Kurstag 1:

Kurstag 1:
Kompartimente der Zelle – Elektronen und Fluoreszenzmikroskopie
Vorbesprechung:
Kompartimente der Zelle
Herstellung von TEM-Präparaten, Immungoldmarkierung
Anschauungsmaterial: Netzchen und getrimmte Kunstharzblöcke
Fluoreszenzmikroskopie, GFP
Praktikum
(A) Transmissionselektronenmikroskopische Bilder: Vergleich der Ultrastruktur nach
chemischer und physikalischer Fixierung, Immungoldmarkierung
(B) Bioimaging von GFP-markierten Zellkompartimenten,
Fragebogen zur Fluoreszenzmikroskopie am Mikroskop besprechen,
Material: Arabidopsis thaliana Pflanzen mit GFP in verschiedenen Kompartimenten –
fluoreszenzmikroskopische Analyse von Keimlingen (max 7Tage alt)
Arbeitsblätter: Fragen zu den TEM-Bildern und zur Fluoreszenzmikrokopie
Kurstag 2:
In silico-Bestimmung der subzellulären Lokalisation von Proteinen
Vorbesprechung:
Einführung in bioinformatische Grundlagen
Umgang mit Sequenzen am PC
Sequenzen in Datenbanken (NCBI, Genbank)
Übersicht über verschiedene Programme zur Vorhersage der subzellulären
Lokalisation von Proteinen auf der Grundlage der Aminosäuresequenz
Arbeitsblätter und Nachbesprechung:
Benutzung der Sequenzdatenbanken
In silico Bestimmung der Lokalisation von Beispielsequenzen
Vergleich der verschiedenen in silico Vorhersagen der Beispielsequenzen mit
experimentellen Daten
Weiterführende Bücher:
Methoden der Bioinformatik
Marc-Thorsten Hütt, Manuel Dehnert
Springer-Lehrbuch (2006), in der UB erhältlich
Angewandte Bioinformatik: Eine Einführung. Mit Übungen und Lösungen
Paul Maria Selzer, Richard Marhöfer und Andreas Rohwer
Springer-Lehrbuch (2003), in der UB erhältlich
Kurstag 3: Cytogenetische Analysen - Untersuchung der Kern- und Chromosomenstruktur
Vorbesprechung:
Kernphasen
Aufbau von Chromatin
Chromosomenstruktur
(A1) Präparation von Chromosomen und Kernpräparaten von Zweibel- Färbung mit
Karminessigsäure + Analyse der Struktur und Größe von Interphasekernen sowie
Chromosomenanzahl von verschiedenen Pflanzenarten: Allium, H. vulgare, N.
tabaccum, A. thaliana, B.napus; Präparate vorgefertigt, Färbung mit Giemsa und
Karminessigsäure
(B) DAPI-Färbung von Präparaten aus H.vulgare und A.thaliana, Beobachtung von
Hetero- und Euchromatin, Nukleolus
(C) FISH: Lokalisierung von hybridisierten Sequenzen an mitotischen Chromosomen
von Beta vulgaris (Bildauswertung am Laptop)
Material
(A)
Wurzelspitzen von Zwiebel, Gerste, Tabak, Arabidopsis, Raps
(B)
Kernpräparate aus Arabidopsis und Gerste
Fluoreszenzmikroskope in E6
(c)
FISH Bilder
Nachbesprechung:
Zusammentragen der Ergebnisse
Repetitive Sequenzen / Epigenetik
Kurstag 4:
Visueller Nachweis von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Zelltod
Vorbesprechung:
Def.: ROS ? Wo entstehen sie?
Nachweisverfahren: Prinzipien der drei Versuche
(A) Lokalisierung der intrazellulären Produktion von ROS durch präzipitierende
Indikatorsubstanzen (Färbung mit NBT und DAB)
(B) Visueller Nachweis von Lipidperoxidation: Mikroskopischer Nachweis von
Malondialdehyd (MDA) nach Stressreaktionen (Licht und Paraquat)
(C) Histochemische Lokalisierung von H2O2 durch tissue printing auf Nitrozellulose
Material:
(A) Keimende Krayopsen von Gerte und Samen von Bohne
(B) Physcometrella patens + Fluoreszenzmikroskopie in E6
(C) Staudensellerie/Tabak/ Stengel von höheren Pfl.
Nachbesprechung:
Zusammentragen der Gruppenergebnisse+ Interpretation: in welchen zelluläre
Kompartimenten wurde ROS nachgewiesen
Kurstag 5:
Fraktionierung von Pflanzenzellen und Untersuchung von Proteinen
(A) Vorbesprechung: Einleitung in die Fraktionierung von Pflanzenzellen + Zentrifugation
(B-1) Besichtigung des Kühlraumes der AG Krupinska (Ausstellung von verschiedenen
Rotor- und Zentrifugen- Typen) mit der ersten Hälfte der Gruppe
(B-2) Beantworten der Fragen des ersten Teils des Fragebogens- die zweite Hälfte der
Gruppe
(C) Starten eines SDS-Polyacrylamid-Gels
Chemikalien und Geräte: am Vortag gegossenes SDS-Gel, 1L Laemmli-Laufpuffer,
Proteingröße-Standard (13 µl), Proben schon mit dem Auftragspuffer pipettiert (20µl), eine
Box mit Eis, Thermomixer, Gel-Apparaturen von unterschiedlicher Größe (um zu
demonstrieren, dass es unterschiedliche Gel-Kammer gibt), Spannungsquelle.
(D)
(E)
Theorie zur SDS-PAGE
Beantworten der Fragen des zweiten Teils des Fragebogens und Lösen der
Aufgabe
Herstellung von ca. 10 mit Coomassie.gefärbten Polyacrylamidgelen mit folgenden
Zellfraktionen: Gesamtproteinextrakt (1), Plastiden (2), Stroma- (3) und ThylakoidenFraktion (4), LHC- (5), PSI- (6) und PSII- (7) Fraktionen.
Anschauungsmaterial: Die Gele haben verschiedene Polyacrylamid-Konzentrationen
und unterschiedliche Größe, sodass man mit den Studenten gut diskutieren kann, wie
die Konzentration des Polyacrylamides die Größe der Gelporen und die Trennung der
Proteine beeinflusst.
(F) Nachbesprechung:
Vergleich des theoretischen und apparenten (von Studenten berechneten)
Molekulargewichts von Rubisco. Diskussion: warum gibt es Unterschiede im theoretischen
und apparenten Molekulargewicht? Welche Methoden könnte man anwenden um eine
unbekannte Proteinbande zu identifizieren?
Kurstag 6:
Plastidenteilung und -differenzierung
Vorbesprechung:
Plastidentypen
Plastidenteilung und -differenzierung im Gerstenblatt
Plastidenteilungsmutanten von Arabidopsis thaliana
(A) Alters- und lichtabhängige Entwicklung von Chloroplasten
Mikroskopie von Plastiden unterschiedlicher Entwicklungsstadien in der Gerste
Material:
Protoplasten aus Segmenten eines Gerstenprimärblattes (7 Tage alt)
(B) Mikroskopische Untersuchung der Plastiden von Plastidenteilungsmutanten
Material:
Mazeriertes Gewebe von Arabidopsis thaliana (Mutanten und Wildtyp)
Arbeitsblatt: Anfertigung von Skizzen und Bestimmung der Größe der Chloroplasten
und der Plastidenzahl pro Zelle sowie Fragen zu den Teilungsmutanten von
Arabidopsis thaliana.