernmetastasierung starb. Diese Ergebnisse zeigen, so Komukai, dass Patienten ohne histologisch offenkundige LK-Metastasen aber mit immunhistochemisch detektierten nodalen Mikrometastasen ein größeres Risiko für eine Rezidiverkrankung haben und eine postoperative Chemotherapie erhalten sollten. Eventuell könnte eine postoperative Radiochemotherapie bereits die Rezidivrate senken, was in weiteren Studien herauszufinden wäre. Eine Arbeitsgruppe um Tanabe et al. arbeitete 2003 3494 Lymphknoten von 78 Patienten mit einem oberflächlichen Plattenepithelkarzinom des Ösophagus auf [91] . Von den 78 Patienten hatten 34 weder Mikro- noch Makrometastasen; 12 hatten nur nodale MM, 32 histologisch offenkundige Metastasen. Nodale Mikrometastasen wurden nur bei Karzinomen, die die Muscularis mucosae oder eine tiefere Penetration erreichten, gefunden. Multivariate Analysen zeigten eine signifikante Korrelation zwischen dem Auftreten von nodalen Mikrometastasen und intraösophagealen, multizentrischen Karzinom und venöser Infiltration (p=0,005 und 0,017). Jedoch zeigte sich kein klinischer Einfluss von nodalen Mikrometastasen hinsichtlich des Patienten - Outcome. Die Inzidenz der Mikrometastasen bei pN+ war signifikant höher als bei pN0 (26 Prozent pN0- und 60 Prozent pN1-Patienten). Dies ist ähnlich wie bei Hosch et al., was nahe legt, dass die Inzidenz von Mikrometastasen bei offenkundigen Lymphknotenmetastasen höher ist [34] . Dabei ist die Inzidenz der MM (pN0) ähnlich wie bei Sato et al. und Glickman et al. In Tanabes Studie war die Entwicklung eines multizentrischen Karzinoms signifikant korreliert mit 81 Diskussion dem Auftreten von Mikrometastasen. Schlussfolgernd daraus könnte die Anzahl der neoplastischen Läsionen im Ösophagus mit einem erhöhten Risiko nodaler Mikrometastasen einhergehen. Die Studie von Tanabe demonstriert einen marginalen Zusammenhang zwischen Zellatypien und nodalen Mikrometastasen. Kein Patient mit geringgradiger Atypie hatte mikrometastatische Mikrometastasen interzelluläre bei Tumorzellen in low-grad-Tumoren Brücken eine den könnte Gefäßinvasion und LK. Diese dadurch Absenz von sein, dass erklärt lymphogene Metastasierung verhindern. Wie in allen hier besprochenen Studien einschließlich der vorliegenden, lässt sich erkennen, dass bei Ösophaguskarzinomen sehr früh die lymphatische Dissemination beginnt. Aus Tabelle 12, S.44 wird ersichtlich, dass Mikrometastasen unabhängig vom T-Stadium des Primärtumors auftraten. Es ist jedoch anzunehmen, dass bei höheren Fallzahlen die Detektionsrate abhängig vom Tumor-Stadium ist. Es zeigte sich sowohl in der vorliegenden Arbeit als auch in den hier besprochenen Studien (siehe auch Tabelle 29, S. 70) eine weit gestreute Dissemination in zervikale, mediastinale und abdominelle Lymphknoten - unabhängig vom unterschiedlichen Sitz der Primärtumore. Folglich können Krebszellen selbst in sehr frühen Stadien des Ösophaguskarzinoms zu weitentfernten Lymphknoten metastasieren. Die Ergebnisse der hier präsentierten Arbeit zeigen, dass nodale Mikrometastasen bei Ösophaguskarzinomen keine klinische Relevanz haben, wenn gleichzeitig eine regionale Lymphadenektomie durchgeführt wurde. Da die meisten mikrometastatischen Foci nur eine wenige Tumorzellen enthalten, könnte das Ausmaß der Tumorlast durch beteiligte maligne Zellen zu gering sein, um die