Charakterisierung eines Rop-Proteins aus Arabidopsis thaliana und
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Charakterisierung eines Rop-Proteins aus Arabidopsis thaliana und seiner Interaktionspartner Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in Dortmund vorgelegt von Henriette Brüggemann aus Kassel Bochum 2005 Inhalt I Inhalt Inhalt Abkürzungen Tabellen Abbildungen 1 Einleitung I VI XI XII 1 1.1 Guaninnukleotid-bindende Proteine in der Signaltransduktion 1 1.2 Die G-Proteine der Ras-Superfamilie 2 1.2.1 Regulationsmechanismen 1.2.2 Strukturelle Gemeinsamkeiten kleiner regulatorischer G-Proteine 1.2.3 Posttranslationale Modifikationen 1.2.4 Gliederung der Ras-Superfamilie 1.3 Rho-Proteine der Rop-Unterfamilie 1.3.1 Charakteristika der Rop-Aminosäuresequenzen 1.3.2 Posttranslationale Modifikationen und Lokalisation der Rop-Proteine 1.3.3 Klassifizierung der Rop-Proteine 1.3.4 Differenzielle Expression der Rop-Gene in pflanzlichen Geweben 1.4 Rop-kontrollierte Signalwege 1.4.1 Die Rolle von Rop in der Pathogenabwehr 1.4.1.1 Die Kontrolle der H2O2-Produktion durch Rop 1.4.1.2 Rop-kontrollierte Faktoren zur Steuerung der Abwehrreaktionen 1.4.2 Rop kontrolliert diverse Prozesse in der Entwicklung der Pflanze 1.4.2.1 Die Rolle von Rop in der Regulation der Meristemerhaltung 1.4.2.2 Die Funktion von Rop in der Sekundärwandbildung 1.4.3 Die Funktion von Rop in Phytohormon-Signalwegen 1.4.3.1 Die Rolle von Rop im Auxin-Signalweg 1.4.3.2 Die Rolle von Rop im Abszisinsäure-Signalweg 1.4.4 Die Kontrolle stressbedingter Reaktionen der Pflanze durch Rop 1.4.5 Die Rolle von Rop in Aktinpolymerisierungsprozessen 1.4.5.1 Regulation des Aktinzytoskeletts durch tierische Rho-Effektoren 1.4.5.2 Die Rolle von Rop in der Regulation des Spitzenwachstums von Pollenschläuchen und Wurzelhaaren 1.4.5.3 Die Funktion von Rop in diffus wachsenden Zellen 1.4.5.4 Rop-kontrollierte Faktoren zur Regulation von Aktinstrukturen 1.5 Regulation der Aktivität von Rop 1.5.1 Regulation durch Guaninnukleotid-Austauschfaktoren 1.5.2 Regulation durch GTPase-aktivierende Proteine 1.5.3 Regulation durch Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitoren 1.6 Potentielle Rop-Effektoren – genannt RICs 2 3 4 4 5 7 9 10 11 11 12 12 14 15 15 17 17 18 18 19 19 20 23 24 25 26 26 27 31 32 2 Problemstellung 34 3 Material und Methoden 35 3.1 Material 35 3.1.1 Geräte 3.1.2 Kit-Systeme 35 36 Inhalt II 3.1.3 Verbrauchsmaterialien 3.1.4 Chemikalien und Biochemikalien 3.1.4.1 Chemikalien 3.1.4.2 Säulenmaterialien 3.1.4.3 Nukleotide 3.1.4.4 Protease-Inhibitoren 3.1.4.5 Antibiotika 3.1.4.6 Enzyme 3.1.4.7 Antikörper und Konjugate 3.1.4.8 Protein- und Nukleinsäure-Grössenstandards 3.1.5 Standardpuffer 3.1.6 Nährmedien 3.1.6.1 Medien zur Anzucht von Escherichia coli 3.1.6.2 Medien zur Anzucht von Hefe 3.1.6.3 Medien zur Anzucht von Insektenzellen 3.1.6.4 Medien zur Anzucht von Säugerzellen 3.1.7 Vektoren 3.1.8 Oligonukleotide 3.1.9 Plasmide 3.1.9.1 Bakterielle Expressionsplasmide 3.1.9.2 Expressionsplasmide für Säugerzellen 3.1.9.3 Expressionsplasmide für Insektenzellen 3.1.9.4 Expressionsplasmide für Pflanzen 3.1.9.5 Hefe-Zweihybridplasmide 3.1.10 cDNA-Bibliotheken 3.1.11 Stämme 3.1.11.1 Escherichia coli-Stämme 3.1.11.2 Saccharomyces cerevisiae-Stämme 3.1.11.3 Zelllinien 3.1.11.4 Pflanzenmaterial 3.1.12 Computer-Software 3.2 Methoden 3.2.1 Kulturmethoden 3.2.1.1 Bakterien 3.2.1.1.1 Kulturbedingungen und Lagerung 3.2.1.1.2 Herstellung kompetenter Bakterien 3.2.1.1.3 Transformation von E. coli 3.2.1.1.4 Proteinexpression in E. coli 3.2.1.1.5 Aufschluss von Bakterien 3.2.1.1.6 Amplifizierung der cDNA-Bank 3.2.1.2 Hefe 3.2.1.2.1 Kulturbedingungen 3.2.1.2.2 Transformation der Hefe L40 3.2.1.2.3 Analyse von Hefe-Zweihybrid-Interaktionen auf Selektionsplatten 3.2.1.2.4 Semiquantitative Analyse von Hefe-Zweihybrid-Interaktionen mit der Galaktosidase-Reportergenanalyse 3.2.1.3 Insektenzellen 3.2.1.3.1 Kulturbedingungen 3.2.1.3.2 Stabile Transfektion mit dem InsectSelect-System 3.2.1.3.3 Transfizieren von Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA 3.2.1.3.4 Bestimmung des Virus-Titers 36 36 36 37 37 37 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41 42 43 43 44 45 45 45 46 46 46 46 46 47 47 47 47 47 47 47 48 48 48 49 49 49 49 50 50 50 50 51 52 53 Inhalt 3.2.1.3.5 Virusamplifikation 3.2.1.3.6 Vereinzelung von Viren 3.2.1.3.7 Proteinexpression in Sf21-Zellen 3.2.1.4 Säugerzellen 3.2.1.4.1 Kulturbedingungen 3.2.1.4.2 Transiente Transfektion durch Lipofektion 3.2.1.4.3 Transiente Transfektion nach der DEAE-Dextran-Methode 3.2.1.5 Zwiebel Epidermiszellen 3.2.1.5.1 Transformation 3.2.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.2.1 Minipräparation von Plasmid-DNA 3.2.2.2 Midipräparation von Plasmid-DNA 3.2.2.3 Maxipräparation von Plasmid-DNA 3.2.2.4 Isolierung der Plasmid-DNA der cDNA-Bibliothek 3.2.2.5 Präparation von Bakmid-DNA 3.2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 3.2.2.7 Polymerasekettenreaktion (PCR) 3.2.2.8 Ortsspezifische Mutagenese 3.2.2.9 Sequenzierung von DNA 3.2.2.10 Restriktion von DNA 3.2.2.11 Dephophorylierung von DNA 3.2.2.12 Ligation von DNA-Fragmenten 3.2.2.13 Aufreinigung von DNA-Fragmenten 3.2.2.14 Agarosegel-Elektrophorese 3.2.2.15 Gelelution von DNA-Fragmenten 3.2.3 Biochemische Methoden 3.2.3.1 Proteinbestimmung nach Bradford 3.2.3.2 SDS-PAGE 3.2.3.3 Färbung von SDS-Gelen und PVDF-Membranen mit Coomassie Brilliant Blue 3.2.3.4 Silberfärbung von SDS-Gelen 3.2.3.5 Western Blot 3.2.3.6 Immunologischer Nachweis von Proteinen im Western Blot (Immunoblot) 3.2.3.7 Immunzytochemischer Nachweis von Proteinen 3.2.3.8 Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie 3.2.3.9 Reinigung von His6-Rop4 3.2.3.10 Reinigung von GST-RopGAP2 aus E. coli 3.2.3.11 Reinigung von RopGAP2 aus Sf21-Zellen 3.2.3.12 Reinigung von GST-RIC6 und GST-RIC9 3.2.3.13 Proteolytischer Verdau im Gel und MALDI-Analyse 3.2.3.14 Nukleotidaustausch an Rop4 3.2.3.15 Nukleotidbefreiung von Rop4 3.2.3.16 Messung der intrinsischen GTP-Hydrolyse durch Rop4 3.2.3.17 Michaelis-Menten-Kinetik 3.2.3.18 pull down aus Cos7-Zelllysaten 3.2.3.19 In vitro pull down-Interaktionstest 3.2.4 Fluoreszenzspektroskopische Methoden 3.2.4.1 Bestimmung der Nukleotiddissoziationsrate 3.2.4.2 Bestimmung der Aktivierungsenergie der Nukleotiddissoziation 3.2.4.3 Magnesiumabhängigkeit der Nukleotiddissoziation III 53 54 54 54 54 54 55 55 55 56 56 56 56 56 56 57 57 58 58 58 58 59 59 59 59 60 60 60 61 61 62 62 63 63 64 65 66 67 68 69 69 69 70 70 71 72 72 72 72 Inhalt 4 IV 3.2.4.4 Fluoreszenzpolarisationstitration 3.2.4.5 Fluoreszenztitration 3.2.4.6 stopped flow-Messung 3.2.5 Konfokale Mikrokopie 73 73 74 74 Ergebnisse 75 4.1 Biochemische und funktionelle Charakterisierung der RopProteine aus Arabidopsis thaliana Bioinformatische Analyse sequenzdeterminierter Eigenschaften des G-Proteins Rop4 4.1.2 Reinigung von Rop4 aus Escherichia coli 4.1.3 Biochemische Charakterisierung von Rop4 4.1.3.1 Nukleotiddissoziation von Rop4 4.1.3.2 Temperaturabhängigkeit der Nukleotiddissoziation von Rop4 4.1.3.3 Abhängigkeit der Nukleotiddissoziation von MgCl2 4.1.3.4 Nukleotidaffinitäten von Rop4 4.1.3.5 Die Hydrolyseaktivität von Rop4 4.1.4 Funktion von Rop4 in der Regulation der Aktinorganisation 4.1.4.1 Lokalisation von Rop4 und Aktin in Zwiebel-Epidermiszellen 4.1.4.2 Der Einfluss von Rop4 auf das Aktinzytoskelett von Säugerzellen im Vergleich zu RhoA, Rac1 und Cdc42 4.1.4.2.1 Expression von Rop4 in Säugerzellen 4.1.4.2.2 Expression von RhoA, Rac1 und Cdc42 in NIH3T3-Zellen 4.1.4.2.3 Expression von RhoA, Rac1 und Cdc42 in HeLa-Zellen 4.1.4.3 In vitro-Interaktion von Rop4 mit der G-Protein-bindenden Domäne von humaner p21-aktivierter Kinase 1 4.1.4.4 Aktivierung von Rop4 durch den Rac-spezifischen Austauschfaktor Tiam1 75 4.1.1 4.2 Regulation von Rop4 durch RopGAP2 aus Arabidopsis thaliana Bioinformatische Analyse sequenzdeterminierter Eigenschaften von RopGAP2 4.2.2 Reinigung von RopGAP2 4.2.2.1 Expression in E. coli und Reinigung eines RopGAP2-Fragmentes 4.2.2.2 Expression und Reinigung von RopGAP2 mit Hilfe des BakulovirusSystems in Spodoptera frugiperda-Zellen 4.2.3 Regulation von Rop-Proteinen durch RopGAP2 4.2.3.1 Untersuchung der Interaktion von RopGAP2 mit Rho-Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem 4.2.3.2 Untersuchung der Interaktionen von RopGAP2 mit unterschiedlichen Rops im Hefe-Zweihybridsystem 4.2.3.3 Untersuchung der Interaktion von RopGAP2 mit Rop4 in vitro 4.2.3.4 Aktivierung der Hydrolyse von Rop4*GTP durch RopGAP2 75 76 78 78 79 80 81 82 82 83 84 84 87 90 93 94 95 4.2.1 4.3 Interaktion von Rops mit RICs Bioinformatische Analyse sequenzdeterminierter Eigenschaften der RICs aus A. thaliana 4.3.2 Die Interaktion zwischen Rops und RICs 4.3.2.1 Untersuchung der Interaktion von RICs mit menschlichen RhoProteinen im Hefe-Zweihybridsystem 4.3.2.2 Untersuchung der Spezifität der Rop-RIC-Interaktion im HefeZweihybridsystem 95 96 96 98 100 100 103 105 106 107 4.3.1 107 109 109 110 Inhalt 5 V 4.3.2.3 Untersuchung der Interaktion von RICs mit Rop4 in vitro 4.3.3 Funktion von RICs in der Regulation der Aktinorganisation 113 114 Diskussion 116 5.1 Rop4 hat die Charakteristika eines molekularen Schalters 5.1.1 Rop4 ist ein aktives Guaninnukleotid-bindendes Protein 5.1.2 Rop4 bindet Guaninnukleotide mit hoher Affinität 5.1.3 Die Nukleotidbindung durch Rop4 erfolgt magnesiumabhängig 5.1.4 Die intrinsische Hydrolyse von GTP durch Rop4 ist relativ langsam 5.2 5.3 Nukleotidaustausch an Rop4 119 RopGAP2 steigert die Hydrolyseaktivität von Rop4 120 RopGAP2 ist ein aktiver Regulator von Rop4 RopGAP2 hat zwei unterschiedliche GNBP-Bindestellen CRIB- und GAP-Domänen binden an dieselben Regionen des GNBPs Die CRIB-Domäne ist für die Aktivität von RopGAP erforderlich Die Bindung von RopGAP an Rop erfolgt nukleotidabhängig Die CRIB-Domäne vermittelt die Rop-Spezifität von RopGAP RICs sind spezifische Interaktionspartner von Rops 5.4.1 Alternatives Spleißen der RIC-Gene? 5.4.2 Rop4 interagiert mit RIC6 und RIC9 5.4.3 Die Interaktion von Rops mit RICs erfolgt teilweise hochspezifisch 5.4.4 Das Auftreten spezifischer RIC-Rop-Interaktionen korreliert mit der Gruppenaufteilung der RICs 5.5 Die Rolle von Rop4 als Regulator des Aktinzytoskelettes 5.5.1 Rop4 induziert Morphologieänderungen in Säugerzellen 5.5.2 Rop4 übernimmt die Funktionen von Rac1 in Säugerzellen 5.5.3 Rop4 ist in Zwiebel-Epidermiszellen membranlokalisiert 5.5.4 Die Rolle von RICs in der Regulation der Aktindynamik 5.6 6 7 117 117 118 118 Der menschliche Austauschfaktor Tiam1 beschleunigt den 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.3.6 5.4 116 Ausblick 120 121 122 125 125 126 128 128 129 129 130 133 134 135 137 138 139 Zusammenfassung 140 Summary 142 Literatur 144 Danksagung Lebenslauf Erklärung XIV XV XVI Abkürzungen VI Abkürzungen A ABA ABI A. bidest ACK ADF ADH ABI APS Arf Arl Arp At, A.t., A. thaliana as AS ATP AU BRK1 BSA Bv bzw. C °C Ca CA CaaX cAMP Cdc25 Cdc42 CDMS cDNA C.e. CFP cGMP clv cm CRIB C-Terminus D DAD Dbl DEAE-Dextran DH DHR D.m. in einer DNA-Sequenz: Adenin; in einer Protein-Sequenz: Alanin Abszisinsäure Abl interactor Aqua bidest Cdc42-assoziierte Tyrosinkinase (activated Cdc42-associated tyrosine kinase) Aktin-depolymerisierender Faktor Alkoholdehydrogenase abscisic acid insensitive Ammoniumperoxodisulfat ADP ribosylation factor Arf-like actin-related protein Arabidopsis thaliana anti sense Aminosäure Adenosintriphophat absorption units brick Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) Beta vulgaris beziehungsweise in einer DNA-Sequenz: Cytosin; in einer Protein-Sequenz: Cystein Temperatur in Grad Celsius Cicer arietinum konstitutiv aktiv (constitutive active) Isoprenylierungssignal (C = Cystein, a = aliphatische Aminosäure, X = beliebige Aminosäure) zyklisches Adenosinmonophosphat cell division cycle 25 cell division cycle 42 C.e. CED5, H.s. DOCK180, D.m. MYOBLAST CITY, A.t. spike1 komplementäre DNA (complementary DNA) Caenorhabditis elegans cyan fluoreszierendes Protein zyklisches Guanosinmonophosphat clavata Zentimeter Cdc42/Rac interactive binding Carboxyterminus Durchlauf; in Protein-Sequenz: Aspartat Dia autoregulatory domain human diffuse B cell lymphoma Diethylaminoethyl-Dextran Dbl-homologe Domäne dock homology region Drosophila melanogaster Abkürzungen DMEM DMSO DN DNA dNTP DTE E E. coli EDTA EF Em ESI-MS EST et al. etc. Ex F F-Aktin FCS FH fl FPLC g G G-Aktin GAP GBD GDI GEF GGTase I GFP Gh GNBP GDP G-Protein GppCH2p GppNHp GSH GST GTP GTPase H HCl Hg His6 H2O H2O2 HPLC H-Ras Hs Hv VII Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dimethylsulfoxid dominant negativ Desoxyribonukleinsäure Desoxynukleosidtriphosphat 1,4-Dithioerythritol Eluat; in Protein-Sequenz: Glutamat Escherichia coli Ethylendiamintetraessigsäure Elongationsfaktor Emissionswellenlänge electrospray ionization mass spectrometry expressed sequence tag et alia et cetera Exzitationswellenlänge Phenylalanin filamentöses Aktin fötales Kälberserum formin homology volle Länge (full length) fast performance liquid chromatography Erdbeschleunigung in einer DNA-Sequenz: Guanin; in einer Protein-Sequenz: Glycin monomeres (globuläres) Aktin GTPase-aktivierende Proteine GTPase-bindende Domäne Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitor guanine nucleotide exchange factor Geranylgeranyltransferase I grün fluoreszierendes Protein Gossypium hirsutum Guaninnukleotid-bindendes Protein Guanosindiphosphat Guaninnukleotid-bindendes Protein Guanosin-5’-β,γ-methylentriphosphat Guanosin-5’-β,γ-imidotriphosphat reduzierte Form von Glutathion Glutathion-S-Transferase Guanosintriphosphat Guanosintriphosphatase Histidin Salzsäure, Chlorwasserstoff Quecksilber Hexahistidinsequenz Wasser Wasserstoffperoxid high pressure liquid chromatography Harvey-Ras Homo sapiens Hordeum vulgare Abkürzungen I IAA IgG IPTG K KAPP kb kcat kD KD KM kobs koff kon KOH l L LB LIMK Lj LPA mA M MALDI m, mantMAPK MBS mg µg Mg2+ ml µl MLC MLCK mM µM mOsmol MPI Ms N NADPH NaOH NAPP NCS n.f. Ni-NTA nm nM nmol Nt VIII Isoleucin Indolessigsäure Immunglobulin G Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid Temperatur in Kelvin; bei Experimenten: Kontrolle; in einer Proteinsequenz: Lysin Kinase-assoziierte Proteinphosphatase Kilobase maximale Geschwindigkeitskonstante Kilodalton Dissoziationsgleichgewichtskonstante Michaeliskonstante beobachtete Geschwindigkeitskonstante Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation Geschwindigkeitskonstante der Assoziation Kalilauge Liter Lysat; in einer Proteinsequenz: Leucin Luria-Bertani LIM-Kinase Lotus japanicus lysophosphatidic acid Milliampere molar; in einer Proteinsequenz: Methionin matrix assisted laser desorption/ionization 3’-O-(N-Methylanthraniloyl)mitogen activated protein kinase myosin binding subunit Milligramm Mikrogramm Magnesiumkation Milliliter Mikroliter myosin light chain MLC-Kinase millimolar mikromolar Milliosmol Max-Planck-Institut Medicago sativa Asparagin reduzierte Form von Nikotinamid-Adenindinukleotidphosphat Natronlauge NAP of plants Neugeborenen-Kälberserum nukleotidfrei Nickel-Nitrilotriessigsäure Nanometer nanomolar Nanomol Nicotiana tabacum Abkürzungen OD Os P PA PAGE PAK PBS PCR PDGF Pfu PH pI PIK PIP2 PIRP PLD pM pmol Ps psi PVDF Q R Rab Rac Rad Rag Ran Ras RBD RCC1 REM Rho RIC Rit RKH RLK RLP RNA RNAi ROK Rop RopGAP2∆70 RopGAP2∆132 ROS rpm RT RT-PCR s S IX optische Dichte Oryza sativa Phophatgruppe; bei SDS-Gelen: Sediment (pellet); in einer Proteinsequenz: Prolin Phosphatidsäure Polyacrylamid-Gelelektophorese p21-aktivierte Proteinkinase phosphate buffered saline Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) platelet derived growth factor Pyrococcus furiosus Pleckstrin homology isoelektrischer Punkt Phosphatidylinositolmonophosphatkinase Phosphatidyl-Inositol-4,5-bis-Phosphat PIR of plants Phospholipase D pikomolar Pikomol Pisum sativum pounds per square inch Polyvinyldifluorid Glutamin Arginin ras-like proteins from rat brain ras related C3 botulinum toxin substrate Ras-associated with diabetes Ras-related GTP binding protein ras related nuclear transport Rat sarcoma Ras-bindende Domäne regulator of chromosome condensation Rho effector homology Ras homologous Rop-interactive CRIB motif-containing protein Ras-like protein in many tissues ROK-Kinektin homology Rezeptorkinase (receptor-like kinase) receptor-like protein Ribonukleinsäure RNA interference Rho-Kinase rho of plants N-terminal deletiertes RopGAP2-Fragment (Aminosäuren 71-424) N-terminal deletiertes RopGAP2-Fragment (Aminosäuren 133-424) reactive oxygen species Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) Raumtemperatur Reverse Transkriptase-PCR Sekunde; bei Oligonukleotiden: sense Serin Abkürzungen SAP Sc SDS Sf SH3 SR SRP Std. I SVol sw T TAD TAE Taq TBST TB TEMED TEV Tiam Tris TRITC TSS Tween 20 U Ü u.a. UK ü.N. USA UV V VCA v/v W WASP WAVE WH wt w/v X X-Gal Y YFP Zm X Alkalische Phosphatase aus shrimps Saccharomyces cerevisiae Natriumdodecylsulfat Spodoptera frugiperda Src homology 3 Rezeptor des Signalerkennungspartikels Signalerkennungspartikel (signal recognition particle) Standard I-Medium Säulenvolumen Schalterregion (switch) in einer DNA-Sequenz: Thymin; in einer Proteinsequenz: Threonin Transaktivierungsdomäne Tris-Acetat-EDTA Thermus aquaticus Tris-buffered saline with Tween-20 Terrific Broth N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Tabak-Etch-Virus T-cell lymphoma invasion and metastasis Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Tetramethyl-Rhodamin-Isothiocyanat transformation and storage solution Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaureat unit (Einheit der Enzymaktivität) Überstand, lösliche Fraktion unter anderem United Kingdom über Nacht United States of America Ultraviolett Volt; in einer Proteinsequenz: Valin Verprolin homology, Cofilin homology, acidic Verhältnis Volumen/Volumen Waschfraktion; in einer Proteinsequenz: Tryptophan Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein WASP familiy Verprolin-homologous protein WASP homology Wildtyp Verhältnis Masse/Volumen beliebige Aminosäure Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid Tyrosin gelb fluoreszierendes Protein Zea mays Tabellen XI Tabellen Tabelle 1.1: Tabelle 1.2: Tabelle 1.3: Tabelle 1.4: Tabelle 1.5: Tabelle 1.6: Tabelle 1.7: Tabelle 1.8: Die fünf Superfamilien Guaninnukleotid-bindender Proteine. Konservierte Sequenzmotive Ras-homologer GNBPs und ihre Funktionen. Mitglieder der Ras-Superfamilie und ihre Funktionen. Nomenklatur pflanzlicher Rho-Proteine. Mutationen von G-Proteinen und ihre Charakteristika. Phylogenetische Gruppen der Rop-Unterfamilie und ihre Funktionen. Ausgesuchte GTPase-aktivierende Proteine der Rho-Proteine. Eigenschaften der Rop-interactive CRIB motif-containing proteins aus A. thaliana nach Wu et al. 2001. Tabelle 3.1: Tabelle 3.2: Tabelle 3.3: Tabelle 3.4: Tabelle 3.5: Tabelle 3.6: Tabelle 3.7: Tabelle 3.8: Tabelle 3.9: Tabelle 3.10: Tabelle 3.11: Tabelle 3.12: Tabelle 3.13: Tabelle 3.14: Tabelle 3.15: Tabelle 3.16: Tabelle 3.17: Einsatz von Antibiotika. Primäre Antikörper. Sekundäre Antikörper. Oligonukleotide. Bakterielle Expressionsplasmide. Expressionsplasmide für Säugerzellen. Expressionsplasmide für Insektenzellen. Expressionsplasmide für Pflanzen. Plasmide für das Hefe-Zweihybridsystem. Verwendete Escherichia coli-Bakterienstämme. Verwendete Saccharomyces cerevisiae-Hefestämme. Verwendete Zelllinien. Bedingungen zur Expression von Proteinen in E. coli. Kulturbedingungen der verwendeten Zelllinien. Zusammensetzung von Sammel- und Trenngel der SDS-PAGE. Parameter zum Blotten von SDS-Gelen. Exzitations- und Emissionswellenlängen zur Aufnahme konfokalmikroskopischer Bilder. Tabelle 4.1: Tabelle 4.2: Tabelle 4.3: Putative Phosphorylierungsstellen von Rop4. Putative posttranslationale Modifikationen von RopGAP2. Sequenzdeterminierte Eigenschaften der RICs. Abbildungen XII Abbildungen Abbildung 1.1: Abbildung 1.2: Abbildung 1.3: Abbildung 1.4: Abbildung 1.5: Abbildung 1.6: Abbildung 1.7: Abbildung 1.8: Abbildung 1.9: Abbildung 1.10: Abbildung 1.11: Abbildung 1.12: Abbildung 1.13: Abbildung 1.14: Die Regulation der G-Proteine der Ras-Superfamilie. Alignment der Aminosäuresequenzen der menschlichen Vertreter der RhoFamilie RhoA, Cdc42 und Rac1 und des pflanzlichen Rop4 aus Arabidopsis thaliana. Phylogenetische Analyse der Rop-Proteine. Alignment der Aminosäure-Sequenzen der elf Rops aus Arabidopsis thaliana. Rop-kontrollierte Signalwege. Die Rolle von Rop in der Regulation pflanzlicher Abwehrmechanismen gegen Pathogene. Signalweiterleitung zur Erhaltung des Meristems durch den CLV-Komplex. Der negative Rückkopplungszyklus zur Regulation der Toleranz von Sauerstoffmangel. Regulation des Aktinzytoskeletts durch Rho-Proteine der Säuger. Schematische Darstellung der Domänenstruktur ausgesuchter Effektoren der Rho-Familie. Der Einfluss von Rop5 auf die Aktinorganisation in Tabak-Pollenschläuchen. Schematische Darstellung der Domänenstruktur ausgesuchter RhoGAPs. Alignment der Aminosäuresequenzen der CRIB-Motiv-enthaltenden RopGAPs aus A. thaliana. Regulation der Rho-Proteine. Abbildung 3.1: Herstellung rekombinanter Bakuloviren und Genexpression mit dem Bac-toBac-System. Abbildung 4.1: Abbildung 4.2: Abbildung 4.3: Abbildung 4.4: Ein Modell der dreidimensionalen Struktur von Rop4 aus A. thaliana. Reinigung von Rop4. Spektrofluorometrische Messung der Nukleotiddissoziation von Rop4. Spektrofluorometrische Messungen zur Analyse der Temperaturabhängigkeit der Nukleotiddissoziation von Rop4. Spektrofluorometrische Messung zur Analyse der Abhängigkeit der Nukleotiddissoziationsgeschwindigkeit von der MgCl2-Konzentration. Spektrofluorometrische Messung zur Bestimmung der Assoziationsratenkonstante von mGDP und mGppNHp an Rop4. Bestimmung der Hydrolyseaktivität von Rop4 mittels HPLC. Der Einfluss von Rop4 auf das Aktinzytoskelett von ZwiebelEpidermiszellen. Effekt von Rop4 auf das Aktinzytoskelett von NIH3T3-Zellen. Effekt von Rop4 auf das Aktinzytoskelett menschlicher HeLa-Zellen. Effekt von RhoA auf das Aktinzytoskelett von NIH3T3-Zellen. Effekt von Rac1 auf das Aktinzytoskelett von NIH3T3-Zellen. Effekt von Cdc42 auf das Aktinzytoskelett von NIH3T3-Zellen. Effekt von RhoA auf das Aktinzytoskelett menschlicher HeLa-Zellen. Abbildung 4.5: Abbildung 4.6: Abbildung 4.7: Abbildung 4.8: Abbildung 4.9: Abbildung 4.10: Abbildung 4.11: Abbildung 4.12: Abbildung 4.13: Abbildung 4.14: Abbildungen XIII Abbildung 4.15: Effekt von Rac1 auf das Aktinzytoskelett menschlicher HeLa-Zellen. Abbildung 4.16: Effekt von Cdc42 auf das Aktinzytoskelett menschlicher HeLa-Zellen. Abbildung 4.17: In vitro-Interaktionstest zum Nachweis der Interaktion von Rop4 mit Pak1 RBD. Abbildung 4.18: Spektrofluorometrische Messung der Dissoziation von mGDP von Rop4 durch Tiam1. Abbildung 4.19: Modell der dreidimensionalen Struktur des GTPase-aktivierenden Proteins RopGAP2 aus A. thaliana. Abbildung 4.20: Schematische Darstellung der Domänenstruktur von RopGAP2 und der hergestellten Fragmente zur Verringerung der Aggregationsneigung. Abbildung 4.21: Reinigung des RopGAP2∆70-Fragmentes. Abbildung 4.22: Lichtmikroskopische Aufnahme RopGAP2-exprimierender Sf21-Zellen. Abbildung 4.23: Reinigung von RopGAP2 aus Sf21-Zellen. Abbildung 4.24: Analyse der Interaktionen von RopGAP2 mit Rho-Proteinen im HefeZweihybridsystem. Abbildung 4.25: Quantifizierung der Hefe-Zweihybridinteraktionen durch Bestimmung der βGalaktosidaseaktivität. Abbildung 4.26: Analyse der Interaktionen von RopGAP2 mit Rho-Proteinen im HefeZweihybridsystem. Abbildung 4.27: Quantifizierung der Hefe-Zweihybridinteraktionen durch Bestimmung der βGalaktosidaseaktivität. Abbildung 4.28: Interaktion zwischen Rop4 und RopGAP2 in vitro. Abbildung 4.29: Aktivierung der Hydrolyse von Rop4*GTP durch RopGAP2. Abbildung 4.30: Vergleich von RIC9-ESTs. Abbildung 4.31: Alignment der analysierten RIC-Sequenzen. Abbildung 4.32: Analyse der Interaktionen von RICs mit menschlichen Rho-Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem. Abbildung 4.33: Quantifizierung der Hefe-Zweihybridinteraktionen durch Bestimmung der βGalaktosidaseaktivität. Abbildung 4.34: Analyse der Interaktionen von RICs und Rops im Hefe-Zweihybridsystem. Abbildung 4.35: Quantifizierung der Hefe-Zweihybridinteraktionen durch Bestimmung der βGalaktosidaseaktivität. Abbildung 4.36: Interaktion von Rop4 mit RIC6 und RIC9 in vitro. Abbildung 4.37: Der Einfluss von RIC9 auf das Aktinzytoskelett von ZwiebelEpidermiszellen. Abbildung 4.38: Der Einfluss von Rop4 auf das Aktinzytoskelett von ZwiebelEpidermiszellen. Abbildung 5.1: Abbildung 5.2: Abbildung 5.3: Abbildung 5.4: Abbildung 5.5: Überlagerung der Kristallstrukturen der Komplexe Cdc42*GppNHpp50RhoGAP und Cdc42*GppNHp-WASP-GBD. Schematische Darstellung der Domänenstruktur von RopGAP2 und der interagierenden Rop-Proteine. Modell der Regulation von RopGAP durch die CRIB-Domäne. Spezifität der Rop-RIC-Interaktion. Modell zur Funktion der Rop-interactive CRIB motif-containing proteins. 1 Einleitung 1 1 Einleitung Da Pflanzen sich in aller Regel nicht fortbewegen können, müssen sie sich mit ihrer Umwelt arrangieren. Sie empfangen Signale aus ihrer Umwelt und beantworten diese. Für die Fähigkeit der Pflanze, auf ihre Umgebung zu reagieren, aber auch für ihre Entwicklung, ist eine Vielzahl von Signalen innerhalb und außerhalb der Zelle notwendig. Die Signalstoffe bewirken ihre Effekte typischerweise durch biochemische Reaktionsketten: Signaltransduktionswege, die das ursprüngliche Signal hochgradig verstärken und weiterleiten. Um angemessen auf Veränderungen in der Umwelt eingehen zu können, besitzt eine Pflanze ein umfangreiches System zur Signalaufnahme und -verarbeitung. Dadurch ist es der Pflanze möglich, viele verschiedene Signale zu beantworten: Licht, chemische Substanzen, mechanische Kräfte und die Schwerkraft. Außer auf Schall kann sie auf alle Signale reagieren, die ein Mensch wahrnehmen kann (Weiler 2003). Grundlegende Vorgänge, wie Wachstum, Differenzierung und Zelltod sind zelluläre Reaktionen auf äußere Signale. Signaltransduktion ist deshalb lebensnotwendig und maßgeblich für die Entwicklung einer Pflanze. Lange Zeit waren die Signaltransduktionswege in planta nur sehr oberflächlich bekannt. Obwohl in den vergangenen Jahren viele Fortschritte in der Erforschung pflanzlicher Signalwege gemacht wurden, sind die meisten zuerst in Einzellern oder Tieren entdeckt und erforscht worden. 1.1 Guaninnukleotid-bindende Proteine in der Signaltransduktion Eine wichtige Rolle in der Signalverarbeitung fällt den Guaninnukleotid-bindenden Proteinen (GNBPs, G-Proteine) zu. Ihre Funktionen betreffen die licht- oder hormoninduzierte Signalweiterleitung, die Kontrolle von Zellwachstum und Differenzierung, die ribosomale Proteinbiosynthese, den vesikulären Transport, die Translokation von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum und in Chloroplasten und den nukleozytoplasmatischen Transport. Insgesamt sind etwa 50 bis 100 verschiedene GNBPs an den Abläufen in einer Zelle beteiligt. Auf Grund von Sequenzhomologien und ihrer unterschiedlichen Funktionen lassen sich die GNBPs in fünf Superfamilien einteilen: die α-Untereinheiten der heterotrimeren G-Proteine, die Ras-Superfamilie, die Translationsfaktoren der Proteinbiosynthese, die großen GTP-bindenden Proteine sowie das Signalerkennungspartikel SRP und sein Rezeptor SR. Zusätzlich gibt es GTP-bindende Proteine, die sich keiner dieser Familien zuordnen lassen (z. B. Septine, Fuzzy Onions (Fzo1), p190-RhoGAP) (Tabelle 1.1). 1 Einleitung 2 In der Literatur wird der Begriff GTPase synonym mit der Bezeichnung GNBPs verwendet, obwohl viele GNBPs auf Grund der sehr langsamen Hydrolyse nicht als Enzyme verstanden werden können. Zum besseren Verständnis wird auch hier teilweise von GTPasen gesprochen. Tabelle 1.1: Die fünf Superfamilien Guaninnukleotid-bindender Proteine. Superfamilien typische Vertreter Funktion heterotrimere G-Proteine Gα Signaltransduktion Ras H-Ras Signaltransduktion Translationsfaktoren IF-2, EF-Tu, EF-G, RF-3 Proteinbiosynthese große GTP-bindende Proteine Dynamin, GBP, Mx Signalerkennungspartikel und sein Rezeptor sonstige SRP, SR 1.2 Septine intrazellulärer Transport transmembranaler Transport Zellteilung Referenzen Pierce et al. 2002 Takai et al. 2001 Andersen et al. 2003, Sonenberg und Dever 2003 Song und Schmid 2003 Keenan et al. 2001 Longtine und Bi 2003 Die G-Proteine der Ras-Superfamilie 1.2.1 Regulationsmechanismen In der intrazellulären Signaltransduktion nehmen GNBPs der Ras-Superfamilie als molekulare Schalter zentrale Positionen ein (Takai et al. 2001). Sie können zwei Konformationen einnehmen: Eine GDP-gebundene, inaktive und eine GTP-gebundene, aktive Konformation (siehe Abbildung 1.1). Abbildung 1.1: Die Regulation der G-Proteine der Ras-Superfamilie. Die Aktivität des Proteins wird durch seine Nukleotidbeladung bestimmt. Die Aktivierung erfolgt durch Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs), die den Austausch von GDP gegen GTP beschleunigen. GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) beschleunigen die Hydrolyse von GTP zu GDP und Phosphat und führen zur Inaktivierung der GTPase. Die intrinsischen Raten für die Aktivierung und die Deaktivierung sind sehr langsam. Deshalb werden diese Prozesse durch regulatorische Proteine beschleunigt. GuaninnukleotidAustauschfaktoren (guanine nucleotide exchange factors, GEFs) beschleunigen die Dissoziation von gebundenem Nukleotid. Auf Grund des Überschusses von GTP über GDP in der Zelle erfolgt der Austausch von GDP durch GTP und damit die Aktivierung des Proteins. 1 Einleitung 3 In diesem Zustand kann das G-Protein Effektorproteine binden und auf diese Weise Signale weiterleiten. GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) beschleunigen die intrinsische Hydrolyse der GTPase und führen so zu einer Deaktivierung des Proteins. 1.2.2 Strukturelle Gemeinsamkeiten kleiner regulatorischer G-Proteine Die G-Proteine der Ras-Superfamilie haben ein Molekulargewicht von 20 bis 40 kD und werden deshalb auch als kleine G-Proteine bezeichnet. Kristallographische Analysen kleiner GNBPs haben gezeigt, dass alle Mitglieder eine 20 kD große, Guaninnukleotid-bindende Domäne besitzen, die charakteristisch für die ganze Superfamilie ist und G-Domäne genannt wird (Vetter und Wittinghofer 2001, Paduch et al. 2001). Die G-Domäne besteht aus fünf α-Helices (A1 bis A5) und sechs β-Faltblättern (B1 bis B6). Die am stärksten konservierten Regionen befinden sich in den Schleifen (G1 bis G5). Der Vergleich zwischen GTP-gebundener und GDP-gebundener Konformation hat gezeigt, dass zwei Regionen stark flexibel und für die Konformationsänderungen nach der Hydrolyse bzw. der Aktivierung durch erneute GTP-Bindung verantwortlich sind. Dabei handelt es sich um die so genannten Schalterregionen switch I und switch II, die das γ-Phosphat des Nukleotids umgeben (Vetter und Wittinghofer 2001). Die P-Schleife, auch Walker A-Motiv oder G1Region genannt, ist für die Bindung der α- und β-Phosphate verantwortlich (Saraste et al. 1990). Neben der P-Schleife lassen sich noch weitere, stark konservierte Sequenzmotive identifizieren (Tabelle 1.2). Tabelle 1.2: Konservierte Sequenzmotive Ras-homologer GNBPs und ihre Funktionen. Verändert nach Paduch et al. 2001. Protein G1 G2 G3 G4 G5 (P-Schleife) (switch I) (switch II) GAGGVGKS YDPTIED ILDTAGQE VGNKCD YIETSAK H-Ras GDGACGKT YVPTVFE LWDTAGQE VGNKKD YMECSAK RhoA GDGAVGKT YVPTVFD LFDTAGQE VGTQID YVECSAL Cdc42 GDGAVGKS YIPTVFD LWDTAGQE VGTKLD YLECSAL Rac1 GAGESGKS RVKTTGI LFDVGGQR FLNKKD THFTCAT Giα GHVDHGKT RGITINT HVDGPGHA FLNKCD IVRGSAL EF-Tu GLGAAGKS TIPTIGF VWDVGGQD FANKQD IQATCAT Arf-1A GXXXXGK S/T XTX DXXG N/T K/Q X D T/G/C C/S A Konsensus Wechselα- und β-Phosphat γ-Phosphat des γ-Phosphat des Guaninbase Guaninbase wirkung mit des Nukleotids und Nukleotids und Nukleotids und Mg2+ Mg2+ Mg2+ 1 Einleitung 4 1.2.3 Posttranslationale Modifikationen Mit wenigen Ausnahmen werden alle Mitglieder der Ras-Superfamilie durch kovalente Bindung hydrophober Palmitinsäure-, Farnesyl- oder Geranylgeranylreste an einem Cysteinrest des jeweiligen G-Proteins posttranslational modifiziert. Diese Lipid- modifikationen sind für die biologische Funktion der Proteine essentiell, da sie die Membranlokalisation vermitteln (Brown und Goldstein 1993, Hancock et al. 1991b, Magee et al. 1992). Das Signal für die posttranslationale Isoprenylierung ist ein C-terminal lokalisiertes, so genanntes CaaX-Motiv (C = Cystein, a = aliphatische Aminosäure, X = beliebige Aminosäure). Die letzte Aminosäure entscheidet über die Art der Isoprenylierung (Takai et al. 2001). Liegt ein Methionin oder Serin vor, so wird das Protein durch die Farnesyltransferase modifiziert; ein Leucin bewirkt die Modifizierung durch die Geranylgeranyltransferase. Im Fall der Ras- und Rho- (ras homologous) Proteine werden nach der Modifizierung des Cysteinrestes die drei C-terminalen Aminosäuren (aaX) proteolytisch abgespalten, und die Carboxylgruppe des isoprenylierten Cysteins wird methyliert (Hancock et al. 1991a). 1.2.4 Gliederung der Ras-Superfamilie In Säugern sind 97 unterschiedliche kleine G-Proteine bekannt; in Hefe sind es 30, in Arabidopsis thaliana sind es 93 (Takai et al. 2001, Bischoff et al. 1999, Vernoud et al. 2003). Anhand von Sequenzhomologien werden sie in fünf Familien Ras, Rho, Rab, Arf und Ran unterteilt (siehe Tabelle 1.3) (Takai et al. 2001). Die Proteine einer Familie haben eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 50 % und in der Regel eine ähnliche Funktion. Unterschiedliche Familien zeigen eine ca. 30 %-ige Übereinstimmung in ihrer Aminosäuresequenz. Die Ras-Familie ist an der Kontrolle der Zellproliferation und Differenzierung sowie der Apoptose beteiligt (Vojtek und Der 1998, Bos 1997). Rho-Proteine kontrollieren die Reorganisation des Zytoskeletts und das Zellwachstum, und sie sind an der Kontrolle der Genexpression beteiligt (Hall 1999, Hall und Nobes 2000). Rab- (ras-like proteins from rat brain) und Arf- (ADP ribosylation factor) Proteine regulieren den vesikulären Transport (Spang 2004, Nie et al. 2003); Ran- (ras related nuclear transport) Proteine sind am Kerntransport beteiligt (Fahrenkrog und Aebi 2003, Dasso 2002). In Pflanzenzellen regulieren Vertreter der Rab-, Arf- und Ran- Familie die gleichen Prozesse wie in anderen eukaryontischen Zellen (Memon 2004, Rose et al. 2004). Ras-homologe Proteine existieren hingegen nicht in Pflanzen. 1 Einleitung 5 Tabelle 1.3: Mitglieder der Ras-Superfamilie und ihre Funktionen. Familien typische Vertreter Funktion Referenzen Ras H-Ras, Rap1A, Rit, Zellproliferation, Wittinghofer 1998a, Vojtek und Der 1998 Rin, Rad, Rheb Differenzierung, Apoptose Rho RhoA, Rac1, Zytoskelett, Zellwachstum, Hall 1999, Zheng und Yang 2000b Cdc42, Rop1 Genexpression, Apoptose Rab Rab1A vesikulärer Transport Spang 2004, Rutherford und Moore 2002 Sar1/Arf Arf1, Sar1a, Arl1 vesikulärer Transport Memon 2004, Nie et al. 2003 Ran Ran Kerntransport Rose et al. 2004, Fahrenkrog und Aebi 2003 1.3 Rho-Proteine der Rop-Unterfamilie Rho-Proteine werden in vier Unterfamilien unterteilt: Rho, Cdc42 (cell division cycle 42), Rac (ras related C3 botulinum toxin substrate) und Rop (rho of plants) (Abbildung 1.2) (Zheng und Yang 2000b, Yang 2002). Cdc42, Rac1 und RhoA gehören zu den am besten untersuchten Proteinen der Rho-Familie (Hall 1998). Cdc42 Rac1 Rop4 RhoA MQT---IKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNKFPSEYVPTVFDNYAVTVMIGGEPYTLGLFD MQA---IKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNAFPGEYIPTVFDNYSANVMVDGKPVNLGLWD MSASRFIKCVTVGDGAVGKTCMLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFSANVVVDGNTVNLGLWD MAAIR-KKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWD * : * * ***** ****:** ::.: ** *:****:*: . : :.*: *.*:* 57 57 60 59 Cdc42 Rac1 Rop4 RhoA TAGQEDYDRLRPLSYPQTDVFLVCFSVVSPSSFENVKEKWVPEITHHCPKTPFLLVGTQI TAGQEDYDRLRPLSYPQTDVFLICFSLVSPASFENVRAKWYPEVRHHCPNTPIILVGTKL TAGQEDYNRLRPLSYRGADVFILAFSLISKASYENVAKKWIPELRHYAPGVPIILVGTKL TAGQEDYDRLRPLSYPDTDVILMCFSIDSPDSLENIPEKWTPEVKHFCPNVPIILVGNKK *******:******* :**:::.**: * * **: ** **: *..* .*::***.: 117 117 120 119 Cdc42 Rac1 Rop4 RhoA DLRDDPSTIEKLAKNKQKPITPETAEKLARDLKAVKYVECSALTQRGLKNVFDEAILAAL DLRDDKDTIEKLKEKKLTPITYPQGLAMAKEIGAVKYLECSALTQRGLKTVFDEAIRAVL DLRDDKQFFIDHPG--AVPITTNQGEELKKLIGSPIYIECSSKTQQNVKAVFDAAIKVVL DLRNDEHTRRELAKMKQEPVKPEEGRDMANRIGAFGYMECSAKTKDGVREVFEMATRAAL ***:* . *:. . : . : : *:***: *: .:: **: * ..* 177 177 178 179 Cdc42 Rac1 Rop4 RhoA EPPETQPKRK---CCIFCPPPVKKRKR---KCLLQPPKQKKKKKNKNRCVFL QARRGKKKSG----CLVL . : : *:. 191 191 196 193 Abbildung 1.2: Alignment der Aminosäuresequenzen der menschlichen Vertreter der Rho-Familie RhoA, Cdc42 und Rac1 und des pflanzlichen Rop4 aus Arabidopsis thaliana. Die am meisten konservierten Aminosäuren in den fünf Schleifen und die rhospezifische insert-Helix sind durch Farben hervorgehoben. Rot: G1 (P-loop); dunkelgrün: G2 (switch I); dunkelblau: G3 (switch II); orange: G4 (N/T K/Q X D-Motiv); hellblau: G5 (T/G/C C/S A-Motiv); hellgrün: Rho-insert-Helix; grau: C-terminale Signalsequenz für posttranslationale Modifizierung. *: alle Aminosäuren identisch; :: konservierte Substitutionen; .: semi-konservierte Substitutionen. Rop-Proteine (Rho of plants) bilden eine pflanzenspezifische Unterfamilie der Rho-Proteine (Zheng und Yang 2000b, Yang 2002). Vertreter von Rho, Rac und Cdc42 kommen in Pflanzen –bis auf eine Ausnahme, ein G-Protein aus Medicago sativa– nicht vor (The Arabidopsis Genome Initiative 2000, Dorjgotov et al. 2003). Ebenso fehlen Ras-Proteine in 1 Einleitung 6 Pflanzen (Fu und Yang 2001). Seit der Klonierung der ersten pflanzlichen cDNA eines RhoProteins (Rho1Ps, Pisum sativum) aus der Erbse 1993 (Yang und Watson 1993) wurden weitere 36 Rop-Gene aus der Erbse, der Baumwolle, Reis, Arabidopsis thaliana, dem Moos Physcomitrella patens und anderen Pflanzen identifiziert (Li et al. 1998, Bischoff et al. 1999, Winge et al. 2000, Winge et al. 1997, Delmer et al. 1995). Sie bilden einen separaten Zweig im Rho-Stammbaum, der der Rac-Unterfamilie am nächsten steht (Abbildung 1.3) (Valster et al. 2000). A B Abbildung 1.3: Phylogenetische Analyse der Rop-Proteine. A: Phylogenetischer Stammbaum der RhoFamilienmitglieder aus Hefe (Sc), Mensch (Hs) und A. thaliana (At). Der Stammbaum zeigt, dass die pflanzlichen Rops eine eigene Unterfamilie bilden, die von den anderen drei Unterfamilien Rho, Cdc42 und Rac zu unterscheiden ist. B: Phylogenetischer Stammbaum der Rop-Proteine. Der Stammbaum zeigt, dass Rops in vier Gruppen unterteilt werden können: I, II, III und IV. At: Arabidopsis thaliana; Bv: Beta vulgaris; Ca: Cicer arietinum; Gh: Gossypium hirsutum; Hs: Homo sapiens; Lj: Lotus japanicus; Nt: Nicotiana tabacum. Verändert nach Zheng und Yang 2000b. In A. thaliana wurden elf Rop-Gene identifiziert, von denen einige nahezu identisch sind. Zum Beispiel sind Rop2 und Rop4 zu 98 % identisch, Rop1 und Rop3 zu 96 % (Li et al. 1998). Phylogenetische Analysen klassifizieren Rops in vier Gruppen (Abbildung 1.3) (Zheng und Yang 2000b). Die Aminosäuresequenzen der Rops aus A. thaliana zeigen eine Übereinstimmung von mehr als 69 % und sind zu mindestens 43 % identisch mit den Mitgliedern der anderen drei Unterfamilien der Rho-Proteine (Agrawal et al. 2003a). Die Namensgebung der Rop-Proteine in der Literatur ist uneinheitlich. So existieren allein in A. thaliana außer „Rop“ auch die Bezeichnungen Arac (für Arabidopsis Rac), AtRAC, AtRac und At-Rac (Tabelle 1.4). Die Rop-Proteine aus anderen Pflanzen werden ebenfalls oft als 1 Einleitung 7 Rac-Proteine bezeichnet. In dieser Arbeit wird für die aus A. thaliana stammenden RhoProteine die „Rop“-Nomenklatur nach Yang (2002) und Li et al. (1998) verwendet. Tabelle 1.4: Nomenklatur pflanzlicher Rho-Proteine. Aus Yang 2002. Rop-Nomenklatur Arac/ AtRAC-Nomenklatur (Li et al. 1998, (Winge et al. 1997, Yang 2002) Winge et al. 2000) Rop1 Arac 11 / AtRAC 11 Rop2 Arac 4 / AtRAC 4 Rop3 Arac 1 / AtRAC 1 Rop4 Arac 5 / AtRAC 5 Rop5 Arac 6 / AtRAC 6 Rop6 Arac 3 / AtRAC 3 Rop7 Arac 2 / AtRAC 2 Rop8 Arac 9 / AtRAC 9 Rop9 Arac 7 / AtRAC 7 Rop10 Arac 8 / AtRAC 8 Rop11 Arac 10 / AtRAC 10 AtRac/ At-Rac-Nomenklatur (Lemichez et al. 2001, Kost et al. 1999a) AtRac 2 / At-Rac 2 AtRac 1 / At-Rac 1 Mutationen in der Nukleotidbindungstasche blockieren den GDP-GTP-Zyklus des G-Proteins und erzeugen dadurch Mutanten, die nur noch in ihrer aktiven oder in ihrer inaktiven Konformation vorliegen (Tabelle 1.5). Analog zu den entsprechenden Mutationen in Ras werden sie dominant negativ und konstitutiv aktiv genannt (Li et al. 1999, Valster et al. 2000, Zheng und Yang 2000a, Zheng und Yang 2000b). Solche Mutanten ermöglichen die Identifizierung von Effektoren und Regulatoren und geben Aufschluss über die physiologische Rolle der Rop-Proteine (Kost et al. 1999a, Valster et al. 2000). Tabelle 1.5: Mutationen von G-Proteinen und ihre Charakteristika. Die Positionen der Mutationen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz von H-Ras. Verändert nach Oxford und Theodorescu 2003. Mutation Charakterisierung Referenz G12V konstitutiv aktiv; GTP-Hydrolyse sterisch inhibiert Lowy und Willumsen 1993 S17N dominant negativ; Nukleotidaffinität verringert, Feig und Cooper 1988 keine Interaktion mit Effektoren F28L aktiv; Nukleotidaffinität verringert Reinstein et al. 1991 Q61L konstitutiv aktiv; GTP-Hydrolyse inhibiert Lowy und Willumsen 1993 D119N konstitutiv aktiv; Nukleotidaffinität verringert, Cool et al. 1999 Interaktion mit Effektoren, erhöhte GEF-Affinität 1.3.1 Charakteristika der Rop-Aminosäuresequenzen Bei der Betrachtung der Aminosäuresequenzen der Rop-Proteine fallen außer den konservierten Bereichen, die für die Nukleotidbindung verantwortlich sind, auch Sequenzmotive auf, die allein in der Rop-Unterfamilie vorkommen. Das GTP-Bindemotiv TKLD in der G4-Region kommt bei allen Rop-Proteinen und der Rac-Unterfamilie vor und verdeutlicht die relativ nahe Stellung der Rops zu Rac (Valster et al. 2000). Die Effektorbindenden Bereiche (die Schalterregionen I und II, Helices A1 und A5, Faltblattstruktur B2, 1 Einleitung 8 Rho-insert-Region) der Rops sind zum Teil hoch konserviert und enthalten viele Aminosäurereste, die spezifisch für Rops sind (Abbildung 1.4) (Mott et al. 1999, Hall 1998). Rop3 Rop5 Rop1 Rop6 Rop2 Rop4 Rop10 Rop11 Rop9 Rop7 Rop8 ------------MSASRFIKCVTVGDGAVGKTCLLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFSANVV ------------MSASRFIKCVTVGDGAVGKTCLLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFSANVV ------------MSASRFVKCVTVGDGAVGKTCLLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFSANVV ------------MSASRFIKCVTVGDGAVGKTCLLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFSANVI -------------MASRFIKCVTVGDGAVGKTCMLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFSANVV ------------MSASRFIKCVTVGDGAVGKTCMLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFSANVV ----------MASSASKFIKCVTVGDGAVGKTCMLICYTSNKFPTDYIPTVFDNFSVNVV ----------MASSASKFIKCVTVGDGAVGKTCMLICYTSNKFPTDYIPTVFDNFSANVV ------------MSASKFIKCVTVGDGAVGKTCMLICYTSNKFPTDYIPTVFDNFSANVA ------------MSTARFIKCVTVGDGAVGKTCMLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFSANVV MSASMAATSTSSATATTFIKCVTVGDGAVGKTCLLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFNANVL :: *:**************:**.****.*****:*******..