Freisetzung von zytoplasmatischem GABA ([ H]

Aus der Neurologischen Universitätsklinik und Poliklinik der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Freisetzung von zytoplasmatischem GABA ([3H]-GABA) und Glutamat
(D-[3H]-Aspartat) durch Transporterumkehr (Heteroexchange)
im Striatum von Ratte und Kaninchen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2001
von Nicole Fichter
geboren in Freiburg im Breisgau
Dekan
Prof. Dr. rer. nat. M. Schumacher
1. Gutachter
Prof. Dr. T. J. Feuerstein
2. Gutachter
Prof. Dr. D. Riemann
Jahr der Promotion
2002
Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:
Posterpräsentation, 2nd Congress of the European Society for Clinical Neuropharmacology,
Würzburg, 9.-11. Nov. 1995
Fichter N., Lücking C., Landwehrmeyer B., Winter T. and Feuerstein T. J. (1995) Nipecotateinduced GABA release from slices of the rat caudato-putamen: Effects of gabapentin. Abstract.
Archives of Pharmacology, Supplement Number 1 to Volume 354 No 4, 1996
Nicht die Taten
bewegen,
sondern die Worte
über die Taten
Aristoteles
Meinen lieben Eltern
gewidmet
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Synaptische Übertragung.............................................................................................1
1.1.1. Die zytoplasmatische Freisetzung der Aminosäuretransmitter
GABA und Glutamat
2
1.2.
1.2.1.
1.2.2.
1.2.3.
1.2.4.
Der inhibitorische Neurotransmitter J-Aminobuttersäure (GABA)............................5
Vorkommen und Verteilung von GABA
5
Der GABA-Metabolismus
6
Der GABA-Transporter
7
Die GABA-Rezeptoren
9
1.3.
1.3.1.
1.3.2.
1.3.3.
1.3.4.
Die exzitatorischen Neurotransmitter Glutamat und Aspartat.....................................9
Vorkommen und Verteilung
10
Der Glutamat-Metabolismus
10
Der Glutamat-Transporter
10
Die Glutamat-Rezeptoren
11
1.4. Anatomische Grundlagen................................................................................................12
1.4.1. Die Basalganglien
12
1.4.1.1.
Lage und Morphologie des Corpus Striatum
13
1.4.1.2.
Die Histochemie des Corpus Striatum
13
1.4.1.3.
Neuronale Schaltkreise
14
1.4.2. Der menschliche Neokortex
15
1.5. Epilepsie und antikonvulsive Therapie................................................................................16
1.5.1. Definition der Epilepsie
16
1.5.2. Epidemiologie
16
1.5.3. Pathophysiologische Grundlagen
17
1.5.4. Pharmakotherapie
18
1.6. Gabapentin..............................................................................................................................18
1.6.1. biochemische Eigenschaften
19
1.6.2. Wirkmechanismus
20
1.7. Fragestellung...........................................................................................................................21
2. Methoden und Materialien
2.1. Gewebe und Präparation.......................................................................................................22
2.1.1. Nucleus Caudatus des Kaninchens
22
2.1.2. Caudatoputamen der Ratte
22
.
Inhaltsverzeichnis
.
2.1.3. Menschlicher Neocortex
22
2.2. Der Freisetzungsversuch........................................................................................................23
2.2.1. Inkubation
23
2.2.2. Superfusion
24
2.2.3. Stimulation
27
2.3. Bestimmung und Charakterisierung der Transmitter.......................................................27
2.3.1 Bestimmung nach Inkubation mit [3H]-GABA bzw. [3H]-D-Aspartat
28
2.3.2 Bestimmung von [3H]-GABA nach Inkubation mit [3H]-Glutamin
28
2.3.3 Bestimmung der endogenen Aminosäuren durch HPLC
30
2.4. Berechnungen.........................................................................................................................32
2.4.1 Zählausbeute für Schnitte und Superfusate
32
2.4.2 Prozentuale Radioaktivitätsabgabe
33
2.4.3 Stimulationsbedingte Tritiumfreisetzung
33
2.4.4. S2/S1-Quotient
34
2.4.5. Basaleffluxquotient
34
2.4.6. Statistische Auswertung
35
2.5. Materialien..............................................................................................................................36
3. Ergebnisse
3.1. Ausgangspunkt der Arbeit.....................................................................................................38
3.2. Die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung................................................................38
3.2.1. Der Einfluss der Inkubationsdauer auf die Schnittbeladung
und die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
40
3
3.2.2. Die Validierung des Modells der Nipecotat-evozierten [ H]-GABAFreisetzung
3.2.2.1.
Der Einfluss des Entzugs von Kalzium (Ca++) und der Gabe von
Cadmiumchlorid (CdCl2)
3.2.2.2.
Der Einfluß von Tetrodotoxin
3.2.2.3.
Der Einfluss von NNC-711
3.2.2.4.
Der Einfluss von Aminooxyessigsäure
3.2.2.5.
Der Einfluss von 3-MCPA
3.2.3. Der Einfluss von Gabapentin auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABAFreisetzung
3.2.3.1.
...nach Inkubation mit [3H]-GABA
3.2.3.2.
...nach Inkubation mit [3H]-Glutamin
41
41
43
44
46
47
51
51
53
Inhaltsverzeichnis
.
3.3. Die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung
im Caudatoputamen der Ratte.............................................................................................58
3.3.1. Die Validierung des Modells der L-trans-PDC-evozierten D-[3H]-AspartatFreisetzung
59
++
3.3.1.1.
Der Einfluss des Entzugs von Kalzium (Ca ) und der Gabe von
Cadmiumchlorid (CdCl2)
59
3.3.1.2.
Der Einfluss von Tetrodotoxin
60
3.3.1.3.
Der Einfluss von Dihydrokainat
60
3.3.2. Der Einfluss von Gabapentin auf die L-trans-PDC-evozierte
D-[3H]-Aspartat-Freisetzung
61
3.4. Der Einfluss von Gabapentin auf die Freisetzung endogener Aminosäuren
im Caudatoputamen der Ratte.............................................................................................62
4. Diskussion
4.1. Die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung................................................................64
4.1.1. Die Validierung des Modells der zytoplasmatischen [3H]-GABA-Freisetzung
4.1.1.1.
Der Ausschluss eines vesikulären Freisetzungsmodus
4.1.1.2.
Der Nachweis eines durch Transporterumkehr vermittelten
Freisetzungsmodus
4.1.1.3.
Der Einfluss von Inhibitoren des GABA-Metabolismus
66
66
4.1.2. Der Einfluss von Gabapentin auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
4.1.2.1.
Der Einfluss von Gabapentin nach Inkubation mit [3H]-GABA
4.1.2.2.
Der Einfluss von Gabapentin nach Inkubation mit [3H]-Glutamin
75
76
77
70
71
4.2. Die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung..................................................81
4.2.1. Die Validierung des Modells der zytoplasmatischen D-[3H]-Aspartat-Freisetzung82
4.2.1.1.
Der Ausschluss eines vesikulären Freisetzungsmodus
4.2.1.2.
Der Nachweis eines durch Transporterumkehr vermittelten
Freisetzungsmodus
4.2.2. Der Einfluss von Gabapentin auf die L-trans-PDC-evozierte
D-[3H]-Aspartat-Freisetzung
82
84
85
4.3. Der Einfluss von Gabapentin auf die Freisetzung endogener Aminosäuren
im Caudatoputamen der Ratte................................................................................................87
5. Zusammenfassung............................................................................................................91
6. Literaturverzeichnis........................................................................................................92
7. Lebenslauf.......................................................................................................................104
8. Danksagung.....................................................................................................................105
Einleitung
Seite 1
1. Einleitung
1.1 Synaptische Übertragung
Innerhalb der Nervenzellen wird Information durch Aktionspotentiale fortgeleitet. Ihre Weitergabe
von einer Nervenzelle zur nächsten findet an morphologisch speziell ausgestalteten Kontaktstellen,
den Synapsen, statt. Die synaptische Erregungsübertragung kann entweder durch elektrische oder
chemische Übertragung erfolgen:
Während bei der elektrischen Synapse morphologisch eine zytoplasmatische Kontinuität zwischen
der prä- und der postsynaptischen Nervenzelle besteht, und somit eine Informationsübertragung
durch direkte elektrische Ströme ermöglicht wird, findet sich bei der chemischen Synapse ein
schmaler Zwischenraum zwischen zwei hintereinandergeschalteten Nervenzellen, der synaptische
Spalt. Hier löst das ankommende elektrische Signal (Aktionspotential) an der präsynaptischen
Nervenendigung die Aktivierung spannungsabhängiger Kalziumkanäle aus. Extrazelluläres Kalzium
(Ca++) strömt in die präsynaptische Nervenendigung ein und induziert die Anlagerung und Fusion
der synaptischen Vesikel mit der Plasmamembran der aktiven Zone und somit die exozytotische
Freisetzung des in den synaptischen Vesikeln enthaltenen chemischen Neurotransmitters (Katz et
Miledi, 1970). Dieser Prozess wird als elektro-sekretorische Kopplung bezeichnet. Der freigesetzte
Transmitter diffundiert durch den synaptischen Spalt und bindet an Rezeptoren der postsynaptischen
Membran. Die Beschaffenheit des Rezeptors -und nicht der Transmitter- entscheidet, ob in der
postsynaptischen Zelle ein exzitatorisches (erregendes) oder ein inhibitorisches (hemmendes)
Potential ausgelöst wird.
Die Beendigung der Signaltransmission erfolgt durch die Entfernung der Transmittersubstanz aus
dem synaptischen Spalt. Hierbei unterscheidet man die Diffusion des Transmitters in das
umgebende Interstitium, den Abbau im synaptischen Spalt und die Wiederaufnahme des
Transmitters in die präsynaptische Nervenendigung und Glia über spezifische WiederaufnahmeTransporter.
Die chemische Übertragung kann somit sowohl inhibitorische als auch exzitatorische Vorgänge
vermitteln. Sie hat die wichtige Eigenschaft, Signale verstärken zu können: Ein einzelnes
Aktionspotential kann Tausende von Neurotransmittermolekülen freisetzen und somit eine
Signalverstärkung von einem Neuron zum anderen ermöglichen. Zusammen mit der Vielzahl an
Transmittern und Rezeptoren werden somit komplexe Interaktionen zwischen den Nervenzellen
ermöglicht. Chemische Synapsen sind deshalb von besonderem Interesse, da sie ein Angriffspunkt
Einleitung
Seite 2
für viele Pharmaka wie z.B. Antiepileptika oder Analgetika darstellen, die erfolgreich in der
Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems eingesetzt werden.
Die vesikuläre Freisetzung der Aminosäuretransmitter GABA bzw. Glutamat und Aspartat wird als
"quasi-physiologischer" Freisetzungsmechanismus betrachtet und ist, wie oben beschrieben,
abhängig von dem depolarisationsgetriggerten Einstrom extrazellulären Kalziums (Haycock et al.,
1978; McMahon et Nicholls, 1991). Bezüglich der Aminosäuretransmitter existiert jedoch neben
der
Ca++-abhängigen,
vesikulären
Transmitterfreisetzung
zudem
ein
Ca++-unabhängiger,
zytoplasmatischer, durch die Umkehr des GABA-Transporters bedingter Freisetzungsmechanismus
(Olsen et al., 1977; Kauppinen et al., 1988).
Auch für Acetylcholin, Dopamin und Noradrenalin wurde entsprechend den folgend aufgeführten
Vorgängen eine Ca++-unabhängige Freisetzung aus einem zytoplasmatischen Transmitterpool
beschrieben (Haycock et al., 1978; Lonart et Zigmond, 1990; Vargas et al, 1977). So konnten z. B.
neurotoxische Konzentrationen von Glutamat die Na+-abhängige, zytoplasmatische Freisetzung von
Dopamin im Caudatoputamen der Ratte induzieren (Lonart et Zigmond, 1990).
1.1.1. Die zytoplasmatische Freisetzung der Aminosäuretransmitter GABA und
Glutamat
Experimentell konnten erstmals Redburn und seine Mitarbeiter (1976) in vitro eine Ca++unabhängige Komponente bei der evozierten [14C]-GABA-Freisetzung durch K+-Depolarisation aus
Synaptosomen beobachten. Von Adam-Vizi (1992) wurden im wesentlichen zwei Hypothesen zur
Klärung dieses Phänomens formuliert:
1. Die Mobilisierung von Ca++ aus seinen intrazellulären Speichern (z.B. Mitochondrien,
endoplasmatisches Retikulum), erhöht die freie, zytoplasmatische Ca++-Konzentration und
induziert so die exozytotische Freisetzung von GABA (Sandoval, 1980). Eine Reihe von
Untersuchungen sprechen jedoch gegen diese Hypothese, da die Depletion der intrazellulären
Ca++-Speicher durch das Ca++-Ionophor A23187 sowie durch die Chelatoren EGTA und EDTA
keinen hemmenden Einfluss auf die Ca++-unabhängige [3H]-GABA-Freisetzung zeigte (Haycock
et al., 1978, Sihra et al., 1984, Pin et Bockaert, 1989).
2. Olsen et al. (1977) beschrieben die Umkehr des elektrogenen, Na+- und Cl--gekoppelten GABATransportsystems. Bedingt durch die Depolarisation der Plasmamembran GABAerger Neurone
kommt es zu einer Erhöhung der intraneuronalen Na+-Konzentration. Die Umkehr des Na+Gradienten über der Plasmamembran bewirkt somit auch eine Umkehr des elektrogenen GABA-
Einleitung
Seite 3
Transporters. GABA wird transportervermittelt aus dem Zytoplasma der GABAergen Neurone in
den Extrazellulärraum transportiert (Erecinska, 1987). Unterstützt wird diese Hypothese von der
Beobachtung, dass die Ca++-unabhängige GABA-Freisetzung in einem Na+-freien Medium
nahezu vollständig blockiert wurde (Haycock et al., 1978) und im Gegensatz dazu die Gabe von
Veratridin oder Na+-Ionophoren, welche den Na+-Einstrom in die Zelle erleichtern, die Ca++unabhängige GABA-Freisetzung steigerten (Sandoval, 1980; Goncalves et Carvalho, 1995).
Die depolarisationsabhängige, nicht-vesikuläre GABA-Freisetzung kommt durch eine Erhöhung
der zytoplasmatischen Na+-Konzentrationen zustande. Diese resultiert entweder aus der
depolarisationsbedingten Aktivierung spannungsabhängiger Na+-Kanäle, der Aktivierung
ionotroper Glutamat-Rezeptoren auf GABAergen Nervenendigungen, Axonen oder Dendriten
(Pin et Bockaert, 1989) oder aus einer Funktionsstörung der energieabhängigen Na+/K+-Pumpe
(Cammack et al., 1994). Die Höhe des nach extrazellulär gerichteten, chemischen Gradienten für
GABA spielt für die nicht-vesikuläre GABA-Freisetzung zudem eine wesentliche Rolle (Meyer,
1991).
Nach Olsen et al. (1977) kann auch eine nicht-depolarisationsbedingte Umkehr des GABATransporters erreicht werden. So wurde nach der Gabe von exogener, nicht-radioaktiv markierter
GABA ein Anstieg der [14C]-GABA-Freisetzung aus Synaptosomen, welche zuvor mit dem
radioaktiv markierten Transmitter inkubiert wurden, beobachtet. Dabei diente die exogen
zugeführte, extrazellulär lokalisierte GABA als Substrat des plamamembranären GABATransporters und wurde im Austausch gegen zytoplasmatische [14C]-GABA in die Zelle
aufgenommen (Olsen et al., 1977). Der Austausch von intrazellulärer gegen extrazellulärer GABA
durch die Umkehr des GABA-Transportes wird auch "Homoexchange" genannt.
Entsprechend sind solche Inhibitoren des GABA-Transporters, welche nicht nur als Inhibitor,
sondern gleichzeitig als Substrat des neuronalen und glialen GABA-Transporters dienen, in der
Lage, GABA zytoplasmatisch freizusetzen (Kanner et al., 1983). Der Wiederaufnahme-Hemmer
wird transportervermittelt in die Zelle aufgenommen, während zytoplasmatische GABA nach
extrazellulär gegentransportiert wird. Die Stimulation der Freisetzung von zytoplasmatischer GABA
durch GABA-verwandte Substanzen kann nach Olsen et al. (1977) in jedem Gewebe, welches einen
GABA-Transportmechanismus besitzt, also sowohl an Nerven- wie auch an Gliazellen, erfolgen.
Die Freisetzung von GABA durch die Gabe einer GABA-verwandten Substanz wird als
"Heteroexchange" bezeichnet (Szerb et al., 1982).
Einleitung
depolarisationsbedingt
Seite 4
depolarisationsunabhängig
in vitro:
in vivo:
in vitro:
• K+-Depolarisation
• K+-Depolarisation
• GABA
• Veratridin, Na+-Ionophoren
• Glutamat
• Inhibitoren des GABA-Transportes,
z.B. Nipecotat
• Glutamat u. Agonisten
• Hemmer der Na+/K+Pumpe, z.B. Ouabain
• Funktionsstörung der
Na+/K+-Pumpe, z.B.
Ischämie
Abnahme/Umkehr des
elektrochemischen Na+-Gradienten
Homo/Heteroexchange
UMKEHR DES GABA-TRANSPORTERS
Abb. 1.1.: Die Mechanismen der zytoplasmatischen Transmitterfreisetzung durch Transporterumkehr
Aus heutiger Sicht ist die Umkehr des elektrogenen GABA-Transporters verantwortlich für die
Ca++-unabhängige GABA-Freisetzung (do Nascimento et al., 1998). Eine wesentliche Bedeutung
wird diesem Freisetzungsmechanimus unter den pathophysiologischen Bedingungen eines
epileptischen Anfalles beigemessen (During et Spencer, 1993). Hierauf soll in Kapitel 1.5.3. näher
eingegangen werden.
Entsprechend den beschriebenen Vorgängen im GABAergen System kann ein exzessiver,
depolarisationsbedingter Anstieg der intrazellulären Na+-Konzentration in glutamatergen, Neuronen
zur Transporterumkehr und Freisetzung zytoplasmatischen Glutamats führen (Szatkowski et al.,
1990). So zeigten in vitro-Untersuchungen von McMahon et al. (1990), dass Veratridin die Ca++unabhängige Freisetzung von Glutamat aus einem nicht-vesikulären, zytoplasmatischen
Transmitterpool induziert. Veratridin verursacht durch die Öffnung spannungsabhängiger
Natriumkanäle den Einstrom von Natrium entlang dessen Konzentrationsgradienten und somit einen
Anstieg der intrazellulären Natriumkonzentration.
Eine pathophysiologische Relevanz ergibt sich aus der Erkenntnis, dass es unter pathologischen
Bedingungen wie Ischämie, Anoxie, Trauma oder Epilepsie zu Energiemangelzuständen mit
Einleitung
Seite 5
konsekutivem Zusammenbruch des Membranpotentials und Depolarisation von Neuronen kommt.
Der Anstieg der intrazellulären Na+-Konzentration durch den depolarisationsbedingten Na+Einstrom dreht den Na+-abhängigen Glutamat-Transport um und führt so zu der nicht-vesikulären
Freisetzung von zytosolischem Glutamat (Zini et al., 1993; Neal et al., 1994). Dieser Mechanismus
ist nach Kauppinen et al. (1988) hauptverantwortlich für infolge Ischämie oder Anoxie freigesetztes
Glutamat, wobei nach Szatkowsky et al. (1990) extrazelluläre Glutamatkonzentrationen von bis zu
370 µM erreicht werden können, was durchaus neurotoxischen Konzentrationen entspricht (Leigh et
al., 1996). In Folge der exzessiven Aktivierung postsynaptischer Glutamatrezeptoren wird,
beginnend mit dem Anstieg der intrazellulären Ca++-Spiegel, eine Kaskade von Reaktionen
angestossen, welche histopathologisch zu einer massiven Zellschwellung und letztlich zum Zelltod
führen (Kristián et Siesjö, 1998). Diese pathophysiologischen Vorgänge infolge einer exzessiven
Glutamatfreisetzung werden unter dem Begriff der Exzitotoxizität zusammengefasst.
1.2. Der inhibitorische Neurotransmitter J-Aminobuttersäure (GABA)
Die γ-Aminobuttersäure (GABA) ist der wichtigste hemmende Neurotransmitter im Gehirn des
Säugetiers und ist hier an bis zu 40 % aller Synapsen beteiligt (Turner et Whittle, 1983).
Die Bedeutung des GABAergen Systems zeigt sich im Auftreten von Krampfanfällen, wenn das
GABA-System durch die Blockade der GABA-Synthese beeinträchtigt ist. Störungen im
GABAergen System werden für eine Reihe neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen
verantwortlich gemacht, so z.B. für die Genese epileptischer Anfälle, die Huntington’sche
Erkrankung, Morbus Parkinson und die Schizophrenie, um nur einige zu nennen.
1.2.1. Vorkommen und Verteilung von GABA
GABA ist im ZNS weit verbreitet, wobei insgesamt höhere Konzentrationen im Vergleich zu
anderen Neurotransmittern gefunden wurden (Enna et Snyder, 1976). Nach Fykse und Fonnum
(1988) findet sich im Zytosol einer Nervenzelle eine Konzentration von 50 – 150 mM, während
extrazellulär Spiegel < 1 µM gefunden werden (Erecinska, 1987). In niedrigeren Konzentrationen
kann GABA auch im peripheren Gewebe nachgewiesen werden, wo es seine regulatorischen
Eigenschaften v. a. im endokrinen Pankreas, aber auch in anderen Organen wie Leber oder Niere
aufzeigt.
Einleitung
Seite 6
Die meisten GABAergen Neurone im ZNS sind inhibitorische Interneurone. Es gibt aber auch
Regionen mit GABAergen Projektionsneuronen, so zum Beispiel die neuronalen Verschaltungen im
Bereich der Basalganglien. Im folgenden Abschnitt 1.4.1. wird dieses Thema näher erläutert.
1.2.2. Der GABA-Metabolismus
Die Blut-Hirn-Schranke ist für GABA normalerweise nicht durchgängig. Sämtliche im Gehirn
vorkommende GABA ist somit endogenen Ursprungs.
GABA entsteht im Stoffwechsel hauptsächlich aus Glucose, welche im Zitratzyklus zur
α−Ketoglutarsäure umgewandelt wird. In den Mitochondrien der GABAergen Neurone erfolgt mit
Hilfe einer Pyridoxal-5-Phosphat (PALP) abhängigen Transaminase die Umwandlung der
α−Ketoglutarsäure in Glutamat. Letzteres wird aus dem Mitochondrium ins Zytosol transportiert,
wo es durch Decarboxylierung zur γ-Aminobuttersäure umgewandelt wird. Diese reversible
Reaktion wird durch das zytoplasmatische Enzym Glutaminsäuredecarboxylase (GAD) katalysiert,
welches ausschliesslich von GABAergen Neuronen exprimiert wird und sich somit als ein
immunzytochemischer Marker für GABAerge Neurone bewährt hat (Barber et al., 1978). Die
Existenz zweier Isoformen der GAD, die GAD65 und GAD67 als Produkt zweier verschiedener Gene
ist bekannt (Erlander et al., 1991). Die beiden Enzyme unterscheiden sich in ihrer Grösse (65 bzw.
67 kDa), Aminosäuresequenz, zellulären bzw. subzellulären Verteilung und der Interaktion mit dem
Kofaktor PALP. Die GAD65 liegt zu einem grossen Anteil als inaktives, PALP-abhängiges
Apoenzym vor, während die GAD67 überwiegend als aktives, bereits an PALP gebundenes
Holoenzym vorliegt. Inhibitoren PALP-abhängiger Enzyme zeigen somit lediglich einen Einfluss
auf die Aktivität des GAD65-Isoenzyms (Kaufman et al., 1991). Ein weiterer Unterschied der beiden
Isoenzyme besteht in deren zellulären und subzellulären Verteilung: In den meisten Hirnregionen
der Ratte konnten beide Isoformen in unterschiedlicher Ausprägung nachgewiesen werden, so auch
im Caudatoputamen, wo nach Lindefors (1993) eine Dominanz der PALP-unabhängigen GAD67
vermutet wird. Die subzelluläre Verteilung zeigte eine annähernd gleichmässige Verteilung der
GAD67 auf Zellkörper und Nervenendigung, während die GAD65 hauptsächlich in Terminalen von
GABAergen Neuronen gefunden werden konnte (Esclapez et al., 1994). Es wird angenommen, dass
die GAD65 mit vesikulären Membranen assoziiert und somit für die Produktion von vesikulär
freigesetzter GABA verantwortlich ist. Dahingegen wird die GAD67 mit der Produktion von GABAMolekülen eines nicht-vesikulären GABA-Pools in Verbindung gebracht (Ruppert et al., 1993).
Entsprechend fanden Andrade da Costa et al. (2000) in ihren immunhistochemischen
Einleitung
Seite 7
Untersuchungen an retinalen Zellen des Affen, dass lediglich GAD67-exprimierende Zellen in der
Lage waren, GABA zytoplasmatisch durch Transporterumkehr freizusetzen.
Freigesetzte GABA wird zur Beendigung der Signaltransmission über den WiederaufnahmeTransporter in die Nervenendigung oder in die unmittelbar benachbarten Gliazellen aufgenommen.
In der Nervenendigung erfolgt das „Recycling“ des Transmitters durch den Transport des
zytoplasmatischen GABA in die Vesikel. Im Gegensatz dazu hat die Aufnahme von GABA in die
Gliazelle den metabolischen Abbau zur Folge. Hierzu wird die aufgenommene GABA in die
Mitochondrien transportiert. Dort erfolgt der Abbau der GABA durch die γ-Aminobuttersäure-αKetoglutarat-Transaminase (GABA-Transaminase, GABA-T), wobei auch hier PALP als Kofaktor
benötigt wird. Durch die Desaminierung der GABA entsteht Bernsteinsäurehalbaldehyd (SuccinatSemialdehyd), welches schliesslich mittels einer spezifischen Dehydrogenase zu Bernsteinsäure
(Succinat) oxydiert wird und in den Zitronensäurezyklus eingeht. Durch die Übertragung der
Aminogruppe von GABA auf die aus dem Zitratzyklus stammende α−Ketoglutarsäure entsteht
mitochondriales Glutamat. Dieses wird im Zytosol durch die Glutamin-Synthetase zu Glutamin
aminiert und schliesslich über die Membrantransporter aus der Gliazelle in das Neuron transportiert,
wo es nach Aufnahme in das Mitochondrium als weitere Quelle zur Synthese von Glutamat als
Vorläufermolekül für GABA dienen kann.
1.2.3. Der GABA-Transporter
Die Wiederaufnahme von GABA aus dem synaptischen Spalt in Neurone und Glia wird als der
wichtigste Mechanismus zur Beendigung der GABA-Transmission angesehen (Iversen et Johnson,
1971). Zum heutigen Zeitpunkt weiss man von der Existenz vier verschiedener GABA-Transporter
(GAT-1 - GAT-4) (do Nascimento et al., 1998), wobei nach Borden et al. (1994) der neuronal
lokalisierte GAT-1-Transporter in vitro zu 85 % am GABA-Transport im Gehirn der Ratte beteiligt
ist. Allen gemeinsam sind die Eigenschaften eines transmitterspezifischen, energieverbrauchenden,
Na+- und Cl--abhängigen Transportes. Dabei ist der Transport eines GABA-Moleküls an den KoTransport von zwei Na+-Ionen und einem Cl--Ion gekoppelt (Kanner et al., 1983). Der hierfür
nötige, nach intrazellulär gerichtete Na+-Gradient wird durch die ATP-abhängige Na+/K+-Pumpe
gewährleistet (Martin, 1973). Jedoch wird die Richtung des GABA-Transportes, wie in Kapitel
1.1.1. bereits näher erläutert, letztlich durch den elektrochemischen Na+-Gradienten über der
Plasmamembran bestimmt.
Einleitung
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Unterschiede der vier Subtypen des GABA-Transporters finden sich in ihrer regionalen Verteilung
sowie in ihrer Sensitivität und Spezifität gegenüber Inhibitoren des GABA-Transporters (Liu et al.,
1993, Clark et Amara, 1994). So sind Nipecotat und sein strukturelles Analogon NNC-711
Inhibitoren der vorwiegend neuronalen GAT-1- und GAT-4-Transporter, während der gliale
Wiederaufnahme-Hemmer ß-Alanin eine hohe Affinität zu GAT-2- und GAT-3-Transportern
aufzeigt (Liu et al., 1993).
Der GABA-Transport wird nicht nur durch die unterschiedliche Verteilung der GABA-TransporterSubtypen mit ihren unterschiedlichen Affinitäten moduliert, sondern wird zudem durch die
Variation der Anzahl aktiver GABA-Tansporter in der Zellmembran reguliert (Bernstein et Quick,
1999). So stieg die Anzahl von Molekülen des GABA-Transporters GAT-1 in der Plasmamembran
innerhalb von Minuten an, wenn Zellkulturen mit ansteigenden Konzentrationen von
extrazellulärem GABA inkubiert wurden. Diese Beobachtung führten die Autoren nicht auf eine
Steigerung der Neusynthese von GABA-Transportprotein zurück, sondern auf eine Umverteilung
des Transporters aus intrazellulären Beständen in die neuronale Plasmamembran. Auch andere
Substrate des GABA-Transporters, z.B. Nipecotat, oder Botenstoffe wie Proteinkinase C hatten eine
Verschiebung von GAT-1 aus intrazellulären Speichern in die Plasmamembran zur Folge. Somit
habe der hochaffine, plasmamembranäre GABA-Transporter nicht nur eine wichtige Funktion bei
der Beendigung der GABA-Transmission, sondern gewährleiste durch die ständige Feinabstimmung
der GABA-Transporter-Funktion eine Konstanzhaltung der GABA-Konzentration im synaptischen
Spalt (Bernstein et Quick, 1999).
Zur
Schaffung
eines
Neuronen-spezifischen
GABA-Pools
aus
einem
unspezifischen
zytoplasmatischen Transmitter-Pool, ist der Transport von GABA in ein subzelluläres
Kompartiment, die Vesikel, erforderlich. Ermöglicht wird dies durch die Substrat-Spezifität des
vesikulären GABA-Transporters. Die Anreicherung von GABA in Vesikeln wurde erstmals von
Fykse und Fonnum (1988) beschrieben, wobei der vesikuläre GABA-Transporter im Unterschied
zum plasmamembranären GABA-Transporter eine niedrigere Affinität zu GABA, eine fehlende
Na+-Abhängigkeit und eine fehlende Hemmbarkeit durch Inhibitoren des plasmamembranären
GABA-Transporters zeigt. Der zum Transport benötigte elektrochemische Protonengradient wird
durch eine Mg+ATPase generiert.
Zusammenfassend dient der plasmamembranäre GABA-Transporter in Abhängigkeit des Na+Gradienten der schnellen und effizienten Entfernung von GABA aus dem synaptischen Spalt bzw.
der Freisetzung zytoplasmatischer GABA, während der vesikuläre Transporter die Verfügbarkeit
eines spezifischen, besser steuerbaren Transmitterpools garantieren soll.
Einleitung
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1.2.4. Die GABA-Rezeptoren
Es sind drei unterschiedliche GABA-Rezeptoren (A – C) bekannt:
Der GABAA-Rezeptor ist ein ionotroper Rezeptor, der für Cl--Ionen permeabel ist. Die Aktivierung
des Rezeptors führt zu einem direkten Einstrom negativer Valenzen, und somit zu einer
Hyperpolarisation mit verminderter Erregbarkeit des postsynaptischen Neurons. Agonist ist das
Fliegenpilzgift Muscimol, Antagonist das Krampfgift Bicucullin. Über eine assoziierte
Bindungsstelle
am
GABAA-Rezeptor
erhöhen
die
Benzodiazepine
allosterisch
die
Öffnungsfrequenz des Chloridkanals, Barbiturate erhöhen allosterisch die Öffnungsdauer. Beide
Pharmakagruppen wirken somit agonistisch am GABAA-Rezeptor (Forth et al., 1992).
