Über Biosynthese und Struktur des tierischen Melanins

Über Biosynthese und Struktur des tierischen Melanins
In v i v o Untersuchungen a m H a r d i n g - P a s s e y - M e l a n o m der M a u s mit Tritium- u n d
K.
**
1 4 C-markiertem
Dopa
HEMPEL
Institut für Medizinische Isotopenforschung der Universität Köln
( Z . Naturforschg. 2 2 b , 1 7 3 — 1 8 0 [ 1 9 6 7 ] ; eingegangen am 22. August 1 9 6 6 )
Bei der Biosynthese des Melanins wird Dopa nicht als Ganzes in Melanin eingebaut, sondern
ein von Atom zu Atom verschiedener Prozentsatz wird vorher abgespalten. Durch Versuche mit radioaktivem Dopa, das gleichzeitig mit Tritium und 14C markiert war, wurde die Einbauwahrscheinlichkeit der einzelnen H- und C-Atome des Dopa gemessen. Als Bezugspunkt diente die Einbauwahrsdieinlichkeit des a-C-Atoms, die gleich 1 gesetzt wurde. Folgende Einbauwahrscheinlichkeiten wurden gemessen: H-a 0,51; H-ß 0,43; H-2 0,46; H-5 0,26; H-6 0,49; C-Carboxyl 0,64.
Die gemessenen Einbauwahrscheinlichkeiten deuten darauf hin, daß Dopa im Gegensatz zu den
bisherigen Vorstellungen nicht ausschließlich durch Polymerisation von 5.6-Indochinon aufgebaut
wird, sondern daß es in großem Umfang Polymer-Einheiten enthält, in denen die Carboxyl-Gruppe
und das H-Atom in 6-Stellung des Dopa noch vorkommen. Auf Grund der Einbauwahrscheinlichkeiten wurde eine neue Strukturformel des Melanins vorgeschlagen.
O b w o h l M e l a n i n das i m Tierreich a m weitesten
verbreitete P i g m e n t ist, sind Untersuchungen
über
seinen chemischen A u f b a u selten. Eine der Ursachen
dieses scheinbar g e r i n g e n Interesses sind die Schwierigkeiten, mit der die A b t r e n n u n g v o n M e l a n i n aus
tierischen G e w e b e n
verbunden
ist. B i s h e r ist kein
Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der d i e verschiedenen H - und C - A t o m e des D o p a in M e l a n i n eingebaut
werden.
Aus
diesen
Wahrscheinlichkeiten
werden
Rückschlüsse auf die Struktur des tierischen
Mela-
nins gezogen
V e r f a h r e n bekannt, Melanin in unveränderter F o r m
v o n Proteinen
webe
u n d anderen Bestandteilen
abzutrennen.
Es
soll
deshalb
im
der
Ergebnisse
Ge-
folgenden
Selektiver
ü b e r Versuche berichtet w e r d e n , durch die es m ö g suchen, o h n e es z u v o r aus d e m G e w e b e zu isolieren.
Bei diesen Versuchen w u r d e M ä u s e n mit H a r d i n g P a s s e y - M e l a n o m e n gleichzeitig mit T r i t i u m u n d
markiertes D o p a
verabreicht. D o p a
1 4 C-
ist p h y s i o l o g i -
P a s s e y - M e l a n o m e n gleichzeitig m i t T r i t i u m u n d
14C
sehe V o r s t u f e des Melanins u n d k o m m t in Melaninbildenden
vorla_d.
und
Geweben
in
meßbarer
Konzentration
Nach einigen T a g e n w u r d e
1 4 C-Aktivität
des M e l a n i n s
die
Tritium-
gemessen.
Da
die
Einbau
von
Dopa
in
Melanin
lich ist, die Struktur des nativen M e l a n i n s zu unter-
Autoradiographische
Versuche mit Dopa:
Abb. 1
zeigt an einem A u t o r a d i o g r a m m den selektiven Einbau v o n D o p a in Melanin des H a r d i n g - P a s s e y - M e l a n o m s . Das A u t o r a d i o g r a m m stammt v o n einer M a u s ,
die 2 T a g e nach I n j e k t i o n v o n r a d i o a k t i v e m
Dopa
getötet w u r d e . D i e S i l b e r k ö r n e r liegen selektiv ü b e r
den Melanin-Granula des C y t o p l a s m a s der M e l a n o c y t e s während die K e r n e dieser Zellen ebenso w i e
Radioaktivität des D o p a v o n M e l a n o m e n selektiv in
die melaninreichen M e l a n o p h a g e n nahezu frei
Melanin
Radioaktivität sind. A u f weitere Einzelheiten dieser
eingebaut
w i r d , brauchte
Melanin
hierzu
von
nicht aus d e m G e w e b e isoliert w e r d e n , s o n d e r n es
autoradiographischen Untersuchungen mit D o p a soll
genügte,
die Radioaktivität
der M e l a n o m e
zu
be-
nicht eingegangen w e r d e n , da h i e r ü b e r bereits b e -
stimmen. A u f G r u n d dieser M e s s u n g e n w u r d e
die
richtet w u r d e 2 .
* Teil der Habilitationsschrift, Würzburg 1967.
** Teilweise vorgetragen auf dem „Symposium on Structure
and Control of the Melanocyte" in Sofia, Mai 1965, und
der „Conference on the Biologic Effects of Ultraviolet Radiation" in Philadelphia, August 1966.
l a H. BERNHEIMER, Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Pathol.
Pharmakol. 247, 202 [1964] ; «> H. TAKAHASHI and T. B.
FITZFATRICK, Nature [London] 209, 888 [1966]; l c B.
FALCK, S . JACOBSSON, a n d E . ROSENGREN, A c t a
2
dermato-vene-
reol. [Helsingfors] 46, 65 [1966];
K. HEMPEL u. H. F.
K. MÄNNL, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 124,192
[1966].
