Die Institute Institut für Pathologie

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Institut für Pathologie
Institute of Pathology
Neuherberg
(Direktor / Director: Prof. Dr. Heinz Hoefler)
ie Forschungsaktivitäten des Institutes
konzentrieren sich auf die Entwicklung
molekular-biologischer Verfahren und
ihren Einsatz in Diagnostik und Prädiktion
der Therapieresponse von Tumoren.
Schwerpunkt dieser Forschungsarbeit ist
weiterhin die Identifizierung neuer Marker
und die Beziehung zwischen ihrer Expression und den histopathologischen Parametern. Da das Institut einerseits Zugang zu
definierten Tumorkollektiven hat, andererseits ,high-throughput’ genomische Assays
wie Expressions-Mikroarrays, Q-RT-PCR,
FISH, CGH sowie Proteomic-Arrays und
Immunohistochemie einsetzen kann, konzentrieren wir uns nun auf die Entwicklung
diagnostischer Tools, die das Verhalten und
das Potenzial eines Tumors individuell für
jeden Patienten vorhersagen können.
Am Jahresende waren im Institut 7
wissenschaftliche Mitarbeiter und Mitarbeiterinnen, 1 Nachwuchswissenschaftler und
3 sonderfinanzierte Wissenschaftler sowie
11 Techniker beschäftigt.
D
esearch in the Institute focuses on
developing clinical molecular-biological tools for the diagnosis and
prediction of therapy response, of tumours.
The mainstay of our work continues to be
the identification of new markers and
linking their expression with histopathological parameters. The Institute has
unparalleled access to both defined tumour
collections and high-throughput genomic
assays such as expression microarrays,
Q-RT-PCR, FISH, and CGH, as well as proteomic arrays and immunohistochemistry.
Using these, we have begun to concentrate
on developing diagnostic tools that predict
parameters of tumour behaviour and
biology at the level of the individual patient,
including predictive indicators of individual
cancer susceptibility.
At the end of the year, there were
7 scientists, 1 junior scientist, 3 scientists
supported by grant funds, and 11 technicians at the Institute.
R
Links-Rechts-Asymmetrie
Diese Untersuchung erfolgte in Zusammenarbeit mit Kollegen der GSF-IEG M. Hrabé
de Angelis, G.K.H. Przemeck und J. Beckers.
Die Bildung der Körperachsen ist während
der frühen Embryonalentwicklung ein
fundamentaler, bei Vertebraten während der
Evolution konservierter Prozess. Für die
geordnete Morphogenese der inneren
Organe ist die Antero-posterior-Achse, die
dorso-ventrale Achse und zusätzlich die
Links-rechts-Achse notwendig. Gene, die für
die normale Etablierung und Kontinuität
einer Links-rechts-Asymmetrie notwendig
sind, beinhalten z.B. Komponenten der
TGF-ß-Familie, der interzellulären Signalmoleküle und Gene, die für die Etablierung des
Primitivknotens und seiner MittellinienFunktion notwendig sind. Wir berichten,
dass Notch-Signale für diese morphogenetischen Prozesse der Links-rechts-Prägung bei
Mäusen notwendig sind. Wir zeigen, dass
das Fehlen des Delta 1 (DII 1)-Genes einen
Situs ambiguus-Phänotyp bewirkt, mit
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Abb. 1: Maus-Embryo am Embryonaltag (E) 7.5 und E 8.5. Beim Embryo E 7.5 ist der Primitivknoten im
Scheitel (Kreis) des Embryonalkonus bereits etabliert. Der Embryo E 8.5 ist kurz vor der charakteristischen AP-Achsendrehung entgegen des Uhrzeigers und zeigt auf seiner Ventralseite den Primitivknoten
(Kreis), der während der weiteren Entwicklung nach caudal wandert und gleichzeitig nach rostral die
Notochorda etabliert. Die Notochorda, eine saitenförmige Struktur, spielt eine wichtige Induktionsrolle
bei der Differenzierung der sagittalen und para-sagittalen Strukturen im embryonalen Körper.
