Nutzen und Risiken von Silber und Silberverbindungen in Folien mit
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Tierärztliche Hochschule Hannover Empfindlichkeit ESBL-bildender E. coli gegenüber Bioziden und Einfluss des Biozids Silber auf Folien mit Lebensmittelkontakt auf die mikrobiologischen und physiko-chemischen Eigenschaften von Putenfleisch INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von Daniela Deus Georgsmarienhütte Hannover 2017 Wissenschaftliche Betreuung: 1. PD Dr. Corinna Kehrenberg, PhD Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit 2. PD Dr. Carsten Krischek Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit 1. Gutachter: Es wird ein gemeinsames Gutachten erstellt von: PD Dr. Corinna Kehrenberg Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit PD Dr. Carsten Krischek Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Pablo Steinberg Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik Tag der mündlichen Prüfung: 17.05.2017 Das Projekt wurde durch die Ahrberg-Stiftung finanziell unterstützt. Meiner Familie Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ............................................................................................................................... 1 1.1 Rechtliche Vorgaben ........................................................................................................ 2 1.2 Biozide.............................................................................................................................. 3 1.2.1 Definitionen und Anwendung im Lebensmittelbereich ............................................ 3 1.2.2 Wirkungsweise und Zielstrukturen für Biozide ........................................................ 4 1.2.2.1 Quartäre Ammoniumverbindungen.................................................................... 5 1.2.2.2 Biguanidine ........................................................................................................ 6 1.2.2.3 Acridine .............................................................................................................. 6 1.2.2.4 Schwermetalle .................................................................................................... 6 1.2.2.5 Nanosilber .......................................................................................................... 8 1.3 Einsatz von Nanosilber als antimikrobielle Substanz in der Lebensmittelindustrie ........ 9 1.3.1 Einsatz von Nanosilber-beschichteten Lebensmittelkontaktmaterialien................... 9 1.3.2 Rechtl. Vorgaben für Nanosilber in Lebensmittelkontaktmaterialien ...................... 9 1.4 E. coli in der Lebensmittelhygiene ................................................................................. 10 1.4.1 Besonderheit von extended-spectrum β-Lactamase-bildenden E. coli ................... 11 2. Publikationen ........................................................................................................................ 12 2.1 Publikation 1: Comparative analysis of the susceptibility to biocides and heavy metals of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli isolates of human and avian origin, Germany ................................................................................................................... 14 2.2 Publikation 2: Effect of a nano-silver coating on the quality of fresh turkey meat during storage after modified atmosphere or vacuum packaging .................................................... 16 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion ...................................... 18 3.1 Vergleichende Analyse der MHK-Werte für ADH, BEN, BKC, ACR, CHX und COP ESBL-bildender E. coli in Bezug auf Herkunft und ESBL-Typ .......................................... 19 3.2 Nachweis und Häufigkeit von Biozid- und Schwermetall-Toleranz vermittelnden Genen .............................................................................................................................................. 20 3.3 Empfindlichkeit ESBL-bildender E. coli gegenüber Silbernitrat in Bezug auf Herkunft und ESBL-Typ ..................................................................................................................... 21 3.4 Einfluss des Folientyps auf verschiedene Fleischbeschaffenheitsparameter ................. 22 3.5 Einfluss des Folientyps auf die Keimzahlen bei inokulierten Putenfleisch ................... 26 4. Zusammenfassung ................................................................................................................ 28 5. Summary .............................................................................................................................. 31 6. Literaturverzeichnis .............................................................................................................. 33 6.1 Verordnungen ................................................................................................................. 42 7. Danksagung .......................................................................................................................... 43 Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celcius µg Mikrogramm ADH Alkyldiaminoethylgylcinhydrochlorid ACR Acriflavin a*-Wert Rotwert BA Biogene Amine BEN Benzethoniumchlorid BfR Bundesinstitut für Risikobewertung BKC Benzalkoniumchlorid Ca Kalzium QAC quarternary ammonium compounds cfu colony forming units CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CO2 Kohlenstoffdioxid COP Kupfersulfat Cu Kupfer DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft EC Electrical conductivity ECHA Europäische Chemikalienagentur EDX energy-dispersive X-ray spectroscopy EFSA European Food Safety Authority ESBL Extended- Spectrum β-Lactamase EVOH ethylene vinyl alcohol g Gramm GKZ Gesamtkeimzahl h Stunden KBE Kolonie bildende Einheiten LB-Agar Luria Bertani - Agar L*-Wert Helligkeitswert Log10 Dekadischer Logarithmus LSM Last square mean MAP Modified Atmosphere Packaging Mb Myoglobin MDA Malondialdehyd MetMB Metmyoglobin MHK Minimale Hemmkonzentration MIC Minimal inhibitory concentration mg Milligramm ml Milliliter mm Millimeter mM Millimol m/S Millimeter pro Sekunde mS/cm Millisiemens/Centimeter N Anzahl der Probanden ng Nanogramm nm Nanometer NaCl Natriumchlorid NaHPO4 Natriumphosphat OxyMb Oxymyoglobin O2 Sauerstoff P Phosphor PA Polyamid PE Polyethylen PP Polypropylen PSE pale, soft, exsudative p. m. post mortem RH relative humidity SCENIHR Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks SD standard deviation SIL Silbernitrat TBARS thiobarbituric acid reactive substances TVC total viable count V Vakuum ZKC Zinkchlorid Teilergebnisse dieser Dissertation wurden an folgenden Stellen veröffentlicht: Vorträge: Deus, D., I.-A. Kernberger, C. Krischek, Y. Pfeifer, G. Klein, F. Reich, B. Strommenger, C. Kehrenberg, (2013): Nutzen und Risiken von Silber und Silberverbindungen in Folien mit Lebensmittelkontakt hinsichtlich der Hygiene und Beschaffenheit von verpacktem Schweine-, Rind-, Puten- und Hähnchenfleisch Vortragsveranstaltung im Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit Deus, D., F. Schill, F. Reich, C. Kehrenberg (2014): Extended-Spectrum-β-Lactamase produzierende Escherichia coli Doktorandenseminar am Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Hannover Poster: Deus, D., C. Krischek, Y. Pfeifer, G. Klein, F. Reich, C. Kehrenberg (2014): Empfindlichkeit gegenüber Silbernitrat und weiteren Bioziden bei Extended-Spectrum βLactamase (ESBL) produzierenden Escherichia coli - Isolaten humanen und tierischen Ursprungs 55. Arbeitstagung der Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der DVG e. V., GarmischPatenkirchen vom 23.09.2014 bis 26.09.2014, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle (Sonderausgabe), S. 145. Deus, D., C. Krischek, Y. Pfeifer, G. Klein, F. Reich, C. Kehrenberg (2015): In-vitro Susceptibility to eight Biocides in Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) producing Escherichia coli isolates of human and avian origin “One health - New Challenges”, First International Symposium of Veterinary Medicine (ISVM2015); Novi Sad, Serbia. Book of Abstracts, ISBN 978-86-82871-37-8, S.142 1. Einleitung 1. Einleitung Im Rahmen der Lebensmittelproduktion finden biozid wirkende Substanzen aufgrund ihrer antimikrobiellen Eigenschaften derzeit breite Verwendung. Sie werden auf verschiedenen Ebenen des Herstellungsprozesses eingesetzt: In der Tierhaltung zur Desinfektion der Ställe, im Rahmen der Personalhygiene als Händedesinfektionsmittel oder zur Schuhsohlendesinfektion, bis hin zur Reinigung der Lebensmittelbereiche und in Verpackungsmaterialien. Die Einsatzmöglichkeiten sind sehr vielfältig. Auch Metalle wie Silber haben antibakterielle Eigenschaften und zählen offiziell zu den Bioziden (ECHA, 2017). Mit Einführung der Nanotechnologie wird Silber derzeit in Form von Nanosilber in vielen Alltagsprodukten eingesetzt, in Japan und den USA z.B. in Lebensmittelbehältnissen. Durch die sehr geringe Größe (bis 100 nm) der Silberpartikel kommt es zu veränderten Stoffeigenschaften und vermutlich zu einer Steigerung der antibakteriellen Wirkung (CHOI et al, 2008). Da die Verbraucher hohe Anforderungen an die Qualität und Sicherheit