K. HEMPEL U. W. ERB, Z. Zellforsch, mikroskop. Anatom.
58,125 [1962].
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Abb. 1. Autoradiogramm eines Harding-Passey-Melanoms der Maus 2 Tage nach i.p. Injektion von DL-Dopa-[2.5.6-T3°. Das
Gewebe wurde im Anschluß an den photographischen Prozeß mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Vergr. ca. 1500-fach. Anhäufung von Silberkörnern über dem Cytoplasma der Melanocyten, deren Kerne — ebenso wie die melaaninreichen Melanophagen — nahezu frei von Radioaktivität sind.
Hydrolyse-Beständigkeit
der
Melanin-Markierung:
ersten 2 Stdn. auf
1 3 % u n d nach weiteren 8 Stdn.
zuvor
bis auf 1 0 % des ursprünglichen Wertes a b . Bei d e m
durch I n j e k t i o n v o n r a d i o a k t i v e m D o p a in v i v o mar-
nach 1 0 Stdn. n o c h ungelösten Rückstand handelt es
kiert w o r d e n war, w u r d e n die säureunlöslichen V e r -
sich u m den eigentlichen Melaninanteil.
Aus
Melanomen,
deren Melanin
zwei T a g e
b i n d u n g e n durch Fällen mit Trichloressigsäure nach
der
Methode
von
SCHMIDT-THANNHAUSER
trennt und mit 5 - p r o z . HCl bei 1 0 0 °
abge-
3
hydrolysiert.
W i e A b b . 2 A zeigt, sank die M e n g e der säureunlös-
Die
Radioaktivität
stands zeigen
Markierung
des
unhydrolysierten
die A b b n . 2 B und
des
Melanoms
Rück-
2 C. W u r d e
DL-Dopa-[A-14C]
wandt, so f a n d e n sich selbst nach 10-stdg.
zur
ver-
Hydro-
lichen V e r b i n d u n g e n auf G r u n d der H y d r o l y s e des
lyse mehr als 8 0 % der eingesetzten
Eiweiß-
i m Melaninrückstand, u n d nur 5 % waren in der Salz-
und
Nucleinsäure-Anteils
innerhalb
der
Radioaktivität
Dauer der Hydrolyse in Stein.
Abb. 2. Menge und Radioaktivität der säureunlöslichen Verbindungen (Melanin, Eiweiß und Nucleinsäuren) des HardingPassey-Melanoms nach 2-, 5- und 10-stdg. Hydrolyse mit 5-proz. HCl bei 100 °C. Die Melanome wurden markiert, indem den
Versuchstieren 2 Tage vor der Tötung DL-Dopa-[a-14C] bzw. DL-Dopa- [carboxyl- 14 C] i.p. injiziert wurde.
3
G.
SCHMIDT
and
S. J. THANNHAUSER, J.
biol. Chemistry
161,
83 [1945].
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säure g e l ö s t ;
14C02
nachweisbar.
D i e Tatsache, daß die
w a r bei diesen Versuchen nicht
Radioaktivität
einen
Abbau
denn
nach
von
Melanin
eigenen
zurückzuführen
Untersuchungen
sich b e i m K o c h e n mit H C l in der Melanin-Fraktion
Generationszeit
anreichert, ist ein weiterer Beweis für den selektiven
s e y - M e l a n o m s n u r ca. 2 5 Stunden 6 . D i e
E i n b a u des D o p a in M e l a n i n .
tät der
Aus
( A b b . 2 C)
Melanome
zeigte
des
große
die
Harding-Pas1 4 C-Aktivi-
Unterschiede
von
gebildetes,
radioakti-
T i e r zu T i e r , w i e unter a n d e r e m auch aus der g r o -
verlor bei der
Hydrolyse
ß e n Streuung der M e ß w e r t e in T a b . 1 h e r v o r g e h t .
Dopa-[carboxyl-14C]
ves M e l a n i n
der Melanocyten
sein;
beträgt
mit H C l bereits i n n e r h a l b der ersten 2 Stdn. mehr
als 5 0 % der M a r k i e r u n g . D e r danach i m
Überlebenszeit
[Tage]
Melanin
n o c h enthaltene Anteil der Radioaktivität w a r stabil
g e b u n d e n . Bei diesen Versuchen entstand unter der
Hydrolyse
mit H C l
14
C02.
D e r sehr
unterschied-
Melanin-Moleküls
führt.
Untersuchungen
durch K o c h e n
mit H C l
Struktur
nativen
des
Aus
an
diesem
Melanin,
Grunde
das
zuvor
gereinigt w u r d e , über
Melanins
nur
wenig
die
aus-
sagen 4 ' 5 .
Einbau der verschiedenen
in
H- und C-Atome
des Dopa
wurde
gleichzeitig
Tritium-
und
1 4 C-
markiertes D o p a i.p. injiziert, und der E i n b a u der
Radioaktivität in V e r b i n d u n g e n der säureunlöslichen
Gewebs-Fraktion
( E i w e i ß , Nucleinsäuren und evtl.
M e l a n i n ) v o n M e l a n o m u n d Leber w u r d e gemessen.
D o p a w a r j e w e i l s n u r an einer Stelle des Moleküls
mit T r i t i u m b z w .
14C
markiert. Die
14C-Markierung
lag in der R e g e l a m a - C - A t o m des D o p a , während
der Sitz der T r i t i u m - M a r k i e r u n g in den verschiedenen V e r s u c h s g r u p p e n variiert wurde. D a s Verhalten
folgender
radioaktiv
markierter
Verbindungen
w u r d e b i s h e r untersucht: D L - D o p a - [ A - T ] ,
[ß-T],
DL-Dopa-[2-T],
[6-T],
DL-Dopa-[a-14C]
14C].