** 48 48 48 48 47 48 50 50 48 48 60 Rop3 Rop5 Rop1 Rop6 Rop2 Rop4 Rop10 Rop11 Rop9 Rop7 Rop8 VNGATVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFILAFSLISKASYENVSKKWIPELKHYA VNGATVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFILAFSLISKASYENVSKKWIPELKHYA VNGSTVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFILAFSLISKASYENVSKKWIPELKHYA VDGNTINLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFLLAFSLVSKASYENVSKKWVPELRHYA VDGNTVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFILAFSLISKASYENIAKKWIPELRHYA VDGNTVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFILAFSLISKASYENVAKKWIPELRHYA VEGITVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFVLAFSLISRASYENVFKKWIPELQHFA VEGTTVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFVLSFSLVSRASYENVFKKWIPELQHFA VDGQIVNLGLWDTAGQEDYSRLRPLSYRGADIFVLAFSLISKASYENVLKKWMPELRRFA VDGSTVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFLLAFSLISKASYENIHKKWLPELKHYA VDGKTVNLGLWDTAGQEDYNRVRPLSYRGADVFILAFSLISRPSFENIAKKWVPELRHYA *:* :*************.*:*********:*:*:***:*:.*:**: ***:***:::* 108 108 108 108 107 108 110 110 108 108 120 Rop3 Rop5 Rop1 Rop6 Rop2 Rop4 Rop10 Rop11 Rop9 Rop7 Rop8 PGVPIVLVGTKLDLRDDKQFFIDHPGAVPITTAQGEELKKLIGAPAYIECSSKTQENVKG PGVPIVLVGTKLDLRDDKQFFIDHPGAVPITTVQGEELKKLIGAPAYIECSSKSQENVKG PGVPIVLVGTKLDLRDDKQFFIDHPGAVPITTAQGEELRKQIGAPTYIECSSKTQENVKA PGVPIILVGTKLDLRDDKQFFAEHPGAVPISTAQGEELKKLIGAPAYIECSAKTQQNVKA PGVPIILVGTKLDLRDDKQFFIDHPGAVPITTNQGEELKKLIGSAVYIECSSKTQQNVKA PGVPIILVGTKLDLRDDKQFFIDHPGAVPITTNQGEELKKLIGSPIYIECSSKTQQNVKA PGVPIVLVGTKMDLREDRHYLSDHPGLSPVTTSQGEELRKHIGATYYIECSSKTQQNVKA PGVPLVLVGTKLDLREDKHYLADHPGLSPVTTAQGEELRKLIGATYYIECSSKTQQNVKA PNVPIVLVGTKLDLRDDKGYLADHT--NVITSTQGEELRKQIGAAAYIECSSKTQQNVKA PGIPIVLVGTKLDLRDDKQFLKDHPGAASITTAQGEELRKMIGAVRYLECSSKTQQNVKA PTVPIVLVGTKSDLRDNMQFPKNYPGACTIFPEQGQELRKEIGALAYIECSSKAQMNVKA * :*::***** ***:: : ::. : . **:**:* **: *:***:*:* ***. 168 168 168 168 167 168 170 170 166 168 180 Rop3 Rop5 Rop1 Rop6 Rop2 Rop4 Rop10 Rop11 Rop9 Rop7 Rop8 VFDAAIRVVLQPPK-QKKK-----KSKAQKACSIL----------VFDAAIRVVLQPPK-QKKK-----KNKAQKACSIL----------VFDAAIRVVLQPPK-QKKK-----KSKAQKACSIL----------VFDAAIKVVLQPPKNKKKK-----KRKSQKGCSIL----------VFDAAIKVVLQPPKQKKKK-----KNKNR--CAFL----------VFDAAIKVVLQPPKQKKKK-----KNKNR--CVFL----------VFDAAIKVVIKPAVKQKE---KKKKQKPRSGC-LSNILCGKN---VFDSAIKEVIKPLVKQKEKTKKKKKQKSNHGC-LSNVLCGRIVTRH VFDTAIKVVLQPPRRKEVP--RRRKNHRRSGCSIASIVCGGCTAAVFDTAIRVALRPPKAKKKI--KPLKTKRSRICFFL----------VFDEAIKVVLHPPSKTKKR------KRKIGLCHVL----------*** **: .::* : : * . 197 197 197 198 195 196 208 215 209 201 209 Abbildung 1.4: Alignment der Aminosäure-Sequenzen der elf Rops aus Arabidopsis thaliana. Die am meisten konservierten Aminosäuren in den fünf Schleifen und die rhospezifische insert-Helix sind durch Farben hervorgehoben. Rot: G1 (P-loop); dunkelgrün: G2 (switch I); dunkelblau: G3 (switch II); orange: G4 (N/T K/Q X D-Motiv); hellblau: G5 (T/G/C C/S A-Motiv); hellgrün: Rho-insert-Helix; grau: C-terminale Signalsequenzen für posttranslationale Modifikationen. *: alle Aminosäuren identisch; :: konservierte Substitutionen; .: semikonservierte Substitutionen. Alle Rho-Proteine (außer RhoL aus Drosophila melanogaster) besitzen eine α-helikale, so genannte insert-Region, die ebenfalls für die Bindung einiger Rac-Effektoren essentiell ist 1 Einleitung 9 (Nisimoto et al. 1997). Die insert-Region der pflanzlichen Rho-Proteine ist zwei Aminosäuren kürzer als die der tierischen Rho-Proteine. Sie zeigt nur wenig Homologie mit den entsprechenden Regionen der tierischen Rho-Proteine. Grosse Unterschiede in der insertRegion innerhalb der Rop-Unterfamilie treten insbesondere bei Rop9, Rop10 und Rop11 aus A. thaliana im Vergleich zu den anderen Rops auf. Am C-terminalen Ende befindet sich bei den meisten Rops eine polybasische Region von acht bis siebzehn Aminosäuren, die der intrazellulären Lokalisation dient. 1.3.2 Posttranslationale Modifikationen und Lokalisation der Rop-Proteine Wie bei den meisten kleinen G-Proteinen wird die subzelluläre Lokalisierung der Rops durch posttranslationale Modifikationen vermittelt, wie der Prenylierung eines Cysteinrestes am CTerminus (Bischoff et al. 2000, Adamson et al. 1992, Kost et al. 1999a, Li et al. 1999, Nambara und McCourt 1999) (1.2.3). Das CaaX-Motiv tritt in den meisten Rop-Sequenzen auf. Sowohl CaaX-Proteasen als auch Prenylcystein-Carboxymethyl-Transferasen sind in Pflanzen vorhanden, was nahe legt, dass der Modifizierungsmechanismus in Pflanzen ähnlich sein könnte wie in Tieren (Bracha et al. 2002, Crowell et al. 1998, Crowell und Kennedy 2001). Auch andere Modifizierungsmechanismen wie Palmitoylierung von Cysteinresten und Phosphorylierung werden diskutiert (Yang 2002). So sind zwei mögliche Phosphorylierungsstellen (SYR in der Schalterregion II und SSK im G5-Motiv) vermutlich Substrate von Rezeptor-Tyrosinkinasen (Trotochaud et al. 1999). Sie treten bei allen Rops außer Rop6 auf; Rop6 enthält an entsprechender Stelle die Aminosäureabfolge SAK, die auch in Rho vorkommt (Zheng und Yang 2000b). Die richtige Lokalisation ist eine Vorbedingung für die Aktivierung der G-Proteine und für die Interaktion mit Effektoren. In einigen Fällen ist die Rekrutierung des G-Proteins an eine bestimmte Region der Membran ausschlaggebend für ihre Funktion (Fu et al. 2001, Lemichez et al. 2001, Molendijk et al. 2001, Jones et al. 2002). Bei Rop-Proteinen sind sehr unterschiedliche subzelluläre Verteilungsmuster gefunden worden, die vermutlich die verschiedenen Funktionen dieser Gruppe widerspiegeln. Die meisten Rops sind an der gesamten Plasmamembran lokalisiert, einige von ihnen ausschließlich (A.t. Rop9, Rop10, Rop6, Mais Rop6 und Rop7). Andere Rops sind –außer an der Plasmamembran– auch an der Membran einer perinukleären Organelle lokalisiert (A.t. Rop4), an spezifischen Stellen der Plasmamembran angereichert (A.t. Rop1, Rop2, Rop5) oder befinden sich am Tonoplast von 1 Einleitung 10 in der Entwicklung befindlichen Vakuolen (ein oder mehrere Rops aus der Erbse) (Kost et al. 1999a, Li et al. 1999, Bischoff et al. 2000, Lin et al. 2001, Fu et al. 2002). 1.3.3 Klassifizierung der Rop-Proteine Grosse Unterschiede innerhalb der Rop-Unterfamilie treten in ihren C-terminalen Bereichen auf (Valster et al. 2000). Dort unterstützt eine polybasische Region die Lokalisation der Rops an spezifischen Membransystemen, die durch die kovalente Modifizierung am C-terminalen Ende vermittelt wird (Kost et al. 1999a, Li et al. 1999). Anhand der allgemeinen Sequenzübereinstimmung und dem Aufbau der C-terminalen, variablen Region werden Rops in vier Gruppen eingeteilt (Abbildung 1.3) (Li et al. 1998, Zheng und Yang 2000b). Alle Mitglieder der Gruppen I, III und IV besitzen das Signalmotiv CaaL (C: Cystein, a: aliphatische Aminosäure, L: Leucin) für Geranylgeranylierung, das von der Geranylgeranyltransferase I (GGTase I) erkannt wird (Zheng und Yang 2000b, Li et al. 2001, Yang 2002). Auch die Rho-Proteine der Säuger werden auf diese Weise modifiziert. Die meisten RopVertreter aus A. thaliana fallen in die Gruppe IV (Tabelle 1.6). Zur Gruppe III gehört u.a. das A.t. Rop7, das ein eher ungewöhnliches Geranylgeranylierungsmotiv mit zwei aromatischen Aminosäureresten (CFFL) besitzt. Die Gruppe I besteht nur aus dem einen Mitglied A.t. Rop8. Diese Sonderstellung hat es auf Grund seiner allgemein großen Sequenzabweichung gegenüber den Rops der Gruppe IV und durch seine N-terminale, zwölf Aminosäuren umfassende Sequenz unbekannter Funktion. Tabelle 1.6: Phylogenetische Gruppen der Rop-Unterfamilie und ihre Funktionen. At: Arabidopsis thaliana; Os: Oryza sativa; Zm: Zea mays; Gh: Gossypium hirsutum; ABA: Abszisinsäure. Verändert nach Yang 2002. Gruppe Vertreter Funktion Referenz I AtRop8 unbekannt Zheng et al. 2002 II AtRop9, 10 ABA-Signalweg AtRop11 unbekannt Kawasaki et al. 1999 OsRac1 H2O2-Erzeugung unbekannt OsRac2-4, unbekannt ZmRop6-8 III AtRop7 Wurzelhaarwachstum GhRac9, 13 H2O2-Erzeugung Delmer et al. 1995, Potikha et al. 1999 OsRop5 unbekannt IV AtRop1-6 Aktindynamiken, polares Wachstum, Li et al. 2001, Lemichez et al. 2001, Wurzelhaarentwicklung, ABA-Signalweg Bischoff et al. 2000, Molendijk et al. 2001, GhRac1 unbekannt Jones et al. 2002, Fu et al. 2002, ZmROPB, D unbekannt Li et al. 1999 Die Prenylierungsmotive der Gruppe II-Rops sind eher heterogen: Sie weisen zwar Farnesylierungs- oder Geranylgeranylierungsmotive auf, es wird aber angenommen, dass sie 1 Einleitung 11 palmitoyliert werden. Rop6 und Rop7 aus Mais enthalten ein putatives Motiv für die GGTase II (CAA) und zwei interne Cysteinreste, die palmitoyliert werden könnten. Rop7 ist konstitutiv an der Plasmamembran lokalisiert, wofür jedoch nicht das CAA-Motiv benötigt wird, sondern ein interner Cysteinrest (Ivanchenko et al. 2000). Rop9 und Rop10 aus Arabidopsis besitzen Signalsequenzen zur Farnesylierung (CTAA und CGKN). In A.t. Rop11 fehlt das Prenylierungsmotiv gänzlich (Li et al. 2001, Zheng et al. 2002). Die Farnesylierung von Rop10 konnte nicht gezeigt werden und auch die Assoziation von Rop9 mit der Plasmamembran ist unabhängig von einer Farnesylierung. Rop10 wurde hingegen in vitro palmitoyliert und eine Inhibierung der Palmitoylierung bewirkt die Ablösung von Rop9, Rop10 und Rop11 von der Plasmamembran (Lavy et al. 2002). 1.3.4 Differenzielle Expression der Rop-Gene in pflanzlichen Geweben Differentielle Genexpression verschiedener Rop-Gene wurde in Baumwolle und Arabidopsis thaliana untersucht und durch RT-PCR gezeigt (Li et al. 1998, Bischoff et al. 1999). Rop2 und Rop4 aus A. thaliana werden ubiquitär exprimiert. A.t. Rop1 hingegen wird ausschließlich in reifen Pollen oder Pollenschläuchen exprimiert; Rop7 nur in Achsen, Wurzeln und im Hypokotyl. Rop3 wird in allen vegetativen Geweben und zusätzlich in Schoten und geöffneten Blüten exprimiert, Rop5 in allen Organen außer der Wurzel, Rop6 in allen Geweben außer in geschlossenen Blüten und Schoten (Li et al. 1998). Generell werden Rops in sehr vielen Geweben exprimiert, aber sie akkumulieren preferentiell in Meristemen und besonders schnell wachsenden Zellen (Li et al. 2001). 1.4 Rop-kontrollierte Signalwege Eine Vielzahl von Effektoren von Rops sind beschrieben, die in unterschiedlichen Signalwegen wirken (Abbildung 1.5) (Übersichten in Valster et al. 2000, Zheng und Yang 2000b, Fu und Yang 2001, Mathur und Hulskamp 2002b). Unter der Kontrolle von Rops regulieren sie multiple physiologische Prozesse: die Entwicklung der Zellpolarität, das Zellwachstum, die Organisation des Aktinzytoskeletts, die Zellwandsynthese, Hormonreaktionen, die Produktion von H2O2 sowie die Zelldifferenzierung (Li et al. 1998, Winge et al. 2000, Molendijk et al. 2001, Jones et al. 2002). 1 Einleitung 12 Abbildung 1.5: Rop-kontrollierte Signalwege. Die Aktivität von Rop wird durch RopGAPs, RopGDIs und evtl. RopGEFs reguliert. Rop kontrolliert durch die Interaktion mit verschiedenen Effektorproteinen Signalwege, die die Entwicklung, Aktindynamiken, die Zellmorphogenese, die Sekundärwandbildung, die Pathogenabwehr u.a. steuern. Verändert nach Valster et al. 2000. 1.4.1 Die Rolle von Rop in der Pathogenabwehr Pflanzen besitzen Mechanismen zum Schutz vor Pathogenen wie beispielsweise dem Mehltau Blumeria graminis f.sp. hordei, der ein Schädling der Gerste ist. Die Mechanismen der pflanzlichen Pathogenabwehr wurden intensiv in Reis, Tabak, Mais und Gerste untersucht (Agrawal et al. 2003a, Kawasaki et al. 1999, Ono et al. 2001, Suharsono et al. 2002). Rops steuern die Abwehrreaktionen der Pflanze u.a. durch die Regulation der H2O2-Produktion und durch ihren Einfluss auf die Aktinpolymerisierung. 1.4.1.1 Die Kontrolle der H2O2-Produktion durch Rop Durch H2O2 entstehen in der Zelle reaktive Sauerstoffverbindungen (reactive oxygen species, ROS), die den Tod infizierter Zellen durch Apoptose herbeiführen (Levine et al. 1994, Mehdy 1 Einleitung 13 et al. 1996). Die Produktion von ROS setzt beim Befall von Pflanzen mit Pathogenen abrupt ein und tötet die Erreger in der infizierten Zelle ab. H2O2 ist nicht nur im Kontext mit Apoptose ein wichtiger Botenstoff sondern auch in der Regulation der Genexpression, der Baumwollfaserbildung, der Phytoallexin-Produktion und in ABA- und Auxin-induzierten Signalwegen (Lamb und Dixon 1997, Potikha et al. 1999, Joo et al. 2001, Pei et al. 1998). Dabei tritt H2O2 in geringen Konzentrationen als Botenstoff auf. H2O2 wird von der NADPH-Oxidase hergestellt. Der tierische NADPH-Oxidase-Komplex besteht aus den Komponenten gp91phox (der katalytischen Untereinheit der NADPH-Oxidase), p22phox, p67phox, p47phox und p40phox (Agrawal et al. 2003a). Der NADPH-Oxidase-Komplex wird durch Rac aktiviert, das an die Untereinheit p67phox bindet (Bokoch 1995, Xing et al. 1997). Ein ähnlicher NADPH-Oxidase-Komplex wurde in Pflanzen identifiziert (Dwyer et al. 1996, Keller et al. 1998, Torres et al. 1998, Groom et al. 1996). Er enthält ein zu gp91phox homologes Protein, aber keine Homologen zu den Untereinheiten p47phox und p67phox (Sagi und Fluhr 2001). Die Rolle von Rop bei der Reaktion auf Pathogenbefall ist u.a. in Kichererbsenblättern gezeigt worden. Die Blätter wurden mit Elizitoren behandelt und es wurde gezeigt, dass dadurch die Expression des Rops ELR26 erhöht wird (Ichinose et al. 1999). In anderen Studien konnte gezeigt werden, dass die Expression von MsRac1 (Ms: Medicago sativa) antisense-RNA in Tabak die Abwehrreaktionen der Pflanze nach Behandlung mit Elizitoren schwächt (Schiene et al. 2000). In Gerste hingegen wurde mit RNAi-Experimenten gezeigt, dass das Rop HvRacB (Hv: Hordeum vulgare) die Abwehrreaktion gegen Getreidemehltau negativ beeinflusst (Schultheiss et al. 2002). Die Verbindung von Rop und dem NADPH-Oxidase-Komplex wurde in verschiedenen Pflanzen beschrieben: Komponenten des pflanzlichen NADPH-Oxidase-Komplexes und ein Rop-Protein translozieren nach Elizitoren-Behandlung von Tomatenzellen gemeinsam zur Membran (Xing et al. 1997). In Tabak wurde Rop immunologisch als Komponente des NADPH-Oxidase-Komplexes identifiziert (Kieffer et al. 1997). Es gibt zahlreiche Belege für einen verwandten Regulationsmechanismus der NADPH-Oxidase durch pflanzliche RopProteine wie durch Rac in tierischen Zellen: Die Expression von konstitutiv aktivem (CA) OsRac1 (Os: Oryza sativa) in Reis führt zu einer verstärkten ROS-Produktion, zu apoptoseartigen Reaktionen der Zellen und reduziert die Anfälligkeit der Pflanze gegenüber der Schädlinge M. grisea und X. oryzae pv. oryzae (Ono et al. 2001, Kawasaki et al. 1999). Die gesteigerte H2O2-Produktion kann durch Diphenyliodonium, einem NADPH-OxidaseInhibitor, unterbunden werden. Eine erhöhte H2O2-Produktion wurde auch bei der Expression von HsRac1 in Saubohnenzellen beobachtet (Park et al. 2000). Ein zweiter Mechanismus zur 1 Einleitung 14 Kontrolle des ROS-Gehaltes durch Rops wurde vor kurzem aufgedeckt. Demnach aktivieren Rops nicht nur die ROS-Produktion, sondern sie unterbinden auch die Entfernung von ROS durch Metallothioneine (Wong et al. 2004). 1.4.1.2 Rop-kontrollierte Faktoren zur Steuerung der Abwehrreaktionen Durch welche molekularen Mechanismen die Regulation der NADPH-Oxidase-Aktivität durch Rop-Proteine erfolgt, ist nicht klar, da kein homologes Protein zur p67phox-Untereinheit in Pflanzen existiert. Es wird angenommen, dass andere Proteine als regulatorische Untereinheiten des Komplexes fungieren und mit Rop interagieren. Außer der Aktivierung der NADPH-Oxidase wird vorgeschlagen, dass Rop eine MAPK- (mitogen activated protein kinase) Kaskade ansteuert. In Reis (Oryza sativa, Os) ist eine solche MAPK-Kaskade identifiziert worden, die durch Rop induziert wird (Abbildung 1.6) (Agrawal et al. 2003a, Agrawal et al. 2003b). Die Aktivierung von Rop erfolgt anscheinend durch die α-Untereinheit eines heterotrimeren G-Proteins. Untersuchungen an Mutanten aus Reis, die kein Gα-Protein besitzen, haben gezeigt, dass ein Gα-Protein oberhalb von OsRac1 im Signalweg fungiert (Suharsono et al. 2002, Ono et al. 2001). Extrazelluläre Rezeptoren sind noch nicht eindeutig identifiziert. Ein Kandidat ist Mlo, ein transmembranales Protein, das Ähnlichkeit mit GProtein-gekoppelten Rezeptoren aufweist und eine Rolle beim Befall von Gerste mit Mehltau spielt (Devoto et al. 1999, Schultheiss et al. 2002). Abbildung 1.6: Die Rolle von Rop in der Regulation pflanzlicher Abwehrmechanismen gegen Pathogene. Das Modell wurde auf Grund der Erkenntnisse aus Reis erstellt. Gα: α-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine; ROS: reactive oxygen species; MAPK: mitogen activated protein kinase. Verändert nach Agrawal et al. 2003a. 1 Einleitung 15 Ein anderer Regulator der ROS-induzierten Apoptose ist Phosphatidsäure (PA) (Sang et al. 2001). PA entsteht durch Hydrolyse von Phospholipiden durch Phospholipase D (PLD). Der Bezug zu Rop ist in diesem Signalweg in zweifacher Weise gezeigt worden. Einerseits wurde die Aktivierung der PLD durch Rop beschrieben, andererseits wird Rop selbst durch PA reguliert (Park et al. 2004, Kim et al. 2004). 1.4.2 Rop kontrolliert diverse Prozesse in der Entwicklung der Pflanze Es gibt einige Anzeichen für eine Funktion von Rop in der Kontrolle der Entwicklung und der Morphologie von Pflanzen. Die Expression von CA und DN Rops in A. thaliana wirkt sich auf diverse Aspekte in der Entwicklung und im Wachstum der Pflanze aus: auf die Samenruhe, die Embryonalentwicklung, die Keimlingsentwicklung, die Seitenwurzelinitiation, die Organmorphogenese, das Wachstum, die apikale Dominanz und die Phyllotaxis (Li et al. 2001, Zheng et al. 2002). Durch Immunfluoreszenzaufnahmen konnte gezeigt werden, dass ein Rop-Protein an einem Endomembransystem lokalisiert ist, das den Tonoplasten in einem bestimmten Stadium der Vakuolenentwicklung darstellt. Daraus wurde geschlossen, dass Rops die Entwicklung von Vakuolen steuern (Lin et al. 2001). 1.4.2.1 Die Rolle von Rop in der Regulation der Meristemerhaltung Es wird vermutet, dass Rops durch die Aktivierung von MAPK-Kaskaden in die Entwicklung der genannten Prozesse eingreifen (Kohorn 1999, Trotochaud et al. 1999, Fletcher 2002). Anhaltspunke dafür sind eine bislang nicht näher charakterisierte Interaktion des aus Lotus japanicus stammenden Rops LjRac1 mit einer Raf-ähnlichen Kinase und die Inaktivierung des so genannten wuschel-Gens durch eine MAPK-Kaskade (Valster et al. 2000). Wuschel ist ein Homeobox-Transkriptionsfaktor, der für die Erhaltung der Stammzellen im Meristem verantwortlich ist (Laux et al. 1996). Besonders intensiv ist ein möglicher Mechanismus der Rop-Aktivierung untersucht worden, der in die o.g. Regulation der Meristemerhaltung involviert ist. Das clv1-Gen (clavata) kodiert eine putative Rezeptorkinase (RLK, für receptor-like kinase). Die extrazelluläre Domäne des CLV1-Rezeptors besteht aus 21 Leucin-reichen Wiederholungen, wie sie in tierischen 1 Einleitung 16 Hormonrezeptoren vorkommen, und die intrazelluläre Domäne ist ein Serinkinase-Modul (Trotochaud et al. 1999). Das clv2-Gen kodiert ein rezeptorartiges Protein (RLP, für receptor-like protein), das ebenso eine extrazelluläre Domäne aus Leucin-reichen Wiederholungen enthält, aber nur einen sehr kurzen zytoplasmatischen Teil ohne Kinasedomäne aufweist (Jeong et al. 1999). CLV1 und CLV2 liegen in vivo vermutlich als Heterodimer vor, wobei CLV2 der Stabilisierung von CLV1 dient (Jeong et al. 1999). CLV1 und CLV2 sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden. CLV3 ist ein Peptid, das sekretiert wird und den Liganden des CLV1/CLV2-RezeptorKomplexes darstellt (Trotochaud et al. 2000). Nach einem Modell von Trotochaud et al. wird das Heterodimer durch Bindung von CLV3 und evtl. einem Helferprotein aktiviert, was zur Autophosphorylierung der Kinasedomänen und zur Assoziation von Effektoren führt (Abbildung 1.7). 2 Abbildung 1.7: Signalweiterleitung zur Erhaltung des Meristems durch den CLV-Komplex. CLV1 und CLV2 bilden einen Heterodimer, der durch Disulfidbrücken verbunden ist. Bindung von CLV3 (und evtl. ein Helferprotein) führt zur Autophosphorylierung der Kinasedomänen und zur Zusammensetzung des aktiven CLVKomplexes. Dieser besteht aus CLV1, CLV2, CLV3, der Proteinphosphatase KAPP und einem Rop-Protein. KAPP: Kinase-assoziierte Proteinphosphatase ; CLV: clavata; P: Phosphatgruppe; X: Helferprotein. Ein potentieller Effektor ist die Kinase-assoziierte Proteinphosphatase (KAPP), eine Typ 2CSerin/Threonin-Phosphatase, die phosphorylierungsabhängig an RLKs bindet und als Negativregulator des CLV1-Signalweges fungiert (Trotochaud et al. 1999, Yu et al. 2003, Yu et al. 2000). Im Komplex mit CLV1 und KAPP wurde außerdem ein Rop-Protein gefunden, dessen Aktivierung vermutlich durch die Assoziation mit dem CLV-Komplex erfolgt. Rop 1 Einleitung 17 aktiviert dann wahrscheinlich eine MAPK-Kaskade (Trotochaud et al. 1999, Clark et al. 1997). 1.4.2.2 Die Funktion von Rop in der Sekundärwandbildung Eine weitere Funktion von Rop besteht in der Kontrolle der Sekundärwandbildung. Anhand von Baumwollfasern kann die Sekundärwandbildung gut studiert werden. Baumwollfasern sind einzelne Zellen, die zunächst in die Länge wachsen und dabei nur eine primäre Zellwand aufbauen. Später wird die primäre in eine sekundäre Zellwand umgewandelt. Dabei ändert sich das Muster der kortikalen Mikrotubuli. Diese Umordnung ist abhängig von der Aktinorganisation. Eine gesteigerte H2O2-Produktion begleitet den Vorgang. Es wurde postuliert, dass Rop die Sekundärwandbildung durch zwei Mechanismen reguliert (Bischoff et al. 1999): Zum einen kontrolliert Rop die H2O2-Produktion, zum anderen die Steuerung der Aktinorganisation in der Zelle. H2O2 tritt hierbei nur in geringen Konzentrationen auf und dient als Botenstoff. Es wurde beobachtet, dass der mRNA-Gehalt von GhRop13 (Gh: Gossypium hirsutum) während der Umwandlung zur sekundären Zellwand in Baumwollfasern stark ansteigt (Delmer et al. 1995). In Arabidopsis-Kulturen wird die die H2O2-Produktion durch Expression von CA GhRac13 stimuliert. Expression der dominant negativen (DN) Mutante von GhRac13 bewirkt eine Inhibition der H2O2-Produktion (Potikha et al. 1999). 1.4.3 Die Funktion von Rop in Phytohormon-Signalwegen Insbesondere die frühen Phasen der Abszisinsäure- (ABA), Auxin- und Brassinolidinduzierten Signalwege sind erst wenig verstanden im Vergleich zu den Signalwegen der Phytohormone Gibberellinsäure, Ethylen und Zytokinin. Die Phänotypen CA bzw. DN Ropexprimierender Pflanzen gleichen denen von Pflanzen, die in der Auxin- bzw. BrassinolidHormonantwort gestört sind (Li et al. 2001, Tao et al. 2002). Außerdem bewirkt die Expression von CA/DN Rop2 Änderungen in den Hormonantworten auf ABA, Indolessigsäure (IAA) und Brassinolide (Li et al. 2001). Demnach kommt den Rop-Proteinen eine wichtige Funktion in den Signalwegen dieser Phytohormone zu. 1 Einleitung 18 1.4.3.1 Die Rolle von Rop im Auxin-Signalweg Das Auxin Indol-3-Essigsäure ist für diverse Prozesse im Wachstum und in der Entwicklung der Pflanze essentiell. Es konnte gezeigt werden, dass Auxin das Nicotiana tabacum-Rop NtRac1 aktiviert, und dass NtRac1-Expression in Protoplasten die Auxin-abhängige Genexpression aktiviert (Tao et al. 2002). CA NtRac1 ist bevorzugt an der Plasmamembran lokalisiert. Da die Aktivierung von MAPK-Kaskaden durch Auxin dokumentiert ist, wird angenommen, dass Rops das Signal vom Auxin-Rezeptor an MAPK-Kaskaden weiterleiten und dadurch die Auxin-gesteuerte Genexpression aktivieren (Tao et al. 2002, Rogg und Bartel 2001, Mockaitis und Howell 2000, Mizoguchi et al. 1994). Die Interaktionspartner von Rop, die für die Aktivierung und die Signalweiterleitung zuständig sind, wurden jedoch bis heute nicht beschrieben. 1.4.3.2 Die Rolle von Rop im Abszisinsäure-Signalweg Abszisinsäure (ABA) ist ein bedeutsames pflanzliches Hormon, dass die Wasserhomöostase kontrolliert, die Samenkeimung, das Wachstum der Pflanze und Stressreaktionen wie die Schließung der Stomata bei Trockenheit. Zwei Rops wurden als zentrale Komponenten im ABA-Signalweg identifiziert (Zheng et al. 2002, Lemichez et al. 2001). Bei Rop10 knock outMutanten sind alle untersuchten, ABA-gesteuerten Reaktionen verstärkt: Die Bewegung der Stomata, die Inhibition der Samenkeimung, das Ergrünen, das Wurzelwachstum und die ABA-induzierte Genexpression (Zheng et al. 2002). Demnach ist Rop10 eine zentrale Komponente des ABA-Signalweges. Da Rop10 an der Plasmamembran lokalisiert ist, wird angenommen, dass es weit am Anfang im ABA-Signalweg fungiert. Die Behandlung von Pflanzen mit ABA inhibiert Rop6 und zerstört das Aktinzytoskelett von Schließzellen. Diese Inaktivierung von Rop6 ist für das Schließen der Spaltöffnung notwendig. Sie ist abhängig von der Aktivität der Serin/Threonin-Phosphatase ABI1 (abscisic acid insensitive), die ein Regulator des ABA-Signalwegs ist (Lemichez et al. 2001). Bei Veränderungen des Volumens der Schließzellen muss die Grösse der Plasmamembran durch Exozytose und Endozytose angepasst werden. Da diese Vesikel an Aktinfilamenten entlang befördert werden und Rops für die Kontrolle derartiger Prozesse in anderen Zelltypen benötigt werden, wird angenommen, dass die ABA-vermittelte Inaktivierung von Rop den Transport von Vesikeln verhindert (Lemichez et al. 2001). 1 Einleitung 19 1.4.4 Die Kontrolle stressbedingter Reaktionen der Pflanze durch Rop Pflanzen besitzen Mechanismen, um auch bei ungünstigen Bedingungen wie niedrigen Temperaturen, hohem Salzgehalt und Trockenheit überleben zu können. Die Weiterleitung solcher “Stress”-Signale erfolgt wahrscheinlich über Rezeptoren, Phosphotransferreaktionen, Botenstoffe wie H2O2 oder Kalzium und MAPK-Kaskaden, und führt zur Aktivierung stressgesteuerter Genexpression (Xiong et al. 2002). Auf Sauerstoffmangel reagieren Pflanzen durch eine erhöhte Expression der Alkoholdehydrogenase (ADH) und Ethanolfermentation. Dies geschieht auf Grund der Aktivierung von Rop2 durch Sauerstoffmangel. Rop2 bewirkt die Erzeugung von H2O2 durch die NADPH-Oxidase, das als Botenstoff wirkt und die Expression von ADH und RopGAP4 aktiviert. RopGAP4 inaktiviert dann wiederum Rop2 in einem negativen Rückkopplungszyklus. Dadurch wird die H2O2-Konzentration gering gehalten, die sonst toxisch auf die Zelle wirken würde (Abbildung 1.8) (Baxter-Burrell et al. 2002). Abbildung 1.8: Der negative Rückkopplungszyklus zur Regulation der Toleranz von Sauerstoffmangel. H2O2-Produktion durch Rop-Aktivierung führt zur Expression von ADH und RopGAP4. ADH wirkt Sauerstoffmangel durch Alkoholfermentation entgegen. RopGAP4 inaktiviert Rop und hält auf diesem Weg die intrazelluläre H2O2-Konzentration gering. ADH: Alkoholdehydrogenase. Aus Gu et al. 2004. 1.4.5 Die Rolle von Rop in Aktinpolymerisierungsprozessen Aktinpolymerisierungsprozesse bilden die Grundlage der flexiblen Organisation des Aktinzytoskeletts, die für grundlegende Prozesse der Pflanze wie die Zellteilung, die Morphogenese und Transportprozesse nötig ist (Vantard und Blanchoin 2002). Studien über die Funktion von Rops in Pflanzen zeigen, dass sie Schlüsselrollen in der Reorganisation des Aktinzytoskeletts innehaben und besonders für das Spitzenwachstum von Wurzelhaaren und Pollenschläuchen essentiell sind (Kost et al. 1999a, Li et al. 1999, Fu et al. 2001, Fu et al. 2002). 1 Einleitung 20 1.4.5.1 Regulation des Aktinzytoskeletts durch tierische Rho-Effektoren Besonders gut untersucht ist die Wirkung der tierischen Rho-Proteine auf aktinabhängige Prozesse in Säugerzellen. Dort regulieren Veränderungen des Aktinzytoskeletts die Zellmorphogenese, Phagozytose, Pinozytose, Zytokinese, das Axonwachstum, Zell-ZellAdhäsion, Zell-Substrat-Adhäsion, die Zellpolarität, den Zellzyklus und die Zellbewegung (Hall 1998). Extrazelluläre Liganden aktivieren Rac und Rho über Transmembranrezeptoren und GEFs wie Tiam1 oder Adapterproteine wie DOCK180 (Lambert et al. 2002, Brugnera et al. 2002) (Abbildung 1.9). Abbildung 1.9: Regulation des Aktinzytoskeletts durch Rho-Proteine der Säuger. Oben: Die Rho-Proteine sind wegen ihrer Isoprenylierung membranlokalisiert und werden durch extrazelluläre Liganden aktiviert. Sind sie aktiviert, kontrollieren sie die Reorganisation des Aktinzytoskeletts, Adhäsion und Migration. Unten: Die Effekte auf die Morphologie von Zellen wurden an transient transfizierten Fibroblasten untersucht. Aktinfilamente wurden mit Rhodamin-Phalloidin sichtbar gemacht. LPA: lysophosphatidic acid; PDGF: platelet derived growth factor; PIP2: Phosphatidyl-Inositol-4,5-bis-Phosphat. Verändert nach Mackay und Hall 1998, Hall 1998, Bishop und Hall 2000. In Fibroblasten bewirkt die Aktivierung von Rho die Bildung von Stressfasern und die Aggregation von Integrinen und assoziierten Proteinen in fokalen Adhäsionskomplexen, die für die Zell-Substrat-Adhäsion essentiell sind (Moorman et al. 1996, Ridley und Hall 1992). Rac-Aktivierung fördert die de novo-Aktinpolymerisierung zur Bildung von netzartigen 1 Einleitung Membranfortsätzen 21 (Lamellipodien) in der Zellperipherie und wellenartigen Membranstrukturen (membrane ruffles) (Ridley et al. 1992). Die Aktivierung von Cdc42 führt zur Ausbildung fingerartiger Membranausstülpungen (Filopodien) (Nobes und Hall 1995, Kozma et al. 1995). Die verschiedenartigen Auswirkungen auf das Aktinzytoskelett und die Zellmorphologie werden durch Effektorproteine und ihre Interaktionen mit anderen Proteinen herbeigeführt. Die räumlich-zeitliche Regulation einzelner Interaktionen resultiert in der umfassenden Kontrolle der Mobilität der Zelle (Schmitz et al. 2000). Die Rho-Effektoren ROK (Rho-Kinase) und Dia sind für die Rho-induzierte Ausbildung von Stressfasern und fokalen Adhäsionen verantwortlich (Bishop und Hall 2000). ROK phosphoryliert MLC (myosin light chain) und die MBS (myosin binding subunit) der MLCPhosphatase (Kimura et al. 1996, Amano et al. 1996). Dadurch wird die durch Aktin aktivierte ATPase-Aktivität von Myosin II stimuliert, was die Aktin-Myosin-Filamentassemblierung zur Folge hat (Amano et al. 1996, Kawano et al. 1999, Bishop und Hall 2000). LIM-Kinase (LIMK) ist ein weiteres Substrat von ROK. Wenn sie phosphoryliert ist, inhibiert sie Cofilin und führt so zur Stabilisierung von Aktinfilamenten an deren pointed end (Maekawa et al. 1999). Dia1, Dia2 und Dia3 gehören zur Familie der Formine. Sie enthalten drei FH- (formin homology) Domänen, eine GTPase-bindende Domäne und eine autoregulatorische DADDomäne (Dia autoregulatory domain) (Deeks et al. 2002, Wasserman 1998). Die FH1Sequenz besteht aus mehreren Prolin-reichen Motiven, die den Austauschfaktor von G-Aktin, Profilin, binden. Durch diese Interaktion trägt Dia zur Neubildung von Aktinfilamenten und zur Aktinorganisation in Stressfasern bei (Wasserman 1998, Watanabe et al. 1999). Die FH2Domäne ist für die Aktinpolymerisierung verantwortlich (Takeya und Sumimoto 2003, Shimada et al. 2004). FH3-Domänen spielen eine wichtige Rolle bei der intrazellulären Lokalisation der Formine (Kato et al. 2001, Petersen et al. 1998). PAK1, PAK2 und PAK3 (p21-aktivierte Kinasen) werden sowohl von Rac als auch von Cdc42 aktiviert. Sie sind Serin/Threonin-Kinasen, die außer der Kinasedomäne auch eine CRIB-Domäne enthalten (Manser und Lim 1999). Sie beeinflussen das Aktinzytoskelett durch Phosphorylierung der MLC-Kinase (MLCK) und LIMK (Arber et al. 1998, Sanders et al. 1999, Bishop und Hall 2000). Proteine der WASP-Familie (Wiskott-Aldrich-Syndrom-Proteine: WASP, N-WASP, WAVE) bilden ein Gerüst (scaffold) und rekrutieren so alle Komponenten zur de novoPolymerisierung von Aktin: Profilin, Aktin-Monomere und den Arp2/3-Komplex (Higgs und Pollard 2001, Machesky und Insall 1999). Durch die Bindung dieser Proteine wird die 1 Einleitung 22 Keimbildung von Aktinfilamenten eingeleitet (Symons et al. 1996). WASP und das ubiquitär exprimierte N-WASP werden von Cdc42 aktiviert. Sie bestehen aus einer N-terminalen WH1(WASP homology) Domäne, einer CRIB-Domäne (Cdc42/Rac interactive binding), einer SH3- (Src homology 3) bindenden, Prolin-reichen Sequenz und einer C-terminalen VCADomäne (Verprolin homology, Cofilin homology, acidic), an die der Arp2/3-Komplex und GAktin binden (Abbildung 1.10) (Machesky und Insall 1998, Rohatgi et al. 1999). Das verwandte Protein WAVE (WASP familiy Verprolin homologous protein) besitzt –wie WASP– ebenfalls die Fähigkeit, G-Aktin, Profilin und Arp2/3 zu binden und ist an der Bildung von membrane ruffles beteiligt (Machesky et al. 1999, Machesky und Insall 1998). Es liegt in der Zelle im Komplex mit den Proteinen PIR121, Nap1, Abi2 und HSPC300 vor (Hildebrand et al. 1996). Da WAVE keine CRIB-Domäne enthält, interagiert es indirekt mit Rac über das Adapterprotein PIR121 (p53-induzierbare mRNA) (Eden et al. 2002). Abbildung 1.10: Schematische Darstellung der Domänenstruktur ausgesuchter Effektoren der RhoFamilie. RKH: Rho-Kinektin-homologe Rho-Bindedomäne; PH: Pleckstrin-homologe Domäne; CRD: Cysteinreiche Domäne; CRIB: Cdc42/Rac interactive binding-Domäne; FH: Formin-homologe Region; DAD: Dia autoregulatory domain; WH1: WASP-homologe Region 1; V: Verprolin homology; C: Cofilin homology; A: acid; B: basic. Der Arp2/3-Komplex bewirkt eine Verzweigung der Aktinfilamente im Winkel von 70° (May 2001). Er besteht aus den –mit Aktin verwandten– Proteinen Arp2 und Arp3 (actin related proteins) und fünf weiteren Proteinen, die in vivo einen stabilen Komplex zusammen bilden (Mullins et al. 1998). VCA-Proteine, G-Aktin und der Arp2/3-Komplex stimulieren dann gemeinsam mit ATP die Aktinpolymerisierung an den Verzweigungsstellen des Filaments. Dabei ahmt der Arp2/3-Komplex einen Aktin-Dimer nach, der dann zusammen mit dem an VCA gebundenen G-Aktin einen stabilen Keim bildet und verlängert werden kann. Die Aktinkeimbildung durch den Arp2/3-Komplex führt so zur Bildung eines dendritischen Netzwerkes, wie es in Lamellipodien beobachtet werden kann (Pollard und Beltzner 2002). Ein weiterer Signalweg, der zur Aktinpolymerisierung führt, verläuft über Phospholipide. Die Phosphatidyl-4-Phosphat-5-Kinase wird durch Rac aktiviert und produziert PhosphatidylInositol-4,5-bis-Phosphat (PIP2) (Chong et al. 1994). Für die Aktinpolymerisierung ist das 1 Einleitung 23 PIP2-abhängige Demaskieren der Aktinfilamente durch das Freisetzen von so genannten capping-Proteinen nötig (Zigmond 1996, Hartwig et al. 1995). 1.4.5.2 Die Rolle von Rop in der Regulation des Spitzenwachstums von Pollenschläuchen und Wurzelhaaren Das Wachstum von Pollenschläuchen und Wurzelhaaren erfolgt über eine Ausdehnung der Zelle ausschließlich an ihrer Spitze. Dafür werden grosse Mengen Material für die Erweiterung der Zellmembran und der Zellwand benötigt. Es wird in Vesikeln transportiert, deren Bewegung in Form der so genannten Zytoplasmaströmung beobachtet werden kann. Die longitudinal angeordneten, dicken Aktinfilamente der Zelle dienen der Myosinabhängigen Organellenbewegung. Die feinen Aktinstrukturen an der Spitze des Pollenschlauches haben vermutlich eine Funktion bei der Sekretion des Zellwandmaterials (Abbildung 1.11). Ein Kalziumgradient, der seine höchste Konzentration an der Spitze aufweist, steuert die Polarität der Sekretionsmaschinerie (Kost et al. 1999b, Vidali et al. 2001, Kost et al. 1998). Unabhängig davon dient die Verlängerung von Aktinfilamenten auch dem Membranvorschub, der ebenso wichtig für das Spitzenwachstum ist (Vidali et al. 2001, Vidali und Hepler 2001). Viele Untersuchungen belegen, dass Rops maßgeblich das Spitzenwachstum von Pollenschläuchen und Wurzelhaaren kontrollieren (Gu et al. 2003, Molendijk et al. 2001). Es wird postuliert, dass Rops mindestens zwei parallele Signalwege aktivieren, wobei einer zur Aktinpolymerisierung führt und einer zur Kalziumakkumulation an der Spitze der Zelle (Fu et al. 2001, Clark et al. 2001, Zheng und Yang 2000a, Feijo et al. 2001, Fu und Yang 2001). Die Wirkung von Rop auf die Aktinstrukturen der Zelle wurde durch Überexpression von Rop1, Rop2, Rop3, Rop5, Rop6 und Rop7 in Wurzelhaaren bzw. Pollenschläuchen gezeigt, wobei diverse Defekte im Spitzenwachstum wie unpolares Wachstum, Anschwellen und unstrukturierte Aktinorganisation auftraten (Jones et al. 2002, Kost et al. 1999a, Li et al. 1999, Fu et al. 2002, Cheung et al. 2003, Lin et al. 1996, Li et al. 1998, Lin und Yang 1997, Camacho und Malho 2003, Li et al. 1999). Die durch Überexpression von Rop1 in Pollenschläuchen ausgelösten Veränderungen konnten dabei durch gleichzeitige Expression von RopGAP1 aufgehoben werden (Fu et al. 2001). Immunfluoreszenzaufnahmen von Rop1 aus der Erbse zeigen eine spezifische Lokalisation an der apikalen Region der Plasmamembran von Pollenschläuchen sowie eine spezifische Inhibierung des Pollenschlauchwachstums durch Rop-Antikörper (Lin und Yang 1997). Auch Rop1 und Rop4 1 Einleitung 24 aus Arabidopsis thaliana sind an der Spitze von Wurzelhaaren lokalisiert (Molendijk et al. 2001, Fu et al. 2001). Demnach bestimmt die Lokalisation von Rop an der Spitze die Polarität der Zelle. Abbildung 1.11: Der Einfluss von Rop5 auf die Aktinorganisation in Tabak-Pollenschläuchen. Konstitutiv aktives Rop5G15V und dominant negatives Rop5T20N (Arabidopsis thaliana) wurden transient in TabakPollenschläuchen exprimiert. Co-Expression von GFP-mTalin macht das Aktinzytoskelett der Pollenschläuche sichtbar (Kost et al. 1998). a: Das Aktinzytoskelett normal wachsender Tabak-Pollenschläuche besteht aus dicken, longitudinal orientierten Filamenten an den Seiten der Pollenschläuche und feinen Strukturen in der Nähe der Spitze. b: Pollenschläuche, die Rop5G15V exprimieren, nehmen eine ballonartige Form an, die Aktinfilamente sind besonders dick, und sie sind helikal angeordnet. c: Die Aktinfilamente in Rop5T20Nexprimierenden Pollenschläuchen sind feiner und weniger organisiert. Diesen Studien zufolge induziert Rop5Aktivierung die Polymerisierung, Bündelung und Organisation von Aktinfilamenten in Pollenschläuchen. Maßstab: 25 µm. Aus Kost et al. 1999a. 1.4.5.3 Die Funktion von Rop in diffus wachsenden Zellen Die meisten Zelltypen sind nicht von solch ausgeprägter Polarität gekennzeichnet, wie Wurzelhaare und Pollenschläuche es sind. Speziell die Zellen in Entwicklungsgeweben wachsen nicht durch lokales Spitzenwachstum, sondern durch so genanntes diffuses Wachstum. Sie haben eine weniger stark ausgeprägte Polarität. Diffuses Wachstum erfolgt durch eine Erhöhung des Turgordrucks, dem die Zellwände nicht standhalten (Kost et al. 1999b). Diese Art des Wachstums findet in zwei Phasen mit unterschiedlichen Mechanismen statt: In der frühen Phase findet Ausdehnung in alle Richtungen statt, in der späten Phase hauptsächlich in eine Richtung. Die Phänotypen von CA (konstitutiv aktiv) und DN (dominant negativ) Rop2-exprimierenden Arabidopsis thaliana-Pflanzen zeigen, dass Rop2 spezifisch die frühe Phase reguliert; die späte Phase ist unabhängig von Rop2 (Fu et al. 2002). Die Funktion von Rop2 wurde anhand des Wachstums epidermaler Zellen gezeigt. GFP-Rop2 ist in diesen Zellen kortikal an den aktuellen Wachstumszonen lokalisiert. An diesen Stellen befinden sich auch zerstreute, feine Aktinfilamente. Die Expression von DN Rop2 inhibiert die Bildung des kortikalen F-Aktins. CA Rop2 hingegen bewirkt die gleichmäßige, delokalisierte Verteilung des F-Aktins über den 1 Einleitung 25 gesamten Zellkortex (Fu et al. 2002). Es wird angenommen, dass −wie beim polaren Spitzenwachstum− gerichtete Exozytose von Zellwand- und Zellmembranmaterial an den Wachstumszonen erforderlich ist (Mathur und Hulskamp 2002b). Offensichtlich treten hierbei ähnliche Mechanismen wie beim Spitzenwachstum auf. 1.4.5.4 Rop-kontrollierte Faktoren zur Regulation von Aktinstrukturen Die pflanzlichen Effektoren von Rop sind nicht immer Homologe von Proteinen, die aus Säugern bereits bekannt sind. In Pflanzen gibt es anscheinend keine Homologen zu PAK, WASP und ROK, die unverzichtbare Funktionen in der Regulation des Aktinzytoskeletts in Säugerzellen ausüben. Formine, WAVE, der Arp2/3-Komplex, Profilin und Cofilin hingegen sind auch in Pflanzen bekannt (Cvrckova et al. 2004, Brembu et al. 2004, Li et al. 2003, Kandasamy et al. 2004, Chen et al. 2003). Offensichtlich erfolgt die Kontrolle der Aktinorganisation in der pflanzlichen Zelle zum Teil ähnlich wie in tierischen Zellen und zum Teil über andere Mechanismen. Der WAVE-Komplex ist ein zentraler Regulator des Arp2/3-Komplexes (Hildebrand et al. 1996). Im Arabidopsis-Genom wurden Homologe aller Untereinheiten des Komplexes identifiziert: WAVE, BRK1 (brick), NAPP (NAP of plants), PIRP (PIR of plants) und AtABI (Abl interactor) (Deeks et al. 2004, Brembu et al. 2004, Basu et al. 2004, El-Assal et al. 2004). Sie sind zu 14 bis 30 % identisch mit den tierischen Untereinheiten. Es konnte gezeigt werden, dass PIRP (das pflanzliche Homologe zu PIR121) spezifisch mit Rop2 interagiert (Basu et al. 2004). Die Rolle des WAVE-Komplexes in der Regulation des Arp2/3Komplexes konnte durch die Analyse von NAPP- und Arp2/3-Mutanten belegt werden, die den gleichen Phänotyp haben. Die Funktionalität des pflanzlichen WAVE-Proteins (auch Scar genannt) wurde durch in vitro-Bindungsstudien bewiesen, die die Interaktion der VCADomäne mit G-Aktin zeigen (Deeks et al. 2004). Demzufolge ist anzunehmen, dass der WAVE-Komplex in Pflanzen ähnliche Funktionen erfüllt wie der tierischer Zellen. Die Ergebnisse zeigen außerdem einen möglichen Mechanismus für die Regulation der Aktinpolymerisierung durch den Arp2/3-Komplex unter der Kontrolle von Rop-Proteinen auf. Formine sind eine weitere Familie von Proteinen, die Einfluss auf die Organisation des Aktinzytoskeletts nehmen. 21 Formine wurden in A. thaliana identifiziert (Deeks et al. 2002). Alle Arabidopsis-Formine enthalten je eine Prolin-reiche FH1- und eine FH2-Domäne. Sie werden in zwei Gruppen eingeteilt: Die Gruppe I enthält zusätzlich zu den FH-Domänen eine weitere Prolin-reiche Region am N-Terminus und zwei Transmembrandomänen (Deeks et al. 1 Einleitung 26 2002, Cvrckova 2000, Cvrckova et al. 2004). Gruppe II weist keine zusätzlichen Sequenzmerkmale auf. Da die pflanzlichen Formine keine zu tierischen GBDs (GTPase-bindende Domänen) homologe Sequenzen aufweisen, wird angenommen, dass sie entweder nicht durch Rops aktiviert werden oder dass die Interaktion mit Rops indirekt über andere Proteine erfolgt. Aktin-depolymerisierende Faktoren (ADFs) sind wichtige Regulatoren der Aktindynamik. Sie binden an Aktinfilamente und induzieren deren Spaltung und Depolymerisierung. Überexpression des Arabidopsis-Homologen ADF1 in verschiedenen Zelltypen unterdrückt die Bildung dicker Aktinfilamente und bewirkt Defekte in der Morphogenese (Dong et al. 2001). Studien in Pollenschläuchen von Tabak zeigen, dass Expression von NtADF1 (Nt: Nicotiana tabacum) der Wirkung von NtRac1-Expression entgegenwirkt. Es wird angenommen, dass Rop-Proteine die ADFs durch Phosphorylierung inhibieren und damit Einfluss auf die Aktinorganisation nehmen (Gu et al. 2004, Chen et al. 2003). Durch welche Effektoren Rop die intrazelluläre Kalziumkonzentration steuert, ist noch relativ unklar. Die Injektion von anti-Rop1Ps-Antikörpern in Zellen führt zur Aufhebung des dortigen Kalziumgradienten (Li et al. 1999). Die Phosphatidyl-Inositolmonophosphatkinase (PIK) könnte ein möglicher Rop-Effektor sein, der mit dem intrazellulären Kalziumspiegel in Verbindung steht: Phosphatidyl-Inositol-4,5-bisphosphat (PIP2), das Produkt der PIK, ist mit Rop5 an der Spitze von Pollenschläuchen co-lokalisiert. Expression der PH- (pleckstrin homology) Domäne der Phospholipase C, die spezifisch PIP2 bindet, hemmt das Pollenschlauchwachstum. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Rop –wie Rac in tierischen Zellen– mit der PIK assoziiert und sie reguliert (Kost et al. 1999a). Weitere Studien stellen die Verbindung von Rop mit Kalzium her: In einem negativen Rückkopplungszyklus wird die Expression von RopGAPs durch Kalzium hyperaktiviert, was wiederum zur Inaktivierung von Rop durch RopGAPs und zum Absinken des Kalziumspiegels führt (Zheng und Yang 2000a). Die Überexpression von RopGAP in Pollen hemmt das Pollenschlauchwachstum und senkt die extrazelluläre Kalziumkonzentration von 2 auf 0,5 mM (Zheng und Yang 2000b). 1.5 Regulation der Aktivität von Rop 1.5.1 Regulation durch Guaninnukleotid-Austauschfaktoren Analog zu tierischen Rho-Proteinen werden Rop-Proteine durch RopGAPs und RopGDIs reguliert. Die tierischen Rho-Proteine werden außerdem durch Guaninnukleotid- Austauschfaktoren aktiviert, die den Austausch von GDP zu GTP katalysieren. Die typischen 1 Einleitung 27 RhoGEFs der Säuger gehören zur Dbl-Familie (human diffuse B cell lymphoma). Die 60 bis heute bekannten Mitglieder dieser Familie enthalten eine katalytische Dbl-homologe Domäne (DH), die für ihre GEF-Aktivität verantwortlich ist (Erickson und Cerione 2004, Whitehead et al. 1997). Außerdem besitzen sie eine PH-Domäne (Pleckstrin homology), die durch die Bindung von Inositol-Phospholipiden bzw. von βγ-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine die Membranlokalisation der Proteine herbeiführt (Cerione und Zheng 1996). Mit Hilfe der DH-Domäne induziert der GEF eine strukturelle Änderung des G-Proteins, durch die die Nukleotidbindungstasche geweitet wird und das Nukleotid abdissoziieren kann (Vetter und Wittinghofer 2001). Die meisten GEFs enthalten zusätzliche Domänen, die die intrazelluläre Lokalisation und die Interaktion mit anderen Proteinen kontrollieren (Takai et al. 2001, Hart et al. 1994, Bustelo 2000, Mertens et al. 2003). Außerdem wurde kürzlich eine neue Familie identifiziert, die eine Docker/DHR- (dock homology region) Domäne besitzt. Die DHR-Domäne des Proteins DOCK180 wirkt gemeinsam mit dem Protein ELMO als GEF für Rac (Brugnera et al. 2002). Eine homologe Domäne aus dem Protein Zizimin1 wurde als neuartige GEF-Domäne für Cdc42 beschrieben (Meller et al. 2002, Braga 2002). Der Mechanismus dieser Proteine ist noch nicht verstanden. RopGEFs mit Dbl-homologen Domänen wurden bis heute nicht in Pflanzen beschrieben (Cerione und Zheng 1996). Allerdings wurde eine Docker-homologe Domäne, CDMS- (C.e. CED5, H.s. DOCK180, D.m. MYOBLAST CITY, A.t. spike1) Domäne genannt, in dem aus A. thaliana stammenden Protein spike1 gefunden (Qiu et al. 2002). Bis heute konnte jedoch keine GEF-Aktivität von spike1 nachgewiesen werden. 1.5.2 Regulation durch GTPase-aktivierende Proteine Unter dem Einfluss GTPase-aktivierender Proteine (GAPs) wird die Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse durch G-Proteine um den Faktor 104 bis 105 beschleunigt (Gideon et al. 1992). Die tierischen RhoGAPs ergänzen das katalytische Zentrum der kleinen G-Proteine, indem sie eine Argininseitenkette –genannt Argininfinger– in der Nukleotidbindungstasche positionieren, welche dort negative Ladungen neutralisiert und dadurch katalytisch wirkt. Außerdem wird ein katalytisch wirksamer Glutaminrest von Rho durch die Komplexbildung mit GAP stabilisiert (Rittinger et al. 1997, Scheffzek et al. 1998, Gamblin und Smerdon 1998). Im Menschen existieren 80 verschiedene RhoGAPs (Tabelle 1.7) (Etienne-Manneville und Hall 2002, Moon und Zheng 2003). 1 Einleitung 28 Tabelle 1.7: Ausgesuchte GTPase-aktivierende Proteine der Rho-Proteine. Verändert nach (Takai et al. 2001). GAP Rho Protein Referenz p50 RhoGAP Rho Rac Cdc42 Lancaster et al. 1994 p190 RhoGAP Rho Rac Cdc42 Settleman et al. 1992 Graf Rho Cdc42 Hildebrand et al. 1996 Myr5 Rho Cdc42 Reinhard et al. 1995 BCR Rac Cdc42 Diekmann et al. 1991 n-Chimaerin Rac Cdc42 Diekmann et al. 1991 RopGAP Rop Wu et al. 2000 Ihnen gemeinsam ist eine etwa 150 Aminosäuren umfassende, konservierte GAP-Domäne (Abbildung 1.12) (Peck et al. 2002). Die GAP-Domäne interagiert mit den Schalterregionen I und II und der P-Schleife von Rho-Proteinen (Moon und Zheng 2003). Die Substratspezifität für Rho-Proteine ist stark unterschiedlich. Abbildung 1.12: Schematische Darstellung der Domänenstruktur ausgesuchter RhoGAPs. Sec14/BCH: Sec14p/BNIP2-Cdc42GAP homology; P: Prolin-reich; RhoGAP: GAP-Domäne; GTPase: GTPase-homologe Domäne; S/T Kinase: Serin/Threonin-Kinase; DH: Dbl-homologe Domäne; PH: Pleckstrin-homologe Domäne; C2: Calcium-dependent lipid binding; CR: Cystein-reich; Aktin-BS: Aktinfilament-Bindestelle; IQ: CalmodulinBindestelle; SH3: Src homology region3; CRIB: Cdc42/Rac interactive binding Domäne. Verändert nach (Moon und Zheng 2003). Drei putative GAPs wurden 1999 durch Hefe-Zweihybridanalysen mit den Rop-Proteinen LjRac1 und LjRac2 aus Lotus japanicus gefunden (Borg et al. 1999). Homologe Gene wurden auch in Arabidopsis, Mais und Reis identifiziert (Wu et al. 2000). Alle RopGAPs beinhalten eine katalytische GAP-Domäne mit der höchsten Übereinstimmung zu Cdc42GAP (Wu et al. 2000). A. thaliana beinhaltet neun Gene, die für RopGAPs kodieren. Die Proteine sind strukturell einzigartig (Gu et al. 2004, Borg et al. 1999, Wu et al. 2000): Sechs RopGAPs aus A. thaliana enthalten zusätzlich zur GAP-Domäne ein N-terminales CRIB-Motiv (Cdc42/Rac interactive binding) und ein Prolin-reiches, putatives Bindemotiv für die Src homology 3(SH3) Region (Abbildung 1.13) (Wu et al. 2000). 1 Einleitung 29 RopGAP1 RopGAP4 RopGAP5 RopGAP2 RopGAP3 MTEVLHFPSSPSASHSSSSSSSSPSPSSLSYASRSNATLLISSDHNRRNPVARFDQDVDF MAKVLK----------SSQSCHFPSPSSSSSTSCGGG-----NDGSNRDPHSPFN----I MGHILI--------------WFASGPYSFGLLDCSNG--------FARGEIERLR----MTKGGGCGGGG------------KGGRRKSTAEEEEE---------EEQNQQQLSLVEFL MTNFSRSKSTGTIGF-PEFKPTRPGPDKYENIHNDDD---------EYEEGHSTTSTDYY * . . 60 41 33 39 50 RopGAP1 RopGAP4 RopGAP5 RopGAP2 RopGAP3 HASIEEQDLRRRSSTDGGEEDDGGEDQISLLALLVAIFRR----SLISCKSNRRELCSME SRREEEEEEEERS-----EKERERFELSSALEILVSAIRR----SVIGGCVGEEDLCSME --KLGKSELWWFG------------GSTSSVGRVVLELAR----CFSTAEVEDNDRPAMD LTALRKSVVSCRV------DNRQDDG--------------------GVGGGISSAVHHME DASTPLSSHASRS------GNGSGSGQLTVVDLLAAVLRKSLVMSCAMERGEDDVVASMD . *: 116 92 75 73 104 RopGAP1 RopGAP4 RopGAP5 RopGAP2 RopGAP3 IGWPTNVRHVAHVTFDRFNGFLGLPVEFEPEVPRRAPSA-----------SATVFGVSTE IGVPTDVRHVAHVTFDRFHGFLGLPVEFEPEVPRRAPSA-----------SATVFGVSTE IGGPTNIRHVAHVTFDRFDGFLGLPSEFEPDVPRKAPSARFHIIILFVFGSATVFGVSTE IGWPTNVRHITHVTFDRFHGFLGLPHELQVEIPCRVPSA-----------SVSVFGVSAE IGWPTEVKHVSHVTFDRFNGFLGLPSELEPEVPPRAPSA-----------SVSVFGVSAK ** **:::*::*******.****** *:: ::* :.*** *.:*****:: 165 141 135 122 153 RopGAP1 RopGAP4 RopGAP5 RopGAP2 RopGAP3 SMQLSYDSRGNCVPTILLLMQNCLYSQGGLQAEGIFRLTAENSEEEAVREQLNRGFIPER SMQLSYDTRGNIVPTILLMMQSHLYSRGGLRVEGIFRINGENGQEEYIREELNKGIIPDN SMQLSYDSRGNCVPVILLLLQSRLYDQGGLQAEGVFRITGENSEEEFVREQLNKGIIPDG SMQCSYDEKGNSVPTILLLMQERLYSQQGLKAEGIFRINPENSQEEHVRDQLNRGIVPEN SMQCSYDDRGNSVPTILLRMQKRLYTEGGLKAEGIFRINPDNGKEEHVRRQLNCGVVPRG *** *** :** **.*** :*. ** . **:.**:**:. :*.:** :* :** *.:* 225 201 195 182 213 RopGAP1 RopGAP4 RopGAP5 RopGAP2 RopGAP3 IDVHCLAGLIK-----AWFRELPTSVLDSLSPEQVMQCQTEEENVELVRLLPPTEAALLD IDVHCLASLIK-----AWFRELPSGVLDSLSPEQVMESESEDECVELVRLLPSTEASLLD IDVHCLAGLIKVLVVIAWFRELPRGVLDPLPSEQVMQCESDEDFVKVVRLLPQTEASLLN IDVHCLAGLIK-----AWFRELPSGVLDGLSPEEVLNCNTEDESVELIKQLKPTESALLN IDVHCLAGLIK-----AWFRELPTGVLDVLTPEQVMRCNTEEDCSRLVILLPPVESAILD *******.*** ******* .*** *..*:*:..::::: .:: * .*:::*: 280 256 255 237 268 RopGAP1 RopGAP4 RopGAP5 RopGAP2 RopGAP3 WAINLMADVVQYEHLNKMNSRNIAMVFAPNMTQMDDPLTALMYAVQVMNFLKTLIEKTLR WAINLMADVVEMEQLNKMNARNIAMVFAPNMTQMLDPLTALMYAVQVMNFLKTLIVKTLK WAINLMADVIQFEHVNKMNSRNLALVFAPNMSQMADPLTALMYAVQVMKLLKSLTEKTVR WAVDLMADVVEEEESNKMNARNIAMVFAPNMTQMTDPLTALMHAVQVMNLLKTLITKTLA WAIGLMADVVEHEQFNKMNARNVAMVFAPNMTQMADPLTALIHAVQVMNFLKTLILMNLK **:.*****:: *. ****:**:*:******:** ******::*****::**:* .: 340 316 315 297 328 RopGAP1 RopGAP4 RopGAP5 RopGAP2 RopGAP3 ERQDSVVEQAHAFPLEPSDESGHQSPSQSLAFNTSEQSEET------QSDNIENAENQSS DRKESRDKLVPASNPSPRDHNGDQSSSRQLLHLMKANKEET------LDNFEAEMKDKEE EREASSSVVDRRCSKEAED--GEKEKDNEEEEEDEEEEEEE------EDEDEDEEEEGDG EREENATGSEGYSPSHSSNSQTDSDSDNAQDMEVSCESQAT----------DSECGEEEE ERE-NADAKARWLKKQTSDPSEEWESQHSEILSPEKPNNNNPKFLRVATLCRLEADNEEE :*: . . : . . .. . .: : : . 394 370 367 347 387 RopGAP1 RopGAP4 RopGAP5 RopGAP2 RopGAP3 SSEISDELTLENNACEQRETDFGKYRTGRLSDSSQQVVLNLDPPAQWPVGRTKGLTNLSR SADEEEEECAES-------VELVDIKKSSLVNNSSGGFGQKHIGWEEQRTMSKASSIVGR VYIIKEEEASEIIK-----VVADEHKSGSIKSEFEG------------SSATDSKGDNGV VEEVEQHQEHLSRHS----THEDETDIGSLCSIEKCFLNQLNNNAARVSNTSISEDWSPK FWNIKKRNDHEGVLD----TSSGNGNIGPVQRLCKHPLFQLSKSTKKAFVSNRDEGRKGR ... . . . : . . 454 423 410 403 443 RopGAP1 RopGAP4 RopGAP5 RopGAP2 RopGAP3 ---------VGSRVERTEAWR ---------VNYRVELFEAWR ---------VQPPICSSNP-AFPLVSFTENKSNTLSSSTSD --------EAWSSRLSSLPW. 466 435 420 424 455 Abbildung 1.13: Alignment der Aminosäuresequenzen der CRIB-Motiv-enthaltenden RopGAPs aus A. thaliana. Das CRIB-Motiv, die putative SH3-Bindestelle sowie die katalytisch wirksame GAP-Domäne sind stark konserviert. Blau: CRIB- (Cdc42/Rac interactive binding) Motiv; grün: SH3-Bindestelle; rot: konservierter Bereich der GAP-Domäne; fett: putativer Argininfinger. *: alle Aminosäuren identisch; :: konservierte Substitutionen; .: semi-konservierte Substitutionen. 1 Einleitung 30 Das CRIB-Motiv ist aus Effektoren von Cdc42 und Rac –wie WASP und PAK– bekannt, bei denen es die spezifische Bindung an aktiviertes Cdc42 bzw. Rac vermittelt (Cotteret und Chernoff 2002, Burbelo et al. 1995). Nach dem CRIB-Motiv wird die entsprechende Domäne von RopGAP CRIB-Domäne genannt. CRIB-Proteine aus Säugern treten mit GAPs in Konkurrenz und können dadurch die GAP-Aktivität inhibieren (Zhang et al. 1997). Die Kombination von CRIB- und GAP-Domäne ist einzig in pflanzlichen RopGAPs beschrieben und stellt möglicherweise einen vollkommen neuen Regulationsmechanismus dar. WASP besitzt neben der CRIB-Region ebenfalls eine Sequenz, die vermutlich SH3-Domänen bindet (Derry et al. 1994). Eine solche Bindestelle ist außerdem aus humanem p50RhoGAP bekannt (Lancaster et al. 1994). Die N- und C-terminalen Regionen der RopGAPs außerhalb der konservierten Domänen sind sehr variabel und vermitteln vermutlich funktionelle Spezifität (Wu et al. 2000). Über den genauen Mechanismus der Regulation der Hydrolyseaktivität von Rop durch RopGAPs ist erst wenig bekannt. Alle RopGAPs besitzen drei konservierte Argininreste innerhalb der GAP-Domäne. Auf Grund von Alignments mit p190RhoGAP, p50RhoGAP und RasGAP ist wahrscheinlich ein Argininrest (Arg159 in RopGAP2) der entsprechende Arginin-Finger, wie er aus RasGAPs und RhoGAPs bekannt ist (Scheffzek et al. 1997, Donovan et al. 2002). Demzufolge ist ein ähnlicher Mechanismus der Katalyse durch die GAP-Domäne der RopGAPs anzunehmen. Einzig A.t. RopGAP1 wurde bislang biochemisch charakterisiert. In vitro-Analysen mit RopGAP1 haben gezeigt, dass es spezifisch für Rops ist und es die Hydrolyseaktivität von Rop1 deutlich stimuliert. Die Aktivität von RopGAP1 sowie die Bindung an Rop werden sowohl durch eine Deletion der CRIB-Domäne als auch durch die Mutation H125Y im CRIB-Motiv drastisch reduziert. Es wird diskutiert, dass die CRIB-Domäne an den Übergangszustand des G-Proteins während der Hydrolyse bindet (Wu et al. 2000). In vivo-Studien zufolge ist das CRIB-Motiv außerdem wichtig für die Lokalisation von A.t. RopGAP1 an der apikalen Region in Pollenschläuchen und für die Rop-gesteuerte Signalkaskade zur Kontrolle des Spitzenwachstums von Pollenschläuchen (Yang 2002). Drei andere RopGAPs aus A. thaliana enthalten außer der GAP-Domäne eine PH- (Pleckstrin homology) Domäne (Gu et al. 2004). Weitere Informationen über diese RopGAP-Gruppe liegen zur Zeit jedoch noch nicht vor. 1 Einleitung 31 1.5.3 Regulation durch Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitoren Die Rho-Proteine der Säuger unterliegen zusätzlich einem dritten Regulationsmechanismus durch Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitoren (GDIs). RhoGDIs kontrollieren durch ihre Bindung an den C-Terminus der Rho-Proteine die Verteilung der Proteine im Zytosol und an der Plasmamembran. Die zytosolisch lokalisierten Proteine binden präferentiell an GDPgebundene Rho-Proteine und entfernen durch die Maskierung des C-terminalen Isoprenylrest die G-Proteine von der Plasmamembran (Olofsson 1999, Etienne-Manneville und Hall 2002). Dadurch reduzieren die GDIs den Nukleotidaustausch durch die membranassoziierten RhoGEFs (Abbildung 1.14). Abbildung 1.14: Regulation der Rho-Proteine. Die Rho-Proteine wechseln zwischen dem aktiven, GTPgebundenen und dem inaktiven, GDP-gebundenen Zustand. Dabei wird die Aktivierung und Inaktivierung durch GEFs und GAPs reguliert. In der aktivierten Form übermitteln die Rho-Proteine das extrazelluläre Signal an Effektormoleküle, die die Zellantwort bestimmen. GDIs verhindern die Reaktivierung durch GEFs, indem sie die Rho-Proteine von der Plasmamembran, dem Ort ihrer Aktivierung und Wirkung, entfernen. Verändert nach Etienne-Manneville und Hall 2002. In Arabidopsis thaliana wurden drei RopGDIs gefunden, die grosse Sequenzübereinstimmung mit RhoGDIs aus Säugern aufweisen (Bischoff et al. 2000). Auch aus Tabak wurde die cDNA für ein verwandtes Protein kloniert (Kieffer et al. 2000). AtRhoGDI1 wird in allen Geweben der Pflanze exprimiert und ist spezifisch für Rops. Es spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der Rop-Rekrutierung an die Plasmamembran (Bischoff et al. 2000). Überexpression von RopGDI1 entfernt GFP-Rop1 von der Plasmamembran und wirkt damit den durch Rop1-Überexpression herbeigeführten Effekten entgegen (Yang 2002). Des Weiteren gibt es Anzeichen dafür, dass ein RopGDI in die Regulation der Lokalisation von Rop2 an speziellen Regionen der Plasmamembran involviert ist (Fu et al. 2002, Jones et al. 2002). 1 Einleitung 1.6 32 Potentielle Rop-Effektoren – genannt RICs Die Definition der Effektorproteine besagt, dass sie bevorzugt an die GTP-gebundene Form der G-Proteine binden und durch diese Bindung aktiviert werden. Im aktivierten Zustand leiten sie daraufhin das Signal weiter. In Säugerzellen gibt es mehr als zwanzig potentielle Effektoren, die an aktiviertes Cdc42 binden (Bishop und Hall 2000). Eine ähnliche Anzahl wird durch aktiviertes Rho und Rac rekrutiert (van Aelst und D'Souza-Schorey 1997). Die meisten Effektoren gehören zu den Familien der PAKs (p21-aktivierte Kinasen), WASPs (Wiskott-Aldrich-Syndrom-Proteine) / WAVEs (WASP familiy Verprolin homologous protein), zu den Forminen, Lipid-Kinasen oder IQGAPs (Cotteret und Chernoff 2002). Effektoren von tierischem Rac und Cdc42 besitzen oft eine spezielle G-Protein-Bindestelle, die ein CRIB- (Cdc42/Rac interactive binding) Motiv enthält (Burbelo et al. 1995). Dazu gehören u.a. die aktivierte Cdc42-assoziierte Tyrosinkinase (ACK), WASP und PAK (Manser et al. 1993, Machesky und Insall 1998, Abo et al. 1998, Cotteret und Chernoff 2002). Bei diesen Effektoren ist das Vorhandensein des CRIB-Motivs notwendig für die Bindung des GProteins (Rudolph et al. 1998). Das CRIB-Motiv umfasst 14 bis 16 zum Teil hoch konservierte Aminosäuren mit der Konsensussequenz ISXPX2-4FXHXXHVG (Burbelo et al. 1995). Viele Effektoren der Rho-Proteine interagieren mit dem G-Protein über ihre REMDomäne (Rho effector homology) oder RKH-Domäne (ROK-Kinektin homology) (Flynn et al. 1998). Anstelle der bekannten CRIB-Effektoren WASP und PAK, die in Pflanzen nicht vorhanden sind, wurde in A. thaliana eine neue Familie von CRIB-Proteinen entdeckt, die Ropinteractive CRIB motif-containing proteins, kurz: RICs. Die elf publizierten Proteine dieser Familie sind im Bereich ihres CRIB-Motivs stark konserviert, während die Regionen außerhalb der CRIB-Region nur leichte Sequenzübereinstimmungen zeigen und keine weiteren Homologien zu bekannten Proteinen aufweisen. Außer dem CRIB-Motiv enthalten einige RICs noch ein Motiv mit der Konsensussequenz PSWMXDFK, das aus keinem anderen Proteinen bekannt ist (Wu et al. 2001). RICs sind auch in weiteren Pflanzenarten gefunden worden, allerdings nicht in anderen Lebewesen. Die RICs aus A. thaliana werden auf Grund ihrer Sequenzübereinstimmung in fünf Gruppen eingeteilt (Wu et al. 2001) (Tabelle 1.8). Durch in vitro-Interaktionsanalysen wurde gezeigt, dass RICs direkt und spezifisch mit GTPgebundenem Rop1 interagieren (Wu et al. 2001). Die Mutationen H37D und H37D/H40D im CRIB-Motiv schwächen die Interaktion erheblich. Demzufolge ist das CRIB-Motiv 1 Einleitung 33 verantwortlich für die Rop-Bindung. Überexpression der RICs in Tabak-Pollenschläuchen führt zu unterschiedlichen Phänotypen und subzellulären Lokalisationsmustern, die teilweise abhängig von gleichzeitiger Rop1-Expression sind (Tabelle 1.8) (Wu et al. 2001). Eine solche Abhängigkeit deutet darauf hin, dass beide Proteine im selben Signalweg wirken. So wurde vorgeschlagen, dass RIC1, RIC3 und RIC4 Effektoren von Rop1 sein könnten und in die Kontrolle des Pollenschlauchwachstums involviert sind, während RIC9 der Effektor eines anderen Rops sein könnte (Keenan et al. 2001). Auch die Expressionsmuster der RICs in verschiedenen Geweben sind unterschiedlich: Die meisten RICs werden in mehreren Geweben exprimiert; einige jedoch ausschließlich in der Blüte (Wu et al. 2001). Da die RICs keine erkennbare funktionelle Gruppe besitzen, wurde postuliert, dass sie als Adapterproteine fungieren, die Rops mit ihren spezifischen Effektoren zusammenbringen. Sie komplettieren auf diese Weise Effektoren, die keine Rop-Bindedomäne besitzen. Möglicherweise agieren einige RICs in der Regulation der Organisation und der Dynamik des Zytoskeletts (Gu et al. 2004). Tabelle 1.8: Eigenschaften der Rop-interactive CRIB motif-containing proteins aus A. thaliana nach Wu et al. 2001. N: N-terminal gelegen; C: C-terminal gelegen; +: vorhanden; ++: deutlich; +++: stark; -: nicht vorhanden / kein Effekt; ÜE: Überexpression; ↓: gehemmt; ↑: verstärkt; #: unpolarisiert; APM: apikale Plasmamembran; Zy: zytoplasmatisch; GPM: gesamte Plasmamembran; SK: subkortikal A: apikal; SA: subapikal; °: nicht analysiert. RIC 9 10 11 6 7 8 1 3 5 2 4 Gruppe I I I II II II III III IV V V Aminosäuren 128 156 116 203 212 190 224 220 193 167 153 CRIB-Anordnung N N N N N N N N N C C + + + + + + + + + PSWMXDFK-Motiv + + + MKMKGI/LYKG/SFK-Motiv Interaktion mit Rop1 in vitro ++ ° ° + +++ ° +++ ° +++ ++ +++ ubiquitäre Expression + + + + + blütenspezifische Expression + + + Expression in Pollen + + + + + + + + + Effekt der RIC-ÜE auf ↓ ↑ ° ↓ ↓ ° ↓ # ↓ ↓ # Pollenschlauchwachstum Effekt der RIC-ÜE auf Rop1↓ ° ° ↓ ↑ ↓ ↑ Phänotyp RIC-Lokalisierung GPM Zy ° APM APM ° APM Zy APM APM APM Effekt der Rop1-ÜE auf RIC° GPM GPM ° ↑ SK ↑ A+SA Lokalisierung 2 Problemstellung 34 2 Problemstellung Als Mitglieder der Rho-Familie kleiner G-Proteine fungieren die pflanzlichen Rops (Rho of plants) als molekulare Schalter, die Signalwege im GDP-gebundenen Zustand ab- und im GTP-gebundenen Zustand einschalten. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Aktinzytoskeletts, der Entwicklung der Zellpolarität, dem Zellwachstum, der Morphogenese, bei Hormonreaktionen und bei der Pathogenabwehr (Li et al. 1998, Winge et al. 2000, Zheng und Yang 2000b, Molendijk et al. 2001, Jones et al. 2002). Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch noch nahezu unverstanden. Es wird postuliert, dass Rops in einer einzigartigen, pflanzenspezifischen Weise reguliert werden. Die Inaktivierung von Rops erfolgt durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) mit einer ungewöhnlichen Primärstruktur. RICs (Rop-interactive CRIB motif-containing proteins) sind kleine Proteine mit einem konservierten CRIB-Motiv, die als mögliche Effektoren von Rops gelten. Es wurde vorgeschlagen, dass sie in die Regulation des Aktinzytoskeletts miteinbezogen sind, aber es ist noch vollkommen unverstanden, auf welche Weise sie wirken. Ziel dieser Arbeit war es, die biochemischen Aspekte der Rop-Regulation durch RopGAPs zu veranschaulichen und die Funktion von Rops im Signalweg zum Aktinzytoskelett weiter aufzuklären. Im Detail bedeutete dies, das aus Arabidopsis thaliana stammenden GNBP Rop4 und seinen Regulator RopGAP2 biochemisch zu charakterisieren. Des weiteren galt es herauszufinden, auf welche Weise diese beiden Proteine miteinander interagieren und sich in ihrer Aktivität beeinflussen. Insbesondere waren die Fragen zu klären, welche Funktion die CRIB-Domäne von RopGAP2 hat und wie sie die GAP-Aktivität des Proteins beeinflusst. Um die Kontrolle der Regulation der Aktinpolymerisierung durch Rops zu erforschen, sollte ihr Effekt auf das Aktinzytoskelett im Vergleich zu den gut erforschten Rho-Proteinen der Säuger untersucht werden. Dabei war die Aufklärung der Funktion der RICs und die Charakterisierung der Interaktion von Rops mit RICs ein entscheidender Punkt. 3 Material und Methoden 35 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Geräte Analysenwaage Begasungsbrutschrank biolistischer DNA-Transferapparat (PDS-1000) DNA-Gelelektrophoresekammer ESI-MS Fast-Blot-Apparatur Power Pack P25 Fluoreszensspektrometer (LS 50 B) Fluoreszensspektrometer (FluoroMax-2) FPLC Gelkammern Hoefer HPLC (System Gold 166) Inkubator HAT Konfokales Mikroskop (TCS-SP2) Sartorius (Göttingen) Nuaire (Plymouth, UK) Biorad (München) Werkstatt MPI Dortmund Finnigan (San Jose, USA) Biometra (Göttingen) Perkin Elmer (Überlingen) ISA Instruments (Stanmore, UK) Amersham Pharmacia (Freiburg) Amersham Pharmacia (Freiburg) Beckman (München) Infors GmbH (Übach Palenberg) Leica Microsystems GmbH (Heidelberg) Konfokales Mikroskop (DMRE) Leica Microsystems GmbH (Heidelberg) Kühlbare Tischzentrifuge (5417R) Eppendorf (Hamburg) Leuchttisch (NU-72) Faust (Schaffhausen, CH) Luminometer (Lumat VB9501) Berthold Technologies (Bad Wildbad) Magnetrührer RCT basic IKA Labortechnik (Staufen) Neubauer-Zählkammer Brand (Melsungen) PAGE-Kammern cti (Idstein) PCR-Gerät Eppendorf (Hamburg) pH-Meter (PerpHect LogRmeter model 320) Orion Research (Boston, USA) Photometer BioPhotometer Eppendorf (Hamburg) Pipetten Gilson (Abimed, Langenfeld) Präzisions-Quarzküvetten Hellma (Mühlheim) Rotoren (JA 10-17, 30.50) Beckman (München) Spannungsquellen (Power Pac 300) BioRad (München) Speed Vac (Concentrator 5301) Eppendorf (Hamburg) Sterile Werkbank Nuaire (Plymouth, UK) stopped-flow (SX16MV) Applied Photophysics (Surrey, UK) Thermomixer (5436) Eppendorf (Hamburg) Tischzentrifuge (Biofuge 13) Kendro (Hanau) UV/VIS-Spektralphotometer UVIKON 933 Kontron (Neufahrn) Ultraschallgerät (450) Branson Sequenzierer (ABI PRISM 3700 DNA Analyzer) Applied Biosystems (Langen) Vakuum-Membranpumpe Ilmvac GmbH (Ilmenau) Zentrifugen (J2-HC, J2-HS und Avanti30) Beckman (München) 3 Material und Methoden 36 3.1.2 Kit-Systeme BigDye Terminator-Kit CellFECTIN-Kit Galacto-Star-Kit ECL Plus Chemolumineszenz-Kit LipofectAMINE PLUS-Reagenz QIAGEN Plasmid Maxi-Kit QIAGEN HiSpeed Plasmid Midi-Kit QIAprep Spin Miniprep-Kit QIAprep Spin Gel Extraction-Kit QIAGEN Plasmid Giga-Kit QIAprep Spin PCR Purification-Kit QIAGEN Plasmid Giga-Kit Applied Biosystems (Langen) Invitrogen (Karlsruhe) Tropix (Bedford, USA) Amersham Pharmacia (Freiburg) Invitrogen (Karlsruhe) Qiagen (Hilden) Qiagen (Hilden) Qiagen (Hilden) Qiagen (Hilden) Qiagen (Hilden) Qiagen (Hilden) Qiagen (Hilden) 3.1.3 Verbrauchsmaterialien Microcarrier-Membran Multiwellplatten (Falcon) Nap-5 Säulen Nitrozellulosemembran Hybond-S super Pipettenspitzen, Zentrifugenröhrchen (Falcon) und Kulturröhrchen PVDF-Membran Reaktionsgefäße Röntgenfilme Sterile Einmal-Pipetten Sterilfilter Vivaspin-Röhrchen Whatman -Papier (3 mm) Zellkulturflaschen und -schalen (Falcon) Biorad (München) Becton Dickinson (Heidelberg) Amersham Pharmacia (Freiburg) Amersham Pharmacia (Freiburg) Becton Dickinson (Heidelberg) Roche Diagnostics (Mannheim) Eppendorf (Hamburg) Kodak (New Haven, USA) Becton Dickinson (Heidelberg) Schleicher &Schüll (Dassel) Vivascience Schleicher & Schüll (Dassel) Becton Dickinson (Heidelberg) 3.1.4 Chemikalien und Biochemikalien 3.1.4.1 Chemikalien Acrylamidlösung Agarose Bradford-Reagenz Coomassie Brilliant Blue Chloroquin Diethylaminoethyl-Dextran (DEAE-Dextran) Dimethylsulfoxid (DMSO) 1,4-Dithioerythritol (DTE) Entwickler/Fixierer für Röntgenfilme Ethidiumbromid Formaldehyd Applichem (Darmstadt) Life Technologies (Karlsruhe) Biorad (München) Serva (Heidelberg) Sigma Aldrich (Deisenhofen) Sigma Aldrich (Deisenhofen) Serva (Heidelberg) Gerbu (Gaiberg) Agfa (Köln) Serva (Heidelberg) Roth (Karlsruhe) 3 Material und Methoden Glutathion Goldpartikel Imidazol Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) Oligonukleotide Ponceau S-Färbelösung Natriumdodecylsulfat (SDS) 37 Merck (Darmstadt) Biorad (München) Merck (Darmstadt) Gerbu (Gaiberg) MWG (Ebersberg) Sigma Aldrich (Deisenhofen) Gerbu (Gaiberg) Alle weiteren Chemikalien wurden im höchsten erhältlichen Reinheitsgrad von den Firmen Aldrich, Fluka, Merck, Roth, Serva, Riedel de Haen, ICN und Sigma Aldrich bezogen. 3.1.4.2 Säulenmaterialien GSH-Sepharose fast flow Ni-NTA-Agarose Hi-LoadTM Superdex 75 und 200 Amersham Pharmacia (Freiburg) Qiagen (Hilden) Amersham Pharmacia (Freiburg) 3.1.4.3 Nukleotide Guanosin-5’-β,γ-imidotriphosphat (GppNHp) Guanosin-5’-β,γ-methylentriphosphat (GppCH2p) Guanosintriphosphat (GTP) 3’-O-(N-Methylanthraniloyl)Guanosindiphosphat (mant-GDP) 3’-O-(N-Methylanthraniloyl)-Guanosin5’-β,γ-imidotriphosphat (mant-GppNHp) Sigma Aldrich (Deisenhofen) Sigma Aldrich (Deisenhofen) Sigma Aldrich (Deisenhofen) Jena Biosciences (Jena) Jena Biosciences (Jena) 3.1.4.4 Protease-Inhibitoren Aprotinin (2 mg/ml) Benzamidin (78 mg/ml) Leupeptin (1 mg/ml) Pepstatin (0,7 mg/ml) Pefabloc (5 mg/ml) Merck (Darmstadt) Merck (Darmstadt) Merck (Darmstadt) Merck (Darmstadt) ICN Biochemicals (Eschwege) Die Protease-Inhibitoren wurden in der angegebenen Konzentration als Stammlösung bei 20°C gelagert. Protease-Inhibitoren-Cocktail „complete“ Roche Diagnostics (Mannheim) 3 Material und Methoden 38 3.1.4.5 Antibiotika Tabelle 3.1: Einsatz von Antibiotika. Antibiotikum gelöst in Ampicillin Chloramphenicol Kanamycin Zeozin Tetrazyklin H2O Ethanol H2O H2O H2O Stammlösung 100 mg/ml 25 mg/ml 25 mg/ml 25 mg/ml 25 mg/ml verwendete Konzentration 100 mg/l Medium 25 mg/l Medium 50 mg/l Medium 50 mg/l Medium 25 mg/l Medium Von den verwendeten Antibiotika wurden Stammlösungen angesetzt, die sterilfiltriert und bei -20°C gelagert wurden. 3.1.4.6 Enzyme Alkalische Phosphatase Rinder-Serum-Albumin (Fraktion V) DNAse I Lysozym Pfu DNA-Polymerase Phosphodiesterase Precisionprotease Restriktionsendonukleasen Alkalische Phosphatase aus shrimps (SAP) T4 DNA-Ligase Taq DNA-Polymerase Roche Diagnostics (Mannheim) Sigma Aldrich (Deisenhofen) Roche Diagnostics (Mannheim) Serva (Heidelberg) Stratagene (Amsterdam, NL) Sigma Aldrich (Deisenhofen) Max-Planck-Institut (Dortmund) New England Biolabs (Beverly, USA) Roche Diagnostics (Mannheim) New England Biolabs (Beverly, USA) Qiagen (Hilden) 3.1.4.7 Antikörper und Konjugate Tabelle 3.2: Primäre Antikörper. 1: Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund. Bezeichnung Organismus, Typ eingesetzte Hersteller Verdünnung anti-Flag Maus IgG 1:200 Sigma Aldrich (Deisenhofen) anti-Myc Maus IgG 1:10 Roche Diagnostics (Mannheim) anti-GFP Kaninchen IgG 1:1000 ABR (Golden,USA) anti-LexA Kaninchen IgG 1:500 Invitrogen (Karlsruhe) anti-VP16 Kaninchen IgG 1:500 Clontech (Heidelberg) anti-GST Maus IgG 1:1000 U. Herbrand1 anti-His6 Kaninchen IgG 1:500 Santa Cruz (Heidelberg) Zum Nachweis von F-Aktin wurde mit Tetramethyl-Rhodamin-Isothiocyanat (TRITC) gekoppeltes Phalloidin der Firma Sigma Aldrich als 1:500-Verdünnung eingesetzt. 3 Material und Methoden Tabelle 3.3: Sekundäre Antikörper. Spezifität, Organismus Konjugat Ziege anti-Maus IgG Alexa-Fluor®488 Kaninchen anti-Maus IgG Alexa-Fluor®488 Schaf anti-Maus IgG, biotinyliert Esel anti-Kaninchen IgG Meerettich-Peroxidase 39 Verdünnung 1:2000 1:3000 1:2000 1:2500 Firma Molecular Probes (Göttingen) Molecular Probes (Göttingen) Amersham Pharmacia (Freiburg) Amersham Pharmacia (Freiburg) Zur Detektion von Proteinen, die bereits mit einem Erstantikörper und mit dem biotinylierten Schaf anti-Maus-Zweitantikörper inkubiert wurden, wurde der Streptavidin-MeerettichPeroxidase (biotinyliert)-Komplex (Amersham Pharmacia, Freiburg) in einer 1:2000Verdünnung eingesetzt. 3.1.4.8 Protein- und Nukleinsäure-Grössenstandards DNA-Standard: 1 kb-Leiter Protein-Standard: LMW-Marker Invitrogen (Karlsruhe) Amersham Pharmacia (Freiburg) 3.1.5 Standardpuffer Gebrauchslösungen wurden stets frisch angesetzt oder von einer Stammlösung frisch verdünnt. Die benötigten Chemikalien wurden in Aqua bidest gelöst und nach Bedarf autoklaviert oder sterilfiltriert. PBS: 137 2,7 10,2 1,8 mM mM mM mM NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 TE-Puffer (10x): 100 10 mM mM Tris EDTA TAE-Puffer: 40 1,14 1 mM ml/l mM Tris Essigsäure EDTA TBST-Puffer: 150 0,1 20 mM % mM NaCl (v/v) Tween 20 Tris HCl pH 7,4 3.1.6 Nährmedien Nährmedien wurden bei 121°C und 1 bar autoklaviert und bei 4°C gelagert. pH 7,8 pH 8,5 3 Material und Methoden 40 3.1.6.1 Medien zur Anzucht von Escherichia coli Luria-Bertani- (LB) Vollmedium: 10 10 5 g/l g/l g/l Bacto-Tryptone NaCl Hefe-Extrakt LB-Festagarplatten: 10 10 5 15 g/l g/l g/l g/l Bacto-Tryptone NaCl Hefe-Extrakt Bacto-Agar Terrific Broth-Vollmedium: 12 24 0,4 2,3 12,5 g/l g/l % g/l g/l Bacto-Tryptone Hefe-Extrakt (v/v) Glycerin KH2PO4 K2HPO4 Standard I-Medium: 25 g/l Standard-Fertigmedium (Merck, Darmstadt) Der pH-Wert der Medien wurde mit NaOH auf 7,2 eingestellt. Nach dem Autoklavieren wurden sterilfiltrierte Antibiotika bis zur gewünschten Konzentration hinzugegeben. 3.1.6.2 Medien zur Anzucht von Hefe YPD-Medium: 20 10 40 g/l g/l ml/l Bactopepton E Hefe-Extrakt 50 % (w/v) Glukose Minimalmedium: 1,2 g/l 5 10 6 0,1 0,05 g/l g/l g/l g/l g/l Hefe Nitrogen-Extrakt ohne Aminosäuren oder Ammoniumsulfat Ammoniumsulfat Succinat NaOH Adenin, Arg, Cys, Leu, Lys, Thr, Trp, Ura Asp, His, Ile, Met, Phe, Pro, Ser, Tyr, Val je je Selektionsmedium UTL: Minimalmedium ohne Ura, Trp, Leu Zum Nachweis von β-Galaktosidaseaktivität in Hefen wurden dem UTL-Medium 80 mg/l 5Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid (X-Gal) zugesetzt. In diesem Fall wurde das Medium mit Phosphatpuffer (s.u.) anstelle von Wasser angesetzt. Dieser sorgt dafür, dass das Medium einen pH-Wert von 7,0 konstant hält; dies ist der optimale pH-Wert für die βGalaktosidase. Selektionsmedium THULLY: Minimalmedium ohne Ura, Trp, Leu, Lys, His mit 25 mM 3-Aminotriazol 3 Material und Methoden 20 x Phosphatpuffer: 41 93 69 g/l g/l Na2HPO4*2H2O NaH2PO4*H2O pH 7,0 Festagarplatten wurden durch Zusatz von 15 % (w/v) Agar zum Medium hergestellt. 3.1.6.3 Medien zur Anzucht von Insektenzellen Grace’s-Medium TC10-Medium Fötales Kälberserum (FCS) Invitrogen (Karlsruhe) Invitrogen (Karlsruhe) Invitrogen (Karlsruhe) Für 10 l TC10-Medium (Invitrogen) wurde eine Dose TC10-Medium in 9,5 l A. bidest gelöst. Der pH-Wert wurde mit 25 % (v/v) HCl auf 5,0 – 5,04 eingestellt, und 3,5 g NaHCO3 wurden zugegeben. Dann wurde der pH-Wert mit 10 N KOH auf den Wert 6,2 eingestellt. Dabei wurde die Lösung klar und hatte dann eine Osmolarität von ca. 280 mOsmol. Das Volumen wurde mit A. bidest auf 10 l aufgefüllt, und das Medium wurde über Papierfilter und anschließend über Sterilfilter filtriert. 3.1.6.4 Medien zur Anzucht von Säugerzellen Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Trypsin/EDTA Fötales Kälberserum (FCS) Neugeborenen-Kälberserum (NCS) Penicillin/Streptomycin (10000 units/ml PenicillinG, 10000µg/ml Streptomycinsulfat) Invitrogen (Karlsruhe) Invitrogen (Karlsruhe) Invitrogen (Karlsruhe) Invitrogen (Karlsruhe) Invitrogen (Karlsruhe) 3.1.7 Vektoren pET28 a(+) pGEX-4T-1 pGEX-5X-1 pFastBac HT B pIZ/V5-His pcDNA3Flag pEGFP-C1 pSP-EYFP pSP-ECFP pBTM116 pVP16 Novagen (Darmstadt) Amersham Pharmacia (Freiburg) Amersham Pharmacia (Freiburg) Invitrogen (Karlsruhe) Invitrogen (Karlsruhe) Invitrogen (Karlsruhe) Clontech (Heidelberg) Stephan Pollmann (Lehrstuhl für Pflanzen physiologie, Ruhr-Universität Bochum) Stephan Pollmann (Lehrstuhl für Pflanzen physiologie, Ruhr-Universität Bochum) Bartel et al. 1993 Hollenberg et al. 1995 3 Material und Methoden 42 3.1.8 Oligonukleotide Alle verwendeten Oligonukleotide wurden, soweit nichts anderes angegeben ist, von der Firma MWG Biotech (Ebersberg) in einer Konzentration von 100 pmol/µl hergestellt. Die Sequenzen sind in Tabelle 3.4 aufgeführt. Tabelle 3.4: Oligonukleotide. Name Rop1AtG15V s Rop1AtG15V as Rop2G14V s Rop2G14V as Rop3G15V s Rop3G15V as Rop4 G15V s Rop4 G15V as Rop4 T20N s Rop4 T20N as Rop5G15V s Rop5G15V as Rop6G15V s Rop6G15V as Rop1 1M BamHI s Rop1 1M +2 BamHI s Rop1dC EcoRI as Rop2 s+2 1M BamHI Rop2dC EcoRI as Rop3 s+2 1M BamHI Rop3dC EcoRI as Rop4 1M BamHI s Rop4 1M SphI s Rop4 1M BamHI +1 s Rop4 1M XhoI +1 s Rop4 180P EcoRI as Rop4 180P XhoI as Rop4 196 BamHI as Rop4 196 EcoRI as Rop5 s +2 1M BamHI Rop5dC EcoRI as Rop6 s +2 1M BamHI Rop6dC EcoRI as RopGAP2 1M pIZ EcoRI s RopGAP2 1M BamHI s RopGAP2 1M BamHI +1 s RopGAP2 21E BamHI s RopGAP2 70E BamHI s RopGAP2 114V BamHI s RopGAP2 132G EcoRI as RopGAP2 132G XhoI as RopGAP2 133N BamHI s RopGAP2 298E EcoRI as RopGAP2 298E XhoI as RopGAP2 299E BamHI s RopGAP2 334S XhoI as Sequenz 5’ – 3’ gcgtgacggttggtgatgtagctgtcggaaaaac gtttttccgacagctacatcaccaaccgtcacgc ccgtcggagatgttgccgtcggaaaaacttg caagtttttccgacggcaacatctccgacgg caccgttggcgacgtagctgttggtaaaacc ggttttaccaacagctacgtcgccaacggtg caccgtcggcgatgttgccgtcggaaaaac gtttttccgacggcaacatcgccgacggtg gatggtgccgtcggaaaaaattgtatgctgatttctt gtaagaaatcagcatacaattttttccgacggcacca gtcaccgttggtgatgtagctgttggtaaaacctg caggttttaccaacagctacatcaccaacggtgac gtcactgtcggcgacgttgctgttggaaagac gtctttccaacagcaacgtcgccgacagtgac cgcggatccatgagcgcttcgaggttcgtaaag cgcggatccccatgagcgcttcgaggttcgtaaag ccggaattctcacggttgcaacaccactcggatg cgcggatccccatggcgtcaaggtttattaagtgtg ccggaattctcatggctgaagcaccacttttatagc cgcggatccccatgagcgcttcgaggttcataaag ccggaattctcaaggttgaagaaccactcggatc cgcggatccatgagtgcttcgaggtttataaagt acatgcatgcaaatgagtgcttcgaggtttataaagt cgcggatccccatgagtgcttcgaggtttataaagt ccgctcgagatgagtgcttcgaggtttataaagt ggcgaattctcatggctgaagcaccacttttatgg ccgctcgagtcatggctgaagcaccacttttatgg cgcggatcctcacaagaacacgcagcggttct ccggaattctcacaagaacacgcagcggttcttg cgcggatccccatgagcgcatcaaggttcataaag ccggaattctcaaggttgaaggaccactctgatcg cgcggatccccatgagtgcttcaaggtttatcaagtg ccggaattctcatggctggagaacgaccttgatag ccggaattcatcatgggcatgactaaaggcggaggttgcgg cgcggatccatgactaaaggcggaggttgcg cgcggatccccatgactaaaggcggaggttgcg cgcggatccgaggaggaagaagaagaagagcag cgcggatccatggagatcggttggccaacaaatg cgcggatccatggtgagtgtgtttggtgtatcggc ggcgaattctcatcctttctcatcataagaacattgca ccgctcgagtcatcctttctcatcataagaacattgc cgcggatccatgaacagtgtcccaacgattctattac ggcgaattctcattcagctagtgtctttgtgataaga ccgctcgagtcattcagctagtgtctttgtgataaga cgcggatccatgcgggaagaaaatgctaccggcat ccgctcgagtcattcacagctgacttccatgtcttg 3 Material und Methoden 43 Tabelle 3.4: Oligonukleotide (Fortsetzung). Name Sequenz 5’ – 3’ ccgctcgagtcagctgagatgttcttgatgctgttc RopGAP2 360R XhoI ccgctcgagtcagagttgattcaagaagcatttctct RopGAP2 385L XhoI as tccccgcgggtcgctagtgcttgagctcaaagt RopGAP2 424Z pIZ SacII as ggcgaattctcagtcgctagtgcttgagctcaaag RopGAP2 424Z EcoRI as ccgctcgagtcagtcgctagtgcttgagctcaaag RopGAP2 424Z XhoI as acgcgtcgacttagtcgctagtgctt RopGAP2 424Z SalI as ccgctcgagtcagtggtggtggtggtggtggtcgctagtgcttgagctcaaag RopGAP2 424Z His XhoI as gggggatccatggcgacgacaatgaagg RIC1 BamHI s gggggatcctcagataatatcgttacagg RIC1 BamHI as aagatccatgaaagatcggatggagcg RIC2 s cgcggatccagatccatgaaagatcggatggagcg RIC2 BamHI s aatcagacgacggtgccggtgagatgg RIC2 as ccgctcgagtcagacgacggtgccggtgagatgg RIC2 XhoI as ccggaattctcagacgacggtgccggtgagatgg RIC2 EcoRI as ccggaattcatggcgaccgtgaaaggccttc RIC3 1M EcoRI s ccggaattcttactctttgtcactgatattattatc RIC3 EcoRI as gggatccatgagagatagaatggag RIC4 BamHI s ccgctcgagggagtggattataaagttgg RIC4 XhoI as ccgctcgagggagtggattataaagttgg RIC4 EcoRI as cgcggatccatgacctcacctatgaagggtcta RIC5 BamHI s ccgctcgagtcatcttcctgtagaacttccaaga RIC5 XhoI as ggcgaattctcatcttcctgtagaacttccaaga RIC5 EcoRI as cgcggatccatgaaaagcctcttgaaagggctc RIC6 BamHI s ccgctcgagtcaaaaatcatcttcattgtcgaattg RIC6 XhoI as ggcgaattctcaaaaatcatcttcattgtcgaattg RIC6 EcoRI as cgcggatccatggctacaagattcaaggggctt RIC9 BamHI s ggcgaattcttaagccaggaccttgcttgatct RIC9 EcoRI as ccgctcgagttaagccaggaccttgcttgatct RIC9 XhoI as acgcgtcgacagccaggaccttgcttgatcttg RIC9 SalI as cgcggatccccatgcagacaattaagtgtgttgttg Cdc42 1M BamHI +1 s cgcggatccccatgcaggccatcaagtgtgtgg Rac1 1M BamHI +1 s ggcgaattctcacctcttcttcacgggaggcgg Rac1 184P EcoRI as cgcggatccatgctaacagttgactccgccgtcaag spike1 CDMS BamHI s ccgctcgagtcagatgtaatgggagagttctgcgg spike1 CDMS XhoI as pGEX 5’ Amersham Pharmacia (Freiburg) pGEX 3’ Amersham Pharmacia (Freiburg) 3.1.9 Plasmide 3.1.9.1 Bakterielle Expressionsplasmide Tabelle 3.5: Bakterielle Expressionsplasmide. fl: volle Länge (full length). N: N-terminal; C: C-terminal. 1: Max-Planck Institut für Züchtungsforschung, Köln; 2: Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund. insert Vektor Organismus Fragment Klonierung tag Referenz Rop4 wt pGEX-5X-1 A. thaliana fl N-GST A. Molendijk1 Rop4 wt pET28 a(+) A. thaliana fl N-His A. Molendijk1 Rop4 wt pGEX-4T-1 A. thaliana fl BamHI+NotI N-GST diese Arbeit Rop4 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 1-180 BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit Rop4 G15V pGEX-5X-1 A. thaliana fl BamHI+NotI N-GST diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-5X-1 A. thaliana fl N-GST A. Molendijk1 3 Material und Methoden 44 Tabelle 3.5: Bakterielle Expressionsplasmide (Fortsetzung). fl: volle Länge (full length). N: N-terminal; C: C-terminal. 1: Max-Planck Institut für Züchtungsforschung, Köln; 2: Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund. insert Vektor Organismus Fragment Klonierung tag Referenz RopGAP2 wt pGEX-5X-1 A. thaliana 1-132 N-GST A. Molendijk1 RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana fl EcoRI+NotI N-GST diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 1-298 EcoRI+XhoI N-GST diese Arbeit RopGAP2 wt pET28 a(+) A. thaliana 114-424 BamHI+XhoI N-His diese Arbeit RopGAP2 wt pET28 a(+) A. thaliana 133-424 BamHI+XhoI N-His diese Arbeit RopGAP2 wt pET28 a(+) A. thaliana 21-298 BamHI+XhoI N-His diese Arbeit RopGAP2 wt pET28 a(+) A. thaliana 21-334 BamHI+XhoI N-His diese Arbeit RopGAP2 wt pET28 a(+) A. thaliana 21-360 BamHI+XhoI N-His diese Arbeit RopGAP2 wt pET28 a(+) A. thaliana 21-385 BamHI+XhoI N-His diese Arbeit RopGAP2 wt pET28 a(+) A. thaliana 21-360 BamHI+XhoI N-His diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 21-424 BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 21-298 BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 21-334 BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 21-385 BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 21-424 BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 1-132 BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit RopGAP2 wt pET28 a(+) A. thaliana 114-424 BamHI+XhoI N-His diese Arbeit RopGAP2 wt pET28 a(+) A. thaliana 133-424 BamHI+XhoI N-His diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 71-424 BamHI+XhoI N-GST + C-His diese Arbeit RopGAP2 wt pGEX-4T-1 A. thaliana 71-424 BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit RIC9 pGEX-4T-1 A. thaliana fl BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit RIC2 pGEX-4T-1 A. thaliana fl BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit RIC1 pGEX-4T-1 A. thaliana fl BamHI N-GST diese Arbeit RIC3 pGEX-4T-1 A. thaliana fl EcoRI N-GST diese Arbeit RIC4 pGEX-4T-1 A. thaliana fl BamHI+EcoRI N-GST diese Arbeit RIC6 pGEX-4T-1 A. thaliana fl BamHI+EcoRI N-GST diese Arbeit RIC5 pGEX-4T-1 A. thaliana fl BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit spike1 CDMS pGEX-4T-1 A. thaliana fl BamHI+XhoI N-GST diese Arbeit Pak1 RBD pGEX-4T-1 H. sapiens 56-141 N-GST U Herbrand2 3.1.9.2 Expressionsplasmide für Säugerzellen Tabelle 3.6: Expressionsplasmide für Säugerzellen. fl: volle Länge (full length); N: N-terminal; C: C-terminal. 1 : Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund. insert Vektor Organismus Fragment Klonierung tag Referenz Rop4 wt pEGFP-C1 A. thaliana fl XhoI+BamHI N-EGFP diese Arbeit Rop4 G15V pEGFP-C1 A. thaliana fl XhoI+BamHI N-EGFP diese Arbeit Rop4 T20N pEGFP-C1 A. thaliana fl XhoI+BamHI N-EGFP diese Arbeit RhoA wt pcDNA3 H. sapiens fl N-Flag U. Herbrand1 RhoA G14V pcDNA3 H. sapiens fl BamHI+XbaI N-Flag diese Arbeit RhoA T19N pcDNA3 H. sapiens fl BamHI+XbaI N-Flag diese Arbeit Rac1 wt pcDNA3 H. sapiens fl N-Flag U. Herbrand1 Rac1 G12V pcDNA3 H. sapiens fl N-Flag U. Herbrand1 Rac1 T17N pcDNA3 H. sapiens fl BamHI+EcoRI N-Flag diese Arbeit Cdc42 wt pcDNA3 H. sapiens fl BamHI+EcoRI N-Myc diese Arbeit Cdc42 G12V pcDNA3 H. sapiens fl BamHI+EcoRI N-Myc diese Arbeit Cdc42 T17N pcDNA3 H. sapiens fl BamHI+EcoRI N-Myc diese Arbeit 3 Material und Methoden 45 3.1.9.3 Expressionsplasmide für Insektenzellen Tabelle 3.7: Expressionsplasmide für Insektenzellen. fl: volle Länge (full length); N: N-terminal; C: Cterminal. 1: Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund. insert Vektor Organismus Fragment Klonierung tag Referenz RopGAP2 pFastBac HT B A. thaliana 71-424 BamHI+XhoI N-His6 diese Arbeit RopGAP2 pFastBac HT B A. thaliana fl N-His6-GST T. Ishizaki1 RopGAP2 pIZ/V5-His A. thaliana Kozak + fl EcoRI+SacII C-His6 diese Arbeit 3.1.9.4 Expressionsplasmide für Pflanzen Tabelle 3.8: Expressionsplasmide für Pflanzen. fl: volle Länge (full length); N: N-terminal; C: C-terminal. 1: Botanisches Institut III, Universität Köln. insert Vektor Organismus Fragment Klonierung tag Referenz Rop4 wt pSP-ECFP A. thaliana fl SphI+EcoRI N-ECFP diese Arbeit Rop4 G15V pSP-ECFP A. thaliana fl SphI+EcoRI N-ECFP diese Arbeit RIC9 pSP-EYFP A. thaliana fl BamHI+SalI C-EYFP diese Arbeit RopGAP2 pSP-EYFP A. thaliana fl BamHI+SalI C-EYFP diese Arbeit mTalin pBA005 Maus fl N-ECFP R. Saedler1 mTalin pBA005 Maus fl N-EGFP R. Saedler1 3.1.9.5 Hefe-Zweihybridplasmide Tabelle 3.9: Plasmide für das Hefe-Zweihybridsystem. insert Vektor Organismus Fragment RopGAP2 wt pBTM116 A. thaliana 1-132 RopGAP2 wt pBTM116 A. thaliana 133-298 RopGAP2 wt pBTM116 A. thaliana 299-424 RopGAP2 wt pBTM116 A. thaliana 133-424 RopGAP2 wt pBTM116 A. thaliana 1-424 Rop4 wt pVP16 A. thaliana 1-180 Rop4 G15V pVP16 A. thaliana 1-180 Rac1 wt pVP16 H. sapiens 1-184 Rac1 G12V pVP16 H. sapiens 1-184 Cdc42 wt pVP16 H. sapiens 1-178 Cdc42 G12V pVP16 H. sapiens 1-178 Rop1 wt pVP16 A. thaliana 1-180 Rop1 G15V pVP16 A. thaliana 1-180 Rop2 wt pVP16 A. thaliana 1-179 Rop2 G14V pVP16 A. thaliana 1-179 Rop3 wt pVP16 A. thaliana 1-180 Rop3 G15V pVP16 A. thaliana 1-180 Rop4 wt pVP16 A. thaliana 1-180 Rop4 G15V pVP16 A. thaliana 1-180 Rop5 wt pVP16 A. thaliana 1-180 Rop5 G15V pVP16 A. thaliana 1-180 Rop6 wt pVP16 A. thaliana 1-180 Rop6 G15V pVP16 A. thaliana 1-180 RIC1 pBTM116 A. thaliana fl RIC2 pBTM116 A. thaliana fl RIC3 pBTM116 A. thaliana fl RIC4 pBTM116 A. thaliana fl RIC5 pBTM116 A. thaliana fl RIC6 pBTM116 A. thaliana fl RIC9 pBTM116 A. thaliana fl Klonierung BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI BamHI+EcoRI EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+EcoRI BamHI+PstI tag LexA LexA LexA LexA LexA VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 VP16 LexA LexA LexA LexA LexA LexA LexA Referenz diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit 3 Material und Methoden 46 3.1.10 cDNA-Bibliotheken Die verwendete cDNA-Bibliothek wurde von F. Lacroute in dem Vektor pFL61 hergestellt und in dem E. coli-Stamm HB101 vermehrt. Sie enthält cDNA von gesamtem Arabidopsis thaliana-Keimlingsgewebe (Minet et al. 1992). 