von verpacktem Fleisch haben, setzt die Lebensmittelindustrie neben den gängigen Verpackungsmethoden unter Schutzgasatmosphären (MAP) oder Vakuum auch „aktive“ Verpackungen z.B. mit antibakteriellen Beschichtungen der Verpackungsmaterialien ein. Dies soll die mikrobielle Kontamination des verpackten Fleisches noch weiter vermindern. Es ist bekannt, dass insbesondere Geflügelfleisch während des Schlachtprozesses stark mit Keimen belastet wird. Dabei spielen Zoonoseerreger wie Campylobacter spp. und Salmonellen eine bedeutende Rolle, ebenso wie Escherichia coli (E. coli) mit erweitertem Resistenzspektrum (extendedspectrum β-Lactamase (ESBL)-bildende E. coli), welche häufig auf Geflügelfleisch nachgewiesen werden (DIERIKX et al., 2013). Daher ist es von besonderem Interesse, bei Geflügelfleisch eine Keimreduktion mittels „aktiver“ Verpackungen zu erwirken, so dass dieses sicher in Verkehr gebracht werden kann und dessen Haltbarkeit verlängert wird. Problematisch sind jedoch die potentielle Toleranz-/ Resistenzentwicklung von Bakterien gegenüber den eingesetzten Bioziden sowie mögliche Veränderungen in der Fleischbeschaffenheit (z.B. Farbe, pH-Wert) (GILBERT et al., 2003; CHOPRA, 2007). Somit ist eine Risiko-Nutzen-Abwägung des Einsatzes von antibakteriellen Substanzen in Lebensmittelkontaktmaterialien notwendig. Diese beiden Aspekte wurden in der vorliegenden Arbeit aufgegriffen. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurden humane und aviäre ESBL-bildende E. coli mittels Mikrodilutionsverfahren hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Silberionen und sieben 1 1. Einleitung weiteren Bioziden getestet, um die Empfindlichkeitslage dieser resistenten Keime zu ermitteln. Im zweiten Teil wurde in einer anwendungsbezogenen Studie der Nutzen einer kommerziellen, mit dem Biozid Silber in Nanoform beschichteten Lebensmittelkontaktfolie auf die mikrobiologischen und physikochemischen Eigenschaften von natürlich kontaminiertem, sowie spezifisch mit ESBL-bildenden E. coli kontaminiertem Putenfleisch untersucht. 1.1 Rechtliche Vorgaben Die Verordnung 178/2002 stellt die Basisverordnung des EU-Lebensmittelrechts dar. Sie beinhaltet allgemeine Grundsätze und Anforderungen an die Lebensmittelsicherheit und berücksichtigt auch den Bereich der Materialien und Gegenstände, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen. In Verbindung mit anderen EU Verordnungen (z.B. VO (EG) 1935/2004, VO (EG) 10/2011) soll sichergestellt werden, dass in der Europäischen Union nur Lebensmittelkontaktmaterialien auf den Markt gelangen und verwendet werden, die „unter normalen und vorhersehbaren Verwendungsbedingungen keine Bestandteile auf Lebensmittel in Mengen abgeben, die geeignet sind, die menschliche Gesundheit zu gefährden oder eine unvertretbare Veränderung der Zusammensetzung der Lebensmittel herbeizuführen oder eine Beeinträchtigung der organoleptischen Eigenschaften der Lebensmittel herbeizuführen.“ In diesem Zusammenhang fällt auch die Verwendung von Bioziden auf Lebensmittelkontaktmaterialien unter die einschlägigen EU-Verordnungen. Grundsätzlich unterliegen Produkte, die als Biozide eingesetzt werden sollen, der Zulassungspflicht. Biozidprodukte dürfen nur Wirkstoffe enthalten, die in der Unionsliste der genehmigten Wirkstoffe aufgeführt sind. Die Zulassung eines Wirkstoffes erfolgt immer im Hinblick auf die Produktart. Dabei werden 22 Produktarten unterschieden. Auf europäischer Ebene finden die BiozidVerordnung 528/2012 zur Wirkstoffprüfung und die VO (EG) 1272/2008 für eine Bewertung der toxikologischen Eigenschaften Anwendung. Ziel der Biozid-Verordnung ist es, im Rahmen einer Wirkstoffprüfung ein einheitlich hohes Schutzniveau für die Gesundheit von Mensch und Tier, das Grundwasser und die Umwelt in allen Mitgliedsstaaten zu etablieren und Wettbewerbsverzerrungen und Handelshemmnisse zwischen den einzelnen Mitgliedsstaaten infolge unterschiedlicher Zulassungspraktiken abzubauen. Die aktuelle Liste der zugelassenen Biozide (Positiv-Liste) kann über die Homepage der Europäischen 2 1. Einleitung Chemikalienagentur (ECHA, 2017) eingesehen werden. Nur Stoffe, die in diese Liste aufgenommen wurden, dürfen als Biozide eingesetzt werden. Für sogenannte „Altwirkstoffe“, zu welchen auch Silber und Kupfer gehören, gibt es Übergangsregelungen. Das bedeutet, dass sie bis zur Genehmigung vorläufig zugelassen sind. Altwirkstoffe sind Stoffe, die bereits vor dem Jahre 2000 auf dem Markt waren. Die ohne Zulassung verkehrsfähigen Biozidprodukte sind dem Anhang II der VO (EG) 1062/2014 zu entnehmen. Dort sind neben den Elementarformen der Schwermetalle Silber und Kupfer, unteranderem auch deren Verbindungen wie Silbernitrat, Silberzeolith, Silber-Zink-Zeolith und Silber-Kupfer-Zeolith aufgeführt. 1.2 Biozide 1.2.1 Definitionen und Anwendung im Lebensmittelbereich In der VO (EG) 528/2012 ist der Begriff Biozidprodukt definiert als „jeglicher Stoff oder jegliches Gemisch in der Form, in der er/es zum Verwender gelangt, und der/das aus einem oder mehreren Wirkstoffen besteht, diese enthält oder erzeugt, der/das dazu bestimmt ist, auf andere Art als durch bloße physikalische oder mechanische Einwirkung Schadorganismen zu zerstören, abzuschrecken, unschädlich zu machen, ihre Wirkung zu verhindern oder sie in anderer Weise zu bekämpfen.“ Als Schadorganismus wird dabei „ein Organismus, einschließlich Krankheitserreger, der für Menschen, Tätigkeiten des Menschen oder Produkte, die von Menschen verwendet oder hergestellt werden, oder für Tiere oder die Umwelt unerwünscht oder schädlich“ ist, bezeichnet. Biozidprodukte können in vier Gruppen unterteilt werden: 1. Desinfektionsmittel 2. Schutzmittel 3. Schädlingsbekämpfungsmittel und 4. Sonstige Biozidprodukte. Zur Hauptgruppe „Desinfektionsmittel“ gehören Produkte für die menschliche Hygiene, Desinfektionsmittel für den Privatbereich 3 und den Bereich des öffentlichen 1. Einleitung Gesundheitswesens, Biozidprodukte für den Veterinärbereich, Desinfektionsmittel für den Lebensmittel- und Futtermittelbereich und Trinkwasserdesinfektionsmittel. „Schutzmittel“ umfassen beispielsweise Topf-Konservierungsmittel zum Schutz von Fertigerzeugnissen (außer Lebens- oder Futtermittel), Holzschutzmittel und Schutzmittel für Fasern, Leder oder Gummi. Unter „Schädlingsbekämpfungsmitteln“ werden unter anderem Rodentizide, Avizide, Molluskizide, Repellentien und Insektizide verstanden. Zu den „Sonstigen Biozid-Produkten“ zählen beispielhaft Schutzmittel für Lebens- und Futtermittel. Der Fokus dieser Dissertationsschrift liegt auf der Gruppe der Desinfektionsmittel und der sonstigen Biozid-Produkte. Dabei handelt es sich um Chemikalien mit antiseptischen, desinfizierenden und konservierenden Eigenschaften. Die Einsatzmöglichkeiten umfassen die Oberflächendesinfektion, die Verwendung als Antiseptikum zur Hautdesinfektion oder als Konservierungsstoff in pharmazeutischen Produkten und in Kosmetika, um Kontaminationen mit Bakterien vorzubeugen (Russell, 2003). Für die Anwendung in Lebensmittelunternehmen hat die Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG) eine Liste erstellt, in der Biozide gelistet sind, die nach bestimmten Richtlinien geprüft und als Desinfektionsmittel im Lebensmittelbereich für wirksam befunden wurden (DVG, 2017). 1.2.2 Wirkungsweise und Zielstrukturen für Biozide Im Gegensatz zu Antibiotika haben Biozide ein breiteres Wirkungsspektrum und wirken auf zellulärer Ebene an mehreren, unspezifischen Zielstrukturen (z.B. Zellwand, Proteine, DNA) gleichzeitig (GILBERT et al., 2003). Die Bandbreite an Bioziden umfasst Stoffe aus folgenden Gruppen: Alkohole, Acridine, Aldehyde, Anilide, Biguanidine, Bisphenole, Diamidine, Halogene, Halophenole, Schwermetalle, Peroxygene, Phenole und quartäre Ammoniumverbindungen. Im Folgenden wird auf die in dieser Dissertationsschrift getesteten Biozide, ihre Wirkmechanismen und Resistenzlage näher eingegangen. 4 1. Einleitung 1.2.2.1 Quartäre Ammoniumverbindungen Benzethoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid und Alkyldiaminoethylglycinhydrochlorid sind wie alle quartären Ammoniumverbindungen (QACs) membranaktive Substanzen und greifen die zytoplasmatische Membran von Bakterien sowie die Plasmamembran von Hefen an (GERBA, 2015). Aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften sind sie zudem wirksam gegen lipidhaltige Viren (GERBA, 2015). Sie greifen intrazelluläre Zielstrukturen an und binden an die DNA (ZINCHENKO et al., 2004). In niedrigen Konzentrationen wirken sie bakteriostatisch, in hohen Konzentration bakterizid (GERBA, 2015). Den genauen Wirkmechanismus beschrieben MCDONELL et al. (1999): 1. Adsorption und Penetration der Zellwand, 2. Reaktion mit der zytoplasmatischen Membran, gefolgt von Membranzerstörung, 3. Verlust von intrazellulärem niedrig-molekularen Material, 4. Degradation von Proteinen und Nukleinsäuren und 5. Wandlyse durch autolytische Enzyme. Alles in allem führt dies zu einem Struktur- und Integritätsverlust der zytoplasmatischen Membran. QACs werden heutzutage in vielen Bereichen des täglichen Lebens (Zahnpasta, Deodorants, Kosmetika) eingesetzt. Außerdem finden sie im Gesundheitswesen, der Tierhaltung und in der Lebensmittelproduktion bei der Oberflächendesinfektion Anwendung. Eine langfristige Anwendung kann zur Toleranzausbildung gegenüber QACs bei Bakterien führen. Eine echte Resistenzausbildung ist allerdings aufgrund der unspezifischen Wirkmechanismen sehr unwahrscheinlich (GERBA, 2015). Verschiedene Gene wie qacE, qacE∆1, qacF, qacG, qacH, emrE, mdfA, sugE(c), sugE(p), oqxA und oqxB werden mit einer Toleranzentstehung gegenüber QACs in Verbindung gebracht (PAL et al., 2014; Zou et al., 2014). Sie kodieren teils für Efflux-Pumpen oder für Teile von Multidrug-Transportern, welche die intrazelluläre Konzentration des Biozids reduzieren. Aufgrund des sehr breiten und unspezifischen Substratspektrums vermitteln sie auch Toleranzen gegenüber Bioziden anderer Stoffgruppen, wie zum Beispiel Chlorhexidin oder Acriflavin, aber auch gegenüber Antibiotika (GILBERT et al., 2003). 