0,8 ( 0 , 0 9 - 3 , 9 )
[38]
0,07 ( 0 , 0 5 - 0 , 2 5 )
[15]
Tab. 1. Radioaktivität von Melanom und Leber 2 bzw. 10
Tage nach i.p. Injektion von DL-Dopa-[a-14C]. Alle Werte sind
Mittelwerte. Die eingeklammerten Zahlen () geben den
niedrigsten und höchsten Wert an. Die Zahlen in eckigen
Klammern geben die Anzahl der Versuchstiere je Gruppe an.
(Untersuchungen an Mäusen mit Harding-Passey-Melanomen.) a Radioaktivität pro 1 g Gewebe in Prozent der pro 1 g
Tiergewicht injizierten 14C-Aktivität.
Melanin
G r u p p e n v o n 3 — 1 6 M ä u s e n mit Harding-PasseyMelanomen
Leber
9,9 ( 1 , 4 - 3 5 , 0 )
[49]
3,7 ( 0 , 2 - 1 6 , 0 )
[17]
10
zeigt, d a ß die H y d r o l y s e mit HCl zu Ä n d e r u n g e n
des
Melanom
2
liche Aktivitäts-Verlust in den A b b n . 2 B und 2 C
können
% Radioaktivität^
DL-Dopa-[5-T],
D i e L e b e r n enthielten nach 2 T a g e n etwa 13-mal
u n d nach 1 0 T a g e n 5 0 - m a l w e n i g e r
Radioaktivität
als die M e l a n o m e . Bei der Radioaktivität der L e b e r n
handelt es sich u m eine unspezifische
des
Lebereiweißes
des
Dopa.
Die
durch
Markierung
Abbauprodukte
Messungen
an
der L e b e r
(14C02)
wurden
durchgeführt, u m festzustellen, inwieweit nach G a b e
von
radioaktivem
Dopa
mit
einer
unspezifischen
M a r k i e r u n g des E i w e i ß e s gerechnet w e r d e n m u ß t e .
D i e Zahlen in T a b . 1 zeigen, daß Fehler durch eine
unspezifische M a r k i e r u n g des G e w e b e s bei den v o r liegenden V e r s u c h e n keine R o l l e spielen dürften.
DL-Dopa-
T a b . 2 zeigt die relative G r ö ß e des E i n b a u s der
DL-Dopa-
verschiedenen H - und C - A t o m e des D o p a in Melanin
DL-Dopa-[carboxyl-
des H a r d i n g - P a s s e y - M e l a n o m s . A l l e W e r t e beziehen
D i e T ö t u n g der Versuchstiere e r f o l g t e nach 2
sich auf den E i n b a u des a - C - A t o m s des D o p a , der
und
gleich 1 gesetzt w u r d e . D a Tritium-markiertes D o p a
o d e r nach 1 0 T a g e n .
T a b . 1 zeigt
den
1 4 C-Gehalt
von Melanom
und
L e b e r nach I n j e k t i o n v o n D L - D o p a - [ A - 1 4 C ] . I m Mit-
g e m e i n s a m mit d e m D o p a - [ a - 1 4 C ]
in Melanin
desselben M e l a n o m s
verabreicht u n d
eingebaut
wurde,
tel enthielt 1 g M e l a n o m 2 T a g e nach der Injektion
spielen Fehler durch b i o l o g i s c h e S c h w a n k u n g e n
9 , 9 % d e r p r o 1 g Tiergewicht injizierten
der Syntheserate des M e l a n i n s zwischen den einzel-
1 4 C-Aktivi-
tät. Nach 1 0 T a g e n w a r der Gehalt auf 3 , 7 % abge-
nen T u m o r e n
in T a b . 2 keine R o l l e .
sunken. D i e s e A b n a h m e
chend
Größe
des
1 4 C-Gehalts
dürfte in
erster L i n i e auf das T u m o r w a c h s t u m u n d nicht auf
4
R. A. N I C O L A U S , Rassegna Med. Sperimentale 9 (Suppl. 1)
[1962].
ist d i e
der
in
Dementspre-
Standardabweichung
der
W e r t e der T a b . 2 relativ g e r i n g .
5
6
R . A . N I C O L A U S , M . P I A T T E L L I , and
hedron [London] 20, 1163 [1964].
K. H E M P E L , unveröffentlicht.
E.
FATTORUSSO,
Tetra-
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HO
(H)
HO-- W
ro— ' - / f r
®
Dopa-Atom
rel. Einbauwahrscheinlichkeit
±
Standard-Abweichung
®
H-2
H-5
H-6
2d
Exp.
0,46
±0,09
(16)
0,26
±0,04
(10)
0,49
±0,06
(10)
10 d
Exp.
0,37
±0,05
(3)
0,19
±0,03
(5)
0,52
±0,10
(4)
@ ©
n-ß
0,43
±0,03
(6)
-
H-a
C-a
C-COOH
0,51
±0,08
(8)
= 1
0,64
±0,06
(3)
0,37
±0,05
(6)
= 1
-
Tab. 2. Relative Wahrscheinlichkeit, mit der die verschiedenen H- und C-Atome des Dopa in Melanin des Harding-PasseyMelanoms eingebaut werden. Die Einbauwahrscheinlichkeit des C-Atoms in a-Stellung des Dopa diente als Bezugspunkt; sie
wurde = 1 gesetzt. Die eingeklammerten Zahlen geben die Anzahl der Tiere je Versuchsgruppe an. (Tötung der Versuchstiere
nach 2 bzw. 10 Tagen.)
D e r Einbau der W a s s e r s t o f f a t o m e des D o p a w a r
Mit
radioaktivem
Dopa
kann
die
Melanin-Syn-
in allen Fällen g e r i n g e r als der des a - C - A t o m s . In
these v o n M e l a n o m e n unter nahezu p h y s i o l o g i s c h e n
Versuchen, bei denen die M e l a n o m - M ä u s e
B e d i n g u n g e n untersucht werden, denn D o p a ist i m
2
Tage
überlebten, w u r d e n f ü r die H - A t o m e W e r t e zwischen
H a r d i n g - P a s s e y - M e l a n o m nachgewiesen w o r d e n
la' d.
