In vitro Generierung und Chimärismusanalyse humaner

Aus der Medizinischen Universitätsklinik
Abteilung für Hämatologie/Onkologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
In vitro Generierung und Chimärismusanalyse
humaner Knochenmarkstromazellen nach
allogener hämatopoetischer
Stammzelltransplantation
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2008
von Tisa Nieborg geb. Küttler
geboren in Gelsenkirchen
Dekan:
Prof. Dr. C. Peters
1. Gutachter:
Prof. Dr. J. Finke
2. Gutachter:
Prof Dr. P. Fisch
Jahr der Promotion:
2008
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
7
1.1 Die Knochenmarktransplantation
7
1.1.1 Geschichte
7
1.1.2 Das blutbildende System
9
1.1.3 Knochenmark- oder Blutstammzelltransplantation
11
1.1.4 Konditionierung
12
1.2 Die Folgen der Transplantation
14
1.2.1 Engraftment und hämatopoetischer Chimärismus
14
1.2.2 Graft-versus-Host Disease
14
1.2.3 Zytomegalievirusinfektion
15
1.3 Reduzierte Konditionierung
16
1.4 Das Knochenmark
19
1.4.1 Mesenchymale Stammzellen
20
1.4.2 Struktur und Funktion von Knochenmarkstromazellen
21
1.5 Entstehungsmechanismen des nicht-hämatopoetischen
Chimärismus
24
1.5.1 Zellkonversion: Plastizität und Transdifferenzierung
25
1.5.2 Zellfusion
26
1.6 Zielsetzung
27
2 Material
29
2.1 Geräte
29
2.2 Chemikalien und Reagenzien
30
2.3 Antikörper
30
2.4 Y-Chromosom Gensonde
31
2.5 Lösungen und Medien
31
3 Methoden
32
A: Generierung von Knochenmarkstromazellen in vitro
32
3.1 Patientenauswahl
32
3.2 Generierung von Knochenmarkstromazellen
36
3
3.2.1 Ansatz der Knochenmarkstromakulturen
38
3.2.2 Mediumwechsel
38
3.2.3 Zellsplitting
39
3.2.4 Zellernte und Fixierung
39
B: Stromazellpopulation und Chimärismusanalyse
3.3 Immunfluoreszenzfärbung und FISH-Analyse
3.3.1 Fluoreszenz In-situ Hybridisierung
40
40
43
3.3.2 Kombination von Y-Chromosom FISH, Kernfärbung und
Vimentin/von-Willebrand-Faktor Immunfluoreszenzfärbung
44
3.3.3 Kombination von Y-Chromosom FISH mit Immunfluoreszenzfärbungen für Vimentin/von-Willebrand-Faktor und CD14/CD45
46
3.3.4 Kombination von Kernfärbung und Immunfluoreszenzfärbungen
für Vimentin/von-Willebrand und CD14/CD45
49
3.4 Kontrollen der Fluoreszenzfärbungen
50
3.5 Auswertungen der Fluoreszenzfärbungen
51
3.6 Statistik
53
4 Resultate
54
A: Analyse des Wachstumsverhaltens von Knochenmarkstromazellen in vitro
54
4.1 Stromazellwachstum und Konditionierung
54
4.1.1 Patientenproben vor der Transplantation
55
4.1.2 Patientenproben nach der Transplantation
55
4.2 Einflüsse auf das Stromazellwachstum nach der Transplantation
59
4.2.1 Patientenalter
59
4.2.2 Diagnose
60
4.2.3 Primäre Therapien zur Erlangung der Remission
60
4.2.4 Art des Transplantates
61
4.2.5 Anzahl der Stammzellen im Transplantat
61
4.2.6 Remissionsstatus
62
4.2.7 Verwendung von Anti-Thymozyten-Globulin während der
Konditionierung
63
4.2.8 Auftreten akuter Graft-versus-Host Disease
63
4.2.9 Zytomegalievirus
64
4
4.2.10 Virostatische Therapie bei der Probenentnahme
65
4.3 Einfluss der verschiedenen Konditionierungen auf das
Stromazellwachstum nach der Transplantation
4.4 Hämatopoetische Regeneration nach der Transplantation
66
68
4.4.1 Transfusion von Erythrozyten/Thrombozytenkonzentraten
68
4.4.2 Leukozytenregeneration nach der Transplantation
69
4.4.3 Thrombozytenregeneration nach der Transplantation
70
B: Stromazellpopulation und Chimärismusanalyse
4.5 Charakterisierung der Stromazellkulturen
4.5.1 Stromazellwachstum in vitro
71
71
71
4.6 Zellkomposition und Chimärismusanalyse
74
4.6.1 Stromazellformationen in vitro
74
4.6.2 Chimärismusanalyse der Stromazellen
78
5 Diskussion
82
A: Generierung und Wachstum von Knochenmarkstromazellen
in vitro
82
5.1 Studienlage und Methodik
82
5.1.1 Schädigung der Stromazellen und die Konsequenzen
5.2 Eigene Ergebnisse
82
83
5.2.1 Konditionierung als prädiktiver Faktor für das
Stromazellwachstum?
84
5.2.2 Weitere Einflüsse auf das Stromazellwachstum
5.3 Hämatopoetische Regeneration nach allogener HZT
84
88
5.3.1 Studien
88
5.3.2 Eigene Ergebnisse
89
B: Chimärismus von Knochenmarkstromazellen nach
allogener HZT
91
5.4 Nicht-hämatopoetischer Chimärismus
91
5.4.1 Studien
91
5.4.2 Chimärismus von Knochenmarkstromazellen
92
5.4.3 Eigene Ergebnisse
93
5
6 Zusammenfassung
96
7 Literaturverzeichnis
98
8 Anhang
115
8.1 Abkürzungsverzeichnis
115
8.2 Publikation
117
8.3 Lebenslauf
118
8.4 Dank
119
6
1 Einleitung
1.1 Die Knochenmarktransplantation
1.1.1 Geschichte
„Blut ist ein ganz besondrer Saft“ (Goethe, 1808).
Nicht erst bei Goethe wird dem Organ große Aufmerksamkeit zuteil. In der
griechischen Mythologie ist nachzulesen, dass bereits Medea das Blut des
alternden Jason mit einem speziellen Trunk erneuerte, den sie intravenös
verabreicht haben soll. Der Held fand danach wieder zu alter Stärke. Infusionen
von Blut oder Mark sollten schon damals den Körper reinigen und Krankheiten
heilen.
Die wahrscheinlich erste dokumentierte Blutübertragung fand 1667 in Cambridge
statt. Dort verband R. Lower die Halsschlagader eines Lammes mit der
Ellbogenvene eines Menschen. Aus dem 18. und 19. Jahrhundert stammen
Berichte
über
Transplantationen
Schilddrüsengewebe
und
bereits
von
im
endokrinem
Mittelalter
Gewebe,
wurde
wie
versucht,
z.B.
mit
Hauttransplantationen Verunstaltungen als Verletzungsfolge zu kurieren.
Einen großen Schritt in Richtung Organverpflanzung bedeutete die Entdeckung
des ersten Blutgruppensystems durch K. Landsteiner im Jahr 1900. Durch die
Kenntnis der Blutgruppen A, B und 0 war damit die Bluttransfusion eine
therapeutische Option bei Verletzungen und Erkrankungen geworden und der
erste Schritt zu einer erfolgreichen Organverpflanzung getan.
Im
frühen
20.
Jahrhundert
wurde
dann
die
Organtransplantation
als
Behandlungsmöglichkeit anerkannt und die ersten Versuche, Organe zu
transplantieren, begannen. Zunächst wurde versucht Tierorgane auf den
Menschen
zu
übertragen.
Durch
die
Fehlschläge
aufgrund
der
Abstoßungsreaktionen wurde jedoch das Vorhaben in den 30er Jahren nahezu
völlig aufgegeben. Erst nach dem 2. Weltkrieg blühte das Interesse an der
Transplantation wieder auf. Im Zuge dessen wurde verstärkt über die
Abstoßungsreaktionen des Körpers nachgedacht, damals noch als „unbekanntes
Moment“ bezeichnet, da die Ursachen noch nicht nachvollziehbar waren.
7
Bereits 1912 wurde von dem Pathologen G. Schöne die These aufgestellt, dass
körpereigene
Immunprozesse
für
die
Abstoßung
körperfremder
Organe
verantwortlich sein könnten.
Diese These wurde bestätigt, als einem Patienten in Boston im Dezember 1954
die Niere seines eineiigen Zwillingsbruders verpflanzt wurde. In diesem Fall war
die größtmögliche Ähnlichkeit des Gewebes gegeben. Der Patient überlebte acht
Jahre mit dem Spenderorgan bis er infolge eines Herzinfarktes starb. Dies machte
deutlich,
dass
erfolgreiche
Transplantationen
bei
nichtidentischen
Gewebsmerkmalen nur durch die Unterdrückung der Abstoßungsreaktion möglich
werden konnten. 1958 wurde von Professor Dausset in Paris das HLA-System
(Human Leukocyte Antigen-System, HLA) entdeckt. Mit seiner Hilfe unterscheidet
das Immunsystem anhand spezifisch ererbter Merkmale zwischen fremdem und
eigenem Gewebe. 1962 wurde dann erstmals Gewebe von Spender und
Empfänger typisiert. Bis heute werden Organe idealerweise nur zwischen
Personen
transplantiert,
die
eine
möglichst
ähnliche
Gewebetypisierung
aufweisen, damit die Abstoßungsreaktion nach der Transplantation deutlich
geringer ausfällt.
Die
Entwicklung
von
Arzneimitteln
zur
spezifischen
Unterdrückung
der
Immunabwehr begann dann in den 60er Jahren des vergangenen Jahrhunderts.
Bereits vor 1960 wurden Kortison und Azathioprin bei transplantierten Patienten
eingesetzt. Ein Durchbruch auf diesem Gebiet gelang den Forschern gegen Ende
der 70er Jahre. Sie entdeckten die immunsuppressive Wirkung eines Pilzes in
Bodenproben aus Norwegen, den Wirkstoff Ciclosporin, der 1983 eingeführt
wurde. Seither wurden die Medikamente ständig weiterentwickelt, verbessert und
neue Substanzen in die Therapie eingeführt, so dass heute sehr gute
Möglichkeiten zur Verfügung stehen, der Organabstoßung entgegenzuwirken.
Insbesondere für die Entwicklung der Knochenmarktransplantation wurde mit der
Detonation der Atombomben über Hiroshima und Nagasaki ein neues Kapitel
eröffnet. Die tragischen Folgen waren äußerst aufschlussreich für die Medizin: es
war möglich, durch Bestrahlung Knochenmark zu „entfernen“. Französische
Forscher verabreichten 1958 einer Gruppe von Strahlungsopfern, deren eigenes
Knochenmark bei einem Unfall zerstört wurde, humanes Knochenmark intravenös.
Fünf der sechs Patienten überlebten die Transplantation problemlos und führten
danach ein beschwerdefreies Leben. In diesem Zusammenhang fanden die
8
Mediziner heraus, dass auch das Transplantat gegen den neuen Wirt reagieren
konnte (Graft versus Host Disease, GvHD). Der Amerikaner E. D. Thomas nutzte
die
Beobachtungen
aus
Japan
und
Frankreich
und
behandelte
einen
Tumorpatienten erfogreich mit einer hochdosierten Ganzkörperstrahlentherapie
und anschließender Knochenmarktransplantation. In der Folgezeit wurde dieser
neue Therapieansatz stetig weiterentwickelt. Somit wurde der Weg geebnet für die
Entwicklung der modernen Knochenmarktransplantation als Standardtherapie für
viele
hämatologische
Neoplasien,
welche
aber
auch
zunehmend
als
Immuntherapie für die Behandlung solider Tumoren eingesetzt wird (Little, Storb,
2002). 1990 erhielt E. D. Thomas den Nobelpreis für Medizin für sein Lebenswerk
auf dem Gebiet der Knochenmarktransplantation.
1.1.2 Das blutbildende System
Das Knochenmark ist die Produktionsstätte der Zellen des menschlichen Blutes.
Dem Knochenmark wird das periphere Blut gegenübergestellt. Dieses besteht aus
dem Blutplasma sowie den darin enthaltenen Zellen und Zellbestandteilen. Eine
grobe Unterteilung unterscheidet zwischen Erythrozyten, Thrombozyten und
Leukozyten/Lymphozyten. Im Knochenmark kann eine weitaus größere Anzahl
von unterschiedlichen Zellen klassifiziert werden. Es handelt sich hierbei um
unreife Vorläuferzellen der genannten Zellen des peripheren Blutes. Die unreifsten
Zellen des Knochenmarks, die sogenannten hämatopoetischen Stammzellen,
werden heute durch den Nachweis bestimmter Oberflächenmoleküle v.a. CD34
(Cluster
of
Differentiation)
differenziert.
Die
Expression
dieses
Oberflächenantigens wird bei der weiteren Differenzierung der ausreifenden
hämatopoetischen Zellen herunterreguliert, sodass CD34 den entscheidenden
Marker für die Bestimmung der Stammzellen darstellt (Bonnet, 2002).
Die hämatopoetischen Stammzellen können sich unter der Wirkung von
bestimmten Wachstumsfaktoren (multipotente Progenitoren, MPP; common
lymphocyte progenitor, CLP; common myeloid progenitor; CMP) in sämtliche
hämatopoetische Zelltypen (myeloide, erythroide oder lymphoide Vorläuferzellen)
differenzieren (Metcalf et al, 1989; Lagasse et al, 2001). Damit sorgen die
Stammzellen für die konstante Erneuerung der Zellen des Blutes und des
Immunsystems. Eine einzige hämatopoetische Stammzelle wäre also in der Lage,
9
das gesamte hämatopoetische System zu regenerieren. Dies wurde im
Tierversuch bereits demonstriert (Osawa et al, 1996). Die Stammzellen
reproduzieren sich selbst, so dass ihr Bestand für unbegrenzte Zeit regelmäßig
erneuert wird (Blau, 2001).
Während die von den lymphoiden Vorläuferzellen abstammenden Lymphozyten
noch einer Prägung bedürfen (z.T. im Thymus, z.T. im Knochenmark), und später
nicht nur im Knochenmark, sondern auch in Milz und Lymphknoten gebildet
werden (Lymphopoiese), proliferieren und reifen alle anderen Vorläuferzellen bis
zu ihrer Endstufe im Knochenmark heran (Myelopoiese). Daran sind u.a. auch
zwei renale Hormone beteiligt, das Erythropoietin für die Reifung und Proliferation
von Erythrozyten und das Thrombopoietin für die Reifung der Megakaryozyten als
Vorstufe der Thrombozyten, bzw. für die Reifung der Thrombozyten selbst. So
schließlich gelangen die reifen Zellen in den Blutkreislauf.
Abbildung 1: Klassisches Modell der Hämatopoese im Knochenmark. Aus mulitpotenten
hämatopoetischen
Stammzellen
gehen
myeloide,
erythrozytäre
Vorläuferzellen hervor, welche sich weiter zu den Blutzellen differenzieren
10
und
lymphoide
1.1.3 Knochenmark- oder Blutstammzelltransplantation
Ist das blutbildende System durch eine Krankheit in seiner Funktion gestört, kann
eine
Stammzelltransplantation
(als
Knochenmark-
bzw.
periphere
Blutstammzelltransplantation, KMT bzw. PBSZT) eine mögliche Therapie sein.
Heute besitzt die Transplantation hämatopoetischer Stammzellen (HZT) einen
wichtigen Stellenwert in der Behandlung von schweren hämatologischen oder
auch onkologischen Erkrankungen und wird als differenzierte hämatopoetische
Zelltherapie vermutlich noch weiter an Bedeutung gewinnen (Little, Storb, 2002;
Horowitz, 2004).
Bei
folgenden
hämatologischen
Erkrankungen
ist
heute
an
eine
Stammzelltransplantation im Rahmen der Primärbehandlung zu denken:
•
akute Leukämien und Myelodysplasien
•
chronisch myeloische Leukämie
•
schwere aplastische Anämie
•
myeolproliferative Syndrome, Philadelphia-Chromosom negativ
•
multiples Myelom
•
aggressive Non-Hodgkin-Lymphome
•
niedrig maligne Lymphome, chronisch lymphatische Leukämie.
Hämatopoetische Stammzellen können auf zwei Wegen gewonnen werden. Bis in
die 80er Jahre war eine Knochenmarkentnahme die einzige Möglichkeit, um
ausreichend hämatopoetische Stammzellen zu gewinnen. Das Knochenmark wird
mittels Punktion aus dem Beckenkamm des Spenders gewonnen. Dieser Eingriff
erfordert, da er recht schmerzhaft ist, eine Allgemeinanästhesie. Inzwischen
können die Stammzellen zumeist aus der peripheren Blutbahn gewonnen werden,
welches ein wesentlich schonenderes Verfahren darstellt. Durch die Gabe eines
hämatopoetischen Wachstumsfaktors (Granulozyten-Colony-stimulating-Factor,
G-CSF) können die Stammzellen zum vermehrten Übertritt in das zirkulierende
Blut angeregt werden. Nach dieser „Mobilisierungsphase“ werden durch spezielle
Zellauftrennungsverfahren (Leukapheresen) gezielt Stammzellen aus dem Blut
geerntet. Der vorübergehende Verlust der Knochenmarkzellen wird durch die gute
Regenerationsfähigkeit
der
Stammzellen
bald
wieder
ausgeglichen.
Die
gewonnenen hämatopoetischen Stammzelltransplantate werden dem Empfänger
intravenös
infundiert
und
müssen
11
mindestens
2x106
CD34+-Zellen/kg
Körpergewicht (KG), bzw. 1010 mononukleäre Zellen/kg KG enthalten (Schmitz,
2004).
Die
Transplantate
bestehen
allerdings
nicht
ausschließlich
aus
Stammzellen. Sie enthalten auch eine Vielzahl anderer weißer Blutzellen
unterschiedlicher
Reife.
Damit
suggerieren
die
Bezeichnung
„periphere
Blutstammzelltransplantation“ als auch der Überbegriff für PBSZT und KMT
„hämatopoetische
Stammzelltransplantation“
fälschlicherweise,
dass
ausschließlich hämatopoetische Stammzellen transplantiert werden (Abkowitz,
2002; Manz et al 2004).
Die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen wird nach dem Grad der
genetischen Unterschiede zwischen Spender und Empfänger in autologe und
allogene Stammzelltransplantation eingeteilt.
Bei der autologen Transplantation sind Spender und Empfänger dieselbe Person.
Hingegen werden dem Patienten bei der allogenen Stammzelltransplantation die
Zellen eines gesunden Spenders übertragen. Der Spender kann ein HLAidentisches Familienmitglied (familiär-allogene Transplantation) oder ein ebenfalls
HLA-identischer fremder Spender sein (fremd-allogene Transplantation). Auch
sind fremd- oder familiär-allogene Transplantationen möglich, wenn beim Spender
nur die Hälfte der HLA-Merkmale identisch ist (haplo-ident). Solche Differenzen in
den Gewebemerkmalen können jedoch nicht nur eine Transplantatabstoßung
begünstigen,
schwersten
sondern
führen
trotz
entsprechender
Graft-versus-Host-Reaktionen,
d.h.
einer
Immunsuppression
zu
Abwehrreaktion
der
transplantierten Immunzellen gegen Empfängerzellen, was im Folgenden noch
näher
erläutert
werden
wird.
Eine
Besonderheit
bilden
die
syngenen
Transplantationen bei denen der Spender genetisch gleich ist (eineiige Zwillinge).
Im Folgenden wird ausschließlich über die allogenen Transplantationen berichtet,
da diese in der vorliegenden Arbeit relevant sind.
1.1.4 Konditionierung
Im Allgemeinen werden Patienten mit einer hämatologischen Neoplasie mit einer
Konditionierungstherapie
auf
die
eigentliche
„vorbereitet“.
12
Stammzelltransplantation
Die Konditionierungstherapie dient folgenden Zielen:
•
Das
Erreichen
einer
Remission,
d.h.,
der
Eradikation
sämtlicher
neoplastischer Zellen bei einer malignen Erkrankung, mit dem Ergebnis,
dass vorübergehend keine Krankheitszeichen nachweisbar sind;
•
Immunsuppression des Empfängers bei allogenen Transplantationen, damit
die übertragenden Stammzellen nicht abgestoßen werden (Armitage,
1994).
Das
Konditionierungsregime
Krankheitsstadium
ab.
Die
hängt
von
der
klassischen
Grunderkrankung
„myeloablativ“
und
dem
bezeichneten
Konditionierungen (myeloablativ = knochenmarkzerstörend) bestehen z. B. aus
der
Kombination
einer
Ganzkörperbestrahlung
(12
Gray)
und
einer
Hochdosischemotherapie (Cyclophosphamid (120mg/kg) und Etoposid (50
mg/kg)), oder einer rein medikamentösen Therapie (Busulphan (16 mg/kg) und
Cyclophosphamid (120 mg/kg)). Die Zytostatika- und Bestrahlungsdosen sind so
ausgewählt, dass die Haupttoxizität die Knochenmarkaplasie (irreversible
Knochenmarkschädigung) darstellt, keine irreversiblen Organschäden auftreten
und trotzdem eine maximale antineoplastische Wirkung erzielt wird.
Neben
zytotoxischen
Antitumoreffekten
werden
bei
der
allogenen
Stammzelltransplantation auch immunologische Effekte (Graft-versus-Leukämie
Reaktion) erzielt. Dies ist der Ansatzpunkt für das Verfahren der reduzierten
Konditionierung (z. B. Fludarabin (150mg/m2), BCNU (300-400 mg/kg) und
Melphalan (110-140 mg/kg)), welches während der letzten Jahre zunehmend
Anwendung findet. Das Prinzip der Stammzelltransplantation mit reduzierter
Konditionierung besteht darin, eine wirksame Immunsuppression des Empfängers
zu erreichen, damit sich nach der Transplantation genügend Spenderstammzellen
etablieren können. In der Folge werden dann die immunologischen Effekte des
Tranplantates genutzt, um verbliebene neoplastische Zellen aus dem Organismus
des Empfängers zu eliminieren.
Nach der Konditionierungsphase kann dann die Stammzelltransplantation
erfolgen. Die transplantierten hämatopoetischen Stammzellen nisten sich im
Knochenmark ein und können sich dort nach etwa 2-3 Wochen wieder zu
funktionsfähigen Blutzellen differenzieren.
13
1.2 Die Folgen der Transplantation
1.2.1 Engraftment und hämatopoetischer Chimärismus
Die
Blutbildung
bleibt
nach
einer
Stammzelltransplantation
lebenslang
spendertypisch, d.h. dass das hämatopoetische System des Empfängers nach
dem Engraftment (Akzeptanz des neuen Gewebes) des Transplantates von den
genetisch verschiedenen hämatopoetischen Spenderzellen gebildet wird. Auch
Abkömmlinge zirkulierender hämatopoetischer Zellen wie Alveolarmakrophagen
(Thomas et al, 1976), Kupffer-Zellen der Leber (Gale et al, 1978), LangerhansZellen der Haut (Hessel et al, 1996; Volc-Platzer et al, 1984) und Mikroglia-Zellen
des ZNS (Unger et al, 1993), aber auch epitheliale Zellen (Spyridonidis et al,
2004a) können nach der Transplantation den Genotyp des Spenders aufweisen,
wohingegen andere Zelltypen weiterhin vom Empfänger stammen. Klinisch wird
hier der Begriff (hämatopoetischer) Chimärismus verwendet. Die Chimäre der
griechischen Mythologie ein Wesen mit Körperteilen von Löwe, Ziege und
Drachen gilt als Symbol für die Toleranz genetisch verschiedener Individuen und
ihrer Organe (Bryant, Martin, 2004).
