Abkürzungen

Das plastidäre Rieske Fe/S-Protein:
Analyse des Transport- und Assemblierungsprozesses
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt der
Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät
(mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich)
der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
von Frau Sabine Molik
geb. am: 19. August 1976 in: Halberstadt
Gutachter:
1. Prof. Dr. Ralf Bernd Klösgen
2. Prof. Dr. Roland Freudl
Halle (Saale), 26. April 2005
urn:nbn:de:gbv:3-000008353
[http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv%3A3-000008353]
I
Abkürzungen ..................................................................................................................IV
1
Einleitung & Problemstellung.................................................... 1
2
Material & Methoden .................................................................. 9
2.1 Material.....................................................................................................9
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
2.1.6
2.1.7
2.1.8
2.1.9
2.1.10
2.1.11
2.1.12
Chemikalien .........................................................................................................9
Enzyme.................................................................................................................9
Reaktionskits ........................................................................................................9
Längenstandards/Marker......................................................................................9
Antibiotika..........................................................................................................10
Kulturmedien......................................................................................................10
Nukleinsäuren und Oligonukleotide...................................................................10
Bakterienstämme und Vektoren .........................................................................11
cDNA-Klone ......................................................................................................11
Antikörper ..........................................................................................................12
Säulenmaterial und Membranen.........................................................................13
Pflanzenmaterial.................................................................................................13
2.2 Methoden ...............................................................................................13
Molekularbiologische Methoden
2.2.1 In vitro-Synthese von Proteinen.........................................................................14
2.2.2 Mutagenese der TPP-Schnittstelle in den Konstrukten 16/Ri-h und 33/Ri-h ....15
2.2.3 Klonierung der AtNFU2-cDNA.........................................................................16
2.2.4 Erstellung der Rieske-Konstrukte zur Expression in Arabidopsis thaliana.......17
Biochemische Methoden
2.2.5 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE).........................................19
2.2.6 Färbung von Proteinen .......................................................................................20
2.2.7 Native Auftrennung von Membranproteinkomplexen: Blue native-PAGE .......21
2.2.8 Auftrennung löslicher Proteinkomplexe des Stromas........................................23
2.2.9 Auftrennung von Proteinkomplexen in der zweiten Dimension (2D) ...............23
2.2.10 Western-Analyse ................................................................................................24
2.2.11 Co-Immunpräzipitation ......................................................................................25
2.2.12 Versuche mit rekonstituiertem IscA1 aus Synechocystis ...................................26
Pflanzliche Methoden
2.2.13 Gewinnung von Proteinfraktionen aus Arabidopsis-Pflanzenmaterial ..............28
2.2.14 Isolierung von Chloroplasten aus Arabidopsis thaliana ....................................28
2.2.15 Behandlung von Arabidopsis-Proteinfraktionen................................................30
2.2.16 Reinigung des Rieske-KKHA-Proteins aus Arabidopsis-Pflanzenextrakten.......30
2.2.17 Isolierung von Chloroplasten aus Spinacia oleracea (Spinat) ...........................31
2.2.18 Importreaktion mit Spinatchloroplasten (in organello-Ansatz) .........................32
2.2.19 Isolierung von Chloroplasten aus Pisum sativum (Erbse)..................................33
2.2.20 Isolierung von Erbsenthylakoiden......................................................................34
2.2.21 Importreaktion mit Erbsenthylakoiden (in thylakoido-Ansatz) .........................34
2.2.22 Erstellung und Selektion transgener Arabidopsis-Pflanzen ...............................35
II
3
Ergebnisse................................................................................ 37
3.1 Transporteigenschaften des Rieske Fe/S-Proteins............................37
3.1.1 Das Transportverhalten des Rieske Fe/S-Proteins in vivo und in vitro..............37
3.1.2 Das Rieske-Thylakoidtransportsignal und die Assemblierung in
Membrankomplexe.............................................................................................41
3.1.2.1
3.1.2.2
3.1.2.3
3.1.2.4
Besonderheiten des Rieske-Thylakoidtransportsignals .............................................................. 41
Der Austausch des Rieske-Membranankers und die Veränderung der TPP-Schnittstelle.......... 44
