Die heutzutage verwendeten Konstrukte zum RNAi

Neuartige Vektoren für RNAi in Pflanzen
Nadja Schmidt, Jasmin Marx, Matthias Merker, Hermann Schmidt und Dirk
Becker
Biozentrum Klein Flottbek, EBBT, Universität Hamburg, Ohnhorststraße 18,
22609 Hamburg
Email: [email protected], Tel.: 040 42816 284/492
Die heutzutage verwendeten Konstrukte zum RNAi-vermittelten Gene Silencing bei Pflanzen
und Tieren weisen normalerweise eine Struktur auf, die aus einer Sense- und AntisenseTeilsequenz des Zieltranskripts besteht, welche durch einen mehrere hundert Basenpaaren
langen Spacer getrennt sind. Reguliert wird diese Art von Konstrukten durch einen einzelnen
Promotor. Nach der Transkription kommt es zur komplementären Basenpaarung zwischen der
Sense- und Antisense-Sequenz, wodurch aufgrund des Spacers eine Haarnadelstruktur
gebildet wird. Der Spacer kann auch durch ein Intron ersetzt werden, wodurch nach dem
Splicen der mRNA eine dsRNA ohne Schleife gebildet wird. Aufgrund der extremen
Homologien in den einzelnen Teilen dieser Konstrukte ist eine Klonierung sehr aufwendig.
Im Gegensatz dazu wurden in unseren Arbeiten Konstrukte verwendet, bei denen das Gen von
zwei gegenläufigen Promotoren flankiert wird. Hierbei sollten zwei einzelsträngige mRNAs
transkribiert werden, die aufgrund ihrer komplementären Sequenzfolge zu einer dsRNA
hybridisieren. Diese entstehende dsRNA ist dann der Auslöser für das Gene Silencing. Im
Rahmen des Vortrages werden Arbeiten aus Tabak, Arabidopsis und Pappeln vorgestellt, in
denen verschiedene RNAi Konstrukte zum Knockdown von transgenen- und endogenen
Genen verwendet wurden. Unter Verwendung der neuartigen RNAi Vektoren, ist es uns
erstmalig gelungen, gesamte cDNA Subtraktionsbanken von Arabidopsis zu klonieren und
diese in „random“ zur Pflanzentransformation von Arabidopsis zu verwenden, um
Mutantenkollektionen zu erstellen.
Durch die gleichzeitige Verwendung von Rekombinasesystemen (cre/loxP und FRT/FLP)
haben wir zusätzlich induzierbare RNAi- und Überexpressionsvektoren erstellt. Hierdurch ist
es zusätzlich möglich, bis dahin letal wirkende Gene in ihrer Funktion zu analysieren.