Der GABAB-Rezeptor ist metabotrop und aktiviert eine Second-Messenger-Kaskade. So wird GProtein-gekoppelt die Leitfähigkeit von K+-Kanälen erhöht und die Leitfähigkeit von Ca++-Kanälen
vermindert. Auch in diesem Fall kommt es zu einer Hyperpolarisation mit verminderter
Erregbarkeit der postsynaptischen Nervenzelle. Baclofen ist ein selektiver Agonist an GABABRezeptoren, Phaclofen ein entsprechender Antagonist (Dutar et al., 1988).
Ein Bicucullin- und Baclofen-insensitiver GABAC-Rezeptor in bipolaren Stabzellen der Retina der
Ratte war nach Feigenspan et al. (1993) selektiv aktivierbar durch das GABA-Analogon cis-4Aminocrotonat (CACA).
Die praesynaptische Lokalisation von GABA-Rezeptoren ermöglicht eine Autoregulation durch
negatives Feedback. Calabresi et al (1991, 1992) beschrieben zum Beispiel die praesynaptische
Lokalisation von GABAB-Rezeptoren auf GABAergen und glutamatergen Neuronen des Striatums
bei Mensch und Ratte. Durch den hemmenden Effekt auf das praesynaptische Neuron erfolge somit
eine Feinabstimmung der funktionellen Aktivität der Basalganglien.
1.3. Die exzitatorischen Neurotransmitter Glutamat und Aspartat
Glutamat und Aspartat sind die wichtigsten exzitatorischen Neurotransmitter des ZNS. Viele akute
und chronische Erkrankungen, wie Schlaganfall, Trauma, Epilepsie, ALS, Morbus Alzheimer u.a.
werden mit exzitatorischen, glutamatergen Mechanismen in Zusammenhang gebracht (Leigh et al.,
1996).
Einleitung
Seite 10
1.3.1. Vorkommen und Verteilung
Glutamat und Aspartat sind ubiquitär im menschlichen Gehirn nachweisbar, wobei Glutamat
quantitativ eine deutlich grössere Rolle spielt. Nur in wenigen Hirnregionen konnte ein Überwiegen
von Aspartat nachgewiesen werden, so z.B. in Projektionen der Kommissur zum gleichseitigen
Nucleus dentatus des Hippokampus oder in bestimmten kortiko-kortikalen Fasern der visuellen
Hirnrinde (Szerb, 1988).
Die intrazelluläre Konzentration von Glutamat liegt bei etwa 10 mM, während extrazellulär
Glutamat in einer Konzentration von etwa 1 µM zu finden ist (Nicholls et Attwell, 1990). Nach
Leigh et al. (1996) reichen extrazelluläre Glutamat-Konzentrationen von 0.2 – 1.0 mM aus, um
exzitotoxisch zu wirken.
1.3.2. Der Glutamat-Metabolismus
Zur Terminierung der glutamatergen Neurotransmission erfolgt die Aufnahme des Transmitters
sowohl in umgebendes Gliagewebe, als auch in das Zytosol des präsynaptischen Neurons. In der
Nervenendigung kann Glutamat erneut vesikulär gespeichert werden, während nach Aufnahme in
gliale Zellen der sog. Glutaminzyklus durchlaufen wird: Die nur in Glia vorkommende GlutaminSynthetase aminiert zunächst Glutamat zu Glutamin, welches membrangängig aus der Gliazelle in
die glutamaterge Nervenendigung transportiert werden kann. Dort erfolgt mitochondrial die
Desaminierung von Glutamin in Glutamat durch das Enzym Glutaminase, welches nun erneut als
spezifischer Neurotransmitter zur Verfügung steht (Peng et al., 1993).
Zu einem kleineren Anteil erfolgt die Neusynthese von Glutamat aus Glucose durch die Aminierung
der aus dem Zitratzyklus stammenden α-Ketoglutarsäure in den Mitochondrien von Astroglia und
Neuronen (Peng et al., 1993). Dies wird katalysiert durch das sowohl zytoplasmatisch als auch
mitochondrial lokalisierte Enzym BCAA-T (branched-chain-amino-acid-transferase), wobei als
Aminogruppen-Donator die verzweigtkettigen Aminosäuren fungieren.
1.3.3. Der Glutamat-Transporter
Der Transport von Glutamat über die Plasmamembran von Neuronen und Gliazellen wird durch ein
hoch- und ein niedrig-affines Transportsystem gewährleistet. Der hochaffine Glutamat-Transporter
dient der schnellen Beendingung der glutamatergen Neurotransmission und schützt somit vor
neurotoxischen Konzentrationen von Glutamat im synaptischen Spalt (Nicholls et Attwell, 1990).
Einleitung
Seite 11
Bisher konnten fünf verschiedene Transporter-Subtypen (EAAT-1 - EAAT-5) gefunden und
sequenziert werden (Arriza et al., 1997). Der plasmamembranäre Glutamat-Transporter transportiert
vornehmlich
L-Glutamat
und
L-Aspartat,
jedoch
auch
die
physiologischerweise
nicht
vorkommenden D-Isomere der beiden Aminosäuren (Davies et Johnston, 1976). Der
energieabhängige Transport erfolgt über einen elektrochemischen Gradienten für Na+: Ein
Glutamatmolekül wird mit zwei Na+-Ionen ins Zellinnere kotransportiert, während ein K+-Ion mit
einer Hydroxylgruppe (OH-) gegentransportiert wird. Hierdurch kommt es zu einer Ansäuerung des
Zellinneren und gleichzeitigen Alkalisierung des Extrazellulärraums (Bouvier et al., 1992).
Zusätzlich wurde ein ungekoppelter, passiver Einstrom von Cl--Ionen beobachtet, dessen Ausmass
in Abhängigkeit des jeweiligen EAAT-Subtyps variierte (Arizza et al., 1997).
Der vesikuläre Glutamat-Transporter zeigt entsprechend dem vesikulären GABA-Transporter eine
niedrige Substrat-Affinität und eine hohe Substrat-Spezifität (Maycox et al., 1990). So wird LGlutamat entlang eines elektrochemischen Gradienten präferentiell gegenüber D-Glutamat
aufgenommen, L- oder D-Aspartat werden nicht transportiert (Naito et Ueda, 1985). Desweiteren ist
der vesikuläre Transporter Na+-unabhängig, jedoch Mg++- und ATP-abhängig (Nicholls, 1989). Die
Bedeutung des vesikulären Glutamat-Transporters liegt in der Bereitstellung eines spezifischen
Transmitterpools aus einem unspezifischen, zytoplasmatischen Reservoir.
1.3.4. Die Glutamatrezeptoren
Glutamat und Aspartat wirken an verschiedenen Rezeptoren: Drei ionotrope Klasse-I-Rezeptoren,
welche ursprünglich anhand ihrer exogenen Agonisten klassifiziert wurden, sowie ein metabotroper,
G-Protein-gekoppelter Klasse-II-Rezeptor.
Bei den Klasse-I-Rezeptoren unterscheidet man NMDA- und non-NMDA-Rezeptoren (Watkins,
1984; Fagg et al., 1985). Der NMDA-Rezeptor ist ein ligandengesteuerter Ionenkanal, welcher bei
einem Ruhemembranpotential durch Mg++-Ionen aus dem Extrazellulärraum blockiert wird. Wird
die postsynaptische Membran jedoch in Gegenwart von Glutamat depolarisiert, so dissoziieren die
Mg++-Ionen aus der Öffnung des Kanals und ermöglichen den nach intrazellulär gerichteten Fluss
von Ca++ und Na+ sowie den Ausstrom von K+. Viele Substanzen können die Aktivität des NMDARezeptors modulieren, so z.B. Glycin als Co-Agonist, Zink oder Protonen. Ein spezifischer
synthetischer Agonist ist das Aminosäureanalogon N-Methyl-D-Aspartat, ein kompetitiver
Antagonist Kynurenat und AP5. Nicht-kompetitive Antagonisten wie das Analgetikum und
Kurznarkotikum Ketamin oder das Psychotikum Phencyclidin wirken über eine direkte Blockade
des Ionenkanals.
Einleitung
Seite 12
Non-NMDA-Rezeptoren werden entsprechend ihrer Agonisten in Kainat- und AMPA-Rezeptoren
eingeteilt. Sie sind gleichfalls Kationenkanäle, welche bei Aktivierung im wesentlichen permeabel
für K+ und Na+ sind. Für beide Rezeptorsubtypen wurde zudem eine geringe Permeabilität für Ca++Ionen beschrieben (Gallo et al., 1992). Im gesamten zentralen Nervensystem sind sie für die
schnelle Erregungsübertragung durch glutamaterge Neurone zuständig. Ein kompetitiver Antagonist
an non-NMDA-Rezeptoren ist CNQX.
Bisher konnten insgesamt acht Subtypen (mGluR1 – 8) des metabotropen Glutamatrezeptors
identifiziert werden, welche entsprechend der Übereinstimmung ihrer Aminosäuresequenz in drei
Gruppen (I – III) eingeteilt werden (Anwyl, 1999). Metabotrope Glutamatrezeptoren sind verknüpft
mit verschiedenen second-messenger-Kaskaden, wobei prinzipell G-Protein-gekoppelt das Enzym
Phospholipase C aktiviert, bzw. eine Adenylatcyclase negativ moduliert wird. Die Aktivierung eines
metabotropen Glutamatrezeptors führt letztlich zu einer verminderten Leitfähigkeit für K+-Ionen, so
dass hieraus eine verstärkte Erregbarkeit des Neurons resultiert. Als nicht selektiver Agonist wurde
1S, 3R-1-Aminozyklopentan-1,3-dicarboxylat (1S, 3R-ACPD) beschrieben (Lombardi et al., 1994).
Nach Sherman et al. (1992) und Calabresi et al. (1992) kann eine Feinabstimmung und Modulation
der glutamatergen Neurotransmission durch negative Feedback-Mechanismen an praesynaptischen
ionotropen als auch metabotropen Autorezeptoren erfolgen.
1.4. Anatomische Grundlagen
1.4.1. Die Basalganglien
In den subcortical gelegenen Teilen des Grosshirns befinden sich in unmittelbarer Nachbarschaft
des Zwischenhirns die Basalganglien. Im herkömmlichen Sinne zählt man hierzu die untereinander
stark verzweigten telencephalen Kerne Nucleus caudatus, Putamen, Globus pallidus, Claustrum und
Corpus amygdaloideum. Heute ist es jedoch üblich, den im Diencephalon liegenden Nucleus
subthalamicus und die im Mesencephalon befindliche Substantia nigra in das Kernsystem der
Basalganglien zu integrieren.
All diesen Kernen ist gemeinsam, dass sie in ihrem Zusammenspiel eine wichtige Funktion in der
zentralnervösen Regulation und Abstimmung der Motorik haben. Entwicklungsgeschichtlich
wurden diese Hirngebiete mit der Ausbildung der Grosshirnrinde dem motorischen Kortex
untergeordnet. Sie erhalten Informationen aus unterschiedlichen Gebieten der Grosshirnrinde und
bewirken eine feine Abstimmung von Bewegungsimpulsen, die, wenn „sinnvoll“ und
Einleitung
Seite 13
„situationsgerecht“, zur Ausführung gelangen, wenn „nicht sinnvoll oder situationsgerecht“,
unterdrückt werden.
1.4.1.1. Lage und Morphologie des Corpus Striatum
Das Corpus Striatum bezeichnet den grössten Kernkomplex des Endhirns. Er stellt die
Eingangskomponente der Basalganglien dar und wird aus dem Nucleus caudatus und dem Putamen
gebildet. Diese entstammen entwicklungsgeschichtlich einer gemeinsamen Anlage und werden erst
sekundär durch die einsprossende Capsula interna voneinander getrennt. So bleiben die beiden Teile
des Striatums nur noch über kleine Brücken grauer Substanz miteinander verbunden, wodurch das
Striatum sein „streifenartiges“ Aussehen bekommt (striatum, lat. = gestreift). Der Nucleus caudatus
legt sich wie ein C-förmiger Schweif (cauda, lat. = Schweif) um das Putamen herum und bildet so
im oberen Teil des Seitenventrikels den Ventrikelboden bzw. die Seitenwand, in seinem unteren
Teil das Ventrikeldach. Seine Form lässt sich durch die Drehung der Hemisphären während der
embryonalen Entwicklung erklären.
Das Putamen ist im Durchschnitt um 13 % grösser als der Nucleus caudatus. Es wird lateral durch
die Capsula externa und das Claustrum, medial durch die Capsula interna und den Globus pallidus
begrenzt.
1.4.1.2. Die Histochemie des Corpus Striatum
Als Folge ihrer gemeinsamen Anlage sind die beiden Kerne des Corpus Striatum in ihrem vorderen
Abschnitt miteinander verschmolzen und setzen sich aus identischen Zelltypen zusammen. Zu mehr
als 90 % dominieren kleine bis mittelgrosse Neurone, deren Dendriten mit zahlreichen Dornen
ausgestattet sind (Gruber, 1985). Die Mehrzahl dieser Neurone enthalten GABA als Transmitter.
Die kolokalisierten, modulatorisch wirkenden Neuropeptide, Enkephalin, Substanz P oder
Dynorphin, erlauben eine weitere Untergruppierung. Diese GABAergen Fasern repräsentieren die
Gesamtheit der striato-pallidären und striato-nigralen Efferenzen. In Superfusionsversuchen
freigesetzte GABA des Striatums stammt nach Meyer et al. (1989) vor allem aus Axonkollateralen
striatonigraler Projektionsneurone. Mittelgrosse bis grosse dornenlose Neurone werden als
Interneurone angesehen, welche Azetylcholin oder Somatostatin, aber auch GABA (Lindefors,
1992) als Transmitter benutzen. Jedoch überwiegen zahlenmässig GABAerge Projektionsneurone
im Vergleich zu den GABAergen Interneuronen. Die Projektionen der verschiedenen
Neuronengruppen sind in Abbildung 1.2. nochmals genauer dargestellt.
Einleitung
Seite 14
1.4.1.3. Neuronale Schaltkreise
Wie aus folgender Abbildung hervorgeht, erhält das Striatum seine afferenten Zuflüsse vor allem
aus dem Kortex, der Substantia nigra pars compacta und dem Nucleus thalamicus.
Abb. 1.2.: Schematische Darstellung der neuronalen Verschaltungen im Bereich der Basalganglien. Sie erhalten keine
direkte, präzise organisierte Information von den Sinnesrezeptoren und besitzen keine direkten efferenten
Verbindungen mit dem Rückenmark. Die Basalganglien sammeln und verarbeiten Informationen aus
unterschiedlichen Cortexarealen und nehmen über thalamo-corticale Efferenzen Einfluss auf die
Willkürmotorik. Sie üben daher eine indirekte, nicht ins Bewusstsein gelangende Funktion der
Bewegungskontrolle aus (Abbildung modifiziert nach Ghez et Gordon, 1996).
Die kortikostriatalen Fasern stammen aus beinahe allen Grosshirnrindenarealen, jedoch projizieren
besonders intensiv der motorische, sensorische und der präfrontale Assoziationskortex in das
Striatum. Die Transmittersubstanz dieser Neurone ist das exzitatorisch wirksame Glutamat.
Thalamostriatale, cholinerge Neurone entstammen den unspezifischen intralaminären Kernen des
Thalamus und projizieren auf mittelgrosse, bedornte Striatumneurone. Die dopaminergen,
nigrostriatalen Neurone projizieren überwiegend hemmend auf cholinerge Interneurone im Striatum,
welche wiederum erregend mit den GABAergen, efferenten striatalen Neuronen verbunden sind.
Einleitung
Seite 15
Die efferenten Fasern des Striatums enthalten als Transmitter GABA und wirken dadurch in ihren
Projektionsgebieten inhibitorisch. Die bereits erwähnten, kolokalisierten Neuropeptide spielen zwar
quantitativ eine eher untergeordnete Rolle, nehmen aber eine wichtige modulatorische Funktion an
den Synapsen der GABAergen striatalen Projektionsneurone ein. Die Projektionsziele sind vor
allem das Pallidum, mit seinem medialen und seinem lateralen Anteil, und die Substantia nigra pars
reticularis.
Die pallidothalamischen, GABAergen Fasern verlaufen aus dem medialen Pallidumsegment in der
sogenannten Ansa lenticularis und erreichen schliesslich den Thalamus im Nucleus ventralis
anterior und lateralis. Exzitatorische Efferenzen des Thalamus projizieren auf die prämotorische und
präfrontale Rinde.
1.4.2. Der menschliche Neokortex
Die Grosshirnrinde ist der beim Menschen am stärksten ausgebildete Anteil des ZNS und bildet die
höchste Ebene der Integration zentralnervöser Impulse. In ihrer Grundstruktur und -funktion
unterscheidet sie sich nicht wesentlich von anderen Kerngebieten. So dient auch sie dazu,
Informationen zu empfangen, zu verarbeiten und an andere Regionen des ZNS weiterzuleiten.
Entwicklungsgeschichtlich unterscheidet man den Neokortex, die eigentliche Grosshirnrinde, vom
Archikortex, der im wesentlichen vom Hippokampus gebildet wird, und dem Paläokortex. Der
Neokortex weist bei mikroskopischer Betrachtung den typischen sechsschichtigen Bau nach
Brodmann auf. In einem Zylinder senkrecht zur Oberfläche von aussen zum Mark hin finden sich
folgende Schichten:
I.
Molekularschicht (lamina molecularis)
II.
äussere Körnerschicht (lamina granularis externa)
III.
Pyramidenschicht (lamina pyramidalis)
IV.
innere Körnerschicht (lamina granularis interna)
V.
Pyramidenschicht (lamina ganglionaris)
VI.
Schicht polymorphkerniger Zellen (lamina multiformis).
Die Leistungsfähigkeit des Neokortex beruht vor allem auf der hohen Faserdichte der Hirnrinde
sowie auf den immensen neuronalen Verschaltungen und Projektionen. Die wichtigsten Afferenzen
erhält der Neokortex aus den thalamischen Kernen. Diese thalamokortikalen Fasern enden an
Dendriten von Neuronen der inneren Körnerschicht und an Pyramidenzellen. Die Gesamtheit der
Efferenzen der Hirnrinde haben ihren Ursprung in Pyramidenzellen in allen Schichten (ausser I),
Einleitung
Seite 16
wobei die Projektionsfasern zu Hirnstamm, Rückenmark, Mittelhirn, Basalganglien und Thalamus
ziehen. Kortiko-kortikale Assoziationsfasern haben ihren Ursprung in Schicht V nach Brodmann
(Petsche, 1985). Die kortikostriatalen Neurone enthalten als Neurotransmitter Glutamat und wirken
in ihrem Projektionsort somit exzitatorisch.
1.5. Epilepsie und antikonvulsive Therapie
1.5.1. Definition der Epilepsie
Die „Fallsucht“ ist als Krankheitsbegriff seit mehr als 4000 Jahren bekannt. Im Altertum prägten
Hippokrates von Kos und Aristoteles die Bezeichnung „Epilepsie“ [griech.: epilambanein], was
soviel wie „ergriffen“, „überwältigt“ werden, bedeutet (Stefan, 1991). Neben den idealistischen
Auslegungen der Epilepsie als ein Besessensein von Dämonen, führte schon Hippokrates (460 - 357
v. Chr.) die Krankheit auf ein natürliches Wesen mit einer natürlichen Ursache zurück. John
Hughlings Jackson (1835 - 1911) formulierte um 1870 die Definiton „ein Krampfanfall ist nichts
weiter als ein Symptom und nur an eine gelegentliche, exzessive und abnorme Entladung des
Nervengewebes gebunden...“ Mit seiner Beschreibung eines einzelnen Anfallgeschehens kann
Jackson somit als Begründer der modernen klinischen Epileptologie angesehen werden. Auch heute
wird die Epilepsie definiert als eine chronische Erkrankung mit wiederholten Anfällen. Klinisch
besteht für die Zeit des Anfalls in abnehmender Häufigkeit eine Störung von Bewusstsein, Motorik,
Empfindung, Erinnerung, Wahrnehmung und Emotionen. Der einzelne Anfall ist charakterisiert
durch die abnorme, synchronisierte Aktivität grosser Neuronenverbände des ZNS.
1.5.2. Epidemiologie
Die Epilepsien stellen nach dem Schlaganfall die zweithäufigste Erkrankung des zentralen
Nervensystems dar, 0.5 bis 1% der Bevölkerung leiden an Epilepsie (Prävalenzrate, p). Die jährliche
Inzidenzrate (I) liegt bei ca. 0.03 – 0.05 %, dies entspricht etwa 30 – 40 jährlichen Neuerkrankungen
pro 100 000 Einwohner (Stefan, 1991).
Bei bis zu 5 % der Bevölkerung tritt mindestens einmal im Laufe ihres Lebens ein
Gelegenheitsanfall infolge einer epileptischen Reaktion des Gehirns auf, ohne dass sich hieraus eine
chronische Erkrankung (Epilepsie) entwickelt. Sie können bei zahlreichen Erkrankungen oder
Funktionsstörungen auftreten, beispielsweise bei Hypoglykämie, Schlafmangel, fieberhaften
Erkrankungen oder auch im Rahmen eines Alkoholentzugsyndroms.
Einleitung
Seite 17
1.5.3. Pathophysiologische Grundlagen
Pathophysiologisch ist für das epileptische Neuron eine abnorme Labilität des Membranpotentials
mit der Neigung zu Spontanentladungen charakteristisch (Speckmann 1986). Gründe hierfür können
Störungen spezieller Membranstrukturen, Störungen des extra- und intrazellulären Ionenhaushaltes
oder eine Imbalanz zwischen erregenden und hemmenden Transmittersubstanzen sein. Unter diesen
Voraussetzungen können Schrittmacherzellen andere Nervenzellen anregen. Versagen die
physiologischen Bremsmechanismen zur Eingrenzung des entstandenen Fokus, entstehen
Anfallsaktivitäten mit klinisch manifesten Konvulsionen (Stefan, 1991).
Als ein Bremsmechanismus bei der Eingrenzung und Terminierung von epileptischen
Übererregungen gilt die zytoplasmatische GABA-Freisetzung durch die Umkehr des GABATransporters: Im Rahmen eines epileptischen Geschehens kommt es infolge der exzessiven
neuronalen Aktivität zu einem Anstieg der extrazellulären Glutamat-Konzentration auf
neurotoxische Spiegel (During et Spencer, 1993). Freigesetztes Glutamat stimuliert nach Harris et
Miller (1989) vorwiegend ionotrope non-NMDA-Rezeptoren auf GABAergen Nervenendigungen
und führt infolge des Natriumeinstroms zu einer Umkehr des Natriumgradienten über der
Plasmamembran und somit zur Umkehr des elektrogenen GABA-Transporters. Inhibitorisch
wirkende GABA wird folglich Transporter-vermittelt aus dem Zytosol von GABAergen Neuronen
und Gliazellen freigesetzt (Abb. 1.3.). So kann in unmittelbarer Nachbarschaft zu glutamatergen
Synapsen zytoplasmatisch freigesetzte GABA der neuronalen Übererregung entgegenwirken und die
Ausbreitung der Erregung verhindern.
1.
2.
3.
4.
5.
Neuron
non-NMDA-Rezeptoren
zytoplasmatisches GABA
GABA-Transporter
Extrazelluläres GABA
Zellkern
GLUTAMAT
Na+
5.
1.
1.
+
Na
2.
2.
3.
3.
4.
Abb. 1.3.: Die Glutamat-induzierte GABA-Freisetzung durch die Umkehr des elektrogenen GABATransporters bei starker neuronaler Überaktivität erhöht die extrazellulären GABA-Spiegel
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Der GABA-Transporter spielt damit nicht nur eine bedeutende Rolle bei der Terminierung der
GABA-Transmission im Rahmen der physiologischen Signalübertragung, sondern ist aufgrund
seiner potentiellen Umkehrbarkeit zudem von wesentlicher Bedeutung zur Aufrechterhaltung einer
effizienten Inhibition bei pathologischer neuronaler Aktivität.
1.5.4. Pharmakotherapie
Die systematische medikamentöse, durch Anfallsreduktion oder Anfallsfreiheit empirisch bestätigte
Therapie der Epilepsien begann 1857 mit der Entdeckung der antiepileptischen Wirkung von Brom
durch Charles Locock. Über 50 Jahre dominierten diese in der Behandlung der Epilepsie bis zur
Einführung des Phenobarbitals 1912 durch Alfred Hauptmann. Seitdem wurden zahlreiche
antiepileptisch wirksame Substanzen entwickelt, welche bis zum heutigen Zeitpunkt als sogenannte
„Standartantiepileptika“ weit verbreitet sind.
Dennoch können die Kriterien einer erfolgreichen antiepileptischen Therapie (Anfallskontrolle und
geringe Nebenwirkungsrate) zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur bei rund 70 % aller
Epilepsiepatienten erfüllt werden. Somit ist für viele der Epilepsiepatienten die Forschung nach
neuen und potenten Antikonvulsiva von grosser Bedeutung (Pedley, 1994). Neue Erkenntnisse und
das bessere Verständnis der pathophysiologischen und neuropharmakologischen Zusammenhänge
im Rahmen eines epileptischen Anfallgeschehens trugen entscheidend zur systematischen
Entwicklung neuer Antikonvulsiva bei. Als ein Ergebnis dieser Forschungen wurde 1995
Gabapentin (Neurontin®) auf den Markt eingeführt.
1.6. Gabapentin
Ursprünglich wurde Gabapentin (1-(Aminomethyl)-cyclohexylessigsäure) unter der Vorstellung
entwickelt, ein strukturelles Analogon des hemmenden Neurotransmitters GABA zu schaffen,
welches im Gehirn die Wirkungen von GABA imitieren würde.
Gabapentin bewährte sich in der klinischen Anwendung vor allem als Zusatzmedikament bei
therapieresistenten, mit den herkömmlichen Antikonvulsiva nicht beherrschbaren fokalen und
sekundär generalisierten tonisch-klonischen Anfällen, wie auch als Monotherapie bei Patienten mit
neu diagnostizierter Epilepsie (Anhut et al., 1995; Chadwick et al., 1998; Lindberger et al., 2000).
Gabapentin zeigte in experimentellen Untersuchungen eine Wirkung bei hypersensitiven
Schmerzzuständen (Field et al., 1997). Desweiteren zeigt Gabapentin neuroprotektive Eigenschaften
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Seite 19
durch eine Verzögerung des exzitotoxisch induzierten Zelltodes in vitro, und befindet sich in
klinischer Erprobung zur Behandlung der amyotrophen Lateralsklerose (Mazzini et al., 1998).
1.6.1. biochemische Eigenschaften
Gabapentin ist eine Aminosäure und hat ein Molekulargewicht von 171.24. Strukturell entspricht es
einem GABA-Molekül, verknüpft mit einem lipophilen Zyklohexanring (Abbildung 1.4.). Dieser
ermöglicht Gabapentin die Passage durch die Blut-Hirn-Schranke, während GABA die Blut-HirnSchranke nicht passieren kann. Gabapentin liegt bei physiologischem pH als Zwitterion, mit einem
Oktanol/Puffer-Verteilungskoeffizient von 7.5 x 10-2 vor (Welty et al., 1993). Der Transport über
die biologischen Membranen der Darmmukosa, der Blut-Hirn-Schranke und schliesslich der
Zellmembranen von Neuronen wird durch ein spezielles Transportsystem ermöglicht, welches mit
dem Transportsystem der endogen vorkommenden L-Aminosäuren identisch ist (Su et al., 1995,
Thurlow et al., 1993). Gabapentin wird somit transportervermittelt im Zytoplasma von Nervenzellen
und Glia angereichert, wo es im Vergleich zum Extrazellulärraum eine bis zu 20-fach höhere
Konzentration erreicht und vermutlich seine Wirkung entfaltet (Su et al., 1995). Die Konzentration
in der interstitiellen Flüssigkeit des Striatums beträgt 3 – 6 % der entsprechenden
Plasmakonzentration, wobei im Hirngewebe im Vergleich zu den Plasmakonzentrationen ähnlich
hohe Substanzspiegel gemessen wurden (Welty et al., 1993; Vollmer et al., 1986). Unter
antikonvulsiv wirksamer Dosierung erreichte Gabapentin in zerebralem Gewebe Konzentrationen
von 10 - 100 µM (Vollmer et al., 1986). Die von uns eingesetzten Konzentrationen von maximal
100 µM waren somit klinisch relevant.
NH2
NH2
COOH
COOH
J-Aminobuttersäure
(GABA)
Gabapentin
Abb. 1.4.: Die Strukturformeln des inhibitorischen Neurotransmitters GABA und des Antikonvulsivums
Gabapentin.
Einleitung
Seite 20
1.6.2. Wirkmechanismus
Entgegen ersten Vermutungen zeigte Gabapentin keine GABA-„mimetischen“ Eigenschaften: Es
wirkt nicht als ein GABA-Agonist und wird nicht metabolisch in GABA umgewandelt. Gabapentin
interferiert in Konzentrationen bis zu 100 µM nicht mit GABAA- oder GABAB-Rezeptoren (Taylor,
1994), ist kein Hemmer des neuronalen oder glialen GABA-Wiederaufnahme-Transporters (Su et
al., 1995) und zeigt in physiologisch relevanten Konzentrationen keine Beeinflussung des GABA
abbauenden Enzymes GABA-Transaminase (Taylor, 1994). Bei Untersuchungen zum Einfluss von
Gabapentin auf verschiedene Neurotransmitter-Rezeptoren konnte in vitro keine Wirkung auf
NMDA- oder non-NMDA-Rezeptoren, Dopamin-, Serotonin- oder Acetylcholinrezeptoren
gefunden werden. Einzig fand sich unter Gabapentin eine signifikante Abnahme der elektrisch- oder
K+-evozierten
Freisetzung
von
Dopamin,
Noradrenalin
und
Serotonin,
wodurch
die
antihypersensitive Wirkung von Gabapentin erklärt werden könnte (Reimann et al., 1983; Schlicker
et al., 1986).
In einer Studie von Gee et al. (1996) gelang es, das Gabapentin-bindende Protein mittels
Chromatographie zu isolieren. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass diese Bindungsstellen den α2δUntereinheiten
spannungsabhängiger
Ca++-Kanälen
entsprechen.
Nachdem
weiterführende
biochemische und elektrophysiologische Studien zunächst keinen Einfluss von Gabapentin auf die
Funktion dieser Ionenkanäle aufzeigen konnten, fanden kürzlich Meder und Dooley (2000) eine
Beeinträchtigung des K+(15 mM)-induzierten, präsynaptischen Ca++-Einstroms durch Gabapentin in
Synaptosomen des Neokortex der Ratte. In einer weiterführenden Studie der selben Arbeitsgruppe
konnte durch Gabapentin die Hemmung der K+-evozierten Freisetzung von Glutamat und Aspartat
gezeigt werden (Fink et al., 2000), wobei diese Beobachtung auf eine direkte Wirkung des
Pharmakons
auf
die
α2δ-Untereinheit
spannungsabhängiger
Ca++-Kanäle
des
P/Q-Typs
zurückgeführt wurden. Shimoyama et al. (2000) fanden entsprechende Ergebnisse in
elektrophysiologischen Studien und sahen darin eine Erklärung für die antinociceptive Wirkung von
Gabapentin. Eine Relevanz dieser Beobachtungen für dessen antikonvulsive Wirkung ist nicht
geklärt. Dahingegen verdichten sich die Hinweise für eine Modulation der GABAergen
Neurotransmission durch Gabapentin.
Einleitung
Seite 21
1.7. Fragestellung
Aufgrund der erwähnten pathophysiologischen Zusammenhänge war es unser vorrangiges Ziel, ein
in vitro Modell der zytoplasmatischen Freisetzung von GABA zu etablieren, in welchem ein
vesikulärer und somit depolarisationsabhängiger Freisetzungsmodus ausgeschlossen werden konnte
und die Wirkung des Antikonvulsivums Gabapentin geprüft werden sollte. Unter der Annahme,
dass Gabapentin seine Wirkung auf die GABAerge Neurotransmission in einer Modulation der
zytoplasmatischen GABA-Spiegel ausübt, wäre auch eine entsprechende Beeinflussung der
zytoplasmatischen Freisetzung von GABA zu erwarten.
