5. Zusammenfassung

5. Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Räumlich-zeitliche Kalziumsignale wie Ca2+-Oszillationen und -Wellen sind in zahlreichen
Zelltypen essentiell für eine reguläre Funktion und daher Gegenstand intensiver
Forschung. Die Entstehung beider Phänomene beruht auf der Freisetzung von
Kalziumionen aus intrazellulären Speichern (z.B. ER und SR) und ihrem Rücktransport
mittels energieverbrauchender Ionenpumpen. Gegenstand unserer Untersuchungen waren
Kardiomyozyten, die sich aus ES-Zellen differenziert haben (Maus, Zellinie R1). Sie
entwickeln sich als Cluster innerhalb sogenannter „Embryoid Bodies“. Die Cluster von
Herzzellen wurden mit einem Skalpell unter dem Lichtmikroskop herausgeschnitten und
durch das Enzym Collagenase in einzelne Zellen isoliert, um anschließend physiologischen
Analysen zur Verfügung zu stehen. Nach Sichtbarmachung der Kalziumionen mittels
Fluoreszenzindikatoren wurden die Zellen unter dem konfokalen Laser-ScanningMikroskop betrachtet und mithilfe eines Videobandes aufgezeichnet, um späteren
Auswertungen zur Verfügung zu stehen.
Die wesentlichen Fragestellungen dieser Arbeit bezogen sich auf die Charakterisierung
von Kalziumsignalen wie Ca2+-Oszillationen,-Wellen und -Sparks, die in den Zellen
auftraten. Darüberhinaus wurde untersucht, ob die Mitochondrien als Bestandteile der
Zelle Einfluss auf die Signalentstehung haben und ob die Ca2+-Oszillationen durch
extrazelluläre Faktoren beeinflussbar sind.
Nach Unterteilung der Zellen in sechs Morphotypen wurde die Frequenz der Ca2+Oszillationen in Abhängigkeit vom Alter untersucht. Es kam, abhängig vom Morphotyp,
zu einer unterschiedlich starken Zunahme der Frequenz. Für eine sichere Identifikation des
Phänotyps der Zellen wären Patch-Clamp-Analysen nötig gewesen, was aber nicht
Gegenstand dieser Arbeit war.
Lässt man die Morphologie außer Acht und teilt die Zellen nur in Altersgruppen ein, so
stellt man fest, dass die Frequenz der Ca2+-Oszillationen mit zunehmendem Alter
statistisch
signifikant
zunimmt.
Durch
die
relativ
hohe
extrazelluläre
Kalziumkonzentration (3,6 mmol/l) ist mit spontaner Kalziumfreisetzung, Ca2+Oszillationen und der Ausbreitung von Ca2+-Wellen eher zu rechnen als unter
Normalbedingungen. Eine Ca2+-Oszillation muss nicht unbedingt eine Kontraktion nach
sich ziehen. Relative Fluoreszenzintensitäten in allen Altersgruppen nahmen statistisch
signifikant ab, was vermutlich durch schnellere Aufnahme der Kalziumionen in die
Speicher des SR sowie eine effektiver arbeitende SERCA-Pumpe verursacht wird.
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5. Zusammenfassung
Die Atmungskette, welche der ATP-Bereitstellung dient, ist in den Mitochondrien
lokalisiert. Ein Hemmstoff des Elektronentransportes am Komplex III der Atmungskette,
Antimycin A, wurde in einer Konzentration von 60 µmol/l appliziert. Die in der 1.
Altersgruppe bei 100% der Zellen aufgetretene Hemmung der Ca2+-Oszillationsfrequenzen
wurde durch Messung der spezifischen Aktivität des Komplex III und des Leitenzyms der
Glycolyse (PHI) näher untersucht. Der Quotient aus Komplex III und PHI (dargestellt in
%) lag deutlich über dem der 2. und 3. Altersgruppe. Deshalb wird vermutet, dass die
Mitochondrien in der 1. Altersgruppe eine dominante Rolle bei der Ca2+Oszillationsentstehung spielen. Wahrscheinlich übernehmen sie einen großen Teil der
Kalziumspeicherfunktion und somit der Oszillationsentstehung, weil das SR noch nicht
voll ausgereift ist. Die Entleerung der mitochondrialen Kalziumspeicher und die durch
Hemmung des Elektronentransportes reduzierte ATP-Synthese ziehen eine abnehmende
Oszillationsfrequenz nach sich. Der Hemmeffekt lässt mit zunehmendem Alter der Zellen
nach. Die relativen Fluoreszenzintensitäten nahmen nach Antimycinapplikation in allen
Altergruppen statistisch signifikant ab. Ursächlich könnte die Entleerung der
mitochondrialen Speicher und somit eine verminderte Kalziumausschüttung der
Mitochondrien sein.
