Vl Gentechnologie der Pflanzen

Zusammenfassung der Vorlesung Molekularbiologie und
Gentechnologie der Pflanzen WS05/06
Die folgenden Seiten sind sicher nicht komplett (Vorlesung Entwicklungsbiologie und div.
Unterkaptitel fehlen) und auch nicht perfekt, aber sicher eine kleine Hilfe zur
Prüfungsvorbreitung. Es sind bestimmt Fehler zu finden, aber im Großen und Ganzen dürften
die Angaben stimmen. Viel Spaß damit.
Klonierung, etc.:
Vektor:
Plasmid
Phage
Cosmid
BAC
YAC
Insertkapazität:
-> 5kbp
-> 25kbp
-> 45kbp
-> 300kbp
-> 400kbp
Plasmid: natürlich in Bacteria, Archaea, Hefen: extrachromosomale DNA von 1-200kbp
Größe
Künstliche Plasmide: -> 7kbp groß, + Insert
Plasmid muss beinhalten:
-Replikon (ORI+Kontrollelemente)
-Selektionsmöglichkeiten (Antibiotikaresistenz,
Auxotrophiemarker)
-MCS (bis zu 30 verschied. Schnittstellen)
-zusätzliche Eigenschaften (Blau-weiß, etc.)
Replikons: ca. 30 verschiedene bekannt, je effektiver, desto mehr Vektorkopien
Antibiotika:
Chloramphenicol: stört 50S
Kanamycin: bindet 30S
Tetracyclin: bindet an A-Stelle (tRNA) von 30S
Erythromycin: blockiert Peptidexit am 50S
Blau-Weiß-Test:
Beta-Galactosidase
X-Gal

blau
Möglichkeiten: Alpha und Omega-Fragment
flankieren MCS: nach Insertion => Knock-out
Omega-Fragment in E.coli
Alpha-fragment in Vektor => Komplementation
Spezielle Vektoren:
Transkriptionsvektoren: mit RNA-Polymerase-Promotoren
Überexpressionsvektoren zur Proteinsynthese: mit Tags zur Detektion, Reinigung, Löslichkeit
Shuttlevektoren: ORI und Selektionsmarker für zwei Organismen: z.B. E.coli +
Saccharomyces Cerevisiae
Insert: aus Verdau und Gelelektrophorese, oder aus PCR
Klonierungstypen:
Verdau mit 1 Enzym: Blunt-end: Religation möglich, aber alk. Phosphatase benutzbar
Sticky-end: “,
Verdau mit zwei Enzymen:
blunt-sticky, sticky-sticky : “
Taq mit 3´-5´-Exonukleaseaktivität erzeugen einen A-Überhang am 3´-Ende
E.coli-Stämme mit folgenden Eigenschaften existieren: keine homolog. Rekomb.,
Deaktivierung von unspez. Endonuklease, Alpha-Komplementation, etc.
Transformationvopn E.Coli: Elektroporation, CaCl2
Selektion: Selektionsmarker, PCR
Pflanzentransformation
-Expression von (Fremd)Gen:
- Resistenzen (Herbizide, etc.)
- Stoffwechselmanipulation (+Vitamine, etc.)
- Molecular Farming (Antikörper, etc.)
- getagte Proteine: Lokalisation, Funktion
-Gene-Knock-out:
- Untersuchung von Genfunktion
- Anti-sense, RNAi, T-DNA, Knock-out-libraries
-Promotor-Reportergen-Fusion:
- Untersuchung von Promotoren (wo, wann, wie stark)
- Reportergene: GFP, Luciferase, beta-glucoronidase
Probleme:
- multizelluläre Organismen
- keine homologe Rekombination bei Fremd DNA-Insertion
Expression entwicklungspezifisch, in welchem Kompartiment, gering/stark
- Insertion von T-DNA zufällig
Strategie:
- Vektorwahl - Klonierungsstrategie - Pflanzenmaterialwahl - stabil/transient
- Trafomethode
Transformationsmethoden :
Agrobacterium tumefaciens: Explantate, Protoplasten
Vakuuminfiltration/Floral Dip: Blütenstände unter Vakuum in Agro-lösung, Samen nutzen
Partikel-Kanone: Explantate
PVX (Virus): ges. Pflanzen
PEG, Elektroporation, Liposomen, Mikroinjektion: Protoplasten
Blatt + Pectinase => Zellen, + Cellulase => Protoplasten, + Auxin => Kallus, + Cytokinin =>
Sproß
Dir. Trafo.: Vektor mit:
(Partikelk., Elporat., etc.)