zufälliger Drehrichtung des Embryos und der
Herzanlage. Die wahrscheinlichste Ursache
dieses Links-rechts-Defektes in DII 1-Embryomutanten ist eine fehlerhafte Entwicklung
der Mittellinienstrukturen (Abb. 1). Diese
a
anterior
posterior
+/+
Störung nimmt ihren Ursprung im Primitivknoten (Abb. 2), der bei DII 1-Embryomutanten deformiert und aufgebrochen ist. Basierend auf Expressionsanalysen bei normalen
Embryonen und Mutanten, schlagen wir
b
anterior
posterior
–/–
10 µm
Abb. 2: Raster-elektronenmikroskopische Aufnahmen (SEM) von Primitivknoten der Mausembryonen
am E 8.5 (a) Wildtyp +/+ und (b) DII 1 -/-. Beim Wildtyp besteht der P-Knoten aus kleinen mesendodermalen Zellen, jede mit einer Monozilie, die Signalmoleküle transportieren kann. Homozygote DII 1Mutanten haben deformierte P-Knoten. Ihre Oberfläche ist aufgrund gestörter Differenzierung der
Mesendoderm-Zellen aufgebrochen. Nur wenige dieser Zellen entwickeln eine Monozilie auf ihrer
apikalen Oberfläche.
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hier ein Modell vor, bei dem Notch-Signale
für eine fehlerfreie Differenzierung der
Zellen des Primitivknotens und seiner Morphologie notwendig sind.
Eine der ersten morphologischen Ereignisse während der Entwicklung, die zu einer
Asymmetrie zwischen der linken und rechten Körperhälfte im Embryo führen, ist die
Drehung der Herzschleife nach rechts. Während dieser Zeit dreht sich der U-förmige
Embryo (Nager) um seine Antero-posterior
+/+
(AP)-Achse entgegen des Uhrzeigers. Um
die Bedeutung der DII 1-Funktion bei diesen
Prozessen zu analysieren, untersuchten wir
die Morphologie und Drehung der Herzanlage und die Drehung der Embryonen. 100 %
der Wildtyp-Embryonen führen eine Drehung der Herzanlage nach rechts aus, nahe
50 % der Homozygoten DII 1-Embryonen
drehen abnormal, entweder komplett oder
inkomplett nach links. Als eine Konsequenz
der Körperdrehung entgegen des Uhrzei-
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–/–
Abb. 3: Lage der vorderen und hinteren Körperhälfte zueinander am E 9.5 und Herzmorphologie E 10.5.
Beim Wildtyp-Embryo (+/+) wächst die hintere Körperregion nach rechts, aufgrund der AP-Drehung
entgegen des Uhrzeigers. Die DII 1-Mutanten (-/-) haben eine Verlagerung der hinteren Körperregion
nach links. SEM-Bilder (a–c) einer normalen, komplett gedrehten Herzanlage (a), einer nicht vollständig
gedrehten Herzanlage (b) und einer spiegelbildlich gedrehten Herzanlage (c) bei der der zukünftige
Lungenventrikel (MA-Metampulla) auf der linken Seite ist und dementsprechend die Proampulla (PA)
rechts liegt.
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gers, wächst der hintere Embryobereich auf
die rechte Seite (Abb. 3 A, links). Im Gegensatz dazu erfolgt bei DII 1-Mutanten die
Körperdrehung bei nahezu 50 % im Uhrzeiger, und deren caudaler Körperteil wächst
nach links (Abb. 3 A, rechts).
Mit dem Raster-Elektronenmikroskop
untersuchten wir die Morphologie der Herzentwicklung (Abb. 3 B a–c). 39 % der
Embryomutanten drehten ihre Herzanlage
vergleichbar dem Wildtyp komplett nach
rechts, 18 % drehten nicht vollständig entweder nach rechts oder links, und 43 % der
Mutanten drehten ihre Herzanlage spiegelbildlich zum Wildtyp komplett nach links.
Trotz der umgekehrten Orientierung sind
alle Bereiche wie Sinus venosus, Atrium,
zukünftiger linker und rechter Ventrikel,
Bulbus cordis und Truncus arteriosus vorhanden.
