Vl Gentechnologie der Pflanzen
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Zusammenfassung der Vorlesung Molekularbiologie und Gentechnologie der Pflanzen WS05/06 Die folgenden Seiten sind sicher nicht komplett (Vorlesung Entwicklungsbiologie und div. Unterkaptitel fehlen) und auch nicht perfekt, aber sicher eine kleine Hilfe zur Prüfungsvorbreitung. Es sind bestimmt Fehler zu finden, aber im Großen und Ganzen dürften die Angaben stimmen. Viel Spaß damit. Klonierung, etc.: Vektor: Plasmid Phage Cosmid BAC YAC Insertkapazität: -> 5kbp -> 25kbp -> 45kbp -> 300kbp -> 400kbp Plasmid: natürlich in Bacteria, Archaea, Hefen: extrachromosomale DNA von 1-200kbp Größe Künstliche Plasmide: -> 7kbp groß, + Insert Plasmid muss beinhalten: -Replikon (ORI+Kontrollelemente) -Selektionsmöglichkeiten (Antibiotikaresistenz, Auxotrophiemarker) -MCS (bis zu 30 verschied. Schnittstellen) -zusätzliche Eigenschaften (Blau-weiß, etc.) Replikons: ca. 30 verschiedene bekannt, je effektiver, desto mehr Vektorkopien Antibiotika: Chloramphenicol: stört 50S Kanamycin: bindet 30S Tetracyclin: bindet an A-Stelle (tRNA) von 30S Erythromycin: blockiert Peptidexit am 50S Blau-Weiß-Test: Beta-Galactosidase X-Gal blau Möglichkeiten: Alpha und Omega-Fragment flankieren MCS: nach Insertion => Knock-out Omega-Fragment in E.coli Alpha-fragment in Vektor => Komplementation Spezielle Vektoren: Transkriptionsvektoren: mit RNA-Polymerase-Promotoren Überexpressionsvektoren zur Proteinsynthese: mit Tags zur Detektion, Reinigung, Löslichkeit Shuttlevektoren: ORI und Selektionsmarker für zwei Organismen: z.B. E.coli + Saccharomyces Cerevisiae Insert: aus Verdau und Gelelektrophorese, oder aus PCR Klonierungstypen: Verdau mit 1 Enzym: Blunt-end: Religation möglich, aber alk. Phosphatase benutzbar Sticky-end: “, Verdau mit zwei Enzymen: blunt-sticky, sticky-sticky : “ Taq mit 3´-5´-Exonukleaseaktivität erzeugen einen A-Überhang am 3´-Ende E.coli-Stämme mit folgenden Eigenschaften existieren: keine homolog. Rekomb., Deaktivierung von unspez. Endonuklease, Alpha-Komplementation, etc. Transformationvopn E.Coli: Elektroporation, CaCl2 Selektion: Selektionsmarker, PCR Pflanzentransformation -Expression von (Fremd)Gen: - Resistenzen (Herbizide, etc.) - Stoffwechselmanipulation (+Vitamine, etc.) - Molecular Farming (Antikörper, etc.) - getagte Proteine: Lokalisation, Funktion -Gene-Knock-out: - Untersuchung von Genfunktion - Anti-sense, RNAi, T-DNA, Knock-out-libraries -Promotor-Reportergen-Fusion: - Untersuchung von Promotoren (wo, wann, wie stark) - Reportergene: GFP, Luciferase, beta-glucoronidase Probleme: - multizelluläre Organismen - keine homologe Rekombination bei Fremd DNA-Insertion Expression entwicklungspezifisch, in welchem Kompartiment, gering/stark - Insertion von T-DNA zufällig Strategie: - Vektorwahl - Klonierungsstrategie - Pflanzenmaterialwahl - stabil/transient - Trafomethode Transformationsmethoden : Agrobacterium tumefaciens: Explantate, Protoplasten Vakuuminfiltration/Floral Dip: Blütenstände unter Vakuum in Agro-lösung, Samen nutzen Partikel-Kanone: Explantate PVX (Virus): ges. Pflanzen PEG, Elektroporation, Liposomen, Mikroinjektion: Protoplasten Blatt + Pectinase => Zellen, + Cellulase => Protoplasten, + Auxin => Kallus, + Cytokinin => Sproß Dir. Trafo.: Vektor mit: (Partikelk., Elporat., etc.) - ORI von E.coli, Selektionsmarker für E.coli - cis-Elemente (Promotor) für Pflanze, Sel.mark. für Pflanze Indir. Trafo: Vektor mit: (Mit Agro) - ORI von E.coli, Selektionsmarker für E.coli - ORI von Agrobac., Selektionsmarker für Agorbac., TDNA-Elemente -cis-Elemente (Promotor) für Pflanze, Sel.mark. für Pflanze Agrobacterium tumefaciens: Ti-Plasmid (tumor-inducing) enthält: VIR-Gene, LB, Auxin-Gene, Cytokinin-Gene, OpinGene, RB, Opin-Katabolismus-Gene, ORI Größe: ca. 200kbp, davon T-DNA: 23kbp Ablauf: Phenol aktiviert VIR-A und VIR-G => Induktion weiterer VIR-Gene Endonukleasen VIR-D1 und VIR-D2 schneiden ssT-DNA von T-DNA aus ssT-DNA+VIR-D1+VIR-E2 bilden nuklease-resistenten Komplex VIR-B1,2,5,7,9 bilden Kanal und Pilus zur Pflanzenzelle VIR-D2 und VIR-E2 mit Signalsequenz für Kern => Transport in Nukleus ssT-DNA => dsT-DNA => Integration in Genom, VIR-Prot. mit Ligase-aktivität (VIR-D) => Nutzung pro- und eukaryotischer Mechanismen Zur Transformation mit Agro.: Nur notwendig: VIR-Gene, LB, Fremdgene, RB, ORI Und: ORI von E.coli, Selektionsmarker für beide Bakterien, Markergen für Pflanze ->Cointegrativer Vektor Binäres Vektorsystem: In Agrobact. schon vorhanden: Helfer-Plasmid mit VIR-Genen, ORI für Agro., sel-mark für Agro in E-coli: Plasmid mit T-DNA, ORI für E.coli + agro, sel.marker, Ablauf: Vermehrung von T-DNA-Konstrukt in E-coli => Transformation in Agro => Transformation von Pflanzenmaterial Nachweis von erfolgreichem Gentransfer: - Resistenzen - PCR auf T-DNA und Beyond border kontrolle DNA-Sonde auf single-integration - Reportergen - Southern-Blot mit T- Transformation von Organellen mit Partikelkanonen (Vorsicht Rückstoß! Gut arettieren) Kultursysteme: Kalluskulturen: Hormongabe zur Ausdifferenzierung, Auxin, dann Cytokinin Suspensionskulturen: “ Pflanzengenome: Gentransfer: von Kern in Mitos von Mitos in Kern von Plast in Kern und Mitos (tRNA) Transfer von Proteinen, Signalen, Stoffwechselprod., etc. von allem zu allem Kern-Genom Mensch: 3500mbp Mais 3000mbp E-coli: 4000kbp Arabidopsis: 120mbp Weizen 16000mbp (hexaploid) Arabidopsis thaliana: -diploid - ca. 20000 Gene Unikale Sequenzen: Strukturgene Mittelrepetitive Sequenzen: rRNA-Gene, Transposons, Hochrepetitive Sequenzen: Satelliten-DNA Plastom: Je Zelle ca. 50 Plastiden, in jedem Plastid ca. 20 Nukleoide, jedes Nukleoid mit ca. 100 DNAMolekülen => polyploid, 80% Gene Runde Struktur, 150kbp groß, 120 