- ORI von E.coli, Selektionsmarker für E.coli
- cis-Elemente (Promotor) für Pflanze, Sel.mark. für
Pflanze
Indir. Trafo: Vektor mit:
(Mit Agro)
- ORI von E.coli, Selektionsmarker für E.coli
- ORI von Agrobac., Selektionsmarker für Agorbac., TDNA-Elemente
-cis-Elemente (Promotor) für Pflanze, Sel.mark. für
Pflanze
Agrobacterium tumefaciens:
Ti-Plasmid (tumor-inducing) enthält: VIR-Gene, LB, Auxin-Gene, Cytokinin-Gene, OpinGene, RB, Opin-Katabolismus-Gene, ORI
Größe: ca. 200kbp, davon T-DNA: 23kbp
Ablauf:
Phenol aktiviert VIR-A und VIR-G => Induktion weiterer VIR-Gene
Endonukleasen VIR-D1 und VIR-D2 schneiden ssT-DNA von T-DNA aus
ssT-DNA+VIR-D1+VIR-E2 bilden nuklease-resistenten Komplex
VIR-B1,2,5,7,9 bilden Kanal und Pilus zur Pflanzenzelle
VIR-D2 und VIR-E2 mit Signalsequenz für Kern => Transport in Nukleus
ssT-DNA => dsT-DNA => Integration in Genom, VIR-Prot. mit Ligase-aktivität (VIR-D)
=> Nutzung pro- und eukaryotischer Mechanismen
Zur Transformation mit Agro.:
Nur notwendig: VIR-Gene, LB, Fremdgene, RB, ORI
Und: ORI von E.coli, Selektionsmarker für beide Bakterien, Markergen für Pflanze
->Cointegrativer Vektor
Binäres Vektorsystem:
In Agrobact. schon vorhanden:
Helfer-Plasmid mit VIR-Genen,
ORI für Agro., sel-mark für Agro
in E-coli:
Plasmid mit T-DNA, ORI für E.coli +
agro, sel.marker,
Ablauf: Vermehrung von T-DNA-Konstrukt in E-coli => Transformation in Agro =>
Transformation von Pflanzenmaterial
Nachweis von erfolgreichem Gentransfer:
- Resistenzen
- PCR auf T-DNA und Beyond border kontrolle
DNA-Sonde auf single-integration
- Reportergen
- Southern-Blot mit T-
Transformation von Organellen mit Partikelkanonen (Vorsicht Rückstoß! Gut arettieren)
Kultursysteme:
Kalluskulturen: Hormongabe zur Ausdifferenzierung, Auxin, dann Cytokinin
Suspensionskulturen: “
Pflanzengenome:
Gentransfer: von Kern in Mitos
von Mitos in Kern
von Plast in Kern und Mitos (tRNA)
Transfer von Proteinen, Signalen, Stoffwechselprod., etc. von allem zu allem
Kern-Genom
Mensch: 3500mbp
Mais 3000mbp
E-coli: 4000kbp
Arabidopsis: 120mbp
Weizen 16000mbp (hexaploid)
Arabidopsis thaliana: -diploid - ca. 20000 Gene
Unikale Sequenzen: Strukturgene
Mittelrepetitive Sequenzen: rRNA-Gene, Transposons,
Hochrepetitive Sequenzen: Satelliten-DNA
Plastom:
Je Zelle ca. 50 Plastiden, in jedem Plastid ca. 20 Nukleoide, jedes Nukleoid mit ca. 100 DNAMolekülen => polyploid, 80% Gene
Runde Struktur, 150kbp groß, 120 Gene, hoher Selektionsdruck, kaum repet. Seq.
