Relevanz von Virusvarianten für Diagnostik, Therapie und
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Relevanz von Virusvarianten für Diagnostik, Therapie und Krankheitsverlauf am Beispiel der Hepatitis B Thomas Bock, PhD Robert Koch-Institut, Berlin FG15, Molekulare Epidemiologie viraler Erreger Bock & Zentgraf 1995 Fortbildung für den Öffentlichen Gesundheitsdienst Berlin, 24. – 26. März 2010 Virus Hepatitis Hepatitis-Viren: Bock & Zentgraf 1995 Hepatitis A Virus (HAV, Picornaviren) Hepatitis B Virus (HBV, Hepadnaviren) Hepatitis C Virus (HCV, Flaviviren, Hepaciviren) Hepatitis D Virus (HDV, Viroid) Hepatitis E Virus (HEV, Caliciviren) Hepatitis G Virus (GBV-C, Flaviviren) TT-Virus (Circoviren) SENV-D/H-Virus (Circoviren) NonA-nonG Viren Andere Virusinfektionen mit Folge Hepatitis: Humanes Cytomegalie Virus (HCMV, HHV5, Beta-Herpesvirus) Herpes simplex Virus (HSV1, [HSV2], Alpha-Herpesvirus) Epstein Barr Virus (EBV, HHV4, Gamma-Herpesvirus) Gelbfieber Virus (Yellow fever virus, YFV, Flaviviren) http://www.clinicalvirology.org/gallery/cvn_em_01.html Quelle: http://www.hepb.de/cps/rde/xchg/bms_hepb/hs.xsl/home_hepatitis-b_kampagne.html Epidemiologie der Hepatitis B Virus Infektion WHO und Robert Koch-Institut, Berlin (Epidem. Bulletin 2009, 20:189-202) • ca. 2 Milliarden von derzeit ca. 6,5 Milliarden Menschen aktuell mit HBV infiziert • > 420 Millionen Menschen = 5%-7% der Weltbevölkerung chronisch HBV infiziert • > 1 Million/Jahr Todesfälle (HBV-induzierten Leberzirrhose [57% aller Fälle], hepatozellulären Karzinom (HCC) [53% aller HCC] • In Europa sind zwischen <0,1% (Nordeuropa) und 8% (Ost- und Südeuropa) der Bevölkerung chronisch mit HBV infiziert • In der Bundesrepublik Deutschland wurden im Jahre 2008 1.850 akuter HBV-Neuerkrankungen an das RKI gemeldet, wobei etwa 5% Virusträger bleiben Hepatitis B Virus Verbreitung Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/09/HBV_prevalence_2005.png Pressefoto zum Start der Kampagne Hepatitis B 2009 Welt-Hepatitis Tag 19.05.2009 Hepatitis B Virus Partikel im Serum 1012 virale Kopien/ml Serum (1013 HBsAg* Partikel/ml Serum) Infektiöse HBV-Virionen Nicht-infektiöse filamentöse und globuläre HBV-Partikel (HBsAg) 100 nm Bock & Zentgraf 1995 Hepatitis B Virus Capsid HBcAg SHBs MHBs HBV DNA genome globular filamenteous LHBs SHBs SHBs Infectious virion „Dane-particel“ (approx. 42 nm) • • • • • • • • Not-infectious HBsAg-particel (apprx. 20 nm) umhülltes ~40 nm DNA-Virus; ~20 nm Kapsid Hepadnavirus, Pararetrovirus pdDNA, ca. 3200 bp 4 überlappende Leserahmen (ORF) preC/Core, preS/surface, RT-Polymerase, X-Protein Promotoren: pg/Core, S and X-Promotor; Enh 1 und Enh 2 8 Genotypen strikt hepatotroph Hepatitis B Virus Genom Su HBV Virion rfa ce Ge HBV Genom ne s Po lym er as e ps Ca idg en X-Gen nach Kann & Gerlich, 1998, modifiziert Hepatitis B Virus Lebenszyklus Virion Hepatozyte Rezeptor ? Polymerase Interaktion Entry Nucleus HBV Minichromosom (Bock et al 2001) cccDNA Formation