Prognose der Patienten mit Ösophaguskarzinomen zu beeinträchtigen, obwohl die Existenz von nodalen Mikrometastasen ein Zeichen für die systemische Beteiligung durch Tumorzellen sein könnte. Es ist zu vermuten, dass, wenn die Immunkompetenz eines Patienten mit Ösophaguskarzinomen intakt ist, beteiligte Tumorzellen abgewehrt oder inaktiv werden könnten. Keene und Demeure postulierten zudem, dass zum Zeitpunkt der OP alle Patienten schon MM haben und immunhistochemische Nachweismethoden in 77 Prozent der Fälle ein Upstaging verfehlen [45] . Es ist vorstellbar, dass Mikrometastasen sich in einem kontrollierten Zustand befinden, der – abhängig von der Entwicklung der 82 Diskussion disseminierten malignen Zellen durch exogene und endogene Faktoren, zur prognostisch bedeutsamen Makrometastasierung reifen könnte. Venöse Invasion war bei Tanabe et al. ebenfalls mit nodalen Mikrometastasen korreliert und somit konkordant mit der Studie von Kikuchi et al. über Magenkarzinome [47] . In der vorliegenden Arbeit wurde eine venöse Invasion durch Tumorzellen nicht untersucht. Allerdings zeigte sich eine signifikante Korrelation von Fällen mit Lymphangiosis carcinomatosa und verringerter Überlebenszeit (p=0,03). Von Rahden konnte 2004 in einem Vortrag am 121. Kongress der Deutschen Gesellschaft für carcinomatosa Chirurgie (LAC) im beim Berlin primär das Vorliegen resezierten einer Lymphangiosis Adenokarzinom des oesophagogastralen Übergangs (AEG) als einen signifikanten und unabhängigen prognostischer Faktor für das Überleben präsentieren [100]. Die Chemotherapie ändert die Gesamtrate der Lymphangiosis carcinomatosa nicht und auch ihre prognostische Bedeutung bleibt erhalten. Auch nach Downstaging in günstigere T-Kategorien durch neoadjuvante Chemotherapie, bleibt bei initial fortgeschrittenen Tumoren die massive LAC ein häufiger Befund. Dies deckt sich mit den Analysen dieser Studie, die das Vorliegen prognostischen einer Faktor Lymphangiosis hervorheben. carcinomatosa Auch in einer als ungünstigen vorangegangenen Veröffentlichung aus der Münchener Arbeitsgruppe um Siewert konnte gezeigt werden, dass eine Lymphangiosis carcinomatosa ein unabhängiger prognostischer Faktor bei den Karzinomen des gastroösophagealen Übergangs ist [85]. 4.2.2 Bedeutung der neoadjuvanten Therapie Die Ergebnisse von Studien, die sich mit der prognostischen Auswirkung von RCTX in den letzten Jahren beschäftigt haben, widersprechen sich zum Teil. Walsh et al. sahen 1996 in einer prospektiven, randomisierten Studie einen Vorteil der RCTX gegenüber dem alleinigen chirurgischen Eingriff bei 58 Patienten [101] . Aufgrund des unzureichenden präoperativen Stagings (z.B. CT-Untersuchungen), des zu zeitigen Abschlusses der Studie und der ungewöhnlich geringen Überlebensraten im „Chirurgie-allein“-Arm des Versuches muss die Arbeit von Walsh et al. kritisiert werden. Ebenso konnten Vogel et al. 1995 einen prognostischen Vorteil und ein klinikopathologisches Ösophaguskarzinompatienen erkennen [99] Downstaging durch RCTX bei 125 . Urba et al. konnten hingegen 2001 in 83 Diskussion einer randomisierten Studie mit 43 Patienten keinen Benefit der RCTX feststellen [96] . 