Gene, hoher Selektionsdruck, kaum repet. Seq. Rekombination in Zirkeln: Änderung der Genrichtung, Genanordnung Gene: - Proteinbiosynthese (plastidencod. RNA-Polymerase, r-Proteine, rRNA,etc.) - Photosynthese (RUBICSO (nicht komplett), ATP-Synthase, etc., NADHDehydrogenase, etc.) Gene => polycistronische Transkripte => Prozessierung, Spleißen, Editing, Dazu kerncodierte Exo-, Endonukleasen notwendig Chondriom: Polyploid, 200-500kbp, verschieden große Ringe, viel nicht codierendes Material, Repeats und inverted repeats von rRNA-Genen => unterschiedl. Molekülen Nur 10% Gene, Gene: - rRNA, tRNA, r-Proteine - Cytochrom b/c, ATP-Synthase, NADH-Dehydrogenase Gene => Prozessierung, Spleißen, (auch Trans-Spleißen) Editing, In Plastom keine Transposons, konserviert, 80% Gene, 120 Stück, 150kbp In Chondriom 4% Transposons, dynamisch, 10% Gene, …Stück, 200-500kbp In beiden Organellentypen keine Histone, runde Struktur => Bakteriell In Nukleus, 10% Transposons, dynamisch, …% Gene, ….., 145Mbp Anteil repet. Gene und Transposons bei 40% Hier: Histone, Chromosomen => eukaryot Genomics: Zerlegung von Genom in kleinere Fragmente: Verwendung von Vektoren Erstellung von Genbanken mit verschiedensten Vektoren: Genombanken, Transkriptombanken (cDNA-Banken) Sequenzierung des Genoms: - Schrotschussprinzip: Zufällige Zerlegung des Genoms in kleinere Fragmente => Sanger-Sequenzierung, Analyse am Computer Gerichtete Analyse: - genetische Kartierung: relative Distanzen (cM) durch Rekombinationsanalye mit RFLPs, Mutanten, Phänotypen (Chrossing over bei Meisose) - gerichtete Kartierung: absolute Distanzen z.B. Chromosome walking (Arbeiten mit Banken und bekannten Sequenzen) Mutantenanalyse Noch viele Genfunktionen in Arabidopsis unbekannt Forward Genetics: von Phänotyp zum Genotyp Mutagenisierung ( Chemikalien, Strahlung, Aktivierung endogener Transposons, T-DNA) von Pflanzenmaterial => auffälliger Phänotyp => Analyse dieses Phänotyps (Kartierung, etc.) Reverse Genetics: vom Genotyp zum Phänotyp Bekannte Genstruktur wird gestört (T-DNA, Transposons, Knock-out-Kollektionen) => welcher Phänotyp zeigt sich, welche Funktion hat das Gen Transkription in Pflanzen: Promotor 5´-Codogener Strang-3´ Terminator 3´-Matrizenstrang-5´ <= wird übersetzt, RNA tritt mit 5´-Ende voran aus Promotoren: - legt Transkriptionsbeginn fest, Bindepunkt für TFs und RNA-Polymerasen - organismusabhängig - cis-Element Bakteriell: -35-BOX------- -10-BOX-------------AUG------Exons, Introns-----------UAA Archaea: TATA-BOX--------------------------------AUG------Exons, Introns-----------UAA Eukaryoten: verschiedene Promotoren, da verschiede RNA-Polymerasen Für RNA-Polymerase II: Enhancer/Silencer--GC-BOX--CAAT-BOX----TATA-BOX---AUG--Exons, Introns--UAA RNA-Polymerase I: transkribiert rRNA-Gene (5,8S, 18S, 28S)(groß, klein, groß Untereinh.), werden polycistronisch abgelesen RNA-Polymerase