Rekombination in Zirkeln: Änderung der Genrichtung, Genanordnung
Gene: - Proteinbiosynthese (plastidencod. RNA-Polymerase, r-Proteine, rRNA,etc.)
- Photosynthese (RUBICSO (nicht komplett), ATP-Synthase, etc., NADHDehydrogenase, etc.)
Gene => polycistronische Transkripte => Prozessierung, Spleißen, Editing,
Dazu kerncodierte Exo-, Endonukleasen notwendig
Chondriom:
Polyploid, 200-500kbp, verschieden große Ringe, viel nicht codierendes Material,
Repeats und inverted repeats von rRNA-Genen => unterschiedl. Molekülen
Nur 10% Gene,
Gene: - rRNA, tRNA, r-Proteine
- Cytochrom b/c, ATP-Synthase, NADH-Dehydrogenase
Gene => Prozessierung, Spleißen, (auch Trans-Spleißen) Editing,
In Plastom keine Transposons, konserviert, 80% Gene, 120 Stück, 150kbp
In Chondriom 4% Transposons, dynamisch, 10% Gene, …Stück, 200-500kbp
In beiden Organellentypen keine Histone, runde Struktur => Bakteriell
In Nukleus, 10% Transposons, dynamisch, …% Gene, ….., 145Mbp
Anteil repet. Gene und Transposons bei 40%
Hier: Histone, Chromosomen => eukaryot
Genomics:
Zerlegung von Genom in kleinere Fragmente: Verwendung von Vektoren
Erstellung von Genbanken mit verschiedensten Vektoren: Genombanken,
Transkriptombanken (cDNA-Banken)
Sequenzierung des Genoms:
- Schrotschussprinzip: Zufällige Zerlegung des Genoms in kleinere Fragmente
=> Sanger-Sequenzierung, Analyse am Computer
Gerichtete Analyse:
- genetische Kartierung: relative Distanzen (cM) durch Rekombinationsanalye
mit RFLPs, Mutanten, Phänotypen (Chrossing over bei Meisose)
- gerichtete Kartierung: absolute Distanzen z.B. Chromosome walking
(Arbeiten mit Banken und bekannten Sequenzen)
Mutantenanalyse
Noch viele Genfunktionen in Arabidopsis unbekannt
Forward Genetics: von Phänotyp zum Genotyp
Mutagenisierung ( Chemikalien, Strahlung, Aktivierung endogener Transposons, T-DNA)
von Pflanzenmaterial => auffälliger Phänotyp => Analyse dieses Phänotyps (Kartierung, etc.)
Reverse Genetics: vom Genotyp zum Phänotyp
Bekannte Genstruktur wird gestört (T-DNA, Transposons, Knock-out-Kollektionen) =>
welcher Phänotyp zeigt sich, welche Funktion hat das Gen
Transkription in Pflanzen:
Promotor
5´-Codogener Strang-3´ Terminator
3´-Matrizenstrang-5´
<= wird übersetzt, RNA tritt mit 5´-Ende
voran aus
Promotoren: - legt Transkriptionsbeginn fest, Bindepunkt für TFs und RNA-Polymerasen
- organismusabhängig
- cis-Element
Bakteriell: -35-BOX------- -10-BOX-------------AUG------Exons, Introns-----------UAA
Archaea: TATA-BOX--------------------------------AUG------Exons, Introns-----------UAA
Eukaryoten:
verschiedene Promotoren, da verschiede RNA-Polymerasen
Für RNA-Polymerase II:
Enhancer/Silencer--GC-BOX--CAAT-BOX----TATA-BOX---AUG--Exons, Introns--UAA
RNA-Polymerase I: transkribiert rRNA-Gene (5,8S, 18S, 28S)(groß, klein, groß Untereinh.),
werden polycistronisch abgelesen