5 1. Einleitung 1.2.2.2 Biguanidine Chlorhexidin ist eine membranaktive Substanz, welche durch Zerstörung der äußeren Zellschichten der Bakterien passiv in die Zelle diffundieren kann und anschließend die zytoplasmatische Membran angreift, so dass zelluläre Bestandteile austreten (MCDONELL et al., 1999). In hohen Konzentrationen führt Chlorhexidin zur Koagulation des Zytoplasmas. Chlorhexidin wirkt gegen nicht-sporenbildende Bakterien und Hefen. Der Effekt gegen Viren ist abhängig von der viralen Hülle; Viren mit lipidhaltigen Hüllen sind empfindlicher als Viren mit nicht-lipidhaltigen Hüllen. Aufgrund seines breiten Wirkungsspektrums und seiner guten Verträglichkeit findet Chlorhexidin in vielen Antiseptika für die Hand- und Mundhygiene Anwendung (MCDONELL et al., 1999). Ein spezifisches Resistenzgen (cepA), welches für eine Efflux-Pumpe kodiert, konnte bei Klebsiella pneumoniae nachgewiesen werden (PAL et al., 2014). Des Weiteren vermitteln die im Kapitel 1.2.2.1 bereits erwähnten Gene qacE, qacE∆1, qacF, qacG, qacH, emrE, mdfA, sugE(c), sugE(p), oqxA und oqxB ebenfalls verminderte Empfindlichkeit gegenüber Chlorhexidin (PAL et al., 2014; ZOU et al., 2014). 1.2.2.3 Acridine Acriflavin als Vetreter der Gruppe der Acridine wird hauptsächlich zur Wundbehandlung verwendet und wirkt über eine Zerstörung der bakteriellen Zellmembran antimikrobiell (KAWAI et al., 2009). Toleranzen gegenüber Acriflavin werden über die im Zusammenhang mit den QAC Toleranzen genannten Resistenzgene qacE, qacE∆1, qacF, qacG, qacH, emrE, mdfA, sugE(c), sugE(p), oqxA, oqxB vermittelt (PAL et al., 2014; ZOU et al., 2014). Bei E. coli und Salmonella enterica sind zusätzlich die chromosomal lokalisierten Resistenzgene acrA, acrB, acrC und acrD bekannt, welche Teile von Effluxpumpen kodieren und somit Toleranz vermitteln können (Ma et al., 1993). 1.2.2.4 Schwermetalle Kupfer, Silber und Zink besitzen antibakterielle Eigenschaften aufgrund der Fähigkeit ihrer Ionen, an die negativ geladene Zellwand von Bakterien zu binden, Enzyme zu deaktivieren 6 1. Einleitung und die Membranpermeabilität zu stören (CHOI et al., 2008). Zusätzlich binden sie an die DNA und bewirken deren Denaturierung. Dies führt letztendlich zu einem Absterben der Bakterienzelle. Schwermetalle werden schon seit Jahrhunderten aufgrund ihrer desinfizierenden Eigenschaften eingesetzt. So kann der Einsatz von Silbernitrat zur Wundbehandlung beispielsweise bis ins 18. Jahrhundert zurückverfolgt werden (KLASEN, 1999). Aber auch heute noch werden Silberverbindungen in der Medizin eingesetzt, wie zum Beispiel in Bandagen, Prothesen und Kathetern (CHOPRA, 2007). Kupfer wird unter anderem aufgrund seiner antimikrobiellen Effekte in Wasserleitungen verwendet oder auch in Krankenhäusern zur Beschichtung von Lichtschaltern und Türklinken. Sowohl Zink-, als auch Kupferverbindungen werden neben anderen Anwendungsbereichen zu veterinärmedizinischen Zwecken, z.B. in Klauenbädern eingesetzt. Der weit verbreitete Einsatz der antimikrobiellen Metalle kann jedoch zu einer Selektion toleranter Bakterien führen. So wurden bei Salmonella Typhimurium die Toleranz vermittelnden Gene silA, silB, silC, die sämtlich Komponenten des silABC Kationen-Efflux-Systems kodieren, sowie die Gene silE und silP, welche ebenfalls zum Kationen-Efflux-System gehören, aber auch individuell Toleranzen gegenüber Silber vermitteln können, beschrieben (GUPTA et al., 1999). SilE kodiert dabei für ein Bindungsprotein und silP für eine ATPase, welche Silberionen aus der Zelle transportiert. Zusätzlich ist noch das Gen silF bekannt, welches für ein periplasmatisches Protein kodiert, welches ebenfalls dem SilABC Efflux-System zugeordnet wird (GUPTA et al., 1999). Für E. coli sind mehrere Kupferresistenzmechanismen bekannt (BONDARCZUK et al., 2013). Zum einen gibt es das cue-System, welches für den Efflux von Kupferionen verantwortlich ist und aus den zwei Komponenten, einer ATPase (kodiert durch copA) und einer periplasmatischen Multicopper-Oxidase (kodiert durch cueO) besteht (RENSING u. GRASS, 2003). Zum anderen ist noch das cus-System bekannt, welches für die periplasmatische Detoxifikation verantwortlich ist. Es besteht aus vier Proteinen: CusCBA (Efflux) und CusF (periplasmatisches Chaperon) (GRASS u. RENSING, 2001 a). Neben der Toleranzvermittlung gegenüber Kupfer soll dieses System auch Silber-Toleranzen vermitteln. Für E. coli wurde neben diesen beiden genannten chromosomal kodierten Systemen, auch das plasmidkodierte System pcoABCDRSE beschrieben (BROWN et al., 1995). Die beiden wichtigsten Proteine dieses Systems sind PcoA, welches, ähnlich wie CueO, als MulticopperOxidase fungiert und PcoC, welches periplasmatische Kupferionen bindet und diese zu dem Protein PcoA transportiert. Für Zinktoleranzen wurde bei Salmonella Typhimurium das Gen zraP beschrieben, welches für ein periplasmatisches Bindungsprotein kodiert und bei E. coli 7 1. Einleitung die Genkombination zitB/ybgR, welche ein Effluxsystem für Zink-Ionen kodiert (GRASS et al., 2001 b; APPIA-AYME et al., 2012). Bei Pseudomonas aeruginosa wurde zudem das czrSRCBA Efflux-Operon nachgewiesen (HASSAN et al., 1999). Des Weiteren sind eine Reihe von Genen (czrA, dsbA, fieF/yiip) bekannt, die Toleranz gegenüber mehreren Metallen vermitteln, wie zum Beispiel gegenüber Zink, Cadmium, Nickel, Quecksilber und Kupfer (PAL et al., 2014). 1.2.2.5 Nanosilber Als Nanopartikel werden Teilchen mit einer Größe von bis zu 100 nm bezeichnet. Durch diese kleine Form der Silberpartikel kommt es zu einer Vergrößerung des Oberflächen – Volumen – Verhältnisses, wodurch Silbernanopartikel erweiterte Eigenschaften hinsichtlich der Optik, Leitfähigkeit, aber auch der antimikrobiellen Aktivität besitzen (DORIA et al., 2012). Hinzu kommt, dass Silbernanopartikel aufgrund ihrer kleinen Größe die Zellwand von Bakterien direkt durchdringen und so in Form eines Depots im Zellinnern die toxischen Ionen kontinuierlich freisetzen können. Wie der wissenschaftliche Ausschuss „Scientific Commitee on Emerging and Newly Identified Health Risks“ (SCENHIR) der Europäischen Union festgestellt hat, findet Nanosilber aufgrund der keimreduzierenden Eigenschaft bereits großflächigen Einsatz Geschirrspülmaschinen, in Haushaltsprodukten Kühlschränken, wie zum Beispiel Schneidebrettchen, Babyfläschchen, Toilettensitzen, in Hygieneartikeln wie Zahnpasta, Zahnbürste und Deodorants und auch in Textilien wie Sportbekleidung, Unterwäsche, Bettwäsche und Matratzen (SCENHIR, 2014). Im medizinischen Bereich wird Nanosilber in Kathetern, Verbandsmaterial und als Antiseptikum verwendet. Im Lebensmittelbereich wird es in Lebensmittelbehältnissen, in Verpackungsmaterialien und als Zusatzstoff verwendet. Durch diesen breitgefächerten Einsatz von Nanosilber, besteht das Risiko der Toleranzentstehung von Bakterien gegenüber Silber. Eine dauerhafte Exposition der Bakterien gegenüber geringen Konzentrationen von Silberionen kann dazu führen, dass weniger empfindliche Bakterien selektiert werden und sich entsprechend verbreiten (MAILLARD u. HARTEMANN, 2013). Aufgrund dieser potentiellen Gefahr stellt sich die Frage, inwiefern der Einsatz von Nanosilber in diversen Alltagsprodukten und in der Lebensmittelindustrie von Nutzen ist oder eher Risiken birgt. 8 1. Einleitung 1.3 Einsatz von Nanosilber als antimikrobielle Substanz in der Lebensmittelindustrie 1.3.1 Einsatz von Nanosilber-beschichteten Lebensmittelkontaktmaterialien Neben den herkömmlichen Verpackungsmethoden (MAP, Vakuumieren), werden zunehmend „aktive“ Verpackungsmethoden verwendet, welche durch Inkorporation antimikrobieller Substanzen in die Verpackungsmaterialien den mikrobiellen Verderb weiter hinaus zögern sollen (LEE, 2010). Besonders Nanosilber wird derzeit immer häufiger in verbrauchernahen Produkten eingesetzt (EPP et al., 2011). Im asiatischen Raum und in den USA befinden sich beispielsweise bereits Lebensmittelbehältnisse mit Nanosilber-Beschichtung auf dem Markt. In der EU ist der Einsatz von Nanosilber in Lebensmittelkontaktmaterialien derzeit nicht zugelassen. Das BfR rät auch von dem Einsatz von Nanosilber in haushaltsnahen Produkten aufgrund der unklaren Datenlage bezüglich gesundheitlicher Risiken für den Verbraucher ab (BFR, 2010). Zum Einen bestehe die Gefahr, dass Nanopartikel mit der Nahrung aufgenommen werden und sich im Körper ansammeln, zum Anderen bestehe das Risiko der Resistenzentstehung von pathogenen Keimen gegenüber Silberverbindungen. 