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Aus der Klinik für Tumorbiologie an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Gewebemikroarrays zur Charakterisierung und Validierung von Angiogenese-assoziierten Proteinen in humanen Tumorxenografts und -zellinien INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2010 von Johann Gregory Wirth geboren in Strasbourg, Frankreich Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. H.H. Fiebig 2. Gutachter: Prof. Dr. H.-E. Schaefer Jahr der Promotion: 2010 „Gar grausamklichen ist anzusehen der Krebs der ulceriert ist (...). Unnd hat ein schwartze finster farb / und in dem Umkreiß so hatt er adern voller melancholisch bluts / die seind gleich den Füßen des krebs / also spreyten sye sich uß.“ Meister Hans von Gerssdorf / genant Schylhans / burger und wundartzet zu Straßburg. Feldtbch der Wundartzney. Straßburg, 1528 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungen 1 Einleitung 1.1 Chemotherapie maligner Tumoren 1.1.1 Klassische Zytostatika 1.1.2 Target-orientierte Therapie 1.1.3 Entwicklung Target-orientierter Wirkstoffe 1.1.4 Gewebemikroarrays für die Charakterisierung und Validierung potentieller Targets 1.2 Angiogenese und Metastasierung 1.2.1 Tumorangiogenese 1.2.1.1 Definition 1.2.1.2 Molekulare Grundlagen 1.2.2 Tumorinvasion und Metastasierung 1.2.2.1 Tumorinvasion 1.2.2.2 Metastasierung 1.2.3 Beschreibung der untersuchten Proteine 1.2.3.1 VEGF 1.2.3.2 Cathepsin B 1.2.3.3 MMP-2 1.2.3.4 Typ I – Kollagen 1.2.3.5 ß1-Integrin 2 Fragestellung 3 Material 3.1 Reagenzien 3.2 Geräte und Verbrauchsmaterial 3.3 Immunhistochemie 3.3.1 Primärantikörper 3.3.2 Ungeeignete Primärantikörper 3.3.3 Sekundärantikörper, Signalverstärker und Puffer zur Vorbehandlung 3.4 Lektinhistochemie 3.5 Western Blotting 3.5.1 Antikörper 3.5.2 Aufbereitung der Zellysate 3.5.3 SDS-PAGE, Proteintransfer, Proteindetektion (Gel und Membran) 3.6 Datenverarbeitung 4 Methoden 4.1 Die Freiburger Xenograft Sammlung 4.2 Erstellen von Gewebemikroarrays 4.2.1 Einbetten der Xenografts 4.2.2 Erstellen des Array Blocks 4.2.3 Schneiden des Array Blocks 4.2.4 Zusammensetzung der Arrays 4.3 Immunhistochemische Färbung und Auswertung 4.3.1 Grundlagen der Immunhistochemie 4.3.2 Immunhistochemische Färbung von Gewebemikroarrays i Inhaltsverzeichnis 4.3.3 Semiquantitative Auswertung der gefärbten Gewebemikroarrays 4.3.4 Vergleich verschiedener Passagen 4.4 Kultur adhärenter humaner Tumorzellinien 4.5 Erstellen von Zellinienarrays 4.5.1 Technische Unterschiede zwischen Xenograftarrays und Zellinienarrays 4.5.2 Einbetten von Zellen 4.6 Gelelektrophorese und Western Blotting 4.6.1 Grundlagen 4.6.2 Erstellen von Zellysaten für Western Blotting 4.6.3 Proteinbestimmung / Bradford Assay 4.6.4 Gelelektrophorese und Western Blotting 4.7 Datenverarbeitung und statistische Auswertung 4.8 In vivo Testung antitumoraler Substanzen 4.8.1 Prinzipien 4.8.2 Wirksamkeitsprüfung von HuMV833 4.8.3 Wirksamkeitsprüfung von Halofuginon 5 Ergebnisse 5.1 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Xenograftarrays 5.1.1 Verwendete Gewebemikroarrays 5.1.2 Vergleich von Tumoren unterschiedlicher Passagen 5.1.3 VEGF-Expression 5.1.3.1 Tumortypspezifische VEGF-Expression 5.1.4 Cathepsin B – Expression 5.1.4.1 Tumortypspezifische Cathepsin B – Expression 5.1.5 MMP-2- und ProMMP-2-Expression 5.1.5.1 Tumortypspezifische (Pro-)MMP-2-Expression 5.1.6 Typ I – Kollagen – Synthese 5.1.6.1 Tumortypspezifischer Gehalt an Typ I – Kollagen 5.1.7 ß1-Integrin-Expression 5.1.7.1 Tumortypspezifische ß1-Integrin-Expression 5.2 Korrelationen der gemessenen Target-Spiegel untereinander 5.3 Korrelation zwischen Target-Expression und Tumorpathologie 5.3.1 Tumordifferenzierung und Expression von MMP-2 5.3.2 Tumordifferenzierung und Gehalt an Typ I – Kollagen 5.3.3 Target-Expression und Ursprung des Xenografts 5.3.4 ß1-Integrin-Expression und Prognose der Patienten 5.4 Testung eines therapeutischen anti-VEGF Antikörpers 5.4.1 HuMV833 5.4.1.1 PAXF 546 5.4.1.2 PAXF 736 5.4.2UntersuchungderposttherapeutischenTarget-Modulation in PAXF 546 5.4.3 Untersuchung zur Auswirkungen der Therapie auf die Zellproliferation und Morphologie von PAXF 546 5.5 Testung eines niedermolekularen Angiogenese-Inhibitors 5.5.1 Halofuginon 5.5.2 Therapie des Nierenzellkarzinoms RXF 944LX 5.5.3 Therapie des Melanoms MEXF 276 5.5.4 Verwendung von Gewebemikroarrays zur Target-Validierung ii Inhaltsverzeichnis 5.6 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Zelllinienarrays 5.6.1 Anwendung des Zellinienarrays 5.6.2 VEGF-Expression 5.6.3 Cathepsin B – Expression 5.6.4 MMP-2- Expression 5.6.5 Expression von ß1-Integrin 5.6.6 Vergleich der Proteinexpression der Xenografts und der Zellinien 5.7 Nachweis von Cathepsin B in Zellinien durch Western Blotting 5.7.1 Auswahl der Zellysate 5.7.2 Ergebnisse der Western Blots 5.7.3 Vergleich der Ergebnisse der Western Blots und der Zellinienarray-Immunhistochemie am Beispiel des Cathepsin B 6 Diskussion 6.1 Immunhistochemische Färbung der Xenograftarrays 6.2 In vivo Testung experimenteller Angiogeneseinhibitoren 6.3 Etablierung des Zellinienarrays 7 Zusammenfassung 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang A. B. C. D. E. F. Färbeergebnisse der Xenograftarrays, Tumorhistologie und Patientendaten Färbeergebnisse der Zellinienarrays Tabelle aktueller, experimenteller antiangiogener Verbindungen Curriculum Vitae Veröffentlichungen Danksagung iii Abkürzungszeichnis Abkürzungen ALL bFGF ca CD cDNA DAB DLT DNA EGF EORTC EZM FAK FISH HE HIF-1alpha IL IHC i.m. i.p. kDa LK MAPK Met MM MMP-2 MTD MTE NCI NHL PAF PBS PDGF PEX Domäne PF PM p.o. Prim Rez s.c. TGF uPA VEGF WB Akute Lymphatische Leukämie Basic fibroblast growth factor Karzinom Cluster of differentiation Copy-DNA Diaminobenzidin Dosislimitierende Toxizität Desoxyribonukleinsäure Endothelial growth factor European Organisation for Research and Treatment of Cancer Extrazelluläre Matrix Focal adhesion kinase Fluoreszenz in situ Hybridisierung Hämatoxylin-Eosin Hypoxia-inducible factor-1 alpha Interleukin Immunhistochemie Intramuskulär Intraperitoneal Kilodalton Lymphknoten MAP-Kinase Metastase Malignes Melanom Matrix Metalloproteinase 2 Maximal tolerable Dosis Maximaler Tageteffekt National Cancer Institute, USA Non Hodgkin Lymphom Platelet activating factor Phosphate buffered saline Platelet-derived growth factor Hämopexin-ähnliche Domäne Platelet factor Pleuramesotheliom Per os Primärtumor Rezidiv Subkutan Transforming growth factor Uroplasminogenaktivator Vascular endothelial growth factor Western Blotting iv v Abkürzungszeichnis Bezeichnung Tumorentität BXF Blasenxenograft Freiburg (Urothelkarzinom) CXF Kolonkarzinom CEXF Zervixkarzinom CNXF Tumor des ZNS GXF Magenkarzinom HNXF Plattenepithelkarzinom der Kopf- und Halsregion LXFA Adenokarzinom der Lunge LXFE Epitheliales Lungenkarzinom LXFL Großzelliges Lungenkarzinom LXFS Kleinzelliges Lungenkarzinom MAXF Mammakarzinom MEXF Melanom OVXF Ovarialkarzinom PXF Pleuramesotheliom PAXF Pankreaskarzinom PRXF Prostatakarzinom RXF Nierenzellkarzinom SXF Sarkom TXF Hodenkarzinom UXF Endometriales Karzinosarkom Xenograft Zellinie: Bezeichnung + L (MAXF 401L) Xenograft Zellinie Xenograft: Bezeichnung + LX (RXF 944LX) Xenograft Zellinie Xenograft Zellinie: Bezeichnung + LXL (GXF 521LXL) Xenograft NCI Zellinie: Bezeichnung + NL (RXF 393NL) NCI Zellinie: Histologie + CL + Namen (PRCL PC3M) 1. 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Chemotherapie maligner Tumoren 1.1.1 Klassische Zytostatika Die Anfänge der Chemotherapie gehen auf die Entdeckung der antitumoralen Wirkung von Stickstoff-Lost, einem Kampfgas, auf ein transplantables Lymphosarkom der Maus in das Jahr 1946 zurück. In den Jahren nach dem 2. Weltkrieg wurden zahlreiche neue zytotoxische Substanzen entwickelt (Tabelle 1.1). 1963 konnte zum ersten Mal ein solider Tumor, ein Chorionkarzinom der Frau, durch alleinige Chemotherapie mit Methotrexat geheilt werden (Hertz, 1963). 1946 Stickstoff-Lost 1952 6-Mecaptopurin 1948 Aminopterin 1953 Busulfan 1948 Amethoprin (Methotrexat) 1954 Urethan 1950 Purinantagonisten seit 1965 verschiedene Platinkomplexe Tab. 1.1: Historischer Überblick über die Anfänge der Chemotherapie, aus [78]. Die derzeit klinisch eingesetzten Zytostatika werden nach ihrem Wirkmechanismus in verschiedene Klassen eingeteilt: • Alkylierende Substanzen, wie Cyclophosphamid, verändern die Guaninbasen der DNA-Doppelhelix über eine kovalente Bindung. • Antimetaboliten beinhalten Folin-, Purin- und Pyrimidinantagonisten (z. B. 5-FU). Sie hemmen die Nukleinsäuresynthese. • Antiproliferativ wirkende Antibiotika können zwischen benachbarten Guaninbasen interkalieren, (Anthracycline, Actinomycin), DNA-Stränge fragmentieren (Bleomycin) oder Basen alkylieren. • Pflanzliche Alkaloide, wie Vincristin und Vinblastin, hemmen die Funktion des Spindelapparats und arretieren dadurch die Mitose in der zweiten Hälfte der Metaphase. 1. 2 Einleitung • Weitere antineoplastische Stoffe bilden Brücken zwischen den DNASträngen (Cisplatin, Carboplatin), hemmen an der DesoxyribunukleotidSynthese beteiligte Enzyme (Inhibition der Ribonukleosid-DiphosphatReduktase durch Hydroxyurea), oder interkalieren mit der DNA (Amsakrin). All diesen zugelassenen Substanzen ist gemeinsam, daß sie die Zellteilung hemmen und eine Apoptose oder Nekrose induzieren. Diese zytotoxische Wirkung („Zytotoxika“) ist in der Regel vom Zellzyklus abhängig (eine Ausnahme sind Alkylanzien). Ruhende Zellen in der G0 - Phase bleiben weitgehend unbeeinflußt, während proliferierende Zellen in den Phasen G1, S, M, G2 gehemmt und / oder getötet werden können. Da der Anteil der Zellen im Zellzyklus konstant ist - er wurde in soliden Tumoren auf 17-35% geschätzt - folgt die Rate der Zellabtötung einer logarithmischen Funktion [78]. Zytostatika wirken aber auch auf andere, gesunde Organe mit einer hohen Zellteilungsrate. Die daraus resultierende wenig spezifische Zytotoxizität bedingt bedeutende Nebenwirkungen. Dosislimitierend sind bei der „konventionellen“ Chemotherapie u.a. die Knochenmarksdepression, Diarrhoe und Erbrechen. Sie senken die Compliance der Patienten und führen unter Umständen zum frühzeitigen Therapieabbruch. Darüber hinaus wird das Auftreten solider Zweittumoren oder Leukämien begünstigt. 1.1.2 Target-oriente Therapie Aus Kapitel 1.1.1 wird ersichtlich, warum seit Jahren nach Therapieformen gesucht wird, die spezifischere antitumorale Wirkungen aufweisen. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie und in der Genomics- und Proteomics-Forschung werden laufend Gene und Proteine identifiziert, die für die Tumorentstehung verantwortlich sind [48]. Diese Onkogene und Onkoproteine stellen mögliche Ansatzpunkte einer rationalen Tumortherapie dar. Solche spezifischen Zielproteine (molekulare „Targets“) sind an der autokrinen Wachstumsstimulation, Neoangiogenese oder Resistenzentwicklung gegen Chemotherapie beteiligt (Tabelle 1.2) [45]. Target-Inhibitoren sind daher gegen spezifische intrazelluläre und interzelluläre Mechanismen von Tumorzellen gerichtet, 1. 3 Einleitung während zytotoxische Substanzen mit wenig Spezifität den physiologischen Vorgang der Zellteilung hemmen. Maligner Prozeß Beispiel eines beteiligten Proteins Proteinfunktion Zellwachstum EGF-Rezeptor Immortalität Telomerase Enzym Zytostatikaresistenz Methylguaninmethyltransferase Enzym Metastasierung Matrix Metalloproteinasen Enzym Vaskularisierung Vascular endothelial growth factor Wachstumsfaktor Rezeptor eines Wachstumfaktors Schutz vor Apoptose Bcl-2 Signaltransduktion Tab. 1.2: Exemplarische Auswahl molekuler Targets. Viele Target-spezifische Substanzen bewirken keine unmittelbare Zytotoxizität, sondern hemmen lediglich einen für das Fortschreiten des Krebses erforderlichen Prozeß. Infolgedessen wird keine logarithmische Zellabtötung erwartet, der klinisch eine Abnahme der Tumormasse entspräche, sondern der Rückgang der klinischen Aggressivität des Tumors. Die obere Dosis ist bei maximaler Hemmung des Targets erreicht, zum Beispiel bei der völligen Inhibition eines Rezeptors. Man spricht hier vom „maximalen TargetEffekt“ (MTE). Aus den oben genannten Gründen geht hervor, daß die Target-orientierten Inhibitoren das Ziel haben, einen akuten Krankheitsverlauf durch Dauertherapie in einen chronischen Verlauf zu überführen, während zytotoxische Substanzen hauptsächlich im akuten Stadium der Krebserkrankung wirksam sind, zum Beispiel bei der Induktionstherapie einer akuten Leukämie. Auch das zu erwartende Nebenwirkungsprofil der molekularen Tumortherapie ist wahrscheinlich anders als bei zytotoxischen Substanzen. Die Kombination von zytotoxischen und Target-modulierenden Substanzen könnte bei nicht überschneidenden Nebenwirkungen günstig sein. Für eine Target-orientierte Therapie ergeben sich damit folgende klinische Überlegungen: 1. Der Tumor muß ein in der Onkologie validiertes Target exprimieren (z.B. aus Tabelle 1.2). 1. Einleitung 4 2. Die Funktion des Targets darf nicht durch alternative Reaktionswege ersetzt werden: Spätestens wenn die Maximaldosis erreicht ist, sollte ein klinischer Effekt eintreten. 3. Therapielimitierend ist statt der allgemeinen Toxizität des Medikaments der Funktionszustand oder die Sättigung des Targets. Der maximale Target-Effekt (MTE) ersetzt hier die dosislimitierende Toxizität (DLT). 4. Die Regression oder Volumenabnahme des Tumors ist mit targetorientierter Therapie meistens nicht zu erreichen, da kein logarithmischer Zelltod zu erwarten ist. Es müssen statt dessen spezifische Parameter entwickelt werden, welche die klinische Auswirkung der Target-Modulation wiederspiegeln (zum Beispiel Messung der Tumordurchblutung durch MRT für das „Monitoring“ einer anti-angiogenen Therapie). Welche Auswirkungen diese Eigenschaften für die Wirkstoffentwicklung haben, ist Gegenstand des nächsten Kapitels. 1.1.3 Präklinische Entwicklung Target-orientierter Wirkstoffe Der Übergang von einer empirisch fundierten zu einer rationalen Therapie geht mit grundlegenden Veränderungen in der onkologischen Wirkstoffentwicklung einher. Das konventionelle, empirische Vorgehen beruht auf einem breit gefächerten „Screening“ nach der biologischen Aktivität zahlreicher Substanzen. Letztere sind Naturstoffe oder synthetische Verbindungen. Sie stammen aus der Chemie, Botanik und Mikrobiologie. Als Testmodelle werden in der Onkologie hauptsächlich Zellinien, murine Tumoren und humane Xenografts verschiedener Histologien verwendet. Es gilt, durch Tumortyp-orientierte Hochdurchsatzverfahren viele Stoffe innerhalb kurzer Zeit zu testen. Der rationalen Testung dagegen liegt eine molekulare Wirkhypothese zugrunde, die durch ein verbessertes Verständnis molekularbiologischer Prinzipien postuliert werden konnte. Sie erfordert ein Screening nach Target-abhängigen Tumoren oder Zellinien, a priori unabhängig von deren Histologie. Solche Krankheitsmodelle können ggf. gentechnisch konstruiert werden. Dieses Testvorgehen ist Targetorientiert. [25,127] 1. 5 Einleitung Neue Substanzklassen für die Target-orientierte Tumortherapie umfassen Antikörper („native“ Antikörper, Immuntoxine, Immunliposome), lösliche Rezeptoren oder niedrigmolekulare, chemisch-sythetische Verbindungen. Antikörper sind meistens gegen Moleküle der Zelloberfläche gerichtet, lösliche Rezeptoren konkurrieren um die Bindung von sezenierten Zytokinen oder Wachstumsfaktoren, niedrigmolekulare Verbindungen können die intrazelluläre Signaltransduktion hemmen. Die Profilierung solcher Wirkstoffe muß wegen den hohen Kosten klinischer Studien so weit es geht in präklinischen Modellen erfolgen. Folgende Anforderungen müssen erfüllt sein: • Validierung des Targets: Das ausgesuchte onkologische Target darf nicht durch andere Proteine ersetzbar sein. In komplexen molekularen Reaktionskaskaden ist das Vorkommen von alternativen Wegen oder „crosstalks“ häufig, welche die Wirkung der Target-Inhibition ausgleichen könnten. • Validierung der Verbindung („Compound Validation“): Der Wirkstoff muß die Funktion des Zielproteins effektiv blockieren. Während und nach der Wirksamkeitsprüfung, zum Beispiel an gentechnisch veränderten Zellen, sollte eine Modulierung der Target-Funktion und der Surrogatmarker durch entsprechende Assays nachweisbar sein („Proof of Principle“). • Die Durchführung solcher Untersuchungen ist nur möglich, wenn Targetabhängige Krankheitsmodelle verfügbar sind. Experimentelle Wirkstoffe könnten im Idealfall in Target-positiven und Target-negativen Tumoren vergleichend geprüft werden. Durch Genomics- Onkoproteine und entdeckt, Proteomics-Untersuchungen die in bestehenden wurden Krankheitsmodellen viele neue nur unter bedeutendem Zeit-, Arbeits- und Materialaufwand charakterisiert werden können. Es besteht daher ein Bedarf an Hochdurchsatzverfahren zum Nachweis neuer Targets auf der Proteinebene. 1. 6 Einleitung 1.1.4 Gewebemikroarrays für die Charakterisierung und Validierung potentieller Targets Die Entwicklung von automatischen Sequenziergeräten und Laborrobotern hat in den letzten Jahren die Aufklärung des gesamten humanen Genoms – ca. 30.000 Gene - ermöglicht. Durch cDNA-Arraytechnologie der sogenannten „Genomics“-Ära wurden auch neue Onkogene und Tumorsupressorgene identifiziert, welche für die Entstehung von Krebs verantwortlich gemacht werden. Die Sequenzierung eines Gens erlaubt jedoch nur begrenzte Rückschlüsse auf die endgültige Struktur und Funktion der Proteine, da durch Spleißen und posttranslationale Prozessierung unterschiedliche Proteinformen entstehen können. So bleibt die Aufklärung der Funktion potentieller Target-Proteine für die Krebstherapie ein zeitintensiver Prozeß. Zwischen der Identifizierung eines Gens, der Aufklärung der Funktion des jeweiligen Proteins und seiner Validierung als klinisch verwendbares Target oder Marker vergehen meist mehrere Jahre. Dieser Engpaß kann auf den Mangel von Hochdurchsatzverfahren Validierung spezifischer zur Charakterisierung Inhibitoren der zurückgeführt Onkoproteine werden (Abb. und 1.3). Insbesondere die umfangreiche Untersuchung neuer Kandidatproteine durch konventionelle Immunhistochemie oder Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) in Tumorgeweben ist ein langwieriges Verfahren, weil pro Objektträger in der Regel nur ein Gewebe analysiert wird. 1. 7 Einleitung Humanes Genom ~ 30.000 Gene ~ 700 Tumorgene Transkriptom ~ 66.000 Transkripte Proteom > 90.000 verschiedene Proteine + posttranslationale & proteolytische Varianten ~ 10.000 potentielle Targets Onkoproteom > 2.100 Proteine „Bottlenecks” : - Charakterisierung der Funktion - Validierung Abb. 1.1: In den letzten Jahren konnten die ca. 30.000 Gene des humanen Genoms identifiziert werden. Die Gesamtheit dieser Gene kodiert mindestens 90.000 unterschiedliche Proteine. Für die Tumorentstehung und –progression wurden ca. 700 Gene, die ca. 2100 Proteine kodieren, verantwortlich gemacht. Nach den rapiden Fortschritten in der Analyse des humanen Genoms ist es nötig, die gewonnenen Erkenntnisse auf die Proteine zu übertragen, sie funktionell zu charakterisieren und für die Krebstherapie zu validieren. [72,122] Die 1998 von Kononen et al. entwickelten Gewebemikroarrays erlauben diesen Engpaß zu überwinden [61]. Hierfür werden mehrere hundert Gewebeproben auf einen „Biochip“ übertragen. Mit einem Gewebearrayer werden 0,6 mm breite Zylinder aus Paraffin eingebetteten Geweben ausgestanzt und in einen Empfängerblock, den Arrayblock, eingefügt. Der Arrayblock kann anschließend geschnitten und durch in situ hybridisierende Verfahren oder immunhistochemisch untersucht werden, sowohl auf DNA-, als auch auf Proteinebene. Die Auswertung erfolgt semiquantitativ am Mikroskop. Durch die Automatisierung der Färbung und der Auswertung läßt sich dieser Prozeß zusätzlich beschleunigen. Vorteile dieses Verfahrens sind, daß eine große Zahl verschiedener Gewebe unter gleichen Bedingungen untersucht und parallel ausgewertet werden kann. Darüber hinaus wird weniger Material und Zeit als bei konventionellen Methoden benötigt. Gewebemikroarrays stellen daher ein schnelles, objektives und wiederholbares Verfahren zur Charakterisierung neuer Targets dar. 1. 8 Einleitung Gewebemikroarrays Tumorsammlungen werden u.a. eingesetzt. Sie zur Profilierung der ermöglichen eine Genexpression in Klassifizierung von Tumoren, die sich nicht nach ihren histopathologischen Merkmalen, sondern nach der Target-Expression richtet. Die statistische Auswertung der gewonnenen Daten erlaubt die Evaluation der neuen Gene und Proteine hinsichtlich ihrer prognostischen Bedeutung oder ihrer molekularen Funktion [6,102]. 1.2 Angiogenese und Metastasierung 1.2.1 Tumorangiogenese 1.2.1.1 Definition Wachsendes Gewebe ist auf das Einsprossen neuer Gefäße zum Austausch von Sauerstoff und Metaboliten angewiesen. Dieser Vorgang wird als Angiogenese oder Neovaskularisierung bezeichnet. Davon abzugrenzen ist die Vaskulogenese, die Differenzierung von Stammzellen zu Gefäßzellen [96]. Im gesunden Körper beteiligt sich die Angiogenese an der Wundheilung, an der Entstehung des Corpus luteum und am Umbau des Endometriums. In diesen physiologischen Prozessen ist die Angiogenese ein genau reguliertes Wechselspiel zwischen i) dem hypoxischen Parenchym, ii) dem Endothel und iii) dem perivaskulären Stroma. Nach Wiederherstellung der Blutversorgung endet die Vasoproliferation und überflüssige Gefäße bilden sich zurück – physiologische Angiogenese ist ein zeitlich und räumlich limitiertes Geschehen. In Tumoren und in anderen Krankheiten, wie die diabetische Retinopathie, Morbus Crohn, rheumatoider Arthritis, Endometriose und Psoriasis ist dieser Prozeß dauerhaft dysreguliert [32]. Ein Tumor entwickelt ab einer Größe von 1 mm3 angiogene Eigenschaften, da Sauerstoff aus den Kapillaren nur über eine Distanz von 250 µm diffundieren kann [38]. Es konnte nachgewiesen werden, daß der Übergang von einem ruhenden, avaskulären zu einem vaskulären Phänotyp, der „angiogenic switch“, durch die Überexpression von angiogenen Wachstumsfaktoren entsteht [44]. Dabei verschiebt sich das Gleichgewicht zwischen antiangiogenen und angiogenen Stimuli zugunsten der Letzteren (Tab. 1.3 und Abb. 1.2). 1. 9 Einleitung Proangiogene Faktoren: VEGF, HIF-1α, bFGF, FGF-2, IL-1, IL-4, IL-8, Angiogenin, EGF, PAF. Antiangiogene Faktoren: Angiostatin (ein Plasminogenfragment), Thrombospondin, Endostatin (ein Fragment von Kollagen Typ XVIII), TGF-ß und PF-4. Tab. 1.3: Endogene Faktoren mit Einfluß auf die Angiogenese, aus [55]. Abb. 1.2: Wechsel von einem in situ Karzinom zu einem invasiven Tumor, modifiziert nach [81]. Das Durchbrechen der Basalmembran ist der erste Schritt der lokalen Tumorinvasion, während die Neovaskularisierung des Tumors eine Voraussetzung für die hämatogene Metastasierung ist. Während der Etablierung der Durchblutung werden drei pathologische Vorgänge initiiert, welche die Prognose des Patienten erheblich verschlechtern: ungehemmtes Wachstum, Invasion und Metastasierung. Dementsprechend geht eine hohe Gefäßdichte im Tumor mit einer schlechten klinischen Prognose einher [115, 126]. 1971 postulierte Judah Folkman das Konzept, Krebs durch eine antiangiogene Therapie von einer akuten in eine chronische Krankheit umzuwandeln [31]. 1983 entdeckten Dvorak et al. den meist beschriebenen Mediator der Angiogenese, „vascular endothelial growth factor“ (= VEGF, auch VPF) [106]. Seitdem wurden die molekularen Mechanismen der Neoangiogenese weiter aufgeklärt und erste antiangiogene Therapien entwickelt (Beispiele sind in Anhang C beschrieben). 1. Einleitung 1.2.1.2 10 Molekulare Grundlagen Durch Hypoxie werden Zellen zur Expression proangiogener Faktoren, u.a. von HIF und VEGF, stimuliert. Diese Faktoren wirken parakrin auf Endothelzellen und führen unmittelbar zur Vasodilatation (durch NO) und zur Permeabilitätssteigerung des Endothels. Darüber hinaus gehen von vielen Faktoren mitogene Signale aus [22,41]. Die proliferierenden Endothelzellen sezenieren Matrix Metalloproteinasen und Plasminogenaktivatoren, die das umliegende Bindegewebe auflösen, und sprossen durch die Basalmembran in das perivaskuläre Stroma ein [87,118]. Die Motilität der Endothelzellen wird dabei von Cadherin- und Zelladhäsionsmolekülen („CAMs“) und Integrinen vermittelt (Abb. 1.3). Schließlich organisieren sich die Endothelzellen an Typ I – Kollagenfasern entlang zu räumlich stabilen Kapillaren. PDGF-Sekretion fördert das Wachstum von Mesenchymzellen, die sich über Kontakte mit den Endothelzellen zu Perizyten und Myozyten differenzieren. Je nach Ausmaß dieses letzten Schrittes entstehen unterschiedlich große Gefäße. Abb. 1.3: Schematische Darstellung der Angiogenese. Hypoxie und angiogene Faktoren bewirken die Proliferation und Migration der Endothelzellen. Die extrazelluläre Matrix wird durch Proteasen degradiert. Die gebildeten Bindegewebsfragmente dienen als Leitstrukturen für die Pseudopodien migrierender Endothelzellen und stellen einen zusätzlichen chemotaktischen Reiz dar. Die Zellmotilität entsteht durch Integrin-vermittelte Zell-Matrix Kontakte und durch Veränderungen im Zytoskelett der Zellen. Abbildung modifiziert nach [40]. 1. 11 Einleitung 1.2.2 Tumorinvasion und Metastasierung Lokal begrenzte Tumoren können chirurgisch kurativ reseziert werden. Die Prognose ist in diesen Fällen für den Patienten gut. Die Mehrzahl der Neoplasien sind zum Zeitpunkt der Diagnose jedoch nicht mehr lokal begrenzt. Ursache ist die Fähigkeit der Tumorzellen, in umliegendes Gewebe zu penetrieren und über die Blut- oder Lymphbahnen Metastasen zu bilden. Dadurch entwickelt sich die Erkrankung von einem lokalen zu einem generalisierten Stadium: TxN1Mx bei Befall der lokalen Lymphkoten, TxNxM1 bei hämatogenen (Fern-) Metastasen. Verfügbare Behandlungsmethoden beschränken sich in diesen Fällen auf eine palliative, systemische Chemotherapie. 90% der Krebspatienten sterben an Metastasen, nicht am Primärtumor selbst [133]. Aus diesen Gründen ist die Entwicklung von Hemmstoffen der Tumorinvasion und Metastasierung ein vorrangiges Ziel der Krebsforschung. 1.2.2.1 Im Tumorinvasion menschlichen Körper werden Zellen durch Adhäsionsmoleküle und Desmosomen untereinander und mit dem Stroma verbunden. Zellverbände sind in der Regel durch Basalmembranen und interstitiellem Stroma voneinander getrennt; Allein während der Morphogenese und der Wundheilung wird diese Kompartimentierung überwunden. Invasive Tumorzellen unterliegen jedoch nicht den homeostatischen Signalen des Wirtes, sondern wachsen heterotop und modellieren sich eine eigene Matrix aus Strukturen des Wirtsorganismus [19,27]. Diese Gewebearchitektur an der invasiven Grenzlinie wurde als „tumor microenvironment“ bezeichnet. Sie beruht auf Wechselwirkungen zwischen dem Tumor und dem Mesenchym des Wirtes, an denen Zellen, die EZM, Enzyme, Wachstumsfaktoren und Zytokine beteiligt sind [60,68]. Der erste Schritt der lokalen Invasion besteht in der Dissemination der Zelle aus dem Tumorkompartiment. Zell-Zell Kontakte werden aufgehoben, die Tumorzelle heftet sich an die Basalmembran des Tumors und an Bindegewebsfasern der EZM. Ähnlich wie während der Angiogenese (die molekularen Mechanismen sind identisch), bilden sich invasive Pseudopodien aus. An diesen „Invasopodien“ vermittelt Integrin die Aktivität von Matrixmetalloproteinasen, Plasmin und weiterer 1. 12 Einleitung Proteasen, so daß die stromale Kompartimentierung durchbrochen wird [4,5,68]. Proteasen, die als Proform im Stroma vorliegen, werden an den Invasopodien aktiviert und lösen eine proteolytische Kaskade aus (Abb. 1.4), in der Matrixbestandteile wie Kollagene, Laminin oder Vitronectin degradiert werden. Ihre Abbauprodukte wirken chemotaktisch auf weitere Tumor-, Mesenchym- und Entzündungszellen. In diesem Wechselspiel zwischen Tumorzellen, Stromaproteinen und extrazellulären Enzymen wird die Migration und Proliferation der Zellen in der neu modellierten Matrix stimuliert. Manche Tumorzellen erreichen Lymphgefäße, wachsen die Lymphbahnen entlang (Lymphangiosis carcinomatosa) oder werden in Lymphknoten geschwemmt. Andere streuen über das Blutsystem und bilden in manchen Fällen Fernmetastasen, die am Ort der Metastasierung eine Invasionsfront mit dem gleichen Aufbau wie am Primärtumor ausbilden [19]. Abb. 1.4: Molekularbiologie der Tumorinvasion, aus [68]. Es sind die Interaktionen zwischen der Tumorzelle, der EZM und den Stromazellen dargestellt. Durch das Zusammenspiel verschiedener Wachstumsfaktoren und Enzymen werden die Zellmotilität, die Zellproliferation und die Proteolyse des Bindegewebes gesteigert. 1. 13 Einleitung 1.2.2.2 Metastasierung Invasive Tumorzellen sind in der Lage, das Tumorkompartiment zu verlassen. Gelangen sie in das Gefäßsystem, kann ein Bruchteil dieser Zellen in ein anderes Organ disseminieren und sich dort absiedeln und vermehren. Dieser mehrstufige Prozeß ist in Abbildung 1.5 dargestellt. 1 2 8 3 4 5 7 6 Abb. 1.5: Entstehung von Metastasen, aus [2,28,89,90]. Der ruhender Primärtumor (1) nimmt einen angiogenen Phänotyp an (2). Einzelne Zellen lösen sich aus ihrem Zellverband durch Herunterregulierung von Adhäsionsmolekülen ab, die Basalmembran des Tumors und das interstitielle Bindegewebe werden enzymatisch lysiert. Dabei wirken Bindegewebsfragmente chemotaktisch. Die Motilität der Zellen wird u.a. durch Integrine vermittelt. Im Zuge der Gewebeinvasion dringen Tumorzellen in Blutgefäße ein (Intravasation) (3), wo sie als Aggregat mit Thrombozyten und Lymphozyten zirkulieren (4). Eventuell embolisieren sie in einem Kapillarbett, zum Beispiel von den Lungen (5), adhärieren über spezifische Adhäsionsmoleküle an das Endothel und proliferieren lokal weiter (6). Dabei retrahieren sich die Endothelzellen und erlauben die Extravasation der Tumorzellen (7). Die Proliferation schreitet im Zielorgan fort und es bilden sich Metastasen (8). Den hohen Selektionsdruck auf dem Weg zum Zielorgang überleben nur 0,01% der zirkulierenden Tumorzellen [89]. Entsprechend der „Seed and Soil” Hypothese von Paget, 1889 [85], sind nur ausgewählte Zellen fähig, in einem fremden Organ zu wachsen. Die Gene und Proteine, welche diese Fähigkeit ausmachen, stellen bedeutende Ansatzpunkte antimetastatischer Therapien dar. Fünf dieser Angiogenese- und Metastasierungs-assoziierten Proteine werden im Folgenden beschrieben. 