RNA-Polymerase II: proteincod. Gene
RNA-Polymerase III: Gene für 5S-rRNA (große Untereinh.), snRNA (wichtig für Spleißen),
snoRNA(wichtig für Ribosomenfunktion), tRNA, scRNA,
plastidäre und mitochondriale RNA-Polymerasen
RNA-Polymerasen bestehen in Eukaryoten aus 10-12 Proteinuntereinheiten
Zur Transkription benötigen sie Transkriptionsfaktoren (z.B. mit Transaktivatoren,
Spezifitätsfaktoren, Bindeproteine)
RNA-Polymerase II benötigt immer zur Initiation: -TBP (TATA-Binding-Protein)
-TAF (TBP-Assoziierter-Faktor)
-div. TFII A,B,D,E,F,J,H (Bindung,
Helikasen, Proteinkinasen)
Viele zusätzliche Faktoren notwendig: Reaktion entwicklungsspezifisch, auf äußere Reize
Bsp.: Kältetoleranz in Arabidopsis
Faktor ICE bindet an CBF-Gen => Expression von CBF (auch transkrfaktor.) => Aktivierung
von Kältetoleranzgenen
Transkriptionskontrolle durch Acetylierung und Deacetylierung
Acetylierung von Lysinresten von Histonen durch HAT (Histonacetyltransferase), löst DNA
von Histonen => Aktivierung
Deacetylierung durch HDAC (Histondeacetylase) bindet DNA an Histone => Inhibierung von
Transkription
RNAP-I: benötigt TBP,TAF,UBF
RNAP-III: auch TBP, bindet an C-BOX-Elemente, A-BOX-E. und G-BOX-E.
Prozessierung:
Spleißen: Exon----GU—Intron---AG----Exon
-Schnitt bei GU => Schleifenbindung => Schnitt bei AG
Mit beteiligt: snRNAs/ ca. 100 Proteine := Spleißosom
snRNPs: U1, U2, U4/6, U5
5´-Capping: GPPP bindet an 5´-Ende von mRNA mit PPP am Ende
=>Guanyl-Transferase spaltet PP von GPPP ab, und P von PPP => am Ende GPPP
=>Guanosin-7-Methyl-Transferase hängt Methylrest an
Polyadenylierung:
letztes Exon--Polyadenylierungssignal—Poly-A-Site---GU-reiche-Region—Transkriptende
Spezifitätsfaktor erkennt Poly-A-signal AAUAAA
CFI und CFII (Endonukleasen) schneiden in Poly-A-Site => Anhängen von 200-250 As am
3´-Ende durch Poly-A-Polymerase
-Schutz vor mRNA-Abbau
-Transport aus dem Kern
-Interaktion mit 5´-Cap => Translationsinitiation
Transkriptionsuntersuchung:
Northern Blot: WO in der Pflanze wird WAS, WANN, WIE STARK exprimiert:
RNA-Isolierung – Auftrennen im Gel – Übertragen auf Membran – Etablierung von kovalent.
Bindung mit UV-Licht – Hybridisierung mit markierter Sonde
Reverse Northern Blot:
DNA auf Membran fixiert – Hybridisierung mit markierter RNA-Sonde
Quantitative RT-PCR:
Isolierung von RNA – rev.Transkription zu cDNA – dann PCR
In-Situ-Hybridisierung
Sichtbarmachen von mRNA mit passender Sonde dir. im Gewebe
Microarray:
Oligonukleotide auf Mikroraster fixiert (repräsentieren jedes Gen)
Hybridisierung mit markierter RNA/DNA
Hochsensitive (hohes Rauschen) aber auch sehr schnelle Methode
Promotoren:
CAMV35S
Nos/ocs
Rbcs
pinII
Beta-Phaseolin
Glutelin
aus Cauliflower-mosaic-virus : konstitutiv, überall, stark
Agrobakterium
: konstitutiv, überall, schwach
in Reis, Tomate
: licht-induzierbar
Kartoffel
: wund-induz.