0 , 2 6 u n d 0 , 5 1 gemessen. Signifikante Unterschiede
Seine Konzentration beträgt dort c a . 1 / i g / G r a m m .
zwischen
D i e biologische Halbwertszeit v o n parenteral v e r a b -
2-
und
10-Tage-Versuchen
waren
nicht
nachweisbar.
reichtem D o p a beträgt bei der M a u s ca. 1 5
Der Einbau
des C - A t o m s
der
Carboxyl-Gruppe
ten7.
Nach
Injektion
von
radioaktiv
Minu-
markiertem
des D o p a w u r d e durch einen V e r s u c h mit DL-Dopa-
D o p a steht dieses deshalb nur etwa eine Stde. f ü r die
[ 2 - T ] und D L - D o p a - [ c a r b o x y l - 1 4 C ] bestimmt. D a b e i
Synthese des markierten Melanins zur
w u r d e der E i n b a u des C - A t o m s auf G r u n d des aus
D a s radioaktive D o p a führte deshalb zu einer selek-
anderen Versuchen bekannten E i n b a u s des W a s s e r -
tiven M a r k i e r u n g
stoffatoms in 2-Stellung des D o p a berechnet.
z u m Zeitpunkt der D o p a - I n j e k t i o n M e l a n i n syntheti-
derjenigen M e l a n i n - G r a n u l a ,
sierten. Diese Granula bilden eine
Diskussion
Dopa
vers
handelte
es
Untersuchungen
sich
mit
bei
d i e s e m Grunde beziehen sich die W e r t e der T a b . 2
Melanom-Trockenpul-
den
hier
radioaktivem
vorliegenden
Dopa
fast
aus-
schließlich u m radioaktives M e l a n i n . D a s zeigt 1. die
Lokalisation
D o p a a u d i die D - F o r m . O b D-Dopa in v i v o unmittel-
(Abb. 2)
8
B. W E I S S and
[1963],
A.
B.
G.
V.
Verbindungen
u n d 3 . die sehr viel g e r i n g e r e
(Tab. 1 ) .
Rossi, Biochem. Pharmacol.
12.
zweifelhaft, da die Fermentaktivität der T y r o s i n a s e
f ü r D - D o p a gering 8 '
B.
FITZPATRICK,
biol. Chemistry
191,
E.
CHALKINS,
and
9
ist und da die D o p a - O x y d a s e -
R e a k t i o n mit D-Dopa negativ a u s f ä l l t 1 0 .
1399
9
10
LERNER, T .
SUMMERSON, J .
W ä h r e n d i m M e l a n o m nur die L - F o r m des D o p a
v o r k o m m e n dürfte, enthielt das radioaktiv markierte
b a r zur Melanin-Bildung verwandt w e r d e n k a n n , ist
Radioaktivität m e l a n i n f r e i e r G e w e b e
7
altes
melaninhaltigen
dioaktivität an nicht-hydrolysierbare
(Melanin)
auf ein 2 T a g e altes b z w . auf ein 1 0 T a g e
Melanin.
( A b b . 1 ) , 2 . d i e B i n d u n g der R a -
der Radioaktivität in
Zellbestandteilen
synchronisierte
biochemischen Untersuchungen v e r f o l g t w u r d e . A u s
Vorstufe
Melanins
Bei der Radioaktivität des
die
S u b p o p u l a t i o n , deren weiteres Verhalten durch die
als p h y s i o l o g i s c h e
des
Verfügung.
W .
S . H. P O M E R A N T Z , J . biol. Chemistry 2 3 8 , 2 3 5 1
[1963].
W. E. KNOX, Amer. J. Human Genetics 10, 249 [1958].
H.
799 [1951].
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Bei d e n v o r l i e g e n d e n Versuchen mit r a d i o a k t i v e m
D o p a m u ß t e damit gerechnet werden, daß a u ß e r h a l b
überführt wurden.
Die
Werte
der T a b . 2
würden
dann die Wahrscheinlichkeit a n g e b e n , mit der die
des M e l a n o m s entstandene A b b a u p r o d u k t e des D o p a
verschiedenen H - u n d C - A t o m e des D o p a in M e l a n i n
über d e n Kreislauf ins M e l a n o m gelangten u n d in
eingebaut werden.
Es soll i m f o l g e n d e n versucht w e r d e n , auf G r u n d
M e l a n i n eingebaut w u r d e n . B e i m A b b a u v o n L-Dopa
in v i v o entsteht zunächst D o p a m i n , aus d e m
dann
der E i n b a u g r ö ß e n
( =
Einbauwahrscheinlichkeiten)
H o m o p r o t o c a t e c h u s ä u r e und zahlreiche andere V e r -
der verschiedenen H - u n d C - A t o m e des D o p a ( T a b . 2 )
b i n d u n g e n gebildet werden. A u s D o p a m i n entstehen
Rückschlüsse auf die Struktur des tierischen Mela-
bei in vitro Versuchen mit Tyrosinase melaninähn-
nins zu ziehen. Rückschlüsse dieser A r t sind aller-
liche V e r b i n d u n g e n 1 1 , 1 2 ; f ü r das Melanin der Sub-
d i n g s nur dann m ö g l i c h , w e n n zusätzlich a n g e n o m -
stantia
m e n w i r d , daß Isotopie-Effekte bei den
nigra
wird
sogar
diskutiert,
ob
Dopamin
nicht der p h y s i o l o g i s c h e V o r l ä u f e r i s t 1 3 . D u r c h V e r suche mit r a d i o a k t i v e m D o p a m i n konnte a b e r
ge-
vorliegen-
den Untersuchungen keine R o l l e gespielt h a b e n u n d
d a ß M e l a n i n ausschließlich aus V e r b i n d u n g e n
auf-
zeigt w e r d e n , d a ß D o p a m i n i m Gegensatz zu D o p a
g e b a u t w i r d , die sich v o m D o p a ableiten. D a Unter-
höchstens
der
suchungen in dieser Richtung zur Zeit nicht vorlie-
und daß die Radioaktivität der
g e n , soll in der weiteren D i s k u s s i o n die Richtigkeit
zu
einer g e r i n g f ü g i g e n
M e l a n o m e führte
14
Markierung
L e b e r in der gleichen G r ö ß e n o r d n u n g lag w i e
die
der
des
Melanome15.