1.
2.
3.
4.
5.
GABA-Transporter
Zytoplasmatische GABA
Extrazelluläres Nipecotat
vesikulär gespeicherte GABA
Zellkern
Neuron
2.
2.
4.
5.
1.
1.
3.
Gliazelle
Abb. 1.5.: Die schematische Darstellung des Mechanismus der zytoplasmatischen Freisetzung von GABA durch
Transporterumkehr.
Hierbei sollte Nipecotat, ein GABA-Wiederaufnahmehemmer, welcher selbst als Substrat des
GABA-Transporters dient, durch Heteroexchange zytoplasmatisches GABA freisetzen und
hierdurch indirekten Einblick auf die GABA-Konzentration des Zytosols geben.
Da Gabapentin in zunehmendem Masse eine neuroprotektive Wirkung zugesprochen wird, sollte in
einem zweiten Schritt ein entsprechendes Modell bezüglich des exzitatorischen Transmittersystems
entwickelt und validiert werden. Die zytoplasmatische Freisetzung von D-[3H]-Aspartat sollte
gleichfalls durch die Induktion des Heteroexchange-Prozesses durch den transportierbaren
Wiederaufnahmehemmer L-trans-PDC erfolgen. Im Anschluss an die Validierung dieses Modells,
sollte auch hier die Wirkung von Gabapentin geprüft werden. Ergänzend hierzu soll ein Einfluss des
Pharmakons auf die spontane Freisetzung endogener Aminosäuretransmitter untersucht werden.
Methoden
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2. Methoden und Materialien
2.1. Gewebe und Präparation
2.1.1. Nucleus Caudatus des Kaninchens
Nicht vorbehandelte Tiere beiderlei Geschlechts wurden mit einer Guillotine dekapitiert. Nach dem
Eröffnen der Schädeldecke wurden die Meningen entfernt, das Gehirn ohne die beiden Bulbi
olfactorii, der Hypophyse und der Medulla oblongata vorsichtig aus der Schädelhöhle entnommen
und sofort in eisgekühlte Pufferlösung (Zusammensetzung siehe Kapitel 2.1.5.) überführt. Ein
gekühlter Aluminiumblock diente als Präparationsunterlage. Das Kleinhirn wurde abpräpariert und
die beiden Hemisphären entlang der Fissura longitudinalis cerebri voneinander getrennt. Das
Septum pellucidum wurde inzidiert, der Seitenventrikel somit von medial eröffnet. Der ihm lateral
anliegende Nucleus caudatus wurde dargestellt und stumpf von der Capsula interna abgelöst. Die so
isolierten Schweifkerne beider Hemisphären wurden dann mit dem Gewebeschneider (McIllwan
tissue chopper, Fa. Bachhofer, Reutlingen) in der frontalen Schnittebene von rostral nach kaudal in
0.35 mm dicke Schnitte zerlegt.
2.1.2. Caudatoputamen der Ratte
Phylogenetisch bedingt, ist bei der Ratte durch die fehlende Einsprossung der Capsula interna eine
Unterscheidung von Nucleus caudatus und Putamen nicht möglich (Kapitel 1.4.1.1.). Aus diesem
Grund bezeichnet die Nomenklatur diesen anatomischen Komplex als “Caudatoputamen”.
Mit männlichen Wistar-Ratten (200-300 g) wurde entsprechend den Kaninchen (Kapitel 2.1.1.)
verfahren.
2.1.3. Menschlicher Neocortex
Das für unsere Versuche zur Verfügung stehende Gewebe stammte von sechs Patienten beiderlei
Geschlechts im Alter zwischen 50 und 70 Jahren, bei denen eine Raumforderung in tiefliegenden
Hirnregionen diagnostiziert worden war. In den meisten Fällen handelte es sich dabei um
Tumorerkrankungen. Diese Patienten wurden in der Neurochirurgischen Universitätsklinik Freiburg
operativ versorgt. Um intraoperativ an die subkortikal liegende Raumforderung zu gelangen, mußte
unter Umgehung funktional wichtiger Strukturen ein Zugang durch kortikale Schichten geschaffen
Methoden
Seite 23
werden. Die Verwendung dieses aus operationstechnischen Gründen entfernten Kortexgewebes zu
Versuchszwecken wurde von der Freiburger Ethikkommission genehmigt.
Die präoperativ bzw. operativ verabreichte Medikation umfasste Flunitrazepam zur präoperativen
Sedierung, Thiopental, Fentanyl oder Flunitrazepam zur Narkose, Dexamethason bei erhöhtem
Hirndruck und Pancuronium als Muskelrelaxans.
Das Kortexgewebe wurde nach seiner Entnahme sofort in eisgekühlte, sauerstoffgesättigte
Pufferlösung überführt und zur weiteren Präparation ins Labor gebracht. Die Transportzeit betrug
dabei unter 10 Minuten. Auf einem eisgekühlten Aluminiumblock wurden makroskopisch
erkennbare Tumorreste, Gefäße oder weiße Hirnsubstanz mit Hilfe eines Skalpells vorsichtig
abpräpariert. Mit dem Gewebeschneider wurden 0.3 mm dicke Schnitte senkrecht zur Oberfläche
angefertigt, um alle kortikalen Zellschichten in einem Gewebeschnitt zu erfassen.
Makroskopisch nicht erkennbare tumoröse Infiltrationen des verwendeten Gewebes konnten die
Ergebnisse qualitativ nicht beeinflussen, da neoplastisches Gewebe keine funktionsfähigen
Nervenendigungen enthält und sich somit einer spezifischen Beladung entzieht (Feuerstein et al.,
1990).
2.2. Der Freisetzungsversuch
2.2.1. Inkubation
Zur Beladung der präparierten Hirnschnitte mit exogen zugeführtem Transmitter wurden die
Gewebeschnitte in unterschiedlichen, von der Art des Transmitters abhängigen Konzentrationen des
radioaktiv markierten Transmitters inkubiert:
Transmitter
Endkonzentration
Inkubationsvolumen
Inkubationszeit
[3H]-GABA
0.1 µM
4 ml
60 oder 30 min
[3H]-Glutamin
3.2 µM
2 ml
60 min
[3H]-Aspartat
0.1 µM
4 ml
30 min
Tab.2.1.: Die Inkubationsbedingungen.
Die Inkubation erfolgte in einem auf 37°C vorgewärmten Wasserbad unter ständiger Begasung mit
Carbogen.
In einigen Versuchen sollte Gabapentin die Einflussnahme auf die GABA-Synthese ermöglicht
werden. Hierbei wurden die Gewebeschnitte mit [3H]-Glutamin inkubiert, da ein Grossteil des
Methoden
Seite 24
striatalen GABA-Pools auf die Synthese aus dem Vorläufermolekül Glutamin zurückzuführen ist.
Dagegen ist exogen zugeführtes Glutamat nur unwesentlich an der Synthese des TransmitterGABA-Pools beteiligt (Fonnum et Paulsen, 1990; Peng et al., 1993). Wie in Abschnitt 1.2.2.
beschrieben, enthalten nur GABAerge Neurone das GABA synthetisierende Enzym
Glutamatdecarboxylase (GAD). Sämtliche Tritium-markierte GABA, die nach Inkubation mit [3H]Glutamin in den Superfusaten und Schnitten gemessen wird, ist somit neuronalen Ursprungs
(Reubi, 1980).
Zur Etablierung des Modells der zytoplasmatischen Freisetzung von exzitatorischen Aminosäuren
erfolgte die Inkubation mit D-[3H]-Aspartat, da Aspartat im Vergleich zu Glutamat nicht in
Vesikeln angereichert wird (Naito et Ueda, 1985). Des weiteren unterliegt D-Aspartat im
Unterschied zu L-Aspartat nicht einem raschen metabolischen Abbau. So entsprachen 97 % des
gemessenen Radioaktivitätsgehaltes der Gewebeschnitte im Anschluss an Perfusionsexperimente
nicht-metabolisiertem D-[3H]-Aspartat (Davies et Johnston, 1976). Die Inkubation mit Tritiummarkierter D-Aspartat hatte somit den Vorteil nur den zytoplasmatischen Transmitterpool zu
markieren, und gewährte durch den nur gering ausgeprägten Metabolismus konstante
Konzentrationen des exogenen Transmitters.
In einigen Versuchen wurde die Superfusion ohne vorherige Inkubation mit dem radioaktivmarkierten Transmitter durchgeführt. Ziel hierbei war es, die Konzentration der endogen im
Hirngewebe vorkommenden Aminosäure-Transmitter in den Superfusaten zu messen.
2.2.2. Superfusion
Die Superfusion ist eine Methode um den Einfluss von Testsubstanzen auf die
Transmitterfreisetzung zu untersuchen.
Nach Beendigung der Inkubation wurde die radioaktive Flüssigkeit vorsichtig abgesaugt und
überschüssiges Inkubationsmedium, welches Zelldetritus und während der Inkubation nicht in die
Schnitte aufgenommene Radioaktivität enthält, wurde durch sorgfältiges Spülen mit vorgewärmter
Superfusionsflüssigkeit entfernt.
Die Schnitte wurden dann auf 12 Kammereinsätze aus Plexiglas verteilt. Ein Polypropylennetz an
Boden und Deckel der Einsätze verhinderte ein Fortschwimmen der Schnitte und ermöglichte
gleichzeitig den Fluss des Superfusionsmediums durch die Kammereinsätze. Diese wurden in die
zugehörigen, zweigeteilten Glaskammern überführt und kontinuierlich mit Superfusionsmedium
superfundiert. Die Glaskammern schlossen die Einsätze wasserdicht gegen das auf 37°C
Methoden
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vorgeheizte Wasserbad ab. Eine Rollenquetschpumpe (PLG-Vielfachschlauchpumpe 132100,
Desaga, Heidelberg, FRG) gewährleistete je nach Versuchsprotokoll eine konstante Flussrate von
1.0 ml/min, 0.4 ml/min bzw. 0.08 ml/min. Jede Kammer war durch ein Schlauchsystem über einen
zuführenden Schenkel mit dem Basalpuffer, bzw. Stimulationspuffer und über einen abführenden
Schenkel mit den Auffangvials verbunden. Der Wechsel von Basalpuffer auf Stimulationspuffer
war durch das Einbringen von Drei-Wege-Hähnen in das Schlauchsystem möglich.
Alle Superfusionsmedien befanden sich während der gesamten Superfusionszeit in einem 37°C
warmen Wasserbad und wurden ständig mit Carbogen begast (schematische Darstellung der
Versuchsanordnung siehe Abb. 2.1).
In Abhängigkeit von Art und Dauer der Inkubation wurden die ersten 20 bis 40 Minuten der
Superfusion verworfen, um abgestorbene Zellbestandteile und nicht in die Zellen aufgenommene
Radioaktivität solange auszuwaschen, bis von einer relativ konstanten basalen Tritiumabgabe
ausgegangen werden konnte (Tab. 2.2.).
Art des Transmitters
Inkubationsdauer
Vorperfusionsdauer
30 min
30 min
60 min
20 min
[3H]-Glutamin
60 min
20 min
D-[3H]-Aspartat
30 min
30 min
--
40 min
[3H]-GABA
endogene Aminosäuren
Tab. 2.2.: Die Vorperfusionsdauer in Abhängigkeit von der Art des Transmitters und der Dauer der Inkubation.
Dieser sogenannten Vorperfusion schloss sich im weiteren Versuchsverlauf die Sammelperiode an,
in welcher jeweils 5-Minuten-Fraktionen des Superfusates bis zum Versuchsende in Vials
aufgegefangen wurden (Abb. 2.2.). Die Zahl der Fraktionen richtete sich dabei nach den jeweiligen
Versuchs- und Stimulationsbedingungen und wird im Kapitel Ergebnisse näher beschrieben.
Nach Inkubation mit [3H]-GABA wurde ab Beginn der Superfusion (throughout)
Aminooxyessigsäure (AOAA, 0.1 mM) zugegeben, ein Enzym, welches den vorzeitigen Abbau der
exogen zugeführten [3H]-GABA durch Hemmung des GABA abbauenden Enzyms GABATransaminase verhindern sollte. Je nach Fragestellung wurden Substanzen, welche auf die
Ausschüttung zusätzlich Einfluss nehmen sollten, dem Superfusionsmedium vor der zweiten
Stimulation hinzugefügt, oder waren während der gesamten Superfusionszeit (throughout) zugegen.
Methoden
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Als Kontrollen wurden bei jedem Versuch mehrere Schnitte ohne die zu prüfenden Substanzen
superfundiert. Sie dienten einerseits dem Vergleich zu den Schnitten mit den zu prüfenden
Substanzen und andererseits zur Aufdeckung möglicher Störeffekte, welche nicht auf einen
Substanzeffekt zurückzuführen sind.
Während der Superfusion wurden die Gewebeschnitte mittels eines Inhibitors des
plasmamembranären Transporters (Nipecotat, bzw. L-trans-PDC) zur Ausschüttung von [3H]GABA, bzw D-[3H]-Aspartat stimuliert. Im nächsten Abschnitt soll hierauf genauer eingegangen
werden. Die Superfusion endete 15 bzw. 20 Minuten nach der letzten Stimulation.
4.
3.
2.
1.
5.
6.
1.
7.
8.
1.
2.
3.
4.
Wasserbad und Thermostat
Stimulationspuffer
Basalpuffer mit oder ohne zu prüfende Substanz
3-Wege-Hahn
5.
6.
7.
8.
Superfusionskammern
Rollenquetschpumpe
Auffangvials
Retriever
Abb. 2.1.: Die schematische Darstellung der Superfusionsanlage, modifiziert nach Jehle.
Wie bereits erwähnt, wurde ein Teil der Versuche ohne vorherige Inkubation der Schnitte mit
radioaktiv markiertem Transmitter durchgeführt. Hierbei überprüften wir den Einfluss von
Gabapentin auf die spontane Freisetzung der endogenen Aminosäuren Glutamat, Aspartat und
GABA.
Methoden
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2.2.3. Stimulation
Wie einleitend bereits näher besprochen, war unser erstes Ziel die Etablierung einer Methode zur
Untersuchung der nicht-vesikulären, zytoplasmatischen GABA-Freisetzung.
Hierzu bedienten wir uns des GABA-uptake-blockers Nipecotat, ein starker, nicht-kompetitiver
Inhibitor des GABA-Transporters (Kroogsgard-Larson et al., 1975). Diese Substanz hat die
Eigenschaft, durch den Prozess des Heteroexchange zytoplasmatische GABA freisetzen zu können.
Die Dauer und Häufigkeit der Stimulation (S) war dabei von der jeweiligen Fragestellung abhängig
und erfolgte, wenn nicht anders angegeben, 15 Minuten (S1) und 55 Minuten (S2) nach Beginn der
Sammelperiode mit je einem Puls von 1 mM Nipecotat über 2 Minuten.
Zur Untersuchung der D-[3H]-Aspartat-Freisetzung erfolgte nach Inkubation mit D-[3H]-Aspartat
die Stimulation mit L-trans-PDC (1 mM), ein kompetitiver Inhibitor des plasmamembranären
Glutamat-Transporters. Dabei wurde analog der Nipecotat-Stimulation verfahren.
Inkubation
Vorperfusion
S1
S2
t (min)
Superfusion
Sammelphase
Abb. 2.2.: Der schematische Verlauf eines Superfusionsversuches.
2.3. Bestimmung und Charakterisierung der Transmitter
Bei Inkubation mit [3H]-GABA bzw. D-[3H]-Aspartat war es möglich, das in den Superfusaten und
Schnitten enthaltene GABA bzw. Aspartat direkt als Tritium-markierten Transmitter zu messen.
Nach Inkubation mit [3H]-Glutamin entstanden bei der metabolischen Umwandlung zu [3H]-GABA
radioaktiv markierte Zwischen- und Abbauprodukte. Dies machte die chromatographische Trennung
von [3H]-GABA von seinen gleichfalls tritiierten Vorstufen und Metaboliten erforderlich, um
fälschlicherweise zu hohe Messwerte zu vermeiden.
Methoden
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Die Quantifizierung der endogenen Aminosäuren Glutamat, Aspartat und GABA erfolgte durch die
Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (high pressure liquide chromatographie, HPLC).
2.3.1 Bestimmung nach Inkubation mit [3H]-GABA bzw. [3H]-D-Aspartat
Nach dem Ende der Superfusion wurden die Schnitte aus den Kammereinsätzen entnommen und in
einem Glasvial mit 0.5 ml Soluene 350 (Packard, Frankfurt/Main) aufgelöst. Erst nach vollständiger
Homogenisierung des Gewebes erfolgte die Zugabe von je 10 ml des Szintillators Ultima Gold
(Packard, Frankfurt/Main). Den Superfusaten wurden je 7 ml dieser Szintillationsflüssigkeit
hinzugefügt.
Der Szintillator (szintilla, lat.: Funke) ermöglicht die Umwandlung der kinetischen Energie der ßStrahlung in Photonen. Dabei wird die beim ß-Zerfall frei werdende kinetische Energie auf die in
der Szintillationsflüssigkeit enthaltenen Fluor-Atome übertragen. Die Elektronen der äußeren
Elektronenhülle des Fluor-Atomes befinden sich dadurch auf einem höheren energetischen Niveau.
Fallen diese Elektronen wieder in ihre Ausgangslage zurück, so wird diese Energie im Form von
Photonen frei. Die Anzahl der Lichtquanten ist dabei proportional der Energie der ß-Teilchen. Die
Quantifizierung der in der Flüssigkeit enthaltenen Tritiummenge erfolgt durch die Detektion der
Photonen mit Hilfe eines Flüssigkeitsszintillationszählers (Pharmacia Diagnostics, Freiburg, BRD).
2.3.2 Bestimmung von [3H]-GABA nach Inkubation mit [3H]-Glutamin
Die bei den Versuchen gewonnenen Superfusate enthielten ein Gemisch von [3H]-GABA und
seinen Vorstufen und Abbauprodukten: [3H]-Glutamin, [3H]-Glutamat, [3H]-Succinatsemialdehyd
und [3H]-Succinat.
Zur Trennung dieser Substanzen wurde die Ionenaustauschchromatographie nach einer erstmals von
Schultheiss et al. (1990) beschriebenen Methode verwendet.
Aminosäuren haben einen amphoteren Charakter, d.h. sie können in Abhängkeit vom pH-Wert
entweder saure oder basische Eigenschaften zeigen. Ein Ionenaustausch kann nur stattfinden, wenn
sowohl der Austauscher (stationäre Phase), als auch die Probensubstanz (mobile Phase) in
ionisierter Form vorliegen. Durch Variation des pH-Wertes kann die Dissoziation beider Systeme
und somit das Ausmaß elektrostatischer Wechselwirkungen beeinflußt werden.
Zur Trennung von [3H]-GABA von seinen Vorstufen [3H]-Glutamin und [3H]-Glutamat sowie von
seinen Metaboliten [3H]-Succinatsemialdehyd und [3H]-Succinat diente uns als stationäre Phase der
Kationenaustauscher DOWEX 50 WX-4 (Aldrich, Deutschland). Dieser trägt als
Methoden
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Austauschergruppe eine Sulfonsäuregruppe und ist somit negativ geladen. Um an den Austauscher
gebunden zu werden, muß GABA in kationischer Form vorliegen.
Der pK1-Wert einer Aminosäure bezeichnet die Dissoziationskonstante der Carboxylgruppe.
Definitionsgemäß liegen dabei 50 % der Moleküle in ionisierter Form vor. Bei einem pH-Wert
welcher dem pK1-Wert einer Aminosäure entspricht, ist die Carboxylgruppe zur Hälfte protoniert
und somit positiv geladen. Der pK1-Wert von GABA liegt bei 4.031. Bei dem pH-Wert, welcher
dem pK1-Wert entspricht, liegt GABA zur Hälfte als Kation vor, während sich die anderen
tritiierten Verbindungen bezüglich der Carboxylgruppe elektrisch neutral verhalten, d. h. bei einem
pH von 4.0 wird die Hälfte des in der Lösung enthaltenen [3H]-GABA an die Austauschersäule
gebunden werden, während die anderen tritiierten Aminosäuren aufgrund der fehlenden
Protonierung ihrer Carboxylgruppe ausgewaschen werden.
Für die säulenchromatographische Auftrennung konnten die Schnitte nicht in Soluene
homogenisiert werden, sondern wurden zur Probenaufbereitung nach Entnahme aus den
Kammereinsätzen in je ein Eppendorfreaktionsgefäss mit 1 ml 0.4 M Perchlorsäure überführt. Die
Homogenisierung des Gewebes erfolgte durch eine einminütige Behandlung mit Ultraschall. Nach
Zentrifugation über 5 Minuten bei 10 000 rpm wurde der Überstand abpipettiert, 8 ml 0.1 % Triton
X-100 hinzugefügt und mit 1 M Essigsäure bzw. 1 M Natriumacetat auf einen pH-Wert von 4.0
eingestellt. Die Superfusate wurden mit 4 ml 0.2 % Triton X-100 versetzt und gleichfalls auf einen
pH-Wert von 4.0 eingestellt.
Die Aufbereitung des Ionenaustauschers DOWEX 50 WX-4 erforderte einen jeweils 30 minütigen
Waschvorgang in 1 M NaOH, 1 M HCl und zuletzt in 1 M NaOH. Die Flüssigkeit wurde nach
Beendigung des Waschvorgang jeweils unter Vakuum abgesaugt. Der so aufbereitete
Ionenaustauscher wurde in 0.2 M NaAcetat gelöst und mit konzentrierter Essigsäure auf einen pHWert von 4.0 eingestellt. Glassäulen (0.5 x 3 cm) wurden mit 1.5 ml des DOWEX 50 WX-4 gefüllt.
Es erfolgte nochmals ein Waschvorgang mit 5 ml 0.2 M Natriumacetat und anschliessend mit 5 ml
0.1 % Triton X-100.
Nun erfolgte die eigentliche Probentrennung: Die Superfusate und homogenisierten Schnitte wurden
auf die Säulen gegeben. Das positiv geladene [3H]-GABA trat in Wechselwirkung mit den
anionischen Gruppen des Austauschers, während [3H]-Glutamin, [3H]-Glutamat, [3H]Succinatsemialdehyd und [3H]-Succinat beim anschließenden Waschvorgang mit 10 ml 0.1 %
Triton X im Effluent ausgewaschen wurden. Die Eluierung von [3H]-GABA erfolgte mit 4 ml 0.4 M
Methoden
Seite 30
Tris (pH 7.4). Die Anhebung des pH-Wertes der mobilen Phase bewirkte dabei den Übergang von
[3H]-GABA in seine Zwitterionenform und somit die Ablösung vom Austauscher.
Zur Bestimmung des Tritium-markierten Transmitters wurde das Eluat mit 12 ml Ultima Gold
(Packard, Frankfurt/Main) versetzt und mittels des Flüssigkeitsszintillationszählers quantifiziert.
Die Wiederfindungsrate von [3H]-GABA im Eluat betrug 66.33 %.
2.3.3 Bestimmung der endogenen Aminosäuren durch HPLC
Im Gegensatz zu der oben beschriebenen, konventionellen Säulen-Chromatographie, bei der die
Probe in der mobilen Phase mittels Schwerkraft durch die stationäre Phase wandert, wird bei der
HPLC die mobile Phase unter hohem Druck durch die Säule mit der stationären Phase gepumpt.
Je nach Art und Wechselwirkung zwischen stationärer Phase und mobiler Phase unterscheidet man
zwischen verschiedenen Trennmechanismen. Wir bedienten uns hierbei der sog. Reversed Phase
Chromatographie (RPC), die in zunehmendem Masse als effektive Methode in der Peptid- und
Proteinanalytik eingesetzt wird. Die RPC nutzt die unterschiedliche Löslichkeit der zu trennenden
Proben in der stationären, bzw. mobilen Phase aus. Hierbei ist die mobile Phase polarer
(hydrophiler) als die stationäre Phase. Hydrophobe Substanzen werden reversibel and die
hydrophoben Bestandteile des RP-Materials gebunden. Durch die Erhöhung des organischen, d.h.
hydrophoben Anteils im Eluenten (mobile Phase) kommt es zur Verringerung der Hydrathülle der
Moleküle und damit zur Desorption und chromatographischen Auftrennung der Substanzen nach
ihrer Hydrophobizität. Je unpolarer (hydrophober) eine Substanz ist, um so länger ist ihre
Retentionszeit an der stationären Phase.
Neben der Säule selbst, ist die Auswahl des richtigen Eluenten von entscheidender Bedeutung für
das chromatographische Ergebnis. Die Adsorption der zu trennenden Substanzen erfolgt
normalerweise aus wässrigen Pufferlösungen. Wir verwendeten hierzu eine 10 mM
NaH2PO4/Na2HPO4-Lösung (pH 7.2) mit einem linear ansteigenden Gradienten von 0-22.5 %
Acetonitril als organische Komponente und einer Flussrate von 1.3 ml/min (Knoerle et al., 1996).
Mit steigendem Anteil von Acetonitril in der mobilen Phase nimmt auch deren Elutionskraft zu.
Die Superfusate und Schnitte wurden wie folgt für die HPLC vorbereitet: Nach Beendigung der
Superfusion wurden die Superfusate über einen Zellulose-Acetat-Filter mit einer Porengrösse von
0.22 µm filtriert. Hierbei sollten Verunreinigungen durch ausgewaschene Zellbestandteile aus den
Superfusaten entfernt werden. Die Schnitte wurden in 1 ml Methanol homogenisiert (Ultraschall, 1
min) und mit 10 000 rpm. für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und
filtriert. Das weitere Protokoll bezieht sich auf Schnitte und Superfusate.
Methoden
Seite 31
Es folgte die Derivatisierung mit dem sog. OPA-Reagenz: o-Phthalaldehyd (1.25 mg) wurde gelöst
in 0.5 ml 1M Natrium-Boratpuffer (pH 10.4), 4.5 ml Methanol und 50 µl Mercaptoethanol. Von
dieser Lösung wurden 25 µl auf 100 µl Superfusat gegeben (Reaktionszeit: 2 Minuten bei
Raumtemperatur). Während dieser Zeit wurde das o-Phthalaldehyd an die Aminogruppe der
Aminosäuren gebunden. Als Reaktionsprodukt der beiden Substanzen entstand ein floureszierendes
Isoindolderivat. Von diesem Reaktionsprodukt wurden 100 µl auf die RP-Säulen gegeben. Durch
die kontinuierliche Steigerung des hydrophoben Anteils in der mobilen Phase (Acetonitril) wurden
die floureszenzmarkierten Aminosäuren in der Reihenfolge ihres hydrophoben Charakters eluiert.
Die Detektion und Quantifizierung der so getrennten Substanzen erfolgte durch die Messung der
Floureszenz bei einer Anregungswellenlänge von 330 nm und einer Emissionswellenlänge von 450
nm. Die Identifizierung der Aminosäuren gelang über den Vergleich der Retentionszeiten mit
Standardchromatogrammen.
Säule (feste Phase):
Nucleosil 100-5 C18 (Fa. Macherey-Nagel, Düren, FRG)
Dimension: Länge 250 mm, Innendurchmesser 4.6 mm
Acetonitril in 10 mM NaPhosphat (pH 7.2)
linear 0 - 22.5 % in 45 Minuten
1.3 ml/min
UV, Anregung: 330 nm, Emission: 450 nm
Minuten
GABA
Glutamin
Glutamat
Aspartat
Absorption
Serin
Glycin
Eluent (mobile Phase):
Gradient:
Flussrate:
Detektion:
Methoden
Seite 32
Um eine Vergleichbarkeit zwischen den einzelnen Kammern zu erreichen, wurde bei der
statistischen Auswertung der gemessene Aminosäurengehalt der Superfusate auf den gemessenen
Aminosäuregehalt der Schnitte bezogen
2.4. Berechnungen
2.4.1 Zählausbeute für Schnitte und Superfusate
Die vom Flüssigkeitsszintillationszähler gemessene Anzahl der Lichtblitze (counts) stellte nur einen
bestimmten Anteil der tatsächlich in den Superfusaten und Schnitten enthaltenen Radioaktivität dar.
Aus diesem Grund wurde die sogenannte Zählausbeute (counting efficiency, C.E.) ermittelt. Die
C.E. bezeichnet den prozentualen Anteil der gemessenen Aktivität (counts per minute, cpm) an der
tatsächlichen Aktivität (desintegrations per minute, dpm) einer gemessenen Probe.
Hierzu diente ein [3H]-Standard mit bekannter Aktivität (dpm), von welchem eine definierte Menge
(20 µl) eingesetzt wurde. Die C.E. ergab sich bei bekanntem Hintergrundrauschen (background, BG
= cpm von 5 ml Puffer mit 7 ml Ultima Gold) aus dem Quotienten der gezählten cpm des [3H]Standards, vermindert um das Hintergrundrauschen (BG) und dividiert durch die tatsächlichen
Zerfälle zum aktuellen Zeitpunkt (dpm). Der aktuelle dpm-Wert des [3H]-Standards errechnete sich
aus dem vom Hersteller angegebenen dpm-Wert zum Herstellungszeitpunkt multipliziert mit dem
zeitlichen Zerfallsfaktor. Dieser konnte einer Tabelle entnommen werden.
Zur C.E.-Bestimmung der Superfusate wurde [3H]-H2O, der Schnitte wurde [3H]-Toluol verwandt.
Somit ergab sich folgende Formel:
cpm (Superfusat + [3H]-H2O) - cpm (BG)
C.E.Superfusat =
aktueller dpm-Wert [3H]-H2O
x 100
cpm (Schnitt + [3H]-Toluol) - cpm (BG)
C.E.Schnitt
=
x 100
3
aktueller dpm-Wert [ H]-Toluol
Bei der Messung von [3H]-GABA nach [3H]-Glutamininkubation war, bedingt durch die
gleichartige Behandlung von Superfusaten und Schnitten bei der chromatographischen Auftrennung,
nur die Berechnung einer C.E. mit Hilfe von [3H]-H2O nötig.
Methoden
Seite 33
Aus der ermittelten Zählausbeute des Szintillationszählers ließen sich die dpm jeder einzelnen
Probe aus den gemessenen cpm errechnen:
cpm
dpm
=
C.E.
Unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität [Ci/mmol] des eingesetzten tritiummarkierten
Transmitters war eine Umrechnung in pmol möglich. Dies wurde zur Berechnung des Gehaltes an
Tritium-markiertem Transmitter in den Schnitten nach Beendigung der Superfusion angewendet
(Beladung, pmol/Schnitt).
2.4.2 Prozentuale Radioaktivitätsabgabe
Eine unterschiedliche radioaktive Beladung der einzelnen Schnitte machte eine Normierung der
einzelnen Superfusatfraktionen erforderlich, um die Versuche miteinander vergleichen zu können.
Hierzu wurde die absolute Tritiummenge einer Superfusatprobe auf den Gesamttritiumgehalt des
zugehörigen Schnittes zu Beginn der Fraktion bezogen.
Die prozentuale Radioaktivitätsabgabe (PR) einer Fraktion ergab sich dann aus folgender Formel:
[3H]-Abgabe in einer 5-min-Fraktion (dpm)
PR
=
3
x 100
[ H]-Gehalt des Schnittes zu Beginn der Fraktion (dpm)
2.4.3 Stimulationsbedingte Tritiumfreisetzung
Die stimulationsbedingte Tritiumfreisetzung (S) errechnete sich aus der Summe der freigesetzten
Radioaktivität der Stimulationsfraktion und der darauffolgenden Fraktionen (SF1 – SFx), abzüglich
der geschätzten basalen Tritiumabgabe dieser Fraktionen.
Bei der Schätzung wurde von einem annähernd linearen Abfall der basalen Freisetzung ausgangen.