143 Plattenepithelkarzinom-Patienten wurden 1997 in einer Studie von Bosset et al. neoadjuvant radiochemotherapiert, dabei konnten die Autoren keine Verbesserung des Langzeitüberlebens feststellen, lediglich die rezidivfreie Zeit wurde verlängert [12]. In einer auf der „Cochrane Database“ beruhenden Metaanalyse von Malthaner et al. [61] konnten 8 Studien über die neoadjuvante RCTX bis 2004 verglichen werden 15, 54, 56, 70, 96, 101] [4, 12, . Es wurde die Ein-Jahres-Mortalität von sechs Studien verglichen, deren Daten zu diesem Zeitpunkt verfügbar waren. Es stellte sich kein signifikanter Unterschied der RCTX versus alleiniger Chirurgie für das Mortalitätsrisiko nach einem Jahr heraus. Eine weitere Metaanalyse von Fiorica et al. [24] , die nur Patienten mit resektablen Ösophaguskarzinomen ohne Metastasierung berücksichtigte, konnte einen signifikanten Unterschied der 3-ÜLR zugunsten der neoadjuvanten Therapie herausfinden. Auch die Metaanalyse von Urschel et al. [97] , die die meisten der bereits erwähnten Studien bearbeitete, zeigte weder nach einem noch nach zwei Jahren eine signifikante Verbesserung der Prognose durch RCTX. Wie auch Forica et al. ergab sich nur nach drei Jahren ein statistisch signifikanter Unterschied in der Mortalität zugunsten der RCTX. Zudem wurde herausgefunden, dass es günstiger sei, wenn die Radiochemotherapie gleichzeitig anstatt aufeinander folgend verabreicht wurde. Auch Malthaner et al. kamen zu ähnlich signifikanter Ergebniskonstellation nach drei Jahren: die neoadjuvante Therapie war zu diesem Zeitpunkt der alleinigen Chirurgie überlegen. Auch Kaklamanos et al. kamen 2003 in einer Metaanalyse [44] , die 2311 Patienten zusammenfasste und vier der auch in den anderen Studien analysierten Arbeiten mit RCTX beinhaltete [12, 54, 70, 101] , zu der Ansicht, dass neoadjuvante Therapie einen moderaten Vorteil im Vergleich zur alleinigen Chirurgie bietet. Allerdings bezog Kaklamanos dieses Ergebnis eher auf die präoperative Chemotherapie (8 Studien) als auf die RCTX (vier Studien), die mit einer erhöhten behandlungsassoziierten Mortalität einherging. Jedoch erscheint dieses Ergebnis durch zu wenige Patienten und Studien im RCTX-Arm als ungenügend untermauert im Gegensatz zu den anderen, bereits besprochenen Metaanalysen mit mehr RCTX-Patienten. In der vorliegenden Arbeit hatten pN0-Patienten mit neoadjuvanter Therapie und fehlendem Nachweis von Tumorzellen einen (zwar nicht signifikanten) prognostischen Vorteil von medianen Überlebenszeit von 5,4 Jahren (±0,6) gegenüber 4,8 Jahren (±1,1) (p=0,24). Die drei Jahre ÜLZ bei nicht präoperativ 84 Diskussion behandelten Patienten betrug 59,3 Prozent, während 60 Prozent neoadjuvant Therapierte diesen Zeitpunkt überlebten. Mit der geringen Fallzahl von n=80 ist ein Vergleich zu den angesprochenen Metaanalysen nur von geringem Wert, allenfalls zeigt sich die Tendenz im Langzeitüberleben als konkordant mit den Ergebnissen von Malthaner, Urschel, Fiorica und Kaklamanos. Nach Ausschluss der CK-positiven Patienten zeigt der Vergleich der Überlebensdaten von Patienten mit RCTX und Patienten mit alleiniger Chirurgie in der vorliegenden Studie einen tendenziellen, jedoch nicht signifikanten (p=0,31) Unterschied (siehe Abbildung 16, S.61). Dies könnte bedeuten, dass Patienten ohne Lymphknotenmetastasen mehr von einer neoadjuvanten Therapie profitieren, gleichzeitig ist die Prognose von nodal positiven Patienten ohnehin wesentlich schlechter. Zumal scheint es, dass ehemals vorhandene Makrometastasen nach