1. 14 Einleitung 1.2.3 Beschreibung der untersuchten Proteine 1.2.3.1 VEGF VEGF ist ein stark konserviertes, homodimeres Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 34-46 kDa. Das humane Gen für VEGF liegt auf Chromosom 6p21.3 [124]. Durch alternatives RNA Spleißen entstehen sechs Isoformen: VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 und VEGF206, die sich in ihrem Expressionsprofil unterscheiden (Die tiefgestellte Zahl steht für die Anzahl von Aminosäuren). VEGF165 ist die häufigste Isoform [97]. Die Dimere sind kovalent über Disulfidbrücken gebunden [93]. Die VEGF-Rezeptoren VEGFR-1, 2 und 3 bilden den flt Subtyp der Thyrosin Rezeptorkinasen. VEGFR-1 (= Flt-1) hat die höchste Affinität für VEGF. Dennoch soll VEGFR-2 (= KDR / Flk-1) für die Mitogenese, Chemotaxis und Motilität von Endothelzellen bedeutender sein [125]. Die Expression der VEGF-Rezeptoren 1 und 2 ist auf Endothelzellen, glatten Muskelzellen und Blutzellen beschränkt [40]. An VEGFR-3 (= Flt-4) binden ausschließlich VEGF-ähnliche Proteine. Dieser Rezeptor ist bei der Lymphangiogenese beteiligt [56]. VEGF-ähnliche Proteine („VEGF-related proteins“) weisen unterschiedliche Affinitäten zu den VEGF-Rezeptoren auf und kommen differenziert im Körper vor. Bekannt sind: Placenta growth factor (PGF), VEGF-B (=VEGF-related factor), VEGF-C (=VEGF-related protein), VEGF-D (=c-fos-induced growth factor) und VEGF-E [97]. Die VEGF-Expression wird durch Hypoxie und den proangiogenen Zytokinen PDGF, TNF-α, IL-1, FGF induziert und eng von „Enhancern“ und Transkriptionsfaktoren kontrolliert [97]. VEGF ist ein potenter Mediator der Vaskulogenese und der Angiogenese [17]. Über komplexe Signaltransduktionskaskaden (Abb. 1.6) erhöht es die Permeabilität des Endothels, induziert die Sekretion von uPA und Matrix Metalloproteinasen, fördert die Proliferation und hemmt die Apoptose der Endothelzellen [22,36,87,118]. Es wurde ein erhöhtes Vorkommen von VEGF in zahlreichen humanen Tumoren beschrieben [26]. Dort fördert VEGF das Wachstum und die Streuung maligner Zellen. Dementsprechend verschlechtert eine hohe VEGF-Expression die Prognose 1. Einleitung 15 des Patienten [116]. Derzeit befinden sich VEGF-Inhibitoren in der klinischen Entwicklung (Beispiele im Anhang C). Abb. 1.6: VEGF vermittelte Signaltransduktion, aus [22]. 1.2.3.2 Cathepsin B Cathepsin B ist ein Glykoprotein mit proteolytischer Aktivität, das als einkettiges (32 kDa), oder als doppelkettiges Molekül vorliegen kann. Letzteres setzt sich aus einer 27 kDa und einer 4 kDa Untereinheit zusammen, welche über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Das Gen für Cathepsin B wurde auf Chromosom 8p22 lokalisiert [33], mehrere Polymorphismen und Spleißvarianten sind bekannt [20,39,58]. Funktionell handelt es sich bei diesem Enzym um eine ubiquitäre, lysosomale Cystein Peptidase mit breiter Substratspezifität. Es hat eine duale Funktion als Endopeptidase und Peptidyldipeptidase / Carboxypeptidase. Letztere wird durch eine sogenannte „occluding loop“ (verdeckende Schleife) ermöglicht, die einen Akzeptor für die freie negative Ladung am Carboxyterminal des Substrates enthält [15,52]. Die Aktivität dieser Carboxypeptidase überwiegt in den Lysosomen (pH ~ 5) und ist am „Turnover“ intrazellulärer Proteine beteiligt. 1. 16 Einleitung Für die extrazelluläre Aktivität von Cathepsin B ist dagegen die Endopeptidaseaktivität von Bedeutung. Ihr pH-Optimum liegt im neutralen Bereich (pH ~ 7,4) [67]. Cathepsin B wird als 45 kDa schweres Proenzym und als reifes, 32 kDa schweres Enzym sezeniert. Procathepsin B wird in einer proteolytischen Kaskade durch andere Proteasen aktiviert. Das reife Enzym wird für die Degradation der EZM (Proteoglykane, Fibronektine, Kollagene) und für die Aktivierung weiterer Proteasen verantwortlich gemacht [47,67]. Die Sekretion von Cathepsin B soll durch Endothelzellen während der Angiogenese, aber auch durch Tumorzellen erfolgen [47,92,94]. In diesem Zusammenhang wird Cathepsin B durch seine pro-invasiven und pro-angiogenen Eigenschaften dem metastatischen Phänotyp eines Tumors zugerechnet [109]. Die pathogenetische Implikation von Cathepsin B an der Krebsprogression konnte experimentell und klinisch bestätigt werden. Eine in vivo Inhibition des Enzyms führte zur Verlangsamung des Tumorwachstums und zur Hemmung der Metastasierung [120]. Klinisch wurde Cathepsin B eine prognostische Aussagekraft für verschiedene Krebserkrankungen zugeschrieben [62,114]. 1.2.3.3 MMP-2 (72kDa Collagenase A, Gelatinase A) Die Familie der Matrix Metalloproteinasen (MMP) umfaßt 24 verschiedene Enzyme, die gemeinsam fast alle Bestandteile der EZM degradieren können. Alle Matrix Metalloproteinasen sind Zink-abhängig. Sie werden als Zymogen, d.h. als proteolytisch aktivierbares Propeptid, sezeniert. Darüber hinaus wurden vier membranständige Formen, MT-MMPs (membrane-type MMP), beschrieben [101]. MMPs werden durch spezifische Inhibitoren, TIMPs („tissue inhibitor of metalloproteinase“) gehemmt [121]. MMP-2 ist eine 72 kDa schwere, neutrale Endopeptidase, die aus vier Domänen zusammengesetzt ist (Abb. 1.7) [21,77,113]: • Die N-terminale Propeptid-Domäne • Das katalytische Zentrum mit der Zn2+ – Bindungsstelle • Die Fibronektin Typ II - ähnliche Domäne innerhalb des aktiven Zentrums • Die Hämopexin-ähnliche Domäne (PEX Domäne) 1. 17 Einleitung Abb. 1.7: Schematische Abbildung der Struktur von pro-MMP-2. Das Propeptid ist in rot dargestellt, die Fibronektin-ähnlichen Domäne in grün, das katalytische Zentrum in türkis, die Hämopexin-ähnliche Domäne in gelb. Die Zink-Ionen sind als rote Kugeln abgebildet, Kalzium-Ionen als blaue Kugeln. Abb. aus [77]. Die konstitutive Expression von MMP-2 ist in der Regel sehr gering. Sie kann jedoch durch zahlreiche Stimuli hochreguliert werden. Dazu zählen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, Zytokine und Wachstumsfaktoren, wie Interleukine, EGF, TGF-α und bFGF. Die Aktivierung der Matrix Metalloproteinasen erfolgt durch den sogenannten „Cystein-switch“. Dabei löst sich der im Propeptid enthaltene Cysteinrest vom ZinkAtom im katalytischen Zentrum und legt dadurch die aktive Tasche frei [121]. Das aktivierte MMP-2 fungiert als neutrale Endopeptidase und degradiert Kollagen Typ I, IV, V und X, sowie Laminin V. Ferner bindet die PEX Domäne vom MMP-2 an Integrin αvβ3, was eine Fokalisierung der proteolytischen Aktivität an zellulären „Invasopodien“ ermöglicht. Aufgrund dieser Mechanismen wird MMP-2 für eine gesteigerte Invasivität von Tumorzellen verantwortlich gemacht [23]. Tatsächlich konnte durch die Transfektion der Tumorzellinien DU145, MYV3L und Madison 109 mit MMP-2 eine Zunahme der in vivo Metastasierung in die Lungen von Mäusen erreicht werden. Ferner wurde experimentell eine positive Korrelation zwischen MMP-2 Aktivität und Tumorzellinvasion beobachtet [69,80,119]. Auch am Patienten wurde MMP-2 mit Metastasierung in Verbindung gebracht, insbesondere in Neoplasien des Kolons, der Brust, der Lungen und der Bauchspeicheldrüse [14,82,112]. In Metastasen wurde ein höherer Gehalt an MMP-2 als in Primärtumoren gemessen. Ferner wurde erkannt, daß eine hohe MMP-2 1. Einleitung 18 Expression statistisch mit einer Verschlechterung der Prognose des Patienten einhergeht [49]. Von der Inhibition der MMPs erhofft man sich eine Reduktion der Angiogenese und der Metastasierung. Eine bedeutende Anzahl von Kandidatsubstanzen befindet sich derzeit in klinischen Studien (Anhang C). 1.2.3.4 Typ I – Kollagen 30% der Proteine des menschlichen Körpers sind Kollagene. 19 Typen mit unterschiedlichen Funktionen sind bekannt, Typ I macht 90% des Kollagens aus. Es liegt als [α1(I)]2 α2(I) Heterotrimer vor und besteht aus Glycin (33%), Prolin, Hydroxyprolin und Hydroxylysin [88]. Typ I – Kollagen wird von Fibroblasten und Osteoblasten sezeniert und bildet im Interstitium 1-20 µm dicke Fasern, die als Netz oder Strang vorliegen [63]. Es gewährleistet einerseits die Stabilität des Bewegungsapparates (Sehnen, Knochen, Knorpel, Nukleus pulposus, Haut, Kornea), andererseits formt es als „interstitielles“ Kollagen eine Leitstruktur für proliferierende und migrierende Zellen. In diesem Zusammenhang wird Typ I – Kollagen eine Rolle an der Umformung von Endothelsträngen in neue, zylindrische Gefäße zugesprochen [53]. Dies konnte durch die Beobachtung bestätigt werden, daß der Zugabe von exogenem Typ I – Kollagen in eine in vitro Kultur von konfluent wachsenden Kapillarzellen eine rapide Bildung von Endothelzylindern folgt [54]. In vivo wurde demonstriert, daß die experimentell ausgelöste Angiogenese auf der Chorionmembran des Huhns eine Ansammlung von Typ I – Kollagen bewirkt. [98]. Aus den Ergebnissen dieser Versuche wurde geschlossen, daß Typ I – Kollagen während der Angiogenese eine strukturelle Funktion erfüllt, welche die räumliche Progression und die Organisation von Endothelsprossen in funktionelle Blutgefäße gewährleistet. Dementsprechend konnte Typ I – Kollagen histologisch und elektronenmikroskopisch in Gefäßen, im Gefäßlumen und in Endothelsträngen identifiziert werden [54,64]. Diese experimentellen Daten weisen auf die Möglichkeit hin, die Tumorangiogenese durch die Inhibition der Synthese von Typ I – Kollagen zu unterbinden. Tatsächlich wirkte sich die Inhibition der Synthese von Typ I – Kollagen durch Halofuginon, einem niedermolekularen Quinazolinonalkaloid, hemmend auf die Ausbildung eines tubulären Endothelzellnetzwerk im Matrigel Modell aus. Zusätzlich verhinderte 1. 19 Einleitung Halofuginon die in vitro Entstehung von neuen Kapillaren in Aortenringen der Ratte [25]. 1.2.3.5 ß1-Integrin (CD 29, VLA) Integrine sind transmembranäre, heterodimere Rezeptoren. Sie sind aus zwei nicht kovalent gebundenen alpha- und beta- Untereinheiten aufgebaut. Jede Untereinheit ist ein Glykoprotein, das aus einem extrazellulären transmembranären und einem kurzen zytoplasmischen Anteil besteht. Bis heute sind 18 alpha- und 8 beta-Untereinheiten identifiziert worden, welche sich zu 24 verschiedenen Heterodimeren zusammensetzen können. Die Größe der Untereinheiten bewegt sich zwischen 150 und 180 kDa (alpha-Untereinheit), bzw. 95 und 210 kDa (beta-Untereinheit) [16,129]. ß1-Integrin kann sich mit 10 verschiedenen alpha-Untereinheiten zusammensetzen. Da die Rezeptorfunktion des Heterodimers von beiden Untereinheiten abhängt, besitzen ß1-Integrine unterschiedliche Liganden (Tab. 1.4). Insgesamt sind alle ß1Integrine sind an der Erkennung der extrazellulären Matrix beteiligt [91]. Integrindimer α1 β1 ............... α2 β1 ............... α3 β1 ............... α4 β1 ............... α5 β1 ............... α6 β1 ............... α7 β1 ............... α8 β1 ............... α9 β1 ............... αv β1............... Ligand Laminin, Kollagen Laminin, Kollagen, Fibronektin Laminin, Kollagen, Fibronektin, Epigrilin Fibronektin, VCAM-1, Invasin Fibronektin, Kollagen Laminin Laminin Fibronektin, Vitronektin, Tenascin Tenascin Fibronektin, Vitronektin Tab. 1.4: Tabellarische Darstellung der ß1-Integrin Liganden. Die Integrine α3 β1, α5 β1 und αv β1 stellen Rezeptoren der RGD Sequenz (Arg-Gly-Asp) dar, eine Aminosäurensequenz, die in zahlreichen Bindegewebsbestandteilen vorkommt [91]. ß1-Integrine vermitteln die Fortleitung mechanischer und chemischer Reize in beide Richtungen über die Zellmembran [51]. Dadurch beeinflussen sie die Motilität, das Wachstum und das Überleben der Zelle. 1. 20 Einleitung Die molekularbiologische Grundlage der Integrinfunktion beruht auf der Gruppierung mehrerer Integrindimere an bestimmten Punkten der Zellmembran („clustering“), wo sie sogenannte „focal adhesions“ bilden. An diesen Stellen leiten Adaptorproteine das Signal vom Integrincluster weiter an das Zytoskelett und zytoplasmischen Proteinkinasen (Abb. 1.8): • Über die Bindung der Aktinfasern an den „focal adhesions“ wird der Zytoskelett reorganisiert und die Adhäsion an die EZM verstärkt [37]. • Die Aktivierung von Kinasen der FAK- und Src-Familien löst eine komplexe Reaktionskaskade aus, welche die Proteintranskription, den Zellzyklus, die Zelldifferenzierung, die Zellmotilität (Ausbildung von Pseudopodien) und das Überleben der Zelle (Aktivierung von Akt, einem Gegenspieler der Apoptose) beeinflußt [34,37,42]. Abb. 1.8: Funktionsmechanismus der Integrine, aus [37]. • Des Weiteren wurde eine erhöhte Proteolyse an den „focal adhesions“ beschrieben, die mit einem „clustering“ von uPA-Rezeptoren und der Sekretion von MMPs einhergeht [12,18,46,73,84,104]. Durch die Proteolyse werden Zell-Matrix Kontakte unterbrochen, was die Migration der Zelle erleichtert, während die Fragmente der degradierten chemotaktischen „Trigger“ für weitere Zellen darstellen. EZM einen 1. Einleitung 21 Es konnte gezeigt werden, daß ß1-Integrine an verschiedenen Prozessen wie die Embryogenese, Entzündung und Wundheilung beteiligt sind [16]. In Tumorzellen ist die Integrinfunktion dysreguliert. Es wurde nachgewiesen, daß ß1-Integrine Tumorzellen vor der Apoptoseinduktion durch freie Radikale und Zytostatika schützen, ihre Invasivität steigern und ihr Wachstum beschleunigen [128,131]. Der negative Einfluß der Integrine auf die Prognose von Krebspatienten läßt sich damit erklären [13,66,79,123]. Die zentrale Rolle der Integrine in der Tumorprogression macht sie zu einem attraktiven Target neuer Tumortherapien. In den letzten Jahren wurden mehrere Integrininhibitoren entwickelt. Sie sind im Anhang C tabellarisch aufgeführt. 2. 22 Fragestellung 2 Fragestellung Die vorliegende Dissertation hat zum Ziele, die Expression der unter Punkt 1.2.3 beschriebenen angiogenese- und metastasierungsassoziierten Proteine mittels Hochdurchsatzanalysen (Gewebemikroarrays) in den Xenografts und Zellinien der Freiburger Tumorsammlung zu charakterisieren und ihre Relevanz für eine gezielte, molekulare Krebstherapie zu überprüfen. Im ersten Teil der Arbeit soll die Verwendung von Gewebemikroarrays für die Profilierung der Proteinexpression in Xenografts humaner Tumoren etabliert und validiert werden. Basierend auf dieser Technologie sollen anschließend Gewebemikroarrays in Kombination mit der in vivo Prüfung von zwei antiangiogenen Substanzen zur Validierung der untersuchten Proteine als therapeutische Targets / Marker eingesetzt werden. Ferner sollen erstmals Arrays aus permanenten Zellinien humaner Tumoren erstellt und immunhistochemisch untersucht werden. Die aus den Zellinienarrays gewonnenen Daten sollen mit Western Blots der gleichen Zellinien verglichen werden (siehe Tab. 2.1). Erster Teil: Etablierung von Xenograftmikroarrays für die immunhistochemische Untersuchung fünf Angiogenese-assoziierter Proteine. • Aus 160 Tumoren der Freiburger Xenograft Sammlung werden Gewebemikroarrays erstellt. • Schnitte der Arrays werden immunhistochemisch auf die Expression von VEGF, Cathepsin B, MMP-2, Typ I – Kollagen und ß1-Integrin hin untersucht. Diese Proteine stellen hochinteressante therapeutische Targets dar. • Dieses Verfahren soll ein schnelles, zuverlässiges und einfaches Screening der Target-Expression in der Freiburger Tumorsammlung ermöglichen. • Die gemessenen Expressionsprofile werden mit klinisch-pathologischen Daten (u.a. Überlebenszeit, Tumordifferenzierung) auf Korrelationen geprüft. In einem zweiten Teil soll die Bedeutung von VEGF und Typ I – Kollagen für die Tumortherapie untersucht werden. 2. 23 Fragestellung Zweiter Teil: Kombination von Gewebemikroarrays mit der in vivo Prüfung neuer Angiogeneseinhibitoren zur Selektion Target-abhängiger Xenografts, sowie Evaluation der Target-Modulation und Target-Validierung. • Anhand der parallelen, vergleichenden Untersuchung von Xenografts in Gewebemikroarrays durch Immunhistochemie werden für die Prüfung eines therapeutischen VEGF-Antikörpers ein VEGF-positives und ein VEGFnegatives Pankreasmodell ausgesucht und deren Ansprechen verglichen. • Es wird ein Array aus den Xenografts der Versuchsgruppen erstellt. • Die Modulation der Expression von VEGF und Kollagen durch die Behandlung mit einem VEGF-Antikörper resp. Halofuginon werden posttherapeutisch im Xenograftarray untersucht. Durch die Untersuchung der Veränderung des Targets in den behandelten Xenografts soll die molekulare Wirkhypothese überprüft werden. • Das gleichzeitige Vorliegen einer Target-Suppression und einer in vivo Wachstumsinhibition des Xenografts soll die Validierung des experimentellen Targets ermöglichen. Dritter Teil: Etablierung von Mikroarrays aus permanenten Zellinien humaner Tumoren für die immunhistochemische Untersuchung vier Angiogenese-assoziierter Proteine. • Zellpellets von 16 unterschiedlichen Zellinien werden kultiviert, in Bouin’s Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet. Aus diesen Zellen wird ein Zellinienmikroarray zusammengestellt. Die Zellinienarrays werden den Xenograftarrays hinsichtlich ihrer Verwendbarkeit gegenübergestellt. • Schnitte dieses Arrays werden immunhistochemisch auf die Expression von VEGF, Cathepsin B, MMP-2 und ß1-Integrin untersucht. Die Ergebnisse der Färbungen der Zellinien werden mit denen der Xenografts, von denen sie abgeleitet wurden, verglichen. 2. 24 Fragestellung Vierter Teil: Messungen der Cathepsin B Expression in 15 Zellinien durch Western Blotting und Immunhistochemie des Zellinienarrays. • Die Resultate der immunhistochemischen Untersuchung der Cathepsin B Expression im Zellinienarray sollen durch Western Blotting bestätigt und somit die Zellinienarray-Technologie validiert werden. Ziel dieser Arbeit ist es damit, ein Methodenspektrum zu etablieren, welches die präklinische Entwicklung von Tumortherapeutika an humanen Xenografts und Zellinien beschleunigt. Erstellen von Xenograft- und Zellinienarrays Etablierung des Verfahrens, Western Blotting Statistische Auswertung Vergleich der gewonnen Werte mit klinischen und pathologischen Daten Selektion von Xenografts für die in vivo Prüfung von Tumortherapeutika In vivo Substanzprüfung an Xenografts Vergleich der Tumorwachstumskurven Erstellen von Gewebemikroarrays aus den behandelten Tumoren und den Kontrollen Immunhistochemische Untersuchung der Targetmodulation Rückschlüsse auf die Substanzwirkung Tab. 2.1: Flußdiagramm der Ziele der vorliegenden Arbeit. 3. Material 3 Material 3.1 Reagenzien 25 Aceton Merck, Darmstadt Bovine Serum Albumin Sigma, Deisenhofen Bradford Reagenz Biorad, München Bromphenolblau Sigma-Aldrich, St Louis, MO Calciumchlorid-Dihydrat Merck, Darmstadt Coomassie Brilliant Blue R-250 Biorad, München Diaminobenzidin HCE-Chemie, Efringen-Kirchen Dithiothreitol (DTT) Boehringer Mannheim ECL Western Blotting Detection Reagents (Kit) Amersham, Little Chalfont, UK Eisessig (100% Essigsäure) Merck, Darmstadt Entwickler, Fixierer und Filme (Hyperfilm™) Kodak, Rochester, NY Eosin Y Sigma-Aldrich, St Louis, MO Ethanol Merck, Darmstadt Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Sigma, Deisenhofen Eukit Hans Thoma, Freiburg FCS (Fetal Calf Serum) Gibco, Invitrogen, Paisley, UK Gemcitabin Lilly, Bad Homburg Gentamicin Gibco, Invitrogen, Paisley, UK Glycerin (Glycerol) Roth, Karlsruhe ß-Glycerolphosphat Sigma-Aldrich, St Louis, MO Glycin Sigma-Aldrich, St Louis, MO Haematoxylin II nach Gill Merck, Darmstadt Halofuginon (RU19110) Collgard Biopharmaceuticals, Petach-Tikva, Israel HEPES Roth, Karlsruhe HuMV833 Protein Design Labs, Fremont, CA IGEPAL Sigma-Aldrich, St Louis, MO Imidazol Sigma-Aldrich, St Louis, MO Kupfersulfat Merck, Darmstadt ß-Mercaptoethanol Serva, Heidelberg Methanol Roth, Karlsruhe Natriumfluorid Sigma-Aldrich, St Louis, MO Natriumorthovanadat Sigma-Aldrich, St Louis, MO PBS (Phosphate buffered Saline) Gibco, Invitrogen, Paisley, UK Picrinsäure Sigma-Aldrich, St Louis, MO RPMI 1640 Medium, mit 25 mmol HEPES Puffer und L-Glutamin Gibco, Invitrogen, Paisley, UK Rainbow Marker RPN 800 und RPN 756 Amersham, Little Chalfont, UK Sodium-Dodecyl-Sulfat Sigma-Aldrich, St Louis, MO Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Merck, Darmstadt Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan Roth, Karlsruhe Trypsin Difco, Detroit, MI Trypsin-EDTA Lösung Gibco, Invitrogen, Paisley, UK Tween 20 ® Sigma-Aldrich, St Louis, MO Wasserstoffperoxid, 30ig% Sigma-Aldrich, St Louis, MO Xylol Merck, Darmstadt 3. 3.2 26 Material Geräte und Verbrauchsmaterial Cell-Scraper Falcon (Becton-Dickinson), Lincoln Park, NJ EI9001 XCELL II Mini Cell Novex, San Diego, CA Eppendorfpipetten Eppendorf, Hamburg Eppendorfröhrchen Eppendorf, Hamburg Gewebekulturflaschen unterschiedl. Größen Greiner, Nürtingen Glasbehälter (Erlenmeyerkolben, Coplin-Behälter) Schott, Mainz Hybond™ ECL Nitrocellulosemembran Amersham, Little Chalfont, UK Kryo-Röhrchen Nunc, Roskilde, DK Lichtmikroskop, Okulare und Objektive Zeiss, Jena Magnetrührer „Ikamag ® Ret“ Janke und Kunkel, Staufen NMR nu/nu Nacktmäuse Oncotest GmbH, Inst. für Exp. Onkologie, Freiburg Multiflex Round Tips Sorenson, Salt Lake City, UT Novex Pre-Cast Gel 4-20% Glycin Invitrogen, Paisley, UK Parafilm “M” American National Can, Greenwich, CT pH-Meter „619 Methrom ®“ Schott, Mainz Paraffin Sectioning Aid System™ Instrumedics, Hackensack, NJ (enthält UV-Lampe, Handroller,Tape Windows, TPC-Lösemittel, Adhesive-4x-Coated Slides) Paraffin für die Array-Blöcke Polyscience, Warrington, PA Pipetten, steril 2 bis 50 ml Costar, Bodenheim Rotationsmikrotom „RM2135“ und Klingen Typ 819 Leica, Nußloch Standartobjektträger und Deckgläser Langenbrink, Emmendingen Tissue Microarrayer Beecher Instruments, Silver Spring, MD Ultrospec III (Spektrometer) Pharmacia LKB Waage Sartorius, Göttingen Zentrifugierröhrchen 15 ml und 50 ml Falcon (Becton-Dickinson), Lincoln Park, NJ 3.3 Immunhistochemie (alle Antikörper sind monoklonal wenn nicht näher bezeichnet) 3.3.1 Primärantikörper Antikörper Verdünnung Lagerung Cathepsin B Ab2 1:25 4 °C ß1-Integrin Ab298 1:1 4 °C Ki-67 Ab3 polykl. 1:50 4 °C Kollagen Typ I 1:1000 -20 °C MMP-2 1:80 4 °C VEGF Ab3 1:80 4 °C IgG1, murin (X 0931) 4 °C Vorbehandlung Firma Zitratpuffer Calbiochem, San Diego, CA Zitratpuffer BioGenex, San Ramon, CA Zitratpuffer NeoMarker s, Fremont, CA Trypsin Sigma-Aldrich , St Louis, MO Zitratpuffer NeoMarkers, Fremont, CA Tris/HCl NeoMarkers, CA Zitratpuffer 3.3.2 Ungeeignete Primärantikörper Cathepsin K, Ab-1 Cathepsin L, Clone 33/2 uPA, Ab-2 Calbiochem, San Diego, CA Sigma-Aldrich, St Louis, MO NeoMarkers, Fremont, CA 3. 27 Material VEGF, Ab-1, polyklonal VEGF, Ab-2, polyklonal Oncogene, Boston, MA Oncogene, Boston, MA 3.3.3 Sekundärantikörper, Signalverstärker und Puffer zur Vorbehandlung („Antigen Retrieval“) Biotin-Goat anti-Rabbit Ig Zymed, San Francisco, CA Biotin-Goat anti-Mouse Ig Zymed, San Francisco, CA Streptavidin Peroxidase Zymed, San Francisco, CA Goat Serum, normal, G9023 Sigma-Aldrich, St Louis, MO Imidazollösung: 200ml PBS, 6 Imidazolkristalle, 8 Tropfen 30ig% H2O2 Zitratpuffer: 9 ml Stammlösung A mit 41 ml Stammlösung B mischen (pH = 6) Stammlösung A: 10 mM Zitronensäure in Aqua destillata Stammlösung B: 10 mM Natriumzitrat in Aqua destillata Trypsinpuffer: 200 ml Aqua destillata, 4 ml 5% CaCl, 200 mg Trypsin, pH=7,8 Tris/HCl Puffer: 10 mM, pH=10 3.4 Lektinhistochemie Es wurde statt eines Primärantikörpers ein biotinyliertes Lektin zur spezifischen Färbung murinen Endothels verwendet. Dieses Lektin, Bandeira simplicifolia Agglutinin-I, weist eine spezifische Affinität zu murinem Endothel, nicht aber zu Blutgefäßen anderer Spezies auf. Es wird das gleiche Färbeprotokoll wie für die Immunhistochemie verwendet [3]. Gearbeitet wurde nach einer Vorbehandlung des Gewebes mit Zitratpuffer mit dem 1 :10 verdünnten Lectin. 3.5 Western Blotting 3.5.1 Antikörper Cathepsin B, Ab-2 Actin, Ab-1 Biotinylierter Anti-Maus Antikörper Calbiochem, San Diego, CA Oncogene, Boston, MA Amersham, Little Chalfont, UK 3.5.2 Aufbereitung der Zelllysate Lysepuffer: 10 mM ß-Glycerophosphat 1 mM NaF 1 mM EDTA 1 mM DTT 0,1mM Na-ortho-vanadat Der Lysepuffer wird vor Gebrauch frisch angesetzt. 1 Tablette Complete™ Mini (Roche, Mannheim) in ELB (50 mM HEPES, 250 mM NaCl, 0,1% IGEPAL) lösen. „Sample Buffer“, modifiziert nach LAEMMLI (DTT-frei): 3. Material 28 62,5 mM Tris/HCl, pH=6,8 20% Glycerol 2% SDS 0,5% Bromphenolblau 5% ß-Mercaptoethanol Lagerung: -20°C 3.5.3 SDS-PAGE, Proteintransfer, Proteindetektion (Gel und Membran) Laufpuffer, zehnfach konzentriert: 250 mM Tris 2500 mM Glycin 1% SDS Lagerung: Raumtemperatur Transferpuffer: 20% Methanol 0,3% (w/v) Tris 1,44% (w/v) Glycin lösen in Aqua dest. Lagerung: Raumtemperatur Tween 20 Puffer: 0,1% Tween 20 in PBS. Blockierlösung: 5% Milchpulver in PBS-Tween 20. Lagerung bei 4°C. Coomassie Färbelösung und Entfärbelösung: 0,25% (w/v) Coomassie Blue (nur für die Färbelösung) 45% Methanol 45% Aqua destillata 10% Eisessig Lagerung: 4°C „Stripping Solution”: 62,5 mM Tris/HCl, pH 6,7 2% (w/v) SDS 0,8% ß-Mercaptoethanol Lagerung: 4°C 3.6 Datenverarbeitung Die Daten der Immunhistochemie wurden in „Excel 2000“ gespeichert. Für die digitalen Aufnahmen wurde eine „Kodak DC 120“ Kamera verwendet, für die Übertragung der Fotos „PictureWorks PhotoEnhancer v3.2“ (Kodak). Die statistischen Tests wurden mit „Sigma Plot 2000 Version 6.00“ und „SYSTAT Version 10“ durchgeführt (SPSS Inc.). 4. Methoden 4 Methoden 4.1 Die Freiburger Xenograft Sammlung 29 Die Freiburger Xenograft Sammlung besteht aus 400 humanen Tumoren, die 20 verschiedene Tumortypen umfassen. Die Tumormodelle entstanden durch die Implantation humaner Tumorproben subkutan in die Flanken von thymusaplastischen Nacktmäusen eines NMR nu/nu Auszuchtstammes [30]. In der ersten Passage wurden jeweils vier 4x4x1 mm große Gewebescheiben auf vier Nacktmäuse transplantiert. Gewebe männlicher Patienten wurde auf männliche Tiere implantiert, Gewebe weiblicher Patienten auf weibliche Tiere. Eine Weiterpassage auf neue Mäuse erfolgte, wenn ein Tumor einen Durchmesser von 10 - 15 mm erreicht hatte. Dazu wurden 3x3x1 mm große Biopsien aus der vitalen Randzone der Xenografts verwendet. Ein Drittel aller implantierten Tumoren konnte mit diesem Verfahren seriell passagiert werden [10]. Nach Etablierung (4 bis 6 Passagen) können Tumoren in Flüssigstickstoff kryokonserviert werden. Da nach längerer Passagierung die Zellpopulation eines Xenografts durch Selektionsdruck seine Heterogenität verlieren kann, wird nach 10 bis 15 Passagen auf kryokonserviertes Tumormaterial zurückgegriffen. Zusätzlich werden bei jeder Passage Tumorproben in Paraffin eingebettet und histologisch untersucht. Dies gewährleistet die konstante Tumoridentitiät und ermöglicht weitere immunhistochemische Analysen. Die Xenografts wurden in der Vergangenheit hinsichtlich ihrer Histologie und Wachstumskinetik untersucht. Auch das molekularbiologische Profil von 60 Xenografts (Expression von Tumormarkern, Hormonrezeptoren und Isoenzymen) wurde bestimmt. Es konnte dabei nachgewiesen werden, daß die Merkmale der Xenografts denen der ursprünglichen Neoplasien entsprechen und daß sie sich während der seriellen Passagierung nicht oder nur geringfügig verändern [7,10,35,65]. In vergleichenden Chemosensitivitätsstudien wurde die Prädiktivität von Xenografts für die Ansprechrate eines Patienten auf Zytostatika untersucht. In 96% der Fälle wurde eine Zytostatikaresistenz, in 90% ein Ansprechen des Tumors korrekt vorhergesagt [29]. 4. 30 Methoden Von 33 Tumoren wurden permanente Zellinien erstellt. Um die Entdifferenzierung der Zellinien nach ausgedehnter Passagierung zu vermeiden, wird nach 20 Passagen auf kryokonservierte Zellen zurückgegriffen. Die Verdopplungszeiten, Chemosensitivität, in vitro Wachstumseigenschaften und Histologien der Zellinien und der Xenografts wurden miteinander verglichen. Das Wachstumsverhalten und Chemosensitivität beider System korrelierten sehr gut miteinander. Die Histologien von reimplantierten Zellinien entsprach jener der ursprünglichen Xenografts [99]. Durch ihre biologische Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Tumor gewährleisten Xenografts und Zellinien eine hohe Prädiktivität für die klinische Chemosensitivität. In ihrer Gesamtheit stellen sie eine vielfältige, unerschöpfliche Sammlung von Krebsmodellen dar, die sich für in vivo und in vitro Substanztestungen, sowie für molekularbiologische Untersuchungen hervorragend eignen. Die Bezeichnung der Xenografts und Zellinien besteht aus einer Buchstabenkombination und einer fortlaufenden Nummer (Sammelnummer). Die ersten Buchstaben stehen für die Histologie des Tumors, XF für „Xenograft Freiburg“. RXF 944, zum Beispiel, ist ein Nierenzellkarzinom renalen Ursprungs. Bei Zellinien wird ein L hinter die Laufnummer gesetzt (RXF 944L). Die Nomenklatur der Passage setzt sich aus zwei Zahlen zusammen: die erste steht für die Summe aller Passagen (auf der Nacktmaus oder in der Kulturflasche), die zweite für die Anzahl der Passagen seit dem Auftauen aus der Kryokonservierung. Zwischen den Zahlen steht ein N für Stickstoff (z.B. RXF 944L 19N17). 4. Methoden 4.2 31 Erstellen von Gewebemikroarrays Das Prinzip der Gewebemikroarraytechnik besteht darin, zahlreiche Proben von in Paraffin eingebetteten Tumoren in einen einzelnen Paraffinblock zu übertragen. Dieser Block kann anschließend geschnitten und mit immunhistochemischen oder in situ hybridisierenden Verfahren untersucht werden. Die Arraytechnik ermöglicht die parallele Analyse der Proteinexpression in Hunderten von Proben. