Proteom- und Populationsdynamik von

Zusammenfassung
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Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde das physiologische Verhalten des schadstoffabbauenden Bakteriums Cupriavidus necator JMP134 bei dessen Konfrontation mit dem
toxischen Modellsubstrat Phenol untersucht. Es wurden Strategien und Mechanismen,
die der Stressbewältigung und Adaptation an zunehmende Phenolkonzentrationen
dienen, auf Populations- und individueller Ebene identifiziert. Dazu wurde eine Methode
etabliert, mit der Zellen anhand ihrer physiologischen Eigenschaften separiert und
deren metabolische Fähigkeiten mit Hilfe der Proteomanalyse näher charakterisiert
werden konnten.
Metabolische und molekulare Untersuchungen der Gesamtpopulation zeigten, dass der
produktive Abbau, als aktiver Mechanismus, eine wichtige Funktion bei der Adaptation
an zunehmende Phenolkonzentrationen einnimmt. Das Phenol, welches dem Bakterium
als alleinige Energie- und Kohlenstoffquelle dient, wird hierbei in Abhängigkeit des
Abbauweges zum einen in Biomasse und zum anderen in Polyhydroxybutyrat (PHB)
metabolisiert. Im ortho-Weg wird, auf Grund eines metabolischen Flaschenhalses,
Phenol sowohl für die Synthese von PHB, als auch für Wachstum und Vermehrung
genutzt. Somit führt die Synthese von PHB während dieser Wachstumsphase ebenfalls
zur Erhöhung der Überlebensfähigkeit, da mit dieser die Konzentration des für die
Zellen toxischen Substrats verringert wird. Mit der Induktion des meta-Weges wird
Phenol zunehmend nur für Wachstum und Vermehrung genutzt.
Die Untersuchungen auf molekularer Ebene haben gezeigt, dass neben der Induktion
des meta-Weges zusätzliche Monooxygenasen, die an der Oxidation des Phenols
beteiligt sind, exprimiert werden. Die Gründe dafür werden zum einem in einer
konzentrationsabhängigen Hemmung der bereits aktiven Phenolhydroxylasen, und zum
anderen in einer unspezifischen, durch die hohe Substratkonzentration ausgelösten
Induktion vermutet.
Die
verstärkte
Expression
periplasmatischer
Proteine
mit
Chaperon–
und
Proteasefunktion, wie DegQ und SurA, weisen darauf hin, dass die Membranen der
Zelle primäres Target des lipophilen Phenols sind, und dass in C. necator JMP134
neben aktiven auch passive Mechanismen induziert werden, um die Wirkung toxischer
Verbindungen einzuschränken.
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Mit Hilfe flowzytometrischer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Zellen
innerhalb einer Population unterschiedlich auf zunehmende Phenolkonzentrationen
reagieren. So wurde bei einer Substratrestkonzentration cR ≥ 1,7 mM eine neue DNASubpopulation
(C1)
detektiert.
Die
Zellen
in
dieser
Subpopulation
waren
gekennzeichnet durch einen geringeren DNA- und PHB-Gehalt. Sie sind wahrscheinlich
das Ergebnis eines Abbaus von DNA und nicht einer Zellteilung.
Eine molekulare Analyse dieser Zellen unterstützt die durch Rekultivierungsversuche
gewonnene Annahme, dass es sich bei diesen um dormante Zellen handelt, welche mit
Abnahme der Phenolrestkonzentration in der Lage sind, in einen aktiven Zustand
zurückzukehren. Im Proteinmuster von Zellen der C1-Subpopulation konnte neben
reprimierten Enzymen des Metabolismuses und Transportes auch die verstärkte
Expression von Proteinen der Translation (RspA, TufA) detektiert werden. Diese weisen
darauf hin, dass die Zellen versuchen ihre Proteinsynthese-Maschinerie erneut zu
aktivieren. Dadurch können sie bei verbesserten Wachstumsbedingungen umgehend
mit der Zellsynthese und der Replikation, und damit der Sicherung der genetischen
Informationen, starten. Sie erfüllen dadurch die Voraussetzung, dass eine individuelle
Mindestbiomasse notwendig ist, bevor eine Induktion der Replikation der DNA erfolgen
kann. Die dafür benötigte Energie und erforderlichen Zellbausteine werden durch den
Abbau von PHB und der DNA bereitgestellt.
Durch
die
erstmalige
Kombination
von
Flowzytometrie,
Zellsortierung
und
Proteomanalyse von Subpopulationen mit verschiedener Eigenschaften wurde eine
Methode für die Mikrobiologie erschlossen, mit der sich, unabhängig von der
Kultivierbarkeit, die Funktion von Zellen innerhalb einer Population oder Gemeinschaft
näher untersuchen lässt.
Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse gewähren einen Einblick in die
Adaptationsmechanismen
von
Individuen
innerhalb
einer
Population
bei
der
Konfrontation mit dem Schadstoff Phenol. Während ein Teil der Population Wachstum
und Vermehrung aufrechterhält, nimmt ein anderer Teil der Population einen
dormanten Zustand ein und sichert so Leben und Überleben der Gesamtpopulation für
den
Fall
einer
weiteren
Zunahme
der
Stresssituation.
Die
Kenntnis
solcher
Überlebensstrategien und die Möglichkeit, bestimmte metabolische Leistungen mit
definierten Zellzuständen in Verbindung zu bringen, weisen den Weg für die
Entwicklung subtiler Lösungsansätze, um Leistungsgrenzen von Mikroorganismen
rechtzeitig zu erkennen bzw. Zellstatus-bedingte Leistungsspitzen gezielt zu nutzen.
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