cccDNA Amplifikation DNA (+) rcDNA cccDNA Transkription pgRNA AAA AAA AAA AAA mRNA Translation DNA (-) pgRNA ER (+) Strang Synthese Virion Sekretion Enkapsidierung Reverse ER Transkription virale Proteine Sekretion HBeAg Adapted from: Ganem D, et al. N Engl J Med 2004 HBsAg Übertragungswege des Hepatitis B Virus • parenteral (Blut/-produkte) (Dialyse) kontaminierte Instrumente kontaminierte Spritzen • sexuell • perinatal Quelle: www.endowsec.com/pated/gifs/elv0010.gif Risikogruppen der Hepatitis B Virus-Infektion Heterosexuelle (Promiskuität) (41%) Drogenabhängige (15%) Homosexuelle (9%) familiärer Kontakt (2%) Heilberufe (1%) Unbekannt (31%) Quelle: CDC Sentinel Counties Study of Viral Hepatitis Alterspezifische Verteilung von HBV Infektionen gemeldete Erkrankungen/100.000 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 3,9% 6,7% 25,9% <5 5 - 15 15 - 25 41,8% 25 - 45 15,3% 6,4% 45 – 65 >65 Altersgruppen Altersspezifische Inzidenz der Hepatitis B, Jilg; Dt. Ärzteblatt 1996 Klinischer Verlauf der Hepatitis B Virus Infektion HBV Infektion inapparent (65%) akut (35%) fulminant (<1%) Ausheilung (90%-95%) Chronische Hepatitis (5-10%) chronisch persistent chronisch aktiv (10%) (70%) (30%) „Gesunde“ HBsAg-Träger (>50%) Zirrhose ? (10%) Primäres Leberkarzinom tuepedia.de/index.php/Ludwig_Uhland Inzidenz des hepatozellulären Karzinoms in Hannover 1995-1998 / n= 268 18,7 % Hepatitis B 7,1 %Hepatitis B und C 13,1 % Hepatitis C 23,1 % Alkohol Missbrauch 7,8% keine Risikofaktoren 0,4 % Steroid Missbrauch 0,4 % M. Wilson 0,7% Hämochromatose 3,7% Hep. C und Alkohol 6,3 % Hep. B und Alkohol 3,0 % Hep B und C und Alkohol 15,7 % andere Leberzirrhose Kubicka et al, Liver 2000; 20(4):312-8 Akute Hepatitis B: Diagnostik Serologie: - HBsAg, anti-HBc (total und IgM) - HBeAg, (anti-HBe) Weitere Methoden: - HBV-DNA (quantitaiv) - Transaminasen HBe/HBs Sero-conversion Ganem & Prince, 2004 Chronische Hepatitis B: Diagnostik • - Zusätzlich zur Akut-Diagnostik: Sonographie der Leber zusätzliche biochemische Marker (Albumin, ChE, Quick, AFP) Ausschluss anderer Infektionen (HIV, HDV, HCV) Leberhistologie keine HBe/HBs Sero-conversion Ganem & Prince, 2004 Diagnostik der HBV Infektion HBsAg positiv anti-HDV HBeAg, HBV-DNA + (hoch-replikativ) >105 IE/ml - (niedrig-replikativ) <105 IE/ml HBV Viruslast und HCC-Risko kumulative Inzidenz des HCC abhängig der “baseline” HBV DNA (n=3851) P<0.01 Chen CJ et al. EASL 2005 HBV-Core-spezifische Quantitative Real Time Taqman PCR HBV qPCR Amplification Plot Kommerziell z.B.: COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test Standard Kurve Weltweite HBV-Genotyp Verteilung A A(a) D G A(e) G C D H E D A(a) Adapted from Hamilton and Gross B(a) C A F F B(j) H F HBV Genotypen und Suszeptibilität zu antiviralen Substanzen • Interferon alpha: Genotyp A und B sprechen relativ gut an Genotyp D und C sprechen nur moderat an • Lamivudine: Resistenzrate höher bei A als in D kein Unterschied zwischen B und C • Adefovir: keine Genotyp-spezifischen Unterschiede • andere Nukleoside: bislang nicht bestimmt Methoden zur HBV Genotyp Bestimmung Variable preS/Sregion zur HBV Genotypisierung Therapie der chronischen Hepatitis B Virus Infektion • (PEG)-Interferon-α α • Nucleoside Analoga (Lamivudine, Entecavir, Telbivudine) • Nucleotide Analoga (Adefovir dipivoxil, Tenofovir) • Hepatitis B Hyperimmunoglobulin (HBIG) Prophylaxis des Hepatozellulären Karzinoms Wirkung Antiviraler Substanzen Inhibition der Reversen Transkription Inhibitoren der viralen Polymerase durch Nucleos(t)idanaloga: • Herpesvirus Polymerase: Aciclovir, Ganciclovir Inhibitoren der Reversen Transcriptase: • HIV: AZT (Zidovudine) • HBV Polymerase: Lamivudin (ZeffixTM) Adefovir (HepseraTM) Adapted from: Ganem D, et al. N Engl J Med 2004 Entecavir (BaracludeTM) Telbivudine (SebivoTM) Tenofovir (Viread®) Selektion von Therapieresistenten Mutationen Schema der Nucleos(t)idanalog-Wirkung Kettenabbruch http://www.mcld.co.uk/hiv/images/lamivudine.gif wt HBV Polymerase-Funktion modifiziert nach: Richman, Nature 2001, 410:995-1001 Nucleotidanalog-Wirkung auf die HBV Polymerase Funktion führt zu Kettenabbruch Hepatitis B: Problem der antiviralen Resistenz • Nur ein virales Target - die HBV Polymerase • Nur eine Substanzklasse (Nucleos(t)id-Analoga) • Antivirale Substanzen: – Lamivudine / Telbivudine (L-NUCLEOSID) – Adefovir / Tenofovir (ACYCLISCHES PHOSPHONAT) – Entecavir (CYCLOPENTEN RING GRUPPE) Selektion von Hepatitis B Virus Varianten Mutanten und Genotypen Virale Faktoren: • HBV ist ein hoch replizierendes Virus (1012 IE/ml) • Die virale Polymerase (Reverse Transcriptase) besitzt keine “proofing reading” Aktivität • 1 - 5 x10-5 Substitutionen/Position/Jahr (S/P/Y) = >107 Fehler/Tag/Patient • 104 fach höher im Vgl. zum humanen Genom • Lange Halbwertszeit der cccDNA (6-10 d) • Lange Halbwertszeit der infizierten Hepatozyte (>30d) Wirt Faktoren: • Selektionsdruck des Immunsystems • Selektionsdruck einer antiviralen Therapie • Andere selektive Einflüsse Bock & Zentgraf 1995 Einfluss von HBV Mutanten auf die Virus Replikation Mutationen im HBV Genom führen zur: • Modulation der HBV Replikation • Beeinflussen die Wirtszell-Suszeptibilität • Maskieren gegen das Immunsystem • oder haben keinen Einfluss Klinische Relevanz von HBV Mutanten Mutationen im HBV Genom können assoziiert sein mit: • • • • • schweren Leberentzündungen fulminanter Hepatitis Leberzirrhose HCC (Leberzellkarzinom) Resistenz gegen eine antivirale Therapie 3221/0 3000 2000 1000 3221/0 Häufige Mutationen im HBV Genom HBV Genom P120T/D144A/G145R „a“ Determinante „Escape“ Mutanten G1896A/C1858T preC-Stopp (HBeAg neg.) Schwere Leberentzündung, Resistenz S-Promoters SP1 Core/HBS/X ORF preC C Enh I XP SP2 preS2 preS1 S TP spacer L180M Lamivudine Resistenz antivirale Resistenz Enh II BCP X M204V/I (YMDD) Lamivudine Resistenz Polymerase ORF A1762T/G1764A HBeAg neg. Stopp Codon trunkiertes X-Protein HCC Assoziation RT RNaseH A181V Adefovir