3.1.11 Stämme 3.1.11.1 Escherichia coli-Stämme Tabelle 3.10: Verwendete Escherichia coli-Bakterienstämme. Bakterienstamm Genotyp TG1 supE, hsd∆5, thi, ∆(lac-proAB), F‘ [traD36, proAB+, lacIq , lacΖ∆M15] XL1 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’ proAB lacIq Z∆M15 Tn10 (Tetr )] BL21(DE3) ompT, hsdSB (rB- ,mB- ), gal(∆cIts857 ind1, Sam7, nin5, CodonPLUS RIL lacUV5-T7gene1), dcm (DE3), Tetr , endA, HTE (argU, ileY, leuW, Camr ) HB101 F–, thi-1, hsdS20 (rB–, mB–), supE44, recA13, ara-14, leuB6, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (strr), xyl-5, mtl-1 TM DH10Bac bMon14272, pMON7124 Referenz Gibson 1984 Stratagene (Amsterdam) Carstens und Waeshe 1999 Promega (Mannheim) Invitrogen (Karlsruhe) 3.1.11.2 Saccharomyces cerevisiae-Stämme Tabelle 3.11: Verwendete Saccharomyces cerevisiae-Hefestämme. Hefestamm Genotyp L40 MATα , trp1-901, leu2-3, his3-200, 112 ade2 LYS2::(lexAop) 4-HIS3 URA::(lexAop)8-lacZ GAL4 gal80 Referenz Vojtek et al. 1993 3.1.11.3 Zelllinien Tabelle 3.12: Verwendete Zelllinien. 1: Abteilung für Virologie, Weizmann-Institut für Wissenschaft, Rehovot, Israel; 2: Labor für Celluläre und Molekulare Biologie, NCI, NIH, Bethesda, USA Zelllinie Beschreibung Referenz Cos7 Nierenepithelzellen eines afrikanischen Grünaffens (Cerocopithecus Y. Gluzman1 aethiops), ursprüngliche Zelllinie (CV-1) transfiziert mit SV40-Virus mit defektem Replikationsursprung NIH/3T3 kontaktinhibierte embryonale Mausfibroblastenzellen (Mus musculus) S.A. Aaronson2 HeLa Epithelzellen aus einem menschlichen Cervix-Karzinom Scherer et al. 1953 Sf21 adhärent und in Suspensionskultur wachsende Zelllinie aus dem Vaughn et al. 1977 Eierstock-Gewebe von Spodoptera frugiperda, unregelmäßige Morphologie Sf9 adhärent und in Suspensionskultur wachsende Zelllinie aus dem Vaughn et al. 1977 Eierstock-Gewebe von Spodoptera frugiperda 3 Material und Methoden 47 3.1.11.4 Pflanzenmaterial Es wurden handelsübliche Zwiebeln (Allium cepa) benutzt. 3.1.12 Computer-Software BLAST SMART AIDA 3.22 Origin 4.1 Graphit 3.0 3.2 Altschul et al. 1990 Schultz et al. 2000 raytest Isotopenmessgeräte (Straubenhardt) MicroCal Software Inc. (Northampton, USA) Erithacus Software (Staines, UK) Methoden 3.2.1 Kulturmethoden 3.2.1.1 Bakterien 3.2.1.1.1 Kulturbedingungen und Lagerung Zur Anzucht von Escherichia coli-Bakterien in Flüssigkulturen wurde ein Einzelklon von einer LB-Platte gepickt und in 5 ml LB-Medium (3.1.6.1) über Nacht im Schüttelinkubator mit 180 rpm bei 37°C als Minikultur inkubiert. Zur Selektion wurden dem Medium abhängig von Vektor und Bakterienstamm Antibiotika zugesetzt (3.1.4.5). Die Anzucht von E. coli auf Festmedium (3.1.6.1) erfolgte über Nacht bei 37°C Inkubationsschrank. Zur Lagerung als Glycerinkultur wurden 700 µl einer Bakterienkultur unter sterilen Bedingungen mit 300 µl Glycerin (100 %) gemischt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt. 3.2.1.1.2 Herstellung kompetenter Bakterien Zur Aufnahme von Plasmid-DNA bei der Transformation wurden E. coli-Bakterien chemisch kompetent gemacht. Dazu wurde eine 5 ml-Vorkultur mit einem Einzelklon beimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert (3.2.1.1.1). Am nächsten Morgen wurden 200 ml LB-Medium (3.1.6.1, ohne NaOH, pH 6,5) mit 2 ml der Vorkultur beimpft und bei 37°C unter Schütteln bei 180 rpm kultiviert. Sobald eine bei 600 nm gemessene optische Dichte von 0,4 erreicht war, wurde die Zellsuspension für 20 Minuten auf Eis inkubiert und nach 10 Minuten Zentrifugation bei 1200 g und 4°C in 1/10 des Ausgangsvolumens (20 ml) eiskaltem TSSPuffer (s.u.) resuspendiert. Die kompetenten Zellen wurden à 500 µl aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. 3 Material und Methoden TSS-Puffer: 48 85 10 5 50 % % % mM (v/v) LB-Medium(ohne NaOH) (w/v) PEG 8000 DMSO MgCl2 pH 6.5 3.2.1.1.3 Transformation von E. coli Kompetente E. coli-Zellen (3.2.1.1.2) wurden auf Eis aufgetaut. Zur Transformation wurden 100 µl der Bakteriensuspension mit 0,1 µg Plasmid-DNA oder einem Ligationsansatz (3.2.2.12) erst 30 Minuten auf Eis, dann 2 Minuten bei 42°C (Hitzeschock) im Heizblock, und dann wieder 1-2 Minuten auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 1 ml LB-Medium (3.1.6.1) wurde die Bakteriensuspension für 1 Stunde bei 37°C im Schüttelinkubator kultiviert (3.2.1.1.1). Daraufhin wurden die Zellen 3 Minuten bei 4000 rpm in der Tischzentrifuge abzentrifugiert, der grösste Teil des Überstands abgenommen und die Zellen vorsichtig im Restüberstand resuspendiert. Anschließend wurde die Suspension auf einer vorgewärmten LB-Platte mit entsprechendem Antibiotikum ausgestrichen (3.1.4.5). Die anschließende Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C. 3.2.1.1.4 Proteinexpression in E. coli Zur Proteinexpression wurde die Expressionskultur 1 %-ig mit einer Vorkultur (3.2.1.1.1) angeimpft und bis zur gewünschten OD bei 37°C angezogen. Dann wurde sie mit IPTG induziert, nach der angegebenen Dauer (s.u.) bei 6000 g und 4 °C für 15 Minuten abzentrifugiert und im späteren Aufschlusspuffer (3.2.3.9-12) resuspendiert. Bis zur Proteinisolierung wurde die Bakteriensuspension bei -20°C gelagert. Tabelle 3.13 gibt die Rahmenparameter verschiedener Expressionskulturen an. Tabelle 3.13: Bedingungen zur Expression von Proteinen in E. coli. ü.N.: über Nacht, ca. 15 Stunden. Protein Medium Temperatur Induktion IPTG Dauer His-Rop4 Std. I 18°C bei OD595 0,8 400 µM ü.N. 50 µM ü.N. Std. I 18°C bei OD595 0,8 GST-RopGAP2∆70 400 µM ü.N. Std. I 18°C bei OD595 0,8 GST-RopGAP2∆132 200 µM 3-4 Stunden GST-RIC6 TB 18°C bei OD595 0,2 GST-RIC9 TB 18°C bei OD595 0,2 200 µM 3-4 Stunden GST-Pak1 RBD TB 30°C bei OD595 0,8 100 µM ü.N. 3.2.1.1.5 Aufschluss von Bakterien Um die Bakterien zu lysieren, wurde der Bakteriensuspension nach dem Auftauen zunächst DNAseI (10 µg/ml) und Lysozym (10 µg/ml) zugegeben. Die Suspension wurde für 20 Minuten im Eisbad inkubiert. Danach erfolgte der vollständige Aufschluss durch Ultraschall im Eisbad. Die Ultraschallbehandlung erfolgte dreimal für je zwei Minuten (Duty Cycle: 60; Stufe 8). Anschließend wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation abgetrennt (40000 g; 4 °C; 45 Minuten). 3 Material und Methoden 49 3.2.1.1.6 Amplifizierung der cDNA-Bank Zunächst wurde der Titer der Bakteriensuspension bestimmt. Dazu wurden 1:105- bis 1:109Verdünnungen der Suspension auf LB-Medium mit Ampicillin ausplattiert. Der Titer wurde aus der Anzahl der koloniebildenden Bakterien (CFU, colonie forming units) berechnet. Zur Amplifikation wurden je 0,5⋅105 CFU auf 40 15 cm-Petrischalen mit LB/Ampicillin-Medium ausplattiert und ü.N. bei 37°C kultiviert. Dann wurden 15 ml LB-Medium auf jede Schale gegeben, und die Bakterien wurden durch Pipettieren von dem Agar abgeschwemmt. Die Bakteriensuspension wurde gesammelt, und restliche Bakterien auf den Platten wurden wie zuvor abgeschwemmt. Die Bakteriensuspension wurde 1 Stunde bei 37°C und 160 rpm inkubiert und als Glycerinkultur gelagert oder zur DNA-Isolierung mit dem Qiagen Plasmid Giga Kit verwendet. 3.2.1.2 Hefe 3.2.1.2.1 Kulturbedingungen Zur Anzucht des Hefestamms L40 (3.1.11.2) in Flüssigkultur wurde ein Einzelklon von einer YPD-Platte (3.1.6.2) gepickt und in 20 ml YPD-Medium (3.1.6.2) über Nacht im Schüttelinkubator mit 160 rpm bei 30°C inkubiert. Transformanten wurden in UTL-Medium (3.1.6.2) auf gleiche Weise angezogen. Die Anzucht von Hefe auf Festmedium (3.1.6.2) erfolgte für 2-3 Tage bei 30°C im Inkubationsschrank. 3.2.1.2.2 Transformation der Hefe L40 Zur Transformation des Hefestammes L40 wurden 20 ml YPD-Medium (3.1.6.2) mit einer Hefekolonie angeimpft und bei 30 °C und 160 rpm für ca. 15 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 300 ml YPD-Medium mit 5 ml der Kultur angeimpft und bis zu einer O.D.595 von 0,4 bis 0,6 angezogen (ca. 4 Stunden). Die Hefezellen wurden dann 4 Minuten bei 1000 g bei Raumtemperatur abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellsediment wurde mit 5 bis 6 ml TE-Puffer (3.1.5) gewaschen und anschließend in 1 ml TE/ 100 mM LiAc aufgenommen. Pro Transformationsansatz wurden 100 µl kompetente Hefezellen mit 10 µl hitzedenaturierter Lachs-Träger-DNA (10 mg/ml) und ca. 1 µg Plasmid-DNA in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß gemischt und 600 µl 40 % PEG 3350-Lösung (s.u.) zugegeben. Es folgte eine halbstündige Inkubation der Ansätze bei 30 °C unter Schütteln bei 600 rpm. Dann wurden 70 µl DMSO zugegeben und die Ansätze 20 Minuten bei 42°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben kurz auf Eis gestellt und bei Raumtemperatur 4 Minuten bei 1000 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde komplett abgenommen und das Pellet in 100 µl TE-Puffer aufgenommen und auf einer UTL-Platte (3.1.6.2) ausgestrichen. Nach zwei bis drei Tagen Inkubation bei 30°C im Brutschrank wurden Transformanten sichtbar. 40 % PEG 3350-Lösung: 40 100 % mM TE (w/v) PEG 3350 Lithiumacetat 3 Material und Methoden 50 3.2.1.2.3 Analyse von Hefe-Zweihybrid-Interaktionen auf Selektionsplatten Um Protein-Protein-Interaktionen auf Selektionsplatten für Hefe-Transformanten (3.2.1.2.2) zu testen, wurden für jede Interaktion jeweils fünf unterschiedliche Co-Transformanten beider Plasmide (Köder- und Beuteplasmid) gemeinsam in 10 ml UTL-Flüssigmedium (3.1.6.2) über Nacht angezogen. Nach ca. 15 Stunden wurde die OD595 einer 1:10-Verdünnung der Kultur bestimmt (Mittelwert aus drei unabhängigen Messungen) und dann Verdünnungen der Kulturen (in UTL-Flüssigmedium) hergestellt, die eine OD595 von 0,1 besitzen. 2 µl jeder Verdünnung wurden dann auf eine THULLY-Platte (3.1.6.2) und auf eine UTL+X-Gal-Platte (3.1.6.2) aufgetropft. Die Platten wurden für zwei bis drei Tage im Brutschrank inkubiert. 3.2.1.2.4 Semiquantitative Analyse von Hefe-Zweihybrid-Interaktionen mit der Galaktosidase-Reportergenanalyse Für jede zu untersuchende Interaktion wurden fünf unterschiedliche Co-Transformanten (3.2.1.2.2) beider Plasmide gemeinsam in 10 ml UTL-Flüssigmedium (3.1.6.2) ca. 15 Stunden angezogen (3.2.1.2.1). Am nächsten Morgen wurde die OD595 der Kultur bestimmt (Mittelwert aus drei unabhängigen Messungen), und 3,6 OD der Kultur wurden bei 1000 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wurde komplett abgesaugt. Dann wurden 800 µl Z-Puffer (s.u.), 50 µl 0,1 % (w/v) SDS und 50 µl Chloroform auf das Zellsediment gegeben und die Hefezellen durch Vortexen darin resuspendiert. Das so entstandene Lysat wurde 1:1000 in Z-Puffer verdünnt. Der Reaktionspuffer des Galacto-StarKits (Tropix) wurde 1:50 mit dem mitgelieferten Substrat versetzt. Von jeder Probe wurden je 60 µl Lysatverdünnung in zwei Luminometerröhrchen pipettiert und mit 300 µl Reaktionspuffer/Substrat vermischt. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lumineszenz für 5 Sekunden gemessen. Die Werte von zwei Proben eines Lysates wurden gemittelt. Z-Puffer: 60 40 10 1 0,5 mM mM mM mM mM Na2HPO4 NaH2PO4 KCl MgSO4 DTE 3.2.1.3 Insektenzellen 3.2.1.3.1 Kulturbedingungen Die Kultivierung von Sf9- und Sf21-Zellen (3.1.11.3) erfolgte bei 27°C in 6 well-Platten, Petrischalen oder in Suspensionskultur. Suspensionskulturen wurden unter Rühren in SpinnerFlaschen im Wasserbad bei 27°C kultiviert. Dabei sollte das Volumen der Kultur nicht mehr als 20 % des Flaschenvolumens einnehmen, um eine ausreichende Belüftung der Kultur zu gewährleisten. Die Einhaltung eines bestimmten CO2-Gehalts oder einer bestimmten relativen Luftfeuchtigkeit war dabei nicht nötig. Die Zellen wurden alle zwei Tage gezählt und passagiert, um eine Zelldichte von 1⋅106 - 2⋅106 Zellen/ml einzuhalten. Für Sf9-Zellen wurde Grace’s-Medium (3.1.6.3) mit 10 % (v/v) FBS verwendet, Sf21-Zellen wurden in TC10- 3 Material und Methoden 51 Medium (3.1.6.3) mit 5 % (v/v) FBS (3.1.6.3) kultiviert. Suspensionskulturen enthielten 10 % (v/v)-iges Pluronic (Invitrogen) in einer Verdünnung von 1:100. 3.2.1.3.2 Stabile Transfektion mit dem InsectSelect-System Das InsectSelect-System der Firma Invitrogen erlaubte die stabile Expression heterologer Proteine in Insektenzelllinien mit dem Vektor pIZ/V5-His (3.1.7). Von diesem Vektor wurde die einklonierte cDNA unter der Kontrolle des OplE2-Promoters, der zu den Promotoren der frühen Phase zählt, exprimiert (Theilmann und Stewart 1992). Er stammt aus dem Orgyia pseudotsugata-Multicapsid-nukleären-Polyhedrosis Virus (OpMNPV). Zur Transkription der einklonierten cDNA wurde die zelleigene Transkriptionsmaschinerie benutzt und keine viralen Faktoren benötigt. Sf9-Zellen wurden mit Hilfe des CellFECTIN-Kits (Invitrogen) transfiziert. Dazu wurden je 1⋅106 Zellen in einer 6 well-Platte ausgesät und 15 Minuten inkubiert (3.2.1.3.1), so dass alle Zellen sich am Untergrund festsetzten. In einem Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden pro Transfektionsansatz 1 ml Medium mit 1-10 µg DNA und 20 µl CellFECTIN-Reagenz für 10 Sekunden gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Auf diese Weise wurden ein Ansatz mit Plasmid, ein Ansatz mit Vektor-DNA und ein Ansatz ohne DNA vorbereitet. Unterdessen wurde das Medium (3.1.6.3) von den Zellen abgenommen und mit je 2 ml serumfreiem Medium gewaschen. Der Transfektionsansatz wurde auf die Zellen getropft und die Platte für 4 Stunden auf einem Schwenktisch bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 2 ml Medium mit FBS auf die Zellen gegeben und die Zellen wurden für 2 Tage im Brutschrank inkubiert. Zur Selektion stabiler Zelllinien wurden die Zellen nach zwei Tagen 1:5 mit neuem Medium verdünnt, in 96 well-Platten überführt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium wurde dann gegen Zeocin-haltiges Medium (600 µg/ml) getauscht und im weiteren alle drei Tage gewechselt. Zeocin-resistente, transfizierte Zellen wuchsen unter diesen Bedingungen, während andere abstarben. Bildeten sich in einem well resistente Klone, so wurden sie getrennt in eine 6 well-Platte transferiert und weiter in Zeocin-haltigem Medium angezogen. Resistente Zellen wurden jeweils 1:5 verdünnt und regelmäßig auf Expression hin überprüft. Dazu wurden Zellsedimente eines wells mit 100 µl Lysepuffer (s.u.) resuspendiert und bei 13000 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit SDS-Probenpuffer (3.2.3.2) versetzt und im Western Blot (3.2.3.5) mit anti-His6-Antikörpern (3.1.4.7) überprüft. Polyklonale Zelllinien wurden nachdem alle anderen Zellen abgestorben waren (ca. 6 Wochen) in Zellkulturflaschen und Spinner-Flaschen angezogen. Lysepuffer: 50 150 1 mM mM % Tris NaCl Nonidet P-40 pH 7,8 3 Material und Methoden 52 3.2.1.3.3 Transfizieren von Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA Im Bac-to-Bac-System der Firma Invitrogen wurden rekombinante Bakuloviren zur Expression von Fremdgenen unter der Kontrolle des Polyhedrinpromoters des Autographa californica-nukleären-Polyhedrosis-Virus (AcNPV) benutzt. Das Polyhedringen wurde in der sehr späten Phase des Bakulovirus-Zyklus exprimiert. Die rekombinanten Bakuloviren wurden durch homologe Rekombination in E. coli hergestellt (Abbildung 3.1). Dazu wurden E. coli DH10Bac-Zellen (3.1.11.1) mit dem rekombinanten pFastBac HT B-Plasmid transformiert. Auf der Basis von sequenzspezifischer Transposition erfolgte in diesen Zellen die Eingliederung der Expressionskassette in die Bakmid-DNA des Stammes. Das Bakmid stellt das rekombinante Virus-Genom dar. Rekombinante Bakmide konnten durch Blaufärbung auf LB-Platten (3.1.6.1) mit Kanamycin, Gentamicin, Tetrazyclin, 50 µM IPTG und 100 µg/ml X-Gal identifiziert werden. Sie wurden isoliert (3.2.2.5) und durch PCR und Restriktionsanalyse charakterisiert. Durch Transfektion der Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA erfolgte die Bildung von Viruspartikeln. Abbildung 3.1: Herstellung rekombinanter Bakuloviren und Genexpression mit dem Bac-to-Bac-System. Zur Transfektion wurden je 9⋅105 Sf21-Zellen in 2 ml Medium in einer 6 well-Platte ausgesät und für eine Stunde bei 27°C inkubiert. 5 µl Bakmid-DNA und 6 µl CellFECTIN wurden getrennt in jeweils 100 µl Medium (3.1.6.3) verdünnt und kurz gemischt. Die beiden Lösungen wurden dann miteinander gemischt und 15 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden nach einer Stunde mit 2 ml Medium gewaschen. Zu jedem Transformationsansatz wurden 800 µl Medium gegeben, und die Mischung wurde dann auf die Zellen getropft. Die Zellen wurden 5 Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde der Transfektionskomplex von den Zellen abgenommen und 2 ml Medium (3.1.6.3) zugegeben. Die Zellen wurden für 3 Tage im Brutschrank kultiviert (3.2.1.3.1). Danach wurden die Zellen mit dem Medium abgeschwemmt, in Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt 3 Material und Methoden 53 und bei 2500 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert. Der Überstand enthielt Viruspartikel mit einem Titer von 2⋅107 bis 4⋅107 pfu/ml. Er kann bei 4°C bis zu anderthalb Jahren gelagert wurden. Die Zellen wurden zur Überprüfung der RopGAP2-Expression lysiert und im Western Blot analysiert (s.o.). 3.2.1.3.4 Bestimmung des Virus-Titers Zur Bestimmung des Virus-Titers wurden 6⋅ 106 Zellen abzentrifugiert und in 12 ml Medium mit Serum gelöst. Je 2 ml wurden in die sechs Vertiefungen einer 6 well-Platte gegeben und 1 Stunde inkubiert. Währenddessen wurden Verdünnungen des zu testenden Virus hergestellt. Der Virus wurde 1:106, 1:107 und 1:108 in Medium (3.1.6.3) verdünnt. Nach 1 Stunde wurde das Medium von den Zellen abgenommen und 1 ml Virus-Verdünnung aufgetropft. Ein well wurde nur mit Medium betropft und diente als Kontrolle. Die Platte wurde dann 2 Stunden bei Raumtemperatur geschwenkt. In dieser Zeit wurden 0,5 g Agarose in 20 ml A. bidest aufgekocht und in ein 48°C-Wasserbad gestellt. Außerdem wurden 5 ml Medium (3.1.6.3) mit Serum auf 48°C erwärmt. Nachdem der Virus von den Zellen abgenommen worden war, wurden 5 ml Agarose mit 5 ml 48°C-Medium und 10 ml Medium (Raumtemperatur) gemischt und je 2,2 bis 2,5 ml vorsichtig auf die Zellen gegeben. Bis die Agarose erstarrt war, wurde die Platte nicht bewegt. Anschließend wurde sie für 10 Tage im Brutschrank inkubiert. Danach wurden Plaques sichtbar. Die Plaques konnten mit 0,1 % (w/v) Neutralrot für 1 Stunde gefärbt werden. 3.2.1.3.5 Virusamplifikation Für die erste Virusamplifikation nach der Transfektion von Sf21 Zellen mit Bakmid-DNA und der anschließenden Ernte der gebildeten Viruspartikel wurden 3⋅106 Sf21-Zellen pro 60 mm-Schale in 4,7 ml Medium (3.1.6.3) ausgesät. Dann wurden 300 µl Virus zugegeben und die Zellen für 3 bis 4 Tage im Inkubator kultiviert (3.2.1.3.1). Anschließend wurden die Zellen bei 2500 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert, und der Überstand verwahrt. Für die nächste Amplifikation wurden 5⋅106 Zellen in einer 10 cm-Schale in 9 ml Medium ausgesät, und mit 2 ml Virus versetzt. Nach 3- bis 4-tägiger Inkubation wurde der Überstand durch Abzentrifugieren der Zellen gesammelt. Für die dritte Amplifikation wurden 2⋅108 Zellen in 500 ml Medium in einer 1 l Spinner-Flasche mit 5 ml Virus versetzt. Nach 3 bis 4 Tagen wurde der Überstand wie oben beschrieben gesammelt und der Titer bestimmt. Er betrug nun zwischen 1⋅107 und 1⋅108 pfu/ml. Der Virus wurde bei 4°C als Stock gelagert. Für alle weiteren Amplifikationen des Viruses wurde generell eine Sf21-Kultur bei 2500 g 10 Minuten abzentrifugiert und in frischem Medium auf eine Zelldichte von 2⋅106 Zellen/ml verdünnt. Dann wurde die Kultur mit einer MOI (multiplicity of infection, Viruspartikel pro Zelle) von 0,1 infiziert und für vier Tage unter Kulturbedingungen inkubiert (3.2.1.3.1). Danach wurden die Zellen wiederum abzentrifugiert. Der virushaltige Überstand wurde im Plaque-assay untersucht, das Zellpellet wurde zur Überprüfung der Expression und/oder zur Proteinreinigung verwendet. 3 Material und Methoden 54 3.2.1.3.6 Vereinzelung von Viren Um einen homogenen Virus zu erhalten, wurden die Viren eines einzelnen Plaques zusammen mit dem Agar, in dem sie sich befinden, mit einer Pasteur-Pipette ausgestochen und für 1 Tag bei 4°C in 1 ml Medium (3.1.6.3) auf dem Rotator inkubiert. Das Medium wurde dann zur Amplifikation des Virus eingesetzt. 3.2.1.3.7 Proteinexpression in Sf21-Zellen Zur Proteinexpression wurden 2,5⋅108 Zellen in 100 ml frischem Medium (3.1.6.3) aufgenommen und mit einer MOI von 3 infiziert. Nach dreitägiger Kultivierung in SpinnerFlaschen im Wasserbad bei 27°C (3.2.1.3.1) wurden die Zellen bei 2500 g für 10 Minuten abzentrifugiert und bei -20°C eingefroren. 3.2.1.4 Säugerzellen 3.2.1.4.1 Kulturbedingungen Die Kultivierung der Zellen erfolgte in 75 cm2-Gewebekulturflaschen mit Penicillin/Streptomycin bei 37°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 90 % und einem CO2Gehalt von 7,5%. Die Säugerzellen mussten regelmäßig passagiert, d.h. verdünnt werden. Dazu wurde das Medium abgegossen und die Zellen wurden mit PBS (3.1.5) gewaschen. Dann wurden sie mit 4 ml Trypsin/EDTA (Invitrogen) für ca. 1-2 Minuten bzw. bis zum Ablösen vom Boden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in 20 ml frischem Medium (3.1.6.4) resuspendiert, und die Zellzahl wurde mit Hilfe der NeubauerZählkammer bestimmt. Die Zellsuspension wurde den Kulturbedingungen (s.u.) entsprechend mit frischem Medium verdünnt und in eine neue Kulturflasche, auf Deckgläschen in 6 wellPlatten bzw. auf Gewebekulturschalen mit 6 cm oder 10 cm Durchmesser überführt. Tabelle 3.14: Kulturbedingungen der verwendeten Zelllinien. Zelllinie Medium Serum Antibiotikum NIH3T3 DMEM 10 % NCS Pen./Strep. 1:100 HeLa DMEM 10% FCS Pen./Strep. 1:100 Cos7 DMEM 10% FCS Pen./Strep. 1:100 Passage alle 3-4 Tage alle 3-4 Tage alle 2-3 Tage Verdünnung 1:3-1:5 1:10-1:15 1:6-1:10 3.2.1.4.2 Transiente Transfektion durch Lipofektion NIH3T3-Zellen (3.1.11.3) und HeLa-Zellen (3.1.11.3) wurden transient durch Lipofektion transfiziert. Dazu wurde der LipofectAMINE PLUS-Kit (Invitrogen) verwendet. 1⋅105 Zellen pro Ansatz wurden in einer 6-well Platte auf Deckgläschen in 4 ml Medium ausgesät und über Nacht inkubiert (3.2.1.4.1). Für die Transfektion wurden 0,3 – 0,6 µg Plasmid-DNA und 6 µl Plus-Reagenz in 100 µl Medium (3.1.6.4) ohne Zusätze gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dazu wurden weitere 100 µl Medium ohne Zusätze und 4 µl Lipofectamin gegeben und weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium wurde von den Zellen abgesaugt, und diese wurden mit 2 ml Medium ohne Zusätze 3 Material und Methoden 55 gewaschen. Zur Transfektion wurden 800 µl Medium ohne Zusätze auf die Zellen gegeben und die 200 µl Transfektionslösung zugetropft. Die Zellen wurden für 3 Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde der Transfektionskomplex abgenommen und die Zellen über Nacht in 3 ml Medium mit allen Zusätzen inkubiert. 3.2.1.4.3 Transiente Transfektion nach der DEAE-Dextran-Methode Die Transfektion von Cos7-Zellen (3.1.11.3) erfolgte mit Hilfe der Diethylaminoethyl(DEAE) Dextran-Methode. Dazu wurden 1,5⋅106 Zellen mindestens 20 Stunden vor der Transfektion auf Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm ausgesät. 2 ml DEAE (0,5 mg/ml in PBS) wurden mit 5 µg DNA vermischt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit dem DNA-DEAE-Gemisch versetzt. Nach Inkubation im Brutschrank für ca. 30 Minuten hatten sich die Zellen abgelöst. Es wurden 10 ml Medium (3.1.6.4) mit Antibiotika, NCS und 80 µmol Chloroquin zugegeben und die Zellen für 2,5 Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde der Überstand von den nun wieder adhärenten Zellen abgesaugt und 5 ml Medium mit 10% DMSO zugegeben. Nach 2,5minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Überstand erneut abgesaugt und nun 10 ml Medium mit den Zusätzen der normalen Kulturbedingungen zugegeben. Es folgte eine zweitägige Inkubation im Brutschrank (3.2.1.4.1). 3.2.1.5 Zwiebel Epidermiszellen 3.2.1.5.1 Transformation Für einen Transformationsansatz wurden 60 mg 1 µm-Goldpartikel (gelöst in 50-100 µl Ethanol, Biorad, München) mit 500 µl A. bidest für 2 Minuten durch Vortexen gemischt. Dann wurden sie für 30 Sekunden bei 6000 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Goldpartikel wurden in 50 µl A. bidest resuspendiert. Sie wurden wiederum 2 Minuten gevortext. Dann wurden 5 µl der zu transformierenden DNA (0,5 µg/µl) zugegeben und wieder 2 Minuten gevortext. Anschließend wurden 20 µl 0,1 M Spermidin zugegeben und wiederum für 2 Minuten gevortext. Nun wurden 50 µl 2,5 M CaCl2 zugegeben und 2 Minuten gevortext. Die Goldpartikel wurden 30 Sekunden bei 6000 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert und der Überstand wurde abgenommen. Sie wurden mit 250 µl 100 % Ethanol resuspendiert und erneut 2 Minuten gevortext. Dann wurden sie abzentrifugiert und in 50 ml 100 % Ethanol aufgenommen. Die Goldpartikel-Suspension wurde auf die Microcarrier-Membran (Biorad) aufgetragen und ca. 30 Minuten trocknen gelassen. In dieser Zeit wurden die Zwiebeln vorbereitet. Sie wurden in 6-8 Stücke zerteilt und die inneren Schichten wurden entfernt. Mit der Innenseite nach oben wurden sie in Petrischalen gelegt, die zuvor mit einem angefeuchteten Whatman-Papier ausgelegt worden sind. Sobald die DNA getrocknet war, konnten die Zwiebeln durch den biolistischen Transferapparat PDS-1000 (Biorad) bei 1100 psi unter einem Helium-Druck von 25 inch Hg beschossen werden. 3 Material und Methoden 56 3.2.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.2.1 Minipräparation von Plasmid-DNA Die Isolierung von Plasmid-DNA aus 5 ml-Schüttelkulturen von E. coli (3.2.1.1.1) wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt. Die DNALösung wurde bei –20°C gelagert. 3.2.2.2 Midipräparation von Plasmid-DNA Die Isolierung größerer Mengen Plasmid-DNA aus einer 100 ml-Übernachtkultur von E. coli (3.2.1.1.1) wurde mit dem QIAGEN HiSpeed Plasmid Midi Kit entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt. 3.2.2.3 Maxipräparation von Plasmid-DNA Die Isolierung großer Mengen Plasmid-DNA aus einer 500 ml-Übernachtkultur (3.2.1.1.1) wurde mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt. 3.2.2.4 Isolierung der Plasmid-DNA der cDNA-Bibliothek Zur Isolierung der cDNA-Plasmidbank (3.1.10) wurde der QIAGEN Plasmid Giga Kit verwendet. 3.2.2.5 Präparation von Bakmid-DNA Die Isolierung von Bakmid-DNA erfolgte aus 5 ml-Kulturen von DH10Bac-Zellen (3.2.1.1.3), die mit pFastBac HT B-Derivaten transformiert worden waren und auf Selektionsplatten blau gefärbt waren. 2 ml der Kultur wurden bei 13000 rpm (Tischzentrifuge) für 2 Minuten abzentrifugiert. Das Zellsediment wurde mit 300 µl Lösung 1 (s.u.) resuspendiert. Dann wurden 300 µl Lösung 2 (s.u.) zugegeben und vorsichtig gemischt. Nach 5-minütiger Inkubation wurden 300 µl 3 M Kaliumacetat pH 5,5 zugegeben und wiederum vorsichtig gemischt. Die Lösung wurde 10 Minuten auf Eis inkubiert und schließlich für 10 Minuten bei 13000 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit 800 µl Isopropanol gefällt. Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die DNA abzentrifugiert (15 Minuten, 13000 rpm) und mit 70 % Ethanol gewaschen. Nach erneutem Abzentrifugieren wurde das Sediment für 5 bis 10 Minuten getrocknet, in 40 µl TE (3.1.5) aufgenommen und sterilfiltriert. Lösung 1: 15 10 100 mM Tris HCl mM EDTA µg/ml RNAse A pH 8,0 3 Material und Methoden Lösung 2: 57 0,2 1 N % NaOH (w/v) SDS 3.2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die Konzentrationsbestimmung von DNA erfolgte photometrisch durch Bestimmung der Extinktion der DNA bei einer Wellenlänge von 260 nm. Als Referenz diente Wasser. Das Ausmaß der Verunreinigung der Probe mit ebenfalls zur Absorption beitragenden Proteinen wurde durch die Bestimmung des Quotienten der Absorption bei 260 nm und 280 nm ermittelt. Der Quotient sollte im Bereich von 1,8 - 2 liegen. Eine Extinktionseinheit von 1 entspricht einer Konzentration von 50 µg/ml DNA. 3.2.2.7 Polymerasekettenreaktion (PCR) Mittels der Polymerasekettenreaktion wurden DNA-Fragmente in vitro selektiv amplifiziert. Ein typischer 50 µl Ansatz bestand aus: 1 µl 10 µM 5’-Primer, 1 µl 10 µM 3’-Primer, 0,6 µl dNTP-Lösung (je 10 mM), 5 µl 10 x PCR-Puffer des Herstellers der Polymerase, 0,05 bis 0,1 µg template-DNA und 1 µl Polymerase. Er wurde mit A. bidest auf 50 µl aufgefüllt. Für analytische Zwecke wurde die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus verwendet. Diente die Vervielfältigung der DNA zum weiteren Klonieren, so wurde die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus eingesetzt, die über eine Korrekturlesefunktion (3´-5´ Exonukleaseaktivität) verfügt, und dadurch niedrigere Fehlerraten aufweist. Bei Verwendung der PfuPolymerase wurden dem Ansatz zusätzlich 10 % (v/v) DMSO zugesetzt. Das Standard-PCR-Programm bestand aus 25 Zyklen mit 30 Sekunden Denaturierung bei 96 °C, 45 Sekunden Hybridisierung bei 55 °C und 30 bis 150 Sekunden Elongation bei 72 °C sowie einer anfänglichen Denaturierung bei 96 °C für 30 Sekunden und einer abschließenden Elongation bei 72 °C für 4 Minuten. Die Hybridisierungstemperatur lag 10°C unterhalb der Denaturierungstemperatur TM. Die Denaturierungstemperatur wurde mit Hilfe der WallaceFormel berechnet: TM /°C = 2⋅(NA+NT)+4⋅(NC+NG) (1) NX ist die Anzahl der Base X in der Primer Sequenz (X: A, T, G, C). Nach Ablauf des PCR-Programms wurden die Proben bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C oder -20 °C aufbewahrt. Die PCR-Reaktion konnte durch Zusatz von Q-Solution, Glycerin, DMSO und Magnesiumchlorid optimiert werden. Außerdem konnte durch Herabsetzen der Hybridisierungstemperatur eine größere Ausbeute an amplifiziertem Fragment erhalten werden. Zur Amplifizierung der RIC2- und RIC9-cDNA aus der cDNA-Bank (Minet et al. 1992) wurde die Hybridisierungstemperatur für 5 Zyklen auf 40 °C heruntergesetzt und in den anschließenden 20 Zyklen langsam bis auf 50°C gesteigert. 3 Material und Methoden 58 3.2.2.8 Ortsspezifische Mutagenese Zum gerichteten Austausch einzelner Aminosäuren auf DNA-Ebene wurde das QuikchangeProtokoll von Stratagene (Amsterdam, Niederlande) angewendet. Diese Methode beruht auf einer PCR-Amplifizierung von zirkulärer Plasmid-DNA aus E. coli mit einem mutagenen Primerpaar. Das erhaltene PCR-Produkt ist im Unterschied zur template-DNA unmethyliert und konnte daher im Anschluss mit der methylierungsabhängigen Restriktionsendonuklease DpnI im Ansatz angereichert werden (Kunkel 1985). Nach der Restriktion wurden die Ansätze in E. coli transformiert (3.2.1.1.3) und die Klone sequenziert (3.2.2.9). 3.2.2.9 Sequenzierung von DNA Die hier verwendete Methode zur Sequenzierung von DNA beruht auf dem cycle sequencingVerfahren nach der BigDye-Terminator-Methode mit fluoreszenmarkierten Didesoxynukleotiden und AmpliTaq-Polymerase FS (Applied Biosystems, Langen). Ein Sequenzieransatz beinhaltete ca. 150 – 300 ng Plasmid-DNA, 3,2 pmol Oligonukleotid und 4 µl Terminator-Mix (BigDye Terminator Kit) in 20 µl Gesamtvolumen. Das PCRProgramm bestand aus einem initialen Denaturierungsschritt bei 96 °C für 30 Sekunden und durchlief dann 25 mal einen Zyklus aus Denaturierung (30 Sekunden 96 °C), Hybridisierung (15 Sekunden 50 °C) und Elongation (4 Minuten 60 °C). Abschließend wurde das Produkt gefällt. Dazu wurden zu 20 µl Sequenzierungsansatz 2 µl 125 mM EDTA, 2 µl 3 M NaAc pH 5,7 und 50 µl 100 % Ethanol gegeben und die Lösung nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur durch Zentrifugation in der Tischzentrifuge präzipitiert (13000 rpm, RT, 30 Minuten). Nach Waschen mit 400 µl 70 % (v/v) Ethanol wurde das Pellet 10 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Die Analyse der Sequenzierprodukte erfolgte durch Kapillarelektrophorese in einem ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Langen). 3.2.2.10 Restriktion von DNA Die gezielte Spaltung doppelsträngiger DNA für analytische oder präparative Zwecke erfolgte mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen, die spezifisch palindromische DNA-Sequenzen hydrolysieren. Bei der Wahl der Pufferbedingungen, der Inkubationstemperaturen und der Inkubationszeiten wurden die Angaben des Herstellers berücksichtigt. Einige Enzyme können nach der Reaktion durch Inkubation des Ansatzes für 15 Minuten bei 65°C hitzeinaktiviert wurden. 3.2.2.11 Dephophorylierung von DNA Zur Dephosphorylierung von restringierter Vektor-DNA (3.2.2.10) wurde 1 µL alkalische Phosphatase aus shrimps (SAP) zum Restriktionsansatz gegeben und für eine weitere halbe Stunde bei 37°C inkubiert. Die SAP konnte anschließend durch 20-minütige Inkubation bei 65°C inaktiviert werden. 3 Material und Methoden 59 3.2.2.12 Ligation von DNA-Fragmenten Für die Ligation von DNA-Fragmenten wurden vollständig restringierte Vektor-DNA und entsprechend restringierte insert-DNA im molaren Verhältnis 1:10 gemischt, mit 10-fach konzentriertem Ligationspuffer des Herstellers versetzt und mit A. bidest auf ein Gesamtvolumen von 19 µl verdünnt. Anschließend wurde dem Ansatz 3 U T4 DNA-Ligase zugesetzt. Danach wurde der Ansatz über Nacht bei 4°C oder für 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrolle diente ein Ansatz, in dem die insert-DNA durch Wasser ersetzt wurde. 3.2.2.13 Aufreinigung von DNA-Fragmenten PCR-Produkte und restringierte DNA wurden mit Hilfe des QIAprep Spin PCR Purification Kits der Firma Qiagen nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. 3.2.2.14 Agarosegel-Elektrophorese DNA-Fragmente (3.2.2.10) wurden mit Hilfe einer Agarosegel-Elektrophorese anhand ihrer Grösse aufgetrennt. Dazu wurden 1 % (w/v)-ige Agarosegele verwendet. Die Agarose wurde mit TAE-Puffer bis zum vollständigen Auflösen aufgekocht, nach Abkühlung auf ca. 50°C mit Ethidiumbromid (1 µg/ml) versetzt und in eine horizontale Gelkammer gegossen. Nach Überschichten des erhärteten Gels mit TAE-Puffer (3.1.5) wurden die Proben mit 6 x DNAProbenpuffer (s.u.) versetzt und zusammen mit einem Grössenstandard (3.1.4.8) auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung von 5 V/cm Gellänge durchgeführt. Die Identifizierung der DNA-Fragmente erfolgte durch Detektion des mit der DNA komplexierten Ethidiumbromids bei 320 nm auf dem UV-Transilluminator. 6x DNA-Probenpuffer: 10 25 30 0,1 0,1 mM mM % % % Tris HCl EDTA (v/v) Glycerin Xylen-Cyanol FF (w/v) Bromphenolblau 3.2.2.15 Gelelution von DNA-Fragmenten Gelelektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente wurden mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert. 3 Material und Methoden 60 3.2.3 Biochemische Methoden 3.2.3.1 Proteinbestimmung nach Bradford Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit Hilfe einer 1:5-Verdünnung des Bradford-Reagenz (Biorad). Durch Kalibrierung mit BSA kann die Proteinkonzentration aus der Eichgeraden ermittelt werden. Die Messungen wurden in 1,5 ml Kunstoffküvetten durchgeführt. Je Probe wurden 3 unabhängige Messungen durchgeführt und die Ergebnisse gemittelt. 3.2.3.2 SDS-PAGE Zur analytischen Auftrennung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts wurde die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli (1970) verwendet. Dazu wurde das Hoefer-System benutzt. Trenn- und Sammelgel wurden entsprechend den Tabellenangaben hergestellt (Tabelle 3.15). Das Trenngel wurde zwischen zwei Glasplatten mit Abstandshaltern gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Nach erfolgter Polymerisierung wurde der Alkohol abgegossen und der Raum über dem Trenngel mit Sammelgellösung (ohne TEMED) gespült. Das Sammelgel wurde gegossen und zur Ausformung der Probentaschen wurde ein Teflonkamm zwischen die Glasplatten in das Sammelgel eingebracht. Das Gel wurde dann in die Apparatur eingesetzt und die Pufferkammern wurden mit SDS-Laufpuffer (s.u.) gefüllt. Die mit SDS-Probenpuffer (s.u.) versetzten Proben wurden vor dem Auftragen für 5 Minuten bei 95°C vollständig denaturiert. Nach dem Auftragen der Proben erfolgte die Elektrophorese bei konstantem Stromfluss bei 30 mA pro Gel. 10 x SDS-Laufpuffer: 30,3 g/l 144,2 g/l 10 g/l Tris HCl Glycin SDS Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris HCl pH 6,8 Trenngelpuffer: 1,5 M Tris HCl pH 8,8 5 x SDS-Probenpuffer: 625 50 500 10 0,2 mM % mM % % Tris HCl pH (v/v) Glycerin DTE (w/v) SDS Bromphenolblau 6,8 Tabelle 3.15: Zusammensetzung von Sammel- und Trenngel der SDS-PAGE. Sammelgel 4 %-ig Trenngel 10 %-ig Acrylamidlösung 30 % 0,67 ml 3,33 ml Puffer (s.u.) 1,25 ml 2,5 ml A. bidest 3,05 ml 4 ml SDS 50 µl 0,1 ml APS 10 % (w/v) 25 µl 50 µl TEMED 5 µl 5 µl Trenngel 12 %-ig 4 ml 2,5 ml 3,35 ml 0,1 ml 50 µl 5 µl 3 Material und Methoden 61 3.2.3.3 Färbung von SDS-Gelen und PVDF-Membranen mit Coomassie Brilliant Blue Polyacrylamidgele (3.2.3.2) wurden mit Coomassie Brilliant Blue R250 gefärbt. Die Gele wurden nach der Elektrophorese für drei bis vier Stunden oder über Nacht in Färbelösung (s.u.) gelegt und unter Schwenken gefärbt. Danach wurden die Gele mit Entfärber (s.u.) wiederum unter Schwenken für ca. eine Stunde entfärbt. Zur Anfärbung von Proteinbanden auf PVDF-Membranen (3.2.3.5) wurde die Membran für 20 Sekunden in Färbelösung geschwenkt und anschließend ca. 2 Minuten mit Entfärbelösung gewaschen, bis klare Proteinbanden sichtbar wurden. Färbelösung für SDS-Gele: 40 10 0,25 % % % (v/v) Ethanol (v/v) Essigsäure (w/v) Coomassie Brilliant Blue R250 Färbelösung für PVDF-Membranen: 45 % 10 % 0,075 % (v/v) Methanol (v/v) Essigsäure (w/v) Coomassie Brilliant Blue G250 Entfärbelösung: 20 10 (v/v) Ethanol (v/v) Essigsäure % % 3.2.3.4 Silberfärbung von SDS-Gelen Das SDS-Gel (3.2.3.2) wurde für eine Stunde in Fixierlösung (s.u.) eingelegt. Alle Inkubationen fanden unter leichtem Schwenken statt. Anschließend wurde das Gel dreimal je 20 Minuten in Waschlösung (s.u.) inkubiert. Dann wurde es für eine Minute in Natriumthiosulfatlösung (s.u.) gelegt und dreimal für 20 Sekunden in A. bidest gewaschen. Darauf folgte die Inkubation für 20 Minuten in Färber (s.u.) und erneutes, zweimaliges Waschen für je 20 Sekunden mit A. bidest. Danach wurde das Gel für 10 Minuten in Entwickler (s.u.) inkubiert. Zum Abbrechen der Färbung wurde das Gel kurz mit A. bidest gespült und dann in Stoplösung (s.u.) gelegt. Fixierer: 50 12 0,5 % % ml/l (v/v) Ethanol (v/v) Essigsäure Formaldehyd 37 % (w/v) Waschlösung: 50 % (v/v) Ethanol Natriumthiosulfatlösung (100 ml): 0,01 g Natriumthiosulfatpentahydrat Färber (100 ml 10 x): 1 0,7 % ml (w/v) Silbernitrat Formaldehyd 37 % Entwickler (200 ml 5 x): 15 0,5 2 % ml mg (w/v) Natriumcarbonat Formaldehyd 37 % (w/v) Natriumthiosulfat 3 Material und Methoden Stoplösung: 62 50 12 % % (v/v) Methanol (v/v) Essigsäure 3.2.3.5 Western Blot Im Western Blot wurden Proteine aus SDS-Gelen (3.2.3.2) elektrophoretisch auf eine Polyvinyldifluorid- (PVDF) Membran übertragen. Der Transfer erfolgte in einer Halbtrockenzelle (Biometra). Auf die Anodenplatte wurden zunächst zwei in Anodenpuffer (s.u.) getränkte Whatmanpapiere gelegt. Darauf wurde dann die in Methanol getränkte und in Anodenpuffer gewaschene, auf Gelgrösse zugeschnittene PVDF-Membran, das Gel und zwei in Kathodenpuffer (s.u.) getränkte Whatmanpapiere geschichtet. Die abschließende Kathodenplatte wurde während des Elektrotransfers mit Eis gekühlt. Der Transfer wurde unter den unten angegebenen Bedingungen durchgeführt (Tabelle 3.16). Anodenpuffer: Kathodenpuffer: 300 100 mM mM Tris Tricin 300 30 mM mM Capronsäure Tris pH 8,7 Tabelle 3.16: Parameter zum Blotten von SDS-Gelen. 1 Gel 2 Gele Stromstärke 300 mA 450 mA Transferzeit 15 Minuten 20 Minuten 3 Gele 450 mA 25 Minuten pH 8,8 4 Gele 600 mA 30 Minuten 3.2.3.6 Immunologischer Nachweis von Proteinen im Western Blot (Immunoblot) Der spezifische Nachweis rekombinanter Proteine auf PVDF-Membranen erfolgte mit Hilfe von Antikörpern, die gegen ein Epitop der entsprechenden Proteine gerichtet waren. Für die ECL-Detektion wurde der primäre Antikörper von einem sekundären Antikörper und evtl. von einem weiteren Konjugat gebunden. Dieser Antikörper bzw. das Konjugat war kovalent an die Meerrettich-Peroxidase gekoppelt. Zunächst wurden unspezifische Bindungsstellen auf der Membran durch Inkubation mit Blockierungslösung (4 % (w/v) Magermilchpulver in TBST-Puffer (3.1.5)) für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C abgesättigt. Alle Inkubationen wurden unter Schwenken durchgeführt. Es folgte die Bindung des ersten Antikörpers für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Die Antikörper wurden in verschiedenen Konzentrationen (3.1.4.7) in Blockierlösung verdünnt und 0,1 ml pro cm2 Membran eingesetzt. Die Membran wurde danach dreimal 10 Sekunden und dreimal 10 Minuten mit TBST gewaschen. Mit dem sekundären und/oder dem tertiären Antikörper wurde entsprechend verfahren. Zur Visualisierung der Proteinbanden wurde der ECL Plus-Kit (Amersham Pharmacia) den Angaben des Herstellers entsprechend verwendet. 3 Material und Methoden 63 3.2.3.7 Immunzytochemischer Nachweis von Proteinen Zum immunologischen Nachweis von Proteinen in Säugerzellen wurden diese in 6 wellPlatten transfiziert (3.2.1.4.2). Nach erfolgter Expression der Proteine wurde das Medium aus den wells entnommen, und die auf Deckgläschen gewachsenen Zellen wurden zunächst mit PBS (3.1.5) gewaschen. Dann wurden sie für 10 Minuten mit 3,7 % (w/v) Formaldehyd in PBS fixiert. Alle Inkubationen erfolgten im Dunkeln, um ein Ausbleichen fluoreszierender Proteine zu vermeiden. Danach wurde zweimal kurz mit PBS gewaschen. Es folgte eine Inkubation für 10 Minuten mit 0,1 % (v/v) Triton-X 100 in PBS zur Permeabilisierung der Zellmembranen. Nach anschließendem, dreimaligen Waschen mit PBS wurden die Deckgläschen mit den Zellen in neue wells gelegt und für 1 Stunde mit 2 % (w/v) BSA in PBS abgesättigt, um unspezifische Bindung der Antikörper zu vermeiden. Alle Antikörper wurden in 2 % (w/v) BSA-haltigem PBS gelöst und verdünnt (3.1.4.7). Zur Inkubation mit dem primären Antikörper für 45 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Deckgläschen mit 150 µl Antikörperlösung betropft. Nach der Inkubation wurden die Deckgläschen dreimal kurz und dreimal für 10 Minuten mit PBS gewaschen. Darauf folgte auf gleiche Weise die Inkubation mit dem fluoreszenzmarkierten, sekundären Antikörper und /oder mit PhalloidinTRITC (3.1.4.7). Nach erneutem Waschen mit PBS wurden die Deckgläschen abschließend mit einem luftblasenfreien Tropfen Mowiol (ca. 20 µl) auf Objektträgern eingebettet und über Nacht abgedunkelt an der Luft getrocknet. 3.2.3.8 Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie Um Nukleotide nachzuweisen, wurde die Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie verwendet (HPLC, high pressure liquid chromatography). Die Auftrennung erfolgte durch Ionenpaarbindung zwischen den negativ geladenen Phosphatgruppen der Nukleotide und den positiv geladenen Tetrabutylammoniumionen, deren hydrophober Acylanteil mit der hydrophoben Festphasen-Matrix (C-18) interagiert. Unter diesen Bedingungen nimmt die Retentionszeit mit steigender Zahl von Phosphatgruppen zu. Die Nukleotidkonzentration konnte mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten nach dem Lambert-Beer´schen Gesetz aus der optischen Dichte bei 254 nm berechnet werden (ε254 (GXP) = 16.700 l⋅mol-1⋅cm-1, ε254 (mGXP) = 22.000 l⋅mol-1⋅cm-1). Durch Kalibrierung des HPLC-Durchflussphotometers konnten sowohl die Zusammensetzung als auch die Nukleotidkonzentration der Probe bestimmt werden. Die Flussgeschwindigkeit betrug 1,6 ml/min. HPLC-Puffer: 3,2 5,7 9,3 0,013 7,5 bzw. 20 g/l g/l g/l g/l % Tetrabutylammoniumbromid K2HPO4 KH2PO4 NaN3 pH 6,5 (v/v) Acetonitril Acetonitril wurde nach dem Lösen der Chemikalien in Wasser und dem Entgasen des Puffers zugegeben. Nukleotide wurden im Puffer mit 7,5 % (v/v) Acetonitril getrennt; mantNukleotide mit 20 % (v/v) Acetonitril. 