neoadjuvanter Behandlung immer noch einen signifikant negativen prognostischen Einfluss haben (siehe Abbildung 12, S.56) und präoperative Radiochemotherapie Metastasen zwar lokal zerstören kann, aber keinen Einfluss auf die primär negative prognostische Bedeutung der Lymphknotenmetastasen hat. Dabei ist zu hinterfragen, ob eine präoperative Therapie unabhängig von der begrenzten pN0-Gruppe dieser Studie bei Tumoren höheren Stage-Grade einen Überlebensvorteil bringt. Patienten mit kompletter Remission nach Radiochemotherapie (ypT0ypN0) haben wahrscheinlich einen Benefit bezüglich lokoregionärer Kontrolle und Überleben, da diese Patienten einen deutlich besserer Überlebensrate als pN1-Patienten aufweisen (41 Prozent (5-ÜLZ ypN0) vs. 8 Prozent (5-ÜLZ pN1)). Auch Imdahl et al. bestätigten dies in einer Studie über die präoperative Radiochemotherapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom wird in dieser Studie die Bedeutung des [37] Lymphknotenstatus . Zudem für das Langzeitüberleben diskutiert. Gelingt es, wie in bei den in dieser Arbeit subsumierten Patienten, durch die präoperative Therapie einen pN0-Status zu erreichen, ist die Prognose des Patienten um ein Vielfaches besser. Bei 56 Prozent der im Rahmen dieser Studie radiochemotherapierten Patienten, bei denen präoperativ routinehistopathologisch ein keine cN1-Stadium angenommen Lymphknotenmetastasen wurde, mehr konnte nachgewiesen werden. 64 Prozent (n=9) der zytokeratinpositiven Patienten (avitale Mikro- oder Makrometastasen) wurden in dieser Studie präoperativ mit einer cN1-Situation eingestuft. In dem Resektat dieser 9 neoadjuvant behandelten Patienten konnte ein 85 Diskussion pN0-Status festgestellt werden. In wie weit die Radiochemotherapie den Anteil an pN0-Patienten tatsächlich erhöht, bleibt unklar, da nur selten präoperativ Lymphknotenbiopsien durchgeführt werden. Schlussfolgernd müsste die präoperative Staginggenauigkeit verbessert werden, um möglichst zuverlässige Aussagen über den nodalen Status eines Patienten zu liefern. Nur genaueste Staging- Informationen können die beste Therapieoption ermöglichen. Zusammenfassend scheint die RCTX in der Langzeitprognose der alleinigen Chirurgie überlegen zu sein, Voraussetzungen sind jedoch Resektabilität der Karzinome, fehlende Metastasierung und die Erkenntnis, dass die Bandbreite des Benefits der Patienten relativ schmal ist. Weitere Studien sind notwendig um Kriterien zu erforschen, die genau diejenigen Patienten identifizieren, die von einer neoadjuvanten Therapie profitieren. Patienten innerhalb der vorbehandelten RCTX-Gruppe (n=59) zeigten in der vorliegenden Arbeit einen signifikanten Überlebensvorteil (p=0,012), wenn sie eine partielle oder komplette Remission aufwiesen (siehe Abbildung 17, S.61). Die meisten Studien stimmen dahingehend überein, dass Patienten mit einer kompletten Remission einen Überlebensvorteil aufweisen, unabhängig vom angewendeten Protokoll [6, 12, 35, 96] . Spekulativ bleibt, ob Unterschied in den Protokollen die Rate der kompletten Remissionen erhöhen könnte [36]. In einer vorausgegangenen Studie von Imdahl et al. mit dem gleichen Patientengut (inklusive N1-Patienten) bestätigte sich ebenfalls, dass Patienten von einer präoperativen Radiochemotherapie nur dann profitieren, wenn eine komplette Remission resultiert und die Patienten die