Resistenz N236T Adefovir Resistenz K130M/V131I überlappt mit A1762/G1764A Mangelnde Suppression der viralen Replikation fördert die Selektion von resistenten Viren Therapie-suszeptibles Virus Behandlungsstart Natürlich vorkommende Virusvarianten Therapie-resistente Varianten HBV Replikation Mangelnde Suppression - Inadäquate Potenz des Medikaments - Inadäquate Medikamentenkonzentration - Inadäquate Einnahme (non compliance) - Prä-existierende HBV Resistenzmutanten Time Fung SK & Lok ASF. Antivir Ther 2004; 9:1013–1026. Locarnini S, et al. Antivir Ther 2004; 9:679–693. Nachweis von Hepatitis B Virus Quasi-Spezies (YMDD vs YIDD) 50% YMDD/YIDD T/G 50% T-C T 10% YIDD G 10% T-C Definition der Therapie-Resistenz • Genotypische Resistenz: Mutationen im HBV Genom welche sich aufgrund der antiviralen Therapie entwickeln • Virologischer Durchbruch: Rückfall der HBV Serum DNA Spiegel während der antiviralen Therapie • Klinischer Durchbruch: Virologischer Durchbruch mit erhöhten ALT Spiegelen oder verschlechterter Histologie • Phänotypische Resistenz: Verringerte Suszeptibilität (in vitro) der antiviralen Therapie assoziiert mit genotypischer Resistenz • Kreuzresistenz: Virusmutanten, die durch eine Substanz selektioniert werden und auch mit einer Resistenz gegen eine andere Substanz einhergehen Cornberg, Wedemeyer et al., Z. Gastroenterologie 2007; 45:525-57 Definition der Therapie-Resistenz Leitlinien der „Arbeitsgemeinschaft Wissenschaftlicher Medizinischer Fachgesellschaften“ Cornberg, Wedemeyer et al., Z. Gastroenterologie 2007; 45:525-57 Klinisch ausreichendes Ansprechen: nach 6 Monaten antiviraler Therapie ist die Viruslast unter < 200 HBV-IE/ml gesunken Primär virologisches non/bad-response: nach 3 Monaten antiviraler Therapie kein Abfall der Viruslast um mindestens >1 log Sekundäre Resistenz: nach initialem Ansprechen auf eine antivirale Behandlung konsekutiver Anstieg der Viruslast um mehr als >1 log über dem Detektionslimit Entwicklung einer antiviralen Resistenz unter Nukleos(t)id-Analog Behandlung Resistenz (%) 80 60 40 Entecavir <1% nach 1 Jahr bei unbehandelten Pat. 20% nach 2 Jahren3 bei Lam-vorbehandelen Pat. 70% Lamivudin1 Tenofovir5 0% after 72 Wochen 20 29% 18% Adefovir2 Telbivudine4 0 Jahr 1 Jahre 2 1 Lai et al. Clin Infect Dis. 2003;36:687-96 2 Hadziyannis et al. Gastroenterology 2006;131:1743–1751, 3 Sherman et al. Hepatology 2008 4 Lai et al. AASLD 2006 5 Heathcote et al. AASLD 2007, Marcellin et al. AASLD 2007 Jahre 3 Jahre 4 Jahre 5 Schema PCR/Sequenzierungsmethode zur Mutationsanalyse von Hepatitis B Virus Resistenzmutationen YMDD 1 1032 nt HBV Polymerase rtM204 Fragment 1 2 3 4 Molekulargenetische Analyse der HBV Polymerase von HBV-infizierten Patienten bei Adefovir Behandlung A F/G B C rtA181V rtL180M rtT184G LAM/ETV ETV YMDD rtA194T TDF? rtS202I rtM204V/I ETV LAM/LdT/ETV D E rtN236T rtM250V rtC256S ETV LAM Polymorphe Bereiche B Häufigkeitsverteilung von HBV Polymerase-Mutationen unter Adefovir Therapie 169 FG A C D E 