Import- und Assemblierungsverhalten der chimären Rieske-Proteine ....................................... 45
Versuche zur Identifizierung der BN-Gel-Komplexe................................................................. 54
3.1.3
Der Einfluß der luminalen Rieske-Domäne auf den Transportprozeß...............59
3.1.3.1 Blockierung des Thylakoidtransports ......................................................................................... 59
3.1.3.2 Das Transportverhaltne der Fe/S-Ligandenmutanten ................................................................. 62
3.1.3.3 Die Analyse des 440 kDa-Kompkexes ....................................................................................... 66
3.2 Kandidaten der plastidären Fe/S-Cluster-Assemblierungsmaschinerie (ISC) ..................................................................................71
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.2.6
Die Basis zur Identifizierung der ISC-Kandidaten ............................................72
Identifizierung der ISC-Kandidaten ...................................................................75
Importverhalten der ISC-Kandidaten .................................................................78
Komplexe der ISC-Kandidaten im Stroma ........................................................82
Interaktionen der ISC-Kandidaten mit dem Rieske-Protein ..............................86
Das IscA1-Protein aus Synechocystis.................................................................89
3.3 Die Suche nach stromalen Rieske-Interaktionspartnern ...................93
3.3.1 Die Expression mutierter Rieske-Proteine aus Spinat in Synechocystis ............94
3.3.1.1 Das Rieske-KK-Protein .............................................................................................................. 94
3.3.1.2 Der Einfluß des HA-Peptids auf Transport und Assemblierung des Rieske-Proteins ................ 95
3.3.1.3 Expression von Rieske-KKHA und Rieske-KRHA in A. thaliana................................................. 98
3.3.2 Die Membranfraktion der Rieske-KK(KR)HA-exprimierenden Pflanzen ........105
3.3.3 Die lösliche Fraktion der Rieske-KKHA-exprimierenden Pflanzen..................110
3.3.4 Die Reinigung von Rieske-KKHA-haltigen Komplexen...................................113
4
Diskussion .............................................................................. 116
4.1
4.2
4.3
Das Rieske-Protein als besonderes ∆pH/Tat-Substrat ........................................116
Das plastidäre Rieske-Protein aus Arabidopsis thaliana....................................118
Die Rieske-Signalankerdomäne..........................................................................119
Komplex 2 – Die plastidäre Sec-Translokase?............................................................... 120
Komplex 3 – Die monomere Form des Cytochrom b6/f-Komplexes? ............................. 121
4.4
Die Bedeutung der luminalen Domäne für den Thylakoidtransport ..................122
Der Transport von gefalteten Proteinen......................................................................... 122
Die Interaktion mit Chaperonen..................................................................................... 124
Der Einbau von Cofaktoren............................................................................................ 126
4.5
Die Kandidaten der plastidären Fe/S-Assemblierungsmaschinerie....................127
Die IscS/NFS-Komponente............................................................................................. 128
Die NFU-Komponente.................................................................................................... 129
Die IscA/ISA-Komponente.............................................................................................. 131
Die ISC-Kandidaten bilden Komplexe im Stroma.......................................................... 133
III
4.6
Die Expression von Rieske-KRHA und Rieske-KKHA in A. thaliana..................135
Das Rieske-KK-Protein .................................................................................................. 135
Der Einfluß des HA-Peptids ........................................................................................... 135
Rieske-KKHA assoziiert mit der Thylakoidmembran....................................................... 136
Die Reinigung des Rieske-KKHA-Proteins zusammen mit der Rubisco-Aktivase............ 137
4.7
Das zusammenfassende Modell..........................................................................138
5
Zusammenfassung................................................................. 140
6
Literatur................................................................................... 142
Erklärung ..................................................................................................................... 158
Danksagung................................................................................................................. 159
Publikationsliste .......................................................................................................... 160
Lebenslauf ................................................................................................................... 161
IV
Abkürzungen
Allgemeine Abkürzungen, Chemikalien, Nukleinsäuren und Maßeinheiten
°C
αX
A
A. thaliana
A. tumefaciens
A. vinelandii
Ap(r)
APS
AS
ATP
Ax
Bistris
BN
bp
BSA
c
C
CAP
cDNA
Cef
CN
C-terminal
Chl.