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt lichtmikroskopisch. [74] In dieser Arbeit werden zusätzlich zu den Xenografts und Zellinien der Freiburger Sammlung auch einzelne Modelle des National Cancer Instituts (USA) verwendet. 4.2.1 Einbetten der Xenografts Das Einbetten der Xenografts in Paraffin erfolgt nach Standardprotokollen: • • • • • • • • • • Gewebeentnahme von der Maus (subkutan wachsende Xenografts) Fixierung 24 Stunden in 10% PBS gepuffertem Formalin Rehydrierung der Gewebe in fließendem Leitungswasser, 1 – 3 Stunden Dehydrierung je 30 Minuten in 50%igem, 70%igem und 90%igem Isopropanol Über Nacht in 100%igem Isopropanol Zwei mal 30 Minuten in frischem Isopropanol 6 Stunden in 100%igem Isopropanol : Paraffin, 1:1 w/w, bei 60°C 6 Stunden in Paraffin bei 60°C 24 Stunden in frischem Paraffin bei 60°C Giessen der Blöcke Von den Tumorblöcken werden routinemäßig Nativ- und Hämatoxylin-Eosin Schnitte angefertigt. Von den HE-Schnitten können Informationen über die Tumormorphologie und dem Zustand des Gewebes (vital, nekrotisch, apoptotisch) gewonnen werden. 4.2.2 Erstellen des Array Blocks Zuerst werden anhand der HE-Schnitte lichtmikroskopisch vitale, morphologisch repräsentative Areale des eingebetteten Tumors identifiziert und gekennzeichnet. Mit dem Gewebemikroarrayer wird ein 0,6 mm breiter Zylinder aus der entsprechenden Stelle im Tumorblock ausgestanzt und in ein gleich großes Loch im Empfängerblock 4. 32 Methoden eingeführt. Es werden in der Regel ca. 150 Xenografts auf einen Block angeordnet („arrayed“), dies in Duplikaten, seltener in Triplikaten. Dadurch enthält der Paraffinblock eines Gewebemikroarrays ca. 300 Tumorproben. Die obere Kapazitätsgrenze eines Arrays liegt bei ca. 600 Proben. Tissue array machine Tissue array machine Multiple biposies arranged in a recipient paraffin block Paraffin block. Biopsy from the corresponding area Slides with marked area of interest Recipient paraffin block. Immunohistochemistry FISH Cell lines can also be organized Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Gewebemikroarraytechnik. Anhand der HE-Schnitte werden repräsentative Areale im Paraffinblock ausgesucht (oben links). An diesen Stellen wird mit dem Gewebearrayer ein 0,6 mm breiter Gewebezylinder ausgestanzt und in einem Empfängerblock eingeführt. Dieser Vorgang wird für alle Proben wiederholt. Der resultierende Block wird geschnitten, die Schnitte immunhistochemisch oder mittels in situ Hybridisierung untersucht und lichtmikroskopisch ausgewertet (unten rechts). Nach der Fertigstellung des Arrays wird dieser für 10 Minuten in einen 60°C warmen Ofen gestellt. Anschließend wird seine Oberfläche mit einem Objektträger geglättet. Durch die vorangeschaltete Untersuchung des HE-Schnittes soll die Selektion von nicht repräsentativen Teilen des Tumors vermieden werden. Beispiele solcher unerwünschten Areale sind u.a. Nekrosen, aber auch große Blutgefäße oder Bindegewebsstraßen. 4. 33 Methoden 4.2.3 Das Schneiden des Array Blocks Das Schneiden des Gewebemikroarrays erfordert eine spezifische Technik. Bei dem konventionelle Verfahren, welches das „Strecken“ des Schnittes im Warmwasserbad beinhaltet, lösen sich die Proben aus der Paraffinmatrix heraus. Aus diesem Grund wird das „Paraffin Sectioning Aid System“ verwendet: Auf den im Mikrotom eingespannten Arrayblock wird mit einem Handroller ein Klebestreifen (“tape window“) aufgetragen. Beim Schneiden erhält man einen faltenlosen, 5 µm dicken Schnitt, der am Klebestreifen hängt. Mit dem Handroller wird der Schnitt auf einen beschichteten Starfrost Objektträger übertragen. Letzterer wird mit dem Rücken nach oben 90 sec unter eine UV-Lampe gelegt. Dadurch polymerisiert die Beschichtung des Objektträgers, das Gewebe wird fixiert, und der Klebestreifen kann mit einem Lösemittel entfernt werden (TPC solvent). Der restliche Klebstoff wird während einer einstündigen Inkubation in Xylol ausgewaschen. Die Schnitte des Arrays sind bis zu 4 Wochen bei 4°C haltbar. Nach längerer Zeit wird das Gewebe rissig. 4.2.4 Zusammensetzung der Arrays Insgesamt werden 161 Xenografts von 23 verschiedenen Tumorentitäten eingesetzt. Diese stellen die Gesamtheit aller charakterisierten, gut wachsenden Tumoren der Freiburger Xenograft Sammlung dar. Tumortyp Urothelkarzinome Kolonkarzinome Tumore des ZNS Magenkarzinome Hals und Kopf Bronchialkarzinome - Adenokarzinome - Plattenepithelkarz. - Großzellige Karz. - Kleinzellige Karz. - nicht näher definiert Mammakarzinome Maligne Melanome Ovarialkarzinome Pankreaskarzinome Prostatakarzinome Anzahl 7 18 4 6 3 37 14 9 6 5 3 16 15 9 3 6 Ursprung histolog. Unterteilung gemischt gemischt n.a. Primärtumoren n.a. BXF v.a. Adenokarzinome CXF Glioblastome (3/4) CNXF v.a. Adenokarzinome GXF Plattenepithelkarzinome HNXF gemischt gemischt gemischt Metastasen n.a. gemischt v.a. Metastasen v.a. Metastasen gemischt gemischt klarzellig n.a. duktal und papillär v.a. amelanotisch v.a. Adenokarzinome Adenokarzinome gemischt Nomenklatur LXFA LXFE LXFL LXFS LXF MAXF MEXF OVXF PAXF PRXF 4. 34 Methoden Pleuramesotheliome 7 gemischt biphasisch und epithelial Nierenzellkarzinome 11 gemischt klarzellig Sarkome 7 gemischt gemischt Hodenkarzinome 5 n.a. n.a. Zervixkarzinome 2 n.a. n.a. Leukämien 2 n.a. n.a. Lymphome 1 n.a. n.a. Andere Typen 4 n.a. v.a. Hepatome SUMME: 161 Xenografts von 23 verschiedenen Tumortypen PXF RXF SXF TXF CEXF LEXF LYXF XF n.a.: nicht angegeben, v.a.: vor allem Um potentielle Zusammenhänge zwischen der Expression eines untersuchten Proteins und klinisch-pathologischen Daten zu analysieren, werden folgende Parameter zu den Tumoren und Patienten dokumentiert: • Tumortyp • Ursprung (Primärtumor, lymphatische Metastase, hämatogene Metastase) • Grade (Differenzierungsgrad) • Stage zum Zeitpunkt der Diagnose (TNM Klassifikation) • Überlebenszeit des Patienten Folgende 16 Zellinien werden für den Zellinienarray verwendet: Name Typ Herkunft 2 Passage CCL HT 29 GXF 251 L LCL H460 LXFA 526 L LXFA 629 L LXFE 66 NL LXFL 529 L LXFL 1072 L MACL MCF-7 MAXF 401 L MEXF 276L MEXF 462 NL MEXF 514 L PRCL PC3 M RXF 393 NL RXF 944 L Kolonkarzinom Magenkarzinom Großzelliges Karzinom1 Adenokarzinom1 Adenokarzinom1 Plattenepithelkarzinom1 Großzelliges Karzinom1 Großzelliges Karzinom1 Mammakarzinom Mammakarzinom Malignes Melanom Malignes Melanom Malignes Melanom Prostatakarzinom klarzelliges Nierenkarzinom klarzelliges Nierenkarzinom ATCC FXP NCI FXP FXP FXP & NCI FXP FXP NCI FXP FXP FXP & NCI FXP NCI FXP & NCI FXP 28N6 36N10 31N9 31N22 49N20 41N19 42N11 33N8 48N7 49N22 36N22 46N18 37N10 31N12 33N22 54N19 1 2 Lungenkarzinome NCI: National Cancer Institute; FXP: Freiburger Xenograft Panel; ATCC: American Type Culture Collection 4. 35 Methoden 4.3 Immunhistochemische Färbung und Auswertung 4.3.1 Grundlagen der Immunhistochemie Die Immunhistochemie basiert auf der Affinität von Antikörpern gegen spezifische Antigene. Der Primärantikörper, ein Immunglobulin G, ist gegen das nachzuweisende Protein gerichtet. Ein zweiter an Biotin gekoppelter Antikörper bindet an das Fc-Teil des Primärantikörpers. In einem dritten Schritt bindet ein Strepavidin-Peroxidase Komplex an Biotin. Die Peroxidase setzt das Chromogen Diaminobenzidin (DAB) in eine unlösliche, dunkelbraune Form um, die lichtmikroskopisch erkennbar ist. Durch die Komplexierung mehrerer Peroxidase- und Streptavidinmoleküle wird das Signal amplifiziert (siehe Abb. 4.2). Abb. 4.2: Prinzip der Immunhistochemie. S: Streptavidin P: Peroxidase B: Biotin 4.3.2 Immunhistochemische Färbung von Gewebemikroarrays Das Antigendetektionsverfahren ist in folgenden Schritten durchgeführt worden: • • • • • • • Gewebe auf Starfrost Objektträgern eine Stunde in 100%igem Xylol entparaffinieren. 3 Min in frischem, 100%igem Xylol inkubieren, gefolgt von 3 Min in Xylol : Ethanol, 1:1 3 Min in 100%igen Ethanol, 3 Min in 90%igen Ethanol, 3 Min in 70%igen Ethanol 30 Min in 200 ml Methanol mit 8 ml 30%igem H2O2 inkubieren. Die endogene Peroxidase wird dadurch inhibiert. Kurz in Aqua destillata abwaschen. Vorbehandlung des Gewebes („Antigen Retrieval“): 4. Methoden 36 Beim Einbetten von Gewebe mit Formalin binden unspezifische Proteine an die Epitope und maskieren dadurch die Antigene eines Gewebes. Eine enzymatische oder thermische Konditionierung legt die Epitope sterisch wieder frei. Je nach Antikörper eignen sich unterschiedliche Puffer: - Mikrowellen Vorbehandlung: Zitratpuffer, EDTA-Puffer, Tris/HCL-Puffer. Inkubationszeit: 20 Min sprudelnd kochen. Es muß ein großes Puffervolumen angesetzt werden (500 ml), um ein Austrocknen der Schnitte durch Verdunstung zu vermeiden (sonst: falsch negative Färbung). - Enzymatische Vorbehandlung bei 37°C: Trypsinpuffer. Inkubationszeit: 15 Minuten. Diese Vorbehandlung ist für hitzeempfindliche Proteine geeignet (z.B. Kollagen). • Schnitte bei Raumtemperatur 30 Min abkühlen lassen. • Kurz in Aqua destillata abwaschen. • 10 Minuten in PBS rehydrieren, dabei das PBS drei mal erneuern. • In einer feuchten Kammer die Schnitte mit 10% normalem Ziegenserum benetzen. 45 Min einwirken lassen. Unspezifische Bindungsstellen für Antikörper werden blockiert. • Überschüssiges Serum mit einem Tuch absaugen. • 100 – 500 µl Primärantikörper auftragen und drei Stunden bei Raumtemperatur oder übernacht bei 4°C inkubieren. D er ß1-IntegrinAntikörper wird zwei Stunden bei 37°C inkubiert. • 3 mal in 200 ml PBS abwaschen. • 2 Tropfen Sekundärantikörper applizieren. 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. • Dreimal in PBS waschen. • Streptavidin-Peroxidase auftragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. • Dreimal in PBS waschen. • Signalamplifikation mit Diaminobenzidin (DAB): 2 Tropfen Imidazollösung und 2 Tropfen DAB auf den Objektträger applizieren. 5 Minuten inkubieren. Anschließend die Objektträger mit der DAB-Imidazollösung in 200 ml Imidazollösung hängen. Weitere 5 Minuten inkubieren. • Kurz in Aqua destillata waschen • Signalamplifizierung mit Kupfersulfat: 0,4% (w/v) CuSO4 und 0,77% (w/v) NaCl in Aqua destillata. 5 Min einwirken lassen. • Kurz in Aqua destillata waschen. • Gegenfärbung der Zellkerne: Objektträger 1 Minute in Hämatoxylin hängen • Schnitte 20 Minuten in langsam fließendem Leitungswasser waschen. • Kurz in Aqua destillata spülen. • Dehydrierung der Schnitte. Die Alkoholreihe wird in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt. Inkubation in Xylol zwei mal drei Minuten. • Schnitt mit Eukit™ unter einem Deckglas versiegeln und trocknen lassen. 4. 37 Methoden 4.3.3 Semiquantitative Auswertung der gefärbten Gewebemikroarrays Die immunhistochemisch gefärbten Gewebemikroarrays werden lichtmikroskopisch, semiquantitativ ausgewertet. Gänzlich ungefärbte Xenografts werden mit null bewertet, die am stärksten gefärbten Xenografts mit drei. Xenografts mit einem Wert von eins oder zwei sind schwach oder mittelmäßig positiv. Grundsätzlich werden alle Versuche mindestens drei mal wiederholt. Bei der Auswertung wird die subzelluläre Lokalisierung des Antigens berücksichtigt. Sie kann diffus oder granulär zytoplasmisch, membranständig oder kernständig sein. Zellen in nekrotischen Arealen werden nicht bewertet. Ferner werden morphologische Merkmalen der Xenografts beachtet, z.B. ob ein Zusammenhang mit der Entfernung einer Zelle von Blutgefäßen vorliegt, oder ob mitotische Zellen ein besonderes Expressionsmuster aufweisen. Mit externen und internen Negativkontrollen wird die Validität der Färbung gesichert. Bei externen Kontrollen wird auf den Primärantikörper verzichtet oder ein Sekundärantikörper ohne Affinität zum Primärantikörper verwendet. Interne Kontrollen sind das Bindegewebe, die Fibrozyten und die Endothelzellen der Nacktmaus. Um technische Artefakte zu vermeiden, werden im einzelnen überprüft, ob • eine differenzierte Färbung vorliegt, • Chromogene zwischen den Zellen oder in Rissen hängen, • die Gewebsstanzen homogen gefärbt sind. 4.3.4 Vergleich verschiedener Passagen Um Xenografts des gleichen Ursprungstumors, aber unterschiedlicher Nacktmäuse zu vergleichen, wurde ein Gewebemikroarray mit 13 Xenografts von bis zu 7 unterschiedlichen Passagen erstellt. Die maximale Anzahl an Passagen zwischen dem „ältesten“ und „jüngsten“ Tumor beträgt 12. 4.4 Kultur adhärenter humaner Tumorzellinien Die Arbeit mit den Zellkulturen erfolgte unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank, um Kontamination mit Bakterien oder Pilzen zu vermeiden. Alle Medien 4. 38 Methoden und Zusätze wurden original versiegelt bei –20°C, n ach erstmaliger Öffnung bei 4°C gelagert. Die Kulturbedingungen waren für alle Tumorzellen identisch und konstant: - Temperatur: 37°C - 5% CO 2 Gasanteil - Medium: Roswell Memorial Park Institute (RPMI) 1640 Von allen Zellinien wurde jeweils die eine Hälfte lysiert und für Western Blotting verwendet und die andere Hälfte in Paraffin eingebettet, in den Zellinien Mikroarray eingefügt und immunhistochemisch gefärbt. Dadurch konnten identische Wachstumsbedingungen (und somit Antigenexpressionen) für einen späteren Vergleich der Ergebnisse der Immunhistochemie und des Western Blottings garantiert werden. 4.5 Erstellen von Zellinienarrays 4.5.1 Technische Unterschiede zwischen Xenograftarrays und Zellinienarrays Bis auf die Einbettmethode der Zellen und auf die Vorbehandlung wird ein Zellinienarray genauso verarbeitet wie eine Array aus solidem Gewebe. Zellinienarrays weisen gegenüber Xenograftarrays Vorteile technischer Natur auf: - Die Zellpopulation ist deutlich einheitlicher - Sie enthalten weder Nekrosen, noch murine Gewebeanteile - Das Einbetten der Zellen ist schonender als jenes der Xenografts. Die Vorbehandlung des Gewebes ist gegebenenfalls überflüssig. Die Immunhistochemie der Zellinien liefert qualitativ bessere Ergebnisse. 4.5.2 Einbetten von Zellen Alle Versuchsschritte erfolgen bis zum Einbetten in Paraffin bei Raumtemperatur. 10-20 Millionen subkonfluent wachsende Zellen werden mit einem „cell scraper“ von dem Boden der Kulturflasche gelöst und mit kaltem PBS in ein Zentrifugierröhrchen überführt. Um die Verklumpung der Zellen zu erleichtern wird kein Trypsin verwendet. • Die Zellen dreimal mit 45 ml kaltem PBS waschen. Ein- bis zweistündige Inkubation in 2 ml Bouin’s Fixative (75% gesättigte Pikrinsäure, 20% Formalin (40%ig), 5% Eisessig) . Die Zellen werden vor der • 4. Methoden • • • • • • • • 39 Inkubation nicht resuspendiert. Durch das Bouin’s Fixative bilden sich gelbe „Pellets“. Bouin’s Fixative entfernen und Pellets zweimal 20 Minuten in 70%igem Ethanol waschen. Ethanol verwerfen und die Pellets über Nacht in frischem 70% Ethanol inkubieren. 70%iges durch 90%iges Ethanol ersetzen, eine Stunde inkubieren. 90%iges durch 100%iges Ethanol ersetzen, drei mal 20 Minuten inkubieren. 100%iges Ethanol durch 100%iges Xylol ersetzen, drei mal 20 Minuten inkubieren. Xylol bis auf einen kleinen Rest abgießen und Pellets in 30 ml, 60°C warmes Paraffin schütten. Pellets dreimal 30 Minuten bei 60°C in Paraffin in kubieren. Die Pellets sind gelb und sinken auf den Boden der Glasbehälter. Werden Pellets mit einem Durchmesser über 5 mm verwendet, muß die Inkubationszeit im Paraffin verlängert werden. Blöcke gießen. 4.6 Gelelektrophorese und Western Blotting 4.6.1 Grundlagen Bei einer Elektrophorese migrieren die negativ geladenen Proteine von der Kathode am oberen Ende des Gels zur Anode am unteren Ende des Gels. Da kleine Proteine schneller die netzartige Struktur des Gels passieren als große, trennen sich die Proteine bandförmig nach ihrem Molekulargewicht auf. Im Anschluß an die erste Elektrophorese werden die Proteine entlang eines elektrischen Feldes auf eine Trägerschicht aus Nitrozellulose übertragen. Der eigentliche Nachweis erfolgt mittels Coomassie Blue (unspezifische Färbung der Proteine) im Gel und Antikörpern (spezifische Färbung von Proteinen) auf der Nitrozellulosemembran. Die Peroxidase des Sekundärantikörpers setzt ein luminiszierendes Substrat um, dessen Signal auf einem Film abgebildet wird (Chemilumineszenz). Die Auswertung beruht auf dem Vergleich der Intensität und Größe der Banden. Durch den Nachweis von ß-Aktin, ein Strukturprotein, welches in allen Tumoren gleich stark vorhanden ist, wird die gleichmäßige Beladung des Gels überprüft. 4.6.2 Erstellen von Zellysaten für Western Blotting Subkonfluente Zellen werden mit Trypsin aus den Kulturflaschen gelöst und drei mal in kaltem PBS gewaschen. Anschließend werden sie in Flüssigstickstoff 4. 40 Methoden schockgefroren und bei –80°C gelagert. Die gefroren en Zellen werden mit ca. 100 µl Lysepuffer lysiert und resuspendiert. Nach dreißigminütiger Inkubation auf Eis werden sie 10 Minuten bei 4°C und 13,000 g zentrifu giert. Der Überstand wird bei –80°C gelagert. 4.6.3 Proteinbestimmung / Bradford Assay Vorraussetzung für die gleichmäßige Beladung eines Polyacrylamidgels ist die Bestimmung der Proteinkonzentration in den Zellysaten. Zu diesem Zweck wird der Bradford Assay durchgeführt, ein kolorimetrisches Verfahren, in dem die Proteinbindung eines blauen Farbstoffs in den Lysatproben und in RinderalbuminReferenzlösungen verglichen wird. Der Proteingehalt der Proben wird anhand einer Eichkurve ermittelt. 1. 2. 3. 4. 5. Bradford Reagenz (Coomassie blue) 1:5 mit Aqua destillata auf 50 ml verdünnen und filtrieren. BSA-Stammlösung (bovines Serumalbumin) ansetzen: 20 mg in 10 ml Aqua destillata auflösen (2 µg/µl). Küvetten für die Lysate und 5 1-ml-Einmalküvetten für die BSAVerdünnungsreihe mit 1 ml Bradford-Lösung füllen. 2 µl Lysat in die Küvetten pipettieren und 15 Minuten inkubieren. BSA-Verdünnungsreihe in 5 Küvetten ansetzen: a. b. c. d. e. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 4.6.4 1 ml Bradford + 1 µl BSA 2 µg/ml (Proteinkonzentration) 1 ml Bradford + 2 µl BSA 4 µg/ml 1 ml Bradford + 3 µl BSA 6 µg/ml 1 ml Bradford + 4 µl BSA 8 µg/ml 1 ml Bradford + 8 µl BSA 16 µg/ml Mit Hilfe von „Parafilm“ Küvetten versiegeln und schütteln. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nullabgleich des Spektrometers mit 1 ml Bradford-Lösung ohne BSA. Erneut die Lösungen mischen. Optische Dichte der Proben bei 595 nm messen. Anhand der Standardkurve die Proteinkonzentrationen ermitteln. Gelelektrophorese und Western Blotting Die Taschen der Gele werden mit jeweils 25 µg des denaturierten Zellysates beladen. Das Lysat wird mit Aqua destillata auf 10 µl aufgefüllt. Diese 10 µl werden 4. Methoden 41 1:1 mit Probenpuffer vermischt („Sample Buffer“, modifiziert nach Laemmli). Es entsteht ein Endvolumen von 20 µl, von dem 19 µl zur Beladung verwendet werden. • • • • • • • • • • • Das Zellysat wird wie in 1.6.5 beschrieben angesetzt und 1:1 mit Probenpuffer vermischt. Gradientengel mit Aqua destillata spülen. Gel in die Elektrophorese Vorrichtung (Novex®) montieren und 800 ml Laufpuffer in die Kompartimente füllen. Dichte der Kompartimente überprüfen. Kamm aus dem Gel entfernen und die Taschen mit Laufpuffer spülen. Das Zellysat mit dem Sample Buffer 5 Minuten bei 95°C denaturieren, anschließend kurz zentrifugieren. Mit „Multiflex Round Tips“ werden 19 µl Zellysat, bzw. 8 µl Molekulargewichtsmarker in die Taschen des Gels pipettiert. Die Elektrophorese wird ca. 2 Stunden bei 150 V durchgeführt. Anschließend wird das Gel entnommen und an eine Nitrozellulosemembran in die Blotting Vorrichtung gelegt. Dazu wird es mit Schaumstoff und Filterpapier gepolstert. Alle Bestandteile werden erst in Transferpuffer getränkt, um das Auftreten von Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran zu vermeiden. Das Blotting wird anderthalb Stunden bei 340 mA durchgeführt. Nach dem Blotting wird die Membran in PBS-Tween gewaschen und über Nacht bei 4°C in Blockierlösung inkubiert. Das Gel wird kurz in Aqua destillata gespült und 30 Minuten mit Coomassie Blue gefärbt. Anschließend wird es abgewaschen, in der Entfärbelösung 12 Stunden lang aufgehellt, getrocknet und zur Dokumentation photographiert. Im nächsten Schritt wird die Nitrozellulosemembran gefärbt: • Membran mit dem Primärantikörper 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schwenker inkubieren. Der Primärantikörper wird mit Blockierlösung nach der Empfehlung des Herstellers verdünnt. • Membran einmal 15 Minuten und drei mal 5 Minuten mit PBS-Tween waschen. • Der Sekundärantikörper wird 1:1000 verdünnt und appliziert. 45 Minuten inkubieren. • Membran einmal 15 Minuten und vier mal 5 Minuten mit PBS-Tween waschen. • Die Detektionsreagenzien werden gemischt und auf die Membran pipettiert. Nach einer Minute wird überschüssiges Reagenz abgesaugt, und die Membran in Klarsichtfolie eingeschweißt. • In einer Dunkelkammer wird ein Film dem Fluoreszenzsignal der Membran ausgesetzt und entwickelt. • Die Membran wird abgewaschen und übernacht in Blockierlösung bei 4°C gelagert. • Für die folgende Färbungen gegen ß-Aktin wird die Membran mit einem Detergenz 30 Minuten bei 50 bis 70°C „gestrippt“. • Nach dem „Stripping“ wird die Membran kurz gewaschen und 1 Stunde in Blockierlösung gelegt. Anschließend wird der Kontrollantikörper ß-Aktin oder ein weiterer Antikörper eingesetzt. 4. 42 Methoden 4.7 Datenverarbeitung und statistische Auswertung Die semiquantitativ gewonnenen Meßwerte der Immunhistochemie sind nicht normalverteilt. Dementsprechend werden für den Vergleich von zwei unabhängigen Stichproben mit stetigem Merkmal der Mann-Whitney-U-Test (Wilcoxon-Rangtest für unabhängige Stichproben) verwendet. Es handelt sich um einen Rangsummentest, in dem die Meßwerte nach ihrer Größe einen Rang zugeteilt bekommen. Anhand der Rangsummen werden die Prüfgrößen U der Stichproben berechnet. H0 wird verworfen, wenn der kleinere U-Wert kleiner oder gleich dem kritischen Wert ist. Letzterer kann einer Tabelle entnommen werden oder wird vom Statistikprogramm ermittelt. Gilt es, eine lineare Korrelation von zwei Meßreihen auszurechnen, wird der Spearmansche Korrelationskoeffizient rs ermittelt, da die Stichproben eine stetige Verteilung aufweisen und nicht normalverteilt sind. Alle statistischen Tests sind zweiseitig. Für die Boxplots werden pro Datenreihe mindestens 5 Werte verwendet. 4.8 In vivo Testung antitumoral wirksamer Substanzen 4.8.1 Prinzipien Die in vivo Testung experimenteller antitumoraler Substanzen wird an tumortragenden, randomisierten NMRI nu/nu Nacktmäusen durchgeführt. Jede Testgruppe besteht aus drei bis sechs Mäusen. Die Tierhaltung richtet sich nach Standardverfahren und entspricht dem deutschen Tierschutzgesetz. Die Nacktmäuse bekommen jeden Tag Flüssigkeit und Nahrung ad libitum und Sonntags ein Leckerli. Der Umgang mit den Tieren erfolgt durch veterinärtechnische Assistenten. Der Allgemeinzustand der therapierten Mäuse wird täglich kontrolliert, das Körpergewicht und das Tumorvolumen zweimal pro Woche gemessen. Das Tumorvolumen wird mit einer Schublehre bestimmt und mit der Formel Tumorvolumen = ½ (a x b) 2 errechnet. a und b sind die beiden gemessenen, senkrecht stehenden Tumordurchmesser. Die Experimente werden beendet, sobald die Tumoren einen Durchmesser von 1,8 cm erreichen. 4. Methoden 43 Das relative Tumorvolumen RTV (in %) wird folgendermaßen definiert: Tumorvolumen am Tag X geteilt durch Tumorvolumen an Tag 0 multipliziert mit 100: Vx/V0. Für das relative Tumorvolumen von Versuchsgruppen wird der Median der einzelnen Werte verwendet: Tx/T0. Man verwendet die graphische Darstellung des relativen Tumorvolumens als Wachstumskurven für die Evaluation der Therapie. Der „T/C Wert“ ist ein Maß für die Wachstumsinhibition eines Tumors am Tag X der Testung. Es errechnet sich aus folgender Gleichung: 100 x Median der RTV der Therapiegruppe / Median der RTV der Kontrollgruppe. Auf der Verdopplungszeit des Xenografts (Zeit bis der mediane RTV 200% erreicht ist) basiert die absolute Wachstumsverlangsamung. Sie ist die Differenz zwischen der medianen Verdopplungszeit der Therapiegruppe und jener der Kontrollgruppe: Td Test minus Td Kontrolle. Die Effektivitätskriterien der Therapie richten sich nach den T/C Werten und dem relativen Tumorvolumen Tx/T0. Die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit einer Substanz wird folgender Tabelle entnommen: ≤ ≤ ≤≤ Eine Tumorremission impliziert den Rückgang der Neoplasie, wie sie durch aktive zytotoxische Substanzen zu erwarten wäre. Eine Tumorstase beschreibt den Wachstumsstillstand, eine Tumorinhibition das verlangsamte Wachstum eines Malignoms. Eine solche Wirkung zeigen „Zytostatika“ (im engeren Sinne). 4.8.2 Wirksamkeitsprüfung von HuMV833 Die Versuchstiere wurden randomisiert und in vier Gruppen aufgeteilt (à 3-4 (PAXF 736), bzw. 6-8 (PAXF 546) Mäuse). Gruppe 1 war die Kontrollgruppe, die zweite wurde mit HuMV833, die dritte mit Gemcitabin und die vierte mit beiden Substanzen therapiert. HuMV833 wurde in Dosen von 100 µg / Maus alle vier Tage von Tag 0 bis 32 intraperitoneal verabreicht. Den Mäusen wurden 300 mg / kg Gemcitabin am 4. 44 Methoden Tag 1, 7 und 14 intravenös injiziert. Die jeweiligen Therapiepläne wurden auch für die Kombinationstherapie verwendet. Die Kontrollgruppe erhielt 0,9% NaCl. Während der Behandlung starb eine Nacktmaus der Kontrollgruppe an zu großer Tumorlast und ein Versuchstier an den Nebenwirkungen der Kombinationstherapie. 4.8.3 Wirksamkeitsprüfung von Halofuginon Xenograft MEXF 276 RXF 944LX Implantation subkutan subkapsulär in die Niere Dosis von Halofuginon 2,5 und 5 µg /Maus/ Tag 2,5 µg /Maus/ Tag Applikation intraperitoneal intraperitoneal Therapiedauer 21 Tage 14 Tage Kontrollsubstanz NaCl NaCl Gruppengröße 10 Nacktmäuse 6 Nacktmäuse Zehn (MEXF 276), bzw. sechs (RXF 944LX) Mäuse wurden jeweils randomisiert in Therapie- und Kontrollgruppen aufgeteilt. Drei Tage nach der Xenoimplantation wurde die Behandlung eingeleitet. Sobald die Melanome subkutan palpabel waren, wurde ihr Volumen zweimal wöchentlich mit einer Schublehre gemessen. Die Größe der intrarenal wachsenden Nierenzellkarzinome konnte erst post mortem anhand des Gewichts der Nieren gemessen werden. 5. 45 Ergebnisse 5 Ergebnisse 5.1 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Xenograftarrays 5.1.1 Verwendete Gewebemikroarrays Anhand von 10 Gewebemikroarrays à 100-160 Tumoren in Duplikaten konnte frisches Tumorgewebe, das während eines Zeitraums von 2 Jahren asserviert wurde, untersucht und archiviert werden. Ein weiterer Array wurde aus Xenografts unterschiedlicher Nacktmauspassagen zusammengestellt. Zwei Arrays enthielten die Xenografts aus zwei in vivo Substanzprüfungen: ein therapeutischer VEGFAntikörper und ein MMP-2 Inhibitor. Sie wurden zur Beobachtung der Targetmodulation und der Identifizierung von Surrogatmarkern eingesetzt. Es war möglich, alle verfügbaren Xenografts ohne Einschränkung in der Form eines Gewebearrays zu organisieren, so daß jeder Array zwischen 63 und 284 Proben in alphabetischer Reihenfolge enthielt (Beispiele in Abb. 5.1-2). Die Qualität der Tumorproben konnte durch ihre Selektion anhand von Hämatoxylin-Eosin Färbungen garantiert werden (s. Kapitel 4.2.2). Als zusätzliche Qualitätssicherung wurden von jedem Xenograft zwei Proben pro Array verwendet. Dadurch konnte bis auf wenige Ausnahmen, ca. 5-10 Proben pro Array, eine sichere Aussage zur Proteinexpression der Tumoren gemacht werden. Die Anwendung galt als zuverlässig, wenn die Spezifität des Antikörpers und die Qualität des Gewebes gegeben war. Abb. 5.1: Darstellung von zwei Arrayblöcken (rechts). Jeder Paraffinblock enthält ca. 280 Tumorproben. Links sind drei gefärbte Schnitte abgebildet. Von einem Block können Schnitte erstellt werden. ca. 100 5. 46 Ergebnisse Abb. 5.2: Zusammensetzung eines Xenograft Gewebearrays. Von jedem Tumor wurden zwei Proben aufgetragen. Dieser Array enthielt 220 Proben von 107 Tumorentitäten und zwei humanen Normalgeweben. 5.1.2 Vergleich von Tumoren unterschiedlicher Passagen Es wurde ein Gewebemikroarray aus 110 Proben erstellt, der 13 Xenografts unterschiedlicher Nacktmauspassagen enthielt. Anhand dieses Arrays wurde die Variabilität der Expression Transplantationen von von einer MMP-2 und Cathepsin Maus zur Nächsten B über 3 untersucht. - 12 Die immunhistochemische Färbung wurde von 0+ (keine gefärbten Zellen) bis 3+ (maximale Färbeintensität) bewertet. Aus den Färbeergebnissen wurde der Mittelwert errechnet. Die Expression beider Proteine blieb weitgehend konstant: • Die maximale Variabilität der Cathepsin B – Expression einer Tumorentität unterschiedlicher Passagen betrug 1,0 und wurde in 21% der Fälle festgestellt. In 42 der 53 Xenografts (79%) variierte die Proteinexpression jedoch um weniger als 1,0 über die serielle Transplantationen. In Abb. 5.3 sind die einzelnen Färbeergebnisse der Xenografts in einem Balkendiagramm dargestellt. Die Standardabweichung für Cathepsin B betrug durchschnittlich 0,27 (Spannweite: 0,0 bis 0,5), bei einem Mittelwert von 0,56. 5. 