Abbildung 2: Chimaera aus der griechischen Mythologie
1.2.2 Graft versus Host Disease
Ist der Spender genetisch verschieden, kann dies nach der Regeneration des
transplantierten Knochenmarks durch die Produktion von Lymphozyten zu
schwerwiegenden Alloreaktionen des Immunsystems wie Abstoßung des
14
Transplantats oder zur so genannten Graft-versus-Host Disease (GvHD) führen.
Dies bedeutet, dass die immunkompetenten Zellen aus dem Transplantat im
Empfängerorganismus zelluläre Immunreaktionen vermitteln und spezifisch gegen
den Empfänger gerichtete zytotoxische Antikörper und T-Zellen bilden.
Im gesunden Organismus werden diese Zellen rasch abgebaut. Bei Empfängern
mit
unterdrückter
oder
geschwächter
Immunabwehr
(als
Folge
der
Konditionierung) kann die GvHD als Sekundärreaktion zu einer schweren akuten
oder
chronischen
Erkrankung
führen.
Die
akute
Form
der
GvHD
tritt
definitionsgemäß innerhalb der ersten 100 Tage nach allogener Transplantation
auf und ist ein Syndrom, welches mit Dermatitis, Hepatitis und Enteritis
einhergeht. Die chronische GvHD, welche sich später als 100 Tage nach allogener
Transplantation manifestiert, ist im Krankheitsbild sehr variabel. Sie kann
verschiedenste
Organsysteme
betreffen
und
ähnelt
einer
chronischen
Autoimmunerkrankung.
Das GvHD- Risiko ist am geringsten bei der Transplantation von HLA-identischen
Geschwistern und nimmt bei Einsatz nur teilweise HLA-identischer Verwandter
oder bei nicht verwandten Spendern mit phänotypisch identischen Haupt-HLAMerkmalen zu (Ruggeri et al, 2002).
Aus diesem Grund wird in der Regel bei allen allogenen Transplantationen eine
GvHD-Prophylaxe mit verschiedenen Immunsuppressiva (z.B. Cyclosporin A,
Kortison,
Methothrexat,
Antithymozytenglobulin)
durchgeführt,
um
die
Immunreaktion der Spenderzellen zu hemmen.
1.2.3 Zytomegalievirusinfektion
Ein hohes Risiko bei der Entwicklung einer GvHD-Reaktion besteht ferner darin,
dass die zu ihrer Behandlung notwendige immunsuppressive Therapie nicht nur
die Immunreaktion des Transplantates hemmt, sondern gleichzeitig auch einen
starken Einfluss auf die Infektionsabwehr des Empfängers nimmt. Somit können
u.a. latent-persistierende Erreger reaktiviert werden, wie z.B. am häufigsten das
Zytomegalievirus (CMV).
Das humane CMV gehört zu der Familie der Herpesviren (Herpesviridae), ist
ubiquitär verbreitet und besitzt wie alle Herpesviren die Eigenschaft der
lebenslangen Persistenz im infizierten Organismus. Die Infektion mit dem CMV 15
sie verläuft bei Immunkompetenten in der Regel asymptomatisch kann bei
Patienten mit iatrogener Imunsuppression im Rahmen von Organtransplantationen
zu lebensbedrohlichen Krankheitsverläufen führen (Sissons, Borgsiewicz, 1989).
Diese können verschiedene Organsysteme betreffen (z.B. Hepatitis, Encephalitis,
gastrointestinale Ulcerationen). Eine der gefürchtetsten Organmanifestationen ist
die atypische interstitielle CMV-Pneumonie, welche besonders bei Patienten nach
hämatopoetischer Stammzelltransplantation mit einem Infektionsmaximum um den
60. Tag post transplantationem auftritt und eine der häufigsten Todesursachen
nach HZT darstellt (Sissons, Borgsiewicz, 1989). Des Weiteren können CMVInfektionen (Primärinfektionen und Reaktivierungen) bei diesen Patienten eine
Abstoßung des Transplantates begünstigen (Becker, 1993; Britt, 1996).
Da die CMV-Infektion nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation
mit einer hohen Letalität behaftet ist, muß sie deshalb möglichst frühzeitig, d.h. vor
dem Auftreten von Symptomen behandelt werden, oder im Sinne einer
Expositionsprophylaxe vermieden werden.
Zur Expositionsprophylaxe kann bei seronegativen Patienten mit seronegativem
Spender z.B. die Gabe von Blutprodukten nur ebenfalls seronegativer Spender
erfolgen, um eine Primärinfektion zu vermeiden.
Für die CMV-seropositiven Patienten, oder die seronegativen Patienten mit
seropositivem Stammzellspender wird eine Frühintervention durchgeführt, d.h.,
dass diese Patienten mittles verschiedener sensitiver Nachweisverfahren
hinsichtlich eines Auftretens der CMV-Infektion überwacht werden. Ist der
Nachweis einer Infektion gesichert, kann dann frühzeitig eine antivirale Therapie
mit dem Nukleosidanalogon Ganciclovir durchgeführt werden (Stamminger, 1997).
1.3 Reduzierte Konditionierung
Das Standardverfahren der allogenen Stammzelltransplantation umfasst eine
Konditionierungstherapie,
deren
hochdosierter
Charakter
eine
irreversible
Eradikation der neoplastischen aber damit auch der gesunden Zellen im
Knochenmarkraum des Patienten bewirken soll. Für die erfolgreiche Durchführung
dieser
myeloablativen
allogenen
Stammzelltransplantation
sind
ein
entsprechender Allgemeinzustand des Patienten, normale Organfunktionen,
entsprechendes
Alter,
sowie
die
Infektionsfreiheit
16
zum
Zeitpunkt
der
Konditionierung
wesentliche
Voraussetzungen,
da
diese
sehr
intensive
Therapieform zu lebensbedrohlichen Komplikationen an nicht blutbildenden
Organen, wie z. B. intestitielle Pneumonie oder Veno-Okklusiv-Erkrankungen der
Leber führen kann. Die Häufigkeit an Komplikationen nimmt altersabhängig zu. In
Anbetracht des durchschnittlichen Erkrankungsalters besteht z.B. bei manchen
Leukämieformen im 5. Lebensjahrzehnt allein aufgrund der Akuttoxizität der
Konditionierungstherapie ein erhöhtes Therapierisiko. Dadurch kann eine
erfolgreiche
Durchführung
der
allogenen
Stammzelltransplantation
mit
zunehmendem Alter unmöglich werden. In der Vergangenheit führte das dazu,
dass Patienten mit vorhersehbaren hohen transplantationsassoziierten Risiken
von der myeloablativen allogenen Stammzelltransplantation ausgeschlossen
wurden, und somit an den Folgen ihrer Grunderkrankung verstarben.
Aber auch bei jüngeren Patienten mit Begleiterkrankungen oder vorbestehenden
Organfunktionseinschränkungen kann die Toxizität der Konditionierungstherapie
zum akuten Funktionsverlust oder zur dauerhaften Schädigung lebenswichtiger
Organe führen.
Bei
der
allogenen
Stammzelltransplantation
wird
nicht
nur
ein
neues
Blutbildungssystem, sondern auch das neue Immunsystem des Spenders durch
reife und neu produzierte Immunzellen übertragen. Damit addieren sich weitere
Effekte verursacht durch die Lymphozyten des Spenders, einerseits resultieren
daraus primär erhöhte Risiken für virale und Pilz-Infektionen, aber es findet auch
die entscheidende immunologische Auseinandersetzung zwischen Spender und
Empfänger statt. Die Spender-T-Lymphozyten können die Zellen des Patienten als
fremd erkennen und damit potentiell eine GvHD in der akuten oder chronischen
Form auslösen. Es wurde aber beobachtet, dass sich gerade diese Immunreaktion
der Spender-T-Lymphozyten auch gegen restliche neoplastische Zellen richten
kann, und dass damit die Patienten mit einer GvHD wesentlich besser gegen
Krankheitsrückfälle geschützt waren (Weiden et al, 1979). Dieser Effekt wird als
Graft-versus-Leukämie Reaktion (GvL) bezeichnet und wurde belegt, als bei
krankheitsrückfälligen Leukämiepatienten eine Transplantation ausschließlich mit
Spender-Lymphozyten zum Heilungserfolg führte (Kolb, 1990; Kolb, Holler 1997).
Um sich diesen Effekt zunutze zu machen, wurden in jüngerer Zeit andere
Verfahren der Konditionierungstherapie entwickelt, deren primäres Ziel die
Etablierung der Spenderblutbildung ohne eine weitestgehende Eradikation
17
neoplastischer Stammzellen ist. Dieses Therapieziel kann mit vorrangig
immunsuppressiven Verfahren erreicht werden, bei denen die Dosis-Intensität
wesentlich geringer ist (reduzierte Konditionierung), als bei den herkömmlichen
myeloablativen Konditionierungsschemata. Die antineoplastische Wirkung der
allogenen Stammzelltransplantation nach reduzierter Konditionierung beruht
entscheidend auf den T-Lymphozyten des Spenders, welche gegen die von
neoplastischen Stammzellen exprimierten Histokompabilitäts-Antigene, aber
möglicherweise auch gegen Leukämie-assoziierte Antigene reagieren und die
Leukämiezellen dadurch vernichten können. Zur Induktion des GvL-Effektes nach
einer Konditionierung mit reduzierter Intensität ist ein frühzeitiges Ausschleichen
der immunsuppressiven Therapie erforderlich, die zur Vorbeugung oder zur
Therapie
immunologischer
Posttransplantationsverlauf
Unverträglichkeitsreaktionen
appliziert
wird.
Reicht
der
Entzug
im
der
immunsuppressiven Medikation allein nicht aus, können Spender-T-Zellen (DonorLymphocytes-Infusion, DLI) in aufsteigender Dosis fraktioniert übertragen werden,
bis ein vollständiger Chimärismus (Lymphozyten haben den Genotyp des
Spenders, keine patienteneigenen Lymphozyten mehr nachweisbar) der SpenderT-Zellen und/oder eine komplette Remission der Erkrankung erreicht ist.
Der medizinische Gewinn, der aus der Reduzierung der Konditionierungsintensität
resultiert, liegt vor allem darin, dass aufgrund der geringeren Toxizität auch
Patienten mit höherem Alter, reduziertem Allgemeinbefinden oder bestehenden
Infektionen mit dieser Methode therapiert werden können (McSweeney et al, 2001;
Slavin
et
al,
1998).
Die
Nebenwirkungen
durch
die
Toxizität
der
Chemotherapeutika wie Diarrhöen, Übelkeit, Erbrechen, Mukositis und Haarausfall
sind bei diesem reduzierten Regime ebenfalls weniger ausgeprägt. Des Weiteren
wurde bei den Patienten beobachtet, dass nach der Transplantation weniger
Transfusionen von Erythrozyten - und Thrombozytenkonzentraten notwendig
waren und der Charakter der Zytopenien im Posttransplantationsverlauf weniger
aggressiv war, als im Vergleich zu myeloablativ vorbehandelten Patienten
(Weissinger et al, 2001; Childs et al, 1999).
Ob zusätzliche positive Effekte auch für die Regenierung der Stromazellen des
Knochenmarks und seiner protektiven Rolle gegenüber der Hämatopoese nach
der Transplantation der geringeren Toxizität dieses Konditionierungsschemas
zuzuschreiben ist, bleibt noch abzuwarten.
18
Die bisherigen klinischen Erfahrungen mit reduzierten Konditionierungsschemata
vor allogener Stammzelltransplantation zeigen jedoch, dass dieses Verfahren
auch
bei
älteren
Patienten
oder
bei
Patienten
mit
limitierenden
Begleiterkrankungen deutlich besser verträglich ist, als eine myeloablative
Konditionierung. Somit kann auch diesen Patienten die Therapiemöglichkeit einer
Stammzelltransplantation angeboten werden und damit zu einer Senkung der
Frühmortalität beitragen. Die erfolgreichen Stammzelltransplantationen bei älteren
Patienten mit reduzierter Konditionierungstherapie scheinen dies zu bestätigen
(Gratwohl et al, 2002).
1.4 Das Knochenmark
Das blutbildende oder rote Knochenmark (KM) ist ein weiches und fetthaltiges
Gewebe,
welches
die
Hohlräume
zwischen
den
Knochenbälkchen
der
Knochenspongiosa ausfüllt.
Dabei bilden die retikulären Bindegewebszellen mit ihren Fortsätzen ein stabiles
Gerüst, das so genannte Knochenmarkstroma. In den dazwischen liegenden
Hohlräumen, den Sinusoiden, nisten die hämatopoetischen Stammzellen und
stehen damit in ständiger Verbindung mit den Stromazellen.
Frühere Beobachtungen einer nicht zufälligen räumlichen Verteilung der
erythroiden sowie der myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark führten zu der
Vermutung, dass hämatopoetisches Gewebe eine differenzierte Struktur besitzt,
die eine wesentliche Bedeutung für die Proliferation und Differenzierung
hämatopoetischer Zellen hat (Lambertsen et al; 1984, Lord et al, 1975). Die
Entwicklung experimenteller Methoden, z.B. in vitro–Assays für hämatopoetische
Vorläuferzellen (Metcalf et al, 1979), in vitro–Knochenmarklangzeitkulturen (Dexter
et al, 1984), sowie die Genklonierung für verschiedene hämatopoetische Zytokine
(Olsson et al, 1992; Sieff et al, 1987) ermöglichte weitere umfassende
Untersuchungen der strukturellen und physiologischen Eigenschaften des
hämatopoetischen Milieus, sowohl in vitro als auch in vivo.
Die auf diesem Weg gewonnenen Erkenntnisse zeigen, dass die Blutbildung über
komplexe
Interaktionen
unterschiedlichen
zwischen
Stromazellen
hämatopoetischen
reguliert
19
wird
und
Zellen
der
sowie
den
Funktion
der
Knochenmarkstromazellen hierbei eine entscheidende Rolle zukommt (Cashman
et al, 1990; Eaves et al, 1991; Liesveld et al, 1989).
1.4.1 Mesenchymale Stammzellen
Das Knochenmark beherbergt neben den hämatopoetischen Stammzellen auch
Stammzellen, die sich nicht in hämatopoetische Zelltypen differenzieren, die
mesenchymalen Stammzellen (MSC). Diese Zellen sind CD45-, CD34- (Graf,
2002) und konnten auch in anderen Geweben, wie Fettgewebe, in Plazenta, in
Gelenksynovia, wie auch im Nabelschnurblut nachgewiesen werden (Gronthos et
al, 2001; Fukuchi et al 2004; De Bari et al, 2001; Lee et al 2004). Es gibt bislang
keine
sichere
Übereinstimmung
bezüglich
der
Charakterisierung
der
mesenchymalen Stammzellen. Daher werden die Stammzell-Populationen nach
den verwendeten Kulturbedingungen und Methoden zur Isolierung unterschieden:
•
nach Friedenstein (Friedenstein et al, 1976; Owen et al, 1987)
•
nach Prockop (Colter et al, 2000, 2001)
•
nach Simmons (Simmons, Torok-Storb, 1991) und
•
nach Verfaillie (Reyes et al, 2001a; Reyes, Verfaillie, 2001b).
Unter definierten Bedingungen können mesenchymale Stammzellen in vitro in
Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten Muskelzellen, Vorläufer von Neuronen
und in Stromazellen differenziert werden (Caplan, 1991; Pittenger et al, 1999;
Wakitani et al, 1995; Woodbury et al, 2000; Makino et al 1999).
Im Jahr 2001 wurde von der Arbeitsgruppe um Verfaillie eine weitere in vitro
adhärent wachsende adulte Stammzelle aus dem Knochenmark beschrieben,
welche als MAPC (multipotent adult progenitor cells) bezeichnet wird (Reyes,
Verfaillie,
2001b).
Diese
Zellen
besitzen
neben
der
Fähigkeit
einer
mesenchymalen Differenzierung auch das Potenzial sich in funktionell aktive
Zellen von Endothel, Neuroektoderm (Neurone, Astrozyten, Oligodendrozyten)
und in Hepatozyten zu differenzieren (Jiang et al, 2002a; Jiang et al, 2002b;
Schwartz et al, 2002). Es konnte gezeigt werden, dass MAPC auch in vivo ihre
eigentliche pluripotente Differenzierungsfähigkeit entfalten können, indem sie sich,
als murine Einzelzellen in frühe Blastozysten injiziert, in den Organismus
integrieren konnten und an der Entwicklung fast aller somatischen Gewebe
beteiligt waren (Jiang et al, 2002a).
20
Kürzlich konnte eine weitere Population von pluripotenten Stammzellen aus
murinem Knochenmark (Kucia et al, 2006) und aus humanem Nabelschnurblut
(Kucia et al, 2007) beschrieben werden. Diese Zellen, als VSEL (very small
embryonic like cells) bezeichnet, haben eine ähnliche Morphologie und einen
ähnlichen Phänotyp wie embryonale Stammzellen. Des Weiteren besitzen sie die
Fähigkeit, sich in vitro in Zellarten aller drei Keimbätter zu differenzieren. Sowohl
für MAPC als auch für VSEL wurden bereits viele Oberflächenmarker
nachgewiesen
(Anjos-Afonso,
2007).
Es
zeigten
sich
auch
hier
häufig
Übereinstimmungen, was vermuten lässt, dass es sich hier möglicherweise um
denselben Zelltyp handeln könnte (Ratajczak et al, 2007). Auch ist es unklar, ob
es sich bei diesen Zelltypen um eine seltene, besonders frühe und unreife
Subfraktion der mesenchymalen Stammzellen handelt, oder um gänzlich andere
Zellen. Es konnte bislang auch nicht zweifelsfrei gezeigt werden, ob das vielseitige
Differenzierungspotential tatsächlich in vivo existiert, oder erst durch spezifische
Kulturbedingungen in vitro induziert wird (Gurtner et al, 2007; Herzog et al, 2003).
1.4.2 Struktur und Funktion der Knochenmarkstromazellen
Die Knochenmarkstromazellen sind strukturell in hämatopoetischen Mikromilieus
organisiert. Damit wird ein lokales Netzwerk beschrieben, welches durch
komplexe Interaktionen die Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung
hämatopoetischer Stammzellen, bzw. Vorläuferzellen beeinflussen kann (Dexter,
1982).
Dieses Mikromilieu wird gebildet durch:
•
die
verschiedenen
Elemente
von
Stromazellen
wie
Adipozyten,
Fibroblasten, Makrophagen, und Endothelzellen,
•
Immunzellen wie B- und T-Lymphozyten, Natürliche Killerzellen
•
pluripotente
Stammzellen,
durch
ihre
Fähigkeit
der
ständigen
Selbsterneuerung und Bildung von Vorläuferzellen aller hämatopoetischen
Zelllinien definiert
•
Vorläuferzellen, welche im Teilungs- und Differenzierungspotential bereits
festgelegt sind und
•
bereits ausgereifte Zellen aller Zelllinien
(Dorshkind, 1990; Mayani et al, 1992a; Torok-Storb et al, 1988).
21
Fibroblastäre Zellen machen den größten Anteil der Knochenmarkstromazellen
aus. Sie können sich in zwei Populationen differenzieren. Zum einen adventitielle
Fibroblasten, welche die Endothelzellen umgeben. Sie regulieren u.a. den Übertritt
reifer Blutzellen in die Knochenmarksinus. Die zweite Population fibroblastärer
Zellen ist innerhalb der blutbildenden Areale lokalisiert. Diese Zellen bilden durch
ihre zytoplasmatischen Ausläufer sowohl ein stützendes Gerüst, stehen aber auch
darüber in direktem Zell-Zell-Kontakt mit den hämatopoetischen Zellen (Lichtman,
1984; Shaklai et al, 1979).
Makrophagen hingegen differenzieren sich aus hämatopoetischen Stammzellen
(Bradley et al, 1966). Einerseits umgeben sie die perisinusoidalen Endothelzellen,
des Weiteren sind sie aber auch in erythroblastischen Arealen zu finden, wo
einzelne Makrophagen von reifenden Erythroblasten umgeben sind. Diese
„zentralen Makrophagen“ stehen über interzelluläre Verbindungen wie gap
junctions mit den erythroiden Vorläuferzellen in direktem Kontakt und sind in der
Lage hämatopoetische Wachstumsfaktoren freizusetzen (Campbell et al, 1987).
Somit scheint ihnen eine Schlüsselrolle in der Regulation der Reifung
erythrozytärer Zellen zuzukommen (Lichtman, 1984; Shaklai et al, 1979).
Weit weniger eindeutig ist, welchen Einfluss Endothelzellen und Adipozyten auf
die
Blutbildung
haben.
Es
konnte
aber
gezeigt
werden,
dass
beide
Zellpopulationen ebenfalls zur Bildung hämatopoetischer Wachstumsfaktoren
fähig sind (Lanotte et al, 1982; Quesenberry et al, 1987).
Die extrazelluläre Matrix eine Substanz mit hochorganisierter Struktur, welche
von verschiedenen Stromaelementen, vor allem Endothelzellen, Makrophagen
und Fibroblasten gebildet wird stellt einen weiteren wichtigen Bestandteil des
hämatopoetischen Mikromilieus dar. Die Hauptbestandteile sind Kollagen,
Proteoglykane, sowie die Glykoproteine, Fibronektin und Laminin (Campbell et al,
1987; Nathan et al, 1987; Owen et al, 1988). Die extrazelluläre Matrix besitzt eine
physikalisch stabilisierende Funktion und ist im Besonderen auch an der
Interaktion zwischen Stromazellen und hämatopoetischen Zellen beteiligt. Es
konnte beobachtet werden, dass Glykosaminoglykane als Bestandteil der
Proteoglykane die von den Stromazellen sezernierten Wachstumsfaktoren binden
können (Gordon et al, 1987). Des Weiteren konnten spezifische Rezeptoren für
das
Glykosaminoglykan
Hyaluronsäure
22
identifiziert
werden,
welche
eine
Freisetzung der Zytokine Interleukin 1 (IL-1) und Interleukin 6 (IL-6) durch
Makrophagen katalysieren (Khaldoyanidi et al, 1999).
Zytokine sind von entscheidender Bedeutung für die Regulation von Wachstum
und Differenzierung hämatopoetischer Vorläufer- und Stammzellen. Sie werden zu
einem großen Teil von den Stromazellen des Knochenmarks gebildet und können
sowohl einen stimulierenden, als auch einen hemmenden Einfluss auf die
Hämatopoese ausüben (Cashman et al, 1990; Delwiche et al, 1985; Eaves et al,
1991; Mayani et al, 1992b; Sieff, 1987).
Makrophagen
Stimulatorische
Inhibitorische
Zytokine/Wachstumsfaktoren
Zytokine/Wachstumsfaktoren
IL-1, IL-6,
TGF-, TNF-, IFN-
G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF
IL-1, IL-6,
Endothelzellen
IFN-
G-CSF, M-CSF, GM-CSF
IL-1
Fibroblasten
IFN-, IFN-
G-CSF, GM-CSF
Tabelle 1: Beispiele zytokin-produzierender Stromazellen
Die Komplexität der zellulären Interaktionen des hämatopoetischen Mikromilieus
wird
durch
die
Wirkungsweise
der
Zytokine
widergespiegelt.
Durch
transmembranöse Rezeptoren oder zytokinbildende Proteine vermittelt, ist der
Wirkeffekt sowohl von der Zytokinkonzentration, als auch von der Art und dem
Reifungsgrad der Zielzelle abhängig (Olsson et al, 1992; Dorshkind et al, 1990).