Bohne
: Samenspezifisch
Reis
: Endospermspezifisch
CAMV35S: in fast allen Pflanzen einsetzbar
-330—DomäneB(überirdisch)—DomäneA (Wurzeln)-+1
Induzierbare Systeme:
Dexmethasoninduzierbar (In Arabidopsis und Tabak):
(Glucocorticoid (wie auch Kortison))
CAMV35S---Markergen---CAMV35S---GVG
GVG: Gal4-Bindedomäne(Hefe)---VP16 transaktivierende Domäne(viral)---GR
Glucocorticoidrezeptor(Säuger)
Expression als ein Protein := künstlicher Transkriptionsfaktor
Dexmethason bindet an GR => Aktivierung von Bindedomäne => Bindung an Gal4-Bereich
kurz vor Transgen
GAL4---CAMV35S-TATA-Minimalpromotor---Gen (induzierbar)
System nach gleichem Prinzip mit Östrogen statt Dexmethason
Ethanolinduzierbar (Kartoffel und Tabak):
CAMV35S---Markergen---CAMV35S---ALC-R
Ethanol bindet an ALC-R-Transkriptionsfaktor => Bindung an palcA-Abschnitt
palcA---CAMV35S-TATA-Minimalpromotor---Gen (induzierbar)
Gen-Knock-Out:
In Hefe und Bakterien durch homologe Rekombination
In Eukaryoten:
-Anti-sense -RNAi
-T-DNA-Insertion, Transposons
-Coexpression
Gene Silencing
Abwehrmechanismus gegen fremde Nukleinsäuren (Viren, Transposons,etc.)
Regulation von Expression
TGS
Transcriptional Gene Silencing:
Transkription von Genen wird gestört/verhindert; durch:
-Deacetylierung von Histonen
-Methylierung von DNA/ Hypermethylierungen im Promotorbereich (treten bei frisch
inserierten Transgenen de novo auf)
-Interaktion homologer DNA Bereiche bei Co-Suppresion => Änderungen der
Chromatinstruktur (Eu zu Hetero)
-Entstehungen von kleinen RNAs/und dsRNA die Methylierung von Chromatin steuern (siehe
siRNA unten)
PTGS
Post Transcriptional Gene Silencing:
RNAi bei Tieren, Quelling bei Pilzen, PTGS in Pflanzen
PTGS-Mechanismus:
(ssRNA + RdRP => dsRNA)
dsRNA + DICER => siRNAs (ca. 21 lang, mit ca. 2 Überhang am 3´-Ende)
siRNA + RISC => Aktivierung; ss-siRNA => Schneiden von Ziel-mRNA
oder ss-siRNA bindet an mRNA + RdRP => mehr dsRNA (:=Verstärker-Effekt)
Beschreibung der beteiligten Bestandteile:
siRNA: 21-23 Nukleotide lange RNAs mit ca. 2 Nukl. Überhang am 3´-Ende
DICER hat PAZ und RNAse-III-Domäne
RISC: RNA-induced-silencing-complex; enthält Argonaut-Protein
PAZ erkennt 3´-Überhang, kommt in DICER und Argonaut vor
Argonaut-Protein: PAZ, PIWI, RNAse-H ähnliche Aktivität; an Histonmethylierung beteiligt
(TGS)
RdRP: RNA-abhängige-RNA-Polymerase; benutzt siRNA als Primer auf Ziel-mRNA =>
mehr dsRNA => stärkeres Silencing
Aufgaben von siRNA:
-legt Ziel-mRNA für RISC fest
-RNA-abh. Methylierung von DNA (Promotorbereiche, v.a. CpG/CNG-Inseln; Promotoren
akitver Gene sind nicht methyliert) und Histonen über RITS-Komplex mit HMT
(Histonmethyltransferase), RdRP dazu notwendig (Deacetylierung ist Voraussetzung für
Methylierung von Histonen) => aktives Euchromatin wird zu transkriptionsinaktivem
Heterochromatin