Markierte
Abbauprodukte
dieser A n n a h m e n unterstellt w e r d e n .
Mögliche Polymer-Einheiten
r a d i o a k t i v e n D o p a dürften also bei den v o r l i e g e n den V e r s u c h e n k a u m zur Radioaktivität der Melan o m e b e i g e t r a g e n haben.
Nach
dem
(Abb. 3)
Zur Bedeutung der
bekannten
der M e l a n i n - B i l d u n g
des Melanins
RAPER-MASON-Schema
wird
angenommen,
Einbaugrößen
1
D i e E i n b a u g r ö ß e n der einzelnen H- und C - A t o m e
Ü
CH
COQß
CH-COO®
~'
in T a b . 2 sind zunächst nur relative W e r t e , da der 3 , 4 - D i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n
E i n b a u des Leitatoms, des C - A t o m s in a-Stellung
Dopachinon
des D o p a , willkürlich gleich 1 gesetzt w u r d e . E i n i g e
experimentelle Ergebnisse deuten aber d a r a u f
hin,
d a ß bei der Ü b e r f ü h r u n g v o n D o p a in M e l a n i n das
HOv^v.
a - C - A t o m des D o p a stets mit eingebaut w i r d .
1. D e r E i n b a u des a - C - A t o m s ist in T a b . 2
Y ^ T
größer
SWAN
und
W R I G H T 12
[
CH2
CH-COO®
HO
als der irgendeines anderen A t o m s .
2.
'cH-COO6
Dopachrom
Leukociopachinon
konnten bei in vitro Synthe-
sen v o n M e l a n i n aus D o p a m i n zeigen, d a ß das
d e m a - C - A t o m des D o p a entsprechende C - A t o m
in 1-Stellung des D o p a m i n zu über 9 7 % in Melan i n eingebaut w i r d , während C - A t o m e des Benz o l r i n g s z u m Teil als C 0 2 abgespalten
3.
NICOLAUS
versuchen
und
an
Mitarbb.4> 5
tierischem
fanden
Melanin
bei
nur
wurden.
Abbau-
HO
HO
H
5,6- Indochinon
5,6-Di hydroxy indol
solche
Bruchstücke, die das v o m a - C - A t o m des D o p a abs t a m m e n d e C - A t o m noch enthielten.
Es g i b t demnach gute G r ü n d e f ü r die A n n a h m e , d a ß
der E i n b a u der a - C - A t o m e des D o p a der Z a h l der
D o p a - M o l e k ü l e entspricht, die insgesamt in M e l a n i n
11
12
G. A.
381.
G. A.
1549.
SWAN
and D.
WRIGHT,
J. chem. Soc. [London] 1954,
Melanin
Abb. 3. Vorstufen der oxidativen Polymerisation des Dopa
bei der Melanin-Bildung (nach M A S O N 1959).
13
14
SWAN
and D.
WRIGHT,
J. chem. Soc. [London] 1956,
15
Arch. int. pharmacodyn. 1 5 2 , 4 3 3 [ 1 9 6 4 ] .
and R. F. K A L L M A N , Cancer Res. 24, 863 [1964] .
K . H E M P E L , in: D E L L A - P O R T A , Structure and Control of the
Melanocyte, Springer-Verlag, Heidelberg 1966.
C . VANDERWENDE,
M.S.BLOIS
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d a ß 5 , 6 - I n d o d i i n o n Grundeinheit des M e l a n i n s ist.
Das würde f ü r die Einbauwahrscheinlichkeiten
der
folgende
verschiedenen H - und C - A t o m e des D o p a
Unterstellt m a n auf Grund der Einbauwahrscheinlichkeit des H - A t o m s in 6-Stellung des D o p a
Konsequenzen haben:
einen
1. Einbauwahrscheinlichkeit
Melaninkette nur durch C — C - B i n d u n g e n
der
Carboxyl-Gruppe
0,5),
d a ß nur 5 0 % aller Polymer-Einheiten des M e l a n i n s
Indolring
enthalten und
daß
außerdem
die
geknüpft
ist, so läßt sich die in A b b . 4 w i e d e r g e g e b e n e h y p o -
und des H - A t o m s in 6-Stellung gleich null.
2 . Einbauwahrscheinlichkeit des H - A t o m s in ^-Stellung gleich 0 , 5 und Einbauwahrscheinlichkeit des
Wasserstoffs in a-Stellung gleich
1 oder
gleich
null, j e nachdem o b die D e c a r b o x y l i e r u n g
DOPACHINON
auf
der Stufe des D o p a c h r o m o d e r der 5 . 6 - D i h y d r o x y -
5,6—IND0CHIN0N
indol-2-carbonsäure erfolgt.
D i e Ergebnisse der T a b . 2 stehen zu den A n n a h -
DOPACHINON
men des RAPER-MASON-Schemas in W i d e r s p r u c h , da
s o w o h l der Wasserstoff aus der 6-Stellung des D o p a
5,6-INDOCHINON-
als auch die C a r b o x y l - G r u p p e zu e i n e m erheblichen
Prozentsatz in M e l a n i n eingebaut w i r d . In
-2-CARBONSÄURE
diesem
Z u s a m m e n h a n g ist es interessant, daß s o g a r in vitro
aus
Dopa
Gruppen
synthetisiertes
des D o p a
Melanin
enthält16.
noch
Melanin
DOPACHINON
Carboxylkann
also
nicht ausschließlich aus 5 . 6 - I n d o c h i n o n gebildet wer-
5,6HNDOCHINON
den.