Der Mittelwert der basalen Tritiumfreisetzung wurde aus der letzten Fraktion vor der Stimulation
(b1) und der ersten Fraktion bei der kein Stimulationseffekt mehr erkennbar war (b2) errechnet.
Dieser Mittelwert musste noch mit der Anzahl der Stimulationsfraktionen multipliziert werden. Die
Methoden
Seite 34
so geschätzte basale Tritiumabgabe wurde von der Summe der freigesetzten Radioaktivität der
Stimulationsfraktionen (∑SF1 + SF2... + SFX ) abgezogen.
Der Quotient aus der so ermittelten stimulationsbedingten Tritiumfreisetzung und des
Tritiumgehaltes des Schnittes zu Beginn der Stimulation ergab den S1 - bzw. S2-Wert.
(∑SF1 + SF2... + SFX ) - (b1 + b2) x Anzahl SF
2
S=
[3H]-Gehalt des Schnittes zu Beginn der Stimulation
2.4.4. S2/S1-Quotient
Um den Einfluss einer Testsubstanz auf die stimulationsbedingte [3H]-GABA-Freisetzung mit den
Kontrollen vergleichbar zu machen, wurde die stimulationsbedingte Freisetzung der zweiten
Stimulation (S1) auf jene der ersten Stimulation (S1) bezogen (S2/S1-Quotient).
Unterschiede in der stimulationsbedingten Tritiumfreisetzung, die auf unterschiedliche Schnittdicke,
-größe oder -beladung zurückzuführen waren, wurden somit ausgeglichen. Versuche mit einer
Testsubstanz wurden gegenüber Versuchen ohne die entsprechende Substanz (Kontrollen)
vergleichbar.
In den Versuchen mit nur einer Stimulation erfolgte der direkte Vergleich der S1-Werte der mit
Gabapentin throughout behandelten Gruppen mit den Kontrollen.
2.4.5. Basaleffluxquotient
Zur Ermittlung eines möglichen Effektes von Testsubstanzen auf die nichtstimulierte, spontane
Transmitterfreisetzung wurde der Basaleffluxquotient gebildet. Er errechnete sich aus dem
Quotienten der jeweils letzten Fraktion (PR) vor den beiden Stimulationsfraktionen. Ein Einfluß der
Testsubstanz konnte dann angenommen werden, wenn sich ein signifikanter Unterschied im
Vergleich zu den Basaleffluxquotienten der mitlaufenden Kontrollen zeigte.
Einflüsse von Testsubstanzen auf die basale Transmitterfreisetzung veränderten den S2/S1Quotienten, was in der Interpretation der entsprechenden Versuche berücksichtigt werden mußte.
Methoden
Seite 35
2.4.6. Statistische Auswertung
Die nachfolgenden Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SEM (Standardfehler des Mittelwertes) einer
bestimmten Versuchsanzahl (n) angegeben.
Signifikante Unterschiede zwischen den durch zugegebene Testsubstanzen beeinflußten
Mittelwerten und dem entsprechenden Mittelwert der S2/S1-Quotienten der Kontrollen wurden mit
Hilfe von Einweg-Varianzanalysen überprüft.
Dem schloss sich der Vergleich der einzelnen Mittelwerte durch den Scheffé-Test mit den
folgenden Signifikanzniveaus an:
* = p < 0.05
** = p < 0.01
*** = p < 0.001
nicht signifikante Unterschiede werden als n.s. angegeben.
Bei der Angabe von Ergebnissen in Prozent des ensprechenden Kontrollmittelwertes wurde das
Fehlerfortpflanzungsgesetz zur Berechnung der entsprechenden SEM angewandt.
Methoden
Seite 36
2.5. Materialien
Inkubations- und Superfusionsmedien:
(gelöst in bidestilliertem Wasser, Angaben in mmol/l)
NaCl
KCl
CaCl2
MgSO4
NaHCO3
KH2PO4
Glucose
Basispuffer
121.0
1.8
1.3
1.2
25.0
1.2
11.0
Ca++-freier Puffer
121.0
1.8
0.0
1.2
25.0
1.2
11.0
Die Lösungen wurden mit Carbogen (95 Vol. % O2, 5 Vol. % CO2) gesättigt und mit 1 N
Natronlauge bzw. 1 N Salzsäure auf einen physiologischen pH-Wert von 7.4 eingestellt. Ein
Osmolaritätsausgleich wurde bei Ansetzen des Ca++-freien Puffers aufgrund der nur geringen
Osmolaritätsunterschiede nicht durchgeführt.
[3H]-GABA
Du Pont; NEN, Dreieich, Deutschland
spezifische Aktivitäten 38.4 / 34.8 / 30.0 Ci/mmol
[3,4-3H]-Glutamin
Du Pont; NEN, Dreieich, Deutschland
spezifische Aktivitäten 60 / 48.4 /47.7 / 44.6 Ci/mmol
D-[3H]-Aspartat
Du Pont; NEN, Dreieich, Deutschland
spezifische Aktivität 21.0 Ci/mmol
[3H]-H2O
Du Pont, NEN, Dreieich, Deutschland
Aminooxyessigsäure (AOAA)
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
MG 109.3, gelöst in aqua bidest.
CdCl2
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
MG 183.32, gelöst in aqua bidest.
Dihydrokainat
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Methoden
Seite 37
[2-Carboxy-4-isopropyl-3-pyrrolidinacetat]
MG 215.2, gelöst in aqua bidest
Gabapentin
Gödecke AG, Freiburg, Deutschland
1-(aminomethyl)-cyclohexanessigsäure
MG 171.24, gelöst in aqua bidest.
3-Mercaptopropionsäure (3-MCPA)
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
MG 106.14, pure liquid, d = 1.22 g/ml
± Nipecotat
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
[3-Piperidincarboxylsäure]
MG 129.2, gelöst in aqua bidest.
NNC 711 hydrochloride
Biotrend Chemikalien, Köln, Deutschland
[1-(2-(((Diphenylmethylen)imino)oxy)
ethyl)-1,2,5,6-tetrahydro-3-pyridincarboxylathydrochlorid]
MG 386.88, gelöst in aqua bidest.
L-trans-PDC
Tocris Cookson, Bristol, Großbritannien
[L-Trans-pyrrolidin-2,4-dicarboxylat]
MG 159.14, gelöst in 0.001 M HCl, bzw. 0.1 N NaOH
Tetrodotoxin
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
MG 319.28, gelöst in aqua bidest.
Alle weiteren Standardreagenzien wurden von den Firmen Merck, Darmstadt und Packard Inst.,
Frankfurt bezogen.
Ergebnisse
Seite 38
3. Ergebnisse
3.1. Ausgangspunkt der Arbeit
Der Verlust einer effizienten, GABAergen Inhibition ist ein wesentlicher Faktor bei der Entstehung
epileptischer Aktivitäten. Wesentlich verantwortlich hierfür ist nach During et al. (1995) eine
verminderte Anzahl von GABA-Transportern in epileptogenem Gewebe, welche die
zytoplasmatische, Transporter-vermittelte GABA-Freisetzung beeinträchtigt. Medikamente, welche
durch einen Eingriff in den GABA-Metabolismus eine Erhöhung des zytoplasmatischen GABAPools und somit des chemischen Gradienten von GABA über der Plasmamembran bewirken
können, wären demnach in der Lage ein Ausgleich für die pathologisch verminderte Anzahl von
GABA-Transportern zu schaffen.
Deshalb soll in dieser Arbeit zunächst ein in vitro Modell der zytoplasmatischen Freisetzung von
radioaktiv markierter GABA, bzw. D-Aspartat entwickelt und validiert werden. Abschliessend soll
in diesem Modell die Wirkung des Antikonvulsivums Gabapentin geprüft werden, von dem ein
Einfluss auf die zytoplasmatische Transmitterkonzentration und somit auf die zytoplasmatische
Freisetzung vermutet wird. Ergänzend zu diesen Untersuchungen soll der Einfluss von Gabapentin
auf die spontane Freisetzung der endogenen Transmitter GABA, Glutamat und Aspartat überprüft
werden.
3.2. Die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
Die folgend beschriebenen Ergebnisse wurden -wenn nicht anders angegeben- nach den allgemeinen
Versuchsbedingungen durchgeführt:
Der GABAerge Transmitterpool wurde durch Inkubation mit [3H]-GABA mit einer
Endkonzentration von 0.1 µM markiert. Im Anschluss begann die Vorperfusion, wobei
Aminooxyessigsäure (AOAA, 0.1 mM) von Beginn an dem Superfusionsmedium zugegeben wurde
(throughout), um den vorzeitigen Abbau von [3H]-GABA während der Superfusion zu verhindern.
Nach der Vorperfusion startete die Sammelphase, wobei jeweils 5-Minuten-Fraktionen gesammelt
wurden. Die Stimulation erfolgte jeweils 45, bzw. 85 Minuten nach Beginn der Superfusion mit je
einem Nipecotat-Puls (1 mM, 2 Minuten). In der folgenden Abbildung aufgeführt ist die prozentuale
Radioaktivitätsabgabe der einzelnen Fraktionen nach Stimulation mit Nipecotat.
Prozentuale Radioaktivitätsabgabe
(% des Gewebetritiums)
Ergebnisse
Seite 39
5
4,5
4
3,5
3
2,5
S1
2
S2
1,5
1
0,5
0
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
Superfusionszeit (min.)
Abb. 3.1.: Die Nipecotat(1mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im Nucleus caudatus des Kaninchens in ihrem
zeitlichen Verlauf. Aufgeführt ist die mittlere prozentuale Radioaktivitätsabgabe von n = 4 Kontrollen
in % ± SEM des zu diesem Zeitpunkt im Schnitt befindlichen [3H]-GABA im Verhältnis zur
Superfusionszeit (min). Die Stimulationen (Nipecotat 1 mM, 2 min) sind schematisch durch die
schwarzen Balken über der Zeitachse dargestellt.
Die Applikation des neuronalen und glialen Wiederaufnahme-Hemmers Nipecotat (1 mM) hatte in
allen geprüften Geweben eine deutliche Steigerung der Transmitterfreisetzung zur Folge. Die S2/S1Quotienten der Kontrollen (unter AOAA throughout) unserer Versuche sind in folgender Tabelle
zusammengestellt:
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kaninchen / Nucleus Caudatus
0.70 ± 0.03
18
Ratte / Caudatoputamen
0.53 ± 0.03
11
Mensch / Neokortex
0.52 ± 0.04
5
Gewebe
Tab. 3.1.: Die S2/S1-Quotienten der Kontrollen nach jeweils 30-minütiger Inkubation, anschliessender Superfusion
unter AOAA und Stimulation mit Nipecotat (1 mM, 2 min). Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM.
Ergebnisse
Seite 40
3.2.1. Der Einfluss der Inkubationsdauer auf die Schnittbeladung und die Nipecotatevozierte [3H]-GABA-Freisetzung
Striatales Gewebe von Kaninchen und Ratte wurde entweder 30 Minuten, oder 60 Minuten mit
[3H]-GABA (0.1 µM) inkubiert. Der nach Beendigung der Superfusion gemessene Gehalt der
Schnitte an Tritium-markiertem Transmitter wurde in pmol umgerechnet.
*
7
6
(pmol/Schnitt)
Beladung der Gewebeschnitte
8
*
5
4
3
2
1
(30)
0
(30)
(60)
Kaninchen
(60)
Ratte
Abb. 3.2.: Der Einfluss der Inkubationsdauer auf die Beladung der Gewebeschnitte mit [3H]-GABA nach Beendigung
der Superfusion. Die Zahlenangaben in den Säulen beziehen sich auf die Inkubationsdauer in Minuten
(min). Die Mittelwerte ± SEM (pmol/Schnitt) betrugen: Kaninchen: 2.15 ± 0.11 (30 min, n = 18), 4.78 ±
0.31 (60 min, n = 5); Ratte: 1.14 ± 0.12 (30 min, n = 11), 6.52 ± 0.88 (60 min, n = 4). Signifikanzniveau:
* = p < 0.05.
Der Vergleich der Beladung der Schnitte nach Beendigung der Superfusion war nach einer 60minütigen Inkubationszeit signifikant höher im Vergleich zu einer 30-minütigen Inkubationszeit.
Dabei blieb die stimulationsbedingte Transmitterfreisetzung von der Inkubationsdauer
unbeeinflusst:
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Gewebe
Inkubationszeit (min)
Kaninchen
30
4.36 ± 0.44
0.70 ± 0.03
18
60
4.57 ± 0.78 n.s.
0.75 ± 0.07 n.s.
5
30
7.88 ± 0.40
0.53 ± 0.03
11
60
7.27 ± 0.93 n.s.
0.60 ± 0.03 n.s.
4
Ratte
Tab. 3.2.: Der Einfluss der Inkubationsdauer auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im Nucleus
Caudatus des Kaninchens sowie im Caudatoputamen der Ratte. Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM.
Signifikanzniveau: n.s. = nicht signifikant.
Ergebnisse
Seite 41
Zusammenfassend konnte weder im Nucleus Caudatus des Kaninchens, noch im Caudatoputamen
der Ratte ein Einfluss der Inkubationszeit auf die stimulationsbedingte [3H]-GABA-Freisetzung
zeigen. Die folgend beschriebenen Versuche bei Inkubation mit [3H]-GABA wurden aufgrund
dieser Ergebnisse, wenn nicht anders angegeben, mit einer Inkubationsdauer von 30 Minuten
durchgeführt.
3.2.2. Die Validierung des Modells der Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung
Die vesikuläre GABA-Freisetzung ist sowohl Ca++- als auch Na+-abhängig und somit durch die
Blockade des Einstroms von Ca++ oder Na+ in die Zelle hemmbar. Im Gegensatz dazu beruht die
Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung entsprechend unserer Hypothese auf einem nichtvesikulären, Ca++- und Na+-unabhängigen Freisetzungsmodus. Zur Validierung unseres Modells
sollte somit zunächst ein vesikulärer Freisetzungsmechanismus ausgeschlossen werden und im
Anschluss der direkte Nachweis eines Transporter-vermittelten Freisetzungsmodus durch die
Blockade des plasmamembranären GABA-Transporters erbracht werden. Desweiteren sollte der
Einfluss von Substanzen, welche in den GABA-Metabolismus eingreifen überprüft werden.
3.2.2.1. Der Einfluss des Entzugs von Kalzium und der Gabe von Cadmiumchlorid auf
die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung...
Anhand zweier methodischer Ansätze sollte ein vesikulärer, Ca++-abhängiger
Freisetzungsmechanismus an der Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung ausgeschlossen
werden:
1. Durch die Superfusion der Gewebeschnitte mit einem Ca++-freien Puffer ab 15 Minuten vor S2
2. Durch die Gabe von Cadmiumchlorid (CdCl2), ein Blocker spannungsabhängiger Ca++-Kanäle
des N- und L-Typs (Feuerstein et al., 1990), 15 Minuten vor S2. CdCl2 wurde dabei in einer
Konzentration von 0.1 mM verabreicht.
Der übrige Versuchsablauf richtete sich nach den allgemeinen Versuchsbedingungen.
...im Nucleus Caudatus des Kaninchens
Weder der Entzug von extrazellulärem Ca++, noch die Gabe von CdCl2 vor S2 zeigten einen Einfluss
auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung (S2/S1). Sowohl der Entzug von Ca++-Ionen aus
dem Superfusionsmedium, als auch die Blockade der spannungsabhängigen Ca++-Kanäle durch
Ergebnisse
Seite 42
CdCl2 15 Minuten vor S2 hatten einen signifikanten Anstieg der spontanen (basalen)
Transmitterfreisetzung zur Folge:
S1 (%) ± SEM
Behandlung vor S2
S2/S1 ± SEM
basal ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
4.36 ± 0.44
0.70 ± 0.03
0.78 ± 0.02
18
Ca++-Entzug
5.79 ± 0.38 n.s.
0.70 ± 0.04 n.s.
1.03 ± 0.11 *
4
CdCl2 0.1 mM
5.36 ± 0.41 n.s.
0.71 ± 0.12 n.s.
1.14 ± 0.11 ***
4
Tab. 3.3.: Der Einfluss des Entzuges von Ca++-Ionen bzw. der Gabe von CdCl2 (0.1 mM) vor S2 auf die Nipecotat(1
mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung und auf die basale Transmitterfreisetzung im Nucleus caudatus des
Kaninchens. Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveau: n.s. = nicht signifikant, * = p <
0.05, *** = p < 0.001.
...im Caudatoputamen der Ratte
Eine graphische Darstellung der analog durchgeführten Versuche im Caudatoputamen der Ratte
zeigt folgende Abbildung:
Prozentuale Radioaktivitätsabgabe
(% des Gewebetritiums)
7
Kontrollen (n=3)
6
Kalzium-Entzug (n=4)
Cadmium (n=4)
5
4
3
2
1
Ca++-Entzug, bzw CdCl2-Gabe
0
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
Superfusionszeit (min.)
Abb. 3.3.: Die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im Caudatoputamen der Ratte in ihrem zeitlichen Verlauf
nach Entzug von Ca++, bzw. Gabe von CdCl2 (0.1 mM) 15 Minuten vor S2. Die Stimulation mit Nipecotat (1
mM, 2 min) erfolgte 45, bzw. 85 Minuten nach Beginn der Superfusion (Schema: schwarze Balken an der
Zeitachse). Die Ordinate bezeichnet die prozentuale Radioaktivitätsabgabe in % des Gewebetritiums. Die
Abszisse zeigt die Superfusionszeit in Minuten auf. Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Die Anzahl (n)
der Versuche ist in Klammern in der Legende angegeben.
Ergebnisse
Seite 43
Sowohl der Entzug von Ca++-Ionen, als auch die Gabe von CdCl2 liessen keine Hemmung der
Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung im Vergleich zu den Kontrollen erkennen.
Desweiteren fällt ein starker Anstieg der basalen Transmitterfreisetzung unter dem Entzug von
Ca++-Ionen, bzw. unter der Einwirkung von CdCl2 auf.
Die statistische Auswertung der gewonnenen Daten lieferte folgendes Ergebnis:
Behandlung vor S2
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
basal ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
7.88 ± 0.4
0.53 ± 0.03
0.77 ± 0.04
11
Ca++-Entzug
6.24 ± 1.01 n.s.
0.73 ± 0.02 *
0.85 ± 0.09 n.s.
4
CdCl2 0.1 mM
5.41 ± 0.42 *
0.94 ± 0.07 ***
1.30 ± 0.08 ***
4
Tab. 3.4.: Der Einfluss des Entzugs von Ca++-Ionen bzw. der Gabe von CdCl2 (0.1 mM) vor S2 auf die Nipecotat(1
mM)-evozierte und die basale [3H]-GABA Freisetzung im Caudatoputamen der Ratte. Alle Angaben sind
Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveaus: n.s. = nicht signifikant, * = p < 0.05, *** = p < 0.001.
Der Entzug von Ca++-Ionen aus der Superfusionslösung hatte eine signifikante Steigerung (p < 0.01)
der stimulationsbedingten Transmitterfreisetzung (S2/S1) um 37.2 % der Kontrollen zur Folge,
während die basale Transmitterfreisetzung eine zwar tendenzielle, jedoch nicht signifikante
Steigerung ergab. Hingegen führte die Gabe von CdCl2 zu einer signifikanten Steigerung (p <
0.001) der Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung um 75.9 % der Kontrollen, als auch zu
einem signifikanten Anstieg (p < 0.001) der basalen Transmitterfreisetzung. Bei der ersten
Stimulation (S1) zeigte sich trotz gleicher Behandlung aller Gruppen eine signifikante Minderung
der evozierten Freisetzung in der mit CdCl2 behandelten Gruppe.
Zusammenfassend ergab sich entsprechend unserer Erwartungen weder im Nucleus Caudatus des
Kaninchens, noch im Caudatoputamen der Ratte eine Hemmung der Nipecotat-evozierten [3H]GABA-Freisetzung durch eine Beeinträchtigung des Ca++-Haushaltes.
3.2.2.2. Der Einfluß von Tetrodotoxin auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABAFreisetzung...
Das Gift des Kugelfisches (Fugu rubripes), Tetrodotoxin (TTX), blockiert spannungsabhängige
Na+-Kanäle und verhindert dadurch den depolarisationsbedingten schnellen Na+-Einstrom und
Ergebnisse
Seite 44
somit die vesikuläre Transmitterfreisetzung. Beruht die Nipecotat-evozierte [3H]-GABAFreisetzung jedoch auf einem Na+-unabhängigen, durch Transporterumkehr vermittelten
Freisetzungsmechanismus, so wäre kein Einfluss von TTX auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABAFreisetzung zu erwarten.
TTX (1 µM) wurde dem Superfusionsmedium bei sonst unveränderten Versuchsbedingungen 15
Minuten vor der zweiten Stimulation hinzugefügt und zeigte hierbei keinen Einfluss auf die
Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung:
Gewebe
Kaninchen
Ratte
Behandlung vor S2
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
4.36 ± 0.44
0.70 ± 0.03
18
TTX 1µM
4.16 ± 0.25 n.s.
0.74 ± 0.07 n.s.
4
Kontrollen
7.88 ± 0.40
0.53 ± 0.03
11
TTX 1µM
8.29 ± 0.89 n.s.
0.44 ± 0.02 n.s.
4
Tab. 3.5.: Die Wirkung von TTX 15 Minuten vor S2 auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im
Nucleus caudatus des Kaninchens sowie im Caudatoputamen der Ratte. Signifikanzniveau: n.s. = nicht
signifikant.
Die Gabe von TTX vor S2 zeigte zudem keinen Einfluss auf die basale Transmitterfreisetzung und
auf die Beladung der Gewebeschnitte mit Tritium-markiertem Transmitter (Werte nicht aufgeführt).
3.2.2.3. Der Einfluss von NNC-711 auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
Der GABA-Wiederaufnahmehemmer NNC-711 blockiert die Wiederaufnahme von GABA aus dem
synaptischen Spalt, ohne dabei in die Nervenendigung aufgenommen zu werden. NNC-711 ist im
Unterschied zu Nipecotat kein Substrat des GABA-Transporters. Sollte die Nipecotat-evozierte
[3H]-GABA-Freisetzung tatsächlich auf einem zytoplasmatischen, durch Transporterumkehr
induzierten Freisetzungsmechanismus beruhen, so müsste die Blockade des plasmamembranären
GABA-Transporters durch NNC-711 die Nipecotat-evozierte Freisetzung antagonisieren.
Diese Versuche wurden im Caudatoputamen der Ratte durchgeführt. Nach Inkubation mit [3H]GABA wurden die Gewebeschnitte unter AOAA superfundiert, wobei 15 Minuten vor S2 NNC-711
in unterschiedlichen Konzentrationen dem Superfusionsmedium hinzugefügt wurde. Der Vergleich
mit den Kontrollen ohne die Zugabe von NNC-711 ergab folgendes Ergebnis:
Seite 45
0,6
n.s.
0,5
0,4
(S2/S1)
Evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
Ergebnisse
0,3
**
**
***
0,2
0,1
0
(4)
(5)
(5)
(5)
(5)
Kontrollen
NNC 0.3 µM
NNC 1 µM
NNC 3 µM
NNC 10 µM
Abb. 3.4.: Die Wirkung von NNC-711 auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung (S2/S1) im
Caudatoputamen der Ratte: Kontrollen 0.54 ± 0.03, NNC 0.3 µM 0.40 ± 0.09, NNC 1.0 µM 0.24 ± 0.02,
NNC 3 µM 0.22 ± 0.02, NNC 10 µM 0.17 ± 0.01, alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Die
Versuchsanzahl (n) ist in Klammern in den Säulen angegeben. Signifikanzniveaus: ** = p < 0.01, *** =
p < 0 .001, n.s. = nicht signifikant.
Die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung (S2/S1) wurde durch NNC-711
konzentrationsabhängig vermindert. Die Hemmung betrug bei 10 µM NNC-711 68.7 % der
Kontrollen. Die entsprechenden S1- und Basalwerte sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die
Schnittbeladung wurde durch NNC-711 nicht beeinflusst (Werte nicht aufgeführt).
Behandlung vor S2
S1 (%) ± SEM
basal
Anzahl (n)
Kontrollen
8.22 ± 1.01
0.86 ± 0.10
4
NNC-711 0.3 µM
8.58 ± 0.37 n.s.
1.53 ± 0.11 ***
5
NNC-711 1.0 µM
8.28 ± 0.52 n.s.
1.17 ± 0.06 n.s.
5
NNC-711 3.0 µM
7.84 ± 0.63 n.s.
1.52 ± 0.08 ***
5
NNC-711 10 µM
8.82 ± 0.50 n.s.
1.28 ± 0.04 *
5
Tab. 3.6.: Der Einfluss von NNC-711 auf die basale [3H]-GABA-Freisetzung. Die S1-Werte zeigen erwartungsgemäss
keine signifikanten Unterschiede, da die Gewebeschnitte bis zu diesem Zeitpunkt gleich behandelt wurden.
Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveaus: *** = p < 0.001, * = p < 0.05, n.s. = nicht
signifikant.
Ergebnisse
Seite 46
3.2.2.4. Der Einfluss von Aminooxyessigsäure auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABAFreisetzung
Die Aminooxyessigsäure (AOAA) ist ein Hemmer Pyridoxal-5-Phosphat-abhängiger Enzyme. Zu
diesen Enzymen gehört die mitochondriale, GABA abbauende GABA-Transaminase. Das
Superfusionsmedium enthielt in unseren Versuchen AOAA in einer Konzentration von 0.1 mM, um
den metabolischen Abbau der GABA zu verhindern und somit den Transmitterpool zu erhöhen.
Um zunächst eine Beeinträchtigung der stimulationsbedingten [3H]-GABA-Freisetzung durch
AOAA auszuschliessen, wurden folgende Versuche im Caudatoputamen der Ratte durchgeführt:
Caudatoputamen-Schnitte der Ratte wurden 30 Minuten in [3H]-GABA (0.1 µM) inkubiert, wobei
das Inkubationsmedium AOAA (0.1 mM) enthielt. Die anschliessende Superfusion erfolgte ohne
die Zugabe von AOAA. Als Kontrollen dienten somit Gewebeschnitte, deren Inkubations- und
Superfusionsmedium
keine
AOAA
enthielten.
Die
übrigen
Versuchsbedingungen
und
Stimulationsparameter wurden unverändert beibehalten.
Inkubation
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
pmol/Schnitt ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
5.72 ± 0.38
0.48 ± 0.02
0.86 ± 0.05
6
AOAA 0.1 mM
4.90 ± 0.78 n.s.
0.58 ± 0.04 n.s.
5.72 ± 0.44 ***
6
Tab. 3.7.: Der Einfluss von AOAA (0.1 mM) auf die Beladung der Gewebeschnitte mit [3H]-GABA und die
Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im Caudatoputamen der Ratte bei Gabe während der
Inkubation (30 min). Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveaus: *** = p < 0.001, n.s. =
nicht signifikant.
Es zeigte sich eine hochsignifikante (p < 0.001) Mehrbeladung der Gewebeschnitte mit [3H]GABA, wenn AOAA nur während der Inkubation auf die Gewebeschnitte einwirken konnte. Es
zeigte sich dagegen kein Effekt auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung.
Desweiteren wurde der Einfluss von AOAA (0.1 mM) auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABAFreisetzung geprüft, wenn dieses während der gesamten Superfusion (throughout), bzw. 15 Minuten
vor S2 gegeben wurde:
Ergebnisse
Behandlung
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
Seite 47
pmol/Schnitt ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
5.72 ± 0.38
0.48 ± 0.02
0.86 ± 0.05
6
AOAA throughout
9.39 ± 0.39 **
0.58 ± 0.06 n.s.
1.10 ± 0.03 *
3
AOAA vor S2
5.93 ± 0.63 n.s.
0.21 ± 0.05 **
0.48 ± 0.02 **
3
Tab. 3.8.: Die Wirkung von AOAA throughout, bzw. 15 Minuten vor S2 auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]GABA-Freisetzung und die Schnittbeladung (pmol/Schnitt) nach Beendigung der Superfusion. Alle
Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveaus: ** = p < 0.01, * = p < 0.05, n.s. = nicht signifikant.
AOAA throughout bewirkte im Vergleich zu den Kontrollen eine signifikante Steigerung von S1,
während der S2/S1-Quotient unbeeinflusst blieb. Die Beladung der Schnitte mit [3H]-GABA am
Ende des Superfusionsversuches war signifikant (p < 0.05) gegenüber den Kontrollen erhöht,
während die basale Transmitterfreisetzung durch AOAA throughout unbeeinflusst war (Werte nicht
aufgeführt). Wurde AOAA 15 Minuten vor S2 dem Superfusionsmedium hinzugefügt, beobachteten
wir signifikant niedrigere S2/S1-Quotienten, wie auch eine signifikant niedrigere Schnittbeladung im
Vergleich zu den Kontrollen. Desweiteren fanden sich unter AOAA vor S2 signifikant niedrigere
Basaleffluxquotienten (Kontrollen 0.98 ± 0.02, AOAA vor S2 0.18 ± 0.01, p < 0.001).
3.2.2.5. Der Einfluss von 3-MCPA auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABAFreisetzung...
Aufgrund der niedrigen S2/S1-Quotienten der Kontrollen (Tab. 3.1.) vermuteten wir eine
Verdünnung des [3H]-markierten GABA-Pools durch endogene, während des Versuchsablaufes neu
synthetisierte GABA. Deshalb überprüften wir den Einfluss einer Blockade des GABAsynthetisierenden Enzyms Glutamatdecarboxylase (GAD). 3-Mercaptopropionsäure (3-MCPA)
hemmt die GAD und wurde während der gesamten Superfusion (throughout) gegeben.
...im Nucleus Caudatus des Kaninchens
Die Blockade der endogenen GABA-Synthese durch 3-MCPA (0.1 mM) throughout hatte keinen
signifikanten Einfluss auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung:
Ergebnisse
S1 (%) ± SEM
Behandlung
Seite 48
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
4.36 ± 0.44
0.70 ± 0.03
18
3-MCPA 0.1 mM
4.42 ± 0.18 n.s.
0.77 ± 0.05 n.s.
6
Tab. 3.9.: Die Wirkung von 3-MCPA auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im Nucleus
caudatus des Kaninchens. Signifikanzniveau: n.s. = nicht signifikant.
Der Tritiumgehalt der Schnitte nach Beendigung der Superfusion, wie auch die basale
Transmitterfreisetzung waren unter 3-MCPA gegenüber den Kontrollen unverändert (Werte nicht
aufgeführt).
...im Caudatoputamen der Ratte
Analog den Versuchen im Nucleus Caudatus des Kaninchens sollte ein möglicher
Verdünnungseffekt durch endogene GABA überprüft werden. Aufgrund der Erkenntnisse unserer
Versuche im Kaninchengewebe wurde 3-MCPA dem Superfusionsmedium nun in einer höheren
Konzentration von 1 mM throughout zugegeben. Dabei wurde ein Teil der Versuche ohne AOAA
durchgeführt, um eine Beeinflussung der 3-MCPA-Wirkung durch die gleichzeitige Anwesenheit
von AOAA zu überprüfen.
ohne AOAA throughout
mit AOAA throughout
0,8
0,7
*
0,6
(S2/S1)
Evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
***
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
(6)
Ko.
(4)
3-MCPA
(11)
Ko.