Außerdem unterliegen die Stromazellen und damit die Zytokinproduktion und
Sekretion selbst der Regulation verschiedener Zytokine, sowohl eigener als auch
fremder
(Pietrangeli
et
al,
1988).
Daher
wird
eine
basale
von
einer
bedarfsinduzierten Zytokinproduktion unterschieden (Dorshkind et al, 1990;
Mayani et al, 1992a).
Es wird deutlich, dass die Hämatopoese im Knochenmark das Ergebnis eines
Gleichgewichts aus stimulierenden und inhibierenden Faktoren ist, welches
wesentlich
durch
die
Zellen
des
Mikromilieus,
insbesondere
der
Knochenmarkstromazellen in Form von direkten Zell-Zell-Kontakten, Bildung der
extrazellulären Matrix, sowie Produktion und Sekretion von löslichen oder
23
membrangebundenen Zytokinen reguliert wird (Clark et al, 1987; Dexter, 1982;
Gordon et al, 1987; Makgoba et al, 1988; Metcalf, 1989; Toksöz et al, 1980).
1.5. Entstehungsmechanismen des nicht-hämatopoetischen
Chimärismus
Mit
dem
Ziel
die
verschiedenen
Prozesse
während
einer
Knochenmarktransplantation im Detail zu verstehen, wurden in der Vergangenheit
unzählige Forschungen betrieben. Dabei wurde der Fokus hauptsächlich auf das
Engraftment, die anschliessende Hämatopoese und die Immunrekonstitution
gelegt. Daher wurde den möglichen Effekten der HZT auf die nichthämatopoetischen Gewebe zunächst wenig Beachtung geschenkt. 1998 wurde
von
der
Arbeitsgruppe
von
Ferrari
das
Forschungsfeld
der
Stammzelltransplantation revolutioniert, indem sie vermuteten, dass Fibroblasten
in Muskelzellen transdifferenzieren können (Ferrari et al, 1998), was somit zu der
Annahme führte, dass im Knochenmark gewebespezifische Stammzellen
beherbergt sind. Bislang herrschte die Meinung vor, dass jedes Gewebe im
adulten Organismus seine gewebespezifischen, adulten Stammzellen enthält,
welche über linienspezifische Vorläuferzellen terminale ausgereifte Zellen des
entsprechenden Gewebes hervorbringt und weder ein Wechsel zwischen
verschiedenen
Zelllinien
möglich
ist,
noch
eine
Umkehrung
der
Differenzierungsrichtung (Hüttmann et al, 2003; Wagers, Weissman, 2004).
Zahlreiche Untersuchungen wurden anschließend durchgeführt und es wird sich
bis heute mit dem Phänomen des nicht-hämatopoetischen Chimärismus
auseinandergesetzt. Dabei umfassen mögliche Theorien das Vorkommen von
multi- bis pluripotenten Stammzellen im Knochenmark, über welche bereits
berichtet worden ist (z.B. MAPC und VSEL, siehe auch Abschnitt 1.4.1), die
Fusion von Spender und Empfängerzellen und die Konversion von determinierten
Knochenmarkzellen in andere Differenzierungen. Es ist bislang allerdings nicht
eindeutig geklärt, welcher genaue Mechanismus für das Auftreten eines nichthämatopoetischen Chimärismus verantwortlich ist.
24
1.5.1 Zellkonversion: Plastizität und Transdifferenzierung
Im frühen Embryonalstadium beginnt bereits in den Zellen der Prozess, welcher
eine Aufteilung in die drei zukünftigen Gewebetypen (Keimblätter) bewirkt. Somit
bilden die drei Keimblätter (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm) den
embryonalen Ursprung aller Körperzellen, denn jede differenzierte Zelle lässt sich
von diesen Keimblättern ableiten. Aus dem Ektoderm entwickeln sich die
Epidermis und das Nervensystem, das Endoderm bringt den Darm, die Lunge und
die Leber hervor. Muskeln, Knorpel, Knochen, Herz, Blut und Niere enstehen aus
dem Mesoderm. Es galt lange Zeit als Dogma, dass nach der Entstehung der
Keimblätter die Zugehörigkeit sämtlicher (adulter) Stammzellen und deren
Abkömmlingen zu einem Keimblatt irreversibel festgelegt ist und sie sich somit
nicht in spezialisierte Zellen eines anderen Gewebetypes entwickeln können.
Allerdings konnte in jüngerer Zeit gezeigt werden, dass scheinbar zumindest
einige adulte Stammzellen sich unter geeigneten Bedingungen auch über
Gewebe- und sogar Keimblattgrenzen hinweg zu differenzieren vermögen (Blau et
al, 2001).
Des
Weiteren
berücksichtigt
das
klassische
Konzept
der
linientreuen
Zelldifferenzierung nicht, dass u.a. durch lokale und systemische humorale
Signale, durch Kontakt mit umgebenden Zellen und durch Faktoren der
extrazellulären Matrix eine spezifische Umgebung (Mikromilieu) geschaffen wird,
welche auf den Phänotyp der Zellen Einfluss nehmen können. Daher wird
mittlerweile vermutet, dass die Zelldifferenzierung nicht einfach hierarchisch
gegliedert ist, sondern dass durch Veränderungen im Mikromilieu der Zustand der
Zelldifferenzierung veränderbar ist (Blau et al, 2001; Fuchs, Segre, 2000;
Quesenberry et al, 2002).
In einer Reihe von Studien, in welchen nach allogener HZT Spenderzellen in nichthämatopoetischen
Geweben
nachgewiesen
werden
konnten
(z.B.
Leber,
Pankreas, Skelettmuskel, Nervengewebe und Endothel) wurde der Begriff
„Transdifferenzierung“ verwendet. Darunter versteht man den Prozess, wenn
Zellen gewebespezifische Eigenschaften verlieren und Kennzeichen eines
anderen Gewebes ausbilden.
Andere
Autoren
prägten
Differenzierungsflexibilität
den
von
Begriff
Zellen.
25
„Plastizität“
Damit
wird
in
die
Bezug
auf
Fähigkeit
die
von
gewebespezifischen Stammzellen bezeichnet, eine Nachkommenschaft zu
erzeugen, welche allerdings die Eigenschaften eines anderen Gewebetypes
besitzen (Alvarez-Dolado, 2003). So zeigten Krause et al, dass eine einzelne
Knochenmarkzelle (im Verdünnungsversuch definierte Lin--KM-Zelle) fähig war,
nach der Transplantation in letal bestrahlten Mäusen, die Hämatopoese langfristig
zu regenerieren und sich im weiteren Verlauf in epitheliale Zellen der Leber,
Lunge, Gastrointestinaltrakt und der Haut differenzieren konnte und somit ein
nicht-hämatopoetische Chimärismus detektiert wurde (Krause et al, 2001).
Um der Fülle an neuen Beschreibungen und der daraus resultierenden Konfusion
im Forschungsfeld des nicht-hämatopoetischen Chimärismus Einhalt zu gebieten
wurden in der Folgezeit klare Kriterien geschaffen, welche die Phänomene der
Differenzierungsflexibilität besser charakterisieren sollten und dies unter dem
Begriff „Zellkonversion“ zusammengefasst.
Die Existenz dieser Zellkonversion wurde bei niederen Wirbeltieren eindrücklich
bewiesen, als gezeigt wurde, dass Amphibien fähig sind Gewebeschädigungen
vollständig zu regenerieren. Dabei dedifferenzieren reife Zellen nahe der Wunde in
primitive
Vorläuferzellen,
welche
dann
durch
Proliferation
und
erneute
Differenzierung den Defekt komplett ersetzen (Brockes, Kumar, 2002). Allerdings
konnte bis heute nicht zweifelsfrei gezeigt werden, dass dieses Phänomen im
Säugerorganismus in vivo gleichfalls stattfindet (Spyridonidis et al, 2008).
1.5.2 Zellfusion
Ein
weiterer
Mechanismus,
welcher
für
die
Entstehung
des
nicht-
hämatopoetischen Chimärismus ursächlich sein soll, ist das Phänomen der
Zellfusion. Die Fusion von Zellen ist ein physiologisches Ereignis beim Menschen:
das menschliche Leben beginnt mit der Fusion von Eizelle und Spermium. Aber
auch im adulten Organismus fusionieren Zellen, z.B. bei der Entstehung von
Osteoklasten aus mononukleären Phagozyten (Vignery, 2000), oder von
Muskelfasern aus Myoblasten (Anderson, 2000).
Es wird vermutet, dass nicht-hämatopoetischer Chimärismus nach einer allogenen
HZT
durch
die
Fusion
von
Stammzellen
aus
dem
Knochenmark
mit
gewebespezifischen, bereits terminal differenzierten Zellen entsteht. Zunächst
waren in vitro Versuche richtungsweisend (Ying et al, 2002; Spees et al, 2003).
26
Der Zusammenhang zwischen Zellfusion und Differenzierungsflexibilität von Zellen
konnte aber auch in vivo hergestellt werden. Vassilopoulos et al konnten bei FAHknockout-Mäusen zeigen, dass die Zellfusion das Prinzip für die Generierung
chimärer FAH+-Hepatozyten nach HZT mit FAH+-Spenderzellen darstellte. Im
Kontrast dazu stehen zwei Studien ebenfalls an Mäusen, welche zeigten (unter
Verwendung eines Cre/lox-Systems), dass nach einer HZT epitheliale Zellen aus
Lunge, Leber und Haut (Harris et al, 2004) bzw. Pankreaszellen (Ianus et al, 2003)
ohne Fusion aus Knochenmarkzellen entstehen. Daher kann auch die Zellfusion
nicht als ausschliessliche Erklärung für die Entstehung chimärer Zellen in nichthämatopoetischen Geweben nach einer Stammzelltransplantation dienen.
1.6 Zielsetzung
Die verschiedenen Elemente des Stroma im Knochenmark stellen die strukturelle
und funktionelle Unterstützung für die hämatopoetischen Stammzellen dar. Wird
dieses Mikromilieu bei der Therapie einer neoplastischen Erkrankung des
hämatopoetischen
Systems
nun
einer
aggressiven
Chemotherapie
oder
Strahlentherapie ausgesetzt, werden die Stromazellen ebenso angegriffen und
eliminiert, wie die erkrankten Stammzellen. Nach der Transplantation muss sich
demnach das gesamte „System“ regenerieren. Die Stromazellen können hier eine
besondere Rolle in ihrer Funktion als Regulator der Hämatopoese einnehmen
(Torok-Storb,
Holmberg,
1994).
Es
kann
aber
auch
zu
verlängerten
Erholungszeiten der Hämatopoese nach der Transplantation (Migliaccio et al,
1990; Carlo-Stella et al, 1997). Besonders die hochdosierte Strahlentherapie im
Vergleich zur Chemotherapie oder die sequentielle Hochdosischemotherapie im Vergleich zur Single-Hochdosischemotherapie sind toxischer für die
Stromazellen (Ayash et al, 1994; Bitran et al, 1996). Dies wurde durch die
Beobachtung verzögerter hämatopoetischer Erholung nach Transplantation und
vorausgehender Strahlentherapie oder Single-Hochdosischemotherapie trotz
vergleichbarer infundierter Menge von hämatopoetischen Stammzellen und durch
Versuche in vitro gezeigt (Moreau et al, 2002).
Mit der vorliegenden Arbeit soll eine Einschätzung über die potentiellen Vorteile
der
reduzierten
Konditionierung
im
Vergleich
zu
den
myeloablativen
Konditionierungen bezüglich der Zerstörung der Kochenmarkstromazellen, die als
27
strukturelle und funktionelle Unterstützung für die hämatopoetischen Stammzellen
fungieren, in vivo möglich gemacht werden.
Knochenmark, in vitro als Langzeitkultur angesetzt, besitzt die Fähigkeit
Stromazellen zu generieren. So wurden Knochenmarkproben von insgesamt 55
Patienten nach einer allogenen Stammzelltransplantation in Kultur gesetzt. 32
Patienten,
welche
mit
einem
auf
Fludarabin
basierten,
reduzierten
Konditionierungsschema behandelt wurden, konnten mit einer Kontrollgruppe von
23
Patienten
verglichen
werden,
Busulphan/Cyclophosphamid-Regime
die
oder
eine
eine
Behandlung
mit
einem
Ganzkörperbestrahlung
als
Konditionierung vor der Transplantation erhielten.
Die
verschiedenen
Wachstumsraten
Knochenmarkproben
von
der
Stromazellen
Patienten
mit
der
einzelnen
unterschiedlichen
Konditionierungstherapien sollten stellvertretend für die toxischen Effekte der
verschiedenen Konditionierungsverfahren in vivo dienen.
Zunächst wurden jedoch alle Zellen der Proben morphologisch untersucht, um den
vielseitigen Charakter des Knochenmarkstroma darzustellen. Hierfür wurden die
Zellen nativ betrachtet und Immunfluoreszenzfärbungen mit verschiedenen
stromalen Markern (z.B. Vimentin für mesenchymale Zellen, von-WillebrandFaktor für endotheliale Zellen) durchgeführt.
Außerdem wurden verschiedene Faktoren, wie z.B. Patientenalter, Diagnose
Remissionsstatus u.a., von welchen eine Einflussnahme auf das Stromawachstum
nicht
ausgeschlossen
werden
konnte,
hinsichtlich
des
Knochenmarkstromawachstums untersucht.
Um eine Aussage über die Herkunft der Knochenmarkstromazellen machen zu
können, wurde eine Chimärismusanalyse bei den Proben von sechs Patientinnen
nach der allogenen Stammzelltransplantation durchgeführt. Alle Patientinnen
wurden mit einem reduzierten Regime konditioniert. Die Spender waren allesamt
männlich
(sex-mismatched
Stammzelltransplantation),
sodass
die
Chimärismusanalyse mittels Y-Chromosom Fluoreszenz in-Situ Hybridisierung
und Immunfluoreszenzfärbungen den Ursprung der Stromazellen zeigen konnte.
28
2 Material
2.1. Geräte
Cryotubes
Corning, Schipohl- Rijk, NL
Deckgläser
neoLab, Heidelberg, D
Elektrische Pipette Pipetboy
Integra Biosciences, Fernwald, D
Falcon -Tubes
Falcon, Heidelberg, D
Färbeküvetten
neoLab, Heidelberg, D
HYBrite
Vysis, Bergisch-Gladbach, D
Inverses Mikroskop CK2
Olympus, Hamburg, D
Kochplatte mit Magnetrührer
Janke&Kunkel, Staufen, D
Laborflaschen
neoLab, Heidelberg, D
Megafuge 1,0 R
Heraeus Sepatech, Stuttgart, D
Neubauer-Zählkammer
Brand, Wertheim/Main, D
pH-Meter pH 535 MultiCal
WTW, Weilheim, D
Pattex Pistole Supermatic 200 plus
Henkel, Düsseldorf, D
Pattex hot Sticks
Henkel, Düsseldorf, D
Phasenkontrastmikroskop LSM 510
Carl Zeiss AG, Jena, D
Pipetus Akku
Hirschmann, Eberstadt, D
Pipettenspitzen
Greiner, Frickenhausen, D
Präzisionswaage Scaltec SBC52
Scaltec, Heiligenstadt, D
Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg, D
SafeLock-Tubes
Eppendorf, Hamburg, D
Sicherheitswerkbank
Heraeus Sepatech, Stuttgart, D
Vortex REAX top
Heidolph, Schwabach, D
Wasserbad
Julabo, Seelbach, D
Zellinkubator
Heraeus Sepatech, Stuttgart, D
Zellkulturflaschen
Becton Dickinson, Heidelberg, D
Zweikammer-Objektträger
Becton Dickinson, Heidelberg, D
29
2.2 Chemikalien und Reagenzien
Aceton
SIGMA, Deisenhofen, D
Antikörperverdünnungsmedium
DAKO, Glostrup, DK
Bovines Serum Albumin (BSA)
SIGMA, Deisenhofen, D
Di-NatriumhydrogenphosphatDihydrat
Merck, Darmstadt, D
Ethanol
Baker, Deventer, NL
Fetal Calf Serum (FCS)
Seromed, Berlin, D
Goat-Serum
DAKO, Glostrup, DK
Human Albumin 20% Immuno
Baxter, Unterschleißheim, D
Hydrocortison
SIGMA, Deisenhofen, D
Kaliumdihydrogenphosphat
Merck, Darmstadt, D
Liquemin N 5000
Hoffmann LaRoche, Basel, CH
Methanol
Merck, Darmstadt, D
Natriumcitrat-Dihydrat
Merck, Darmstadt, D
Natriumchlorid
Merck, Darmstadt, D
NP-40 (Nonoxynol 40)
Calbiochem/Merck, Darmstadt, D,
ProLong Antifade Mounting Medium
Molecular Probes, Leiden, NL
RNAse A
Hoffmann LaRoche, Basel, CH
Trypsin-EDTA
SIGMA, Deisenhofen, D
Tween 20
SIGMA, Deisenhofen, D
2.3 Antikörper
monoclonal mouse anti-human CD45,
Leucocyte Common Antigen
(Clones 2B11, PD7/26)
Dako, Glostrup, DK
monoclonal mouse anti-human-CD14,
(Clone Tük 4)
Dako, Glostrup, DK
mouse-anti-human-Vimentin
Biotechnology, Heidelberg, D
mouse-anti-human-von-Willebrand Factor
Serotec, Düsseldorf, D
Alexa 647 F(ab`)2 fragment of goat
anti-mouse IgG (H+L)
Molecular Probes, Leiden, NL
30
Draq5
Biostatus, Shepshed, UK
mouse IgG1-FITC
Immunotech, Marseille, F
mouse-anti-human-CD45-FITC
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D
mouse IgG1+2-negative Control
Serotec, Düsseldorf, D
2.4 Y-Chromosom-Gensonde
CEP Y (Satellite III) Spectrum orange
Vysis, Bergisch-Gladbach, D
Hybridisierungspuffer
Vysis, Bergisch-Gladbach, D
2.5 Lösungen und Medien
MyeloCult H5100
StemCell Technologies, Vancouver, CA
Phosphat buffered Saline (PBS)
GIBCO, NY, USA
Saline sodium citrate (SSC):
175,3g NaCl +
88,2g Na-Citrat-Dihydrat +
800ml Aqua bidest; pH auf 7,0 einstellen
Volumen mit Aqua bidest auf 1000 ml
autoklavieren
2x SSC-Waschlösungen:
100ml 20xSSC+
2x SSC/0,1% NP40
1ml NP40 bzw.
2x SSC/0,3% NP40
3ml NP40 bzw.
2x SSC/0,1% Tween20
1ml Tween20 +
850ml Aqua bidest; pH auf 7,0 einstellen
Volumen mit Aqua bidest auf 1000ml
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Stammlösung (20x):
29,25g Na2HPO4 x 2 H2O +
4,9g KH2PO4 +
160g NaCl
Volumen mit Aqua bidest auf 1000ml,
30 min rühren (pH 6,8- 7,0)
31
3 Methoden
A: Generierung von Knochenmarkstromazellen in vitro
3.1 Patientenauswahl
Diese Studie schließt insgesamt 82 Patienten ein, welche zwischen 2000 und
2003 eine allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation als Therapie einer
hämatologischen Neoplasie an der Universitätsklinik Freiburg erhalten hatten. Die
Auswahl der Patienten erfolgte nach dem Zufallsprinzip. Für diagnostische
Zwecke wurde den Patienten aus dem Beckenkamm regelmäßig heparinisiertes
Knochenmark entnommen. Nach Einwilligung der Patienten konnte Zellmaterial,
welches für die Routineuntersuchungen nach der HZT nicht mehr benötigt wurde
für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden.
Die Proben wurden vor der Konditionierung, am Tag +30 und Tag +100 nach der
Transplantation gewonnen und direkt in Langzeitkulturen angesetzt. Es wurden
insgesamt 125 Kulturen von den 82 Patienten angesetzt. Davon waren 36
Kulturen von 10 Patienten im Verlauf kontaminiert, wurden verworfen und gingen
damit nicht in die Analyse ein.
In die Auswertung sind somit 89 Proben eingegangen. Dabei wurden bei 17
Patienten Proben nur vor der allogenen Stammzelltransplantation entnommen (17
Proben) und für die Analyse nach der Transplantation standen von insgesamt 55
Patienten 72 Proben zur Verfügung.
Anhand des Konditionierungsregimes vor der Transplantation wurden die 55
Patienten in drei Gruppen eingeteilt:
1. Patienten mit reduzierter Konditionierung (FBM-Gruppe, n=32)
2. Patienten mit myeloablativer Standardchemotherapie (BuCy-Gruppe, n=14)
3. Patienten mit myeloablativer Standardchemotherapie und fraktionierter
Bestrahlung (TBI-Gruppe, n=9)
Die klinischen Charakteristika sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
32
Konditionierung
FBM
Patientenanzahl
Standardmyeloablativ
total
32
23
55
54 (22-67)
40 (20-51)
45 (20-67)
17/15
16/7
33/22
KM
2
5
7
PBSC
30
18
48
AML
12
11
23
ALL
0
9
9
MDS
3
1
4
CML/MPS
3
2
5
MM, NHL/CLL
10
0
10
SAA
4
0
4
CR1/2
3
10
13
CP1
0
1
1
SAA/MDS unbehandelt
8
1
9
andere
21
11
32
familiär HLA-ident
7
9
16
familiär HLA-nicht ident
1
0
1
fremd HLA-ident
22
11
33
fremd HLA-nicht ident
2
3
5
ja
25
14
39
nein
8
9
17
CsA/MTX
3
21
24
CsA/MMF
26
2
28
andere
3
2
5
Alter
1
Geschlecht (m/w)
Transplantat
Diagnose
Remissionsstatus
Spender
ATG
Immunsuppression
33
Konditionierung
Standard-
FBM
myeloablativ
total
Akute GvHD
Grad 0-I
20
14
34
Grad II-IV
12
9
21
Patient+ und/oder Spender+
26
21
47
beide negativ
6
2
8
ja
15
13
28
nein
17
10
27
CMV, IgG seropositiv
CMV-Reakivierung
1
Tabelle 2: Klinische Charakteristika der Patienten, Median (Range); CR1/2, erste oder zweite
komplette Remission; CP1 erste chronische Phase
Die klinische Entscheidung, die Patienten mit einer reduzierten Konditionierung,
anstelle einer Standardkonditionierungstherapie für die Transplantation zu
induzieren (Gruppe 1), hing sowohl vom Alter (>55 Jahre), der Diagnose (Schwere
aplastische Anämie (SAA), Lymphome, Myelodysplastisches Syndrom (MDS)), als
auch von den Komorbiditäten ab.
Die Patienten aus der FBM-Gruppe, im Folgenden auch mit FBM abgekürzt,
erhielten ein Schema bestehend aus Fludarabin (150mg/m2), BCNU (BisChlorethyl-Nitrosurea, auch Carmustin, 300-400 mg/kg) und Melphalan (110-140
mg/kg). Eine Ausnahme bildeten Patienten mit schwerer aplastischer Anämie
(SAA), welche mit Fludarabin (150 mg/m2) und Cyclophosphamid (150 mg/kg)
behandelt wurden, aber trotzdem zu dieser Gruppe gerechnet wurden, da dieses
Schema ebenfalls reduziert ist.
Die Patienten aus der myeloablativ behandelten BuCy-Gruppe, im Folgenden mit
BuCy abgekürzt, erhielten die Standardchemotherapie Busulphan (16 mg/kg) und
Cyclophosphamid (120 mg/kg) als Konditionierung. Das Konditionierungsregime
für die Patienten aus der zweiten myeloablativ behandelten Gruppe, im weiteren
Text mit TBI (total body irradiation) benannt, bestand aus einer fraktionierten
Ganzkörperbestrahlung (12 Gy), kombiniert mit einer medikamentösen Therapie
mit Cyclophosphamid (120mg/kg) und Etoposid (50 mg/kg).