In Arabisdopsis 4 Dicer-like Proteine
Aufbau von RNAi-Konstrukt:
LB—Promotor---Markergen----Promotor—Gen---Intron---invertiertes Gen---RB
=>Bildung von Haarnadel-RNA, mit dsRNA und Intron als Schleife
siRNA von exogenen Faktoren beigesteuert
miRNA: -im Genom codiert
-deckt nur eine Region im Zielgen ab (siRNA deckt komplettes Gen ab)
Im Kern: Pri-miRNA + Drosha=> pre-miRNA (immer noch als Hairpin)
Im Cytoplasma: Pre-miRNA + DICER => miRNA
RNA-Editing:
Bei Pflanzen:
In Mitochondrien und Chloroplasten
Entdeckung in Pflanzen durch Abweichung im genet. Code
CGG codiert normal für Arginin,
in Mitochondrien für Tryptophan CGG=>TGG
- Durch Editing entstehen Start und Stoppcodons
- Ca. 80% der Editingereignisse verändern die AS-Sequenz
- Editierung von Introns => Veränderung der räumlichen Struktur
- Editierte und uneditierte mRNAs werden translatiert (aus unvollständig editierten mRNAs
translatierte Proteine werden nicht genutzt sondern abgebaut)
In Mitochondrien 400 Editingstellen: hauptsächlich C=>U, wenig U=>C
In Chloroplasten 30: C=>U
Mechanismus bei Pflanzen unbekannt: aber keine gRNA, keine Desaminasen und wohl auch
keine Transaminasen => vielelicht RNA-Helikase
Erste Entdeckung in Trypanosomen
Einfügen vieler Us
Anwesenheit von guideRNA mit Komplementarität und zusätzlichen As
Editsom: Endonuklease öffnet, TUTase fügt ein, Ligase verbindet
Insertions/Deletionsediting: z.B. Trypanosomen (+/-U/mRNA), Wirbeltier-Mito.
(+A/mRNA,tRNA)
Konversions/Substitutionsediting: z.B. Pflanzen mt/cp (C=>U/U=>C/ mRNA,tRNA,rRNA)
Säugerkern (C=>U/ mRNA)
Nutzung transgener Pflanzen
Golden Rice
Reis mit erhöhtem beta-Carotin-Gehalt
Besteht Bedarf?:
-Reis ist Hauptnahrungsmittel im Großteil der Welt
-Vitamin A Mangel v.a. bei Kindern; hohe Kindersterblichkeit,
Erblinden
-geschälter Reis (nur Endosperm) enthält kein beta-Carotin, mit Schale
=> ranzig
-Carotinoide vermindern Krebsrisiko, Herzleiden
=> Bedarf vorhanden
Isoprenstoffwechsel:
IPP(Isopentenylpyrophosphat) -> GGPP(Geranylgeranylpyrophosphat) -> Carotinoide
PSY
PDS+ZDS/CRTI
LCY
Hydrolase
GGPP -> Phytoen
->
Lycopen -> beta-Carotin -> Zeaxanthin
Anreicherung soll in Plastiden im Endosperm geschehen, sonst Wachstumsprobleme
PSY = Phytoensynthase (aus Narzisse), CRTI (bakteriell),
PDS = Phytoendesaturase, LCY = Lycopencyclase
in Pflanze muss rein:
LB---Endospermpromotor---CRTI (bakteriell) mit rbcs (cp-targetingseq. aus
Erbse/RUBISCO)---CAMV35S---PSY (Narzisse)---Sel.marker.---RB
Zwei verschiedene Konstrukte verwendet:
Einmal normal => Beta-Carotin und Zeaxanthin
Einmal zusätzlich mit LCY => variabler Gehalt von Beta-Carotin
Patentschutz: scheise…/ aber Kleinbauernlösung
Weitere Maßnahmen: -höherer Gehalt an Beta-Carotin
-Verwendung anderer Reissorte
-Verhalten von Pflanzen unter Anbaubedingungen
-weniger Übertragung von Beyond-Border-Seq.