1.3.2 Rechtliche Vorgaben für Nanosilber in Lebensmittelkontaktmaterialien In der Rahmenverordnung (EG) Nr. 1935/2004 sind die allgemeinen Anforderungen an sämtliche Lebensmittelkontaktmaterialien festgelegt. Ergänzt wird sie durch die Verordnung (EG) 450/2009, welche spezifische Anforderungen für die Verwendung und Zulassung aktiver und intelligenter Materialien festlegt, die dazu bestimmt sind, mit Lebensmitteln in Berührung zu kommen. Auf nationaler Ebene regelt die Bedarfsgegenständeverordnung die Bestimmungen zu Materialien, die dazu bestimmt sind, mit Lebensmitteln in Kontakt zu kommen. Demnach muss jeder neu beantragte Stoff einer Sicherheitsbewertung durch die EFSA unterzogen werden und kann anschließend in die gemeinschaftliche Liste der zugelassenen Stoffe, die in aktiven und intelligenten Bestandteilen verwendet werden dürfen, aufgenommen werden. Es muss sichergestellt sein, dass sie sich für den vorgesehenen Verwendungszweck eignen und diesen wirksam erreichen. Außerdem dürfen keine Bestandteile an Lebensmittel in Mengen abgegeben werden, die dazu geeignet sind, die 9 1. Einleitung Gesundheit des Menschen zu gefährden oder eine unvertretbare Veränderung des Lebensmittels herbeiführen. In dieser Verordnung wird auch der Einsatz von Nanopartikeln, die wesentlich andere chemische und physikalische Eigenschaften als der Ausgangsstoff besitzen, im Allgemeinen thematisiert und eine Risikobewertung auf Einzelfallbasis gefordert. Künstlich hergestellte Nanopartikel bedürfen somit einer erneuten Zulassung im Vergleich zum Ausgangsstoff. 1.4 E. coli in der Lebensmittelhygiene Wie aus dem Jahrbuch 2015 des Robert-Koch-Instituts (RKI) hervorgeht, gehören darmpathogene E. coli neben Salmonellen und Campylobacter spp. zu den wichtigsten Erregern von bakteriellen Lebensmittelinfektionen (RKI, 2016). E. coli ist ein in der Darmflora von Vögeln und Säugetieren natürlich vorkommender Keim. Während des Schlachtprozesses kann es daher zur Kontamination des Schlachtkörpers und Fleisches mit E. coli kommen. Bestimmte Stämme von E. coli können beim Menschen allerdings auch schwerwiegende Infektionen hervorrufen, wie zum Beispiel Harnwegsinfektionen und Septikämien. Die E. coli Stämme, welche außerhalb des Darmes Krankheiten auslösen, werden als extraintestinal pathogene E. coli (ExPEC) bezeichnet (RUSSO u. JOHNSON, 2003). Andere Stämme von E. coli können dagegen Infektionen des Magen-Darm-Traktes auslösen und werden als intestinal pathogene E. coli (InPEC) bezeichnet (CHEN u. FRANKEL, 2004; ROLLE u. MAYR, 2006). InPEC sind besonders für Gastroenteritiden von Säuglingen und Kleinkindern verantwortlich. Die zur InPEC-Gruppe zählenden Stämme lassen sich auch noch weiter einteilen, zum Beispiel in die enteroinvasiven E. coli (EIEC), die enterotoxischen E. coli (ETEC) und die enteroaggregativen E. coli (EAEC). Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) sind in der Lage, Vero- oder Shigatoxine zu bilden und können blutigen Durchfall (hämorrhagische Colitis) und beim hämolytisch-urämischen Syndrom (HUS) auch Nierenversagen auslösen. Shigatoxinbildende E. coli kommen bei Wiederkäuern natürlicherweise im Darm vor, ohne dass diese Tiere erkranken (RKI, 2008). Über den Kot gelangen die Keime in die Umwelt und können über Fleisch- und Milchprodukte, aber auch durch direkten Kontakt auf den Menschen übertragen werden. 10 1. Einleitung 1.4.1 Besonderheit von extended-spectrum β-Lactamase-bildenden E. coli Extended-spectrum β-Lactamasen (ESBLs) sind bakterielle Enzyme, die β-LaktamAntibiotika, wie Penicilline, Cephalosporine und Monobactame hydrolysieren und damit inaktivieren können (WITTE u. MIELKE, 2003). Auch Cephalosporine der 3. Generation (Cefotaxim, Ceftriaxon, Cefepim) werden durch ESBLs inaktiviert. ESBLs können von Gram-negativen Bakterien wie z.B. E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Peudomonas aerugionisa und Acinetobacter baumannii gebildet werden (WITTE u. MIELKE, 2003). Die ESBLs werden durch β-Lactamase-Gene (sogenannte bla-Gene) kodiert, welche sich noch weiter differenzieren lassen, unter anderem in ESBLs vom Typ SHV, TEM und CTX-M (KOLA et al, 2012). Bei Infektionen mit ESBL-bildenden Keimen sind die Behandlungsmöglichkeiten für erkrankte Personen stark eingeschränkt, zumal die Keime auch häufig Resistenzen gegenüber weiteren Wirkstoffklassen aufweisen. Die Übertragung von ESBL-bildenden Keimen auf den Menschen erfolgt unter anderem durch den Verzehr kontaminierter Lebensmittel, wobei insbesondere Geflügelfleisch mit ESBL-bildenden Enterobacteriaceae kontaminiert sein kann (KOLA et al., 2012; REICH et al., 2013). Dadurch besteht einerseits die direkte Gefahr einer Infektion mit EBSL-bildenden pathogenen Keimen. Andererseits ist es möglich, dass die resistenzvermittelnden Gene über horizontale Gentransferprozesse an andere Bakterien derselben Spezies oder aber auch an andere bakterielle Spezies weitergegeben werden. Dieses ist möglich, da sich die ESBL-Resistenz vermittelnden Gene häufig auf Plasmiden befinden. Sind zusätzlich noch weitere Resistenzgene auf demselben Plasmid lokalisiert, ist eine gemeinsame Übertragung auf den Rezipienten möglich. So kann über einen Plasmidtransfer eine kombinierte Resistenz gegenüber mehreren Klassen antimikrobieller Wirkstoffe vermittelt werden. 11 2. Publikationen 2. Publikationen Dieser Dissertation liegen zwei Publikationen zugrunde: Publikation 1: Daniela Deus, Carsten Krischek, Yvonne Pfeiffer, Ahmad Reza Sharifi, Ulrike Fiegen, Felix Reich, Guenter Klein, Corinna Kehrenberg (2016): Comparative Analysis of the Susceptibility to Biocides and Heavy Metals of Extended-Spectrum β-Lactamase-producing Escherichia coli Isolates of Human and Avian Origin, Germany Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, angenommen, https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2017.01.023 Die erste Publikation beschäftigt sich mit einer vergleichenden Empfindlichkeitstestung von extended-spectrum β-Lactamase produzierenden E. coli aviären und humanen Ursprungs gegenüber einer Auswahl an Bioziden und Schwermetallen und mit der Untersuchung auf Toleranz vermittelnde Gene. Idee und Konzeption: C. Kehrenberg, C. Krischek, D. Deus Experimentelle Umsetzung: D. Deus, C. Kehrenberg, U. Fiegen Auswertung der Ergebnisse: D. Deus, . C. Kehrenberg, . C. Krischek, A.R. Sharifi Verfassen des Manuskriptes: D.Deus, C. Kehrenberg, C. Krischek 12 2. Publikationen Publikation 2: Daniela Deus, Corinna Kehrenberg, Dirk Schaudien, Günther Klein, Carsten Krischek (2016): Effect of a nano-silver coating on the quality of fresh turkey meat during storage after modified atmosphere or vacuum packaging. Poultry Science, 96, 449-457 https://doi.org/10.3382/ps/pew308 Die zweite Publikation beschäftigt sich mit dem Einfluss einer mit Nanosilber beschichteten Folie auf verschiedene Fleischqualitätsparameter bei verpacktem Putenfleisch. Idee und Konzeption: C. Krischek, C. Kehrenberg, D. Deus Experimentelle Umsetzung: D. Deus, C. Krischek, D. Schaudien, Auswertung der Ergebnisse: D. Deus, C. Krischek, D. Schaudien, Verfassen des Manuskriptes: D. Deus, C. Krischek, C. Kehrenberg, D. Schaudien 13 2. Publikationen 2.1 Publikation 1 Comparative Analysis of the Susceptibility to Biocides and Heavy Metals of ExtendedSpectrum β-Lactamase-producing Escherichia coli Isolates of Human and Avian Origin, Germany DANIELA DEUS 1, CARSTEN KRISCHEK 1, YVONNE PFEIFER 2, AHMAD REZA SHARIFI 3, ULRIKE FIEGEN 1, FELIX REICH 1, GUENTER KLEIN 1, and CORINNA KEHRENBERG 1* 1 Institute for Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany; 2 Robert Koch-Institute, Nosocomial Pathogens and Antibiotic Resistance, Wernigerode, Germany 3 Department of Animal Sciences, Animal Breeding and Genetics, Georg-August-University Goettingen, Goettingen, Germany Running title: Biocide susceptibility of ESBL E. coli * Corresponding author: Mailing address: Institute for Food Quality and Food Safety, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Bischofsholer Damm 15, 30173 Hannover, Germany; Phone: +49-511-856-7554. Fax: +49-511-856-7694. Electronic mail address: [email protected] DOI-Nummer: https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2017.01.023 14 2. Publikationen ABSTRACT A total of 174 extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli isolates collected from humans (n=140) and healthy broiler chickens (n=34) was included in the study. The MIC values of alkyl diaminoethyl glycin hydrochloride, benzethonium chloride, benzalkonium chloride, chlorhexidine, acriflavine, copper sulfate, silver nitrate and zinc chloride were determined by the broth microdilution method. Significant differences in MIC distributions were found between human and avian isolates and between CTX-M-, SHV- and TEM-type ESBL E. coli for chlorhexidine, silver nitrate, zinc chloride and copper sulfate by statistical analysis. Isolates with reduced susceptibility were investigated for the presence and localization of tolerance-mediating genes by PCR analysis and Southern Blotting. The genes emrE, mdfA, sugE(c), cueO, copA, zntA and zitB were commonly present in isolates with elevated MICs, while the genes qacE∆1, qacF, qacH, sugE(p), cusC and pcoA, were less prevalent. In several isolates, a plasmid localization of the genes qacE∆1, qacF, qacH and sugE(p) on large plasmids >20 kb was detected. Keywords: biocides, heavy metals, susceptibility, ESBL-producing E. coli, MIC values 15 2. Publikationen 2.2 Publikation 2 Short title: TURKEY MEAT PACKAGED WITH NANO-SILVER COATED FILM Effect of a nano-silver coating on the quality of fresh turkey meat during storage after modified atmosphere or vacuum packaging D. DEUS*, C. KEHRENBERG*, D. SCHAUDIEN#, G. KLEIN*, C. KRISCHEK*1 *Institute of Food Quality and Food Safety, Foundation University of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover, Germany # Fraunhofer-Institute for Toxicology and Experimental Medicine (ITEM), Nikolai-Fuchs- Straße 1, D-30625 Hannover, Germany Corresponding author: Carsten Krischek Institute of Food Quality and Food Safety Foundation University of Veterinary Medicine Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover, Germany Tel: +49-511-856-7617, Fax: +49-511-856-827617 E-mail: [email protected] DOI-Nummer: https://doi.org/10.3382/ps/pew308 Scientific section: Microbiology and Food Safety 1 Corresponding author: [email protected] 16 2. Publikationen ABSTRACT Nano-silver is used in consumer products due to its antibacterial properties. The aim of this study was to evaluate the effect of a nano-silver-coated film on the quality of turkey meat during vacuum-sealed and modified atmosphere packaging up to 12 days of storage. In the first part of the experiment, turkey breasts were packaged using either vacuum packaging or modified atmosphere packages (MAPs) and contained films with or without a nano-silver coating (control film). Parameters such as pH, electrical conductivity, color (lightness L*, redness a*), myoglobin redox forms, thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), biogenic amines (BAs), total viable bacterial counts, Pseudomonas species counts and Enterobacteriaceae species counts were evaluated on storage days 4, 8 and 12. In the second part of the study, the antimicrobial effect of a nano-silver-coated film on turkey breast was evaluated after inoculation with Escherichia coli (E. coli). Turkey meat packaged with the nano-silver film exhibited lower a* values on days 1 (3.15 ± 0.62), 4 (3.90 ± 0.68) and 8 (4.27 ± 0.76) compared to the packaged meat with the control film (3.41 ± 0.73, 4.35 ± 0.94, 4.85 ± 0.89, respectively), indicating special optical properties of nanoparticles. Concerning the BAs, silver packaged meat showed higher values of tyramine on day 12 (1274 ± 392 ng/g meat) and cadaverine on day 4 (1224 ± 435 ng/g meat) compared to the normal packaged products (647 ± 576 and 508 ± 314 ng/g meat, respectively). MAP meat revealed higher L* and TBARS values and lower microbial counts than the vacuum packaged products on all days. The MAP meat also showed lower a* results on days 4 and 8 and higher metmyoglobin (metMb) values on days 8 and 12 compared to the vacuum products. In the inoculation study, the microbial counts of the turkey meat were comparable between the two film types. The study showed that the nano-silver coating did not exhibit any advantageous effects on the quality and microbiological parameters of the turkey meat. Key words: turkey, nano-silver coated film, modified atmosphere package, vacuum package, meat quality 17 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion Die vorliegende Dissertationsschrift fasst zwei Publikationen zusammen, in denen zum einen die Empfindlichkeit von ESBL-bildenden E. coli gegenüber Silbernitrat und anderen Bioziden getestet wurde (Publikation 1), zum anderen in einer anwendungsbezogenen Studie der Effekt von Silberionen unter Verwendung einer mit Nanosilber beschichteten Lebensmittelkontaktfolie auf die mikrobiologischen und chemischen Eigenschaften von natürlich kontaminiertem und spezifisch mit ESBL-E. coli kontaminiertem Putenfleisch (Publikation 2) untersucht wurden. Die erste Publikation befasste sich mit der Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) von ESBL-produzierenden E. coli humanen (n=140) und aviären (n=34) Ursprunges gegenüber acht verschiedenen Bioziden [Alkyldiaminoethylglycinhydrochlorid (ADH), Benzethoniumchlorid (BEN), Benzalkoniumchlorid (BKC) Acriflavin (ACR), Chlorhexidin (CHX), Kupfersulfat (COP) Silbernitrat (SIL) und Zinkchlorid (ZKC)]. Des Weiteren wurden ausgewählte Isolate auf das Vorhandensein von Toleranz vermittelnden Genen mittels PCR und Southern Blotting untersucht. In der zweiten Publikation wurde im Rahmen eines zwölftägigen Lagerungsversuches Putenfleisch in vier verschiedenen Verpackungsvarianten [MAP und herkömmliche Lebensmittelfolie (MAP1), Vakuum und herkömmliche Lebensmittelfolie (V1), MAP und Nanosilber-Folie (MAP2) und Vakuum und Nanosilber-Folie (V2)] verpackt und an drei Probenahmetagen (Tag 4, 8 und 12) auf verschiedene Fleischbeschaffenheitsparameter untersucht. Zusätzlich wurde ein zweiter Versuch durchgeführt, bei dem Putenfleisch mit einem ESBL-bildenden E. coli inokuliert wurde und der Effekt der mit Nanosilber beschichteten Lebensmittelkontaktfolie während einer zehntägigen Lagerungsdauer auf die Keimzahl des ESBL-E. coli untersucht wurde. 18 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 3.1 Vergleichende Analyse der MHK-Werte für ADH, BEN, BKC, ACR, CHX und COP ESBL-bildender E. coli unter Berücksichtigung von Herkunft und ESBL-Typ Die MHK-Werte für ADH, BEN, BKC, ACR, CHX, COP zeigten insgesamt ein unimodales und enges Verteilungsmuster. Bei Betrachtung des Biozids CHX stellten sich die humanen Isolate, welche hauptsächlich vom CTX-M-ESBL-Typ waren, im Vergleich zu den aviären Isolaten (überwiegend SHV- und TEM-ESBL-Typ) als toleranter dar. Dies spiegelte sich für CHX in einem, gegenüber den aviären Isolaten, um eine Verdünnungsstufe höher liegenden MHK50- und MHK90-Wert wider. Bei dem Biozid COP war die Situation entgegengesetzt, hier zeigten aviäre Isolate einen um eine Verdünnungsstufe höheren MHK90-Wert. Das Biozid CHX findet aufgrund seines breiten Wirkungsspektrums und seiner guten Verträglichkeit in humanmedizinischen Produkten breite Anwendung, beispielsweise in Handwaschprodukten und Produkten für die Mundhygiene (MCDONELL u. RUSSELL, 1999). Somit ist es möglich, dass die humanen Isolate, aufgrund des häufigeren Kontakts mit diesem Biozid, etwas toleranter sind als die aviären Isolate. In der Tierhaltung hingegen, kommt COP als Desinfektionsmittel und Futterergänzungsmittel weit verbreitet zum Einsatz (AARESTRUP u. HASMAN, 2004). Dies könnte wiederrum die leicht erhöhte Toleranz der aviären Isolate im Vergleich zu den humanen Isolaten erklären. Im Gegensatz zu den MHK50- und MHK90-Werten für ZKC, welche keinen Unterschied zwischen humanen und aviären Isolaten vermuten ließen, zeigten die statistischen Analysen, dass die humanen Isolate insgesamt toleranter waren als die aviären Isolate. interessant, da Zink in Form von Zinkoxid häufig in der Dies ist Tierhaltung als Futterergänzungsmittel eingesetzt wird. Zink ist ein lebensnotwendiges Spurenelement, welches in hohen Konzentrationen jedoch toxisch wirkt (GRASS et al. 2001 b). Die hier ermittelten Unterschiede in den Empfindlichkeiten könnten aber auch durch die sehr unterschiedliche Anzahl an humanen und aviären Isolaten bedingt sein, daher sollten die Ergebnisse anhand eines größeren Stammkollektivs überprüft und bestätigt werden. 19 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion 3.2 Nachweis und Häufigkeit von Biozid- und Schwermetall-Toleranz vermittelnden Genen Für die PCR-Analysen wurden nur Isolate mit MHK-Werten am rechten Ende der Verteilungskurve herangezogen. Dabei wurden insgesamt neun Isolate mit höheren MHKWerten für QACs, 22 Isolate für ACR und vier Isolate für CHX auf die entsprechenden Toleranz vermittelnden Gene (emrE, mdfA, sugE(c), sugE(p), oqxA, oqxB, qacE, qacE∆1, qacF, qacG, qacH) untersucht. Am häufigsten konnten in diesen Fällen die Gene mdfA, sugE(c) und emrE nachgewiesen werden. Auch ZOU et al. (2014) fanden in den USA ähnlich hohe Prävalenzen (96.5%, 77.2% und 84.0%) für mdfA, emrE and sugE(c) bei E. coli und bestätigen somit die Ergebnisse unserer Studie. Im Gegensatz dazu waren die Gene qacE∆1 und qacF sowohl bei ZOU et al. (2014), als auch in dieser Studie, seltener nachzuweisen. Beide Gene vermitteln Toleranz über einen Efflux-Mechanismus. Das Gen qacF konnte auf einem >21kb großen Plasmid eines CTX-M-1 E. coli isoliert von einem ambulanten Patienten nachgewiesen werden, das Gen qacE∆1, welches eine deletierte Variante von qacE ist, hingegen bei zwei CTX-M-1 und einem CTX-M-15 tragenden E. coli. Es ist bekannt, dass Klasse-1-Integrons mit einer relativ hohen Prävalenz in Gram-negativen Bakterien vorkommen und diese häufig qacE∆1 umfassen (KÜCKEN et al., 2000; JAGLIC u. CERVINKOVA, 2012). Somit sollten weitere Untersuchungen bezüglich der Lokalisation der in dieser Studie gefundenen qacE∆1-Gene erfolgen, um zu ermitteln, ob die hier nachgewiesenen qacE∆1-Gene Bestandteile von Integrons sind, oder separat vorliegen (PAULSEN et. al, 1993). In Bezug auf ACR-Toleranzen wurde bei E. coli noch beschrieben, dass die für eine Effluxpumpe kodierenden Gene acrA und acrB an der Toleranzbildung beteiligt sind (MA et al, 1993). Da die Effluxpumpe aber zur Wildtyp Ausstattung gehört, wurde auf den Nachweis dieser Gene in Publikation 1 verzichtet. Die Gene kodieren Teile einer multi-drug Effluxpumpe, welche eine physiologische Schutzfunktion für die häufig enterisch lebenden E. coli gegenüber Gallensalzen und Fettsäuren vermitteln (Ma et al, 1993; MA et al, 1995). Im Falle von Kupfersulfat wurden acht Isolate auf das Vorhandensein von mit Kupfertoleranz in Verbindung stehenden Genen untersucht (cueO, copA, cusC, pcoA). Das Gen cueO konnte dabei bei allen acht Isolaten, und das Gen copA bei sieben Isolaten nachgewiesen werden. Weniger häufig wurden die Gene cusC (n=2) und pcoA (n=1) detektiert. Beide im Rahmen 20 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion der PCR-Analyse untersuchten Isolate mit einem MHK-Wert 1024 µg/ml für Zinkchlorid waren positiv für zntA und zitB. ZitB fungiert als Exporter für Zink-Ionen und ZntA, als ATPase-Transporter, welcher bei Bedarf hochreguliert wird, um die Konzentration an freien Zinkionen zu reduzieren (WANG et al, 2012). 