1 153 Reverse Transcriptase Spacer 1 RNaseH 344 200 210 230 241 247 257 Terminal Protein B 189 179/1 163 1 37 47 75 91 60 Anzahl Patienten 50 40 30 n=276 Patienten 20 10 336 290 271 268 266 260 257 253 238 231 221 215 207 187 181 173 163 153 145 135 131 129 Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A 127 124 120 115 106 80 53 38 21 7 0 aa Substitutionen Polymorphe Bereiche der HBV RT-Domäne Qi et al. 2004 AASLD FG A B C DE 250 Polymorphe Bereiche number of patients 200 Polymorphe Stellen (>1% Sequenz Variation) in der HBV RT-Domäne 150 100 59 (17%) der 344 HBVRT Reste zeigen >1% Sequenzvariation bei HBeAg+ Patienten 50 I1 6T L9 1 S1 I 06 L1 T 15 V L1 22 N1 F 24 H1 H 26 D1 R 31 L1 N 80 A1 M 81 V I1 87 rt V L 19 1 M I 20 M 4I 20 4V L2 17 R V2 33 N2 I 36 N2 T 48 H C2 5 W 6 26 0 E2 L 63 D I2 Q 66R 26 7M /H 0 n=276 Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A aa Substitution Suszeptibilität von HBV Polymerase Mutanten gegenüber Adefovir Dipivoxil in funktionellen phänotypischen Assays Wildtyp 1,2 rtN236T 1,20 EC50= >20 µM 1 1,00 0,8 0,80 0,6 EC50=3 µM 0,4 0,60 0,40 0,2 0,20 0 0,00 control 1µM ADV 5µM ADV 10µM ADV 1,40 control 1 µM ADV 10 µM ADV 20 µM ADV 1,40 rtN248H 1,20 rtV233I 1,20 1,00 EC50= 16 µM 1,00 EC50= 12 µM 0,80 0,80 0,60 0,60 0,40 0,40 0,20 0,20 0,00 0,00 control 1 µM Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A 10 µM 20 µM control 1 µM ADV 10 µM ADV 20 µM ADV Kreuzresistenz bei HBV Therapeutika 169 FG A C D E 1 Reverse Transcriptase 1 153 RNaseH 344 200 210 230 241 247 257 Spacer 189 Terminal Protein B 163 179/1 37 47 75 91 1 YMDD V173L L180M A181V/S A184G S202I M204I M204V N236T M250V LAM Lamivudine ETV* Entecavir LdT Telbivudine FTC Emtricitabine ADV Adefovir TdF tenofovir Yang H. et al. Hepatology 2003;38:705A; Lai CL et al Hepatology 2003;38:262A * ETV Resistenz benötigt YVDD Mutation Selektion kompensatorischer Mutationen unter sequentieller antiviraler Behandlung Selektion kompensatorischer Mutationen unter antiviraler Behandlung: Patienten Patient 1 Patient 3 Patient 2 3221 2148 M552V 2150 M552I 1996 G145R 2076 L528M 1921 T476N EcoR1 1407 preC ATG=1 Muster von HBV Polymerase Mutanten pHBV1.2 preS1preS2 preC S C X TP spacer RT polymerase RNaseH 552 149 145 118 120 B-domainC-domain HBIg T HBIg G145R Lam L180M M V I I Lam I M204V V R M M V V M204V (I195M) M204I (I195T) R sG145R/M552I sP120T/M204I L180M/M204V T HBIg P120T sG145R/L528M/M204V sP120T/L180M/M204V FCV M L180M (W171W) T 560 528 C-domain R sG145R sP120T B-domain 476 472 - COOH NH2 - TGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTC HBV wt S-ORF catalytic site a-determinant adw 2 P-ORFNH2 -NQYGTMQNLHDSCSRQLYVSLMLLYKTYGWKLHLYSHPIVLGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAICSVVRRAFPHCLAFSYMDDVVLGAK - COOH LAM - + - + - + - G145R/L180M/M204V + P120T/L180M/M204V - L180M/M204V + M204V - P120T + wt pHBV1.2 - control HBV Marker Sensitivität von Polymerase Mutanten gegenüber Lamivudine + 1.0 µM Lamivudine HBV Progeny