Therapie überstehen [37] . Triboulet et al. konnte durch Radiochemotherapie bei Ösophaguskarzinompatienten in einer heterogenen (nicht ausschließlich N0) Gruppe von 161 Patienten eine 5-ÜLZ von 49,8 Prozent erreichen [93] , die 5-ÜLZ der vorbehandelten Adenokarzinompatienten erreichte in dieser Studie 75 Prozent bei 28 Prozent kompletter und 67 Prozent partieller Response, wobei es sich ausschließlich um pN0-Patienten handelte. Die Ergebnisse dieser Studie mit dem modifizierten N0-Kollektiv stimmen ebenfalls mit den damaligen Ergebnissen überein. Patienten ohne aktive nodale Metastasierung (auch ehemals cN1-Stadium) profitieren von einer neoadjuvanten Therapie nur bei kompletter oder partieller Response (p=0,023). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass ehemals vorhandenes nodales Involvement im Sinne von avitaler 86 Diskussion Zytokeratinaktivität weiterhin eine (bezogen auf das pN0-Niveau) ungünstige Prognose impliziert (p=0,0024). Imdahl schlussfolgerte in seiner Studie mit 102 Ösophaguskarzinompatienten, dass sich eine neoadjuvante Therapie nur für Patienten mit einer kompletten Remission und einem postoperativen komplikationslosen Ablauf günstig auswirkt, da die perioperative Morbidität bei vorbehandelten Patienten erhöht ist [36] . Natürlich beeinflussen die Nebenwirkungen der präoperativen Radiochemotherapie das Langzeitüberleben: zu erwähnen sind pulmonale Fibrosierungen mit erschwerter Lymphadenktomie und allgemeine Abwehrschwäche. Hinsichtlich der histologischen Unterschiede geht aus der vorliegenden Studie hervor, dass pN0-Patienten mit Adenokarzinomen eher von der präoperativen Therapie profitieren als pN0-Patienten mit Plattenepithelkarzinomen. Die Daten von Imdahl et al. legen nahe, dass Patienten mit Adenokarzinomen des Ösophagus eine neoadjuvante Therapie besser tolerieren Adenokarzinom weisen [36] meist . Patienten mit der histologischen Entität nicht die Noxen Alkohol (Leberfunktionseinschränkungen, kardiale Probleme) und Nikotin (COPD, KHK Arteriosklerose) auf, die eine Vielzahl von perioperativen Risiken bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen nach sich ziehen [87] und präsentieren sich präoperativ in einem besseren Allgemeinzustand. Neoadjuvante Therapie verringert die Mikrometastasenrate in dieser Studie nicht. Dieses Ergebnis muss jedoch mit Vorsicht genossen werden, da nur 5 Fälle mit MM gefunden wurden und nicht fest steht, ob alle LK entfernt worden sind und die Aufarbeitung somit vollständig ist. Aufgrund der Studienlage ist zu vermuten, dass die MM-Rate deutlich höher ist, zumal die Detektionsrate in Studien mit höherer durchschnittlicher LK-Zahl ansteigt. Glickman et al. konnten in ihrer Studie mit ähnlichem Patientengut sogar beobachten, dass die Inzidenz von Mikrometastasen bei vorbehandelten Patienten ansteigt. Anlass zur Kritik bietet die selektionierte Patientenauswahl und – wie in den meisten Studien der Fall – die retrospektive Auswertung, was leicht zu einem systemischen Fehler führt. In jedem Fall ist davon auszugehen, dass die neoadjuvante Therapie einen tumorsterilisierenden, systemischen Effekt aufweist und primär kurable Tumorstadien neoadjuvant im Rahmen einer Studie behandelt werden sollten. Zusammengefasst ist die präoperative Radiochemotherapie bei Patienten im pN0Stadium empfehlenswert, da eine positive Tendenz