3 Material und Methoden 64 3.2.3.9 Reinigung von His6-Rop4 Rop4 wurde als N-terminale Fusion mit einem Histidinhexapeptid (His6-Rop4) aus einer 10 lExpressionskultur gereinigt (3.2.1.1.4). Die Bakterien wurden in 100 ml Aufschlusspuffer resuspendiert (s.u.). Nach dem Äquilibrieren der Nickel-NTA-Agarose-Säule mit 5-10 Säulenvolumen (SVol) Aufschlusspuffer (2 ml/min) wurde der Überstand (3.2.1.1.5) His6Rop4-exprimierender E. coli-Bakterien mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min auf die Säule aufgetragen. Anschließend wurde mit 2 ml/min Waschpuffer (s.u.) gewaschen, bis eine stabile Basislinie erreicht worden war (etwa 10-20 SVol). Zur Elution des Fusionsproteins wurde ein Gradient mit steigender Imidazolkonzentration (Elutionspuffer, s.u.) an die Säule angelegt, der sich über 5 SVol erstreckte. Die Elution erfolgte mit 0,5 ml/min. Nach Ablauf des Gradienten wurde für weitere fünf SVol mit 1 ml/min Elutionspuffer gespült. Das eluierte Protein wurde durch Zentrifugation in Vivaspin-Röhrchen mit einem Ausschlussvolumen von 10 kD bei 3000 g und 4°C auf etwa 20 mg/ml aufkonzentriert und dann zur Gelfiltration eingesetzt. Dazu wurde eine Gelfiltrationssäule (Hi-LoadTM Superdex 200, Amersham Pharmacia) mit 2 SVol Gelfiltrationspuffer (s.u.) äquilibriert (1 ml/min). Aufkonzentriertes His6-Rop4 wurde auf die Säule aufgetragen (0,5 ml/min), und im Weiteren wurde mit 1 ml/min Puffer gespült. Das eluierende Protein wurde in 3 ml Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen, die nach Analyse durch SDS-PAGE (3.2.3.2) monomeres, reines Protein enthielten, wurden zusammengeführt und wiederum auf 20 mg/ml aufkonzentriert. Das Protein wurde nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff bei -80°C gelagert. Aufschlusspuffer: 150 5 5 5 10 mM mM % mM mM PBS NaCl MgCl2 (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol Imidazol Imidazol wurde den Puffern aus einer 2 M Stammlösung in PBS zugefügt. Waschpuffer: 350 5 5 5 20 mM mM % mM mM PBS NaCl MgCl2 (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol Imidazol 150 5 5 5 500 mM mM % mM mM PBS NaCl MgCl2 (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol Imidazol Elutionspuffer: 3 Material und Methoden Gelfiltrationspuffer: 65 50 150 5 5 5 mM mM mM % mM Tris pH 7,6 NaCl MgCl2 (v/v) Glycerin DTE 3.2.3.10 Reinigung von GST-RopGAP2 aus E. coli RopGAP2 wurde als N-terminale Fusion mit der Glutathion-S-Transferase (GST-RopGAP2) aus einer 2 l-Expressionskultur (3.2.1.1.4) gereinigt. Das Bakteriensediment wurde in 30 ml Aufschlusspuffer (s.u.) resuspendiert. Überstände GST-RopGAP2 (und -Derivate, z.B. GSTRopGAP2∆70)-exprimierender Bakterien (3.2.1.1.5) wurden nach dem Äquilibrieren der GSH-Sepharose-Säule (5 SVol Aufschlusspuffer, 2 ml/min) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min auf die Säule aufgetragen. Dann wurde bis zum Erreichen einer stabilen Basislinie mit 2 ml/min Waschpuffer (s.u.) gewaschen (etwa 10 SVol). Die Elution erfolgte bei 0,5 ml/min mit einem GSH-Gradienten (Elutionspuffer, s.u.), der sich über 5 SVol erstreckte. Danach wurde mit fünf SVol Elutionspuffer mit 1 ml/min weiter gespült. Das eluierte Protein wurde durch Zentrifugation in Vivaspin-Röhrchen mit einem Ausschlussvolumen von 20 kD bei 3000 g und 4°C auf etwa 10 mg/ml aufkonzentriert und dann zur Gelfiltration eingesetzt. Eine Gelfiltrationssäule (Hi-Load Superdex 200, Amersham Pharmacia) wurde mit 2 SVol Gelfiltrationspuffer (s.u.) äquilibriert (1 ml/min), und das aufkonzentrierte Protein wurde auf die Säule aufgetragen (0,5 ml/min). Die Elution erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min. Das eluierende Protein wurde in 3 ml Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen, die nach Analyse durch SDS-PAGE (3.2.3.2) monomeres, reines Protein enthielten, wurden zusammengeführt und auf 5 mg/ml aufkonzentriert. Das Protein wurde nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff bei -80°C gelagert. Aufschlusspuffer: 5 5 % mM PBS (v/v) Glycerin DTE Dem Aufschlusspuffer wurde 1 Tablette pro 50 ml Proteaseinhibitoren complete (Roche) zugesetzt. Waschpuffer: 350 5 5 mM % mM PBS NaCl (v/v) Glycerin DTE 5 5 20 % mM mM PBS (v/v) Glycerin DTE GSH Elutionspuffer: Nach der Zugabe von GSH wurde der pH-Wert auf 7,6 eingestellt. 3 Material und Methoden 66 Gelfiltrationspuffer: 50 150 5 5 mM mM % mM Tris pH 7,6 NaCl (v/v) Glycerin DTE 3.2.3.11 Reinigung von RopGAP2 aus Sf21-Zellen Zur Isolierung von RopGAP2∆70 als N-terminale Fusion mit einem Histidinhexapeptid und der Glutathion-S-Transferase (His-GST-RopGAP2∆70) aus Sf21-Zellen (3.2.1.3.7) wurde das Zellsediment (aus 100 ml Kultur) zunächst in 6 ml Aufschlusspuffer resuspendiert (s.u.). Die Zellsuspension wurde durch Ultraschallbehandlung im Eisbad aufgeschlossen. Die Behandlung erfolgte zwei bis drei mal für je 10 Sekunden (Mikrospitze; Stufe 5). Nach dem Aufschluss wurde NaCl aus einer 5 M Stammlösung bis zu einer Konzentration von 300 mM und Imidazol (aus einer 2 M Stammlösung) zu einer Konzentration von 10 mM zugegeben. Dann wurde das Lysat für 45 Minuten bei 40000 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und auf eine zuvor mit Äquilibrierungspuffer (s.u.) äquilibrierte Nickel-NTA-Agarosesäule (0,5 ml) aufgetragen. Anschließend wurde die Säule mit 40 ml Waschpuffer (s.u.) gewaschen. Die Elution erfolgte in drei Schritten mit je 2 ml Elutionspuffer (s.u.). Die Fraktion, die das Fusionsprotein enthielt, wurde durch Auftropfen von 1 µl auf Nitrozellulose und anschließende Färbung der Membran mit Ponceau S-Lösung identifiziert. Sie wurde ca. 16 Stunden gegen Gelfiltrationspuffer dialysiert. Dann wurde das Protein für 4 bis 8 Stunden mit Precisionprotease (5 U pro mg Fusionsprotein) versetzt und bei 4°C inkubiert. Während dieser Zeit wurde eine GSH-Sepharose-Säule (0,5 ml) mit Gelfiltrationspuffer (s.u.) äquilibriert. Der Ansatz wurde dann auf die GSH-Säule aufgetragen, um die abgespaltene His6-GST-Sequenz des ursprünglichen Fusionsproteins und die Protease, die ebenfalls ein GST-Fusionsprotein ist, abzutrennen. Der Durchlauf wurde in VivaspinRöhrchen mit einem Ausschlussvolumen von 20 kD bei 3000 g und 4°C auf 5 mg/ml aufkonzentriert. Eine S200 Gelfiltrationssäule (Hi-Load Superdex 200, Amersham Pharmacia) wurde mit 2 SVol Gelfiltrationspuffer (0,2 ml/min) gewaschen, und das konzentrierte Protein wurde aufgetragen. Es wurden Fraktionen à 0,5 ml gesammelt. Nach Analyse mit SDS-PAGE (3.2.3.2) wurden die Fraktionen, die reines, lösliches RopGAP2∆70 enthielten, zusammengeführt und schockgefroren. Aufschlusspuffer: 25 3 5 mM mM % NaH2PO4/Na2HPO4 pH 8,0 β-Mercaptoethanol (v/v) Glycerin Dem Aufschlusspuffer und dem Waschpuffer wurden je 1 Tablette pro 50 ml Proteaseinhibitoren complete (Roche) zugesetzt. Imidazol wurde den Puffern aus einer 2 M Stammlösung in PBS zugefügt. Äquilibrierungspuffer: 25 300 10 3 5 mM mM mM mM % NaH2PO4/Na2HPO4 pH 8,0 NaCl Imidazol β-Mercaptoethanol (v/v) Glycerin 3 Material und Methoden 67 Waschpuffer: 25 300 25 3 5 mM mM mM mM % NaH2PO4/Na2HPO4 pH 8,0 NaCl Imidazol β-Mercaptoethanol (v/v) Glycerin Elutionspuffer: 25 300 250 3 5 mM mM mM mM % NaH2PO4/Na2HPO4 pH 8,0 NaCl Imidazol β-Mercaptoethanol (v/v) Glycerin Gelfiltrationspuffer: 50 150 5 5 mM mM % mM Tris pH 7,6 NaCl (v/v) Glycerin DTE 3.2.3.12 Reinigung von GST-RIC6 und GST-RIC9 RIC6 und RIC9 wurden als N-terminale Fusionen mit der Glutathion-S-Transferase (GSTRIC6 und GST-RIC9) aus 3 l-Expressionskulturen gereinigt (3.2.1.1.4). Die Überstände GSTRIC6- bzw. GST-RIC9-exprimierender Bakterien (3.2.1.1.5) wurden nach dem Äquilibrieren der GSH-Sepharose-Säule (5 SVol Aufschlusspuffer, 2 ml/min, s.u.) mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min auf die Säule aufgetragen. Dann wurde bis zum Erreichen einer stabilen Basislinie mit 2 ml/min Waschpuffer (s.u.) gewaschen (etwa 10 SVol). Die Elution erfolgte bei 0,5 ml/min mit einem GSH-Gradienten (Elutionspuffer, s.u), der sich über 5 SVol erstreckte. Danach wurde mit fünf SVol Elutionspuffer mit 1 ml/min weiter gespült. Das eluierte Protein wurde durch Zentrifugation in Vivaspin-Röhrchen mit einem Ausschlussvolumen von 20 kD bei 3000 g und 4°C auf etwa 2 mg/ml aufkonzentriert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Proteine wurden bei -80°C gelagert. Aufschlusspuffer: 20 150 5 3 200 5 mM mM % mM µM mM Tris pH 7,6 NaCl (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol Pefabloc EDTA Dem Aufschlusspuffer wurden 2 Tabletten pro 50 ml Proteaseinhibitoren complete (Roche) zugesetzt. Waschpuffer: 20 300 5 3 200 5 mM mM % mM µM mM Tris pH 7,6 NaCl (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol Pefabloc EDTA 3 Material und Methoden 68 Elutionspuffer: 20 150 5 3 10 mM mM % mM mM Tris pH 7,6 NaCl (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol GSH Nach der Zugabe von GSH wurde der pH-Wert auf 7,6 eingestellt. 3.2.3.13 Proteolytischer Verdau im Gel und MALDI-Analyse Die zu untersuchenden Banden wurden mit einem Skalpell aus einem mit Coomassie Brilliant Blue gefärbten SDS-Gel (3.2.3.2, 3.2.3.3) ausgeschnitten und in ca. 1 mm x 1 mm grosse Stücke zerkleinert. Die Gelstücke wurden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß transferiert und zweimal für 10 Minuten in 1 ml A. bidest gewaschen. Alle Inkubationen erfolgten, soweit nichts anderes angegeben wird, bei Raumtemperatur. Das Wasser wurde abgenommen, und die Gelstückchen wurden für 10 Minuten mit 15 µl 100 % Acetonitril bedeckt. Nachdem die Gelstückchen eingeschrumpft waren, wurde das Acetonitril abgenommen und durch 15 µl 100 mM NH4CO3 ersetzt. Nach 5-minütiger Inkubation wurden erneut 15 µl Acetonitril zugegeben und für 15 Minuten weiter inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgesaugt, und die Gelstückchen wurden für 30 Minuten in der Speed Vac getrocknet. Die getrockneten Gelstückchen wurden mit 20 µl 10 mM DTT / 100 mM NH4CO3 wieder aufgeschwemmt und für 45 Minuten bei 56°C inkubiert. Daraufhin wurde der Überstand abgenommen und 5 Minuten in 20 µl Acetonitril inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das Acetonitril wieder abgenommen und durch 20 µl 55 mM Jodacetamid ersetzt. Der Ansatz wurde für 15 Minuten bei Dunkelheit inkubiert. Danach wurde der Überstand entfernt, und die Gelstückchen wurden für 5 Minuten mit 20 µl 100 mM NH4CO3 gewaschen. Dann wurden sie für 5 Minuten mit 20 µl Acetonitril eingeschrumpft. Der Überstand wurde entfernt, und die Probe wurde für 30 Minuten in der Speed Vac getrocknet. Für den proteolytischen Verdau wurden die Gelstückchen mit 80 µl Verdauungspuffer (s.u.) mit 1 µl Trypsin (2,5 mg/ml) bedeckt und für 45 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wurde der Überstand entfernt, die Gelstückchen mit 20 µl Verdauungspuffer ohne Trypsin benetzt, und für 8 bis 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Um die Peptide aus den Gelstückchen zu extrahieren, wurde die Restfeuchte abgenommen und zunächst aufbewahrt. Dann wurden die Gelstückchen mit 15 µl 25 mM NH4CO3 bedeckt, 15 Minuten inkubiert, und anschließend wurden 15 µl Acetonitril zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten wurde die Flüssigkeit abgenommen und ebenfalls aufbewahrt. Die Gelstückchen wurden daraufhin mit 10 µl 5 % (v/v) Essigsäure versetzt und 15 Minuten unter Schütteln inkubiert. Dann wurden 10 µl Acetonitril zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten wurde der Überstand wiederum abgenommen und verwahrt. Zuletzt wurden 10 µl Acetonitril zu den Gelstückchen gegeben und nach 15 Minuten wieder abgenommen. Alle vier Extrakte wurden vereint und als 1:10-Verdünnung für die MALDI-Analyse eingesetzt. Die Massenspektren wurden an einem Elektrospray-Ionisations-LCQ-Massenspektrometer mit Nano-ElektrosprayIonenquelle (Finnigan) aufgenommen. Verdauungspuffer: 50 5 mM mM NH4CO3 CaCl2 3 Material und Methoden 69 3.2.3.14 Nukleotidaustausch an Rop4 Für den Nukleotidaustausch an Rop4 wurde die Tatsache ausgenutzt, dass die Dissoziationsrate des Nukleotids abhängig von der Magnesiumkonzentration ist. Durch EDTA-Zugabe wurde Mg2+ komplexiert. Dies führt zu einer Schwächung der Nukleotidbindung, und es wird dasjenige Nukleotid von Rop4 gebunden, das im Überschuss im Ansatz vorhanden ist. Um an Rop gebundenes GDP gegen GTP auszutauschen, wurden 500 µM Rop4*GDP mit 10 mM EDTA und 50 mM GTP (500-facher Überschuss gegenüber Rop4) in 100 µl Austauschpuffer (s.u.) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Alle weiteren Arbeiten erfolgten bei 4°C. In der Inkubationszeit wurde eine NAP-5-Säule (Amersham Pharmacia) mit 5 Säulenvolumen Austauschpuffer äquilibriert. Wurde das Protein nach dem Austausch aufkonzentriert, so wurden dem Puffer 5 mM Magnesiumchlorid zugesetzt. Der Austauschansatz wurde auf die NAP-5-Säule aufgetragen. Sobald die Probe in das Säulenbett eingelaufen war, wurden 200 µl Puffer zugegeben, dann erneut 1 ml. Es wurden 15 Fraktionen à 2 Tropfen aufgefangen. Von jeder Fraktion wurde 1 µl auf eine Nitrozellulosemembran aufgetragen. Die Membran wurde eine Minute in Ponceau S-Färbelösung (Pharmacia) gefärbt und in A. bidest entfärbt. Die proteinhaltigen Fraktionen außer den letzten, nur noch schwach gefärbten Fraktionen, wurden zusammengeführt und die Nukleotidzusammensetzung und die GTPKonzentration wurden mittels HPLC (3.2.3.8) bestimmt. Austauschpuffer: evtl. 50 150 5 3 5 mM mM % mM mM Tris pH 7,6 NaCl (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol MgCl2 Beim Austausch zu GppNHp, GppCH2p und mGppNHp wurde anstelle eines 500-fachen Nukleotidüberschusses nur ein zweifacher Überschuss eingesetzt. Das gebundene Nukleotid wurde dabei während des Austausches durch Zusatz alkalischer Phosphatase (5U/mg Rop4) zum Austauschansatz verdaut. Beim Austausch zu mGDP wurde ein zehnfacher Überschuss eingesetzt, jedoch keine alkalische Phosphatase verwendet. 3.2.3.15 Nukleotidbefreiung von Rop4 Um Rop4 von Nukleotid zu befreien, wurde das gebundene GDP zunächst zu GppCH2p ausgetauscht (3.2.3.14). Dann wurde GppCH2p durch Zugabe von Phosphodiesterase (1 µl/mg Rop4) abgebaut. Die Inkubation mit der Phosphodiesterase erfolgte 8-16 Stunden bei 4°C. Anschließend wurde der Abbau des GppCH2p durch HPLC (3.2.3.8) überprüft. Anschließend wurde der Nukleotidbefreiungsansatz über eine NAP-5-Säule gereinigt (s.o.). 3.2.3.16 Messung der intrinsischen GTP-Hydrolyse durch Rop4 Die intrinsische Hydrolyserate wurde mittels Umkehrphasen-HPLC (3.2.3.8) bestimmt. 250 µl Rop4*GTP (100 µM) wurden dazu im Hydrolysepuffer (s.u.) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Hydrolysereaktion wurde durch Zugabe von MgCl2 ad. 15 mM gestartet. Zu 3 Material und Methoden 70 Beginn und nach 10 bis 120 Minuten wurden je 25 µl entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Zur Analyse mittels HPLC (3.2.3.8) wurden die Proben bei 95°C aufgetaut und das Protein denaturiert. Die Nukleotidkonzentration wurde gegen die Zeit aufgetragen. An die Daten wurde eine einfach exponentielle Funktion angepasst, deren Exponent die intrinsische Hydrolyserate angibt. Hydrolysepuffer: 50 150 5 3 mM mM % mM Tris pH 7,6 NaCl (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol 3.2.3.17 Michaelis-Menten-Kinetik Zur Aufnahme der Michaelis-Menten-Kinetik wurden steigende Mengen Rop4*GTP (100 bis 1000 µM) in Hydrolysepuffer (s.u.) mit 1 µM RopGAP2∆70 gemischt und nach 2 Minuten in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Nukleotidzusammensetzung der Proben wurde wiederum mittels Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Zur Analyse mittels HPLC (3.2.3.8) wurden die Proben bei 95°C aufgetaut und das Protein denaturiert. Der Nukleotidumsatz wurde gegen die entsprechende Rop4-Konzentration aufgetragen. An die Daten wurde eine einfach exponentielle Funktion angepasst, deren Amplitude die Maximalgeschwindigkeit angibt. Die Michaeliskonstante entspricht der Rop4-Konzentration, bei der die Geschwindigkeit halbmaximal ist. Hydrolysepuffer: 50 150 5 3 mM mM % mM Tris pH 7,6 NaCl (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol 3.2.3.18 pull down aus Cos7-Zelllysaten 500 µl GSH-Sepharose (50 % (v/v)) wurden zunächst dreimal mit je 2 ml GST-Fish-Puffer (s.u.) gewaschen und dann in Puffer (s.u.) aufgenommen, so dass wieder eine 50 % (v/v) -ige Lösung entstand. Anschließend wurden 400 µl dieser Lösung mit 1 ml Lysat GST-PAK1 RBD-exprimierender Bakterien versetzt. Nach 30 Minuten Inkubation auf einem Rotator bei 4°C wurde der Überstand abgenommen und das Sepharose-Material erneut fünfmal mit je 1 ml Puffer gewaschen. Bis zur Verwendung im pull down-Experiment wurde die gekoppelte Sepharose in 1 ml Puffer bei 4°C gelagert. Cos7-Zellen (3.1.11.3) wurden auf Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm angezogen und transfiziert (3.2.1.4.3). Für einen Ansatz wurden jeweils zwei Schalen benötigt. Nach zwei Tagen Inkubation wurde das Medium abgesaugt. Die Schalen wurden im weiteren auf Eis gelagert. Die Zellen wurden mit 5 ml eiskaltem PBS (3.1.5) gewaschen und mit 1 ml GST-Fish-Puffer mit Protease-Inhibitoren (Aprotinin, Benzamidin, Leupeptin, Pepstatin, Pefabloc, jeweils 1:1000) bedeckt. Die Zellen wurden mit einem Gummispatel von den Platten abgelöst, und die Suspension in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt. Die Proben 3 Material und Methoden 71 wurden 5 Minuten bei 13000 rpm (Tischzentrifuge) und 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Pro Ansatz wurden 100 µl der mit GST-PAK1 RBD gekoppelten GSH-Sepharose (s.o.) in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß mit dem Lysat der Cos7-Zellen versetzt, von dem zuvor 50 µl zur Kontrolle des Gesamtproteins im Lysat einbehalten wurden. Die Ansätze wurden 30 Minuten bei 4°C und 165 rpm auf einem Rotator inkubiert. Danach wurde die GSHSepharose dreimal mit GST-Fish-Puffer (versetzt mit Protease-Inhibitoren im Verhältnis 1:1000) gewaschen und anschließend mit einer Spritze mit feiner Kanüle trockengesaugt. Nach Zugabe von 20 µl 2 x SDS-Probenpuffer (3.2.3.2) wurde der Ansatz zur Denaturierung gebundener Proteine 5 Minuten auf 95°C erhitzt und abschließend per SDS-PAGE (3.2.3.2), Western Blot (3.2.3.5) und Antikörper-Reaktion (3.2.3.6) analysiert. Die Auftragung der Gesamtlysate stellte hierbei eine Kontrolle dar. GST-Fish-Puffer: 50 100 2 10 1 mM mM mM % % Tris HCl pH 7,4 NaCl MgCl2 (v/v) Glycerin (w/v) Igepal CA-630 Puffer für Kopplung: 50 150 1 5 mM mM mM mM Tris HCl NaCl MgCl2 DTT pH 7,5 3.2.3.19 In vitro pull down-Interaktionstest Für den in vitro pull down-Versuch wurde zunächst die GSH-Sepharose drei mal mit je 1 ml Puffer (s.u.) gewaschen und bei 3000 rpm (Tischzentrifuge) für 2 Minuten abzentrifugiert. Pro Ansatz wurden 20 µl 50 % (v/v)-ige GSH-Sepharose-Suspension verwendet. Zur Kopplung des GST-Fusionsproteins an die GSH-Sepharose wurden 20 µl GSH-Sepharose-Suspension (50 %ig) mit 100 µg GST-Fusionsprotein und 100 µg BSA (10 mg/ml) in 1 ml Puffer für eine Stunde auf dem Rotator bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die gekoppelte GSHSepharose bei 3000 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert und zweimal mit je 1 ml Puffer gewaschen. Dann wurde die GSH-Sepharose in 1 ml Puffer aufgenommen und mit 25 µg HisRop4*GppNHp (3.2.3.9, 3.2.3.14) versetzt. Darauf folgte eine weitere Inkubation für eine Stunde bei 4°C auf dem Rotator. Die GSH-Sepharose wurde dann fünfmal mit je 1 ml Waschpuffer gewaschen. Der Überstand nach dem letzten Zentrifugieren (immer bei 3000 rpm) wurde mit einer Spritze komplett abgesaugt und das Pellet in 50 µl 1-fachem SDSProbenpuffer (3.2.3.2) aufgenommen. Die Probe wurde 5 Minuten im Heizblock bei 95°C inkubiert, kurz anzentrifugiert, und dann der Überstand für die Analyse mit SDS-PAGE (3.2.3.2) und Western Blot (3.2.3.5) verwendet. Puffer: 30 100 3 5 5 mM mM mM % mM Tris pH 8,0 NaCl β-Mercaptoethanol Glycerol MgCl2 3 Material und Methoden 72 3.2.4 Fluoreszenzspektroskopische Methoden 3.2.4.1 Bestimmung der Nukleotiddissoziationsrate Zur fluoreszenzspekrometrischen Bestimmung der Nukleotiddissoziationsrate von Rop4 wurde das Protein zunächst mit mant-GDP bzw. mant-GppNHp beladen (3.2.3.14). Die Messungen wurden im Perkin-Elmer LS50B-Fluoreszenzspektrometer durchgeführt. Durch den Einsatz eines Küvettenwechslers können vier Küvetten à 1200 µl in 20 sec-Intervallen simultan gemessen werden. Die Exzitationswellenlänge beträgt 366 nm, die Emissionswellenlänge 450 nm. Standardmäßig wurde für die Messung eine Temperatur von 22°C gewählt. Die mit fluoreszenzmarkiertem Nukleotid beladene GTPase wurde in einer Konzentration von 400 nM in einem Volumen von 1200 µl vorgelegt und die Messung gestartet. Je nach Anfangsfluoreszenz wurden die Schlitzbreiten variiert (Exzitation: 5-15 mm; Emission: 10-20 mm). Dann wurde nicht markiertes Nukleotid (GTP, GDP oder GppNHp) und evtl. Tiam1 hinzu pipettiert. Messpuffer: 50 150 5 5 3 mM mM mM % mM Tris HCl NaCl MgCl2 (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol pH 7,6 Die gemessene Fluoreszenz wurde gegen die Zeit aufgetragen. Die Auswertung der Daten erfolgte durch das Anpassen einer einfach exponentiellen Funktion an die Messpunkte. Der Exponent der Funktion gibt die Rate der Nukleotiddissoziation an. 3.2.4.2 Bestimmung der Aktivierungsenergie der Nukleotiddissoziation Für die Bestimmung der Aktivierungsenergie der Nukleotiddissoziation wurden die Dissoziationsraten von mGDP und mGppNHp von Rop4 bei 10°C, 16°C, 22°C, 30°C und 37°C bestimmt (3.2.4.1). Zur Berechnung der Aktivierungsenergie der Nukleotiddissoziation wurde der natürliche Logarithmus der Dissoziationsraten gegen den Kehrwert der jeweiligen Temperatur in K aufgetragen (Arrheniusdiagramm). An die Punkte wurde eine Gerade angepasst, deren Steigung der Aktivierungsenergie der Nukleotiddissoziation entspricht. 3.2.4.3 Magnesiumabhängigkeit der Nukleotiddissoziation Für die Bestimmung der Magnesiumabhängigkeit der Nukleotiddissoziation wurden die Dissoziationsraten von mGDP und mGppNHp von Rop4 bei MgCl2-Konzentrationen zwischen 5 µM und 100 mM bestimmt (3.2.4.1). Es wurde vorausgesetzt, dass Mg2+ unabhängig und nicht mit der Dissoziation von Nukleotid gekoppelt aus dem ternären Rop4*Nukleotid*Mg2+ Komplex dissoziieren kann. Rop4 wurde mit mGDP bzw. mGppNHp beladen (3.2.3.14), wobei sich kein MgCl2 in dem verwendeten Austauschpuffer befand. Das mit fluoreszenzmarkiertem Nukleotid beladene 3 Material und Methoden 73 Rop4 wurde dann in Puffern der verschiedenen Magnesiumkonzentrationen verdünnt und die Nukleotiddissoziationsraten wurden ermittelt. Die Raten (kobs) wurden gegen die Magnesiumkonzentration aufgetragen und mit der folgenden Funktion ausgewertet (Rudolph 1998): kobs = k2 k3 + cMg2+ K1 1+ 1+ K1 cMg2+ (2) 3.2.4.4 Fluoreszenzpolarisationstitration Fluoreszenzpolarisationstitrationen wurden an einem FluoroMax II Fluoreszenzspektrometer (Spex Instruments, Grasbrunn) in Quarzglasküvetten (0,6 ml Volumen, Hellma, Mülheim) gemessen. Die Polarisatoren im Strahlengang des Anregungs- und des Emissionslichts wurden durch die FluoroMax-Software automatisch gesteuert. Die Messungen mit GST-RIC9 (3.2.3.12) und Rop4*mGppNHp bzw. Rop4*mGDP (3.2.3.9, 3.2.3.14, 100 nM) erfolgten in dem unten angegebenen Puffer. Die Anregungswellenlänge betrug 366 nm und die Emissionswellenlänge 450 nM. Puffer: 30 5 3 5 mM mM mM % Tris pH 7,6 MgCl2 β-Mercaptoethanol (v/v) Glycerin 3.2.4.5 Fluoreszenztitration Zur Bestimmung der Gleichgewichtsdissoziationskonstante der Interaktion zwischen Rop4 und RopGAP2 wurde Rop4 mit mGppNHp beladen (3.2.3.14) und in einer Konzentration von 400 nM in einem Volumen von 1200 µl Puffer (s.u.) in einer Küvette vorgelegt. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte im Perkin-Elmer LS50B-Fluoreszenzspektrometer. Die Exzitationswellenlänge betrug 366 nm, die Emissionswellenlänge 450 nm. Alle Fluoreszenztitrationen wurden bei 22°C durchgeführt. Nachdem die Probe temperiert war, wurde die Messung gestartet. Sobald das Fluoreszenzsignal stabil war, wurde RopGAP2∆70 bzw. RopGAP2∆132 in 50 nM Schritten zutitriert und die Fluoreszenz dabei verfolgt. Die Fluoreszenzänderungen wurden gegen die RopGAP2-Konzentrationen aufgetragen und die Dissoziationsgleichgewichtskonstanten durch Anpassen einer quadratischen Gleichung an die Datenpunkte errechnet. Messpuffer: 50 150 5 5 3 mM mM mM % mM Tris HCl NaCl MgCl2 (v/v) Glycerin β-Mercaptoethanol pH 7,6 3 Material und Methoden 74 3.2.4.6 stopped flow-Messung Die Nukleotidassoziation an nukleotidfreies Rop4 (3.2.3.15) wurde mit Hilfe der stopped flow-Apparatur (Applied Photophysics SX16MV) aufgenommen. Das Prinzip dieser Methode beruht auf der automatischen Injektion zweier Lösungen, welche die beiden Interaktionspartner enthalten, in eine Messzelle und dem Aufnehmen des Fluoreszenzsignals. Die erste Spritze wurde mit 1 ml 200 nM mGDP bzw. mGppNHp befüllt. Je 1 ml nukleotidfreies Rop4 (Rop4n.f.) wurden in Konzentrationen von 2 µM bis 24 µM in die zweite Spritze gefüllt. Die Messungen wurden bei 10°C durchgeführt, da Rop4n.f. bei höheren Temperaturen nicht stabil war. Die Exzitation erfolgte mit 360 nm. Die Fluoreszenzänderung wurde bei jeder Messung gegen die Zeit aufgetragen. Der Exponent einer einfach exponentiellen Funktion, die an die Daten angepasst wurde, liefert die Rate kobs. Die kobs-Werte aller Messungen wurden dann gegen die jeweiligen Rop4n.f.-Konzentrationen aufgetragen. Mit Hilfe einer Geraden, die durch diese Punkte verläuft, kann die Nukleotidassoziationsrate bestimmt werden. Sie wird durch die Steigung ausgedrückt. 3.2.5 Konfokale Mikrokopie Fluoreszierende Proteine wurden konfokal mikroskopiert. Für diese Arbeit wurden Argonund Krypton-Laser sowie Argon-Krypton- und Helium-Neon-Mischgaslaser eingesetzt, deren Hauptemissionslinien bei 488 nm, 568 nm und 647 nm liegen. Die Exzitations- und Emissionswellenlängen, mit denen die Messungen erfolgten, wurden in Tabelle 3.17 zusammengefasst. Die Aufnahmen von Säugerzellpräparaten (3.2.3.7) wurden an dem LeicaMikroskop TCS-SP2 gemacht, die Aufnahme von Zwiebelepidermispräparaten erfolgte am Leica-Mikroskop DMRE (AG Hülskamp, Botanisches Institut III der Universität Köln). Tabelle 3.17: Exzitations- und Emissionswellenlängen zur Aufnahme konfokalmikroskopischer Bilder. Ex: Exzitationswellenlänge; Em: Emissionswellenlängen. Kombination Molekül A Ex Em Molekül B Ex Em 1 GFP 488 nm 495 – 535 nm CFP 458 nm 465 – 485 nm 2 GFP 488 nm 495 – 530 nm TRITC 540 nm 578 - 620 nm 3 Alexa 488 488 nm 495 – 530 nm TRITC 540 nm 578 - 620 nm 4 CFP 458 nm 465 – 510 nm YFP 514 nm 530 – 600 nm 4 Ergebnisse 75 4 Ergebnisse Die molekularen Mechanismen, die der Regulation von Rops durch RopGAPs zugrunde liegen, sind erst wenig erforscht. Ebenso ist noch wenig über die Signalwege zur Regulation des Aktinzytoskeletts in Pflanzen bekannt. Um diese Problematik anzugehen, wurde zunächst ein Vertreter der Rop-Proteine biochemisch charakterisiert. Dabei handelt es sich um Rop4, ein Mitglied der Gruppe IV-Rops, deren Beteiligung an der Aktinorganisation angenommen wird. Anschließend folgte die Charakterisierung des Rop-Regulators RopGAP2 und die Analyse der potentiellen Rop-Effektorproteine RICs (Rop-interactive CRIB motif-containing proteins). 4.1 Biochemische und funktionelle Charakterisierung der Rop-Proteine aus Arabidopsis thaliana 4.1.1 Bioinformatische Analyse sequenzdeterminierter Eigenschaften des GProteins Rop4 Als Grundlage für die Charakterisierung von Rop-Proteinen aus A. thaliana wurden in dieser Arbeit zunächst die sequenzdeterminierten Eigenschaften des Proteins Rop4 aus Arabidopsis thaliana unter Zuhilfenahme bioinformatischer Analyseprogramme untersucht. Das Rop4-Protein umfasst 196 Aminosäuren mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von 21,8 kD. Bei pH 7,0 sind 18 Aminosäuren negativ und 26 positiv geladen. Der isoelektrische Punkt (pI) liegt bei 9,3. Rop4 wurde mit einem Instabilitätsindex von 37,04 als stabiles Protein vorhergesagt (Guruprasad et al. 1990). Mit einem Hydropathiewert von -0,147 kann Rop4 als schwach hydrophobes Protein klassifiziert werden (Kyte und Doolittle 1982). Rop4 ist vermutlich im Zytoplasma lokalisiert (Emanuelsson et al. 2000). Die Rop-Sequenz enthält zahlreiche putative Motive, die mit Hilfe der „Prosite“-Datenbank identifiziert werden konnten (Falquet et al. 2002). Auf diese Weise wurden ein GTP-bindendes Motiv, drei Phosphorylierungsstellen der Caseinkinase 2, eine putative Tyrosinkinase-Phosphorylierungsstelle und zwei mögliche Phophorylierungsstellen der Proteinkinase C gefunden (Tabelle 4.1). Am C-Terminus enthält es eine CaaX-Sequenz, die eine Membranlokalisierung vermitteln könnte. Drei Threoninreste und vier Tyrosinreste konnten als mögliche Phosphorylierungsstellen identifiziert werden, die zum Teil mit den Sequenzmotiven aus der Proscan-Analyse übereinstimmen (Blom et al. 1999). 4 Ergebnisse 76 Tabelle 4.1: Putative Phosphorylierungsstellen von Rop4. Mit Hilfe der Programme Proscan und NetPhos2 wurden putative Motive in der Rop4-Sequenz identifiziert, die Erkennungsstellen für Phosphorylierung sein könnten (Falquet et al. 2002, Blom et al. 1999). Proscan identifiziert diese Sequenzen anhand der PrositeDatenbank. Modifikation Proscan-Analyse NetPhos2-Analyse Position Sequenz Position Sequenz Phosphorylierung durch 74 SYR 74 LRPLSYRGA Proteinkinase C 159 SSK Phosphorylierung durch 11 TVGD Caseinkinase 2 38 TVFD 118 TKLD Phosphorylierung durch 99 KWIPELRHY 35 FPTDYVPTV Tyrosinkinase 67 GQEDYNRLR 93 SKASYENVA 155 GSPIYIECS Phosphorylierung an Serinresten 92 ISKASYENV 152 KLIGSPIYI Die mögliche Tertiärstruktur von Rop4 wurde nach Schwede et al. (2003) berechnet (Abbildung 4.1). Sie zeigt die typische G-Domäne kleiner G-Proteine und die für RhoProteine spezifische insert-Helix. Abbildung 4.1: Ein Modell der dreidimensionalen Struktur von Rop4 aus A. thaliana. Das Modell wurde mit Hilfe des Programms SWISS-MODEL auf der Grundlage der Aminosäuresequenz von Rop4 erstellt (Schwede et al. 2003). Es zeigt die fünf α-Helices (rot), sechs β-Faltblätter (gelb) und fünf Schleifen (grün), die für kleine G-Proteine typisch sind, und die zusätzliche Rho-insert-Helix. Das Nukleotid bindet in einer Tasche zwischen den Schalterregionen (switch) I und II und der P-Schleife (P-loop). 4.1.2 Reinigung von Rop4 aus Escherichia coli Da Rop4 als ein lösliches, stabiles Protein vorhergesagt wurde (4.1.1), bot sich die heterologe Expression in E. coli an. Dazu wurde das Plasmid pET28a(+).Rop4 (3.1.9.1) benutzt, das die Synthese des Rop4-Proteins als Fusion mit einem N-terminalen Histidinhexapeptid 4 Ergebnisse 77 ermöglicht. Die Herstellung des Fusionsproteins erfolgte in dem Escherichia coli-Stamm BL21 (DE3) CodonPLUS RIL, der für die Expression pflanzlicher Proteine zusätzliche tRNAs enthält (3.1.11.1, 3.2.1.1.4). Die Reinigung des Proteins erfolgte über Nickel-NTAAgarose und anschließende Gelfiltration (3.2.3.9). Die Gelfiltration lieferte zwei Proteinformen, die aggregiertes bzw. monomeres Protein darstellen (Abbildung 4.2). Abbildung 4.2: Reinigung von Rop4. His6-Rop4 wurde in E. coli hergestellt und via Nickel-NTA-Agarose und Gelfiltration gereinigt. A: SDS-PAGE 12 %, gefärbt mit Coomassie Brilliant Blue. Die Spuren zeigen einzelne Schritte der Affinitätschromatographie. L: Bakterienlysat; D: Durchlauf der Nickel-NTA-Agarose-Säule; E: Eluat der Nickel-NTA-Agarose-Säule. B: Elutionsprofil der Gelfiltration. Es wurde mit 300 ml Puffer eluiert. Die Fraktionsgrösse betrug 3 ml. Die erste Population enthält aggregiertes Rop4-Protein und Verunreinigungen durch andere Proteine. Die zweite Population enthält reines Rop4-Protein. C: SDS-PAGE 12 %, gefärbt mit Coomassie Brilliant Blue. Die Spuren zeigen einzelne Fraktionen der Gelfiltration. Fraktionen 28 bis 35 enthalten monomeres, reines Protein. D: Elutionsprofil der HPLC. Anhand der Retentionszeit wurde die detektierte Verbindung als GDP identifiziert. Das apparente Molekulargewicht des Proteins ließ sich anhand der SDS-PAGE auf ca. 24 kD abschätzen (3.2.3.2). Auf diese Weise konnten in einer durchschnittlichen Reinigung etwa 18 mg monomeres Protein aus 1 l Bakterienkultur gewonnen werden. Mittels HPLC (3.2.3.8) wurde analysiert, ob das Protein nukleotidbeladen ist. Anhand dieser Analyse wurde deutlich, dass im isolierten Rop4-Protein ein GDP-Molekül pro Protein gebunden war. Das gereinigte Protein stand nun in ausreichender Menge für die biochemische Charakterisierung zur Verfügung. 4 Ergebnisse 78 4.1.3 Biochemische Charakterisierung von Rop4 Die Affinität der G-Proteine der Ras-Superfamilie zu Guaninnukleotiden ist in der Regel sehr hoch (KD-Werte von 10-7 bis 10-12 M), und die intrinsische GTP-Hydrolyse ist sehr langsam (kcat-Werte von 2,5·10-5 /s bis 2·10-3 /s) (Bourne et al. 1991, Weiss et al. 1989, Simon et al. 1996, Wittinghofer et al. 1993). Dadurch ist es sehr unwahrscheinlich, dass das Nukleotid ohne äußeren Einfluss dissoziiert oder dass GTP spontan zu GDP und Orthophosphat hydrolysiert wird. Erst durch den Einfluss von regulatorischen Proteinen werden beide Vorgänge beschleunigt. Bei der biochemischen Charakterisierung von Rop4 wurden deshalb zunächst seine Nukleotidbindungseigenschaften und seine Hydrolyseaktivität bestimmt. 4.1.3.1 Nukleotiddissoziation von Rop4 Um die Nukleotiddissoziation von Rop4 zu analysieren, wurde das gereinigte Protein in vitro mit den fluoreszierenden 3’-O-(N-Methylanthraniloyl)- (mant, m) Nukleotiden mGDP und mGppNHp beladen (3.2.3.14). GppNHp ist ein nicht hydrolysierbares GTP-Analogon. Die Fluoreszenzemission von proteingebundenem mant-Nukleotid ist etwa doppelt so gross wie von in Lösung befindlichem mant-Nukleotid und liefert in Bindungsstudien daher genügend grosse Fluoreszenzänderungen (3.2.4.1). Wird mGDP-beladenes Rop4 (Rop4*mGDP) mit einem grossen Überschuss nicht fluoreszierenden Nukleotids versetzt, so fällt die Fluoreszenz ab, da das mant-Nukleotid gegen unmarkiertes Nukleotid ausgetauscht wird (Abbildung 4.3). Abbildung 4.3: Spektrofluorometrische Messung der Nukleotiddissoziation von Rop4. Die Exzitationswellenlänge beträgt 366 nm, die Emissionswellenlänge 450 nm. A: Vergleich der Dissoziationsrate von mGDP unter Verwendung unterschiedlicher, nicht markierter Nukleotide. Die Messung erfolgte mit 400 nM Rop4*mGDP bei 24°C. In der Kontrolle wurde kein Überschuss nicht fluoreszenzmarkierten Nukleotids verwendet, in den Proben wurde ein 500-facher Überschuss von GTP, GDP oder GppNHp eingesetzt. B: Vergleich der Dissoziationsraten von mGDP und mGppNH. Die Messung erfolgte mit 400 nM Rop4*mGDP bzw. Rop4*mGppNHp bei 22°C. In der Kontrolle wurde kein Überschuss nicht fluoreszenzmarkierten Nukleotids verwendet, in den Proben wurde ein 500-facher GDP- bzw. GppNHp-Überschuss eingesetzt. 4 Ergebnisse 79 Dabei ist die Rückreaktion wegen des grossen Überschusses an unmarkiertem Nukleotid vernachlässigbar. Die Ergebnisse zeigen, dass es keine Rolle spielt, welches Nukleotid im Überschuss verwendet wird. Die Dissoziationsrate koff wird über den Fluoreszenzabfall bestimmt (3.2.4.1). Der Fluoreszenzabfall ist für GTP, GDP und GppNHp gleich und beträgt bei Raumtemperatur 2,8±0,3·10-4 /s. Wird die Dissoziation von mGDP mit der von mGppNHp verglichen, so ist zu sehen, dass mGppNHp bei 22°C mit einer koff-Rate von 9,6⋅10-4 /s etwa vier mal schneller von Rop4 abdissoziiert als mGDP (koff = 2,3⋅10-4). 4.1.3.2 Temperaturabhängigkeit der Nukleotiddissoziation von Rop4 Die Reaktionsgeschwindigkeiten enzymatischer Reaktionen zeigen in der Regel eine deutliche Abhängigkeit von der Temperatur. Deshalb wurde im Weiteren die Nukleotiddissoziation von Rop4 in Abhängigkeit von der Temperatur untersucht (Abbildung 4.4). Abbildung 4.4: Spektrofluorometrische Messungen zur Analyse der Temperaturabhängigkeit der Nukleotiddissoziation von Rop4. Die Exzitationswellenlänge beträgt 366 nm, die Emissionswellenlänge 450 nm. Die Dissoziationsraten von mGDP und mGppNHp von Rop4 in Gegenwart eines 500-fachen Überschusses nicht fluoreszierenden Nukleotids wurden bei 10°C, 16°C, 22°C, 30°C und 37°C gemessen. Für die Messungen wurden je 400 nM Rop4*mGDP bzw. Rop4*mGppNHp eingesetzt. A: Fluoreszenzabfall durch mGDPDissoziation von Rop4 bei unterschiedlichen Temperaturen. B, C: Die Auftragung der logarithmierten Dissoziationsraten ln k von mGDP bzw. mGppNHp gegen den Kehrwert der absoluten Temperatur im Arrhenius-Diagramm ergibt eine Gerade, deren Steigung der Aktivierungsenergie Ea der Reaktion entspricht. 4 Ergebnisse 80 Um die Temperaturabhängigkeit der Nukleotiddissoziation zu analysieren, wurde wiederum Rop4*mGDP bzw. Rop4*mGppNHp mit einem Überschuss von nicht fluoreszierendem Nukleotid versetzt und bei Temperaturen zwischen 10°C und 37°C die Änderung der Fluoreszenz mit der Zeit verfolgt (3.2.4.2). Die Nukleotiddissoziation von Rop4 wies eine deutliche Temperaturabhängigkeit auf. Aus den Dissoziationsraten der Nukleotide bei unterschiedlichen Temperaturen konnte die Aktivierungsenergie Ea der Reaktion nach Arrhenius berechnet werden (3.2.4.2). Die Aktivierungsenergie beträgt im Fall von mGDP 78,5 kJ/mol, im Fall von mGppNHp 71,5 kJ/mol. 4.1.3.3 Abhängigkeit der Nukleotiddissoziation von MgCl2 Mg2+ Kationen spielen bei der Nukleotidbindung vieler GNBPs eine wichtige Rolle, weil sie die negativen Ladungen am β- und des γ-Phosphats des Nukleotids koordinieren (Schweins et al. 1997). Um herauszufinden, in wie weit die Nukleotidbindung von Rop4 durch Mg2+ beeinflusst wird, wurde die Nukleotiddissoziation bei unterschiedlichen Magnesiumchloridkonzentrationen verfolgt (3.2.4.3) (Abbildung 4.5). Abbildung 4.5: Spektrofluorometrische Messung zur Analyse der Abhängigkeit der Nukleotiddissoziationsgeschwindigkeit von der MgCl2-Konzentration. Die Exzitationswellenlänge beträgt 366 nm, die Emissionswellenlänge 450 nm. Die Dissoziationsraten von mGDP (A) und mGppNHp (B) von Rop4 in Gegenwart eines 500-fachen Überschusses nicht fluoreszierenden Nukleotids wurden bei MgCl2Konzentrationen zwischen 2 µM und 100 mM bei 22°C gemessen. Die Rop4*mGDP bzw. Rop4*mGppNHpKonzentration beträgt 400 nM. Anhand des Kurvenverlaufes wurden die KD-Werte für Mg2+ berechnet. Die Dissoziation von mGDP erfolgte bei niedrigen MgCl2-Konzentrationen sehr rasch und wurde mit steigenden MgCl2-Konzentrationen langsamer bis ein Sättigunseffekt eintrat, und die Rate koff nicht weiter abnahm. Der Kurvenverlauf für die Dissoziation von mGppNHp war bei MgCl2-Konzentrationen unter 5 mM mit dem der mGDP-Dissoziation vergleichbar. Bei höheren Konzentrationen nahm die Dissoziationsrate jedoch wieder zu. Dieser Effekt ist als kinetischen Salzeffekt bekannt (Rudolph M 1998). Demnach liegt eine deutliche Mg2+- 4 Ergebnisse 81 Abhängigkeit der Nukleotiddissoziation von Rop4 vor. Anhand der Kurvenverläufe wurden die Dissoziationsgleichgewichtskonstanten KD für Mg2+ errechnet (3.2.4.3). Sie betragen 150 µM im Fall von Rop4*mGDP und 16 µM im Fall von Rop4*mGppNHp. 4.1.3.4 Nukleotidaffinitäten von Rop4 Die Nukleotidaffinitäten von Rop4 werden durch Dissoziationsgleichgewichtskonstanten ausgedrückt, die sich aus der Assoziationsratenkonstante kon und der Dissoziationsratenkonstante koff berechnen lassen. Zur Bestimmung der Assoziationsratenkonstante der Nukleotidbindung wurde die Fluoreszenzänderung verfolgt, die bei der Bindung von mantNukleotiden an nukleotidfreies (n.f.) Rop4 erfolgt (3.2.4.6) (Abbildung 4.6). Abbildung 4.6: Spektrofluorometrische Messung zur Bestimmung der Assoziationsratenkonstante von mGDP und mGppNHp an Rop4. Die Exzitationswellenlänge beträgt 366 nm, die Emissionswellenlänge 450 nm. Die Messungen wurden bei 10°C mit 200 nM Nukleotid durchgeführt. A: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenz nach Mischung von nukleotidfreiem Rop4 und mGDP durch die stopped flow-Apparatur. B, C: Die Auftragung der apparenten Raten kobs der Nukleotidbindung gegen die Rop4-Konzentration ergibt eine Gerade, deren Steigung die Assoziationsratenkonstante kon wiedergibt. Mit Hilfe der stopped flow-Apparatur wurden hierfür steigende Konzentrationen von Rop4 n.f. mit mGDP bzw. mGppNHp sehr schnell vermischt und die Fluoreszenz verfolgt (3.2.4.6). 4 Ergebnisse 82 Dabei war ein rascher Fluoreszenzanstieg zu verzeichnen. Anhand der Assoziationsraten kobs für steigende Konzentrationen von Rop4 n.f. konnte dann die Assoziationsratenkonstante berechnet werden. Für mGDP wurde eine Assoziationsratenkonstante kon von 0,0314 s-1µM-1 bestimmt. Für mGppNHp betrug die Assoziationsratenkonstante 0,0119 s-1µM-1. Zur Berechnung der Dissoziationsgleichgewichtskonstanten KD als Quotient aus koff und kon wurden die Dissoziationsraten, die in Kapitel 4.1.3.2 bei 10°C ermittelt wurden, herangezogen. Die Dissoziationsgleichgewichtskonstanten für mGDP und mGppNHp betragen 2 nM (mGDP) bzw. 15 nM (mGppNHp). 4.1.3.5 Die Hydrolyseaktivität von Rop4 Zur Bestimmung der Hydrolyseaktivität wurde Rop4 mit GTP beladen (3.2.3.14). Anschließend wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Nukleotidzustand von Rop4 mittels HPLC bestimmt (Abbildung 4.7) (3.2.3.8, 3.2.3.16). Die Hydrolyserate ergab sich aus der Abnahme der GTP-Konzentration oder dem Anstieg der GDP-Konzentration und betrug bei Raumtemperatur 2,7 ± 0,2·10-4 /s. Abbildung 4.7: Bestimmung der Hydrolyseaktivität von Rop4 mittels HPLC. 100 µM Rop4*GTP wurden bei Raumtemperatur (24°C) inkubiert und die Nukleotidzusammensetzung der Probe wurde zu den angegebenen Zeiten durch HPLC bestimmt. Die Auftragung der relativen GTP-Konzentration gegen die Zeit ermöglicht die Berechnung der intrinsischen Hydrolyserate. 4.1.4 Funktion von Rop4 in der Regulation der Aktinorganisation Nachdem die biochemischen Eigenschaften von Rop4 untersucht waren, sollte im Weiteren auf die Funktion von Rop4 bei der Regulation der Aktinorganisation eingegangen werden. Hierzu wurde Rop4 zunächst in planta sowie heterolog in Säugerzellen exprimiert und der Effekt der Rop4-Expression mikroskopisch untersucht. 4 Ergebnisse 83 4.1.4.1 Lokalisation von Rop4 und Aktin in Zwiebel-Epidermiszellen Für die in planta-Expression von Rop4 wurden Epidermiszellen der Zwiebel herangezogen. Diese Zellen sind leicht zu transformieren und zu mikroskopieren und deshalb gut geeignet, um die subzelluläre Lokalisation von Rop4 und dessen Einfluss auf das pflanzliche Aktinzytoskelett zu studieren. Die Zwiebelepidermis wurde hierzu mit den Plasmiden pSPECFP.Rop4 wt (Wildtyp) bzw. pSP-EYFP.Rop4G15V und pBA005.mTalin transformiert (3.1.9.4) (Abbildung 4.8). Abbildung 4.8: Der Einfluss von Rop4 auf das Aktinzytoskelett von Zwiebel-Epidermiszellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von Epidermiszellen der Zwiebel nach Transformation mit den Plasmiden pSPECFP.Rop4 wt bzw. pSP-ECFP.Rop4G15V zusammen mit pBA005.mTalin. Die transformierten Konstrukte sind links bzw. über den Bildern vermerkt. Zum Vergleich des Aktinzytoskelettes wurde unten eine Zelle abgebildet, die nur GFP-mTalin exprimiert. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Die Exzitationswellenlänge für GFP beträgt 488 nm, die Emission wurde von 495 nm bis 535 nm aufgenommen. CFP wurde mit 458 nm angeregt und von 465 nm bis 485 nm detektiert. Die Plasmide pSP-ECFP.Rop4 wt und pSP-EYFP.Rop4G15V ermöglichen die transiente Expression von Rop4 als N-terminale Fusion mit dem cyan fluoreszierenden Protein (CFP). Von dem Plasmid pSP-ECFP.Rop4 wt wurde die Rop4-Sequenz exprimiert, während das Plasmid pSP-EYFP.Rop4G15V für die konstitutiv aktive Rop4-Mutante G15V kodierte. Das Plasmid pBA005.mTalin kodiert für Talin aus der Maus (mTalin) als N-terminale Fusion mit 4 Ergebnisse 84 dem grün fluoreszierenden Protein (GFP). mTalin bindet spezifisch an F-Aktin und ermöglicht so die Visualisierung des Aktinzytoskeletts (Kost et al. 1998). Die fluoreszierenden Fusionsproteine wurden nach 24 Stunden in der lebendigen Zelle mikroskopiert (3.2.5). Das Aktinzytoskelett der Zwiebel-Epidermiszellen zeigte ein kortikales Netzwerk, das die Vakuole umgibt (Abbildung 4.8). Die einzelnen Aktinstränge waren dabei in CFP-Rop4-exprimierenden Zellen weniger stark ausgebildet als in den Kontrollzellen. CFP-Rop4 war an der Membran der Zwiebelzellen lokalisiert. Dabei war kein Unterschied erkennbar in Zellen, die CFP-Rop4 wt oder CFP-Rop4G15V exprimierten. CFP-Rop4 ist an der Membran und um den Kern herum mit Aktin co-lokalisiert. In den Zytoplasmasträngen, die durch die Vakuole reichen, verlaufen ausschließlich Aktinstränge. Ein Teil der Fusionsproteine ist jeweils im Kern lokalisiert. Hierbei handelt es sich vermutlich um eine durch den Fusionsteil herbeigeführte, artifizielle Lokalisation des Fusionsproteins. 4.1.4.2 Der Einfluss von Rop4 auf das Aktinzytoskelett von Säugerzellen im Vergleich zu RhoA, Rac1 und Cdc42 4.1.4.2.1 Expression von Rop4 in Säugerzellen Um zu analysieren, ob das pflanzliche Rop4 das Aktinzytoskelett von Säugerzellen beeinflusst, wurden NIH3T3-Maus-Fibroblasten und humane HeLa-Zellen (3.1.11.3) transient mit den Plasmiden pEGFP-C1.Rop4, pEGFP-C1.Rop4G15V und pEGFP-C1.Rop4T20N transfiziert (3.1.9.2, 3.2.1.4.2), die für GFP-Fusionsproteine mit Rop4 in der Wildtyp-Form (wt), der konstitutiv aktiven Form (G15V) bzw. als T20N-Mutante kodieren. Die T20NMutation in Rop4 wird analog zu einer in Ras als dominant negativ (DN) beschriebenen Mutation benutzt. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion fixiert und permeabilisiert (3.2.3.7). Das Aktinzytoskelett wurde mit Tetramethyl-Rhodamin- Isothiocyanat- (TRITC) Phalloidin gefärbt. Phalloidin ist ein Gift des Pilzes Amantia phalloides und bindet spezifisch F-Aktin. Die GFP-Rop4 wt-exprimierenden NIH3T3-Zellen wiesen im Vergleich zu untransfizierten Zellen besonders wenig Stressfasern auf. Sie zeigten eine deutliche Polarität und wiesen Lamellipodien auf (Pfeile). Ihre Oberfläche zeigte zahlreiche Membranausstülpungen (membrane ruffles). GFP-Rop4 war dabei an der Zellmembran und zum Teil im Zellkern lokalisiert. In den Lamellipodien und membrane ruffles konnte eine co-Lokalisation mit Aktin beobachtet werden (Abbildung 4.9). Die GFP-Rop4 G15V-exprimierenden NIH3T3-Zellen erschienen teilweise bipolar, das heisst, sie bildeten an zwei entgegengesetzten Seiten Lamellipodien aus (Pfeile). Ansonsten entsprach der Phänotyp dem der GFP-Rop4 wt- 4 Ergebnisse 85 exprimierenden Zellen. GFP-Rop4G15V konnte ebenfalls teilweise an der Plasmamembran, teilweise im Kern ausgemacht werden. Bei Expression von GFP-Rop4T20N ähnelten die Zellen den untransfizierten Zellen (Abbildung 4.9, mittlere Reihe). Sie zeigten keinen deutlichen Phänotyp. Es konnten keine Veränderungen des Aktinzytoskeletts beobachtet werden. GFP-Rop4T20N war im Zytoplasma lokalisiert und nicht mit Aktin co-lokalisiert. Diese Zellen zeigten keine membrane ruffles. Abbildung 4.9: Effekt von Rop4 auf das Aktinzytoskelett von NIH3T3-Zellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von NIH3T3-Zellen nach transienter Transfektion von pEGFP-C1.Rop4 Wildtyp (wt), pEGFPC1.Rop4G15V (konstitutiv aktiv) bzw. pEGFP-C1.Rop4T20N (so genannte dominant negative Mutante). Die transfizierten Konstrukte sind links und die angefärbten Proteine über den Bildern vermerkt. Eine untransfizierte Zelle ist in der mittleren Reihe gezeigt. Aktin wurde mit Phalloidin-TRITC gefärbt. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Die Exzitationswellenlänge für GFP beträgt 488 nm, die Emission wurde von 495 nm bis 530 nm aufgenommen. TRITC wurde mit 540 nm angeregt und von 578 nm bis 620 nm detektiert. Wurde GFP-Rop4 wt in HeLa-Zellen exprimiert, so waren diese Zellen stark abgerundet und wiesen sehr viele zackenförmige Zellfortsätze auf, die den Filopodien der NIH3T3-Zellen ähnelten. Ihre Stressfasern waren wie in NIH3T3-Zellen stark reduziert. GFP-Rop4 wt befand sich wiederum an der Membran und war mit Aktin co-lokalisiert. Der Phänotyp der GFPRop4G15V-exprimierenden Zellen unterschied sich davon kaum. Es war auffällig, dass GFPRop4G15V besonders an Kontaktstellen mit Nachbarzellen vertreten und dort mit Aktin colokalisiert war (Abbildung 4.10, Pfeile). An diesen Kontaktstellen befinden sich adherent junctions und tight junctions. Die Expression von GFP-Rop4T20N in den HeLa-Zellen 4 Ergebnisse 86 beeinflusste die Morphologie bzw. das Aktinzytoskelett nicht; diese Zellen glichen untransfizierten Zellen. Abbildung 4.10: Effekt von Rop4 auf das Aktinzytoskelett menschlicher HeLa-Zellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von HeLa-Zellen nach transienter Transfektion der Plasmide pEGFP-C1.Rop4 Wildtyp (wt), pEGFP-C1.Rop4G15V (konstitutiv aktiv) bzw. pEGFP-C1.Rop4T20N (so genannte dominant negative Mutante). Die transfizierten Konstrukte sind links und die angefärbten Proteine über den Bildern vermerkt. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Aktin wurde mit Phalloidin-TRITC gefärbt. Die Exzitationswellenlänge für GFP beträgt 488 nm, die Emission wurde von 495 nm bis 530 nm aufgenommen. TRITC wurde mit 540 nm angeregt und von 578 nm bis 620 nm detektiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass Rop4 in der Wildtyp- und in der konstitutiv aktiven Form einen deutlichen Einfluss auf das Zytoskelett von Säugerzellen ausübt, während Rop4T20N keinen bestimmten Phänotyp verursacht. 4 Ergebnisse 87 4.1.4.2.2 Expression von RhoA, Rac1 und Cdc42 in NIH3T3-Zellen Um den Effekt der Rop4-Expression mit dem Einfluss humaner Rho-Proteine auf die Zellmorphologie vergleichen zu können, wurden menschliches RhoA, Rac1 und Cdc42 in NIH3T3- und HeLa-Zellen (4.1.4.2.3) exprimiert. Die Plasmide pCDNA3.RhoA wt, pCDNA3.RhoAG14V und pCDNA3.RhoAT19N kodieren für humanes RhoA in der Wildtyp-Form, der konstitutiv aktiven Form (G14V, CA) und der dominant negativen Form (T19N, DN). Die Rac-Varianten werden als Fusionsproteine mit einem Flag-Epitop exprimiert (3.1.9.2). Wurden NIH3T3-Fibroblasten mit dem Plasmid pCDNA3.RhoA wt transfiziert, bildeten sie sehr viele Stressfasern aus und kontrahierten, d.h. sie waren kleiner und kompakter als gewöhnliche Zellen. Flag-RhoA wurde an der Plasmamembran und im Zytoplasma nachgewiesen. Dieser Phänotyp trat in noch stärkerer Form bei CA Flag-RhoA-transfizierten Zellen auf (Abbildung 4.11). Abbildung 4.11: Effekt von RhoA auf das Aktinzytoskelett von NIH3T3-Zellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von NIH3T3-Zellen nach transienter Transfektion der Plasmide pCDNA3.RhoA wt, pCDNA3.RhoAG14V und pCDNA3.RhoAT19N. Die transfizierten Konstrukte sind links und die angefärbten Proteine über den Bildern vermerkt. Eine untransfizierte Zelle ist in der mittleren Reihe gezeigt. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Aktin wurde mit Phalloidin-TRITC gefärbt, die Flag-RhoA-Varianten mit einem α-Flag-Antikörper und mit einem Alexa488markierten Zweitantikörper. Die Exzitationswellenlänge für Alexa488 beträgt 488 nm, die Emission wurde von 495 nm bis 530 nm aufgenommen. TRITC wurde mit 540 nm angeregt und von 578 nm bis 620 nm detektiert. 4 Ergebnisse 88 Flag-RhoAT19N (DN)-exprimierende Zellen wiesen hingegen keine Stressfasern auf. Teilweise bildeten sie filopodienartige Zellfortsätze aus. Flag-RhoAT19N war gleichmäßig über die gesamte Zelle verteilt. Die Plasmide pCDNA3.Rac1 wt, pCDNA3.Rac1G12V und pCDNA3.Rac1T17N kodieren für humanes Rac1 in der Wildtyp-Form, der konstitutiv aktiven Form (G12V) und der dominant negativen Form (T17N). Rac1 wird in den Zellen als Fusionsprotein mit einem Flag-Epitop hergestellt (3.1.9.2). NIH3T3-Zellen, die Flag-Rac1 wt exprimierten, waren im Vergleich zu Rho-aktivierten Zellen abgerundet, hatten eine flächigere Form und waren durch eine klare Polarität gekennzeichnet. Sie bildeten Lamellipodien aus, in denen Flag-Rac1 wt an der Membran lokalisiert war (Abbildung 4.12, Pfeile). Ihre Stressfasern waren stark reduziert. Flag-Rac1G12V (CA)-exprimierende Zellen waren teilweise bipolar und besaßen Lamellipodien in verschiedenen Orientierungen (Pfeile). Abbildung 4.12: Effekt von Rac1 auf das Aktinzytoskelett von NIH3T3-Zellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von NIH3T3-Zellen nach transienter Transfektion der Plasmide pCDNA3.Rac1 wt, pCDNA3.Rac1G12V und pCDNA3.Rac1T17N. Die transfizierten Konstrukte sind links und die angefärbten Proteine über den Bildern vermerkt. Untransfizierte Zellen sind in der unteren Reihe gezeigt. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Aktin wurde mit Phalloidin-TRITC gefärbt, die Flag-Rac1-Varianten mit einem α-Flag-Antikörper und mit einem Alexa488markierten Zweitantikörper. Die Exzitationswellenlänge für Alexa488 beträgt 488 nm, die Emission wurde von 495 nm bis 530 nm aufgenommen. TRITC wurde mit 540 nm angeregt und von 578 nm bis 620 nm detektiert. 4 Ergebnisse 89 Flag-Rac1 CA war ausschließlich an der Zellmembran lokalisiert. Diese Zellen wiesen außerdem membrane ruffles auf. Flag-Rac1T17N (DN) bewirkte keine Veränderungen der Morphologie von NIH3T3-Zellen. Es ist gleichmäßig in der Zelle verteilt. Die Plasmide pCDNA3.Cdc42 wt, pCDNA3.Cdc42G12V und pCDNA3.Cdc42T17N kodieren für humanes Cdc42 in der Wildtyp-Form, der konstitutiv aktiven Form (G12V) und der dominant negativen Form (T17N). Cdc42 wird in den Zellen als Fusionsprotein mit einem Myc-Epitop hergestellt (3.1.9.2). Bei der Expression von Myc-Cdc42 wt und Myc-Cdc42 CA in NIH3T3-Zellen entstand wie bei Rac-aktivierten Zellen eine deutliche Polarität. Außerdem traten Lamellipodien auf (Abbildung 4.13, Pfeile). Ansonsten waren diese Zellen von membrane ruffles und Filopodien gekennzeichnet. Myc-Cdc42 CA war an der Membran und insbesondere in den Filopodien lokalisiert. Die Expression von Myc-Cdc42 DN hatte keine Auswirkungen auf die Gestalt der NIH3T3-Zellen. Abbildung 4.13: Effekt von Cdc42 auf das Aktinzytoskelett von NIH3T3-Zellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von NIH3T3-Zellen nach transienter Transfektion der Plasmide pCDNA3.Cdc42 wt, pCDNA3.Cdc42G12V und pCDNA3.Cdc42T17N. Die transfizierten Konstrukte sind links und die angefärbten Proteine über den Bildern vermerkt. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Aktin wurde mit Phalloidin-TRITC gefärbt, die Myc-Cdc42-Varianten mit einem α-Myc-Antikörper und mit einem Alexa488-markierten Zweitantikörper. Die Exzitationswellenlänge für Alexa488 beträgt 488 nm, die Emission wurde von 495 nm bis 530 nm aufgenommen. TRITC wurde mit 540 nm angeregt und von 578 nm bis 620 nm detektiert. 4 Ergebnisse 90 4.1.4.2.3 Expression von RhoA, Rac1 und Cdc42 in HeLa-Zellen Ähnliche Reaktionen waren bei der Expression von RhoA, Rac1 und Cdc42 in menschlichen HeLa-Zellen zu beobachten. Wurde Flag-RhoA wt bzw. -G14V in diesen Zellen exprimiert, so entstanden Stressfasern, die die Zelle durchspannten und die Zellen kontrahierten. FlagRhoAT19N induzierte keine Stressfasern (Abbildung 4.14). Abbildung 4.14: Effekt von RhoA auf das Aktinzytoskelett menschlicher HeLa-Zellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von HeLa-Zellen nach transienter Transfektion der Plasmide pCDNA3.RhoA wt, pCDNA3.RhoAG14V und pCDNA3.RhoAT19N. Die transfizierten Konstrukte sind links und die angefärbten Proteine über den Bildern vermerkt. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Aktin wurde mit Phalloidin-TRITC gefärbt, die Flag-RhoA-Varianten mit einem α-Flag-Antikörper und mit einem Alexa488-markierten Zweitantikörper. Die Exzitationswellenlänge für Alexa488 beträgt 488 nm, die Emission wurde von 495 nm bis 530 nm aufgenommen. TRITC wurde mit 540 nm angeregt und von 578 nm bis 620 nm detektiert. Bei der Expression von Flag-Rac1 wt in HeLa-Zellen wurden Lamellipodien gebildet und membrane ruffles (Abbildung 4.15, Pfeile). Flag-Rac1 war an der Membran lokalisiert. Die CA Mutante Rac1G12V induzierte einen Phänotyp, der durch eine komplette Abrundung der 4 Ergebnisse 91 Zelle gekennzeichnet war. Diese Zellen hatten wenig Stressfasern. Sie besaßen zahlreiche filopodienartige Membranfortsätze, die an der gesamten Zelloberfläche auftraten. Abbildung 4.15: Effekt von Rac1 auf das Aktinzytoskelett menschlicher HeLa-Zellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von HeLa-Zellen nach transienter Transfektion der Plasmide pCDNA3.Rac1 wt, pCDNA3.Rac1G12V und pCDNA3.Rac1T17N. Die transfizierten Konstrukte sind links und die angefärbten Proteine über den Bildern vermerkt. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Aktin wurde mit Phalloidin-TRITC gefärbt, die Flag-Rac1-Varianten mit einem α-Flag-Antikörper und mit einem Alexa488-markierten Zweitantikörper. Die Exzitationswellenlänge für Alexa488 beträgt 488 nm, die Emission wurde von 495 nm bis 530 nm aufgenommen. TRITC wurde mit 540 nm angeregt und von 578 nm bis 620 nm detektiert. Häufig waren Zellpaare zu sehen, die in ihrer Kontaktzone miteinander verbunden sind (Pfeile). Flag-Rac1G12V befand sich an der Membran und verstärkt in der Kontaktzone zwischen zwei Zellen. Dort war es mit Aktin co-lokalisiert. Flag-Rac1T17N-transfizierte Zellen ähnelten untransfizierten Zellen, obwohl sie teilweise auch filopodienartige Membranfortsätze besaßen. Sie bildeten keine Lamellipodien aus. Flag-Rac1T17N war zum Teil an der Membran lokalisiert. 4 Ergebnisse 92 Die Expression von Myc-Cdc42 wt induzierte einen ähnlichen Phänotyp in den Zellen wie die Flag-Rac1 wt-Expression. Die Zellen waren polar und bildeten Lamellipodien aus, in denen Cdc42 an der Membran mit Aktin co-lokalisert war (Abbildung 4.16, Pfeile). Bei MycCdc42G12V-transfizierten Zellen war dies nur teilweise zu beobachten. Ihre Zellform war meist nicht von der untransfizierter Zellen zu unterscheiden. Sie bildeten jedoch zahlreiche Filopodien aus, in denen Cdc42 mit Aktin co-lokalisiert war. Cdc42T17N hatte keine Auswirkungen auf die Morphologie der Zelle. Abbildung 4.16: Effekt von Cdc42 auf das Aktinzytoskelett menschlicher HeLa-Zellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von HeLa-Zellen nach transienter Transfektion der Plasmide pCDNA3.Cdc42 wt, pCDNA3.Cdc42G12V und pCDNA3.Cdc42T17N. Die transfizierten Konstrukte sind links und die angefärbten Proteine über den Bildern vermerkt. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Aktin wurde mit Phalloidin-TRITC gefärbt, die Myc-Cdc42-Varianten mit einem α-Myc-Antikörper und mit einem Alexa488-markierten Zweitantikörper. Die Exzitationswellenlänge für Alexa488 beträgt 488 nm, die Emission wurde von 495 nm bis 530 nm aufgenommen. TRITC wurde mit 540 nm angeregt und von 578 nm bis 620 nm detektiert. Diese Studien zeigen, dass Rop4 in NIH3T3-Zellen wie auch in HeLa-Zellen den gleichen Phänotyp wie Rac1 induziert. 4 Ergebnisse 93 4.1.4.3 In vitro-Interaktion von Rop4 mit der G-Protein-bindenden Domäne von humaner p21-aktivierter Kinase 1 Der mit Rac1 vergleichbare Einfluss von Rop4 auf das Aktinzytoskelett in Säugerzellen ließ vermuten, dass Rop4 in diesem System mit Effektoren von Rac1 interagiert, die das Aktinzytoskelett beeinflussen. Daher sollte im Weiteren überprüft werden, ob Rop4 mit zellulären Rac1-Effektoren in vitro interagiert. Pak1 ist ein bekannter Effektor von Rac1, der ein CRIB-Motiv in der Rho-Protein-bindenden Domäne (RBD) besitzt (1.4.5.1) (Manser und Lim 1999). Diese Domäne von Pak1b wurde als Fusionsprotein mit der Glutathion-S-Transferase (GST) vom Plasmid pGEX-4T-1.Pak1RBD in E. coli exprimiert, an GSH-Sepharose gekoppelt und für einen in vitro-Interaktionstest (pull down) mit Rop4 bzw. Rop4G15V eingesetzt (3.1.9.1, 3.2.1.1.4, 3.2.3.18). Hierzu wurden die Rop-Proteine als GFP-Fusion in Cos7-Zellen exprimiert, und die löslichen Fraktionen der Zelllysate wurden für den Interaktionstest verwendet. Die Expression wurde nach SDS-PAGE der Zelllysate und Western Blot mit GFP-Antikörpern überprüft (Abbildung 4.17). Der Nachweis der Interaktion von HsPak1b-RBD mit GFP-markiertem Rop4 erfolgte nach SDS-PAGE der Eluate der GSH-Sepharose im Western Blot mit GFP-spezifischen Antikörpern (3.2.3.2, 3.2.3.5). Abbildung 4.17: In vitro-Interaktionstest zum Nachweis der Interaktion von Rop4 mit Pak1 RBD. Cos7Zellen wurden transient mit den Plasmiden pEGFP-C1.Rop4 wt (Wildtyp), pEGFP-C1.Rop4G15V (konstitutiv aktiv) bzw. pEGFP-C1.Rop4T20N (so genannte dominant negative Mutante) transfiziert. Die Überstände der Zelllysate wurden im pull down-Interaktionstest mit GST-Pak1b RBD eingesetzt. Als Kontrolle dienten Lysate von Zellen, die nur mit dem Expressionsvektor pEGFP-C1 transfiziert wurden (-). A: Schematische Darstellung der Domänenstruktur von Pak1b aus H. sapiens. Die mit Rho-Proteinen interagierende Domäne (CRIB, Aminosäuren 56-141) enthält ein CRIB-Motiv und wurde für den Interaktionstest eingesetzt. B: Western Blot der löslichen Fraktion der Zelllysate mit anti-GFP-Antikörpern. C: Western Blot der Eluate des pull downInteraktionstests. GFP-Rop4 wurde mit anti-GFP-Antikörpern nachgewiesen. 4 Ergebnisse 94 Die Western Blot-Analyse mit anti-GFP-Antikörpern zeigt, dass Rop4 wt und Rop4G15V mit der CRIB-Domäne von Pak1b interagieren (Abbildung 4.17). Die Interaktion mit Rop4 CA ist bei gleich starker Expression beider Proteine stärker, da CA Rop4 häufiger in der GTPgebundenen Form vorliegt. Rop4T20N hingegen konnte nicht in der löslichen Fraktion der Zelllysate nachgewiesen werden. Anscheinend ist es nicht stabil oder unlöslich. Daher konnten dessen Wechselwirkungen mit der CRIB-Domäne auch nicht analysiert werden. 4.1.4.4 Aktivierung von Rop4 durch den Rac-spezifischen Austauschfaktor Tiam1 Neben der Interaktion von Rop4 mit Rac1-Effektoren ließ der Rac-ähnliche Phänotyp der Rop4-exprimierenden Säugerzellen auch vermuten, dass Rop4 von GEFs der Säugerzellen aktiviert werden kann. Tiam1 ist ein humaner GEF, der spezifisch für Rac ist. Die DH- und PH-Domäne von Tiam1 (Aminosäuren 1033 bis 1404) vermitteln dabei die GEF-Aktivität. Im Folgenden wurde untersucht, ob die gereinigte DH/PH-Domäne von Tiam1 (freundlicherweise von L. C. Häusler, MPI Dortmund zur Verfügung gestellt) die mGDP-Dissoziation von Rop4 in Gegenwart eines Überschusses nicht fluoreszierenden Nukleotids beschleunigt (3.2.4.1) (Abbildung 4.18). Es konnte dabei gezeigt werden, dass die Dissoziationsrate signifikant abhängig von Tiam1 ist. Je mehr Tiam1-Protein sich im Ansatz befand, desto schneller erfolgte der Nukleotidaustausch an Rop4. Abbildung 4.18: Spektrofluorometrische Messung der Dissoziation von mGDP von Rop4 durch Tiam1. A: Schematische Darstellung der Domänenstruktur von Tiam1. B: Nukleotiddissoziation von Rop4*mGDP. Die Messung wurde mit 1 µM – 4 µM DH/PH-Domäne von Tiam1 (Aminosäuren 1033-1404) und 400 nM Rop4*mGDP bei 22°C durchgeführt. Der Überschuss nicht markierten Nukleotids beträgt 500-fach. Die Exzitationswellenlänge beträgt 366 nm, die Emissionswellenlänge 450 nm. 4 Ergebnisse 95 Außer Tiam1 wurden auch der Ras-spezifische Austauschfaktor Cdc25 und der RanAustauschfaktor RCC1 mit Rop4*mGDP getestet. Diese Proteine zeigten jedoch keine Wirkung auf den Nukleotidaustausch an Rop4 (Daten nicht gezeigt). Demzufolge ist eine spezifische Aktivierung von Rop4 in NIH3T3- sowie HeLa-Zellen durch zelluläre RacAustauschfaktoren anzunehmen. 4.2 Regulation von Rop4 durch RopGAP2 aus Arabidopsis thaliana 4.2.1 Bioinformatische Analyse sequenzdeterminierter Eigenschaften von RopGAP2 Als Grundlage für die biochemische Charakterisierung von RopGAP2 aus A. thaliana wurden zunächst die sequenzdeterminierten Eigenschaften des Proteins mit Hilfe bioinformatischer Analyseprogramme analysiert. RopGAP2 besteht aus 424 Aminosäuren und besitzt ein berechnetes Molekulargewicht von 46,7 kD. Mit seinen 71 negativ und 32 positiv geladenen Aminosäuren hat es bei pH 7,0 einen pI-Wert von 4.57. RopGAP2 wird mit einem Instabilitätsindex von 59.41 als möglicherweise instabiles Protein vorhergesagt (Guruprasad et al. 1990). Der aliphatische Index nach Ikai 1980 beträgt 75.38 (Ikai 1980). Mit einem Hydropathiewert von -0.533 wird RopGAP2 als relativ schwach hydrophatisch klassifiziert (Kyte und Doolittle 1982). Für RopGAP2 wird eine zytoplasmatische Lokalisation vorhergesagt (Emanuelsson et al. 2000). Mit Hilfe der „Prosite“-Datenbank wurden zahlreiche putative Motive innerhalb der RopGAP2-Aminosäuresequenz identifiziert (Falquet et al. 2002): eine CRIB-Domäne, eine RhoGAP-homologe Domäne, zwei mögliche Phosphorylierungstellen durch eine cAMP- oder cGMP-abhängige Proteinkinase, drei putative Phosphorylierungssequenzen der Proteinkinase C, achtzehn mögliche Phosphorylierungsstellen der Caseinkinase 2, eine mögliche Amidierungsstelle und ein Glycin-reiches Motiv (Tabelle 4.2) (Falquet et al. 2002). Mit Hilfe des Programms „Netphos2“ wurden 27 Serinreste, drei Threoninreste und zwei Tyrosinreste als mögliche Phosphorylierungsstellen identifiziert (Blom et al. 1999). Die Tertiärstruktur von RopGAP2 wurde im Bereich der Aminosäuren 107 bis 299 nach Schwede et al. 2003 berechnet (Abbildung 4.19). Dieser Bereich enthält neun α-Helices, die die RhoGAP-Domäne bilden. Das RopGAP2-Modell kann nicht komplett berechnet werden, da keine Strukturen von Proteinen vorliegen, die ausreichende Homologie zu den N- und Cterminalen Bereichen von RopGAP2 aufweisen. 4 Ergebnisse 96 Tabelle 4.2: Putative posttranslationale Modifikationen von RopGAP2. Mit Hilfe des Programms Scan Prosite wurden putative Motive in der RopGAP2-Sequenz identifiziert, die Erkennungsstellen für Phosphorylierung oder Amidierung sein könnten (Falquet et al. 2002). Modifikation Position Sequenz Modifikation Position Sequenz 165-168 SQEE 49 SCR Proteinkinase C Caseinkinase 2 252 401 SNK SPK cAMP/cGMP abhängige Proteinkinase 15-18 16-19 RRKS RKST Amidierung 13 GGRR Caseinkinase 2 18-21 19-22 34-37 127-130 STAE TAEE SLVE SYDE 208-211 217-220 295-298 304-307 317-320 319-322 321-324 338-341 362-365 363-366 395-398 409-412 421-424 SPEE TEDE TLAE TGSE SQTD TDSD SDSD TDSE STHE THED SISE SFTE STSD Abbildung 4.19: Modell der dreidimensionalen Struktur des GTPase-aktivierenden Proteins RopGAP2 aus A. thaliana. Das Modell wurde mit Hilfe des Programms SWISS-MODEL erstellt (Schwede et al. 2003). Es zeigt den Bereich der Aminosäuren 107 – 299, der homolog zur helikalen RhoGAP-Domäne ist. 4.2.2 Reinigung von RopGAP2 4.2.2.1 Expression in E. coli und Reinigung eines RopGAP2-Fragmentes Für die geplanten biochemischen Experimente zur Untersuchung der Funktion von RopGAPs aus A. thaliana sollte zunächst der Vertreter RopGAP2 in grossen Mengen hergestellt und gereinigt werden. Da sich die Verwendung bestimmter Codons zwischen E. coli und A. thaliana unterscheidet, wurde für die heterologe Expression von RopGAP2 in E. coli der Stamm BL21(DE3) Codon Plus RIL gewählt (3.1.11.1). Das dafür verwendete Plasmid pGEX-4T-1.RopGAP2 ermöglicht die Synthese des RopGAP2-Proteins als N-terminale 4 Ergebnisse 97 Fusion mit der Glutathion-S-Transferase (GST) (3.1.9.1). Die Reinigung des Wildtyp- (wt) Proteins erfolgte via Affinitätschromatographie mit GSH-Sepharose und durch Gelfiltration (3.2.3.10). Dabei eluierte das Protein im Ausschlussvolumen der Gelfiltrationssäule, d.h. es lag als Multimer vor. Die Analyse durch SDS-PAGE zeigte, dass sich ein zweites Protein in diesem Aggregat befand, das etwa 12 kD kleiner ist als RopGAP2 (3.2.3.2). Durch Western Blot-Analyse mit anti-GST-Antikörpern als auch durch tryptischen Verdau im Gel und anschließender matrix assisted laser desorption/ionization- (MALDI) Massenspektroskopie wurde dieses Protein als RopGAP2-Fragment identifiziert, das am C-Terminus degradiert vorlag (3.2.3.13). Die Aggregationsneigung des Proteins konnte durch Verwendung unterschiedlicher Puffer und Veränderung der Expressionsbedingungen nicht verringert werden. Auf der Grundlage von Sekundärstrukturvorhersagen wurden unterschiedliche Fragmente von RopGAP2 hergestellt, bei denen bestimmte Sekundärstrukturelemente von RopGAP2 deletiert wurden, die möglicherweise ungefalten vorlagen und zur Aggregation führen könnten (Abbildung 4.20). Abbildung 4.20: Schematische Darstellung der Domänenstruktur von RopGAP2 und der hergestellten Fragmente zur Verringerung der Aggregationsneigung. Links aussen: Grenzen der RopGAP2-Fragmente. Rechts aussen: Aggregationsverhalten der Fragmente. Plasmide zur Expression der genannten Fragmente: pGEX-4T-1.RopGAP2; pGEX-4T-1.RopGAP2 1-298; pET28 a(+).RopGAP2 114-424; pET28 a(+).RopGAP2 133-424; pET28 a(+).RopGAP2 21-298; pET28 a(+).RopGAP2 21-334; pET28 a(+).RopGAP2 21-360; pET28 a(+).RopGAP2 21-385; pET28 a(+).RopGAP2 21-360; pGEX-4T-1.RopGAP2 21-424; pGEX-4T-1.RopGAP2 21-298; pGEX-4T-1.RopGAP2 21-334; pGEX-4T-1.RopGAP2 21-385; pGEX-4T-1.RopGAP2 21-424; pGEX4T-1.RopGAP2 1-132; pET28 a(+).RopGAP2 114-424; pET28 a(+).RopGAP2 133-424; pGEX-4T-1.RopGAP2 71-424; pGEX-4T-1.RopGAP2 71-424 (3.1.7.1). CRIB: CRIB-Domäne; GAP: RhoGAP-homologe Domäne. Viele der N- und C-terminalen Deletionen führten zu keiner Verbesserung der Löslichkeit von RopGAP2. So erwies sich die CRIB-Domäne (Aminosäuren 1-132) als vollständig unlöslich. Einzig die GAP-Domäne (Aminosäuren 133-424) und ein Fragment, das um 70 Aminosäuren am N-Terminus verkürzt ist (Aminosäuren 71-424), konnten in löslicher Form isoliert werden (3.1.9.1). 4 Ergebnisse 98 Das RopGAP2-Fragment 71-424 (RopGAP2∆70) beginnt mit dem konservierten CRIB-Motiv und enthält ferner die gesamte GAP-Domäne. Es wurde als GST-Fusionsprotein (exprimiert vom Plasmid pGEX-4T-1.RopGAP2 71-424, 3.1.9.1) durch Chromatographie mit GSHSepharose und durch anschließende Gelfiltration gereinigt (3.2.3.10) (Abbildung 4.21). Abbildung 4.21: Reinigung des RopGAP2∆70-Fragmentes. RopGAP2∆70 wurde als GST-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und über GSH-Sepharose und Gelfiltration gereinigt. A: Schematische Darstellung des GSTFusionsproteins. B: Elutionsprofil der Gelfiltration. C: SDS-PAGE (10 %, gefärbt mit Coomassie Brilliant Blue) zur Analyse einzelner Fraktionen der Gelfiltration. GST: Glutathion-S-Transferase; CRIB: CRIB-Domäne; GAP: RhoGAP-homologe Domäne; AU: absorption units. Bei der Gelfiltration wurden zwei Proteinspezies getrennt, wobei die erste aggregiertem Protein entspricht, während die zweite Proteinspezies mit einem Molekulargewicht von 205 kD vermutlich Trimere umfasst. Auch bei Reinigung dieses Fragments von RopGAP2 trat ein Abbauprodukt auf, das durch weitere Reinigungsschritte nicht vom RopGAP2∆70-Protein getrennt werden konnte. Aus 1 l Kultur konnten dabei 9 mg lösliches Protein gewonnen werden. 4.2.2.2 Expression und Reinigung von RopGAP2 mit Hilfe des Bakulovirus-Systems in Spodoptera frugiperda-Zellen Zur Optimierung der Stabilität und der Reinigung sollte RopGAP2 im Weiteren mit Hilfe des Bakulovirus-Expressionssystems in Spodoptera frugiperda-Zellen hergestellt werden (3.2.1.3). Dieses System erlaubt posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierungen und die korrekte Faltung eukaryotischer Proteine. Die Expression von RopGAP2 wurde in 4 Ergebnisse 99 zwei unterschiedlichen Systemen durchgeführt (3.2.1.3.2, 3.2.1.3.3). Zum einen wurde eine Zelllinie hergestellt, die stabil RopGAP2 exprimiert, zum anderen wurde ein System benutzt, in dem die Expression transient durch Infektion der Zellen mit einem Expressionsvirus erfolgt. Da die Expression in der stabilen Zelllinie nur geringe Ausbeuten lieferte, wurde die Expression im Weiteren nur noch transient fortgesetzt. Dafür wurde ein rekombinanter Virus hergestellt, der eine Kassette zur Expression von RopGAP2 enthält (Abbildung 4.23). Der Virus wurde in Sf21-Zellen amplifiziert und das RopGAP2-Protein exprimiert (3.1.11.3, 3.2.1.3.5, 3.2.1.3.7). Dabei änderte sich der Phänotyp der Sf21-Zellen in der Weise, dass sie ihr Volumen vergrößerten, Zelleinschlüsse bildeten und lysierten (Abbildung 4.22). Abbildung 4.22: Lichtmikroskopische Aufnahme RopGAP2-exprimierender Sf21-Zellen. A: nicht infizierte Sf21-Zellen sind in Flüssigkultur abgerundet. B: Werden sie mit dem rekombinant hergestellten RopGAP2-Virus infiziert, so sind einige vergrösserte Zellen zu beobachten und die Zellen lysieren nach vier bis sechs Tagen. Die Expressionskassette aus dem Plasmid pFastBac HT B.RopGAP2 71-424 wurde durch homologe Rekombination mit Hilfe des Plasmids pMON7124 des E. coli-Stammes DH10Bac in das Bakmid bMon14272 transferiert (Abbildung 3.1, 3.1.9.1, 3.1.11.1, 3.2.1.3.3). Von dem rekombinanten Bakmid bMON14272.RopGAP2∆70 wurde RopGAP2∆70 als Fusionsprotein mit einer N-terminalen Hexahistidinsequenz exprimiert. Dieses Protein konnte jedoch nicht über Nickel-NTA-Agarose aufgereinigt werden, da die Histidinsequenz anscheinend nicht zugänglich war. Um eine mögliche Einfaltung der Histidinsequenz zu verhindern, wurde das rekombinante Bakmid bMON14272.RopGAP2 hergestellt, von dem RopGAP2 f.l. als Fusion mit einer N-terminalen Hexahistidinsequenz und GST exprimiert wurde. Die Histidinsequenz kann mit Hilfe der Precisionprotease von GST abgespalten werden. Die Reinigung des Fusionsproteins erfolgte durch Chromatographie über Nickel-NTAAgarose, anschließende Spaltung mit Precisionprotease, Entfernung von GST und der Protease durch Reinigung über GSH-Sepharose und Gelfiltration (Abbildung 4.23) (3.2.3.11). Bei der Gelfiltration traten wiederum zwei Proteinpopulationen auf, wobei eine dem aggregierten Protein entsprach während die zweite vermutlich ein Heptamer darstellte. Mit dem entwickelten Protokoll konnten 0,3 mg reines His6-GST-RopGAP2-Protein aus 100 ml Kultur erzielt werden. 4 Ergebnisse 100 Abbildung 4.23: Reinigung von RopGAP2 aus Sf21-Zellen. RopGAP2 wurde mit dem BakulovirusExpressionssystem von dem Bakmid bMON14272.RopGAP2 als His6-GST-Fusionsprotein in S. frugiperda exprimiert und über Nickel-NTA-Agarose, GSH-Sepharose und Gelfiltration gereinigt. A: Schematische Darstellung des His6-GST-Fusionsproteins und der Protease-Schnittstellen. B: SDS-PAGE (10 %, gefärbt mit Coomassie Brilliant Blue) zur Analyse der Reinigungsschritte über Affinitätssäulen. C: Elutionsprofil der Gelfiltration und SDS-PAGE (10 %, gefärbt mit Coomassie Brilliant Blue) zur Analyse einzelner Fraktionen der Gelfiltration. GST: Glutathion-S-Transferase; CRIB: CRIB-Domäne; GAP: RhoGAP-homologe Domäne; TEV: TEV-Protease-Erkennungssequenz; L: Sf21-Lysat; Ü: Überstand; P: Sediment; D: Durchlauf der Nickel-NTAAgarose-Säule; W: Waschfraktion der Nickel-NTA-Agarose-Säule; E: Eluat der Nickel-NTA-Agarose-Säule. 4.2.3 Regulation von Rop-Proteinen durch RopGAP2 4.2.3.1 Untersuchung der Interaktion von RopGAP2 mit Rho-Proteinen im HefeZweihybridsystem Um aufzuklären, auf welche Weise RopGAP2 regulatorisch auf Rop-Proteine wirkt, wurde die Interaktion von RopGAP2 mit Rop4 im Hefe-Zweihybridsystem untersucht (Abbildung 4.24). Da viele Effektoren von humanem Rac1 und Cdc42 CRIB-Domänen −wie sie auch in RopGAPs vorkommen− enthalten, wurde außerdem die Interaktion von RopGAP2 mit diesen Proteinen untersucht. Zum Test der Interaktionen wurde ein Hefe-Zweihybridsystem verwendet, das auf der DNA-bindenden Domäne des bakteriellen Transkriptionsfaktors LexA und 4 Ergebnisse 101 der Transaktivierungsdomäne des viralen Transkriptionsfaktors VP16 basiert. In diesem System werden Interaktionen durch die Expression zweier verschiedener Reportergene angezeigt. Zum einen wird im Falle einer Interaktion die β-Galaktosidase exprimiert, die den Farbstoff 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid (X-Gal) spaltet und so zu einer Blaufärbung der Hefekolonien führt. Als zweites Reportergen wird bei Interaktion das HIS3Gen exprimiert, welches die Histidinauxotrophie des verwendeten Hefestammes (L40) supprimiert, so dass dieser auf Minimalmedium ohne Zusatz von Histidin wachsen kann (3.1.11.2, 3.2.1.2.3). Abbildung 4.24: Analyse der Interaktionen von RopGAP2 mit Rho-Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem. Die Interaktion von RopGAP2 wt, der CRIB-Domäne und der GAP-Domäne von RopGAP2 mit Rop4, Cdc42 und Rac1 Wildtyp (wt) bzw. konstitutiv aktiv (CA) wurde in dem S. cerevisiae-Stamm L40 untersucht. A: Schematische Darstellung der verwendeten RopGAP2-Konstrukte. B: Selektion von Hefetransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate mit interagierenden Fusionsproteinen von VP16 und LexA durch Expression der β-Galaktosidase auf X-Gal-haltigem Medium. C: Selektion von Hefetransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate mit interagierenden Fusionsproteinen durch Expression des HIS3-Gens auf histidinfreiem Medium. Die Vektoren des Hefe-Zweihybridsystems, pBTM116 und pVP16, dienen als Negativkontrolle. wt: Wildtyp, CA: konstitutiv aktiv. Rop4 wurde vom Plasmid pVP16.Rop4 1-180 in Fusion mit der VP16-Transaktivierungsdomäne (TAD) exprimiert. Das Plasmid pVP16.Rop4G15V 1-180 wurde zur Expression der konstitutiv aktiven (CA) Rop4-Mutante (G15V) als TAD-Fusion verwendet. Humanes Cdc42 und humanes Rac1 wurden ebenfalls als Wildtyp bzw. CA Mutante in Fusion mit der VP16TAD von den Plasmiden pVP16.Cdc42 1-178, pVP16.Cdc42G12V 1-178, pVP16.Rac1 1-184 und pVP16.Rac1G12V 1-184 exprimiert (3.1.9.5). Um eine Membranlokalisation durch posttranslationale Prenylierung zu unterbinden, war in diesen Plasmiden das 3’-Ende der GNBP-cDNA deletiert, welches für die C-terminale CaaX-Sequenz der GNBPs kodiert. Als Köderproteine wurden RopGAP2 f.l. (volle Länge), der nicht konservierte, C-terminale Bereich sowie die CRIB- und die GAP-Domäne von RopGAP2 einzeln exprimiert (3.1.9.5, Plasmide pBTM116.RopGAP2, pBTM116.RopGAP2 1-132, pBTM116.RopGAP2 299-424 4 Ergebnisse 102 bzw. pBTM116.RopGAP2 133-424). Die Expression der Fusionsproteine wurde durch SDSPAGE von Zelllysaten und Western Blot mit anti-LexA- und anti-VP16-Antikörpern überprüft (3.2.3.2. 3.2.3.5). Das Wachstum bzw. die Färbung auf Selektionsplatten zeigte, dass RopGAP2 mit allen drei getesteten G-Proteinen –Rop4, Cdc42 und Rac1– interagierte. Die Interaktion mit konstitutiv aktiven G-Proteinen lieferte jeweils ein stärkeres Signal als die mit dem wt G-Protein. Auch die einzelnen Domänen von RopGAP2 interagierten zumindest mit den konstitutiv aktiven Formen der G-Proteine. Die Interaktion ist demnach spezifisch für die aktive Konformation des GNBPs. Diese Ergebnisse zeigen ferner, dass die CRIB-Domäne von RopGAP2 eine funktionelle G-Protein-bindende Domäne ist und dass RopGAP2 damit zwei unabhängige G-Protein-bindende Domänen enthält. Um die Stärke der Interaktionen zu quantifizieren, wurde eine β-GalaktosidaseReportergenanalyse durchgeführt (3.2.1.2.4) (Abbildung 4.25). Die Analyse zeigte, dass alle Interaktionen mit der CA Form der G-Proteine stärker erfolgen als mit der wt-Form. Am stärksten ist diese Präferenz bei der GAP-Domäne ausgeprägt. Bei der CRIB-Domäne ist eine deutliche Spezifität für Rop4 zu erkennen, da die Interaktionen mit Rac1 und Cdc42 schwächer sind. Bei der Betrachtung der RopGAP2 wt-Interaktionen fällt auf, dass die Interaktionsstärken der einzelnen Domänen nicht addiert werden können, um die Interaktionsstärke des Gesamtproteins zu errechnen. RopGAP2 wt interagiert am stärksten mit Cdc42. Die Interaktion des RopGAP2 wt-Proteins mit Rop4 ist schwächer verglichen mit der Interaktion der CRIB-Domäne und Rop4. Abbildung 4.25: Quantifizierung der Hefe-Zweihybridinteraktionen durch Bestimmung der βGalaktosidaseaktivität. Die Aktivität des β-Galaktosidase-Reportergens in Lysaten von S. cerevisiae L40-CoTransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate wurde für die Interaktionen von RopGAP2 wt, der CRIBDomäne und der GAP-Domäne von RopGAP2 mit Rop4, Cdc42 und Rac1 wt bzw. konstitutiv aktiv bestimmt. Sie ist ein Maß für die Stärke der Interaktion der Fusionsproteine. Die Werte der β-Galaktosidaseaktivität wurden photometrisch in mindestens drei unabhängigen Experimenten ermittelt und mit der Stärke der Rop4 CA-RopGAP2 wt-Interaktion in Relation gesetzt, die auf den Wert 1 normiert wurde. wt: Wildtyp, CA: konstitutiv aktiv. 4 Ergebnisse 103 4.2.3.2 Untersuchung der Interaktionen von RopGAP2 mit unterschiedlichen Rops im Hefe-Zweihybridsystem In A. thaliana wurden elf unterschiedliche Rop-Proteine und neun unterschiedliche RopGAPs gefunden. Viele Rop-Proteine werden in den gleichen Geweben bzw. Organen exprimiert. Daher liegt es nahe anzunehmen, dass die Interaktionspartner der Rops deutliche Spezifitäten einzelnen Rops gegenüber ausgebildet haben. Um die Spezifität der beiden G-Protein-bindenden Domänen von RopGAP2 gegenüber verschiedenen Rops zu untersuchen, wurden die A.t.Rops der Gruppe IV (Rop1 bis Rop6) im oben beschriebenen Hefe-Zweihybridsystem mit RopGAP2 analysiert (Abbildung 4.26). Abbildung 4.26: Analyse der Interaktionen von RopGAP2 mit Rho-Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem. Die Interaktion von RopGAP2 wt, der CRIB-Domäne und der GAP-Domäne von RopGAP2 wurde mit Rop1 bis Rop6 wt bzw. konstitutiv aktiv in dem S. cerevisiae-Stamm L40 untersucht. A: Schematische Darstellung der verwendeten RopGAP2-Konstrukte. B: Selektion von Hefetransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate mit interagierenden Fusionsproteinen von VP16 und LexA durch Expression der β-Galaktosidase auf X-Gal-haltigem Medium. C: Selektion von Hefetransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate mit interagierenden Fusionsproteinen durch Expression des HIS3-Gens auf histidinfreiem Medium. Für diese Analysen wurden folgende Plasmide eingesetzt: pVP16.Rop1 1-180, pVP16.Rop1G15V 1-180, pVP16.Rop2 1-179, pVP16. Rop2G14V 1-179, pVP16.Rop3 1-180, pVP16.Rop3G15V 1-180, pVP16.Rop4 1-180, pVP16.Rop4G15V 1180, pVP16.Rop5 1-180, pVP16.Rop5G15V 1-180, pVP16.Rop6 1-180, pVP16.Rop6G15V 1-180, pBTM116. RopGAP2, pBTM116.RopGAP2 1-132 und pBTM116.RopGAP2 133-424. Die Vektoren des Hefe-Zweihybridsystems, pBTM116 und pVP16, dienen als Negativkontrolle. wt: Wildtyp, CA: konstitutiv aktiv. Die G-Proteine wurden wiederum in ihrer wt-Form und in ihrer CA Form jeweils mit einer Cterminalen Deletion der CaaX-Sequenz dazu eingesetzt (3.1.9.5). Die Expression der 4 Ergebnisse 104 Fusionsproteine wurde durch SDS-PAGE von Zelllysaten und Western Blot mit anti-LexAund anti-VP16-Antikörpern überprüft (3.2.3.2. 3.2.3.5). Für fast alle Kombinationen wurden Interaktionen festgestellt. Wie sich schon zuvor bei Rop4, Cdc42 und Rac1 gezeigt hatte, interagieren alle Rops in ihrer CA Form stärker als in der wt-Form, in der GTP vermutlich durch RopGAP2 hydrolysiert wird und Rop deshalb nur zum Teil mit GTP beladen in der Zelle vorliegt. Die einzelnen Domänen von RopGAP2 interagieren stärker mit den G-Proteinen als das wt-Protein. Die semiquantitative Auswertung durch die β-Galaktosidase-Reportergenanalyse machte die Unterschiede zwischen den Rops deutlicher (Abbildung 4.27). Die CRIB-Domäne von RopGAP2 zeigte eine klare Präferenz für Rop2. Auch die GAP-Domäne interagierte mit Rop2 stärker als mit anderen Rops. Die Interaktionen der CRIB-Domäne mit Rop1 und Rop3 sind sehr schwach. Dies sind auch diejenigen Rops, die am schwächsten mit der GAP-Domäne von RopGAP2 interagieren. Zwischen Rop4, Rop5 und Rop6 wurden nur minimale Unterschiede sowohl bei der Interaktion mit der CRIB- als auch der GAP-Domäne gefunden. Die Interaktionen mit RopGAP2 wt zeigten geringere Unterschiede in der β-GalaktosidaseReportergenanalyse. Im Gegensatz zur den einzelnen Domänen wurde die stärkste Interaktion von RopGAP2 wt mit Rop1 gefunden. Abbildung 4.27: Quantifizierung der Hefe-Zweihybridinteraktionen durch Bestimmung der βGalaktosidaseaktivität. Die Aktivität des β-Galaktosidase-Reportergens in Lysaten von S. cerevisiae L40-CoTransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate wurde für die Interaktionen von RopGAP2 wt, der CRIBDomäne und der GAP-Domäne von RopGAP2 mit Rop4, Cdc42 und Rac1 wt bzw. konstitutiv aktiv bestimmt. Sie ist ein Maß für die Stärke der Interaktion der Fusionsproteine. Die Werte der β-Galaktosidaseaktivität wurden photometrisch in mindestens drei unabhängigen Experimenten ermittelt und mit der Stärke der Rop4 wt – RopGAP2 wt-Interaktion in Relation gesetzt, die auf den Wert 1 normiert wurde. wt: Wildtyp, CA: konstitutiv aktiv. 4 Ergebnisse 105 4.2.3.3 Untersuchung der Interaktion von RopGAP2 mit Rop4 in vitro Die Interaktion von Rop4 mit RopGAP2 wurde durch einen in vitro-Interaktionstest verifiziert. Dazu wurde gereinigtes GST-RopGAP2∆70 und mit GppNHp-beladenes His6Rop4 eingesetzt (siehe 4.1.2 und 4.2.2.1). GST-RopGAP2∆70 wurde an GSH-Sepharose gekoppelt und die Bindung von His6-Rop4*GppNHp an das GST-Fusionsprotein wurde im Western Blot mit einem anti-His6-Antikörper nachgewiesen (3.2.3.5, Abbildung 4.28 A). Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung von His6-Rop4*GppNHp an RopGAP2∆70 auch in vitro spezifisch erfolgt. Dabei wurde His6-Rop4*GppNHp (Spur 1) der GDP-gebundenen Form (His6-Rop4*GDP, Spur 2) vorgezogen. Abbildung 4.28: Interaktion zwischen Rop4 und RopGAP2 in vitro. A: In vitro-Interaktionstest mit an GSHSepharose gebundenem GST-RopGAP2∆70 zum Nachweis der Interaktion von Rop4 mit RopGAP2. Die Interaktion von gereinigtem GST-RopGAP2∆70 mit His6-Rop4 wurde im Western Blot mit einem anti-His6Antikörper nachgewiesen. Als Kontrollen dienten His6-Rop4*GDP, Puffer und ein Ansatz mit His6Rop4*GppNHp und GST. 1: GST-RopGAP2∆70 + His6-Rop4*GppNHp; 2: GST-RopGAP2∆70 + His6Rop4*GDP; 3: GST + His6-Rop4*GppNHp; -: GST-RopGAP2∆70 + Puffer. B: Fluoreszenztitration von His6Rop4*mGppNHp mit RopGAP2∆70. Wird RopGAP2∆70 zu 400 nM His6-Rop4*GppNHp titriert, so nimmt die Fluoreszenz der mant-Gruppe abhängig von der RopGAP∆70-Konzentration ab. Der Betrag der Fluoreszenzänderung wird gegen die RopGAP2∆70-Konzentration aufgetragen und zur Berechnung des KDWertes herangezogen. Der KD der His6-Rop4*GppNHp-RopGAP2∆70 Interaktion beträgt 84±29 nM. F: Betrag der Fluoreszenzänderung. In Fluoreszenztitrationsexperimenten wurde ebenfalls die Interaktion von Rop4*mGppNHp und RopGAP2∆70 nachgewiesen (3.2.4.5). Das Prinzip dieses Experiments beruht auf einer Fluoreszenzänderung des mant-Nukleotids in Abhängigkeit von der Bindung eines Proteins an Rop4*mGppNHp. Wird Rop4*mGppNHp mit RopGAP2∆70 titriert, so nimmt die Fluoreszenz ab. Anhand der Fluoreszenzänderung kann die Dissoziationsgleichgewichtskonstante KD berechnet werden (3.2.4.5, Abbildung 4.28 B). Für die Interaktion zwischen Rop4*GppNHp und RopGAP2∆70 beträgt sie 84 ± 29 nM. Wird mit der GAP-Domäne von RopGAP2 (RopGAP2∆132, Aminosäuren 133-424) auf gleiche Weise titriert, so ändert sich 4 Ergebnisse 106 die Fluoreszenz bis zu einer Zugabe von 10 µM RopGAP2∆132 nicht. Dies deutet darauf hin, dass die CRIB-Domäne hauptverantwortlich für die oben gezeigte Interaktion ist. 4.2.3.4 Aktivierung der Hydrolyse von Rop4*GTP durch RopGAP2 Die intrinsische Hydrolyseaktivität von Rop4 ist gering und scheint GAPs zu benötigen, die die GTP-Hydrolyse stimulieren (siehe 4.1.3.5). Um die Aktivität von RopGAP2 zu untersuchen, wurde die Hydrolyse von Rop4*GTP in Gegenwart von RopGAP2∆70 durch HPLC-Analyse verfolgt (3.2.3.8) (Abbildung 4.29). Abbildung 4.29: Aktivierung der Hydrolyse von Rop4*GTP durch RopGAP2. Die Hydrolyse von Rop4*GTP wurde anhand der GDP-Zunahme während der Reaktion mittels HPLC verfolgt. A: Vergleich der intrinsischen Hydrolyse von Rop4*GTP (100 µM) mit der Hydrolyse in Ansätzen mit RopGAP2∆70 (100 nM) bzw. RopGAP2∆132 (GAP-Domäne, 100 nM). B: Beschleunigung der Rop4*GTP- (100 µM) Hydrolyse in Abhängigkeit von der RopGAP2∆70-Konzentration. C: Michaelis-Menten-Kinetik mit RopGAP2∆70 (1 µM) und steigenden Rop4*GTP-Konzentrationen (100 µM bis 1000 µM). Durch Mittelung von drei unabhängigen Experimenten wurden folgende Werte erhalten: KM = 275±44 µM; kcat = 3,3±0,2 /s. Die Rop4*GTP-Hydrolyse wurde dabei deutlich konzentrationsabhängig durch RopGAP2∆70 beschleunigt. Durch Aufnahme der Michaelis-Menten-Kinetik mit RopGAP2∆70 wurde ein 4 Ergebnisse 107 KM-Wert von 275 ± 44 µM und eine kcat-Konstante von 3,3 ± 0,2 /s ermittelt (3.2.3.17). Der KM-Wert gibt die Rop4*GTP-Konzentration an, bei der die halbmaximale Hydrolysegeschwindigkeit erreicht wird. Die ermittelte kcat ist ein Maß für die maximale Umsatzrate. Wird die isolierte GAP-Domäne (RopGAP2∆132) von RopGAP2 eingesetzt, so ist keine messbare Beschleunigung der Hydrolyse von Rop4*GTP zu beobachten. Demzufolge ist die CRIB-Domäne für die volle Funktion von RopGAP2 nötig. 