II: proteincod. Gene RNA-Polymerase III: Gene für 5S-rRNA (große Untereinh.), snRNA (wichtig für Spleißen), snoRNA(wichtig für Ribosomenfunktion), tRNA, scRNA, plastidäre und mitochondriale RNA-Polymerasen RNA-Polymerasen bestehen in Eukaryoten aus 10-12 Proteinuntereinheiten Zur Transkription benötigen sie Transkriptionsfaktoren (z.B. mit Transaktivatoren, Spezifitätsfaktoren, Bindeproteine) RNA-Polymerase II benötigt immer zur Initiation: -TBP (TATA-Binding-Protein) -TAF (TBP-Assoziierter-Faktor) -div. TFII A,B,D,E,F,J,H (Bindung, Helikasen, Proteinkinasen) Viele zusätzliche Faktoren notwendig: Reaktion entwicklungsspezifisch, auf äußere Reize Bsp.: Kältetoleranz in Arabidopsis Faktor ICE bindet an CBF-Gen => Expression von CBF (auch transkrfaktor.) => Aktivierung von Kältetoleranzgenen Transkriptionskontrolle durch Acetylierung und Deacetylierung Acetylierung von Lysinresten von Histonen durch HAT (Histonacetyltransferase), löst DNA von Histonen => Aktivierung Deacetylierung durch HDAC (Histondeacetylase) bindet DNA an Histone => Inhibierung von Transkription RNAP-I: benötigt TBP,TAF,UBF RNAP-III: auch TBP, bindet an C-BOX-Elemente, A-BOX-E. und G-BOX-E. Prozessierung: Spleißen: Exon----GU—Intron---AG----Exon -Schnitt bei GU => Schleifenbindung => Schnitt bei AG Mit beteiligt: snRNAs/ ca. 100 Proteine := Spleißosom snRNPs: U1, U2, U4/6, U5 5´-Capping: GPPP bindet an 5´-Ende von mRNA mit PPP am Ende =>Guanyl-Transferase spaltet PP von GPPP ab, und P von PPP => am Ende GPPP =>Guanosin-7-Methyl-Transferase hängt Methylrest an Polyadenylierung: letztes Exon--Polyadenylierungssignal—Poly-A-Site---GU-reiche-Region—Transkriptende Spezifitätsfaktor erkennt Poly-A-signal AAUAAA CFI und CFII (Endonukleasen) schneiden in Poly-A-Site => Anhängen von 200-250 As am 3´-Ende durch Poly-A-Polymerase -Schutz vor mRNA-Abbau -Transport aus dem Kern -Interaktion mit 5´-Cap => Translationsinitiation Transkriptionsuntersuchung: Northern Blot: WO in der Pflanze wird WAS, WANN, WIE STARK exprimiert: RNA-Isolierung – Auftrennen im Gel – Übertragen auf Membran – Etablierung von kovalent. Bindung mit UV-Licht – Hybridisierung mit markierter Sonde Reverse Northern Blot: DNA auf Membran fixiert – Hybridisierung mit markierter RNA-Sonde Quantitative RT-PCR: Isolierung von RNA – rev.Transkription zu cDNA – dann PCR In-Situ-Hybridisierung Sichtbarmachen von mRNA mit passender Sonde dir. im Gewebe Microarray: Oligonukleotide auf Mikroraster fixiert (repräsentieren jedes Gen) Hybridisierung mit markierter RNA/DNA Hochsensitive (hohes Rauschen) aber auch sehr schnelle Methode Promotoren: CAMV35S Nos/ocs Rbcs pinII Beta-Phaseolin Glutelin aus Cauliflower-mosaic-virus : konstitutiv, überall, stark Agrobakterium : konstitutiv, überall, schwach in Reis, Tomate : licht-induzierbar Kartoffel : wund-induz. Bohne : Samenspezifisch Reis : Endospermspezifisch