hinsichtlich der Prognose 87 Diskussion besteht. Ehemals vorhanden Lymphknotenmetastasen haben auch nach RCTX noch einen ungünstigen prognostischen Einfluss, bei einer geringen ÜLZ von medianen 2,3 Jahren (±0,8) müssen intensive Therapieoptionen kritisch abgewogen werden. Unter dem Ziel, die Rate kompletter Remissionen zu steigern, wird die Suche nach neuen Modalitäten kombinierter Behandlung (z.B. Thermoradiochemotherapie), der Einsatz neuer Zytostatika sowie tumorbezogener Prognosefaktoren wie Mikrometastasen für eine Individualisierung der Therapie eine wichtige Rolle spielen. Lymphangiosis carcinomatosa scheint ein unabhängiger, ungünstiger prognostischer Faktor bei den pN0-Patienten der vorliegenden Studie zu sein, unabhängig vom Vorhandensein multimodaler Therapie (p=0,03 in der univariaten Auswertung). Ein gleiches Ergebnis wurde in einer Arbeitsgruppe von von Rathen et al. bei 146 neoadjuvant chemotherapierter Patienten mit Karzinomen des gastroösophagealen Übergangs (AEG) bestätigt [100]. 88 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung In dieser Arbeit wurden Lymphknoten von 80 Patienten mit Ösophaguskarzinom im Stadium pN0 auf okkulte Tumorzellen untersucht. 74 Prozent dieser Patienten haben eine neoadjuvante Radiochemotherapie erhalten. Bei 6,25 Prozent der Patienten konnten Mikrometastasen festgestellt werden. Nach Korrelation mit Überlebensdaten zeigte sich kein Effekt immunhistochemisch von MM anfärbbare, auf die Prognose. Weiterhin zytokeratinaufnehmende Zellen, konnten die der hsitologischen Definition von MM nicht entsprechen, registriert werden. Hierbei handelte es sich um avitale Mikro- oder Makrometastasen, Narben und Fibrosen. Bei 23,75 Prozent der Zytokeratinpositivität Patienten (CKLK+) konnte nachgewiesen diese werden. lymphknotenbegrenzte Die Korrelation mit Überlebensdaten zeigt einen signifikant ungünstigen Einfluss von Patienten mit nachgewiesener CKLK+ auf die Prognose. Man kann davon ausgehen, dass es sich bei CKLK+ größtenteils um ehemalige Lymphknotenmetastasen nach präoperativer Radiochemotherapie handelt. Die Detektionsrate der Zytokeratinpositivität stieg mit größerer Anzahl untersuchter Lymphknoten. Somit kann die Staginggenauigkeit durch die Examination von mehr Lymphknoten erhöht werden. Die präoperative Radiochemotherapie konnte die Inzidenz von MM oder CKLK+ nicht senken. Bei Patienten mit kompletter oder partieller Remission nach vorausgegangener RCTX konnte eine signifikant verbesserte Überlebenszeit gezeigt werden. In uni- als auch multivariater Auswertung der Ergebnisse zeigte sich, dass insbesondere Patienten mit Adenokarzinomen eine signifikant bessere Prognose nach RCTX (p=0,03) aufwiesen. Bei multimodal behandelten Patienten, bei denen avitale Mikro- oder Makrometastasen nachgewiesen wurden, zeigte sich vor allem bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen eine signifikant verringerte Überlebensrate. RCTX scheint in einer Langzeitprognose einen günstigen Effekt bei Patienten resektablen Ösophaguskarzinomen ohne Metastasierung zu haben. Lymphangiosis carcinomatosa ist ein unabhängiger, prognostisch ungünstiger Faktor, wie univariate Analysen gezeigt haben. Um verwertbare, aussagekräftige Ergebnisse zu der Frage des prognostischen Einflusses von Mikrometastasen zu erhalten, ist es unabdingbar, eine multizentrische, prospektive Studie mit hohen Fallzahlen und einheitlichem Studienprotokoll durchzuführen. 