34
Zur Prophylaxe gegen die GvHD wurde allen Patienten Cyclosporin A (CsA)
verabreicht. Die Patienten aus der FBM-Gruppe bekamen als zusätzliches
Immunsuppressivum Mycophenolat Mofetil (MMF), die Patienten aus der Gruppe
der myeloablativen Konditionierungen wurden mit Methotrexat (MTX) als Zusatz
am ersten (15 mg/m2), dritten und sechsten (jeweils 10 mg/m2) Tag nach der
Transplantation versorgt.
Darüber hinaus erhielten alle Patienten, bei welchen der Spender nicht familiärer
Herkunft war, oder bei welchen das Transplantat in den HLA-Merkmalen nicht
übereinstimmte, der Spender somit haplo-ident war, noch zusätzlich direkt vor der
Transplantation Antithymozyten-Globulin (ATG-S, 20/mg/kg/d) für 1-3 Tage, um
das Risiko einer Transplantatabstoßung zu minimieren.
35
3.2 Generierung von Knochenmarkstromazellen
Wie oben beschrieben wurde den Patienten im Peritransplantationsverlauf
regelmäßig Knochenmark entnommen um den Verlauf und das Engraftment (das
Anwachsen des Transplantates) beurteilen zu können. Mit dem Einverständnis der
Patienten
konnte
Knochenmarkaspirat,
welches
nicht
mehr
für
die
Routinediagnostik im Rahmen der hämatopoetischen Stammzelltransplantation
benötigt wurde, für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden.
Von insgesamt 72 Patienten konnten 89 Kulturen erfolgreich angesetzt werden. 17
Kulturen (von 17 Patienten) wurden vor Beginn der Konditionierung entnommen,
um eventuelle Unterschiede im Wachstumsverhalten der Stromakulturen vor und
nach der Transplantation und der Konditionierung zu ermitten. Damit sollte eine
Aussage möglich gemacht werden, ob die Behandlung mit den entsprechenden
Konditionierungsregimes eine Vorhersage über die Fähigkeit der Generierung von
Stromazellen in vitro wagen kann.
Die verbleibenden 72 Kulturen von den 55 Patienten nach der hämatopoetischen
Stammzelltransplantation wurden entweder am Tag +30 (n=47) oder Tag +100
(n=25)
nach
der
Transplantation
entnommen.
In
allen
drei
Konditionierungsgruppen konnten Proben untersucht werden, die sowohl vor der
HZT, als auch an Tag +30 und an Tag +100 gewonnen wurden, wie es in Tabelle
3 dargestellt ist.
Proben
Proben
Tag +30 nach
Tag +100 nach
Transplantation
Transplantation
(n=47)
(n=25)
9
28
15
8
19
10
BuCy
5
12
8
TBI
3
7
2
Proben vor
Transplantation
(n=17)
FBM
Standardmyeloablativ
Tabelle 3: Übersicht der gewonnen Proben insgesamt
36
Bei acht Patienten konnten mehrfach Knochenmarkproben (insgesamt 17 Proben)
in Langzeitkulturen angesetzt werden (FBM-Gruppe: Patienten 1-5, 11 Kulturen;
BuCy-Gruppe: Patienten 6-8, 6 Kulturen). Die doppelten Proben der einzelnen
Patienten
wurden
hauptsächlich
an
verschiedenen
Entnahmezeitpunkten
gewonnen (1 Kultur Tag +30 und 1 Kultur Tag +100). Bei einem Patienten war an
einem Entnahmezeitpunkt ausreichend Zellmaterial für mehrere Kulturansätze
vorhanden (FBM1: zwei Kulturen an Tag +30 und eine an Tag +100).
Zeitpunkt der KM-Entnahme
Tag +30 (n)
Wachstum +
Tag +100 (n)
Wachstum -
Wachstum +
FBM 1
2
FBM 2
1
1
FBM 3
1
1
FBM 4
1
1
FBM 5
1
1
BuCy 1
1
BuCy 2
1
1
1
BuCy 3
1
Wachstum -
1
1
Tabelle 4: Übersicht der acht Patienten mit mehrfach angesetzten Kulturen
Die Proben dieser acht Patienten wiesen eine unterschiedliche Dynamik im
Wachstumsverhalten auf, wurden aber bezüglich ihrer Fähigkeit Stromazellen zu
generieren, als positiv gewertet. Für die spätere Analyse der Faktoren, von
welchen
eine
Einflussnahme
auf
die
Fähigkeit
zur
Generierung
von
Knochenmarkstromazellen nicht ausgeschlossen werden konnte (z.B. Alter,
Diagnose, Remissionsstatus), wurden diese acht Patienten aufgrund der
unterschiedlichen Wachstumsdynamik ausgeklammert und die univariate Analyse
mit den verbleibenden 47 Patienten (FBM-Gruppe: 27; Standard-myeloablativeGruppe: 20) durchgeführt (siehe Abschnitt 4.2).
37
3.2.1 Ansatz der Knochenmarkstomakulturen
Alle Proben wurden innerhalb der ersten 24h nach der Entnahme unter
aseptischen
Bedingungen
zur
Kultivierung
vorbereitet.
Das
entnommene
6
Knochenmark wurde in 1-2ml Portionen (ca. 1,5-2x10 Zellen/ml) mit 5ml eines
Nährmediums
(Myelocult
+
Hydrocortison
500ml:25l)
versehen
und
in
Zellkulturflaschen bei 37°C/ 6% CO2 inkubiert.
Zweimal pro Woche wurden die Kulturen hinsichtlich ihres Stromawachstums
mikroskopisch ausgewertet und gleichzeitig die Morphologie der Zellen beobachtet
(siehe auch Abschnitt 3.3 und Abschnitt 4.6.1). Als positives Wachstum wurde ein
Stromazellrasen von mehr als 75% der Fläche der Kulturflasche definiert und der
Zeitraum der Wachstumsphase, welche die Zellen zur Generierung einer
konfluenten
Fläche
benötigten,
wurde
anschließend
protokolliert.
Die
Knochenmarkproben wurden entweder so lange kultiviert, bis ein vollständiger
Zellrasen in den Kulturflaschen gewachsen war, oder bis zu einem Maximum von
acht Wochen. Jene Proben, welche nach acht Wochen kein Stromawachstum
zeigten, bzw. welche weniger als 25% der Kulturflaschenfläche Zellrasen
aufwiesen, wurden negativ gewertet.
3.2.2 Mediumwechsel
Einmal pro Woche musste das Nährmedium gewechselt werden. Beim ersten
Mediumwechsel wurde das Medium vollständig erneuert, bei jedem weiteren
Wechsel nur noch die Hälfte des Volumens aufgefrischt.
Stromazellen wachsen im Gegensatz zu hämatopoetischen (Stamm)Zellen
adhärent und so ist eine Trennung von den mobilen hämatopoetischen Zellen
möglich, damit die Stromazellen optimalen Wachstumsbedingungen ausgesetzt
sind und eine möglichst reine Kultur entstehen kann.
Zunächst wurde das Zell-Mediumgemisch in ein Falconröhrchen überführt und bei
2000 rpm für 5 min zentrifugiert. Beim ersten Wechsel wurde der Überstand fast
vollständig entnommen und die Zellen mit 6ml frischem Nährmedium versetzt. Im
weiteren Verlauf wurde lediglich ein Überstand von 3ml entnommen und durch 3ml
frisches Nährmedium ersetzt. Die Inkubation konnte dann fortgesetzt werden.
38
3.2.3 Zellsplitting
Als eine deutliche Zellvermehrung beobachtet werden konnte, wurden die Zellen
auf zwei neue Kulturflaschen gesplittet. So konnte noch mehr Zellmaterial
gewonnen werden.
Dafür wurden die Stromazellen dreimal mit PBS gewaschen. Zum Lösen der
Zellen aus der Kulturflasche wurde 3ml Trypsin-EDTA auf die Zellen gegeben, die
Kulturflasche leicht angeklopft, und dann ca. 8 min bei 37°/6% CO2 inkubiert. Die
Reaktion wurde mit 10ml PBS/FCS 10% gestoppt. Nach erneutem Zentrifugieren
und zweimaligem Waschen konnten die Zellen in neues Medium aufgenommen
und auf zwei Flaschen zur weiteren Kultivierung verteilt werden.
3.2.4 Zellernte und Fixierung
Etwa 7-10 Tage später hatten sich die Zellen soweit vermehrt, dass sie nun für die
weiteren Untersuchungen geerntet werden konnten.
Hierfür wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und wieder mit 3ml TrypsinEDTA vom Flaschenboden gelöst. Nach Abstoppen der Reaktion mit 10ml
PBS/FCS 10% und erneut zweimaligem Waschen mit PBS, wurden die Zellen in
500l PBS resuspendiert. Die Zellzahl konnte nun in der Neubauerzählkammer
bestimmt werden.
Hiernach pipettierte man 1-2x104 Zellen auf die Objektträgerfläche (4cm2/Kammer)
eines Zweikammerobjektträgers. Es konnten auf zwei Areale pro Objektträger je
à 4cm2 Zellen aufgebracht werden. Der Objektträger hat einen speziellen
Kammeraufsatz und einen für Zellkulturen beschichteten Boden, so dass die
Zellen nach kurzer Inkubation im Nährmedium an den Boden adhärieren können.
Zu den Zellen gab man 800l Nährmedium dazu und inkubierte die Objektträger
dann bei 37°C/6% CO2 für weitere drei Tage.
Als nun die Zellen adhärent waren, konnten sie auf dem Objektträger fixiert
werden. Dazu wurde das Nährmedium abpipettiert, verworfen, und die Zellen
dreimal mit PBS gewaschen. Nachdem die Objektträger völlig getrocknet waren,
wurde der Kammeraufsatz entfernt. Die Zellen wurden in einer Küvette mit
Methanol/Aceton 1:1 bei -20°C für 10 min fixiert und standen somit für die
verschiedenen Färbemethoden zur Verfügung.
39
B: Stromazellpopulation und Chimärismusanalyse
3.3 Immunfluoreszenzfärbungen und FISH-Analyse
Zur Analyse der einzelnen Zellpopulationen der Knochenmarkstromazellproben
und
zur
Differenzierung
(Chimärismusanalyse),
verschiedenen
ihrer
wurden
Herkunft
die
Färbemethoden
von
Zellen
Spender
von
unterzogen.
oder
insgesamt
So
konnten
Empfänger
26
Patienten
die
einzelnen
Zellstrukturen sichtbar gemacht werden.
Wie bereits erwähnt (siehe Abschnitt 3.2.1) erfolgte die erste morphologische
Begutachtung bereits während der Zeit der Kultivierung. Zweimal wöchentlich
wurden die Kulturen unter dem Phasen-Konrast-Mikroskop beobachtet, um das
Wachstumsverhalten
der
Zellen
zu
erfassen.
Um
zusätzlich
zu
der
mikroskopischen Begutachtung einen genaueren Überblick über die Morphologie
der Zellen zu erhalten, wurden zwei Objektträger von je zwei verschiedenen
Patienten (1 FBM, 1 BuCy nach HZT) mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt.
Eine Übersicht über die Patienten ist in den folgenden Tabellen dargestellt.
Alter zum
Patient
Zeitpunkt
(Nr.)
der HZT
Geschlecht
Diagnose
Konditionierung
(Jahre)
Patient/
Tag der
Geschlecht
Probenentnahme
Spender
1
41
MDS
(FBM)
w/
vor HZT
2
55
NHL
(FBM)
w/
vor HZT
3
50
AML
(BuCy)
m/
vor HZT
4
51
ALL
(TBI)
m/
vor HZT
5
35
ALL
(TBI)
w/
vor HZT
Tabelle 5: Patienten mit gefärbten Proben, vor der HZT entnommen
Die
Proben
der
Patienten
Nr.
1-5
wurden
vor
der
hämatopoetischen
Stammzelltransplantation gewonnen, um eine eventuelle Veränderung der
Stromazellpopulationen nach der Konditionierungstherapie und anschließender
Stammzelltransplantation zu erfassen.
40
Alter zum
Patient
Zeitpunkt
(Nr.)
der HZT
Geschlecht
Diagnose
Konditionierung
(Jahre)
Patient/
Tag der
Geschlecht
Probenentnahme
Spender
nicht-geschlechtsidente HZT
6
62
AML
FBM
w/m
Tag +30
7
53
MDS
FBM
w/m
Tag +30
8
66
NHL
FBM
w/m
Tag +30
9
35
MPS
FBM
w/m
Tag +30
10
65
AML
FBM
w/m
Tag +100
11
63
NHL
FBM
w/m
Tag +30
12
42
SAA
FBM
m/w
Tag +30
13
62
MDS
FBM
m/w
Tag +100
14
57
MM
FBM
m/w
Tag +100
15
62
NHL
FBM
m/w
Tag +100
16
58
AML
FBM
m/w
Tag +100
17
41
CML
BuCy
m/w
Tag +30
18
32
AML
BuCy
m/w
Tag +30
19
35
ALL
TBI
m/w
Tag +100
geschlechtsidente HZT
20
22
SAA
FBM
w/w
Tag +30
21
37
AML
FBM
w/w
Tag +100
22
46
AML
BuCy
w/w
Tag +30
23
38
ALL
TBI
w/w
Tag +30
24
64
MDS CML
FBM
m/m
Tag +30
25
65
AML
FBM
m/m
Tag +100
26
35
AML
BuCy
m/m
Tag +100
Tabelle 6: Patienten mit gefärbten Proben, nach der HZT entnommen
Um einen eventuellen Chimärismus der Stromazellen nachzuweisen, wurde bei
den sechs Patientinnen, nach einer sex-mismatched Stammzelltranplantation
(männlicher Spender, weiblicher Empfänger, Patient Nr. 6-11) die Kombination
einer Y-Chromosom-FISH mit Immunfluoreszenzfärbungen für spezifische Marker
der Stromazellen (z.B. Vimentin als Marker für mesenchymale Zellen, vonWillebrand-Faktor als Marker für endotheliale Zellen) verwendet.
41
Damit
sichergestellt
werden
konnte,
dass
keine
kontaminierenden
hämatopoetischen Zellen (CD45+) oder Makrophagen (CD14+) Einfluß auf das
Ergebnis nehmen, wurden die konservierten Zellen mit spezifischen Antikörpern
(CD45 für hämatopoetische Zellen und CD14 für Makrophagen) gegengefärbt.
Um die Zellpopulationen in den gewonnenen Knochenmarkproben der einzelnen
Patienten nach der hämatopoetischen Stammzelltransplantation (Patient Nr. 1226) analysieren zu können, wurden verschiedene Immunfluoreszenzfärbungen
(Fluoreszenzfärbung für Vimentin mit CD14, oder CD45 u.a., siehe unten)
kombiniert.
Folgende Antikörper wurden zusätzlich zu der Gen-Sonde für das Y-Chromosom
zur Darstellung der entsprechenden Zellstrukturen verwendet:
Antikörper/Sonde
Ziel-Antigen,
CEP Y (Satellite III) Spectrum
Spezifische DNA-Sequenz des
orange (Vysis)
Y-Chromosoms
Draq5 (Biostatus)
unspezifisch DNA
mouse-anti-human-Vimentin
Vimentin, mesenchymale Zellen
(Biotechnology)
mouse-anti-human-von-Willebrand-
von-Willebrand-Faktor, endotheliale
Factor (Serotec)
Zellen
mouse-anti-human-CD45
CD45+ hämatopoetische Zellen
(DAKO)
(Primärantikörper)
mouse-anti-human-CD14
CD14+ Makrophagen
(DAKO)
(Primärantikörper)
Alexa 647 F(ab`)2 fragment of goat
Fc-Teil des Primärantikörper
anti-mouse IgG (H+L)
(Sekundärantikörper)
(Molecular Probes)
Tabelle 7: Übersicht über verwendete Antikörper
42
3.3.1 Fluoreszenz In-situ Hybridisierung (FISH):
Um den Ursprung der Stromazellen nach der Transplantation zu bestimmen, d.h.,
ob die Stromazellen mit dem Transplantat übertragen worden sind oder der
Organismus des Patienten selbst neue eigene Stromazellen bildet, wurde bei
sechs Patientinnen (Patienten Nr. 6-11 in Tabelle 6), welche eine sex-mismatched
Stammzelltransplantation (männlicher Spender) erhalten hatten, eine FISHAnalyse durchgeführt.
Die Methode der In-situ Hybridisierung wurde 1969 erstmalig beschrieben (Gall,
Pardue, 1969). Mittels der Technik der In-situ Hybridisierung wurde es möglich
Nukleinsäuresequenzen (DNA oder RNA) sichtbar zu machen. Die FISH basiert
auf dem Prinzip, dass sich z.B direkt mit einem Fluorochrom (z.B. Rhodamin)
markierte Einzelstrang-DNA-Fragmente (oder RNA-Fragmente), die auch als
Sonden bezeichnet werden, an komplementäre DNA-Sequenzen (oder RNA)
spezifisch zu einem stabilen Doppelstrang zusammenlagern. Dieser Vorgang wird
als Hybridisierung bezeichnet (Nath, Johnson, 1999).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Test-Sonde verwendet, welche direkt mit
einem Rhodamin-Derivat als Fluoreszenz-Farbstoff markiert ist und spezifisch an
DNA-Sequenzen des DYZ1 Lokus in der q12 Region des Y-Chromosoms bindet.
Wie bereits beschrieben, müssen die markierten Nukleinsäurefragmente als
Einzelstränge vorliegen, damit die komplementären Basensequenzen zu einem
Hybridmolekül zusammenlagern können. Daher werden die Ziel-DNA und die
markierte DNA-Sonde durch Hitze denaturiert (gespalten) und die anschließende
Hybridisierung wird durch eine Inkubation bei 37°C ermöglicht.
43
Abbildung 3: Prinzip der FISH
Der
DNA-Sonde
sind
unmarkierte
DNA-Fragmente
beigemischt,
welche
unspezifische Bindungen der Sonde im Zellkernplasma und Zytoplasma
verhindern sollen. Unterschiedliche Bedingungen im Färbeverfahren können den
Anteil der korrekt gebundenen Sonden beeinflussen. Es ist wichtig, dass die
Temperatur während Denaturierung und Hybridisierung möglichst konstant ist und
entsprechend definierte Konzentrationen der Salze und der DNA-stabilisierenden
Moleküle, welche den Hybridisierungs- und Waschlösungen zugegeben sind,
benutzt werden (Leitch, Jackson, 1994).
Sind Gen-Sonde und Ziel-DNA hybridisiert, können die Fluoreszenzsignale
daraufhin mit einem entsprechenden Mikroskop nachgewiesen werden.
3.3.2 Kombination von Y-Chromosom FISH, Kernfärbung und Vimentin/vonWillebrand-Faktor Immunfluoreszenzfärbung
Um eine Aussage drüber treffen zu können, ob ein Y-Chromosom als Marker für
eine Spenderzelle innerhalb des Zellkernes der Stromazellen lokalisiert ist, wurde
die
FISH
mit
einer
Vimentin-
oder
von-Willebrand-Faktor-
Immunfluoreszenzfärbung (Marker für Stromazellen) kombiniert (Spyridonidis et al,
2004a). Damit eine genaue Zuordnung der Hybridisierungssignale der Gen-Sonde
44
zu den einzelnen Zellen möglich ist, wurden auch die Zellkerne mit einem DNAbindendem Fluorochrom (Draq5) dargestellt.
Da der zur Kernfärbung verwendete Farbstoff Draq5 nicht nur an DNA, sondern
auch an zytoplasmatische oder nukleoläre RNA binden kann, mussten die Zellen
jeweils vor und nach der FISH einer Behandlung mit einer RNAse unterzogen
werden. Durch die damit einhergehende Zerstörung der RNA kann deren
Anfärbung mit Draq5 vermieden werden (Suzuki et al, 1997).
Die Objektträger mit den fixierten Stromazellen wurden dazu mit 100l RNAse A
(Konzentration 2mg/ml in PBS 1% BSA) versehen und 45 min bei 37°C/6%CO2 in
der Feuchtkammer inkubiert. Danach wusch man die Objektträger zweimal für 5
min in einer Küvette mit 2xSSC bei Raumtemperatur.
Als Vorbereitung für die FISH mussten die Zellen dann 30 min in 2xSSC
0,1%NP40 bei 37°C gewaschen werden, um die Zellmembranen zu lysieren.
Danach dehydrierte man die Zellen in einer Ethanolreihe 70%, 85%, 100% jeweils
für 1,5 min und ließ die Objektträger lufttrocknen. Sodann wurde für die FISHAnalyse die Sonde vorbereitet. Dazu wurden 10l Sondengemisch pro
Objektträgerfeld benötigt, welches sich aus 1l mit einem Rhodamin-Derivat
direkt-markierter
Gen-Sonde,
Hybridisierungspuffer
(enthält
2l
bidestilliertem
Dextransulfat,
Wasser
Formamid
und
und
7l
SSC)
zusammensetzte. Das Sondengemisch wurde auf den Objektträger gegeben, mit
einem Deckgläschen versehen und mit Silikon versiegelt, um ein Verdunsten des
Sonden- Puffer- Gemisches während der Prozesse der Denaturierung und
anschließender Hybridisierung zu vermeiden. Die Denaturierung von Gen-Sonde
und der DNA der Stromazellen wurde mit Hilfe eines Hybridisierungsgerätes
erreicht. Die Objektträger wurden im HYBrite auf der auf 73°C erhitzten
Metallplatte des Gerätes für 3 min belassen. Zur Hybridisierung zwischen der YChromosom-Sonde und der zellulären DNA wurden die Zellen über Nacht in einer
Feuchtkammer im Zellinkubator bei 37°C/6% CO2 inkubiert.
Am nächsten Tag wurde das Silikon vorsichtig gelöst und die Objektträger kurz in
einer Küvette mit 2xSSC 0,3%NP40 gewaschen, um die Deckgläschen zu lösen.
Es folgte ein letzter Waschschritt für die FISH: dreimaliges Waschen der Zellen in
einer Küvette mit 2xSSC 0,3%NP40 für jeweils 2 min bei 73°C.
Im Anschluss an die FISH für das Y-Chromosom wurde die ImmunfluoreszenzFärbung zur Darstellung der stromalen Marker Vimentin und von-Willebrand45
Faktor (mouse-anti-human-Vimentin, mouse-anti-human-von-Willebrand-Factor)
durchgeführt. Um unspezifische Antikörperbindungen zu vermeiden, wurden
zunächst mögliche Bindungsstellen mit PBS 1% BSA geblockt. Die Flüssigkeit
wurde nach 30 min Inkubation vom Objektträger abgeklopft und danach kurz in
2xSSC
gewaschen.
Pro
Zellareal
wurden
nun
10l
des
mit
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) direkt-markierten Antikörpers aufpipettiert, mit
Deckgläschen versiegelt und für 2 Stunden in der Feuchtkammer im Zellinkubator
bei 37°C/6% CO2 bebrütet. Um die Deckgläschen nach der Inkubation wieder zu
lösen, wurden die Objektträger kurz in 2xSSC geschwenkt, und danach dreimal für
jeweils 5 min in 2xSSC 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur gewaschen.
Nach der Immunfluoreszenzfärbung schloss sich die Darstellung der nukleären
DNA mit dem Farbstoff Draq5 an. Dazu wurde zunächst die oben bereits
beschriebene Behandlung der Zellen mit RNAse A und der anschließende
Waschvorgang wiederholt. Danach wurden die Objektträger mit 100l des
Kernfarbstoffes Draq5 (5mM 1:1000 in PBS) für 10 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Um das Ausbleichen der Fluorochrome zu verhindern, wurden die
Objektträger mit den fixierten Stromazellen nach zweimaligem Waschvorgang in
2xSSC 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur mit je 10l ProLong Antifade
Mounting Medium versehen und mit Deckgläschen versiegelt. Nach dem
Aushärten
des
Mounting
Medium
konnten
die
Objektträger
bis
zur
mikroskopischen Auswertung gelagert werden.