CAMV35S: in fast allen Pflanzen einsetzbar -330—DomäneB(überirdisch)—DomäneA (Wurzeln)-+1 Induzierbare Systeme: Dexmethasoninduzierbar (In Arabidopsis und Tabak): (Glucocorticoid (wie auch Kortison)) CAMV35S---Markergen---CAMV35S---GVG GVG: Gal4-Bindedomäne(Hefe)---VP16 transaktivierende Domäne(viral)---GR Glucocorticoidrezeptor(Säuger) Expression als ein Protein := künstlicher Transkriptionsfaktor Dexmethason bindet an GR => Aktivierung von Bindedomäne => Bindung an Gal4-Bereich kurz vor Transgen GAL4---CAMV35S-TATA-Minimalpromotor---Gen (induzierbar) System nach gleichem Prinzip mit Östrogen statt Dexmethason Ethanolinduzierbar (Kartoffel und Tabak): CAMV35S---Markergen---CAMV35S---ALC-R Ethanol bindet an ALC-R-Transkriptionsfaktor => Bindung an palcA-Abschnitt palcA---CAMV35S-TATA-Minimalpromotor---Gen (induzierbar) Gen-Knock-Out: In Hefe und Bakterien durch homologe Rekombination In Eukaryoten: -Anti-sense -RNAi -T-DNA-Insertion, Transposons -Coexpression Gene Silencing Abwehrmechanismus gegen fremde Nukleinsäuren (Viren, Transposons,etc.) Regulation von Expression TGS Transcriptional Gene Silencing: Transkription von Genen wird gestört/verhindert; durch: -Deacetylierung von Histonen -Methylierung von DNA/ Hypermethylierungen im Promotorbereich (treten bei frisch inserierten Transgenen de novo auf) -Interaktion homologer DNA Bereiche bei Co-Suppresion => Änderungen der Chromatinstruktur (Eu zu Hetero) -Entstehungen von kleinen RNAs/und dsRNA die Methylierung von Chromatin steuern (siehe siRNA unten) PTGS Post Transcriptional Gene Silencing: RNAi bei Tieren, Quelling bei Pilzen, PTGS in Pflanzen PTGS-Mechanismus: (ssRNA + RdRP => dsRNA) dsRNA + DICER => siRNAs (ca. 21 lang, mit ca. 2 Überhang am 3´-Ende) siRNA + RISC => Aktivierung; ss-siRNA => Schneiden von Ziel-mRNA oder ss-siRNA bindet an mRNA + RdRP => mehr dsRNA (:=Verstärker-Effekt) Beschreibung der beteiligten Bestandteile: siRNA: 21-23 Nukleotide lange RNAs mit ca. 2 Nukl. Überhang am 3´-Ende DICER hat PAZ und RNAse-III-Domäne RISC: RNA-induced-silencing-complex; enthält Argonaut-Protein PAZ erkennt 3´-Überhang, kommt in DICER und Argonaut vor Argonaut-Protein: PAZ, PIWI, RNAse-H ähnliche Aktivität; an Histonmethylierung beteiligt (TGS) RdRP: RNA-abhängige-RNA-Polymerase; benutzt siRNA als Primer auf Ziel-mRNA => mehr dsRNA => stärkeres Silencing Aufgaben von siRNA: -legt Ziel-mRNA für RISC fest -RNA-abh. Methylierung von DNA (Promotorbereiche, v.a. CpG/CNG-Inseln; Promotoren akitver Gene sind nicht methyliert) und Histonen über RITS-Komplex mit HMT (Histonmethyltransferase), RdRP dazu notwendig (Deacetylierung ist Voraussetzung für Methylierung von Histonen) => aktives Euchromatin wird zu transkriptionsinaktivem Heterochromatin In Arabisdopsis 4 Dicer-like Proteine Aufbau von RNAi-Konstrukt: LB—Promotor---Markergen----Promotor—Gen---Intron---invertiertes