89 Literatur 6 Literatur 1. Akiyama H., Tsurumaru M., Udagawa H.,Kajiyama Y. (1994) Radical lymph node dissection for cancer of the thoracic esophagus. Ann Surg. 220(3): 36472; discussion 372-3. 2. Altorki N.K., Girardi L.,Skinner D.B., En bloc esophagectomy improves survival for stage III esophageal cancer, in J Thorac Cardiovasc Surg. 1997. p. 948-55; discussion 955-6. 3. Ando N., Iizuka T., Kakegawa T., Isono K., Watanabe H., Ide H., Tanaka O., Shinoda M., Takiyama W., Arimori M., Ishida K.,Tsugane S. (1997) A randomized trial of surgery with and without chemotherapy for localized squamous carcinoma of the thoracic esophagus: the Japan Clinical Oncology Group Study. J Thorac Cardiovasc Surg. 114(2): 205-9. 4. 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World J Surg. 19(3): 444-9. 103 Anhang 7 Anhang 7.1 Reagenzien Hämalaun nach Mayer (für Immunhistochemie) PBS (20fach) PBS (1fach) PK-Lysepuffer SSC (20fach) TBE 0,5 M EDTA 1g Hämatoxylin 0,2 g Natriumjodat 50 g Aluminiumkaliumsulfat 50 g Chloraldehyd 1g Zitronensäure auf 1 l mit Aqua dest. auffüllen 160 g NaCl 29,25 g di-Natriumhydrogenphosphat 4,9 g Kaliumhydogenphosphat auffüllen auf 1000 ml mit Aqua dest., Lagerung bei RT Stock-Lösung 1:20 mit Aqua dest. verdünnen 400 µl H2O 5 µl 1 M Tris HCl 0,1 µl 0,5 M EDTA 100 µl 10 % SDS 13,2 µl PK (19 mg/ml) 87,66 g 3 M NaCl 44,12 g 0,3 M NaCitrat bis 450 ml auffüllen mit HCl auf pH 7 einstellen auf 500 ml auffüllen, bei RT lagern 108 g Tris-Hydroxymethylaminomethan 55 g Borsäure 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8 auf 1 l mit Aqua bidest auffüllen und autoklavieren (119°C, 20 min) 93,06 g EDTA mit 10 M NaOH auf pH 8 einstellen auf 500 ml mit Aqua bidest. auffüllen und autoklavieren (119°C, 20 min) 10 M NaOH 40 g Na-Plätzchen in 100 ml H2O auflösen Zitratpuffer Lösung A: 21,01 g Zitronensäuremonohydrat, mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen Lösung B: 29,41 g tri-Natriumzitrat-dihydrat mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen Lösungen bei 4°C lagern 7,5 ml Lösung A mit Aqua dest. auf 400 ml auffüllen, mit Lösung B auf pH 6 einstellen, mit Aqua dest. auf 500 ml auffüllen 7.2 Geräte und Zubehör Digitalkamera: SONY 3CCD Sony Corporation, Japan Videosystem AVT-HORN MC3210/II/PM Aalen, Deutschland 104 Anhang Mikroskop Axioskop 50 Carl Zeiss Zeiss Manual-Tissue-Arrayer Beecher Instruments, Inc. Photometer, Ultrospec 2000 Pharmacia Bioteck (Schweden) Gel Electrophoresis Apparatus GNA-100 (Gelkammer) Pharmacia (Schweden) pH-Meter 211 Hanna Instruments PTC-200, Peltier Thermal Cycler (PCRMaschine) MJ Reseach Schlitten-Mikrotom Jung Autostainer-Gerät DakoCytomation (Glostrup, Dänemark) Dampfgarer Gourmet Braun Folieneindeckler Vogel Entparaffinierungsgerät Medite Zentrifuge 5417R Eppendorf (Hamburg) Concentrator 5301 (Speedvac) Eppendorf (Hamburg) Thermomixer comfort, 1,5 ml Eppendorf (Hamburg) MS2 Minishaker (Vortexer) IKA® Waage: BP 310s, 0,02 g - 310 g Sartorius AG, Göttingen Mikrowelle Siemens Hybiad OmniGene (Heizblock) MWG-Biotech (Gesellschaft für angewandte Biotechnologie mbH) Gefrierschrank (-20, -60, -80°C) Kühlschrank (4°C) Liebherr Brutschrank Memmert Wasserbad GFL® (Burgwedel) Objektträger R. Langenbrinck, Teningen SuperFrost®Plus