3.3.3 Kombination von Y-Chromosom FISH und Immunfluoreszenzfärbungen
für Vimentin/von-Willebrand-Faktor und CD14/CD45
Zum Nachweis eines eventuellen Chimärismus der Knochenmarkstromazellen
musste ausgeschlossen werden, dass die Expression der gewebespezifischen
Marker der gefärbten Zellen lediglich durch kontaminierende hämatopoetische
Spenderzellen vorgetäuscht wurde. Des Weiteren konnten positive Signale der YChromosom-Gensonde in hämatopoetischen Spenderzellen die Analyse des
nicht-hämatopoetischen Chimärismus der Stromazellen verfälschen. Deshalb war
eine weitere Untersuchung auf hämatopoetische Marker unerlässlich. Dazu wurde
die Expression des CD45-Oberflächenantigens gemessen. Dieses Protein wird
ausschließlich von hämatopoetischen Zellen (ausgenommen Erythrozyten,
46
Thrombozyten) exprimiert (Trowbridge, Thomas, 1994). Eine weitere Fehlerquelle
konnte die Detektion von Makrophagen darstellen. Makrophagen können andere
Zellen phagozytieren und damit vorübergehend spezifische Marker dieser Zellen
bilden (Meletis, Friesen, 2002). Daher musste auch ein Nachweis mit Antikörpern
gegen den von Makrophagen exprimierten Marker CD14 erfolgen.
So wurde eine Dreifachfärbung für das Y-Chromosom und die Zellantigene
Vimentin/von-Willebrand-Faktor
und
CD45/CD14
durchgeführt,
um
eine
Kontamination mit hämatopoetischen CD45+/CD14+-Zellen auszuschließen.
Die verwendeten Antikörper gegen CD45 und CD14 sind nicht direkt mit einem
Fluorochrom
markiert.
Daher
wurde
hier
die
Methode
der
indirekten
Fluoreszenzfärbung in das bereits beschriebene Protokoll (Abschnitt 3.3.2)
integriert.
Das Prinzip beruht darauf, dass zunächst der Primärantikörper zu den Zellen
gegeben wird, dort sein entsprechendes Antigen erkennt und sich daran bindet.
Der Sekundärantikörper ist direkt mit einem Fluorochrom gebunden und erkennt
den Fc-Teil des Primärantikörpers, an welchen er sich bindet und so durch die
Fluoreszenz-Markierung die entsprechenden Strukturen sichtbar machen kann.
Abbildung 4: Prinzip der Immunfluoreszenzfärbung mit Primär- und Sekundärantikörper
47
Zunächst erfolgte die Y-Chromosom FISH, wie oben bereits beschrieben.
Nachdem die Gen-Sonde hybridisiert war und die Objektträger dem letzten
Waschschritt unterzogen waren, wurden mögliche Bindungstellen mit ZiegenSerum (Verdünnung 1:10 in PBS 1% BSA) geblockt, um unspezifische
Antikörperbindungen zu vermeiden. Nach 20 min wurde die Flüssigkeit vom
Objektträger abgeklopft und dieser danach kurz in einer Küvette mit 2xSSC
gewaschen.
Für
die
Methode
der
indirekten
CD14,
oder
CD45
Immunfluoreszenzfärbung wurden die Zellen für 60 min bei Raumtemperatur mit
100l Primärantikörper (monoclonal mouse-anti-human-CD45/CD14) jeweils in
einer Konzentration von 16l/ml (1:20) inkubiert. Anschließend folgte ein
dreimaliger Waschvorgang für je 5 min in 2xSSC 0,1 % Tween 20 ebenfalls bei
Raumtemperatur. Nun konnten 100l des mit dem Fluorochrom Alexa 647
markierten goat-anti-mouse-Sekundärantikörper (Alexa 647 F(ab`)2 fragment of
goat-anti-mouse IgG) in einer Konzentration von 20l (1:100) auf die Objektträger
gegeben und dort für weitere 60 min bei Raumtemperatur belassen werden. Zur
Verdünnung der Antikörper wurde ein Antikörperverdünnungsmedium verwendet,
welches mit Ziegen-Serum in einer Konzentration von 1,5% versetzt war.
Nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper schloss sich unmittelbar die
direkte Immunfluoreszenzfärbung mit den Antikörpern gegen Vimentin oder vonWillebrand-Faktor (s.o.) an. Die Antikörperinkubation erfolgte diesmal bei
Raumtemperatur und der anschließende dreimalige Waschvorgang wurde erneut
für je 5 min in 2xSSC 0,1 % Tween 20 bei Raumtemperatur durchgeführt.
Um das Ausbleichen der Fluorochrome zu verhindern wurden die Objektträger mit
den gefärbten Stromazellen mit je 10l ProLong Antifade Mounting Medium
versehen und mit Deckgläschen versiegelt.
48
3.3.4 Kombination von Kernfärbung und Immunfluoreszenzfärbungen für
Vimentin/von-Willebrand-Faktor und CD14/CD45
Vimentin/von-Willebrand-Faktor + CD14:
Um ausschließen zu können, dass Makrophagen ebenso stromale Marker
exprimieren, wurden die Immunfluoreszenzfärbungen für Vimentin oder vonWillebrand-Faktor in Kombination mit einer CD14-Färbung (mouse-anti-humanCD14 als Primärantikörper, als Sekundärantikörper Alexa 647 direkt-markierter
goat-anti-mouse-IgG) wie in Abschnitt 3.3.3 beschrieben durchgeführt.
CD45 (direkt) + CD14 (indirekt):
In diesem Zusammenhang wurde auch die Fähigkeit der Makrophagen überprüft,
CD45 als Oberflächenantigen hämatopoetischer Zellen exprimieren zu können,
indem eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung für CD14 (mouse-anti-humanCD14 als Primärantikörper, als Sekundärantikörper Alexa 647 direkt-markierter
goat-anti-mouse-IgG) mit einer direkten Immunfluoreszenzfärbung für CD45
(mouse-anti-human-CD45-FITC) kombiniert wurde (s.o.).
Vimentin/von-Willebrand-Faktor + CD45 (indirekt):
Des Weiteren sollte untersucht werden, ob die Vimentin+- oder von-WillebrandFaktor+-Zellen den hämatopoetischen Marker CD45 exprimieren können. Dafür
wurden die direkten Immunfluoreszenzfärbungen entweder mit Vimentin oder vonWillebrand-Faktor in Kombination mit der indirekten CD45-Färbung (mouse-antihuman-CD45 als Primärantikörper, Alexa 647 direkt-markierter goat-anti-mouseIgG als Sekundärantikörper) nach dem bereits beschriebenem Protokoll
durchgeführt.
Damit die Zuordnung der einzelnen Zellen vereinfacht wurde, kam bei allen oben
genannten Färbungs-Kombinationen eine Zellkern-Färbung mit Draq5 zur
Anwendung.
49
3.4 Kontrollen der Fluoreszenzfärbungen
Folgende Antikörper fanden bei den Kontrollfärbungen Verwendung:
Antikörper/Sonde
CEP Y (Satellite III) Spectrum orange
(Vysis)
mouse IgG1-FITC
(Immunotech)
mouse IgG1+2-negative Control
(Serotec)
mouse-anti-human-CD45
(DAKO)
mouse-anti-human-CD14
(DAKO)
Alexa 647 F(ab`)2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L)
(Molecular Probes)
mouse-anti-human-CD45 FITC
(Invitrogen)
Tabelle 8: Übersicht der verwendeten Kontrollantikörper
Y-Chromosom FISH:
Als
Negativkontrolle
für
die
FISH-Analyse
wurden
Zellen
von
bereits
transplantierten weiblichen Patienten mit weiblichem Spender verwendet, da hier
kein Vorkommen von Y-Chromosomen anzunehmen war. Für die Positivkontrolle
dienten
Zellen
von
männlichen
Patienten,
welche
ihr
hämatopoetisches
Transplantat von einem männlichen Spender erhalten hatten und somit zu
erwarten war, dass bei der FISH Y-Chromosomen zur Darstellung kommen
würden.
50
Direkte Vimentin/von-Willebrand-Faktor Fluoreszenzfärbungen:
Von allen Patientenproben wurden Objektträger zur Kontrolle der direkt mit einem
Fluorochrom markierten Antikörper gegen Vimentin und von-Willebrand-Faktor mit
einem FITC-markierten Maus-IgG1 Antikörper gefärbt. Dieser Antikörper ist nicht
gegen humane Strukturen gerichtet und somit konnte die Färbung mit den
genannten Antikörpern als erfolgreich angesehen werden, wenn bei den
Kontrollzellen keine unspezifischen FITC-Signale detektiert wurden.
Indirekte CD14/CD45 Fluoreszenzfärbungen:
Für die Negativkontrolle der indirekten CD14 und CD45 Fluoreszenzfärbung
diente ein unmarkierter Maus-Isotypkontrollantikörper als Primärantikörper. Er
wurde in einer Verdünnung von 1:20 angewendet, die Verdünnung wurde wieder
mit einem Antikörperverdünnungsmedium durchgeführt, welches mit 1,5% ZiegenSerum versetzt war. Für die Fluoreszenzfärbung kam als Sekundärantikörper der
mit Alexa 647 direkt markierte goat-anti-mouse-Antikörper zur Anwendung.
Als Positivkontrolle dienten aus EDTA-Blut gewonnene mononukleäre Zellen. Die
bereits bei der Kombination von Y-Chromosom FISH + Vimentin/von-Willebrand
Faktor + CD14/CD45 verwendeten Antikörper gegen die Antigene CD14 und
CD45 wurden wie oben beschrieben eingesetzt, d.h. wieder mit einer
Konzentration von 16l/ml auf die Zellen gegeben. Als Sekundärantikörper wurde
wieder der mit Alexa 647 direkt markierte goat-anti-mouse-Antikörper verwendet,
um ein Fluoreszenzsignal zu erhalten, und damit die CD14+/CD45+- Zellen
darzustellen.
3.5 Auswertung der Fluoreszenzfärbungen
Unter dem Begriff Fluoreszenz versteht man den Übergang eines Moleküls
(Fluorochrom) von einem elektronisch angeregten Zustand (durch Absorption
eines Photons) zurück in den Grundzustand, wobei die überschüssige Energie
durch Emission eines Photons (Fluoreszenz) abgegeben wird.
In dieser Arbeit wurden drei Fluoreszenzfarbstoffe verwendet (Tabelle 9). Bei den
Immunfluoreszenzfärbungen waren die Fluorochrome Alexa 647 und FITC direkt
an die Antikörper gebunden. Auch das Rhodamin-Derivat war direkt an die YChromosom-Sonde gebunden.
51
Absorptionsmaximum1
Emissionsmaximum1
(nm)
(nm)
FITC
494
518
Alexa 647
632
647
Draq52
647
670
Rhodamin-Derivat2
549
588
Fluorochrom
1
2
Tabelle 9 : Fluoreszenzfarbstoffe, Wert ist geräteabhängig, nach Herstellerangaben
Die
Auswertung
der
Fluoreszenzfärbungen
wurde
am
konfokalen
Laserscanningmikroskop LSM 410 vorgenommen. Für jedes Fluorochrom wurde
die Emission innerhalb eines bestimmten Wellenbereiches gemessen, nachdem
sie
durch
die
drei
Lasersysteme
des
Mikroskopes
nahe
ihrem
Absorptionsmaximum angeregt worden waren. So konnten die Signale einem
Farbkanal zugeordnet werden und waren damit völlig unabhängig von der
eigentlichen Fluoreszenzfarbe der einzelnen Fluorochrome.
Fluorochrom
Markierte Struktur
Farbkanal
FITC
Vimentin, von-Willebrand-Faktor, CD45
grün
Alexa 647
CD45, CD14
grün
Draq5
Nukleäre DNA
blau
Rhodamin-Derivat
Y-Chromosom
rot
Tabelle 10: Fluorochrome der verschiedenen Antikörper mit zugeordnetem Farbkanal
52
3.6 Statistik
Die Ergebnisse sind als Mediane oder als Einzelwerte dargestellt. Die statistische
Auswertung erfolgte mit Hilfe des Fisher’s Exact-Tests für dichotome Merkmale.
Des Weiteren kam der McNemar Test zum Vergleich von Merkmalen innerhalb
einer Gruppe zum Einsatz. Für unabhängige Gruppen mit gemeinsamem, nicht
normalverteiltem Merkmal wurde der Mann-Whitney-Test für unverbundene
Stichproben verwendet. Ein Resultat wurde als statistisch signifikant betrachtet,
wenn die Nullhypothese mit 95 % Wahrscheinlichkeit abgelehnt werden konnte (p
< 0,05).
53
4. Resultate
A: Analyse des Wachstumsverhaltens von Knochenmarkstromazellen in vitro
4.1 Stromazellwachstum und Konditionierung
4.1.1 Patientenproben vor der Transplantation
Um den Einfluss der Konditionierungstherapien auf das Wachstumsverhalten der
Stromazellen zu erfassen, wurden insgesamt 17 Proben von 17 Patienten vor
Beginn der Konditionierung, und damit vor der Transplantation entnommen und in
Langzeitkulturen angesetzt.
Bei 58 % dieser Kulturen konnte Zellwachstum beobachtet werden (10/17). Die
Krankheitsaktivität zu diesem Zeitpunkt schien ohne Einfluss auf das Wachstum
zu sein, denn die Proben der Patienten, welche sich im Stadium der kompletten
Remission (complete remission, CR) befanden, wiesen in 36% Wachstum von
Stromazellen auf. Bei den Proben der Patienten, welche nicht in kompletter
Remission waren, konnte bei 54% Wachstum beobachtet werden (36% versus
54%, p>0.05, nicht signifikant, ns).
FBM
Stromazellwachstum
vor HZT
Standard-myeloablativ
total
gesamt
BuCy
TBI
66%
50%
40%
66%
58%
(6/9)
(4/8)
(2/5)
(2/3)
(10/17)
p> 0.05, ns
p> 0.05, ns
Tabelle 11: Übersicht über das Stromazellwachstum der einzelnen Proben vor HZT
Es wurde kein Unterschied im Wachstumsverhalten beobachtet, als die Proben
den vorgesehenen Konditionierungstherapiegruppen zugeordnet wurden (FBM
66% (6/9) versus Standard-myeloablativ 50% (4/8), p>0.05, ns).
54
Auch im Vergleich der beiden konventionell geplanten Konditionierungstherapien
BuCy und TBI zeigten sich keine deutlichen Veränderungen im Wachstum der
Stromakulturen.
Die
Proben
der
drei
Patienten,
welche
für
ein
Konditionierungsregime nach dem TBI-Schema (Strahlentherapie 12 Gray,
Cyclophosphamid und Etoposid) geplant waren, produzierten Stromazellen mit
derselben Effizienz, wie die Kulturen der Patienten, welche für die andere
Standard-myeloablative
Konditionierungstherapie
mit
BuCy
(Busulfan,
Cyclophosphamid) vorgesehen waren (TBI 66% (2/3) versus BuCy 40% (2/5),
p>0.05, ns).
Aufgrund der geringen Patientenzahl kann allerdings nicht darauf geschlossen
werden, dass irgendein klinisches oder biologisches Merkmal die Fähigkeit zur
Generierung von Stromazellen kennzeichnen könnte.
Somit
kann
auch
Konditionierung
mit
oder
der
eine
Konditionierungstherapien
klinischen
der
keine
beiden
Entscheidung
für
konventionellen
Vorhersage
über
das
die
reduzierte
myeloablativen
Wachstum
der
Stromazellen in vitro gewagt werden.
4.1.2 Patientenproben nach der Transplantation
Nach der Transplantation wurden insgesamt 72 Knochenmarkproben von 55
verschiedenen Patienten untersucht. Davon waren 32 Patienten mit reduzierter
Konditionierung vorbehandelt, die anderen 23 Patienten wurden mit der Standardmyeloablativen Therapie versorgt (BuCy oder TBI).
Das Knochenmark wurde am Tag +30 nach der Transplantation (47 Proben) und
am Tag +100 nach der Transplantation (25 Proben) gewonnen (siehe auch
Tabelle 12). Die Patienten befanden sich am Tag +30 mit Ausnahme eines
Patienten alle im Stadium der kompletten Remission, wohingegen am Tag +100
nach Transplantation nur 46 von den 55 Patienten keine Krankheitszeichen
aufwiesen. Im Kollektiv mit reduzierter Konditionierung (FBM) waren 28 der 32
Patienten in CR, im BuCy-Kollektiv: 9 von 14 Patienten und im TBI-Arm alle 9
Patienten. Das Stromawachstum zu Tag +30, Tag +100 und total nach der
Stammzelltransplantation ist in der folgenden Tabelle 12 dargestellt.
55
Stromawachstum
Stromawachstum
Stromawachstum
Tag +30 nach HZT
Tag +100 nach HZT
total nach HZT
75% (21/28)
80% (12/15)
77% (33/43)
36% (7/19)
50% (5/10)
41% (12/29)
BuCy
50% (6/12)
50% (4/8)
50% (10/20)
TBI
14% (1/7)
50% (1/2)
22% (2/9)
FBM
Standardmyeloablativ
Tabelle 12: Übersicht über das Stromazellwachstum der einzelnen Proben nach HZT
Im Verlauf entwickelten insgesamt 21 Patienten eine schwere akute Graft-versusHost Disease >Grad II (FBM: 12/32, BuCy: 3/14, TBI: 6/9).
Bei 28 Patienten wurde aufgrund der Immunsuppression eine symptomatische
Reaktivierung des Zytomegalievirus beobachtet (FBM: 15/32, BuCy: 7/14, TBI:
6/9).
Proben der FBM-Gruppe:
Es
wurden
43
Knochenmarkproben
von
32
Patienten
mit
reduzierter
Konditionierung bis zum Tag +100 entnommen (siehe Tabelle 13). In 77% der
Fälle (33/43) wurde ein positives Stromawachstum beobachtet. Im Vergleich zu
den Proben, welche vor der Transplantation entnommen wurden, zeigte sich trotz
der Behandlung mit den entsprechenden konditionierenden Chemotherapeutika
keine signifikante Veränderung im Wachstumsverhalten (77% 33/43) versus 66%
6/9), p>0.05, ns).
vor HZT
total nach HZT
66% (6/9)
77% (33/43)
Stromawachstum
p>0.05, ns
Tabelle 13: Vergleich Stromazellwachstum vor und nach HZT (FBM-Gruppe)
56
Auch gab es keine relevanten Unterschiede im Vergleich der einzelnen Gruppen
der verschiedenen Entnahmezeitpunkte untereinander.
vor HZT
66% (6/9)
Stromawachstum
Tag +30
Tag +100
nach HZT
nach HZT
75% (21/28)
80% (12/15)
p>0.05, ns
p>0.05, ns
Tabelle 14: Vergleich Stromazellwachstum an verschiedenen Entnahmezeitpunkten (FBMGruppe)
Proben der standard-myeloablativ konditionierten Patienten:
In der Gruppe der Patienten, welche im Vorfeld eine Standard-myeloablative
Konditionierung erhalten hatten (23 Patienten), wuchsen die Stromazellen bis zum
Tag +100 in 41% der Proben (12/29). Hier wurde beobachtet, dass im Vergleich
zu der Gruppe mit reduzierter Konditionierung das Wachstum signifikant seltener
festzustellen war (Standard-myeloablativ: 41% (12/29) versus FBM: 77% (33/43),
p<0.05, s).
Stromawachstum total
FBM
Standard-myeloablativ
77% (33/43)
41% (12/29)
nach HZT
p<0.05, s
Tabelle 15: Vergleich Stromazellwachstum FBM und Standard-myeloablative nach HZT
57
Bei der genaueren Beobachtung der beiden Untergruppen (BuCy und TBI) wurde
deutlich, dass die Proben aus der TBI-Gruppe öfter Stromawachstum vermissen
ließen (siehe Tabelle 12). Die insgesamt nach der HZT gewonnenen Proben aus
der BuCy-Gruppe zeigten im Vergleich zur FBM-Gruppe deutlich weniger
Wachstum in vitro, wenngleich keine statistisch signifikanten Level erreicht wurden
(BuCy: 50% (10/20) versus FBM: 77% (33/43), p>0.05, ns).
Stromawachstum total
FBM
BuCy
77% (33/43)
50% (10/20)
nach HZT
p>0,05, ns
Tabelle 16: Vergleich Stromazellwachstum FBM und BuCy nach HZT
Dagegen konnten bei den 9 Proben von Patienten aus der TBI-Gruppe nur
zweimal Stromawachstum beobachtet werden. Vergleicht man diese Gruppe mit
den beiden anderen Gruppen, so werden hier, unter der Berücksichtigung, dass
die Fallzahlen in der TBI-Gruppe sehr klein sind, statistisch signifikante
Unterschiede erreicht (FBM: 77% (33/43) versus TBI: 22% (2/9), p<0.05, s; BuCy:
50% (10/20) versus TBI: 22% (2/9), p<0.05, s).
FBM
TBI
BuCy
77% (33/43)
22% (2/9)
50% (10/20)
Stromawachstum total
nach HZT
p<0.05, s
p<0.05, s
Tabelle 17: Vergleich Stromazellwachstum FBM, TBI und BuCy nach HZT
58
4.2 Einflüsse auf das Stromazellwachstum nach der
Transplantation
Bei
allogenen
hämatopoetischen
Stammzelltransplantationen
wirken
viele
verschiedenste Faktoren zusammen, welche den Erfolg oder das Versagen dieser
Therapieform beeinflussen können. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit
einige dieser Faktoren, wie das Patientenalter, die zugrunde liegende Diagnose,
der Remissionsstatus zum Zeitpunkt der HZT, die Art des Transplantates, die
infundierte Anzahl der Stammzellen im Transplantat, die Verwendung von ATG
wegen fremd-allogener oder HLA-nicht-identer HZT, die Reaktivierung von CMV,
die virostatische Therapie bei Probenentnahme, sowie das Auftreten akuter GvHD
>II°,
von
welchen
eine
Einflussnahme
auf
das
Stromawachstum
nicht
ausgeschlossen werden konnte, in die Analyse einbezogen.
Das Stromawachstumsmuster von den 72 Proben der 55 verschiedenen Patienten
wurde entweder vom Entnahmetag +30 (47 Proben) oder am Tag +100 (25
Proben) nach der Stammzelltransplantation ausgewertet.
Bei acht Patienten konnten mehrfach Knochenmarkproben (insgesamt 17 Proben)
in Langzeitkulturen angesetzt werden (FBM-Gruppe: 5 Patienten, 11 Kulturen;
BuCy-Gruppe: 3 Patienten, 6 Kulturen; siehe Tabelle 4 im Abschnitt 3.2).
Die Proben dieser acht Patienten wiesen eine unterschiedliche Dynamik im
Wachstumsverhalten auf. Daher wurden sie für diese Auswertung ausgeklammert
und eine univariate Analyse mit den verbleibenden 47 Patienten (FBM-Gruppe: 27
Patienten; Standard-myeloablative-Gruppe: 20 Patienten) durchgeführt.
4.2.1 Patientenalter
Um einen Einfluss auf das Stromawachstum festzustellen wurden die Proben
bezüglich
des
Patientenalters
auf
Unterschiede
im
Wachstumsverhalten
untersucht. Dabei wurde die Altersgrenze bei 50 Jahren angesetzt.