47 Ergebnisse 4 3 2 1 RXF 1220 GXF 209 PAXF 736 MEXF 276 MAXF 401 MEXF 1341 RXF 944 PAXF 546 CXF 1103 LXFL 529 XF 575 -1 MAXF MX1 0 LXFA 629 Cathepsin B Expression Cathepsin B Expression in 3-12 Passagen Abb. 5.3: Darstellung der Cathepsin B – Expression in 13 Neoplasien aus 3-12 verschiedenen Nacktmauspassagen. Die Balken stellen die Färbeergebnisse der Xenografts dar (0 bis 3). Die Abweichungen der Meßwerte einzelner Xenografts sind gering, sie erreichen maximal den Wert 1,0. • Die MMP-2-Expression variierte in einem vergleichbaren Ausmaß: 40 von 48 (83,3%) der untersuchten Passagen zeigten eine Diskrepanz unterhalb von 1,0, acht eine Diskrepanz von 1,0 (16,7%) (Abb. 5.4). Die mittlere Standardabweichung betrug 0,28 (Spannweite: 0,00 bis 0,50), bei einem Mittelwert von 1,23. MMP-2 Expression in 3-12 Passagen 3 2 1 RXF 1220 GXF 209 PAXF 736 MEXF 276 MAXF 401 MAXF MX1 MEXF 1341 RXF 944 PAXF 546 CXF 1103 XF 575 -1 LXFL 529 0 LXFA 629 MMP-2 Expression 4 Abb. 5.4: Darstellung der MMP-2-Expression in 13 Neoplasien aus 3-12 verschiedenen Nacktmauspassagen. Die Balken stellen die Färbeergebnisse der Xenografts dar. 5. Ergebnisse 5.1.3 48 VEGF-Expression Die VEGF-Expression von 154 Xenografts wurde in 5 Gewebemikroarrays untersucht. Eine Anfärbung von VEGF wurde ausschließlich im Zytoplasma beobachtet. In der Regel waren alle Zellen einer Tumorprobe gleichmäßig angefärbt, daher richtete sich die Auswertung nach der Färbeintensität. Ungefärbte Gewebe wurden mit 0+ bewertet, maximal gefärbte Gewebe mit 3+. Digitale Aufnahmen exemplarischer Färbungen sind in Abbildung 5.5 dargestellt. Die durchschnittliche Expression von VEGF betrug 1,0+. 5. 49 Ergebnisse A B C D E F Abb. 5.5: Immunhistochemische Färbung von VEGF in einem Gewebemikroarray. A: Pleuramesotheliom PXF 1652, 1+. B: Teratokarzinom TXF 881, 1+. C: Adenokarzinom der Lunge LXFA 923, 1+. D: Mammakarzinom MAXF 1691, 2+. E: Adenokarzinom des Magen GXF 251, 3+. F: Urothelkarzinom BXF 1218, 3+. Vergrößerung: x400. 5. 50 Ergebnisse 5.1.3.1 Tumortypspezifische VEGF-Expression Die VEGF-Expression zeigte keine deutliche Abhängigkeit vom Tumortyp, sondern ein breites Vorkommen in allen untersuchten Histologien. Lediglich die kleinzelligen Bronchialkarzinome stellten in dieser Hinsicht eine Ausnahme dar. Die mittleren Färbergebnisse aller Xenografts (Mittelwert und Standardabweichung) sind tabellarisch im Anhang A aufgeführt. Die Werteverteilung innerhalb eines Tumortyps wurde in einem Box-Plot (Abb. 5.6) dargestellt. VEGF Expression 3 2 1 TXF SXF RXF PXF PRXF OVXF MEXF MAXF LXFS LXFL LXFE LXFA GXF CXF BXF 0 Abb. 5.6: Darstellung der tumortypspezifischen VEGF-Expression in einem BoxPlot. Innerhalb der blauen Fläche, zwischen dem 25% und dem 75% Quartil, liegen 50% der Werte, innerhalb der Schnurrhaare 80% der Werte. Alle Werte, die außerhalb dieser Verteilung liegen, sind als Punkt abgebildet. Die Linie innerhalb der Boxen zeigt den Median an. Es sind nur Tumortypen dargestellt, die aus einem Kollektiv von mindestens 5 Xenografts bestehen. Das generalisierte Vorkommen des angiogenen Faktors – unabhängig des Tumortyps – spiegelt sich in der Höhe der Boxen wieder. - Urothelkarzinome (n=7): Von den 7 Urothelkarzinomen zeigte BXF 1218 die durchschnittlich höchste VEGF-Expression (2+) (Abb. 5.5). - Kolonkarzinome (n=16): Von den 16 untersuchten Kolonkarzinomen ist ein Viertel stark positiv, ein viertel mäßig positiv und eine Hälfte negativ. 5. 51 Ergebnisse - Tumoren des ZNS (n=4): Bis auf CNXF 498, ein Glioblastom, zeigte keine Neoplasie eine überdurchschnittliche VEGF-Expression. - Magenkarzinome (n=6): Die Immunhistochemie ergab, daß GXF 281 der Magentumor mit dem höchsten VEGF-Gehalt war. Vier Adenokarzinome zeigten eine mäßige, einer keine VEGF-Expression (Abb. 5.5). - Kopf- und Halskarzinome (n=3): HNXF 908 erreichte überdurchschnittliche VEGF Werte, während HNXF 536 mäßig viel und HNXF 921 gar kein VEGF aufwies. Adenokarzinome der Lunge (n=14): Die Mehrheit zeigte eine schwache Färbung. LXFA 592 und 1670 waren die einzigen Neoplasien mit einem hohen VEGF-Spiegel. 3 weitere Malignome waren mäßig angefärbt (). - Plattenepithelkarzinome der Lunge (n=9): Von den 9 Tumoren exprimierten LXFE 856 und 409 viel, 3 mäßig viel und 4 kein VEGF. - Großzellige Bronchialkarzinome (n=6): LXFL 1674 zeigte die höchste VEGF-Expression unter den großzelligen Bronchialkarzinomen. Von den 5 übrigen Tumoren waren 3 mäßig stark und 2 gar nicht angefärbt. - Kleinzellige Bronchialkarzinome (n=5): Die Kleinzeller waren bis auf LXFS 538 alle negativ. - Mammakarzinome (n=15): Die Hälfte der 15 Mammakarzinome exprimierten kein VEGF. 5 Malignome waren mäßig stark angefärbt, während sich in MAXF 1727, 1691 und 1721 sehr hohe Spiegel des angiogenen Faktors fanden (Abb. 5.5). - Melanome (n=12): MEXF 1736 zeigte von den 12 untersuchten Melanomen den höchsten VEGF-Spiegel (3+). Auch MEXF 1732 war stark positiv. In den 10 anderen Melanomen wurde jeweils zur Hälfte mäßig viel, bzw. wenig VEGF beobachtet. - Ovarialkarzinome (n=9): OVXF 1692 und 1724 waren am stärksten gefärbt, während in 3 weiteren Tumoren mäßig viel VEGF nachgewiesen wurde. Die andere Hälfte der Ovarialkarzinome zeigten kein VEGF. - Pankreaskarzinome (n=3): Nur PAXF 546 exprimierte viel VEGF, PAXF 1657 mäßig viel und PAXF 736 nur wenig. - Prostatakarzinome (n=5): Bis auf PRXF 1369, in dem viel VEGF beobachtet wurde, konnte in keiner Prostataneoplasie VEGF nachgewiesen werden. 5. Ergebnisse - 52 Pleuramesotheliome (n=7): PXF 1730 zeigte die höchste VEGFExpression. Insgesamt enthielten die Mesotheliome wenig VEGF. - Nierenzellkarzinome (n=9): RXF 944 und RXF 393 waren von den 9 Karzinomen am stärksten angefärbt. Die VEGF-Expression von RXF 1220 lag im mittleren Bereich. Die 6 anderen Nierenzellkarzinome exprimierten kaum VEGF. - Sarkome (n=5): In keinem der 5 untersuchten Sarkome konnten hohe VEGF-Spiegel erkannt werden. - Hodentumoren (n=5): TXF 404 und 593 erreichten 3+, während TXF 1207 und 881 in mittleren Bereich lagen. In TXF 1641 wurde kein VEGF nachgewiesen (Abb. 5.5). - Zervixkarzinome (n=2): Beide Neoplasien exprimierten mäßig viel VEGF. - Gesunde humane Haut enthielt kein VEGF. - Die Tubuluszellen der humanen Niere (n=1) zeigten eine hohe VEGFExpression. Im Gegensatz dazu waren die Glomeruli nicht angefärbt. 5.1.4 Cathepsin B – Expression Cathepsin B wurde in 10 verschiedenen Gewebemikroarrays immunhistochemisch gefärbt. Die Expression des Enzyms wurde in 160 Geweben der Freiburger Xenograft Sammlung durchschnittlich fünf mal untersucht. Die Cathepsin B – Färbung war pünktchenförmig im Zytoplasma verteilt, was dem lysosomalen Vorkommen des Enzyms entsprechen könnte. In manchen Tumoren war Cathepsin B am murinen Bindegewebe entlang überexprimiert und in angrenzenden Tumorzellen basal (bindegewebsnah) polarisiert (Abb. 5.7). 5. 53 Ergebnisse A B Abb. 5.7: In manchen Tumoren, zum Beispiel im Adenokarzinom der Lunge LXFA 1012 (A) und im Plattenepithelkarzinom HNXF 908 (B), war Cathepsin B an Bindegewebssträngen entlang überexprimiert (Pfeile). Vergrößerung: A x1000, B x400 Eine starke Expression von Cathepsin B in allen Zellen einer Tumorprobe wurde mit 3+ bewertet. Ein hoher Anteil positiver Zellen mit mäßiger Expression oder ein mäßiger Anteil stark positiver Zellen wurde mit 2+ bewertet, in einer schwächeren Ausprägung mit 1+. Den Xenografts ohne nachweisbare Expression wurde 0+ zugeteilt. In Abbildung 5.8 sind 4 Beispiele dargestellt. Der Mittelwert und die Standardabweichung der Proteinexpressionen wurden errechnet und statistisch ausgewertet (Anhang A). Die durchschnittliche Enzymexpression betrug 1,3+. Negativkontrollen mit Maus Immunglobulin als Primärantikörper zeigten keine Färbung. Der Antikörper zeigte keine Kreuzreaktion mit murinem Cathepsin B. 5. 54 Ergebnisse A B C D Abb. 5.8: Immunhistochemischer Nachweis von Cathepsin B im Gewebemikroarray. Das Enzym ist granulär im Zytoplasma verteilt. A: Glioblastom CNXF 295, 3+. B: Ovarialkarzinom OVXF 1023, 2+. Cathepsin B ist teilweise am Bindegewebsrand überexprimiert. C: Plattenepithelkarzinom der KopfHals Region HNXF 536, 3+. D: Klarzelliges Nierenzellkarzinom RXF 393, 1+. Vergrößerung: A-C x400, D x600. 5.1.4.1 Tumortypspezifische Cathepsin B – Expression Die Cathepsin B – Expression war in den 160 untersuchten Tumoren breit gefächert. Sie zeigte aber teilweise eine ausgeprägte Abhängigkeit vom Tumortyp. Dies traf insbesondere zu für die kleinzelligen Bronchialkarzinome, die Hodenkarzinome und die Magenkarzinome, die eine extrem niedrige Cathepsin B – Expression aufwiesen. Auch in den Mammakarzinomen wurde eine sehr schwache Cathepsin B – Expression beobachtet. Eine merklich erhöhte Cathepsin B – Expression lag in den Adenokarzinomen der Prostata und der Blase und in den Pleuramesotheliomen vor. Drei Viertel der Werte dieser Tumoren lagen über 5. 55 Ergebnisse dem Durchschnitt aller Xenografts. Abbildung 5.9 zeigt in einem Box-Plot die Verteilung der Färbeergebnisse je nach Tumortyp. Cathepsin B Expression 3 2 1 TXF SXF RXF PRXF PXF OVXF MEXF MAXF LXFS LXFL LXFE LXFA GXF CXF BXF 0 Abb. 5.9: Darstellung der Cathepsin B – Expression in 15 Tumortypen. Eine besonders niedrige Expression fällt in den Magenkarzinomen, den kleinzelligen Bronchialkarzinomen und den Hodenkarzinomen auf. Die Expression in den meisten Xenografts zeigt im untersuchten Kollektiv jedoch keine Abhängigkeit vom Tumortyp. • - Xenografts mit starker Cathepsin B – Expression: Urothelkarzinome (n=7): Von den 7 Urothelkarzinomen waren alle bis auf BXF 1218 positiv. BXF 439, BXF 1036 und BXF 1352 hatten eine sehr starke Cathepsin B – Expression (2,5+). - Pleuramesotheliome (n=7): PXF 541 und 1652 exprimierten viel Cathepsin B, die anderen Mesotheliome weniger. - Prostatakarzinome (n=6): Alle überdurchschnittlich viel Cathepsin B. 6 Prostatakarzinome enthielten 5. Ergebnisse 56 • Xenografts mit variabler Cathepsin B – Expression: - Kolonkarzinome (n=17): Von diesem großen Tumorkollektiv exprimierten 5 Neoplasien sehr viel, 5mäßigvielund 7 nur wenig oder gar kein Cathepsin . Tumoren des ZNS (n=4): 3 Tumoren waren stark positiv, 1 negativ - Kopf- und Halskarzinome (n=3): HNXF 536 und HNXF 908 wiesen eine sehr hohe Cathepsin B – Expression auf. Auffällig war die Überexpression der Protease in den Zellen, die an murinen Bindegewebssträngen grenzten (Abb. 5.7-8). HNXF 921 exprimierte kein Cathepsin B (Abb. 5.7-8). - Adenokarzinome der Lunge (n=14): Fünf Neoplasien waren stark positiv, 3 waren negativ. Die anderen 6 Karzinome zeigten eine mittlere Expression (Abb. 5.8). - Plattenepithelkarzinome der Lunge (n=9): Vier Karzinome exprimierten viel, eines mäßig viel und 4 kein Cathepsin B. - Großzellige Bronchialkarzinome (n=6): Von den 6 Karzinomen waren LXFL 529 und LXFL 1674 stark positiv. Ein Tumor exprimierte mäßig viel Cathepsin B, alle anderen nur wenig. - Melanome (n=13): MEXF 514 war einer der Tumoren mit der höchsten Cathepsin B – Expression. Auch MEXF 384, 462, und 1341 waren stark positiv. In den 9 anderen Melanomen wurde wenig oder mäßig viel Enzym beobachtet. - Ovarialkarzinome (n=9): Sechs Neoplasien waren stark, drei kaum gefärbt (Abb. 5.8). - Pankreaskarzinome (n=3): Nur PAXF 1657 exprimierte viel Cathepsin B. - Nierenzellkarzinome (n=10): Die Cathepsin B – Expression der 10 Hypernephrome war breit gefächert: 3 waren stark positiv, 3 deutlich negativ. Die Werte der anderen Tumoren lagen im mittleren Bereich (Abb. 5.8). - Sarkome (n=5): SXF 1186 zeigte eine hohe Cathepsin B – Expression, SXF 1301 eine mittlere. Die anderen 3 Sarkome waren negativ. - Zervixkarzinome (n=2) wiesen mäßig viel Cathepsin B auf. 5. 57 Ergebnisse • Xenografts mit schwacher Cathepsin B – Expression: - Magenkarzinome (n=6): Bis auf GXF 324 exprimierte kein Magenkarzinom Cathepsin B. - Kleinzellige Bronchialkarzinome (n=5): In keinem der 5 Karzinome konnte Cathepsin B nachgewiesen werden. - Mammakarzinome (n=15): Bis auf MAXF 1721, MAXF 1727 und MAXF MDA-MB 468 lag die Expression von Cathepsin B unter dem allgemeinen Durchschnitt. - Hodentumoren (n=5): Keiner der 5 Hodentumoren exprimierte viel Cathepsin B. • Humane Normalgewebe: - Gesunde Haut (Praeputium, n=1) wurde mit 1+ bewertet. - Niere (chirurgisches Resektat, n=1) zeigte eine mittlere Cathepsin B – Expression von 1,5+. 5.1.5 MMP-2- und ProMMP-2-Expression Die MMP-2-Expression wurde in 144 Tumoren der Freiburger Xenograft Sammlung auf 6 Arrays untersucht. Das Enzym war in den positiven Neoplasien stets homogen im Zytoplasma verteilt. Der Antikörper zeigte keine Kreuzreaktion mit MT-MMP-2, dementsprechend wurden keine membranständigen Färbungen beobachtet. Es wurde sowohl die Proform als auch die aktive Form des Enzyms gefärbt (bispezifischer Antikörper). Die Affinität des Antikörpers zur Proform war von Bedeutung, da nur das intrazelluläre Enzym beurteilt wurde. Der Einfachheit halber soll im Folgenden die Bezeichnung MMP-2 verwendet werden. Die semiquantitative Auswertung richtete sich vorrangig nach der Intensität der Färbung, da die Zellen eines einzelnen Tumors in der Regel eine gleich hohe MMP2-Expression zeigten. Nur in wenigen Tumoren variierte der Enzymgehalt deutlich von Zelle zu Zelle. Dunkelbraune Zellen wurden mit 3+ bewertet, braune Zellen mit 2+, hellbraune mit 1+ und ungefärbte Zellen mit 0+ (Abb. 5.10). 5. 58 Ergebnisse A B C D Abb. 5.10: Immunhistochemischer Nachweis von MMP-2 im Gewebemikroarray. A: Das Plattenepithelkarzinom der Lunge LXFE 211 zeigte keine MMP-2Expression und wurde mit 0+ bewertet. B: Das Melanom MEXF 274 wurde mit 2+ bewertet. C: Das Pankreaskarzinom PAXF 546 wurde mit 2+ bewertet. D: CXF 1297 exprimierte viel MMP-2 und wurde mit 3+ bewertet. Vergrößerung x400. Die durchschnittliche MMP-2-Expression der 144 untersuchten Geweben lag bei 1,0+. Über die Hälfte der Tumoren exprimierten kaum MMP-2, während mäßig hohe und hohe Proteinexpressionen gleich häufig vorkamen. Diese Werteverteilung ist in einem Histogramm in Abbildung 5.11 dargestellt. Negativkontrollen blieben ungefärbt. Murines MMP-2 wurde nicht gefärbt. 5. 59 Ergebnisse 5 0 prozentuale Häufigkeit 4 0 3 0 2 0 1 0 0 0 - 0 ,5 0 ,5 - 1 1 - 1 ,5 M M P -2 1 ,5 - 2 2 - 2 ,5 2 ,5 - 3 F ä r b e e r g e b n is s e Abb. 5.11: Das Histogramm zeigt die prozentuale Häufigkeit der Färbeergebnisse von MMP-2. Ca. 60% der Tumoren wiesen eine sehr schwache MMP-2-Expression (<1+) auf. Im höheren Bereich ist die MMP-2-Expression gleichmäßiger verteilt. 5.1.5.1 Tumortypspezifische (Pro-)MMP-2-Expression MMP-2 wurde in den meisten Tumortypen nachgewiesen. Die Expression der Protease war in den Adenokarzinomen der Blase, des Kolons, des Magens, der Lunge und des Ovars, so wie in den Melanomen breitgefächert und zeigte in diesen Fällen keine deutliche Abhängigkeit von Tumortyp. Ein überdurchschnittliches Vorkommen von MMP-2 wurde in den Nierenzellkarzinomen nachgewiesen. Während MMP-2 in den großzelligen Karzinomen der Lunge schwach vorhanden war, fehlte MMP-2 in Plattenepithelkarzinomen Pleuramesotheliomen und den kleinzelligen der Lunge, den den Bronchialkarzinomen, den Mammakarzinomen, den Prostatakarzinomen fast vollständig. Die Färbeergebnisse von 5 Tumortypen, deren MMP-2-Expression eine Abhängigkeit vom Tumortyp aufwies, wurden in einem Balkendiagramm in Abbildung 5.12 dargestellt. Es konnte zusätzlich nachgewiesen werden, daß innerhalb des untersuchten Kollektivs ein Zusammenhang zwischen der histologischen Tumordifferenzierung und der MMP-2-Expression besteht (Kapitel 5.3.1). 5. 60 Ergebnisse MMP-2 Expression in 5 Tumortypen 3,5 MMP-2 Expression 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 RXF (Median=2,7) PXF (Median=0,5) LXFE (Median=0,2) PRXF (Median=0) LXFS (Median=0) Abb. 5.12: Darstellung der MMP-2-Expression in 5 verschiedenen Tumortypen. Jeder Balken stellt den Mittelwert und die Standardabweichung der MMP-2Expression eines Xenografts dar. Von jeden Tumortyp wurden mindestens 5 Xenografts parallel untersucht. Die Nierenzellkarzinome wiesen eine hohe MMP-2Expression auf, während die Pleuramesotheliome, die epithelialen und kleinzelligen Bronchialkarzinome und die Prostatakarzinome kaum MMP-2 enthielten. Die Expression in den anderen Xenografts zeigte keine Abhängigkeit von Tumortyp. • Xenografts mit starker MMP-2-Expression: - Nierenzellkarzinome (n=8): Die MMP-2-Expression der Nierenzellkarzinome war entweder sehr hoch (RXF 486, 488, 631, 1220, 1393) oder sehr niedrig (RXF 944, 1653). Ein Tumor, RXF 393, war mäßig stark gefärbt. - Pankreaskarzinome (n=3): Alle drei Pankreaskarzinome zeigten eine starke MMP-2-Expression (Abb. 5.10). • Xenografts mit variabler MMP-2-Expression: - Urothelkarzinome (n=6): BXF 1036 und 1299 waren die einzigen Tumoren mit hohen MMP-2-Spiegeln, während die anderen 4 Urothelkarzinome kein MMP-2 exprimierten. - Kolonkarzinome (n=17): 17 Kolonkarzinome wurden untersucht. Ein Viertel exprimierte viel, ein Viertel mäßig viel und die Hälfte der Tumoren nur sehr wenig MMP-2 (Abb. 5.10). 5. 61 Ergebnisse - Tumoren des ZNS (n=4): CNXF SF 268 war stark positiv. Die anderen 3 Neoplasien zeigten mäßig hohe MMP-2-Spiegel. - Magenkarzinome (n=6): Nur GXF 97 und 214 waren negativ. Die anderen 4 Tumoren zeigten eine mittlere bis starke Färbung. - Kopf- und Halskarzinome (n=3): HNXF 921 war der einzige der 3 Tumoren mit hoher MMP-2-Expression. - Adenokarzinome der Lunge (n=14): Von den 14 Neoplasien konnten in 6 Fällen eine hohe, in 4 eine mittlere und in 4 keine MMP-2-Expression nachgewiesen werden. - Großzellige Bronchialkarzinome (n=5): Drei der 5 Malignome wiesen eine mäßige, zwei keine MMP-2-Expression auf. - Melanome (n=12): Zwei Melanome waren stark positiv (MEXF 274 und 989), 5 mäßig positiv und 5 zeigten keine MMP-2-Expression (Abb. 5.10). - Ovarialkarzinome (n=8): Bis auf OVXF 899 und 1023 waren die Ovarialkarzinome nur schwach positiv. - Sarkome (n=3): Die 3 Sarkome zeigten eine mäßige MMP-2-Expression. • Xenografts mit schwacher MMP-2-Expression: - Plattenepithelkarzinome der Lunge (n=8): In keinem der 8 Plattenepithelkarzinome wurde MMP-2 nachgewiesen (Abb. 5.10). - Kleinzellige Bronchialkarzinome (n=5): Die 5 kleinzelligen Bronchialkarzinome zeigten kein MMP-2. - Mammakarzinome (n=14): Fast alle getesteten Mammakarzinome exprimierten kein MMP-2. Von den 14 Tumoren waren nur 4 mäßig positiv. - Pleuramesotheliome (n=5): In den 5 Mesotheliomen wurde fast kein MMP2 beobachtet. - Prostatakarzinome (n=5): Bis auf PRXF DU 145 LX waren alle Prostataneoplasien negativ. - Hodentumoren (n=4): Die MMP-2-Spiegel der 4 Hodenkarzinome lagen unter dem Durchschnitt. - Zervixkarzinome (n=2): Keines der beiden Zervixkarzinome exprimierte MMP-2. 5. Ergebnisse • Humane Normalgewebe: - In der Niere wurde keine MMP-2-Expression gefunden. 5.1.6 62 Typ I – Kollagen – Gehalt Es wurde ein Antikörper mit einer spezifischen Affinität für Typ I – Kollagen (murines und humanes) verwendet. Typ I – Kollagen unterschied sich von den anderen untersuchten Proteinen durch seinen murinen Ursprung. Es war häufig mit weiteren Bestandteilen des Wirtmesenchyms ko-lokalisiert. Typ I – Kollagen wurde in 136 Tumoren auf 4 verschiedenen Arrays untersucht. Die Evaluation des Vorkommens von Typ I – Kollagen richtete sich nach der Anzahl und der Länge der angefärbten Bindegewebsstränge in den Tumorproben. Mehr als 3 Bindegewebsstränge, welche die Gewebsprobe vollständig durchzogen, wurden mit 3+ bewertet. 2 lange Bindegewebsstränge oder mehrere kurze Fasern wurden ein 2+, in geringerer Ausprägung ein 1+ zugeordnet (Abb. 5.13). Ungefärbtes Mesenchym wurde nicht bewertet, da angenommen wurde, daß es aus anderen Bindegewebsfasern bestand. Das durchschnittliche Vorkommen von Typ I – Kollagen lag bei 1+. Die Hälfte aller Xenografts enthielt fast kein Typ I – Kollagen, ein Viertel mäßig viel und ein Viertel sehr viel. 5. 63 Ergebnisse A B C D E F Abb. 5.13: Immunhistochemischer Gewebemikroarray. A: Großzelliges Nachweis von Typ Bronchialkarzinom I LXFL – Kollagen 1674 0+. im B: Kolonkarzinom Colo 205, 3+. C: Kolonkarzinom CXF 1297, 3+. D: Glioblastom CNXF 486, 3+. E: Glioblastom CNXF U251X, 3+. F: Kolonkarzinom CXF 158, 2+. Vergrößerung: A-E x400, F x160. 5. 64 Ergebnisse 5.1.6.1 Tumortypspezifischer Gehalt an stromalem Typ I – Kollagen Das Vorkommen von Typ I – Kollagen zeigte in wenigen Fällen eine Abhängigkeit von Tumortyp. Die Glioblastome zeigten als einziger Tumortyp einen sehr hohen Kollagenanteil (Abb. 5.13). In den Pleuramesotheliome und den großzelligen Bronchialkarzinome wurde zu 75% kein Typ I – Kollagen gefunden. Die Mediane der Typ I – Kollagen – Synthese in den kleinzelligen Bronchialkarzinomen, den Plattenepithelkarzinomen der Lunge, den Ovarialkarzinomen und den Nierenzellkarzinomen waren kleiner als im Gesamtkollektiv. In den anderen Tumortypen war das Vorkommen von Kollagen wechselhaft. Es konnte jedoch innerhalb des vorliegenden Tumorkollektivs ein Zusammenhang zwischen der Tumordifferenzierung und der Typ I – Kollagen Expression festgestellt werden (Kapitel 5.3.2). Im folgenden ist die Kollagensynthese der einzelnen Tumortypen beschrieben. • Xenografts mit einem hohen Kollagenanteil: - Glioblastome (n=3): In allen drei Glioblastomen fand eine starke Kollagensynthese statt (Abb. 5.13). In CNXF SF 268 (kein Glioblastom) wurde kein Typ I – Kollagen nachgewiesen. • Xenografts mit einem variablen Kollagenanteil: - Urothelkarzinome (n=6): In 3 Tumoren wurde ein hoher, in einem ein mittlerer und in 2 ein niedriger Gehalt an Typ I – Kollagen beobachtet. - Kolonkarzinome (n=15): Sechs Kolonkarzinome waren reich an Typ I – Kollagen, 4 enthielten mäßig viel und 5 nur wenig (Abb. 5.13). - Magenkarzinome (n=6): Die Magenkarzinome enthielten bis auf GXF 324 wenig bis mäßig viel Typ I – Kollagen. - Kopf- und Halskarzinome (n=3): Alle 3 untersuchten Neoplasien zeigten einen mittelmäßigen Kollagenanteil. - Adenokarzinome der Lunge (n=14): Der Kollagengehalt dieser Malignome war gleichmäßig verteilt. Ein Drittel wies einen hohen, ein Drittel einen mäßigen und ein Drittel einen geringen Kollagenanteil auf. 5. 65 Ergebnisse - Mammakarzinome (n=14): Sechs Brusttumoren enthielten sehr wenig, 5 mäßig viel und 3 sehr viel Typ I – Kollagen. - Melanome (n=10): Vier Melanome waren negativ und 5 stark positiv. Ein Melanom hatte einen mittleren Kollagenanteil. - Pankreaskarzinome (n=3): Bis auf PAXF 1657 waren die Pankreaskarzinome stark kollagenhaltig. - Prostatakarzinome (n=4): Von den 4 untersuchten Adenokarzinomen waren zwei negativ und zwei positiv. - Sarkome (n=2): SXF 1301 wurde mit 1+ bewertet, SXF 1649 mit 0+. - Hodentumoren (n=2): TXF 404 wurde mit 1+ bewertet, TXF 881 mit 1,5+. - Zervixkarzinome (n=2): CEXF 633 erhielt die 3+, CEXF 610 0+. • Xenografts mit einem niedrigen Kollagenanteil: - Plattenepithelkarzinome der Lunge (n=8): Bis auf LXFE 856 wurde ein mittleres bis schwaches Vorkommen von Typ I – Kollagen beobachtet. - Kleinzellige Bronchialkarzinome (n=5): Bis auf LXFS 538 enthielten die kleinzelligen Bronchialkarzinome wenig Typ I – Kollagen. - Ovarialkarzinome (n=8): Insgesamt waren die Ovarialkarzinome kollagenarm. OVXF 1353 wies jedoch viele Typ I – Kollagenfasern auf. - Nierenzellkarzinome (n=9): Der Kollagenanteil war in 2 Neoplasien hoch, in 2 mittelgradig und in 5 sehr niedrig. • Xenografts mit einem sehr niedrigen Kollagenanteil: - Großzellige Bronchialkarzinome (n=6): Alle 6 großzelligen Bronchialkarzinome enthielten vergleichsweise wenig Typ I – Kollagen (Abb. 5.13). - Pleuramesotheliome (n=7): Bis auf PXF 1652 enthielten keine Pleuramesotheliome Typ I – Kollagen. • Humane Normalgewebe: - Haut: Das Corium wurde mit 3+ bewertet. Die Epidermis enthielt kein Kollagen. 5. 66 Ergebnisse 5.1.7 ß1-Integrin-Expression Insgesamt wurden 152 Tumoren in 6 Mikroarrays mit anti-ß1-Integrin Antikörpern gefärbt. Der Antikörper war gegen die ß1-Untereinheit der Integrindimeren gerichtet. Der subzellulären Lokalisation des Integrins entsprechend wurde eine membranständige Färbung beobachtet. Die Auswertung orientierte sich in erster Linie an den Anteil positiver Zellen im Gewebe. Einer Wertung von 3+ entsprach einer Färbung aller Zellen, 2+ einer Färbung von mindestens zwei Dritteln der Zellen, 1+ von mindestens einem Drittel (Abb. 5.14). Von den 152 Tumoren zeigten 80% keine ß1-Integrin-Expression. 21 Xenografts waren hoch positiv, was 15% des Gesamtkollektivs entspricht. Der Mittelwert der Färbungen lag bei 0,44+. Endothelzellen und Stroma der Maus zeigten keine Färbung . A B C D Abb. 5.14: Immunhistochemischer Nachweis von ß1-Integrin im Gewebemikroarray. A: Das Zervixkarzinom CEXF 610 wurde mit 3+ bewertet. Die Färbung der Zellmembranen ist bei starker Vergrößerung gut zu erkennen. B: Adenokarzinom der Lunge LXFA 629, 2+. C: Melanom MEXF 462, 3+. D: Pankreaskarzinom PAXF 546, 3+. Vergrößerung: A x1000, B-E x400. 5. 67 Ergebnisse 5.1.7.1 Tumortypspezifische ß1-Integrin-Expression ß1-Integrin kam in drei Tumortypen gehäuft vor: In Pleuramesotheliomen (43% positiv), Nierenzellkarzinomen (33% positiv) und Adenokarzinomen der Lunge (29% positiv). In den Kolonkarzinomen, Magenkarzinomen, kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Mammakarzinomen, Ovarialkarzinomen und Sarkomen war kein ß1-Integrin nachweisbar, in den übrigen Tumortypen nur vereinzelt. • Xenografts mit einer hohen ß1-Integrin-Expression: - Adenokarzinome der Lunge (n=14): LXFA 677 war stark positiv (3+), LXFA 629 mäßig positiv. In 3 weiteren Tumoren wurde ein schwaches Vorkommen von Integrin beobachtet. 9 Tumoren waren negativ (Abb. 5.14). - Pankreaskarzinome (n=3): Bis auf PAXF 736 zeigten die Pankreaskarzinome eine starke ß1-Integrin-Expression (Abb. 5.14). - Nierenzellkarzinome (n=10): Von den 10 untersuchten Nierenzellkarzinomen zeigten 3 eine hohe, 2 eine mäßige und 5 keine ß1Integrin-Expression. - Pleuramesotheliome (n=7): PXF 1118 und 1741 waren stark positiv (3+), PXF 1752 zeigte einen mäßigen Gehalt an Integrin. Die übrigen 4 Mesotheliome waren negativ. - Zervixkarzinome (n=2): In beiden Zervixkarzinomen wurden große Mengen ß1-Integrin nachgewiesen (Abb. 5.14). • Xenografts mit einer mittleren ß1-Integrin-Expression: - Urothelkarzinome (n=7): BXF 1036 und 1304 hatten eine hohe, bzw. mittlere ß1-Integrin-Expression. 5 von den 7 Tumoren waren negativ. Melanome (n=14): Zwei Melanome waren stark positiv: MEXF 462 (3+) und 384 (2+). Die übrigen 12 Melanome exprimierten kein ß1-Integrin - Prostatakarzinome (n=5): 4 Adenokarzinome waren negativ, PRXF DU 145 wies einen hohen Gehalt an Integrin auf (2,5+). - Hodentumoren (n=4): TXF 1207 war stark positiv. 2 Tumoren waren mäßig angefärbt. TXF 593 zeigte keine ß1-Integrin-Expression. 5. 68 Ergebnisse • Xenografts ohne oder mit geringer ß1-Integrin-Expression: - Kolonkarzinome (n=17): Von 17 Kolonkarzinomen zeigte ein einziges eine geringe ß1-Integrin-Expression. Alle anderen Malignome waren negativ. - Tumoren des ZNS (n=3): Alle drei Neoplasien waren negativ. - Magenkarzinome (n=6): Keines der untersuchten Gewebe zeigte eine ß1Integrin-Expression. - Kopf- und Halskarzinome (n=1): HNXF 908 zeigte keine Anfärbung. - Plattenepithelkarzinome der Lunge (n=9): Bis auf LXFE 856 wurde in keinem Plattenepithelkarzinom der Lunge ß1-Integrin beobachtet. - Großzellige Bronchialkarzinome (n=6): LXFL H460 zeigte eine mäßige ß1Integrin-Expression, drei weitere großzelligen Bronchialkarzinome waren schwach positiv. In den anderen Neoplasien wurde mit diesem Alle kleinzelligen Nachweisverfahren kein ß1-Integrin beobachtet. - Kleinzellige Bronchialkarzinome (n=5): Bronchialkarzinome waren negativ. - Mammakarzinome (n=15): Vierzehn Mammakarzinome waren negativ. Allein MAXF 1384 wies einen hohen Gehalt an Integrin auf (2+). - Ovarialkarzinome (n=7) zeigten hier kein ß1-Integrin. - Sarkome (n=6): In keinem der 6 Sarkomen konnte ß1-Integrin nachgewiesen werden. • Humane Normalgewebe: ß1-Integrin konnte weder im Nierengewebe (Tubuli, Glomeruli), noch in der Haut nachgewiesen werden. 5.2 Korrelationen der gemessenen Targetexpressionen Die Mittelwerte der Expression von VEGF, Cathepsin B, MMP-2, Typ I – Kollagen und ß1-Integrin wurden untereinander auf Korrelationen geprüft. Da die Stichproben eine stetige Verteilung aufwiesen und nicht normalverteilt waren, wurde der Spearmansche Rangkorrelationskoeffizient rs errechnet. rs kann Werte zwischen –1 und 1 annehmen. Ein Wert von 0 sagt aus, daß kein Zusammenhang zwischen den Variablen besteht. Werte von 1 oder –1 bedeuten, daß die eine Variable vollständig durch die andere über eine lineare Funktion vorhergesagt werden kann. 5. 69 Ergebnisse Es wurden keine Korrelationen über 0,5 oder unter –0,5 gefunden. 5.3 Korrelationen zwischen Targetexpression und Tumorpathologie Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen der Freiburger Xenograft Sammlung konnten mit bekannten klinisch-pathologischen Daten der Tumoren / Patienten verglichen werden. Folgende Informationen waren verfügbar: • Differenzierungsgrad des Tumors: Grade 1 – 4 • Staging (TNM) • Ursprung des Xenografts: Primärtumor, Organmetastase, Lymphknoten, Rezidiv • Überlebenszeit des Patienten (postoperativ, in Tagen) Diese Daten wurden mit der Expression von VEGF, Cathepsin B, MMP-2, Typ I – Kollagen und ß1-Integrin auf mögliche Zusammenhänge hin untersucht. In drei Fällen konnte ein Zusammenhang im untersuchten Material nachgewiesen werden. 5.3.1 Tumordifferenzierung und Expression von MMP-2 Die MMP-2-Expression von differenzierten (Grade 1-3) und undifferenzierten Tumoren wurde verglichen. Der Median der differenzierten Tumoren lag mit 1,5+ deutlich über dem der undifferenzierten Tumoren von 0,5+. Zur Auswertung der Daten wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet, da zwei unabhängige, nicht normalverteilte Stichproben mit stetigem Merkmal (der Differenzierungsgrad) vorlagen. Die abhängige Variable ist die MMP-2-Expression, die Gruppenzugehörigkeit wird durch das Grading definiert (1-3 versus 4): n1: Expressionswerte der differenzierten Tumoren mit einer Verteilungsfunktion F1 (n=60). n2: Expressionswerte der undifferenzierten Tumoren mit einer Verteilungsfunktion F2 (n=25). Testhypothesen: H0: F1 = F2, die MMP-2-Expression ist in beiden Gruppen gleich verteilt und unabhängig von der Tumordifferenzierung. H1: F1 ≠ F2, die MMP-2-Expression unterscheidet sich in beiden Gruppen signifikant. 