-keine Antibiotikaresistenzen als Marker mehr
Bisher verwendet: Oryza sativa japonica
Meistverwendete Sorte aber: Oryza sativa indica
1. Neuansatz:
-Verwendung von O.s.indica
-PMI (Phospho-Mannose-Isomerase) als Markersystem
-Test auf Einzelintegration und Beyond-Border (South. Blot und PCR)
LB---CAMV35S---PMI
and. Richtung Glutelin-Promotor---PSY----CAMV35S--CRTI-mit rbcs---RB
Pflanzen ohne PMI gehen auf Mannose-Nährboden ein (Mannose => Fructose)
=> Gehalt an Beta-Carotin bleibt unter erstem Versuch zurück
2. Neuansatz: Golden Rice 2
PSY aus Mais wird nun verwendet
LB---GluPro---CRTIrbcs---Glu---PSY(Mais)---PMI---RB
=>hoher Beta-Carotingehalt, im Freiland noch höher
Sojabohnenanbau: ca. 60% transgen
Bioplastik
-abbaubar
-bakterielle Synthese teuer
-Anbau in Pflanzen in großem Maßstab möglich/ günstig
3-Keto-Thiolase
A.CoA-Reduktase
PHB-Synthetase
2xAcetyCoA AcetoacetyCoA  HydroxybutyrylCoA  Polyhydroxybutyrat
In cps, sonst Krüppelwuchs => Verwendung von rbcs
LB---35S---3Enzyme-mit-rbcs---RB
Zucker/Fructan-Synthese
-Saccharose wird von Kariesbakt. Verwertet
-Fructan: Saccharose mit Fructose-Rest, von Kariesbakt. nicht verwertbar,
kommt normal in Pilzen, Gräser, Bakterien vor (Speicherstoff)
-bakterielle Fermentation teuer
-Anhängen von Fructose durch 1sst (Sucrose-Sucrose-Fructyryl-Transferase)
=> transgene Zuckerrübe mit
LB---35S---1sst---RB
Fettsäurenproduktion
-Mehrfach ungesätt. Fettsäuren: OMEGA-3, 6 : positive Wirkung
-geringe Produktion im Mensch
Linolensäure + diverse Desaturasen
Mehrere Gene notwendig => funktioniert in Arabidopsis, Übertragung auf z.B. Sojabohne
Stabilere Kaffepflanzen
-Coffea robusta ist robuste Pflanze, enthält aber zuviel Coffein
Ziel: Verringerung des Gehalts durch RNAi
3 Enzyme des Coffeinsynthesewegs werden blockiert
=> Coffeingehalt bei 30% des Wildtyps
Aber:
-Verlust von Schädlingsresistenz (Coffein)
-Umstellung auf neue Art teuer
-Feldversuche nötig
Proteomics
:=Identifiaktion und Analyse von Proteinen
Humanes Genom: ca. 40.000 Gene => human. Proteom: ca. 1.000.000 Proteine
Trennunsmethoden:
Zentrifugation, Elektrophorese (SDS-PAGE(Denaturierung), BN(Komplexe)), Isoelektrische
Fokussierung
Proteintransport:
Co- und posttranslational
Cotra.: Am ER; SRP bindet an Signalsequenz von Protein und an ER-Membran, SRP wird
frei und Protein gelangt ins ER
Posttra.: alle restl.;
Siganlsequenzen: Bei mt und cp: N-terminal, Peroxisom: C-terminal, Kern: internal
Sektorielle Proteine:
Transport in ER  Golgi-app.  sekretor. Versikel
Golgi-app.: Aus Zisternen bestehend; Vesikelfluss, Membranweitergabe, Prozessierung von
Proteinen (Glykosylierungen etc.)
Vesikelbildung: GTP-abh., Coat-Proteine außen, Cargo-Proteine innen (binden TransportProt.)
Vesikelfusion: v-SNARE auf Vesikel, bindet an t-SNARE an Membran, spezifisch, bilden 4
Helixbündel  Fusion (Recycling von SNARE-Proteinen)
Mitochondrien: TIM/TOM transportieren Proteine durch Membranen, ATP-abh., Nutzung
von pH-Gradient, Chaperone beteiligt
Chloroplasten: TIC/TOC “ “ “
Vorlesungsmitschrieb by: TinaColada
Skript by: Sir Tobi