(6)
3-MCPA
Abb.3.5.: Die Wirkung von 3-MCPA (1 mM) throughout auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABAFreisetzung im Caudatoputamen der Ratte mit oder ohne AOAA throughout. Die Mittelwerte betrugen
ohne AOAA-throughout: Kontrollen 0.48 ± 0.02, 3-MCPA 0.57 ± 0.01; mit AOAA throughout:
Kontrollen 0.54 ± 0.03, 3-MCPA 0.75 ± 0.04. Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveaus:
* = p < 0.05, *** = p < 0.001,
Ergebnisse
Seite 49
Im Caudatoputamen der Ratte sahen wir die von uns erwartete signifikante Steigerung der S2/S1Quotienten unter 3-MCPA. Diese betrug ohne die gleichzeitige Anwesenheit von AOAA 18.4 % der
Kontrollen. Die entsprechenden S1-Werte zeigten einen signifikanten Unterschied (Kontrollen 5.72
± 0.38 %, 3-MCPA 3.70 ± 0.12 %, p < 0.01), weshalb das Ergebnis dieser Versuchsreihe nur
bedingt aussagekräftig ist. Mit AOAA (0.1 mM) throughout betrug die Steigerung der S2/S1Quotienten unter 3-MCPA gegenüber den Kontrollen 41.1 %, die entsprechenden S1-Werte zeigten
keinen statistischen Unterschied (Werte nicht aufgeführt). 3-MCPA hatte unabhängig von der
gleichzeitigen Anwesenheit von AOAA weder einen Einfluss auf die basale Transmitterfreisetzung,
noch auf Beladung der Gewebeschnitte mit [3H]-GABA (Werte nicht aufgeführt).
...im Neokortex des Menschen
Die Versuche im neokortikalen Gewebe des Menschen wurden entsprechend den allgemeinen
Versuchsbedingungen durchgeführt. Auch hier fanden sich sehr niedrige S2/S1-Quotienten der
Kontrollen, weshalb ein möglicher Verdünnungseffekt durch endogen nachsynthetisierte, nichttritiierte GABA ausgeschlossen werden sollte.
Der Einfluss von 3-MCPA unter Aminooxyessigsäure
3-MCPA wurde dem Superfusionsmedium von Beginn der Superfusion an zugegeben und in den
Konzentrationen 0.1 mM und 1 mM getestet. Dabei wurde gleichzeitig Aminooxyessigsäure
(AOAA) throughout gegeben, um einen vorzeitigen GABA-Abbau zu verhindern.
Behandlung unter
Konzentration
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
AOAA throughout
Kontrollen
___
14.42 ± 1.51
0.52 ± 0.04
5
3-MCPA throughout
0.1 mM
17.80 ± 1.75 n.s.
0.52 ± 0.03 n.s.
5
1 mM
18.41 ± 0.67 n.s.
0.55 ± 0.03 n.s.
5
Tab. 3.10.: Die Wirkung von 3-MCPA auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im menschlichen
Neokortex. Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveaus: n.s. = nicht signifikant.
3-MCPA zeigte bei gleichzeitiger Hemmung Pyridoxal-5-Phosphat-abhängiger Enzyme durch
AOAA keinen Einfluss auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung. Der Schnittbeladung
Ergebnisse
Seite 50
nach Beendigung der Superfusion, wie auch die basale Transmitterfreisetzung waren unter 3-MCPA
war gegenüber den Kontrollen unverändert (Werte nicht aufgeführt).
Der Einfluss von 3-MCPA ohne die gleichzeitige Anwesenheit von AOAA
Da 3-MCPA unter dem gleichzeitigen Einfluss von AOAA keinen Effekt hatte, wurden
weiterführende Experimente ohne die Zugabe von AOAA zum Superfusionsmedium durchgeführt
um eventuelle Interaktionen der beiden Substanzen im GABA-Metabolismus auszuschliessen.
Die präparierten Kortexschnitte wurden 60 Minuten mit [3H]-GABA (0.1 µM) inkubiert. Die
Vorperfusionszeit betrug 20 Minuten, wobei 3-MCPA (1 mM) von Beginn an dem
Superfusionsmedium beigefügt wurde. Die Stimulation erfolgte 45 Minuten (S1) und 85 Minuten
(S2) nach Beginn der Superfusion mit jeweils einem Nipecotat-Puls über 2 Minuten. Abhängig von
der Stimulationskonzentration erhielten wir folgende Ergebnisse:
Nipecotat-
Behandlung
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
pmol/Schnitt
Anzahl (n)
konzentration
1 mM
0.32 mM
0.1 mM
Kontrollen
9.26 ± 1.02
0.53 ± 0.05
1.22 ± 0.15
5
3-MCPA 1 mM
22.51 ± 1.65 ***
0.33 ± 0.02 **
1.29 ± 0.20 n.s.
5
Kontrollen
6.86 ± 0.32
0.46 ± 0.03
0.90 ± 0.07
6
3-MCPA 1mM
7.79 ± 0.41 n.s.
0.49 ± 0.04 n.s.
1.37 ± 0.21 n.s.
6
Kontrollen
6.48 ± 0.52
0.63 ± 0.03
0.97 ± 0.12
11
3-MCPA 1 mM
7.02 ± 1.22 n.s.
0.47 ± 0.03 **
1,90 ± 0.13 ***
11
Tab. 3.11.: Die Wirkung von 3-MCPA throughout auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im
Neokortex des Menschen in Abhängigkeit von der Stimulationskonzentration (Nipecotat 0.1 mM / 0.32
mM / 1 mM). Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveaus: ** = p < 0.01, *** = p <
0.001, n.s. = nicht signifikant.
Erwartungsgemäss zeigte sich eine konzentrationsabhängige Minderung der stimulierten [3H]GABA-Freisetzung (S1) bei abnehmenden Konzentrationen von Nipecotat. Die mit Nipecotat
(1mM, bzw. 0.1 mM) stimulierte [3H]-GABA-Freisetzung (S2/S1) zeigte unter 3-MCPA statt der
von uns erwarteten Steigerung eine klare Minderung im Vergleich zu den Kontrollen. 3-MCPA
erhöhte den Schnittgehalt (pmol/Schnitt) an radioaktiv-markierter GABA, wenn die Gewebeschnitte
während der Superfusion mit 0.1 mM Nipecotat stimuliert wurden. Die basale
Ergebnisse
Seite 51
Transmitterfreisetzung dieser Versuche blieb durch die Gabe von 3-MCPA unbeeinflusst (Werte
nicht aufgeführt).
3.2.3. Der Einfluss von Gabapentin auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABAFreisetzung...
3.2.3.1. ...nach Inkubation mit [3H]-GABA ...
Um einen möglichen Einfluss von Gabapentin (GBP) auf die zytoplasmatische [3H]-GABAFreisetzung zu überprüfen, wurde das Pharmakon der Superfusionslösung zu unterschiedlichen
Zeitpunkten und in unterschiedlichen, klinisch relevanten Konzentrationen zugefügt. Die im
folgenden beschriebenen Versuche wurden unter der gleichzeitigen Blockade des GABA-Abbaus
durch AOAA (0.1 mM) durchgeführt. Gewebeschnitte, welche nicht unter Gabapentin superfundiert
wurden dienten als Kontrollen.
...im Nucleus Caudatus des Kaninchens
Die Gewebeschnitte wurden 60 Minuten mit [3H]-GABA inkubiert. Gabapentin wurde der
Superfusionslösung in den Konzentrationen 32 µM oder 0.1 mM ab Beginn der Vorperfusion
(throughout) hinzugefügt.
Behandlung
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
4.24 ± 0.44
0.66 ± 0.05
9
GBP 32 µM
3.61 ± 0.20 n.s.
0.56 ± 0.06 n.s.
4
GBP 0.1 mM
5.25 ± 0.78 n.s.
0.58 ± 0.02 n.s.
8
Tab. 3.12.: Die Wirkung von Gabapentin (throughout) auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im
Nucleus caudatus des Kaninchens. Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveau: n.s. = nicht
signifikant.
Gabapentin zeigte bei den eingesetzten Konzentrationen keine Wirkung auf die Nipecotat-evozierte
[3H]-GABA-Freisetzung. Desweiteren blieben sowohl die basale Transmitterfreisetzung, als auch
die Beladung der Gewebeschnitte durch die Gabe von Gabapentin unbeeinflusst (Werte nicht
aufgeführt).
Ergebnisse
Seite 52
Um den Einfluss von Gabapentin bei einer längeren Einwirkzeit des Pharmakons zu überprüfen,
wurde bei den weiterführenden Versuchen zwischen der ersten und zweiten Stimulation (S1, S2)
eine einstündige Sammelpause eingelegt: Die Schnitte wurden 30 Minuten in 0.1 µM [3H]-GABA
inkubiert, die Vorperfusionszeit betrug 30 Minuten. Gabapentin (0.1 mM) wurde throughout
gegeben und konnte somit auch während der Sammelpause, deren Superfusat verworfen wurde, auf
die Gewebeschnitte einwirken. Die erste Stimulation (S1) mit Nipecotat (1 mM, 2 min) erfolgte wie
bisher 45 Minuten nach Beginn der Superfusion, während die zweite Stimulation (S2) unter
Berücksichtigung der 60-minütigen Sammelpause nun 145 Minuten nach Beginn der Superfusion
durchgeführt wurde.
Behandlung/ 60 min Pause
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
2.99 ± 0.12
0.67 ± 0.04
10
GBP 0.1 mM
3.15 ± 0.24 n.s.
0.63 ± 0.05 n.s.
12
Tab. 3.13.: Die Wirkung von Gabapentin (throughout) auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
im Nucleus caudatus des Kaninchens nach Verlängern der Einwirkzeit des Pharmakons vor der
zweiten Stimulation. Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveau: n.s. = nicht
signifikant.
Auch die Verlängerung der Einwirkzeit von Gabapentin vor der zweiten Stimulation zeigte keinen
signifikanten Einfluss auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im Nucleus Caudatus
des Kaninchens. Sowohl die basale Transmitterfreisetzung, als auch die Schnittbeladung nach
Beendigung der Superfusion zeigten sich von Gabapentin unbeeinflusst (Werte nicht aufgeführt).
...im Caudatoputamen der Ratte...
Entsprechend der zuletzt geschilderten Versuche im Nucleus Caudatus des Kaninchens wurden
Gewebeschnitte des Caudatoputamens der Ratte 30 Minuten mit [3H]-GABA inkubiert und mit oder
ohne Gabapentin (GBP, 0.1 mM) throughout superfundiert. Die Stimulationen erfolgten
entsprechend den allgemeinen Versuchsbedingungen 45 Minuten (S1) und 85 Minuten (S2) nach
Beginn der Superfusion. Analog den Versuchen im Caudatoputamen des Kaninchens wurde in
einigen Versuchen zwischen den beiden Stimulationen (S1, S2) eine 60-minütige Sammelpause
eingelegt. Das Superfusat dieser Periode wurde verworfen. Die zweite Stimulation (S2) erfolgte in
diesen Versuchen 145 Minuten nach Beginn der Superfusion.
Ergebnisse
Behandlung
ohne Pause
Seite 53
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
8.21 ± 0.66
0.52 ± 0.04
6
GBP 0.1 mM
6.77 ± 0.57 n.s.
0.59 ± 0.02 n.s.
5
9.33 ± 1.02
0.64 ± 0.06
6
8.46 ± 0.83 n.s.
0.70 ± 0.08 n.s.
6
mit Pause (60 min) Kontrollen
GBP 0.1 mM
Tab.3.14.: Die Wirkung von Gabapentin throughout (GBP 0.1 mM) auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABAFreisetzung im Caudatoputamen der Ratte mit und ohne Einlegen einer einstündigen Sammelpause zur
Verlängerung der Einwirkzeit von Gabapentin. Signifikanzniveau: n.s. = nicht signifikant.
Die statistische Auswertung ergab auch im Caudatoputamen der Ratte nach Inkubation mit [3H]GABA und anschliessender Superfusion mit Gabapentin (0.1 mM) throughout, unabhängig von der
Einwirkdauer des Pharmakons, keine signifikante Steigerung der Nipecotat-evozierten [3H]-GABAFreisetzung im Vergleich zu den Kontrollen. Gleichfalls blieben die basale Transmitterfreisetzung,
als auch die Schnittbeladung nach Beendigung der Superfusion von Gabapentin unbeeinflusst
(Werte nicht aufgeführt).
3.2.3.2. ...nach Inkubation mit [3H]-Glutamin
Die Inkubation mit [3H]-Glutamin sollte erfolgen, um ausschliesslich die neuronalen
Transmitterpools mit [3H]-GABA zu markieren und einen eventuell vorhandenen Effekt von
Gabapentin auf den GABA-Metabolismus aufzudecken.
Caudatoputamen-Schnitte der Ratte wurden 60 Minuten mit [3H]-Glutamin (3.2 µM) inkubiert. Die
anschliessende Superfusionsphase erfolgte ohne Zugabe von AOAA, um den GABA-Metabolismus
nicht zu beeinträchtigen. Die Vorperfusionszeit betrug 20 Minuten, bei den Versuchen mit nur einer
Stimulation 60 Minuten. Die Stimulation mit Nipecotat (1 mM, 2 min) erfolgte 30 Minuten (S1) und
60 Minuten (S2) nach Beginn der Superfusion. Nach Beendingung des Superfusionsversuches
erfolgte die Trennung von [3H]-GABA von seinen gleichfalls radioaktiv markierten Metaboliten
durch die Kationenaustausch-Chromatographie (Kap. 2.1.3.2.).
Ergebnisse
Seite 54
Der Einfluss von Gabapentin bei Gabe 15 Minuten vor der zweiten Stimulation (S2)
Unter den zuvor beschriebenen Versuchsbedingungen wurde Gabapentin in den Konzentrationen 1
µM, 10 µM oder 100 µM dem Superfusionsmedium 15 Minuten vor S2 hinzugefügt.
n. s.
0,6
0,5
(S2/S1)
Evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
0,7
n. s.
0,4
n. s.
0,3
0,2
0,1
0
(14)
(4)
(5)
(11)
Kontrollen
1 µM
10 µM
100 µM
Gabapentin
Abb. 3.6.: Der Einfluss von Gabapentin 15 Minuten vor S2 auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABAFreisetzung nach Inkubation mit [3H]-Glutamin im Caudatoputamen der Ratte. Die S2/S1-Quotienten
betrugen: Kontrollen 0.37 ± 0.06, GBP 1 µM 0.29 ± 0.03, GBP 10 µM 0.28 ± 0.10, GBP 100 µM 0.59
± 0.1 (Mittelwerte ± SEM). Die korrespondierenden S1-Werte zeigten keinen statistischen Unterschied
(Werte nicht aufgeführt). Die Versuchsanzahl (n) ist in den Klammern in den Säulen angegeben.
Signifikanzniveau: n.s. = nicht signifikant.
Gabapentin zeigte bei der Gabe 15 Minuten vor S2 keinen signifikanten Einfluss auf die Nipecotatevozierte [3H]-GABA-Freisetzung. Es konnte jedoch ein tendenzieller Anstieg der S2/S1-Quotienten
beobachtet werden, wenn Gabapentin in einer Konzentration von 100 µM zugegeben wurde.
Der Einfluss von Gabapentin bei Gabe 75 Minuten vor der zweiten Stimulation (S2)
Die Einwirkdauer von Gabapentin auf die Gewebeschnitte wurde verlängert, indem zwischen den
beiden Stimulationen (S1, S2) eine 60-minütige Sammelpause eingelegt wurde, in welcher
Gabapentin bereits dem Superfusionsmedium zugegeben worden war. Das Superfusat dieser
Periode wurde verworfen. Die erste Stimulation (S1) erfolgte 30 Minuten nach Beginn der
Ergebnisse
Seite 55
Superfusion, während die zweite Stimulation 120 Minuten nach Beginn der Superfusion und somit
15 Minuten nach Wiedereinsetzen der Sammelphase durchgeführt wurde. Gabapentin konnte
hierdurch 75 Minuten auf die Gewebeschnitte einwirken, bevor diese zur Ausschüttung von [3H]-
1,5
(% des Gewebetritiums)
Prozentuale Radioaktivitätsabgabe
GABA stimuliert wurden. Die folgende Abbildung soll den Versuchsablauf verdeutlichen:
60 min Pause
1
S1
0,5
S2
0
25
30
35
40
45/105
110
115
120
125
130
135
Superfusionszeit (min)
Abb. 3.7.: Der zeitliche Verlauf der Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung im Caudatoputamen der Ratte
nach Inkubation mit [3H]-Glutamin und Einlegen einer einstündigen Sammelpause. Die Abbildung zeigt
die mittlere prozentuale Radioaktivitätsabgabe von 4 Kontrollen (keine weiteren Substanzen im
Superfusionsmedium). Stimulationsbedingungen: Nipecotat (1 mM, 2 Min.) 30 Minuten (S1) und 120
Minuten (S2) nach Beginn der Superfusion (schwarze Balken über der Zeitachse).
Der bereits in dieser Abbildung angedeutete enorme Ausfluss von [3H]-GABA bei der ersten
Stimulation im Vergleich zur zweiten Stimulation spiegelte sich bei der statistischen Auswertung
dieser Versuche in sehr niedrigen S2/S1-Quotienten, bei hohen S1-Werten wider:
Behandlung ab 75 min vor S2
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
basal ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
3.29 ± 0.54
0.13 ± 0.07
0.25 ± 0.03
5
GBP 0.1 mM
6.90 ± 1.16 *
0.16 ± 0.04 n.s.
0.18 ± 0.01 n.s.
6
Tab. 3.15.: Die Wirkung von Gabapentin auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im
Caudatoputamen der Ratte. Gabapentin wurde dem Superfusionsmedium vor Einlegen einer 60minütigen Sammelpause und somit 75 Minuten vor der zweiten Stimulation (S2) beigegeben. Alle
Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveaus: * = p < 0.05, n.s. = nicht signifikant.
Ergebnisse
Seite 56
Es ergaben sich signifikant (p < 0.05) höhere S1-Werte der Gabapentin-Gruppe im Vergleich zu den
Kontrollen, obwohl die Gewebeschnitte bis zu diesem Zeitpunkt nicht unterschiedlich behandelt
wurden. Die spontane [3H]-GABA-Freisetzung während der Sammelpause verminderte den bei S2
zur Verfügung stehenden [3H]-GABA-Pool, was sich in den niedrigen S2/S1-Quotienten zeigte.
Diese zeigten jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen
(Kontrollen versus Gabapentin).
Um eine Entleerung des [3H]-GABA-Pools bei S2 zu verhindern, wurden folgend beschriebene
Versuche mit einer niedrigeren Stimulationskonzentration (Nipecotat, 0.1 mM, 2 min) durchgeführt.
Der Einfluss von Gabapentin auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung bei einer
niedrigeren Stimulationskonzentration
Die übrigen Versuchsbedingungen blieben bis auf die Änderung der Stimulationskonzentration
(Nipecotat 0.1 mM) unverändert. Gabapentin wurde in den Konzentrationen 1 µM, 10 µM und 100
µM eingesetzt.
Behandlung ab 75 min vor S2
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
2.09 ± 0.45
0.009 ± 0.07
7
Gabapentin 1 µM
2.03 ± 0.47 n.s.
0.12 ± 0.03 n.s.
5
Gabapentin 10 µM
1.66 ± 0.11 n.s.
0.11 ± 0.05 n.s.
10
Gabapentin 100 µM
2.87 ± 0.31 n.s.
0.16 ± 0.03 n.s.
4
Tab. 3.16.: Die Wirkung von Gabapentin auf die Nipecotat(0.1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im
Caudatoputamen der Ratte. Gabapentin wurde dem Superfusionsmedium 75 Minuten vor der zweiten
Stimulation beigegeben. Die Stimulationen erfolgten 30 Minuten (S1), bzw. 120 Minuten (S2) nach
Beginn der Superfusion mit je einem Nipecotatpuls von 0.1 mM über 2 Minuten. Alle Angaben sind
Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveau: n.s. = nicht signifikant.
Das Senken der Stimulationskonzentration (Nipecotat 0.1 mM) konnte keinen Ausgleich für die
Depletion des Gewebes infolge der Sammelpause schaffen, was sich in weiterhin sehr niedrigen
S2/S1-Quotienten zeigte. Gabapentin zeigte auch hier weder einen Einfluss auf die Nipecotatevozierte [3H]-GABA-Freisetzung, noch auf die basale Transmitterfreisetzung (Werte nicht
aufgeführt).
Ergebnisse
Seite 57
Der Einfluss von Gabapentin auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung bei nur
einer Stimulation
Auch durch eine niedrigere Stimulationskonzentration konnte die Pausen-bedingte Minderung des
[3H]-GABA-Pools bei S2 nicht verhindert werden. Da Gabapentin jedoch möglichst lange auf die
Gewebeschnitte einwirken sollte, prüften wir die Wirkung von Gabapentin throughout bei nur einer
Stimulation.
Nach 60-minütiger Inkubation mit [3H]-Glutamin (3.2 µM) verlängerten wir die Vorperfusionszeit
von 20 Minuten auf 60 Minuten, wobei Gabapentin der Vorperfusionslösung zugegeben wurde. Es
wurden insgesamt sechs 5-Minuten-Fraktionen gesammelt, wobei die Schnitte 70 Minuten nach
Beginn der Superfusion mit einem Nipecotatpuls (1 mM, 2 Min.) zur Ausschüttung von [3H]GABA gebracht wurden. Gabapentin (1 µM, 10 µM, 100 µM) war während der gesamten
Superfusionszeit (throughout), und somit 70 Minuten vor der Stimulation, im Superfusionsmedium
enthalten.
Der Vergleich der stimulationsbedingten [3H]-GABA-Freisetzung der mit Gabapentin behandelten
2
*
1,8
n.s.
n.s.
1,6
1,4
1,2
(S)
Evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
Gruppen mit der Kontrollgruppe ergab folgendes Ergebnis:
1
0,8
0,6
0,4
0,2
(6)
(3)
(5)
(12)
0
Kontrollen
1 µM
10 µM
100 µM
Gabapentin
Abb. 3.8.: Die Wirkung von Gabapentin auf die Nipecotat(1 mM)-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im
Caudatoputamen der Ratte bei nur einer Stimulation (S). Die stimulationsbedingte [3H]-GABAFreisetzung (% des zu Beginn der Stimulation in dem Gewebe enthaltenen [3H]-GABA) betrug:
Kontrollen 1.16 ± 0.18, GBP 1 µM 1.11 ± 0.36, GBP 10 µM 1.31 ± 0.18, GBP 100 µM 1.72 ± 0.13
(Mittelwerte ± SEM). Die Versuchsanzahl (n) ist in den Klammern in den Säulen angegeben.
Signifikanzniveau: * = p < 0.05, n.s. = nicht signifikant.
Ergebnisse
Seite 58
Ein signifikanter (p < 0.05) Anstieg der Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung (S) um 48.1
% der Kontrollen war zu beobachten, wenn Gabapentin in einer Konzentration von 100 µM
während der gesamten Superfusion zugegen war.
3.3. Die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung im Caudatoputamen der Ratte
Analog der Nipecotat-evozierten Freisetzung von [3H]-GABA sollte eine Stimulation glutamaterger
Nervenendigungen zur Aussschüttung von D-[3H]-Aspartat durch die Umkehr des GlutamatWiederaufnahmetransporters erfolgen. L-trans-PDC (L-trans-pyrrolidin-2,4-dicarboxylat) ist ein
kompetitiver Inhibitor des L-Glutamat-Wiederaufnahmetransporters (Bridges et al., 1991) und wird,
analog des Nipecotat im GABAergen System, in die glutamaterge Nervenendigung gegen den
Austausch von zytoplasmatischem D-[3H]-Aspartat aufgenommen.
Die Inkubationszeit betrug in dieser Versuchsreihe 30 Minuten bei einer D-[3H]-AspartatEndkonzentration von 0.1 µM. Die Vorperfusionszeit betrug ebenfalls 30 Minuten. Anschliessend
wurden sechszehn 5-Minuten-Fraktionen gesammelt. Die Stimulation erfolgte 45 Minuten (S1) und
85 Minuten (S2) nach Beginn der Superfusion.
Zur Etablierung dieser Methode erfolgte zunächst die Bestimmung der Stimulationskonzentration
bei einer Stimulationsdauer von 2 Minuten. Die erste Stimulation (S1) erfolgte mit einem L-transPDC-Puls von 0.1 mM, bei der zweiten Stimulation (S2) wurde L-trans-PDC in den
Konzentrationen 1 mM, 0.1 mM oder 0.01 mM eingesetzt.
S2 (%) ± SEM
PDC-Konzentration bei S2
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
0.01 mM
0.26 ± 0.1
0.16 ± 0.06
4
0.1 mM
0.92 ± 0.12
0.61 ±0.05
3
1 mM
3.16 ± 0.46
2.12 ± 0.35
4
Tab. 3.17.: Die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung im Caudatoputamen der Ratte. Die Zahlenangaben
sind Mittelwerte ± SEM.
Die Stimulation mit einer L-trans-PDC-Konzentration von 1 mM bewirkte eine deutliche D-[3H]Aspartat-Freisetzung von durchschnittlich 3.16 ± 0.46 % des zu Beginn der Stimulation im Gewebe
enthaltenen D-[3H]-Aspartat.
Ergebnisse
Seite 59
Somit entschieden wir uns im weiteren die Stimulation mit PDC 1 mM durchzuführen, um
Substanzeffekte auf die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung eindeutig beurteilen zu
können.
3.3.1. Die Validierung des Modells der L-trans-PDC-evozierten D-[3H]-AspartatFreisetzung
Entsprechend der Validierung des Modells der zytoplasmatischen Freisetzung von GABA sollte bei
der L-trans-PDC-evozierten D-[3H]-Aspartat-Freisetzung ein vesikulärer Freisetzungsmechanismus
ausgeschlossen werden und im Anschluss der Nachweis eines Transporter-vermittelten
Freisetzungsmodus durch die Blockade des plasmamembranären Glutamat-Transporters erbracht
werden.
3.3.1.1. Der Einfluss des Entzugs von Kalzium und der Gabe von Cadmiumchlorid auf
die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung
Sollte die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung tatsächlich auf einem nichtvesikulären, Ca++-unabhängigen Freisetzungsmechanismus beruhen, so wäre sowohl für den Entzug
von Ca++-Ionen aus der Superfusionslösung, als auch für die Blockade spannungsabhängiger Ca++Kanäle durch Cadmiumchlorid (CdCl2) kein Einfluss auf die stimulationsbedingte Freisetzung von
D-[3H]-Aspartat zu erwarten.
Der Versuchsablauf richtete sich nach den unter Kapitel 3.3. beschriebenen allgemeinen
Versuchsbedingungen. Gewebeschnitte des Caudatoputamens der Ratte wurden ab 15 Minuten vor
der zweiten Stimulation (S2) mit einem Ca++-freien Puffer superfundiert. In anderen Versuchen
wurde dem Superfusionsmedium 15 Minuten vor S2 CdCl2 (0.1 mM), ein Blocker
potentialabhängiger Ca++-Kanäle, hinzugefügt.
Behandlung vor S2
S1 (%) ± SEM
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
4.82 ± 0.44
0.52 ± 0.02
4
Ca++-Entzug
4.27 ± 0.49 n.s.
0.41 ± 0.02 n.s.
4
CdCl2 0.1 mM
5.10 ± 0.70 n.s.
0.76 ± 0.06 **
4
Tab. 3.17.: Die Wirkung des Entzuges von Ca++, bzw. der Gabe von CdCl2 (0.1 mM) auf die L-trans-PDC(1 mM)evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung im Caudatoputamen der Ratte. Angegeben sind Mittelwerte ± SEM.
Signifikanzniveaus: ** = p < 0.01, n.s. = nicht signifikant.
Ergebnisse
Seite 60
Die Entfernung von Ca++ aus dem Superfusionsmedium hatte keinen signifikanten Einfluss auf die
L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung, wohingegen CdCl2 eine signifikante (p < 0.05)
Steigerung des S2/S1-Quotienten verursachte. Die basale Transmitterfreisetzung wie auch die
Beladung der Gewebeschnitte mit D-[3H]-Aspartat blieb von dem Entzug der Ca++-Ionen und der
Gabe von CdCl2 unbeeinflusst (Werte nicht aufgeführt).
3.3.1.2. Der Einfluss von Tetrodotoxin (TTX) auf die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]Aspartat-Freisetzung
TTX blockiert spannungsabhängige Na+-Kanäle und führt durch die Hemmung des
depolarisationsbedingten schnellen Na+-Einstroms zur Unterbrechung von Aktionspotentialen.
TTX (1 µM) wurde dem Superfusionsmedium 15 Minuten vor S2 hinzugefügt.
S1 (%) ± SEM
Behandlung vor S2
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
4.82 ± 0.44
0.52 ± 0.02
4
TTX 1 µM
3.19 ± 0.47 *
0.49 ± 0.06 n.s.
4
Tab. 3.18.: Die Wirkung von TTX (1µM) auf die L-trans-PDC(1 mM)-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung im
Caudatoputamen der Ratte. Angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveau: * = p < 0.05, n.s. =
nicht signifikant.
Ein Vergleich der S2/S1-Quotienten der mit TTX behandelten Gruppe mit der Kontrollgruppe ergab
keinen signifikanten Unterschied. Auch die basale Transmitterfreisetzung und die Schnittbeladung
nach Beendigung der Superfusion wurden durch TTX nicht beeinflusst (Werte nicht aufgeführt).
3.3.1.3. Der Einfluss von Dihydrokainat auf die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]Aspartat-Freisetzung
Ist die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung tatsächlich auf eine Umkehr des
Glutamattransporters zurückzuführen, so müsste die stimulierte Freisetzung durch eine Blockade
des Glutamattransporters antagonisiert werden. Zur Prüfung dieser Hypothese bedienten wir uns des
nicht-transportierbaren Wiederaufnahmehemmers Dihydrokainat (DHK), welcher 15 Minuten vor
S2 dem Superfusionsmedium in den Konzentration 100 µM oder 10 µM zugegeben wurde.
Seite 61
0,7
0,6
*
*
0,5
(S2/S1)
Evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung
Ergebnisse
0,4
0,3
0,2
0,1
(5)
(4)
(5)
Kontrollen
10 µM
100 µM
0
Dihydrokainat
Abb. 3.9.: Die Wirkung von DHK auf die L-trans-PDC(1 mM)-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung im
Caudatoputamen der Ratte. Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Die Versuchsanzahl (n) ist in
Klammern in den Säulen angegeben. Der mittlere S2/S1-Wert der Kontrollen lag bei 0.58 ± 0.02, von
DHK (10 µM) bei 0.45 ± 0.04 und von DHK (100 µM) bei 0.47 ± 0.03. Die entsprechenden S1-Werte
zeigten keinen signifikanten Unterschied. Signifikanzniveau: * = p < 0.05.
Unsere oben aufgeführten Überlegungen wurden durch diese Ergebnisse bestätigt. Die L-transPDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung konnte durch die Blockade des Glutamattransporters
antagonisiert werden. Die Hemmung in Prozent der Kontrollen betrug für DHK (10 µM) 22.5 %
und für DHK (100 µM) 18.9 %. Weder die basale Transmitterfreisetzung, noch die Beladung der
Gewebeschnitte wurden durch DHK beeinflusst (Werte nicht aufgeführt).
3.3.2. Der Einfluss von Gabapentin auf die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-AspartatFreisetzung
Auch in dem Modell der zytoplasmatischen Freisetzung von D-[3H]-Aspartat sollte ein Einfluss des
Pharmakons Gabapentin überprüft werden. Diese Versuche wurden nach den allgemeinen
Bedingungen durchgeführt, wobei nach der ersten Stimulation (L-trans-PDC, 1mM, 2 min) eine 60minütige Sammelpause eingelegt wurde. Hier wurde Gabapentin in einer Konzentration von 0.1
mM dem Superfusionsmedium zugegeben. Die zweite Stimulation (S2) erfolgte 15 Minuten nach
wiedereinsetzen der Sammelphase, wodurch Gabapentin insgesamt 75 Minuten vor S2 auf die
Gewebeschnitte einwirken konnte.
Ergebnisse
Seite 62
S1 (%) ± SEM
Behandlung 75 Min. vor S2
S2/S1 ± SEM
Anzahl (n)
Kontrollen
4.38 ± 0.23
0.47 ± 0.04
4
GBP 0.1 mM
4.22 ± 0.78 n.s.
0.36 ± 0.07 n.s.