5. Ergebnisse 70 Nach dem Vergleich der Rangsummen wird H0 verworfen. Es besteht ein signifikanter unterschied zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 (p<0,05). Die MMP-2-Expression ist damit in den differenzierten Tumoren signifikant höher als in den undifferenzierten Tumoren (Abb. 5.16, folgende Seite). 5.3.2 Tumordifferenzierung und Gehalt an Typ I – Kollagen Tumoren mit einem Grade 1 bis 3 wurden undifferenzierte Tumoren (Grade 4) hinsichtlich ihres Typ I – Kollagenanteils gegenübergestellt. Der Mittelwert des Kollagenanteils war in den differenzierten Tumoren höher als in den undifferenzierten (1,3+ versus 0,7+). Zur Auswertung der Daten wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. Die abhängige Variable ist der Typ I – Kollagenanteil, die Gruppenzugehörigkeit wird durch das Grading definiert (1-3 versus 4): n1: Färbeergebnisse der differenzierten Tumoren mit einer Verteilungsfunktion F1 (n=53). n2: Färbeergebnisse der undifferenzierten Tumoren mit einer Verteilungsfunktion F2 (n=16). Testhypothesen: H0: F1 = F2, Typ I – Kollagen ist in beiden Gruppen gleich verteilt und unabhängig von der Tumordifferenzierung. H1: F1 ≠ F2, der Gehalt an Typ I – Kollagen unterscheidet sich in beiden Gruppen signifikant. Nach dem Vergleich der Rangsummen wird H0 verworfen. Es besteht ein signifikanter unterschied zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 (p<0,05). Der Anteil von Typ I – Kollagen ist damit in den differenzierten Tumoren signifikant höher als in den undifferenzierten Tumoren (Abb. 5.15). Faerbeintensitaet 5. 71 Ergebnisse 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 Grade 1-3 Grade 4 Grade 1-3 MMP-2 Expression Grade 4 Typ I - Kollagen Vorkommen Abb. 5.15: Vergleich des Gehalts an MMP-2 (blau) und Typ I – Kollagen (rot) in undifferenzierten und differenzierten Tumoren. Die unterschiedliche Werteverteilung wird graphisch durch die Mediane und Quartile dargestellt. Es ist deutlich erkennbar, daß in besser differenzierten Xenografts (Grade 1-3) die Expression von MMP-2- und Typ I – Kollagen höher war als in den undifferenzierten Neoplasien. 5.3.3 Targetexpression, Ursprung des Xenografts und Staging Im Rahmen dieser Arbeit konnte kein signifikanter Unterschied in der TargetExpression von Xenografts hinsichtlich ihrer Herkunft (Primärtumor, Organmetastase, Lymphknotenmetastase, Rezidiv) oder des klinischen Stagings (TNM-Klassifikation) errechnet werden. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Xenografts, die von Metastasen oder Rezidiven abgeleitet wurden, eine signifikant höhere Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 aufwiesen als die Primärtumoren. Dies könnte auf ein aggressiveres Wachstumsverhalten der Filiae deuten. 5.3.4 ß1-Integrin-Expression und Prognose der Patienten Der Zusammenhang zwischen ß1-Integrin-Expression und der Lebenserwartung wurde für 94 Krebspatienten untersucht. Die Daten wurden nach der ß1-Integrin-Expression gruppiert: Eine Integrinexpression über dem 75% Quartil (1,5+) der Grundgesamtheit der Färbeergebnisse wurde a priori als hochreguliert definiert. Ein Färbeergebnis über 1,5+ entsprach dem Vorliegen von ß1-Integrin in der Mehrzahl der Zellen eines Xenografts. Tumoren mit einer Proteinexpression unter dem 75% Quartil wurden als ß1-Integrin-negative Gruppe zusammengefaßt. Die abhängige Variable ist die postoperative Überlebenszeit des Patienten. Grade, Stage und Alter wurden als intervenierende Variablen ausgeschlossen. 5. 72 Ergebnisse n1: Überlebenszeit der Patienten, die an einem Tumor mit hoher ß1-IntegrinExpression erkrankt waren (n=14), mit einer Verteilungsfunktion F1. n2: Überlebenszeit der Patienten, die an einem Tumor mit niedriger ß1-IntegrinExpression erkrankt waren (n=80), mit einer Verteilungsfunktion F2. Testhypothesen: H0: F1 = F2, die Überlebenszeit ist in beiden Gruppen gleich verteilt und unabhängig von der ß1-Integrin-Expression. H1: F1 ≠ F2, die Überlebenszeit unterscheidet sich in beiden Gruppen signifikant. Nach Anwendung des Log-Rank Tests nach Mantel-Haentzel wird H0 verworfen (p<0,001). Weitere Untersuchungen mit unterschiedlicher Gewichtung der frühen und späten Sterbefälle ergaben das gleiche Ergebnis (Log-Rank Tests nach Breslow und nach Tarone-Ware, jeweils p<0,001). Die postoperative Überlebenszeit der Patienten hängt damit im untersuchten Kollektiv signifikant von der ß1-Integrin-Expression ab (Abb. 5.16). 1,0 Anteil lebender Patienten Integrin Expression 0,8 negativ positiv 0,6 0,4 0,2 0,0 0 00 10 00 20 00 30 00 40 00 50 00 60 00 70 00 80 Überleben (Tage) Abb. 5.16: Darstellung der Überlebenszeit der Patienten in einer Kaplan-Meier Kurve. Die Kurven beschreiben die Überlebenszeit der Patienten versus Zeit. Patienten, die an einem Tumor mit hoher ß1-Integrin-Expression litten (blaue Kurve), zeigten eine signifikante kürzere postoperative Überlebensdauer als die Patienten mit Integrin-negativen Tumoren. 5. Ergebnisse 73 5.4 Testung eines therapeutischen anti-VEGF Antikörpers 5.4.1 HuMV833 HuMV833 ist ein therapeutischer, humanisierter anti-VEGF Antikörper, der sich in der klinischen Entwicklungsphase befindet. Die Wirksamkeit von HuMV833 wurde einzeln und in Kombination mit Gemcitabin an den Pankreaskarzinomen PAXF 546 und PAXF 736 geprüft. Die Auswahl der beiden Modelle richtete sich nach deren weitgehender Therapieresistenz und nach der prognostischen Bedeutung von VEGF im Pankreaskarzinom [83]. PAXF 546 wies einen angiogenen Phänotyp mit hoher VEGF-Expression und hoher Gefäßdichte auf, während in PAXF 736 niedrige VEGF-Spiegel und eine geringe Gefäßdichte vorlagen. Ein solches Expressionsmuster konnte immunhistochemisch bestätigt werden: Der Mittelwert der VEGF-Expression von PAXF 546 lag mit 2+ deutlich über dem von PAXF 736, der 0+ betrug (Abb. 5.17). Nach der Testung des antiangiogenen Antikörpers wurde das Ansprechen der Tumoren gemessen und mittels Gewebemikroarrays die Modulation der VEGFExpression evaluiert. Abb. 5.17: In PAXF 546 (links) wurde eine bedeutende VEGF-Expression im Gewebemikroarray nachgewiesen (2+). In PAXF 736 wurde fast kein VEGF erkannt. Vergrößerung x160. Das Gewicht der PAXF 546 - tragenden Mäuse nahm in der Kontrollgruppe um 7% ab, was als Folge der kachektischen Wirkung von PAXF 546 regelmäßig gefunden wurde. Ein solcher Gewichtsverlust trat in den therapierten Mäusen als Zeichen der wirksamen Therapie nicht auf. 5. 74 Ergebnisse 5.4.1.1 PAXF 546 Die Monotherapie mit HuMV833 bewirkte eine Tumorhemmung auf 36% der Kontrolle beim PAXF 546, während Gemcitabin mit 23% geringfügig wirksamer war. Der T/C Wert sagt aus, daß das mediane Volumen der behandelten Xenografts 36%, bzw. 23% des medianen Volumens der Kontrolltumoren betrug (Kapitel 4.8.1). Eine Tumorregression trat nicht ein. Bei beiden Substanzen wurde eine absolute Wachstumsverzögerung von 2 Tagen beobachtet. Eine Kombinationstherapie von HuMV833 und Gemcitabin wirkte synergistisch und zeigte eine Tumorstase. Das Therapieschema erreichte damit den stärksten antitumoralen Effekt: Der T/C Wert sank auf 10% und die absolute Wachstumsverzögerung betrug 19 Tage. Darüber hinaus wurde die Tumorkachexie aufgehoben: Nach 4 Wochen erreichte der mediane Gewichtsverlust in der Kontrollgruppe 7%, in den behandelten Gruppen wurde dagegen eine Gewichtszunahme beobachtet. Wegen hoher Tumorlast (Tumordurchmesser > 18 mm ) schied am Tag 28 die Kontrollgruppe aus dem Versuch. Die Kurven in Abbildung 5.18 vergleichen das Wachstum der Kontrolltumoren und der mit behandelten Xenografts. Die Kombinationsbehandlung mit HuMV833 und Gemcitabin bewirkte innerhalb der ersten 10 Tagen eine Tumorregression auf 91% Medianes relatives Tumorvolumen (%) des Initialvolumens, die jedoch im weiteren Verlauf nachließ. 2500 Kontrolle HuMV833 HuMV833 + Gem 2000 1500 1000 500 0 0/11 3 7 10 14 17 Zeit [Tage] 21 24 28 35 Abb. 5.18: Die schwarze Kurve stellt das relative, mediane Tumorvolumen der Kontrollgruppe dar, die blaue und rote Kurven das Volumen der mit HuMV833, resp. HuMV833 und Gemcitabin therapierten Tumoren. Nach Beendigung der Therapie betrug der T/C Wert 36% (Monotherapie), bzw. 10% (Kombinationstherapie). 5. 75 Ergebnisse 5.4.1.2 PAXF 736 Das schwach vaskularisierte Pankreaskarzinom PAXF 736 sprach auf die antiangiogene Therapie insgesamt weniger gut an als PAXF 546. Gemcitabin zeigte keine Wirksamkeit (T/C=60%). Gleiches traf für den Effekt von HuMV833 zu (T/C=83%). Durch die Kombinationstherapie wurde lediglich eine grenzwertige, tumorinhibierende Wirkung erzielt (T/C=50%, absolute Wachstumsverlangsamung 1 Tag), die jedoch im Vergleich zu PAXF 546 merklich geringer war. Dementsprechend liegen in Abbildung 5.19 die Kurven der Therapiegruppen eng beieinander. Medianes Relatives Tumorvolumen (%) 9 00 K o n tro lle H u M V 8 3 3 1 0 0 g /M a u s 7 00 5 00 3 00 1 00 0 /1 0 3 7 10 14 17 21 24 28 Z e it [T a g e ] Abb. 5.19: Die Tumorvolumina in der Kontrollgruppe und in der Therapiegruppe unterscheiden sich nicht, eine antitumorale Wirkung wird nicht beobachtet (T/C Wert = 83%). In beiden Pankreastumoren war die Kombinationstherapie den Monotherapien überlegen. Insbesondere in PAXF 546 zeigte sie eine beachtliche Wirkung auf das Tumorwachstum. Die HuMV833-Therapie erwies sich im hochangiogenen Pankreaskarzinom PAXF 546 deutlich wirksamer als im VEGF-armen Tumor PAXF 736. 5. 76 Ergebnisse 5.4.2 Untersuchung der posttherapeutischen Targetmodulation in PAXF 546 Nach Beendigung des Therapieversuchs wurden je drei repräsentative Xenografts pro Versuchsgruppe in Paraffin eingebettet. Die Tumorproben wurden auf einem Gewebemikroarray zusammengestellt. Anhand dieses Arrays konnte die VEGFExpression in den Tumoren aller Versuchsgruppen parallel posttherapeutisch untersucht werden. Abbildung 5.20 zeigt einen Ausschnitt des gefärbten Arrays. PAXF 546 Kontrollen PAXF 546 HuMV833 - Therapie Abb. 5.20: Es sind 10 Gewebebiopsien von PAXF 546 abgebildet, welche immunhistochemisch gegen VEGF gefärbt wurden. In der obersten Reihe sind die Vehikel behandelten Kontrolltumoren angeordnet, in der unteren die mit HuMV833 therapierten Xenografts. Auch bei schwacher Vergrößerung kann die stärkere Färbung der Kontrolltumoren (höhere VEGF-Spiegel) erkannt werden. Die dunkelbraunen Areale sind Nekrosen (Pfeil). Sie traten in den behandelten Xenografts vermehrt auf. Vergrößerung x63. Bei einer stärkeren Vergrößerung war es möglich, die VEGF-Färbung genauer zu differenzieren. Während die Kontrolltumoren hohe VEGF-Spiegel aufwiesen, wurde in den behandelten Xenografts eine Verringerung der VEGF-Expression beobachtet (Abb. 5.21). 5. 77 Ergebnisse A C B * D E Abb. 5.21: A: Im unbehandelten Pankreaskarzinom PAXF 546 konnte eine hohe VEGF-Expression nachgewiesen werden. B und C: In den mit HuMV833 behandelten Tumoren fiel die VEGF-Färbung deutlich schwächer aus als in der Kontrollgruppe. D und E: Xenografts aus der Gruppe der Kombinationstherapie. Die VEGF-Spiegel sind niedrig. Zusätzlich fallen hydropische Tumorzellen auf (Markierung *). Vergrößerung: A, B, D: x160; C, E: x400. Die fotographierten Gewebe sind auf dem gleichen Objektträger enthalten. 5. 78 Ergebnisse Anhand des Gewebemikroarrays konnten VEGF-Spiegel parallel und unter gleichen Bedingungen in Tumoren unterschiedlicher Therapiegruppen bestimmt werden. Dieser direkte Vergleich der VEGF-Expression ermöglichte eine zuverlässige Aussage über die Hemmung des therapeutischen Targets. Nach der Therapie mit einem anti-VEGF Antikörper war die Verminderung des Targets VEGF deutlich erkennbar. 5.4.3 Untersuchung zur Auswirkungen der HuMV833-Therapie auf die Zellproliferation und die Morphologie von PAXF 546 Die Auswirkung der antiangiogenen Therapie auf die Zellproliferation wurde anhand des Proliferationsmarkers Ki-67 untersucht. Die stärkste Veränderung des Zellwachstums wurde nach der Kombinationstherapie mit HuMV833 und Gemcitabin beobachtet: Während die Kontrolltumoren ein homogenes Zellwachstum zeigten (Abb. 5.22 C), exprimierten in den behandelten Neoplasien nur jene Zellen, die in unmittelbarer Nähe zu großen Blutgefäßen lagen Ki-67 (Abb. 5.22 A). Am Rand dieser vitalen Zellinseln konnten Zellen mit einem erweiterten, hohl wirkenden zytoplasmatischen Raum erkannt werden, deren Morphologie auf eine reversible Zellschädigung mit hydropischer Schwellung deutete (Abb. 5.22 B). Ursächlich läßt sich eine hypoxische Zellschädigung durch die antiangiogene Therapie vermuten. Noch weiter von den Blutgefäßen entfernt wurde ausschließlich nekrotisches Tumorgewebe erkannt. Die korrekte Identifizierung der Blutgefäße wurde mittels einer Lektinfärbung (Bandeira simplicifolia) gewährleistet, die eine spezifische Affinität für murines Endothel besitzt (Abb. 5.23) [3]. A * x Abb. 5.22: A und B: Es wurde Ki-67 in den behandelten PAXF 546 Tumoren untersucht. Ki-67 konnte in den Kernen der gefäßnahen Tumorzellen nachgewiesen werden (Pfeil). 5. 79 Ergebnisse B * * Weiter von den Blutgefäßen entfernt wurden hydropisch geschwollene Tumorzellen erkannt, die kein Ki-67 exprimierten (Markierung *).Sie bildeten eine Übergangszone zwischen den proliferierenden Zellen und Nekrosen (Markierung x in A). Vergrößerung: A x160, B x400. C C: In den Vehikel behandelten Pankreaskarzinomen fand sich ein gleichmäßigeres Expressionsmuster von Ki-67. Großflächiges Auftreten (prä-) nekrotischer Zellen wurde im Gegensatz zu den behandelten Xenografts nicht beobachtet. Vergrößerung x400. * Abb. 5.23: Lektinfärbung des murinen Endothels mit Bandeira simplicifolia. Ein dünner, brauner Streifen, der zwischen Tumorzellen und ungefärbten Erythrozyten (Markierung *) liegt, ist oben links erkennbar. Vergrößerung x160. 5. 80 Ergebnisse 5.5 Testung eines niedermolekularen Angiogenese-Inhibitors 5.5.1 Halofuginon Halofuginon ist ein niedermolekulares Quinazolinonalkaloid mit einer dokumentierten inhibitorischen Wirkung auf die Synthese von Typ I – Kollagen und MMP-2 (Abb. 5.24) [25]. Wegen dieser antiangiogenen Eigenschaften wird aktuell sein Nutzen klinisch getestet. Abb. 5.24: Strukturformel des Halofuginon-Moleküls. Die Wirksamkeit von Halofuginon wurde in mehreren Dosierungen bei zwei Tumoren geprüft, dem Nierenzellkarzinom RXF 944LX (2,5 µg Halofuginon / Maus / Tag) und dem malignen Melanom MEXF 276 (2,5 und 5µg Halofuginon). RXF 944LX wurde als Zellsuspension subkapsulär in die Niere injiziert. Durch die Verwendung eines orthotop wachsenden Tumormodells konnte die Tumormetastasierung posttherapeutisch untersucht werden. MEXF 276 wurde subkutan implantiert. In unabhängigen Experimenten wurden im Nierenzellkarzinom und im Melanom mäßig hohe Typ I – Kollagen – Vorkommen beobachtet (1,33 ±0,6, bzw. 1,75 ±0,25). Die MMP-2-Expression beider unbehandelten Xenografts ergab immunhistochemisch sehr niedrige Werte (0,0 ±0,0 , bzw. 0,4 ±0,4). Sie eignete sich daher a priori nicht als molekularer Marker der Halofuginon-Wirkung. 5.5.2 Therapie des Nierenzellkarzinoms RXF 944LX Posttherapeutisch konnte das Gewicht der orthotop wachsenden Nierenzellkarzinome gemessen werden. Die unbehandelten Xenografts in der Nierenkapsel wogen durchschnittlich dreimal so viel wie die mit 2,5 µg Halofuginon therapierten Tumoren (T/C = 31%). Die Halofuginon-Therapie bewirkte damit eine Tumorinhibition. In Abbildung 5.25 ist das Gewicht der Karzinome inklusive der Nieren dargestellt. Darüber hinaus zeigte die Sectio der Mäuse, daß in den Kontrollgruppen die Nierenzellkarzinome in das Pankreas (3/3 Mäuse) und in die Lungen metastasiert 5. 81 Ergebnisse hatten (2/3 Mäuse). In den therapierten Mäusen wurde solch eine Metastasierung nicht beobachtet. Durch die Halofuginon Behandlung konnte eine Inhibition des Tumorwachstums und eine Suppression der Metastasierung erzielt werden. Wirkung von Halofuginon auf das Gewicht der Tumoren und Nieren in orthotop wachsenden RXF 944LX Mittleres Gewicht [g] 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrolle HF 2.5 µg/Maus/d Abb. 5.25: Wirkung von Halofuginon auf das orthotop wachsende Nierenzellkarzinom RXF 944LX. Das durchschnittliche Gewicht der befallenen Tumornieren ist in der Kontrollgruppe dreifach so hoch wie in den therapierten Mäusen. Die Typ I – Kollagen – Synthese in RXF 944LX wurde posttherapeutisch in einem Gewebemikroarray gemessen. Während in den Kontrolltumoren deutliche Kollagenstränge das Gewebe durchzogen, wurde in den behandelten Xenografts kein Bindegewebe beobachtet (Abb. 5.26-27). +++ C HF HF, 2.5 µg: + Abb. 5.26: Nachweis von Typ I – Kollagen im Nierenzellkarzinom RXF 944LX. Links, ein Ausschnitt des gefärbten Arrays (C: Kontrollen; HF: 2,5 µg Halofuginon / Maus / Tag). Oben rechts: Färbung von Typ – I Kollagen in einem 5. 82 Ergebnisse Vehikelbehandelten Tumor. Unten rechts: Färbung von Kollagen in einem behandelten Xenograft. Vergrößerung: links x63, rechts x90. Färbeintensität Wirkung von Halofuginon auf die Typ I - Kollagen Expression im orthotop wachsenden, humanen Nierenzellkarzinom RXF 944LX 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrolle Behandlung HF 2.5 µg/Maus Abb. 5.27: Wirkung von Halofuginon auf die Typ I – Kollagen – Synthese in orthotop wachsenden Nierenzellkarzinomen. Bei einer Dosierung von 2,5 µg / Maus / Tag bewirkte Halofuginon eine signifikante Inhibition der Kollagensynthese (p<0,004). Die Zellanordnung war jedoch sowohl in den unbehandelten, als auch in den behandelten Xenografts homogen. Eine mit der Halofuginon-Wirkung auf MEXF 276 (s.u.) vergleichbaren Veränderung der Gewebemorphologie wurde nicht festgestellt. 5.5.3 Therapie des Melanoms MEXF 276 Bei der Dosierung von 2,5 µg Halofuginon / Maus / Tag wurde die stärkste Wirkung beobachtet: Das subkutan wachsende Melanom 276 sprach auf diese Therapie mit einem T/C-Wert von 33% im Sinne einer Tumorinhibition an (Abb. 5.28). Neun von zehn Mäusen überlebten die Behandlung. Bei der doppelten Dosis von 5 µg / Maus / Tag starben jedoch fünf von neun Mäusen an den Nebenwirkungen der Substanz. Der Effekt von Halofuginon galt in diesem Bereich als toxisch und konnte nicht vollständig evaluiert werden 5. 83 Ergebnisse Mittleres Tumorvolumen [mm3] 1200 Vehicle Control 1000 HF 2.5 µg/mouse i.p. for 3 weeks 800 600 400 200 0 21/0 3 7 10 14 17 21 Zeit nach Randomisierung [d] Abb. 5.28: Wirkung von 2,5 µg Halofuginon / Maus / Tag auf das Wachstum von MEXF 276. Die behandelten Tumoren erreichten nach 3 Wochen nur ein Drittel der Größe der Kontrolltumoren. Posttherapeutisch wurde in einem Gewebemikroarray der Gehalt an Typ I – Kollagen und des Proliferationsmarkers Ki-67 gemessen. Von jeder Therapiegruppe wurden neun Biopsien verwendet. Wie bei dem Nierenzellkarzinom wurde eine Reduktion der Kollagensynthese beobachtet, die jedoch im Melanom schwächer ausgeprägt war. Die Inhibition der Kollagensynthese in den drei Therapiegruppen ist in Abbildung 5.29 statistisch in einem Balkendiagramm aufgeführt, während Abbildungen 5.30-32 den parallelen immunhistochemischen Nachweis der Kollagenfasern fotographisch darstellt. In den unbehandelten Xenografts waren die Tumorzellen von einem dichten Kollagennetz umgeben, welches in den behandelten Karzinomen deutlich schwächer ausgeprägt war. 5. 84 Ergebnisse Typ I - Kollagen Faerbung in MEXF 276 Faerbeintensitaet 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrolle 5 µg/Maus 2.5 µg/Maus Behandlung Abb. 5.29: Mittlerer Gehalt an Typ I – Kollagen in den unbehandelten (links) und behandelten (Mitte und rechts) Melanomen. Die stärkste Inhibition wurde in der höchsten (toxischen) Dosierung erreicht. Eine schwächere Suppression der Kollagensynthese wurde bei niedriger Dosierung festgestellt. Abb. 5.30: MEXF 276. In den unbehandelten Melanomen wurden zwischen den Tumorzellen zahlreiche Typ I – Kollagenfasern nachgewiesen. Vergrößerung x300. Abb. 5.31: MEXF 276. Die Behandlung mit 5 µg Halofuginon/Maus/Tag bewirkte eine Abschwächung der murinen Kollagenexpression. Die Bindegewebsfasern sind rarefiziert. Vergrößerung x300. 5. 85 Ergebnisse Abb. 5.32: MEXF 276. Therapie mit 2,5 µg Halofuginon/Maus/Tag. Die Färbung fiel in diesen Biopsien deutlich heller als in den Kontrolltumoren aus, was auf eine Reduktion der Kollagensynthese schließen ließ. Unten links ist der Tumor nekrotisch. Vergrößerung x300. Zusätzlich zur Kollagensynthese wurde die Tumorproliferation untersucht. Zu diesem Zweck wurde der Gewebemikroarray der behandelten Xenografts und der Kontrollen gegen Ki-67 gefärbt. Die durchschnittliche Ki-67 Expression war in den unbehandelten Melanomen höher als in den mit Halofuginon therapierten Xenografts: Der Mittelwert der Kontrollgruppe lag mit 2,3+ über dem des behandelten Tumorkollektivs (1,6+) (Abb. 5.33). Ki-67 Faerbung von MEXF 276 4 Faerbeintensitaet 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrolle 2.5 µg/Maus Behandlung mit Halofuginon Abb. 5.33: Ki-67 Nachweis in unbehandelten (linker Balken) und behandelten (rechter Balken) Melanomen. Durch die HuMV833 Therapie konnte eine mäßige Hemmung der Zellproliferation erzielt werden. Halofuginon bewirkte eine ähnliche Veränderung des mikroskopischen Gewebeaufbaus des Xenografts wie HuMV833. In der Hämatoxylin-Eosin Färbung waren bei schwacher Vergrößerung runde, vitale Gewebezonen um kleine, zentral gelegene Blutgefäße erkennbar, die von ausgedehnten nekrotischen Arealen umgeben waren (Abb. 5.34). 5. 86 Ergebnisse N N Abb. 5.34: Hämatoxylin-Eosin Färbung von MEXF 276 nach dreiwöchiger Halofuginon-Behandlung. Dunkle, zirkuläre Areale um kleine Blutgefäße enthalten vitale Melanomzellen. Diese sind von Nekrose umgeben (Markierung N). Vergrößerung x160 Abb. 5.35: Hämatoxylin-Eosin Färbung eines unbehandelten Melanoms MEXF 276. Die vitalen Zellen sind gleichmäßig angeordnet, es sind mehrere Blutgefäße zu erkennen.Vergrößerung x200 5. 87 Ergebnisse 5.5.4 Verwendung von Gewebemikroarrays zur Target-Validierung Die immunhistochemische Analyse von Gewebemikroarrays ermöglichte die Quantifizierung der Expression therapeutischer Targets in der Freiburger Xenograft Sammlung. Anhand von Gewebemikroarrays wurde zum Beispiel festgestellt, daß PAXF 546 höhere VEGF-Spiegel enthielt als PAXF 736. Während der in vivo Prüfung des therapeutischen VEGF-Antikörpers HuMV833 konnte die Chemosensitivität von Karzinomen mit unterschiedlicher TargetExpression verglichen werden. Das Ansprechen von PAXF 546 auf die antiangiogene Behandlung und die Therapieresistenz von PAXF 736 bestätigten die Bedeutung der Target-Expression für den Therapieerfolg. Nach den in vivo Versuchen war es darüber hinaus möglich, Biopsien der behandelten und unbehandelten Karzinome parallel, unter identischen Versuchsbedingungen zu untersuchen. So konnte posttherapeutisch die Modulation der Target-Expression erkannt werden: Immunhistochemisch wurde zum Beispiel nach der Halofuginon Therapie in den behandelten Xenografts eine niedrigere Expression von Typ I – Kollagen gefunden als in den Kontrolltumoren. Das selektive Ansprechen Target-abhängiger Tumoren auf eine rationelle Therapie und die Suppression des Targets bestätigten die molekularen Wirkhypothese. Schließlich erlaubte der Vergleich der Targetmodulation mit der Wachstumsinhibition des Tumors (T/C-Werte) die experimentelle Validierung des Targets. 5. 88 Ergebnisse 5.6 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Zellinienarrays 5.6.1 Anwendung des Zellinienmikroarrays Weil Aussagen zur Proteinexpression eines Xenografts nur begrenzt auf Zellinien der gleichen Neoplasie übertragen werden können, wurde ein Array aus Pellets permanenter Zellinien humaner Tumoren erstellt und immunhistochemisch untersucht. Die 16 unterschiedlichen Zellinien wurden über einen Zeitraum von 6 Monaten kultiviert. Jeweils die Hälfte der Zellen wurde für den Zellinienarray, bzw. für das Western Blotting verwendet. Von jeder Linie wurden zwei bis vier Proben in den Array eingefügt. Hinsichtlich der Qualität der immunhistochemischen Färbung zeigten sich die Zellinienarrays den Xenograftarrays überlegen. Dies kann auf die formalinfreie Einbettmethode und auf die Homogenität der Zellpellets zurückgeführt werden. Die Expression von VEGF, Cathepsin B, MMP-2 und ß1-Integrin wurde mehrfach untersucht. Färbungen von Typ I – Kollagen wurde nicht durchgeführt, da kein Bindegewebe in der Zellkultur zu erwarten war. Für die Auswertung der Zellinienarrays wurde die gleiche Methode verwendet wie für die Xenografts. Die subzelluläre Lokalisation der Proteine entsprach jener in den soliden Tumoren. Statt Mittelwerte werden wegen der kleineren Tumorkollektive die Mediane angegeben. 5.6.2 VEGF-Expression Aussagen über die VEGF-Expression konnten zu 15 Zellinien gemacht werden. PRCL PC3M zeigte mit 2,9+ die stärkste Anfärbung: VEGF lag dicht gepackt in einer granulären Verteilung im Zytoplasma vor. Insgesamt zeigte sich in 3 von 15 Zellinien eine hohe Expression von VEGF: in GXF 251L, MEXF 276L und PRCL PC3M. Sieben Zellinien zeigten eine mäßige VEGF-Expression: CCL HT29, LXFA 526L, LCL H460, LXFL 529L, LXFL 1072L, MEXF 462NL und MEXF 514L. In den 5 anderen Zellinien wurde kein VEGF nachgewiesen. Die mediane VEGF-Expression lag bei 1,3+. Abbildung 5.35 zeigt die Färbungen von 5 Zellinien. 5. 89 Ergebnisse A B C D E Abb. 5.36: Immunhistochemischer Nachweis von VEGF im Zellinienarray. Die granuläre Verteilung von VEGF im Zytoplasma ist deutlich zu erkennen. A: Großzelliges Bronchialkarzinom LXFL 1072L, 1+. B: Großzelliges Bronchialkarzinom LXFL 529L, 1+. C: Melanomzellinie MEXF 276L, 3+. D: Prostatakarzinomzellinie PRCL PC3M, 3+. E: Melanomzellinie MEXF 462NL, 2+. Vergrößerung: A-D x1000, E x400. 5. Ergebnisse 5.6.3 90 Cathepsin B – Expression Die Expression von Cathepsin B konnte in 15 Zellinien gemessen werden. Der Median lag bei 1,5+. Fünf von 15 Zellinien zeigten eine Überexpression von Cathepsin B: MEXF 276L und MEXF 514L wurden mit 3+ bewertet, LCL H460 mit 2,2+, CCL HT 29 und LXFL 529L mit 2+. In 7 Zellinien wurde mäßig viel Cathepsin B beobachtet, in 3 Zellinien fehlte das Enzym. Die Abbildungen der Cathepsin B Färbungen sind vergleichend mit den Ergebnissen des Western Blottings im Kapitel 5.7.3 dargestellt. 5.6.4 MMP-2-Expression Die Expression von MMP-2 wurde in 15 Zellinien untersucht. Die mediane Färbung betrug 1,0+. Vier von 15 Zellinien waren stark positiv, in absteigender Reihenfolge handelte es sich um LXFA 629L, LXFA 526L, GXF 251L und LXFL 529L. Vier Zellinien zeigten eine mittlere MMP-2-Expression: LCL H460, MEXF 276L, MEXF 462NL und RXF 944L. In 7 Zellinien wurde keine MMP-2-Expression beobachtet: CCL HT29, LXFE 66NL, LXFL 1072L, MACL MCF-7, MEXF 514L, PRCL PC3M und RXF 393NL (Abb. 5.36). Bis auf LXFL 529L stimmen alle Ergebnisse mit Daten aus früheren ELISAMessungen überein [59]. 5. 91 Ergebnisse A B C D Abb. 5.37: Darstellung der Färbung von MMP-2 in 4 permanenten Zellinien humaner Tumoren. Positive Zellen weisen ein dunkelbraunes Zytoplasma auf, die Kerne sind durch die Hämatoxylin-Gegenfärbung blau koloriert. A: Prostatakarzinomzellinie PRCL PC3M, 0+. B: Melanomzellinie MEXF 462NL, 1+. C: Großzelliges Bronchialkarzinom LXFL 529L, 2+. D: Adenokarzinom der Lunge LXFA 629L, 3+. Vergrößerung x400. 5.6.5 Expression von ß1-Integrin Die mediane ß1-Integrin-Expression der 15 untersuchten Zellinien lag bei 0,25+. Vier deutlich positive Zellinien konnten identifiziert werden: MEXF 276L, MEXF 462NL, GXF 251L und LXFA 526L. Eine mäßige ß1-Integrin-Expression wurde in 2 Zellinien gefunden: LXFA 629L und LXFL 529L. Analog zu den Xenografts exprimierte die Mehrheit der Zellinien kein ß1-Integrin. Bei diesen 9 Zellinien handelte es sich um CCL HT 29, LXFE 66NL, LCL H460, LXFL 1072L, MAXF 401L, MACL MCF-7, MEXF 514L, PRCL PC3M und RXF 393NL. In Abbildung 5.37 B und C ist die membranständige Färbung von ß1-Integrin deutlich erkennbar. 5. 92 Ergebnisse A B C Abb. 5.38: Immunhistochemischer Nachweis von ß1-Integrin in einem Zellinienarray. A: Mammakarzinomzellinie MACL MCF 7, 0+. B: Melanomzellinie MEXF 276L, 3+. C: Melanomzellinie MEXF 462NL, 3+. Vergrößerung: A x400, B-C x1000. 5.6.6 Vergleich der Proteinexpression der Xenografts und der Zellinien Durch die unterschiedliche Prozessierung der Zellinien und der Xenografts ist ein exakter, quantitativer Vergleich der Proteinexpression durch Immunhistochemie nicht möglich. Um dennoch die Unterschiede zwischen beiden Tumorentitäten abschätzen zu können, wurden die medianen Expressionsprofile der Tumortypen verglichen. Darüber hinaus wurde statistisch untersucht, ob die Stichproben sich signifikant unterschieden (Mann-Whitney-U-Test für unabhängige Stichproben). Die Proteinexpressionen der Xenografts und der Zellinien zeigten in keinem Fall eine signifikante Abweichung. • VEGF: Der VEGF-Gehalt von 14 Zellinien und Xenografts wurde verglichen. Der Median der VEGF-Expression lag in der Gruppe der Zellinien mit 1,3+ 5. 93 Ergebnisse um 0,3 höher als in der Gruppe der Xenografts. Acht von 14 Tumoren zeigten in vivo und in vitro eine analoge VEGF-Expression. Im Gegensatz dazu zeigten die 3 Zellinien mit hohen VEGF-Spiegeln als Xenografts nur eine niedrige oder mäßige Expression des angiogenen Faktors. • Cathepsin B: Es konnten 14 Werte verglichen werden. Der Median der Expression in den Zellinien war nur geringfügig höher als jener in den Xenografts (1,5+ versus 1,4+). LXFL 529 und MEXF 514 zeigten sowohl als Xenograft als auch als Zellinie einen starken Cathepsin B – Gehalt, während LXFL 1072 in keiner Kulturform Cathepsin B exprimierte. • MMP-2: Die MMP-2-Expression von 12 Zellinien und 12 Xenografts wurde verglichen. Während der Median des MMP-2 in den Zellinien 1,0+ betrug, erreichte er in den Xenografts 1,2+. In 3 Fällen stimmte eine starke Enzymexpression in den Zellinien mit der Expression in den Xenografts überein: LXFA 526, GXF 251 und LXFL 529. In 2 Fällen wurden in beiden Tumorformen mittlere und in 2 Fällen niedrige Werte beobachtet. In 5 Tumorentitäten wurde eine Diskrepanz im MMP-2-Gehalt festgestellt. • ß1-Integrin: Die ß1-Integrin-Werte von 14 Tumorentitäten konnten verglichen werden. Beide Mediane waren annähernd gleich gering: 0,25 für die Zellinien, 0,45 für die Xenografts. Als einziger Tumor zeigte MEXF 462 in vitro und in vivo eine maximale Integrin-Expression. Weitere 8 Tumoren zeigten unter beiden Kulturbedingungen (in vivo und in vitro) eine übereinstimmende Enzymexpression. In 2 von 14 Tumorentitäten wurde eine Diskrepanz im der ß1-Integrin-Expression festgestellt. 