Hinsichtlich des Stromawachstums konnte kein signifikanter Unterschied bei den
Patientenproben in Abhängigkeit vom Alter festgestellt werden (>50 Jahre: 64%
versus <50 Jahre: 68%, p>0.05, ns).
59
Alter
Stromawachstum
>50 Jahre
<50 Jahre
64% (18/28)
68% (13/19)
nach HZT
p>0.05, ns
Tabelle 18: Abhängigkeit Stromawachstum und Alter
4.2.2 Diagnose
Für die Analyse der Diagnosen wurden die Patienten in ebenfalls zwei Gruppen
eingeteilt. Patienten mit der Diagnose Myelodysplastisches Syndrom (MDS) und
Schwere aplastische Anämie (SAA) bildeten die eine Gruppe, alle anderen (AML,
ALL, CML/MPS, MM, NHL/CLL) wurden in die zweite Gruppe eingeteilt. Auch bei
der Betrachtung dieser Konstellation zeigten sich keine Unterschiede im
Wachstumsverhalten der einzelnen Stromakulturen wie es in der folgenden
Tabelle 19 gezeigt ist.
Diagnose
Stromawachstum
MDS/SAA
andere
100% (8/8)
59% (23/39)
nach HZT
p>0.05, ns
Tabelle 19: Abhängigkeit Stromawachstum und Diagnose
4.2.3 Primäre Therapien zur Erlangung der Remission
Im Vorfeld jeder hämatologischen Stammzelltransplantation werden die Patienten,
je nach Diagnose verschiedentlich behandelt, um eine möglichst komplette
Remission zu erlangen. Daran schließt sich dann die eigentliche Konditionierung
als Vorbereitung für die Stammzelltransplantation an. Im Hinblick auf die Fähigkeit
der Generierung von Stromazellen nach der HZT wurden die Patientenproben
auch hinsichtlich dieses Parameters untersucht. Im Median wurden die Patienten
60
vor der HZT drei Therapien unterzogen (Anzahl primärer Therapien: 3, range 012). Daher wurde dies als Grenze für die zu unterscheidenden Gruppen gewählt.
Anzahl primärer Therapien
vor HZT1
Stromawachstum
<3
3
67% (16/24)
61% (14/23)
nach HZT
p>0.05, ns
1
Tabelle 20: Abhängigkeit Stromawachstum und Anzahl primärer Therapien, Median
4.2.4 Art des Transplantates
Einige Patienten bekamen als hämatopoetisches Transplantat Knochenmark (KM)
übertragen. Die Proben dieser Patienten wurden daher mit den Proben von den
anderen Patienten verglichen, welche periphere Blutstammzellen (periphere blood
stem cells, PBSC) als Transplantat erhalten hatten.
Auch zwischen den beiden Gruppen konnte kein signifikanter Unterschied im
Wachstum der Stromazellen festgestellt werden.
Transplantat
Stromawachstum
KM
PBSC
60% (3/5)
64% (27/42)
nach HZT
p>0.05, ns
Tabelle 21: Abhängigkeit Stromawachstum und Transplantat; KM, Knochenmark; PBSC
periphere Blutstammzellen
4.2.5 Anzahl der Stammzellen im Transplantat
Bei den Patienten welche periphere Blutstammzellen als Transplantat erhalten
hatten (n=42) wurde der Anteil der CD34+-Zellen (hämatopoetische Stammzellen)
ermittelt. Im Median enthielten die Transplantate 10,22 x 108 CD34+-Zellen/kg
61
Körpergewicht des Patienten, was wiederum als Grenze für den Vergleich
zwischen den Patientenproben dienen konnte, welche mehr oder weniger
Stammzellen bei der Transplantation erhielten. In der Analyse der beiden Gruppen
bezüglich des Stromawachstums zeigten sich keine statistisch relevanten
Unterschiede.
CD34+-Zellen/kg KG1
Stromawachstum
<10,22 x 108
10,22 x 108
80% (28/23)
69% (13/19)
nach HZT
p>0.05, ns
+
Tabelle 22: Abhängigkeit Stromawachstum und Anzahl CD34 -Zellen im Transplantat;
1
Median; KG, Körpergewicht
4.2.6 Remissionstatus
Um herauszufinden, ob die Krankheitsaktivität eine Wirkung auf das Wachstum
der Stromakulturen entfalten konnte, wurde das Wachstum in Abhängigkeit vom
Remissionstatus zum Zeitpunkt der Transplantation und 100 Tage nach der
Transplantation (Tag +100) als Faktor verglichen.
Dabei wurden die Proben der Patienten, welche zur Zeit der Transplantation, oder
am Tag +100 nach der HZT in kompletter Remission waren zu einer Gruppe
zusammengefasst und allen anderen Patienten (welchen nicht in CR waren)
gegenübergestellt. Die Krankheitsaktivität zeigte keinen signifikanten Einfluss auf
das Wachstum der Proben der einzelnen Patienten.
Stromawachstum
nach HZT
Remission
Remission
bei HZT
Tag +100 nach HZT
CR
andere
CR
andere
50% (6/12)
71% (25/35)
66% (26/39)
62% (5/8)
p>0.05, ns
p>0.05, ns
Tabelle 23: Abhängigkeit Stromawachstum und Remissionstatus; CR, komplette Remission
62
4.2.7 Verwendung von Antithymozyten-Globulin während der
Konditionierung
Um das Risiko einer Abstoßungsreaktion zu minimieren, erhielten 32 Patienten,
bei welchen das hämatopoetische Transplantat nicht HLA-ident war, direkt vor der
Transplantation Antithymozyten-Globulin (ATG-S, 20/mg/kg/d, 1-3 Tage).
Hinsichtlich des Wachstumsverhaltens der Stromakulturen wurde nun eine
Analyse vorgenommen, wobei die Patienten mit ATG in der Behandlung den
anderen Patienten (mit HLA-identen Spendern, kein ATG in der Behandlung)
gegenübergestellt wurden. Die zusätzliche Immunsuppression mit ATG zeigte sich
nicht beeinflussend auf das Stromawachstum.
ATG
Stromawachstum
ja
nein
72% (23/32)
53% (8/15)
nach HZT
Tabelle
24:
Abhängigkeit
p>0.05, ns
Stromawachstum
und
Verwendung
von
ATG-S;
ATG,
Antithymozytenglobulin
4.2.8 Auftreten akuter Graft-versus-Host Disease
Die Graft-versus-Host Disease stellt eine gefürchtete Komplikation bei allen
allogenen Transplantationen dar. Besonders die akute Form, welche sich
definitionsgemäß innerhalb der ersten hundert Tage nach der Transplantation
manifestiert, kann einen schweren Krankheitsverlauf zeigen, weshalb in der Regel
bei allen allogenen Transplantationen eine GvHD-Prophylaxe mit verschiedenen
Immunsuppressiva durchgeführt wird.
Dem Auftreten einer schweren Graft-versus-Host Disease >Grad II (GvHD) als
gefürchtete Komplikation, wurde in dieser Arbeit eine Einflussnahme auf das
Zellwachstum der Kulturen zugesprochen. Insgesamt kam es bei 19 Patienten zu
einer akut schweren GvHD >Grad II. Diese Gruppe wurde mit den Patienten
verglichen, welche keine GvHD enwickelten, oder diese nur in geringem Maße
ausgeprägt war (Grad 0-I).
63
Es zeigten sich jedoch keine Unterschiede bei den Wachstumsraten der
verschiedenen Kulturen.
Akute GvHD (Grad 0-IV)
Stromawachstum
0-I
II-IV
67% (19/28)
63%(12/19)
nach HZT
p>0.05, ns
Tabelle 25: Abhängigkeit Stromawachstum und akute GvHD
4.2.9 Zytomegalievirus
Durch die immunsuppressive Therapie ist das Risiko der symptomatischen
Reaktivierung verschiedener stummer Virusinfektionen zu beobachten. Der
Infektion mit dem Zytomegalievirus kommt speziell bei Patienten nach allogener
hämatopoetischer Stammzelltransplantation eine herausragende Bedeutung zu,
da die Infektion zur gefürchteten CMV-Pneumonie führen kann, welche mit einer
hohen Letalität behaftet ist. Die Stromazellkulturen von Patienten, welche post
transplantationem eine symptomatische CMV-Infektion erlitten, wurden demnach
auch auf Unterschiede im Wachstumsverhalten im Vergleich zu den Proben der
asymptomatischen Patienten untersucht.
Die symptomatische Reaktivierung des Zytomegalievirus bei den Patienten hatte
keinen signifikanten Einfluss auf das Wachstum der Stromazellkulturen.
CMV-Reaktivierung
Stromawachstum
nein
ja
77% (17/22)
56% (14/25)
nach HZT
p>0.05, ns
Tabelle 26: Abhängigkeit Stromawachstum und CMV-Reaktivierung; CMV, Zytomegalievirus
64
4.2.10 Virostatische Therapie bei der Probenentnahme
Nach der Stammzelltransplantation erhielten insgesamt 22 Patienten eine
virostatische Therapie gegen das CMV. Daher wurden die Knochenmarkproben
von diesen Patienten im Vergleich zu den Proben der Patienten, welche keine
virostatische Therapie erhielten, hinblicklich der Generierung von Stromazellen
betrachtet.
Hinsichtlich des Stromawachstums konnte auch bei diesen Gruppen kein
signifikanter Unterschied bei den einzelnen Patientenproben festgestellt werden.
Virostatische Therapie
bei Probenentnahme
Stromawachstum
nein
ja
64% (16/25)
50% (11/22)
nach HZT
p>0.05, ns
Tabelle 27: Abhängigkeit Stromawachstum und virostatische Therapie
65
4.3 Einfluss der verschiedenen Konditionierungen auf das
Stromazellwachstum nach der Transplantation
Ein besonderes Augenmerk wurde in dieser Arbeit auf die Auswirkungen der
verschiedenen Konditionierungstherapien gerichtet. Daher wurden die einzelnen
Patientenproben, welche nach der allogenen HZT entnommen wurden (n=47), nun
den drei Konditionierungsgruppen zugeordnet. Wie in Abschnitt 4.2 bereits
beschrieben
konnten
bei
acht
Patienten
mehrfach
Knochenmarkproben
(insgesamt 17 Proben) in Langzeitkulturen angesetzt werden (siehe Tabelle 4 im
Abschnitt 3.2). Da die Proben dieser acht Patienten eine unterschiedliche Dynamik
im Wachstumsverhalten aufwiesen wurden sie auch für diese Auswertung
ausgeklammert
und
die
univariate
Analyse
mit
den
verbleibenden
47
Patientenproben durchgeführt (FBM-Gruppe: 27 Patientenproben; Standardmyeloablative-Gruppe: 20 Patientenproben, davon BuCy: 11 und TBI: 9).
Standard-
FBM
n
myeloablativ
27
BuCy
TBI
total
11
9
47
20
Tabelle 28: Übersicht der ausgewerteten Patientenproben
Bei 85% der Patienten aus der FBM-Gruppe (23/27) konnte in den Proben bis zu
Tag
+100
nach
der
hämatopoetischen
Stammzelltransplantation
Stromazellwachstum nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu wurde in der
Standard-myeloablativen Gruppe nur bei 40% (8/20) ein positives Wachstum
beobachtet. Der statistische Vergleich ergab einen signifikanten Unterschied im
Wachstumsverhalten der verschiedenen Patientengruppen.
Stromawachstum
FBM
Standard-myeloablativ
85% (23/27)
40% (8/20)
nach HZT
p<0.05, s
Tabelle 29: Vergleich Stromawachstum nach Konditionierung mit FBM oder Standardmyeloablativ
66
Eine genauere Analyse der beiden Untergruppen der Standard-myeloablativen
Patienten zeigte, dass deutlich weniger Zellwachstum in den angesetzten Kulturen
der TBI-Gruppe (22%, BuCy-Gruppe: 54%) zu verzeichnen war und im
statistischen Vergleich mit der FBM-Gruppe ebenfalls signifikante Level erreicht
werden konnten.
Stromawachstum
FBM
TBI
85% (23/27)
22% (2/9)
nach HZT
p<0.05, s
Tabelle 30: Vergleich Stromawachstum nach Konditionierung mit FBM oder TBI
Die Proben der Patienten aus der BuCy-Gruppe wiesen in 54% der Kulturen ein
positives Zellwachstum auf. Im Hinblick auf die andere myeloablative Gruppe (TBI)
waren deutlich mehr Kulturen positiv.
Im Vergleich mit den Proben der Patienten aus der FBM-Gruppe (85%) zeigten
sich keine signifikanten Unterschiede im Wachstum, wenngleich eine klare
Tendenz zu sehen war, dass die Proben der Patienten, welche eine reduzierte
Konditionierung im Vorfeld der Stammzelltransplantation erhalten hatten, doch
wesentlich häufiger Stromazellen generieren konnten.
Stromawachstum
FBM
BuCy
85% (23/27)
54% (6/11)
nach HZT
p>0.05, ns
Tabelle 31: Vergleich Stromawachstum nach Konditionierung mit FBM oder BuCy
67
4.4 Hämatopoetische Regeneration nach der Transplantation
Nach der hämatopoetischen Stammzelltransplantation nisten sich die neuen
Stammzellen im Knochenmark ein und benötigen etwa zwei bis drei Wochen, um
sich wieder zu funktionsfähigen Zellen zu differenzieren, seien es Erythrozyten,
Leukozyten, oder Thrombozyten.
Da die verschiedenen Elemente der Knochenmarkstromazellen die strukturelle
und funktionelle Unterstützung für die Stammzellen darstellen, und durch die enge
Interaktion der beiden Systeme die Selbsterneuerung und Differenzierung der
Stammzellen
durch
das
Stromagerüst
katalysiert
wird,
wurden
die
hämatopoetische Regeneration und das Stromawachstum der Patientenproben
bis Tag +100 nach der Stammzelltransplantation analysiert.
Für diese Analyse mussten acht Patienten (FBM: 4, BuCy:4) ausgeschlossen
werden, da sie bereits vor dem Tag +100 einen Krankheitsrückfall erlitten hatten.
4.4.1 Transfusion von Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentraten
Zunächst wurde der Verbrauch von Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentraten
beobachtet (EK und TK), die nach der Transplantation von den Patienten benötigt
wurden.
Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Verbrauch der Blutzellkonzentrate
zwischen den Patienten, deren Knochenmarkproben Stromazellen ausbilden
konnten und derer, welche kein Zellwachstum in ihren Proben aufweisen konnten.
Stromawachstum nach HZT
ja (n=26)
nein (n=13)
EK (n)1
13.5
11
p>0.05, ns
TK (n)1
13
16
p>0.05, ns
1
Tabelle 32: Abhängigkeit Stromawachstum und Substitution von Blutkonzentraten, Median;
EK Erythrozytenkonzentrate; TK Thrombozytenkonzentrate
68
4.4.2 Leukozytenregeneration nach der Transplantation
Um eine genauere Aussage über die hämatopoetische Erholung in Bezug auf das
Wachstumsverhalten zu erhalten, wurde die Regeneration der einzelnen Zellarten
in den verschieden konditionierten Gruppen separat betrachtet.
Den Patienten wurde nach der hämatologischen Stammzelltransplantation
regelmäßig Blut abgenommen um die Regeneration und das Engraftment ( die
Akzeptanz der fremden Zellen im Empfängerorganismus) zu überwachen. So
wurde
der
Zeitraum,
in
welchem
die
neuen
Stammzellen
Leukozyten
ausdifferenzieren konnten, als Parameter genutzt. Als Grenze musste die Zellzahl
von 1x109/l erreicht werden.
Es zeigte sich, dass die Leukozytenregeneration in keiner Gruppe signifikant
verlangsamt oder gar beschleunigt war. Auch der Vergleich zwischen den
Patienten, deren Kulturen Stromazellen generieren konnten mit denen, deren
Knochenmarkkulturen kein Zellwachstum aufwiesen, konnte keine statistisch
relevanten Unterschiede darstellen. So kann ein positives Stromazellwachstum in
vitro keine Vorhersage für eine zügige Regeneration der Leukozyten nach
hämatopoetischer Stammzelltransplantation darstellen.
Stromawachstum
n
Leukozyten
1x109/l (Tage)1
ja
26
15
nein
13
15
ja
20
14
nein
3
14
Standard-
ja
6
17
myeloablativ
nein
10
16
ja
4
17
nein
3
15
ja
2
18
nein
7
16
total
FBM
BuCy
TBI
>0.05, ns
>0.05, ns
>0.05, ns
>0.05, ns
>0.05, ns
1
Tabelle 33: Abhängigkeit Stromawachstum und Leukozytenregeneration nach HZT, Median
69
4.4.3 Thrombozytenregeneration nach der Transplantation
Als weiterer Marker für die Regeneration der neuen Hämatopoese kann auch die
Differenzierung und Bildung von Thrombozyten dienen.
Auch hier wurde als Parameter der Zeitraum verwendet, welchen die neuen
Stammzellen brauchten, um Thrombozyten zu bilden. Es musste die Zellzahl von
100x109/l erreicht werden, der Zeitraum wurde in Tagen gemessen.
Auch hier fanden sich keine Korrelationen zwischen den Ergebnissen des
Wachstumsverhaltens der Stromazellen und der Dauer der tatsächlichen
laborchemischen Normothrombozytämie.
Stromawachstum
total
FBM
Standard
BuCy
TBI
Thrombozyten
n
100x109/l (Tage)1
ja
26
25
nein
13
28
ja
20
25
nein
3
26
ja
6
26
nein
10
28
ja
4
22
nein
3
14
ja
2
31
nein
7
28
>0.05, ns
>0.05, ns
>0.05, ns
>0.05, ns
>0.05, ns
1
Tabelle 34: Abhängigkeit Stromawachstum und Thrombozytenerholung nach HZT, Median
70
B: Stromazellpopulation und Chimärismusanalyse
4.5 Charakterisierung der Stromazellkulturen
Im Knochenmark stellen die verschiedenen Elemente des Knochenmarkstroma
die strukturelle und funktionelle Unterstützung der hämatopoetischen Stammzellen
dar und nehmen nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation eine
besondere Rolle in ihrer Funktion als Regulator der Hämatopoese ein.
In dieser Arbeit wurde nun neben dem Wachstumsverhalten ein weiterer
Schwerpunkt zum einen auf die Komposition der verschiedenen Stromazellen in
den entnommenen Kulturen gelegt und zum anderen versucht, den Ursprung
dieser Zellen zu ermitteln (Chimärismusanalyse).
Es wurden alle 89 Proben der 72 Patienten (vor HZT 17 Proben von 17 Patienten;
nach HZT 72 Proben von 55 Patienten) in dieser Analyse berücksichtigt.
4.5.1 Stromazellwachstum in vitro
Stromazellwachstum vor und nach HZT:
Zunächst wurde der Zeitraum zwischen Kulturansatz und erstem Auftreten von
Zellwachstum
in
den
Patientenproben,
welcher
bei
den
regelmäßigen
miroskopischen Kontrollen protokolliert worden war, ausgewertet. Bei den
positiven Proben ließ sich erstes Zellwachstum nach etwa 20 Tagen feststellen.
Dabei zeigte sich kein Unterschied im Hinblick auf den Zeitpunkt, zu welchem die
Proben gewonnen wurden, denn sowohl die Proben, welche vor Beginn der
Konditionierungstherapie entnommen wurden, als auch die Proben, entnommen
zu den verschiedenen Zeitpunkten nach der Stammzelltransplantation brachten
die gleichen Ergebnisse.
Proben vor HZT
Proben nach HZT
total
n=17
n=72
n=89
Zeitraum bis zum ersten
20
20
20
Zellwachstum, Tage1
(14-36)
(8-38)
(8-38)
Tabelle 35: Wachstumsdynamik der Proben von Ansatz bis zum ersten Zellwachstum,
1
Median, (range)
71
Während der Zellkultivierung war auffällig, dass verschiedene Kulturen deutlich
länger zu brauchen schienen, um einen konfluenten Zellrasen nach Beginn des
Zellwachstums zu bilden. So wurde auch dieser Zeitraum, nämlich zwischen
Auftreten von erstem Zellwachstum und konfluentem Zellrasen (>75% der
Kulturfläche) genauer betrachtet. Es wurde deutlich, dass die Kulturen, welche vor
der Stammzelltransplantation und damit vor Beginn der Konditionierungstherapie
entnommen worden waren, wesentlich schneller einen konfluenten Zellrasen
generieren konnten, als die Proben der Patienten post transplantationem.
Proben vor HZT
Proben nach HZT
total
Zeitraum bis zur
9
30
22,5
Konfluenz, Tage1
(3-31)
(7-64)
(3-64)
1
Tabelle 36: Wachstumsdynamik bis zum Erreichen der Konfluenz, Median, (range)
Stromazellwachstum nach HZT und Konditionierung:
Die Zuordnung der Patientenproben in die jeweiligen Konditionierungsgruppen
wies bezüglich des erstmaligen Auftretens von Stromazellwachstum nach
Kulturansatz keine Unterschiede auf. So konnten die Kulturen der Patienten der
FBM-Gruppe
nach
20,5
Tagen
und
die
Patienten
aus
der
Standard-
myeloablativen-Gruppe nach 20 Tagen Stromazellen generieren.
FBM
Standard-myeloablativ
Zeitraum bis zum ersten
20,5
20
Zellwachstum, Tage1
(8-38)
(11-34)
Tabelle 37: Vergleich Wachstumsdynamik zwischen FBM und Standard-myeloablativ,
1
Median, (range)
72
Nun wurde auch hier bei den Proben der Zeitraum bis zur Ausbildung eines
konfluenten Zellrasens den entsprechenden Konditionierungsgruppen zugeordnet.
Diese Auswertung zeigte, dass die Proben der Patienten, welche mit dem
reduzierten Konditionierungsschema vorbehandelt wurden, etwas schneller (nach
26 Tagen) konfluentes Wachstum vorweisen konnten. Die Proben der Standardmyeloablativen-Gruppe konnten im Median erst nach 33 Tagen einen kompletten
Zellrasen generieren.
FBM
Standard-myeloablativ
total
Zeitraum bis zur
26
33
30
Konfluenz, Tage1
(8-64)
(7-61)
(7-64)
Tabelle 38: Vergleich Wachstumsdynamik bis zum Erreichen der Konfluenz zwischen FBM
1
und Standard-myeloablativ, Median, (range)
73
4.6 Zellkomposition und Chimärismusanalyse
4.6.1 Stromazellformationen in vitro
Native Zellen:
Die Stromazellkulturen wurden morphologisch zunächst nativ, d.h. ohne
Verwendung von Immunfluoreszenzfärbungen spezifischer stromaler Marker wie
Vimentin
oder
von-Willebrand-Faktor
betrachtet.
Bei
der
Analyse
unter
Verwendung des Phasenkontrastmikroskops der ungefärbten Zellen zeigte sich in
allen Proben eine homogene, fibroblastäre Formation der Zellen.
Damit die Morphologie der Zellen noch deutlicher dargestellt werden konnte
wurden exemplarisch jeweils zwei Objektträger von zwei verschiedenen
Patientenproben (FBM und BuCy nach HZT) mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt.
Abbildung 5: links: Stromazellen nativ (Phasenkontrastmikroskop), rechts: Stromazellen
nach Hämatoxylin/Eosin-Färbung
74
Immunzytochemische Färbungen:
Die generierten Zellen aus den verschiedenen Knochenmarkproben wurden
geerntet und auf Objektträgern fixiert. Danach konnten die Immunzytochemischen
Färbungen wie in Abschnitt 3.3 beschrieben durchgeführt werden.