Diese anatomische, spiegelbildliche Herzverlagerung konnten wir auf molekularer
Ebene bestätigen. Wir analysierten die
Expression des 6 HLH Transkriptions-Faktors
Hand 1. Sie beginnt schon kurz vor der
Implantation des Keimes und bleibt auf die
Herzanlage und die Neuralleisten-Abkömmlinge beschränkt. In der Herzanlage beim
Wildtyp ist Hand 1 in der Proampulla
(zukünftiger linker Ventrikel) exprimiert und
nur in einer beschränkten Region der
Metampulla (zukünftiger rechter Ventrikel).
Entsprechend der spielbildlichen Morphologie der Mutanten-Herzen war auch Hand 1
exprimiert.
Zusammenfassend kann geschlossen
werden, dass die Defekte in der Links-rechtsAchsenbildung bei DII 1-Embryo-Mutanten
einmal aus dem gestörten Primitivknoten
und zusätzlich gestörten Mittellinie resultieren.
Veränderte Regulation von Cyclin D1 und
p27 in Mantel-Zell-Lymphomen:
Bedeutung für die Pathogenese und eine
zielgerichtete Therapie
Das Mantel-Zell-Lymphom (MCL) ist charakterisiert durch die Translokation t(11,14), die
zu Desregulierung und Überexpression von
Cyclin D1 führt. Ein hoher Gehalt an Cyclin
D1 begünstigt eine Komplexbildung mit der
cyclinabhängigen Kinase 4 (CDK4), was zum
Einsetzen der CDK4-Kinaseaktivität führt.
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Die Aktivität dieser Kinase in Übereinstimmung mit der Aktivität der Cyclin E/CDK2Kinase ist entscheidend für die Phosphorylierung des Retinoblastom-Genproduktes,
welche zur Freisetzung von E2F und andere
Faktoren führt, die für eine Progression des
Zellzyklus und Wachstums notwendig sind.
Durch diese Kopplung ist die desregulierte
Cyclin D1-Überexpression in MCL direkt an
der Lymphombildung beteiligt.
P27 ist ein CDK-Hemmer, der eine wesentliche Rolle in der Regulierung der G1/SProgression spielt und dessen Aktivität
teilweise durch Interaktionen mit dem
D-Typ-Cyclin reguliert wird. p27 scheint, in
Übereinstimmung mit Cyclin D, ein Vermittler vieler wachstumshemmender (und
-stimulierender) Signale in der Umgebung
der Zelle zu sein. So erhöht sich zum Beispiel der freie p27-Gehalt, und die Zellen
gehen in G1-Arrest als Antwort auf Serumentzug, Sauerstoffmangel und bestimmte
Chemokine wie z.B. TGF-ß.
In enger Kooperation mit dem Laboratory
of Pathology am National Cancer Institute,
Bethesda, USA, haben wir gezeigt, dass das
Mantel-Zell-Lymphom einen relativ niedrigen Gehalt an immunhistochemisch nachweisbarem p27 hat, verglichen mit anderen
B-Zell-Lymphomen mit ähnlichen Wachstumsraten. Es wird angenommen, dass
diese Lymphome eine vergleichsweise hohe
Ubiquitinierungsaktivität haben, die in den
Abbau von p27 involviert zu sein scheint.
Mittels Western-Blot und Co-Immunopräzipitation untersuchten wir Zusammenhänge
zwischen Cyclin D1 und p27 in mehreren
Cyclin D1-positiven lymphoiden Zelllinien
und in primären MCL-Fällen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl in
Zelllinien als auch in den Primärtumoren die
Mehrheit des detektierbaren zellulären p27
als Komplex mit Cyclin D1 vorliegt und dass
ein stöchiometrischer Überschuss des Cyclin
D1 über p27 besteht. Diese Ergebnisse
untermauern unsere Hypothese, dass Überschuss an Cyclin D1 in MCL zusätzlich zu
seiner direkten Wirkung – die CDK4-vermittelte Rb-Phosphorylierung – auch agiert
um erhöhte Level an p27 abzufangen (und
möglicherweise auch von anderen CIP/KIPFamilienmitgliedern), was sich generell auf
die Kontrolle des Zellwachstums auswirken
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Pathogenesis of mantle cell lymphoma
CDK4
D1
CDK4
D1
CDK4
CDK4
D1
D1
D1
D1 CDK4
D1 CDK4 D1 CDK4
P27
CDK4
D1 P27
CDK4
CDK4
D1
CDK4
D1 P27
CDK4
D1 P27
CDK4
D1
P
P
D1 CDK4
E2F
Rb
D1 CDK4
P
CDK4
D1 P27
CDK2
E
E2F
P
RB
p27Kip1
Increased degradation
of p27Kip1 ?