Der Cholinester Carbachol ruft an Herzzellen vom Schrittmachertyp einen negativ
chronotropen Effekt hervor. Es sollte herausgefunden werden, ob die Ca2+-Oszillationen
von extrazellulär beeinflussbar sind oder aber völlig autonom in der Zelle entstehen. Aus
der Applikation von Carbachol (1 µmol/l) resultierte in der 2. Altersgruppe im Gegensatz
zur 1. und 3. eine statistisch signifikante Abnahme der Oszillationsfrequenz. Der fehlende
Effekt in der 3. Altersgruppe geht mit den Quellenangaben (Carbacholeffekt nur nach
vorausgegangener β-adrenerger Stimulation) konform.
Der Strom If bestimmt die Frequenz von Schrittmacherzellen. Er lässt sich in aus ESZellen differenzierten Kardiomyozyten durch Applikation von CsCl (2 mmol/l) blockieren.
Wenn man von einem Auftreten des If–Stromes in allen drei Altersgruppen ausgeht (zur 1.
Gruppe wurden in der Literatur gegensätzliche Angaben gemacht), dann unterliegt If einer
extrazellulären Modulation durch CsCl. Es kam in den drei Altersgruppen zu statistisch
signifikanter Abnahme der Frequenz von Ca2+-Oszillationen. Es kann davon ausgegangen
werden, dass zufällig sehr viele Schrittmacherzellen auf Videoband aufgenommen wurden,
weil der prozentuale Anteil der gehemmten Zellen deutlich über dem in der Literatur
angegebenen Prozentsatz an Zellen lag, in denen der If-Strom gemessen wurde.
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5. Zusammenfassung
Neben dem Auftreten von Ca2+-Oszillationen wurden Kardiomyozyten beobachtet, deren
Kerne stärker oder schwächer fluoreszierten als das umgebende Zytosol. Eine wesentliche
Aufgabe des Kernkalziums besteht u.a. in der Steuerung der Transkription.
Ein anderes interessantes Phänomen ist das Auftreten von Kalziumsparks sowohl im
Zytosol als auch im Kern. Es konnte eine Zunahme der Sparkaktivität mit fortschreitendem
Alter der Zellen beobachtet werden, was mit anderen Quellenangaben übereinstimmt. Die
Entstehung der Sparks beruht auf der spontanen Öffnung eines oder mehrerer RyRs.
Vermutlich erklärt eine zunehmende Dichte der RyRs und die stärkere Beladung des SR
mit Kalzium das sich stetig vermehrende Auftreten von Sparks. Sparks können schließlich
auch eine Ca2+-Welle initiieren. Am Ursprung der Welle tritt ein sogenannter Makrospark
auf,
welcher
durch
eine
besonders
hohe
intrazelluläre
Kalziumkonzentration
gekennzeichnet ist.
Ein weiteres Phänomen ist das Auftreten lange andauernder Ca2+-Oszillationen
hauptsächlich in Zellen der mittleren Altersgruppe.
Ca2+-Wellen sind in Kardiomyozyten der Maus, die sich aus ES-Zellen differenziert haben,
ein selten zu beobachtendes Ereignis. Abortive Wellen sind hingegen häufiger zu finden.
Ca2+-Wellen treten in Zusammenhang mit Kontraktionen auf. Sie rühren von koordinierter
Aktivität intrazellulärer Kalziumkanäle her. Kalziumionen werden aus dem SR über RyRs
freigesetzt, diffundieren zwischen den Clustern von RyRs und werden anschließend durch
die SERCA zurückgepumpt. Kalziumwellen mit Geschwindigkeiten zwischen 3 und 100
µm/s wurden auch in nicht erregbaren Zellen gefunden (z.B. Oozyten, Hepatozyten,
Fibroblasten). Die Kalziumfreisetzung erfolgt dabei über die IP3-Kaskade aus dem ER.
Eine Ca2+-Wellenentstehung in isolierten Zellorganellen wurde auch beschrieben. Die
experimentellen Ergebnisse indizieren eine Ähnlichkeit von solch einem in vitro-System
mit einem erregbaren Medium.
Wenn die Experimente fortgeführt würden, so wäre es zweckmäßig Patch-Clamp-Analysen
durchzuführen, um die Morphotypen den Phänotypen exakt zuzuordnen. Dann könnten die
Hemmstoffe gezielt an den Phänotypen getestet werden. Darüberhinaus wären
weiterführende Untersuchungen über die Funktion der Mitochondrien in den drei
Altersgruppen, besonders aber in der ersten Gruppe, interessant.
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