3.3 Empfindlichkeit ESBL-bildender E. coli gegenüber Silbernitrat in Bezug auf Herkunft und ESBL-Typ Aufgrund des Einsatzes von Silber als biozidale Substanz, insbesondere in Form von Nanopartikeln, und in Hinblick auf die anwendungsbezogene Studie (Publikation 2), sollen die Ergebnisse der Empfindlichkeitstestung für Silbernitrat und die Untersuchung auf Toleranz vermittelnde Gene hier gesondert dargestellt werden. Die bei der Empfindlichkeitstestung ermittelnden MHK-Werte der Isolate waren für Silbernitrat (SIL) unimodal und sehr eng verteilt (Table 2 in Publikation 1). Während der Vergleich der MHK50- und MHK90-Werte keine Unterschiede zwischen den E. coli unterschiedlichen Ursprunges offenbarte, zeigten die statistischen Analysen signifikante Unterschiede: Die humanen Isolate zeigten signifikant (P ≤ 0,05) höhere MHK-Werte als die aviären Isolate. Es wird deutlich, dass die alleinige Betrachtung der MHK50- und MHK90Werte in diesem Fall für einen fundierten Vergleich der MHK-Werte zwischen den humanen und aviären Isolaten nicht ausreicht. Die höhere Toleranz der humanen Isolate kann durch eine stärkere Exposition der Bakterien gegenüber diesem Schwermetall im menschlichen Alltag bedingt sein, da Silber z.B. in Form von Nanosilber als antibakterielles Agens in viele Haushaltsprodukte inkorporiert wird (CHOPRA, 2007). Durch diese Produkte wird über einen langen Zeitraum stets eine geringe Menge an Silberionen freigesetzt, sodass möglicherweise weniger empfindliche Bakterien selektiert werden. Dieses würde dann über eine Verschiebung des MHK-Wertes dieser Isolate zu ermitteln sein. Der Vergleich der Empfindlichkeiten der Isolate in Bezug auf den ESBL-Genotyp zeigte signifikant (P ≤ 0.05) höhere MHK-Werte der CTX-M Isolate im Vergleich zu den TEM- und den SHV-bildenden Isolaten. Bei den in dieser Studie inkludierten Isolaten war der größte Anteil der CTX-M E. coli humanen Ursprunges, während hingegen die SHV und TEM E. coli hauptsächlich aviären Ursprunges waren. Somit bestätigen die Ergebnisse die zuvor 21 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion beschriebenen Unterschiede in den Empfindlichkeiten gegenüber SIL. Trotzdem muss hierbei berücksichtigt werden, dass nur eine begrenzte Anzahl an SHV- und TEM-bildenden Isolaten zur Verfügung stand und somit dieses Ergebnis durch eine Testung weiterer Stämme bestätigt werden muss. Im Gegensatz zu Antibiotika, für die eine Einteilung der Bakterien in empfindlich, intermediär und resistent häufig möglich ist (CLSI, 2014), liegen für Biozid- und Schwermetalltoleranzen von Bakterien noch keine anerkannten Grenzwerte vor. Auch epidemiologische cut-off values, welche eine Wildtyp Population von einer Nicht-Wildtyp Population abgrenzen, liegen (als Vorschläge) nur für sehr wenige Biozide und Bakterienspezies vor (MORISSEY et al., 2014). Für Silber-Ionen sind auch keine Vorschläge für cut-off values zur Anwendung bei E. coli aus der Literatur bekannt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen aber, dass die Empfindlichkeitslage von E. coli gegenüber Silberionen günstig zu sein scheint, da keine Nicht-Wildtyp Isolate in der untersuchten Population detektiert werden konnten. Trotzdem wurden bereits Silber-Toleranz vermittelnde Gene im Chromosom von E. coli (K12) beschrieben (SILVER, 2003) und eine Selektion solcher Isolate erscheint durch den weit verbreiteten Einsatz von Silber als antimikrobielles Schwermetall als möglich. Bei Salmonellen wurde des Weiteren ein Plasmid (pMGH100), auf welchem neun SilberToleranz vermittelnde Gene lokalisiert sind, beschrieben (SILVER et al., 2006). Somit ist auch eine horizontale Verbreitung der Toleranz vermittelnden Gene unter Enterobacteriaceae möglich. Die stark variierende Freisetzung an Silberionen aus verschiedenen Silberverbindungen, kann zu einer dauerhaften Exposition der Bakterien mit einer zu geringen Menge an Silberionen führen, sodass über den permanenten Selektionsdruck tolerantere Bakterien selektiert werden (CHOPRA, 2007). 3.4 Einfluss des Folientyps auf verschiedene Fleischbeschaffenheitsparameter In verschiedenen Studien wurden die Effekte unterschiedlicher Verpackungsvarianten auf verpacktes Fleisch untersucht (NTZIMANI et al 2008, CORTEZ-VEGA et al. 2012 BLACHA et al. 2014). Hierbei standen jedoch hauptsächlich die herkömmlichen Verpackungsvarianten (MAPs und Vakuum) mit einer Variation der Gase (Sauerstoff, 22 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion Kohlendioxid und Stickstoff) und Gaskonzentrationen im Vordergrund. Hingegen untersuchten LA STORIA et al. (2012) die Effekte einer Kombination von MAP und antimikrobiellen Folien, welche mit einer Nisin-Lösung beschichtet wurden, auf die Haltbarkeit von Rindersteaks und zeigten einen hemmenden Effekt auf das Keimwachstum. Auch Nanosilber wird in Lebensmittelbehältnissen eingesetzt, doch nur wenige Studien bezüglich der Effekte auf verschiedene Lebensmittel und bezüglich der Migrationsraten der Nanopartikel liegen derzeit vor (ARTIAGA et al., 2015; LI et al., 2017; GALLOCHIO et al., 2016). Um die Fleischbeschaffenheit zu beurteilen, können verschiedene Parameter bestimmt werden. Hierzu gehören der pH-Wert und die Leitfähigkeit (EC), der Tropfsaftverlust, RotWert (a*) und Helligkeitswert (L*) und die Anteile der Myoglobin-Redoxformen. Um eine Aussage zur Haltbarkeit und Genusseigenschaften zu treffen, können die Keimzahlen verschiedener Mikroorganismen (z.B Enterobacteriaceae, Pseudomonas ssp.) oder auch die Konzentration an chemischen Verderbnisparametern wie TBARS und biogenen Aminen bestimmt werden. Im Folgenden werden die Effekte der Nanosilberfolie auf diese verschiedenen Parameter bei verpacktem Putenfleisch dargestellt und diskutiert. Veränderungen des Erscheinungsbildes Es konnte ein Einfluss der Nanosilberfolie auf die Farbwerte, insbesondere den a*-Wert nachgewiesen werden (Tabelle 2 in Publikation 2). Die L*-Werte der in Nanosilber verpackten Putenbrüste waren an Tag 1 signifikant (P ≤ 0,05) niedriger als der mit normaler Folie verpackten Putenbrüste. Da dieser Effekt jedoch an den Tagen 4, 8, 12 nicht beobachtet werden konnte, scheint er eher auf individuelle Farbunterschiede des Fleisches vor dem Verpacken zurückzuführen sein, welche möglicherweise durch eine natürlich vorkommende Farbheterogenität in der Brustmuskulatur bedingt ist. Häufig wird die Fleischfarbe auch über den Anteil der drei Myoglobin-Redoxformen Oxymyoglobin (oxyMb, hellrot), Deoxmyoglobin (deoxyMb, tiefrot) oder Metmyoglobin (metMb, braun) analysiert (ORKUSZ et al., 2013). Auffällig war, dass die a*-Werte bei dem mit Nanosilberfolie verpackten Fleisch signifikant (P ≤ 0,05) niedriger als bei dem mit normaler Folie verpackten Fleisch waren, obwohl kein Unterschied der Mb-Redoxformen-Anteile festgestellt werden konnte (Tabelle 3 in Publikation 2). Es ist zu vermuten, dass die Nanopartikel auf der Folie die Lichtreflexion 23 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion während der Farbmessung beeinflusst haben, wie auch von DORIA et al. (2012) gezeigt wurde. Thiobarbitursäure reaktive Substanzen (TBARS) Bei der TBARS-Analyse wird Malondialdehyd, ein Abbauprodukt des oxidativen FettsäureAbbaus, nach Reaktion mit Thiobarbitursäure photometrisch nachgewiesen, wodurch Rückschlüsse auf die Lipidoxidation des Fleisches gezogen werden können. Verstärkte Lipidoxidation kann zu sensorischen Veränderungen im Sinne einer verstärkten Ranzigkeit des Fleisches führen (CORTEZ-VEGA et al., 2012). Besonders hohe Sauerstoffkonzentrationen können zu stärkerer Lipidoxidation führen (MARTINEZ et al. 2006, BLACHA et al., 2014). Bezüglich des Folientyps war auffällig, dass an Tag 4 die TBARSKonzentrationen bei dem mit Nanosilberfolie verpackten Fleisch signifikant (P ≤ 0,05) höher waren als bei den mit der herkömmlichen Folie verpackten Proben (Tabelle 3 in Publikation 2). An Tag 8 verhielt es sich hingegen genau andersrum. Ein Effekt der Nanosilberfolie ist somit möglich, auch wenn die Ergebnisse widersprüchlich sind und an Tag 12 kein Effekt des Folientyps mehr festzustellen war. Trotzdem ist die Lipidoxidation nicht nur vom Sauerstoffgehalt in der umgebenden Atmosphäre abhängig, sondern auch von der Fettzusammensetzung des Fleisches (LADIKOS u. LOUGOVOIS, 1998). Dieser Faktor scheint hier jedoch von untergeordneter Rolle zu sein, da die verpackten Putenschnitzel der vier verschiedenen Verpackungsvarianten