P
Rb
P
P
Activation of transcriptional
genes required for G1/S
Abb. 4: Hypothetisches Modell der Wirkung einer Cyclin D1-Überexpression in Mantel ZellLymphomen. Der Cyclin D1/cyclinabhängige Kinase (CDK) 4 Komplex bewirkt Phosphorylierung
des Retinoblastoma-Proteins (RB). Dies führt zur Freisetzung des E2F-Transkriptionsfaktors,
der wiederum eine Progression des Zellzyklus in die S-Phase bewirkt. Der CDK Inhibitor p27 ist
gebunden und wird zurückgedrängt durch den erhöhten Gehalt an Cyclin D1, so dass dadurch
seine inhibitorische Wirkung auf Cyclin E verloren geht.
würde. Dies ist von wesentlicher Bedeutung
für das Verstehen des Entstehungsmechanismus von Mantel Zell-Lymphomen und
für die Entwicklung neuer Therapieansätze.
Unsere Hypothese geht davon aus, dass
therapeutische Ansätze, den Cyclin D1Gehalt zu erniedrigen oder die Konzentration des freien p27 zu erhöhen, einen bedeutenden therapeutischen Schritt darstellen
könnten.
Zusammenarbeit
Der Leiter des Instituts ist o. Univ.-Professor für Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie der
Technischen Universität München. Außerdem lehren drei
Mitarbeiter des Instituts an der Technischen Universität
und eine Mitarbeiterin an der Universität Innsbruck.
Mitarbeiter des Instituts lehren an der Universität London
MSc Kurs „Radiation biology“ und sind Gründungsmitglieder des Europäischen ‚on-line Pathologie Atlas der
Maus‘ „PATHBASE“.
Es bestehen Kooperationen mit der Technischen Universität München sowie mit nationalen Forschungseinrichtungen innerhalb der HGF und mit internationalen
Partnern innerhalb des 5. und 6. Rahmenprogramms
der EU.
Drittmittelprojekte sind durch die DFG, Bayerische
Forschungsstiftung, Wilhelm-Sander-Stiftung, Deutsche
Krebshilfe und die Europäische Union gefördert.
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Ausgewählte Veröffentlichungen
Przemeck, G.K.H., Heinzmann, U., Beckers, J., Hrabé de
Angelis, M.: Node and midline defects are associated
with left-wing development in Delta1 mutant embryos.
Development 130, 3-13 (2003)
Massberg, S., Gawaz, M., Grüner, S., Schulte, V.,
Konrad, I., Zohlnhöfer, D., Heinzmann, U., Nieswandt, B.:
A crucial Role of Glycoprotein VI for Platelet Recruitment
to the Injured Arterial Wall In Vivo. Journal of Experimental Medicine 197, 1, 41-49 (2003)
Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J.,
Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Rosenbrock, H., Keller, U.,
Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M.:
Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR
Contrast Agents. Radiology 228, 760-767 (2003)
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Quintanilla-Martinez, L., Davies-Hill, T., Fend, F., CalzadaWack, J., Sorbara, L., Campo, E., Jaffe, E., Raffeld, M.:
Sequestration of p27KIP1 protein by caclin D1 in typical
and blastic variants of mantle cell lymphomas (MCL):
Implications for pathogenesis. Blood 101, 8, 3181-3187
(2003)
Quintanilla-Martinez, L., Kremer, M., Specht, K., CalzadaWack, J., Schaich, R., Nathrath, M., Höfler, H., Fend, F.:
Analysis of signal transducer and activator of transcription 3 (Stat 3) pathway in multiple myeloma. American
Journal of Pathology. 162, 5, 1449-1461 (2003)