Es wurden dazu die Proben von insgesamt 26 Patienten verwendet. Fünf
Patientenproben wurden vor Beginn der Konditionierungstherapie entnommen, 21
Proben wurden von den Patienten nach der Stammzelltransplantation gewonnen.
Davon waren 15 Patienten mit dem reduzierten, auf Fludarabin-basierendem
Konditionierungsregime FBM vorbehandelt. Die restlichen Patienten wurden im
Vorfeld
mit
der
Standard-myeloablativen
Konditionierung
therapiert.
Eine
Übersicht bietet die folgende Tabelle.
FBM nach HZT
Patienten (n)
Standard-myeloablative
nach HZT
vor HZT
Tag +30
Tag +100
Tag +30
Tag +100
5
8
7
4
2
Tabelle 39: Übersicht über immunzytochemisch gefärbte Patientenproben
Nach der Durchführung der verschiedenen Immunfluoreszenzfärbungen zur
Anfärbung der spezifischen stromalen Markern (Vimentin, von-Willebrand-Faktor)
konnte die Zellkompostition der Stromakulturen ausgewertet werden. In allen
Proben, ob vor oder nach der HZT entnommen, ob reduzierte oder Standardmyeloablative Konditionierung vor der Stammzelltransplantation, zeigten sich
starke Expressionen der Vimentin+- und von-Willebrand-Faktor+-Zellen.
75
Abbildung 6: Stromazellen mit Kernfärbung (blau) und Immunfluoreszenzfärbung für
Vimentin (grün)
Abbildung 7: Stromazellen mit von-Willebrand-Faktor-Immunfluoreszenzfärbung (grün)
76
Hingegen
konnten
bei
den
Patientenproben,
welche
mit
den
Immunfluoreszenzfärbungen CD14/CD45 behandelt wurden, kaum, bzw. keine
Zellen
mit
den
Oberflächenantigenen
CD14
(Makrophagen)
und
CD45
(hämatopoetische Zellen) mit den entsprechenden Antikörpern detektiert werden,
unabhängig davon, welcher Konditionierungsgruppe die Proben zugeordnet waren
oder zu welchem Zeitpunkt sie dem Patienten entnommen worden waren.
Abbildung 8: links: Stromazellen mit Kernfärbung (blau) und Immunfluoreszenzfärbung für
CD45
(keine
Signale);
rechts:
Stromazellen
mit
Kernfärbung
(blau)
und
Immunfluoreszenzfärbung für CD14 (keine Signale)
Die Kombination der Immunfluoreszenzfärbungen für CD45 oder CD14 mit einem
der beiden Marker für Stromazellen (Vimentin/von-Willebrand-Faktor), um
darzustellen, ob CD45+- bzw. CD14+-Zellen auch diese Oberflächenantigene
exprimieren können, zeigten, dass sich die Zellkulturen der verschiedenen
Patienten nahezu ausschließlich aus Vimentin+- bzw. von-Willebrand-Faktor+Zellen zusammensetzten.
So konnte durch die morphologischen und immunzytochemischen Analysen
gezeigt werden, dass in den verschiedenen Patientenproben, unabhängig davon,
zu welcher Konditionierungsgruppe sie gehörten, oder zu welchem Zeitpunkt die
Entnahme der Knochenmarkzellkultur erfolgte, keine Unterschiede in der
Zellkomposition fest zu stellen waren.
77
4.6.2 Chimärismusanalyse der Stromazellen
Es wurden außerdem Stromazellen von sechs Patientinnen gesondert analysiert,
welche alle eine Konditionierung mit dem reduzierten Schema erhalten und
danach periphere Blutstammzellen als Transplantat erhalten hatten. Die Spender
dieser Patientinnen waren allesamt männlich, so dass eine mögliche KoÜbertragung von Stromazellen neben den hämatopoetischen Stammzellen und
damit der Ursprung der Stromazellen untersucht werden konnte. Dazu wurde bei
diesen Zellen eine Chimärismusanalyse durchgeführt, da nach einer wie hier
vorliegenden sex-mismatched Stammzelltransplantation mit männlichem Spender
bei weiblichen Patienten bei einer tatsächlichen Ko-Übertragung von Stromazellen
oder anderen Mechanismen, welche zu einem Chimärismus führen können, YChromosom+-Stromazellen in den Kulturen zu erwarten waren. Somit wurden die
auf den Objektträgern fixierten Zellen mit einer Dreifächfärbung bestehend aus YChromosom-FISH (zur Detektion der Y-Chromosome), Kernfärbung Draq5 um die
FISH-Signale eindeutig zuordnen zu können, einer Immunfluoreszenzfärbung für
Oberflächenantigene stromaler Zellen (Vimentin, von-Willebrand-Faktor) und zum
Ausschluss einer Verunreinigung der Kultur mit hämatopoetischen Zellen mit einer
Immunfluoreszenzfärbung für CD45/CD14 behandelt.
Abbildung 9: Färbeschema der Patientenproben für die Chimärismusanalyse
78
Als
Negativkontrolle
für
die
FISH-Analyse
wurden
Zellen
von
bereits
transplantierten weiblichen Patienten mit weiblichem Spender verwendet, da hier
kein Vorkommen von Y-Chromosomen anzunehmen war. Für die Positivkontrolle
dienten Zellen von männlichen Patienten, welche ihr Transplantat von einem
männlichen Spender erhalten hatten und somit zu erwarten war, dass bei der
FISH Y-Chromosomen zur Darstellung kommen würden. Die Kontrollfärbungen
zeigten ausschließlich bei den männlichen Patientenproben mit männlichem
Spender fluoreszierende Signale.
Abbildung 10: Negativ-Kontrolle: Stromazellen von weiblichen Patientinnen nach sexmatched HZT mit Y-Chromosom-FISH (kein Signal), Kernfärbung (blau), von-WillebrandFaktor-Immunfluoreszenzfärbung (grün), Immunfluoreszenzfärbung für CD45 (keine Signale)
Abbildung 11: Positiv-Kontrolle: Stromazellen von männlichen Patienten nach sex-matched
HZT mit Y-Chromosom-FISH (rot), Kernfärbung (blau), Immunfluoreszenzfärbung für CD14
(keine Signale) und von-Willebrand-Faktor-Immunfluoreszenzfärbung (grün)
79
Die auf Chimärismus zu untersuchenden Proben der sechs weiblichen Patienten
mit männlichem Spender zeigten allesamt eine starke Expression von Vimentin
und von-Willebrand-Faktor. Es ließen sich in keiner Probe CD14+- (Makrophagen)
oder CD45+- (hämatopoetische Zellen) Zellen nachweisen, womit sich diese
Proben bezüglich der Stromazellkomposition nicht von den restlichen Kulturen
unterschieden.
Abbildung 12: Stromazellen einer Patientin nach sex-mismatched HZT mit Y-ChromosomFISH (keine Signale), Kernfärbung (blau), Immunfluoreszenzfärbung für CD45 (keine
Signale) und Vimentin-Immunfluoreszenzfärbung (grün)
80
Bei einer Probe konnte eine Y-Chromosom+-Zelle detektiert werden, welche
allerdings sowohl Vimentin als auch von-Willebrand-Faktor negativ war und somit
am ehesten eine kontaminierende hämatopoetische Spenderzelle darstellte.
Abbildung 13: Stromazelle einer Patientin nach sex-mismatched HZT mit Y-ChromosomFISH (rot), Kernfärbung (blau) und Immunfluoreszenzfärbung für Vimentin und vonWillebrand-Faktor (jeweils keine Signale)
Jedoch konnten in keiner anderen Zelle der sechs verschiedenen Patientenproben
weitere positive Signale für ein Y-Chromosom entdeckt werden, was den Ursprung
der Knochenmarkstromazellen dieser Patientenproben dem jeweiligen Spender
zugeordnet
hätte.
Somit
konnten
in
dieser
Knochenmarkstromazellen nachgewiesen werden.
81
Arbeit
keine
chimären
5 Diskussion
A: Generierung und Wachstum von Stromazellen in vitro
5.1 Studienlage und Methodik
Es gibt verschiedene Untersuchungen und Ansätze, um die Schädigung der
Knochenmarkstromazellen ex vivo nach einer allogenen hämatopoetischen
Stammzelltransplantation mit vorausgegangener Konditionierungstherapie zu
evaluieren, wie z.B. die Beobachtung des Wachstumsverhaltens der stromalen
Elemente in Kulturen oder die Generierung fibroblastärer Colony-forming-units.
Die Ergebnisse der Studien zeigen nicht unbedingt übereinstimmende Ergebnisse,
was möglicherweise durch unterschiedliche Studiendesigns bedingt ist, aber auch
dadurch, dass verschiedene Elemente des stromalen Mikromilieus untersucht
worden sind (Nikkels et al, 1987).
5.1.1 Schädigung der Stromazellen und die Konsequenzen
Es stellt sich nun die Frage, ob die Knochenmarkstromazellen trotz vorheriger
Konditionierung nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation
weiterhin genauso die Fähigkeit besitzen, die Proliferation und Differenzierung der
hämatopoetischen Stammzellen in vivo zu unterstützen.
In
verschiedenen
Studien
Knochenmarkstromazellen
von
konnte
gezeigt
Patienten
mit
werden,
soliden
dass
die
Tumoren
oder
Knochenmarkaspirate von gesunden Spendern in über 99% konfluentes
Zellwachstum generieren können (Treweeke et al, 1993; Koc et al, 2000).
Hingegen ist bei Patienten mit hämatologischen Neoplasien, unabhängig davon,
ob die Erkrankungen therapiert worden waren oder nicht, wesentlich seltener
Stromawachstum in Knochenmarkaspiraten zu beobachten gewesen (50%). Des
Weiteren brauchten diese Kulturen deutlich mehr Zeit um einen konfluenten
Zellrasen zu bilden.
Andere
Studien
verschiedenen
haben
sich
hämatologischen
mit
dem
Knochenmarkstromawachstum
Neoplasien
82
wie
z.B.
MDS
oder
bei
SAA
auseinandergesetzt und Beeinträchtigungen darstellen können. Auch bezüglich
Unterschiede im Alter und bezüglich verschiedener Therapiestrategien wurden die
Knochenmarkstromazellen hinsichtlich ihrer Wachstumsfähigkeit betrachtet und
ähnliche Ergebnisse demonstriert (Treweeke et al, 1993; Domenech et al, 1994).
Diese Studien weisen darauf hin, dass das Stromawachstum in vitro verschiedene
klinische
Einflüsse
reflektieren
kann.
Daher
kann
die
Betrachtung
des
Wachstumsverhaltens von Knochenmarkstromakulturen in vitro eine entsprechend
funktionierende Methode für die Beurteilung der möglichen Effekte der
verschiedenen Konditionierungstherapien vor einer allogenen hämatopoetischen
Stammzelltransplantation auf die Knochenmarkstromazellen in vivo darstellen.
5.2 Eigene Ergebnisse
Wir konnten bei dem Vergleich der Wachstumsraten der Stromakulturen,
gewonnen vor der Konditionierung und nach der Transplantation, tatsächlich
deutliche Unterschiede ausmachen. So konnten insgesamt 58% der Proben vor
der Konditionierung Stromazellwachstum zeigen, hingegen konnten die Proben
aus der TBI-Gruppe nach der Konditionierung und HZT von Tag +30 lediglich in
14% (1/7) Stromazellen generieren und alle Proben aus der TBI-Gruppe nach der
Transplantation wiesen in 22% (2/9) Zellwachstum auf. Dies deutet darauf hin,
dass in vitro Veränderungen, oder Beeinträchtigungen der Wachstumsfähigkeit
von Stromazellen, verursacht durch Transplantations-assoziierte Faktoren wie z.B.
das konditionierende Regime, aufgezeigt werden können und somit unsere
Methode geeignet ist, um diese Veränderungen zu detektieren.
Aufgrund der geringen Patientenzahl kann allerdings nicht darauf geschlossen
werden, dass irgendein klinisches oder biologisches Merkmal für die Fähigkeit zur
Generierung von Stromazellen kennzeichnend ist.
Somit kann auch die klinische Entscheidung für die reduzierte Konditionierung
oder eine der beiden konventionellen myeloablativen Konditionierungstherapien
keine Vorhersage über das Wachstum der Stromazellen in vitro wagen.
83
5.2.1 Konditionierung als prädiktiver Faktor für das Stromazellwachstum?
Mit unserer Arbeit konnten wir zeigen, dass die reduzierte Konditionierung nach
dem FBM-Schema allein keinen Einfluß auf das Wachstum Stromazellen in vitro
genommen hat. Wir haben das Zellwachstum vor Beginn der Transplantation mit
den Kulturen, welche nach der HZT gewonnen wurden verglichen und konnten
keine signifikanten Unterschiede feststellen. Die Kulturen, welche vor der
Konditionierung entnommen wurden, wiesen in 58% (10/17, die Kulturen der
späteren FBM-Patienten in 66%, 6/9) Stromazellwachstum auf, die Proben der
FBM-Patienten nach der Stammzelltransplantation konnten in 77% (33/43)
Stromazellen generieren (58%, bzw. 66% versus 77%, p>0.05, nicht signifikant).
Allerdings konnten wir signifikante Unterschiede feststellen, als wir alle Proben,
welche nach der allogenen Stammzelltransplantation gewonnen wurden, in die
verschiedenen Konditionierungsgruppen (FBM, BuCy und TBI) einordneten und
anschließend auf die Fähigkeit Stromazellen generieren zu können untersuchten.
Der Vergleich der Gruppen zeigte, dass die Proben der Patienten aus der FBMGruppe deutlich häufiger konfluente Stromazellpopulationen ausbilden konnten
(85%, 23/27) als die Proben der Standard-myeloablativen Gruppe (40%, 8/20),
was statistisch einen signifikanten Level erreicht hat (85% versus 40%, p<0.05,
signifikant).
5.2.2 Weitere Einflüsse auf das Stromazellwachstum
Wir konnten allerdings nicht sicher davon ausgehen, dass die geringere Fähigkeit
der Knochenmarkkulturen der Patienten aus der Standard-myeloablativen-Gruppe
zur
Generierung
von
Stromazellen
nur
auf
das
Konditionierungsregime
zurückzuführen ist, sondern dass noch viele weitere Faktoren existieren, welche
im Rahmen einer allogenen Stammzelltransplantation ebenfalls einen Einfluss auf
das Stromawachstum nehmen können. Daher schlossen sich diesbezüglich
weitere Untersuchungen an.
Im Vergleich einiger Faktoren, von welchen eine Einflussnahme auf das
Stromawachstum angenommen werden konnte, zeigten sich jedoch änhliche
Verhältnisse in den verschiedenen Gruppen, und schieden somit als Ursache für
84
den
Unterschied
im
Stromawachstum
zwischen
den
beiden
Konditionierungsgruppen aus (siehe Tabelle 40).
So wurden bei beiden Gruppen hauptsächlich periphere Blutstammzellen (PBSC)
als hämatopoetisches Transplantat verwendet (PBSC: FBM-Gruppe: 93%,
Standard-myeloablativ-Gruppe: 78%), die Zahl der Stammzellen im Transplantat
wies im Median keine Unterschiede auf (FBM: 10.4 x 108 Zellen/kg KG, Standardmyeloablativ: 10.02 x 108 Zellen/kg KG) und die Anzahl der vorangegangenen
intensiven Therapien, um vor der Transplantation eine Remission zu erreichen,
war im Median gleich (beide 3). Des Weiteren zeigten sich in beiden Gruppen
ähnlich
viele
Patienten
Zytomegalievirus
mit
durch
die
einer
symptomatischen
Immunsuppression
Reaktivierung
(FBM:
47%,
des
Standard-
myeloablativ: 56%) und auch die Anzahl der CMV-seropositiven Patienten zeigte
keine große Differenz innerhalb der beiden Gruppen (FBM: 81%, Standardmyeloablativ 91%). Sowohl in der FBM-Gruppe als auch bei den Standardmyeloablativen Patienten trat die akute GvHD >II° gleichmäßig auf (GvHD>II°,
FBM: 37%, Standard-myeloablativ: 39%).
Konditionierung
FBM
Standard-myeloablativ
(n)
(n)
30 (93%)
18 (78%)
10,4 x 108
10,02 x 108
3 (0-12)
3 (0-7)
Akute GvHD >II°
12 (37%)
9 (39%)
CMV-Reaktivierung
15 (47%)
13 (56%)
CMV-IgG-seropositiv
26 (81%)
21 (91%)
PBSC
Anzahl der Stammzellen
im Transplantat
1
Anzahl der Therapien
zum Erreichen der CR1
Tabelle 40: Übersicht über Auftreten und Verteilung verschiedener Faktoren bei FBM und
Standard-myeloablativ von welchen eine Einflussnahme auf das Stromazellwachstum
1
angenommen werden konnte, Median
85
Interessanterweise zeigten sich doch bei vier weiteren Faktoren, von welchen man
eine Korrelation zu verminderter Wachstumsfähigkeit der Stromazellen erwarten
konnte, genau umgekehrte Verhältnisse bezüglich der gezeigten Wachstumsraten
in den entsprechenden Konditionierungsgruppen (siehe Tabelle 41). Es wurde in
beiden Patientengruppen noch das Alter, die Diagnose, der Remissionstatus zum
Zeitpunkt der HZT und die Identität des Spenders (fremd/familiär) und die damit
verbundene Gabe von ATG als ein das Stromawachstum beeinflussender Faktor
angesehen. Dies zeigte, dass ausgerechnet die Patienten aus der FBM-Gruppe
älter waren (Median, FBM: 54 Jahre, Standard-myeloablativ: 40 Jahre) und zum
Zeitpunkt der HZT viel seltener das Stadium der kompletten Remission erreicht
hatten, als die Patienten der Standard-myeloablativen Gruppe (CR, FBM: 9%,
Standard-myeloablativ: 44%). Weiterhin waren mehrere fremd-allogene oder HLAnicht idente Stammzelltransplantationen in dieser Gruppe zu verzeichnen, was die
zusätzliche
Medikation
von
ATG
zur
Prophylaxe
gegen
eine
Transplantatabstoßung notwendig machte (FBM: 78%, Standard-myeloablativ
60%) und es litten mehr Patienten in der FBM-Gruppe an MDS oder SAA (FBM:
21%, Standard-myeloablativ: 4%).
Konditionierung
FBM
Standard-myeloablativ
(n)
(n)
Alter (Jahre)1
54 (22-67)
40 (20-51)
Diagnose MDS/SAA
7 (21%)
1 (4%)
3 (9%)
11 (44%)
25 (78%)
14 (60%)
Komplette Remission
bei HZT
ATG bei HZT
Tabelle 41: Übersicht über vier weitere Faktoren von welchen eine Einflussnahme auf das
1
Stromazellwachstum angenommen werden konnte, Median
86
Deshalb untersuchten wir das Wachstumsverhalten der Stromazellen in einer
univariaten Analyse um die Fähigkeit der Knochenmarkaspirate Stromazellen zu
generieren hinsichtlich dieser Faktoren beurteilen zu können, bzw. ob diese
Faktoren tatsächlich einen Einfluss auf das Stromawachstum in vitro besitzen.
Nach der Auswertung der einzelnen Parameter konnten wir für keinen der
genannten Faktoren einen Einfluss auf unsere Stromakulturen nachweisen. Es
zeigten sich keine signifikanten Unterschiede im Wachstum der Zellkulturen.
So ist die Verwendung der Standard-myeloablativen Konditionierung im
Gegensatz zum reduzierten FBM-Regime die einzige Ursache, auf welche wir ein
geringeres Stromazellwachstum zurückführen konnten.
Betrachtet man die Patientenproben der Standard-myeloablativen Gruppe noch
gesondert in ihren Untergruppen (BuCy und TBI), so zeigte sich, dass besonders
die Proben der Patienten, welche zusätzlich noch mit einer fraktionierten
Ganzkörperbestrahlung behandelt wurden (TBI-Gruppe), selten Stromazellen in
vitro generieren konnten (Wachstum TBI-Gruppe: 22%). Ähnliche Ergebnisse
wurden in anderen Studien präsentiert, welche zeigen konnten, dass das
Knochenmarkstroma durch eine konditionierende Bestrahlung wesentlich stärker
geschädigt wird, als nach einer Konditionierung mit einer reinen Chemotherapie
(Treweeke et al, 1993; Domenech et al, 1994, Moreau et al, 2002).
Wir konnten im Vergleich der FBM-Gruppe und der BuCy-Gruppe keine statistisch
signifikanten Unterschiede im Zellwachstum nachweisen, jedoch ist eine klare
Tendenz zu sehen, dass die Proben der Patienten aus der FBM-Gruppe deutlich
häufiger Stromazellen generieren konnten (Wachstum FBM: 85%, BuCy: 54%).
Auch dieses Erbgebnis korreliert mit einer Reihe von weiteren Studien. Es konnte
in verschiedenen Versuchen in vitro gezeigt werden, dass Busulphan (als
Bestandteil des myeloablativen Schemas) eine toxische Wirkung auf die
Stromazellen
besitzt,
während
BCNU
(als
Bestandteil
der
reduzierten
Konditionierung) keinen Effekt auf die Proliferation des Knochenmarkstroma zu
haben scheint (Fried et al, 1977; McManus, Weiss, 1984; Uhlmann et al, 1991).
Aufgrund der geringen Patientenanzahl haben diese Ergebnisse jedoch lediglich
einen hinweisenden Charakter und lassen demnach keine allgemeingültigen
Rückschlüsse zu.
87
5.3 Hämatopoetische Regeneration nach allogener HZT
Die hämatopoetischen Stammzellen werden strukturell und funktionell durch die
verschiedenen Elemente des Knochenmarkstroma unterstützt. Besonders nach
einer Stammzelltransplantation kommt den Stromazellen durch ihre Rolle als
Regulator für die Hämatopoese eine besondere Bedeutung zu (Torok-Storb,
Holmberg, 1994). Allerdings wird bei der Therapie einer neoplastischen
Erkrankung des hämatopoetischen Systems das Mikromilieu der Stromazellen
ebenso der aggressiven Chemotherapie oder Strahlentherapie ausgesetzt und die
Zellen damit angegriffen und eliminiert, wie die erkrankten Stammzellen. Dies
kann zu verlängerten Erholungszeiten der Hämatopoese nach der Transplantation
führen.
5.3.1 Studien
Es
gibt
zahlreiche
hämatopoetischen
Untersuchungen,
Regeneration
welche
nach
sich
einer
mit
der
verzögerten
Stammzelltransplantation
auseinandersetzen (Migliaccio et al, 1990; Carlo-Stella et al, 1997; Torok-Storb et
al,
1994;
Lazarus
et
al,
1992).
Bei
allogenen
hämatologischen
Stammzelltransplantationen können demnach viele biologische Faktoren für ein
verzögertes Engraftment ursächlich sein. Dies mag auch ein Grund dafür sein,
dass sich bislang wenig mit dem anderen Part des Mikromilieus, außer dem
Stammzellkompartiment nämlich der Stromazellpopulation hinsichtlich der
hämatopoetischen Regenerierung beschäftigt wurde (Annaloro et al, 2000).
In einer Studie von Annaloro et al wurden bei Patienten nach einer autologen
Stammzelltransplantation und verzögertem Engraftment bei dieser Form der
Transplantation fallen keine extramedullären Faktoren als Grund für eine
verzögerte hämatologische Erholung ins Gewicht Knochenmarkbiopsien
entnommen und ausgewertet. Als Vergleich diente ein Patientenkollektiv, welches
durchweg ein normales Engraftment nach der autologen Stammzelltransplantation
zeigte. Die Knochenmarkzellpopulation war vor der HZT bei allen Proben
unauffällig, nach der Stammzelltransplantation waren in allen Proben z.T. schwere
Schädigungen, wie z.B. retikuläre Ödeme oder eine massive Verringerung der
Knochenmarkzellpopulation zu erkennen. Dies zeigt, dass das Maß der
88
Zerstörung
der
Knochenmarkstromazellen
durch
ein
intensives
Konditionierungsregime durchaus bei der Beobachtung der hämatopoetischen
Regeneration zu beücksichtigen ist, da der Einfluss auf das Engraftment und die
anschließende Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen durch die
enge Interaktion mit dem Stromamilieu doch immens zu sein scheint (Torok-Storb,
Holmberg, 1994).