aus einem Brustmuskel geschnitten wurden und somit ein gleicher Fettgehalt anzunehmen ist. Biogene Amine und mikrobielle Kontamination Der Gehalt an biogenen Aminen kann als wichtiges Kriterium für den Fleischverderb herangezogen werden. Sie entstehen durch die Decarboxylierung von freien Aminosäuren durch mikrobielle Enzyme oder Gewebeenzyme (NTZIMANI et al., 2008). Doch neben der Funktion als Verderbnisindikatoren, können einige biogene Amine, wie Histamin und Tyramin auch eine ernsthafte Gesundheitsgefahr darstellen, indem sie beispielsweise die neuronale Überleitung stören und Kopfschmerzen und Übelkeit verursachen (VINCI et al., 2002, FRAQUEZA et al, 2012). Der Zusammenhang zwischen der Konzentration an 24 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion bestimmten BAs und der mikrobiellen Kontamination wird in der Literatur kontrovers diskutiert. NTZIMANI et al. (2008) beschreibt die positive Korrelation zwischen dem Vorkommen von Pseudomonaden und dem Gehalt an Putrescin und Cadaverin, während LAZARO et al. (2015) keinen Zusammenhang zwischen dem Gehalt an BAs und der mikrobiellen Kontamination sieht. Letzteres lässt sich mit den in dieser Studie erhaltenen Ergebnissen bestätigen (Tabelle 4 in Publikation 2). Während es signifikante (P ≤ 0,05) Unterschiede bei den BAs für die unterschiedlichen Folientypen gab, war der Keimgehalt für die beiden Folientypen vergleichbar. Insgesamt variierten die Werte der BAs sehr stark, Cadaverin und Spermidin wurden jedoch vorrangig gebildet. Ein Effekt des Folientyps war an Tag 4 und 12 zu sehen, wo mit Nanosilberfolie verpacktes Fleisch höhere (P ≤ 0,05) Cadaverin-Werte (Tag 4) und Tyramin-Werte (Tag 12) im Vergleich zu Fleisch in der nicht beschichteten Folie, aufwies. Einen Effekt der Kombination aus Verpackungsvariante und Folientyp gab es an Tag 4, wo Fleisch aus Vakuumverpackungen mit Nanosilberfolie höhere (P ≤ 0,05) Werte von Putrescin und Cadaverin und an Tag 8 höhere (P ≤ 0,05) Werte von Tyramin, Histamin und Spermidin zeigte als vakuumiertes Fleisch ohne Nanosilberfolie. Auch Fleisch aus den MAPs in Kombination mit der Nanosilberfolie zeigte an Tag 4 höhere (P ≤ 0,05) Werte an Histamin und Spermidin im Vergleich zu MAPs ohne beschichtete Folie. An Tag 4 jedoch, war die Putrescin-Konzentration und an Tag 8 die Tyramin-Konzentration bei Fleisch aus den Verpackungen ohne Nanosilberfolie signifikant (P ≤ 0,05) höher als bei dem Fleisch aus Verpackungen mit Nanosilberfolie. Es gilt zu berücksichtigen, dass die Bildung der BAs ein komplexer Prozess ist, der nicht nur von der mikrobiellen und gewebespezifischen Aktivität der Decarboxylasen, sondern auch von dem Vorhandensein bestimmter Aminosäuren, wie Lysin, Histidin oder Arginin, die von den Enzymen zu biogenen Amine decarboyliert werden, abhängig ist (JAIRATH et al, 2015). Es ist interessant, dass in unserer Studie in mehreren Durchgängen für die Nanosilberfolie kein keimreduzierender Effekt nachgewiesen werden konnte, obwohl die antibakteriellen Eigenschaften von Silberionen beschrieben wurden (KLASEN, 1999). Der fehlende Effekt in unserer Studie könnte durch die Verdünnung der abgelösten Silberionen und durch den Tropfsaft des Fleisches bedingt sein. Die Ablösung konnte gut in den elektronenmikroskopischen Bildern der Folie nach dem Fleischkontakt beobachtet werden, da nach längerem Kontakt keine Nanopartikel mehr auf der Folie sichtbar waren (Abbildung 1 in Publikation 2). Daneben kann es auch an einer zu geringen Konzentration an Nanopartikeln 25 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion auf der Folie oder einer zu kurzen Lagerungsdauer gelegen haben, sodass die Silberionen nicht in der Lage waren, ihre antibakteriellen Eigenschaften zu entfalten. Auch GALLOCHIO et al. (2016) konnten keinen Unterschied zwischen den Keimgehalten von Hähnchenfleisch, welches in Nanosilber-Plastiktüten oder Kontrolltüten verpackt war, feststellen und bestätigen somit unsere Ergebnisse. Hingegen stellten LI et al. (2017) während einer Lagerungsdauer von 35 Tagen geringere Keimgehalte bei Reis, welcher in mit Nanosilber beschichteten Folien verpackt war, im Vergleich zu Reis in unbeschichteten Folien fest. ARTIAGA et al. (2015) untersuchten die Migration von Nanosilberpartikeln aus Lebensmittelaufbewahrungsbehältnissen und zeigten, dass die Freisetzung der Nanopartikel unter anderem von dem verpackten Lebensmittel, der Temperatur und der Expositionsdauer abhängt. Der in der chinesischen Studie untersuchte Reis ist im Vergleich zu frischem Fleisch viel trockener und wurde deutlich länger gelagert, was zu den unterschiedlichen Ergebnissen hinsichtlich des antibakteriellen Effekts geführt haben könnte (LI et al., 2017). 3.5 Einfluss des Folientyps auf die Keimzahlen bei inokulierten Putenfleisch Da trotz maximaler Gesamtkeimgehalte von 6,08 log10 KBE/g Fleisch am Tag 12 in unserer Studie kein antibakterieller Effekt der Nanosilberfolie beobachtet werden konnte, wurde in einem zweiten Versuch Putenfleisch von Anfang an mit hohen Konzentrationen an ESBLbildenden E. coli inokuliert, um die Ergebnisse des vorherigen Versuches zu überprüfen. Es zeigte sich, dass auch hier an den Tagen 4, 8 und 12 die Keimzahlen des mit der Kontrollfolie verpackten Fleisches (6.25, 5.74, 5.56 log10 KBE/g) und des mit Nanosilberfolie verpackten Fleisches (6.37, 5.67, 5.64 log10 KBE/g) vergleichbar waren. Diese Ergebnisse bestätigen die zuvor erlangten Ergebnisse bezüglich eines nicht vorhandenen oder nicht ausreichenden, antimikrobiellen Effekts der Nanosilberfolie auf den Keimgehalt. Auch hier kommen die bereits beschriebenen Ursachen, wie eine Behinderung der Wechselwirkung zwischen Fleisch, Mikroflora und Silberionen, vermutlich bedingt durch den Tropfsaft, oder aber eine zu niedrige Konzentration an Silberionen auf der Folie oder zu kurze Lagerungsdauer, in Betracht. 26 3. Zusammenfassung der Ergebnisse und übergreifende Diskussion Es zeigt sich also, dass der Nutzen einer Nanosilber-Lebensmittelkontaktfolie hinsichtlich der Fleischqualität und der chemischen und mikrobiologischen Parameter bei verpacktem Putenfleisch nicht nachgewiesen werden kann (Publikation 2), obgleich die Empfindlichkeitslage von ESBL-bildenden E. coli sich als sehr günstig darstellte (Publikation 1). 27 4. Zusammenfassung 4. Zusammenfassung Daniela Deus Empfindlichkeit ESBL-bildender E. coli gegenüber Bioziden und Einfluss des Biozids Silber auf Folien mit Lebensmittelkontakt auf die mikrobiologischen und physikochemischen Eigenschaften von Putenfleisch Silber und Silberverbindungen, besonders in Form von Nanopartikeln, werden derzeit aufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften in etlichen Haushaltsprodukten, unter anderem in Lebensmittelaufbewahrungsbehältnissen weit verbreitet eingesetzt. Es ist bekannt, dass Geflügelfleisch während der Schlachtung einem hohen Risiko der Kontaminierung mit Mikroorgansimen ausgesetzt ist. Grund dafür sind einerseits technologisch bedingte Kontaminationsquellen (z.B. Brüher, Rupfer), aber auch das hohe Quellvermögen der Muskelfasern beim Geflügel. Insbesondere extended-spectrum β-Lactamase- (ESBL-) bildende E. coli haben eine hohe Prävalenz bei Mastgeflügel und können über das Lebensmittel zum Verbraucher gelangen. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Effekte einer mit Nanosilber beschichteten Folie auf verschiedene Fleischparameter von verpacktem Putenfleisch zu untersuchen und den Nutzen dieser Folie im Vergleich zu einer Kontrollfolie zu evaluieren. Dabei wurde auch der Einfluss der Silberfolie auf die Keimzahlen von ESBL-bildenden E. coli auf Putenfleisch getestet. Außerdem sollte untersucht werden, ob der weitverbreitete Einsatz von Silberverbindungen bereits zu einer Toleranzbildung bei ESBL-bildenden E. coli gegenüber diesem Biozid geführt haben könnte. Zu diesem Zweck wurden in drei Durchgängen je 48 Putenschnitzel in vier verschiedenen Verpackungsvarianten verpackt und über einen Zeitraum von 12 Tagen bei 4°C gelagert. Bei den Verpackungsvarianten handelte es sich um: Schutzgasatmosphäre (80%O2 und 20%CO2) mit Kontrollfolie (MAP1), Vakuum mit Kontrollfolie (V1), Schutzgasatmosphäre mit Nanosilberfolie (MAP2) und Vakuum mit Nanosilberfolie (V2). An drei Probenahmetagen (Tag, 4, 8 und 12) wurden verschiedene Fleischbeschaffenheitsparameter untersucht, wie Keimzahlen, pH-Wert, elektrische Leitfähigkeit, Helligkeits- (L*)-und Rot (a*)-Wert, TBARS, biogene Amine (BA) und Redoxformen des Myoglobins. Außerdem wurden in 28 4. Zusammenfassung einem zweiten Versuch Putenbrüste mit einem ESBL-bildenden E. coli inokuliert und in Nanosilberfolie oder Kontrollfolie verpackt. An Tag 4, 8 und 10, wurden dann die Keimzahlen bestimmt und verglichen. Des Weiteren wurde eine Empfindlichkeitstestung ESBL-bildender E. coli aviären und humanen Ursprunges mittels Bouillon-Mikrodilution durchgeführt. Hierbei wurden die MHK Werte für Alkyldiaminoethylglycinhydrochlorid (ADH), Benzethoniumchlorid (BEN), Benzalkoniumchlorid (BKC), Chlorhexidin (CHX), Acriflavin (ACR), Kupfersulfat (COP), Silbernitrat (SIL) und Zinkchlorid (ZKC) bestimmt. Isolate mit erhöhten MHK-Werten wurden anschließend auf das Vorhandensein von Toleranz vermittelnden Genen untersucht. Diese Untersuchungen umfassten bei den quartären Ammoniumverbindungen (QACs) ADH, BEN und BKC, CHX und ACR die Gene qacE, qacE∆1, qacF, qacG, qacH, mdfA, emrE, sugE(c), sugE(p), oqxA und oqxB bei COP die Gene copA, cueO, cusC und pcoA und bei ZKC die Gene zntA und zitB. Ein Effekt der Nanosilberfolie auf die verschiedenen Fleischbeschaffenheitsparameter war nur im Falle des a*-Wertes und der BAs zu erkennen. Der a*-Wert war signifikant (P ≤ 0,05) niedriger im Vergleich zu dem a*-Wert des Fleisches, welches in der Kontrollfolie verpackt war. Bezüglich der BAs hatte das mit Nanosilberfolie verpackte Fleisch an Tag 4 signifikant (P ≤ 0,05) höhere Cadaverin- und an Tag 12 Tyramin-Werte. Wider Erwarten konnte kein Unterschied in Bezug auf die Keimzahlen bei den mit Nanosilber- oder Kontrollfolie verpackten Putenbrüsten festgestellt werden. Der Effekt der Verpackungsvariante war im Vergleich zu dem Effekt des Folientyps stärker ausgeprägt. So zeigte in MAP verpacktes Fleisch signifikant (P ≤ 0,05) höhere L*-Werte, TBARS-Konzentrationen und niedrigere Keimzahlen als in Vakuum verpacktes Fleisch. In Bezug auf die Empfindlichkeitstestung gegenüber Silbernitrat zeigten die getesteten ESBLbildenden E. coli ein sehr enges, unimodales Verteilungsmuster der MHK-Werte, sodass keine deutlich weniger empfindlichen Isolate für diese Silberverbindung detektiert werden konnten. Für die anderen Biozide wurde ebenfalls ein unimodales, aber weniger enges Verteilungsmuster sichtbar und es konnten einige QAC, ZKC oder COP-Toleranz vermittelnde Gene bei verschieden Isolaten mit erhöhten MHK-Werten nachgewiesen werden. Teilweise waren diese auf einem Plasmid lokalisiert (qacE∆1, qacF, qacH). Signifikante (P ≤ 0,05) Unterschiede in der Verteilung der MHK-Werte von humanen und 29 4. Zusammenfassung aviären Isolaten waren bei CHX, SIL und ZKC zu sehen, wobei die humanen Isolate höhere Werte aufwiesen. Bei COP hatten dagegen die aviären Isolate höhere MHK-Werte inne. Außerdem zeigten die CTX-M-bildenden E. coli im Falle in Bezug auf CHX, SIL und ZKC signifikant (P ≤ 0,05) höhere MHK-Werte als die TEM- und SHV-bildenden ESBL E. coli. Aus den Untersuchungen kann gefolgert werden, dass die getestete Nanosilberfolie keinen positiven Effekt auf die Haltbarkeit und auf eine Keimreduzierung von ESBL-bildenden E. coli bei Putenfleisch hat, obgleich die generelle Empfindlichkeitslage einer getesteten Stammsammlung von ESBL-bildenden E. coli gegenüber Silber und weiteren Bioziden als günstig einzustufen war. 30 5. Summary 5. Summary Daniela Deus Susceptibility of ESBL- producing E. coli to biocides and the effects of the biocide silver in a film with food contact on microbial and physico-chemical properties of turkey meat Nowadays, silver and silver compounds are widely used in different household products, like food storage containers, due to their antibacterial properties. It is known that poultry meat is exposed to a high risk of contamination with microorganisms during processing, caused by technological sources of contamination (e.g. brewer, plucker) and high potential of swelling of the fibres in poultry. Especially extended-spectrum β-lactamase- (ESBL-) producing E.coli are highly prevalent in poultry and may be transferred via the food chain to consumers. The aim of the present study was to examine the effects of a nano-silver coated film on different turkey meat parameters and to evaluate the use of this film in comparison to a control film. Therefore, also the influence of the nano-silver-coated film on microbial counts of ESBL- producing E. coli was investigated. With regard to the widespread use of silver compounds, we wanted to gain information concerning the effect on tolerance development of ESBL- producing E. coli towards this biocide. Thus, in triplicate, 48 poultry cutlets were packaged in four different packaging variants and stored up to 12 days at 4°C. The four packaging variants included: Modified atmosphere packaging (80%O2 and 20%CO2) and control film (MAP1), vacuum and control film (V1), modified atmosphere packaging and nano-silver-coated film (MAP2) and vacuum and nanosilver-coated film (V2). On three days (days 4, 8 and 12) several meat quality parameters were determined, e.g. viable counts, pH-values, electrical conductivity (EC), lightness- (L*) and redness- (a*) values, TBARS, biogenic amines (BA) and redoxforms of myoglobin. Besides, in a second trial poultry breast was inoculated with ESBL- producing E. coli and packaged either in nano-silver-coated film, or control film. During 10 days of storage viable counts were determined and compared with one another. Furthermore, susceptibility testing of avian and human ESBL- producing E. coli was performed using the broth microdilution method. For this, MIC-values of alkyl diaminoethyl glycin hydrochloride (ADH), benzethonium chloride (BEN), benzalkonium chloride (BKC), 31 5. Summary chlorhexidine (CHX), acriflavine (ACR), copper sulfate (COP), silver nitrate (SIL) and zinc chloride (ZKC) were determined. Isolates exhibiting elevated MIC values were screened for the presence of genes conferring tolerance to the quarternary ammonium compounds (QACs) ADH, BEN and BKC, CHX and ACR (qacE, qacE∆1, qacF, qacG, qacH, mdfA, emrE, sugE(c), sugE(p), oqxA, oqxB), to COP (copA, cueO, cusC, pcoA) and ZKC (zntA, zitB). An effect of the nano-silver-coated film on meat quality parameters was only detected regarding the a*- and BA-values. Concerning the a*-values, they were significantly (P ≤ 0.05) lower than a*-values of meat packaged in the control film. BA- values of cadaverine and tyramine were significantly (P ≤ 0.05) higher in meat packaged in nano-silver-coated film than in meat packaged in the control film on day 4 (cadaverine) and day 12 (tyramine). Contrary to expectations, no differences in viable counts could be found between turkey breasts packaged in nano-silver-coated film or packaged in the control film. The effect of packaging variant was more pronounced than the effect of the type of layer: Meat packaged in MAP showed significantly (P ≤ 0.05) higher L*-values and TBARS concentration and a lower concentration of viable counts than vacuum packaged meat. With regard to the susceptibility testing, MIC values of SIL showed a narrow and unimodal distribution and no less susceptible isolates could be detected. The same unimodal distribution, but less narrow, could be found for the other biocides and several QAC, COP and ZKC tolerance-mediating genes could be found in different isolates. Some of them were plasmid encoded (qacE∆1, qacF, qacH). Significant (P ≤ 0.05) differences in MIC distribution between human and avian isolates were determined for CHX, SIL and ZKC showing higher MIC values of the human isolates and for COP showing higher MIC values of the avian isolates. Furthermore, CTX-M E. coli exhibited significantly higher MIC values than TEM- and SHV type E. coli for CHX, SIL and ZKC. From this data it can be concluded that the tested nano-silver-coated film has no positive effect on meat shelf-life and on reducing the microbial counts of ESBL- producing E. coli in poultry meat, despite the fact that the general susceptibility of the tested ESBL- producing E. coli to silver and other biocides can be classified as good. 32 6. Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis AARESTRUP, F.M. u. H. 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Mai 2012 über die Bereitstellung auf dem Markt und die Verwendung von Biozidprodukten DELEGIERTE VERORDNUNG (EG) NR. 1062/2014 der Kommission vom 4. August 2014 über das Arbeitsprogramm zur Systematischen Prüfung aller in Biozidprodukten enthaltenen alten Wirkstoffe gemäß der Verordnung (EG) Nr. 528/2012 des Europäischen Parlaments und Rates 42 7. Danksagung 7. Danksagung Als erstes möchte ich mich bei Frau PD Dr. Corinna Kehrenberg, PhD und Herrn PD Dr. Carsten Krischek für das Überlassen des sehr interessanten und aktuellen Themas und die Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit bedanken. Ich bin sehr froh, Sie als zuverlässige Ansprechpartner stets an meiner Seite gehabt zu haben. Desweiteren gilt mein Dank Frau Dr. Yvonne Pfeifer vom Robert-Koch-Institut und Herrn Dr. Felix Reich vom Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover für die Zurverfügungstellung der ESBL-Stämme. Besonders bedanken möchte ich mich bei Isa, da wir im selben Boot saßen und uns gegenseitig sowohl fachlich als auch moralisch immer unterstützt haben. Wir haben viel zusammen gelacht und besonders die Zeit am RKI bleibt mir in guter Erinnerung. Ein ganz großes Dankeschön geht an all die fleißigen Helfer meiner umfangreichen Versuche, ohne die sie nicht zu bewältigen gewesen wären. Hier möchte ich besonders Bettina EngelAbé, Manuela von Ahlen, Anke Bertling, Vera Meyer, Iris Oltrogge und Inna Pahl erwähnen. Ich danke euch für die tolle Zusammenarbeit! Insbesondere danke ich auch meinen lieben Doktorandenkollegen Ines, André, Sylvia, Heike und Sandra für Ihre Unterstützung bei den Versuchen, die schönen Mittagspausen und lustigen Anekdoten. Ihr habt meinen Arbeitsalltag durch Eure humorvolle Art bereichert! Der größte Dank gilt jedoch meinem Mann, der mich immer unterstützt und mir den Rücken freigehalten hat. Außerdem danke ich meinem Sohn Eric dafür, dass er mir jeden Tag ein Lächeln ins Gesicht zaubert! Ich liebe euch! 43