NICOLAUS 4 '
5
nimmt auf G r u n d v o n
Abbauversu-
chen an tierischem Melanin an, daß a u d i
Verbin-
Abb. 4. Mögliche Struktur des Melanins im Harding-PasseyMelanom.
d u n g e n , die bei der B i l d u n g v o n 5 . 6 - I n d o c h i n o n aus
D o p a intermediär entstehen ( A b b . 3 ) , unmittelbar in
thetische Strukturformel des Melanin-Moleküls
Melanin eingebaut werden k ö n n e n . V o n den in Be-
stellen. Nach dieser Formel ist Melanin ein K o p o l y -
tracht k o m m e n d e n V e r b i n d u n g e n ( A b b . 3 ) enthalten
merisat aus D o p a c h i n o n ,
die meisten noch die C a r b o x y l - G r u p p e , w ä h r e n d der
I n d o c h i n o n - c a r b o n s ä u r e . Das Mengenverhältnis die-
Wasserstoff
ser drei Polymer-Einheiten beträgt 3 : 2 : 1 .
aus der 6-Stellung des D o p a
nur
im
5.6-Indochinon
und
auf5.6-
Dabei
D o p a c h i n o n erhalten bleibt. D o p a d i i n o n und einige
w i r d a n g e n o m m e n , daß D o p a d i i n o n in 2- und 5-Stel-
V e r b i n d u n g e n mit C a r b o x y l - G r u p p e n
l u n g , das heißt an den C - A t o m e n nachbarständig zu
ten,
wenn
die
Hypothese
von
( A b b . 3 ) soll-
NICOLAUS 4
zutrifft,
ebenfalls Polymer-Einheiten des M e l a n i n s sein.
Verknüpfung der Polymer-Einheiten
im
Melanin
I m Melanin ist j e d e P o l y m e r - E i n h e i t mit mindestens zwei
Nachbar-Einheiten
verknüpft. Die
den
Carbonyl-Gruppen,
Derivate
Ver-
sollen
suchungen
wie
von
von
dagegen
verknüpft
CROMARTIE u n d
HORNER
und
ist.
Die
Indol-
an
Unter-
in A n l e h n u n g
HARLEY-MASON
SPIETSCHKA
18
über
17
das
soß-C-
A t o m des P y r r o l r i n g s und die C - A t o m e 4 und 5 des
Benzolrings
v e r k n ü p f t sein. Tatsächlich
dürfte
die
k n ü p f u n g kann durch C — C - B i n d u n g e n e r f o l g e n . Da-
Z a h l der Polymer-Einheiten noch sehr viel
neben werden aber a u d i noch Ä t h e r - und P e r o x y d -
sein, da außer den genannten C h i n o n e n auch n o c h
Brücken diskutiert. I m f o l g e n d e n soll versucht wer-
die entsprechenden S e m i d i i n o n e und
den, eine mit den v o r l i e g e n d e n Versuchsergebnissen
v o r k o m m e n könnten. Das V o r k o m m e n
in Einklang befindliche Strukturformel des M e l a n i n s
Elektronen i m M e l a n i n wird auf solche Semichinone
aufzustellen.
zurückgeführt19.
18
17
C. ROBSON and G. A. SWAN, in: DELLA-PORTA, Structure
and Control of the Melanocyte, Springer-Verlag, Heidelberg 1966.
R. I. T. CROMARTIE and J. HARLEY-MASON, Biochem. J. 6 6 ,
713 [1957].
N.
18
19
L. HORNER U. W.
[1954/55].
M . S. BLOIS, A. B.
471 [1964].
SPIETSCHKA,
ZAHLAN,
größer
Hydrochinone
ungepaarter
Liebigs Ann. Chem. 591, 1
and J.
E . MALING,
Biophys. J. 4,
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ex-
rer A t o m e des D o p a sollte es aber möglich sein, die-
Einbauwahrscheinlichkeiten
sen S p i e l r a u m m e h r u n d m e h r einzuschränken und
T a b . 3 bringt einen Vergleich zwischen den
perimentell
gefundenen
der verschiedenen H - und C - A t o m e des D o p a
und
schließlich zu einer den tatsächlichen
Verhältnissen
den auf Grund der hypothetischen Melanin-Struktur
gerecht w e r d e n d e n V o r s t e l l u n g von der Struktur des
(Abb. 4)
tierischen Melanins zu gelangen.
berechneten Werten. G r ö ß e r e
Abweichun-
g e n finden sich nur bei der Einbauwahrscheinlichkeit
Vergleich zwischen natürlichem und
des H - A t o m s in 5-Stellung, f ü r das die hypothetische
Strukturformel
einen
etwas
kleineren
Wert
liefert.
Bei
ber.
gef.
C-Carboxyl
C-a
0,66
1,00
0,64
1,00
H-a
0,50
0,50
0,50
0,33
0,50
0,53
0,43
0,64
0,25
0,47
n - ß
H-2
H-5
H-6
Gegenwart v o n T y r o s i n a s e
handelt
es sich
um
— aber auch durch Aut-
gen gebildet w e r d e n . Hinter dem Begriff
syntheti-
sches M e l a n i n v e r b i r g t sich eine Vielzahl v o n V e r b i n d u n g e n , deren A u f b a u nicht allein v o n der V o r stufe abhängt, s o n d e r n in erheblichem U m f a n g auch
v o n der A r t der Herstellung. A u s diesem
Grunde
dürften viele dieser synthetischen Melanine mit d e m
tierischen M e l a n i n k a u m m e h r als F a r b e und N a m e n
D i e F o r m e l in A b b . 4 beschreibt M e l a n i n in der
Form
Melanin
o x y d a t i o n — aus D o p a und verwandten V e r b i n d u n -
Tab. 3. Einbauwahrscheinlichkeit der verschiedenen H- und
C-Atome des Dopa in Melanin des Harding-Passey-Melanoms.