Dies wurde ebenfalls durch die Beobachtung verzögerter hämatopoetischer
Erholung nach Stammzelltransplantationen mit vorausgehender Strahlentherapie
oder Single-Hochdosischemotherapie, trotz vergleichbarer infundierter Menge von
hämatopoetischen Stammzellen, aber auch durch Versuche in vitro gezeigt
(Moreau et al, 2002).
Des Weiteren konnte die Forschungsgruppe von Koc bei Patienten nach autologer
HZT und zusätzlicher Gabe von mesenchymalen Stammzellen direkt nach der
Transplantation eine sehr schnelle hämatologische Regenerierung nachweisen
(Koc et al, 2000).
5.3.2 Eigene Ergebnisse:
In der vorliegenden Arbeit wurde die hämatopoetische Erholung (und damit das
Engraftment) hinsichtlich des Wachstums der aus den Knochenmarkkulturen
generierten Stromazellen untersucht. Damit eine genaue Aussage über die
hämatopoetische Erholung gemacht werden konnte, wurde die Regeneration der
einzelnen Zellarten in den verschieden konditionierten Gruppen separat analysiert.
Es zeigte sich, dass die Leukozytenregeneration in keiner Gruppe signifikant
verlangsamt oder beschleunigt war. Auch der Vergleich zwischen den Patienten,
deren
Kulturen
Stromazellen
generieren
konnten
und
jenen,
deren
Knochenmarkkulturen kein Zellwachstum aufwiesen, konnte keine statistisch
relevanten Unterschiede darstellen. Die gleichen Ergebnisse zeigten sich bei der
Betrachtung der thrombozytären Regeneration nach der HZT. Auch hier konnten
wir keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Konditionierungsgruppen und
den Patienten mit positiven, bzw. stromazellnegativen Kulturen ausmachen.
Damit konnte die Fähigkeit des Knochenmarks, Stromazellen in vitro zu
generieren keine Vorhersage über das Engraftment und die hämatopoetische
Regeneration nach einer Stammzelltransplantation wagen.
89
Dieser Unterschied zu den Ergebnissen der bereits genannten Studien mag zum
einen in der doch relativ geringen Proben-, bzw. Patientenanzahl liegen. Zum
anderen
haben
wir
eine
Methode
(in
vitro
Generierung
von
Knochenmarkstromazellen) benutzt, um die Charakteristik der Stromazellen des
Knochenmark darzustellen, welche bezüglich der tatsächlichen Gegebenheiten in
vivo, nämlich der Generierung von Knochenmarkstromazellen und der daraus
resultierenden funktionellen Unterstützung des Engraftments und Differenzierung
der hämatopoetischen Stammzellen, nicht vollständig übertragbar zu sein scheint.
Für diese Untersuchung würden sich Zellkulturen nach dem Dexter-Typ
wahrscheinlich besser eignen. In diesen Zellkulturen können in vitro Stromazellen
generiert werden, wobei die hämatopoetischen Stammzellen in den Kulturen
erhalten bleiben.
Letztendlich gibt es weiterhin viele medulläre aber auch extramedulläre Faktoren,
welche die Zellzahlen im peripheren Blut nach einer HZT variieren können. Daher
wird durch diese Vielzahl an Variablen die Aussagekraft der Fähigkeit des
Knochenmarks nach einer Konditionierung mit einem reduziertem Protokoll, oder
einem myeloablativem Schema und anschließender HZT Stromazellen zu
generieren im Hinblick auf die hämatopoetische Regeneration nach der HZT doch
stark beeinflusst.
90
B: Chimärismusanalyse von Knochenmarkstromazellen nach
allogener HZT
5.4 Nicht-hämatopoetischer Chimärismus
5.4.1 Studien
Eine große Anzahl verschiedener Studien hat sich in den letzten Jahren mit nichthämatopoetischem Chimärismus nach allogener HZT in vivo bei Tieren befasst.
Es gelang z.B. der Nachweis von Spenderzellen in epithelialen Geweben, wie
Leberparenchym (Lagasse et al, 2000; Krause et al, 2001; Vassilopoulos et al,
2003), Alveolarepithel (Krause et al, 2001; Theise et al, 2002), Nierenparenchym
(Kale et al, 2003; Poulsom et al, 2001), aber auch in Stromazellen aus dem
Knochenmark (Anklesaria et al, 1989).
Auch beim Menschen existiert ein nicht-hämatopoetischer Chimärismus nach
allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation.
Anfänglich gab es einige Studien, die einen Chimärismus von epithelialem
Gewebe nach einer HZT beschrieben (Alison et al, 2000; Theise et al, 2000b;
Körbling et al, 2002; Okamoto et al, 2002). Allerdings wurden die Ergebnisse der
Studien aufgrund methodologischer Einschränkungen mit Skepsis betrachtet, da
nicht sicher ausgeschlossen werden konnte, ob die detektierten epithelialen
Spenderzellen nicht wahrhaftig hämatopoetische Zellen waren, welche über die
Zirkulation in epitheliales Gewebe eingedrungen waren und damit fehlinterpretiert
wurden (Blau et al, 2001; Abkowitz, 2002; Herzog et al, 2003).
Weitere
Studien
versuchten
bei
Patienten
nach
allogener
Stammzelltransplantation bei Epithelzellen aus Mundabstrichen Spenderzellen zu
detektieren, was eine wesentlich verlässlichere Methode darstellte, da man bei
Mundabstrichen isolierte, morphologisch gut differenzierbare Zellen untersuchen
kann (Spyridonidis et al, 2004b; Tran et al, 2003). Damit ist die Gefahr einer
Fehlinterpretation
von
kontaminierenden
deutlich geringer.
91
hämatopoetischen
Spenderzellen
Abbildung 15: Epithelialer Chimärismus im Mundabstrich einer Frau nach sex-mismatched
HZT. Die zwei einzelnen Zellen aus einem Mundabstrich sind mit einer Immunhistochemie für
Zytokeratin und FISH gefärbt. Ein detektiertes Y-Chromosom (rot) innerhalb des Zellkernes (blau)
+
einer Zytokeratin -Zelle (grün) ist mit einem Pfeil markiert.
Bei der Generierung von Knochenmarkstromazellen in Langzeitkulturen können
die Zellen ebenso gut morphologisch untersucht werden, da Stromazellen
adhärent wachsen und somit gut differenzierbar sind.
5.4.2 Chimärismus von Knochenmarkstromazellen
Bereits in den 80er Jahren wurde die Existenz des Chimärismus von
Knochenmarkstromazellen nach einer Transplantation bei Mäusen nachgewiesen.
Die Forschungsgruppe um Anklesaria konnte zeigen, dass nach einer
Konditionierungstherapie infundierte humane und murine Stromazellen nicht nur
ein komplettes Engraftment bewiesen, sondern auch ihre gesamte Funktion als
Regulator
der
Hämatopoese
im
Empfängerorganismus
entfalten
konnten
(Anklesaria et al, 1989).
Anhand dieser Daten stellte sich nun die Frage, ob auch beim Menschen nach
allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation Stromazellen aus dem
Transplantat gebildet werden können. Es existierten vor, bzw. zu Beginn der
Laborarbeit fünf Studien, welche über Y-Chromosom-Analysen bei sexmismatched
transplantierten
Patientinnen
einen
Chimärismus
von
Knochenmarkstromazellen nachzuweisen versuchten (Simmons et al, 1987; Laver
et al, 1987; Agematsu, Nakahori, 1991; Koc et al, 1999; Awaya et al, 2002). Es
konnten in keiner Arbeit Spenderzellen im Knochenmarkstroma nachgewiesen
werden.
92
Nahezu gleichzeitig erschienen zwei andere Studien, welche unabhängig
voneinander chimäre Stromazellen post transplantationem zeigen konnten (Cilloni
et al, 2000; Horwitz et al, 1999). Die Arbeitsgruppe von Horwitz zeigte bei
Säuglingen mit Osteogenesis imperfecta (genetisch bedingter Defekt der
osteoblastären Produktion von Kollagen Typ I, was zu Osteopenien, multiplen
Frakturen und schweren Knochendeformitäten führt), welche nach einer
myeloablativen
Konditionierung
eine
allogene
hämatopoetische
Stammzelltransplantation erhalten hatten, dass drei Monate nach der HZT 1,5-2%
spendertypische Osteoblasten detektiert werden konnten. Bei allen Säuglingen
zeigte sich eine deutlich vermehrte Mineralisierung der Knochen, es traten im
Posttransplantationsverlauf weniger Frakturen auf und es stellte sich ein
altersentsprechendes Längenwachstum ein. Dies deutet darauf hin, dass
mesenchymale Stammzellen im Empfängerorganismus angenommen werden und
sich dort auch in entsprechende Zellen differenzieren können (Horwitz et al, 1999).
Cilloni konnte mit seiner Arbeitsgruppe mittels PCR-Analyse zeigen, dass bei
sieben Patienten (von 14 ausgewerteten Patienten) mit hämatologischen
Neoplasien, welche nach einer Konditionierung mit einem myeloablativen Regime
(TBI-basiert) eine T-Zell-depletierte hämatopoetische Stammzelltransplantation
erhalten hatten, chimäre differenzierte Stromazellen im Knochenmark aufzufinden
waren.
5.4.3 Eigene Ergebnisse
Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurden Stromazellen, generiert aus
Knochenmarkproben von sechs verschiedenen Patientinnen nach einer allogenen
hämatopoetischen Stammzelltransplantation mit männlichem Spender, auf das
Vorkommen stromaler Spenderzellen untersucht.
Durch die problemlose Differenzierbarkeit adhärenter Stromazellen konnten wir
die bereits gut etablierte Dreifachfärbung, bestehend aus Y-Chromosom-FISH,
Immunfluoreszenzfärbung für die Oberflächenmarker Vimentin (mesenchymale
Zellen)
oder
von-Willebrand-Faktor
(endotheliale
Zellen)
und
Immunfluoreszenzfärbung für CD45 (hämatopoetische Zellen) oder CD14
(Makrophagen) anwenden (Spyridonidis et al, 2004a). Um kontaminierende
hämatopoetische
Zellen
herauszufiltern,
93
wurde
die
Kombination
mit
der
Immunfluoreszenzfärbung für CD45 gewählt, da CD45 typischerweise auf allen
kernhaltigen hämatopoetischen Zellen stark exprimiert wird (Trowbridge, Thomas,
1994). Auch die Möglichkeit, dass die Stromazellen fähig sind, diesen
Oberflächenantikörper selbst zu exprimieren konnten wir ausschließen, indem wir
die stromalen Marker mit der Färbung für CD45 kombinierten und keine CD45positiven Signale bei den mit Vimentin+- oder von-Willebrand-Faktor+-Zellen
ausmachen konnten. Des Weiteren war es möglich, dass Gewebemakrophagen
durch Herunterregulierung ihrer CD45-Expression bei ausschließlicher CD45Färbung übersehen werden (Abkowitz, 2002). Daher wurde auch die Kombination
mit der Immunfluoreszenzfärbung für CD14 zur Detektion der Makrophagen
verwendet. Somit konnten wir mit nur geringem Risiko der Fehldetektion von
hämatopoetischen
Zellen
oder
Makrophagen
unsere
Chimärismusanalyse
durchführen.
In keiner Patientenprobe konnten wir eine spendertypische Stromazelle (Y+Vimentin+/von-Willebrand-Faktor+-CD45-/CD14-) nachweisen und somit konnten
wir
keinen
Chimärismus
von
Knochenmarkstromazellen
bei
unserem
Patientenkollektiv zeigen.
Es können verschiedene potentielle Gründe für dieses Ergebnis unserer
Untersuchung verantwortlich sein.
Alle
Patientinnen
erhielten
als
hämatopoetisches
Transplantat
periphere
Blutstammzellen. Es ist wahrscheinlich, dass diese Art des Transplantates nicht
ausreichend
mesenchymale
Stammzellen
enthält,
um
überhaupt
einen
erfassbaren Chimärismus zu ermöglichen. In der Studie von Cilloni erhielt ein
Patient ebenfalls nur periphere Blutstammzellen und auch bei diesem konnte die
Gruppe keinen Chimärismus der Stromazellen nachweisen, wohingegen die
anderen Patienten, bei welchen ein Chimärismus gezeigt werden konnte,
zumindest anteilig CD34+ Zellen aus dem Knochenmark als Transplantat erhalten
hatten. Um diese These zu stützen, wäre ein Vergleich mit Knochenmarkproben
von Patientinnen nötig gewesen, welche Knochenmark als hämatopoetisches
Transplantat bei einer sex-mismatched Stammzelltransplantation erhalten hätten.
In unserem Patientenkollektiv hatten sieben Patienten Knochenmark als
Transplantat erhalten, allerdings waren davon fünf Patienten männlichen
Geschlechts und die zwei weiblichen Patienten hatten einen weiblichen Spender
94
(sex-matched HZT). Somit konnten wir mit unserer Methode bei diesen Patienten
keinen derartigen Vergleich zeigen.
Die sechs Patientinnen, deren Proben für die Chimärismusanalyse verwendet
werden konnten, wurden alle mit dem reduzierten, auf Fludarabin-basierenden
Konditionierungsschema vor der Transplantation behandelt. Die Konditionierung
mit diesem Regime vernichtet die Knochenmarkzellen und damit die
Knochenmarkstromazellen nicht vollständig. Daher ist es nicht auszuschließen,
dass die rezipienten Stromazellen in vivo gegenüber den fremden Spenderzellen
doch einen selektiven Vorteil bezüglich der Regenerierung und Differenzierung
ausnutzen können. Cilloni et al konnten bei ihren Patienten, welche eine TBIbasierte Konditionierung erhalten hatten, nach der Transplantation Stromazellen
mit dem Genom des Spenders in den Kulturen nachweisen (Cilloni et al, 2000).
Dies weist darauf hin, dass die myeloablative Konditionierung, welche deutlich
toxischer ist, als das Regime, welches unser Patientenkollektiv erhalten hatte,
günstiger für das Engraftment von Knochenmarkstromazellen nach der HZT zu
sein scheint.
Des Weiteren muss bedacht werden, dass es durch die von uns (und damit in
vitro)
geschaffenen
Wachstumsbedingungen
für
die
patienteneigenen
Knochenmarkstromazellen einen Vorteil gegenüber den Spenderzellen bezüglich
der Wachstumsfähigkeit gegeben haben kann. Um diese Möglichkeit noch näher
zu
beleuchten
bzw.
Chimärismusanalyse
um
von
diese
Möglichkeit
auszuschließen,
Knochenmarkstromazellen
Stanzbiopsien durchgeführt werden.
95
in
situ,
sollte
eine
z.B.
aus
6 Zusammenfassung
A) Mit der vorliegenden Arbeit sollte eine Einschätzung über die potentiellen
Vorteile der reduzierten Konditionierung im Vergleich zu den myeloablativen
Konditionierungen bezüglich der Zerstörung der Kochenmarkstromazellen in vivo
gemacht werden. Dabei konnten wir folgendes zeigen:
•
Die Patientenproben aus der FBM-Gruppe konnten signifikant häufiger
konfluente Stromazellen ausbilden, als die Proben der Standardmyeloablativen Gruppe.
•
Verschiedene Faktoren, von welchen eine Einflussnahme auf das
Stromazellwachstum nicht ausgeschlossen werden konnte, wurden in einer
univariaten Analyse untersucht, jedoch konnten wir auch hier keinen
Einfluss nachweisen.
Des Weiteren wurde die hämatopoetische Erholung (und damit das Engraftment)
hinsichtlich des Wachstums der aus den Knochenmarkkulturen generierten
Stromazellen untersucht.
Wir konnten keine Unterschiede nachweisen, unabhängig davon, mit welcher
Konditionierung die Proben vorbehandelt waren. Somit konnte die Fähigkeit des
Knochenmarks, Stromazellen zu generieren, keine Vorhersage über die
hämatopoetische Regeneration nach einer Stammzelltransplantation wagen.
B) Innerhalb der letzten Jahre wurden zahlreiche Hinweise entdeckt, dass
Knochenmark neben der Blutbildung zusätzlich das Potential für die Bildung
anderer Gewebetypen besitzt (Spyridonidis et al, 2004a; Tran et al, 2003; Cilloni et
al, 2000; Horwitz et al, 1999).
In dieser Arbeit haben wir Knochenmark von sechs Patientinnen (alle waren aus
der FBM-Gruppe, alle erhielten PBSC als Transplantat) nach allogener sexmismatched HZT mittels Y-Chromosom-FISH und Immunfluoreszenz-färbungen
für die stromalen Marker Vimentin und von-Willebrand-Faktor auf das Vorkommen
chimärer Stromazellen untersucht.
Wir konnten mit unseren Methoden in der vorliegenden Arbeit in keiner Probe
chimäre Stromazellen nachweisen.
96
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8 Anhang
8.1 Abkürzungsverzeichnis
ALL
akute lymphatische Leukämie
AML
akute myeloische Leukämie
ATG
Antithymozyten Globulin
BSA
Bovines Serum Albumin
BuCy
Busulphan/Cyclophosphamid
CD
cluster of differentiation
CLL
chronisch lymphatische Leukämie
CLP
common lymphozyte progenitor
CML
chronisch myeloische Leukämie
CMP
common myeloid progenitor
CMV
Zytomegalievirus
CR
complete remission
CsA
Cyclosporin A
DLI
donor lymphocytes infusion
DNA
desoxyribonucleic acid
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
FBM
Fludarabin/BCNU/Melphalan
FCS
fetal calf serum
FISH
Fluoreszenz In-situ Hybridisierung
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
G-CSF
granulocyte colony-stimulating factor
GM-CSF
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
GvHD
Graft-versus-Host-Disease
GvL
graft versus leukemia effect
Gy
Gray
HE
Hämatoxylin-Eosin
HLA
human leukocyte antigen
HSZ
hämatopoetische Stammzellen
HZT
hämatopoetische Stammzelltransplantation
IFN
Interferon
114
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
KG
Körpergewicht
KM
Knochenmark
KMT
Knochenmarktransplantation
LCA
leukocyte common antigen
MAPC
multipotent adult progenitor cells
M-CSF
macrophage colony-stimulating factor
MDS
myelodysplastisches Syndrom
MM
multiples Myelom
MMF
Mycophenolat mofetil
MPP
multipotente Progenitoren
MPS
myeloproliferatives Syndrom
MSZ
mesenchymale Stammzelle
MTX
Methotrexat
NHL
Non-Hodgkin-Lymphom
PBS
phosphat buffered saline
PBSC
periphere Blutstammzellen
PBSCT
periphere Blutstammzelltransplantation
PCR
polymerase chain reaction
PDGF
platelet-derived growth factor
RNA
ribonucleic acid
rpm
rounds per minute
RT
Raumtemperatur
SAA
schwere aplastische Anämie
SSC
sodium saline citrate
SZ
Stammzelle
TBI
total body irradiation
TGF
transformation-growth-factor
TNF
Tumornekrosefaktor
VSEL
very small embryonic like cells
ZNS
zentrales Nervensystem
115
8.2 Publikation
Spyridonidis A, Küttler T, Wäsch R, Samek E, Waterhouse M, Behringer D,
Bertz H, Finke J (2005) Reduced intensity conditioning compared to standard
conditioning preserves the in vitro growth capacity of bone marrow stroma, which
remains of host origin. Stem Cells Dev 14 (2): 213-222
116
8.3 Lebenslauf
zur Person
Tisa Nieborg geb. Küttler
geboren am 03. März 1977 in Gelsenkirchen
Nationalität: deutsch
Familienstand: verheiratet
Schulausbildung/Lehre
1983 - 1985
Grundschule St. Urbanus in Gelsenkirchen
1985 - 1997
Hiberniaschule in Herne
1993 - 1995
Berufsausbildung zur Damenschneiderin
1997
Allgemeine Hochschulreife
Medizinische Ausbildung
1997 - 1998
Freiwilliges Soziales Jahr als Rettungssanitäterin
bei der Berufsfeuerwehr Gelsenkirchen
1998 - 2005
Studium der Humanmedizin an der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
03/2001
Ärztliche Vorprüfung
03/2002
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04/2004
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04/2004 - 02/2005
Praktisches Jahr
Chirurgie, Städtisches Klinikum Karlsruhe
Anästhesie, Kreisspital Männedorf, Schweiz
Innere Medizin, Städtisches Klinikum Karlsruhe
05/2005
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Promotion
Beginn 2002
bei Prof. Dr. J. Finke, Abteilung Innere Medizin I,
Universitätklinikum Freiburg
Beruf
seit 08/2005
Assistenzärztin,
Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin,
Chefarzt: Prof. Dr. H.G. Bone
Knappschaftskrankenhaus Recklinghausen
117
8.4 Dank
Obwohl man als Doktorand immer versichert, dass man die Arbeit alleine gemacht
hat, sind doch trotzdem viele Köpfe und Herzen, in welcher Form auch immer an
der Fertigstellung beteiligt.
Zunächst möchte ich mich bei Prof. Dr. J. Finke für die Überlassung der
spannenden und für mich auch sehr herausfordernden Arbeit bedanken. Ebenso
bedanke ich mich bei Prof. Dr. P. Fisch für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Es wäre besonders am Anfang für mich völlig unmöglich gewesen auch nur eine
Zellkultur erfolgreich zu pflegen, wenn Eva Samek, Ulrike Tritschler und Sophie
Krüger mir nicht aus meinen Laborkinderschuhen geholfen hätten. Besonders Eva
Samek war für mich durch ihre immense Erfahrung und Geduld eine große
Bereicherung.
Des Weiteren bedanke ich mich bei Li de Lima-Hahn und Dr. Marie Follo für ihre
Hilfe bei Färbungen und mikroskopischen Auswertungen.
Auf seiner Doktorreise kommt man immer an nahezu unüberwindliche Grenzen.
Doch da gibt es dann jene, die einem wieder den richtigen Weg weisen können.
Von ganzem Herzen danke ich daher meinem verrückten griechischen Helden, PD
Dr. A. Spyridonidis, der sich egal zu welcher Tages- (oder Nacht) Zeit, egal wo auf
der Welt er gerade weilte, immer Antworten auf meine Fragen wusste. Seine
unglaubliche
Begeisterungsfähigkeit
und
Energie
haben
letztendlich
die
Fertigstellung dieser Arbeit möglich gemacht und mich eine herausragende und
einzigartige Betreuung erleben lassen.
Freunde werden in der Endphase solcher Arbeiten immer mitstrapaziert. Einen
kühlen Kopf behalten haben Dr. Christine Guhl, Dr. Nora Kussebi und Jutta
Schlotthauer, die mir jeden unmöglichen Satz mit freundlichen Kommentaren
versehen haben. Vielen Dank für die kritische Durchsicht meiner Zeilen und die
seelischen Aufmunterungen.
Wenn Freunde in der Endphase strapaziert werden, so muss die Familie die
ganze Zeit (vor allem in den schlechteren Tagen) den Kopf herhalten.
Das hat meine Familie, allen voran meine Eltern Ursula und Thilo Küttler und mein
Mann Jochen wie selbstverständlich getan, wofür ich mich auch bei ihnen aus
tiefstem Herzen bedanken möchte.
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