4
Tab. 3.19.: Die Wirkung von Gabapentin auf die L-trans-PDC(1 mM)-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung im
Caudatoputamen der Ratte bei Gabe 75 Minuten vor der zweiten Stimulation (S2). Alle Angaben sind
Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveau: n.s. = nicht signifikant.
Gabapentin zeigte auf die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung keinen Einfluss.
Auch die basale Transmitterfreisetzung sowie der Schnittgehalt nach Beendigung der Superfusion
blieben von Gabapentin unbeeinflusst (Werte nicht aufgeführt).
3.4. Der Einfluss von Gabapentin (bzw. eines während des Versuchsablaufes
hieraus
gebildeten
Metaboliten)
auf
die
Freisetzung
endogener
Aminosäuren im Caudatoputamen der Ratte
Die Wirkung von Gabapentin auf die spontane Freisetzung endogener, inhibitorischer und
exzitatorischer Aminosäuren sollte geprüft werden
Die Gewebeschnitte wurden im Anschluss an die Präparation sofort in die Superfusionskammern
transferiert und superfundiert. Gabapentin wurde dem Superfusionsmedium throughout in den
Konzentrationen 0.1 mM und 0.01 mM zugegeben. Die Vorperfusion dauerte 40 Minuten, es
wurden insgesamt fünf 10-Minuten-Fraktionen mit je 800 µl gesammelt. Die Messung der
Konzentration der endogenen Aminosäuren in den Superfusaten erfolgte mittels HPLC.
Bei der statistischen Auswertung wurden sämtliche Fraktionen einer Behandlungsgruppe gemittelt.
Somit ergab sich bei 5 Fraktionen und 6 Kammern eine Anzahl von 30 Einzelwerten pro
Behandlungsgruppe.
Behandlung
GABA
Glutamat
Aspartat
(µmol/l Superfusat)
(µmol/l Superfusat)
(µmol/l Superfusat)
Anzahl (n)
Kontrolle
0.75 ± 0.05
0.23 ± 0.01
0.51 ± 0.02
30
Gabapentin 0.1 mM
0.74 ± 0.05 n.s.
0.14 ± 0.01 *
0.18 ± 0.02 *
30
Tab. 3.20.: Die Wirkung von Gabapentin 0.1 mM auf die Freisetzung von endogenen Aminosäure-Transmittern im
Caudatoputamen der Ratte. Alle Angaben sind Mittelwerte ± SEM. Signifikanzniveaus: * = p < 0.05, n.s.
= nicht signifikant.
Ergebnisse
Seite 63
Unter dem Einfluss von Gabapentin zeigte sich eine signifikante Minderung der spontanen
Freisetzung der exzitatorischen Aminosäuren um 40.1 % (Glutamat), bzw. 64.7 % (Aspartat) der
Kontrollen. Ein Effekt auf die spontane Freisetzung von GABA konnte nicht beobachtet werden.
Ein weiterer Versuch sollte zudem die Wirkung von Gabapentin bei einer Konzentration von 10 µM
überprüfen. Die übrigen Versuchsbedingungen blieben unverändert. Bei der statistischen
Auswertung wurde die durchschnittliche in den Superfusaten gemessene Transmittermenge (µmol/l)
auf den entsprechenden Schnittgehalt (µmol/l) bezogen. Wie folgende Abbildung verdeutlicht,
konnten die zuvor beschriebenen Ergebnisse bestätigt werden:
1
(% des Schnittgehaltes)
Freigesetzte Transmittermenge
1,2
Kontrollen (n = 20)
GBP 0.01 mM (n = 20)
GBP 0.1 mM (n = 20)
0,8
0,6
n.s. n.s.
*
0,4
*
*
0,2
*
0
GABA
Glutamat
Aspartat
Abb. 3.10.: Die Wirkung von Gabapentin (0.1 mM, 0.01 mM) auf die Freisetzung der endogenen AminosäureTransmitter GABA, Glutamat und Aspartat im Caudatoputamen der Ratte. Alle Angaben sind
Mittelwerte ± SEM in % des Schnittgehaltes des jeweiligen Transmitters: GABA: 0.50 ± 0.05, 0.44 ±
0.05, 0.47 ± 0.05; Glutamat: 0.36 ± 0.04, 0.09 ± 0.04, 0.19 ± 0.04; Aspartat: 1.06 ± 0.06, 0.13 ± 0.06,
0.34 ± 0.06. Die Anzahl (n) der gemessenen Proben ist in der Legende angegeben. Signifikanzniveaus: *
= p < 0.05, n.s. = nicht signifikant.
Gabapentin senkte signifikant die spontane Freisetzung der exzitatorischen Transmitter Glutamat
und Aspartat im Caudatoputamen der Ratte. Dieser Effekt betrug bei einer Konzentration von 0.01
mM Gabapentin 75.6 % (Glutamat), bzw. 87.2 % (Aspartat) der Kontrollen. Ein Einfluss auf die
GABA-Freisetzung konnte in dieser Versuchsreihe nicht beobachtet werden.
Diskussion
Seite 64
4. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde ein in vitro Modell zur zytoplasmatischen Transmitterfreisetzung
durch Transporterumkehr entwickelt und validiert. An diesem Modell wurde die Wirkung des
Antikonvulsivums Gabapentin geprüft, von dem ein Einfluss auf die zytoplasmatische
Transmitterkonzentration und damit auch auf die zytoplasmatische Transmitterfreisetzung
angenommen wurde. Abschliessend wurde der Einfluss von Gabapentin auf die spontane (basale)
Freisetzung von endogenen Aminosäuretransmittern untersucht.
4.1. Die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
Nipecotat (3-Piperidincarboxylat) ist ein potenter, nicht-kompetitiver Inhibitor des neuronalen und
glialen GABA-Transporters (Johnston, 1976), wobei nach Suzdak et al. (1992) präferenziell der
neuronale Transporter mit einer zweifach höheren Affinität gehemmt wird. Entsprechend fanden
Borden et al. (1994) eine höhere Affinität zum neuronalen GAT-1-Transporter (IC50 8 ± 0.4 µM) im
Vergleich zu den vorwiegend glial lokalisierten GAT-2- und GAT-3-Transportern (IC50 102 – 378
µM). So konnte der plasmamembranäre GABA-Transporter nach Krogsgaard-Larsen und Johnston
(1975) bei einer Nipecotat-Konzentration von 1 mM zu 99 ± 1 % gehemmt werden. Der vesikuläre
GABA-Transporter wird nach McIntire et al. (1997) nur unwesentlich gehemmt. Nipecotat weist
eine strukturelle Ähnlichkeit mit dem selektiven GABAA-Rezeptor-Agonisten Muscimol auf, dem
Gift des Fliegenpilzes (Amanita muscaria). Doch im Gegensatz zu Muscimol wirkt Nipecotat nicht
auf GABA-Rezeptoren (Solis et Nicoll, 1992). Auch konnte bei einer Konzentration von 1 mM kein
Einfluss auf die Aktivität der GABA-metabolisierenden Enzyme Glutamatdecarboxylase (GAD)
und GABA-Transaminase (GABA-T) nachgewiesen werden (Krogsgaard-Larsen et Johnston,
1975).
In Superfusionsversuchen wurde Nipecotat bisher zur Blockade der Wiederaufnahme von GABA in
Neurone und Glia während des gesamten Versuchsablaufes (throughout) eingesetzt (Szerb, 1982;
Hüring, 1998). Die Wiederaufnahme der freigesetzten [3H]-GABA durch den hochaffinen GABATransporter wurde verhindert und damit messbare Konzentrationen von [3H]-GABA in den
Superfusaten erreicht.
Szerb (1982) beobachtete dabei eine Erhöhung der spontanen Ausschüttung von endogener GABA.
Nipecotat erhöhte zudem die basale [3H]-GABA-Freisetzung im Nucleus Caudatus des Kaninchens,
Diskussion
Seite 65
wenn dieses vor der zweiten Stimulation der Superfusionslösung hinzugefügt wurde (Limberger et
al., 1986). Die Autoren führten dies auf den Heteroexchange-Mechanismus zurück. Nipecotat dient
hierbei als Substrat des GABA-Transporters und wird entsprechend der Charakteristika der GABAWiederaufnahme aktiv und im Austausch gegen zytoplasmatisches GABA nach intrazellulär
transportiert (Kanner et al., 1983). In Zellkulturen GABAerger striataler Neurone wird Nipecotat
rasch im Zytosol akkumuliert und führt zu einem raschen und signifikanten Anstieg der
extrazellulären GABA-Konzentration (Pin et Bockaert, 1989). Nach elektrophysiologischen
Untersuchungen von Solis und Nicoll (1992) werden hierbei physiologisch relevante GABAKonzentrationen erreicht, welche die Aktivierung postsynaptischer GABA-Rezeptoren zur Folge
haben. Die gesteigerte elektrisch- oder durch K+-Depolarisation-evozierte, vesikuläre GABAFreisetzung bei gleichzeitiger Anwesenheit von Nipecotat wird dagegen nicht auf den
Heteroexchange-Prozess zurückgeführt, sondern auf die Hemmung der Wiederaufnahme von
GABA infolge Blockade des GABA-Transporters (Szerb, 1982).
Zunächst wurden GABAerge Neurone auf ihre Stimulierbarkeit durch die pulsatile Gabe von
Nipecotat überprüft: Bei Inkubation mit [3H]-GABA und anschliessender Superfusion unter AOAA
bewirkte die Gabe von Nipecotat (1 mM) über 2 Minuten einen steilen Anstieg der [3H]-GABAFreisetzung, wobei der maximale Effekt, entsprechend den Ergebnissen von Bernath et al. (1988),
innerhalb der ersten 5-10 Minuten zu beobachten war. Die maximale [3H]-GABA-Freisetzung
betrug in unseren Versuchen das 3-5-fache der basalen Transmitterfreisetzung. Die selbe
Grössenordnung fanden Szerb (1982) und Bernath et al. (1988) initial nach der Zugabe von
Nipecotat in die Superfusionslösung bei Superfusionsversuchen im Kortex, bzw. Caudatoputamen
der Ratte. Die [3H]-GABA-Freisetzung zeigte sich in unseren Versuchen nach Beendigung der
Stimulation rasch rückläufig und erreichte nach etwa 20 Minuten das basale Niveau.
Desweiteren wurde überprüft, ob eine verlängerte Inkubationszeit einen Einfluss auf den
stimulierbaren, zytoplasmatischen [3H]-GABA-Pool hat. Da der Transport der exogen zugeführten
[3H]-GABA in Neurone und Gliazellen ein aktiver, zeitabhängiger Prozess ist, müsste eine
Verlängerung der Inkubationszeit zu einer höheren Beladung der Gewebeschnitte führen, sofern der
Sättigungsbereich noch nicht erreicht ist. Sowohl im Nucleus Caudatus des Kaninchens, als auch im
Caudatoputamen der Ratte zeigte sich eine signifikante Mehrbeladung der Gewebeschnitte nach 60minütiger Inkubationszeit im Vergleich zu einer Inkubationsdauer von 30 Minuten. Dies hatte
jedoch keinen Einfluss auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung, d.h. trotz einer
Erhöhung des verfügbaren [3H]-GABA-Pools konnte bei gleicher Stimulationskonzentration keine
Diskussion
Seite 66
Steigerung der evozierten zytoplasmatischen Freisetzung erreicht werden. Da auch unter optimalen
Versuchsbedingungen die Überlebenszeit von Neuronen und Glia in vitro begrenzt ist, und deshalb
die Versuchszeit möglichst kurz gehalten werden sollte, wurden die Gewebeschnitte in den
weiterführenden Versuchen 30 Minuten mit [3H]-GABA inkubiert.
Ein Teil der Versuche zur Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung wurde nach Inkubation mit
[3H]-Glutamin durchgeführt, um den Einfluss von Gabapentin auf den GABA-Metabolismus
untersuchen zu können. Bei Inkubation mit [3H]-Glutamin betrug der Nipecotat-evozierte,
maximale Anstieg der [3H]-GABA-Freisetzung etwa das 2-fache der basalen [3H]-GABAFreisetzung, wobei das basale Niveau wieder nach ca. 15 Minuten erreicht wurde.
Aufgrund des schnellen Wirkungseintrittes, des deutlich stimulierenden Effektes und der
Reversibilität mit einer schnellen Beendigung der Wirkung von Nipecotat sahen wir Nipecotat als
geeignetes stimulierendes Agens für unser Modell der zytoplasmatischen Freisetzung von [3H]GABA.
4.1.1. Die Validierung des Modells der zytoplasmatischen [3H]-GABA-Freisetzung
4.1.1.1. Der Ausschluss eines vesikulären Freisetzungsmodus
In Zellkulturen striataler Neurone der Maus konnten erstmals Weiss et al. (1988) die Existenz einer
durch exzitatorische Aminosäuren induzierten GABA-Freisetzung mit den Charakteristika eines
nicht-vesikulären, Ca++-unabhängigen und Na+-abhängigen Freisetzungsmodus nachweisen. Auch
in unseren biochemischen Versuchen zur Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung sollte ein
Ca++-abhängiger, vesikulärer Freissetzungsmechanismus durch den Entzug von Ca++-Ionen aus dem
Superfusionsmedium, sowie durch die Gabe von Cadmiumchlorid (CdCl2), ein anorganischer
Blocker spannungsabhängiger Ca++-Kanäle des N- und L-Typs (Feuerstein et al., 1990),
ausgeschlossen werden. In elektrophysiologischen Untersuchungen konnte dies bereits an
hippokampalen Neuronen der Ratte gezeigt werden (Westerink et de Vries, 1989; Honmou et al.,
1995b; Gaspary et al., 1998).
Um den Einfluss eines Ca++-Entzuges zu untersuchen, wurde auf die Zugabe eines Chelators
verzichtet, obwohl einige Autoren dem Superfusionsmedium zur Überprüfung einer Ca++unabhängigen GABA-Freisetzung den Chelator EGTA zugaben (Bernath et al., 1989, Sihra et al.,
1984). Dieser bindet auch endogenes, membrangebundenes Ca++ und garantiert somit die
vollständige Entfernung des divalenten Kations. Da diese Studien den stimulatorischen Eigeneffekt
von EGTA auf die GABA-Freisetzung nicht berücksichtigten, überprüften Arias et al. (1984) den
Diskussion
Seite 67
Einfluss von EGTA auf die Ca++-unabhängige Freisetzung von GABA sowie von Glutamat,
Acetylcholin und Dopamin. Die Ausschüttung von Tritium-markierter GABA in Ca++- und
Magnesium (Mg++)-freier Lösung wurde durch EGTA um maximal 215 % gegenüber der basalen
GABA-Freisetzung gesteigert, während in Anwesenheit von 1.2 mM MgSO4, bzw. einer
physiologischen Pufferlösung (mit 2.5 mM CaCl2 und 1.2 mM MgSO4) dieser Effekt nicht zu
beobachten war (Arias et al., 1984). Die Autoren vermuteten, dass die fehlende Bindung der beiden
divalenten Kationen zu einer Destabilisierung der Plasmamembran führe. Hierdurch steige die
Permeabilität der Plasmamembran für Na+-Ionen und der depolarisierende Na+-Einstrom führe
schliesslich zur Freisetzung von GABA. Die Anwesenheit von Mg++-Ionen im Extrazellulärraum
könne dabei eine ausreichende Stabilisierung der Zellmembran gewährleisten, so dass EGTA in
einem Ca++-freien, Mg++-haltigen Superfusionsmedium keinen Einfluss auf die Ca++-unabhängige
GABA-Freisetzung zeige. Gegensätzliche Ergebnisse erbrachten die Versuche von Minc-Golomb et
al. (1988) im Hippokampus der Ratte: Die spontane GABA-Freisetzung betrug in einem Ca++freien, jedoch Mg++-haltigen Superfusionsmedium ohne die Zugabe von EGTA 250 % der
Kontrollen, während die zusätzliche Gabe von EGTA die basale GABA-Freisetzung auf 825 % der
Kontrollen steigerte.
Um eine mögliche Beeinflussung unserer Versuche durch die Gabe von Chelatoren zu vermeiden,
führten wir unsere Superfusionsversuche zur Überprüfung einer Ca++-Abhängigkeit mit einer Ca++freien Lösung ohne die Zugabe von Chelatoren durch.
Wie vermutet, zeigte der Entzug von Ca++-Ionen aus der Superfusionslösung 15 Minuten vor der
zweiten Stimulation sowohl im Nucleus caudatus des Kaninchens, als auch im Caudatoputamen der
Ratte keinen hemmenden Effekt auf die Nipecotat-evozierte, zytoplasmatische [3H]-GABAFreisetzung. Somit konnte eine Ca++-abhängige, vesikuläre Beteiligung an der Nipecotat-evozierten
[3H]-GABA-Freisetzung ausgeschlossen werden.
Im Caudatoputamen der Ratte zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Nipecotat-evozierten [3H]GABA-Freisetzung mit einem Anstieg der S2/S1-Quotienten gegenüber den Kontrollen um 37.2 %,
wenn Ca++ 15 Minuten vor S2 dem Superfusionsmedium entzogen wurde. Die entsprechenden
Ergebnisse der Versuche im Nucleus Caudatus des Kaninchens waren nicht signifikant. Jedoch
fanden Limberger et al. (1986) in Superfusionsversuchen im Nucleus Caudatus des Kaninchens
einen Anstieg der [3H]-GABA-Freisetzung unter Ca++-Entzug bei gleichzeitiger Anwesenheit von
Nipecotat (0.1 mM). Allerdings wurde Nipecotat in den von Limberger et al. (1986) durchgeführten
Versuchen zur Blockade der Wiederaufnahme von GABA während der gesamten Superfusion
Diskussion
Seite 68
eingesetzt, und nicht wie in den hier beschriebenen Experimenten als Stimulus zur Freisetzung
zytoplasmatischen GABAs.
Bezüglich der basalen Transmitterfreisetzung beobachteten wir im Nucleus Caudatus des
Kaninchens einen signifikanten (p < 0.05) Anstieg der basalen [3H]-GABA-Freisetzung um 31.4 %,
wenn die Gewebeschnitte 15 Minuten vor S2 mit einem Ca++-freien Puffer superfundiert wurden.
Die entsprechenden Versuche im Caudatoputamen der Ratte waren nicht signifikant. Bernath et
Zigmond (1988) konnten eine gesteigerte basale Freisetzung von [3H]-GABA aus dem
Caudatoputamen der Ratte beobachten, wenn Ca++ 20 Minuten vor S2 dem Superfusionsmedium
entzogen wurde. Die Steigerung der basalen GABA-Freisetzung betrug 258 %, jedoch enthielt das
Superfusionsmedium
auch
hier
EGTA.
Pothashner
et
al.
(1978)
beobachteten
in
Superfusionsversuchen des zerebralen Kortex des Meerschweinchens ebenfalls eine signifikante
Steigerung der basalen GABA-Freisetzung unter Ca++-freiem Puffer ohne die zusätzliche Gabe
eines Chelators, sowohl bei der Messung von endogener wie auch von exogen zugeführter GABA.
Die erhöhte Membranlabilität der Neurone unter Ca++-Entzug und die damit verbundene Neigung
zu Spontanentladungen ist durch folgende Hypothese zu erklären: Die Reduktion des
Membranpotentials durch den Entzug positiver Valenzen (Ca++) von der Aussenseite der
Plasmamembran führt zu einer Potentialänderung, welche ausreichend für die Öffnung
spannungsabhänger
Na+-Kanäle
ist.
Der
depolarisierende
Na+-Einstrom
infolge
Permeabilitätssteigerung der Plasmamembran induziert so die Freisetzung von GABA. Unterstützt
wird diese Aussage durch die Beobachtung, dass die unter Ca++-Entzug erhöhte basale GABAFreisetzung durch die Gabe von Tetrodotoxin (TTX), ein Hemmer spannungsabhängiger Na+Kanäle, antagonisierbar ist (Minc-Golomb et al., 1988). Auch die in unserem Modell beobachtete
Steigerung der Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung unter Ca++-Entzug kann durch die
beschriebene Hypothese erklärt werden: Der erleichterte Na+-Einstrom bei destabilisierter
Plasmamembran kann zu einer Umkehr des transmembranären Na+-Gradienten führen und somit die
Nipecotat-evozierte, Transporter-vermittelte [3H]-GABA-Freisetzung verstärken.
Die Blockade spannungsabhängiger Na+-Kanäle durch TTX bei normalen extrazellulären Ca++Spiegeln führt zu einer Unterbrechung von Aktionspotentialen und somit zur Blockade der
depolarisationsabhängigen, vesikulären Transmitterfreisetzung. So konnte in einer Reihe von
Untersuchungen die elektrisch stimulierte Freisetzung von [3H]-GABA durch die Zugabe von TTX,
gehemmt werden (Potashner et. al., 1978, Bernath et al., 1988). Für TTX konnte bereits bei einer
Konzentration von 0.1 µM eine komplette Unterdrückung des depolarisationsbedingten Na+Einstroms nachgewiesen werden (Mc Ilwain et al., 1969).
Diskussion
Seite 69
Unter der Annahme, dass die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung jedoch auf einen
depolarisationsunabhängigen, nicht-vesikulären Freisetzungsmechanismus zurückzuführen ist, wäre
eine Beeinflussung der Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung durch TTX nicht zu erwarten.
Diese Vermutung konnte in unseren Untersuchungen bestätigt werden, die Gabe von TTX in einer
Endkonzentration von 1 µM hatte keinen Einfluss auf die stimulationsbedingte [3H]-GABAFreisetzung.
Entsprechende
Ergebnisse
fanden
Westerink
et
de
Vries
(1989)
in
Mikrodialyseversuchen der Ratte, in welchen über implantierte striatale Sonden die Infusion mit
Nipecotat (0.5 mmol/l) erfolgte: Die Perfusion mit TTX (1 µmol/l) zeigte keinen Einfluss auf den
Nipecotat-induzierten Anstieg der Konzentration endogener GABA in den Dialysaten. Desweiteren
untersuchte diese Arbeitsgruppe den Effekt einer Blockade spannungsabhängiger Ca++-Kanäle
durch Cadmiumchlorid (CdCl2, 0.3 mmol/l) auf die Nipecotat-evozierte GABA-Freisetzung. Die
Gabe von CdCl2 hatte keine Hemmung des Nipecotat-induzierten Anstiegs der GABAKonzentration in den Dialysaten zur Folge. Auch in den von uns durchgeführten
Superfusionsversuchen konnte die stimulierte, Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung durch
die Gabe von CdCl2 (0.1 mM) 15 Minuten vor S2 nicht gehemmt werden. Entsprechende
elektrophysiologische
Untersuchungen
von
Honmou
et
al.
(1995b)
untersuchten
die
postsynaptischen Effekte von endogener, durch Nipecotat freigesetzte GABA aus CA 1Pyramidenzellen des Hippokampus der Ratte. Die Applikation von Nipecotat (10 mM) hatte einen
Anstieg der Leitfähigkeit der postsynaptischen Zellmembran für Chloridionen zur Folge, welche
weder durch die Zugabe von CdCl2 (0.2 mM) noch durch den Entzug der extrazellulären Ca++-Ionen
beeinträchtigt wurde.
Eine Erklärung für den in unseren Versuchen signifikanten Anstieg der basalen [3H]-GABAFreisetzung sowohl im Nucleus caudatus des Kaninchens, als auch im Caudatoputamen der Ratte
unter der Einwirkung von CdCl2 wäre auch hier die Beeinträchtigung der Stabilität der
Zellmembran. Die Folge wären verstärkte Spontanentladungen der Neurone mit einer erhöhten
basalen Transmitterfreisetzung. Dieser Effekt zeigte sich im Caudatoputamen der Ratte auch auf die
stimulierte [3H]-GABA-Freisetzung. Hier kam es unter CdCl2 zu einem Anstieg der S2/S1Quotienten um 76.0 % der Kontrollen, wobei diese Ergebnisse aufgrund des gegenüber den
Kontrollen signifikant verminderten S1-Wertes der mit CdCl2 behandelten Gruppe, bei bis dahin
gleicher Behandlung beider Gruppen, nur eingeschränkt beurteilbar sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Nipecotat-evozierten, zytoplasmatischen [3H]-GABAFreisetzung ein Ca++- und Na+-unabhängiger Freisetzungsmechanismus zugrundeliegt: Die fehlende
Hemmbarkeit durch den Entzug von Ca++-Ionen sowie durch die Blockade spannungsabhängiger
Diskussion
Ca++-Kanäle
(CdCl2)
und
Na+-Kanäle
(TTX)
Seite 70
schliessen
einen
vesikulären
Freisetzungsmechanismus aus. Die durch den Ca++-Entzug herbeigeführte Destabilisierung der
Plasmamembran mit konsekutivem Anstieg der basalen und evozierten Transmitterfreisetzung war
unter der Blockade der spannungsabhängigen Ca++-Kanäle durch CdCl2 verstärkt zu beobachten.
4.1.1.2. Der Nachweis eines durch Transporterumkehr vermittelten Freisetzungsmodus
Zur weiteren Validierung unseres Modells wurde der Einfluss einer Blockade des GABATransporters auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung geprüft. NNC-711 ist ein
spezifischer, hochpotenter, nicht-kompetitiver Inhibitor des plasmamembranären GABATransporters und hemmt nahezu selektiv den neuronalen GAT-1-Transporter mit einem IC50-Wert
von 40 ± 10 nM (Borden et al., 1994), wodurch die Verbindung eine insgesamt eine höhere Affinität
zum GABA-Transporter als Nipecotat aufweist. In Tierversuchen zeigte es deutliche antikonvulsive
Eigenschaften, die in höheren Dosen jedoch mit erheblichen Nebenwirkungen einhergingen (Suzdak
et al., 1992).
Im Gegensatz zu Nipecotat dient NNC-711 dem GABA-Transporter nicht als Substrat und wird
somit nicht in die Zelle aufgenommen. Es blockiert die Wiederaufnahme von GABA ohne
gleichzeitige Transporterumkehr und kann somit die Wirkung von Nipecotat antagonisieren. Wie in
unseren Ergebnissen dargestellt wurde, ergab die Applikation von nur 1 µM NNC-711 ab 15
Minuten vor S2 eine signifikante Hemmung der durch Nipecotat evozierten [3H]-GABAFreisetzung. Bei einer Konzentration von 10 µM NNC-711 betrug diese 68.7 % der Kontrollen. Die
signifikante Steigerung der basalen [3H]-GABA-Freisetzung ist hingegen durch die Blockade der
Wiederaufnahme des spontan freigesetzten Transmitters aus dem synaptischen Spalt zu erklären.
Elektrophysiologische Untersuchungen an Pyramiden- und Körnerzellen des Hippokamus der Ratte
ergaben eine 67.0 %ige Hemmung der Nipecotat-induzierten, zytoplasmatischen [3H]-GABAFreisetzung durch die Gabe des nicht-transportierten, kompetitiven Wiederaufnahmehemmers SKF89976 (Solis et Nicoll, 1992). Gaspary und Mitarbeiter (1998) konnten in Zellkulturen
hippokampaler Neurone der Ratte die Aktivierung postsynaptischer GABA-Rezeptoren durch eine
transportervermittelte GABA-Freisetzung nachweisen. Diese zeigte in Gegenwart von NNC-711 (10
µM) eine signifikante Abnahme um 57.6 % der Kontrollen. Die inkomplette Blockade wurde
hierbei durch die Präsenz verschiedener Isoformen des GABA-Transporters in den Zellkulturen mit
unterschiedlicher Affinität zu NNC-711 erklärt. Diese Hypothese wäre auch in unserem Modell eine
Erklärung für die inkomplette Blockade der Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung durch
Diskussion
Seite 71
NNC-711. Desweiteren zeigt Nipecotat seine Wirkung sowohl auf Neurone, als auch auf Glia,
während NNC-711 nahezu selektiv auf den neuronalen GAT-1-Transporter Einfluss nimmt und
somit die Transporter-vermittelte Freisetzung aus Gliazellen nicht beeinflussen kann.
Nachdem in unserem in vitro-Modell zunächst ein vesikulärer Freisetzungsmechanismus
ausgeschlossen wurde, konnte durch die Gabe des nicht-transportierbaren Wiederaufnahmehemmers
NNC-711 der unmittelbare Beweis dafür geliefert werden, dass die Nipecotat-evozierte [3H]GABA-Freisetzung auf einer Umkehr des GABA-Transporters beruht. Die zytoplasmatische, durch
Transporterumkehr induzierte Transmitterfreisetzung in vivo beruht auf der Stimulation ionotroper
Glutamatrezeptoren auf GABAergen-Nervenendigungen (During et al., 1995). Entsprechend
konnten Duarte et al. (1993) in einem in vitro Modell der Glutamat-induzierten, zytoplasmatischen
[3H]-GABA-Freisetzung in retinalen Zellkulturen des Hühnerembryos die Unabhängigkeit von
extrazellulärem Ca++, Insensitivität gegenüber TTX und Hemmbarkeit durch NNC-711 nachweisen.
4.1.1.3. Der Einfluss von Inhibitoren des GABA-Metabolismus auf die Nipecotatevozierte [3H]-GABA-Freisetzung
Der metabolische Abbau von [3H]-GABA während eines Freisetzungsversuches bereitet oftmals
Schwierigkeiten in der Interpretation der Ergebnisse, wenn keine chromatographische Abtrennung
von [3H]-GABA von seinen gleichfalls radiaktiv-markierten Metaboliten erfolgt. Dieses Problem
kann umgangen werden, indem man dem Superfusionsmedium einen Inhibitor der GABAabbauenden GABA-α-Ketoglutarat-Transaminase (GABA-Transaminase) zugibt (Oja et Kontro,
1988). Aminooxyessigsäure (AOAA) ist einer der potentesten Inhibitoren der GABA-Transaminase
(GABA-T) mit einer nahezu vollständigen Hemmung des GABA-Abbaus bei einer Konzentration
von 0.1 mM (Oja et Kontro, 1988). So konnte bei der Gabe von 0.1 mM AOAA throughout nahezu
alle Radioaktivität in den Superfusaten als [3H]-GABA identifiziert werden (Bernath et Zigmond,
1988; Limberger et al., 1986). Die Wirkung von AOAA beruht auf seiner Fähigkeit Pyridoxal-5Phosphat (PALP = Vitamin B6) zu binden (Beal et al., 1991). PALP fungiert als Wirkgruppe der
Amino-Transferasen und Aminosäure-Decarboxylasen und gilt als der wichtigste Kofaktor im
Aminosäure-Stoffwechsel. In der Literatur differieren die Hypothesen bezüglich einer gleichzeitigen
Hemmung der Aktivität der GABA-synthetisierenden GAD durch AOAA. Bakkelund et al. (1993)
beobachteten im Striatum der Ratte neben der Blockade der GABA-T eine initiale Hemmung der
GAD, wenn AOAA in einer Konzentration von 10 mM eingesetzt wurde. Dies steht im
Widerspruch zu den Ergebnissen von Carmona et al. (1980) und Löscher et al. (1989). Im
Diskussion
Seite 72
Rattengehirn konnten sie nach intravenöser, bzw. intraperitonealer Verabreichung von AOAA (50 150 mg/kg) keine wesentliche Beeinflussung der GAD nachweisen, bei gleichzeitiger, nahezu 100
% iger Hemmung der GABA-T. Die in den letzten Jahren gewonnenen Kenntnisse über die
Existenz zweier verschiedener GAD-Isoformen mit unterschiedlicher PALP-Abhängigkeit, sowie
artspezifischer und regionaler Verteilungsunterschiede könnte eine Erklärung für die in der Literatur
beschriebenen, zum Teil gegensätzlichen Aussagen bezüglich einer Beeinfussung der GAD durch
AOAA sein. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse von Ruppert et al. (1993) wäre in unseren
Versuchen kein Einfluss auf die Aktivität der GABA-Synthese zu erwarten, da die Produktion
zytosolischen GABAs durch die GAD67-Isoform erfolgt, welche als PALP-unabhängiges Enzym
durch AOAA nicht in ihrer Aktivität beeinflusst wird.