Gen---RB =>Bildung von Haarnadel-RNA, mit dsRNA und Intron als Schleife siRNA von exogenen Faktoren beigesteuert miRNA: -im Genom codiert -deckt nur eine Region im Zielgen ab (siRNA deckt komplettes Gen ab) Im Kern: Pri-miRNA + Drosha=> pre-miRNA (immer noch als Hairpin) Im Cytoplasma: Pre-miRNA + DICER => miRNA RNA-Editing: Bei Pflanzen: In Mitochondrien und Chloroplasten Entdeckung in Pflanzen durch Abweichung im genet. Code CGG codiert normal für Arginin, in Mitochondrien für Tryptophan CGG=>TGG - Durch Editing entstehen Start und Stoppcodons - Ca. 80% der Editingereignisse verändern die AS-Sequenz - Editierung von Introns => Veränderung der räumlichen Struktur - Editierte und uneditierte mRNAs werden translatiert (aus unvollständig editierten mRNAs translatierte Proteine werden nicht genutzt sondern abgebaut) In Mitochondrien 400 Editingstellen: hauptsächlich C=>U, wenig U=>C In Chloroplasten 30: C=>U Mechanismus bei Pflanzen unbekannt: aber keine gRNA, keine Desaminasen und wohl auch keine Transaminasen => vielelicht RNA-Helikase Erste Entdeckung in Trypanosomen Einfügen vieler Us Anwesenheit von guideRNA mit Komplementarität und zusätzlichen As Editsom: Endonuklease öffnet, TUTase fügt ein, Ligase verbindet Insertions/Deletionsediting: z.B. Trypanosomen (+/-U/mRNA), Wirbeltier-Mito. (+A/mRNA,tRNA) Konversions/Substitutionsediting: z.B. Pflanzen mt/cp (C=>U/U=>C/ mRNA,tRNA,rRNA) Säugerkern (C=>U/ mRNA) Nutzung transgener Pflanzen Golden Rice Reis mit erhöhtem beta-Carotin-Gehalt Besteht Bedarf?: -Reis ist Hauptnahrungsmittel im Großteil der Welt -Vitamin A Mangel v.a. bei Kindern; hohe Kindersterblichkeit, Erblinden -geschälter Reis (nur Endosperm) enthält kein beta-Carotin, mit Schale => ranzig -Carotinoide vermindern Krebsrisiko, Herzleiden => Bedarf vorhanden Isoprenstoffwechsel: IPP(Isopentenylpyrophosphat) -> GGPP(Geranylgeranylpyrophosphat) -> Carotinoide PSY PDS+ZDS/CRTI LCY Hydrolase GGPP -> Phytoen -> Lycopen -> beta-Carotin -> Zeaxanthin Anreicherung soll in Plastiden im Endosperm geschehen, sonst Wachstumsprobleme PSY = Phytoensynthase (aus Narzisse), CRTI (bakteriell), PDS = Phytoendesaturase, LCY = Lycopencyclase in Pflanze muss rein: LB---Endospermpromotor---CRTI (bakteriell) mit rbcs (cp-targetingseq. aus Erbse/RUBISCO)---CAMV35S---PSY (Narzisse)---Sel.marker.---RB Zwei verschiedene Konstrukte verwendet: Einmal normal => Beta-Carotin und Zeaxanthin Einmal zusätzlich mit LCY => variabler Gehalt von Beta-Carotin Patentschutz: scheise…/ aber Kleinbauernlösung Weitere Maßnahmen: -höherer Gehalt an Beta-Carotin -Verwendung anderer Reissorte -Verhalten von Pflanzen unter Anbaubedingungen -weniger Übertragung von Beyond-Border-Seq. -keine Antibiotikaresistenzen als Marker mehr Bisher verwendet: Oryza sativa japonica Meistverwendete Sorte aber: Oryza sativa indica 1. Neuansatz: -Verwendung von O.s.indica -PMI (Phospho-Mannose-Isomerase) als Markersystem -Test auf Einzelintegration und Beyond-Border (South. Blot und PCR) LB---CAMV35S---PMI and. Richtung Glutelin-Promotor---PSY----CAMV35S--CRTI-mit rbcs---RB Pflanzen ohne PMI gehen auf Mannose-Nährboden ein (Mannose => Fructose) => Gehalt an Beta-Carotin bleibt unter erstem Versuch zurück 2. Neuansatz: Golden Rice 2 PSY aus Mais wird nun verwendet LB---GluPro---CRTIrbcs---Glu---PSY(Mais)---PMI---RB =>hoher Beta-Carotingehalt, im Freiland noch höher Sojabohnenanbau: ca. 60% transgen Bioplastik -abbaubar -bakterielle Synthese teuer -Anbau in Pflanzen in großem Maßstab möglich/ günstig 3-Keto-Thiolase A.CoA-Reduktase PHB-Synthetase 2xAcetyCoA AcetoacetyCoA HydroxybutyrylCoA Polyhydroxybutyrat In cps, sonst Krüppelwuchs => Verwendung von rbcs LB---35S---3Enzyme-mit-rbcs---RB Zucker/Fructan-Synthese -Saccharose wird von Kariesbakt. Verwertet -Fructan: Saccharose mit Fructose-Rest, von Kariesbakt. nicht verwertbar, kommt normal in Pilzen, Gräser, Bakterien vor (Speicherstoff) -bakterielle Fermentation teuer -Anhängen von Fructose durch 1sst (Sucrose-Sucrose-Fructyryl-Transferase) => transgene Zuckerrübe mit LB---35S---1sst---RB Fettsäurenproduktion -Mehrfach ungesätt. Fettsäuren: OMEGA-3, 6 : positive Wirkung -geringe Produktion im Mensch Linolensäure + diverse Desaturasen Mehrere Gene notwendig => funktioniert in Arabidopsis, Übertragung auf z.B. Sojabohne Stabilere Kaffepflanzen -Coffea robusta ist robuste Pflanze, enthält aber zuviel Coffein Ziel: Verringerung des Gehalts durch RNAi 3 Enzyme des Coffeinsynthesewegs werden blockiert => Coffeingehalt bei 30% des Wildtyps Aber: -Verlust von Schädlingsresistenz (Coffein) -Umstellung auf neue Art teuer -Feldversuche nötig Proteomics :=Identifiaktion und Analyse von Proteinen Humanes Genom: ca. 40.000 Gene => human. Proteom: ca. 1.000.000 Proteine Trennunsmethoden: Zentrifugation, Elektrophorese (SDS-PAGE(Denaturierung), BN(Komplexe)), Isoelektrische Fokussierung Proteintransport: Co- und posttranslational Cotra.: Am ER; SRP bindet an Signalsequenz von Protein und an ER-Membran, SRP wird frei und Protein gelangt ins ER Posttra.: alle restl.; Siganlsequenzen: Bei mt und cp: N-terminal, Peroxisom: C-terminal, Kern: internal Sektorielle Proteine: Transport in ER Golgi-app. sekretor. Versikel Golgi-app.: Aus Zisternen bestehend; Vesikelfluss, Membranweitergabe, Prozessierung von Proteinen (Glykosylierungen etc.) Vesikelbildung: GTP-abh., Coat-Proteine außen, Cargo-Proteine innen (binden TransportProt.) Vesikelfusion: v-SNARE auf Vesikel, bindet an t-SNARE an Membran, spezifisch, bilden 4 Helixbündel Fusion (Recycling von SNARE-Proteinen) Mitochondrien: TIM/TOM transportieren Proteine durch Membranen, ATP-abh., Nutzung von pH-Gradient, Chaperone beteiligt Chloroplasten: TIC/TOC “ “ “ Vorlesungsmitschrieb by: TinaColada Skript by: Sir Tobi