[ber. = beredinet nach Melanin-Formel (Abb. 4) ; gef. =
experimentell bestimmt (Tab. 2).]
vorliegenden
synthetischem
braun-schwarze Niederschläge, die bei O x y d a t i o n in
Einbauwahrscheinlichkeit
Dopa-Atom
synthetischem
Melanin
als ein F a d e n m o l e k ü l ,
obwohl
g e m e i n s a m haben.
SWAN
und M i t a r b b .
1 2 ' 1 6 ' 20
untersuchten in um-
fangreichen Versuchen mit Deuterium- und
1 4 C-mar-
kiertem D o p a und D o p a m i n den E i n b a u verschiedener H - u n d C - A t o m e in synthetisches Melanin. Ihre
Ergebnisse
sind
aber mit denen
der
vorliegenden
allgemein a n g e n o m m e n w i r d , daß M e l a n i n ein ver-
A r b e i t schwer vergleichbar, da die Untersuchungen
zweigtes Molekül ist. D i e V e r z w e i g u n g e n könnten in
z. T . mit D o p a m i n u n d nicht mit D o p a durchgeführt
Stellung
w u r d e n und da a u ß e r d e m auf Grund der Versuchs-
5
erfolgen.
Quervernetzungen
Der
überwiegende
sollte j e d o c h
Teil
der
durch andere
Bin-
d u n g e n , z. B . Äther-Bindungen o d e r
Peroxyd-Brük-
ken e r f o l g e n ; sonst wäre die relativ h o h e
Einbau-
wahrscheinlichkeit des D o p a - W a s s e r s t o f f s insgesamt
a n o r d n u n g nur A n g a b e n über den prozentualen Isotopen-Gehalt in M e l a n i n und M e l a n i n - V o r s t u f e
macht w e r d e n k o n n t e n . A u s diesen A n g a b e n
gesind
Einbauwahrscheinlichkeiten nicht zu berechnen. Im-
nicht verständlich. Brücken dieser A r t sind in A b b . 3
m e r h i n zeigten diese Untersuchungen, daß der W a s -
aus G r ü n d e n der Übersichtlichkeit nicht eingezeich-
serstoff der Seitenkette des D o p a in erheblichem U m -
net.
f a n g in M e l a n i n eingebaut w i r d und daß der K o h l e n -
D i e auf Grund der E i n b a u g r ö ß e n
(Tab. 2)
gestellte Strukturformel des Melanins
auf-
(Abb. 4)
ist
stoff der C a r b o x y l - G r u p p e weitgehend als C 0 2
gespalten w i r d
selbstverständlich nicht mehr als ein erster Versuch,
ein mit den Ergebnissen
und
den
Ergebnissen
der v o r l i e g e n d e n
anderer
Arbeit
Untersuchungen
KIRBY
und
ab-
20.
OGUNKOYA
suche mit T r i t i u m
und
21
bestimmten
1 4 C-markiertem
durch
Ver-
Dopa
den
in
E i n b a u verschiedener H - und C - A t o m e des D o p a in
entwickeln.
synthetisches M e l a n i n . Bei diesen Versuchen diente,
Einbauwahrscheinlichkeiten sagen über die Struktur
g e n a u wie in der v o r l i e g e n d e n A r b e i t , der E i n b a u
eines Stoffes ähnlich wenig aus wie eine Elementar-
des a - C - A t o m s des D o p a als Bezugspunkt und w u r d e
Einklang
stehendes M e l a n i n - M o d e l l
zu
A n a l y s e . Sie legen aber wie diese den
Spielraum
fest, innerhalb dessen sich alle Betrachtungen
über
gleich 1 gesetzt. KIRBY et al.
21
Einbauwahrscheinlichkeiten:
f a n d e n die f o l g e n d e n
H-a 0 , 5 2 ;
H-ß
0,54;
dürfen.
H - 2 0 , 3 7 ; H - 5 0 , 4 2 und H - 6 0 , 1 3 . Der Vergleich
Durch die Bestimmungen der E i n b a u - G r ö ß e n weite-
dieser W e r t e mit denen der T a b . 2 zeigt eine über-
Strukturformeln
20
des
Melanins
bewegen
G . A . SWAN, A n n . N . Y . A c a d . S e i . 1 0 0 , 1 0 0 5
[1963].
21
G. W. KIRBY and L.
[1965].
OGUNKOYA,
Chem. Commun.
21,
546
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raschende
Übereinstimmung.
Signifikante
schiede fanden sich lediglich bei der
Unter-
Einbauwahr-
scheinlichkeit des H - A t o m s in 6-Stellung. D e r sehr
viel geringere Einbau dieses H - A t o m s in
syntheti-
sches M e l a n i n deutet darauf hin, d a ß bei synthetischem Melanin I n d o l r i n g e als P o l y m e r - E i n h e i t eine
ungleich g r ö ß e r e R o l l e spielen als b e i m natürlichen
Melanin.
D i e unerwartet gute Ü b e r e i n s t i m m u n g
zwischen
d e n an synthetischem Melanin und den an natürlichem M e l a n i n g e w o n n e n e n E r g e b n i s s e n darf nicht
d a r ü b e r hinwegtäuschen, daß die F r a g e u n b e a n t w o r tet ist, o b synthetisches M e l a n i n eine mit d e m natürlichen M e l a n i n vergleichbare Substanz ist.
diese F r a g e offen ist, können nur
Solange
Untersuchungen
an nativem Melanin gesicherte Kenntnisse zur Struktur des tierischen Melanins liefern.
Methode
Radioaktive Verbindungen: DL-Dopa-[a-T]
(spez.