Um die Wirkung von AOAA auf unser Modell der Nipecotat-evozierten Freisetzung von [3H]GABA zu überprüfen, wurden die in Kapitel 3.2.2.4. beschriebenen Versuche durchgeführt. Dabei
konnte kein Einfluss auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung festgestellt werden, wenn
AOAA nur während der Inkubation eingesetzt wurde. Der Gehalt der Gewebeschnitte an Tritiummarkierter GABA nach Beendigung der Superfusion war aufgrund der Blockade des GABA-Abbaus
durch AOAA signifikant gegenüber den Kontrollen erhöht.
Die Applikation von AOAA während der gesamten Superfusion (throughout) resultierte dagegen in
einer signifikanten Steigerung der bei S1 freigesetzten Transmittermenge und ist am ehesten auf eine
Erhöhung der zytoplasmatischen [3H]-GABA-Spiegel infolge der Hemmung des GABA-Abbaus
durch AOAA zu erklären. Dieser Effekt war bei S2 in gleichem Maße ausgeprägt, wodurch der
S2/S1-Quotient im Vergleich zu den Kontrollen unverändert blieb. Dies entspricht den
Beobachtungen
von
Bakkelund
et
al.
(1993).
Auch
diese
Arbeitsgruppe
konnte
in
Mikrodialysestudien im Striatum der Ratte einen Anstieg der stimulationsbedingten GABAFreisetzung unter AOAA beobachten. Daraus ergibt sich folgende Hypothese: Die durch
Transporterumkehr
induzierte
Transmitterfreisetzung
kann
durch
eine
Erhöhung
des
zytoplasmatischen GABA-Pools und somit des chemischen Gradienten von GABA über der
Plasmamembran verstärkt werden. Desweiteren konnte in unseren Versuchen eine signifikante
Mehrbeladung nach Beendigung der Superfusion der mit AOAA superfundierten Schnitte gemessen
werden, welche jedoch im Vergleich zu „AOAA während der Inkubation“ aufgrund des starken
stimulationsbedingten [3H]-GABA-Ausflusses weniger ausgeprägt war.
Zusammenfassend können diese Ergebnisse im Sinne einer reversiblen Blockade der GABATransaminase durch AOAA interpretiert werden: Die Hemmung des [3H]-GABA-Abbaus während
der gesamten Superfusion erhöht den Gehalt an [3H]-markiertem Transmitter ohne die Nipecotat-
Diskussion
Seite 73
evozierte [3H]-GABA-Freisetzung (S2/S1) zu beeinflussen. Die Gabe von AOAA throughout hatte
somit keinen Einfluss auf die Interpretierbarkeit unserer Ergebnisse.
Als nächsten Schritt überprüften wir den Einfluss einer Blockade der GABA-Synthese auf die
Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung:
Die Gabe gleicher Nipecotat-Pulse bei beiden Stimulationen (S1, S2) liesse ohne die Zugabe
weiterer Substanzen, welche auf die stimulationsbedingte Ausschüttung Einfluss nehmen könnten,
ein S2/S1-Verhältnis von 1.0 erwarten. Da jedoch die S2/S1-Quotienten der Kontrollen deutlich
niedriger lagen (Tab 3.1.), versuchten wir, eine mögliche Verdünnung des [3H]-markierten GABAPools durch endogene, während des Versuchsablaufes synthetisierte GABA aufzudecken. Der
relative
Anteil
von
endogener
GABA
am
Gesamt-GABA-Pool
nimmt
während
des
Versuchsablaufes zu, während der relative Anteil von [3H]-GABA in gleichem Masse abnimmt.
Dieser Verdünnungseffekt spiegelt sich bei der stimulierten Freisetzung zytoplasmatischen GABAs
in einem entsprechend verminderten Anteil von [3H]-GABA an der Gesamt-GABA-Freisetzung
wider. Die Nachsynthese von endogener GABA ist ein zeitabhängiger Prozess und somit zum
Zeitpunkt der zweiten Stimulation stärker ausgeprägt als zur ersten Stimulation, was in einem S2/S1Quotienten kleiner 1.0 resultiert (Feuerstein et al., 1996). Eine Hemmung der endogenen GABASynthese durch die Blockade der Glutamatdecarboxylase (GAD), müsste das Absinken des relativen
Anteils
von
[3H]-GABA
erwartungsgemäss
verhindern
und
somit
den
beschriebenen
Verdünnungseffekt antagonisieren. Dann müsste es zu einem Anstieg der S2/S1-Quotienten
kommen. Um dies zu überprüfen, gaben wir der Superfusionslösung 3-MCPA zu, ein kompetitiver
Inhibitor der GAD (Wu et Roberts, 1974).
Diese Überlegungen konnten in unseren Untersuchungen unter 3-MCPA (0.1 mM) throughout im
Nucleus Caudatus des Kaninchens nicht bestätigt werden. Erst bei einer 3-MCPA-Konzentration
von 1 mM wurde ein signifikanter Anstieg der S2/S1-Quotienten im Caudatoputamen der Ratte
erreicht und damit unsere Hypothese bestätigt. Die in den Ergebnissen beschriebenen Unterschiede
bezüglich der gleichzeitigen Superfusion mit AOAA throughout wären ebenfalls durch eine
fehlende [3H]-GABA-Pool-Verdünnung interpretierbar. Die Versuche mit 1 mM 3-MCPA konnten
im Kaninchen nicht durchgeführt werden, da entsprechendes Gewebe nicht mehr verfügbar war.
Jedoch fand Hüring (1998) bei der elektrisch evozierten [3H]-GABA-Freisetzung im Neokortex des
Kaninchens einen signifikanten Anstieg des S2/S1-Quotienten bei einer 3-MCPA-Konzentration von
1 mM, dagegen zeigte sich bei einer Konzentration von 0.1 mM 3-MCPA ebenfalls keine Wirkung.
Im
menschlichen
Neokortex
fiel
zunächst
die
deutlich
höhere
stimulationsbedingte
Transmitterfreisetzung (S1) im Vergleich zum tierischen Gewebe auf. So wurden, bei Superfusion
Diskussion
Seite 74
unter AOAA und unveränderten Stimulationsbedingungen, bei der ersten Stimulation (S1) ca. 14 %
der zu diesem Zeitpunkt im Schnitt befindlichen [3H]-GABA freigesetzt, während bei der Ratte
unter gleichen Bedingungen die stimulationsbedingte [3H]-GABA-Freisetzung (S1) etwa 8 %
betrug. 3-MCPA throughout hatte im menschlichen Neokortex in den Konzentration von 0.1 und 1
mM keine Steigerung der S2/S1-Quotienten zur Folge. Wurden die Versuche ohne die gleichzeitige
Gabe von AOAA durchgeführt, so zeigte sich bei der Stimulation mit Nipecotat 1 mM unter 3MCPA ein enormer [3H]-GABA-Efflux bei S1: 22.5 ± 1.65 % der zu Beginn der Stimulation im
Schnitt befindlichen [3H]-GABA wurde durch einen 2-minütigen Nipecotat-Puls von 1 mM
freigesetzt. 3-MCPA steigerte somit signifikant die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung bei
S1 um 143.1 % der Kontrollen und bewirkte hierdurch vermutlich eine Depletion der kortikalen
Gewebeschnitte. Der bei S2 zur Verfügung stehende [3H]-GABA-Pool wurde stark reduziert, was
sich im Vergleich zu den Kontrollen in einem signifikant erniedrigten S2/S1-Quotienten
widerspiegelte. Um die Depletion des zytoplasmatischen GABA-Pools zu vermeiden, senkten wir in
den darauffolgenden Versuchen die Nipecotat-Konzentration auf 0.32 mM, bzw. 0.1 mM.
Hierdurch erzielten wir zwar eine deutliche, konzentrationsabhängige Abnahme der Nipecotatevozierten [3H]-GABA-Freisetzung (S1), jedoch blieb der von uns erwartete Anstieg des S2/S1Quotienten unter 3-MCPA aus. Bei der Stimulation mit Nipecotat 0.1 mM war der S2/S1-Quotient
unter der Blockade der GAD mit 3-MCPA -entgegen unseren Erwartungen- signifikant erniedrigt.
Eine Erklärung für diese Beobachtung können wir zum jetzigen Zeitpunkt nicht finden.
Im Gegensatz dazu kann der nach Stimulation mit Nipecotat 0.1 mM und Superfusion unter 3MCPA signifikant erhöhte Gehalt der Schnitte an [3H]-GABA im Vergleich zu den Kontrollen
durch die Blockade der endogenen GABA-Synthese erklärt werden: Tritium-markierter Transmitter
wird infolge der verminderten Nachsynthese endogener GABA in geringerem Ausmass aus seinen
intrazellulären Speichern verdrängt. Entsprechend müsste der [3H]-GABA-Gehalt der Schnitte nach
Beendigung der Superfusion im Vergleich zu den Kontrollen erhöht sein. Dieser Effekt war bei
einer höheren Stimulationskonzentration vermutlich aufgrund der hohen stimulationsbedingten
[3H]-GABA-Freisetzung maskiert.
Zusammenfassend sind die niedrigen S2/S1-Werte der Kontrollen unserer Versuche im
Caudatoputamen der Ratte auf den vermuteten Verdünnungseffekt durch endogen synthetisierte
GABA zurückzuführen: Es zeigte sich unter der Blockade der GAD durch 3-MCPA (1 mM) der
erwartete Anstieg der S2/S1-Quotienten, welcher sich vor allem unter der gleichzeitigen Superfusion
mit AOAA bemerkbar machte. Da AOAA, wie bereits erläutert wurde, keinen oder einen nur
geringen Einfluss auf die GABA synthetisierende GAD hat, beruht der additive Effekt dieser
Diskussion
Seite 75
Substanz am ehesten auf der Hemmung des GABA-Abbaus durch die Blockade der GABATransaminase und der damit verbundenen Steigerung des zytoplasmatischen GABA-Pools.
Desweiteren wäre infolge der Blockade des GABA-Abbaus eine Einschränkung der Synthese von
GABA aus den Metaboliten des GABA-Abbaus denkbar (Kapitel 1.2.2.). Der Anstieg der S2/S1Quotienten unter 3-MCPA ohne die gleichzeitige Anwesenheit von AOAA kann rechnerisch auch
auf den signifikanten niedrigeren S1-Werten im Vergleich zu den Kontrollen beruhen und ist somit
nur bedingt aussagekräftig.
Die Interpretation der entsprechenden Ergebnisse im Neokortex des Menschen war erschwert
aufgrund der im Vergleich zu den Tiermodellen starken Stimulierbarkeit zur Ausschüttung von
[3H]-GABA durch die pulsatile Gabe von Nipecotat. Diese Beobachtung könnte durch eine
unterschiedliche Affinität von 3-MCPA zu den beiden artspezifisch unterschiedlich lokalisierten
Isoformen der GAD (GAD65, GAD67) erklärt werden. Während nach Lindefors (1993) im
Caudatoputamen der Ratte die GAD67 dominiert, ist die zelluläre Verteilung der GAD-Isoformen im
menschlichen Neokortex nicht bekannt. Würde 3-MCPA bevorzugt die GAD67 hemmen, so wäre
diese Hypothese eine Erklärung für unsere Ergebnisse im Caudatoputamen der Ratte. Jedoch sind
Studien über eine selektive Beeinflussung einer der beiden GAD-Isoformen durch 3-MCPA in der
Literatur nicht beschrieben.
Abschliessend kann aufgrund der zur Validierung durchgeführten Untersuchungen die Nipecotatevozierte [3H]-GABA-Freisetzung als geeignetes Modell zur Prüfung der zytoplasmatischen
GABA-Freisetzung unter dem Einfluss von Testsubstanzen betrachtet werden.
4.1.2. Der Einfluss von Gabapentin auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABAFreisetzung
Im Anschluss an die Validierung unseres Modells sollte der Einfluss des Antikonvulsivums
Gabapentin auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung geprüft werden.
Der antikonvulsive Wirkmechanismus von Gabapentin ist noch nicht identifiziert. Es wird jedoch
ein Einfluss auf die GABAerge Neurotransmission im Sinne einer Verstärkung der GABAergen
Inhibition vermutet:
So steigert Gabapentin nach Löscher et al. (1991) die Akkumulation von GABA in verschiedenen
Hirnregionen der Ratte um bis zu 100 % gegenüber den Kontrollen. Auch in in-vivoMagnetresonanz-spektroskopischen Untersuchungen an Patienten mit komplex-fokaler Epilepsie
Diskussion
Seite 76
zeigte sich ein Anstieg der zerebralen GABA-Konzentration im Bereich des occipitalen Kortex nach
Einnahme von Gabapentin (Petroff et al., 1996). Dagegen fanden sich bei Epilepsiepatienten ohne
Gabapentinbehandlung deutlich erniedrigte GABA-Spiegel im Vergleich zu gesunden Probanden.
Unter Gabapentin, welches hierbei sowohl als Zusatz- als auch als Monotherapie in klinisch
üblichen Dosierungen eingesetzt wurde, konnte eine signifikante Steigerung der GABA-Spiegel auf
normale oder sogar leicht höhere Konzentrationen im Vergleich zu den gesunden Probanden
aufgezeigt werden. In einer weiterführenden Studie der selben Arbeitsgruppe erreichte der Anstieg
der GABA-Konzentration im occipitalen Kortex etwa eine Stunde nach oraler Applikation der
ersten Dosis sein Maximum (Petroff et al., 2000). Götz et al. (1993) beobachteten eine signifikante
Steigerung der [3H]-GABA-Freisetzung unter der Einwirkung von Gabapentin in therapeutisch
wirksamen Konzentrationen, wenn Caudatoputamen-Schnitte der Ratte nach Inkubation mit dem
Precursor [3H]-Glutamin durch K+-Depolarisation zur Ausschüttung von [3H]-GABA stimuliert
wurden. Die stimulierte Transmitterfreisetzung durch K+-Depolarisation erfolgt nach Haycock et al
(1978) sowohl aus einem vesikulären als auch aus einem zytoplasmatischen GABA-Pool. Da
Gabapentin keinen Einfluss auf die vesikuläre, elektisch evozierte Freisetzung endogener GABA im
Hippokampus der Ratte zeigte (Taylor, 1989), sprächen diese Ergebnisse zusammenfassend für eine
Gabapentin-induzierte Verstärkung der zytoplasmatischen GABA-Freisetzung infolge einer
Erhöhung des zytoplasmatischen GABA-Pools.
4.1.2.1. Der Einfluss von Gabapentin nach Inkubation mit [3H]-GABA
Nach Inkubation mit [3H]-GABA konnte Gabapentin weder im Gewebe des Kaninchens, noch in
dem der Ratte, eine Wirkung auf die zytoplasmatische, Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung
zeigen.
Bisherige Studien ergaben, dass die Wirkung von Gabapentin auf einem zeitabhängigen Prozess
beruht. So fanden Wamil et McLean (1994) in klinisch relevanten Konzentrationen von Gabapentin
eine Limitierung hochfrequenter Aktionspotentiale in kortikalen und spinalen Zellkulturen von
Mäuseembryonen. Dieser Effekt war deutlich zeitabhängig, mit einem IC50 von 19 µM nach 10 - 60
Minuten Einwirkzeit von Gabapentin. Auch die Beobachtung, dass Gabapentin nach intravenöser
Applikation seine höchste antikonvulsive Wirkung erst nach etwa zwei Stunden und somit später als
der Zeitpunkt der maximalen Substanzkonzentration im Blutplasma oder im interstitiellen Raum
des Gehirns erreicht (Welty et al., 1993), steht nach Taylor (1994) eher in Zusammenhang mit einer
langsamen pharmakologischen Wirkung als mit einer verzögerten Verteilung im Gehirn.
Diskussion
Seite 77
Somit versuchten wir in unseren nächsten Versuchen einen Gabapentin-Effekt durch die
Verlängerung der Einwirkzeit von Gabapentin vor S2 aufzudecken. Jedoch konnte auch durch das
Einlegen einer einstündigen Sammelpause und somit durch die Verlängerung der Einwirkzeit von 85
auf 145 Minuten vor der zweiten Stimulation, kein Gabapentin-Effekt beobachtet werden.
Im Gegensatz dazu ergaben elektrophysiologische Untersuchungen von Kocsis und Honmou (1994)
am Nervus opticus neonataler Ratten, dass die Vorbehandlung mit Gabapentin (0.1 mM) die
Nipecotat-induzierte GABA-Freisetzung steigerte, was sekundär zu einer Depolarisation
postsynaptischer Neurone durch die Aktivierung von GABAA-Rezeptoren führte. Eine direkte
Beeinflussung des Membranpotentials durch Gabapentin wurde ausgeschlossen. Entsprechende
Ergebnisse fanden Honmou et al. (1995a) im Hippokampus der adulten Ratte. In beiden
Experimenten war jedoch eine einstündige Vorbehandlung des Gewebes mit Gabapentin
erforderlich. Eine kürzere Wirkdauer von Gabapentin hatte keinen Einfluss auf die Nipecotatevozierte GABA-Freisetzung. Weiterführende Patch-clamp-Versuche im Hippokampus der Ratte
bewiesen
die
fehlende
Abhängigkeit
der
Nipecotat-induzierten
GABA-Freisetzung
von
extrazellulärem Ca++, als Hinweis auf einen nicht-vesikulären Freisetzungsmechanismus (Honmou
et al., 1995b). Die Wirkung von Gabapentin führten die Autoren auf eine Modulation des GABAStoffwechsels im Sinne einer Erhöhung der zytoplasmatischen GABA-Spiegel zurück.
Im Gegensatz dazu fand sich in unseren Freisetzungsversuchen zunächst kein Einfluss von
Gabapentin auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung. Berücksichtigt man jedoch die
Tatsache, dass die Arbeitsgruppe um Honmou et al. (1994, 1995a,b) nicht unmittelbar die
freigesetzte Menge des endogenen Transmitters bestimmte, sondern eine indirekte Messung der
endogenen GABA-Freisetzung durch die Registrierung der Änderung des Membranpotentials
postsynaptischer Neurone vornahm, so lassen sich unsere Ergebnisse folgende Interpretation zu: Übt
Gabapentin seine Wirkung tatsächlich über eine Interaktion mit zytosolischen Enzymen im Sinne
einer Steigerung des zytoplasmatischen GABA-Pools aus, so kann in unseren bisherigen Versuchen
die Gabapentin-Wirkung durch die Inkubation mit [3H]-GABA und Blockade des GABA-Abbaus
durch AOAA maskiert sein. Nur bei Inkubation der Gewebeschnitte mit dem GABA-Precursor
[3H]-Glutamin und anschliessender Superfusion ohne die Zugabe von Substanzen, welche den
GABA-Stoffwechsel beeinflussen, kommt es zur intraneuralen, metabolischen Transformation zu
[3H]-GABA und somit zu einer für uns sichtbaren Einflussnahme von Gabapentin.
Diskussion
Seite 78
4.1.2.2. Der Einfluss von Gabapentin nach Inkubation mit [3H]-Glutamin
Aufgrund dieser Überlegungen überprüften wir im weiteren den Einfluss von Gabapentin auf die
Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung im Caudatoputamen der Ratte nach Inkubation mit
[3H]-Glutamin, Superfusion ohne die zusätzliche Gabe von AOAA und anschliessender
säulenchromatographischer Abtrennung von [3H]-GABA von seinen tritiierten Metaboliten.
Gabapentin zeigte hier bei der Gabe 15 min vor S2 einen zwar tendenziellen, jedoch nicht
signifikanten Anstieg der S2/S1-Quotienten im Vergleich zu den nicht mit Gabapentin behandelten
Kontrollen.
In der Annahme, dass Gabapentin in diesem Versuchsansatz nicht lange genug auf das Gewebe
einwirken konnte, legten wir zwischen den beiden Stimulationen eine einstündige Sammelpause
ein. Die bei gleicher Behandlung signifikant höheren S1-Werte der Gabapentin-Gruppe im
Vergleich zu den Kontrollen lassen jedoch nur eine eingeschränkte Beurteilung dieser Versuche zu.
Bei S2 konnte trotz gleicher Nipecotat-Pulse bei beiden Stimulationen ein nur geringer [3H]-GABAEfflux erzielt werden, woraus sich sehr niedrige S2/S1-Quotienten ergaben. Entsprechend war die
basale Transmitterfreisetzung im Anschluss an die Sammelpause tendenziell niedriger im Vergleich
zur basalen Transmitterfreisetzung vor der ersten Stimulation (Abb. 3.7.). Das Einlegen einer
einstündigen Sammelpause verminderte somit wesentlich den bei S2 zur Verfügung stehenden [3H]GABA-Pool. Um dem entgegenzuwirken und Gabapentin weiterhin eine ausreichende Einwirkzeit
zu
gewähren,
führten
wir
die
darauffolgenden
Versuche
mit
einer
niedrigeren
Stimulationskonzentration durch. Die Stimulation mit Nipecotat 0.1 mM ergab weiterhin nur sehr
niedrige S2/S1-Quotienten, welche aufgrund starker Abweichungen vom Mittelwert keinen
signifikanten Unterschied zwischen den mit Gabapentin behandelten Gruppen und den Kontrollen
ergab. Ein Gabapentin-Effekt auf die Nipecotat-evozierte [3H]-GABA-Freisetzung konnte erst
nachgewiesen werden, wenn nur eine Stimulation mit Nipecotat 1 mM durchgeführt wurde und
Gabapentin zum Zeitpunkt der Stimulation bereits 70 Minuten auf die Caudatoputamen-Schnitte
einwirken konnte: In einer Konzentration von 0.1 mM steigerte Gabapentin die Nipecotat-evozierte
[3H]-GABA-Freisetzung signifikant um 48.1 % der Kontrollen.
Gabapentin konnte in unserem Versuchsmodell eine Steigerung der Nipecotat-evozierten [3H]GABA-Freisetzung erst dann erzielen, wenn
Gabapentin auf den GABA-Metabolismus durch Inkubation mit dem Precursor [3H]-Glutamin und
Superfusion ohne AOAA einwirken konnte und
Diskussion
Seite 79
Gabapentin vor der Stimulation zur zytoplasmatischen Freisetzung von GABA 70 Minuten auf die
Gewebeschnitte einwirken konnte. Bei kürzeren Einwirkzeiten hatte Gabapentin keinen
signifikanten Effekt.
Unsere Versuchsergebnisse bekräftigen somit die Vermutung, dass die antikonvulsive Wirkung von
Gabapentin über eine Erhöhung der zytoplasmatischen GABA-Konzentration zustande kommt.
Dabei wären zwei Möglichkeiten denkbar, welche durch unsere Versuchsanordnung nicht weiter
differenziert werden konnten:
Zum einen könnte Gabapentin durch die Blockade des vesikulären GABA-Transporters
Akkumulation von GABA in Vesikeln GABAerger Neurone hemmen. Hierdurch würde sich
konsekutiv die zytoplasmatische GABA-Konzentration erhöhen. Diese Eigenschaft wurde für das
antikonvulsiv wirkende γ-vinyl-GABA (Vigabatrin) beschrieben (Mc Intire et al., 1997,
Christensen et al., 1991), für welches zudem die irreversible Hemmung der neuronalen, GABAabbauenden GABA-Transaminase (GABA-T) als Wirkmechanismus gilt (Satzinger, 1994). Sollte
Gabapentin tatsächlich die Anreicherung von GABA in den Vesikeln hemmen, müsste die
elektrisch evozierte, vesikuläre GABA-Freisetzung unter Gabapentin vermindert sein. Jedoch
konnte Taylor (1989) keinen Einfluss von Gabapentin auf die elektrisch evozierte Freisetzung
endogener GABA entdecken.
Zum anderen wäre eine Erhöhung der zytoplasmatischen GABA-Spiegel durch die Interaktion des
Pharmakons mit zytosolischen Enzymen des GABA-Stoffwechsels im Sinne einer Steigerung der
GABA-Synthese oder einer Hemmung des GABA-Abbaus denkbar. So fanden Goldlust et al.
(1995) in vitro Hinweise für eine Blockade der GABA-T durch Gabapentin, allerdings nur bei
hohen, klinisch nicht relevanten Konzentrationen. Wurde Mäusen über eine Woche Gabapentin in
einer antikonvulsiv wirksamen Dosierung intraperitoneal verabreicht, so konnte zerebral gleichfalls
eine erhöhte Aktivität der GABA-T gemessen werden (Leach et al., 1997). Desweiteren ergaben
sich in vitro Hinweise auf eine durch Gabapentin induzierte Aktivitätssteigerung der GABAsynthetisierenden GAD, jedoch auch hier in klinisch nicht relevanten Konzentrationen des
Pharmakons (Taylor et al., 1992).
Unter Berücksichtigung der pathophysiologischen Zusammenhänge im Rahmen eines epileptischen
Anfalls, lassen unsere Untersuchungen folgenden Schluss zu: Gabapentin erhöht die
zytoplasmatischen GABA-Spiegel, was sich unseren Versuchen in einer signifikanten Zunahme der
Nipecotat-evozierten, zytoplasmatischen [3H]-GABA-Freisetzung widerspiegelte. Somit wäre
denkbar, dass ein Anstieg der zytoplasmatischen GABA-Konzentrationen in vivo die
Diskussion
Seite 80
zytoplasmatische Freisetzung von GABA durch Transporterumkehr während starker neuronaler
Aktivität verstärken kann. Wichtig sind hierbei die von During et Spencer (1993) gemachten
Beobachtungen: Bei Patienten mit einer komplex-fokalen Epilepsie wurde während und nach einem
epileptischen Anfall neben dem Anstieg der Glutamatkonzentration im epileptogenen Hippokampus
gleichzeitig einen Anstieg der extrazellulären GABA-Konzentrationen gemessen. Dieser war im
epileptogenen Hippokampus im Vergleich zur gesunden kontralateralen Seite deutlich vermindert.
Zur Weiterführung dieser in vivo-Studien untersuchten During und seine Mitarbeiter (1995) den
Effekt einer K+-Depolarisation bzw. der Gabe von Glutamat auf die extrazelluläre GABAKonzentration im epileptogenen versus gesunden Hippokampus. Bei der lokalen Stimulation mit
Glutamat blieb im epileptogenen Hippokampus im Vergleich zum gesunden kontralateralen
Hippokampus die Steigerung der GABA-Konzentration in den Dialysaten aus. Im Gegensatz dazu
wurden unter K+-Depolarisation signifikant höhere GABA-Konzentrationen in den Dialysaten des
epileptogenen Hippokampus gegenüber des gesunden Hippokampus gemessen. Während unter K+Depolarisation GABA vesikulär und zu einem kleineren Anteil auch zytoplasmatisch freigesetzt
wird (Haycock et al., 1978), ist die Glutamat-induzierte GABA-Freisetzung nach Harris et Miller
(1989) auf eine Umkehr des GABA-Transporters zurückzuführen. Hierdurch erklären sich die
beschriebenen Beobachtungen: Eine verminderte Anzahl von GABA-Transportern im epileptogenen
Hippokampus beeinträchtigt die Glutamat-induzierte, durch Transporterumkehr vermittelte GABAFreisetzung, wohingegen die extrazellulären GABA-Konzentrationen nach K+-Depolarisation
infolge eine verminderten Wiederaufnahme von GABA erhöht sein würden. Zur Überprüfung dieses
Sachverhaltes bestimmten During et al. (1995) die Bindungsrate von [3H]-Nipecotat im gesunden
und im epileptogenen Hippokampus der Ratte, um den möglichen Verlust von GABA-Transportern
im epileptogenen Hippokampus zu quantifizieren. Es ergab sich eine Minderung der absoluten
Anzahl von [3H]-Nipecotat-Bindungsstellen um 48 ± 9 % im epileptogenen gegenüber dem
gesunden Hippokampus der Ratte, was einem entsprechenden Verlust von GABA-Transportern
entspricht. Williamson et al. (1995) fanden in vitro Hinweise für eine Beeinträchtigung der
Transporterfunktion bei Patienten mit Temporallappenepilepsie bei Temporallappensklerose: In
elektrophysiologischen Untersuchungen des operativ entfernten sklerotischen Hippokampus wurde
eine signifikant verlängerte postsynaptische Antwort nach exogen verabreichter GABA gemessen.
Als Kontrollgruppe diente hierbei das Gewebe nach Hippokampektomie bei Patienten mit
tumorbedingter Temporallappenepilepsie. Wurde der GABA-Transporter durch die Zugabe des
Inhibitors NNC-711 geblockt, so hatte dies einen nur unwesentlichen Einfluss auf die exogene
Zugabe von GABA im sklerotischen Gewebe, während hierdurch die GABA-Antwort im
Diskussion
Seite 81
Hippokampusgewebe von Tumorpatienten nahezu dreifach verlängert wurde. Auch diese
Ergebnisse sprechen dafür, dass in dem pathologisch veränderten Gewebe von Patienten mit einer
Temporallappenepilepsie bei Hippokampussklerose entweder eine Zerstörung oder eine DownRegulation der GABA-Transporter stattgefunden hat. Bei Patienten mit einer tumorbedingten
Temporallappenepilepsie scheint die Transporterfunktion nicht beeinträchtig zu sein. Um zu prüfen,
ob die verlängerte postsynaptische Antwort auf exogene GABA-Zufuhr im sklerotisch veränderten
Hippokampus tätsächlich auf eine Beeinträchtigung der Transporterfunktion zurückzuführen ist,
wäre zur Weiterführung dieser Studien die konkrete Bestimmung der Transporterfunktion und anzahl sinnvoll.
Zusammenfassend kann Gabapentin durch die Erhöhung der zytosolischen GABA-Konzentration
ausgleichend für die pathologisch verminderte Anzahl von GABA-Transportern im krankhaften,
epileptogenen Hirngewebe wirken (Taylor et al., 1998). Unter Berücksichtigung der Ergebnisse von
During et al. (1995) und Williamson et al (1995) wäre für Gabapentin vor allem eine Wirkung auf
jene Epilepsieerkrankungen zu erwarten, deren Gewebe mit strukturellen Veränderungen im Sinne
einer Verminderung der Anzahl von GABA-Transportern einhergeht.
4.2. Die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung
Analog der Nipecotat-evozierten Freisetzung von [3H]-GABA, etablierten wir ein Modell der
zytoplasmatischen Freisetzung von D-[3H]-Aspartat durch die Umkehr des plasmamembranständigen, hochaffinen Glutamat-Transporters. L-trans-2,4-pyrrolidin dicarboxylat (L-trans-PDC) ist
einer der potentesten Inhibitoren des Glutamat-Transporters (Ki 5.06 µM), bei nur niedriger
Affinität zu NMDA und non-NMDA-Rezeptoren (Bridges et al., 1991). Es hemmt den GlutamatTransporter kompetitiv und wird gleichzeitig als Substrat des Transporters im Austausch gegen
intrazelluläres Glutamat, bzw. Aspartat in die Zelle aufgenommen (Kanai et al., 1994; Griffiths et
al., 1994). Nach Arriza et al. (1994, 1997) zeigt L-trans-PDC eine Affinität zu den GlutamatTransportern EAAT-1 bis -3 und EAAT-5.
In bisherigen Versuchen wurde L-trans-PDC eingesetzt, um in den Superfusaten messbare
Konzentrationen von Glutamat, bzw. Aspartat zu erhalten. Ohne die Zugabe eines
Wiederaufnahme-Hemmers waren sehr starke Stimuli, d.h. hohe K+-Konzentrationen, bzw. hohe
elektrische Stimulationsfrequenzen nötig, um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten (Waldmeier et
Diskussion
Seite 82
al., 1993). Erst die verzögerte Wiederaufnahme des synaptisch freigesetzten Transmitters durch
Blockade des Glutamat-Transporters erbrachte messbare Transmitterkonzentrationen in den
Superfusaten. Dabei beobachteten Waldmeier et al. (1993) einen Anstieg der basalen Freisetzung
von Glutamat, wenn L-trans-PDC throughout im Superfusionsmedium enthalten war. Dieser Effekt
zeigte sich deutlich Na+-abhängig, und weist auf die Beteiligung des Na+-abhängigen GlutamatTransporters hin.
