Structural characterization of Arabidopsis thaliana ethylene

Structural characterization of Arabidopsis thaliana
ethylene signaling molecules and the non-ribosomal
peptide synthetase from Planktothrix agardhii
DISSERTATION
in fulfilment of the requirements for the degree “Dr. rer. nat.”
of the Faculty of Mathematics and Natural Sciences
at Kiel University
Submitted by
Heidi Kaljunen
Kiel, 2014
First referee:
Prof. Dr. Axel J. Scheidig
Second referee:
Prof. Dr. Frank Sönnichsen
Date of the oral examination:
12.12.2014
Approved for publication:
12.12.2014
Signed: Prof. Dr. Wolfgang J. Duschl, Dean
2
ZUSAMMENFASSUNG
Pflanzen nutzen ein komplexes Signalweiterleitungsnetzwerk zur Regulierung von
Entwicklungsprozessen und zur Reaktion auf umweltbedingte und biologische Belastungen.
Ethylen ist ein Schlüsselhormon in der Kontrolle dieses Netzwerks, weshalb es zusammen mit
seinem Signalweg Objekt jahrzehntelanger intensiver Untersuchungen wurde. Im Modellsystem
Arabidopsis thaliana wird das Hormon von einer Gruppe aus fünf Rezeptoren (ETR1, ERS1,
ETR2, ERS2 und EIN4) erkannt, die den Sensorhistidinkinasen bakterieller zwei-komponenten
Systeme ähneln. Hauptziel dieser Arbeit war die Expression und Reinigung des gesamten ETR1 zur
strukturellen Untersuchung, um einen Einblick in die ersten Schritte der Ethylensignalisierung zu
erhalten. Der vollständige ETR1 wurde erfolgreich im Baculovirussystem exprimiert, die Isolation
des Rezeptors aus der Membran gelang allerdings nicht. Zuätzlich zum vollständigen ETR1 wurde
die zytosolische Domäne des Rezeptors mit Hilfe der Kleinwinkelstreuung untersucht. Das
entsprechende SAXS Modell war wie erwartet ein Dimer.
EDR1 aus A. thaliana ist eine CTR1- ähnliche MAPKKK, die Resistenzen, Zelltod und
ethyleninduzierte Seneszenz reguliert. Es besteht aus einer N-terminalen Regulationsdomäne und
einer katalytischen C-terminalen Domäne mit Ser/Thr Kinaseaktivität. Da gezeigt wurde, dass
EDR1 trans autophosphoryliert, sollte dieser Mechanismus röntgenkristallographisch untersucht
werden. Die Kristallstruktur der katalytischen Domäne von EDR1 (EDR1-D792N) zusammen mit
dem ATP-Analogon AMPPNP wurde gelöst. Die asymmetrische Einheit enthält 2 Moleküle, wovon
eines überraschenderweise in der aktiven Konformation vorlag. Außerdem formt das aktive EDR1D792N einen trans-autophosphorylierenden Komplex mit dem inaktiven Monomer einer
benachbarten asymmetrischen Einheit.
Zusätzlich zum pflanzlichen Abwehrmechanismus wurde die Adenylierungsdomäne der
cyanobakteriellen nicht-ribosomalen Peptidsynthetase (non-ribosomal peptide synthetase, NRPS)
untersucht. NRPS sind große Multidomänenenzyme, die in einer Reihe von Pilzen und bakterieller
Spezies vorkommen und den ribosomenunabhängigen Aufbau biologisch aktiver Peptide
unterschiedlicher Zusammensetzung und Funktion katalysieren. Die A-Domäne spielt eine zentrale
Rolle in den NRPS, da sie die Aminosäure erkennt und aktiviert, die in das wachsende Peptid
eingebaut wird. Die A-Domäne ApnA A1 aus Planktothrix agardhii der Anabaenopeptinsynthetase
is ein aufschlussreicher Vertreter seiner Klasse, da es die außergewöhnliche Fähigkeit besitzt zwei
sehr
unterschiedliche
Aminosäuren
(Arginin
und
Tyrosin)
zu
aktivieren.
Strukturelle
Untersuchungen zur Klärung der doppelten Spezifität wurden durchgeführt. Basierend auf
Strukturen der ApnA A1 wurden 2 Reste des aktiven Zentrums identifiziert, die eine zentrale Rolle
bei der Substratbindung spielen. Mutation dieser Reste resultierte in Enzymvarianten, die entweder
für Tyrosin oder Arginin mono-spezifisch waren, oder in einigen Fällen in der Lage waren LTryptophan zu aktivieren. Außerdem konnten einige ApnA A1 Mutanten unnatürliche Aminosäuren
(4-Fluorophenylalanin und 4-Azidophenylalanin) aktivieren. Ein Peptidprodukt mit einer
eingebauten unnatürliche Aminosäuren könnte für industrielle oder pharmazeutische Anwendungen
nützlich sein.
ABSTRACT
Plants employ a complex network of signaling pathways to regulate developmental
processes and to mediate the responses to both environmental and biological stress factors. Ethylene
is one of the key plant hormones involved in controlling this network, which has made it and its
signaling pathway a target of intense research for several decades. In the model plant Arabidopsis
thaliana, the plant hormone is detected by a group of five receptors (ETR1, ERS1, ETR2, ERS2
and EIN4) that resemble the sensor histidine kinases of bacterial two-component system. The main
aim in this thesis study was the expression and purification of the full-length ETR1 for structural
studies to gain insights into the initial steps in ethylene signaling. The FL ETR1 was successfully
expressed in baculovirus expression vector system but the isolation of the receptor from the
membrane was hampered. In addition to the FL ETR1, the cytosolic portion of the receptor was
studied using Small Angle X-ray Scattering. The resulting SAXS model had the expected dimeric
arrangement.
EDR1 from A. thaliana is a CTR1-like MAPKKK that is involved in regulating disease
resistance responses, cell death and also ethylene-induced senescence. It possesses an N-terminal
regulatory domain and C-terminal catalytic domain wit Ser/Thr kinase activity. As EDR1 has been
shown to autophosphorylate in trans, the mechanism of this was studied using X-ray
crystallography. A crystal structure for the catalytically inactive kinase domain of EDR1 (EDR1D792N) was obtained in the presence of the ATP substrate analog AMP-PNP. The asymmetric unit
contained two molecules, one of which surprisingly was in an active-like conformation.
Furthermore, the active-like EDR1-D792N molecule was found to form an authentic transautophosphorylation complex with the inactive monomer from the adjacent asymmetric unit.
In addition to the plant defense signaling proteins, an adenylation (A) domain from
cyanobacterial non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) was studied. NRPSs are large
multidomain enzymes that are found from a number of fungal and bacterial species and catalyze the
ribosome-independent assembly of biologically active peptides with diverse composition and
function. The A domain plays a central role in the NRPS system as it recognizes and activates the
amino acid, which is incorporated into the growing peptide. The A domain ApnA A1 from the
Anabaenopeptin synthetase of Planktothrix agardhii is an interesting member of its class as it has
an unusual ability to activate two very distinct amino acids (arginine and tyrosine). Structural
studies on this enzyme were performed to elucidate its bi-specificity. Based on the solved ApnA A1
structures, two active site residues with a crucial role in the substrate binding were identified. The
mutation of these residues led to enzyme variants, which were mono-specific for either tyrosine or
arginine, or in some instances were able to activate L-tryptophan. Additionally a number of ApnA
A1 mutants were shown to activate unnatural amino acids (4-fluorophenylalanine and 4azidophenylalanine). A final peptide product with an unnatural amino acid incorporated, could
possibly have useful industrial or pharmaceutical applications.