5. 94 Ergebnisse 5.7 Nachweis von Cathepsin B in Zellinien durch Western Blotting 5.7.1 Auswahl der Zellysate Die Expression von Cathepsin B wurde parallel zur Immunhistochemie durch 4 Western Blots in 15 Zellinien nachgewiesen: CCL HT 29, GXF 251L, LCL H460, LXFA 526L, LXFA 629L, LXFE 66NL, LXFL 529L, LXFL 1072L, MACL MCF-7, MAXF 401L, MEXF 276L, MEXF 462NL, MEXF 514L, PRCL PC3M und RXF 393NL. Ein Molekulargewichtsmarker und 9 Zellysate gleicher Proteinkonzentration wurden pro SDS-Polyacryamid-Gel verwendet (Abb. 5.38). Abb. 5.39: Coomassie Blau Färbung eines SDS-Polyacrylamid-Gels. Die sechste Spur ist ein Molekulargewichtsmarker, die 9 anderen Spuren sind Zellysate. Die Coomassie Färbung wurde nach der partiellen Übertragung der Proteine auf die Nitrozellulosemembran durchgeführt. Sie färbt Proteine unspezifisch blau an und dient als Ladungskontrolle neben der ß-Aktinbestimmung. 5.7.2 Ergebnisse der Western Blots Zum Nachweis von Cathepsin B auf der Nitrozellulosemembran wurde der gleiche Antikörper wie für die Immunhistochemie benutzt. Nachweisbar war sowohl die monomere Form von Cathepsin B, als auch die schwere Untereinheit des Dimers. Die Molekulargewichte lagen respektive bei 32 und 27 kDa. In der Literatur ist die Expression des Cathepsinmonomers und des -dimers beschrieben worden [67,70,127]. Dementsprechend wurden in 4 von 12 positiven Zellinien sowohl die einkettige, als auch die zweikettige Form von Cathepsin B nachgewiesen (GXF 251L, LXFE 66NL, MEXF 276L und MEXF 462NL). In 7 Tumoren konnte nur die 27 kDa Untereinheit des Dimers nachgewiesen werden, während MEXF 514L als einzige Zellinie ausschließlich das 32 kDa Monomer exprimierte. Digitale Aufnahmen der Film- und Nitrozellulosemembranen sind in den Abbildungen 5.39-40 gezeigt. 5. 95 Ergebnisse Die Auswertung der Cathepsin B – Expression erfolgte durch den Vergleich der Breite der positiven Banden (Abb. 5.39-40). Eine sehr starke Expression von Cathepsin B wurde in MEXF 276L, • MEXF 514L und LXFE 66NL nachgewiesen. Eine mäßig hoher Cathepsin B – Spiegel wurde in LXFL 529L und in • MEXF 462NL beobachtet. Eine schwache Cathepsin B – Expression konnte in CCL HT 29, GXF • 251L, MAXF 401L, RXF 393NL, LCL H460, LXFA 526L und PRCL PC3M erkannt werden. In MACL MCF-7, LXFA 629L und LXFL 1072L wurde kein Cathepsin B • beobachtet. MEXF 514L MEXF 276L GXF 251L LCL H460 MARKER LXFA 526L MEXF 462NL PRCL PC3M LXFL 1072L MACL MCF7 66kDa 46kDa 30kDa ß-Aktin Cathepsin B 21kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Abb. 5.40: Ergebnisse des Western Blots Nr. 3: Das gleichmäßige Signal von ßAktin (oben) spiegelt die korrekte Gelbeladung wieder (25 µg / Tasche). Der Molekulargewichtsmarker zeigt eine gelbe Bande bei 46 kDa, eine rote bei 30 kDa und eine hellblaue bei 21 kDa. Die Cathepsin B Banden (unten) liegen auf der Höhe von 32 und 27 kDa. Die obere Bande entspricht dem Cathepsinmonomer, die untere der schweren Untereinheit des Cathepsindimers. Die stärkste Enzymexpression zeigten MEXF 514L, MEXF 276L und MEXF 462NL (Banden 10, 9 und 4). 5. 96 Ergebnisse LXFL 529L MEXF 514L LXFE 66NL MARKER MEXF 276L LXFA 629L RXF 393NL MAXF 401L MACL MCF7 CCL HT29 66kDa 46kDa 30kDa ß-Aktin Cathepsin B 21kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Abb. 5.41: Ergebnisse des Western Blots Nr. 4: Darstellung der Expression von ßAktin (oben) und Cathepsin B (unten) in 9 Tumoren. Es wurden 25 µg Gesamtprotein in die Geltaschen geladen. Die höchsten Cathepsin B – Spiegel wurden in MEXF 276L, LXFE 66NL und MEXF 514L beobachtet (Banden 6, 8 und 9). 5.7.3 Vergleich der Ergebnisse der Western Blots und der ZellinienarrayImmunhistochemie am Beispiel des Cathepsin B Um einen optimalen Vergleich der Cathepsin B – Detektion in den Zellinien mittels Immunhistochemie und Western Blotting zu ermöglichen, wurden die Zellen für beide Untersuchungsmethoden parallel gesammelt (Beschreibung der Methoden im Kapitel 4.4). Dadurch wurden identische Wachstumsbedingungen gewährleistet. Sämtliche Ergebnisse der Immunhistochemie und des Western Blotting stimmten überein. Die Breite der Banden im Western Blotting verhielt sich proportional zur Braunfärbung in der Immunhistochemie. Eine Gegenüberstellung der Ergebnisse ist den Abbildungen 5.41-44 dargestellt. 5. 97 Ergebnisse MEXF 514L MEXF 276L GXF 251L LCL H460 MARKER LXFA 526L MEXF 462NL PRCL PC3M LXFL 1072L MACL MCF7 MEXF 514L MEXF 276L GXF 251L LCL H460 MARKER LXFA 526L MEXF 462NL PRCL PC3M LXFL 1072L MACL MCF7 MEXF 276L PRCL PC3M Abb. 5.42: Links: Cathepsin B – Nachweis in 25 µg Gesamtprotein durch WB (oben) und in 0,6 mm breiten Gewebsstanzen durch IHC (unten) in der Melanomzellinie MEXF 276L (roter Pfeil). Die Breite der beiden Banden im Western Blot und die dunkle Färbung der Zellen im Array (3+) stimmen überein und sprechen für eine hohe Enzymexpression. Rechts: Cathepsin B – Nachweis durch WB und IHC in der Prostatakarzinomzellinie PRCL PC3M (roter Pfeil). Sowohl die IHC, als auch die WB, weisen auf eine schwache Enzymexpression hin. Vergrößerung x1000. 5. 98 Ergebnisse MEXF 514L MEXF 276L GXF 251L LCL H460 MARKER LXFA 526L MEXF 462NL PRCL PC3M LXFL 1072L MACL MCF7 MEXF 514L MEXF 276L GXF 251L LCL H460 MARKER LXFA 526L MEXF 462NL PRCL PC3M LXFL 1072L MACL MCF7 LXFL 1072L MEXF 462NL Abb. 5.43: Links: Cathepsin B – Nachweis durch WB (oben) und IHC (unten) in der Zellinie des großzelligen Bronchialkarzinoms LXFL 1072L (roter Pfeil). Cathepsin B konnte weder im WB, noch in der IHC (0+) identifiziert werden. Die Ergebnisse beider Nachweismethoden stimmten damit überein. Rechts: Cathepsin B – Nachweis durch WB (oben) und IHC (unten) in der Melanomzellinie MEXF 462NL (roter Pfeil). Die Breite beider Banden im Western Blot und die deutliche Färbung mancher Zellen im Array (1,7+) sprechen beide für eine Enzymexpression. Vergrößerung x1000. mäßig starke 5. 99 Ergebnisse LXFL 529L MEXF 514L LXFE 66NL MARKER MEXF 276L LXFA 629L RXF 393NL MAXF 401L MACL MCF7 CCL HT29 LXFL 529L MEXF 514L LXFE 66NL MARKER MEXF 276L LXFA 629L RXF 393NL MAXF 401L MACL MCF7 CCL HT29 MEXF 514L MACL MCF-7 Abb. 5.44: Links: Cathepsin B – Nachweis durch WB (oben) und IHC (unten) in der Melanomzellinie MEXF 514L (roter Pfeil). Die Enzymdetektion lieferte sowohl im Western Blot, als auch im Array maximale Werte. Alle Zellen von MEXF 514L waren im Zellinienarray dunkelbraun gefärbt, während im Western Blot ein starkes Signal auf der Höhe von 32 kDa, der Proform des Enzyms entsprechend, gemessen wurde. Rechts: Cathepsin B – Nachweis durch WB (oben) und IHC (unten) in der Mammakarzinomzellinie MAXF MCF7 (roter Pfeil). Die geringe Breite der Bande im WB und die schwache Färbung der Zellen in der IHC (0,2+) sprechen beide für eine niedrige Enzymexpression. Vergrößerung x1000. 5. 100 Ergebnisse MEXF 514L MEXF 276L GXF 251L LCL H460 MARKER LXFA 526L MEXF 462NL PRCL PC3M LXFL 1072L MACL MCF7 Abb. 5.45: Vergleichende Darstellung der Ergebnisse des Western Blottings (oben) und der Immunhistochemie (unten) im Adenokarzinom der Lunge LXFA 526L. Cathepsin B wurde in geringen Mengen in manchen Zellen des Arrays gefunden (Mittelwert: 1+). Im Western Blotting konnte kein Cathepsin B nachgewiesen werden. Vergrößerung x1000. LXFA 526L 6. 101 Diskussion 6 Diskussion Durch die vollständige Sequenzierung des humane Genoms mit automatischen Sequenzierungsapparaten und DNA-Mikroarrays wurde in den letzten Jahren eine Vielzahl Tumor-assoziierter Gene identifiziert. Diese liefern für die Onkologie interessante therapeutische Ansatzpunkte oder diagnostische Marker. Dennoch bleibt die Charakterisierung und Validierung der Genprodukte auf der Proteinebene mangels geeigneter Hochdurchsatzverfahren ein außerordentlich langwieriger, teurer und arbeitsintensiver Prozeß. In dieser Arbeit wird erstmals die Charakterisierung molekularer Targets und ihre Validierung für die antitumorale Therapie mit Hilfe von Gewebemikroarrays humaner Xenografts beschrieben. Diese neuartige Technologie stellt ein Hochdurchsatzverfahren für die rapide, parallele Analyse der Proteinexpression in Hunderten von Gewebebiopsien dar [75,95]. Im Rahmen dieser Arbeit ermöglichten Gewebemikroarrays eine beschleunigte Anwendung neuer Erkenntnisse aus der Molekularbiologie auf die antitumorale Wirkstoffentwicklung. Fünf Schlüsselproteine der Angiogenese und Tumorinvasion wurden in über 150 nachwachsenden Xenografts und in 16 permanenten Zellinien humaner Tumoren untersucht. Die Ergebnisse der Target-Charakterisierung konnten daher auf Tumormodelle für in vitro und in vivo Prüfungen experimenteller Verbindungen übertragen werden. Ein „Vorscreening“ erhöht die Erfolgsquoten der in vivo Testung und vermindert die Zahl erforderlicher Versuchstiere. Dabei ist die Vielfalt der Freiburger Xenograft Sammlung ein entscheidender Vorteil, da auch seltene, oft unheilbare Neoplasien in den Gewebemikroarrays mitenthalten sind und in die Wirkstoffentwicklung miteingeschlossen werden können. So können moderne Therapien, auch für seltene Tumoren, früher evaluiert werden, zum Beispiel die Wirkung von Halofuginon auf Nierenzellkarzinomen. Erstmals wird in dieser Arbeit die Erstellung eines Arrays permanenter Zellinien humaner Tumoren beschrieben. Die 16 Zellinien konnten hinsichtlich ihrer Expression von VEGF, Cathepsin B, MMP-2 und ß1-Integrin charakterisiert werden. Die immunhistochemisch gemessene Cathepsin B - Expression wurde durch Western Blotting bestätigt. 6. 102 Diskussion 6.1 Immunhistochemische Färbung der Xenograftarrays In den vergangenen Jahren wurde die biologische Stabilität der Freiburger Xenograft Sammlung über multiple Passagen in der Nacktmaus experimentell bewiesen. Dies gewährleistet den Erhalt der Prädiktivität der Tumormodelle für die in vivo Substanztestung [7,10,30,35]. In dieser Arbeit mußte in einem ersten Schritt die Unabhängigkeit der Meßwerte im Gewebemikroarray von der seriellen Passage überprüft werden. Zu diesem Zweck wurde ein Array, Nacktmauspassagen der Proben enthielt, von 13 Xenografts immunhistochemisch jeweils gefärbt. Es mehrerer wurde die Expressionen von Cathepsin B und MMP-2 untersucht, zwei Proteine, für welche zuverlässig funktionierende Antikörper und Färbemethoden etabliert worden waren. Die Ergebnisse der Färbungen zeigten keine Transplantations-abhängigen Veränderungen der Proteinexpression: Die mittlere Standardabweichung der Meßwerte einzelner Xenografts unterschiedlicher Passagen lagen bei ± 0,27 für Cathepsin B und ± 0,28 für MMP-2 (Mittelwerte jeweils 0,56 und 1,23). Dies kann als Bestätigung gelten, daß sich Xenografts während der seriellen Passage nur in einem sehr geringen Ausmaß verändern und validiert auch deren Gebrauch für Gewebemikroarrays. Im folgenden konnten fünf Mediatoren der Tumorangiogenese und der Metastasierung in den Xenografts der Freiburger Sammlung bestimmt werden. Die Charakterisierung eines Zielproteins beinhaltete die Untersuchung: • der Häufigkeit der Proteinexpression innerhalb der Xenograft Sammlung, • die Stärke der Expression in Tumoren unterschiedlicher Organe, • von Zusammenhängen zwischen Proteinexpression und Tumordifferenzierung, Ursprung des Xenografts (Primärtumor, Metastase etc.), dem klinischen Stadium und der postoperativen Überlebenszeit der Patienten, • den Vergleich der Färbeergebnisse mit Werten früherer ELISA-Untersuchungen aus dem Arbeitskreis von Prof. Fiebig. VEGF ist der meist beschriebene Mediator der Angiogenese. Seine Überexpression geht mit einer Verschlechterung der Prognose für die Patienten und mit einer 6. 103 Diskussion gesteigerten Tumoraggressivität einher. Daher erhofft man sich von der Inhibition von VEGF, die Progression von Krebserkrankungen verlangsamen zu können (Kapitel 1.2.3.1). In der Freiburger Tumorsammlung zeigte VEGF eine außerordentlich breitgefächerte Expression. Es gab keinen Tumortyp, in dem nicht mindestens ein Xenograft VEGF exprimierte. Die Heterogenität der VEGF-Synthese kann durch Unterschiede im Sauerstoffbedarf bedingt sein (metabolische Aktivität), durch die Abhängigkeit des Tumors von anderen angiogenen Faktoren, wie bFGF oder PDGF, oder durch genetische Instabilität, die zu einer Entkopplung der VEGF-Expression vom eigentlichen Bedarf an Sauerstoff führen kann [50]. Die hier beobachtete Unabhängigkeit der Targetexpression von Tumortyp (siehe Box Plot in Abb. 5.6) gibt wichtige Hinweise für die Entwicklung von Angiogeneseinhibitoren. Xenografts für die präklinische Testung oder Patienten für klinische Studien experimenteller Verbindungen sollten in erster Linie in Hinblick auf die Targetexpression des Tumors ausgewählt werden. So kann von Vornherein die Prüfung neuer Wirkstoffe in resistenten Tumormodellen vermieden werden, und die Erfolgsrate präklinischer und klinischer Wirksamkeitsstudien maßgeblich erhöht werden. In dieser Arbeit wird eine derartige „Target-orientierte“ Testung auf Antitumoraktivität am Beispiel eines anti-VEGF-Antikörpers beschrieben (Kapitel 5.4). Das pro–invasive und pro–angiogene Enzym Cathepsin B wird für die Verschlechterung der Prognose epithelialer Lungenkarzinomen, Kopf-Hals-Tumoren und Mammakarzinomen verantwortlich gemacht [62,114]. Die Erkenntnisse dieser Studien legen nahe, daß Cathepsin B einen geeigneten Ansatzpunkt antimetastatischer Tumortherapien liefern könnte. Die immunhistochemische Färbung von Cathepsin B zeigte in dieser Arbeit eine hohe Spezifität: Es gelang nicht nur, das lysosomale Vorkommen von Cathepsin B als granuläre, Überexpression zytoplasmatische und Färbung darzustellen, Polarisierung des Enzyms am sondern murinen auch, eine Bindegewebe nachzuweisen. Diese fokale Ansammlung von Cathepsin B kann als Ausdruck einer lokal gesteigerten Invasivität des Tumors verstanden werden. Möglicherweise ist sie die Folge parakriner Signale, die aus den molekularen Interaktionen zwischen Tumorzellen, Stroma und degradierten Matrixbestandteilen resultieren. Diese 6. 104 Diskussion Beobachtung untermauert das Konzept eines molekularen „Mikroklimas“ an der Grenze zwischen Neoplasie und Normalgewebe [68]. In dieser Arbeit ist erstmals die parallele Analyse der Cathepsin B - Expression in zahlreichen, häufigen und seltenen Tumorarten beschrieben. In manchen Tumortypen wurde überdurchschnittlich viel Cathepsin B identifiziert: Es handelte sich um Urothelkarzinome, Pleuramesotheliome und Prostatakarzinome. Diese Resultate bestätigten Angaben aus der Literatur [24,108]. Über die Expression von Cathepsin B in Pleuramesotheliomen liegen bisher keine Veröffentlichungen vor. Kenntnisse über die Tumorspezifität der Cathepsin B - Expression können vielfältige klinische Anwendungen finden: - Für die Verbesserung der Tumordiagnostik wurde von Marten et al. ein Verfahren entwickelt, in dem Cathepsin B als Biomarker zur Detektion von dysplastischen adenomatösen Polypen verwendet wird [71]. In dieser Studie wurde eine durch Cathepsin B aktivierbare Fluoreszenzprobe in Mäusen mit intestinalen Polypen injiziert. Bis zu mikroskopisch kleinen, Cathepsin B haltigen Polypen konnten anschließend mit bildgebenden Mitteln detektiert werden. Dieses Verfahren soll zukünftig auf eine klinische, endoskopische oder tomographische Bildgebung übertragen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, daß diese neuartigen Verfahren zukünftig zur Früherkennung von Pleuramesotheliomen verwendet werden könnte, insbesondere bei Risikopatienten. - In Urothelkarzinomen, welche in dieser Arbeit eine hohe Cathepsin B Expression zeigten, wurden das Enzym bereits als Tumormarker vorgeschlagen. Eijan et al beschrieben eine signifikante Erhöhung der Cathepsin B – Spiegel im Urin betroffener Patienten [24]. - Andere Arbeitsgruppen, wie Satchi et al. und Toki et al., haben Prodrugs entwickelt, die durch Cathepsin B proteolytisch aktiviert werden [100,117]. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit implizieren, solche Prodrugs nicht in kleinzelligen Lungenkarzinomen, Hodenkarzinomen und Magenkarzinomen zu verwenden, weil hier die Cathepsin B - Expression sehr niedrig ist (Kapitel 5.1.4.1). Die vorliegenden Daten legen dagegen ihre Verwendung für Neoplasien mit hohen Cathepsin B - Spiegeln (Pleuramesotheliome, Urothelund Prostatakarzinome) nahe. 6. 105 Diskussion Durch Gewebemikroarrays konnten 18 Xenografts identifiziert werden, die wegen ihrer außerordentlich hohen Cathepsin B - Expression für die in vivo Prüfung solcher experimenteller Substanzen geeignet sind. Ähnlich wie Cathepsin B ist MMP-2 ein vielversprechendes Target für antimetastatische und antiangiogene Therapien. Der für diese Untersuchung verwendete Antikörper war sowohl für MMP-2, als auch für ProMMP-2 spezifisch und zwar für humanes und murines MMP-2 [111]. Bei den Ergebnissen wurde jedoch nur das intrazelluläre Enzym beurteilt. Daher wurde vor allem die zytoplasmatische Proform des Enzyms gemessen. Murines MMP-2 und ProMMP-2, welches durch Fibroblasten in das Interstitium sezeniert werden, gingen nicht mit in die Wertung ein. Der Enzymnachweis verhielt sich aus diesen Gründen sehr spezifisch: Es wurden nur Tumorzellen als positiv bewertet, die aktuell ProMMP-2 synthetisierten und / oder gespeichert haben. Diese Gegebenheiten erklären, warum die (Pro-)MMP-2-Expression in dieser Arbeit deutlich niedrigere Werte annahm als in einem früheren ELISA, in dem zusätzlich zum intrazellulären Enzym auch stromales ProMMP-2 gemessen wurde [59]. Während die Immunhistochemie sicherlich am ehesten die aktive ProMMP-2Synthese der Tumorzellen wiederspiegelt, kann per ELISA Technik nur eine Aussage zum ProMMP-2-Spiegel des gesamten Gewebes gemacht werden. Die Validität des verwendeten Antikörpers wurde dadurch bestätigt, daß in Zellinien wiederum die Ergebnisse der Immunhistochemie und eines früheren ELISA übereinstimmten (siehe Kapitel 6.3.2 und Referenz [59]). Durch die Gewebemikroarray-Technologie wurden 20 Xenografts identifiziert, die sich durch ihre hohen MMP-2-Spiegel für in vivo Testungen experimenteller MMP-2-Inhibitoren eignen. Dabei handelte es sich insbesondere um Nierenzellund Pankreaskarzinome (respektive n=8 und n=3). Die erhöhte MMP-2-Expression in den Nierenzellkarzinomen bestätigte frühere Veröffentlichungen [43,57]. Es wurden jedoch auch in anderen Tumortypen positive Xenografts identifiziert, zum Beispiel in 43% der Adenokarzinome der Lunge (n=14), in 25% der Kolonkarzinome (n=17) und in 17% der Melanome (n=12). 6. Diskussion 106 Auch für diese Tumortypen könnten therapeutische MMP-2-Inhibitoren (weiter-) entwickelt werden. Die Indikation für eine anti-MMP-2 Therapie sollte auch hier in auf der Target-Expression beruhen, nicht auf dem Ursprungsorgan des Tumors. In 60% der Xenografts war jedoch kein MMP-2 nachweisbar. Ein wesentlicher Teil der Target-Charakterisierung waren die statistischen Untersuchungen der Expressionsprofile. Im Fall von MMP-2 konnte eine signifikante Korrelation zur Tumordifferenzierung nachgewiesen werden: Undifferenzierte Tumoren (Grade 4) zeigten eine signifikant schwächere MMP2-Expression als besser differenzierte Xenografts (Grade 1-3) (Mann-Whitney-UTest, n=85, p<0,05). Die Gruppe der undifferenzierten Tumoren hatte eine mediane MMP-2-Expression von 0,5+, jene der differenzierten Xenografts von 1,5+. Eine geringere MMP-2-Expression ist bei anaplastischen Kolonkarzinomen gegenüber besser differenzierten Kolonkarzinomen in der Literatur beschrieben worden [86]. Diese Befunde belegen, daß aus der semiquantitativen Auswertung der Gewebemikroarrays statistische Zusammenhänge erhalten werden können. Typ I - Kollagen war das einzige murine und damit stromale Protein, das in dieser Arbeit untersucht wurde. Die Kollagensynthese ist ein Prozeß, der nicht allein von der Nacktmaus ausgeht, sondern auf Wechselwirkungen zwischen dem Xenograft und dem Wirtsorganismus beruht. Dies spiegelte sich in der Ungleichmäßigkeit des Kollagengehalts wieder, der in den 136 Tumoren gemessen wurde. Das Kollektiv der Glioblastome stellte den einzigen Tumortyp dar, in dem gleichmäßig viel Kollagen identifiziert wurde: 3 von 3 Glioblastome wurden mit 3+ bewertet. Dies entspricht dem extrem gefäßreichen Phänotyp dieses Tumors. In zahlreichen Tumortypen wurde nur ein sehr geringer Kollagengehalt beobachtet. Es handelte sich dabei um überwiegend undifferenzierte Tumoren, wie kleinzellige und großzellige Lungenkarzinome. Auch die Pleuramesotheliome enthielten kein Typ I – Kollagen. Insgesamt wurde festgestellt, daß in anaplastischen Neoplasien signifikant weniger Typ I – Kollagen vorlag als in besser differenzierten Tumoren (n=69, p<0,05). Diese Tendenz kann auf das Fehlen der organtypischen Architektur des malignen Gewebes verstanden werden. Gut differenzierte Tumorzellen zeigen eine 6. 107 Diskussion Polarisierung zur Basalmembran. Der Gewebeaufbau orientiert sich nach dem Stroma des Wirtsorganismus. Ein Beispiel sind die verzweigten Papillen von Kolonkarzinomen, in denen die Mehrheit der Tumorzellen an bindegewebigen Septen adhärieren. Im Gegensatz dazu besitzen anaplastische Tumorzellen keinen organisierten Zellaufbau. Sie wachsen als unstrukturierte, dicht gepackte, pleomorphe Zellmassen mit wenig Stroma, in denen folglich gehäuft Nekrosen auftreten. Wie hier gezeigt wurde, enthalten solche undifferenzierten Tumoren weniger Typ I - Kollagen. Typ I – Kollagen wurde als Leitstruktur für proliferierende Endothelzellen identifiziert. Es bietet sich daher an, die Tumorangiogenese durch die Inhibition der Kollagensynthese zu hemmen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die antitumorale Wirksamkeit eines solchen Wirkstoffs, Halofuginon, in vivo getestet und bestätigt (Kapitel 5.5). Halofuginon ist derzeit in der klinischen Prüfung bei der EORTC. ß1-Integrin wurde in 152 Tumoren der Freiburger Xenograft Sammlung untersucht. Nur 21 Xenografts (15%) zeigten eine Überexpression von ß1-Integrin. Diese Größenordnung positiver Zellen stimmt mit anderen Veröffentlichungen überein. Von 76 untersuchten serösen Adenokarzinomen des Ovars waren 16% für ß1-Integrin positiv, in invasiven Urothelkarzinomen waren es 22% [66,79]. Vergleichende Darstellungen der ß1-Integrin-Expression in unterschiedlichen Tumortypen wurden bisher nicht publiziert. In dieser Arbeit wurde erstmals ein gehäuftes Vorkommen von ß1-Integrin in Pleuramesotheliomen, Nierenzellkarzinomen, Adenokarzinomen der Lunge, Pankreaskarzinomen und Zervixkarzinomen beschrieben. Durch wenige Färbungen konnten so zu 152 verschiedenen Tumoren sichere Aussagen zur ß1-Integrin-Expression gemacht werden. Für die Testung experimenteller Integrin-Inhibitoren würde es sich anbieten, Target-positive und Target-negative Xenografts der jeweiligen Tumortypen auszusuchen, beispielsweise PXF 1118 oder 1741 (hohe Integrin-Expression) und PXF 537 oder 541 (keine Integrin-Expression), und ihre Ansprechrate zu vergleichen. Ein weiteres zentrales Ergebnis der Untersuchung von ß1-Integrin in der Freiburger Xenograft Sammlung war der Nachweis seiner prognostischen Bedeutung. Die mittlere postoperative Überlebenszeit der Patienten, in denen die Überexpression von ß1-Integrin nachgewiesen wurde, betrug 109 Tage. Die Gruppe der Patienten, in 6. 108 Diskussion denen kein ß1-Integrin vorlag, lebte durchschnittlich 1201 Tage. Es konnte nachgewiesen werden, daß im untersuchten Patientenkollektiv die ß1-IntegrinExpression mit einer signifikanten Verkürzung der Lebenserwartung einherging (n=94, Log Rank - Test p<0,001). Die Tumordifferenzierung, das Staging und das Alter des Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose wurden zuvor als intervenierende Variablen ausgeschlossen. Konkordante Beobachtungen wurden in der Literatur veröffentlicht [13,79,123]. Ein Zusammenhang zwischen stark verminderter Überlebenszeit und der ß1Integrin-Expression kann auf folgende Prozesse zurückgeführt werden: - Eine erhöhte Vaskularisierung und Metastasierung des Tumors, - eine verbesserter Schutz der Tumorzellen gegen das Immunsystem des Patienten [130], sowie - eine Hemmung der proapoptotischen Wirkung von Chemotherapeutika [105]. Weitere Untersuchungen über die prognostische Bedeutung von ß1-Integrin an größeren Patientenkollektiven sind in Hinblick auf eine zukünftige klinische Verwendung dieses Proteins zu empfehlen. Der Nachweis der klinischen Relevanz von ß1-Integrin macht dieses Protein zu einem hochinteressanten therapeutischen Target. Die vorliegenden Untersuchungen implizieren, daß durch die gezielte Inhibition von ß1-Integrin die Lebenserwartung bei ca. 20% der Krebspatienten verlängert werden könnte. 6.2 In vivo Testung experimenteller antiangiogener Substanzen Die Charakterisierung Tumor-assoziierter Proteine in der Freiburger Xenograft Sammlung Testung ermöglichte die gezielte Auswahl von Tumormodellen für die in vivo der experimentellen Zytostatika. Darüber hinaus konnte mittels Gewebemikroarrays die Targetmodulation in behandelten und unbehandelten Xenografts parallel und unter gleichen Versuchsbedingungen verglichen werden. In Kombination mit der Ansprechrate der Xenografts im Tiermodell konnten die Wirkhypothesen neuer antitumoraler Wirkstoffe überprüft und molekulare Targets validiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die beiden antiangiogenen Wirkstoffe HuMV833 und Halofuginon am Nacktmausmodell getestet. 6. 109 Diskussion HuMV833 ist ein anti-VEGF Antikörper, der derzeit in der klinischen Entwicklungsphase I/II von der EORTC getestet wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß HuMV833 durch die Neutralisation von VEGF die Angiogenese und damit das Wachstum von VEGF-abhängigen Tumoren in vivo hemmen kann. Die Wirksamkeit von HuMV833 wurde hier allein und in Kombination mit Gemcitabin an zwei Pankreaskarzinomen, PAXF 546 und 736, geprüft. Die VEGF-Expression beider Xenografts wurde vor der in vivo Testung in einem Gewebemikroarray immunhistochemisch und einem ELISA bestimmt. Während PAXF 546 eine hohe VEGF-Expression zeigte, konnte der angiogene Faktor in PAXF 736 nur in geringen Mengen nachgewiesen werden. In einem weiteren Versuch wurde festgestellt, daß die Gefäßdichte in PAXF 546 fünffach höher war als in PAXF 736 [103]. Die Verwendung beider Modelle erlaubte einen Vergleich der therapeutischen Wirksamkeit in Abhängigkeit vom Target, hier, in Tumoren mit unterschiedlicher VEGF-Expression und Gefäßdichte. Die Kombinationstherapie mit HuMV833 und Gemcitabin lieferte in beiden Tumormodellen die besten Ergebnisse. Die HuMV833-Monotherapie bewirkte auch einzeln in PAXF 546 eine Tumorinhibition, erwies sich in PAXF 736 - dem VEGF-armen Xenograft - aber als unwirksam. Insgesamt sprach PAXF 546 signifikant besser auf die antiangiogene Therapie an als PAXF 736. Nach Beendigung der in vivo Experimente wurde ein Array aus behandelten und unbehandelten Tumoren erstellt. In PAXF 546 waren die VEGF-Spiegel nach der HuMV833-Therapie entscheidend reduziert. Die posttherapeutische Untersuchung von PAXF 546 mit einem Proliferationsmarker zeigte ferner eine Veränderung der Gewebestruktur in den therapierten Tumoren: Während in den Kontrolltumoren proliferierende Zellen gleichmäßig verteilt waren, wurden in den therapierten Xenografts wachsende Zellen nur in unmittelbarer Nähe von residualen Blutgefäßen beobachtet. Diese Areale waren ringförmig von hydropischen Zellen und Nekrosen umgeben, die möglicherweise durch das Ausbleiben der Neovaskularisierung entstanden sind. Die Folgen einer Therapie mit HuMV833, d.h. die TargetSuppression durch den anti-VEGF Antikörper, die makroskopische Wachstumsinhibiton des Tumors und die mikroskopische Veränderung der Tumorgewebestruktur, untermauerten die molekulare Wirkhypothese von HuMV833 und validierten das HuMV833-Target VEGF in PAXF 546. Die 6. 