Ziel unserer Versuche war es jedoch, durch die pulsatile Gabe von L-trans-PDC die Freisetzung von
zytoplasmatischem,
stellvertretend
für
Glutamat
eingesetztem
D-[3H]-Aspartat
durch
Transporterumkehr zu erreichen, und einen eventuellen Effekt des Antiepileptikums Gabapentin auf
den zytoplasmatischen Aspartat-Transmitter-Pool nachzuweisen: Die Gabe eines 2-minütigen Ltrans-PDC-Pulses (1 mM) resultierte in unseren Versuchen innerhalb der ersten Minuten in einem
deutlichen Anstieg der D-[3H]-Aspartat-Freisetzung aus glutamatergen Terminalen. Dabei betrug
der maximale Anstieg das 3.8-fache der basalen Transmitterfreisetzung. Die gesamte
stimulationsbedingte Transmitterfreisetzung (S2, n = 4 Kontrollen) betrug im Mittel 3.16 ± 0.46 %
des zu diesem Zeitpunkt im Schnitt befindlichen D-[3H]-Aspartat. Etwa 20 Minuten nach Beginn
der Stimulation wurde das basale Freisetzungsniveau wieder erreicht. Ähnliche Ergebnisse erhielten
Rawls et al. (1997) in Mikrodialysestudien des Caudatoputamens der Ratte: Die Perfusion mit 1
mM L-trans-PDC ergab einen initial 4-fachen Anstieg der extrazellulären Konzentration von
endogenem Glutamat. Die Perfusion mit 0.1mM L-trans-PDC hatte dagegen keinen signifikanten
Anstieg von Glutamat im Extrazellulärraum zur Folge.
Unsere Untersuchungen sind deshalb von Bedeutung, da es bei den (patho)-physiologischen
Vorgängen von Ischämie, Anoxie, Trauma oder Epilepsie zu einer Störung des Energiehaushaltes
mit konsekutivem Zusammbruch des Membranpotentials und Depolarisation von Neuronen infolge
Na+-Einstroms kommt (Bouvier et al., 1992, Zini et al., 1993). Der Anstieg der intrazellulären Na+Konzentration dreht den Na+-abhängigen Glutamat-Transporter um und führt so zu der nichtvesikulären Freisetzung von zytosolischem Glutamat, bzw. Aspartat. Nach Szatkowsky et al. (1990)
können durch diesen Mechanismus extrazelluläre Glutamatkonzentrationen von bis zu 370 µM
erreicht werden, was durchaus neurotoxischen Konzentrationen entspricht (Leigh et al., 1996).
Volterra et al. (1997) zeigten in vitro, dass die L-trans-PDC-induzierte, zytoplasmatische
Freisetzung von Glutamat aus kortikalen Zellkulturen der Ratte strukturelle, sowie biochemische
Veränderungen zur Folge hat: Mit einer zeitlichen Verzögerung von ca. 24 Stunden hatte die
Diskussion
Seite 83
Applikation von 200 µM L-trans-PDC eine diffuse Zellschädigung von Neuronen mit einem
Anstieg des Nekrosemarkers Lactatdehydrogenase (LDH) zur Folge.
4.2.1. Die Validierung des Modells der zytoplasmatischen D-[3H]-Aspartat-Freisetzung
4.2.1.1. Der Ausschluss eines vesikulären Freisetzungsmodus
Zur Validierung des Modells der zytoplasmatischen Freisetzung von D-[3H]-Aspartat durch die
Umkehr
des
Glutamattransporters,
sollte
zunächst
ein
vesikulärer
Freisetzungsmodus
ausgeschlossen werden. Hierzu überprüften wir den Einfluss eines Ca++-Entzugs, der Gabe von
Cadmiumchlorid (CdCl2) und der Gabe von TTX auf die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-AspartatFreisetzung.
Eine Ca++-Abhängigkeit der L-trans-PCD-evozierten D-[3H]-Aspartat-Freisetzung konnte in
unseren Versuchen ausgeschlossen werden, sowohl für den Entzug der Ca++-Ionen aus dem
Superfusionsmedium, als auch für die Blockade spannungsabhängiger Ca++-Kanäle durch CdCl2.
Die knapp signifikante Steigerung des S2/S1-Quotienten bei der Gabe von CdCl2 vor S2 ist
vermutlich auf eine Beeinträchtigung der Membranstabilität und die daraus resultierende Neigung
zu Spontanentladungen zurückzuführen.
Diese Ergebnisse stimmen mit Resultaten von Griffiths et al. (1994) überein, welche an Zellkulturen
zerebellärer Körnerzellen und kortikaler Astrozyten nach Beladung mit D-[3H]-Aspartat eine
konzentrationsabhängige Transmitterfreisetzung durch L-trans-PDC mit den Charakteristika eines
Ca++-unabhängigen und Na+-abhängigen Prozesses gefunden haben. Entsprechend konnte die Ltrans-PCD-evozierte Freisetzung von endogenem Aspartat in in vivo Mikrodialyse-Versuchen im
Caudatoputamen der Ratte durch die Perfusion mit niedrigen Ca++-Konzentrationen (0.1 mM) nicht
gehemmt werden (Rawls et al., 1997). Desweiteren war in vitro auch die L-trans-PCD-evozierte
Freisetzung von [3H]-Glutamat in Gewebeschnitten des Caudatoputamens der Ratte (Hummel,
1999) wie auch von endogenem Glutamat in Zellkulturen kortikaler Neurone und Glia der Ratte
(Volterra et al., 1996) unabhängig von den extrazellulären Ca++-Spiegeln.
Desweiteren untersuchten die erwähnten Autoren (Volterra et al., 1996; Rawls et al., 1997;
Hummel, 1999) den Einfluss einer Blockade spannungsabhängiger Na+-Kanäle durch Tetrodotoxin
(TTX) auf die L-trans-PDC-evozierte Glutamatfreisetzung. Nach Volterra et al. (1996) und Hummel
(1999) konnte diese durch die Gabe von TTX (1 µM) nicht gehemmt werden. Im Gegensatz dazu
beobachteten Rawls et al. (1997) in vivo eine Hemmung der L-trans-PCD-evozierten Glutamat-
Diskussion
Seite 84
Freisetzung unter TTX 1 µM. Bei in vivo-Mikrodialyse-Versuchen sind die neuronalen Schaltkreise
zwischen den Basalganglien und dem Kortex intakt. Die nicht-vesikuläre, L-trans-PDC-evozierte
Freisetzung von Glutamat aus kortikostriatalen Terminalen hatte somit die Aktivierung einer
Neuronenschleife ausgehend vom Striatum über den Thalamus zum Kortex zur Folge. Über diesen
positiven Feedback wurden kortikostriatale Neurone zur vesikulären Freisetzung von Glutamat
stimuliert. Dieser Effekt wurde durch die Gabe von TTX antagonisiert. Unabdingbar für diese
Beobachtung war somit die Intaktheit der neuronalen Verschaltungen zwischen Basalganglien und
Kortex.
Da wir in unseren Versuchen jedoch die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung aus
kortiko-striatalen Terminalen im isolierten Caudatoputamen der Ratte beobachteten, waren positive
Rückkopplungsmechanismen nicht zu erwarten. Zudem betrachteten wir die Freisetzung von DAspartat, welches im Gegensatz zu Glutamat nicht vesikulär gespeichert wird, so dass eine
vesikuläre
Freisetzungskomponente
ausgeschlossen
werden
konnte.
Die
Blockade
des
spannungsabhängigen, schnellen Na+-Einstroms durch TTX zeigte in unseren Versuchen
erwartungsgemäss
keine
Beeinträchtigung
der
L-trans-PCD-evozierten
D-[3H]-Aspartat-
Freisetzung.
Zusammenfassend konnten unsere Versuche die Hypothese bestätigen, dass der L-trans-PDCevozierten D-[3H]-Aspartat-Freisetzung ein Ca++- und Na+-unabhängiger Freisetzungsmechanismus
zugrundeliegt: Die fehlende Hemmbarkeit durch den Entzug von Ca++-Ionen und die Blockade
spannungsabhängiger Ca++-Kanäle (CdCl2) wie auch Na+-Kanäle (TTX) schliessen einen
vesikulären Freisetzungsmechanismus aus.
4.2.1.2. Der Nachweis eines durch Transporterumkehr vermittelten Freisetzungsmodus
Um zu prüfen, ob die zytoplasmatische Freisetzung von D-[3H]-Aspartat tatsächlich auf einer
Umkehr des Glutamattransporters beruht, wurde der Einfluss einer Blockade des GlutamatTransporters auf die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung geprüft.
Dihydrokainat (DHK) ist ein kompetitiver Inhibitor des plasmamembranständigen GlutamatTransporters mit einer niedrigeren Affinität im Vergleich zu L-trans-PDC (Bridges et al., 1991),
wobei DHK dem Glutamat-Transporter nicht als Substrat dient und somit nicht in das Zellinnere
transportiert wird (Koch et al., 1999a). Die Bindung an ionotrope Glutamatrezeptoren ist gering und
die Glutamat-metabolisierenden Enzyme bleiben bei Konzentrationen bis zu 1 mM ohne
wesentliche Beeinflussung (Johnston, 1979). Nach Koch et al. (1999b) hemmt DHK vorwiegend
Diskussion
den
glial
lokalisierten
EAAT-2
Subtyp,
sowie
Seite 85
die
auf
Synaptosomen
lokalisierten
Glutamattransporter. Für letztere beschrieben Ferkany und Coyle (1989) und Robinson et al. (1991)
pharmakologisch
unterschiedliche
Subtypen
mit
heterogener
regionaler
Verteilung
3
und
3
unterschiedlicher Affinität zu DHK. So blieb die Wiederaufnahme von [ H]-Glutamat und D-[ H]Aspartat in Synaptosomen des Kleinhirns der Ratte von DHK im wesentlichen unbeeinflusst,
während die Wiederaufnahme der beiden tritiierten Aminosäuren in Synaptosomen des Striatums
signifikant vermindert wurde (Ferkany et Coyle, 1989; Robinson et al., 1991).
Somit wäre eine antagonistische Wirkung von DHK auf die L-trans-PDC-evozierte Freisetzung von
Aspartat im Caudatoputamen der Ratte zu erwarten. In der Tat beobachteten wir bereits bei einer
DHK-Konzentration von 10 µM eine signifikante Reduktion der L-trans-PDC-evozierten D-[3H]Aspartat-Freisetzung um 22.5 % der Kontrollen. Entsprechend zeigten Koch et al. (1999a) in
kortikalen
Synaptosomen
der Ratte, dass DHK (300
µM)
als
nicht-transportierbarer
Wiederaufnahmehemmer sowohl die Glutamat-induzierte, als auch die als Ischämiemodell dienende
Kaliumzyanid-induzierte, zytoplasmatische Freisetzung von D-[3H]-Aspartat komplett verhindern
kann.
Die drei Charakteristika der L-trans-PDC-evozierten D-[3H]-Aspartat-Freisetzung, namentlich die
Ca++-Unabhängigkeit, die TTX-Insensitivität und die Antagonisierbarkeit durch DHK beweisen,
dass die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-Aspartat-Freisetzung auf einen nicht-vesikulären, durch die
Umkehr des Glutamat-Transporters bedingten Freisetzungsmechanismus zurückzuführen ist.
4.2.2. Der Einfluss von Gabapentin auf die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]-AspartatFreisetzung
Im Rahmen eines epileptischen Anfalles wurde ein Anstieg der extrazellulären Glutamat-Spiegel
beobachtet (During et Spencer, 1993, Walker et al., 1995). Walker und seine Mitarbeiter äusserten
dabei den Verdacht, dass dieser Effekt auf einer Umkehr des Glutamat-Transporters über einen
Glutamat/Ascorbat-Heteroexchange beruht. Desweiteren steht die exzitotoxische Wirkung von
Glutamat in Zusammenhang mit den subakuten Veränderungen nach zerebraler Ischämie (Neal et
al., 1994) und der Pathogenese der chronisch verlaufenden, sporadischen Form der amyotrophen
Lateralsklerose (ALS) (Plaitakis 1990).
So fanden Neal et al. (1994) in vitro einen signifikanten Anstieg der extrazellulären
Konzentrationen von Glutamat, Aspartat und GABA in der ischämischen Retina von Ratte und
Diskussion
Seite 86
Kaninchen. Ähnliche Ergebnisse fanden Globus et al. (1991) im Caudatoputamen der Ratte,
entsprechend der Vorstellung, dass es im Rahmen einer zerebralen Ischämie zu einer
Beeinträchtigung des Energiehaushaltes mit nachfolgendem Zusammenbruch des Ionengradienten
über der Plasmamembran, anhaltender Depolarisation und zytoplasmatischer Freisetzung von
exzitatorischen Aminosäuren durch die Umkehr des elektrogenen Glutamattransporters kommt.
Bei der ALS kommt es zu einer langsam progredienten Degeneration sowohl des ersten, als auch
des zweiten motorischen Neurons in Hirnrinde und Rückenmark. Sie ist klinisch charakterisiert
durch das progrediente Auftreten sowohl spastischer als auch schlaffer Lähmungen. Man
unterscheidet eine familiäre Form (5 %) mit autosomal dominantem Erbgang, von einer
sporadischen Form (95 %) (Poeck, 1998). Rothstein et al. (1990) konnten in der zerebrospinalen
Flüssigkeit von ALS-Patienten signifikant erhöhte Konzentrationen von Glutamat und Aspartat
nachweisen. Der regionale Verlust von Glutamat-Transportern mit daraus resultierender
verminderter Wiederaufnahme des Transmitters nach synaptischer Freisetzung wird für die
chronische Erhöhung extrazellulärer Glutamat-Spiegel auf neurotoxische Konzentrationen
verantwortlich gemacht (Rothstein et al., 1995).
Bisherige Untersuchungen bezüglich einer Beeinflussung der Glutamat-vermittelten Exzitotoxizität
durch Gabapentin waren nicht konklusiv. Gabapentin zeigte in einem in vitro–Modell der ALS
einen protektiven Effekt auf die vom Zelltod bedrohten Nervenzellen (Rothstein et al., 1995). Es
wurde in Zellkulturen des Rückenmarks neonataler Ratten der Verlust von Glutamattransportern
durch die Gabe von Inhibitoren des Glutamat-Transporters imitiert und der Einfluss verschiedener
neuroprotektiver Substanzen geprüft. Gabapentin (0.1 mM) wurde über insgesamt 4 Wochen den
Zellkulturen zugegeben und zeigte unter diesen Bedingungen einen nahezu vollständigen Schutz
gegenüber der Glutamat-vermittelten Neurotoxizität (Rothstein et al., 1995). Entsprechend fanden
Gurney et al. (1996) unter Gabapentin signifikant verlängerte Lebenszeiten transgener Mäuse in
einem in vivo Modell für ALS. Auch klinisch konnte in einer Phase-III-Studie in einem
Beobachtungszeitraum von 6 - 12 Monaten unter Gabapentin die Abnahme der Muskelkraft bei
ALS-Patienten dosisabhängig verlangsamt und die Überlebensrate signifikant gesteigert werden
(Mazzini et al., 1998). Leach et al. (1997) fanden im Gehirn von gesunden Mäusen eine signifikante
Abnahme der zerebralen, extrazellulären Glutamatkonzentration, wenn Gabapentin über insgesamt
8 Tage verabreicht wurde. Gabapentin zeigte dagegen keine Wirkung nach Verabreichung einer
einmaligen Dosis in unterschiedlichen Konzentrationen. Dahingegen blieb die elektrisch-evozierte,
vesikuläre Freisetzung von endogenem Glutamat im Hippokampus der Ratte von Gabapentin
unbeeinflusst (Taylor, 1989).
Diskussion
Seite 87
Unter der Annahme, dass die neuroprotektive Wirkung von Gabapentin auf einer Minderung der
zytoplasmatischen Konzentration exzitatorischer Aminosäuretransmitter beruht, wurde Gabapentin
hinsichtlich seiner Wirkung auf die L-trans-PDC-evozierte, zytoplasmatische Freisetzung von D[3H]-Aspartat geprüft.
Gabapentin zeigte in unseren Experimenten keinen Einfluss auf die L-trans-PDC-evozierte D-[3H]Aspartat-Freisetzung. Diese Beobachtung könnte dadurch erklärt werden, dass D-Aspartat zwar in
die Nervenendigung aufgenommen wird, jedoch keinem intrazellulären Metabolismus unterliegt
(Davies et Johnston, 1976). Eine Wirkung von Gabapentin auf Synthese oder Abbau exzitatorischer
Aminosäuren wäre dann aufgrund der Markierung des zytoplasmatischen Transmitterpools
glutamaterger Neurone mit D-[3H]-Aspartat nicht erkennbar. Jedoch konnte auch die L-trans-PDCevozierte Freisetzung von [3H]-Glutamat nach Inkubation mit dem Glutamat-Precursor [3H]Glutamin durch Gabapentin nicht beeinflusst werden (Hummel, 1999).
Dennoch ergaben einige Studien Hinweise auf eine Beeinflussung des Glutamatstoffwechsels durch
Gabapentin: So hemmt Gabapentin nach Goldlust et al (1995) in vitro kompetitiv das Enzym
branched-chain-amino-acid-aminotransferase (BCAA-T), welches die de-novo Synthese von
Glutamat katalysiert. Die Synthese von Glutamat aus verzweigtkettigen Aminosäuren stellt im
Gehirn eine zwar kleine, aber signifikante Fraktion an der gesamten Glutamat-Biosynthese in
Neuronen und Glia dar (Gurney et al., 1996). Man unterscheidet eine zytoplasmatische, neuronal
lokalisierte und eine mitochondrial lokalisierte Form der BCAA-T, wobei entsprechend dem
vermuteten Wirkort von Gabapentin präferentiell die zytoplasmatische Isoform durch das
Pharmakon gehemmt werden soll (Hutson et al., 1998). Die Folge einer Hemmung der BCAA-T
durch Gabapentin wären erniedrigte zytoplasmatische Glutamatspiegel in glutamatergen
Nervenzellen. Entsprechende Ergebnisse konnten in vivo bisher nicht gefunden werden. Ein zweiter
Mechanismus durch welchen Gabapentin in den Glutamat-Metabolismus eingreifen könnte ist die
Stimulation des Glutamat-abbauenden Enzyms Glutamatdehydrogenase (GDH), was in vitro jedoch
nur in sehr hohen, klinisch nicht relevanten Dosen des Pharmakons nachgewiesen werden konnte
(Goldlust et al., 1995). Bisher sind auch hier entsprechende Untersuchungen in vivo nicht
beschrieben worden. Jedoch konnten Volterra et al. (1996) zeigen, dass eine Aktivitätssteigerung
der GDH prinzipiell eine Hemmung der L-trans-PDC-vermittelten Neurotoxizität bewirken kann.
Diskussion
Seite 88
4.3. Der Einfluss von Gabapentin auf die Freisetzung endogener Aminosäuren
im Caudatoputamen der Ratte
Unsere bisher gewonnenen Erkenntnisse beziehen sich auf Versuche, in welchen der
Transmitterpool mit dem radioaktiv markierten Transmitter selbst ([3H]-GABA, D-[3H]-Aspartat),
bzw. dessen Vorstufe ([3H]-Glutamin) markiert wurde. Gabapentin zeigte dabei nur einen Effekt,
wenn ein Einfluss des Pharmakons auf den GABA-Stoffwechsel nach Inkubation mit [3H]-Glutamin
möglich war. Nach Inkubation mit D-[3H]-Aspartat konnte eine Wirkung von Gabapentin nicht
beobachtet werden, eventuell aufgrund der Eigenschaft von D-Aspartat, nicht metabolisiert zu
werden.
Um Gabapentin die Gelegenheit zu geben, auf den endogenen Metabolismus zu wirken,
betrachteten wir in dieser Versuchsreihe den Einfluss von Gabapentin auf die extrazellulären
Konzentrationen der endogenen Aminosäuren Glutamat, Aspartat und GABA.
Bei der statistischen Auswertung dieser Versuche wurden sämtliche Fraktionen einer
Behandlungsgruppe gemittelt. Ein statistischer Vergleich zwischen den einzelnen Fraktionen
(Fraktion 1 - 5) einer Behandlungsgruppe ergab keine signifikanten Unterschiede, was die Bildung
eines Mittelwertes aller Fraktionen rechtfertigte. Wir beobachteten hierbei in unserer ersten
Versuchsreihe eine Abnahme der spontanen Freisetzung von Glutamat und Aspartat im Vergleich
zu den Kontrollen, wenn Gabapentin (0.1 mM) während der gesamten Superfusionszeit anwesend
war. Gabapentin minderte die Glutamatkonzentration in den Superfusaten um 39.9 %, die
Aspartatkonzentration wurde um 65.8 ± % reduziert. Entsprechende Ergebnisse fanden sich in der
Wiederholung dieser Versuchsreihe, wenn der Superfusatgehalt auf den Schnittgehalt bezogen
wurde: Die Konzentrationsabnahme betrug 48.1 % für Glutamat und 68.3 % für Aspartat. Wurde
Gabapentin in einer Konzentration von 0.01 mM throughout gegeben, so fand sich eine Abnahme
der spontanen Freisetzung von Glutamat um 75.6 % der Kontrollen und von Aspartat um 87.2 %.
Um die statistische Aussagekraft unserer Experimente zu untermauern, wurden diese Versuche
unter den gleichen Bedingungen wiederholt (Ergebnisse nicht aufgeführt). Interessanterweise fand
sich hier keine Wirkung von Gabapentin auf die spontane Freisetzung der endogenen Aminosäuren.
Dabei fiel auf, dass jene Versuche, welche einen eindeutigen Einfluss von Gabapentin auf die
Glutamat- und Aspartat-Konzentrationen zeigten, durchweg im Sommer durchgeführt wurden, bei
starker Sonneneinstrahlung in die Laborräume und langer Exposition der Phosphat-gepufferten,
wässrigen Gabapentinlösungen gegenüber dem Sonnenlicht (3-4 Stunden). Hingegen wurden jene
Versuche, welche keinen Effekt von Gabapentin auf die spontane Freisetzung der endogenen
Aminosäuretransmitter zeigten, im Winter bei künstlichem Tageslicht durchgeführt. Eine mögliche
Diskussion
Seite 89
Erklärung hierfür bietet die Eigenschaft von Gabapentin, Phosphat-katalysiert in einer wässrigen
Lösung und in einem pH-Bereich von 1.4 - 11.1 durch intramolekulare, irreversible Aminolyse ein
Lactam (8-Aza-spiro[5,4]decan-9-on = Gabapentin-Lactam) zu bilden (Kearney et al., 1992). Sollte
diese Reaktion durch die Sonneneinstrahlung während des Versuchsablaufes beschleunigt werden,
so wäre nicht auszuschliessen, dass die beobachteten Effekte nicht auf Gabapentin, sondern auf
Gabapentin-Lactam, zurückzuführen sind.
Aufgrund dieser Überlegungen wurden in unseren Labors Versuche durchgeführt, in welchen
Gabapentin (0.1 mM) in einem physiologischen Phosphat-Puffer zwei Stunden mit ultraviolettem
Licht bei 260 und 330 nm Wellenlänge bei 37°C bestrahlt wurde (Feuerstein et Knörle, persönliche
Mitteilung). Hierbei ging man von einer Reaktionsausbeute von ca. 1 % aus (Kearney et al., 1992),
was einer Gabapentin-Lactam-Konzentration von 1 µM entspricht. Die anschliessende Superfusion
und Bestimmung von Glutamat erfolgte analog den beschriebenen Versuchen zum Einfluss von
Gabapentin auf die spontane Freisetzung endogener Aminosäuren. Die Auswertung dieser Versuche
ergab entsprechend den "Sommerversuchen" eine signifikante Abnahme der Glutamatkonzentration
in den Superfusaten um etwa 50 % der Kontrollen. Kontrollversuche wurden ohne vorhergehende
UV-Bestrahlung der Gabapentinlösungen durchgeführt und zeigten keinen Einfluss der
Testsubstanz auf die Glutamatkonzentration in den Superfusaten. Eine mögliche Erklärung für die
fehlende Reproduzierbarkeit unserer Ergebnisse wäre demnach, dass in den „Winterversuchen“
keine, bzw. nur in unwesentlichem Ausmass eine Lactamisierung von Gabapentin zu GabapentinLactam stattgefunden hat, während die in den "Sommerversuchen" zu beobachteten GabapentinEffekte auf Gabapentin-Lactam zurückzuführen sind, welches während des Versuchsablaufes durch
die Energiezufuhr unter Sonneneinstrahlung entstanden ist.
Weiterführende Experimente verglichen die neuroprotektive Wirkung von Gabapentin und
Gabapentin-Lactam (Jehle et al., 2000). Dabei reduzierte Gabapentin-Lactam die Ischämieinduzierte [3H]-Glutamat-Freisetzung um 42.5 %, Gabapentin selbst lediglich um 30.6 %. Der
Autor untersuchte desweiteren die Überlebensrate von Ganglienzellen in einem in-vivo-Modell
einer akuten retinalen Ischämie bei Ratten, wo Gabapentin keine neuroprotektive Wirkung zeigte.
Als zugrundeliegender Wirkmechanismus für Gabapentin-Lactam wurde die Aktivierung des
mitochondrialen KATP-Kanales beschrieben. Eine Reduktion der nicht-vesikulären, Ischämieinduzierten Freisetzung endogenen Glutamats durch Agonisten von Kaliumkanälen, welche eine
Hyperpolarisation des präsynaptischen Neurons zur Folge haben, wurde durch Zini et al. (1993)
beschrieben. Nach Freiman et al. (1999, 2001) fungiert auch Gabapentin als Agonist an diesen
Ionenkanälen, jedoch in sehr viel geringerem Ausmass im Vergleich zu Gabapentin-Lactam (Jehle
Diskussion
Seite 90
et al., 2000). Dies wird vor allem auf Unterschiede im pharmakokinetischen Verhalten
zurückgeführt, da Gabapentin-Lactam im Gegensatz zu Gabapentin bei physiologischem pH
ungeladen und somit membrangängiger ist.
Ungeachtet all dieser Überlegungen ergeben die bisher durchgeführten Studien bezüglich der
Wirkung von Gabapentin auf die glutamaterge Neurotransmission keinen Konsens. So zeigte
Gabapentin nach Leach et al. (1997) und Rothstein et al. (1995) seine Wirkung lediglich nach
chronischer Verabreichung, eine Wirkung nach einmaliger Applikation konnte nicht gesehen
werden. Dahingegen war Gabapentin nach Jehle et al. (2000) zwar während des akuten
ischämischen Ereignisses, jedoch nur unter pathologischen Bedingungen in vitro, nicht in vivo
wirksam. Dass der klinischen Wirksamkeit von Gabapentin gegenüber der glutamatvermittelten
Neurotoxizität möglicherweise mehrere Mechanismen zugrundeliegen ist nicht auszuschliessen.
Weiterführende Studien sind demnach von wesentlicher Bedeutung.
Zusammenfassung
Seite 91
5. Zusammenfassung
Wir entwickelten ein in vitro Modell der depolarisationsunabhängigen, zytoplasmatischen
Freisetzung von GABA, bzw. D-Aspartat durch die Umkehr des hochaffinen, plasmamembranären
Transporters. Zur Validierung unserer Methodik schlossen wir die Beteiligung eines
depolarisationsabhängigen, vesikulären Freisetzungsmechanismus aus und bewiesen durch die
Blockade des Wiederaufnahme-Transporters den zytoplasmatischen Freisetzungsmodus infolge
Umkehr des elektrogenen Transportes.
Desweiteren überprüften wir in diesem Modell die Wirkung des Pharmakons Gabapentin:
Gabapentin zeigte in klinisch relevanter Konzentration eine Beeinflussung der zytoplasmatischen,
Nipecotat-evozierten [3H]-GABA-Freisetzung, wenn dem Pharmakon nach ausreichender
Einwirkzeit ein Einfluss auf den Metabolismus nach Inkubation mit dem Precursor [3H]-Glutamin
gewährt wurde. Es fand sich dann eine signifikante Steigerung der zytoplasmatischen [3H]-GABAFreisetzung durch Gabapentin, was indirekt auf eine Erhöhung der zytoplasmatischen GABASpiegel hinweist. Durch welchen Mechanismus Gabapentin letztlich die zytoplasmatische GABAKonzentration erhöht, konnte durch unser Modell nicht weiter differenziert werden. Die
verschiedenen, in der weiterführenden Literatur aufgeführten Hypothesen wurden diskutiert, wobei
wir die Beeinflussung des GABA-Metabolismus durch Gabapentin im Sinne einer Steigerung der
zytoplasmatischen GABA-Konzentration favorisieren.
Bezüglich der zytoplasmatischen, L-trans-PDC-evozierten Freisetzung des stellvertretend für
Glutamat eingesetzten D-[3H]-Aspartat war Gabapentin unwirksam. Wurde jedoch die spontane
Freisetzung der endogenen Transmitter Glutamat und Aspartat unter Gabapentin gemessen, so
zeigte sich eine signifikante Abnahme der exzitatorischen Transmitterkonzentrationen in den
Superfusaten und somit im Extrazellulärraum. Wir gehen deshalb davon aus, dass Gabapentin,
entsprechend seiner Wirkung auf die inhibitorische GABAerge Neurotransmission, auf den
Metabolismus
exzitatorischer
Aminosäuren
einwirken
könnte.
Desweiteren
ist
nicht
auszuschliessen, dass die unter der Superfusion mit Gabapentin beobachtete Abnahme der
spontanen Freisetzung von Glutamat und Aspartat auf das Reaktionsprodukt der Lactamisierung,
Gabapentin-Lactam, zurückzuführen ist.
Literaturverzeichnis
Seite 92
6. Literaturverzeichnis
Adam-Vizi V (1992) External Ca2+-independent release of neurotransmitters. J Neurochem 58 (2):
395-405
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Lebenslauf
Seite 104
7. LEBENSLAUF
Persönliche Angaben
Name:
Nicole Fichter
Wohnort:
Im Kleegärtle 13
79235 Vogtsburg-Achkarren
geboren:
01. Mai 1972, Freiburg im Breisgau
Schulbildung
1978 - 1982
Grundschule in Vogtsburg-Achkarren
1982 - 1988
Hugo-Höfler-Realschule Breisach a. Rh.
1988 - 1991
Max-Weber-Schule Freiburg, Wirtschaftsgymnasium
Studium
10.1991 - 09.1997
Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
10.1997 - 04.1998
Praktisches Jahr, Städtisches Klinikum Karlsruhe
05.1998 - 08.1998
Praktisches Jahr, Universitätsspital Zürich, Neurochirurgie
11.1998
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Berufliche Weiterbildung
05.1999 – 10.2000
Ärztin im Praktikum an der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik der
Ludwig-Maximilians-Universität München, Klinikum Grosshadern.
Direktor: Prof. Dr. H.-J. Reulen
Seit 06/2001
Ärztin in Weiterbildung an der Universitäts-Augenklinik Rostock
Direktor: Prof. Dr. R. Guthoff
Inhaltsverzeichnis
.
Vielen Dank...
...meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. T. J. Feuerstein für die Überlassung des Themas dieser
Dissertation, die gute fachliche Betreuung und die tatenkräftige Unterstützung bei der
Labortätigkeit!
...Frau Dr. Diana Peckys für die Einführung in die grossen und kleinen Geheimnisse des
Laboralltages und als Ansprechpartnerin bei auftauchenden Fragen und Problemen.
...Frau Dipl.-Biol. Katrin Lindenberg und Dr. Melanie Darstein für deren geduldiges und
gründliches Korrekturlesen der vorliegenden Arbeit.
...Herrn Dr. Rainer Knörle für die praktische und theoretische Hilfe bei meinen HPLC-Versuchen.
...allen, die die Zeit im Labor mit mir geteilt haben und mich gerne an diese zurückdenken lassen!
...ganz besonders meinen Eltern, Geschwistern und Freunden, die immer für mich da waren, wenn
ich sie brauchte, an mich glaubten und mich unterstützten!