4.3 Interaktion von Rops mit RICs 4.3.1 Bioinformatische Analyse sequenzdeterminierter Eigenschaften der RICs aus A. thaliana In A. thaliana wurden elf Gene für RICs (Rop-interactive CRIB motif-containing proteins) beschrieben (Wu et al. 2001). Sieben der RIC-Gene wurden in dieser Arbeit untersucht. Die entsprechenden cDNAs für RIC1 bis RIC6 und RIC9 konnten in dieser Arbeit oder von A. Berken mittels PCR aus cDNA-Bibliotheken bzw. mittels RT-PCR aus mRNA von A. thaliana kloniert werden (3.1.10, 3.1.9.1) (Abbildung 4.31). Die klonierten Sequenzen unterscheiden sich teilweise deutlich von den publizierten Aminosäuresequenzen und von EST-Sequenzen in den Datenbanken, und sie stellen möglicherweise Spleißvarianten der RICs dar (Abbildung 4.30). Abbildung 4.30: Vergleich von RIC9-ESTs. Schematische Darstellung der Primärstruktur von EST(expressed sequence tag) Sequenzen mit Homologie zu RIC9. EST-Datenbankeinträge: TC191927, NP037700, AAD21424, AU236405, AU227318. Rot: CRIB-Motiv. Die Sequenzen der hier analysierten RICs (RIC1 bis RIC6, RIC9) wurden zunächst in silico charakterisiert (Tabelle 4.3). Putative Phosphorylierungsstellen der Proteinkinase C oder der Caseinkinase II sind in allen RIC-Sequenzen enthalten. Einige RICs besitzen zusätzlich Signalsequenzen für Amidierung. Dem Programm „Target P“ zufolge sind RICs zytoplasmatisch lokalisiert (Emanuelsson et al. 2000). 4 Ergebnisse 108 Ric6 RIC9 RIC5 RIC3 RIC4 RIC1 RIC2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------MKDRMERLLILPFSLGCSTQSCVAVATTHQQKKPNQLIKRREESHENGSFEKEYTKMDRN 60 RIC6 RIC9 RIC5 Ric3 RIC4 RIC1 RIC2 ---------------------------------MKSLL---KGLRYISQVF---ES--------------------------MATR------FKGLYN--KSFKCFSDIF---DVE-------------------------MTSP------MKGLL---KGLRYIARIF---EDE-------------------------MAT-------VKGLL---KGLRYITQIF---DEE-------------------------MAT-------VKGLL---KGLRYITQIF---DEE-------------------------MATT------MKGLL---KGLRYITQIF---DEE--GANMLDGRVESDAKGSFRKDYTKMENNNNGANISDGIYRIIRSFKSFSHFFIRYEEETKE ..: :.:: :: .* : 17 23 22 21 21 22 120 RIC6 RIC9 RIC5 Ric3 RIC4 RIC1 RIC2 KEEEIQIGNPTDVKHVAHIGWDGPSANATAPSWMTEFNSGGGFESAEGVGEDDSSIKCMS EEEEMEIGYPTDVRHVSHIGWD--SSSSSAPSWLHEFKTSN------NVLEPNSSWP--KEPEMQIGIPTDVKHVAHIGWE--GPSATTPSWMHDFKPTDQTKTETKGTSNKKPGSSGE KDKDMQIGFPTDVKHVAHIGSD--GPATNVPSWMGDFKPQENENGQVVSRADAN-NNQIG XDXDMQIGFPTDVKHVAHIGSD--GPATNVPSWMGDFKPQENENGQVVSRADAN-NNQIG KEQEMQIGFPTDVKHVAHIGSD--GPTNTTPSWMNDFKTQEHEKGQVVSRGNSNKYNPQG REAEMEIGFPTDVKHLSHIGVD---------GTMTTFDNTS------------SSFP--: :::** ****:*::*** : . : *. . 60 49 58 78 78 58 156 RIC6 RIC9 RIC5 Ric3 RIC4 RIC1 RIC2 ----EYGGRSRDLPNLPKSTRKAASEKGSPTKDKSSDKTKRRSSNKGTSSSSRRPKEATE -----FQGNSKEME-----------------RESTKQNLKKKLSSKASLLCN-----------KHRKGRRKTSTGNNSPTESPSRVGGSVRPSKRNTGKQREQNTGSGSESG---------EGVGLQELLPP--TDKPKHKKTRRKSETVS--QNGSPPRRNSSASASDMQPKNTRRH ---EGVGLQELLPP--TDKPKHKKTRRKSETVS--QNGSPPRRNSSASASDMQPKNTRRH TNQRGAGLKELLPSNTNEKPKQKTRRKPGGAASPNHNGSPPRKSSGNAASSDEPSKHSRH -----FSG----------------------------------FHLTGTVV---------: 133 102 129 131 131 140 167 RIC6 RIC9 RIC5 Ric3 RIC4 RIC1 RIC2 EQDELSSWPSGLPEIPKKSRRKKKSTKETAVNGGSSRSTRRSDVDNMSEYMSETGSVRSM ------SWS------PRFSR----SSKVLA------------------------------SGLELPQQTDQFVVPKQSKQKKSKGSATG-GGEPPPSNEPSNTKETDISVRAVYPCAGL HRSRHGSIDSSND--PSVRRRRVVSVTTNDMEGSYPLSDSSTHSRKSTSRHRKPKGS-GG HRSRHGSIDSSND--PSVRRRRVVSVTTNDMEGSYPLSDSSTHSRKSTSRHRKPKGS-GG NRSAHGSTDSSNDQEPSVRRRRGG-IPAPDTEVPNQIPDGSAPPRKATSRPRKLKGSSAG ------------------------------------------------------------ 193 116 187 188 188 198 RIC6 RIC9 RIC5 Ric3 RIC4 RIC1 RIC2 PQFDNRDDF---------------------------------------------------------GSSTGR---------------------------GELSMKKT-KGKTENPIVESVDTCNDNNISDKEGELSMKKT-KGKTENPIVESVDTCNDNNISDKEGEGSIKKSSKGKPEN----SVDTTCNDII-------------------------------------- 202 193 220 220 223 Abbildung 4.31: Alignment der analysierten RIC-Sequenzen. In Zusammenarbeit mit A. Berken wurden die Sequenzen von RIC1 bis RIC6 und RIC9 kloniert. Sie umfassen 116-223 Aminosäuren und beinhalten das konservierte CRIB-Motiv (rot) in unterschiedlichen Positionen. *: alle Aminosäuren identisch; :: konservierte Substitutionen; .: semi-konservierte Substitutionen. Tabelle 4.3: Sequenzdeterminierte Eigenschaften der RICs. Die Aminosäuresequenzen der RICs wurden mit Hilfe verschiedener Programme analysiert, die unter dem Namen ProtParam zusammengefasst sind (Guruprasad et al. 1990, Ikai 1980, Kyte und Doolittle 1982). AS: Aminosäuren. Protein RIC1 RIC2 RIC3 RIC4 RIC5 RIC6 RIC9 Aminosäuren 224 167 220 220 193 202 116 Molekulargewicht 24,1 19,1 24,2 24,2 20,7 22,2 13,3 pI-Wert 9,89 6,60 9,68 9.54 9,84 9,08 7,78 Anzahl negativ geladener AS 24 24 28 28 20 31 15 Anzahl positiv geladener AS 36 23 37 35 31 35 16 Hydrophatiewert -1.281 -0.741 -1.199 -1.163 -1.178 -1.201 -0.800 Instabilitätsindex 44.32 37.93 51.54 51.93 52.45 88.23 59.56 aliphatischer Index 42.28 55.45 50.00 50.00 39.38 39.60 52.93 4 Ergebnisse 109 4.3.2 Die Interaktion zwischen Rops und RICs 4.3.2.1 Untersuchung der Interaktion von RICs mit menschlichen Rho-Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem Zur Analyse der RICs wurde zunächst die Funktionalität des CRIB-Motivs der RICs in dem bereits beschriebenen Hefe-Zweihybridsystem untersucht. Da das CRIB-Motiv aus Effektoren von Cdc42 und Rac1 bekannt ist, wurde zunächst die Bindung von RICs an diese beiden GProteine getestet (Abbildung 4.32). Hierzu wurden die RICs als Fusion mit der DNAbindenden Domäne des LexA-Proteins mit Hilfe von Derivaten des Vektors pBTM116 in S. cerevisiae L40 exprimiert (3.1.9.5). Cdc42 und Rac1 wurden als wt-Proteine und als konstitutiv aktive Mutante als Fusionen mit der VP16-Transaktivierungsdomäne von den Plasmiden pVP16.Cdc42 1-178, pVP16.Cdc42G12V 1-178, pVP16.Rac1 1-184 und pVP16.Rac1G12V 1-184 co-exprimiert. Die Expression der Fusionsproteine wurde durch SDS-PAGE von Zelllysaten und anschließendem Western Blot sichergestellt (3.2.3.2. 3.2.3.5). Abbildung 4.32: Analyse der Interaktionen von RICs mit menschlichen Rho-Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem. Die Interaktion der RICs 1-6 und 9 mit Cdc42 und Rac1 Wildtyp (wt) bzw. konstitutiv aktiv (CA) wurde in dem S. cerevisiae Stamm-L40 untersucht. A: Selektion von Hefetransformanten der pBTM116und pVP16-Derivate (pBTM116.RIC1, pBTM116.RIC2, pBTM116.RIC3, pBTM116.RIC4, pBTM116.RIC5, pBTM116.RIC6, pBTM116.RIC9) mit interagierenden Fusionsproteinen von VP16 und LexA durch Expression der β-Galaktosidase auf X-Gal-haltigem Medium. B: Selektion von Hefetransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate mit interagierenden Fusionsproteinen durch Expression des HIS3-Gens auf histidinfreiem Medium. Die Vektoren des Hefe-Zweihybridsystems, pBTM116 und pVP16, dienen als Negativkontrolle. Im Fall von RIC4, RIC6 und RIC9 konnte eine Interaktion mit mindestens einem menschlichen Protein der Rho-Familie nachgewiesen werden. Die Interaktion ist spezifisch 4 Ergebnisse 110 für die konstitutiv aktive Variante von Rac1 bzw. Cdc42. Demzufolge handelt es sich bei dem CRIB-Motiv dieser drei RICs um eine funktionelle G-Protein-Bindestelle. Die Stärke der Interaktion wurde mit Hilfe der β-Galaktosidase-Reportergenanalyse quantifiziert (Abbildung 4.33). Die Ergebnisse des Tests bestätigen die Resultate der Selektionsplatten. Abbildung 4.33: Quantifizierung der Hefe-Zweihybridinteraktionen durch Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität. Die Aktivität des β-Galaktosidase-Reportergens in Lysaten von S. cerevisiae L40-CoTransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate wurde für die Interaktionen der RICs mit Cdc42 und Rac1 wt bzw. CA bestimmt. Sie ist ein Maß für die Stärke der Interaktion der Fusionsproteine. Die Werte der βGalaktosidaseaktivität wurden photometrisch in mindestens drei unabhängigen Experimenten ermittelt und mit der Stärke der Cdc42 CA-RIC9 wt-Interaktion in Relation gesetzt, die auf den Wert 1 normiert wurde. wt: Wildtyp, CA: konstitutiv aktiv. 4.3.2.2 Untersuchung der Spezifität der Rop-RIC-Interaktion im Hefe- Zweihybridsystem Nachdem die Funktionalität des CRIB-Motives als G-Protein-Bindestelle gezeigt werden konnte, sollte im Weiteren die Spezifität der Rop-RIC-Interaktion analysiert werden. Die Fülle verschiedener Rops und RICs in A. thaliana lässt Spezifitäten einzelner Rops zu bestimmten RICs vermuten. Aus diesem Grund wurden im beschriebenen HefeZweihybridsystem die unterschiedlichen Rop-RIC-Kombinationen auf ihre Interaktion hin untersucht (Abbildung 4.34 und 4.35). 4 Ergebnisse 111 Abbildung 4.34: Analyse der Interaktionen von RICs und Rops im Hefe-Zweihybridsystem. Die Interaktion der RICs 1-6 und 9 mit den Rops 1-6 wt bzw. CA wurde in dem S. cerevisiae-Stamm L40 untersucht. A: Selektion von Hefetransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate (pVP16.Rop1, pVP16.Rop1G15V, pVP16.Rop2, pVP16.Rop2G14V, pVP16.Rop3, pVP16.Rop3G15V, pVP16.Rop4, pVP16.Rop4G15V, pVP16.Rop5, pVP16.Rop5G15V, pVP16.Rop6, pVP16.Rop6G15V) mit interagierenden Fusionsproteinen durch Expression der β-Galaktosidase auf X-Gal-haltigem Medium. B: Selektion von Hefetransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate mit interagierenden Fusionsproteinen von VP16 und LexA durch Expression des HIS3-Gens auf histidinfreiem Medium. Die Vektoren des Hefe-Zweihybridsystems, pBTM116 und pVP16, dienen als Negativkontrolle. Hierzu wurden die Rops in der wt- und konstitutiv aktiven Form als Fusion mit der Transaktivierungsdomäne von VP16 (3.1.9.5) in dem S. cerevisiae-Stamm L40 mit den RICs als LexA-Fusion (3.1.9.5) coexprimiert. Die Selektion interagierender Klone erfolgte wiederum über die Expression der β-Galaktosidase und das His-prototrophe Wachstum. Um die Expression der RICs in Hefe zu überprüfen, wurden die RIC-Fusionsproteine im Western Blot mit anti-LexA-Antikörpern nachgewiesen (3.2.3.2. 3.2.3.5). Insbesondere bei der semiquantitativen Analyse der Interaktionen in der β-GalaktosidaseReportergenanalyse (Abbildung 4.35) fällt auf, dass einige RICs eine besonders grosse RopSpezifität aufweisen. So interagiert zum Beispiel RIC1 ausschließlich mit Rop4. RIC3 und RIC4 sind spezifisch für Rop2 und Rop4. RIC6 und RIC9 haben keine ausgeprägte Spezifität einzelnen Rops gegenüber. Sie interagieren mit allen Rops, allerdings in unterschiedlicher Weise. Die stärksten Interaktionen finden mit Rop2, Rop4 und Rop5 statt. RIC5 hat die gleichen Spezifitäten wie RIC6 und RIC9, die Interaktion erfolgt jedoch weniger stark. Allein RIC2 interagiert mit keinem Rop der Gruppe IV. Bei allen RICs ist erkennbar, dass sie stärker mit der aktivierten Form des G-Proteins interagieren. 4 Ergebnisse 112 Abbildung 4.35: Quantifizierung der Hefe-Zweihybridinteraktionen durch Bestimmung der βGalaktosidase-Aktivität. Die Aktivität des β-Galaktosidase-Reportergens in Lysaten von S. cerevisiae L40 CoTransformanten der pBTM116- und pVP16-Derivate wurde für die Interaktionen der RICs mit den Rops wt bzw. CA bestimmt. Sie ist ein Maß für die Stärke der Interaktion der Fusionsproteine. Die Werte der β-GalaktosidaseAktivität wurden photometrisch in mindestens drei unabhängigen Experimenten ermittelt und mit der Stärke der Rop4 CA – RIC6 wt-Interaktion in Relation gesetzt, die auf den Wert 1 normiert wurde. wt: Wildtyp, CA: konstitutiv aktiv; K: Kontrolle (pVP16). 4 Ergebnisse 113 4.3.2.3 Untersuchung der Interaktion von RICs mit Rop4 in vitro Um die Interaktion von Rops mit RICs im Hefe-Zweihybridsystem durch in vitro-Experimente zu verifizieren, sollten die sieben untersuchten RICs in E. coli exprimiert und gereinigt werden. Hierzu wurden Fusionsproteine der RICs mit der Glutathion-S-Transferase (Plasmide pGEX-4T-1.RIC1, pGEX-4T-1.RIC2, pGEX-4T-1.RIC3, pGEX-4T-1.RIC4, pGEX-4T1.RIC5, pGEX-4T-1.RIC6, pGEX-4T-1.RIC9, 3.1.9.1) kreiert. Bei der Expression dieser Proteine in E. coli BL21(DE3) Codon Plus RIL zeigte sich jedoch, dass außer RIC6 und RIC9 alle anderen RICs entweder nicht exprimiert wurden, stark degradiert wurden oder unlöslich waren. GST-RIC6 und GST-RIC9 wurden über GSH-Sepharose gereinigt und im in vitro-Interaktionstest eingesetzt (3.2.3.12, 3.2.3.19). Sie wurden an GSH-Sepharose gekoppelt und die Bindung von His6-Rop4*GppNHp wurde im Western Blot (3.2.3.5) durch einen antiHis6-Antikörper nachgewiesen (Abbildung 4.36). Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Rop4*GppNHp an RIC6 und RIC9 auch in vitro erfolgt und dass die Interaktion spezifisch durch aktiviertes Rop4 vermittelt wird. Abbildung 4.36: Interaktion von Rop4 mit RIC6 und RIC9 in vitro. A: SDS-PAGE (12 %, gefärbt mit Coomassie Brilliant Blue) zum Verlauf der Reinigung von GST-RIC9. Ü: Überstand des Bakterienlysates; P: Sediment; D: Durchlauf der GSH-Sepharose; E1-E6: Fraktionen der Elution des Fusionsproteins. B: Polarisationsexperiment zur Analyse der Interaktion zwischen Rop4 und RIC9. Für die Messung wurden 100 nM Rop4*mGppNHp / Rop4*mGDP und 10 µM GST-RIC9 verwendet. C: Western Blot zum Nachweis der Interaktion von GST-RIC6 und GST-RIC9 mit His6-Rop4 mit einem anti-His6-Antikörper. Als Kontrollen dienten His6-Rop4*GDP und GST. D: Densitometrische Auswertung der Signale im Western Blot. Es wurden die Ergebnisse aus mindestens drei unabhängigen Experimenten gemittelt. 4 Ergebnisse 114 Die Interaktion von Rop4*mGppNHp mit RIC9 wurde auch in Polarisationsexperimenten gemessen (3.2.4.4). Dabei steigt das Polarisationssignal des mant-Nukleotids bei der Bindung von GST-RIC9 (Abbildung 4.36). Bei Verwendung von Rop4*mGDP wurde kein signifikanter Anstieg der Fluoreszenz beobachtet. Die beobachtete Fluoreszenzänderung war allerdings sehr gering, so dass die Ermittlung der Dissoziationsgleichgewichtskonstante nicht möglich war. 4.3.3 Funktion von RICs in der Regulation der Aktinorganisation Die physiologische Funktion von RICs ist noch weitgehend unbekannt. Für einige RICs wird eine Beteiligung an der Organsation des Aktinzytoskeletts angenommen. Um den Einfluss von RIC9 auf die Aktinorganisation zu untersuchen, wurde RIC9 mit dem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) N-terminal fusioniert. YFP-RIC9 wurde zusammen mit CFPmTalin bzw. CFP-Rop4 von den Plasmiden pSP-EYFP.RIC9, pSP.ECFP.Rop4 und pBA005.mTalin in Zwiebelzellen exprimiert (3.2.1.5.1) (Abbildung 4.37). Abbildung 4.37: Der Einfluss von RIC9 auf das Aktinzytoskelett von Zwiebel-Epidermiszellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von Epidermiszellen der Zwiebel nach Transformation mit den Plasmiden pSP-EYFP.RIC9 und pBA005.mTalin. Die transformierten Konstrukte sind links bzw. über den Bildern vermerkt. Zum Vergleich des Aktinzytoskelettes wurde unten eine Zelle abgebildet, die nur GFP-mTalin exprimiert. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Die Exzitationswellenlänge für CFP beträgt 458 nm, die Emission wurde von 465 nm bis 510 nm aufgenommen. YFP wurde mit 514 nm angeregt und von 530 nm bis 600 nm detektiert. 4 Ergebnisse 115 Die Architektur des Aktinzytoskeletts wurde durch die Expression von YFP-RIC9 nicht signifikant beeinflusst. Es hat die gleiche Struktur wie in Zellen, die nur mit GFP-mTalin transformiert wurden. YFP-RIC9 ist dabei zytoplasmatisch lokalisiert. Teilweise ist es zusammen mit Aktin in Zytoplasmasträngen lokalisiert, die die Vakuole durchqueren. Teilweise befindet es sich an der Membran und ist dort mit Aktin co-lokalisiert. Wird YFP-RIC9 zusammen mit CFP-Rop4 exprimiert, so ist YFP-RIC9 mit CFP-Rop4 wt bzw. G15V co-lokalisiert. Zwischen CFP-Rop4 wt- und CFP-RopG15V-exprimierenden Zellen wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt (Abbildung 4.38). Ein Teil der Fusionsproteine ist jeweils im Kern lokalisiert. Dies ist vermutlich auf eine durch den CFPFusionsteil herbeigeführte artifizielle Lokalisation zurückzuführen. Abbildung 4.38: Der Einfluss von RIC9 auf das Aktinzytoskelett von Zwiebel-Epidermiszellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von Epidermiszellen der Zwiebel nach Transformation mit den Plasmiden pSP-EYFP.RIC9 und pSP-ECFP.Rop4 wt bzw. pSP-ECFP.Rop4 G15V. Die transformierten Konstrukte sind links bzw. über den Bildern vermerkt. Überlagerungen von grün und rot sind in gelb dargestellt und zeigen eine co-Lokalisation der beiden Proteine an. Die Exzitationswellenlänge für CFP beträgt 488 nm, die Emission wurde von 465 nm bis 510 nm aufgenommen. YFP wurde mit 514 nm angeregt und von 530 nm bis 600 nm detektiert. 5 Diskussion 116 5 Diskussion Rho-homologe Rop-Proteine spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Aktinzytoskeletts in Pflanzen. Als Mitglieder der Ras-Superfamilie wirken sie als molekulare Schalter, die zwischen einem GDP-gebundenen und einem GTP-gebundenen Zustand wechseln. Bei den Rho-Proteinen der Säuger regulieren GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) und Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) den GTPase-Zyklus (Bourne et al. 1991, Wittinghofer 1998b, Nuoffer und Balch 1994, Diekmann und Hall 1995, Scheffzek et al. 1998). In Pflanzen wird eine ähnliche Regulation angenommen. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Es wird vermutet, dass sie in einer neuartigen Weise reguliert werden, die spezifisch für die pflanzlichen RhoProteine ist (Zheng und Yang 2000b, Li et al. 1998, Mathur und Hulskamp 2002b). So besitzen RopGAPs eine einzigartige Struktur aus einer CRIB-Domäne und einer GAPDomäne, wobei die Funktion der CRIB-Domäne noch nicht verstanden ist (Wu et al. 2000). Für die Studien der Regulation pflanzlicher Rho-Proteine wurden Proteine der Ackerschmalwand (A. thaliana) gewählt, da diese Pflanze als Modellorganismus gilt, intensiv untersucht wird und ihr Genom komplett sequenziert ist (The Arabidopsis Genome Initiative 2000). 5.1 Rop4 hat die Charakteristika eines molekularen Schalters Ein molekularer Schalter zeichnet sich durch den Wechsel zwischen einem inaktiven und einem aktiven Zustand aus. Bei Proteinen der Ras-Superfamilie wechselwirkt nur der aktive, GTP-beladene Zustand mit Effektoren. Ein molekularer Schalter ist weiterhin durch die strikte Regulierbarkeit dieser zwei Zustände gekennzeichnet. Bei GNBPs sorgen dafür hauptsächlich zwei Eigenschaften: Ihre hohe Affinität zu Guaninnukleotiden (KD-Werte von 10-7 bis 10-12 M) und ihre niedrige intrinsische Hydrolyseaktivität (kcat-Werte von 2,5·10-5 /s bis 2·10-3 /s) (Bourne et al. 1991, Weiss et al. 1989, Simon et al. 1996, Wittinghofer et al. 1993). Durch diese Eigenschaften ist es sehr unwahrscheinlich, dass das Nukleotid unter physiologischen Bedingungen spontan vom Protein abdissoziiert oder dass GTP spontan hydrolysiert wird. Beide Vorgänge finden erst unter dem Einfluss von GAPs und GEFs statt und können auf diese Weise exakt reguliert werden. 5 Diskussion 117 5.1.1 Rop4 ist ein aktives Guaninnukleotid-bindendes Protein Das A. thaliana-Protein Rop4 wurde rekombinant in E. coli exprimiert und in aktiver Form gereinigt (4.1.2). Die ersten Hinweise auf aktives Rop4 waren der Befund, dass Rop4 als Monomer aus E. coli gereinigt werden konnte sowie die Tatsache, dass es dabei im 1:1Komplex mit GDP vorliegt (4.1.2). Das gebundene Nukleotid konnte gegen andere Guaninnukleotide (GTP, GppNHp, GppCp, mant-Nukleotide) ausgetauscht werden (4.1.3.1). Rop4 kann demzufolge drei Nukleotidzustände einnehmen: einen GTP-gebundenen, einen GDP-gebundenen, und es kann nukleotidfrei vorliegen. Diesen Ergebnissen zufolge erfüllt Rop4 alle Anforderungen an ein aktives Guaninnukleotid-bindendes Protein. 5.1.2 Rop4 bindet Guaninnukleotide mit hoher Affinität Die ersten Experimente dienten der Bestimmung der Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeit von mant-GDP und mant-GppNHp. Die Nukleotiddissoziation unterliegt einer deutlichen Temperaturabhängigkeit (4.1.3.2). Die Nukleotidbindungseigenschaften von Rop4 werden durch die Dissoziationskonstanten (KD) für fluoreszenzmarkiertes GDP (mant-GDP, mGDP) und das fluoreszenzmarkierte, nicht hydrolysierbare GTP-Analogon mGppNHp beschrieben. Um diese ermitteln zu können, wurden die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation (kon) und der Dissoziation (koff) der Nukleotide an Rop4 bestimmt (4.1.3.1, 4.1.3.2, 4.1.3.4). Die betreffenden KD-Werte von 2 nM (mGDP) bzw. 15 nM (mGppNHp) liegen im Bereich der anderer G-Proteine der RasSuperfamilie (Wittinghofer et al. 1993). Im Vergleich zu den Rho-Proteinen der Säuger, Rac1, Cdc42 und RhoA, bindet Rop4 die Nukleotide mit einer geringeren Affinität. Cdc42 bindet mGDP mit einem KD von 2 pM, mGppNHp mit einem KD von 230 pM (Rudolph 1998). Im Fall von Rac1 liegen die KD-Werte bei 28 pM (mGDP) bzw. 67 pM (mGTP). Die Affinität von RhoA zu mGDP entspricht einem KD von 6 pM (Häusler 2004). Die in allen G-Proteinen hochkonservierten fünf Peptidschleifen (G1-G5) ermöglichen diese hochaffine Bindung von Nukleotiden (Vetter und Wittinghofer 2001, Bourne et al. 1991). Die G1, G2 und G3-Regionen (auch P-Schleife, Schalterregionen (switch) I und II genannt) sind absolut essentiell für die Koordination des Magnesiumions und die Bindung der Phosphatgruppen. Sie sind damit im Wesentlichen verantwortlich für die hochaffine Bindung von Guaninnukleotiden. Die G4- und G5-Schleifen spielen bei der Erkennung der Guaninbase eine wichtige Rolle und sorgen für die Diskriminierung anderer Nukleotide (CTP, ATP, TTP) (Bourne et al. 1991, Dever et al. 1987, Paduch et al. 2001). 5 Diskussion 118 Die Dissoziation von mGppNHp von Rop4 erfolgte schneller als die von mGDP (4.1.3.1). Der Unterschied zwischen den Dissoziationsraten ergibt sich möglicherweise daraus, dass GppNHp wegen der Substitution des β,γ-Brückensauerstoffatoms (in GTP) gegen eine Iminogruppe eine geringere Polarität aufweist, weshalb die Bindung an GNBPs geschwächt sein könnte (Rudolph 1998). Eine unterschiedlich schnelle Dissoziation von [3H]GDP und [35S]GTPγS von Rac wurde ebenfalls beschrieben (Xu et al. 1997). 5.1.3 Die Nukleotidbindung durch Rop4 erfolgt magnesiumabhängig Für Rop4 konnte gezeigt werden, dass die Dissoziationsrate des Nukleotids durch MgCl2 im umgebenden Puffer von Rop4 verringert wird (4.1.3.3). Diese Abhängigkeit wurde bereits für andere G-Proteine beschrieben (Rudolph 1998). Das Magnesiumion ist für die Koordinierung und die elektrostatische Abschirmung der negativen Ladungen der β- und γ- Phosphate der Nukleotide notwendig und trägt auf diese Weise signifikant zur festen Nukleotidbindung der GNBPs bei (Vetter und Wittinghofer 2001). Im magnesiumfreien Zustand ist die Struktur des GNBPs verändert: Die Nukleotidbindungstasche ist aufgeweitet, wodurch die Dissoziation des Nukleotids beschleunigt wird (Shimizu et al. 2000). Die in dieser Arbeit ermittelten Dissoziationsgleichgewichtskonstanten für Mg2+ von 16 µM (mGppNHp) bzw. 150 µM (mGDP) liegen in einer Grössenordnung, die auch für Cdc42 und Ras ermittelt wurde (Hall und Self 1986, John et al. 1993, Leonard et al. 1994). Im Fall von Cdc42 betragen die Mg2+-Konstanten für mGDP-gebundenes Protein 3 µM und für mGppNHp 15,6 µM (Rudolph 1998). Unter physiologischen Bedingungen ist 2+ proteingebundenes Nukleotid deshalb mit Mg gesättigt. Die Magnesiumabhängigkeit der Nukleotidbindung zeigt, dass der zugrunde liegende Mechanismus bei Rop4 der gleiche zu sein scheint wie bei anderen G-Proteinen. 5.1.4 Die intrinsische Hydrolyse von GTP durch Rop4 ist relativ langsam Die intrinsische GTP-Hydrolyse durch Rop4 erfolgt mit einer Rate von 2,7 ± 0,2·10-4 /s (4.1.3.5). Die Aktivität von Rop4 und Rop6 wurde auch von A. Molendijk und Mitarbeitern in vergleichbarer Grösse beschrieben (Molendijk et al. 2001). Sie liegt im mittleren Bereich der für kleine G-Proteine gefundenen Hydrolyseraten von 2,5·10-5 /s bis 2·10-3 /s (Weiss et al. 1989, Simon et al. 1996). Für Rac1 wurden beispielsweise Hydrolyseraten von 3,3·10-4 /s 5 Diskussion 119 (Zhang et al. 2001) bis 5·10-4 /s publiziert (Zhang et al. 1998). Für Cdc42 wurden Raten von 2,1·10-3 /s (Rudolph 1998) bis 1,1·10-3 /s (Zhang et al. 1998) beschrieben. Die intrinsische Hydrolyserate von RhoA beträgt 2,6·10-4 /s (Zhang et al. 1998). Spontane Hydrolyse ohne den Einfluss regulatorischer Proteine ist somit auch bei Rop4 sehr unwahrscheinlich. Die ermittelten Hydrolyse- und Nukleotiddissoziationsraten zeigen die Notwendigkeit von GAPs und GEFs zur Regulation von Rop4 auf und weisen Rop4 als molekularen Schalter aus. 5.2 Der menschliche Austauschfaktor Tiam1 beschleunigt den Nukleotidaustausch an Rop4 Bei den ermittelten Nukleotidaffinitäten ist die spontane Nukleotiddissoziation von Rop4 ohne den Einfluss katalytisch wirkender Nukleotid-Austauschfaktoren sehr langsam (4.1.3.4). Da bislang noch keine Rop-spezifischen GEFs in Pflanzen beschrieben wurden, war lange Zeit unklar, ob Rops überhaupt durch GEFs reguliert werden können. Für andere pflanzliche kleine G-Proteine wie Arf wurden GEFs bereits im Genom von Arabidopsis thaliana identifiziert (Steinmann et al. 1999). In einem GEF-assay mit dem Rac-spezifischen, menschlichen GEF Tiam1 konnte gezeigt werden, dass die Nukleotiddissoziation von Rop4 durch Tiam1 beschleunigt werden kann (4.1.4.4). Dies ist ein Hinweis darauf, dass die pflanzlichen Rops −wie die verwandten RhoProteine der Säuger− durch GEFs reguliert werden. Diese sind anscheinend strukturell verschieden von den bekannten RhoGEFs des Dbl-Typs (Takai et al. 2001). In dem Bakterium Salmonella tryphimurium agiert das Protein SopE als GEF für Rac und Cdc42; es hat jedoch keine Homologie zu Dbl-Proteinen (Schlumberger et al. 2003, Buchwald et al. 2002, Hardt et al. 1998). So ist es vorstellbar, dass auch die pflanzlichen Rops durch GEFs aktiviert werden, die zu einem neuen Typ gehören und mit einem eigenen Mechanismus arbeiten. Auch die Tatsache, dass Rop direkt mit Rezeptorkinasen assoziiert ist, zeigt, dass die Aktivierung von Rop möglicherweise über andere Mechanismen gesteuert wird als die der tierischen Rho-Proteine (Trotochaud et al. 1999). 5 Diskussion 5.3 120 RopGAP2 steigert die Hydrolyseaktivität von Rop4 RopGAPs aus A. thaliana besitzen eine ungewöhnliche Primärstruktur mit einer N-terminalen CRIB- (Cdc42/Rac interactive binding) und einer C-terminalen GAP- (GTPase-aktivierendes Protein) Domäne (Borg et al. 1999, Wu et al. 2000). Die GAP-Aktivität führt zur beschleunigten Hydrolyse des Rop-gebundenen GTPs und damit zur Inaktivierung des Schalterproteins. Die CRIB-Domäne ist aus Effektoren von Rac und Cdc42 bekannt, wurde aber bislang nicht in RhoGAPs gefunden (Osada et al. 1997, Burbelo et al. 1995, Rudolph et al. 1998, Mott et al. 1999). Die Funktion der CRIB-Domäne in der Regulation der GAPAktivität von RopGAP2 bzw. der Rop-Aktivität ist daher noch nicht aufgeklärt und sollte in dieser Arbeit untersucht werden. 5.3.1 RopGAP2 ist ein aktiver Regulator von Rop4 Zur Analyse der RopGAP-Reaktion wurde RopGAP2 aus A. thaliana als GST-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Dabei war die Verwendung eines Konstruktes erfolgreich, bei dem die N-terminalen 70 Aminosäuren deletiert wurden. Außerdem wurde die von der CRIB-Domäne isolierte GAP-Domäne in E. coli exprimiert und gereinigt (4.2.2.1). Andere RopGAP2-Konstrukte waren nicht zu reinigen, da sie entweder unlöslich exprimierten oder Aggregate mit Abbauprodukten bildeten. Auch die gut löslichen Fragmente RopGAP2∆70 und RopGAP2∆132 unterlagen einer geringen Degradation: Die gereinigten RopGAP2∆70- und RopGAP2∆132-Proteine waren durch Proteine anderer Molekulargewichte verunreinigt. Durch Massenspektroskopie wurde festgestellt, dass es sich bei den zusätzlichen Proteinen im SDS-Gel nicht um Chaperone aus E. coli handelte, die zum Teil ähnliche Molekulargewichte haben, sondern um Abbauprodukte von RopGAP2. Durch diese wird die Konzentration des aktiven Proteins möglicherweise reduziert, dessen Anteil in der Probe nicht genau bestimmt werden konnte. Auswertungen von SDS-PAGEs mit RopGAP2 haben ergeben, dass bis zu 60 % des Proteins in Form des Abbauproduktes vorlagen. Ob diese in ihrer Aktivität eingeschränkt sind, ist nicht bekannt. Konstanten, die durch konzentrationsabhängige Experimente ermittelt wurden, können aus diesem Grund trotz Ausgleich fehlerbehaftet sein. Durch die Expression von RopGAP2 im Bakulovirus-System in Spodoptera frugiperdaZellen (Sf21) konnte eine Degradation durch zelluläre Proteasen unterbunden werden, und die Aggregation des RopGAP2-Proteins konnte stark reduziert werden (4.2.2.2). Durch das 5 Diskussion 121 entwickelte Expressions- und Reinigungsprotokoll kann stabiles RopGAP2-Protein für zukünftige biochemische und strukturelle Analysen synthetisiert werden. Das teilweise degradierte, in E. coli hergestellte RopGAP2∆70-Protein beschleunigte die GTP-Hydrolyseaktivität von Rop4 um das 10000-fache auf eine Hydrolyserate von 3 /s. Die Auswertung der Michaelis-Menten-Kinetik der GAP-stimulierten Hydrolysereaktion ergab einen KM-Wert von 275 µM. Der Quotient aus kcat und KM betrug 1,1·10-2 /s·µM und gilt als Maß für die Effizienz der Katalyse. Die kcat-Werte der GAP-stimulierten Hydrolyse von Ras, Ran und Rab liegen im Bereich zwischen 5 /s und 20 /s (Ahmadian et al. 1997a, Ahmadian et al. 1997b, Graham et al. 1999, Klebe et al. 1995, Albert et al. 1999). Die kcat-Werte der durch p50RhoGAP, p190, Bcr und 3BP-1 stimulierten GTP-Hydrolyse von Rac1 betrugen zwischen 0,4 /s und 1,2 /s (Zhang et al. 1998). Die Analyse der kinetischen Parameter der GAP-stimulierten GTP-Hydrolyse von Rop4 ergab einen KM-Wert von 275 µM. Dieser Wert ist relativ hoch im Vergleich zu den KM-Werten von 18,7 µM bis 49,3 µM für die durch p50RhoGAP, p190, Bcr und 3BP-1 stimulierte Hydrolyse von Rac1. Die Michaelis-Menten-Konstante KM von Rap1GAP zum Vergleich beträgt 50 µM (Daumke 2004). Der KM-Wert der Reaktion von H-Ras*GTP mit NF1 beträgt hingegen nur 0,23 µM (Ahmadian et al. 1997a). Die Quotienten aus kcat und KM liegen für die Rac1-GAPs zwischen 1,5·10-2 /s·µM und 4,3·10-2 /s·µM (Zhang et al. 1998). Die spezifische GAP-Aktivität von Rho-GAP beträgt 7,9·10-4 /s·nM (Leonard et al. 1998). Der ermittelte Wert für die Effizienz der RopGAP2-stimulierten Rop4*GTP-Hydrolyse liegt mit 1,1·10-2 /s·µM nahezu im Bereich der für Rac1-GAPs ermittelten Werte. Allerdings ist anzumerken, dass Rop4 nicht zwangsläufig das natürliche Substrat von RopGAP2 sein muss, da elf verschiedene Rops und neun unterschiedliche RopGAPs in A. thaliana vorkommen. 5.3.2 RopGAP2 hat zwei unterschiedliche GNBP-Bindestellen In Hefe-Zweihybridanalysen der Interaktion von RopGAP2 mit Rop4 konnte gezeigt werden, dass RopGAP2 zwei funktionelle Rop-Bindungsstellen besitzt. Sowohl die CRIB-Domäne als auch die GAP-Domäne interagierten mit Rop4 (4.2.3.1). Die Funktionalität der CRIBDomäne wurde im gleichen System durch die Interaktion mit menschlichem Rac und Cdc42 gezeigt. Die Affinitäten der CRIB- und der GAP-Domäne zu Rop4 sind wahrscheinlich sehr unterschiedlich. Durch Titration von Rop4*mGppNHp mit RopGAP2 ∆70 wurde die hohe 5 Diskussion 122 Affinität von RopGAP2∆70 zu Rop4*mGppNHp gezeigt (4.2.3.3). Der ermittelte KD beträgt 84 nM. Diese hochaffine Bindung von Rop im nanomolaren Bereich wird wahrscheinlich durch die CRIB-Domäne von RopGAP2 vermittelt. Die Fluoreszenztitration von Rop4*mGppNHp mit der isolierten GAP-Domäne von RopGAP2 (RopGAP2∆132) führte zu keiner Änderung des Fluoreszenzsignals. Dafür gibt es zwei mögliche Erklärungen: Entweder erfolgte im gewählten Konzentrationsbereich keine Bindung, oder die Bindung führte zu keiner Änderung des Fluoreszenzsignals. CRIB-Domänen gelten als hochaffine Bindungspartner von GNBPs (Burbelo et al. 1995, Bock et al. 2000). Für die Interaktion unterschiedlich grosser CRIB-Motiv-enthaltender Fragmente von WASP mit Cdc42 wurden KDWerte zwischen 77 und 490 nM ermittelt (Rudolph et al. 1998). Die Interaktion von Rac1, Rac2 und Rac3 mit der GBD von α-PAK erfolgt mit KD-Werten zwischen 1 µM und 2,4 µM (Blumenstein 2004). Da die isolierte CRIB-Domäne von RopGAP2 instabil und unlöslich ist, konnte die Bindung von Rop an die CRIB-Domäne in vitro nicht gezeigt und analysiert werden. Die Stimulation der GTP-Hydrolyse durch RopGAP2∆70 erfolgte mit einem KM-Wert von 275 µM, der auf eine Affinität im mikromolaren Bereich schließen lässt (4.2.3.4). Der ermittelte, relativ hohe KM-Wert von RopGAP2∆70 ist wahrscheinlich der niedrigen Affinität der GAP-Domäne zu Rop4 zuzuschreiben. Die KD-Werte anderer GAPs liegen im mikromolaren Bereich und unterscheiden sich demnach stark von denen der CRIB-Proteine. So liegt der KD-Wert der Interaktion zwischen Ras und p120RasGAP bei 4,8 µM (Gideon et al. 1992). p50RhoGAP bindet Rac1*GppNHp mit einer Affinität von 26,4 µM, Bcr mit einer Affinität von 10,5 µM, 3BP-1 mit 27,7 µM und p190 mit einem KD-Wert von 40,5 µM (Zhang et al. 1998). Bis ca. 10-fach kleinere Werte wurden für Cdc42 und RhoA gefunden (Zhang et al. 1997, Zhang und Zheng 1998, Leonard et al. 1998). Der KM-Wert der von der CRIB-Domäne isolierten GAP-Domäne konnte nicht ermittelt werden, da die benötigten Rop4-Konzentrationen dazu sehr hoch sind und nicht erreicht werden konnten. 5.3.3 CRIB- und GAP-Domänen binden an dieselben Regionen des GNBPs Das Vorhandensein zweier unabhängiger GNBP-Bindungsstellen in einem Molekül wirft die Frage auf, ob beide Domänen von RopGAP2 an ein einziges Rop-Molekül binden oder ob zwei Rop-Moleküle von RopGAP2 gebunden werden: Eins durch die CRIB-Domäne und eins durch die GAP-Domäne. Anders ausgedrückt ist die Frage zu klären, ob das an die CRIBDomäne bindende Rop gleichzeitig Substrat der GAP-Domäne ist oder ob ein weiteres RopMolekül an die GAP-Domäne bindet. 5 Diskussion 123 Es ist bekannt, dass die CRIB-Motive von Rho-Effektoren die Spezifität der G-Protein-Bindung vermitteln, und dies wurde auch für die CRIB-Domäne von RopGAP2 in dieser Arbeit bestätigt (4.2.3.2) (Leonard et al. 1997). Entsprechend wäre es denkbar, wenn die CRIBDomäne von RopGAP2 die spezifische Rop-Bindung herbeiführen und das gleiche Rop-Protein dann in einem negativen Rückkopplungszyklus durch die GAP-Domäne von RopGAP2 inaktiviert würde. CRIB-Proteine haben eine sehr hohe Affinität zu GNBPs, während die Affinität der GAPs zu G-Proteinen eher gering ist (Brinkmann 2000, Blumenstein 2004, Rudolph et al. 1998). Somit könnte die CRIB-Domäne in RopGAP2 die Affinität des Proteins zu Rop-Proteinen steigern und die Inaktivierung damit wirksamer gestalten. Auf der anderen Seite können GNBPs an Interaktionspartner binden ohne gleichzeitig Substrat dieser Proteine zu sein. Die GNBP-Bindung hat in solchen Fällen regulatorischen Charakter. In einigen Forminen der Tiere und Pilze (z.B. Dia) wird beispielsweise durch die Bindung von Rho an die GNBP-Bindedomäne (GBD) die intramolekulare Interaktion zwischen der GBD- und der DAD- (Diaphanous autoregularory domain) Domäne aufgehoben und eine Konformationsänderung im Protein induziert, wodurch das Protein in den aktiven Zustand überführt wird (Deeks et al. 2002). Die GBD von Dia dient ausschließlich regulatorischen Zwecken, und Rho ist kein Substrat von Dia. Auch Rac und Cdc42 regulieren die Aktivität ihrer CRIB-Effektoren PAKs (p21-aktivierte Kinasen) ohne gleichzeitig Substrate dieser Proteine zu sein (Chong et al. 2001). Die bekannten CRIB-Effektoren der Säuger wie WASP, PAKs und ACK treten mit den zellulären RhoGAPs in Konkurrenz und inhibieren dadurch die Aktivität der GAPs, die der Signalweiterleitung durch das GNBP entgegenwirken (Zhang et al. 1997). Für die gleichzeitige Bindung von zwei Rop-Molekülen durch RopGAP2 und damit gegen die Bindung von einem Rop-Molekül durch beide Domänen von RopGAP spricht ebenfalls, dass sowohl CRIB-Motive bekannter Rho-Effektoren als auch GAPs an dieselben Stellen von GProteinen binden. Die Strukturen der G-Protein-bindenden Domänen von ACK (activated Cdc42-associated tyrosine kinase), PAK, WASP und Par6 im Komplex mit Cdc42 zeigen, dass das CRIB-Motiv ein intermolekulares β-Faltblatt mit der Faltblattstruktur B2 von Cdc42 bildet. Außerdem erfolgt die Bindung der Effektoren an das GNBP über Interaktionen mit den Schalterregionen I und II sowie den Helices A1 und A5 (Mott et al. 1999, Abdul-Manan et al. 1999, Garrard et al. 2003, Morreale et al. 2000, Hakoshima et al. 2003). Die GAP-Domäne von Cdc42GAP bindet an die Schalterregionen I und II und an die P-Schleife von Cdc42, also an die gleichen Regionen, die auch von Cdc42-Effektoren gebunden werden (Leonard et al. 1998, Rittinger et al. 1997, Mott et al. 1999, Abdul-Manan et al. 1999, Bishop und Hall 2000). Ebenso interagiert die GAP-Domäne von p190RhoGAP mit den Schalterregionen I und II und der P-Schleife von Rho (Moon und Zheng 2003). Die vorausgesagte Struktur von 5 Diskussion 124 RopGAP2 ähnelt den RhoGAPs der Säuger sehr (4.2.1). Unter der Voraussetzung, dass die CRIB-Domäne in bekannter Weise an Rop bindet, ist es aus sterischen Gründen nicht möglich, dass beide Domänen von RopGAP2 an ein einziges Rop-Molekül binden, da die Bindestellen für CRIB- und GAP-Domänen überlappen (Abbildung 5.1). Abbildung 5.1: Überlagerung der Kristallstrukturen der Komplexe Cdc42*GppNHp-p50RhoGAP und Cdc42*GppNHp-WASP-GBD. Das Modell zeigt, dass sowohl das GBD-Fragment von WASP als auch p50RhoGAP an die Schalterregionen I und II von Cdc42 binden. Die Bindestellen an Cdc42 überlappen. Eine gleichzeitige Bindung von CRIB- und GAP-Domäne ist daher unmöglich (Rittinger et al. 1997, Abdul-Manan et al. 1999). Rot: Cdc42; blau: Humanes p50RhoGAP (Aminosäuren 198-439); grün/gelb: WASP-GBD (Aminosäuren 230-288); gelb: CRIB-Region des WASP-Fragmentes. Der Arginin-Finger von p50RhoGAP (Argininrest 85 des Fragmentes) ist als Kugel-und-Stab-Modell hervorgehoben. GppNHp und Mg2+ sind an Cdc42 gebunden. sw I, sw II: Schalterregionen I und II von Cdc42. In dieser Arbeit sollte die Stöchiometrie der Rop-RopGAP-Bindung untersucht werden. Allerdings werden dafür wegen der niedrigen Affinität der GAP-Domäne zu Rop4 millimolare Konzentrationen der Proteinlösungen benötigt. Mittels Gelfiltration konnte die Stöchiometrieanalyse wegen des starken Aggregationsverhaltens nicht durchgeführt werden. Durch in vitro-Interaktionsanalysen (pull down) mit GST-RopGAP2∆70 kann eine Stöchiometrie der Rop4*GppHNp-Bindung nicht eindeutig geklärt werden, da ein verstärktes HisRop4-Signal keinen Rückschluss auf die Ursache zulässt. 5 Diskussion 125 5.3.4 Die CRIB-Domäne ist für die Aktivität von RopGAP erforderlich Das Auftreten einer CRIB- und einer GAP-Domäne in einem Molekül ist bislang einzig in Pflanzen beschrieben worden und wird deshalb als ein völlig neuartiger Regulationsmechanismus diskutiert. Welche Funktion die CRIB-Domäne der pflanzlichen RopGAPs in der Kontrolle der Regulation von Rop ausübt, ist noch weitgehend ungeklärt. In vivo-Studien zeigten, dass das CRIB-Motiv von RopGAP1 für die Lokalisation des Proteins an der apikalen Region von Pollenschläuchen und für die Funktion von RopGAP1 als Negativregulator im Rop1-Signalweg nötig ist (Yang 2002). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die von der CRIB-Domäne isolierte GAP-Domäne von RopGAP2 die GTP-Hydrolyse durch Rop4 nur geringfügig beschleunigt (4.2.3.4). Demnach ist das Vorhandensein der CRIB-Domäne unbedingt erforderlich für die volle Funktionalität von RopGAP2. Eine vergleichbare Beobachtung wurde auch schon im Fall von RopGAP1 gemacht. Wu et al. (2000) zeigten, dass die isolierte GAP-Domäne von RopGAP1 die Hydrolyseaktivität von Rop1 nur wenig im Vergleich zum Volllängenprotein RopGAP1 beschleunigt (Wu et al. 2000). Isolierte GAP-Domänen anderer GAPs hingegen zeigten volle Aktivität (Krämer 2001, Ahmadian et al. 1997, Krall et al. 2002, Muller et al. 1997). 5.3.5 Die Bindung von RopGAP an Rop erfolgt nukleotidabhängig In Hefe-Zweihybridanalysen mit Rop4 wt und konstitutiv aktivem Rop4 konnte zunächst die spezifische Bindung von Rop*GTP gegenüber Rop*GDP durch die CRIB-Domäne demonstriert werden (4.2.3.1, 4.2.3.2). Diese Eigenschaft ist charakteristisch für Effektoren von GNBPs (Hakoshima et al. 2003, Bishop und Hall 2000, Cotteret und Chernoff 2002). Die spezifische Bindung von aktiviertem Rop durch die GAP-Domäne wurde ebenfalls durch Hefe-Zweihybridstudien gezeigt (4.2.3.1, 4.2.3.2). Durch in vitro-Analysen mit RopGAP2∆70 wurde die nukleotidabhängige Bindung bestätigt (4.2.3.3). Die Erkenntnis, dass die Bindung der CRIB-Domäne von RopGAP2 an Rop4 nukleotidabhängig erfolgt, steht im Kontrast zu ersten Untersuchungen von RopGAPs durch Wu et al. (2000). In Experimenten mit RopGAP1 und Rop1 wurde gezeigt, dass die CRIB-Domäne von RopGAP1 sowohl mit der GTP- als auch mit der GDP-gebundenen Form von Rop1 interagiert. Weiterhin wurde demonstriert, dass die CRIB-Domäne an den Übergangszustand von Rop1 (Rop1*GDP-AlF4) bindet (Wu et al. 2000). Strukturen der menschlichen CRIB-Proteine WASP, PAK1, Arfaptin und ACK im Komplex mit Cdc42 wurden in der GppNHp-Form gelöst (Mott et al. 1999, Abdul-Manan et 5 Diskussion 126 al. 1999, Garrard et al. 2003, Morreale et al. 2000, Tarricone et al. 2001, Hakoshima et al. 2003). Die Interaktion dieser Effektoren von Cdc42 erfolgt GTP-abhängig. 5.3.6 Die CRIB-Domäne vermittelt die Rop-Spezifität von RopGAP Um die ungewöhnliche Domänenstruktur der RopGAPs weiter zu verstehen, wurden die Interaktionsspezifitäten der CRIB- und der GAP-Domäne von RopGAP2 gegenüber unterschiedlichen Rops im Hefe-Zweihybridsystem bestimmt. In A. thaliana werden elf unterschiedliche Rops und sechs RopGAPs mit CRIB-Domänen exprimiert. Es wurde gezeigt, dass einzelne Rops bestimmte Signalwege regulieren. Die Expressionsmuster der Rops unterscheiden sich zwar in gewissen Geweben, die meisten Rops werden jedoch in vielen unterschiedlichen Geweben exprimiert und treten daher parallel in der Zelle auf. Nur Rop1 wird ausschließlich in reproduktiven Geweben exprimiert (Li et al. 1998). Die gewebespezifische Expression der RopGAPs ist noch nicht untersucht bzw. dokumentiert worden. Beim Vergleich der Interaktionen verschiedener Rops der Gruppe IV (Rop1 bis Rop6) mit den einzelnen Domänen von RopGAP2 fiel auf, dass beide Domänen zwischen den verschiedenen Rops differenzieren und unterschiedlich stark mit diesen interagieren (Abbildung 5.2, 4.2.3.2). Abbildung 5.2: Schematische Darstellung der Domänenstruktur von RopGAP2 und der interagierenden Rop-Proteine. Die Stärke der Interaktion zwischen den Rops und den Domänen von RopGAP2 wird durch die Grösse der Rops hervorgehoben. Die Unterschiede bei der CRIB-Domäne von RopGAP2 zwischen den einzelnen Rops fallen stärker aus als bei der GAP-Domäne. Die stärkste Bindung der CRIB-Domäne erfolgte an Rop2. Möglicherweise ist Rop2 der natürliche Regulator von RopGAP2. Die GAP-Domäne interagiert besonders mit Rop2, Rop4, Rop5 und Rop6. 