110 Diskussion Therapieresistenz von PAXF 736 bestätigte die Bedeutung der Targetexpression für die pharmakologische Wirkung. Eine wichtige Schlußfolgerung, die aus diesem Versuch gezogen werden kann, ist daß die Auswahl der Patienten für klinische Studien nicht nur auf das Ursprungsorgan des Tumors basieren sollte, sondern in erster Linie auf die TargetExpression. Der Kontrast zwischen den Ansprechrate zweier Pankreaskarzinome mit unterschiedlichen VEGF-Spiegeln hat dies auf klare Weise demonstriert. Daher erscheint es um so sinnvoller, Xenograft- und Zelliniensammlungen nicht nur nach dem Tumortyp oder der Histologie einzuteilen, sondern auch anhand molekularer Marker, wie zum Beispiel VEGF, zu klassifizieren. Gewebemikroarrays sind für solch eine Einteilung besonders gut geeignet, da sie die parallele Untersuchung einer großen Zahl von Proben ermöglichen. Eine weitere antiangiogene Verbindung ist Halofuginon. Dieses niedermolekulare Quinazolinonalkaloid befindet sich derzeit in der ersten Phase der klinischen Prüfung bei der EORTC. Halofuginon hat einen inhibitorischen Effekt auf die Synthese von Typ I – Kollagen und moduliert die Expression weiterer proangiogener, stromaler Proteine, wie MMP-2. Die Wirksamkeit von Halofuginon wurde am stark vaskularisierten Nierenzellkarzinom RXF 944LX und am Melanom MEXF 276 in zwei Dosierungen getestet: 2,5 und 5 µg / Maus / Tag. Während Halofuginon sich in der höheren Dosierung als toxisch erwies, und die Ergebnisse nicht evaluiert werden konnten, wurde bei der niedrigeren Dosierung eine Wachstumsinhibition erzielt: Das mediane Volumen der behandelten Xenografts betrug in beiden Tumormodellen ca. ein Drittel des Volumens der Kontrollen. Darüber hinaus hemmte Halofuginon im orthotop wachsenden Nierenzellkarzinom RXF 944LX die Metastasierung in den Pankreas und die Lungen der Mäuse. Ein bedeutendes Ergebnis der posttherapeutischen Untersuchung der Tumoren lieferte ihre immunhistochemische Färbung in einem Gewebemikroarray. In den behandelten Tumoren konnte der erwartete molekulare Effekt von Halofuginon, die Verminderung des Kollagengehalts, beobachtet und somit die molekulare Wirkhypothese bestätigt werden. Die MMP-2-Spiegel, die zuvor schon in beiden Neoplasien niedrig waren (0,0-0,5), wurden nicht nachweisbar beeinflußt. Typ I - Kollagen spielt eine wichtige Rolle in der Adhäsion und Migration von Tumorund Endothelzellen. Die Verminderung der Kollagensynthese könnte daher das 6. Diskussion 111 verlangsamte Wachstum und das Ausbleiben der Metastasierung der Nierenzellkarzinome erklären. Im Lichte dieser Ergebnisse bietet sich Typ I – Kollagen als Surrogatmarker für die Selektion von Patienten für weitere klinische Studien von Halofuginon an. 6.3 Etablierung des Zellinienarrays Aussagen zur Proteinexpression eines Xenografts können nur begrenzt auf Zellinien des gleichen Tumors übertragen werden, da Zellinien oft undifferenzierter als Xenografts sind und die molekularen Interaktionen zwischen Stroma und Tumor fehlen. Daher besteht der Bedarf, ein Verfahren zur Hochdurchsatzuntersuchung eigens für Zellinien zu etablieren. Die erfolgreiche Etablierung eines Zellinienarrays ist daher ein zentrales Ergebnis dieser Arbeit. Es ermöglicht, die durch Zellinienarrays generierten Daten in kombinierte in vitro / in vivo Testprozeduren antitumoraler Verbindungen einzufügen. Dabei macht man sich die einfache Handhabung und das rasche Wachstum der Zellinien für weit angelegte, primäre Screens zunutze, in denen Hunderte experimenteller Substanzen an mehreren Zellinien getestet werden können. Die antitumorale Wirksamkeit vielversprechender Substanzen kann anschließend in komplexeren Modellen, wie in Xenografts, näher untersucht werden [8,9]. Die Anwendung von Zellinienarrays ermöglichte die Charakterisierung der Expression von VEGF, Cathepsin B, MMP-2 und ß1-Integrin in 16 Zellinien, einen Vergleich mit der Proteinexpression in den Xenografts und mit den Resultaten der Cathepsin B - Expression aus Western Blots. Technisch war die Färbung des Zellinienarrays durch die Homogenität des verwendeten Zellmaterials und durch die Qualität der Färbung, die durch die Einbettmethode mit Pikrinsäure erzielt wurde, außerordentlich zuverlässig. Ein Beleg dafür ist die exakte Übereinstimmung der Messungen der Immunhistochemie und des Western Blotting (Kapitel 5.7.3). Es wurden drei Zellinien mit einer Überexpression von VEGF identifiziert. Da die Sauerstoffspannung im Brutschrank für alle kultivierten Zellinien identisch war, muß diese Überexpression auf andere Faktoren als in den Xenografts zurückgeführt werden. Die Meßwerte spiegeln eher die endogene VEGF-Expression der Zellinien 6. Diskussion 112 wieder, als die reaktive, Hypoxie-induzierte VEGF-Synthese. Die Färbeergebnisse zeigen daher das Ausmaß der Entkopplung der VEGF-Expression vom eigentlichen Sauerstoffbedarf der Zelle. Die Cathepsin B - Expression war in 5 Zellinien erhöht. Während in manchen Xenografts Cathepsin B an den Kontaktstellen zwischen Tumor und Bindegewebe überexprimiert war, ist solch eine reaktive Überexpression des Enzyms in den Zellkulturen nicht zu erwarten. In den Zellinien kann die Synthese der lysosomalen Protease am ehesten als Parameter des intrazellulären „Turnovers“ oder als Folge einer genetischen Veränderung betrachtet werden [1],. Die Identifizierung positiver Zellinien könnte für die Entwicklung therapeutischer und diagnostischer Verfahren genutzt werden. Beispiele sind Polymer-gekoppelte Prodrugs, die durch Cathepsin B aktiviert werden, fluoresziierende Cathepsin-Substrate zur Tumordetektion und die Testung von Cathepsin B Inhibitoren (Kapitel 6.1). Die Western Blots lieferten weitere Informationen über die Cathepsin B – Expression: Interessanterweise exprimierten nicht alle 12 positiven Zellinien die monomere und die dimere Form der Protease. In MEXF 514L konnte ausschließlich das 32 kDa Monomer nachgewiesen werden, in 7 von 12 Tumoren wiederum nur die schwere Untereinheit des Dimers. Die leichte Kette lag mit 4 kDa unter der Nachweisgrenze von 21 kDa. In 4 von 12 positiven Zellinien lagen beide Formen vor. Sowohl das Monomer, als auch das Dimer sind enzymatisch aktiv. Verschiedene Cathepsin B – Polymorphismen sind in der Literatur beschrieben worden, nicht alle sind jedoch funktionell [11,20,58]. Daher sollte vor der Testung experimenteller Substanzen, welche auf die Aktivität des Enzyms basieren, die Kinetik des Enzyms in einem geeigneten Assay überprüft werden. So könnte eine Fehleinschätzung der Testsubstanz vermieden werden. Durch die Färbung von MMP-2 und ß1-Integrin konnten jeweils 4 Zellinien identifiziert werden, die sich durch ihre hohe Target-Expression für eine spezifische Target-orientierte Therapie eignen würden. Die Ergebnisse der Immunhistochemie von MMP-2 stimmten bis auf GXF 251L mit einem früheren ELISA überein [59]. Der Vergleich der immunhistochemisch bestimmten Proteinexpressionen in Zellinien und Xenografts ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied (Mann- 6. 113 Diskussion Whitney-U-Test für unabhängige Stichproben, p>0,05). Die Immunhistochemie hatte den Vorteil, daß stromal synthetisierte Proteine der Maus aus den Xenografts nicht mit in die Wertung einflossen, wie es beim Einsatz von Tumorlysaten vorgekommen wäre. Für diese Fragestellung war daher die Immunhistochemie ein geeigneteres Verfahren als ELISA oder Western Blotting. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sowohl Xenografts, als auch permanente Zellinien humaner Tumoren für Gewebemikroarrays verwendet werden können. Die Mikroarray-Technologie Tumormodellen wichtiger Proteine, ermöglichte die an den Nachweis therapeutisch in beiden interessanten, molekularbiologischen Prozessen beteiligt sind. In Zukunft kann die Mikroarray-Technologie zur Optimierung kombinierter in vitro und in vivo Testverfahren verwendet werden. Es würde sich anbieten, Zelliniensammlungen mittels der Arraytechnologie weiterhin in Hinblick auf neue Targets zu charakterisieren und die generierten Daten zu katalogisieren und bioinformatisch aufzuarbeiten. Da Zellinien für das umfangreiche Screening experimenteller Verbindungen verwendet werden, könnten bioinformatische Verfahren etabliert werden, welche die Wirksamkeitsprofile mit den Target-Expressionen automatisch korrelieren. Dadurch wäre es möglich, zum Verständnis der Wirkmechanismen experimenteller Substanzen beizutragen und rationell weitere auszusuchen. Tumormodelle für anschließende Wirksamkeitsprüfungen 7. 114 Zusammenfassung 7 Zusammenfassung In dieser Arbeit wurden erstmals Gewebemikroarrays aus Xenografts und permanenten Zellinien humaner Tumoren hergestellt. Durch Immunhistochemie wurde die Expression fünf Angiogenese- und Metastasierungs-assoziierter Proteine in 150 Xenografts und 16 Zellinien bestimmt. Gewebemikroarrays ermöglichten die parallele Analyse multipler Tumortypen unter konstanten Versuchsbedingungen. Dadurch konnte eine umfassende, objektive Targetcharakterisierung des Tumorpanels erfolgen. So wurden die Expressionsmuster von VEGF, Cathepsin B, MMP-2, Typ I - Kollagen und ß1-Integrin in 19 Tumortypen und zwei gesunden Geweben untersucht und Target-positive Subgruppen identifiziert. Die Meßwerte blieben immer zwischen der 3. und 12. Tumorpassagen konstant. Ferner wurden Targetexpression, Tumorhistologie und die Überlebenszeit des Patienten miteinander korreliert. Die Expression von MMP-2 und Typ I - Kollagen war bei undifferenzierten Xenografts statistisch signifikant niedriger als bei besser differenzierten Neoplasien (U-Test, p<0,05). Ferner korrelierte die ß1-Integrin-Überexpression mit einer signifikanten Verkürzung der postoperativen Überlebenszeit (Log rank-Test, p<0,001) im untersuchten Patientengut. Fünf Tumormodelle wurden aufgrund ihrer Targetexpression gezielt für die in vivo Testungen eines Antikörpers gegen VEGF und eines Inhibitors der Kollagensynthese selektiert. Posttherapeutisch wurde die Targetmodulation in einem Array überprüft. Der Vergleich der Targetmodulation mit den Ergebnissen der in vivo Testung ermöglichte die Validierung neuer molekularer Targets und die Bestätigung der molekularen Wirkhypothesen. Ein zentrales Ergebnis dieser Arbeit war die Erstellung eines Gewebemikroarrays permanenter Zellinien. Die Expression von VEGF, Cathepsin B, MMP-2 und ß1Integrin wurde immunhistochemisch ermittelt und für Cathepsin B mittels Western Blotting bestätigt: In allen 14 Zellinien stimmten die Meßwerte beider Methoden überein. Gewebemikroarrays erlaubten eine schnelle, umfassende, objektive und reproduzierbare Profilierung der Target-Expression in der Freiburger Xenograft Sammlung. Durch ihre Anwendung auf Xenografts und Zellinien humaner Tumoren werden sie die Entwicklung neuer Target-orientierter Wirkstoffe wesentlich forcieren. 8. Literaturverzeichnis 115 Literaturverzeichnis 1. Agarwal SK (1990) Cathepsins, a view. Bioch Educ, 18: 67-72 2. Al-Mehdi AB, Tozawa K, Fisher AB, Shientag L, Lee A, Muschel RJ (2000) Intravascular origin of metastasis from the endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med, 6: 100-102 3. Alroy J, Goyal V, Skutelsky E (1987) Lectin histochemistry of mammalian endothelium. Histochemistry, 86 : 603-607 4. Andreasen P, Kioller L, Christensen L, Duffy M (1997) The urokinase type plasminogen activator system in cancer metastasis: a review. Int J Cancer, 72: 1-22 5. Andreasen PA, Egelund R, Petersen HH (2000) The plasminogen activation system in tumor growth, invasion, and metastasis. Cell Mol Life Sci, 57: 25-40 6. Bärlund M, Forozan F, Kononen J, Bubendorf L, Chen Y, Bittner ML, Torhorst J, Haas P, Bucher C, Sauter G, Kallioniemi O, Kallioniemi A (2000) Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. JNCI, 92: 1252-1259 7. Bender K, Steiert A, Berger DP, Fiebig HH (1992) Characterization of 53 human tumor xenografts by polymorphic enzyme analysis. Fiebig HH, Berger DP (eds): Immunodeficient mice in oncology. Contrib Oncol. Basel, Karger, vol 42, pp 87-97. 8. Berger DP, Henß H, Winterhalter BR, Fiebig HH (1990) The clonogenic assay with human tumor xenografts: Evaluation, predictive value and application for drug screening. Annals of Oncology, 1: 333-341 9. Berger DP, Winterhalter BR, Fiebig HH (1992) Establishment and characterization of human tumor xenografts in thymus-aplastic nude mice. Fiebig HH, Berger DP (eds): Immunodeficient mice in oncology. Contrib Oncol. Basel, Karger, vol 42, pp 23-46. 10. Berger DP, Winterhalter BR, Fiebig HH (1992) Establishment and characterization of human tumor xenografts in thymus-aplastic nude mice. Fiebig HH, Berger DP (eds): Immunodeficient mice in oncology. Contrib Oncol. Basel, Karger, vol 42, pp 23-46. 11. Berquin IM, Sloane BF (1996) Cathepsin B – Expression in human tumors. Adv Exp Med Biol, 389: 281-294 12. Boger D, Goldberg J, Silletti S, Kessler T, Cheresh D (2001) Identification of a novel class of small-molecule antiangiogenic agents through the screening of combinatorial libraries which function by inhibiting the binding and localization of proteinase MMP-2 to integrin αvβ3. J Am Chem Soc, 123: 1280-1288 13. Bottger TC, Maschek H, Lobo M, Gottwohl RG, Brenner W, Junginger T (1999) 8. Literaturverzeichnis 116 Prognostic value of immunohistochemical expression of beta-1 integrin in pancreatic carcinoma. Oncology, 56: 308-313 14. Bramhall SR (1997) The matrix metalloproteinases and their inhibitors in pancreatic cancer. Int J Pancreatol, 21: 1-12 15. Brodt P, Dedhar S (1996) Lysosomal endoproteases. Brodt P (ed): Cell Adhesion and Invasion in Cancer Metastasis New York, Springer, pp 151-164 16. Brodt P, Dedhar S (1996) The Integrins: Mediators of cell-extracellular matrix and intercellular communication. in: Cell Adhesion and Invasion in Cancer Metastasis, 1996 New York, Springer, pp 35-60 17. Brogi E, Wu T, Namiki A, Isner JM (1996) Indirect angiogenic cytokines upregulate VEGF and bFGF gene expression in vascular smooth muscle cells, whereas hypoxia upregulates VEGF expression only. Circulation, 2: 649-652 18. Brooks PC, Stromblad S, Sanders LC, von Schalscha TL, Aimes RT, Stetler-Stevenson WG, Quigley JP, Cheresh DA (1996) Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin alpha v beta 3. Cell, 85: 683-93 19. Brown LF, Guidi AJ, Schnitt SJ, Van De Water L, Iruela-Arispe ML, Yeo TK, Tognazzi K, Dvorak HF (1999) Vascular stroma formation in carcinoma in situ, invasive carcinoma and metastatic carcinoma of the breast. Clin Cancer Res, 5: 1041-1056 20. Cao L, Taggart RT, Berquin IM, Moin K, Fong D, Sloane BF (1994) Human gastric adenocarcinoma Cathepsin B: isolation and sequencing of full-length cDNAs and polymorphisms of the gene. Gene, 139: 163-169 21. Chen E, Kridel S, Howard E, Li W, Godzik A, Smith J (2002) A unique substrate recognition profile for matrix metalloproteinase 2. J Biol Chem, 277: 4485-4491 22. Connolly DT, Heuvelman DM, Nelson R, Olander JV, Eppley BL, Delfino JJ, Siegel NR, Leimbgruber RM, Feder J (1989) Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angiogenesis. J Clin Invest 84: 1470-1478 23. Durko M, Brodt P (1996) The Metalloproteinases ans their inhibitors Brodt P (Ed): Cell adhesion and invasion in cancer metastasis. New York, Springer, pp 114-150 24. Eijan AM, Sandes E, Puricelli L, Casabe AR (2000) Cathepsin B levels in urine from bladder cancer patients. Oncol Rep, 7: 1395-1399 25. Elkin M, Miao H, Nagler A, Aingorn E, Reich R, Hemo I, Dou H, Pines M, Vlodavsky I (2000) Halofuginone: a potent inhibitor of critical steps in angiogenesis progression. FASEB, 14: 2477-2485 8. Literaturverzeichnis 117 26. Ferrara N (1999) Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. J Mol Med, 77: 527-543 27. Fidler IJ (1990) Critical factors in the biology of human cancer metastasis. Cancer Res, 50: 6130-6138 28. Fidler IJ, Hart IR (1982) Biologic diversity in metastatic neoplasms – origins and implications. Science, 217: 998-1001 29. Fiebig HH, Dengler WA, Roth T (1999) Human tumor xenografts: Predictivity, characterization and discovery of new anticancer agents. Fiebig HH, Berger AM (eds): Relevance of tumor models for anticancer drug development. Contrib Oncol. Basel, Karger, vol 54, pp 29-50. 30. Fiebig HH, Löhr GW (1984) Wachstum menschlicher Malignome in der thymusaplastischen Nacktmaus. Medwelt, 35: 52-58, 81-86 31. Folkman J (1971) Tumor angiogenesis: Therapeutic implications. N Engl J Med, 285: 1182-1186 32. Folkman J (1995) Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med, 1: 27-31 33. Fong D, Chan MM, Hsieh WT, Menninger JC, Ward DC (1992) Confirmation of the human cathepsin B gene assignment to chromosome 8. Hum Genet, 89: 10-12 34. Frisch S, Francis H (1994) Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. J Cell Biol, 124: 619-626 35. Furtwängler I, Fiebig HH, Berger DP, Wittekind C, Löhr GW (1992) Immunohistochemical characterization of human tumor xenografts established in nude mice. Fiebig HH, Berger DP (eds): Immunodeficient mice in oncology. Contrib Oncol. Basel, Karger, vol 42, pp 148-151. 36. Gerber HP, McMurtrey A, Kowalski J, Yan M, Keyt BA, Dixit V, Ferrara N (1998) VEGF regulates endothelial cell survival through the phosphatidyl-inositol 3’-kinase/akt signal transduction pathway. J Biol Chem, 273: 30336-30343 37. Giancotti F, Ruoslathi E (1999) Integrin Signaling. Science, 285: 1028-1032 38. Gimbrone MA Jr, Cotran RS, Leapman SB, Folkman J (1974) Tumor growth and neovascularization: an experiement using rabbit cornea. JNCI, 52: 413-427 39. Gong Q, Chan SJ, Baikowski AS, Steiner DF, Frankfater A (1993) Characterization of the cathepsin B gene and multiple mRNAs in human tissues: evidence for alternative splicing of cathepsin B pre-mRNA. DNA Cell Biol, 12: 299-309 40. Gordon MS, Kerbel RS, Sledge GW, Pluda JM, Ellis LM (2002) 8. 118 Literaturverzeichnis Fourth international symposium on anti-angiogenic agents. Frontpage of the second announcement, January 2002. 41. Griffioen AW, Molema G (2000) Angiogenesis, potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacol Rev 52: 237-268 42. Guadagno TM, Ohtsubo M, Roberts JM, Assoian RK (1993) A link between cyclin A expression and adhesion-dependent cell cycle progression. Science, 262: 81572-5 43. Hagemann T, Gunawan B, Schulz M, Fuzesi L, Binder C (2001) mRNA expression of matrix metalloproteases and their inhibitors differs in different subtypes of renal cell carcinomas. Eur J Cancer, 37: 1839-1846 44. Hanahan D, Folkman J (1996) Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell, 86: 353-364, 1996 45. Hanahan D, Weinberg RA (2000) The hallmarks of cancer. Cell, 100: 57-70 46. Hapke S, Kessler H, Arroyo de Prada N, Benge A, Schmitt M, Lengyel E, Reuning U (2001) Integrin αvβ3 / vitronectin receptor interaction affects expression of the urokinase system in human ovarian cancer cells. J Biol Chem, 276: 26340-26348 47. Hazen L, Bleeker F, Lauritzen B, Bahns S, Song J, Van Driel B, Lyon H, Hansen U, Köhler A, Van Noorden C (2000) Comparative localization of cathepsin B protein and activity in colorectal cancer. JHC, 48: 1421-1430 48. Herrmann PC, Liotta LA, Petricoin EF 3 (2001) Cancer proteomics: the state of the art. Dis Markers, 17: 49-57 49. Hidalgo M, Eckhardt SG (2001) Development of matrix metalloproteinase inhibitors in cancer therapy. JNCI, 93: 178-191 50. Hlatky L, Hahnfeldt P, Folkman J (2002) Clinical application of antiangiogenic therapy: Microvessel density, what it does and doesn’t tells us. J Natl Cancer Inst, 94: 883-893 51. Hynes R et Al (1987) Integrins: a family of cell surface receptors. Cell, 48: 549-54 52. Illy C, Quraishi O, Wang J, Purisima E, Vernet T, Mort J (1997) Role of the occluding loop in cathepsin B activity. Jour Biol Chem, 272: 1197-1202 53. Iruela-Arispe ML, Hasselaar P, Sage EH (1991) Differential expression of extracellular proteins is correlated with angiogenesis in vitro. Lab Invest, 64: 174-186 54. Jackson CJ, Jenkis KL (1991) rd 8. Literaturverzeichnis 119 Type I collagen fibrils promote rapid vascular tube formation upon contact with the apical side of cultured endothelium. Exp Cell Res, 192: 319-323 55. Josko J, Gwozdz B, Jedrejowska-Szypulka H, Hendryk S (2000) VEGF and its effect on angiogenesis. Med Sci Monit, 6: 1047-1052 56. Kaipainen A, Korhonen J, Mustonen T, van Hinsbergh VW, Fang GH, Dumont D, Breitman M, Alitalo K (1995) Expression of fms-like tyrosin kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci USA, 92: 3566-3570 57. Kallakury BV, Karikehalli S, Haholu A, Sheehan CE, Azumi N, Ross JS (2001) Increased expression of matrix metalloproteinases 2 and 9 and TIMP-1 and 2 correlate with poor prognostic variables in renal cell carcinoma. Clin Cancer Res, 7: 3113-3119 58. Keppler D, Sloane BF (1996) Cathepsin B: multiple enzyme forms from a single gene and their relation to cancer. Enzyme protein, 49: 94-105 59. Klostermeyer A, Fiebig HH, Burger AM (1999) Characterization of matrix mettaloproteinases in 47 human tumor xenografts shows high expression of MMP-2 in melanomas and sarcomas. Proc Amer Assoc Cacer Res, 40: 463 60. Kohn EC, Liotta LA (1995) Molecular insights into cancer invasion: strategies for prevention and intervention. Cancer Res, 55: 1856-1862 61. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund M, Schramel P, Leighton S, Torhorst J, Mihatsch MJ, Sauter G, Kallioniemi OP (1998) Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med, 4: 844-847 62. Lah TT, Blejec A, Kos J, Gorodetsky E, Somers R, Daskal I (2000) Cathepsin B, a prognostic indicator in lymph node negative breast carcinoma patients. Clin Cancer Res, 6: 578-584 63. Leonhardt H (1985) Bindegewebe. Leonhardt H: Histologie, Zytologie und Mikroanatomie des Menschen. Stuttgart, Thieme, 7. überarbeitete Auflage, pp 95-115. 64. Leonhardt H (1985) Blutgefäße (Vasa sanginea). Leonhardt H: Histologie, Zytologie und Mikroanatomie des Menschen. Stuttgart, Thieme, 7. überarbeitete Auflage, pp 194-204. 65. Licht T, Fiebig HH, Berger DP, Bross KJ, Mertelsmann R (1992) Intrinsic multidrug resistance in nude mouse xenografts: Immunocytochemical detection of Pglycoprotein and chemoresistance in vitro. Fiebig HH, Berger DP (eds): Immunodeficient mice in oncology. Contrib Oncol. Basel, Karger, vol 42, pp 416-427. 66. Liebert M, Washington R, Stein J, Wedemeyer G, Grossman HB (1994) Expression of the VLA beta 1 family in bladder cancer. Am J Pathol, 144: 1016-1022 67. Linebaugh B, Sameni M, Day N, Sloane B, Keppler D (1999) 8. Literaturverzeichnis 120 Exocytosis of active cathepsin B enzyme activity at pH 7.0, inhibition and molecular mass. Eur J Biochem, 264: 100-109 68. Liotta LA, Kohn EC (2001) The microenvironment of the tumour-host interface. Nature, 411: 375-379 69. Liotta LA, Tryggvason K, Garbisa S et al (1980) Metastatic potential correlates with enzymatic degradation of basement membrane collagen. Nature, 284: 67-68 70. Mach L, Stuwe K, Hagen A, Ballaun C, Glossl J (1992) Proteolytic processing and glycosylation of Cathepsin B. Biochem J, 282: 577-582 71. Marten K, Bremer C, Khazaie K, Sameni M, Sloane B, Tung CH, Weißleder R (2002) Detection of dysplastic intestinal adenomas using enzyme-sensing molecular beacons in mice. Gastroenterology, 122: 571-575 72. Martin DB, Nelson PS (2001) From genomics to proteomics: techniques and applications in cancer research. Trends Cell Biol, 11: 60-65 73. Meissauer A, Kramer MD, Schirrmacher V, Brunner G (1992) Generation of cell surface-bound plasmin by cell-associated urokinase-type or secreted tissuetype plasminogen activator: a key event in melanoma cell invasiveness in vitro. Exp Cell Res, 199: 179-190 74. Mirlacher M, Storz M (2000) Gewebe-Chips für die molekulare Untersuchung von Tumoren. Labmed: 293-297, Sep 75. Moch H, Schraml P, Bubendorf L, Mirlacher M, Kononen J, Gasser T, Mihatsch M, Kallioniemi O, Sauter G (1999) High-throughput tissue microarray analysis of to evaluate genes uncovered by cDNA microarray screening in renal cell carcinoma. AJP, 154: 981-986 76. Monga M, Sausville EA (2002) Developmental therapeutics program at the NCI: molecular target and drup discovery process. Leukemia, 16: 520-526 77. Morgunova E, Tuuttila A, Bergmann U, Isupov M, Lindqvist, Schneider G, Tryggvason K (1999) Structure of human pro-matrix metalloproteinase-2: activation mechanism revealed. Science, 284: 1667-1670 78. Moser K, Stacher A (1986) Chemotherapie maligner Erkrankungen. 3. Auflage Deutscher Ärzte-Verlag, Köln 79. Muller-Klingspor V, Hefler L, Obermair A, Kaider A, Breitenecker G, Leodolte S, Kohlberger P (2001) Prognostic value of beta1-integrin in serous adenocarcinomas of the ovary. Anticancer Res, 21: 2185-2188 80. Nakajima M, Welch D, Belloni PN, Nicolson GL (1987) Degradation of basement membrane type IV collagen and lung subendothelial matrix by rat mammary adenocarcinoma cell clones of different metastatic potentials. Cancer Res, 47: 4869-4876 8. Literaturverzeichnis 121 81. National Cancer Institute, MD, USA: Angiogenesis http://www.cancer.gov 82. Nawrocki B, Polette M, Marchand V, Monteau M, Gillery P, Tournier JM (1997) Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human bronchopulmonary carcinomas. Int J Cancer, 72: 556-564 83. Niedergethmann M, Hildenbrand R, Wostbrock B, Hartel M, Sturm JW, Richter A, Post S (2002) High expression of vascular endothelial growth factor predicts early recurrence and poor prognosis after curative resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas. Pancreas, 25: 111-121 84. Nip J, Brodt P (1995) The role of vitronectin receptor and urokinase-type plasminogen activator receptor in metastatic melanoma cells. J Clin Invest 95: 2096-20103 85. Paget S (1889) The distribution of secondary growth in cancer of the breast. Lancet, 1: 571-573 86. Papadopoulou S, Scorilas A, Arnogianaki N, Papapanayiotou B, Tzimogiani A, Agnantis N, Talieri M (2001) Expression of gelatinase A in human colon cancer and normal colon mucosa. Tumour Biol, 22: 383-389 87. Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R (1991) Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1 in microvascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 181: 902-906 88. Petrides P (1998) Binde- und Stützgewebe. Löffler G, Petrides P: Biochemie und Pathobiochemie. Berlin, Springer, 6. Auflage, pp. 733-760. 89. Petrides P (1998) Tumorgewebe. Löffler G, Petrides P (Hrg): Biochemie und Pathobiochemie. Berlin, Springer, 6. Auflage, pp. 1090-1113. 90. Pfreundschuh M, Schölmerich J (2000) Pathophysiologie Pathobiochemie. München, Urban & Fischer 1. Auflage 91. Plow E, Haas T, Zhang L, Loftus J, Smith J (2000) Ligand binding to integrins. J Biol Chem, 275: 21785-788 92. Poole AR, Tiltman KJ, Recklies AD, Stocker TA (1978) Differences in secretion of the protease Cathepsin B at the edges of human breast carcinomas and fibroadenomas. Nature, 273: 545-547 93. Potgens AJ, Lubsen NH, van Altena MC, Vermeulen R, Bakker A, Schoenmakers JG, Ruiter DJ, de-Waal RM (1994) Covalent dimerization of VEGF is essential for ist biological activity. J Biol Chem, 269: 32879-32885 8. Literaturverzeichnis 122 94. Recklies AD, Tiltman KJ, Stocker TA, Poole AR (1980) Secretion of proteinases from malignant and nonmalignant human breast tissue. Cancer Res, 40: 550-556 95. Richter J, Wagner U, Kononen J, Fijan A, Bruderer J, Schmid U, O Kallioniemi, Sauter G (2000) High-throughput tissue microarray analysis of cyclin E gene amplification and overexpression in urinary bladder cancer. AJP, 157: 787-794 96. Risau W (1997) Mechanisms of angiogenesis. Nature, 386: 671-674 97. Robinson CJ, Stringer SE (2001) The splice variants of vascular endothelial growth factor (VEGF) and their receptors. J Cell Science 114: 853-865 98. Rooney P, Kumar P, Ponting J, Kumar S (1997) The role of collagens and proteoglycans in tumor angiogenesis. Lewis CE, Bicknell R, Ferrara N (eds): Tumor Angiogenesis. Oxford, Oxford University Press, pp 141-151. 99. Roth T, Burger AM, Dengler WA, Willmann H, Fiebig HH (1999) Human tumor cell lines demonstrating the characteristics of patient tumors as useful models for anticancer drug screening. Fiebig HH, Berger AM (eds): Relevance of tumor models for anticancer drug development. Contrib Oncol. Basel, Karger, vol 54, pp 145-156. 100. Satchi R, Connors TA, Duncan R (2001) PDEPT: Polymer directed enzyme prodrug therapy. I. HPMA copolymer-cathepsin B and PK1 as a model combination. Br J Cancer, 85: 1070-1076 101. Sato H, Takino T, Okada Y, Cao J, Shinagawa A, Yamamoto E, Seiki M (1994) A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumour cells. Nature, 370: 61-65 102. Schraml P, Kononen J, Bubendorf L, Moch H, Bissig H, Nocito A, Mihatsch M, Kallioniemi O, Sauter G (1999) Tissue Microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res, 5: 1966-1975 103. Schüler JB, Fiebig HH, Burger AM (1999) Development of human tumor models for evaluation of compounds which target human tumor vasculature. Fiebig HH, Berger AM (eds): Relevance of tumor models for anticancer drug development. Contrib Oncol. Basel, Karger, vol 54, pp 181-190. 104. Seftor REB, Seftor EA, Gehlsen KR, Stetler-Stevenson WG, Brown PD, Ruoslahti E, Hendrix MJ (1992) Role of αvβ3 integrin in human melanoma cell invasion. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 1557-61 105. Sethi T, Rintoul R, Moore S, acKinnon A, Salter D, Choo C, Chilvers E, Dransfield I, Donnelly S, Strieter R, Haslett C (1999) Extracellular matrix proteins protect small cell lung cancer cells against apoptosis: A mechanism for SCLC growth and drug resistance in vivo. Nat Med, 5: 662-668 106. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, Perruzzi CA, Harvey VS, Dvorak HS (1983) 8. Literaturverzeichnis 123 Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science, 219: 983-985 107. Shoemaker RH, Scudiero DA, Melillo G, Currens MJ, Monks AP, Rabow AA, Covell DG, Sausville EA (2002) Application of high-throughput, molecular-targeted screening to anticancer drug discovery. Curr Top Med Chem, 2: 229-246 108. Sinha A, Wilson M, Gleason D, Reddy P, Sameni M, Sloane B (1995) Immunohistochemical localization of Cathepsin B in neoplastic human prostate. Prostate, 26: 171-178 109. Sloane JF, Dunn JR, Honn KV (1981) Lysosomal cathepsin B: correlation with metastatic potential. Science, 212: 1151-1153 110. Sporn MB (1996) The war on cancer. Lancet, 347: 1377-1381 111. Steinbeck, J (1937) Of mice and men. Peguin USA 112. Stretler-Stevenson WG (1996) Dynamics of matrix turnover during pathological remodeling of the extracellular matrix. Am J Pathol, 148: 1345 113. Stretler-Stevenson WG (1999) Matrix metalloproteinases in angiogenesis: a moving target for therapeutic intervention. J Clin Invest, 103: 1237-1241 114. Strojan P, Budhina M, Smid L, Svetic B, Vrohec I, Kos J, Skrk J (2000) Prognostic significance of cysteine proteinases cathepsin B and L and their endogenous inhibitors stefins A and B in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Cancer Res, 6: 1052-1062 115. Toi M, Kondo S, Suzuki H, Yamamoto Y, Inada K, Imazawa T, Taniguchi T, Tominaga T (1996) Quantitative analysis of VEGF in primary breast cancer. Cancer, 77: 1101-1106 116. Toi M, Matsumoto T, Bando H (2001) Vascular endothelial growth factor: its prognostic, predictive, and therapeutic implications. Lancet Oncol, 2: 667-673 117. Toki B, Cerveny C, Wahl A, Senter P (2002) Protease-mediated fragmentation of p-aminobenzyl ethers: A new strategy for the activation of anticancer prodrugs. J Org Chem, 67: 1866-1872 118. Unemori EN, Ferrara N, Bauer EA, Amento EP (1992) VEGF induces interstitial collagenase expression in human endothelial cells. J Cell Physiol, 153: 557-562 119. Ura H, Bonfil RD, Reich R, Reddel R, Pfeifer A, Harris CC, Klein AJP (1989) Expression of type IV collagenase and procollagen genes and its correlation with the tumorigenic, invasive, and metastatic abilities of oncogene-transformed human bronchial epithelial cells. Cancer Res, 49: 4615-4621 120. Van Noorden CJF, Jonges GN, Meade-Tollin LC, Smith RE, Köhler A 8. Literaturverzeichnis 124 In vivo inhibition of cysteine proteinases delays the onset of growth of human pancreatic cancer explants. Br J Cancer, 82: 931-936 121. Van Wart HE, Birkedal-Hansen H (1990) The Cysteine Switch. Proc Natl Acad Sci USA, 87: 5578-5582 122. Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, Smith HO, Yandell M (2001) The sequence of the human genome. Science, 291: 1304-1351 123. Vihinen P, Nikkola J, Vlaykova T, Hahka-Kempinen M, Talve L, Heino J, Pyrhonen S (2000) Prognostic value of beta1 integrin expression in metastatic melanoma. Melanoma Res, 10: 243-251 124. Vincenti V, Cassano C, Rocchi M, Persico G (1996) Assignement of the vascular endothelial growth factor gene to human chromosome 6p12.3. Circulation, 93: 1493-1495 125. Waltenberger J, Claesson-Welch L, Siegbahn A, Shibuya M, Heldin CH (1994) Different signal transduction properties of KDR and flt1, two receptors for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem, 269: 26988-26995 126. Weidner N, Folkman J, Possa F, Bevilacqua P, Allred E, Moore DH, Meli S, Gasparini G (1992) Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. JNCI, 84: 1875-1887 127. Werle B, Ebert W, Klein W, Spieß E (1994) Cathepsin B in tumors, normal tissue and isolated cells from the human lung. Anticancer Res, 14: 1169-1176 128. Wu Y, Chen L, Zheng PS, Yang B (2002) ß1-Integrin mediated glioma cell adhesion and free radical-induced apoptosis are regulated by binding to a C-terminal domain of PG-M/Vesican. J Biol Chem, 277: 12294-12301 129. Xiong J-P, Stehle T, Diefenbach B, Zhang R, Dunker R, Scott D, Joachimiak A, Goodman S, Arnaout A (2001) Crystal structure of the extracellular segment of integrin αvβ3. Science, 294: 339-345 130. Yasuda M, Tanaka Y, Tamura M, Fujii K, Sugaya M, So T, Takenoyama M, Yasumoto K (2001) Stimulation of beta1 integrin down-regulates ICAM-1 expression and ICAM-1 mediated adhesion of lung cancer cells through focal adhesion kinase. Cancer Res, 61: 2022-2030 131. Zhang, Ozaki I, Mitzuta T, Hisatomi A, Tadano J, Sakai T, Yamamoto K (2002) ß1-integrin protects hepatoma cells from chemotherapy induced apoptosis via a mitogenactivated protein kinase dependent pathway. Cancer, 15: 896-906 9. Anhang 125 Anhang A: Färbeergebnisse der Xenograftarrays, Tumorhistologie und Patientendaten VEGF Xenograft CATHEPSIN B Mittelwert n MMP-2 SD Mittelwert n SD Mittelwert n SD BXF 439 1,00 2 0,00 2,50 1 0,00 0,00 1 0,00 BXF 1036 0,00 2 0,00 2,50 1 0,00 3,00 1 0,00 BXF 1218 2,00 3 0,00 0,50 1 0,00 0,50 1 0,00 BXF 1258 0,50 3 0,50 0,00 1 0,00 0,00 3 0,00 BXF 1299 0,00 3 0,00 1,19 8 0,75 2,00 3 1,41 BXF 1304 1,00 2 0,00 1,70 5 1,08 BXF 1352 0,00 2 0,00 2,50 1 0,00 0,00 1 0,00 CXF DLD1 1,00 2 0,00 3,00 2 0,00 0,00 2 0,00 CXF 94 2,50 3 0,50 0,50 5 0,63 2,75 2 0,25 CXF/LS 147 1,50 3 1,50 1,00 1 0,00 0,00 1 0,00 CXF 158 0,00 5 0,00 1,00 9 1,03 0,00 3 0,00 Colo 205 2,50 3 0,50 2,25 2 0,25 0,00 1 0,00 CXF 243 0,50 3 0,50 0,17 6 0,37 0,50 2 0,50 CXF 264 1,00 4 0,00 2,29 7 0,96 2,67 3 0,47 CXF 280 0,33 4 0,47 2,10 10 0,62 1,50 2 1,50 CXF 609 0,00 3 0,00 0,56 9 0,86 0,75 2 0,25 CXF 883 0,33 4 0,47 1,67 6 0,90 1,50 2 1,50 CXF 886 0,50 3 0,50 0,71 7 0,59 1,50 2 0,50 CXF 975 3,00 2 0,00 0,50 2 0,50 1,50 1 0,00 CXF 1093 0,67 4 0,94 0,31 8 0,43 3,00 3 0,00 CXF 1103 1,33 4 0,47 0,55 10 0,72 0,08 3 0,12 CXF 1256 1,00 4 0,82 1,14 7 1,27 0,25 2 0,25 CXF 1297 3,00 4 0,00 2,61 9 0,39 3,00 3 0,00 CXF 1729 0,75 3 0,75 0,75 2 0,75 3,00 1 0,00 CNXF SF 268 1,00 2 0,00 2,00 1 0,00 3,00 2 0,00 CNXF 295 0,00 3 0,00 2,50 4 0,50 1,00 3 0,00 CNXF 498 2,67 4 0,24 0,33 6 0,55 0,50 2 0,50 CNXF U 251X 0,67 4 0,47 2,36 7 0,74 0,67 3 0,47 CXF 1749 GXF 97 1,50 4 0,41 0,69 8 0,75 0,67 3 0,47 GXF 209 1,17 4 0,24 0,41 11 0,51 2,38 4 0,82 GXF 214 0,00 4 0,00 0,64 7 0,69 0,33 3 0,47 GXF 251 1,13 5 0,74 0,89 9 0,61 2,50 2 0,50 GXF 281 2,50 3 0,50 0,25 8 0,66 1,50 2 0,50 GXF 324 1,50 3 0,50 2,29 7 0,70 2,50 2 0,50 HNXF 536 1,00 2 0,00 2,83 6 0,37 0,50 2 0,50 HNXF 908 2,17 4 0,24 2,33 3 0,24 0,00 3 0,00 HNXF 921 0,00 2 0,00 0,00 5 0,00 2,00 2 0,00 LCL ACCX 0,00 2 0,00 1,00 2 1,00 0,00 1 0,00 LXF 1680 0,00 4 0,00 1,75 4 0,43 1,50 2 1,50 LXFA 289 0,83 4 0,62 0,50 8 0,71 0,67 3 0,47 9. Anhang 126 Xenograft VEGF Mittelwert CATHEPSIN B Mittelwert n SD MMP-2 Mittelwert LXFA 297 0,50 3 0,50 2,75 4 0,43 0,50 3 0,71 LXFA 526 1,00 LXFA 592 2,00 4 1,08 0,71 7 0,65 3,00 3 0,00 5 0,00 2,14 7 0,23 0,67 3 LXFA 629 0,47 0,50 4 0,41 1,32 11 0,75 1,06 4 0,72 LXFA 677 0,83 4 0,62 1,78 9 0,58 2,00 2 1,00 LXFA 923 0,75 3 0,25 2,38 8 0,41 1,25 2 0,25 LXFA 983 0,25 5 0,43 1,06 9 0,90 3,00 2 0,00 LXFA 1012 1,63 5 0,22 2,06 8 0,53 1,50 3 0,71 LXFA 1041 0,25 5 0,43 0,28 9 0,53 0,00 2 0,00 LXFA 1335 0,63 5 0,65 1,06 8 0,88 1,83 3 1,03 LXFA 1584 0,50 4 0,41 2,38 8 0,99 2,00 2 0,00 LXFA 1647 0,33 4 0,47 1,79 7 0,52 1,67 3 0,94 LXFA 1670 2,50 2 0,00 2,33 3 0,94 2,50 2 0,50 LXFE 397 1,00 5 0,79 0,33 6 0,37 0,00 3 0,00 LXFE 409 2,63 5 0,41 0,75 8 0,75 0,50 2 0,50 LXFE 856 3,00 2 0,00 1,50 1 0,00 0,50 2 0,50 LXFE 909 0,75 5 0,75 0,08 6 0,19 0,00 3 0,00 LXFE 1422 1,50 3 1,50 0,00 3 0,00 0,00 2 0,00 LXFE 1472 1,50 3 0,50 0,71 7 0,65 0,00 2 0,00 n SD n SD LXFL H 460 1,67 4 0,24 1,13 4 0,54 1,67 3 0,47 LXFL 529 1,75 5 1,30 2,25 10 0,56 1,88 4 1,14 LXFL 1029 0,00 2 0,00 1,83 6 1,07 0,50 2 0,50 LXFL 1072 1,50 4 1,22 0,88 8 0,93 1,17 3 0,85 LXFL 1674 2,17 4 0,24 2,50 4 0,35 0,33 3 0,47 LXFL 1743 0,00 3 0,00 0,50 1 0,00 LXFS 428 0,25 3 0,25 0,00 8 0,00 0,00 2 0,00 LXFS 538 1,33 5 0,71 0,19 8 0,35 0,00 3 0,00 LXFS 573 0,00 3 0,00 0,42 6 0,61 0,50 2 0,50 LXFS 605 0,00 3 0,00 0,17 6 0,37 0,00 2 0,00 LXFS 650 0,33 4 0,47 0,22 9 0,34 0,00 3 0,00 MAXF 401 0,00 4 0,00 0,03 12 0,10 1,45 4 0,69 MAXF 449 0,50 3 0,50 0,25 6 0,38 0,00 2 0,00 MAXF 583 0,75 3 0,75 0,36 7 0,69 0,00 2 0,00 MAXF 713 0,50 4 0,71 0,30 5 0,40 0,00 3 0,00 MAXF 857 0,50 5 0,87 0,20 10 0,46 0,00 3 0,00 MAXF 1162 1,63 5 1,08 1,39 9 0,66 0,67 3 0,47 MAXF 1322 1,50 3 0,50 0,40 5 0,80 0,00 2 0,00 MAXF 1384 0,75 3 0,25 0,33 6 0,75 0,00 2 0,00 MAXF 1691 2,75 3 0,25 0,67 3 0,94 0,75 4 0,43 MAXF 1721 2,25 3 0,75 2,00 3 1,41 0,00 4 0,00 MAXF 1727 3,00 3 0,00 MAXF 1738 1,50 2 0,00 MAXF MX1 0,83 4 0,85 0,52 12 0,60 1,40 5 1,36 MAXF MCF7 1,25 3 0,25 1,17 3 0,62 0,25 4 0,43 MAXF MDA-MB 468 1,25 3 0,25 2,00 1 0,00 0,50 2 0,50 MEXF HT144 2,00 2 0,00 1,50 1 0,00 1,00 1 0,00 MEXF 274 0,17 4 0,24 0,88 8 1,02 3,00 2 0,00 9. Anhang 127 VEGF CATHEPSIN B Xenograft Mittelwert n SD MEXF 276 0,75 3 MEXF 384 0,00 MEXF 462 0,50 MEXF 514 MEXF 535 MMP-2 Mittelwert n SD Mittelwert 0,25 0,83 9 0,53 0,00 3 0,00 3 0,00 2,36 7 1,03 4 0,41 2,36 7 0,69 1,75 4 0,83 1,00 4 0,00 2,90 5 0,20 1,00 4 0,71 0,00 2 0,00 1,33 3 0,47 MEXF 622 0,00 4 0,00 1,50 2 0,00 n SD MEXF 695 1,00 2 0,00 0,90 5 0,80 1,50 2 0,50 MEXF 989 1,50 5 1,12 0,22 9 0,48 2,25 4 0,43 1,25 2 1,25 0,00 2 0,00 2,31 9 0,97 0,33 3 0,47 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 MEXF 1024 MEXF 1341 1,00 4 1,08 MEXF 1732 2,00 3 0,00 MEXF 1736 2,50 2 0,00 MEXF 1737 0,00 2 0,00 OVXF A2780 0,33 4 0,47 0,25 8 0,35 0,00 3 0,00 OVXF 369 0,00 2 0,00 0,50 6 0,50 0,50 2 0,50 OVXF 645 0,00 3 0,00 2,14 7 0,23 1,00 1 0,00 OVXF 899 1,67 4 1,25 1,92 6 0,84 3,00 2 0,00 OVXF 1023 1,63 5 1,19 2,00 9 0,78 2,25 4 0,43 OVXF 1353 0,75 3 0,25 0,83 6 0,90 1,50 2 0,50 OVXF 1692 3,00 2 0,00 2,50 1 0,00 OVXF 1724 3,00 2 0,00 3,00 2 0,00 1,50 2 0,50 OVXF 1754 1,50 2 0,00 3,00 1 0,00 0,00 1 0,00 PAXF 546 2,00 2 1,41 0,23 11 0,34 1,90 5 1,02 PAXF 736 0,00 2 0,00 0,85 6 0,96 2,42 3 0,52 PAXF 1657 1,33 3 0,58 2,63 4 0,48 1,88 4 0,85 1,00 2 0,00 PRXF 1252 PRXF 1369 2,00 3 0,00 2,00 2 0,00 0,00 1 0,00 PRXF 1655 0,00 2 0,00 2,00 1 0,00 0,00 1 0,00 PRXF 1658 0,00 2 0,00 1,50 1 0,00 0,00 1 0,00 PRXF DU 145LX 0,50 3 0,50 2,00 7 0,27 1,00 2 0,00 PRXF PC3 M 0,00 2 0,00 2,75 2 0,25 0,00 2 0,00 PXF 537 0,00 3 0,00 2,08 6 0,98 0,67 3 0,47 PXF 541 0,00 3 0,00 1,08 6 0,84 0,00 3 0,00 PXF 1118 0,00 3 0,00 1,79 7 0,65 0,50 3 0,41 PXF 1652 1,67 4 0,24 0,00 3 0,00 0,00 3 0,00 PXF 1752 0,00 2 0,00 1,50 1 0,00 PXF 1730 2,00 4 0,82 2,67 3 0,24 0,50 2 0,50 PXF 1741 1,50 2 0,00 2,50 1 0,00 RXF 393 2,67 4 0,47 2,00 6 0,96 1,67 3 1,25 0,50 5 0,63 RXF 423 RXF 486 0,67 4 0,47 2,19 8 0,50 3,00 3 0,00 RXF 488 0,00 2 0,00 0,64 7 0,87 2,50 2 0,50 RXF 631 0,50 3 0,50 1,58 6 0,61 3,00 3 0,00 RXF 944 2,00 4 1,41 1,46 11 0,91 0,36 4 0,41 RXF 1220 1,25 5 1,09 1,85 9 0,98 2,80 5 0,40 RXF 1393 0,50 3 0,50 1,50 7 1,00 3,00 1 0,00 RXF 1653 0,00 3 0,00 0,11 9 0,31 0,00 3 0,00 RXF 1733 RXF 1734 0,00 3 0,00 2,25 2 0,25 SXF 463 0,00 2 0,00 0,50 2 0,50 9. Anhang Xenograft 128 VEGF Mittelwert n SD CATHEPSIN B Mittelwert n SD MMP-2 Mittelwert n SD SXF 627 SXF 1186 1,00 2 0,00 2,50 6 0,91 SXF 1301 0,33 4 0,47 1,86 11 0,57 0,33 3 0,47 SXF 1410 1,00 3 1,00 0,13 4 0,22 0,75 2 0,25 SXF 1649 0,00 4 0,00 0,83 3 0,62 0,50 2 0,50 TXF 404 3,00 2 0,00 0,83 3 0,62 0,50 2 0,50 TXF 593 3,00 2 0,00 0,50 2 0,50 0,50 2 0,50 TXF 881 0,83 4 0,62 0,00 3 0,00 0,00 2 0,00 TXF 1207 1,00 2 0,00 0,00 2 0,00 TXF 1641 0,00 2 0,00 0,00 2 0,00 1,00 1 0,00 UXF 1138 LX 1,50 3 0,50 0,71 7 0,65 0,67 3 0,47 XF 575 0,00 3 0,00 0,88 6 1,02 2,25 4 0,83 XF HEP G2 LX 0,67 4 0,94 1,75 8 0,43 2,67 3 0,47 XF HEP LI 375 0,50 4 0,71 0,17 6 0,37 2,33 3 0,94 LEXF CCRF 0,75 3 0,75 0,00 3 0,00 0,00 3 0,00 LYXF 1189 1,75 3 0,25 0,00 3 0,00 0,00 3 0,00 1,00 1 0,00 0,00 1 0,00 XF HUH 7 LECL K 562 CEXF 610 1,00 3 1,00 2,00 1 0,00 0,00 1 0,00 CEXF 633 1,00 2 0,00 1,50 1 0,00 0,00 1 0,00 2,00 1 0,00 0,00 1 0,00 SeAx 1370 Niere 2,50 3 0,50 1,50 1 0,00 Haut 0,00 2 0,00 1,00 1 0,00 Kollagen I ß1-Integrin Ki-67 Wertung bis 4+ Xenograft Mittelwert Mittelwert n SD BXF 439 0,00 2 0,00 0,00 4 0,00 BXF 1036 2,50 BXF 1218 1,88 2 0,50 3,00 4 0,00 2 0,88 0,00 4 BXF 1258 0,00 2,50 1 0,00 0,00 4 0,00 0,00 1 0,00 BXF 1299 0,67 3 0,94 0,00 5 0,00 1,33 3 0,94 BXF 1304 1,00 0,00 1,50 1 0,00 1,33 3 0,47 0,00 4 0,00 2,00 1 0,00 3,50 2 0,50 2,33 3 0,47 1,67 3 1,70 n SD 1 BXF 1352 CXF DLD1 CXF 94 2,00 1 0,00 0,00 1 0,00 CXF/LS 147 0,33 3 0,47 1,25 4 0,43 Mittelwert n SD CXF 158 0,75 4 0,43 0,00 5 0,00 Colo 205 2,67 3 0,47 0,00 4 0,00 CXF 243 2,00 1 0,00 0,00 1 0,00 2,33 3 0,47 CXF 264 1,25 4 0,83 0,00 5 0,00 4,00 3 0,00 CXF 280 0,00 2 0,00 0,00 5 0,00 3,00 3 0,82 CXF 609 3,00 2 0,00 0,00 4 0,00 2,50 2 0,50 9. Anhang 129 Kollagen I ß1-Integrin Ki-67 Wertung bis 4+ Xenograft Mittelwert n SD Mittelwert n SD Mittelwert n SD CXF 883 2,00 1 0,00 0,00 5 0,00 1,00 3 0,71 CXF 886 1,00 1 0,00 0,00 1 0,00 1,33 3 0,47 CXF 975 0,00 4 0,00 CXF 1093 2,00 2 0,00 0,00 5 0,00 3,33 3 0,47 CXF 1103 0,75 4 0,83 0,00 5 0,00 4,00 3 0,00 CXF 1256 1,00 2 1,00 0,00 2 0,00 0,67 3 0,94 CXF 1297 1,00 2 0,00 0,20 5 0,40 4,00 3 0,00 CXF 1749 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 0,00 4 0,00 CXF 1729 CNXF SF 268 0,00 1 0,00 3,25 2 0,25 CNXF 295 2,50 4 0,87 0,00 4 0,00 0,00 2 0,00 CNXF 498 3,00 3 0,00 0,00 4 0,00 3,00 2 0,00 CNXF U 251X 3,00 4 0,00 0,00 4 0,00 1,00 2 0,00 GXF 97 1,25 4 1,30 0,00 5 0,00 3,00 3 1,41 GXF 209 1,00 3 1,41 0,00 5 0,00 3,06 3 0,34 GXF 214 0,00 3 0,00 0,00 5 0,00 0,25 2 0,25 GXF 251 0,67 3 0,47 0,00 5 0,00 3,67 3 0,47 GXF 281 1,00 1 0,00 0,00 1 0,00 1,67 3 0,47 GXF 324 3,00 1 0,00 0,00 1 0,00 1,89 3 0,16 HNXF 536 1,00 1 0,00 2,25 2 0,25 HNXF 908 1,83 3 0,62 0,00 4 0,00 4,00 2 0,00 HNXF 921 1,00 3,25 2 0,75 LCL ACCX 1,00 1 0,00 1,00 1 0,00 LXF 1680 0,00 4 0,00 2,75 4 0,43 0,50 2 0,50 LXFA 289 3,00 2 0,00 0,60 5 0,49 2,17 3 1,03 LXFA 297 2,25 4 0,83 0,50 4 0,50 1,00 2 0,00 LXFA 526 2,75 4 0,43 0,50 2 0,50 1,67 3 0,47 LXFA 592 0,67 3 0,94 0,00 5 0,00 1,56 3 0,42 LXFA 629 1,88 4 1,14 1,75 4 0,43 1,61 3 0,28 LXFA 677 1,67 3 1,25 3,00 5 0,00 2,00 3 0,00 LXFA 923 2,00 1 0,00 1,00 1 0,00 1,17 3 0,24 LXFA 983 0,00 3 0,00 0,00 5 0,00 1,33 3 0,47 LXFA 1012 0,00 3 0,00 0,00 5 0,00 1,00 3 0,00 LXFA 1041 1,00 2 1,00 0,80 5 0,75 1,50 3 0,71 LXFA 1335 0,00 4 0,00 1,20 5 1,17 2,22 3 1,10 LXFA 1584 1,00 1 0,00 0,00 5 0,00 3,44 3 0,79 LXFA 1647 2,00 3 0,00 1,30 5 0,40 3,00 3 0,00 LXFA 1670 0,00 2 0,00 0,00 1 0,00 0,00 2 0,00 LXFE 397 0,25 4 0,43 0,00 5 0,00 3,67 3 0,47 LXFE 409 0,67 3 0,94 0,00 5 0,00 3,67 3 0,47 LXFE 856 2,00 1 0,00 1,50 1 0,00 2,67 3 0,47 LXFE 909 0,25 4 0,43 0,00 5 0,00 0,89 3 0,16 LXFE 1422 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 3,00 2 0,00 LXFE 1472 1,00 1 0,00 1,00 1 0,00 2,83 3 0,62 1 0,00 9. Anhang 130 Kollagen I ß1-Integrin Ki-67 Wertung bis 4+ Xenograft Mittelwert n SD Mittelwert n SD Mittelwert n SD LXFL 529 0,00 4 0,00 0,40 5 0,49 1,11 3 0,96 LXFL 1029 LXFL 1072 LXFL 1674 LXFL 1743 0,00 1,00 1,00 0,00 1 3 3 1 0,00 0,82 0,82 0,00 0,00 0,50 0,75 0,00 1 4 4 4 0,00 0,50 0,43 0,00 3,67 1,22 4,00 3 3 2 0,47 0,31 0,00 LXFS 428 1,00 2 0,00 0,00 1 0,00 2,33 3 0,47 LXFS 538 1,33 3 0,47 0,00 5 0,00 3,00 3 0,82 LXFS 573 0,50 2 0,50 0,00 1 0,00 3,00 2 0,00 LXFS 605 0,00 2 0,00 0,00 1 0,00 2,83 3 0,24 LXFS 650 0,67 3 0,47 0,00 5 0,00 2,33 3 0,94 MAXF 401 0,38 4 0,41 0,00 5 0,00 1,33 3 0,47 MAXF 449 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 3,67 3 0,47 MAXF 583 MAXF 713 2,50 4 0,50 0,00 5 0,00 3,33 3 0,47 MAXF 857 0,00 4 0,00 0,00 5 0,00 0,00 2 0,00 MAXF 1162 2,00 3 0,00 0,00 5 0,00 2,00 3 0,00 MAXF 1322 2,00 1 0,00 0,00 1 0,00 2,33 3 0,47 MAXF 1384 1,00 1 0,00 2,00 1 0,00 3,00 3 0,82 MAXF 1691 0,33 3 0,47 0,25 4 0,43 1,00 1 0,00 MAXF 1721 1,33 3 1,25 0,00 4 0,00 MAXF 1727 1,33 3 1,25 0,00 1 0,00 MAXF 1738 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 MAXF MX1 0,83 3 0,24 0,00 5 0,00 3,00 3 0,00 MAXF MCF7 1,67 3 0,47 0,00 4 0,00 4,00 2 0,00 MAXF MDA-MB 468 1,75 2 0,75 0,00 4 0,00 MEXF HT144 0,00 1 0,00 0,00 3 0,00 MEXF 274 2,50 2 0,50 0,00 4 0,00 2,00 1 0,00 MEXF 276 1,75 2 0,25 0,00 1 0,00 1,00 3 0,82 2,00 1 0,00 1,33 3 0,47 3,00 4 0,00 1,22 3 0,31 0,00 4 0,00 2,00 2 0,00 MEXF 384 MEXF 462 2,00 2 0,00 MEXF 514 2,00 1 0,00 0,00 5 0,00 1,33 3 0,47 MEXF 695 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 1,00 3 0,00 MEXF 989 1,00 1 0,00 0,00 5 0,00 1,67 3 0,94 0,00 1 0,00 3,33 3 0,47 2,44 3 0,79 MEXF 535 MEXF 622 MEXF 1024 MEXF 1341 0,33 3 0,47 0,00 5 0,00 MEXF 1732 3,00 1 0,00 0,00 4 0,00 0,00 1 0,00 MEXF 1736 MEXF 1737 2,00 2 0,00 0,33 3 0,47 OVXF A2780 0,50 2 0,50 0,00 4 0,00 2,17 3 0,24 OVXF 369 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 2,67 3 0,47 0,00 1 0,00 3,00 2 1,00 OVXF 645 OVXF 899 1,00 3 1,41 0,00 4 0,00 2,50 2 1,50 OVXF 1023 0,75 4 0,43 0,50 4 0,50 3,00 3 0,00 OVXF 1353 2,00 1 0,00 0,00 1 0,00 3,00 3 0,82 OVXF 1692 1,50 2 1,50 OVXF 1724 0,00 2 0,00 1,75 2 0,25 9. Anhang 131 Kollagen I ß1-Integrin Ki-67 Wertung bis 4+ Xenograft Mittelwert n SD Mittelwert n SD OVXF 1754 0,00 1 0,00 0,00 3 0,00 Mittelwert n SD PAXF 546 2,33 3 0,58 2,25 4 PAXF 736 2,00 2 0,00 0,00 1,50 3,25 2 1,06 1 0,00 1,50 PAXF 1657 0,17 3 0,29 2,33 2 0,71 3 1,15 3,00 2 0,00 PRXF 1369 0,00 1 0,00 PRXF 1655 3,00 1 0,00 0,00 4 0,00 0,00 3 0,00 PRXF 1658 3,00 1 PRXF DU 145LX 0,00 2 0,00 0,00 3 0,00 0,00 2,50 4 0,50 0,00 3 0,00 PRXF 1252 PRXF PC3 M PXF 537 0,00 1 0,00 0,00 3 0,00 2,75 2 0,25 PXF 541 0,00 3 0,00 0,00 4 0,00 0,00 2 0,00 PXF 1118 0,75 2 0,25 3,00 3 0,00 2,00 2 1,00 PXF 1652 N 2,00 3 0,00 0,00 3 0,00 0,00 2 0,00 PXF 1752 0,00 1 0,00 1,67 3 0,47 PXF 1730 0,00 3 0,00 0,25 4 0,43 1,00 2 0,00 PXF 1741 0,00 1 0,00 3,00 1 0,00 RXF 393 0,33 3 0,47 0,60 5 0,49 2,00 3 0,82 0,00 1 0,00 1,00 1 0,00 1,63 4 0,22 1,50 2 0,50 0,00 1 0,00 0,50 2 0,50 0,82 0,75 4 1,30 1,67 3 0,47 RXF 423 RXF 486 0,67 3 0,94 RXF 488 RXF 631 2,00 RXF 944 1,33 3 0,62 0,00 4 0,00 3,00 3 0,82 RXF 1220 1,00 4 1,00 2,40 5 1,20 1,00 3 0,00 RXF 1393 2,50 2 0,50 0,00 5 0,00 0,50 2 0,50 RXF 1653 0,00 3 0,00 0,00 5 0,00 1,00 3 0,71 RXF 1733 0,00 1 0,00 RXF 1734 0,00 2 0,00 3 2,25 4 1,30 SXF 463 0,00 1 0,00 1,22 3 0,57 SXF 627 0,00 1 0,00 2,00 1 0,00 SXF 1186 0,00 1 0,00 3,33 3 0,47 0,00 5 0,00 2,33 3 0,47 0,00 1 0,00 2,83 3 0,62 SXF 1301 1,00 2 0,00 SXF 1410 SXF 1649 0,00 1 0,00 0,00 2 0,00 0,17 3 0,24 TXF 404 1,00 1 0,00 0,50 2 0,50 2,67 3 0,94 0,00 1 0,00 1,50 2 0,50 0,60 5 0,49 2,17 3 1,18 2,00 1 0,00 0,50 2 0,50 0,00 1 0,00 3,00 2 1,00 TXF 593 TXF 881 1,50 2 0,50 TXF 1207 TXF 1641 UXF 1138 LX 0,33 3 0,47 0,00 4 0,00 XF 575 1,00 2 1,00 0,00 4 0,00 XF HEP G2 LX 0,33 3 0,47 0,75 4 0,43 1,00 2 0,00 XF HEP LI 375 0,67 3 0,94 0,00 4 0,00 1,00 2 0,00 1 4 3 0,00 0,00 0,00 3,00 2 0,00 0,00 0,00 0,00 2 1 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 CEXF 610 0,00 1 0,00 3,00 4 CEXF 633 3,00 1 0,00 2,50 1 0,00 SeAx 1370 0,00 1 0,00 0,00 1 0,00 Niere 0,00 3 0,00 Haut 0,00 3 0,00 XF HUH 7 LEXF CCRF LYXF 1189 LECL K 562 9. Anhang 132 Tumorpathologie Xenograft Ursprung BXF 439 Met Histologie -- Stage -Grade T N M Urothel ca BXF 1036 Urothel ca BXF 1218 Urothel ca 1 Prim Urothel ca 4 2 BXF 1299 Prim Urothel ca 2 2 Urothel ca 3 2 BXF 1352 LK Urothel ca Prim Adeno ca CXF DLD1 CXF 94 1 243 146 1 544 Adeno ca CXF/LS 147 CXF 158 147 294 BXF 1258 BXF 1304 Überleben in Tagen postoperativ 3 245 Adeno ca Prim Colo 205 Adeno ca 2 2 0 0 987 Adeno ca CXF 243 Met Adeno ca 3 CXF 264 Rez Adeno ca 3 CXF 280 Met Adeno ca 4 1 CXF 609 Met Adeno ca 3 1 150 CXF 883 Prim Adeno ca 2 3 0 0 915 CXF 886 Met Adeno ca 3 3 1 1 653 Adeno ca 2 3 1 0 lebt 5475+ 3 1 CXF 975 CXF 1093 Adeno ca 2 CXF 1103 Rez Adeno ca 3 CXF 1256 Met Adeno ca 2 Adeno ca 3 Adeno ca 2 CXF 1297 CXF 1749 Met CXF 1729 Astrocytom CNXF 295 Glioblastoma multiforme 4 CNXF 498 Glioblastoma multiforme 4 CNXF U 251X GXF 97 Prim Glioblastoma multiforme Adeno ca 4 2 GXF 209 Prim Adeno ca 3 GXF 214 Prim Adeno ca 4 GXF 251 Prim Adeno ca 3 GXF 281 Prim Adeno ca 2 GXF 324 Prim Adeno ca 3 HNXF 536 Met Plattenepithel ca HNXF 908 Rez Plattenepithel ca 2 HNXF 921 Rez Plattenepithel ca 4 LXFA 289 Met LXFA 297 LK LXFA 592 LXFA 629 LK LXFA 677 LXFA 923 95 434 175 1 3 1 1 60 1 420 1 Adeno ca CNXF SF 268 LXFA 526 1 Met 4 0 4 2 4 1 860 0 699 1 14 0 107 1 133 1 101 3 1 286 55 Adeno ca 3 2 2 Adeno ca 4 2 2 Adeno ca 3 3 1 1 42 Adeno ca 4 1 0 0 771 Adeno ca 3 4 1 Adeno ca 3 2 2 1 15 2999 0 101 1 163 Adeno ca 3 LXFA 983 Adeno ca 3 1 31 1 90 LXFA 1012 Adeno ca 3 852 LXFA 1041 Adeno ca 2 72 9. Anhang Xenograft 133 Ursprung Histologie LXFA 1335 Adeno ca LXFA 1584 Adeno ca LXFA 1647 Met LXFA 1670 Grade T N M Überleben (Tage postop.) 1 137 3 Adeno ca 1 Bronchoalveoläres ca LXFE 397 Prim Plattenep ca 3 LXFE 409 Met Plattenep ca 4 LXFE 856 Plattenep ca 2 LXFE 909 Plattenep ca LXFE 1422 Plattenep ca LXFE 1472 Plattenep ca LXFL H 460 LCLC, undiff, klarzellig 4 1 1 6570 1 261 138 2 3 1 193 4 LXFL 529 Prim LCLC, undiff, klarzellig 4 3 1 0 115 LXFL 1029 Prim LCLC, undiff, klarzellig 4 2 2 1 180 LXFL 1072 Prim 2 1 1 90 LCLC, undiff, klarzellig 4 LXFL 1674 LCLC, undiff, klarzellig 4 LXFL 1743 LCLC, undiff, klarzellig 4 LXFS 428 Met SCLC, intermediär 4 LXFS 538 Met SCLC, intermediär 4 LXFS 573 1 1 118 1 28 1 312 1 53 SCLC LXFS 605 LK SCLC, “oat cell” 4 LXFS 650 Met SCLC, intermediär 2 MAXF 401 Met Papilläres Adeno ca 1 MAXF 449 Prim Duktales mamma ca 3 MAXF 583 MAXF 713 Met Prim Adeno ca Adeno ca 2 3 3 1 1 2 MAXF 857 Prim Duktales mamma ca 4 4 1 MAXF 1162 Prim Duktales mamma ca 3 4 0 MAXF 1322 Met Papilläres Adeno ca 3 MAXF 1384 Met Adeno ca 3 1 1 593 0 6533 1 0 40 0 132 859 1 32 30 MAXF 1691, 1721, 1727, 1738: keine Angaben MAXF MX1, MCF7, MDA-MB 468: keine Angaben MEXF HT144 MM MEXF 274 LK MM, amelanotisch 1 1 252 MEXF 276 LK MM, amelanotisch 0 1 321 MEXF 384 Met MM, amelanotisch 1 12 MEXF 462 Prim MM, amelanotisch MEXF 514 LK MM, melanotisch MEXF 535 LK MM, amelanotisch MEXF 622 Met MM 4 MEXF 695 Met MM, amelanotisch 3 1 30 MEXF 989 Met MM, melanotisch 3 1 90 MEXF 1024 Met MM, amelanotisch 3 1 122 MEXF 1341 Met MM, amelanotisch 1 305 MEXF 1732 LK MM, amelanotisch MEXF 1736 MM, amelanotisch MEXF 1737 MM, amelanotisch OVXF A2780 3 1 1 1 1 38 0 lebt 3285+ 1 118 1 1613 1 Undifferenziiertes ca 4 OVXF 369 Prim Undifferenziiertes ca 4 OVXF 645 Met Pap-serös. adeno ca 2 1 380 OVXF 899 Met Pap-serös. adeno ca 2 1 18 OVXF 1023 Met Pap-serös. adeno ca 3 1 790 OVXF 1353 Met Adenoides ca 3 OVXF 1609, 1724, 1754: keine Angaben 1139 1 1 9. Anhang 134 Xenograft Ursprung Histologie PAXF 546 Met Adeno ca PAXF 736 Met Adeno ca 3 PAXF 1657 Met Adeno ca 2 2 1 Adeno ca 3 3 2 Adeno ca 3 1 4 1 PRXF 1252 PRXF 1369 Met PRXF 1655 1 Adeno ca Pleuramesotheliom PXF 541 PXF 1118 Rez PM, biph, v.a. epithelial PM, biph, v.a. epithelial PXF 1652 Prim Pleuramesotheliom, epit PXF 1752 Prim Pleuramesotheliom PXF 1730 452 525 150 303 100 3 120 0 0 Pleuramesotheliom PXF 1741 Prim Pleuramesotheliom, epit RXF 393 Prim Nierenzell ca 3 2 RXF 423 Prim Nierenzell ca 1 3 RXF 486 Prim Nierenzell ca 3 3 RXF 488 Prim Nierenzell ca 1 RXF 631 Met Nierenzell ca 3 RXF 944 Met Nierenzell ca RXF 1220 Met RXF 1393 Met RXF 1653 RXF 1733 RXF 1734 1 0 228 0 1 404 0 1 186 3 0 0 2320+ 1 1 42 3 3 2 1 312 Nierenzell ca 2 3 1 1 60 Nierenzell ca 4 1 1 734 Met Nierenzell ca 2 1 150 Met Nierenzell ca Nierenzell ca SXF 463 1 Rhabdomyosarkom, embryonal Met Rhabdomyosarkom, pleo SXF 1186 Met Osteoblast. Osteosarkom SXF 1301 Rez Rhabdomyosarkom, pleo SXF 1410 Met SXF 1649 Met TXF 404 Prim Embryonales ca TXF 593 Met Embryonales ca TXF 881 Prim Terato ca TXF 1207 Prim TXF 1641 XF 575 1 Adeno ca PXF 537 UXF 1138 LX 30 1 Adeno ca Met PRXF PC3 M SXF 627 N M Überleben (Tage postop.) Adeno ca PRXF 1658 PRXF DU 145 LX Grade T 677 3 3 2 0 1 lebt 6205+ 1 200 0 331 Sarkom 1 lebt 3285+ Oseosarkom 1 299 1 3 lebt 6570+ lebt 5480+ Terato ca Terato ca Met Endometr. Carcinosarkom 3 1 1 4665 Hepatom XF HEP LI 375 Hepatom XF HEP G2 LX Hepatom XF HUH 7 Hepatom LEXF CCRF ALL LYXF 1189 NHL LECL K 562 CML CEXF 610 Zervix ca 74 CEXF 633 Zervix ca 161 SeAx 1370 Kutanes T-Zell-Lymphom 9. Anhang 135 Anhang B: Färbergebnisse des Zellinienarrays VEGF Cathepsin B ß1 Integrin VEGF MMP-2 Zellinie Mittelwert Mittelwert CCL HT 29 1,33 2,25 2,00 1,00 0,00 2,00 1,75 2,50 0,00 2,00 1,67 0,67 1,00 0,83 2,00 1,00 1,50 0,50 2,50 3,00 0,75 1,33 2,17 0,00 0,50 2,25 0,00 1,00 1,00 1,00 2,00 0,00 1,00 0,00 0,50 1,00 2,00 0,00 0,00 0,25 1,50 0,17 0,00 0,00 0,75 0,00 2,50 1,83 3,00 1,67 3,00 3,00 2,25 2,00 1,00 1,00 PRCL PC3 M 2,00 2,92 3,00 1,50 0,00 0,00 1,50 3,00 0,00 0,00 RXF 393 NL 0,50 1,00 1,00 0,00 0,50 0,00 1,00 Mittelwert 1,33 1,46 0,83 1,54 0,90 Anzahl 15,00 15,00 15,00 13,00 15,00 MEDIAN 1,33 1,50 0,00 1,50 1,00 GXF 251 L LXFA 526 L LXFA 629 L LXFE 66 NL LCL H 460 LXFL 529 L LXFL 1072 L MAXF 401 L MACL MCF-7 MEXF 276 L MEXF 462 L MEXF 514 L RXF 944 L Mittelwert Mittelwert Mittelwert 9. Anhang Wirkstoff 136 Sponsor Testphase Mechanismus Marimastat British Biotech Phase III: kleinzellige Lungenkarzinome Synthetischer MMP-Inhibitor COL-3 Collagenex, PA Phase I / II: Hirntumore und Kaposi Sarkom MMP Inhibitoren Neovastat BMS-275291 Synthetischer MMP-Inhibitor Tetracyclinderivat Aeterna, Phase II: Multiples Myelom Natürlich Québec Phase III: Nierenzellkarzinom, vorkommender Phase III: nicht kleinzelliges MMP-Inhibitor Lungenkarzinom Bristol-Myers Phase I / II: Kaposi Sarkom Synthetischer Squibb, CT Phase II / III: fortgeschrittenes Inhibitor von oder metastasiertes nicht MMP-2 und 9 kleinzelliges Lungenkarzinom AG 3340 Agouron, Phase III Inhibitor von MMP-2 und 3 BAY 12-9566 Bayer MMP-2 und 3 Inhibitor Breitspektrum CGS 27023A Novartis Integrin Inhibitoren - Entwicklung abgebrochen Phase I EMD 121974 (Cilengitide) Merck, Darmstadt Phase I: HIV-assoziierte „Small molecule“ Kaposi Sarkome Blockiert den Phase I / II: progressive oder Integrinrezeptor rezidivierende anaplastische Gliom Medi-522 MedImmune, Phase I / II: CPT-11 Antikörper (Vitaxin II) MD refraktäres, fortgeschrittenes, Blockiert den kolorektales Karzinom Integrinrezeptor Inhibitoren angiogener Faktoren, deren Rezeptoren oder Signaltransduktion SU 6668 Sugen, CA Phase I: fortgeschrittene Tumore SU 5416 Sugen, CA Phase III IFN-α im Handel erhältlich Phase II/III (siehe NCI Database) Avastatin N.C.I., MD Genentech, CA Phase II-III in einer vielzahl von Tumoren PTK 787 Novartis Phase I / II Blockiert die Signaltransduktion der Rezeptoren von VEGF, FGF und PDGF VEGFR-2 Antagonist Inhibition der VEGF und PDGF Produktion Monoklonaler Antikörper gegen VEGF Inhibition der VEGF-Rezeptor Thyrosinkinasen 9. Anhang 137 Direkte Inhibitoren der Endothelzellen Thalidomid Squalamin 2-ME im Handel erhältlich Genera Pharmaceuticals TNP-470 EntreMed, MD TAP Pharma Combrestatin Oxigene Phase I-III in einer Vielzahl von Tumoren Phase I: fortgeschrittene Tumore Phase II: Hirntumore, Ovarialkarzinom, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom Phase I: solide Tumore Unbekannt Fischleberextrakt Inhibitor der Na+/H+-Pumpe Inhibition von Endothelzellen Phase II Phase I Endostatin Entremed Weitere Wirkstoffe Pase I / II CAI N.C.I., (Carboxyamido- MD triazol) Phase I / II: verschiedene Tumoren, z.T. Kombinationstherapien Celecoxib Pharmacia IL-12 Genetics Institute, MA Cytran, WA Phase I: Prostatakarzinom Phase I / II: Zervixkarzinom Phase II: Basalzellkarzinom, metastasiertes Mammakarzinom Phase I / II: Kaposi Sarkom Hochregulierung von IFN-γ und IP10 Phase II: unbehandelte, unbekannt metastasierte, kolorektale Karzinome, Ovarialkarzinome IM 862 Inhibitoren des Kalzium Einstroms Reguliert die Phosphorylierung von FAK. COX-2 Inhibitor Anhang C: Auswahl einiger antiangiogener Substanzen. Stand: Februar 2002. Quellen: 1. Hidalgo M, Eckhardt SG: Development of matrix metalloproteinase inhibitors in cancer therapy. JNCI, 93(3): 178-191, 2001 2. Kerbel RS: Clinical trials of antiangiogenic drugs. J Clin Oncology, 19 (Sept 15 supplement): 45-51, 2001 3. National Cancer Institute, MD, USA: Angiogenesis inhibitors in clinical trials. http://www.cancer.gov 9. Anhang 138 Teile dieser Arbeit wurden publiziert: Wirth JG, Schandelmaier K, Tetling E, Fiebig HH, Burger AM: Tissue microarrays of human xenografts for the characterization and validation of new molecular targets in cancer therapy. Onkologie, 24, Suppl. 6: 234, 2001 (Poster auf der Jahrestagung der DGHO/ÖGHO) Schandelmaier K, Wirth JG, Tetling E, Fiebig HH, Burger AM: Correlation of HSP90, c-erbB2 and Bcl-2 alpha in a panel of 98 human tumor xenografts derived from patient explants. Onkologie, 24, Suppl. 6: 233, 2001 (Poster auf der Jahrestagung der DGHO/ÖGHO) Wirth JG, Schandelmaier K, Fiebig HH, Burger AM: Xenograft tissue microarrays: Applications in characterization and validation of new molecular targets. Vortrag im Rahmen der Jahrestagung der Gesellschaft Deutscher Chemiker (GDCh), Fachgruppe Medizinische Chemie. Mit einem Stipendium dotiert. Wirth JG, Tetling E, Fiebig HH, Burger AM: Halofuginone activity in relation to collagen type I, VEGF and MMP-2 expression in human tumor cell lines and xenografts in vitro and in vivo. Eur J Cancer, 38, Suppl. 7: 73, 2002 (Poster auf dem 14. EORTC-NCI-AACR Symposium, „Molecular targets and cancer therapeutics“) Burger AM, Schandelmaier K, Wirth JG, Grell M, Fiebig HH: The humanized monoclonal anti-EGFR antibody EMD72000 potently inhibits the growth of EGFRexpressing human tumor xenografts in vivo. Annual Meeting of the AACR, Toronto, March 2003. Wirth GJ, Schandelmaier K, Smith V, Burger AM, Fiebig HH. Microarrays of 41 human tumor cell lines for the characterization of new molecular targets: expression patterns of cathepsin B and the transferrin receptor. Oncology. 2006;71(1-2):86-94. 2007 Mar 8. Smith V, Wirth GJ, Fiebig HH, Burger AM. Tissue microarrays of human tumor xenografts: characterization of proteins involved in migration and angiogenesis for applications in the development of targeted anticancer agents. Cancer Genomics Proteomics. 2008 Sep-Oct;5(5):263-73. 9. Anhang 139 Danksagung Herrn Prof. Dr. H. H. Fiebig danke ich für die Überlassung des Themas, die Bereitstellung sämtlicher Materialien und Laborkapazitäten und die stete und freundliche Förderung meiner Arbeit. Herrn Prof. Dr. H.-E. Schaefer danke ich für seine Bereitschaft, die Zweitbegutachtung zu übernehmen. Frau Priv. Doz. Dr. A.M. Burger danke ich besonders herzlich für die ausgezeichnete Betreuung meiner Arbeit. Ihr fachkundiger Rat, die vielen, konstruktiven Diskussionen und die kritische Beurteilung der Experimente waren außerordentlich wertvoll. Auch für ihre praktische Hilfe bei dem Entwurf des Manuskriptes bin ich ihr sehr dankbar. Sie schaffte es, in mir die Begeisterung und die Motivation für die Arbeit in der experimentellen Krebsforschung zu wecken. Des Weiteren möchte ich allen Mitarbeitern meinen Dank für die angenehme Zusammenarbeit aussprechen, namentlich Herrn Dr. G. Kelter, Frau B. Treyer und Herrn R. Vollmer für die Hilfe beim Kultivieren der Zellen, Frau E. Tetling und Frau S. Ribiero für die Unterstützung beim Sammeln, Einbetten und Färben der Gewebe, Frau C. Steidle, Frau V. Jung, Frau S. Kissel und Frau E. Simon für die Hilfe bei in vivo Untersuchungen, Herrn Dr. F. Dai und Frau Dr. V. Smith für die Ratschläge zum Western Blotting und Frau H. Willmann und Frau M. Weissmann für die organisatorische Hilfe. Frau Kathrin Schandelmaier danke ich für die freundliche Unterstützung, die Anteilnahme an den kleinen und großen Problemen des Doktorandenalltags sowie die fröhlichen gemeinsamen Stunden im Labor.