DNA 3.2 kb 1 2 3 4 5 6 7 8 + Lam 9 10 11 12 13 + Lam 14 15 + Lam 250 - Keine Sensitivität - erhöhte Replikation unter LAM Behandlung 200 150 100 50 V V + La m P1 20 T/ L1 80 M P 12 /M 0T 20 4V /L 18 0M /M 20 4V + La m G 14 5R /L 18 0M P 12 /M 0T 20 /L 4V 18 0M /M 20 4V + La m w tHB w tHB co nt ro l 0 Bock et al. Gastroenterology 2002 Rational für eine De Novo KombinationsTherapie → Kombination von Therapeutika ohne Kreuzresistenz Drug B Resistenz Mutante Drug A wt Wildtyp Drug A Resistenz Mutante Drug B Clavel et al NEJM 2004;350:1023-35 ; Zoulim Antiviral Res 2004;64: 1-15 Geringes Risiko zur Selektion von MDR Wege zur Resistenzvermeidung Maximieren der antiviralen Aktivität – – – – Wahl von Präparaten mit hoher antiviraler Potenz Vorgegebene Dosierung einhalten Leichte Einnahme, hohe Resorption (Nahrungsunabhängig) Für maximale Therapie-Adhärenz sorgen (Compliance) Maximieren der Resistenzbarriere – – – Vermeidung sequentieller Monotherapie Auswahl von Nukleos(t)idanaloga mit einer hohen Resistenzbarriere Kombination komplementärer Resistenzprofile Cornberg et al. Upgrade der Leitlinie, AWMF-Register-Nr.: 021/011, Z Gastroenterol 2007;45:1-50 Resistenz: Zusammenfassung der Leitlinie 2007 • Die neuen Leitlinien unterstreichen die Wichtigkeit der Resistenzvermeidung und adäquatem Resistenzmanagement - Bei >1 Mio Kop/ml Einsatz hochpotenter Substanzen - HBV-DNA Monitoring alle 3 Monate, Intensivierung der Therapie bei unvollständigem Ansprechen nach 6-12 Monaten - Rasche Intervention nach sekundärem Therapieversagen (>1 log Viruslastanstieg) - Vermeidung sequenzieller Monotherapie - „Add-on“ Therapie mit komplementärem Resistenzprofil Cornberg et al. Upgrade der Leitlinie, AWMF-Register-Nr.: 021/011, Z Gastroenterol 2007;45:1-50 University of Tübingen Deptartment of Molecular Pathology Prof. Dr. Reinhard Kandolf Dr. Bernd Köberlein Dr. Anja Düchting Dr. Stefanie Simonovic Dipl. Biol. Agnes Bryniok Dipl. Biol. Friedericke Utta cand. med. Christine Walker cand. med. Martin Wolf cand. med. Christian Wollboldt Rosa Mamato Heike Kaiser Acknowledgments Medical School of Hannover Prof. Dr. Heiner Wedemeyer Prof. Dr. Michael Manns Charitè Universitätsmedizin Berlin, Bemjamin Franklin, Virchow Prof. Dr. Thomas Berg Prof. Dr. Carsten Tschöpe German Cancer Research Center, DKFZ, Heidelberg Prof. Dr. Hanswalter Zentgraf Prof. Dr. Frank Rösl Duke University, Durham, USA Prof. Dr. Hans Tillmann Albert Schweitzer Hospital, Lambarene, Gabon Prof. Dr. Peter Kremsner Robert Koch-Institut, FG15: Dr. Marina Höhne Dr. Sabine Diedrich Dr. Meike Chevillotte Dr. Sandra Niendorf Dr. Andreas Mas Marques Fr. Tina Dittmann Fr. Daniela Gutt Fr. Roswitha Lorenz Fr. Ute Obst Fr. Christin Kellner Fr. Kathrin Stanossek Fr. Jenny Thiele Fr. Sonja Zimmermann Tran Hung Dao Hospital, Hanoi, Viet Nam Prof. Dr. Nguyen T. Binh Dr. Song Le Huu Dr. Nguyen Toan Royal Melbourne Hospital, Australia Prof. Dr. Joseph Torresi Prof. Dr. Stephen Locarnini www.a-birken.de/welt.gif