Objektträger R. Langenbrinck, Teningen 105 7.3 Abkürzungsverzeichnis • 2-ÜLR Zwei-Jahre-Überlebensrate (in Prozent) • 2-ÜLZ Zwei-Jahre-Überlebenszeit • 5-ÜLR Fünf-Jahre-Überlebensrate (in Prozent) • 5-ÜLZ Fünf-Jahre-Überlebenszeit • CI Confidence Intervall, Konfidenzintervall • CK Zytokeratin • CK+; CK- Zytokeratin-positiv; -negativ • COPD chronic obstructive pulmonary desease • CT Computertomographie • EKG Elektrokardiogramm • Gy Gray • H&E Hämalaun-Eosin • HCl Salzsäure • IHC Immunhistochemie • kD Kilo-Dalton • KHK Koronare Herzerkrankung • LK Lymphknoten • MG Molekulargewicht • MM Mikrometastase(n) • MM+; MM- Mikrometastasen-positiv; - negativ • RCTX neoadjuvante Radiochemotherapie • Rö Röntgen • SD Standard deviation, Standardabweichung • UICC Union Internationale Contre le Cancer • vgl. vergleiche Anhang 106 Anhang Danksagung Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dr. Andreas Imdahl für die Überlassung des Themas und die hervorragende Betreuung während der Projektarbeit. Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Martin Werner, der es ermöglichte, dass diese Arbeit durch Nutzung der Räumlichkeiten und Kapazitäten des Pathologischen Instituts der Universität Freiburg gedeihen konnte. Frau Gabriele Bartsch hatte während meiner Zeit als Doktorand stets ein freundliches Wort und war in allen administrativen Belangen ein wahrer Segen. Stets guten Rat, wissenschaftliche Anleitung und sehr gut funktionierende, kompetente Zusammenarbeit fand ich bei meinem Betreuer PD Dr. Walch. Besonders sei Herrn Dr. Thorsten Wiech gedankt, der nicht nur fachlich meine Arbeit voranbrachte, sondern mich auch durch Humor und Freundschaft begleitete. Den Mitarbeiter/Innen, des immunhistochemischen Labors des Pathologischen Instituts - insbesondere Frau Doktorowski - ist für die Herstellung der zahlreichen Schnitte ein großes Dankeschön auszusprechen. Ohne sie wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Zuviel Kopfzerbrechen bei Statistik und Datenanalyse ersparte mir Frau Eva Fischer aus der Chirurgischen Unversitätsklinik Freiburg, ihre vorbehaltlose Zuarbeit während des Projektes war phänomenal. Martha war in dieser oftmals auch schwierigen Zeit stets für mich da. Ihre Liebe und ihr Verständnis führten mich durch alle Höhen und Tiefen. Vielen Dank. Meinen Eltern und meinen Freunden sei für Ihre stets vorhandene moralische Unterstützung gedankt. 107 Anhang Lebenslauf Persönliche Angaben Name: Markus Schricker Adresse: Dreikönigstr.5 79102 Freiburg Mail: [email protected] Geburtsdatum: 31.08.1975 Geburtsort: Altenburg / Thüringen Schulbildung 1982 - 1990 1.bis 8. Klasse II.Polytechnischen Oberschule Thalheim i. Erzgeb. 1990 – 1994 9.bis 12. Klasse (Abitur) Gymnasium Stollberg Derzeitige Tätigkeit: seit 01 / 2005 Assistenzarzt in der Inneren Abteilung des St.- Josefskrankenhauses Freiburg seit 02 / 2004 Promotion am Pathologischen Institut / Chirurgische Universitätsklinik Freiburg „Bedeutung von Mikrometastasen beim pN0 gestagten Patienten mit Ösophagus-Ca“ Vorherige Tätigkeit: 2002-2004 Arzt im Praktikum in der Inneren Abteilung des Loretto-Krankenhaus Freiburg/Br. 2004-2005 Assistenzarzt in der Inneren Abteilung des Bruder-Klaus-Krankenhauses Waldkirch Studium: 1995 – 2002 Studium der Humanmedizin an der Georgia - August - Universität Göttingen 05/2005 Abschluss des Studiums