Akt. 40 m C / m M o l ) , DL-Dopa-[/?-T] (spez. Akt. 12 m C /
m M o l ) , DL-Dopa-[2-T] (spez. Akt. 1700 m C / m M o l )
und DL-Dopa-[5-T] (spez. Akt. 100 m C / m M o l ) wurden
nach eigenen Verfahren 2 2 synthetisiert. DL-Dopa-[6-T]
(spez. Akt. 4700 m C / m M o l ) wurde nach der Methode
von
SCHREIER,
PACHA
und
RUTSCHMANN
23
dargestellt,
während DL-Dopa-[A- 14 C] (spez. Akt. 5 m C / m M o l ) von
Hoffmann-Laroche, B a s e l 2 4 , und DL-Dopa- [carboxyl1 4 C]
(spez. Akt. 2 m C / m M o l ) von der New England
Nuclear Corp., Boston, bezogen wurden. A l l e markierten Verbindungen wurden am Tage vor dem Versuch
papierchromatographisch gereinigt; M e d i u m : Methyläthylketon/Propionsäure/Wasser ( 7 5 : 2 5 : 3 0 ) , Papier:
SS 2043 b Mgl. Die radiochemische Reinheit der verwendeten Verbindungen wurde radiopapierchromatographisch in 3 verschiedenen Systemen [Methyläthylketon/
Propionsäure/Wasser
(75 : 25 : 3 0 ) ;
n-Butanol/Eisessig/Wasser ( 4 : 1 : 5 , org. P h a s e ) ; Phenol/Wassergesättigt] überprüft. Sie war > 96 Prozent.
Tierversuche: Als Versuchstiere dienten 25 — 35 g
schwere männliche Albino-Mäuse, Stamm N M R I - H a n 2 5 ,
mit subcutan gelegenen Melanomknoten eines mittleren Gewichtes von 2 g. Die Tumoren wurden durch
subcutane Injektion einer Suspension von 0,1 g
Melanom-Homogenat in 0,3 cm 3 physiol. NaCl ca.
4 — 6 Wochen vor Versuchsbeginn erzeugt.
22
23
H . HEMPEL, in Vorbereitung.
E. SCHREIER, W. PACHA U. J.
46, 954 [1963].
Gruppen von 5 — 10 Melanom-Mäusen wurde gleichzeitig 300 /iic 3 H-markiertes und 3 /uc 14 C-markiertes
Dopa in 0,3 cm 3 physiol. NaCl gelöst i.p. injiziert. Die
Mäuse wurden 2 bzw. 10 Tage später getötet, Melanome
und Lebern wurden entnommen, gewogen und sofort
mit Trockeneis eingefroren. Aus den Geweben wurden
die säureunlöslichen Verbindungen (Proteine, Nucleinsäuren und Melanin) nach der Methode von SCHMIDTTHANNHAUSER 3 durch Fällung mit Trichloressigsäure
abgetrennt. Man erhält so ein Trockenpulver, das nur
noch die oben genannten Verbindungen enthält.
Hydrolyse von Melanom-Trockenpulver: Trockenpulver (ca. 100 mg) aus Melanomen, die 2 Tage zuvor
durch Injektion von radioaktivem Dopa in vivo markiert worden waren, wurden mit 10 cm 3 5% HCl auf 1 0 0 °
erwärmt. Nach 2, 5 und 10 Stdn. wurde der ungelöste
Teil abzentrifugiert, 2-mal mit dest. Wasser gewaschen,
im Exsikkator über P2O5 getrocknet, gewogen und die
Radioaktivität nach Verbrennen gemessen.
Zur Bestimmung von 1 4 CO ä , das während der Hydrolyse aus Melanin entsteht, wurde gleichzeitig ein gelinder Strom von N 2 über die Lösung geleitet und C 0 2
anschließend in einer mit Colamin beschickten Vorlage
aufgefangen. Die Radioaktivität der Colamin-Lösung
wurde ebenso wie die der Salzsäure nach Abzentrifugieren des ungelösten Rückstandes im Flüssigkeitsscintillationszähler gemessen.
Radioaktivitätsmessung:
Die Radioaktivität
von
Lösungen (Colamin-Lösung bzw. HCl) wurde gemessen, indem jeweils 0,5 cm 3 dieser Lösungen zu 15 cm 3
Scintillator-Lösung der folgenden Zusammensetzung
gegeben wurden: 0,2 g 1.4-bis-2(5-phenyloxazollyl)benzol
( P O P O P ) , 8,0 g 2.5-Diphenyl-oxazol
(PPO),
2000,0 cm 3 Toluol (tech.) und 1260,0 cm 3 Äthanol
(95%).
Zur Messung der Radioaktivität fester Proben
(Trockenpulver aus Geweben) wurden diese in einer
0 2 -Atmosphäre verbrannt, und ihr Gehalt an Tritium
und 1 4 C wurde anschließend mit einem Flüssigkeitsscintillations-Zähler (Tri-Carb, Modell 314 E X , Fa.
Packard, U S A ) simultan gemessen 2 6 . Die Zählausbeute betrug für Tritium 3,5 Prozent und für 1 4 C 10
Prozent. Je Gewebsprobe wurden mindestens 2 Bestimmungen durchgeführt. Die Standardabweichung der
Meßwerte vom Mittelwert betrug bei Tritium + 2% und
bei 1 4 C ± 4 Prozent.
Frau
24
RUTSCHMANN,
URSULA
STEHR
und
Fräulein
REGINA
KREUTZ
danke ich für ihre ausgezeichnete Mitarbeit bei der
Durchführung der Versuche. Die Untersuchungen wurden durch Mittel der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t unterstützt.
Helv. chim. Acta
25
28
Fa. H o f f m a n n - L a r o c h e , Basel, danke ich für die
Überlassung von 14C-Dopa.
Zentralinstitut für Versuchstierzucht, Hannover-Linden.
K. HEMPEL, Atompraxis 1 0 , 148 [1964].
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