5 Diskussion 127 Auf welche Weise Rops sich gegenseitig beeinflussen und wie die von ihnen gesteuerten Signalwege miteinander verschaltet sind oder voneinander getrennt werden, ist noch weitgehend unbekannt. Eine Möglichkeit, die Aktivitäten unterschiedlicher Rops miteinander zu verknüpfen und ihre Signalwege auf diese Weise miteinander zu verschalten, könnte die spezifische Interaktion der Rops mit RopGAPs darstellen. Unter der Annahme, dass jede Domäne von RopGAP2 je ein Rop-Molekül bindet, könnte auf diese Weise bei Aktivierung eines bestimmten Rops in der Zelle, das an die CRIB-Domäne von RopGAP bindet, die Aktivität eines anderen Rops durch die GAP-Aktivität von RopGAP abgeschaltet werden. So könnte durch die Bindung von beispielsweise Rop2 an die CRIB-Domäne von RopGAP2 die GAP-Domäne aktiviert werden und die Hydrolyseaktivität von Rop2, Rop5 oder Rop6 beschleunigen. Abbildung 5.3 zeigt ein Modell des Mechanismus, bei dem die Aktivität der GAP-Domäne durch die CRIB-Domäne gesteuert wird. Ein solcher Mechanismus würde eine äußerst differenzierte Regulation und Verschaltung der Rop-Signalwege erlauben. Abbildung 5.3: Modell der Regulation von RopGAP durch die CRIB-Domäne. RopGAP liegt im inaktiven Zustand vor, solange das aktivierende Rop (hellgrün) nicht mit GTP beladen ist. Wird dieses Rop mit GTP beladen, bindet es an die CRIB-Domäne von RopGAP und induziert dadurch die GAP-Aktivität des Proteins. RopGAP ist dann in der Lage, das Ziel-Rop (dunkelgrün) zu inaktivieren. Auf diese Weise wäre es möglich, unterschiedliche Rop-Signalwege miteinander zu verschalten. 5 Diskussion 5.4 128 RICs sind spezifische Interaktionspartner von Rops Die Funktionen der Rop-interactive CRIB motif-containing proteins (RICs) sind noch weitgehend unverstanden. Außerhalb des CRIB-Motivs enthalten sie keine weiteren bekannten Motive oder Domänen. Einige von ihnen werden als Mittlerproteine in der Regulation von Aktindynamiken vermutet (Wu et al. 2001, Keenan et al. 2001). In anderen Organismen kommen keine Proteine mit homologen Sequenzen außer dem CRIB-Motiv vor. Wahrscheinlich wirken die RICs als Adaptoren, die durch GTP-beladenes Rop aktiviert werden und dann weitere Proteine des Rop-Signalweges rekrutieren (Wu et al. 2001). Diese Proteine können als die eigentlichen Effektoren verstanden werden, da erst sie physiologische Effekte bewirken. Die cDNAs von RIC1, RIC2, RIC3, RIC4, RIC5, RIC6 und RIC9 wurden kloniert und hinsichtlich ihrer Spezifität gegenüber Rop-Proteinen aus A. thaliana untersucht. Außerdem wurden in vitro-Analysen einzelner RIC-Rop-Interaktionen durchgeführt. 5.4.1 Alternatives Spleißen der RIC-Gene? Die meisten der sieben klonierten Sequenzen von RIC1, RIC2, RIC3, RIC4, RIC5, RIC6 und RIC9 weichen in Teilen von den publizierten Sequenzen ab (4.3.1). Die Unterschiede zwischen den Sequenzen und weiteren homologen ESTs treten an zum Teil identischen Stellen, blockweise auf bzw. enden dort. Möglicherweise handelt es sich bei den betreffenden Proteinen um unterschiedliche Spleißvarianten. Die meisten eukaryotischen Gene enthalten Introns, die aus der prä-mRNA herausgespleißt werden müssen, um funktionelle mRNA zu erhalten. In Arabidopsis enthalten 79 % aller nukleären Gene Introns (The Arabidopsis Genome Initiative 2000). Spleißen ist demzufolge in Pflanzen wie in anderen Eukaryoten ein wichtiges Instrument zur Regulation der Genexpression. Es ist bekannt, dass pflanzliche Gene typischerweise weniger und kürzere Introns aufweisen als tierische. Der generelle Spleißmechanismus und die Intron-ExonStruktur sind aber vergleichbar. Durch alternatives Spleißen kann die Aktivität von Proteinen, die Lokalisierung innerhalb der Zelle oder die RNA-Stabilität und die Effizienz der Translation beeinflusst werden (Smith et al. 1989, Iida et al. 2004, Eckardt 2002). 5 Diskussion 129 5.4.2 Rop4 interagiert mit RIC6 und RIC9 Die sieben in dieser Arbeit analysierten, potentiellen Rop-Effektorproteine RICs wurden in bakterielle Expressionsvektoren kloniert und die Expression der GST-Fusionsproteine in E. coli getestet (4.3.2.3). Die RICs sind zum Grossteil sehr instabil und vermutlich unstrukturiert. Bei der Expression in E. coli kommt es zu massivem Abbau der Proteine und zur Ablagerung in unlöslichen Einschlüssen. Aus diesem Grund war eine Untersuchung der Proteine in vitro nur eingeschränkt möglich und wurde nur für RIC6 und RIC9 durchgeführt. RIC6 und RIC9 wurden als GST-Fusionsproteine in E. coli exprimiert und aufgereinigt (4.3.2.3). Die CRIB-Domänen von ACK und WASP wurden ebenfalls als unstrukturiert beschrieben. Erst die Bindung an Cdc42 induziert die Ausbildung einer stabilen Faltung der CRIB-Domäne (Mott et al. 1999, Abdul-Manan et al. 1999). Vor diesem Hintergrund scheint es für die Zukunft sinnvoll, RICs gemeinsam mit Rops zu co-exprimieren, um funktionelle Proteine zu erhalten. Zur Verbesserung der Expression könnte auch die Verwendung anderer Spleissvarianten herangezogen werden. Durch in vitro-Interaktionsanalysen konnte die Interaktion von RIC6 und RIC9 mit Rop4*GppNHp nachgewiesen werden (4.3.2.3). Sie erfolgte spezifisch mit der aktivierten Form des Rop-Proteins (Rop4*GppNHp), nicht aber mit der deaktivierten Form (Rop4*GDP), wie es von Effektoren von GNBPs bekannt ist (Bishop und Hall 2000, Zhang et al. 1998, Owen et al. 2000). RICs sind somit bona fide-Effektoren, die so definiert sind, dass sie mit der GTP- aber nicht mit der GDP-gebundenen Form der GNBPs interagieren. 5.4.3 Die Interaktion von Rops mit RICs erfolgt teilweise hochspezifisch Die Funktionalität des CRIB-Motivs der RICs wurde durch die Interaktion mit humanem Rac, Cdc42 und den Rops aus Arabidopsis thaliana gezeigt (4.3.2.2). Die Interaktion von Rop4 mit RIC6 und RIC9 konnte durch in vitro-Experimente mit gereinigten Proteinen bestätigt werden (4.3.2.3). Sie erfolgt wiederum spezifisch mit der aktivierten (GppNHp-beladenen) Form des GNBPs. Den elf Rop-Genen in Arabidopsis thaliana stehen elf RIC-Gene gegenüber. Von diesen werden RIC1, RIC2, RIC4 und RIC9 ubiquitär exprimiert, RIC6, RIC3 und RIC5 werden spezifisch in Pollen exprimiert (Wu et al. 2001). Auch die meisten Rops werden ubiquitär exprimiert (Li et al. 1998). Rop-Proteine sind in eine Vielzahl unterschiedlicher Prozesse 5 Diskussion involviert. 130 Einzelne Rops steuern unterschiedliche Signalwege und regulieren unterschiedliche Funktionen der Pflanzenzelle. Die Signalwege müssen entsprechend funktionell voneinander getrennt werden. Es stellt sich demzufolge die Frage, welches RIC mit welchem Rop in der Zelle interagiert. Anscheinend treten mehrere RICs und Rops parallel auf. Spezifitäten der Proteine bestimmen demzufolge die Interaktionen. Zur Aufklärung der Spezifität der RIC-Rop-Interaktion wurden Analysen im HefeZweihybridsystem durchgeführt (4.3.2.2). Rops sind auf Grund ihrer hohen Sequenzübereinstimmung höchstwahrscheinlich strukturell sehr ähnlich; im Fall der RICs ist dies jedoch völlig unklar. Das Hefe-Zweihybridsystem erlaubt deshalb nur Vergleiche der Interaktion von einem ausgewählten RIC mit unterschiedlichen Rops, jedoch nicht den Vergleich der Interaktion eines einzelnen Rops mit verschiedenen RICs. Der Grund dafür liegt darin, dass die Reportergenaktivität in einzelnen Fällen abhängig von der Struktur der zu testenden Interaktionspartner und vom verwendeten System sein kann. Die Strukturen der RICs sind auf Grund ihrer variablen Aminosäuresequenzen vermutlich sehr unterschiedlich. Da die Ähnlichkeit der Rops untereinander sehr gross ist und sie vermutlich alle die Faltung einer G-Domäne besitzen, sind Unterschiede bei der Interaktion eines einzelnen RICs mit verschiedenen Rops systemunabhängig und einzig auf die Unterschiede zwischen den Rops zurückzuführen. Die Spezifitätsanalysen zeigten, dass einige RICs hochspezifische Interaktionspartner einzelner Rops sind, andere hingegen eine geringe Spezifität für ein bestimmtes Rop aufweisen und nahezu mit jedem Rop-Protein interagieren (Abbildung 5.4). Abbildung 5.4: Spezifität der Rop-RIC-Interaktion. Einige RICs sind hochspezifische Interaktionspartner einzelner Rops, andere weisen hingegen eine geringe Spezifität gegenüber Rops auf und interagieren mit nahezu jedem Rop-Protein. 5.4.4 Das Auftreten spezifischer RIC-Rop-Interaktionen korreliert mit der Gruppenaufteilung der RICs Die RICs werden auf Grund ihrer Sequenzübereinstimmung in fünf Gruppen unterteilt (Wu et al. 2001). Die Spezifitätsanalysen der Interaktion mit Rops spiegeln sich in der 5 Diskussion 131 Gruppenaufteilung der RICs wieder. RIC6 und RIC9 zeigten die geringste Spezifität gegenüber Rops. RIC9 unterscheidet sich von allen anderen getesteten RICs durch sein MKMKGI/LYKG/SFK-Motiv. Dieses Motiv kommt nur in den Sequenzen von RIC9, RIC10 und RIC11 der Gruppe I vor. Die Funktion dieses Motivs ist unbekannt. Homologe Motive kommen in anderen Proteinen nicht vor. Die RICs dieser Gruppe besitzen zudem die kleinsten Molekulargewichte unter den RICs. RIC9 wird ubiquitär exprimiert und ist als einziges RIC an der gesamten Plasmamembran von Pollenschläuchen lokalisiert. Es wird nicht gemeinsam mit Rop1 in einem Signalweg vermutet (Wu et al. 2001). RIC6 gehört zusammen mit RIC7 und RIC8, die ebenfalls hier nicht untersucht wurden, zur Gruppe II. Diese Gruppe ist am stärksten konserviert unter den fünf Gruppen von RICs. RIC6 wird nicht ubiquitär exprimiert, sondern ausschließlich in Blüten. RIC6 und RIC9 vermitteln vermutlich Funktionen, die nicht Rop-spezifisch sind, da fast alle Rops gleichzeitig mit RIC6 und RIC9 exprimiert werden. Allerdings könnte eine Trennung von Rop-Signalwegen auch durch die unterschiedliche subzelluläre Lokalisation der Proteine erfolgen. Eine Sonderstellung nimmt RIC2 ein. Es interagiert mit keinem Rop im HefeZweihybridsystem. RIC2 unterscheidet sich von allen anderen RICs durch sein C-terminal gelegenes CRIB-Motiv. Außerdem fehlt RIC2 die PSWMXDFK-Box, die in allen anderen RICs vorkommt. Es besitzt vermutlich eine andere Struktur als die anderen RICs. RIC2 wird ubiquitär exprimiert und interagiert gemäß anderer Studien in vitro mit Rop1 (Wu et al. 2001). Möglicherweise liegt der Grund dafür, dass es im Hefe-Zweihybridsystem keine Interaktionen gezeigt hat, in seiner außergewöhnlichen Struktur, die wegen der Fusion mit LexA eine Interaktion mit VP16-fusioniertem Rop verhindert haben könnte, da die GBD möglicherweise nicht zugängig war. RIC1 und RIC3 wurden als Mitglieder der Gruppe III beschrieben. Das hier verwendete RIC4 ist RIC3 sehr ähnlich und wird deshalb auch zur Gruppe III gezählt. RIC4 gehört nach Wu et al. (2001) mit RIC2 zur Gruppe V, die publizierte Sequenz weicht jedoch deutlich von der klonierten Sequenz ab (A. Berken, persönliche Mitteilung). RIC1 hat sich als hochspezifischer Interaktionspartner von Rop4 erwiesen. RIC1 und Rop4 werden ubiquitär exprimiert. RIC3 und RIC4 interagierten mit Rop2 und Rop4. Diese beiden Rops werden ebenfalls in allen Geweben exprimiert (Li et al. 1998). RIC3 jedoch nur in Blüten (Wu et al. 2001). Die Expression von RIC4 wurde als ubiquitär beschrieben (Wu et al. 2001). Da hier jedoch vermutlich eine andere Spleißvariante untersucht wurde, ist die Expression dieses Proteins nicht zwangsläufig mit dem publizierten Ergebnis übereinstimmend. 5 Diskussion 132 RIC5 bildet eine eigene Gruppe V. Es wird schwach in Blüten exprimiert (Wu et al. 2001). Im Hefe-Zweihybridsystem zeigte es Interaktionen mit Rop2, Rop4, Rop5 und Rop6, die in vielen unterschiedlichen Geweben exprimiert werden (Li et al. 1998). RIC3 und RIC4 induzieren den gleichen Phänotyp bei Überexpression in Pollen wie Rop1, und ihre Lokalisation wird durch die gleichzeitige Expression von Rop1 verändert (Kieffer et al. 1997). Aus diesen Gründen wurde vorgeschlagen, dass diese RICs in den Signalwegen von Rop1 fungieren und die Aktinpolymerisierung und den Aufbau eines Kalziumgradienten während des Pollenschlauchwachstums regulieren (Wu et al. 2001). Ebenfalls wurde postuliert, das RIC4 und RIC1 im Signalweg von Rop2 wirken, wobei RIC4 zur Aktinpolymerisierung führt und RIC1 die Mikrotubuliorganisation inhibiert (nicht publiziert). Dies ist im Einklang mit den in dieser Arbeit gefundenen Interaktionen. Diese Daten zeigen, dass die Interaktion der RICs mit einzelnen Rops hochspezifisch erfolgt und dass einzelne RICs dadurch unterschiedliche Funktionen in der Pflanze ausüben können. Demnach ist es gut vorstellbar, dass RICs die Aktivität der Rops kanalisieren und einzelne Signalkaskaden aktivieren. Abbildung 5.5 zeigt ein Modell, das die bisherigen Erkenntnisse über die RICs zusammenfasst. Abbildung 5.5: Modell zur Funktion der Rop-interactive CRIB motif-containing proteins. RICs binden an die aktivierte Form der Rop-Proteine und rekrutieren als Adapterproteine Effektoren. Welche Motive in der Aminosäuresequenz der RICs die Spezifität Rops gegenüber verursachen, ist nicht klar, da die Sequenzen in vielen verschiedenen Bereichen unterschiedlich sind und diese Unterschiede nicht an einzelnen Aminosäuresubstitutionen festgemacht werden können. Vermutlich sind jedoch diejenigen Bereiche ausschlaggebend, die sich N- und C-terminal des hoch konservierten CRIB-Motives befinden. Die NMR-Strukturen von Fragmenten der humanen Effektoren WASP (Wiskott-Aldrich syndrome proteine), PAK (p21-activated kinase) und ACK (activated Cdc42-associated tyrosine kinase), die das CRIB-Motiv enthalten und im Komplex mit Cdc42 vorliegen, 5 Diskussion 133 zeigen, auf welche Weise die Bindung an das GNBP erfolgt (Mott et al. 1999, Abdul-Manan et al. 1999, Morreale et al. 2000). Die Fragmente bestehen aus dem CRIB-Motiv in einer ausgestreckten Konformation und C- und N-terminal angrenzenden Bereichen. Die Aminosäuren des CRIB-Motives kontaktieren das Faltblatt B2 und die Helices A1 und A5. Auf diese Weise entsteht ein intermolekulares β-Faltblatt. Im Fall von WASP und PAK enthält das Fragment C-terminal des CRIB-Motivs gelegen einen doppelsträngigen, antiparallelen βhairpin und eine kurze α-Helix. Auch diese Bereiche sind an der Interaktion mit dem GNBP beteiligt. Der β-hairpin und die C-terminale α-Helix binden an die Schalterregionen I und II von Cdc42 (Abdul-Manan et al. 1999, Morreale et al. 2000). Auch das ACK-Fragment interagiert über ein β-hairpin mit den Schalterregionen I und II (Mott et al. 1999). Die Interaktion der CRIB-Motiv-enthaltenden Fragmente mit Cdc42 erfolgt mit einem Asparaginsäurerest aus der Schalterregion I über zwei Histidinreste, die in allen CRIB-Proteinen konserviert sind. Rho weist anstelle des Asparaginsäurerestes an der gleichen Position ein Glutaminsäurerest auf (Mott et al. 1999, Abdul-Manan et al. 1999, Bishop und Hall 2000). Tierische CRIBProteine nutzen diesen Unterschied wahrscheinlich, um zwischen Rac/Cdc42 und Rho zu unterscheiden (Leonard et al. 1997). Der Mechanismus, mit dem die Spezifität für Rac oder Cdc42 bestimmt wird, ist jedoch noch unklar. Möglicherweise beruht er auf der Interaktion bestimmter Effektoren mit der Helix A5 des GNBPs (Morreale et al. 2000). Sowohl der betreffende Asparaginsäurerest des GNBPs als auch die zwei Histidinreste der Effektoren sind in Rops bzw. RICs streng konserviert. N-terminal des CRIB-Motives sind die Sequenzen der RICs sehr variabel. Dort weicht RIC2 am deutlichsten von allen anderen RICs ab, da ihm die N-terminal anschließenden Aminosäuren fehlen. 5.5 Die Rolle von Rop4 als Regulator des Aktinzytoskelettes Es ist bekannt, dass die Rho-Proteine der Säuger wesentlich an der Organisation des Aktinzytoskeletts beteiligt sind (Moorman et al. 1996, Ridley und Hall 1992, Ridley et al. 1992, Nobes und Hall 1995, Kozma et al. 1995). Die Signalkaskaden, die zur Aktinpolymerisierung in tierischen Zellen führen und die aktinabhängigen Prozesse in der Zelle regeln, sind bereits recht gut untersucht. Viele Anzeichen sprechen dafür, dass die Organisation des Aktinzytoskeletts in der pflanzlichen Zelle zum Teil durch andersartige Mechanismen reguliert wird als in Säugerzellen. Homologe der Proteine des Arp2/3-Komplexes, des WAVE-Komplexes und Formine sind in Pflanzen identifiziert worden, Homologe der bekannten Regulatoren des Aktinzytoskeletts wie PAK, WASP und ROK fehlen hingegen in Pflanzen (Deeks et al. 2004, Li et al. 2003, Deeks et al. 2002). 5 Diskussion 134 5.5.1 Rop4 induziert Morphologieänderungen in Säugerzellen Um die Funktion von Rop4 in der Regulation aktinabhängiger Prozesse vergleichend mit den Rho-Proteinen der Säuger zu untersuchen, wurden humanes RhoA, Cdc42, Rac1 und Rop4 aus Arabidopsis thaliana in NIH3T3-Fibroblasten der Maus und in menschlichen HeLaZellen exprimiert (4.1.4.2). Die Auswirkungen der Expression auf das Aktinzytoskelett sowie die subzelluläre Lokalisation der Proteine wurden anschließend durch konfokale Mikroskopie analysiert. Bei der Expression der Rho-Proteine in Säugerzellen im Rahmen dieser Arbeit wurde beobachtet, dass die Aktivierung von Rho die Bildung von Stressfasern induziert, Rac die Formierung von Lamellipodien und membrane ruffles bewirkt und Cdc42 zur Ausbildung von Filopodien führt (4.1.4.2). Dies ist übereinstimmend mit den publizierten Angaben zur Funktion dieser Rho-Proteine (Moorman et al. 1996, Ridley und Hall 1992, Ridley et al. 1992, Nobes und Hall 1995, Kozma et al. 1995). Die Expression von Rop4 induziert wie Rac1 die Bildung von Lamellipodien und membrane ruffles. Die Stressfasern der Zellen sind reduziert. Damit ruft Rop4 den gleichen Phänotyp wie Rac1 bei den Zellen hervor (4.1.4.2). Dies wurde sowohl in NIH3T3-Zellen beobachtet als auch in HeLa-Zellen. Die Expression in zwei verschiedenen Zelltypen dient dazu, zelltypspezifische Effekte ausschließen zu können. Auch andere Funktionen von Rops wurden bereits im Säugerzellsystem oder in anderen Organismen als Pflanzen erforscht: Die Aktivierung der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies durch das aus Mais (Oryza sativa) stammende Rop-Protein Rac2 wurde in NIH3T3-Zellen untersucht (Hassanain et al. 2000). Die Funktion von AtRop1 beim polaren Zellwachstum wurde in der Spalthefe Schizzosaccharomyces pombe analysiert (Li et al. 1998). Rop4 befindet sich an der Plasmamembran der Säugerzellen und tritt dort häufig mit Aktin co-lokalisiert auf. Dies lässt darauf schließen, dass Rop4 durch zelluläre Säuger-Enzyme prenyliert werden kann und dass es auch im heterologen System von zellulären CaaXProteasen und auch von Prenylcystein-Carboxymethyl-Transferasen erkannt wird. Die coLokalisierung von Rop4 mit Aktin untermauert die Funktion von Rops in der Regulation der Aktindynamik. 5 Diskussion 135 5.5.2 Rop4 übernimmt die Funktionen von Rac1 in Säugerzellen Rop4- und Rac1-Expression rufen den gleichen Phänotyp in Säugerzellen hervor. Rop4 ist dem humanen Rac1 offensichtlich so ähnlich, dass die zellulären Aktivatoren wie auch die Effektoren von Rac1 mit Rop4 interagieren und es aktivieren bzw. von ihm reguliert werden. Funktionelle Äquivalenz von menschlichem HsRac1 und pflanzlichen Rop-Proteinen wurde auch im Zusammenhang mit der Aktivierung der NADPH-Oxidase durch HsRac1 bzw. OsRac2 berichtet (Hassanain et al. 2000). Die p21-aktivierten Proteinkinasen (PAKs) gehören zu den am besten untersuchten Effektoren von Rac und Cdc42 und spielen eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle von Aktindynamiken und der Zelladhäsion. Die sechs bekannten PAK-Isoformen der Säuger besitzen eine N-terminale regulatorische Domäne und am C-Terminus eine hochkonservierte Kinasedomäne, wobei die regulatorische Domäne inhibierend auf die Kinasedomäne wirkt. Der N-terminale Bereich von PAK1 enthält ein CRIB- (Cdc42/Rac interactive binding) Motiv, das als GNBP-Bindestelle dient (Osada et al. 1997, Zhao et al. 1998, Chong et al. 2001). Rop4 ist in der Lage in vitro mit dem Rac1-Effektor Pak1 zu interagieren (4.1.4.3). Ebenso konnte gezeigt werden, dass der Rac-spezifische Austauschfaktor Tiam1 Rop4 aktivieren kann. Das vorausgesagte Strukturmodell von Rop4 zeigt die strukturelle Ähnlichkeit von Rop4 und Rac1 (Abbildung 5.6). Auch die hohe Übereinstimmung der Aminosäuresequenzen von 64.1 % untermauert die nahe Verwandschaft von Rac1 und Rop4. So besitzen die Rops das gleiche Nukleotidbindungsmotiv wie Rac, das TKLD-Motiv (Schwede et al. 2003, Valster et al. 2000). Rac, Cdc42 und Rho sind im Laufe der Evolution wahrscheinlich aus einem gemeinsamen Vorgängerprotein entstanden. Sie kommen in Säugern, Insekten und Pilzen vor. Da diese drei Gruppen der Rho-Familie jedoch nicht in Pflanzen vorkommen und Rop-Proteine im Gegenzug ausschließlich in Pflanzen vorkommen, liegt der Schluss nahe, dass alle vier Gruppen der Rho-Familie möglicherweise aus einem gemeinsamen „Vorläufer“-Rho-Protein entstanden sein könnten. Die einzelnen Gruppen der heutigen Mitglieder der Rho-Familie wären dann erst nach der Trennung von Tieren, Pflanzen und Pilzen entstanden. Dafür spräche, dass auch die Effektoren der Rho-Proteine konserviert sind und in verschiedenen Organismen auftreten. Viele Effektoren von Rac, Cdc42 und Rop haben einen gemeinsamen Ursprung (Cotteret und Chernoff 2002). Ebenso ist die GAP-Domäne der RhoGAPs in unterschiedlichen Organismen konserviert (Lamarche and Hall 1994, Peck et al. 2002, 5 Diskussion 136 Nakano et al. 2001). Die Erkenntnis, dass der humane Rac-Austauschfaktor Tiam1 den Nukleotidaustausch an Rop4 beschleunigen kann, deutet an, dass die Aktivierung des „Vorläufer“-Rho-Proteins durch GEFs des Dbl-Typs erfolgte. Nach der Trennung der Organismen und dem eventuellen Verlust von Dbl-GEFs in einzelnen Gruppen wurden in diesen Organismen dann vermutlich neue Mechanismen zum Nukleotidaustausch entwickelt. In S. tryphimurium entstand auf diese Weise möglicherweise der GEF SopE und in Pflanzen ein neuer, noch unbekannter GEF-Typ (Hardt et al. 1998). Abbildung 5.6: Ähnlichkeit zwischen Rop4 und Rac1. Vergleich des vorausgesagten Strukturmodells von Rop4 (grün) mit der Kristallstruktur von Rac1*GDP (rot) (Schwede et al. 2003, Tarricone et al. 2001). Das von Rac1 gebundene GDP wurde als Kugal-und-Stab-Modell dargestellt. Die Aufnahmen Rop4-exprimierender HeLa-Zellen zeigen die co-Lokalisation von Rop4 und Aktin in der Kontaktzone zweier Zellen (4.1.4.2). Dies wurde ebenfalls in CA Rac1exprimierenden Zellen beobachtet. In der Kontaktzone befinden sich Adhäsionsstellen (adherent junctions und tight junctions) (Bazzoni und Dejana 2004). Für die Bildung und Stabilisierung von adherent junctions ist das Rekrutieren von E-Cadherin und Aktin an die interzellulären Kontaktzonen von Epithelzellen essentiell (Adams et al. 1996, Yap et al. 1997, Yonemura et al. 1995). Rac und Cdc42 sind in die Bildung Cadherin-abhängiger Zell-ZellKontakte involviert und regulieren diese. Überexpression von CA Rac bzw. Cdc42 in Säugerzellen verhindert Zelladhäsion. Überexpression von DN Cdc42 bzw. Rac erlaubt Cadherin-abhängige Adhäsion, beeinflusst jedoch die spätere Entwicklung der Adhäsion (Chu et al. 2004). IQGAPs sind Effektoren von Rac und Cdc42 (Cotteret und Chernoff 2002, Aspenstrom 1999). IQGAP1 wurde im Komplex mit filamentösem Aktin und Cdc42 nachgewiesen. 5 Diskussion 137 Außerdem wurde gezeigt, dass es an Zell-Zell-Adhäsionsstellen lokalisiert ist und für die Bildung von Rac- und Cdc42-induzierten Zell-Zell-Kontakten benötigt wird. Es interagiert dort mit E-Cadherin und β-Catenin und induziert die Dissoziation von α-Catenin vom Cadherin-Catenin-Komplex (Kuroda S et al. 1998). Dies führt zum Zusammenbrechen der Zell-Zell-Kontakte. Cdc42 und Rac1 wirken der Aktivität von IQGAP entgegen, indem sie es inhibieren und dadurch den Cadherin-Catenin-Komplex stabilisieren (Kaibuchi et al. 1999, Fukata et al. 1999). 5.5.3 Rop4 ist in Zwiebel-Epidermiszellen membranlokalisiert Um die Funktion von Rop4 bei der Regulation der Aktinorganisation in der pflanzlichen Zelle zu analysieren, wurden Rop4 in der Wildtyp-Form und als konstitutiv aktive Mutante in Zwiebel-Epidermiszellen exprimiert (4.1.4.1). Dafür wurde es am N-Terminus mit CFP fusioniert, um die erwartete posttranslationale Prenylierung am C-Terminus nicht zu unterbinden. Aktinfasern wurden durch GFP-mTalin sichtbar gemacht, mit dem die Zwiebelzellen cotransformiert wurden (Kost et al. 1998). mTalin ist ein Aktin-bindendes Protein aus der Maus. Die Auswertung transformierter Zellen zeigte, dass Rop4 wie in den Säugerzellen an der Membran der Zwiebelzellen lokalisiert ist. Dort war es teilweise mit Aktin co-lokalisiert. An bestimmten Stellen der Membran und am Zellkern war es besonders angereichert. Durch die Expression von Rop in den Zellen scheint die Ausbildung von Aktinfasern reduziert worden zu sein. Da es sich bei den Zwiebel-Epidermiszellen um ausgereifte Zellen handelt, sind bei transienter Expression von Rop4 weder Wachstum noch Morphologieänderungen der Zellen zu erwarten. Die Zellwand dieser Zellen ist bereits ausgesteift und macht keine Formveränderungen der Zelle mehr mit. Lediglich Veränderungen der intrazellulären Aktinstrukturen können durch die Rop4-Expression beeinflusst werden. Eine reduzierte Zahl von Aktinfilamenten deutet auf eine Umorganisation des Aktinzytoskeletts als Folge der Rop4Aktivität hin. Die Membranlokalisierung von Rop4 zeigt, dass Rop4 in den Zwiebelzellen funktionell exprimiert und posttranslational modifiziert wird. Eine Lokalisation von Rop4 an der Plasmamembran wurde ebenfalls in Tabak BY-2- (bright yellow) Zellen beobachtet (Molendijk et al. 2001). Auch die endogenen Rops des Wurzelmeristems sind membranlokalisiert. In BY-2Zellen, die sich in der Teilung befinden, ist GFP-Rop4 hauptsächlich an der Zellplatte 5 Diskussion 138 lokalisiert, wo die Assemblierung von Aktinfilamenten stattfindet (Molendijk et al. 2001). Im gleichen Zelltyp wurde Rop4 auch in der perinukleären Region des Zellkerns gefunden (Bischoff et al. 2000). In der gleichen Studie wurde deutlich, dass die Lokalisation allein durch den C-Terminus des Proteins herbeigeführt wird. Durch die Überexpression kann das natürliche Verteilungsmuster der Proteine in der Zelle gestört werden, da beispielsweise nicht genügend RopGDIs in der Zelle vorliegen, die für die Regulation der subzellulären Lokalisation der Rops und für die Rezyklisierung an bestimmte Stellen der Plasmamembran nötig sind (Molendijk et al. 2001, Bischoff et al. 2000). Die Bindung von RopGDI1 an Rop4 und Rop6 wurde bereits dokumentiert (Bischoff et al. 2000). Die beobachtete Lokalisation von Rop4 am Zellkern kann auch ein Artefakt der Expression als CFP-Fusionsprotein sein, da GFP-Fusionsproteine und GFP-Varianten eine generelle Tendenz zur Lokalisation im Kern zeigen (Fuhrmann et al. 1999). Zudem ist nicht sicher, ob das gesamte Rop-Protein der Zelle prenyliert vorliegt. 5.5.4 Die Rolle von RICs in der Regulation der Aktindynamik Bei der Expression von RIC9 in Zwiebel-Epidermiszellen wurde beobachtet, dass das Protein hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist (4.3.3). Es lag zusammen mit Aktinfasern in den Zytoplasmasträngen vor, die die Vakuole durchqueren, war aber nicht mit Aktin colokalisiert. Wurde Rop4 gemeinsam mit RIC9 exprimiert, so war RIC9 mit Rop4 an der Membran co-lokalisiert. Ein Grossteil des RIC9-Proteins befand sich wiederum im Zytoplasma. Die Expression von RIC9 in Pollenschläuchen hat gezeigt, dass das Protein in diesem Zelltyp an der gesamten Plasmamembran lokalisiert ist und auf das Pollenschlauchwachstum negativen Einfluss ausübt. Rop1-Expression beeinflusst dabei den durch RIC9 ausgelösten Phänotyp der Pollenschläuche nicht (Wu et al. 2001). Das tierische Effektorprotein von Cdc42, WASP, wurde mit Aktinstressfasern co-lokalisiert beschrieben, aber auch als zytoplasmatisches Protein, das zum Teil im Kern lokalisiert ist und zum Teil an der Membran (Vetterkind et al. 2002, Shimizu et al. 2000). Es wurde postuliert, dass RICs die Signale der Rop-Proteine weiterleiten und demzufolge auch an der Regulation der Aktinorganisation in der Zelle beteiligt sind. RICs wurden in Pollen überexprimiert und verursachten verschiedene Phänotypen. Bei der Expression von RIC1, RIC2, RIC5, RIC6 und RIC9 wurde reduziertes Pollenschlauchwachstum festgestellt. Durch RIC10-Expression wurde das Pollenschlauchwachstum gefördert, RIC3 und RIC4 bewirken unpolarisiertes Wachstum (Wu et al. 2001). 5 Diskussion 139 Es ist anzunehmen, dass RICs durch Rops an der Membran aktiviert werden und dann entweder Effektoren zur Membran rekrutieren oder im aktivierten Zustand mit den Effektoren an die Orte der Aktinpolymerisierung translozieren. Dies kann nur durch die gleichzeitige Expression von Rop, RIC und mTalin aufgeklärt werden, da eine co-Lokalisation von RIC und Aktin möglicherweise nur bei gleichzeitiger Expression von Rop- und Rop-vermittelter RIC-Aktivierung beobachtet werden kann. 5.6 Ausblick Die Ergebnisse der Analysen zur Funktion der RICs haben gezeigt, dass RICs Interaktionspartner von aktivierten Rops sind. Die Bindung der RICs an Rops erfolgt hochspezifisch. Es ist anzunehmen, dass RICs die Aktivität der Rops kanalisieren und spezifisch Signalkaskaden aktivieren. Die Frage, welche strukturelle Grundlage die Spezifität der Rop-Bindung durch RICs bestimmt, ist in Zukunft durch weitere Experimente zu beantworten. Zur weiteren Aufklärung der Rolle der RICs in Rop-kontrollierten Signalwegen ist die Identifizierung der Interaktionspartner, die im Signalweg unterhalb der RICs fungieren, von grossem Interesse. In dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass RopGAP2 die Hydrolyse von Rop4*GTP beschleunigt. Des Weiteren wurde bestätigt, dass RopGAP2 zwei unterschiedliche funktionelle Rop-Bindestellen besitzt. Sowohl die CRIB- als auch die GAP- Domäne interagieren mit der aktivierten Form von Rops. Die Affinität der CRIB-Domäne zu Rops ist dabei sehr viel höher als die der GAP-Domäne. Die Untersuchungen haben ergeben, dass die CRIB-Domäne für die Katalyse der Rop4*GTP-Hydrolyse durch die GAP-Domäne nötigt ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein Modell zur Regulation der RopGAP-Aktivität entwickelt. Es basiert auf der Vermutung, dass RopGAP2 zwei Rop-Moleküle bindet. Durch eines der Rops wird es aktiviert, das andere fungiert als Substrat. Durch einen solchen Mechanismus würden unterschiedliche Rop-Signalwege miteinander verschaltet werden. Zur Bestätigung des Modells bleibt zu klären, ob tatsächlich zwei Rop-Moleküle von RopGAP gebunden werden oder ob beide Domänen von RopGAP an ein einziges RopMolekül binden. Dafür wäre eine Kristallstruktur von RopGAP sehr hilfreich. Sie würde helfen, den Mechanismus der Regulation von RopGAP zu verstehen. 6 Zusammenfassung 140 6 Zusammenfassung Als Mitglieder der Rho-Familie kleiner G-Proteine fungieren die pflanzlichen Rops (Rho of plants) als molekulare Schalter, die Signalwege im GTP-gebundenen Zustand an- und im GDP-gebundenen Zustand abschalten. Rops spielen so eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Aktinzytoskeletts, der Entwicklung der Zellpolarität, dem Zellwachstum, der Morphogenese, bei Hormonreaktionen und bei der Pathogenabwehr. Im Gegensatz zu den gut beschriebenen Signalwegen der Rho-Proteine aus Tieren ist bislang nur wenig über die Rop-gesteuerten Signalwege und ihre Regulation in Pflanzen bekannt. Tierische Rho-Proteine werden durch Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) und GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) reguliert. GEFs vom Dbl-Typ katalysieren dabei die Aktivierung der Rho-Proteine durch den Austausch von GDP zu GTP. GAPs katalysieren die Inaktivierung, indem sie die Hydrolyse von GTP zu GDP beschleunigen. Rops scheinen in einer einzigartigen, pflanzenspezifischen Weise reguliert zu werden. RopGAPs besitzen eine ungewöhnliche Struktur aus einer CRIB-Domäne und einer GAP-Domäne, wobei die Funktion der CRIB-Domäne noch nicht verstanden ist. Dbl-GEFs konnten bis dato in pflanzlichen Genomen nicht identifiziert werden. Pflanzen enthalten ferner eigentümliche Effektoren, die RICs (Rop-interactive CRIB motif-containing proteins). Diese kleinen Proteine mit einem konservierten CRIB-Motiv werden wahrscheinlich durch GTP-gebundenes Rop aktiviert und rekrutieren als Adaptoren weitere Proteine des Rop-Signalweges. Ziel dieser Arbeit war es, die biochemischen Aspekte der Regulation von Rops durch RopGAPs zu untersuchen, und die Funktion von Rops im Signalweg zum Aktinzytoskelett weiter aufzuklären. Hierzu wurde zunächst das Protein Rop4 aus A. thaliana rekombinant in E. coli exprimiert und in aktiver Form gereinigt. Durch fluoreszenzspektrometrische Messungen konnte gezeigt werden, dass die Nukleotidbindung durch Rop4 magnesium- und temperaturabhängig mit hoher Affinität (2 nM) erfolgt. Des Weiteren wurde eine geringe Hydrolyseaktivität von Rop4 (2,7·10-4 /s) bestimmt. Mit diesen beiden Eigenschaften erfüllt Rop4 die Bedingungen an einen molekularen Schalter der Ras-Superfamilie. Bei den ermittelten Nukleotidaffinitäten ist eine spontane Nukleotiddissoziation von Rop4 ohne den Einfluss regulatorisch wirkender GEFs sehr langsam. Es konnte gezeigt werden, dass der menschliche Austauschfaktor Tiam1 den Nukleotidaustausch an Rop4 beschleunigt. 6 Zusammenfassung 141 Dies spricht dafür, dass Rops prinzipiell durch GEFs reguliert werden können und lässt vermuten, dass RopGEFs in Pflanzen vorliegen. Zur Analyse der Funktion von RopGAPs wurde RopGAP2 aus A. thaliana in E. coli und mit Hilfe des Bakulovirus-Systems in Insektenzellen exprimiert und aufgereinigt. Die Interaktion von RopGAP2 mit Rop4 wurde durch Hefe-Zweihybridanalysen und durch in vitro-Interaktionsstudien demonstriert. Die Bindung von RopGAP2 an Rop4 erfolgte nukleotidabhängig mit nanomolarer Affinität (84 nM). RopGAP2 beschleunigte die GTP-Hydrolyseaktivität von Rop4 um das 10000-fache, während die isolierte GAP-Domäne von RopGAP2 die Hydrolyse von Rop4*GTP nur geringfügig beeinflusste. Demnach ist die CRIB-Domäne für die volle Aktivität von RopGAP erforderlich. Weitere Untersuchungen der Interaktion von RopGAP2 mit Rops im Hefe-Zweihybridsystem machten deutlich, dass sowohl die CRIB- als auch die GAP-Domäne von RopGAP2 mit Rop-Proteinen interagiert, und sie demnach zwei unabhängige Rop-Bindestellen darstellen. Beide Domänen bevorzugten aktiviertes Rop, wobei die CRIB-Domäne anscheinend die Rop-Spezifität vermittelt. Zur Untersuchung der Rop-Effektoren wurden RIC6 und RIC9 rekombinant in E. coli exprimiert und gereinigt. Durch in vitro-Interaktionsanalysen konnte gezeigt werden, dass Rop4 in seiner aktiven Form mit RIC6 und RIC9 interagiert. Interaktionsstudien im Hefe-Zweihybridsystem ließen erkennen, dass die Interaktion der RICs mit einzelnen Rops hochspezifisch erfolgt. Demnach ist anzunehmen, dass RICs die Aktivität der Rops kanalisieren und spezifische Signalkaskaden aktivieren. Um die Funktion von Rops und RICs bei der Regulation der Aktinorganisation zu untersuchen, wurden fluoreszierende Fusionsproteine in planta und in Säugerzellen exprimiert. Mikroskopische Untersuchungen von Rop4-exprimierenden Zellen der Zwiebel zeigten, dass Rop4 an der Plasmamembran lokalisiert ist, und die Aktinstränge in diesen Zellen weniger stark ausgebildet waren als in Kontrollzellen. RIC9 war in Zwiebelzellen zytoplasmatisch lokalisiert. Die Architektur des Aktinzytoskeletts wurde durch die RIC9-Expression nicht beeinflusst. Wurde RIC9 zusammen mit Rop4 exprimiert, so ist RIC9 zum Teil mit Rop4 co-lokalisiert. Rop4-exprimierende Säugerzellen zeigten eine co-Lokalisation von Rop4 und Aktin an der Plasmamembran sowie Morphologieänderungen, die denen glichen, die durch humanes Rac1 hervorgerufen werden. Durch weiterführende in vitro-Experimente konnte in diesem Zusammenhang auch gezeigt werden, dass Rop4 auf Grund seiner Ähnlichkeit mit Rac1 mit dem Rac1-Effektor PAK1 interagiert. 6 Summary 142 Summary As members of the Rho family of small G proteins, the plant Rops (Rho of plants) act as molecular switches, that turn in their GTP-bound state signaling pathways on and in their GDP-bound state off. Thus, Rops play an important role in the regulation of the actin cytoskeleton, the development of cell polarity, cell growth, morphogenesis, hormone responses and pathogen defense. In contrast to the well studied signaling pathways of the mammalian Rho proteins, only little is known about the Rop-mediated signaling pathways and the regulation of Rops. In animals, Rho proteins are regulated by GEFs (guanine nucleotide exchange factors) and GAPs (GTPase-activating proteins). GEFs of the Dbl-type catalyse the activation of the Rho proteins by accelerating the exchange of GDP to GTP. GAPs catalyse the inactivation by facilitating the hydrolysis of GTP to GDP. Rops seem to be regulated in a unique and plant specific manner. RopGAPs possess an unusual structure of a CRIB domain and a GAP domain whereby the function of the CRIB domain is not known. So far, no Dbl-GEFs could be identified in plant genomes. Moreover, plants possess potential effectors, the RICs (Rop-interactive CRIB motif-containing proteins). These small proteins with a conserved CRIB motif probably get activated by GTP-bound Rop and then recruit other proteins of the Rop pathway as adaptors. The aim of my work was to analyse the biochemical aspects of the regulation of Rops by RopGAPs and to further clarify the function of Rops in the signaling pathway to the actin cytoskeleton. To do this, Rop4 from A. thaliana was recombinantly expressed in E. coli and purified as an active protein. By fluorescence spectrometry it could be shown, that nucleotide binding occurs magnesium- and temperature-dependent with a high affinity (2 nM). Furthermore, the activity of the protein to hydrolyse GTP was found to be rather low (2,7·10-4 /s). With these biochemical characteristics, Rop4 fulfills all requirements of a molecular switch of the Ras superfamily. With the determined nucleotide affinities, spontaneously nucleotide dissociation is very slow without influence of regulatory nucleotide exchange factors. It could be shown, that the human exchange factor Tiam1 can accelerate the nuclotide exchange on Rop4. This indicates that Rops generally can be regulated by GEFs and that RopGEFs presumably exist also in plants. 6 Summary 143 To analyse the function of RopGAPs, RopGAP2 from A. thaliana was expressed and purified from E. coli and with the baculovirus expression system from insect cells. The interaction of RopGAP2 with Rop4 was demonstrated by yeast two hybrid studies and by in vitro analysis. Binding of RopGAP2 to Rop4 occured nucleotide state-dependent with nanomolar affinity (84 nM). RopGAP2 facilitated GTP hydrolysis by Rop4 with a factor of 10000, while the isolated GAP domain of RopGAP2 influenced hydrolysis of Rop4*GTP only very weak. Therfore, the CRIB domain is necessary for the full activity of RopGAP. Further analysis of the interaction of RopGAP2 with Rops in the yeast two hybrid system revealed that both, the CRIB and the GAP domain of RopGAP2 interact with Rop proteins and that they therefore represent two independent Rop binding sites. Both domains prefere activated Rop, the CRIB domain probably mediates Rop specificity of RopGAP. For analysing the Rop effectors, RIC6 and RIC9 were expressed recombinantly in E. coli and purified. By in vitro interaction studies it could be shown, that Rop4 interacted with RIC6 and RIC9 in its active form. Further analysis in the yeast two hybrid system displayed that interaction with distinct Rops occurs highly specific. Therefore, it is proposed that RICs balance the activity of Rops and activate distinct signaling cascades. To analyse the functions of Rops and RICs in the regulation of the actin organisation, fluorescent fusionproteins were expressed in planta and in mammalian cells. Microscopical analysis of Rop4-expressing onion epidermis cells showed, that Rop4 is localised at the plasma membrane and actin fibres are less strong than in control cells. In those cells, RIC9 was localised in the cytoplasm. The architecture of the actin cytoskeleton was not influenced by the RIC9 expression. When RIC9 was co-expressed with Rop4, a population of RIC9 was co-localised with Rop4. Rop4-expressing mammalian cells displayed co-localisation of Rop4 and actin at the plasma membrane and changes in the morphology of the cells that were similar to those observed in human Rac1-expressing cells. In this context, further in vitro experiments have shown, that, because of the high similarity between Rop and Rac, Rop4 can be activated by the cellular Rac1 effector PAK1. 7 Literatur 144 7 Literatur Abdul-Manan, N., B. Aghazadeh, G. A. Liu, A. Majumdar, O. Ouerfelli, K. A. Siminovitch und M. K. Rosen. 1999. 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Dr. Toshimasa Ishizaki und Anette Langerak danke ich für ihre grosse Hilfsbereitschaft und für die zahlreichen, wertvollen Ratschläge für den Umgang mit Insektenzellkulturen. Bei Dr. Ulrike Herbrand möchte ich mich ganz herzlich für die Einführung in die Zellkultur und für Ihre Hilfe beim Mikroskopieren bedanken. Rainer Saedler danke ich für seine grosse Hilfsbereitschaft und die tatkräftige Unterstützung bei den Zwiebel-Experimenten. Dr. Holger Rehmann danke ich für sein grosses Interesse am Fortgang meiner Arbeit und für die vielen Vorschläge und Ideen und seine stetige Diskussionsbereitschaft. Bei Dr. Jens Tränkle möchte ich mich für die Unterstützung bei praktischen Problemen im Labor sowie für das Korrekturlesen dieser Arbeit und seine hilfreichen Vorschläge bedanken. Bei Dr. Marian Farkasovsky und Beate Voss bedanke ich mich für die vielen guten Ratschläge im Labor und die gute Zusammenarbeit. Dennis Fiegen danke ich für die Hilfe mit einigen Abbildungen dieser Arbeit. Delia Deaconescu danke ich für ihre Kollegialität und Unterstützung. Dr. Robert Gail danke ich für seine stete Diskussionsbereitschaft und seine Ratschläge. Ich bedanke mich bei allen Mitgliedern der Abteilung Strukturelle Biologie und insbesondere bei meinen Labor- und Bürokollegen für das angenehme Arbeitsklima. Den Beschäftigten der zentralen Einrichtungen des Max-Planck-Instituts danke ich für ihre freundliche Unterstützung. Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir mein Studium ermöglichten und mich auch ansonsten in jeglicher Hinsicht unterstützt haben. Meinem lieben Freund Jens danke ich dafür, dass er immer Verständnis für meine Arbeit aufgebracht hat und mich in der Freizeit auf andere Gedanken gebracht hat. XV Lebenslauf Henriette Brüggemann Wehmenkamp 31 45131 Essen Persönliche Daten Geburtsdatum 21. Juli 1976 Geburtsort Kassel Staatsangehörigkeit deutsch Schulbildung 8/1983 - 10/1987 Lembergschule in Ludwigsburg und Gemeinschaftsgrundschule in Wetter (Ruhr) 10/1987 - 6/1996 Geschwister-Scholl-Gymnasium in Wetter (Ruhr), Abschluss: Abitur (Note: 2,3) Studium 10/1996 - 6/2001 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum, Abschluss: Diplom (Note: 1,2) 7/2000 - 6/2001 Diplomarbeit am Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik unter Leitung von Prof. Dr. U. Kück Thema: Molekulargenetische Analyse von Entwicklungsmutanten des Ascomyceten Sordaria macrospora 10/1999 – 2/2000 Praktikum bei der Bayer AG in Wuppertal, Abteilung Antiinfektiva I 7/2000 Studienabschluss-Stipendium der Ruth und Gerd Massenberg-Stiftung Promotion 7/2001 – 1/2005 Anfertigung der Doktorarbeit am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in Dortmund, Abteilung Strukturelle Biologie, unter Leitung von Prof. Dr. A. Wittinghofer und Prof. Dr. E. Weiler XVI Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät eingereicht habe, und dass es sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare handelt. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde. Bochum, den