CTP
d
DEPC
dGTP
DMSO
DNA
dNTP
DTT
ECL
E. coli
EDTA
Fe/S
FM
g
g
G
Gm(r)
GTP
h
HA
HEPES
Hyg
IgG
ISC
kb
kDa
Kn(r)
l
µg
µl
µM
M
mA
Grad Celsius
Anti-X Antikörper
Adenin
Arabidopsis thaliana
Agrobacterium tumefaciens
Azotobacter vinelandii
Ampicillin (-Resistenz)
Ammoniumpersulfat
Aminosäure(n)
Adenosin-5´-triphosphat
Absorption bei der Wellenlänge x
Bis-(2-hydroxyethyl)-imino-tris-(hydroxymethyl)-methan
Blue native
Basenpaare
Rinderserumalbumin
Konzentration
Cytosin
m7G(5´)ppp(5´)G
komplementäre DNA (copy-DNA)
Cefotaxim
Colorless native
Carboxy-terminal
Chlorophyll
Cytidin-5´-triphosphat
Tag (e)
Diethylpyrocarbonat
2´-Desoxyguanosin-5´-triphosphat
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
2´-Desoxynukleosid-5´-triphosphat
Dithiothreitol
enhanced chemilumescence
Escherichia coli
Ethylendiamintetraessigsäure
Eisen-Schwefel
Frischmasse
Gramm
Schwerkraft
Guanin
Gentamycin (-Resistenz)
Guanosin-5´-triphosphat
Stunde (n)
Hämagglutinin
4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-Ethansulfonsäure
Hygromycin
Immunglobulin G
iron-sulfur cluster formation, Fe/S-Cluster-Assemblierung
Kilobasen
Kilodalton
Kanamycin (-Resistenz)
Liter
Mikrogramm
Mikroliter
Mikromolar
Molar
Milliamper
V
mg
min
ml
mM
MOPS
mRNA
ng
nm
N-terminal
PAGE
PBS
PCR
PEG
PMSF
PVDF
Rif
RNA
RNase
RT
SDS
sek
Syn.
T
TEMED
Tcr
TG
Tricin
Tris
U
UpM
UTP
V
v/v
Vol.
w/v
Milligramm
Minute
Milliliter
Millimolar
Morpholinopropansulfonsäure
messenger (Boten-) RNA
Nanogramm
Nanometer
Amino-terminal
Polyacrylamidgelelektrophorese
Phosphate Buffered Saline
Polymerasekettenreaktion
Polyethylenglykol
Phenylmethylsulfonylfluorid
Polyvinylidendifluorid
Rifampicin
Ribonukleinsäure
Ribonuclease
Raumtemperatur
Natriumdodecylsulfat
Sekunde (n)
Synomym
Thymin
N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin
Tetracyclin-Resistenz
Tris-Gylcin
N-Tris-(hydroxymethyl)-methylglycin
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Unit, Einheit der Enzymaktivität
Umdrehungen pro Minute
Uridin-5´-triphosphat
Volt
Volumen zu Volumen
Volumen
Gewicht zu Volumen
Abkürzungen für Polypeptide und Proteinkomplexe
16 (23, 33) kDa
ATP-S.
Cpn60
Cyt. b6/f
Hsp60 (70)
LHCII
PC
PSI
PSII
RuA
Rubisco
SPP
TP
TPP
16 (23, 33) kDa-Untereinheit des Wasserspaltungsapparates
ATP-Synthasekomplex
Chaperonin 60
Cytochrom b6/f-Komplex
heat shock protein 60 (70)
Antennenkomplex von Photosystem II
Plastocyanin
Photosystem I
Photosystem II
Rubisco-Aktivase
Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase
Stromaprozessierungspeptidase
Transitpeptid
Thylakoidprozessierungspeptidase
Einbuchstaben- und (Dreibuchstaben-) Code der Aminosäuren
A
C
D
E
F
G
H
(Ala)
(Cys)
(Asp)
(Glu)
(Phe)
(Gly)
(His)
Alanin
Cystein
Asparaginsäure
Glutaminsäure
Phenylalanin
Glycin
Histidin
I
K
L
M
N
P
Q
(Ile)
(Lys)
(Leu)
(Met)
(Asn)
(Pro)
(Gln)
Isoleucin
Lysin
Leucin
Methionin
Asparagin
Prolin
Glutamin
R
S
T
W
Y
V
(Arg)
(Ser)
(Thr)
(Trp)
(Tyr)
(Val)
Arginin
Serin
Threonin
Tryptophan
Tyrosin
Valin